Cảm ơn bạn đã ghé thăm Nature.com.Phiên bản trình duyệt bạn đang sử dụng có hỗ trợ CSS hạn chế.Để có trải nghiệm tốt nhất, chúng tôi khuyên bạn nên sử dụng trình duyệt cập nhật (hoặc tắt Chế độ tương thích trong Internet Explorer).Trong thời gian chờ đợi, để đảm bảo hỗ trợ liên tục, chúng tôi sẽ hiển thị trang web không có kiểu và JavaScript.
Các phương pháp quang phổ khối và miễn dịch học mới để phân tích phức hợp các oligosacarit dai dẳng trong thân cây ngô được xử lý trước bằng AFEX.Sinh khối lignocellulose là một giải pháp thay thế bền vững cho nhiên liệu hóa thạch và được sử dụng rộng rãi để phát triển công nghệ sinh học nhằm sản xuất các sản phẩm như thực phẩm, thức ăn chăn nuôi, nhiên liệu và hóa chất.Chìa khóa của những công nghệ này là phát triển các quy trình cạnh tranh về chi phí để chuyển đổi carbohydrate phức tạp có trong thành tế bào thực vật thành các loại đường đơn giản như glucose, xyloza và arabinose.Vì sinh khối lignocellulose rất cứng đầu nên nó phải được xử lý bằng phương pháp nhiệt hóa học (ví dụ: tẩy tế bào chết bằng sợi amoniac (AFEX), axit loãng (DA), chất lỏng ion (IL)) và kết hợp các phương pháp xử lý sinh học (ví dụ: thủy phân bằng enzym và lên men vi sinh vật) để thu được sản phẩm mong muốn..Tuy nhiên, khi các enzyme nấm thương mại được sử dụng trong quá trình thủy phân, chỉ 75-85% đường hòa tan được hình thành là monosacarit và 15-25% còn lại là oligosacarit hòa tan, khó hấp thụ, không phải lúc nào cũng có sẵn cho vi sinh vật.Trước đây, chúng tôi đã phân lập và tinh chế thành công các oligosacarit cứng đầu hòa tan bằng cách sử dụng kết hợp tách carbon và đất tảo cát và sắc ký loại trừ kích thước, đồng thời nghiên cứu các đặc tính ức chế enzyme của chúng.Chúng tôi đã phát hiện ra rằng các oligosacarit có chứa các chất thay thế axit uronic bị methyl hóa ở mức độ trùng hợp (DP) cao hơn sẽ khó xử lý hơn với các hỗn hợp enzyme thương mại so với các oligosacarit trung tính và DP thấp.Ở đây chúng tôi báo cáo việc sử dụng một số phương pháp bổ sung, bao gồm lập hồ sơ glycan bằng cách sử dụng kháng thể đơn dòng (mAbs) đặc hiệu cho glycan sinh khối thực vật để mô tả các liên kết glycan trong thành tế bào thực vật và thủy phân enzyme, ion hóa giải hấp laser có hỗ trợ ma trận, khối phổ thời gian bay..MALDI-TOF-MS) sử dụng các đỉnh chẩn đoán thông tin cấu trúc thu được bằng phương pháp quang phổ sau khi phân rã thứ cấp các ion âm, sắc ký khí và phép đo khối phổ (GC-MS) để mô tả các liên kết oligosacarit có và không có dẫn xuất.Do kích thước nhỏ của oligosacarit (DP 4–20), các phân tử này khó sử dụng để liên kết và mô tả đặc tính của mAb.Để khắc phục vấn đề này, chúng tôi đã áp dụng một phương pháp cố định oligosacarit dựa trên liên hợp biotin mới, phương pháp này đã dán nhãn thành công phần lớn các oligosacarit hòa tan DP thấp trên bề mặt vi bản, sau đó được sử dụng trong hệ thống mAb thông lượng cao để phân tích thắt cụ thể.Phương pháp mới này sẽ tạo điều kiện phát triển các xét nghiệm glycome thông lượng cao tiên tiến hơn trong tương lai có thể được sử dụng để phân lập và mô tả các oligosacarit có trong các dấu ấn sinh học cho mục đích chẩn đoán.
Sinh khối lignocellulose, bao gồm các nguyên liệu nông nghiệp, lâm nghiệp, cỏ và gỗ, là nguyên liệu tiềm năng để sản xuất các sản phẩm dựa trên sinh học, bao gồm thực phẩm, thức ăn chăn nuôi, nhiên liệu và tiền chất hóa học để tạo ra các sản phẩm có giá trị cao hơn1.Carbohydrate (chẳng hạn như cellulose và hemiaellulose) có trong thành tế bào thực vật bị khử polyme thành monosacarit bằng quá trình xử lý hóa học và biến đổi sinh học (chẳng hạn như thủy phân bằng enzyme và lên men vi sinh vật).Các phương pháp tiền xử lý phổ biến bao gồm sự trương nở sợi bằng amoniac (AFEX), axit loãng (DA), chất lỏng ion (IL) và nổ hơi nước (SE), sử dụng kết hợp hóa chất và nhiệt để giảm sản xuất lignocellulose bằng cách mở thành tế bào thực vật3,4.độ cứng đầu của vật chất, 5. Quá trình thủy phân bằng enzym được thực hiện với lượng chất rắn cao bằng cách sử dụng các enzym có chứa carbohydrate hoạt tính thương mại (CAZymes) và quá trình lên men vi sinh vật bằng cách sử dụng men hoặc vi khuẩn biến đổi gen để sản xuất nhiên liệu và hóa chất dựa trên sinh học 6 .
CAZyme trong các enzym thương mại bao gồm một hỗn hợp phức tạp của các enzym hiệp đồng với nhau để cắt các liên kết đường-carbohydrat phức tạp để tạo thành các monosacarit2,7.Như chúng tôi đã báo cáo trước đó, mạng lưới phức tạp của các polyme thơm của lignin với carbohydrate làm cho chúng rất khó hấp thụ, dẫn đến chuyển hóa đường không hoàn toàn, tích tụ 15-25% oligosacarit giới tính không được tạo ra trong quá trình thủy phân sinh khối tiền xử lý bằng enzym.Đây là một vấn đề phổ biến với các phương pháp tiền xử lý sinh khối khác nhau.Một số lý do cho sự tắc nghẽn này bao gồm sự ức chế enzyme trong quá trình thủy phân, hoặc sự vắng mặt hoặc mức độ thấp của các enzyme thiết yếu cần thiết để phá vỡ các liên kết đường trong sinh khối thực vật.Hiểu được thành phần và đặc điểm cấu trúc của đường, chẳng hạn như các liên kết đường trong oligosacarit, sẽ giúp chúng ta cải thiện quá trình chuyển hóa đường trong quá trình thủy phân, giúp các quy trình công nghệ sinh học có chi phí cạnh tranh với các sản phẩm có nguồn gốc từ dầu mỏ.
Việc xác định cấu trúc của cacbohydrat là một thách thức và đòi hỏi sự kết hợp của nhiều phương pháp như sắc ký lỏng (LC)11,12, quang phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)13, điện di mao quản (CE)14,15,16 và khối phổ (MS)17.,18.Các phương pháp MS như khối phổ thời gian bay với giải hấp laser và ion hóa sử dụng ma trận (MALDI-TOF-MS) là một phương pháp linh hoạt để xác định cấu trúc carbohydrate.Gần đây, MS song song phân ly do va chạm (CID) của các chất gây nghiện ion natri đã được sử dụng rộng rãi nhất để xác định dấu vân tay tương ứng với các vị trí đính kèm oligosacarit, cấu hình dị thường, trình tự và vị trí phân nhánh 20, 21 .
Phân tích Glycan là một công cụ tuyệt vời để xác định sâu các liên kết carbohydrate22.Phương pháp này sử dụng các kháng thể đơn dòng (mAbs) hướng đến glycan của thành tế bào thực vật làm chất thăm dò để hiểu các mối liên kết carbohydrate phức tạp.Hơn 250 mAbs có sẵn trên toàn thế giới, được thiết kế chống lại các oligosacarit tuyến tính và phân nhánh khác nhau bằng cách sử dụng các loại sacarit khác nhau24.Một số mAbs đã được sử dụng rộng rãi để mô tả cấu trúc, thành phần và sự biến đổi của thành tế bào thực vật, vì có sự khác biệt đáng kể tùy thuộc vào loại tế bào thực vật, cơ quan, tuổi, giai đoạn phát triển và môi trường tăng trưởng25,26.Gần đây hơn, phương pháp này đã được sử dụng để hiểu quần thể túi trong hệ thống thực vật và động vật và vai trò tương ứng của chúng trong việc vận chuyển glycan được xác định bởi các dấu hiệu dưới tế bào, giai đoạn phát triển hoặc kích thích môi trường và để xác định hoạt động của enzyme.Một số cấu trúc khác nhau của glycans và xylan đã được xác định bao gồm pectin (P), xylan (X), mannan (M), xyloglucans (XylG), glucan liên kết hỗn hợp (MLG), arabinoxylan (ArbX), galactomannan (GalG), axit glucuronic-arabinoxylan (GArbX) và arabino-galactan (ArbG)29.
Tuy nhiên, bất chấp tất cả những nỗ lực nghiên cứu này, chỉ có một số nghiên cứu tập trung vào bản chất của sự tích lũy oligosacarit trong quá trình thủy phân tải lượng chất rắn cao (HSL), bao gồm giải phóng oligosacarit, thay đổi độ dài chuỗi oligomeric trong quá trình thủy phân, các polyme DP thấp khác nhau và đường cong của chúng.các bản phân phối 30,31,32.Trong khi đó, mặc dù phân tích glycan đã được chứng minh là một công cụ hữu ích để phân tích toàn diện cấu trúc glycan, nhưng rất khó để đánh giá các oligosacarit DP thấp tan trong nước bằng phương pháp kháng thể.Các oligosacarit DP nhỏ hơn có trọng lượng phân tử nhỏ hơn 5-10 kDa không liên kết với các bản ELISA 33, 34 và bị rửa trôi trước khi thêm kháng thể.
Ở đây, lần đầu tiên, chúng tôi trình diễn xét nghiệm ELISA trên các tấm được phủ avidin bằng cách sử dụng kháng thể đơn dòng, kết hợp quy trình biotin hóa một bước đối với oligosacarit chịu lửa hòa tan với phân tích glycome.Cách tiếp cận phân tích glycome của chúng tôi đã được xác thực bằng phân tích dựa trên MALDI-TOF-MS và GC-MS về các liên kết oligosacarit bổ sung bằng cách sử dụng dẫn xuất trimethylsilyl (TMS) của các chế phẩm đường thủy phân.Cách tiếp cận sáng tạo này có thể được phát triển như một phương pháp thông lượng cao trong tương lai và tìm thấy ứng dụng rộng rãi hơn trong nghiên cứu y sinh35.
Các sửa đổi sau dịch mã của các enzym và kháng thể, chẳng hạn như quá trình glycosyl hóa,36 ảnh hưởng đến hoạt động sinh học của chúng.Ví dụ, những thay đổi trong quá trình glycosyl hóa protein huyết thanh đóng một vai trò quan trọng trong viêm khớp và những thay đổi trong quá trình glycosyl hóa được sử dụng làm dấu hiệu chẩn đoán37.Nhiều loại glycan khác nhau đã được báo cáo trong tài liệu là dễ dàng xuất hiện trong nhiều loại bệnh, bao gồm các bệnh viêm mãn tính ở đường tiêu hóa và gan, nhiễm virus, ung thư buồng trứng, vú và tuyến tiền liệt38,39,40.Hiểu cấu trúc của glycan bằng phương pháp ELISA glycan dựa trên kháng thể sẽ mang lại sự tự tin hơn trong chẩn đoán bệnh mà không cần sử dụng các phương pháp MS phức tạp.
Nghiên cứu trước đây của chúng tôi cho thấy rằng các oligosacarit cứng đầu vẫn không bị thủy phân sau khi tiền xử lý và thủy phân bằng enzym (Hình 1).Trong công trình đã xuất bản trước đây của mình, chúng tôi đã phát triển một phương pháp chiết xuất pha rắn bằng than hoạt tính để phân lập oligosacarit từ dịch thủy phân thân cây ngô đã xử lý trước AFEX (ACSH)8.Sau khi chiết xuất và phân tách ban đầu, oligosacarit được phân đoạn tiếp bằng sắc ký loại trừ kích thước (SEC) và được thu thập theo thứ tự trọng lượng phân tử.Các monome và oligome đường được giải phóng từ các quá trình tiền xử lý khác nhau được phân tích bằng phân tích thành phần đường.Khi so sánh hàm lượng oligome đường thu được bằng các phương pháp tiền xử lý khác nhau, sự hiện diện của oligome cứng đầu là một vấn đề phổ biến trong quá trình chuyển đổi sinh khối thành monosacarit và có thể dẫn đến giảm sản lượng đường ít nhất 10-15% và thậm chí lên đến 18%.CHÚNG TA.Phương pháp này được sử dụng để sản xuất các phân đoạn oligosacarit quy mô lớn hơn nữa.ACH thu được và các phân đoạn tiếp theo của nó với các trọng lượng phân tử khác nhau đã được sử dụng làm vật liệu thí nghiệm để mô tả đặc tính của oligosacarit trong công trình này.
Sau khi tiền xử lý và thủy phân bằng enzyme, các oligosacarit dai dẳng vẫn không bị thủy phân.Ở đây (A) là một phương pháp tách oligosacarit trong đó oligosacarit được phân lập từ dịch thủy phân thân cây ngô (ACSH) đã xử lý trước AFEX bằng cách sử dụng một lớp than hoạt tính và đất tảo cát;(B) Phương pháp tách oligosacarit.Các oligosacarit được phân tách thêm bằng sắc ký loại trừ kích thước (SEC);(C) Các monome và oligome sacarit được giải phóng từ các quá trình tiền xử lý khác nhau (axit loãng: DA, chất lỏng ion: IL và AFEX).Điều kiện thủy phân bằng enzym: tải trọng chất rắn cao 25% (w/w) (tải trọng khoảng 8% glucan), quá trình thủy phân 96 giờ, tải lượng enzym thương mại 20 mg/g (tỷ lệ Ctec2:Htec2:MP-2:1:1) và ( D) Các monome và oligome đường của glucose, xyloza và arabinose được giải phóng từ thân ngô đã xử lý trước AFEX (ACS).
Phân tích Glycan đã được chứng minh là một công cụ hữu ích để phân tích cấu trúc toàn diện của glycans trong các chất chiết xuất được phân lập từ dư lượng sinh khối rắn.Tuy nhiên, các sacarit hòa tan trong nước được trình bày dưới mức sử dụng phương pháp truyền thống này41 vì các oligosacarit có trọng lượng phân tử thấp rất khó cố định trên các đĩa ELISA và bị rửa trôi trước khi bổ sung kháng thể.Do đó, để liên kết và mô tả đặc điểm của kháng thể, phương pháp đánh dấu biotin một bước đã được sử dụng để phủ các oligosacarit hòa tan, không tuân thủ lên các bản ELISA được phủ avidin.Phương pháp này đã được thử nghiệm bằng cách sử dụng ACSH được sản xuất trước đây của chúng tôi và một phần nhỏ dựa trên trọng lượng phân tử (hoặc mức độ trùng hợp, DP) của nó.Quá trình biotin hóa một bước đã được sử dụng để tăng ái lực liên kết oligosacarit bằng cách thêm biotin-LC-hydrazide vào đầu khử của carbohydrate (Hình 2).Trong dung dịch, nhóm hemiacet ở đầu khử phản ứng với nhóm hydrazide của biotin-LC-hydrazide để tạo thành liên kết hydrazone.Với sự có mặt của chất khử NaCNBH3, liên kết hydrazone bị khử thành sản phẩm cuối cùng ổn định được đánh dấu biotin.Với việc sửa đổi đầu khử đường, việc liên kết các oligosacarit DP thấp với các đĩa ELISA trở nên khả thi và trong nghiên cứu của chúng tôi, điều này đã được thực hiện trên các đĩa được phủ avidin bằng cách sử dụng mAbs nhắm mục tiêu glycan.
Sàng lọc các kháng thể đơn dòng dựa trên ELISA cho oligosacarit đánh dấu biotin.Ở đây (A) kết hợp quá trình đánh dấu biotin của oligosacarit và sàng lọc ELISA tiếp theo với mAbs nhắm mục tiêu glycan trên các tấm phủ NeutrAvidin và (B) cho thấy quy trình một bước để đánh dấu biotin cho các sản phẩm phản ứng.
Sau đó, các tấm phủ avidin với các kháng thể liên hợp oligosacarit được thêm vào các kháng thể sơ cấp và thứ cấp, đồng thời được rửa trong môi trường nhạy cảm với ánh sáng và thời gian.Sau khi liên kết kháng thể hoàn tất, thêm cơ chất TMB để ủ đĩa.Phản ứng cuối cùng đã dừng lại với axit sulfuric.Các đĩa đã ủ được phân tích bằng cách sử dụng đầu đọc ELISA để xác định cường độ liên kết của từng kháng thể nhằm phát hiện liên kết chéo đặc hiệu của kháng thể.Để biết chi tiết và các thông số của thí nghiệm, hãy xem phần "Vật liệu và Phương pháp" tương ứng.
Chúng tôi chứng minh tính tiện ích của phương pháp mới được phát triển này cho các ứng dụng cụ thể bằng cách mô tả các oligosacarit hòa tan có trong ACSH cũng như trong các phân đoạn oligosacarit thô và tinh khiết được phân lập từ các sản phẩm thủy phân lignocellulose.Như được hiển thị trong Hình 3, các xylan thay thế epitope phổ biến nhất được xác định trong ACSH bằng phương pháp xét nghiệm glycome đã axyl hóa sinh học thường là uronic (U) hoặc methyluronic (MeU) và pectic arabinogalactans.Hầu hết chúng cũng được tìm thấy trong nghiên cứu trước đây của chúng tôi về phân tích glycan của chất rắn không thủy phân (UHS)43.
Phát hiện các epitope oligosacarit cứng đầu bằng cách sử dụng một kháng thể đơn dòng hướng vào glycan của thành tế bào.Phần “trung tính” là phần ACN và phần “có tính axit” là phần FA.Màu đỏ sáng hơn trên bản đồ nhiệt biểu thị hàm lượng văn bia cao hơn và màu xanh lam sáng hơn biểu thị nền trống.Giá trị màu sắc trên thang đo dựa trên giá trị OD thô cho các công thức N=2.Các văn bia chính được các kháng thể nhận ra được hiển thị bên phải.
Các cấu trúc không phải cellulose này không thể bị phân cắt bởi các cellulase và hemicellulase phổ biến nhất trong hỗn hợp enzyme thương mại được thử nghiệm, bao gồm các enzyme thương mại được sử dụng phổ biến nhất.Do đó, cần có các enzyme phụ trợ mới cho quá trình thủy phân của chúng.Nếu không có các enzyme phụ trợ phi cellulose cần thiết, các liên kết phi cellulose này sẽ ngăn chặn quá trình chuyển đổi hoàn toàn thành monosacarit, ngay cả khi các polyme đường gốc của chúng được thủy phân rộng rãi thành các đoạn ngắn hơn và được hòa tan bằng hỗn hợp enzyme thương mại.
Nghiên cứu sâu hơn về phân phối tín hiệu và cường độ liên kết của nó cho thấy rằng các epitope liên kết thấp hơn ở các phân số đường DP cao (A, B, C, DP cho đến 20+) so với các phân số DP thấp (D, E, F, DP) trong các bộ điều chỉnh độ sáng) (Hình 1).Các mảnh axit phổ biến hơn trong các epitope phi cellulose so với các mảnh trung tính.Những hiện tượng này phù hợp với mô hình quan sát được trong nghiên cứu trước đây của chúng tôi, trong đó các gốc axit và DP cao có khả năng chống lại quá trình thủy phân enzyme cao hơn.Do đó, sự hiện diện của các epitope glycan không xenlulô và các chất thay thế U và MeU có thể góp phần rất lớn vào sự ổn định của oligosacarit.Cần lưu ý rằng hiệu quả liên kết và phát hiện có thể là vấn đề đối với oligosacarit DP thấp, đặc biệt nếu epitope là một oligosacarit dimeric hoặc trimeric.Điều này có thể được kiểm tra bằng cách sử dụng oligosacarit thương mại có độ dài khác nhau, mỗi loại chỉ chứa một epitope liên kết với một mAb cụ thể.
Do đó, việc sử dụng các kháng thể đặc hiệu cho cấu trúc đã tiết lộ một số loại liên kết khó tính nhất định.Tùy thuộc vào loại kháng thể được sử dụng, kiểu thắt thích hợp và độ mạnh của tín hiệu mà nó tạo ra (nhiều nhất và ít nhất), các enzyme mới có thể được xác định và thêm bán định lượng vào hỗn hợp enzyme để chuyển đổi glyco hoàn chỉnh hơn.Lấy ví dụ về phân tích các oligosacarit ACSH, chúng ta có thể tạo cơ sở dữ liệu về các liên kết glycan cho từng vật liệu sinh khối.Cần lưu ý ở đây rằng nên tính đến ái lực khác nhau của các kháng thể và nếu không biết được ái lực của chúng, điều này sẽ tạo ra những khó khăn nhất định khi so sánh tín hiệu của các kháng thể khác nhau.Ngoài ra, so sánh các liên kết glycan có thể hoạt động tốt nhất giữa các mẫu đối với cùng một kháng thể.Sau đó, các liên kết cứng đầu này có thể được liên kết với cơ sở dữ liệu CAZyme, từ đó chúng tôi có thể xác định các enzym, chọn các enzym ứng cử viên và kiểm tra các enzym phá vỡ liên kết hoặc phát triển các hệ thống vi sinh vật để biểu hiện các enzym này để sử dụng trong các nhà máy tinh chế sinh học44.
Để đánh giá cách các phương pháp miễn dịch bổ sung cho các phương pháp thay thế để mô tả các oligosacarit trọng lượng phân tử thấp có trong các chất thủy phân lignocellulose, chúng tôi đã thực hiện MALDI (Hình 4, S1-S8) và phân tích các sacarit có nguồn gốc từ TMS dựa trên GC-MS trên cùng một bảng điều khiển (Hình 5) phần oligosacarit.MALDI được sử dụng để so sánh xem sự phân bố khối lượng của các phân tử oligosacarit có khớp với cấu trúc dự định hay không.Trên hình.4 cho thấy MC của các thành phần trung tính ACN-A và ACN-B.Phân tích ACN-A đã xác nhận một loạt các loại đường pentose từ DP 4–8 (Hình 4) đến DP 22 (Hình S1), có trọng lượng tương ứng với các oligosacarit MeU-xylan.Phân tích ACN-B đã xác nhận chuỗi pentose và glucoxylan với DP 8-15.Trong tài liệu bổ sung như Hình S3, các bản đồ phân bố khối lượng gốc axit FA-C cho thấy một loạt các loại đường pentose được thay thế (Me)U với DP là 8-15 phù hợp với các xylan được thay thế được tìm thấy trong quá trình sàng lọc mAb dựa trên ELISA.Các epitope là nhất quán.
Phổ MALDI-MS của oligosacarit không tuân thủ hòa tan có trong ACS.Ở đây, (A) ACN-A phân đoạn trọng lượng thấp chứa axit uronic đã methyl hóa (DP 4-8) glucuroxylan oligosacarit được thế và (B) ACN-B xylan và oligosacarit axit uronic đã methyl hóa được thế bằng glucuroxylan (DP 8-15).
Phân tích thành phần của dư lượng glycan của oligosacarit chịu lửa.Ở đây (A) Thành phần sacarit TMS của các phân đoạn oligosacarit khác nhau thu được bằng phân tích GC-MS.(B) Cấu trúc của các loại đường có nguồn gốc TMS khác nhau có trong oligosacarit.ACN – phần axetonitril chứa oligosacarit trung tính và FA – phần axit ferulic chứa oligosacarit axit.
Một kết luận thú vị khác được rút ra từ phân tích LC-MS của phần oligosacarit, như trong Hình S9 (có thể thấy các phương pháp trong tài liệu bổ sung điện tử).Các mảnh của nhóm hexose và -OAc được quan sát nhiều lần trong quá trình thắt phần ACN-B.Phát hiện này không chỉ xác nhận sự phân mảnh được quan sát thấy trong phân tích glycome và MALDI-TOF, mà còn cung cấp thông tin mới về các dẫn xuất carbohydrate tiềm năng trong sinh khối lignocellulose đã được xử lý trước.
Chúng tôi cũng đã phân tích thành phần đường của phần oligosacarit bằng cách sử dụng dẫn xuất đường TMS.Sử dụng GC-MS, chúng tôi đã xác định thành phần của đường thần kinh (không dẫn xuất) và đường có tính axit (GluA và GalA) trong phần oligosacarit (Hình 5).Axit glucuronic được tìm thấy trong các thành phần axit C và D, trong khi axit galacturonic được tìm thấy trong các thành phần axit A và B, cả hai đều là thành phần DP cao của đường axit.Những kết quả này không chỉ xác nhận dữ liệu ELISA và MALDI của chúng tôi mà còn phù hợp với các nghiên cứu trước đây của chúng tôi về sự tích lũy oligosacarit.Do đó, chúng tôi tin rằng các phương pháp miễn dịch hiện đại sử dụng quá trình biotin hóa oligosacarit và sàng lọc ELISA tiếp theo là đủ để phát hiện oligosacarit khó hòa tan trong các mẫu sinh học khác nhau.
Vì các phương pháp sàng lọc mAb dựa trên ELISA đã được xác thực bằng một số phương pháp khác nhau, nên chúng tôi muốn khám phá thêm tiềm năng của phương pháp định lượng mới này.Hai oligosacarit thương mại, xylohexasacarit oligosacarit (XHE) và 23-α-L-arabinofuranosyl-xylotriose (A2XX), đã được mua và thử nghiệm bằng cách sử dụng phương pháp mAb mới nhắm vào glycan của thành tế bào.Hình 6 cho thấy mối tương quan tuyến tính giữa tín hiệu liên kết đánh dấu biotin và log nồng độ oligosacarit, gợi ý một mô hình hấp phụ Langmuir khả thi.Trong số các mAbs, CCRC-M137, CCRC-M138, CCRC-M147, CCRC-M148 và CCRC-M151 tương quan với XHE, và CCRC-M108, CCRC-M109 và LM11 tương quan với A2XX trong phạm vi từ 1 nm đến 100 nano.Do số lượng kháng thể sẵn có hạn chế trong quá trình thí nghiệm, các thí nghiệm hạn chế được thực hiện với từng nồng độ oligosacarit.Cần lưu ý ở đây rằng một số kháng thể phản ứng rất khác nhau với cùng một oligosacarit làm cơ chất, có lẽ là do chúng liên kết với các epitope hơi khác nhau và có thể có ái lực liên kết rất khác nhau.Các cơ chế và ý nghĩa của việc xác định văn bia chính xác sẽ phức tạp hơn nhiều khi phương pháp mAb mới được áp dụng cho các mẫu thực.
Hai oligosacarit thương mại đã được sử dụng để xác định phạm vi phát hiện của các mAbs nhắm mục tiêu glycan khác nhau.Ở đây, các mối tương quan tuyến tính với log nồng độ nồng độ oligosacarit biểu thị các kiểu hấp phụ Langmuir đối với (A) XHE với mAb và (B) A2XX với mAb.Các epitope tương ứng biểu thị cấu trúc của oligosacarit thương mại được sử dụng làm cơ chất trong xét nghiệm.
Việc sử dụng các kháng thể đơn dòng nhắm mục tiêu glycan (phân tích glycocomic hoặc sàng lọc mAb dựa trên ELISA) là một công cụ mạnh mẽ để mô tả đặc tính chuyên sâu của hầu hết các glycan chính của thành tế bào tạo nên sinh khối thực vật.Tuy nhiên, phân tích glycan cổ điển chỉ đặc trưng cho glycan thành tế bào lớn hơn, vì hầu hết các oligosacarit không được cố định hiệu quả trên các tấm ELISA.Trong nghiên cứu này, thân cây ngô đã xử lý trước bằng AFEX được thủy phân bằng enzym ở hàm lượng chất rắn cao.Phân tích đường được sử dụng để xác định thành phần của carbohydrate thành tế bào khó tính trong dịch thủy phân.Tuy nhiên, phân tích mAb của oligosacarit nhỏ hơn trong sản phẩm thủy phân bị đánh giá thấp và cần có các công cụ bổ sung để cố định hiệu quả oligosacarit trên các đĩa ELISA.
Chúng tôi báo cáo ở đây một phương pháp cố định oligosacarit mới và hiệu quả để sàng lọc mAb bằng cách kết hợp quá trình đánh dấu sinh học oligosacarit, sau đó là sàng lọc ELISA trên các tấm phủ NeutrAvidin™.Các oligosacarit đánh dấu biotin cố định cho thấy có đủ ái lực với kháng thể để cho phép phát hiện nhanh chóng và hiệu quả các oligosacarit khó tính.Phân tích thành phần của các oligosacarit cứng đầu này dựa trên phép đo khối phổ đã xác nhận kết quả của phương pháp sàng lọc miễn dịch mới này.Do đó, các nghiên cứu này chứng minh rằng sự kết hợp giữa quá trình biotin hóa oligosacarit và sàng lọc ELISA với các kháng thể đơn dòng nhắm mục tiêu glycan có thể được sử dụng để phát hiện các liên kết chéo trong oligosacarit và có thể được áp dụng rộng rãi trong các nghiên cứu sinh hóa khác mô tả cấu trúc của oligosacarit.
Phương pháp định hình glycan dựa trên biotin này là báo cáo đầu tiên có khả năng nghiên cứu các liên kết carbohydrate khó tính của oligosacarit hòa tan trong sinh khối thực vật.Điều này giúp hiểu tại sao một số bộ phận của sinh khối rất cứng đầu khi sản xuất nhiên liệu sinh học.Phương pháp này lấp đầy một khoảng trống quan trọng trong các phương pháp phân tích glycome và mở rộng ứng dụng của nó cho nhiều loại chất nền hơn ngoài oligosacarit thực vật.Trong tương lai, chúng tôi có thể sử dụng rô-bốt để đánh dấu biotin hóa và sử dụng phương pháp mà chúng tôi đã phát triển để phân tích các mẫu thông lượng cao bằng ELISA.
Ngô rơm (CS) được trồng từ hạt lai Pioneer 33A14 được thu hoạch vào năm 2010 từ Kramer Farms ở Ray, Colorado.Với sự cho phép của chủ đất, sinh khối này có thể được sử dụng cho nghiên cứu. Các mẫu được bảo quản khô, độ ẩm <6% trong túi zip-lock ở nhiệt độ phòng. Các mẫu được bảo quản khô, độ ẩm <6% trong túi zip-lock ở nhiệt độ phòng. Образцы хранились сухими влажности < 6% в пакетах с застежкой-молнией при комнатной тем пературе. Các mẫu được bảo quản khô ở độ ẩm <6% trong túi có khóa kéo ở nhiệt độ phòng.Tỷ lệ người tiêu dùng bị ảnh hưởng < 6% tỷ lệ người tiêu dùng bị ảnh hưởng样品在室温下以干燥< 6% Tỷ lệ thanh toán của người lao động trên toàn thế giới < 6%. Mẫu được bảo quản trong túi zipper ở nhiệt độ phòng với độ ẩm < 6%.Nghiên cứu tuân thủ các hướng dẫn của địa phương và quốc gia.Phân tích thành phần được thực hiện bằng giao thức NREL.Chế phẩm được phát hiện có chứa 31,4% glucan, 18,7% xylan, 3,3% arabinan, 1,2% galactan, 2,2% acetyl, 14,3% lignin, 1,7% protein và 13,4% tro.
Cellic® CTec2 (138 mg protein/ml, lô VCNI 0001) là hỗn hợp phức hợp của cellulase, β-glucosidase và Cellic® HTec2 (157 mg protein/ml, lô VHN00001) của Novozymes (Franklinton, NC, USA)).Multifect Pectinase® (72 mg protein/mL), một hỗn hợp phức hợp gồm các enzyme phân giải pectin, được tài trợ bởi DuPont Industrial Bioscatics (Palo Alto, CA, USA).Nồng độ protein enzyme được xác định bằng cách ước tính hàm lượng protein (và trừ đi phần đóng góp của nitơ phi protein) bằng cách sử dụng phân tích nitơ Kjeldahl (phương pháp AOAC 2001.11, Dairy One HTX Inc., Ithaca, NY, USA).Đất tảo cát 545 được mua từ EMD Millipore (Billerica, MA).Than hoạt tính (DARCO, hạt 100 lưới), Avicel (PH-101), xylan sồi và tất cả các hóa chất khác được mua từ Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).
Tiền xử lý AFEX được thực hiện tại GLBRC (Phòng thí nghiệm nghiên cứu chuyển đổi sinh khối, MSU, Lansing, MI, Hoa Kỳ).Tiền xử lý được thực hiện ở 140° C. trong 15 phút.46 thời gian lưu trú ở tỷ lệ 1:1 của amoniac khan so với sinh khối ở mức tải 60% (w/w) trong lò phản ứng mẻ để bàn bằng thép không gỉ (Công ty Parr Instruments).Mất 30 phút.Lò phản ứng được đưa đến nhiệt độ 140°C và amoniac nhanh chóng được giải phóng, cho phép sinh khối nhanh chóng trở lại nhiệt độ phòng.Thành phần của thân cây ngô xử lý trước AFEX (ACS) tương tự như thành phần của thân cây ngô chưa xử lý (UT-CS).
Chất rắn cao ACSH 25% (w/w) (khoảng 8% dextran tải) đã được điều chế làm nguyên liệu ban đầu để sản xuất oligosacarit quy mô lớn.Quá trình thủy phân ACS bằng enzym được thực hiện bằng cách sử dụng hỗn hợp enzym thương mại bao gồm Cellic® Ctec2 10 mg protein/g glucan (trong sinh khối đã xử lý trước), Htec2 (Novozymes, Franklinton, NC), 5 mg protein/g glucan và Multifect Pectinase (Genencor Inc, USA).).), 5 mg protein/g dextran.Quá trình thủy phân bằng enzym được thực hiện trong bình phản ứng sinh học 5 lít với thể tích làm việc là 3 lít, pH 4,8, 50°C và 250 vòng/phút.Sau khi thủy phân trong 96 giờ, dịch thủy phân được thu lại bằng cách ly tâm ở 6000 vòng/phút trong 30 phút và sau đó ở 14000 vòng/phút trong 30 phút để loại bỏ chất rắn không thủy phân.Dịch thủy phân sau đó được lọc vô trùng qua cốc lọc 0,22 mm.Dịch thủy phân đã lọc được bảo quản trong chai vô trùng ở 4° C. và sau đó được phân đoạn trên carbon.
Phân tích thành phần của các mẫu sinh khối dựa trên chiết xuất theo quy trình phân tích trong phòng thí nghiệm của NREL: chuẩn bị mẫu để phân tích thành phần (NREL/TP-510-42620) và xác định carbohydrate cấu trúc và lignin trong sinh khối (NREL/TP-510 – 42618)47.
Phân tích oligosacarit của dòng thủy phân được thực hiện trên thang đo 2 ml bằng phương pháp thủy phân axit dựa trên nồi hấp.Trộn mẫu thủy phân với 69,7 µl axit sulfuric 72% trong ống nuôi cấy có nắp vặn 10 ml và ủ trong 1 giờ trên bàn ở nhiệt độ 121 °C, làm lạnh trên đá và lọc vào lọ sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) .Nồng độ của oligosacarit được xác định bằng cách lấy tổng nồng độ đường trong mẫu thủy phân bằng axit trừ đi nồng độ của monosacarit trong mẫu không thủy phân.
Nồng độ glucose, xyloza và arabinose trong sinh khối thủy phân bằng axit được phân tích bằng cách sử dụng hệ thống Shimadzu HPLC được trang bị bộ lấy mẫu tự động, bộ gia nhiệt cột, bơm đẳng tốc và máy dò chỉ số khúc xạ trên cột Bio-Rad Aminex HPX-87H.Cột được duy trì ở 50°C và rửa giải bằng H2SO4 0,6 ml/phút 5 mM trong nước.chảy.
Dịch nổi phía trên dịch thủy phân được pha loãng và phân tích hàm lượng monome và oligosacarit.Đường monome thu được sau quá trình thủy phân bằng enzym được phân tích bằng HPLC được trang bị cột Bio-Rad (Hercules, CA) Aminex HPX-87P và cột bảo vệ tro.Nhiệt độ cột được duy trì ở 80°C, nước được sử dụng làm pha động với tốc độ dòng 0,6 ml/phút.Oligosacarit được xác định bằng cách thủy phân trong axit loãng ở 121 ° C theo các phương pháp được mô tả trong tài liệu tham khảo.41, 48, 49.
Phân tích sacarit được thực hiện trên nguyên liệu thô, AFEX đã xử lý trước và tất cả dư lượng sinh khối không thủy phân (bao gồm sản xuất các chiết xuất thành tế bào nối tiếp và sàng lọc mAb của chúng) bằng cách sử dụng các quy trình được mô tả trước đây 27, 43, 50, 51 .Đối với phân tích đường glycome, các cặn không tan trong cồn của vật liệu thành tế bào thực vật được chuẩn bị từ các cặn sinh khối và được chiết xuất nối tiếp bằng các thuốc thử tăng cường độ như amoni oxalat (50 mM), natri cacbonat (50 mM và 0,5% khối lượng/thể tích), CON.(1M và 4M, cả hai đều có 1% w/v natri borohydride) và axit clorit như đã mô tả trước đây52,53.Các chất chiết xuất sau đó được xử lý ELISA dựa trên một bảng phức tạp gồm các mAb50 hướng đến glycan của thành tế bào, và các phản ứng liên kết mAb được trình bày dưới dạng bản đồ nhiệt.mAbs nhắm mục tiêu glycan thành tế bào thực vật đã được mua từ kho dự trữ trong phòng thí nghiệm (dòng CCRC, JIM và MAC).
Quá trình biotin hóa một bước của oligosacarit.Sự kết hợp của carbohydrate với biotin-LC-hydrazide được thực hiện bằng quy trình sau.Biotin-LC-hydrazide (4,6 mg/12 μmol) được hòa tan trong dimetyl sulfoxit (DMSO, 70 μl) bằng cách khuấy mạnh và đun nóng ở 65°C trong 1 phút.Axit axetic băng (30µl) được thêm vào và đổ hỗn hợp này lên natri xyanoborohydrua (6,4 mg/100µmol) và hòa tan hoàn toàn sau khi đun nóng ở 65° C. trong khoảng 1 phút.Sau đó, từ 5 đến 8 μl hỗn hợp phản ứng được thêm vào oligosacarit khô (1-100nmol) để thu được lượng mol dư gấp 10 lần hoặc hơn so với nhãn trên đầu khử.Phản ứng được thực hiện ở 65°C trong 2 giờ, sau đó các mẫu được tinh chế ngay lập tức.Không có natri xyanoborohydrua nào được sử dụng trong các thí nghiệm dán nhãn mà không khử và các mẫu được phản ứng ở 65° C. trong 2,5 giờ.
Phủ ELISA và rửa các mẫu oligosacarit đánh dấu biotin.25 μl mẫu đánh dấu biotin (100 μl mỗi mẫu cô đặc được pha loãng trong 5 ml dung dịch đệm Tris 0,1 M (TBS)) được thêm vào từng giếng của tấm phủ avidin.Các giếng đối chứng được phủ 50 μl biotin ở nồng độ 10 μg/ml trong 0,1 M TBS.Nước khử ion được sử dụng làm lớp phủ cho các phép đo trắng.Viên nén được ủ trong 2 giờ ở nhiệt độ phòng trong bóng tối.Rửa đĩa 3 lần với 0,1% sữa gầy trong 0,1 M TBS sử dụng chương trình số.11 cho căn hộ Grenier 3A.
Bổ sung và rửa các kháng thể chính.Thêm 40 µl kháng thể sơ cấp vào mỗi giếng.Ủ tấm vi mạch trong 1 giờ ở nhiệt độ phòng trong bóng tối.Các đĩa sau đó được rửa 3 lần với 0,1% sữa trong 0,1M TBS bằng chương trình rửa #11 cho Grenier Flat 3A.
Thêm kháng thể thứ cấp và rửa.Thêm 50 µl kháng thể thứ cấp của chuột nhắt/chuột cống (pha loãng theo tỷ lệ 1:5000 trong sữa 0,1% trong TBS 0,1 M) vào mỗi giếng.Ủ tấm vi mạch trong 1 giờ ở nhiệt độ phòng trong bóng tối.Các khay vi thể sau đó được rửa 5 lần với 0,1% sữa trong 0,1 M TBS bằng chương trình rửa khay Grenier Flat 5A #12.
Thêm một chất nền.Thêm 50 μl 3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine (TMB) vào chất nền cơ bản (bằng cách thêm 2 giọt dung dịch đệm, 3 giọt TMB, 2 giọt hydro peroxide vào 15 ml nước khử ion).Chuẩn bị chất nền TMB.và xoáy trước khi sử dụng).Ủ tấm vi mạch ở nhiệt độ phòng trong 30 phút.Trong bóng tối.
Hoàn thành bước và đọc máy tính bảng.Thêm 50 µl axit sunfuric 1 N vào mỗi giếng và ghi lại độ hấp thụ từ 450 đến 655 nm bằng máy đọc ELISA.
Chuẩn bị dung dịch 1 mg/ml của các chất phân tích này trong nước khử ion: arabinose, rhamnose, fucose, xyloza, axit galacturonic (GalA), axit glucuronic (GlcA), mannose, glucose, galactose, lactose, N-acetylmannosamine (manNAc), N-acetylglucosamine .(glcNAc), N-acetylgalactosamine (galNAc), inositol (chuẩn nội).Hai chất chuẩn được chuẩn bị bằng cách thêm các dung dịch đường 1 mg/mL như trong Bảng 1. Các mẫu được đông lạnh và đông khô ở -80° C. cho đến khi loại bỏ hết nước (thường khoảng 12-18 giờ).
Thêm 100–500 µg mẫu vào các ống có nắp vặn trên cân phân tích.Ghi lại số tiền được thêm vào.Tốt nhất là hòa tan mẫu trong dung môi có nồng độ cụ thể và thêm vào ống dưới dạng dịch lỏng.Sử dụng 20 µl inositol 1 mg/ml làm chất chuẩn nội cho mỗi ống mẫu.Lượng chất chuẩn nội được thêm vào mẫu phải bằng lượng chất chuẩn nội được thêm vào ống chuẩn.
Cho 8 ml metanol khan vào lọ có nắp vặn.Sau đó 4 ml dung dịch HCl 3 N. trong metanol, đậy nắp và lắc.Quá trình này không sử dụng nước.
Thêm 500 µl dung dịch metanol HCl 1 M vào các mẫu oligosacarit và ống TMS tiêu chuẩn.Các mẫu được ủ qua đêm (168 giờ) ở 80° C. trong một khối nhiệt.Làm khô sản phẩm của quá trình metanol hóa ở nhiệt độ phòng bằng ống sấy.Thêm 200 µl MeOH và làm khô lại.Quá trình này được lặp lại hai lần.Thêm 200 µl metanol, 100 µl pyridin và 100 µl anhydrit axetic vào mẫu và trộn đều.Các mẫu được ủ ở nhiệt độ phòng trong 30 phút.và sấy khô.Thêm 200 µl metanol và làm khô lại.
Thêm 200 µl Tri-Sil và đun nóng ống có nắp đậy trong 20 phút.80°C, sau đó làm nguội đến nhiệt độ phòng.Sử dụng ống góp sấy khô để làm khô thêm mẫu đến thể tích khoảng 50 µl.Điều quan trọng cần lưu ý là chúng tôi không để mẫu khô hoàn toàn.
Thêm 2 ml hexan và trộn đều bằng vortex.Đổ đầy các đầu pipet Pasteur (5-8 mm) bằng một miếng bông thủy tinh bằng cách đặt bông thủy tinh lên trên đầu pipet có đường kính 5-3/4 inch.Các mẫu được ly tâm ở 3000 g trong 2 phút.Bất kỳ dư lượng không hòa tan được kết tủa.Làm khô mẫu đến 100-150 µl.Một thể tích khoảng 1 μl được bơm vào GC-MS ở nhiệt độ ban đầu là 80°C và thời gian ban đầu là 2,0 phút (Bảng 2).