Misaotra anao nitsidika ny Nature.com.Ny kinova browser ampiasainao dia manana fanohanana CSS voafetra.Mba hahazoana traikefa tsara indrindra, manoro hevitra anao izahay hampiasa navigateur nohavaozina (na esory ny Compatibility Mode amin'ny Internet Explorer).Mandritra izany fotoana izany, mba hiantohana ny fanohizana ny fanohanana, dia hanolotra ny tranokala tsy misy fomba sy JavaScript izahay.
Fomba vaovao immunological sy spectrometric faobe ho an'ny famakafakana sarotra momba ny oligosaccharides maharitra amin'ny sôkôla katsaka efa nokarakaraina tamin'ny AFEX.Ny biomass Lignocellulosic dia safidy maharitra amin'ny solika fôsily ary ampiasaina betsaka amin'ny famolavolana bioteknolojia amin'ny famokarana vokatra toy ny sakafo, sakafo, solika ary akora simika.Ny fanalahidin'ireo teknolojia ireo dia ny fampivoarana ny fizotran'ny fifaninanana lafo vidy amin'ny famadihana ny gliosida sarotra misy ao amin'ny rindrin'ny zavamaniry ho siramamy tsotra toy ny glucose, xylose ary arabinose.Satria ny biomass lignocellulosic dia tena mafy loha, dia tsy maintsy iharan'ny fitsaboana thermochemical (ohatra, fibre amoniaka exfoliation (AFEX), asidra dilute (DA), ranon-javatra ionika (IL)) sy ny fitsaboana biolojika (ohatra, hydrolysis enzymatic sy ny fermentation mikraoba) miaraka mba hahazoana ny vokatra irina..Na izany aza, rehefa ampiasaina amin'ny dingan'ny hydrolysis ny enzymes holatra ara-barotra, ny 75-85% amin'ny siramamy azo levona miforona dia monosaccharides, ary ny 15-25% sisa dia oligosaccharides azo levona, izay tsy azo ampiasaina amin'ny microorganisms.Talohan'izay dia nahomby ny nanokafana sy nanadio ny oligosaccharides mafy loha levona tamin'ny alàlan'ny fitambaran'ny fanasarahana karbaona sy diatomaceous tany ary ny chromatography fanilikilihana ny habeny, ary nanadihady ihany koa ny toetrany manakana ny enzyme.Hitanay fa ny oligosaccharides misy ambaratonga ambony amin'ny fanoloana asidra uronika methylated polymerization (DP) dia sarotra kokoa ny manodina amin'ny fangaro anzima ara-barotra noho ny DP ambany sy ny oligosaccharides tsy miandany.Eto izahay dia mitatitra ny fampiasana fomba maro fanampiny, anisan'izany ny glycan profiling amin'ny fampiasana antibody monoclonal (mAbs) manokana amin'ny fambolena glycans biomass mba hamaritana ny fatorana glycan ao amin'ny rindrin'ny selan'ny zavamaniry sy ny hydrolysate enzymatic, ny ionization laser desorption matrix, ny mass spectrometry amin'ny sidina..Ny MALDI-TOF-MS) dia mampiasa tampon'ny diagnostika ara-drafitra azo amin'ny spectroscopy taorian'ny fahapotehan'ny ion ratsy, ny chromatography entona ary ny spectrometry faobe (GC-MS) mba hamaritana ny fatorana oligosaccharide misy sy tsy misy derivatization.Noho ny habe kely amin'ny oligosaccharides (DP 4-20), ireo molekiola ireo dia sarotra ampiasaina amin'ny famatorana sy ny famantarana ny mAb.Mba handresena an'io olana io, dia nampiharina ny fomba immobilization oligosaccharide mifototra amin'ny biotin conjugation vaovao izay nanamarika tamim-pahombiazana ny ankamaroan'ny oligosaccharides azo levona DP ambany eo amin'ny tontolon'ny microplate, izay nampiasaina tamin'ny rafitra mAb avo lenta ho an'ny fanadihadiana ligation manokana.Ity fomba vaovao ity dia hanamora ny fivoaran'ny fitiliana glycome avo lenta avo lenta kokoa amin'ny ho avy izay azo ampiasaina hanokafana sy hamaritana ny oligosaccharides misy ao amin'ny biomarkers ho an'ny tanjona diagnostika.
Ny biomass lignocellulosic, ahitana akora fambolena, ala, bozaka ary hazo, dia mety ho enti-mamokatra vokatra mifototra amin'ny biôlôjika, ao anatin'izany ny sakafo, ny sakafo, ny solika ary ny akora simika hamokarana vokatra ambony kokoa1.Ny karbôhydrate (toy ny cellulose sy hemicellulose) izay misy ao amin'ny rindrin'ny selan'ny zavamaniry dia lasa monosaccharides amin'ny alàlan'ny fanodinana simika sy biotransformation (toy ny hydrolysis enzymatic sy ny fermentation microbial).Ny fitsaboana mialoha mahazatra dia ny fanitarana ny fibre amoniaka (AFEX), ny asidra dilute (DA), ny ranon-javatra ionika (IL), ary ny fipoahana entona (SE), izay mampiasa fitambarana simika sy hafanana mba hampihenana ny famokarana lignoselulose amin'ny fanokafana ny rindrin'ny sela zavamaniry3,4.ny ditran'ny zavatra, 5. Ny hydrolyse enzymatic dia atao amin'ny enta-mavesatra be dia be amin'ny fampiasana enzymes (CAZymes) sy fermentation mikraoba amin'ny fampiasana leviora transgenika na bakteria mba hamokarana solika sy simika mifototra amin'ny biolojika 6.
CAZymes ao amin'ny anzima ara-barotra dia ahitana fitambarana anzima saro-pady izay mampifamatotra ny fatorana gliosida-siramamy sarotra ho lasa monosaccharides2,7.Araka ny efa notaterinay teo aloha, ny tambajotra be pitsiny ny aromatika polymers ny lignin miaraka amin'ny gliosida mahatonga azy ireo ho tena saro-takarina, izay mitarika ho amin'ny fiovam-po siramamy tsy feno, manangona 15-25% ny firaisana ara-nofo oligosaccharides izay tsy novokarina nandritra ny hydrolysis enzymatic ny biomass pretreated.Olana mahazatra amin'ny fomba fitsaboana mialoha ny biomass isan-karazany izany.Ny antony sasany mahatonga an'io tavoara io dia ny tsy fahampian'ny enzyme mandritra ny hydrolysis, na ny tsy fisian'ny enzymes tena ilaina ilaina hanapaka ny fatorana siramamy ao amin'ny biomass.Ny fahatakarana ny firafitry ny siramamy sy ny toetran'ny rafitra, toy ny fatoran'ny siramamy ao amin'ny oligosaccharides, dia hanampy antsika hanatsara ny fiovan'ny siramamy mandritra ny hydrolysis, ka mahatonga ny fizotry ny biotechnologie hifaninana amin'ny vokatra azo avy amin'ny solika.
Ny famaritana ny firafitry ny gliosida dia sarotra ary mitaky fomba fampifandraisana toy ny chromatography ranoka (LC)11,12, spectroscopy résonance magnetika nokleary (NMR)13, electrophoresis capillary (CE)14,15,16 ary spectrometry faobe (MS)17., valo ambin'ny folo.Ny fomba MS toy ny spectrometry faobe amin'ny sidina miaraka amin'ny desorption laser sy ny ionization amin'ny fampiasana matrix (MALDI-TOF-MS) dia fomba maro samihafa hamantarana ny rafitry ny carbohydrate.Vao haingana, Collision-Induced Dissociation (CID) tandem MS ny sodium ion adducts no be mpampiasa indrindra mba hamantarana ny dian-tanana mifanaraka amin'ny oligosaccharide attachment toerana, anomeric configurations, sequences, ary sampana toerana 20, 21.
Ny famakafakana glycan dia fitaovana tena tsara hamantarana lalina ny fatorana karbôhydrate22.Ity fomba ity dia mampiasa antibody monoclonal (mAbs) natao hambolena glycan rindrin'ny sela ho toy ny famotopotorana mba hahafantarana ny fifandraisan'ny carbohydrate sarotra.Maherin'ny 250 mAbs no azo eran-tany, natao hanohitra ny oligosaccharides tsipika sy sampana isan-karazany amin'ny fampiasana saccharides24.Maro ny mAbs no nampiasaina betsaka mba hamaritana ny rafitra, ny firafitry ary ny fanovàna ny rindrin'ny selan'ny zavamaniry, satria misy fahasamihafana lehibe arakaraka ny karazana selan'ny zavamaniry, ny taova, ny taona, ny dingan'ny fivoarana, ary ny tontolo iainana25,26.Vao haingana, io fomba io dia nampiasaina mba hahafantarana ny isan'ny vesicle ao amin'ny rafi-pambolena sy ny biby ary ny andraikiny avy amin'ny fitaterana glycan araka ny voafaritra amin'ny marika subcellular, ny dingana fampandrosoana, na ny fanentanana ara-tontolo iainana, ary ny famaritana ny hetsika enzymatic.Ny sasany amin'ireo rafitra samihafa amin'ny glycans sy xylans izay fantatra dia ny pectin (P), xylan (X), mannan (M), xyloglucans (XylG), glucans fatorana mifangaro (MLG), arabinoxylan (ArbX), galactomannan (GalG) , glucuronic acid-arabinoxylan (GArbX) .
Na izany aza, na dia eo aza ireo ezaka fikarohana rehetra ireo, fanadihadiana vitsivitsy ihany no nifantoka tamin'ny toetran'ny fanangonana oligosaccharide mandritra ny hydrolysis enta-mavesatra avo lenta (HSL), ao anatin'izany ny famoahana oligosaccharide, ny fiovan'ny halavan'ny rojo oligomerika mandritra ny hydrolysis, ny polymers DP ambany isan-karazany, ary ny fiolahany.fizarana 30,31,32.Mandritra izany fotoana izany, na dia voaporofo ho fitaovana mahasoa ho an'ny fanadihadiana feno momba ny rafitra glycan aza ny fanadihadiana glycan, dia sarotra ny manombatombana ny oligosaccharides DP ambany tsy misy rano amin'ny fampiasana fomba antibody.Oligosaccharides DP kely kokoa miaraka amin'ny lanjan'ny molekiola latsaky ny 5-10 kDa dia tsy mifatotra amin'ny takelaka ELISA 33, 34 ary sasana alohan'ny fanampim-panafody.
Eto, sambany izahay dia mampiseho ny ELISA assay amin'ny takelaka misy avidin mampiasa antibody monoclonal, manambatra dingana biotinylation dingana iray ho an'ny oligosaccharides refractory azo levona miaraka amin'ny fanadihadiana glycome.Ny fomba fiasantsika amin'ny famakafakana glycome dia nohamarinin'ny MALDI-TOF-MS sy GC-MS mifototra amin'ny famakafakana oligosaccharide mifameno amin'ny fampiasana trimethylsilyl (TMS) derivatization amin'ny fitambaran'ny siramamy hydrolyzed.Ity fomba fiasa vaovao ity dia azo amboarina ho fomba fiasa avo lenta amin'ny ho avy ary hahita fampiharana bebe kokoa amin'ny fikarohana biomedical35.
Misy fiantraikany amin'ny asan'izy ireo ny fiovan'ny enzymes sy antibody, toy ny glycosylation,36.Ohatra, ny fiovan'ny glycosylation ny proteinina serum dia manana anjara toerana lehibe amin'ny arthritis mamaivay, ary ny fiovan'ny glycosylation dia ampiasaina ho marika famantarana37.Ny glycans isan-karazany dia notaterina tao amin'ny literatiora ho hita mora foana amin'ny aretina isan-karazany, anisan'izany ny areti-mifindra mitaiza ao amin'ny taratasy mivalona amin'ny gastrointestinalina sy ny atiny, ny otrikaretina virosy, ny oviana, ny nono ary ny homamiadan'ny prostate38,39,40.Ny fahatakarana ny firafitry ny glycans amin'ny fampiasana glycan mifototra amin'ny antibody ELISA dia hanome fahatokisana fanampiny amin'ny aretina aretina tsy misy fampiasana fomba MS sarotra.
Ny fandinihanay teo aloha dia naneho fa ny oligosaccharides mafy loha dia nijanona tsy voahidy taorian'ny fitsaboana mialoha sy ny hydrolysis enzymatic (sary 1).Tao anatin'ny asa navoakanay teo aloha, dia namolavola fomba fitrandrahana saribao mivaingana izahay mba hanavahana ny oligosaccharides amin'ny AFEX-pretreated corn stover hydrolyzate (ACSH)8.Taorian'ny fitrandrahana voalohany sy ny fisarahana, ny oligosaccharides dia nozaraina bebe kokoa tamin'ny chromatography exclusion (SEC) ary nangonina araka ny filaharan'ny lanjan'ny molekiola.Ny monomerina siramamy sy oligomerina navoaka tamin'ny fitsaboana isan-karazany dia nodinihina tamin'ny alalan'ny famakafakana ny fatran'ny siramamy.Raha ampitahaina ny votoatin'ny oligomer siramamy azo amin'ny fomba fitsaboana isan-karazany, ny fisian'ny oligosaccharides mafy loha dia olana mahazatra amin'ny fiovan'ny biomass ho monosaccharides ary mety hitarika amin'ny fihenan'ny vokatra siramamy farafahakeliny 10-15% ary hatramin'ny 18%.Etazonia.Ity fomba ity dia ampiasaina amin'ny famokarana lehibe kokoa ny ampahany oligosaccharide.Ny vokatra ACH sy ny ampahany manaraka miaraka amin'ny lanja molekiola samihafa dia nampiasaina ho fitaovana andrana amin'ny famaritana ny oligosaccharides amin'ity asa ity.
Taorian'ny fitsaboana mialoha sy ny hydrolysis enzymatic, ny oligosaccharides maharitra dia mbola tsy voahidy.Ity (A) dia fomba fanasarahana oligosaccharide izay mitokana ny oligosaccharides amin'ny AFEX-pretreated corn stover hydrolyzate (ACSH) amin'ny fampiasana fandriana feno karbaona mavitrika sy tany diatomaceous;(B) Fomba fisarahana ny oligosaccharides.Ny oligosaccharides dia nosarahin'ny chromatography exclusion size (SEC);(C) Saccharide monomers sy oligomers navoaka avy amin'ny fitsaboana isan-karazany (asidra voadio: DA, ranoka ionika: IL sy AFEX).Toetran'ny hydrolysis enzymatic: 25% (w/w) avo lenta (eo ho eo amin'ny 8% glucan), 96 ora hydrolyse, 20 mg/g entana anzima ara-barotra (Ctec2: Htec2: MP-2: 1: 1 ratio) ary ( D) Sugar monomers sy oligomer glucose, xylose ary arabinose-navoaka avy amin'ny AFEX presttreated AFEX.
Ny famakafakana glycan dia voaporofo fa fitaovana ilaina amin'ny famakafakana ara-drafitra feno momba ny glycans amin'ny fitrandrahana mitokana amin'ny sisa tavela amin'ny biomass.Na izany aza, ny saccharides mety levona amin'ny rano dia tsy aseho amin'ny fampiasana an'io fomba nentim-paharazana41 io satria ny oligosaccharides lanja molekiola ambany dia sarotra ny tsy mihetsika amin'ny takelaka ELISA ary sasana alohan'ny fanampim-panafody.Noho izany, ho an'ny famatorana sy ny famantarana ny antibody, dia nampiasaina ny fomba biotinylation dingana iray mba hametahana ny oligosaccharides tsy mety levona amin'ny takelaka ELISA misy avidin.Ity fomba ity dia nosedraina tamin'ny fampiasana ACSH novokarina teo aloha sy ampahany iray mifototra amin'ny lanjan'ny molekiolany (na ny mari-pahaizana polymerization, DP).Ny biotinylation dingana iray dia nampiasaina mba hampitomboana ny fifandraisan'ny oligosaccharide amin'ny fampidirana biotin-LC-hydrazide amin'ny faran'ny fihenan'ny kôbhydrate (sary 2).Amin'ny vahaolana, ny vondrona hemiacetal amin'ny faran'ny fampihenana dia mihetsika miaraka amin'ny vondrona hydrazide biotin-LC-hydrazide mba hamorona fatorana hydrazone.Eo anatrehan'ny NaCNBH3, ny fifamatoran'ny hydrazone dia mihena amin'ny vokatra farany biotinylated azo antoka.Miaraka amin'ny fanovana ny faran'ny fihenan'ny siramamy, dia azo atao ny mamatotra ny oligosaccharides DP ambany amin'ny takelaka ELISA, ary tamin'ny fandalinanay dia natao tamin'ny takelaka misy avidin tamin'ny fampiasana mAbs glycan-targeted.
Fandinihana ny antibody monoclonal mifototra amin'ny ELISA ho an'ny oligosaccharides biotinylated.Eto (A) mitambatra ny biotinylation ny oligosaccharides sy ny fitiliana ELISA manaraka miaraka amin'ny glycan-kendrena mAbs amin'ny takelaka misy NeutrAvidin ary (B) dia mampiseho dingana iray amin'ny biotinylation ny vokatra fanehoan-kevitra.
Ny takelaka vita amin'ny Avidin miaraka amin'ny antibody oligosaccharide-conjugated dia nampidirina tamin'ny antibody voalohany sy faharoa ary nosasana tamin'ny fitaovana maivana sy saro-pady.Rehefa vita ny fifamatorana amin'ny antibody dia ampio ny substrate TMB mba hikolokolo ny takelaka.Najanona tamin'ny asidra solifara ihany ny fanehoan-kevitra.Ny takelaka incubated dia nodinihina tamin'ny alàlan'ny mpamaky ELISA mba hamaritana ny tanjaky ny antibody tsirairay mba hamantarana ny fifandraisana amin'ny antibody manokana.Ho an'ny antsipiriany sy ny mari-pamantarana amin'ny fanandramana, jereo ny fizarana mifanaraka amin'izany "Ny fitaovana sy ny fomba".
Asehontsika ny fampiasana an'io fomba vaovao novolavolaina io ho an'ny fampiharana manokana amin'ny alàlan'ny famaritana ny oligosaccharides mety levona misy ao amin'ny ACSH ary koa ny ampahany amin'ny oligosaccharide voadio sy voadio mitokana amin'ny hydrolysates lignoscellulosic.Araka ny asehon'ny sary 3, ny xylans misolo ny epitope mahazatra indrindra hita ao amin'ny ACSH amin'ny fampiasana fomba fitiliana glycome bioacylated dia matetika uronic (U) na methyluronic (MeU) ary arabinogalactans pectic.Ny ankamaroan'izy ireo dia hita ihany koa tamin'ny fanadihadiana nataontsika teo aloha momba ny famakafakana ny glycans amin'ny solida tsy misy hydrolyzed (UHS)43.
Fikarohana ny epitope oligosaccharide recalcitrant amin'ny fampiasana antibody monoclonal mankany amin'ny glycan rindrin'ny sela.Ny ampahany "tsy neutre" dia ny ampahany ACN ary ny ampahany "asidra" dia ny ampahany FA.Ny mena mamiratra kokoa amin'ny sarintany mafana dia manondro atiny epitope avo kokoa, ary ny manga mamiratra kokoa dia manondro ambadika banga.Ny soatoavina loko eo amin'ny mizana dia mifototra amin'ny soatoavina OD manta ho an'ny famolavolana N=2.Ny epitope lehibe fantatry ny antibody dia aseho eo ankavanana.
Ireo rafitra tsy misy cellulose ireo dia tsy azo novakiana tamin'ny cellulase sy hemicellulase mahazatra indrindra ao amin'ny fangaro anzima ara-barotra voasedra, izay ahitana ny enzyme ara-barotra fampiasa matetika.Noho izany, ilaina ny anzima fanampiny vaovao amin'ny hydrolysis azy ireo.Raha tsy misy anzima fanampiny tsy misy cellulose ilaina, ireo fatorana tsy misy cellulose ireo dia manakana ny fiovam-po tanteraka ho monosaccharides, na dia hydrolyzed betsaka aza ny polymers siramamy ao amin'ny ray aman-dreniny ho sombiny fohy kokoa ary levona amin'ny fampiasana fangaro anzima ara-barotra.
Ny fandalinana fanampiny momba ny fizarana famantarana sy ny tanjaky ny fatorana dia nampiseho fa ny epitope mifatotra dia ambany kokoa amin'ny ampahany siramamy DP avo (A, B, C, DP hatramin'ny 20+) noho ny ampahany ambany DP (D, E, F, DP) amin'ny dimer) (sary 1).Ny ampahany asidra dia mahazatra kokoa amin'ny epitope tsy misy cellulose noho ny ampahany tsy miandany.Ireo trangan-javatra ireo dia mifanaraka amin'ny lamina voamarika tamin'ny fandinihana nataontsika teo aloha, izay misy ny DP sy ny asidra avo lenta kokoa amin'ny hydrolysis enzymatic.Noho izany, ny fisian'ny epitope glycan tsy misy cellulose sy ny fanoloana U sy MeU dia afaka manampy betsaka amin'ny fahamarinan'ny oligosaccharides.Tsara homarihina fa ny fahombiazan'ny fifamatorana sy ny fitiliana dia mety ho olana amin'ny oligosaccharides DP ambany, indrindra raha ny epitope dia oligosaccharide dimeric na trimeric.Azo tsapaina izany amin'ny fampiasana oligosaccharides ara-barotra amin'ny halavany samihafa, ny tsirairay dia tsy misy afa-tsy epitope iray izay mifatotra amin'ny mAb manokana.
Noho izany, ny fampiasana antibody manokana momba ny rafitra dia naneho karazana fatorana mihemotra.Miankina amin'ny karazana antibody ampiasaina, ny lamina mifandraika amin'izany, ary ny tanjaky ny famantarana avoakany (ny ankamaroany sy ny kely indrindra), dia azo fantarina ny anzima vaovao ary ampiana semi-quantitative amin'ny fifangaroan'ny enzyme ho an'ny glycoconversion feno kokoa.Raha raisina ho ohatra ny famakafakana ny oligosaccharides ACSH dia afaka mamorona angon-drakitra momba ny fatorana glycan ho an'ny akora biomass tsirairay isika.Marihina eto fa tokony hojerena ny fifandraisan'ny antikora samihafa, ary raha tsy fantatra ny fifandraisany, dia hiteraka fahasahiranana sasany izany rehefa mampitaha ny famantarana ny antikora samihafa.Ankoatr'izay, ny fampitahana ny fatorana glycan dia mety miasa tsara indrindra eo amin'ny santionany ho an'ny antibody mitovy.Ireo fatorana mafy loha ireo dia azo ampifandraisina amin'ny angon-drakitra CAZyme, izay ahafahantsika mamantatra anzima, mifantina ny anzima kandida ary mitsapa ny enzyme manapaka fatorana, na mamolavola rafitra mikraoba hanehoana ireo enzymes ireo ho ampiasaina amin'ny biorefineries44.
Mba hanombanana ny fomba famenoana ny fomba fiasa immunological fomba hafa amin'ny famaritana ny oligosaccharides lanja molekiola ambany misy ao amin'ny hydrolysates lignocellulosic, dia nanao MALDI (sary 4, S1-S8) izahay ary fanadihadiana ny saccharides azo avy amin'ny TMS mifototra amin'ny GC-MS amin'ny tontonana mitovy (sary 5) oligosaccharide.Ny MALDI dia ampiasaina hampitaha raha mifanaraka amin'ny rafitra nokasaina ny fizarana faobe ny molekiola oligosaccharide.Amin'ny aviavy.4 dia mampiseho ny MC ny singa tsy miandany ACN-A sy ACN-B.Ny fanadihadiana ACN-A dia nanamafy ny karazana siramamy pentose manomboka amin'ny DP 4-8 (sary 4) ka hatramin'ny DP 22 (sary S1), izay mifanaraka amin'ny oligosaccharides MeU-xylan ny lanjany.Ny fanadihadiana ACN-B dia nanamafy ny andiany pentose sy glucoxylan miaraka amin'ny DP 8-15.Ao amin'ny fitaovana fanampiny toy ny Figure S3, ny sarintanin'ny fizarana faobe asidra FA-C dia mampiseho karazana siramamy pentose misolo (Me) U miaraka amin'ny DP an'ny 8-15 izay mifanaraka amin'ny xylans voasolo hita ao amin'ny fitiliana mAb miorina amin'ny ELISA.Mifanaraka ny epitope.
MALDI-MS spectrum ny oligosaccharides tsy mifanaraka amin'ny soluble misy ao amin'ny ACS.Eto, (A) ACN-A ambany lanja isan-karazany fractions methylated uronic asidra (DP 4-8) nisolo glucuroxylan oligosaccharides sy (B) ACN-B xylan sy methylated uronic asidra oligosaccharides nosoloina glucuroxylan (DP 8-15).
Famakafakana ny firafitry ny glycan sisa amin'ny oligosaccharides refractory.Eto (A) TMS saccharide firafitry ny oligosaccharide fractions isan-karazany azo tamin'ny fampiasana GC-MS fanadihadiana.(B) Ny firafitry ny siramamy azo avy amin'ny TMS izay misy ao amin'ny oligosaccharides.ACN - ampahany acetonitrile misy oligosaccharides tsy miandany ary FA - ampahany asidra ferulika misy oligosaccharides asidra.
Ny fehin-kevitra mahaliana iray hafa dia nalaina avy amin'ny famakafakana LC-MS momba ny ampahany oligosaccharide, araka ny aseho amin'ny sary S9 (mety ho hita ao amin'ny fitaovana elektronika fanampiny).Ny ampahany amin'ny vondrona hexose sy -OAc dia nojerena imbetsaka nandritra ny ligation ny ampahany ACN-B.Ity fikarohana ity dia tsy vitan'ny hoe manamafy ny fizarazarana hita amin'ny famakafakana glycome sy MALDI-TOF, fa manome fampahalalana vaovao momba ny derivatives carbohydrate mety hitranga amin'ny biomass lignoscellulosic pretreated.
Nodinihinay ihany koa ny firafitry ny siramamy amin'ny ampahany oligosaccharide amin'ny fampiasana siramamy TMS derivatization.Amin'ny fampiasana GC-MS, dia namaritra ny firafitry ny neural (tsy derivative) sy ny siramamy asidra (GluA sy GalA) izahay ao amin'ny ampahany oligosaccharide (sary 5).Ny asidra glucuronic dia hita ao amin'ny singa asidra C sy D, raha ny asidra galacturonic kosa dia hita ao amin'ny singa asidra A sy B, izay samy singa DP avo lenta amin'ny siramamy asidra.Ireo valiny ireo dia tsy manamarina ny angon-drakitra ELISA sy MALDI ihany, fa mifanaraka amin'ny fanadihadiana nataontsika teo aloha momba ny fanangonana oligosaccharide.Noho izany, mino izahay fa ny fomba immunological maoderina mampiasa biotinylation ny oligosaccharides sy ny fitiliana ELISA manaraka dia ampy hamantarana ny oligosaccharides recalcitrant azo levona amin'ny santionany biolojika isan-karazany.
Koa satria ny fomba fitiliana mAb mifototra amin'ny ELISA dia nohamarinina tamin'ny fomba maro samihafa, dia te-hijery bebe kokoa ny mety ho an'ity fomba vaovao ity izahay.Oligosaccharides ara-barotra roa, xylohexasaccharide oligosaccharide (XHE) ary 23-α-L-arabinofuranosyl-xylotriose (A2XX), no novidina sy nosedraina tamin'ny fampiasana fomba fiasa mAb vaovao mikendry ny glycan rindrina sela.Ny sary 6 dia mampiseho fifandraisana an-tariby eo amin'ny mari-pamantarana mifamatotra biotinylated sy ny fifantohana amin'ny log of oligosaccharide, manolotra modely mety amin'ny Adsorption Langmuir.Anisan'ireo mAbs, CCRC-M137, CCRC-M138, CCRC-M147, CCRC-M148, ary CCRC-M151 mifandray amin'ny XHE, ary CCRC-M108, CCRC-M109, ary LM11 mifandray amin'ny A2XX amin'ny 1 nm hatramin'ny 100 nano.Noho ny tsy fahampian'ny antibody mandritra ny fanandramana, dia natao ny fanandramana voafetra tamin'ny fifantohana oligosaccharide tsirairay.Marihina eto fa tsy mitovy ny fihetsiky ny antibody sasany amin'ny oligosaccharide mitovy amin'ny substrate, angamba satria mifatotra amin'ny epitope hafa kely izy ireo ary mety manana fifandraisana mifamatotra tena samy hafa.Ny mekanika sy ny fiantraikan'ny famantarana epitope marina dia ho sarotra kokoa rehefa ampiharina amin'ny santionany tena izy ny fomba fiasa mAb vaovao.
Oligosaccharides ara-barotra roa no nampiasaina mba hamaritana ny halaviran'ny mAbs isan-karazany mikendry ny glycan.Eto, ny fifandraisana an-tariby miaraka amin'ny fifantohana amin'ny oligosaccharide dia manondro ny lamina adsorption Langmuir ho an'ny (A) XHE amin'ny mAb ary (B) A2XX amin'ny mAb.Ny epitope mifandraika amin'izany dia manondro ny firafitry ny oligosaccharides ara-barotra ampiasaina ho substrate amin'ny assay.
Ny fampiasana antibody monoclonal mikendry glycan (fanadihadiana glycocomic na fitiliana mAb mifototra amin'ny ELISA) dia fitaovana mahery vaika ho an'ny famaritana lalina ny ankamaroan'ny glycans rindrina sela lehibe izay mamorona biomass amin'ny zavamaniry.Na izany aza, ny famakafakana glycan klasika dia mampiavaka ny glycans rindrina sela lehibe kokoa, satria ny ankamaroan'ny oligosaccharides dia tsy mihetsika tsara amin'ny takelaka ELISA.Ao anatin'ity fanadihadiana ity, ny kobam-bary efa nokarakaraina AFEX dia nalaina tamin'ny hydrolyzée enzymatique amin'ny votoaty solida be.Ny famakafakana siramamy dia nampiasaina hamaritana ny firafitry ny kôbhydrate amin'ny rindrin'ny sela ao amin'ny hydrolyzate.Na izany aza, ny famakafakana mAb momba ny oligosaccharides kely kokoa amin'ny hydrolysates dia atao ambanin-javatra, ary ny fitaovana fanampiny dia ilaina mba hamerenana amin'ny fomba mahomby ny oligosaccharides amin'ny takelaka ELISA.
Izahay dia mitatitra eto ny fomba immobilization oligosaccharide vaovao sy mahomby amin'ny fitiliana mAb amin'ny fampifangaroana ny biotinylation oligosaccharide arahin'ny fitiliana ELISA amin'ny takelaka misy takelaka NeutrAvidin ™.Ny oligosaccharides biotinylated tsy mihetsika dia nampiseho fifandraisana ampy ho an'ny antibody mba ahafahana mamantatra haingana sy mahomby ny oligosaccharides recalcitrant.Ny famakafakana ny firafitry ny oligosaccharides mafy loha mifototra amin'ny spectrometry faobe dia nanamafy ny valin'ity fomba fiasa vaovao amin'ny immunoscreening ity.Noho izany, ireo fanadihadiana ireo dia mampiseho fa ny fampifangaroana ny biotinylation oligosaccharide sy ny fitiliana ELISA miaraka amin'ny antibody monoclonal glycan-targeted dia azo ampiasaina hamantarana ny crosslinks amin'ny oligosaccharides ary azo ampiharina amin'ny fandalinana biochemika hafa mampiavaka ny firafitry ny oligosaccharides.
Ity fomba fanaovana profiling glycan mifototra amin'ny biotin ity no tatitra voalohany afaka manadihady ny fatoran'ny karbôhydrate tsy misy dikany amin'ny oligosaccharides mety levona ao amin'ny biomass zavamaniry.Izany dia manampy amin'ny fahazoana ny antony mahatonga ny ampahany sasany amin'ny biomass dia mafy loha amin'ny famokarana biofuel.Ity fomba ity dia mameno banga lehibe amin'ny fomba famakafakana glycome ary manitatra ny fampiharana azy amin'ny substrate midadasika kokoa ankoatry ny oligosaccharides zavamaniry.Amin'ny ho avy, mety hampiasa robotika ho an'ny biotinylation isika ary hampiasa ny fomba novolavolainay ho an'ny famakafakana santionany avo lenta amin'ny fampiasana ELISA.
Nojinjaina tamin'ny taona 2010 tao amin'ny Fambolena Kramer ao Ray, Colorado ny mololo katsaka (CS) nambolena tamin'ny masomboly hybrid Pioneer 33A14.Raha nahazo alalana avy amin'ny tompon-tany dia azo ampiasaina amin'ny fikarohana ity biomassa ity. Ny santionany dia voatahiry maina <6% ny hamandoana ao anaty kitapo zip-hidy ao anaty mari-pana. Ny santionany dia voatahiry maina <6% ny hamandoana ao anaty kitapo zip-hidy ao anaty mari-pana. Образцы хранились сухими при влажности < 6% amin'ny пакетах с застежкой-молнией при комнатной температуре. Ny santionany dia voatahiry maina amin'ny hamandoana <6% ao anaty kitapo misy zipper amin'ny mari-pana.样品在室温下以干燥< 6% 的水分储存在自封袋中。样品在室温下以干燥< 6% Образцы хранят в пакетах с застежкой-молнией при комнатной температуре с влажностью < 6%. Ny santionany dia voatahiry ao anaty kitapo zipper amin'ny mari-pana amin'ny efitrano misy hamandoana <6%.Nanaraka ny torolàlana eo an-toerana sy nasionaly ny fanadihadiana.Ny famakafakana compositional dia natao tamin'ny alàlan'ny protocol NREL.Ny fitambarana dia hita fa misy 31,4% glucan, 18,7% xylan, 3,3% arabinan, 1,2% galactan, 2,2% acetyl, 14,3% lignin, 1,7% proteinina ary 13, 4% lavenona.
Cellic® CTec2 (138 mg proteinina/ml, lot VCNI 0001) dia fitambaran'ny cellulase, β-glucosidase ary Cellic® HTec2 (157 mg proteinina/ml, lot VHN00001) avy amin'ny Novozymes (Franklinton, NC, USA)).Multifect Pectinase® (72 mg proteinina/mL), fitambarana saro-pady amin'ny enzyme manimba pectin, dia nomen'ny DuPont Industrial Biosciences (Palo Alto, CA, Etazonia).Ny fatran'ny proteinina enzyme dia nofaritana tamin'ny fanombanana ny votoatin'ny proteinina (sy ny fanesorana ny fandraisan'anjaran'ny azota tsy proteinina) amin'ny fampiasana Kjeldahl nitrogen analysis (AOAC method 2001.11, Dairy One Cooperative Inc., Ithaca, NY, USA).Ny tany diatomaceous 545 dia novidina tamin'ny EMD Millipore (Billerica, MA).Ny karbaona mavitrika (DARCO, 100 mesh granules), Avicel (PH-101), beech xylan, ary ny zavatra simika hafa rehetra dia novidina tamin'ny Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).
Ny fitsaboana AFEX dia natao tao amin'ny GLBRC (Biomass Conversion Research Laboratory, MSU, Lansing, MI, Etazonia).Ny fitsaboana mialoha dia natao tamin'ny 140 ° C. nandritra ny 15 minitra.46 fotoana ipetrahana amin'ny 1: 1 ratio amin'ny amoniaka anhydrous amin'ny biomass amin'ny 60% (w / w) entana ao anaty reactor batch benchtop stainless steel (Parr Instruments Company).Naharitra 30 minitra izany.Nentina tamin'ny 140 ° C ny reactor ary navoaka haingana ny amoniaka, ka nahafahan'ny biomass hiverina haingana amin'ny mari-pana.Ny firafitry ny AFEX pre-treated corn stover (ACS) dia mitovy amin'ny an'ny untreated corn stover (UT-CS).
Ny solids avo ACSH 25% (w / w) (eo ho eo amin'ny 8% dextran loading) dia nomanina ho fitaovana fanombohana amin'ny famokarana oligosaccharides lehibe.Ny hydrolysis enzymatic an'ny ACS dia natao tamin'ny fampiasana fangaro anzima ara-barotra anisan'izany ny Cellic® Ctec2 10 mg proteinina / g glucan (amin'ny biomass efa voatsabo), Htec2 (Novozymes, Franklinton, NC), proteinina 5 mg / g glucan, ary Multifect Pectinase (Genencor Inc, Etazonia).).), 5 mg proteinina / g dextran.Ny hydrolysis enzymatic dia natao tao amin'ny bioreactor 5 litatra miaraka amin'ny volume miasa 3 litatra, pH 4.8, 50 ° C ary 250 rpm.Taorian'ny hydrolyse nandritra ny 96 ora, ny hydrolyzate dia nangonina tamin'ny centrifugation tamin'ny 6000 rpm nandritra ny 30 minitra ary avy eo tamin'ny 14000 rpm nandritra ny 30 minitra mba hanesorana ny solids unhydrolysed.Ny hydrolyzate dia niharan'ny filtration sterile tamin'ny alalan'ny tavoahangy sivana 0,22 mm.Ny hydrolyzate voasivana dia voatahiry ao anaty tavoahangy sterile amin'ny 4 ° C. ary avy eo nozaraina amin'ny karbaona.
Famakafakana ny firafitry ny santionany biomass mifototra amin'ny fitrandrahana araka ny fomba famakafakana laboratoara NREL: fanomanana santionany ho an'ny famakafakana ny composition (NREL/TP-510-42620) sy ny famaritana ny kôbhydrate sy lignin amin'ny biomass (NREL/TP-510 – 42618)47.
Ny famakafakana oligosaccharide momba ny renirano hydrolyzate dia natao tamin'ny mari-pamantarana 2 ml tamin'ny fampiasana fomba hydrolysis asidra mifototra amin'ny autoclave.Afangaro ny santionany hydrolyzate miaraka amin'ny 69.7 µl amin'ny asidra solifara 72% ao anaty tavoahangy 10 ml visy cap culturelle ary atsofohy mandritra ny 1 ora eo amin'ny benchtop amin'ny 121 ° C, mangatsiatsiaka amin'ny ranomandry ary sivana ao anaty vial chromatography liquide (HPLC).Ny fifantohana amin'ny oligosaccharides dia nofaritana tamin'ny fanesorana ny fatran'ny monosaccharides ao amin'ny santionany tsy hydrolyzed avy amin'ny fitambaran'ny siramamy ao amin'ny santionany asidra-hydrolyzed.
Ny fatran'ny glucose, xylose, ary arabinose ao amin'ny biomass hydrolysed asidra dia nodinihina tamin'ny alàlan'ny rafitra Shimadzu HPLC misy autosampler, tsanganana heater, paompy isocratic, ary mpitsikilo fanondro refractive amin'ny tsanganana Bio-Rad Aminex HPX-87H.Ny tsanganana dia notazonina tamin'ny 50 ° C ary nopotehina tamin'ny rano 0,6 ml / min 5 mM H2SO4.mikoriana.
Ny supernatant hydrolyzate dia nolevina ary nodinihina ho an'ny votoatin'ny monomer sy oligosaccharide.Ny siramamy monomeric azo taorian'ny hydrolysis enzymatic dia nodinihina tamin'ny HPLC miaraka amin'ny tsanganana Bio-Rad (Hercules, CA) Aminex HPX-87P ary tsanganana mpiambina lavenona.Ny mari-pana amin'ny tsanganana dia nitazona tamin'ny 80 ° C, ny rano dia nampiasaina ho toy ny dingana finday miaraka amin'ny taham-pidirana 0,6 ml / min.Ny oligosaccharides dia nofaritana tamin'ny hydrolysis amin'ny asidra dilute amin'ny 121 ° C araka ny fomba voalaza ao amin'ny refs.41, 48, 49.
Ny famakafakana saccharide dia natao tamin'ny manta, AFEX efa notsaboina mialoha ary ny sisa rehetra tsy misy hydrolysed biomass (anisan'izany ny famokarana ny rindrin'ny sela serial sy ny fitiliana mAb) amin'ny fampiasana ny fomba fiasa voalaza teo aloha 27, 43, 50, 51.Ho an'ny famakafakana glycome, ny sisa tavela amin'ny rindrina sela zavamaniry dia voaomana avy amin'ny sisa tavela amin'ny biomass ary iharan'ny fitrandrahana serial miaraka amin'ny reagents mahery vaika toy ny ammonium oxalate (50 mM), ny sodium carbonate (50 mM ary 0.5% w / v), CON.(1M sy 4M, samy misy 1% w/v sodium borohydride) sy chlorite asidra araka ny voalaza teo aloha52,53.Ny fitrandrahana dia nalaina tamin'ny ELISA tamin'ny tontolon'ny mAb50s saro-pady mankany amin'ny glycan rindrin'ny sela, ary ny fanehoan-kevitry ny mAb dia naseho ho toy ny sarintany hafanana.Ny mAbs mikendry ny glycan rindrina sela zavamaniry dia novidina tamin'ny tahiry laboratoara (CCRC, JIM ary MAC series).
Biotinylation dingana iray amin'ny oligosaccharides.Ny conjugation ny gliosida amin'ny biotin-LC-hydrazide dia natao tamin'ny alalan'ny fomba manaraka ireto.Ny biotin-LC-hydrazide (4.6 mg / 12 μmol) dia levona amin'ny dimethyl sulfoxide (DMSO, 70 μl) amin'ny alàlan'ny famporisihana mafy sy ny hafanana amin'ny 65 ° C. mandritra ny 1 min.Nampiana asidra glacier (30 µl) ary nararaka tamin'ny sodium cyanoborohydride (6,4 mg/100 µmol) ilay fangaro ary levona tanteraka rehefa avy nafanaina tamin'ny 65° C. nandritra ny 1 minitra teo ho eo.Avy eo, avy amin'ny 5 ka hatramin'ny 8 μl ny fangaro fanehoan-kevitra dia nampidirina tamin'ny oligosaccharide maina (1-100 nmol) mba hahazoana ny fihoaram-pefy 10 heny na mihoatra amin'ny marika eo amin'ny faran'ny fampihenana.Ny fanehoan-kevitra dia natao tamin'ny 65 ° C nandritra ny 2 ora, avy eo dia nodiovina avy hatrany ny santionany.Tsy nisy sodium cyanoborohydride nampiasaina tamin'ny fanandramana fametahana tsy misy fampihenana, ary ny santionany dia naneho hevitra tamin'ny 65 ° C. nandritra ny 2.5 ora.
ELISA coating sy fanasana ny santionany ny biotinylated oligosaccharides.25 μl santionany biotinylated (100 μl isaky ny santionany mivondrona ao anaty 5 ml 0,1 M Tris buffer solution (TBS)) dia nampiana tao amin'ny lavadrano tsirairay amin'ny takelaka misy avidin.Ny fantsakana fanaraha-maso dia nofonosina tamin'ny biotine 50 μl amin'ny fifantohana 10 μg / ml amin'ny 0,1 M TBS.Ny rano deionized dia nampiasaina ho coating amin'ny fandrefesana banga.Ny takelaka dia natsipy nandritra ny adiny 2 tamin'ny mari-pana ao anaty haizina.Sasao in-3 ny lovia amin'ny ronono 0,1% amin'ny 0,1 M TBS amin'ny alàlan'ny programa no.11 ho an'ny Grenier flat 3A.
Fanampiana sy fanasana antibody voalohany.Ampio 40 µl antibody voalohany ny lavadrano tsirairay.Atsofohy mandritra ny adiny 1 ny microplate amin'ny mari-pana ao anaty haizina.Avy eo dia nosasana in-3 tamin'ny ronono 0,1% tamin'ny TBS 0,1M ny takelaka tamin'ny alàlan'ny programa fanasana #11 ho an'ny Grenier Flat 3A.
Ampio antibody faharoa ary sasao.Ampio 50 µl ny totozy / voalavo antibody faharoa (voatsoboka 1:5000 amin'ny ronono 0,1% amin'ny 0,1 M TBS) isaky ny lavadrano.Atsofohy mandritra ny adiny 1 ny microplate amin'ny mari-pana ao anaty haizina.Nosasana in-5 tamin'ny ronono 0,1% tao anaty TBS 0,1 M ny takelaka mikro avy eo tamin'ny fampiasana programa fanasan-damba Grenier Flat 5A #12.
Fanampiana substrate.Ampio 50 µl amin'ny 3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine (TMB) amin'ny substrate fototra (amin'ny fampidirana 2 nilatsaka ny buffer, 3 nilatsaka TMB, 2 nilatsaka ny hydrogène peroxyde amin'ny 15 ml ny deionized rano).Omano ny substrate TMB.ary vortex alohan'ny fampiasana).Atsofohy amin'ny mari-pana mandritra ny 30 minitra ny microplate.Ao anaty haizina.
Fenoy ny dingana ary vakio ny takelaka.Asio 50 µl asidra solifara 1 N isaky ny lavaka fantsakana ary raketo ny 450 hatramin'ny 655 nm amin'ny alàlan'ny mpamaky ELISA.
Manomàna vahaolana 1 mg / ml amin'ireto analytes ireto amin'ny rano deionized: arabinose, rhamnose, fucose, xylose, asidra galacturonic (GalA), asidra glucuronic (GlcA), mannose, glucose, galactose, lactose, N-acetylmannosamine (manNAc), N-acetylglucosamine.(glcNAc), N-acetylgalactosamine (galNAc), inositol (fenitra anatiny).Fitsipika roa no nomanina tamin'ny fampidirana ny vahaolana siramamy 1 mg / mL aseho amin'ny tabilao 1. Ny santionany dia mangatsiaka ary lyophilize amin'ny -80 ° C. mandra-pialan'ny rano rehetra (matetika eo amin'ny 12-18 ora).
Ampio 100–500 µg ny santionany amin'ny fantsona satrony amin'ny fifandanjana analytique.Soraty ny vola nampiana.Ny tsara indrindra dia ny famongorana ny santionany amin'ny fifantohana manokana amin'ny solvent ary ampio amin'ny fantsona toy ny aliquot ranoka.Ampiasao 20 µl inositol 1 mg/ml ho fenitra anatiny ho an'ny fantsona santionany tsirairay.Ny habetsaky ny fenitra anatiny ampiana amin'ny santionany dia tsy maintsy mitovy amin'ny habetsaky ny fenitra anatiny ampiana amin'ny fantsona mahazatra.
Ampio 8 ml methanol anhydrous amin'ny vial satrony.Avy eo 4 ml ny 3 N. metanolika HCl vahaolana, voasarona sy nihozongozona.Ity dingana ity dia tsy mampiasa rano.
Ampio 500 µl 1 M HCl methanol solution ny santionany oligosaccharide sy ny fantsona TMS mahazatra.Ny santionany dia natsipy nandritra ny alina (168 ora) tamin'ny 80 ° C. tao anaty sakana mafana.Hamainina amin'ny mari-pana amin'ny efitrano ny vokatra methanolysis amin'ny fampiasana manifold fanamainana.Ampio 200 µl MeOH ary maina indray.Averina indroa io dingana io.Ampio 200 µl methanol, 100 µl pyridine ary 100 µl anhydride acetic ny santionany ary afangaro tsara.Ny santionany dia natsofoka tamin'ny mari-pana mandritra ny 30 minitra.ary maina.Ampio methanol 200 µl ary maina indray.
Ampio 200 µl ny Tri-Sil sy ny fantson-drano voasarona mandritra ny 20 minitra.80°C, avy eo nangatsiaka tamin’ny mari-pana.Mampiasà manifold fanamainana hanamainana bebe kokoa ny santionany amin'ny habetsaky ny 50 µl eo ho eo.Tsara ny manamarika fa tsy navelanay ho maina tanteraka ireo santionany.
Ampio 2 ml ny hexane ary afangaro tsara amin'ny vortex.Fenoy ny tendron'ny pipettes Pasteur (5-8 mm) miaraka amin'ny volon'ondry fitaratra amin'ny fampidirana ny volon'ondry fitaratra eo ambonin'ny pipette 5-3/4 santimetatra.Ny santionany dia natao centrifuge tamin'ny 3000 g nandritra ny 2 minitra.Ny sisa tavela tsy mety levona dia esorina.Amainina hatramin'ny 100-150 µl ny santionany.Volana manodidina ny 1 μl dia nampidirina tao amin'ny GC-MS tamin'ny mari-pana voalohany 80 ° C ary fotoana voalohany 2.0 minitra (Table 2).