Nature.com ကိုလာရောက်လည်ပတ်တဲ့အတွက် ကျေးဇူးတင်ပါတယ်။သင်အသုံးပြုနေသောဘရောက်ဆာဗားရှင်းတွင် CSS ပံ့ပိုးမှုအကန့်အသတ်ရှိသည်။အကောင်းဆုံးအတွေ့အကြုံအတွက်၊ အပ်ဒိတ်လုပ်ထားသောဘရောက်ဆာ (သို့မဟုတ် Internet Explorer တွင် လိုက်ဖက်ညီသောမုဒ်ကိုပိတ်ပါ) ကိုအသုံးပြုရန် ကျွန်ုပ်တို့အကြံပြုအပ်ပါသည်။ဤအတောအတွင်း၊ ဆက်လက်ပံ့ပိုးမှုသေချာစေရန်၊ ပုံစံများနှင့် JavaScript မပါဘဲ ဝဘ်ဆိုက်ကို တင်ဆက်ပါမည်။
AFEX နှင့် ကြိုတင်ပြင်ဆင်ထားသော ပြောင်းဖူးမီးဖိုရှိ အဆက်မပြတ် oligosaccharides များ၏ ရှုပ်ထွေးသောခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုအတွက် ခုခံအားစနစ်နှင့် အစုလိုက်အပြုံလိုက် တိုင်းတာမှုနည်းလမ်းအသစ်များ။Lignocellulosic biomass သည် ရုပ်ကြွင်းလောင်စာများအတွက် ရေရှည်တည်တံ့သော အစားထိုးတစ်မျိုးဖြစ်ပြီး အစားအစာ၊ အစာ၊ လောင်စာနှင့် ဓာတုပစ္စည်းများကဲ့သို့သော ထုတ်ကုန်များထုတ်လုပ်ရန်အတွက် ဇီဝနည်းပညာများကို ဖွံ့ဖြိုးတိုးတက်စေရန် တွင်ကျယ်စွာအသုံးပြုပါသည်။ဤနည်းပညာများ၏သော့ချက်မှာ အပင်ဆဲလ်နံရံများတွင်ရှိသော ရှုပ်ထွေးသောကာဗိုဟိုက်ဒရိတ်များကို ဂလူးကို့စ်၊ xylose နှင့် arabinose ကဲ့သို့သော ရိုးရိုးသကြားများအဖြစ်သို့ ပြောင်းလဲရန်အတွက် ကုန်ကျစရိတ်-အပြိုင်အဆိုင်လုပ်ငန်းစဉ်များ ဖွံ့ဖြိုးတိုးတက်လာခြင်းဖြစ်သည်။lignocellulosic biomass သည် အလွန်မာကျောသောကြောင့်၊ ၎င်းကို အပူချိန်ထိန်းညှိခြင်း (ဥပမာ၊ အမိုးနီးယားဖိုက်ဘာဖယ်ရှားခြင်း (AFEX)၊ dilute acids (DA)၊ ionic liquids (IL)) နှင့် ဇီဝကုသမှုများ (ဥပမာ၊ enzymatic hydrolysis နှင့် microbial fermentation) တို့ကို ပေါင်းစပ်၍ လိုချင်သောထုတ်ကုန်ကို ရယူရပါမည်။.သို့သော်၊ စီးပွားဖြစ်မှိုသတ်ဆေးအင်ဇိုင်းများကို hydrolysis လုပ်ငန်းစဉ်တွင်အသုံးပြုသောအခါ၊ ဖြစ်ပေါ်လာသောပျော်ဝင်နိုင်သောသကြားများ၏ 75-85% သည် monosaccharides များဖြစ်ပြီး ကျန် 15-25% သည် အဏုဇီဝသက်ရှိများအတွက် အမြဲမရရှိနိုင်သော ပျော်ဝင်နိုင်သော၊ ဆွဲဆောင်နိုင်သော oligosaccharides များဖြစ်သည်။ယခင်က၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် ကာဗွန်နှင့် diatomaceous earth ခွဲထုတ်ခြင်းနှင့် အရွယ်အစားဖယ်ထုတ်ခြင်း chromatography တို့ကို ပေါင်းစပ်အသုံးပြု၍ ပျော်ဝင်နိုင်သော ခေါင်းမာသော oligosaccharides များကို အောင်မြင်စွာခွဲထုတ်ပြီး သန့်စင်ပြီး ၎င်းတို့၏ အင်ဇိုင်းတားဆီးခြင်းဆိုင်ရာ ဂုဏ်သတ္တိများကို စူးစမ်းလေ့လာခဲ့သည်။ပိုလီမာဖြစ်စေခြင်း (DP) မီသိုင်းလိတ်ယူရိုနစ်အက်ဆစ်အစားထိုးမှုများပါ၀င်သော oligosaccharides များသည် DP နည်းပါးပြီး ကြားနေ oligosaccharides များထက် စီးပွားဖြစ်အင်ဇိုင်းရောစပ်မှုများဖြင့် လုပ်ဆောင်ရန် ပို၍ခက်ခဲသည်ကို ကျွန်ုပ်တို့တွေ့ရှိခဲ့သည်။ဤတွင် ကျွန်ုပ်တို့သည် အပင်ဆဲလ်နံရံများနှင့် အင်ဇိုင်းမက်တစ် ဟိုက်ဒရိုလစ်ဆိတ်များ၊ matrix-assisted laser desorption ionization၊ time-of-flight mass-spectrometry ကိုဖော်ပြရန်အတွက် ဇီဝလောင်စာ glycans များကိုအသုံးပြုရန်အတွက် monoclonal antibodies (mAbs) ကိုအသုံးပြုခြင်း အပါအဝင် နောက်ထပ်နည်းလမ်းများစွာကို ကျွန်ုပ်တို့အစီရင်ခံပါသည်။.MALDI-TOF-MS) သည် အနုတ်လက္ခဏာဆောင်သော အိုင်းယွန်းများ၊ ဓာတ်ငွေ့ ခရိုမာတိုပညာနှင့် အစုလိုက်အပြုံလိုက် အစိတ်အပိုင်းများ (GC-MS) ၏နောက်ဆက်တွဲ ယိုယွင်းပျက်စီးပြီးနောက် spectroscopy မှရရှိသော ဖွဲ့စည်းပုံဆိုင်ရာ အချက်အလက်ရှာဖွေရေးအထွတ်အထိပ်များကို အသုံးပြုသည်။oligosaccharides (DP 4–20) ၏သေးငယ်သောအရွယ်အစားကြောင့်၊ ဤမော်လီကျူးများသည် mAb binding နှင့် characterization အတွက်အသုံးပြုရန်ခက်ခဲပါသည်။ဤပြဿနာကို ကျော်လွှားရန်အတွက်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် တိကျသော ligation ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုအတွက် မြင့်မားသော throughput mAb စနစ်တွင် အသုံးပြုခဲ့သည့် DP နိမ့်သောပျော်ဝင်နိုင်သော oligosaccharides အများစုကို microplate မျက်နှာပြင်ပေါ်တွင် အောင်မြင်စွာတံဆိပ်ကပ်ထားသည့် biotin conjugation-based oligosaccharide immobilization နည်းလမ်းအသစ်ကို အသုံးပြုခဲ့သည်။ဤနည်းလမ်းအသစ်သည် ရောဂါရှာဖွေရေးရည်ရွယ်ချက်များအတွက် biomarkers များတွင်ပါရှိသော oligosaccharides များကိုခွဲထုတ်ရန်နှင့် လက္ခဏာရပ်အဖြစ် အသုံးပြုနိုင်သည့် အနာဂတ်တွင် ပိုမိုအဆင့်မြင့်သော high throughput glycome assays များကို ဖွံ့ဖြိုးတိုးတက်စေမည်ဖြစ်သည်။
စိုက်ပျိုးရေး၊ သစ်တော၊ မြက်နှင့်သစ်သားပစ္စည်းများဖြင့် ဖွဲ့စည်းထားသည့် Lignocellulosic ဇီဝလောင်စာသည် အစားအစာ၊ အစားအစာ၊ လောင်စာဆီနှင့် ဓာတုဗေဒဆိုင်ရာ ရှေ့ပြေးနမိတ်များ အပါအဝင် ဇီဝအခြေခံထုတ်ကုန်များ ထုတ်လုပ်ရန်အတွက် အလားအလာရှိသော အစားအစာများဖြစ်သည်။အပင်ဆဲလ်နံရံများတွင်ပါရှိသော ကာဗိုဟိုက်ဒရိတ်များ (ဆဲလ်လူလိုစ့်နှင့် ဟီမီဆဲလ်လူလိုစ့်) ကို ဓာတုဗေဒလုပ်ဆောင်ခြင်းနှင့် ဇီဝအသွင်ပြောင်းခြင်း (အင်ဇိုင်းမက်တစ် ဟိုက်ဒရိုဂျင်နှင့် အဏုဇီဝအချဉ်ဖောက်ခြင်းကဲ့သို့) ဖြင့် မိုနိုဆာကာခရိုက်များအဖြစ် ခွဲထုတ်သည်။အသုံးများသော ကြိုတင်ကုသမှုများတွင် အမိုးနီးယားဖိုက်ဘာချဲ့ထွင်ခြင်း (AFEX)၊ အက်ဆစ်ပျော့ (DA)၊ အိုင်းယွန်းအရည် (IL)၊ နှင့် ရေနွေးငွေ့ပေါက်ကွဲမှု (SE) တို့သည် အပင်ဆဲလ်နံရံများဖွင့်ခြင်းဖြင့် လီနိုဆဲလ်လူလိုစ့်ထုတ်လုပ်မှုကို လျှော့ချရန် ဓာတုနှင့် အပူကို ပေါင်းစပ်အသုံးပြုသည့် ၃၊၄။ဒြပ်ထု၏ခိုင်မာခြင်း၊ 5. Enzymatic hydrolysis သည် ဇီဝအခြေခံလောင်စာများနှင့် ဓာတုပစ္စည်းများထုတ်လုပ်ရန် ဇီဝအခြေခံလောင်စာများနှင့် ဓာတုပစ္စည်းများထုတ်လုပ်ရန် 6 .
စီးပွားဖြစ်အင်ဇိုင်းများတွင် CAZymes သည် monosaccharides2,7 အဖြစ် ပေါင်းစပ်ထားသော ရှုပ်ထွေးသော ကာဗိုဟိုက်ဒရိတ်-သကြားနှောင်ကြိုးများကို ပေါင်းစပ်ထားသော ရှုပ်ထွေးသော အင်ဇိုင်းများ နှင့် ဖွဲ့စည်းထားသည်။အစောပိုင်းတွင်ကျွန်ုပ်တို့အစီရင်ခံခဲ့သည့်အတိုင်း၊ ဘိုဟိုက်ဒရိတ်ပါသော lignin ၏ရှုပ်ထွေးသောအမွှေးရနံ့ပိုလီမာများ၏ကွန်ရက်သည် ၎င်းတို့အား အလွန်အမင်းစိတ်မ၀င်စားစေဘဲ ပြီးပြည့်စုံသောသကြားအဖြစ်ပြောင်းလဲခြင်းဆီသို့ဦးတည်ကာ ပြုပြင်ထားသောဇီဝလောင်စာ၏အင်ဇိုင်း ဟိုက်ဒရိုလစ်ဇိုင်းတွင်မထုတ်လုပ်နိုင်သော လိင် oligosaccharides ၏ 15-25% စုစည်းနေပါသည်။ဤသည်မှာ ဇီဝလောင်စာပြုပြင်ခြင်းနည်းလမ်းအမျိုးမျိုးဖြင့် ဖြစ်ရိုးဖြစ်စဉ်ပြဿနာတစ်ခုဖြစ်သည်။ဤပိတ်ဆို့မှုအတွက် အချို့သော အကြောင်းရင်းများတွင် hydrolysis လုပ်နေစဉ် အင်ဇိုင်းတားစီးခြင်း သို့မဟုတ် အပင်ဇီဝလောင်စာတွင် သကြားချည်နှောင်ရန် လိုအပ်သော မရှိမဖြစ်လိုအပ်သော အင်ဇိုင်းများ မရှိခြင်း သို့မဟုတ် နည်းပါးခြင်း တို့ ပါဝင်ပါသည်။oligosaccharides ရှိသကြားနှောင်ကြိုးများကဲ့သို့သော သကြားများ၏ဖွဲ့စည်းပုံနှင့်ဖွဲ့စည်းပုံသွင်ပြင်လက္ခဏာများကိုနားလည်ခြင်းသည်ကျွန်ုပ်တို့အား hydrolysis လုပ်စဉ်သကြားအဖြစ်ပြောင်းလဲခြင်းကိုတိုးတက်စေပြီး၊ ဇီဝနည်းပညာဆိုင်ရာလုပ်ငန်းစဉ်များကိုရေနံမှရရှိသောထုတ်ကုန်များနှင့်ကုန်ကျစရိတ်-အပြိုင်အဆိုင်ဖြစ်စေသည်။
ကာဗိုဟိုက်ဒရိတ်ဖွဲ့စည်းပုံကို ဆုံးဖြတ်ခြင်းသည် စိန်ခေါ်မှုဖြစ်ပြီး အရည် ခရိုမာတိုဂရမ် (LC)11,12၊ နူကလီးယားသံလိုက်ပဲ့တင်ရိုက်ခတ်မှုဆိုင်ရာ spectroscopy (NMR)13၊ သွေးကြောမျှင် အီလက်ထရောနစ် (CE)14,15,16 နှင့် ဒြပ်ထုထည် (MS)17 ကဲ့သို့သော ပေါင်းစပ်နည်းလမ်းများ လိုအပ်ပါသည်။၊ဆယ့်ရှစ်။မက်ထရစ် (MALDI-TOF-MS) ကို အသုံးပြု၍ လေဆာ စုပ်ယူမှု နှင့် အိုင်းယွန်းဓာတ်ပြုခြင်း ဖြင့် ပျံသန်းချိန် အစုလိုက် အပြုံလိုက် spectrometry ကဲ့သို့သော MS နည်းလမ်းများသည် ကာဗိုဟိုက်ဒရိတ်ဖွဲ့စည်းပုံများကို ခွဲခြားသတ်မှတ်ရန် စွယ်စုံရနည်းလမ်းတစ်ခုဖြစ်သည်။မကြာသေးမီက၊ Collision-Induced Dissociation (CID) tandem MS of sodium ion adducts သည် oligosaccharide attachment positions၊ anomeric configurations၊ sequences နှင့် branching positions 20၊ 21 နှင့် သက်ဆိုင်သော လက်ဗွေများကို ဖော်ထုတ်ရန်အတွက် အကျယ်ပြန့်ဆုံးအသုံးပြုခဲ့သည်။
Glycan ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခြင်းသည် ကာဗိုဟိုက်ဒရိတ်နှောင်ကြိုးများ 22 ကို အတွင်းကျကျခွဲခြားသတ်မှတ်ခြင်းအတွက် အကောင်းဆုံးကိရိယာတစ်ခုဖြစ်သည်။ဤနည်းလမ်းသည် ရှုပ်ထွေးသော ကာဗိုဟိုက်ဒရိတ်ချိတ်ဆက်မှုများကို နားလည်ရန် ဆဲလ်နံရံ glycan စိုက်ရန် ညွှန်ကြားထားသည့် monoclonal antibodies (mAbs) ကို အသုံးပြုသည်။250 mAbs ထက်ပို၍ saccharides24 ကိုအသုံးပြု၍ အမျိုးမျိုးသော linear နှင့် branched oligosaccharides များကိုဆန့်ကျင်ဒီဇိုင်းပြုလုပ်ထားသောကမ္ဘာတစ်ဝှမ်းတွင်ရရှိနိုင်သည်။အပင်ဆဲလ်အမျိုးအစား၊ ကိုယ်တွင်းအင်္ဂါ၊ အသက်၊ ဖွံ့ဖြိုးမှုအဆင့်နှင့် ကြီးထွားမှုပတ်ဝန်းကျင် 25,26 တို့ပေါ်မူတည်၍ သိသာထင်ရှားသောကွာခြားချက်များရှိသောကြောင့် mAbs အများအပြားကို အပင်ဆဲလ်နံရံ၏ဖွဲ့စည်းပုံ၊ ဖွဲ့စည်းမှုနှင့် ပြုပြင်မွမ်းမံမှုများတွင် ကျယ်ကျယ်ပြန့်ပြန့်အသုံးပြုထားသည်။မကြာသေးမီက၊ အပင်နှင့် တိရိစ္ဆာန်စနစ်များရှိ vesicle လူဦးရေများကို နားလည်ရန်နှင့် subcellular အမှတ်အသားများ၊ ဖွံ့ဖြိုးမှုအဆင့်များ သို့မဟုတ် ပတ်ဝန်းကျင်လှုံ့ဆော်မှုဆိုင်ရာ လှုံ့ဆော်မှုများမှ ဆုံးဖြတ်ထားသည့်အတိုင်း glycan သယ်ယူပို့ဆောင်ရေးတွင် ၎င်းတို့၏ သက်ဆိုင်ရာအခန်းကဏ္ဍများကို နားလည်ရန်နှင့် enzymatic လုပ်ဆောင်ချက်ကို ဆုံးဖြတ်ရန်အတွက် အသုံးပြုခဲ့သည်။ခွဲခြားသတ်မှတ်ထားသော glycans နှင့် xylans ၏မတူညီသောဖွဲ့စည်းပုံအချို့တွင် pectin (P)၊ xylan (X)၊ mannan (M)၊ xyloglucans (XylG)၊ mixed bond glucans (MLG)၊ arabinoxylan (ArbX)၊ galactomannan (GalG) ၊ glucuronic acid-arabinoxylan (GArabino-galact) နှင့် 2.
သို့သော်၊ ဤသုတေသနပြုမှုများအားလုံးကြားမှ၊ oligosaccharide ထုတ်လွှတ်မှု၊ hydrolysis ကာလအတွင်း oligomeric ကွင်းဆက်အရှည်ပြောင်းလဲမှု၊ DP အမျိုးမျိုးသော DP ပိုလီမာများနှင့် ၎င်းတို့၏မျဉ်းကွေးများအပါအဝင် မြင့်မားသောအစိုင်အခဲဝန် (HSL) ဟိုက်ဒရိုလစ်စီအတွင်း oligosaccharide စုစည်းမှုသဘောသဘာဝကို လေ့လာမှုအနည်းငယ်ကသာ အာရုံစိုက်ထားသည်။ဖြန့်ချီရေး 30၊31၊32။ဤအတောအတွင်း၊ glycan ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုသည် glycan ဖွဲ့စည်းတည်ဆောက်ပုံကို ကျယ်ကျယ်ပြန့်ပြန့်ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာရန်အတွက် အသုံးဝင်သောကိရိယာတစ်ခုဖြစ်ကြောင်း သက်သေပြခဲ့သော်လည်း၊ ရေတွင်ပျော်ဝင်နိုင်သောနိမ့်သော DP oligosaccharides သည် ပဋိပစ္စည်းနည်းလမ်းများကို အသုံးပြု၍ အကဲဖြတ်ရန်ခက်ခဲသည်။5-10 kDa ထက်နည်းသော မော်လီကျူးအလေးချိန်ရှိသော DP oligosaccharides အသေးများသည် ELISA plates 33, 34 နှင့် ချည်နှောင်ခြင်းမပြုပါ၊ ပဋိပစ္စည်းမထည့်မီတွင် ဆေးကြောပါသည်။
ဤတွင်၊ ပထမအကြိမ်တွင်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် ပျော်ဝင်နိုင်သော refractory oligosaccharides နှင့် ပျော်ဝင်နိုင်သော refractory oligosaccharides များအတွက် glycome ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုနှင့်အတူ monoclonal antibodies ကိုအသုံးပြုကာ monoclonal antibodies များကိုအသုံးပြုကာ ELISA စစ်ဆေးမှုတစ်ခုကို သရုပ်ပြပါသည်။glycome ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခြင်းအတွက် ကျွန်ုပ်တို့၏ချဉ်းကပ်ပုံကို MALDI-TOF-MS နှင့် GC-MS အခြေပြု ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခြင်းဖြင့် hydrolyzed သကြားပါဝင်မှုများ၏ trimethylsilyl (TMS) မှဆင်းသက်လာခြင်းကို အသုံးပြု၍ ဖြည့်စွက် oligosaccharide linkages များကို အတည်ပြုခဲ့ပါသည်။ဤဆန်းသစ်တီထွင်သောချဉ်းကပ်မှုအား အနာဂတ်တွင် မြင့်မားသောနည်းလမ်းတစ်ခုအဖြစ် တီထွင်နိုင်ပြီး ဇီဝဆေးပညာသုတေသန35တွင် ပိုမိုကျယ်ပြန့်သောအသုံးချမှုကို ရှာဖွေနိုင်သည်။
glycosylation ကဲ့သို့သော အင်ဇိုင်းများနှင့် ပဋိပစ္စည်းများ၏ ပြုပြင်မွမ်းမံမှုများပြီးနောက်၊ 36 သည် ၎င်းတို့၏ ဇီဝကမ္မလုပ်ဆောင်မှုကို ထိခိုက်စေသည်။ဥပမာအားဖြင့်၊ သွေးရည်ကြည်ပရိုတင်းများ၏ glycosylation ပြောင်းလဲမှုများသည် ရောင်ရမ်းခြင်းအဆစ်အမြစ်ရောင်ခြင်းအတွက် အရေးကြီးသောအခန်းကဏ္ဍမှပါဝင်ပြီး glycosylation ပြောင်းလဲမှုများကို ရောဂါရှာဖွေရေးအမှတ်အသားများအဖြစ် အသုံးပြုပါသည်။အစာအိမ်နှင့် အူလမ်းကြောင်းနှင့် အသည်း၊ ဗိုင်းရပ်စ်ကူးစက်မှု၊ သားအိမ်၊ ရင်သားနှင့် ဆီးကျိတ်ကင်ဆာ ၃၈၊ ၃၉၊ ၄၀ အပါအဝင် ရောဂါအမျိုးမျိုးတွင် အလွယ်တကူပေါ်လာစေရန် အမျိုးမျိုးသော glycans များကို စာပေတွင် အစီရင်ခံထားသည်။ပဋိပစ္စည်းအခြေခံ glycan ELISA နည်းလမ်းများကို အသုံးပြု၍ glycans ၏ဖွဲ့စည်းပုံကိုနားလည်ခြင်းသည် ရှုပ်ထွေးသော MS နည်းလမ်းများကိုအသုံးမပြုဘဲ ရောဂါရှာဖွေခြင်းအတွက် ထပ်လောင်းယုံကြည်မှုပေးလိမ့်မည်။
ကျွန်ုပ်တို့၏ယခင်လေ့လာမှုအရ ခေါင်းမာသော oligosaccharides သည် ကြိုတင်ကုသခြင်းနှင့် enzymatic hydrolysis (ပုံ 1) ပြီးနောက် ရေဓာတ်မ၀င်ရောက်ကြောင်းပြသခဲ့သည်။ကျွန်ုပ်တို့၏ယခင်ထုတ်ဝေသည့်အလုပ်တွင်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် AFEX-pretreated ပြောင်းဖူး stover hydrolyzate (ACSH)8 မှ oligosaccharides ကိုခွဲထုတ်ရန်အတွက် အသက်သွင်းထားသောမီးသွေးအစိုင်အခဲအဆင့်ထုတ်ယူသည့်နည်းလမ်းကို တီထွင်ခဲ့သည်။ကနဦးထုတ်ယူခြင်းနှင့် ခွဲထုတ်ပြီးနောက်၊ oligosaccharides များကို အရွယ်အစားဖယ်ထုတ်ထားသော chromatography (SEC) ဖြင့် အပိုင်းပိုင်းခွဲကာ မော်လီကျူးအလေးချိန်အစီအစဥ်ဖြင့် စုဆောင်းခဲ့သည်။ပြုပြင်မှုအမျိုးမျိုးမှ ထွက်ရှိလာသော သကြားမိုနိုမာများနှင့် အိုလီဂိုမာများကို သကြားပါဝင်မှု ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခြင်းဖြင့် ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခဲ့သည်။အမျိုးမျိုးသောကြိုတင်ပြင်ဆင်မှုနည်းလမ်းများဖြင့်ရရှိသောသကြား oligomers ၏ပါဝင်မှုကိုနှိုင်းယှဉ်သောအခါတွင်၊ ခေါင်းမာသော oligosaccharides ပါဝင်မှုသည် biomass မှ monosaccharides အဖြစ်သို့ပြောင်းလဲခြင်းတွင်အဖြစ်များသောပြဿနာဖြစ်ပြီးသကြားအထွက်နှုန်းကိုအနည်းဆုံး 10-15% နှင့် 18% အထိလျှော့ချနိုင်သည်။အမေရိကန်။ဤနည်းလမ်းကို oligosaccharide အပိုင်းအစများ အကြီးစားထုတ်လုပ်မှုအတွက် အသုံးပြုသည်။ဤလုပ်ငန်းတွင် oligosaccharides ၏လက္ခဏာရပ်အတွက် ကွဲပြားသော မော်လီကျူးအလေးချိန်များရှိသော ရလဒ် ACH နှင့် ၎င်း၏နောက်ဆက်တွဲအပိုင်းအစများကို စမ်းသပ်ပစ္စည်းအဖြစ် အသုံးပြုခဲ့သည်။
ကြိုတင်ပြုပြင်ခြင်းနှင့် အင်ဇိုင်းဓာတ်အားဖြည့်ခြင်းပြီးနောက်၊ မြဲမြံသော oligosaccharides များသည် ရေဓာတ်မပြည့်ဝဘဲ ကျန်ရှိနေခဲ့သည်။ဤတွင် (A) သည် activated carbon နှင့် diatomaceous earth ထုပ်ပိုးထားသော အိပ်ရာကို အသုံးပြု၍ AFEX-pretreated corn stover hydrolyzate (ACSH) မှ oligosaccharides ကိုခွဲထုတ်သည့်နည်းလမ်းတစ်ခုဖြစ်သည်။(ခ) oligosaccharides ခွဲခြားနည်း။oligosaccharides ကို အရွယ်အစား ဖယ်ထုတ်ခြင်း chromatography (SEC) ဖြင့် ထပ်မံ ပိုင်းခြားထားပါသည်။(ဂ) ကြိုတင်ပြင်ဆင်မှုအမျိုးမျိုးမှထုတ်လွှတ်သော Saccharide monomers နှင့် oligomers (diluted acid- DA၊ ionic liquid- IL နှင့် AFEX)။Enzymatic hydrolysis အခြေအနေ- မြင့်မားသောအစိုင်အခဲများ 25% (w/w) (ခန့်မှန်းခြေအားဖြင့် 8% glucan loading)၊ 96 နာရီ hydrolysis၊ 20 mg/g စီးပွားဖြစ်အင်ဇိုင်း loading (Ctec2:Htec2:MP-2:1:1 ratio) နှင့် (D) သကြားမိုနိုမာများနှင့် ဂလူးကို့စ်အာရာဘင်ဆီစထရီ နှင့် AC ပြောင်းဖူးမှ ထုတ်လွှတ်သော AF မီးဖိုမှ စီလိုစထရီ နှင့် Oligomers)။
Glycan ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုသည် အစိုင်အခဲ ဇီဝလောင်စာ အကြွင်းအကျန်များမှ ခွဲထုတ်ထားသော ထုတ်ယူမှုများတွင် glycans ၏ ကျယ်ကျယ်ပြန့်ပြန့် ဖွဲ့စည်းတည်ဆောက်ပုံဆိုင်ရာ ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုအတွက် အသုံးဝင်သော ကိရိယာတစ်ခုဖြစ်ကြောင်း သက်သေပြခဲ့သည်။သို့သော်၊ ရေတွင်ပျော်ဝင်နိုင်သော saccharides များသည် ဤရိုးရာနည်းလမ်း 41 ကိုအသုံးပြု၍ ကိုယ်စားပြုမှုနည်းပါးနေသောကြောင့် မော်လီကျူးအလေးချိန်နည်းသော oligosaccharides များသည် ELISA ပြားများပေါ်တွင် မတည်မငြိမ်ဖြစ်ပြီး ပဋိပစ္စည်းမထည့်မီတွင် ဆေးကြောရန်ခက်ခဲသောကြောင့်ဖြစ်သည်။ထို့ကြောင့်၊ ပဋိပစ္စည်းပေါင်းစပ်ခြင်းနှင့် လက္ခဏာရပ်များအတွက်၊ avidin-coated ELISA ပြားများပေါ်တွင် ပျော်ဝင်နိုင်သော၊ မလိုက်လျောညီထွေမရှိသော oligosaccharides များကို ပေါင်းစပ်ရန်အတွက် တစ်ဆင့်တည်း ဇီဝရုပ်ပွားခြင်းနည်းလမ်းကို အသုံးပြုခဲ့သည်။ဤနည်းလမ်းကို ကျွန်ုပ်တို့၏ယခင်ထုတ်လုပ်ထားသော ACSH နှင့် ၎င်း၏မော်လီကျူးအလေးချိန် (သို့မဟုတ် ပိုလီမာပြုလုပ်ခြင်းဒီဂရီ၊ DP) ပေါ်မူတည်၍ အပိုင်းကို အသုံးပြု၍ စမ်းသပ်ထားသည်။ကာဗိုဟိုက်ဒရိတ်၏အဆုံးသို့ biotin-LC-hydrazide ပေါင်းထည့်ခြင်းဖြင့် oligosaccharide binding affinity ကို တိုးမြှင့်ရန်အတွက် အဆင့်တစ်ဆင့် biotinylation ကိုအသုံးပြုခဲ့သည် (ပုံ။ 2)။ဖြေရှင်းချက်တွင်၊ လျှော့ချသည့်အဆုံးရှိ hemiacetal အုပ်စုသည် ဟိုက်ဒရာဇိုက်အုပ်စုဖြစ်သော biotin-LC-hydrazide နှင့် ဓာတ်ပြုပြီး ဟိုက်ဒရာဇုံနှောင်ကြိုးကို ဖွဲ့စည်းသည်။လျှော့ချသည့်အေးဂျင့် NaCNBH3 ၏ရှေ့မှောက်တွင်၊ ဟိုက်ဒရာဇုန်းနှောင်ကြိုးကို တည်ငြိမ်သော biotinylated နောက်ဆုံးထုတ်ကုန်အဖြစ်သို့ လျှော့ချသည်။သကြားလျှော့ချခြင်း၏အဆုံးကို ပြုပြင်မွမ်းမံခြင်းဖြင့်၊ နိမ့်သော DP oligosaccharides များကို ELISA ပြားများနှင့် ချိတ်ဆက်မှုဖြစ်နိုင်ကာ ကျွန်ုပ်တို့၏လေ့လာမှုတွင် ၎င်းကို glycan-ပစ်မှတ်ထားသော mAbs ကိုအသုံးပြု၍ avidin-coated plates များပေါ်တွင် ပြုလုပ်ခဲ့သည်။
biotinylated oligosaccharides အတွက် ELISA ကို အခြေခံထားသော monoclonal antibodies များကို စစ်ဆေးခြင်း။ဤတွင် (A) ပေါင်းစပ်ထားသော oligosaccharides ၏ biotinylation နှင့် NeutrAvidin coated plates ပေါ်ရှိ glycan-targeted mAbs ဖြင့် နောက်ဆက်တွဲ ELISA စစ်ဆေးခြင်း နှင့် (B) သည် တုံ့ပြန်မှုထုတ်ကုန်များ၏ biotinylation အတွက် အဆင့်တစ်ဆင့်လုပ်ထုံးလုပ်နည်းကို ပြသထားသည်။
ထို့နောက် oligosaccharide-conjugated antibodies ပါရှိသော Avidin-coated plates များကို primary နှင့် secondary antibodies များသို့ ပေါင်းထည့်ကာ အလင်းနှင့် အချိန်-အထိခိုက်မခံသော ကြားခံတစ်ခုတွင် ဆေးကြောပါ။ပဋိပစ္စည်း ချိတ်ဆက်မှု ပြီးပါက၊ ပန်းကန်ပြားကို သားဖောက်ရန်အတွက် TMB အလွှာကို ထည့်ပါ။နောက်ဆုံးတွင် ဆာလဖူရစ်အက်ဆစ်ဖြင့် တုံ့ပြန်မှုကို ရပ်တန့်ခဲ့သည်။ပဋိပစ္စည်းတစ်ခုစီ၏ ဆက်စပ်ပစ္စည်းတစ်ခုစီ၏ ချိတ်ဆက်မှုအားကောင်းမှုကို ဆုံးဖြတ်ရန် ELISA reader ကို အသုံးပြု၍ ခွဲခြမ်းစိပ်ဖြာထားသော ပြားများကို ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာထားသည်။စမ်းသပ်မှု၏အသေးစိတ်အချက်အလက်များနှင့် ကန့်သတ်ချက်များအတွက် သက်ဆိုင်ရာကဏ္ဍ "ပစ္စည်းများနှင့် နည်းလမ်းများ" ကို ကြည့်ပါ။
ကျွန်ုပ်တို့သည် ACSH တွင်ပျော်ဝင်နိုင်သော oligosaccharides များအပြင် lignocellulosic hydrolysates မှခွဲထုတ်ထားသော အစိမ်းလိုက်နှင့် သန့်စင်ထားသော oligosaccharide အပိုင်းအစများတွင် ပျော်ဝင်နိုင်သော oligosaccharides များကို လက္ခဏာရပ်များဖြင့် သီးခြားအပလီကေးရှင်းများအတွက် အသစ်တီထွင်ထားသောနည်းလမ်း၏ အသုံးဝင်ပုံကို သရုပ်ပြပါသည်။ပုံ 3 တွင်ပြထားသည့်အတိုင်း၊ bioacylated glycome assay method ကိုအသုံးပြု၍ ACSH တွင်တွေ့ရှိရသော အသုံးအများဆုံး epitope-အစားထိုး xylans များသည် များသောအားဖြင့် uronic (U) သို့မဟုတ် methyluronic (MeU) နှင့် pectic arabinogalactans တို့ဖြစ်သည်။၎င်းတို့ထဲမှ အများစုကို ဟိုက်ဒရိုလစ်စိုင်မဟုတ်သော အစိုင်အခဲများ (UHS)43 ၏ glycans ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုဆိုင်ရာ ကျွန်ုပ်တို့၏ယခင်လေ့လာမှုတွင်လည်း တွေ့ရှိခဲ့သည်။
ဆဲလ်နံရံ glycan ဆီသို့ ဦးတည်သော monoclonal antibody ကို အသုံးပြု၍ recalcitrant oligosaccharide epitopes များကို ထောက်လှမ်းခြင်း။"ကြားနေ" အပိုင်းသည် ACN အပိုင်းအစဖြစ်ပြီး "အက်ဆစ်" အပိုင်းသည် FA အပိုင်းဖြစ်သည်။အပူမြေပုံပေါ်ရှိ ပိုတောက်ပသော အနီရောင်များသည် ပိုမိုမြင့်မားသော epitope အကြောင်းအရာကို ညွှန်ပြပြီး ပိုမိုတောက်ပသော အပြာရောင်များသည် နောက်ခံဗလာကို ဖော်ပြသည်။စကေးပေါ်ရှိ အရောင်တန်ဖိုးများသည် ဖော်မြူလာများအတွက် N=2 ကုန်ကြမ်း OD တန်ဖိုးများအပေါ် အခြေခံထားသည်။ပဋိပစ္စည်းများမှ အသိအမှတ်ပြုထားသော အဓိက epitopes များကို ညာဘက်တွင် ပြထားသည်။
အသုံးအများဆုံး စီးပွားဖြစ်အင်ဇိုင်းများ ပါ၀င်သည့် စမ်းသပ်ထားသော စီးပွားဖြစ်အင်ဇိုင်းအရောအနှောတွင် အသုံးအများဆုံး ဆဲလ်လူလာနှင့် ဟီမီဆဲလ်လာစ့်များ သည် ဤဆယ်လူလိုမဟုတ်သောဖွဲ့စည်းပုံများကို မရှင်းလင်းနိုင်ပါ။ထို့ကြောင့် ၎င်းတို့၏ hydrolysis အတွက် အရန်အင်ဇိုင်းအသစ်များ လိုအပ်ပါသည်။လိုအပ်သော cellulose မဟုတ်သော တွဲဖက်အင်ဇိုင်းများ မရှိဘဲ၊ အဆိုပါ cellulose မဟုတ်သော အနှောင်အဖွဲ့များသည် ၎င်းတို့၏ မိခင်သကြားပိုလီမာများကို တိုတောင်းသော အစိတ်စိတ်အမွှာမွှာအဖြစ်သို့ ကျယ်ပြန့်စွာ ဟိုက်ဒရောလစ်ဖြင့် ချဲ့ထွင်ကာ စီးပွားဖြစ် အင်ဇိုင်းအရောအနှောများကို အသုံးပြု၍ ပျော်ဝင်နေလျှင်ပင်၊ အဆိုပါ cellulose မဟုတ်သော အနှောင်အဖွဲ့များသည် မိုနိုဆာကာရိုက်များအဖြစ်သို့ ပြီးပြည့်စုံသော ပြောင်းလဲခြင်းကို တားဆီးပါသည်။
အချက်ပြဖြန့်ဖြူးမှုနှင့် ၎င်း၏စည်းနှောင်မှုအားကောင်းမှုကို ထပ်မံလေ့လာမှုအရ binding epitopes များသည် မြင့်မားသော DP သကြားအပိုင်းပိုင်းများ (A, B, C, DP 20+ အထိ) နည်းပါးကြောင်း DP အပိုင်း (D, E, F, DP) ရှိ dimers များတွင်) (ပုံ. 1) (ပုံ. 1)။အက်ဆစ်အပိုင်းအစများသည် ကြားနေအပိုင်းအစများထက် cellulose မဟုတ်သော epitopes များတွင် ပို၍အဖြစ်များပါသည်။ဤဖြစ်စဉ်များသည် DP နှင့် acid moieties မြင့်မားသော enzymatic hydrolysis ကို ပိုမိုခံနိုင်ရည်ရှိသော ကျွန်ုပ်တို့၏ယခင်လေ့လာမှုတွင် လေ့လာခဲ့သည့်ပုံစံနှင့် ကိုက်ညီပါသည်။ထို့ကြောင့်၊ cellulose မဟုတ်သော glycan epitopes နှင့် U နှင့် MeU အစားထိုးမှုများသည် oligosaccharides ၏တည်ငြိမ်မှုကို များစွာအထောက်အကူပြုနိုင်သည်။အထူးသဖြင့် epitope သည် dimeric သို့မဟုတ် trimeric oligosaccharide နိမ့်သော DP oligosaccharides များအတွက် စည်းနှောင်ခြင်းနှင့် ထောက်လှမ်းခြင်းဆိုင်ရာ စွမ်းဆောင်ရည်သည် ပြဿနာရှိနိုင်သည်ကို သတိပြုသင့်သည်။၎င်းကို သတ်သတ်မှတ်မှတ် mAb နှင့် ချိတ်ထားသည့် epitope တစ်ခုသာပါရှိသော မတူညီသော အရှည်ရှိသော စီးပွားဖြစ် oligosaccharides များကို အသုံးပြု၍ ၎င်းကို စမ်းသပ်နိုင်သည်။
ထို့ကြောင့်၊ ဖွဲ့စည်းတည်ဆောက်ပုံ-သတ်သတ်မှတ်မှတ် ပဋိပစ္စည်းကိုအသုံးပြုခြင်းသည် အချို့သော recalcitrant bonds အမျိုးအစားများကို ထင်ရှားစေသည်။အသုံးပြုထားသော ပဋိပစ္စည်းအမျိုးအစားပေါ် မူတည်၍ သင့်လျော်သော ligation ပုံစံနှင့် ၎င်းထုတ်လုပ်သည့် အချက်ပြ၏ အစွမ်းသတ္တိ (အများဆုံးနှင့် အနည်းဆုံး)၊ အင်ဇိုင်းအသစ်များကို ပိုမိုပြီးပြည့်စုံသော glycoconversion အတွက် အင်ဇိုင်းအရောအနှောထဲသို့ တစ်ဝက်တစ်ပျက်ပမာဏ ထည့်သွင်းနိုင်သည်။ဥပမာတစ်ခုအနေဖြင့် ACSH oligosaccharides ၏ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုကိုယူပြီး၊ ဇီဝဒြပ်ပစ္စည်းတစ်ခုစီအတွက် glycan နှောင်ကြိုးများ၏ဒေတာဘေ့စ်တစ်ခုကို ကျွန်ုပ်တို့ဖန်တီးနိုင်သည်။ဤနေရာတွင် သတိပြုသင့်သည်မှာ မတူညီသော ပဋိပစ္စည်းများ၏ ဆက်စပ်မှုကို ထည့်သွင်းစဉ်းစားသင့်ပြီး ၎င်းတို့၏ ရင်းနှီးမှုကို မသိပါက၊ မတူညီသော ပဋိပစ္စည်း၏ အချက်ပြမှုများကို နှိုင်းယှဉ်သောအခါတွင် အချို့သော အခက်အခဲများကို ဖန်တီးပေးမည်ဖြစ်ပါသည်။ထို့အပြင်၊ glycan နှောင်ကြိုးများကို နှိုင်းယှဉ်ခြင်းသည် တူညီသောပဋိပစ္စည်းအတွက် နမူနာများကြားတွင် အကောင်းဆုံးဖြစ်နိုင်သည်။ဤခိုင်မာသောနှောင်ကြိုးများကိုကျွန်ုပ်တို့သည်အင်ဇိုင်းများကိုခွဲခြားသတ်မှတ်နိုင်သည်၊ ထိုအင်ဇိုင်းများကိုရွေးချယ်နိုင်ပြီးနှောင်ကြိုးပြတ်တောက်သောအင်ဇိုင်းများအတွက်စမ်းသပ်ခြင်းသို့မဟုတ် biorefineries44 တွင်အသုံးပြုရန်အတွက်ဤအင်ဇိုင်းများကိုဖော်ပြရန်အဏုဇီဝစနစ်များကိုဖော်ထုတ်ရန်အတွက်ဤခိုင်မာသောနှောင်ကြိုးများကို CAZyme ဒေတာဘေ့စ်နှင့်ချိတ်ဆက်နိုင်သည်။
lignocellulosic hydrolysates တွင်ပါရှိသောနိမ့်မော်လီကျူးအလေးချိန် oligosaccharides ဝိသေသလက္ခဏာအတွက် ခုခံအားဆိုင်ရာနည်းလမ်းများ မည်ကဲ့သို့ဖြည့်စွမ်းနိုင်သည်ကို အကဲဖြတ်ရန် ကျွန်ုပ်တို့သည် MALDI (ပုံ 4၊ S1-S8) နှင့် GC-MS ပေါ်အခြေခံ၍ တူညီသော panel (ပုံ 5) oligos ပေါ်အခြေခံ၍ TMS မှရရှိသော saccharides များကို ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခဲ့ပါသည်။MALDI ကို oligosaccharide မော်လီကျူးများ၏ အစုလိုက်အပြုံလိုက် ဖြန့်ဖြူးမှုသည် ရည်ရွယ်ထားသော ဖွဲ့စည်းပုံနှင့် ကိုက်ညီမှုရှိမရှိ နှိုင်းယှဉ်ရန် အသုံးပြုသည်။သဖန်းသီးပေါ်မှာ။4 သည် ကြားနေအစိတ်အပိုင်းများ ACN-A နှင့် ACN-B တို့၏ MC ကိုပြသသည်။ACN-A ပိုင်းခြားစိတ်ဖြာချက်သည် DP 4–8 (ပုံ. 4) မှ DP 22 (ပုံ. S1) မှ pentose သကြားအကွာအဝေးကို အတည်ပြုခဲ့သည်၊ACN-B ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုတွင် DP 8-15 ဖြင့် pentose နှင့် glucoxylan စီးရီးတို့ကို အတည်ပြုခဲ့သည်။Figure S3 ကဲ့သို့သော ဖြည့်စွက်ပစ္စည်းတွင်၊ FA-C အက်ဆစ်အစိုဓာတ် အစုလိုက်အပြုံလိုက် ဖြန့်ဖြူးမြေပုံများသည် ELISA-based mAb စိစစ်မှုတွင်တွေ့ရှိရသော အစားထိုး xylans နှင့် ကိုက်ညီသော (Me)U အစားထိုး pentose သကြားအကွာအဝေးကို ပြသထားသည်။epitopes များသည် တသမတ်တည်းဖြစ်သည်။
MALDI-MS ရောင်စဉ် ACS တွင် ပျော်ဝင်နိုင်သော မကိုက်ညီသော oligosaccharides များ။ဤတွင်၊ (A) ACN-A တွင် မီသိုင်းလိတ်ယူရိုနစ်အက်ဆစ် (DP 4-8) နှင့် အစားထိုးထားသော glucuroxylan oligosaccharides နှင့် (B) ACN-B xylan နှင့် methylated uronic acid oligosaccharides ပါဝင်သော အလေးချိန်နိမ့်အပိုင်းအစများကို glucuroxylan (DP 8-15)။
refractory oligosaccharides ၏ glycan အကြွင်းအကျန်များ၏ဖွဲ့စည်းမှုကိုလေ့လာခြင်း။ဤတွင် (က) GC-MS ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုကို အသုံးပြု၍ ရရှိသော အမျိုးမျိုးသော oligosaccharide အပိုင်းအစများ၏ TMS saccharide ဖွဲ့စည်းမှု။(ခ) oligosaccharides တွင်ပါရှိသော TMS မှရရှိသော သကြားမျိုးစုံ၏ဖွဲ့စည်းပုံများ။ACN - အက်စီတိုနိုက်ထရစ် အပိုင်းအစတွင် ကြားနေ oligosaccharides နှင့် FA - အက်ဆစ် oligosaccharides ပါရှိသော ဖာရူလစ်အက်ဆစ်အပိုင်း။
ပုံ S9 တွင်ပြသထားသည့်အတိုင်း LC-MS ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုမှ စိတ်ဝင်စားဖွယ်ကောင်းသော ကောက်ချက်ချမှုကို ပုံ S9 တွင်ဖော်ပြထားသည် (နည်းလမ်းများကို အီလက်ထရွန်းနစ်ဖြည့်စွက်ပစ္စည်းတွင်တွေ့မြင်နိုင်သည်)။hexose နှင့် -OAc အုပ်စုများ၏ အပိုင်းအစများကို ACN-B အပိုင်းကို ချိတ်ဆက်စဉ်တွင် ထပ်ခါတလဲလဲ တွေ့ရှိခဲ့သည်။ဤရှာဖွေတွေ့ရှိမှုသည် glycome နှင့် MALDI-TOF ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုတွင် တွေ့ရှိခဲ့သော အကွဲကွဲအပြားပြားကို အတည်ပြုရုံသာမက ပြုပြင်ထားသော lignocellulosic biomass တွင် ဖြစ်နိုင်ချေရှိသော ကာဗိုဟိုက်ဒရိတ်ဒြပ်စင်များအကြောင်း အချက်အလက်အသစ်များကိုလည်း ပေးပါသည်။
TMS သကြားပုံထွက်ခြင်းကို အသုံးပြု၍ oligosaccharide အပိုင်း၏သကြားပါဝင်မှုကိုလည်း ပိုင်းခြားစိတ်ဖြာပါသည်။GC-MS ကိုအသုံးပြု၍ oligosaccharide အပိုင်း (ပုံ 5) တွင် အာရုံကြော (ဆင်းသက်လာမဟုတ်သော) နှင့် အက်ဆစ်သကြားများ (GluA နှင့် GalA) တို့၏ ပါဝင်မှုကို ကျွန်ုပ်တို့ ဆုံးဖြတ်ခဲ့သည်။Glucuronic အက်ဆစ်ကို အက်စစ်ဓာတ်ပါဝင်ပစ္စည်းများ C နှင့် D တွင်တွေ့ရှိရပြီး galacturonic acid ကို အက်စစ်ဓာတ်ပါဝင်မှုများသော A နှင့် B တွင်တွေ့ရှိရပြီး နှစ်ခုစလုံးသည် အက်ဆစ်သကြားများ၏ DP မြင့်မားသောအစိတ်အပိုင်းများဖြစ်သည်။ဤရလဒ်များသည် ကျွန်ုပ်တို့၏ ELISA နှင့် MALDI ဒေတာကို အတည်ပြုရုံသာမက oligosaccharide စုဆောင်းမှုဆိုင်ရာ ကျွန်ုပ်တို့၏ယခင်လေ့လာမှုများနှင့်လည်း ကိုက်ညီပါသည်။ထို့ကြောင့်၊ oligosaccharides ၏ biotinylation နှင့် နောက်ဆက်တွဲ ELISA စစ်ဆေးမှုကိုအသုံးပြု၍ ခေတ်မီကိုယ်ခံအားစနစ်နည်းလမ်းများသည် ဇီဝဗေဒနမူနာအမျိုးမျိုးတွင် ပျော်ဝင်နိုင်သော recalcitrant oligosaccharides ကိုရှာဖွေတွေ့ရှိရန် လုံလောက်သည်ဟု ကျွန်ုပ်တို့ယုံကြည်ပါသည်။
ELISA-based mAb စစ်ဆေးမှုနည်းလမ်းများကို မတူညီသောနည်းလမ်းများစွာဖြင့် အတည်ပြုထားသောကြောင့်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် ဤအရေအတွက်နည်းသစ်၏ အလားအလာကို ထပ်မံစူးစမ်းလိုပါသည်။စီးပွားဖြစ် oligosaccharides နှစ်ခု၊ xylohexasaccharide oligosaccharide (XHE) နှင့် 23-α-L-arabinofuranosyl-xylotriose (A2XX) ကို ဆဲလ်နံရံ glycan ကို ပစ်မှတ်ထားသော mAb ချဉ်းကပ်မှုအသစ်ကို အသုံးပြု၍ ဝယ်ယူစမ်းသပ်ခဲ့သည်။ပုံ 6 သည် biotinylated binding signal နှင့် oligosaccharide အာရုံစူးစိုက်မှု၏ မှတ်တမ်းအာရုံစူးစိုက်မှုကြားရှိ ဆက်စပ်မှုကို Langmuir စုပ်ယူမှုပုံစံကို အကြံပြုပြသထားသည်။mAbs၊ CCRC-M137၊ CCRC-M138၊ CCRC-M147၊ CCRC-M148၊ နှင့် CCRC-M151 တို့သည် XHE နှင့် ဆက်နွှယ်နေပြီး CCRC-M108၊ CCRC-M109 နှင့် LM11 တို့သည် A2XX နှင့် ဆက်နွှယ်နေပါသည်။ 1010 ထက်မပိုပါ။စမ်းသပ်မှုအတွင်း ပဋိပစ္စည်းများ အကန့်အသတ်ဖြင့် ရရှိနိုင်မှုကြောင့် oligosaccharide အာရုံစူးစိုက်မှုတစ်ခုစီနှင့် အကန့်အသတ်ရှိသော စမ်းသပ်မှုများကို လုပ်ဆောင်ခဲ့သည်။ဤနေရာတွင် သတိပြုသင့်သည်မှာ အချို့သော ပဋိပစ္စည်းများသည် တူညီသော oligosaccharide နှင့် အလွန်ကွဲပြားခြားနားသော တုံ့ပြန်မှုဖြစ်ပြီး ၎င်းတို့သည် အနည်းငယ်ကွဲပြားသော epitopes များနှင့် ချည်နှောင်ထားသောကြောင့် အလွန်ကွဲပြားသော ပေါင်းစပ်ဆက်စပ်မှုများ ရှိနိုင်သည်ဟု ယူဆသင့်ပါသည်။mAb ချဉ်းကပ်မှုအသစ်ကို အစစ်အမှန်နမူနာများသို့ အသုံးချသောအခါ တိကျသော epitope ခွဲခြားခြင်း၏ ယန္တရားများနှင့် သက်ရောက်မှုများသည် ပိုမိုရှုပ်ထွေးပါသည်။
အမျိုးမျိုးသော glycan-ပစ်မှတ်ထား mAbs ၏ ထောက်လှမ်းမှုအကွာအဝေးကို ဆုံးဖြတ်ရန်အတွက် စီးပွားဖြစ် oligosaccharides နှစ်ခုကို အသုံးပြုခဲ့သည်။ဤတွင်၊ oligosaccharide အာရုံစူးစိုက်မှု၏မှတ်တမ်းအာရုံစူးစိုက်မှုနှင့်အတူတစ်ပြေးညီဆက်စပ်မှုများသည် (A) XHE နှင့်အတူ mAb နှင့် (B) A2XX နှင့်အတူ mAb အတွက် Langmuir စုပ်ယူမှုပုံစံများကိုဖော်ပြသည်။ဆက်စပ် epitopes များသည် စစ်ဆေးမှုတွင် အသုံးပြုသော စီးပွားဖြစ် oligosaccharides များ၏ ဖွဲ့စည်းပုံများကို ညွှန်ပြပါသည်။
glycan-targeted monoclonal antibodies (glycocomic analysis သို့မဟုတ် ELISA-based mAb screening) ကို အသုံးပြုခြင်းသည် အပင်ဇီဝလောင်စာများအဖြစ် အဓိကကျသော ဆဲလ်နံရံ glycans အများစု၏ အတွင်းကျကျ လက္ခဏာရပ်များ အတွက် အစွမ်းထက်သော ကိရိယာတစ်ခု ဖြစ်သည်။သို့သော်၊ ရှေးရိုး glycan ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုသည် oligosaccharides အများစုကို ELISA ပြားများပေါ်တွင် ထိထိရောက်ရောက် ထိန်းထားနိုင်ခြင်း မရှိသောကြောင့် ပိုကြီးသော ဆဲလ်နံရံ glycans များကိုသာ ဖော်ပြသည်။ဤလေ့လာမှုတွင်၊ AFEX-pretreated ပြောင်းဖူးမီးဖိုသည် မြင့်မားသောအစိုင်အခဲများပါဝင်မှုတွင် ဇိုင်းမားဖြင့် ဟိုက်ဒရောလစ်ပြုလုပ်ထားသည်။သကြားခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခြင်းကို ဟိုက်ဒရိုလစ်ဇိတ်တွင် ကယ်လ်စီထရက်ဆဲလ်နံရံကာဗိုဟိုက်ဒရိတ်ပါဝင်မှုကို ဆုံးဖြတ်ရန် အသုံးပြုသည်။သို့ရာတွင်၊ hydrolysates တွင်သေးငယ်သော oligosaccharides ၏ mAb ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုကို လျှော့တွက်ထားပြီး ELISA ပြားများပေါ်ရှိ oligosaccharides များကို ထိထိရောက်ရောက် ထိန်းထားနိုင်ရန် နောက်ထပ်ကိရိယာများ လိုအပ်ပါသည်။
oligosaccharide biotinylation ကို ပေါင်းစပ်ပြီး NeutrAvidin™ coated plates ပေါ်ရှိ ELISA စစ်ဆေးခြင်းဖြင့် mAb စစ်ဆေးခြင်းအတွက် ဆန်းသစ်ပြီး ထိရောက်သော oligosaccharide immobilization နည်းလမ်းကို အစီရင်ခံပါသည်။သိမ်းဆည်းထားသော biotinylated oligosaccharides များသည် recalcitrant oligosaccharides များကို လျင်မြန်ပြီး ထိရောက်စွာ ထောက်လှမ်းနိုင်စေရန် ပဋိပစ္စည်းအတွက် လုံလောက်သော ဆက်စပ်မှုကို ပြသခဲ့သည်။အစုလိုက်အပြုံလိုက် တိုင်းတာမှုအပေါ်အခြေခံ၍ ဤခေါင်းမာသော oligosaccharides ၏ဖွဲ့စည်းမှုကို လေ့လာခြင်းမှ ဤ immunoscreening ချဉ်းကပ်မှုအသစ်၏ရလဒ်များကိုအတည်ပြုခဲ့သည်။ထို့ကြောင့်၊ ဤလေ့လာမှုများက oligosaccharide biotinylation နှင့် ELISA ၏ glycan-ပစ်မှတ်ထားသော monoclonal antibodies များနှင့် ELISA စစ်ဆေးခြင်းတို့ကို oligosaccharides အတွင်းရှိ crosslinks များကိုရှာဖွေတွေ့ရှိနိုင်ပြီး oligosaccharides ၏ဖွဲ့စည်းပုံသွင်ပြင်လက္ခဏာဖြစ်သော အခြားသောဇီဝဓာတုလေ့လာမှုများတွင် တွင်ကျယ်စွာအသုံးချနိုင်သည်ကို သက်သေပြပါသည်။
ဤ biotin-based glycan profileing နည်းလမ်းသည် အပင်ဇီဝလောင်စာတွင် ပျော်ဝင်နိုင်သော oligosaccharides ၏ recalcitrant carbohydrate bonds များကို စုံစမ်းစစ်ဆေးနိုင်သည့် ပထမဆုံးအစီရင်ခံစာဖြစ်သည်။ဇီဝလောင်စာထုတ်လုပ်ရာတွင် အချို့သောအစိတ်အပိုင်းများသည် ဇီဝလောင်စာထုတ်လုပ်ရာတွင် အဘယ်ကြောင့် ဤမျှ ခိုင်မာနေသနည်းဟူသည်ကို နားလည်စေသည်။ဤနည်းလမ်းသည် glycome ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုနည်းလမ်းများတွင် အရေးကြီးသောကွာဟချက်ကို ဖြည့်ဆည်းပေးပြီး ၎င်း၏အသုံးချမှုကို အပင် oligosaccharides ကျော်လွန်၍ ကျယ်ပြန့်သောအလွှာများသို့ တိုးချဲ့သည်။အနာဂတ်တွင်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် ဇီဝရုပ်ပွားခြင်းအတွက် စက်ရုပ်များကို အသုံးပြုပြီး ELISA ကို အသုံးပြု၍ နမူနာများ မြင့်မားသော ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုအတွက် တီထွင်ထားသော နည်းလမ်းကို အသုံးပြုနိုင်ပါသည်။
ကော်လိုရာဒို၊ Ray ရှိ Kramer Farms မှ Pioneer 33A14 စပ်မျိုးစေ့များမှ စိုက်ပျိုးထားသော ပြောင်းမြက် (CS) ကို 2010 ခုနှစ်တွင် ရိတ်သိမ်းခဲ့ပါသည်။မြေပိုင်ရှင်၏ ခွင့်ပြုချက်ဖြင့် ဤဇီဝဒြပ်ကို သုတေသနအတွက် အသုံးပြုနိုင်သည်။ နမူနာများကို အခန်းအပူချိန်တွင် ဇစ်သော့အိတ်အတွင်း အစိုဓာတ် < 6% ဖြင့် သိမ်းဆည်းထားသည်။ နမူနာများကို အခန်းအပူချိန်တွင် ဇစ်သော့အိတ်အတွင်း အစိုဓာတ် < 6% ဖြင့် သိမ်းဆည်းထားသည်။ Образцы хранились сухими при влажности < 6% в пакетах с застежкой-молнией при комнатной температуре. နမူနာများကို အခန်းအပူချိန်တွင် ဇစ်တပ်ထားသောအိတ်များတွင် စိုထိုင်းဆ <6% ဖြင့် ခြောက်အောင် သိမ်းဆည်းထားပါသည်။样品在室温下以干燥< 6% 的水分储存在自封袋中။样品在室温下以干燥< 6% Образцы хранят в пакетах с застежкой-молнией при комнатной температуре с влажностью < 6%. နမူနာများကို ဇစ်အိတ်များတွင် စိုထိုင်းဆ < 6% ဖြင့် အခန်းအပူချိန်တွင် သိမ်းဆည်းထားသည်။လေ့လာမှုသည် ဒေသန္တရနှင့် နိုင်ငံတော် လမ်းညွှန်ချက်များကို လိုက်နာခဲ့သည်။NREL ပရိုတိုကောကို အသုံးပြု၍ ဖွဲ့စည်းမှုဆိုင်ရာ ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုကို ပြုလုပ်ခဲ့သည်။ပါဝင်မှုတွင် 31.4% glucan၊ 18.7% xylan၊ 3.3% arabinan၊ 1.2% galactan၊ 2.2% acetyl၊ 14.3% lignin၊ 1.7% protein နှင့် 13. 4% ash တို့ ပါဝင်ကြောင်း တွေ့ရှိခဲ့သည်။
Cellic® CTec2 (138 mg ပရိုတင်း/ml၊ lot VCNI 0001) သည် Novozymes (Franklinton, NC, USA) မှ ဆဲလ်လူလာစ့်၊ β-glucosidase နှင့် Cellic® HTec2 (157 mg protein/ml, lot VHN00001) ၏ ရှုပ်ထွေးသောအရောအနှောတစ်ခုဖြစ်သည်။Multifect Pectinase® (72 mg ပရိုတင်း/mL)၊ ရှုပ်ထွေးသော pectin ပျက်စီးစေသော အင်ဇိုင်းများ ရောစပ်ထားသော DuPont Industrial Biosciences (Palo Alto, CA, USA) မှ လှူဒါန်းခဲ့ပါသည်။Kjeldahl နိုက်ထရိုဂျင် ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှု (AOAC နည်းလမ်း 2001.11၊ Dairy One Cooperative Inc., Ithaca, NY, USA) ကို အသုံးပြု၍ ပရိုတင်းပါဝင်မှု (ပရိုတင်းမဟုတ်သော နိုက်ထရိုဂျင်၏ ပံ့ပိုးမှုကို နုတ်ပြီး) အင်ဇိုင်းပရိုတင်းပါဝင်မှုအား ခန့်မှန်းခြင်းဖြင့် ဆုံးဖြတ်ခဲ့သည်။Diatomaceous earth 545 ကို EMD Millipore (Billerica, MA) မှ ဝယ်ယူခဲ့သည်။အသက်သွင်းထားသော ကာဗွန် (DARCO၊ 100 mesh granules)၊ Avicel (PH-101)၊ beech xylan နှင့် အခြားဓာတုပစ္စည်းများအားလုံးကို Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) မှ ဝယ်ယူခဲ့သည်။
AFEX ကြိုတင်ပြင်ဆင်ခြင်းကို GLBRC (Biomass Conversion Research Laboratory၊ MSU၊ Lansing၊ MI၊ USA) တွင် ပြုလုပ်ခဲ့သည်။140 ဒီဂရီစင်တီဂရိတ်တွင် 15 မိနစ်ကြိုတင်ကုသမှုကိုပြုလုပ်ခဲ့သည်။46 သံမဏိခုံတန်းတင်အသုတ်ဓာတ်ပေါင်းဖို (Parr Instruments Company) တွင် 60% (w/w) တွင် 60% (w/w) ဖြင့် ဇီဝလောင်စာဆီ 1:1 အချိုးတွင် နေထိုင်ချိန်။မိနစ် 30 ကြာတယ်။ဓာတ်ပေါင်းဖိုကို ၁၄၀ ဒီဂရီစင်တီဂရိတ်သို့ ယူဆောင်လာကာ အမိုးနီးယားကို လျင်မြန်စွာ ထုတ်လွှတ်ကာ ဇီဝဒြပ်စင်များကို အခန်းအပူချိန်သို့ လျင်မြန်စွာ ပြန်လည်ရောက်ရှိစေခဲ့သည်။AFEX ကြိုတင်ကုသထားသော ပြောင်းဖူးမီးဖို (ACS) ၏ ပါဝင်မှုသည် မကုသရသေးသော ပြောင်းဖူးမီးဖို (UT-CS) နှင့် ဆင်တူသည်။
မြင့်မားသောအစိုင်အခဲများ ACSH 25% (w/w) (ခန့်မှန်းခြေအားဖြင့် 8% dextran loading) ကို oligosaccharides အကြီးစားထုတ်လုပ်မှုအတွက် အစပြုပစ္စည်းအဖြစ် ပြင်ဆင်ထားပါသည်။ACS ၏ Enzymatic hydrolysis ကို Cellic® Ctec2 10 mg protein/g glucan (ကြိုတင်ပြုပြင်ထားသော ဇီဝလောင်စာတွင်)၊ Htec2 (Novozymes, Franklinton, NC), 5 mg protein/g glucan နှင့် Multifect Pectinase (Genencor Inc, USA) အပါအဝင် စီးပွားဖြစ်အင်ဇိုင်းအရောအနှောကို အသုံးပြုထားသည်။)ပရိုတင်း 5 mg/g dextran။Enzymatic hydrolysis ကို 3 လီတာ ၊ pH 4.8 ၊ 50°C နှင့် 250 rpm ရှိသော 5 လီတာ ဇီဝဓာတ်ပေါင်းဖိုတွင် လုပ်ဆောင်ခဲ့သည်။96 နာရီကြာ hydrolysis ပြီးနောက်၊ hydrolyzate ကို 6000 rpm တွင် centrifugation ဖြင့် မိနစ် 30 ကြာ စုဆောင်းပြီးနောက် 14000 rpm တွင် မိနစ် 30 ကြာ ဟိုက်ဒရိုလစ်ဇစ်များကို ဖယ်ရှားရန်။ထို့နောက် ဟိုက်ဒရိုလစ်ဇိတ်ကို 0.22 mm filter beaker ဖြင့် ပိုးမွှားစစ်ထုတ်ခြင်း ခံရပါမည်။စစ်ထုတ်ထားသော ဟိုက်ဒရိုလစ်ဇိတ်ကို 4°C တွင် ပိုးမွှားပုလင်းများတွင် သိမ်းဆည်းထားပြီး ကာဗွန်ပေါ်တွင် အပိုင်းပိုင်းခွဲထားသည်။
NREL ဓာတ်ခွဲခန်းခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုလုပ်ထုံးလုပ်နည်းအရ ထုတ်ယူအခြေခံဇီဝဒြပ်နမူနာများ၏ ပါဝင်ဖွဲ့စည်းမှုကို ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခြင်း- ဖွဲ့စည်းမှုခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုအတွက်နမူနာများပြင်ဆင်ခြင်း (NREL/TP-510-42620) နှင့် ဇီဝလောင်စာတွင်ဖွဲ့စည်းပုံဆိုင်ရာကာဗိုဟိုက်ဒရိတ်နှင့် lignin တို့ကို ဆုံးဖြတ်ခြင်း (NREL/TP-510 – 42618) 47။
ဟိုက်ဒရိုလစ်ဇိတ်စီးကြောင်း၏ Oligosaccharide ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုကို autoclave-based acid hydrolysis နည်းလမ်းကို အသုံးပြု၍ 2 ml စကေးဖြင့် ပြုလုပ်ခဲ့သည်။ဟိုက်ဒရိုလစ်ဇိတ်နမူနာကို 69.7 µl ၏ 72% sulfuric acid နှင့် 10 ml ဝက်အူထုပ်ယဉ်ကျေးမှုပြွန်တွင် ရောနှောပြီး 121°C တွင် ခုံတန်းလျားတစ်ခုပေါ်၌ 1 နာရီကြာအောင် သားဖောက်ပြီး ရေခဲပေါ်တွင် အအေးခံကာ စွမ်းဆောင်ရည်မြင့် ခရိုမာတိုဂရမ်အရည် (HPLC) ဖန်ပုလင်းထဲသို့ စစ်ထုတ်ပါ။oligosaccharides ၏အာရုံစူးစိုက်မှုအား အက်ဆစ်-hydrolyzed နမူနာရှိ စုစုပေါင်းသကြားပြင်းအားမှ hydrolyzed မဟုတ်သောနမူနာတွင် monosaccharides ၏အာရုံစူးစိုက်မှုကိုနုတ်ခြင်းဖြင့်ဆုံးဖြတ်သည်။
Bio-Rad Aminex HPX-87H ကော်လံတွင် autosampler၊ ကော်လံအပူပေးစက်၊ isocratic pump နှင့် အလင်းယိုင်မှုအညွှန်းကိန်း detector တပ်ဆင်ထားသော Shimadzu HPLC စနစ်ဖြင့် အက်ဆစ်တွင် ဂလူးကို့စ်၊ xylose နှင့် arabinose ပါဝင်မှုကို ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခဲ့သည်။ကော်လံကို 50°C တွင် ထိန်းသိမ်းထားပြီး 0.6 ml/min 5 mM H2SO4 ကို ရေထဲတွင် ဖယ်ထုတ်ထားသည်။စီးဆင်းမှု။
ဟိုက်ဒရိုလစ်ဇိတ် supernatant ကို မိုနိုမာနှင့် oligosaccharide ပါဝင်မှုအတွက် ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာပြီး ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခဲ့သည်။Bio-Rad (Hercules, CA) Aminex HPX-87P ကော်လံနှင့် ash guard column တပ်ဆင်ထားသော HPLC မှ အင်ဇိုင်းဓာတ်အားခွဲထုတ်ပြီးနောက် ရရှိသော Monomeric သကြားများကို ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာသည်။ကော်လံအပူချိန်ကို 80 ဒီဂရီစင်တီဂရိတ်တွင် ထိန်းသိမ်းထားပြီး စီးဆင်းမှုနှုန်း 0.6 ml/min ဖြင့် ရေကို မိုဘိုင်းအဆင့်အဖြစ် အသုံးပြုခဲ့သည်။refs တွင်ဖော်ပြထားသောနည်းလမ်းများအတိုင်း Oligosaccharides ကို 121°C တွင် dilute acid တွင် hydrolysis ဖြင့်ဆုံးဖြတ်သည်။၄၁၊ ၄၈၊ ၄၉။
Saccharide ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခြင်းကို ယခင်ဖော်ပြထားသော လုပ်ထုံးလုပ်နည်း 27၊ 43၊ 50၊ 51 တို့ကို အသုံးပြု၍ ကုန်ကြမ်း၊ AFEX ကြိုတင်ကုသပြီး ရေနှင့်မဟုတ်သော ဇီဝလောင်စာအကြွင်းအကျန်များ (အမှတ်စဉ်ဆဲလ်နံရံထုတ်ယူမှုများနှင့် ၎င်းတို့၏ mAb စစ်ဆေးခြင်းအပါအဝင်) တွင် ပြုလုပ်ခဲ့သည်။glycome ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုအတွက်၊ အပင်ဆဲလ်နံရံတွင် အရက်မပျော်ဝင်နိုင်သော အကြွင်းအကျန်များကို ဇီဝလောင်စာအကြွင်းအကျန်များမှ ပြင်ဆင်ပြီး အမိုနီယမ်အောက်ဆီလိတ် (50 mM)၊ ဆိုဒီယမ်ကာဗွန်နိတ် (50 mM နှင့် 0.5% w/v), CON ကဲ့သို့သော ပြင်းထန်ပြင်းထန်သော ဓာတ်ပစ္စည်းများဖြင့် ဆက်တိုက်ထုတ်ယူခြင်းကို ခံယူထားသည်။(1M နှင့် 4M၊ 1% w/v ဆိုဒီယမ် ဘိုရိုဟိုက်ဒရိတ်ပါရှိသော) နှင့် ယခင်က ဖော်ပြထားသည့်အတိုင်း အက်ဆစ်ကလိုရိုက် (1M နှင့် 4M)ထို့နောက် ကောက်နှုတ်ချက်များကို ဆဲလ်နံရံ glycan သို့ ဦးတည်သည့် ရှုပ်ထွေးသော mAb50s ၏ ရှုပ်ထွေးသော panel ကို ELISA ထံ ပေးပို့ခဲ့ပြီး mAb binding တုံ့ပြန်မှုများကို အပူမြေပုံအဖြစ် ပြသခဲ့သည်။အပင်ဆဲလ်နံရံ glycan ကို ပစ်မှတ်ထားသည့် mAbs ကို ဓာတ်ခွဲခန်းစတော့များ (CCRC၊ JIM နှင့် MAC စီးရီး) များမှ ဝယ်ယူခဲ့သည်။
oligosaccharides ၏ ဇီဝဖြစ်စဉ်ကို အဆင့်တစ်ဆင့်ခွဲခြင်းbiotin-LC-hydrazide နှင့် ကာဗိုဟိုက်ဒရိတ်ပေါင်းစပ်ခြင်းကို အောက်ပါနည်းလမ်းကို အသုံးပြု၍ လုပ်ဆောင်ခဲ့သည်။Biotin-LC-hydrazide (4.6 mg/12 μmol) ကို dimethyl sulfoxide (DMSO, 70 μl) တွင် ပြင်းပြင်းထန်ထန် မွှေပြီး 65°C. တွင် အပူပေးခြင်းဖြင့် 1 မိနစ်ကြာ ပျော်ဝင်ပါသည်။Glacial acetic acid (30 µl) ထည့်ပြီး အရောအနှောကို ဆိုဒီယမ် cyanoborohydride (6.4 mg/100 µmol) ပေါ်သို့ လောင်းချပြီး 65°C. တွင် အပူပေးပြီးနောက် 1 မိနစ်ခန့် လုံးလုံးပျော်သွားသည်။ထို့နောက်၊ လျှော့ချရေးအစွန်းတွင် တံဆိပ်၏ ၁၀ ဆ သို့မဟုတ် ထို့ထက်ပိုသော အံသွားများရရှိရန် တုံ့ပြန်မှုအရောအနှော၏ 5 မှ 8 μl ကို အခြောက်လှန်းသော oligosaccharide (1-100 nmol) သို့ ပေါင်းထည့်ခဲ့သည်။တုံ့ပြန်မှုကို 65 ဒီဂရီစင်တီဂရိတ်တွင် 2 နာရီကြာပြုလုပ်ပြီးနောက်နမူနာများကိုချက်ချင်းသန့်စင်ခဲ့သည်။လျှော့ချခြင်းမရှိဘဲ တံဆိပ်ကပ်ခြင်း စမ်းသပ်မှုတွင် ဆိုဒီယမ် cyanoborohydride ကို အသုံးမပြုဘဲ နမူနာများကို 65°C. တွင် 2.5 နာရီကြာ တုံ့ပြန်ခဲ့သည်။
ELISA အပေါ်ယံပိုင်းနှင့် biotinylated oligosaccharides နမူနာများကို ဆေးကြောခြင်း။0.1 M Tris ကြားခံဖြေရှင်းချက် (TBS) ၏ 5 ml တွင် အရည်ဖျော်ထားသော စုစည်းနမူနာတစ်ခုစီ၏ 100 μl) ကို avidin-coated plate ၏ ရေတွင်းတစ်ခုစီသို့ ပေါင်းထည့်ခဲ့သည်။ထိန်းချုပ်ရေတွင်းများကို 0.1 M TBS တွင် 10 μg/ml ရှိသော biotin 50 μl ဖြင့် ဖုံးအုပ်ထားသည်။အလွတ်တိုင်းတာမှုများအတွက် Deionized ရေကို အပေါ်ယံအလွှာအဖြစ် အသုံးပြုခဲ့သည်။တက်ဘလက်ကို အမှောင်ထဲတွင် အခန်းအပူချိန်တွင် ၂ နာရီကြာ ပေါက်ဖွားခဲ့သည်။ပရိုဂရမ်နံပါတ်ကို အသုံးပြု၍ 0.1 M TBS တွင် အဆီထုတ်ထားသောနို့ 0.1% ဖြင့် ပန်းကန်ပြားကို ၃ ကြိမ်ဆေးပါ။Grenier flat 3A အတွက် ၁၁။
ပင်မပဋိပစ္စည်းထည့်ခြင်းနှင့် ဆေးကြောခြင်း။ရေတွင်းတစ်ခုစီတွင် မူလပဋိပစ္စည်း 40 µl ကိုထည့်ပါ။အမှောင်ထဲတွင် အခန်းအပူချိန်တွင် မိုက်ခရိုပြားကို ၁ နာရီကြာ ဖုတ်ပါ။ထို့နောက် ပန်းကန်ပြားများကို 0.1M TBS တွင် နို့ 0.1% ဖြင့် ၃ ကြိမ် ဆေးကြောပြီး Grenier Flat 3A အတွက် wash program #11 ကို အသုံးပြုသည်။
ဒုတိယ ပဋိပစ္စည်းထည့်၍ ဆေးကြောပါ။ကြွက်/ကြွက်၏ 50 µl ဒုတိယပဋိပစ္စည်း (0.1% နို့တွင် 0.1 M TBS တွင် 1:5000 ကို ရောထားသော) ရေတွင်းတစ်ခုစီသို့ ထည့်ပါ။အမှောင်ထဲတွင် အခန်းအပူချိန်တွင် မိုက်ခရိုပြားကို ၁ နာရီကြာ ဖုတ်ပါ။ထို့နောက် Grenier Flat 5A plate wash program #12 ကို အသုံးပြု၍ 0.1 M TBS တွင် နို့ 0.1% ဖြင့် 5 ကြိမ် ဆေးကြောပေးပါသည်။
အလွှာတစ်ခုထည့်ခြင်း။အောက်ခံအလွှာသို့ 3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine (TMB) ၏ 50 µl ကို ပေါင်းထည့်ပါ (ကြားခံအစက် ၂ စက်၊ TMB ၃ စက်၊ ဟိုက်ဒရိုဂျင်ပါအောက်ဆိုဒ် ၂ စက်ကို ဒိုင်းယွန်ရှင်းရေ ၁၅ မီလီလီတာသို့ ပေါင်းထည့်ခြင်းဖြင့်)။TMB substrate ကိုပြင်ဆင်ပါ။အသုံးမပြုမီ vortex)။မိုက်ခရိုပြားကို အခန်းအပူချိန်တွင် မိနစ် 30 ဖုတ်ပါ။အမှောင်ထဲမှာ။
အဆင့်ကို ပြီးအောင်လုပ်ပြီး တက်ဘလက်ကိုဖတ်ပါ။ရေတွင်းတစ်ခုစီတွင် 1 N sulfuric acid ၏ 50 µl ကိုထည့်ကာ ELISA reader ကို အသုံးပြု၍ စုပ်ယူမှုကို 450 မှ 655 nm မှ မှတ်တမ်းတင်ပါ။
ဤခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှု၏ 1 mg/ml ၏အဖြေများကို ဖယ်ထုတ်ထားသောရေတွင် arabinose၊ rhamnose၊ fucose၊ xylose၊ galacturonic acid (GalA)၊ glucuronic acid (GlcA)၊ mannose၊ glucose၊ galactose၊ lactose၊ N-acetylmannosamine (manNAc), N-acetylagosamine.(glcNAc), N-acetylgalactosamine (galNAc), inositol (အတွင်းပိုင်းစံ)။ဇယား 1 တွင်ပြသထားသည့် 1 mg/mL သကြားရည်များကို ပေါင်းထည့်ခြင်းဖြင့် စံနှစ်ခုကို ပြင်ဆင်ထားပါသည်။ နမူနာများကို ရေအားလုံးကို ဖယ်ရှားသည်အထိ -80°C တွင် အေးခဲပြီး lyophilized (ပုံမှန်အားဖြင့် 12-18 နာရီ)။
ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာချိန်ခွင်လျှာတွင် ဝက်အူထုပ်ပြွန်များသို့ နမူနာ 100-500 µg ထည့်ပါ။ထည့်ထားသောပမာဏကို မှတ်တမ်းတင်ပါ။နမူနာကို သတ်သတ်မှတ်မှတ် ပြင်းအားတစ်ခုတွင် ပျော်ဝင်ပြီး ၎င်းကို အရည် aliquot အဖြစ် ပြွန်ထဲသို့ ထည့်ရန် အကောင်းဆုံးဖြစ်သည်။နမူနာပြွန်တစ်ခုစီအတွက် အတွင်းပိုင်းစံအဖြစ် 1 mg/ml inositol 20 µl ကို အသုံးပြုပါ။နမူနာသို့ ထည့်လိုက်သော အတွင်းပိုင်းစံပမာဏသည် စံပြွန်ထဲသို့ ထည့်ထားသည့် အတွင်းပိုင်းစံပမာဏနှင့် တူညီရပါမည်။
ဝက်အူအဖုံးပုလင်းထဲသို့ 8 ml of anhydrous methanol ကိုထည့်ပါ။ထို့နောက် 3 N. မက်သနောလစ် HCl ဖြေရှင်းချက်၏ 4 ml ကို ဖုံးအုပ်ပြီး လှုပ်ခါပါ။ဤလုပ်ငန်းစဉ်သည် ရေကို အသုံးမပြုပါ။
oligosaccharide နမူနာများနှင့် စံ TMS ပြွန်များတွင် 1 M HCl မီသနောဖြေရှင်းချက် 500 µl ကိုထည့်ပါ။နမူနာများကို 80°C. အပူဘလောက်တစ်ခုတွင် ညတွင်းချင်း (168 နာရီ) ပေါက်ဖွားခဲ့သည်။အခြောက်ခံထားသော အမံကိုအသုံးပြု၍ အခန်းအပူချိန်တွင် မက်သာနိုချေစီထုတ်ကုန်ကို အခြောက်ခံပါ။200 µl MeOH ထည့်ပြီး အခြောက်ခံပါ။ဤလုပ်ငန်းစဉ်ကိုနှစ်ကြိမ်ထပ်ခါတလဲလဲဖြစ်ပါတယ်။နမူနာထဲသို့ မီသနော 200 µl၊ pyridine 100 µl နှင့် acetic anhydride 100 µl တို့ကို ရောမွှေပါ။နမူနာများကို အခန်းအပူချိန်တွင် မိနစ် 30 ကြာ ဖုတ်ထားသည်။အခြောက်ခံပါ။မီသနော 200 µl ထည့်ပြီး အခြောက်ခံပါ။
Tri-Sil 200 µl ကို ထည့်ပြီး အပူပေးပြွန်ကို မိနစ် 20 ထားပါ။80°C ၊ ထို့နောက် အခန်းအပူချိန်တွင် အအေးခံပါ။နမူနာအား ခန့်မှန်းခြေအားဖြင့် 50 µl ပမာဏအထိ အခြောက်ခံရန် အခြောက်ခံသည့်အချိ်န်ကို အသုံးပြုပါ။နမူနာများကို လုံးဝခြောက်သွေ့အောင် ခွင့်မပြုကြောင်း သတိပြုရန် အရေးကြီးပါသည်။
hexane 2 ml ကိုထည့်ပြီး vortexing ဖြင့် ရောမွှေပါ။5-3/4 လက်မ လုံးပတ်ရှိ ပိုက်ပိုက်၏ထိပ်တွင် ဖန်သိုးမွှေးထည့်ခြင်းဖြင့် Pasteur pipettes (5-8 mm) ၏ အကြံပေးချက်များကို ဖြည့်ပါ။နမူနာများကို 3000 ဂရမ်တွင် 2 မိနစ်ကြာ အာရုံစူးစိုက်ထားသည်။မပျော်ဝင်နိုင်သော အကြွင်းအကျန်မှန်သမျှကို မိုးရွာစေပါသည်။နမူနာကို 100-150 µl အခြောက်ခံပါ။ခန့်မှန်းခြေအားဖြင့် 1 μl ပမာဏကို GC-MS တွင် ကနဦးအပူချိန် 80°C နှင့် ကနဦးအချိန် 2.0 မိနစ် (ဇယား 2) တွင် ထိုးသွင်းခဲ့သည်။