Misaotra anao nitsidika ny Nature.com. Voafetra ny fanohanana CSS amin'ny dikan-tranonkala ampiasainao. Ho an'ny traikefa tsara indrindra, manoro hevitra anao izahay hampiasa navigateur nohavaozina (na hanafoana ny Compatibility Mode ao amin'ny Internet Explorer). Mandritra izany fotoana izany, mba hahazoana antoka fa mitohy ny fanohanana, dia hampiseho ny tranonkala tsy misy styles sy JavaScript izahay.
Fomba vaovao momba ny hery fiarovana sy ny spektrometria ho an'ny fanadihadiana sarotra momba ny oligosaccharides maharitra ao anaty fatana katsaka efa notsaboina tamin'ny AFEX. Ny biomass lignocellulosic dia safidy maharitra ho solon'ny solika fôsily ary ampiasaina betsaka amin'ny fampivoarana ny bioteknolojia ho an'ny famokarana vokatra toy ny sakafo, sakafom-biby, solika ary simika. Ny fanalahidin'ireo teknolojia ireo dia ny fampivoarana ny dingana mifaninana amin'ny vidiny ho an'ny fanovana ny gliosida sarotra hita ao amin'ny rindrin'ny sela ho siramamy tsotra toy ny glucose, xylose ary arabinose. Satria mafy loha ny biomass lignocellulosic, dia tsy maintsy iharan'ny fitsaboana thermochemical (ohatra, ny fanesorana ny fibre amoniaka (AFEX), asidra dilute (DA), ranoka ionika (IL)) ary fitsaboana biolojika (ohatra, hydrolysis enzymatic sy fermentation microbial) miaraka mba hahazoana ny vokatra irina. Na izany aza, rehefa ampiasaina amin'ny dingana hydrolysis ny anzima holatra ara-barotra, dia 75-85% amin'ny siramamy mety levona miforona ihany no monosaccharides, ary ny 15-25% sisa dia oligosaccharides mety levona sy sarotra fehezina, izay tsy azon'ny zavamananaina bitika ampiasaina foana. Teo aloha, dia nahomby tamin'ny fanavahana sy fanadiovana ireo oligosaccharides mafy loha mety levona izahay tamin'ny fampiasana fitambaran'ny karbônina sy ny tany diatomaceous ary ny chromatography fanesorana habe, ary koa ny fanadihadiana ny toetrany manakana ny anzima. Hitanay fa sarotra kokoa ny manodina ireo oligosaccharides misy asidra uronika methylated polymerization (DP) ambony kokoa amin'ny fangaroan'ny anzima ara-barotra noho ny oligosaccharides DP ambany sy tsy miandany. Eto izahay dia mitatitra ny fampiasana fomba fanampiny maromaro, anisan'izany ny fanaovana profiling glycan amin'ny fampiasana antibodies monoclonal (mAbs) manokana ho an'ny glycans biomass zavamaniry mba hanavahana ny fatoran'ny glycan ao amin'ny rindrin'ny sela zavamaniry sy ny hydrolysates enzymatic, ny ionization desorption laser assisted matrix, ny time-of-flight mass-spectrometry. . MALDI-TOF-MS) dia mampiasa tampon'isa diagnostika fampahafantarana ny rafitra azo avy amin'ny spectroscopy aorian'ny fihenan'ny ion ratsy faharoa, ny chromatography gazy ary ny spectrometry faobe (GC-MS) mba hanavahana ny fatoran'ny oligosaccharide misy sy tsy misy derivatization. Noho ny haben'ny oligosaccharides kely (DP 4–20), ireo molekiola ireo dia sarotra ampiasaina amin'ny fifamatorana sy ny famaritana ny mAb. Mba handresena io olana io, dia nampiasa fomba fametrahana oligosaccharide mifototra amin'ny biotin conjugation vaovao izahay izay nahomby tamin'ny fanamarihana ny ankamaroan'ny oligosaccharides mety levona DP ambany eo amin'ny velaran'ny microplate, izay avy eo dia nampiasaina tao amin'ny rafitra mAb avo lenta ho an'ny fanadihadiana ligation manokana. Ity fomba vaovao ity dia hanamora ny fampivoarana ny fanadihadiana glycome avo lenta kokoa amin'ny ho avy izay azo ampiasaina hanasarahana sy hamantarana ny oligosaccharides hita ao amin'ny biomarkers ho an'ny tanjona diagnostika.
Ny biomass lignocellulosic, izay ahitana akora avy amin'ny fambolena, ala, ahitra ary hazo, dia akora fototra mety amin'ny famokarana vokatra avy amin'ny zavamananaina, anisan'izany ny sakafo, ny sakafom-biby, ny solika ary ireo akora simika mba hamokarana vokatra sarobidy kokoa1. Ny gliosida (toy ny cellulose sy hemicellulose) izay hita ao amin'ny rindrin'ny sela zavamaniry dia esorina amin'ny polymer ho monosaccharides amin'ny alàlan'ny fanodinana simika sy ny biotransformation (toy ny hydrolysis enzymatic sy ny fermentation microbial). Ny fitsaboana mialoha mahazatra dia ahitana ny fanitarana ny fibre amoniaka (AFEX), asidra dilute (DA), ranoka ionika (IL), ary fipoahana etona (SE), izay mampiasa fitambaran'ny simika sy hafanana mba hampihenana ny famokarana lignocellulose amin'ny alàlan'ny fanokafana ny rindrin'ny sela zavamaniry3,4. hamafin'ny zavatra, 5. Ny hydrolysis enzymatic dia tanterahina amin'ny enta-mavesatra avo lenta amin'ny alàlan'ny fampiasana anzima misy gliosida mavitrika ara-barotra (CAZymes) sy fermentation microbial amin'ny alàlan'ny leviora na bakteria transgenic mba hamokarana solika sy simika avy amin'ny zavamananaina 6.
Ny CAZymes ao amin'ny anzima ara-barotra dia voaforon'ny fifangaroan'ny anzima saro-takarina izay mampisaraka ny fatorana gliosida-siramamy saro-takarina mba hamorona monosaccharides2,7. Araka ny notaterinay teo aloha, ny tambajotra saro-takarina amin'ny polymers aromatika amin'ny lignin amin'ny gliosida dia mahatonga azy ireo ho sarotra vahana, izay mitarika ho amin'ny fiovam-po siramamy tsy feno, manangona 15-25% amin'ny oligosaccharides firaisana ara-nofo izay tsy vokarina mandritra ny hydrolysis anzima amin'ny biomass efa voatsabo mialoha. Olana mahazatra amin'ny fomba fitsaboana biomass isan-karazany izany. Ny antony sasany mahatonga ity sakana ity dia ny fanakanana ny anzima mandritra ny hydrolysis, na ny tsy fisian'ny na ny haavon'ny anzima tena ilaina izay ilaina hanapahana ny fatorana siramamy ao amin'ny biomass zavamaniry. Ny fahatakarana ny firafitry ny siramamy sy ny toetran'ny rafitry ny siramamy, toy ny fatorana siramamy ao amin'ny oligosaccharides, dia hanampy antsika hanatsara ny fiovam-po siramamy mandritra ny hydrolysis, ka mahatonga ny dingana bioteknolojia ho mifaninana amin'ny vokatra avy amin'ny solika.
Sarotra ny mamaritra ny rafitry ny gliosida ary mitaky fitambaran'ny fomba toy ny chromatography liquide (LC)11,12, spectroscopy resonance magnetika nokleary (NMR)13, electrophoresis capillary (CE)14,15,16 ary spectrometry faobe (MS)17. ,valo ambin'ny folo. Ny fomba MS toy ny spectrometry faobe time-of-flight miaraka amin'ny desorption laser sy ionization mampiasa matrix (MALDI-TOF-MS) dia fomba azo ampiasaina amin'ny famantarana ny rafitry ny gliosida. Vao haingana, ny Collision-Induced Dissociation (CID) tandem MS an'ny sodium ion adducts no nampiasaina betsaka indrindra hamantarana ny dian-tanana mifanaraka amin'ny toerana misy ny fifamatoran'ny oligosaccharide, ny firafitra anomerika, ny filaharana, ary ny toerana misy ny sampana 20, 21.
Fitaovana tena tsara ho an'ny famantarana lalina ny fifamatoran'ny gliosida ny famakafakana glycan22. Ity fomba ity dia mampiasa antikôra monoclonal (mAbs) izay alefa any amin'ny rindrin'ny sela zavamaniry ho toy ny fitaovana fitiliana mba hahatakarana ny fifamatoran'ny gliosida sarotra. Maherin'ny 250 mAbs no misy maneran-tany, natao hanoherana oligosaccharides linear sy sampana isan-karazany amin'ny fampiasana saccharides isan-karazany24. Maro ny mAbs no nampiasaina betsaka mba hanazavana ny rafitra, ny firafiny ary ny fanovana ny rindrin'ny sela zavamaniry, satria misy fahasamihafana lehibe miankina amin'ny karazana sela zavamaniry, ny taova, ny taona, ny dingana fivoarana ary ny tontolo iainana fitomboana25,26. Vao haingana, ity fomba ity dia nampiasaina mba hahatakarana ny isan'ny vesicle ao amin'ny rafitry ny zavamaniry sy ny biby ary ny anjara asany tsirairay avy amin'ny fitaterana glycan araka ny voafaritry ny marika subcellular, ny dingana fivoarana, na ny fanentanana ara-tontolo iainana, ary mba hamaritana ny asan'ny anzima. Ny sasany amin'ireo rafitra samihafa amin'ny glycans sy xylans izay efa fantatra dia ahitana ny pectin (P), xylan (X), mannan (M), xyloglucans (XylG), mixed bond glucans (MLG), arabinoxylan (ArbX), galactomannan (GalG), glucuronic acid-arabinoxylan (GArbX) ary arabino-galactan (ArbG)29.
Na izany aza, na eo aza ireo ezaka fikarohana rehetra ireo, dia vitsy ihany ireo fanadihadiana nifantoka tamin'ny toetran'ny fanangonan'ny oligosaccharide mandritra ny hydrolysis avo lenta (HSL), anisan'izany ny famoahana oligosaccharide, ny fiovan'ny halavan'ny rojo oligomerika mandritra ny hydrolysis, ny polymer DP ambany isan-karazany, ary ny fiolahany. 30,31,32. Mandritra izany fotoana izany, na dia voaporofo fa fitaovana mahasoa ho an'ny fanadihadiana feno momba ny rafitry ny glycan aza ny fanadihadiana glycan, dia sarotra ny manombana ny oligosaccharides DP ambany mety levona anaty rano amin'ny alàlan'ny fomba antibody. Ny oligosaccharides DP kely kokoa manana lanja molekiola latsaky ny 5-10 kDa dia tsy mifamatotra amin'ny takelaka ELISA 33, 34 ary voasasa alohan'ny hanampiana antibody.
Eto, sambany izahay no mampiseho ny fitiliana ELISA amin'ny takelaka voarakotra avidin mampiasa antikôra monoclonal, izay mampifangaro ny fomba fiasa biotinylation dingana iray ho an'ny oligosaccharides tsy mety levona miaraka amin'ny fanadihadiana glycome. Ny fomba fiasanay amin'ny fanadihadiana glycome dia nohamarinina tamin'ny alàlan'ny fanadihadiana MALDI-TOF-MS sy GC-MS momba ny fifandraisana oligosaccharide mifameno amin'ny alàlan'ny fampiasana trimethylsilyl (TMS) derivatization amin'ny siramamy hydrolyzed. Ity fomba fiasa manavao ity dia azo amboarina ho fomba fiasa avo lenta amin'ny ho avy ary hahita fampiharana bebe kokoa amin'ny fikarohana biomedika35.
Ny fanovana aorian'ny fandikana ny anzima sy ny antikôra, toy ny glycosylation,36 dia misy fiantraikany amin'ny asany biolojika. Ohatra, ny fiovan'ny glycosylation amin'ny proteinina serum dia mitana anjara toerana lehibe amin'ny aretin'ny tonon-taolana, ary ny fiovan'ny glycosylation dia ampiasaina ho mari-pamantarana diagnostika37. Voalaza ao amin'ny literatiora fa misy glycans isan-karazany miseho mora foana amin'ny aretina isan-karazany, anisan'izany ny aretina mitaiza amin'ny taratasy mivalona amin'ny gastrointestinal sy ny aty, ny aretina viraliny, ny homamiadan'ny ovaire, ny nono ary ny prostaty38,39,40. Ny fahatakarana ny firafitry ny glycans amin'ny fampiasana fomba glycan ELISA mifototra amin'ny antibody dia hanome fahatokisana fanampiny amin'ny famaritana aretina tsy misy ny fampiasana fomba MS sarotra.
Ny fanadihadianay teo aloha dia naneho fa ireo oligosaccharides mafy loha dia mbola tsy nihidrolyzé taorian'ny fitsaboana mialoha sy ny hidirôlizà anzima (Sary 1). Tao amin'ny asanay navoaka teo aloha, dia namorona fomba fitrandrahana dingana mafy orina amin'ny arina mavitrika izahay mba hanasarahana ireo oligosaccharides avy amin'ny hydrolyzate katsaka efa notsaboina mialoha ny AFEX (ACSH)8. Taorian'ny fitrandrahana sy fanasarahana voalohany, dia nozaraina bebe kokoa tamin'ny alàlan'ny chromatography exclusion size (SEC) ireo oligosaccharides ary nangonina araka ny filaharan'ny lanjan'ny molekiola. Ny monomeran'ny siramamy sy oligomeran'ny fitsaboana mialoha isan-karazany dia nohadihadiana tamin'ny alàlan'ny fanadihadiana ny firafitry ny siramamy. Rehefa mampitaha ny votoatin'ny oligomeran'ny siramamy azo avy amin'ny fomba fitsaboana mialoha isan-karazany, ny fisian'ny oligosaccharides mafy loha dia olana mahazatra amin'ny fiovan'ny biomass ho monosaccharides ary mety hitarika fihenan'ny vokatra siramamy farafahakeliny 10-15% ary hatramin'ny 18% mihitsy aza. US. Ity fomba ity dia ampiasaina amin'ny famokarana ampahany oligosaccharide amin'ny ambaratonga lehibe kokoa. Ny ACH vokatr'izany sy ny ampahany manaraka azy miaraka amin'ny lanjan'ny molekiola samihafa dia nampiasaina ho fitaovana fanandramana ho an'ny famaritana ny oligosaccharides amin'ity asa ity.
Taorian'ny fitsaboana mialoha sy ny hydrolysis anzima, dia nijanona tsy hydrolyzed ireo oligosaccharides maharitra. Eto (A) dia fomba fanasarahana oligosaccharide izay anavahana ireo oligosaccharides avy amin'ny hydrolysate katsaka efa notsaboina mialoha ny AFEX (ACSH) amin'ny fampiasana fandriana feno karbônina mavitrika sy tany diatomaceous; (B) Fomba fanasarahana oligosaccharides. Nosarahina bebe kokoa tamin'ny alàlan'ny chromatography exclusion size (SEC) ireo oligosaccharide; (C) Monomers sy oligomers saccharide navoaka avy amin'ny fitsaboana mialoha isan-karazany (asidra voatsatso: DA, ranoka ionika: IL sy AFEX). Toe-javatra hydrolysis anzima: enta-mavesatra be 25% (w/w) (eo amin'ny 8% eo ho eo ny enta-mavesatra glucan), hydrolysis 96 ora, enta-mavesatra anzima ara-barotra 20 mg/g (tahan'ny Ctec2:Htec2:MP-2:1:1) ary (D) Monomers sy oligomers siramamy amin'ny glucose, xylose ary arabinose navoaka avy amin'ny katsaka efa notsaboina mialoha ny AFEX (ACS).
Voaporofo fa fitaovana mahasoa ho an'ny fanadihadiana feno momba ny rafitry ny glycans ao amin'ny fitrandrahana avy amin'ny sisa tavela amin'ny biomass mivaingana ny fanadihadiana glycan. Na izany aza, vitsy ny saccharides mety levona anaty rano amin'ny fampiasana ity fomba nentim-paharazana ity41 satria sarotra ny mampijanona ny oligosaccharides lanja molekiola ambany amin'ny takelaka ELISA ary voasasa alohan'ny hanampiana antibody. Noho izany, ho an'ny fifamatorana sy ny famaritana ny antibody, dia nampiasaina ny fomba biotinylation dingana iray mba handrakofana oligosaccharides mety levona sy tsy mifanaraka amin'ny takelaka ELISA voarakotra avidin. Notsapaina ity fomba ity tamin'ny fampiasana ny ACSH novokarinay teo aloha sy ny ampahany mifototra amin'ny lanjany molekiolany (na ny haavon'ny polymerization, DP). Nampiasaina ny biotinylation dingana iray mba hampitomboana ny fifandraisana amin'ny oligosaccharide amin'ny alàlan'ny fanampiana biotin-LC-hydrazide amin'ny faran'ny gliosida mampihena (Sary 2). Ao amin'ny vahaolana, ny vondrona hemiacetal amin'ny faran'ny fampihenana dia mihetsika amin'ny vondrona hydrazide amin'ny biotin-LC-hydrazide mba hamorona fifamatorana hydrazone. Eo anatrehan'ny akora mampihena NaCNBH3, dia mihena ho vokatra farany biotinylated marin-toerana ny fatoran'ny hydrazone. Noho ny fanovana ny farany mampihena siramamy, dia azo natao ny fifamatoran'ny oligosaccharides DP ambany amin'ny takelaka ELISA, ary tao amin'ny fanadihadianay dia natao tamin'ny takelaka voarakotra avidin izany tamin'ny fampiasana mAbs mikendry glycan.
Sivana ny antikôra monoklonal mifototra amin'ny ELISA ho an'ny oligosaccharides biotinylated. Eto (A) biotinylation mitambatra amin'ny oligosaccharides sy ny sivana ELISA manaraka miaraka amin'ny mAbs glycan-targeted amin'ny takelaka voarakotra NeutrAvidin ary (B) mampiseho fomba fiasa dingana iray ho an'ny biotinylation ny vokatra fihetsiketsehana.
Avy eo dia nampiana tamin'ny antibody voalohany sy faharoa ireo takelaka voarakotra Avidin miaraka amin'ny antibody mifamatotra oligosaccharide ary nosasana tao anaty fitaovana saro-pady amin'ny hazavana sy ny fotoana. Rehefa vita ny fifamatoran'ny antibody, dia ampio ny substrate TMB mba hampidirana ny takelaka. Najanona tamin'ny asidra solifara ny fihetsika. Nohadihadiana tamin'ny fampiasana mpamaky ELISA ireo takelaka nampidirina mba hamaritana ny tanjaky ny fifamatoran'ny antibody tsirairay mba hamantarana ny fifandraisana manokana amin'ny antibody. Raha mila fanazavana fanampiny sy ny masontsivana amin'ny andrana, jereo ny fizarana mifandraika amin'izany "Akora sy fomba".
Asehonay ny maha-ilaina ity fomba vaovao novolavolaina ity ho an'ny fampiharana manokana amin'ny alàlan'ny famaritana ireo oligosaccharides mety levona ao amin'ny ACSH ary koa ao amin'ny ampahany oligosaccharide manta sy voadio nalaina avy amin'ny hydrolysates lignocellulosic. Araka ny aseho amin'ny Sary 3, ny xylans nosoloina epitope mahazatra indrindra hita ao amin'ny ACSH amin'ny alàlan'ny fomba fanadihadiana glycome bioacylated dia matetika uronic (U) na methyluronic (MeU) ary pectic arabinogalactans. Ny ankamaroan'izy ireo dia hita ihany koa tao amin'ny fanadihadiana teo aloha momba ny famakafakana ny glycans amin'ny solids tsy hydrolyzed (UHS)43.
Fitiliana ireo epitope oligosaccharide tsy mety miova amin'ny alalan'ny fampiasana antikôra monoklonal alefa any amin'ny rindrin'ny sela glycan. Ny ampahany "tsy miandany" dia ny ampahany ACN ary ny ampahany "asidra" dia ny ampahany FA. Ny mena mamiratra kokoa eo amin'ny sarintany hafanana dia manondro votoaty epitope ambony kokoa, ary ny manga mamiratra kokoa dia manondro ambadika banga. Ny sandan'ny loko eo amin'ny mizana dia mifototra amin'ny sandan'ny OD manta ho an'ny raikipohy N=2. Ny epitope lehibe fantatry ny antikôra dia aseho eo ankavanana.
Ireo rafitra tsy misy selulosa ireo dia tsy azo notapahin'ireo selazy sy hemiselulosa mahazatra indrindra ao amin'ny fangaroan'ny anzima ara-barotra nosedraina, izay ahitana ireo anzima ara-barotra ampiasaina matetika indrindra. Noho izany, ilaina ny anzima mpanampy vaovao amin'ny hidiran'izy ireo anaty rano. Raha tsy misy ireo anzima fanampiny tsy misy selulosa ilaina, ireo fatorana tsy misy selulosa ireo dia manakana ny fiovam-po tanteraka ho monosaccharides, na dia voahidrolyzy be aza ny pôlimera siramamy ray aman-dreniny ho sombintsombiny fohy kokoa ary levona amin'ny alàlan'ny fangaroan'ny anzima ara-barotra.
Ny fandalinana fanampiny momba ny fizarana ny famantarana sy ny tanjaky ny fifamatorany dia naneho fa ny epitopes fifamatorany dia ambany kokoa amin'ny ampahany siramamy DP avo lenta (A, B, C, DP hatramin'ny 20+) noho ny amin'ny ampahany DP ambany (D, E, F, DP) ao amin'ny dimer) (Sary 1). Ny sombin-asidra dia mahazatra kokoa amin'ny epitopes tsy cellulose noho ny sombin-javatra tsy miandany. Ireo trangan-javatra ireo dia mifanaraka amin'ny lamina hita tamin'ny fandalinanay teo aloha, izay ny DP avo lenta sy ny ampahany asidra dia mahatohitra kokoa ny hydrolysis anzima. Noho izany, ny fisian'ny epitopes glycan tsy cellulose sy ny fanoloana U sy MeU dia afaka mandray anjara betsaka amin'ny fahamarinan'ny oligosaccharides. Tsara homarihina fa ny fahombiazan'ny fifamatorany sy ny fitadiavana dia mety ho olana ho an'ny oligosaccharides DP ambany, indrindra raha oligosaccharide dimeric na trimeric ny epitope. Azo andramana izany amin'ny fampiasana oligosaccharides ara-barotra amin'ny halavany samihafa, izay samy misy epitope iray ihany izay mifamatotra amin'ny mAb manokana.
Noho izany, ny fampiasana antikôra manokana amin'ny rafitra dia naneho karazana fatorana tsy mety miova. Miankina amin'ny karazana antikôra ampiasaina, ny lamina fatorana mety, ary ny tanjaky ny famantarana vokariny (ny ankamaroany sy ny tsy dia betsaka), dia azo fantarina sy ampiana amin'ny fomba semi-quantitative amin'ny fangaroan'ny anzima ny anzima vaovao mba hahazoana glycoconversion feno kokoa. Raha raisina ho ohatra ny famakafakana ny oligosaccharides ACSH, dia afaka mamorona tahiry momba ny fatorana glycan ho an'ny fitaovana biomass tsirairay isika. Tsara homarihina eto fa tokony hojerena ny fahasamihafan'ny antikôra, ary raha tsy fantatra ny fahasamihafan'izy ireo, dia hiteraka fahasarotana sasany izany rehefa mampitaha ny famantarana ny anzima samihafa. Ankoatra izany, ny fampitahana ny fatorana glycan dia mety hiasa tsara indrindra eo amin'ny santionany ho an'ny antibody mitovy. Ireo fatorana mafy loha ireo dia azo ampifandraisina amin'ny tahiry CAZyme, izay ahafahantsika mamantatra ny anzima, mifantina anzima kandidà ary manandrana ny anzima manapaka fatorana, na mamolavola rafitra mikraoba mba hanehoana ireo anzima ireo hampiasaina amin'ny biorefineries44.
Mba hanombanana ny fomba famenon'ny fomba imunolojika ireo fomba hafa amin'ny famaritana ireo oligosaccharides lanja molekiola ambany hita ao amin'ny hydrolysates lignocellulosic, dia nanao MALDI (Sary 4, S1-S8) sy fanadihadiana ireo saccharides avy amin'ny TMS mifototra amin'ny GC-MS eo amin'ny ampahany oligosaccharide mitovy (Sary 5) izahay. Ampiasaina ny MALDI mba hampitahana raha mifanaraka amin'ny rafitra kasaina hatao ny fizarana ny lanjan'ny molekiola oligosaccharide. Ao amin'ny sary 4 dia mampiseho ny MC an'ireo singa tsy miandany ACN-A sy ACN-B. Ny fanadihadiana ACN-A dia nanamafy karazana siramamy pentose manomboka amin'ny DP 4–8 (Sary 4) ka hatramin'ny DP 22 (Sary S1), izay mifanandrify amin'ny oligosaccharides MeU-xylan ny lanjany. Ny fanadihadiana ACN-B dia nanamafy ny andian-dahatsoratra pentose sy glucoxylan miaraka amin'ny DP 8-15. Ao amin'ny fitaovana fanampiny toy ny Sary S3, ny sarintany fizarana ny lanjan'ny ampahany asidra FA-C dia mampiseho karazana siramamy pentose nosoloina (Me)U miaraka amin'ny DP 8-15 izay mifanaraka amin'ny xylans nosoloina hita amin'ny fitiliana mAb mifototra amin'ny ELISA. Mitovy ny epitopes.
Karazana MALDI-MS amin'ny oligosaccharides tsy mifanaraka amin'ny fenitra mety levona hita ao amin'ny ACS. Eto, (A) Ampahany ACN-A misy oligosaccharides glucuroxylan nosoloina asidra uronika metilasita (DP 4-8) ary (B) ACN-B xylan sy oligosaccharides asidra uronika metilasita nosoloina glucuroxylan (DP 8-15).
Famakafakana ny firafitry ny sisa tavela amin'ny glycan amin'ny oligosaccharides refractory. Eto (A) Firafitry ny TMS saccharide amin'ny ampahan'ny oligosaccharide isan-karazany azo avy amin'ny fanadihadiana GC-MS. (B) Rafitry ny siramamy avy amin'ny TMS isan-karazany hita ao amin'ny oligosaccharides. ACN - ampahan'ny acetonitrile misy oligosaccharides tsy miandany ary FA - ampahan'ny asidra ferulic misy oligosaccharides asidra.
Nisy fehin-kevitra mahaliana iray hafa nalaina avy amin'ny fanadihadiana LC-MS momba ny ampahany oligosaccharide, araka ny aseho amin'ny Sary S9 (hita ao amin'ny fitaovana fanampiny elektronika ny fomba fiasa). Hita imbetsaka ny sombin-javatra avy amin'ny vondrona hexose sy -OAc nandritra ny fametahana ny ampahany ACN-B. Tsy vitan'ny hoe manamafy ny fizarazarana hita tamin'ny fanadihadiana glycome sy MALDI-TOF fotsiny ity zavatra hita ity, fa manome fampahalalana vaovao momba ny mety ho vokatry ny gliosida ao amin'ny biomass lignocellulosic efa notsaboina mialoha ihany koa.
Nodinihinay ihany koa ny firafitry ny siramamy ao amin'ny ampahany oligosaccharide amin'ny alàlan'ny TMS derivatization siramamy. Tamin'ny fampiasana GC-MS, dia voafaritray ny firafitry ny siramamy neural (tsy derivative) sy asidra (GluA sy GalA) ao amin'ny ampahany oligosaccharide (Sary 5). Ny asidra glucuronic dia hita ao amin'ny singa asidra C sy D, raha ny asidra galacturonic kosa dia hita ao amin'ny singa asidra A sy B, izay samy singa DP avo lenta amin'ny siramamy asidra. Ireo valiny ireo dia tsy vitan'ny hoe manamafy ny angon-drakitra ELISA sy MALDI anay, fa mifanaraka amin'ny fanadihadianay teo aloha momba ny fanangonan'ny oligosaccharide ihany koa. Noho izany, mino izahay fa ny fomba immunological maoderina mampiasa biotinylation ny oligosaccharides sy ny sivana ELISA manaraka dia ampy hamantarana ny oligosaccharides recalcitrant mety levona amin'ny santionany biolojika isan-karazany.
Koa satria efa nohamarinina tamin'ny fomba maro samihafa ny fomba fitiliana mAb mifototra amin'ny ELISA, dia tianay ny handinika bebe kokoa ny mety ho vitan'ity fomba fitiliana vaovao ity. Oligosaccharides ara-barotra roa, xylohexasaccharide oligosaccharide (XHE) sy 23-α-L-arabinofuranosyl-xylotriose (A2XX), no novidina ary nosedraina tamin'ny fampiasana fomba fiasa mAb vaovao mikendry ny glycan rindrin'ny sela. Ny Sary 6 dia mampiseho fifandraisana linear eo amin'ny famantarana fifandraisana biotinylated sy ny fifantohana log an'ny fifantohana oligosaccharide, izay manondro ny mety ho modely adsorption Langmuir. Anisan'ireo mAbs, ny CCRC-M137, CCRC-M138, CCRC-M147, CCRC-M148, ary CCRC-M151 dia mifandray amin'ny XHE, ary ny CCRC-M108, CCRC-M109, ary LM11 dia mifandray amin'ny A2XX amin'ny elanelana 1 nm ka hatramin'ny 100 nano. Noho ny tsy fahampian'ny antibodies nandritra ny fanandramana, dia voafetra ny fanandramana natao tamin'ny fifantohana oligosaccharide tsirairay. Tsara homarihina eto fa misy antikôra sasany mihetsika amin'ny fomba hafa amin'ny oligosaccharide mitovy amin'ny substrate, angamba satria mifamatotra amin'ny epitopes somary hafa kely izy ireo ary mety manana fifandraisana mifamatotra samihafa. Ho sarotra kokoa ny fomba fiasa sy ny fiantraikan'ny famantarana marina ny epitope rehefa ampiharina amin'ny santionany tena izy ny fomba fiasa mAb vaovao.
Oligosaccharides ara-barotra roa no nampiasaina mba hamaritana ny elanelan'ny fahitana ireo mAbs isan-karazany mikendry glycan. Eto, ny fifandraisana lineary miaraka amin'ny fifantohana log amin'ny fifantohana oligosaccharide dia manondro ny lamina adsorption Langmuir ho an'ny (A) XHE miaraka amin'ny mAb sy (B) A2XX miaraka amin'ny mAb. Ny epitopes mifandraika amin'izany dia manondro ny rafitry ny oligosaccharides ara-barotra ampiasaina ho substrates amin'ny fanadihadiana.
Ny fampiasana antikôra monoklonal mikendry ny glycan (fanadihadiana glycocomic na ny fitiliana mAb mifototra amin'ny ELISA) dia fitaovana mahery vaika ho an'ny famaritana lalina ny ankamaroan'ny glycans lehibe ao amin'ny rindrin'ny sela izay mandrafitra ny biomass an'ny zavamaniry. Na izany aza, ny fanadihadiana glycan klasika dia mamaritra ny glycans lehibe kokoa ao amin'ny rindrin'ny sela ihany, satria ny ankamaroan'ny oligosaccharides dia tsy voafehy tsara amin'ny takelaka ELISA. Ato amin'ity fandalinana ity, ny sôkôla katsaka efa notsaboina tamin'ny AFEX dia nohidrolyzed tamin'ny alalan'ny anzima tamin'ny votoatin'ny solids avo lenta. Nampiasaina ny fanadihadiana siramamy mba hamaritana ny firafitry ny gliosida rindrin'ny sela recalcitrant ao amin'ny hydrolyzate. Na izany aza, ny fanadihadiana mAb momba ny oligosaccharides kely kokoa ao amin'ny hydrolysates dia tsy dia nojerena loatra, ary ilaina ny fitaovana fanampiny mba hampijanonana tsara ny oligosaccharides amin'ny takelaka ELISA.
Eto izahay dia mitatitra fomba vaovao sy mahomby amin'ny fampihenana ny oligosaccharide amin'ny alalan'ny fitiliana mAb amin'ny alalan'ny fampifangaroana ny biotinylation oligosaccharide arahin'ny fitiliana ELISA amin'ny takelaka voarakotra NeutrAvidin™. Ny oligosaccharides biotinylated tsy mihetsika dia naneho fifandraisana ampy amin'ny antibody mba ahafahana mamantatra haingana sy mahomby ny oligosaccharides mafy loha. Ny famakafakana ny firafitry ny oligosaccharides mafy loha ireo mifototra amin'ny spectrometry faobe dia nanamafy ny vokatry ny fomba fiasa vaovao amin'ny fitiliana immunoscreening. Noho izany, ireo fanadihadiana ireo dia mampiseho fa ny fampifangaroana ny biotinylation oligosaccharide sy ny fitiliana ELISA miaraka amin'ny antibody monoclonal mikendry glycan dia azo ampiasaina hamantarana ny fifandraisana mivantana amin'ny oligosaccharides ary azo ampiharina betsaka amin'ny fanadihadiana biochemika hafa izay mamaritra ny rafitry ny oligosaccharides.
Ity fomba fanaovana profil glycan mifototra amin'ny biotin ity no tatitra voalohany afaka manadihady ny fifamatoran'ny gliosida tsy mety levona amin'ny oligosaccharides mety levona ao amin'ny biomass an'ny zavamaniry. Izany dia manampy amin'ny fahatakarana ny antony mahatonga ny ampahany sasany amin'ny biomass ho mafy loha rehefa resaka famokarana solika biolojika. Ity fomba ity dia mameno ny banga lehibe amin'ny fomba famakafakana glycome ary manitatra ny fampiharana azy amin'ny karazana substrates midadasika kokoa ankoatra ny oligosaccharides an'ny zavamaniry. Amin'ny ho avy, mety hampiasa robotika ho an'ny biotinylation isika ary hampiasa ny fomba novolavolainay ho an'ny famakafakana avo lenta amin'ny santionany amin'ny alàlan'ny ELISA.
Nojinjaina tamin'ny taona 2010 avy amin'ny Kramer Farms any Ray, Colorado ny mololo katsaka (CS) novolena avy amin'ny voa hybride Pioneer 33A14. Noho ny fahazoan-dàlana avy amin'ny tompon-tany, ity biomass ity dia azo ampiasaina amin'ny fikarohana. Notehirizina tao anaty kitapo misy zip-lock maina latsaky ny 6% ny hamandoana tao anaty mari-pana ao an-trano ireo santionany. Notehirizina tao anaty kitapo misy zip-lock maina latsaky ny 6% ny hamandoana tao anaty mari-pana ao an-trano ireo santionany. Образцы хранились сухими при влажности < 6% amin'ny пакетах с застежкой-молнией при комнатной температуре. Notehirizina tao anaty kitapo misy zipo sy mari-pana ao an-trano ireo santionany, maina amin'ny hamandoana latsaky ny 6%.样品在室温下以干燥< 6% 的水分储存在自封袋中。样品在室温下以干燥< 6% Образцы хранят в пакетах с застежкой-молнией при комнатной температуре с влажностью < 6%. Tehirizina ao anaty kitapo misy zipo ny santionany amin'ny mari-pana ao an-trano miaraka amin'ny hamandoana latsaky ny 6%.Nanaraka ny torolàlana eo an-toerana sy nasionaly ny fandalinana. Natao tamin'ny alalan'ny protocole NREL ny fanadihadiana momba ny firafitry ny akora. Hita fa misy glucan 31.4%, xylan 18.7%, arabinan 3.3%, galactan 1.2%, acetyl 2.2%, lignin 14.3%, proteinina 1.7% ary lavenona 13.4% ny firafitry ny akora.
Ny Cellic® CTec2 (proteinina 138 mg/ml, lot VCNI 0001) dia fangaro sarotra misy cellulase, β-glucosidase ary Cellic® HTec2 (proteinina 157 mg/ml, lot VHN00001) avy amin'ny Novozymes (Franklinton, NC, Etazonia)). Ny Multifect Pectinase® (proteinina 72 mg/mL), fangaro sarotra misy anzima manimba pectin, dia nomen'ny DuPont Industrial Biosciences (Palo Alto, CA, Etazonia). Ny fifantohan'ny proteinina anzima dia voafaritra tamin'ny alàlan'ny fanombanana ny votoatin'ny proteinina (ary ny fanesorana ny anjara asan'ny azota tsy proteinina) tamin'ny alàlan'ny fampiasana ny fanadihadiana azota Kjeldahl (fomba AOAC 2001.11, Dairy One Cooperative Inc., Ithaca, NY, Etazonia). Ny tany diatomaceous 545 dia novidina avy amin'ny EMD Millipore (Billerica, MA). Novidina tao amin'ny Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) ny arina mavitrika (DARCO, granules 100 mesh), Avicel (PH-101), beech xylan, ary ireo akora simika hafa rehetra.
Natao tao amin'ny GLBRC (Biomass Conversion Research Laboratory, MSU, Lansing, MI, Etazonia) ny fitsaboana mialoha ny AFEX. Natao nandritra ny 15 minitra tamin'ny 140° C ny fitsaboana mialoha, fotoana fijanonana 46 minitra tamin'ny tahan'ny 1:1 amin'ny amoniaka tsy misy rano amin'ny biomass amin'ny 60% (w/w) ao anaty reactor batch vy tsy misy harafesina (Parr Instruments Company). Naharitra 30 minitra izany. Nafindra tany amin'ny 140°C ny reactor ary navoaka haingana ny amoniaka, ka nahafahan'ny biomass niverina haingana tamin'ny mari-pana ao amin'ny efitrano. Mitovy amin'ny an'ny AFEX pre-treated corn stover (ACS) ny firafitry ny AFEX pre-treated corn stover (UT-CS).
Ny akora mivaingana ACSH 25% (w/w) avo lenta (eo amin'ny 8% eo ho eo ny dextran) no nomanina ho akora fanombohana ny famokarana oligosaccharides amin'ny ambaratonga lehibe. Ny hydrolysis anzima an'ny ACS dia natao tamin'ny fampiasana fangaro anzima ara-barotra izay ahitana Cellic® Ctec2 10 mg proteinina/g glucan (ao anaty biomass efa voatsabo), Htec2 (Novozymes, Franklinton, NC), 5 mg proteinina/g glucan, ary Multifect Pectinase (Genencor Inc, Etazonia). ), 5 mg proteinina/g dextran. Ny hydrolysis anzima dia natao tao anaty bioreactor 5 litatra miaraka amin'ny volume miasa 3 litatra, pH 4.8, 50°C ary 250 rpm. Rehefa avy hydrolysis nandritra ny 96 ora, ny hydrolyzate dia nangonina tamin'ny alàlan'ny centrifugation tamin'ny 6000 rpm nandritra ny 30 minitra ary avy eo tamin'ny 14000 rpm nandritra ny 30 minitra mba hanesorana ny zavatra mivaingana tsy hydrolyzed. Avy eo dia nosivanina tamin'ny alalan'ny vera sivana 0.22 mm ny hydrolyzate. Notehirizina tao anaty tavoahangy sterile tamin'ny 4° C ny hydrolyzate voasivana ary avy eo dia nozaraina tamin'ny karbônina.
Famakafakana ny firafitry ny santionan'ny biomass mifototra amin'ny fitrandrahana araka ny fomba famakafakana laboratoara NREL: fanomanana ny santionany ho an'ny famakafakana ny firafitry ny akora (NREL/TP-510-42620) ary famaritana ny gliosida ara-drafitra sy ny lignin ao amin'ny biomass (NREL/TP-510 - 42618)47.
Natao tamin'ny mizana 2 ml ny famakafakana oligosaccharide tamin'ny reniranon'ny hydrolyzate tamin'ny fampiasana fomba hydrolyse asidra mifototra amin'ny autoclave. Afangaro amin'ny asidra solifara 72% 69.7 µl ao anaty fantsona fambolena misy satroka visy 10 ml ny santionan'ny hydrolyzate ary atsobohy mandritra ny 1 ora eo ambony latabatra amin'ny 121 °C, avela hangatsiaka amin'ny ranomandry ary sivana ao anaty tavoara chromatography ranoka avo lenta (HPLC). Ny fifantohan'ny oligosaccharides dia voafaritra tamin'ny fanesorana ny fifantohan'ny monosaccharides ao amin'ny santionany tsy hydrolyzed amin'ny fifantohan'ny siramamy manontolo ao amin'ny santionany hydrolyzed asidra.
Nodinihina tamin'ny alalan'ny rafitra Shimadzu HPLC misy autosampler, fanafanana tsanganana, paompy isokratika, ary mpitsikilo fanondroana refractive amin'ny tsanganana Bio-Rad Aminex HPX-87H ny fifantohana gliokaozy, xylose, ary arabinose. Nohazonina tamin'ny 50°C ny tsanganana ary nodiovina tamin'ny rano 0.6 ml/min 5 mM H2SO4.
Nohavaozina ny ranoka hydrolyzate ary nohadihadiana ny votoatin'ny monomer sy oligosaccharide. Ny siramamy monomerika azo avy amin'ny hydrolysis anzima dia nohadihadiana tamin'ny alalan'ny HPLC izay nampiana tsanganana Bio-Rad (Hercules, CA) Aminex HPX-87P sy tsanganana fiarovana lavenona. Notazonina tamin'ny 80°C ny mari-pana tsanganana, ary nampiasaina ho dingana finday ny rano miaraka amin'ny tahan'ny fikorianan'ny rano 0.6 ml/min. Ny oligosaccharides dia voafaritra tamin'ny alalan'ny hydrolysis tao anaty asidra levona tamin'ny 121°C araka ny fomba voalaza ao amin'ny refs. 41, 48, 49.
Natao tamin'ny AFEX manta, efa notsaboina mialoha sy ny sisa tavela amin'ny biomass tsy voahidrolyse rehetra (anisan'izany ny famokarana fitrandrahana rindrin'ny sela sy ny sivana mAb azy ireo) ny fanadihadiana Saccharide tamin'ny fampiasana fomba fiasa voalaza teo aloha 27, 43, 50, 51. Ho an'ny fanadihadiana glycome, ny sisa tavela amin'ny rindrin'ny sela zavamaniry tsy mety levona amin'ny alikaola dia nomanina avy amin'ny sisa tavela amin'ny biomass ary nosedraina tamin'ny alalan'ny reagents mahery vaika kokoa toy ny ammonium oxalate (50 mM), sodium carbonate (50 mM sy 0.5% w/v), CON. (1M sy 4M, samy misy sodium borohydride 1% w/v) ary asidra chlorite araka ny voalaza teo aloha 52,53. Avy eo dia nosedraina tamin'ny ELISA ireo fitrandrahana tamin'ny alalan'ny mAb50s maromaro nalefa tany amin'ny glycan rindrin'ny sela, ary naseho ho toy ny sarintany hafanana ny fihetsiky ny mAb. Ny mAbs mikendry ny glycan rindrin'ny sela zavamaniry dia novidina avy amin'ny tahiry laboratoara (CCRC, JIM ary MAC series).
Biotinylation dingana iray amin'ny oligosaccharides. Ny fampifangaroana gliosida amin'ny biotin-LC-hydrazide dia natao tamin'ny alalan'ity fomba fiasa manaraka ity. Ny Biotin-LC-hydrazide (4.6 mg/12 μmol) dia natsonika tao amin'ny dimethyl sulfoxide (DMSO, 70 μl) tamin'ny alalan'ny fikororohana mafy sy fanafanana tamin'ny 65° C nandritra ny 1 minitra. Nampiana asidra asetika glasiala (30 µl) ary nararaka teo amin'ny sodium cyanoborohydride (6.4 mg/100 µmol) ny fangaro ary natsonika tanteraka rehefa avy nafanaina tamin'ny 65° C nandritra ny 1 minitra teo ho eo. Avy eo, 5 ka hatramin'ny 8 μl amin'ny fangaro fihetsika no nampiana tamin'ny oligosaccharide maina (1-100 nmol) mba hahazoana molar mihoatra ny 10 heny na mihoatra amin'ny marika eo ambonin'ny tendrony mampihena. Natao tamin'ny 65°C nandritra ny 2 ora ny fihetsika, ary avy eo dia nodiovina avy hatrany ireo santionany. Tsy nisy sodium cyanoborohydride nampiasaina tamin'ny andrana fametrahana marika raha tsy nisy fampihenana, ary narahina tamin'ny 65° C nandritra ny 2.5 ora ireo santionany.
Fandrakofana sy fanasana santionan'ny oligosaccharides biotinylated amin'ny alalan'ny ELISA. Nampiana santionany biotinylated 25 μl (100 μl amin'ny santionany mifantoka tsirairay afangaro amin'ny vahaolana buffer Tris 0.1 M (TBS) 5 ml) tao amin'ny lavaka tsirairay amin'ny takelaka voarakotra avidin. Norakofana biotin 50 μl amin'ny fifantohana 10 μg/ml ao anaty TBS 0.1 M ny lavaka fanaraha-maso. Nampiasaina ho toy ny fandrakofana ho an'ny fandrefesana blank ny rano deionized. Notehirizina nandritra ny 2 ora tamin'ny mari-pana ao an-trano tao anaty haizina ny takelaka. Sasao in-3 amin'ny ronono tsy matavy 0.1% ao anaty TBS 0.1 M ny takelaka amin'ny fampiasana ny fandaharana laharana 11 ho an'ny Grenier flat 3A.
Fanampiana sy fanasana ireo antikôra voalohany. Ampio 40 µl amin'ny antikôra voalohany ao anaty lavaka tsirairay. Avela hilona mandritra ny adiny 1 amin'ny mari-pana ao an-trano ao anaty haizina ny takelaka kely. Avy eo dia nosasana intelo tamin'ny ronono 0.1% tao anaty TBS 0.1M ireo takelaka tamin'ny fampiasana ny programa fanasana #11 ho an'ny Grenier Flat 3A.
Ampio antikôra faharoa ary sasao. Ampio 50 µl antibody faharoa avy amin'ny totozy/voalavo (nafangaro 1:5000 tamin'ny ronono 0.1% tao anaty fitoeran-javatra 0.1 M) ao anaty lavaka tsirairay. Avela hilona mandritra ny 1 ora ao anaty haizina amin'ny mari-pana ao an-trano ny takelaka kely. Avy eo dia nosasana in-5 tamin'ny ronono 0.1% tao anaty fitoeran-javatra 0.1 M ireo takelaka kely tamin'ny fampiasana ny programa fanasana takelaka Grenier Flat 5A #12.
Manampy substrate. Ampio 50 µl ny 3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine (TMB) amin'ny substrate fototra (amin'ny fanampiana buffer 2 mitete, TMB 3 mitete, peroxyde hydrogène 2 mitete amin'ny rano deionized 15 ml). Omano ny substrate TMB. ary afangaro amin'ny vortex alohan'ny hampiasana azy). Avela hilona amin'ny mari-pana ao an-trano mandritra ny 30 minitra ny microplate. Ao anaty haizina.
Fenoy ny dingana ary vakio ny takelaka. Ampio asidra solifara 1 N 50 µl ao anaty lavaka tsirairay ary soraty ny fidiran'ny rano avy amin'ny 450 ka hatramin'ny 655 nm amin'ny fampiasana mpamaky ELISA.
Manomàna vahaolana 1 mg/ml amin'ireto analyta ireto ao anaty rano deionized: arabinose, rhamnose, fucose, xylose, galacturonic acid (GalA), glucuronic acid (GlcA), mannose, glucose, galactose, lactose, N-acetylmannosamine (manNAc), N-acetylglucosamine (glcNAc), N-acetylgalactosamine (galNAc), inositol (fenitra anatiny). Nisy fenitra roa nomanina tamin'ny fanampiana ireo vahaolana siramamy 1 mg/mL aseho ao amin'ny Tabilao 1. Ampangatahina ireo santionany ary tehirizina ao anaty vata fampangatsiahana amin'ny -80° C mandra-pahalasan'ny rano rehetra (matetika eo amin'ny 12-18 ora eo ho eo).
Ampio santionany 100–500 µg amin'ny fantsona misy sarony visy eo amin'ny mizana famakafakana. Soraty ny habetsahana nampiana. Tsara kokoa ny manalefaka ny santionany amin'ny fifantohana solvent manokana ary ampio ao anaty fantsona toy ny ranoka aliquot. Ampiasao 20 µl amin'ny inositol 1 mg/ml ho fenitra anatiny ho an'ny fantsona santionany tsirairay. Ny habetsahan'ny fenitra anatiny ampiana amin'ny santionany dia tsy maintsy mitovy amin'ny habetsahan'ny fenitra anatiny ampiana amin'ny fantsona mahazatra.
Ampio methanol tsy misy rano 8 ml ao anaty tavoara kely misy sarony visy. Avy eo dia ampio 4 ml amin'ny vahaolana methanolic HCl 3 N, sarony ary hozongozonina. Tsy mampiasa rano ity dingana ity.
Ampio vahaolana methanol 1 M HCl 500 µl amin'ny santionany oligosaccharide sy ny fantsona TMS mahazatra. Notehirizina nandritra ny alina (168 ora) tamin'ny 80° C tao anaty sakana mafana ireo santionany. Amainina amin'ny mari-pana ao an-trano ny vokatra metanolyzy amin'ny fampiasana fitaovana fanamainana. Ampio MeOH 200 µl ary amainina indray. Averina indroa ity dingana ity. Ampio methanol 200 µl, pyridine 100 µl ary acetic anhydride 100 µl amin'ny santionany ary afangaro tsara. Notehirizina tamin'ny mari-pana ao an-trano nandritra ny 30 minitra ireo santionany ary nohamainina. Ampio methanol 200 µl ary amainina indray.
Ampio Tri-Sil 200 µl ary hafanaina mandritra ny 20 minitra ny fantsona misy sarony. 80°C, avy eo ampangatsiahina amin'ny mari-pana ao an-trano. Ampiasao ny fitaovana fanamainana mba hanamainana bebe kokoa ny santionany hatramin'ny 50 µl eo ho eo. Tsara homarihina fa tsy navelantsika ho maina tanteraka ny santionany.
Ampio hexane 2 ml ary afangaro tsara amin'ny alalan'ny vortexing. Fenoy sombin-taratasy fitaratra ny tendron'ny pipettes Pasteur (5-8 mm) amin'ny alàlan'ny fampidirana ny taratasy fitaratra eo ambonin'ny pipettes 5-3/4 inch ny savaivony. Notsindrina tamin'ny centrifuge tamin'ny 3000 g nandritra ny 2 minitra ny santionany. Arotsaka ny sisa tavela tsy mety levona. Amainina hatramin'ny 100-150 µl ny santionany. Natsofoka tao amin'ny GC-MS ny habetsahana eo amin'ny 1 μl eo ho eo tamin'ny mari-pana voalohany 80 °C ary tamin'ny fotoana voalohany 2.0 minitra (Tabilao 2).