Cảm ơn bạn đã ghé thăm Nature.com. Phiên bản trình duyệt bạn đang sử dụng có hỗ trợ CSS hạn chế. Để có trải nghiệm tốt nhất, chúng tôi khuyên bạn nên sử dụng trình duyệt được cập nhật (hoặc tắt Chế độ tương thích trong Internet Explorer). Trong thời gian chờ đợi, để đảm bảo hỗ trợ liên tục, chúng tôi sẽ hiển thị trang web mà không có kiểu dáng và JavaScript.
Các phương pháp miễn dịch và phổ khối lượng mới để phân tích phức hợp các oligosaccharide bền vững trong thân cây ngô được xử lý sơ bộ bằng AFEX. Sinh khối lignocellulose là một giải pháp thay thế bền vững cho nhiên liệu hóa thạch và được sử dụng rộng rãi để phát triển các công nghệ sinh học sản xuất các sản phẩm như thực phẩm, thức ăn chăn nuôi, nhiên liệu và hóa chất. Chìa khóa của các công nghệ này là phát triển các quy trình cạnh tranh về chi phí để chuyển đổi các carbohydrate phức tạp có trong thành tế bào thực vật thành các đường đơn giản như glucose, xylose và arabinose. Vì sinh khối lignocellulose rất khó phân hủy, nó phải được xử lý bằng các phương pháp nhiệt hóa học (ví dụ: tách sợi amoniac (AFEX), axit loãng (DA), chất lỏng ion (IL)) và xử lý sinh học (ví dụ: thủy phân enzyme và lên men vi sinh) kết hợp để thu được sản phẩm mong muốn. Tuy nhiên, khi sử dụng các enzyme nấm thương mại trong quá trình thủy phân, chỉ có 75-85% lượng đường hòa tan được tạo thành là monosaccharide, và 15-25% còn lại là các oligosaccharide hòa tan, khó phân hủy, không phải lúc nào cũng có sẵn cho vi sinh vật. Trước đây, chúng tôi đã phân lập và tinh chế thành công các oligosaccharide hòa tan khó phân hủy bằng cách kết hợp phương pháp tách bằng carbon và đất tảo cát cùng với sắc ký loại trừ kích thước, đồng thời nghiên cứu các đặc tính ức chế enzyme của chúng. Chúng tôi nhận thấy rằng các oligosaccharide chứa các nhóm thế axit uronic metyl hóa có độ trùng hợp (DP) cao hơn khó xử lý hơn với các hỗn hợp enzyme thương mại so với các oligosaccharide có DP thấp và trung tính. Ở đây, chúng tôi báo cáo việc sử dụng một số phương pháp bổ sung, bao gồm phân tích cấu hình glycan bằng kháng thể đơn dòng (mAbs) đặc hiệu với glycan sinh khối thực vật để đặc trưng hóa các liên kết glycan trong thành tế bào thực vật và các sản phẩm thủy phân enzyme, ion hóa giải hấp thụ laser hỗ trợ ma trận, phổ khối lượng thời gian bay (MALDI-TOF-MS). MALDI-TOF-MS sử dụng các đỉnh chẩn đoán cung cấp thông tin cấu trúc thu được bằng quang phổ sau khi phân rã thứ cấp của các ion âm, sắc ký khí và phổ khối lượng (GC-MS) để đặc trưng hóa các liên kết oligosaccharide có và không có dẫn xuất hóa. Do kích thước nhỏ của oligosaccharide (DP 4–20), các phân tử này khó sử dụng để liên kết và đặc trưng hóa kháng thể đơn dòng (mAb). Để khắc phục vấn đề này, chúng tôi đã áp dụng một phương pháp cố định oligosaccharide dựa trên liên hợp biotin mới, phương pháp này đã thành công trong việc gắn nhãn phần lớn các oligosaccharide hòa tan có DP thấp lên bề mặt vi tấm, sau đó được sử dụng trong hệ thống mAb tốc độ cao để phân tích liên kết đặc hiệu. Phương pháp mới này sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho việc phát triển các xét nghiệm glycome tốc độ cao tiên tiến hơn trong tương lai, có thể được sử dụng để phân lập và đặc trưng hóa các oligosaccharide có trong các dấu ấn sinh học phục vụ mục đích chẩn đoán.
Sinh khối lignocellulose, bao gồm các vật liệu nông nghiệp, lâm nghiệp, cỏ và gỗ, là nguyên liệu tiềm năng để sản xuất các sản phẩm sinh học, bao gồm thực phẩm, thức ăn chăn nuôi, nhiên liệu và tiền chất hóa học để sản xuất các sản phẩm có giá trị cao hơn1. Carbohydrate (như cellulose và hemicellulose) có trong thành tế bào thực vật được phân giải thành monosaccharide bằng quá trình xử lý hóa học và chuyển hóa sinh học (như thủy phân enzyme và lên men vi sinh). Các phương pháp tiền xử lý phổ biến bao gồm giãn nở sợi amoniac (AFEX), axit loãng (DA), chất lỏng ion (IL) và nổ hơi nước (SE), sử dụng sự kết hợp giữa hóa chất và nhiệt để giảm sản lượng lignocellulose bằng cách mở thành tế bào thực vật3,4. 5. Thủy phân enzyme được thực hiện ở tải trọng chất rắn cao bằng cách sử dụng các enzyme chứa carbohydrate hoạt tính thương mại (CAZymes) và lên men vi sinh sử dụng nấm men hoặc vi khuẩn chuyển gen để sản xuất nhiên liệu và hóa chất sinh học6.
Các CAZyme trong các enzyme thương mại bao gồm một hỗn hợp phức tạp các enzyme hoạt động đồng thời để phân cắt các liên kết carbohydrate-đường phức tạp tạo thành monosaccharide2,7. Như chúng tôi đã báo cáo trước đó, mạng lưới phức tạp của các polyme thơm của lignin với carbohydrate khiến chúng rất khó xử lý, dẫn đến quá trình chuyển hóa đường không hoàn toàn, tích tụ 15-25% oligosaccharide không được tạo ra trong quá trình thủy phân enzyme của sinh khối đã được xử lý sơ bộ. Đây là một vấn đề phổ biến với nhiều phương pháp xử lý sơ bộ sinh khối. Một số nguyên nhân gây ra tắc nghẽn này bao gồm sự ức chế enzyme trong quá trình thủy phân, hoặc sự thiếu hụt hoặc nồng độ thấp của các enzyme thiết yếu cần thiết để phá vỡ các liên kết đường trong sinh khối thực vật. Hiểu được thành phần và đặc điểm cấu trúc của đường, chẳng hạn như các liên kết đường trong oligosaccharide, sẽ giúp chúng ta cải thiện quá trình chuyển hóa đường trong quá trình thủy phân, làm cho các quy trình công nghệ sinh học có tính cạnh tranh về chi phí với các sản phẩm có nguồn gốc từ dầu mỏ.
Việc xác định cấu trúc của carbohydrate rất khó khăn và đòi hỏi sự kết hợp của nhiều phương pháp như sắc ký lỏng (LC)11,12, quang phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)13, điện di mao quản (CE)14,15,16 và phổ khối lượng (MS)17, 18. Các phương pháp MS như phổ khối lượng thời gian bay với sự giải hấp và ion hóa bằng laser sử dụng ma trận (MALDI-TOF-MS) là một phương pháp đa năng để xác định cấu trúc carbohydrate. Gần đây, MS song song phân ly do va chạm (CID) của các chất cộng hợp ion natri đã được sử dụng rộng rãi nhất để xác định dấu vân tay tương ứng với vị trí gắn kết oligosaccharide, cấu hình anomeric, trình tự và vị trí phân nhánh 20, 21.
Phân tích glycan là một công cụ tuyệt vời để xác định sâu sắc các liên kết carbohydrate22. Phương pháp này sử dụng kháng thể đơn dòng (mAbs) hướng đến glycan thành tế bào thực vật làm chất dò để hiểu các liên kết carbohydrate phức tạp. Hơn 250 mAbs hiện có trên toàn thế giới, được thiết kế chống lại nhiều oligosaccharide mạch thẳng và mạch nhánh bằng cách sử dụng nhiều saccharide khác nhau24. Một số mAbs đã được sử dụng rộng rãi để mô tả cấu trúc, thành phần và sự biến đổi của thành tế bào thực vật, vì có sự khác biệt đáng kể tùy thuộc vào loại tế bào thực vật, cơ quan, tuổi, giai đoạn phát triển và môi trường sinh trưởng25,26. Gần đây hơn, phương pháp này đã được sử dụng để hiểu quần thể túi trong hệ thống thực vật và động vật và vai trò tương ứng của chúng trong vận chuyển glycan được xác định bởi các dấu hiệu dưới tế bào, giai đoạn phát triển hoặc các tác nhân kích thích môi trường, và để xác định hoạt động enzym. Một số cấu trúc khác nhau của glycan và xylan đã được xác định bao gồm pectin (P), xylan (X), mannan (M), xyloglucan (XylG), glucan liên kết hỗn hợp (MLG), arabinoxylan (ArbX), galactomannan (GalG), axit glucuronic-arabinoxylan (GArbX) và arabino-galactan (ArbG)29.
Tuy nhiên, bất chấp tất cả những nỗ lực nghiên cứu này, chỉ có một vài nghiên cứu tập trung vào bản chất của sự tích tụ oligosaccharide trong quá trình thủy phân tải trọng chất rắn cao (HSL), bao gồm sự giải phóng oligosaccharide, sự thay đổi chiều dài chuỗi oligomeric trong quá trình thủy phân, các polyme DP thấp khác nhau và đường cong phân bố của chúng 30,31,32. Trong khi đó, mặc dù phân tích glycan đã được chứng minh là một công cụ hữu ích cho việc phân tích toàn diện cấu trúc glycan, nhưng rất khó để đánh giá các oligosaccharide DP thấp hòa tan trong nước bằng phương pháp kháng thể. Các oligosaccharide DP nhỏ hơn với trọng lượng phân tử nhỏ hơn 5-10 kDa không liên kết với đĩa ELISA 33, 34 và bị rửa trôi trước khi thêm kháng thể.
Lần đầu tiên, chúng tôi trình bày phương pháp xét nghiệm ELISA trên đĩa phủ avidin sử dụng kháng thể đơn dòng, kết hợp quy trình biotin hóa một bước cho các oligosaccharide khó phân hủy hòa tan với phân tích glycome. Phương pháp phân tích glycome của chúng tôi đã được xác thực bằng phân tích dựa trên MALDI-TOF-MS và GC-MS về các liên kết oligosaccharide bổ sung bằng cách dẫn xuất trimethylsilyl (TMS) của các thành phần đường thủy phân. Phương pháp tiên tiến này có thể được phát triển thành một phương pháp năng suất cao trong tương lai và tìm thấy ứng dụng rộng rãi hơn trong nghiên cứu y sinh học35.
Các biến đổi sau dịch mã của enzyme và kháng thể, chẳng hạn như glycosyl hóa,36 ảnh hưởng đến hoạt động sinh học của chúng. Ví dụ, những thay đổi trong glycosyl hóa của protein huyết thanh đóng vai trò quan trọng trong viêm khớp, và những thay đổi trong glycosyl hóa được sử dụng làm dấu ấn chẩn đoán37. Nhiều loại glycan đã được báo cáo trong tài liệu là dễ dàng xuất hiện trong nhiều bệnh khác nhau, bao gồm các bệnh viêm mãn tính của đường tiêu hóa và gan, nhiễm virus, ung thư buồng trứng, vú và tuyến tiền liệt38,39,40. Hiểu cấu trúc của glycan bằng phương pháp ELISA glycan dựa trên kháng thể sẽ mang lại sự tự tin hơn trong chẩn đoán bệnh mà không cần sử dụng các phương pháp MS phức tạp.
Nghiên cứu trước đây của chúng tôi cho thấy các oligosaccharide cứng đầu vẫn không bị thủy phân sau quá trình tiền xử lý và thủy phân bằng enzyme (Hình 1). Trong công trình đã công bố trước đây, chúng tôi đã phát triển phương pháp chiết pha rắn bằng than hoạt tính để phân lập oligosaccharide từ dịch thủy phân thân cây ngô được tiền xử lý bằng AFEX (ACSH)8. Sau khi chiết xuất và tách ban đầu, các oligosaccharide được phân đoạn thêm bằng sắc ký loại trừ kích thước (SEC) và thu thập theo thứ tự khối lượng phân tử. Các monome và oligome đường được giải phóng từ các quá trình tiền xử lý khác nhau được phân tích bằng phân tích thành phần đường. Khi so sánh hàm lượng oligome đường thu được bằng các phương pháp tiền xử lý khác nhau, sự hiện diện của các oligosaccharide cứng đầu là một vấn đề phổ biến trong quá trình chuyển đổi sinh khối thành monosaccharide và có thể dẫn đến giảm năng suất đường ít nhất 10-15% và thậm chí lên đến 18%. Phương pháp này được sử dụng để sản xuất các phân đoạn oligosaccharide quy mô lớn hơn nữa. ACH thu được và các phân đoạn tiếp theo của nó với khối lượng phân tử khác nhau được sử dụng làm vật liệu thí nghiệm để đặc trưng hóa oligosaccharide trong công trình này.
Sau quá trình tiền xử lý và thủy phân bằng enzyme, các oligosaccharide bền vững vẫn còn chưa bị thủy phân. Hình (A) là phương pháp tách oligosaccharide, trong đó oligosaccharide được phân lập từ dịch thủy phân thân cây ngô đã được tiền xử lý bằng AFEX (ACSH) bằng cách sử dụng lớp vật liệu đóng gói gồm than hoạt tính và đất tảo cát; (B) Phương pháp tách oligosaccharide. Các oligosaccharide được tách tiếp bằng sắc ký loại trừ kích thước (SEC); (C) Các monome và oligome saccharide được giải phóng từ các quá trình tiền xử lý khác nhau (axit loãng: DA, chất lỏng ion: IL và AFEX). Điều kiện thủy phân bằng enzyme: tải trọng chất rắn cao 25% (w/w) (tải trọng glucan khoảng 8%), thủy phân 96 giờ, tải trọng enzyme thương mại 20 mg/g (tỷ lệ Ctec2:Htec2:MP-2:1:1) và (D) Các monome và oligome đường glucose, xylose và arabinose được giải phóng từ thân cây ngô đã được tiền xử lý bằng AFEX (ACS).
Phân tích glycan đã được chứng minh là một công cụ hữu ích cho việc phân tích cấu trúc toàn diện của glycan trong các chất chiết xuất được phân lập từ cặn sinh khối rắn. Tuy nhiên, các saccharide hòa tan trong nước bị đánh giá thấp khi sử dụng phương pháp truyền thống này41 vì các oligosaccharide có trọng lượng phân tử thấp khó cố định trên đĩa ELISA và bị rửa trôi trước khi thêm kháng thể. Do đó, để liên kết và đặc trưng hóa kháng thể, phương pháp biotin hóa một bước đã được sử dụng để phủ các oligosaccharide hòa tan, không tương thích lên các đĩa ELISA được phủ avidin. Phương pháp này đã được thử nghiệm bằng cách sử dụng ACSH đã được sản xuất trước đây của chúng tôi và một phần dựa trên trọng lượng phân tử (hoặc mức độ trùng hợp, DP) của nó. Phương pháp biotin hóa một bước được sử dụng để tăng ái lực liên kết oligosaccharide bằng cách thêm biotin-LC-hydrazide vào đầu khử của carbohydrate (Hình 2). Trong dung dịch, nhóm hemiacetal ở đầu khử phản ứng với nhóm hydrazide của biotin-LC-hydrazide để tạo thành liên kết hydrazone. Khi có mặt chất khử NaCNBH3, liên kết hydrazone bị khử thành sản phẩm cuối cùng được biotin hóa ổn định. Với sự biến đổi đầu khử của đường, việc liên kết các oligosaccharide có DP thấp với đĩa ELISA trở nên khả thi, và trong nghiên cứu của chúng tôi, điều này đã được thực hiện trên các đĩa được phủ avidin bằng cách sử dụng kháng thể đơn dòng nhắm mục tiêu vào glycan.
Sàng lọc kháng thể đơn dòng dựa trên ELISA đối với oligosaccharide được biotin hóa. Hình (A) thể hiện sự kết hợp giữa quá trình biotin hóa oligosaccharide và sàng lọc ELISA tiếp theo với các kháng thể đơn dòng nhắm mục tiêu vào glycan trên đĩa phủ NeutrAvidin, và hình (B) cho thấy quy trình một bước để biotin hóa các sản phẩm phản ứng.
Các đĩa được phủ avidin với kháng thể liên hợp oligosaccharide sau đó được thêm kháng thể chính và kháng thể phụ và rửa trong môi trường nhạy sáng và nhạy thời gian. Sau khi quá trình liên kết kháng thể hoàn tất, thêm chất nền TMB để ủ đĩa. Phản ứng cuối cùng được dừng lại bằng axit sulfuric. Các đĩa đã ủ được phân tích bằng máy đọc ELISA để xác định độ mạnh liên kết của từng kháng thể nhằm phát hiện sự liên kết chéo đặc hiệu của kháng thể. Để biết chi tiết và thông số của thí nghiệm, xem phần “Vật liệu và Phương pháp” tương ứng.
Chúng tôi chứng minh tính hữu ích của phương pháp mới được phát triển này cho các ứng dụng cụ thể bằng cách xác định đặc điểm của các oligosaccharide hòa tan có trong ACSH cũng như trong các phân đoạn oligosaccharide thô và tinh khiết được phân lập từ các chất thủy phân lignocellulose. Như được thể hiện trong Hình 3, các xylan thay thế epitope phổ biến nhất được xác định trong ACSH bằng phương pháp xét nghiệm glycome sinh học thường là arabinogalactan uronic (U) hoặc methyluronic (MeU) và pectin. Hầu hết chúng cũng được tìm thấy trong nghiên cứu trước đây của chúng tôi về phân tích glycan của chất rắn không thủy phân (UHS)43.
Phát hiện các epitop oligosaccharide khó phân hủy bằng kháng thể đơn dòng hướng đến glycan thành tế bào. Phần “trung tính” là phần ACN và phần “axit” là phần FA. Màu đỏ sáng hơn trên bản đồ nhiệt cho thấy hàm lượng epitop cao hơn, và màu xanh lam sáng hơn cho thấy nền trống. Giá trị màu trên thang dựa trên giá trị OD thô cho các công thức N=2. Các epitop chính được kháng thể nhận diện được hiển thị ở bên phải.
Các cấu trúc phi cellulose này không thể bị phân cắt bởi hầu hết các cellulase và hemicellulase thông thường trong hỗn hợp enzyme thương mại được thử nghiệm, bao gồm cả những enzyme thương mại được sử dụng phổ biến nhất. Do đó, cần có các enzyme phụ trợ mới để thủy phân chúng. Nếu thiếu các enzyme phụ trợ phi cellulose cần thiết, các liên kết phi cellulose này sẽ ngăn cản quá trình chuyển đổi hoàn toàn thành monosaccharide, ngay cả khi các polymer đường gốc của chúng được thủy phân rộng rãi thành các đoạn ngắn hơn và hòa tan bằng cách sử dụng hỗn hợp enzyme thương mại.
Nghiên cứu sâu hơn về sự phân bố tín hiệu và độ bền liên kết cho thấy các epitope liên kết thấp hơn ở các phân đoạn đường có DP cao (A, B, C, DP lên đến 20+) so với các phân đoạn có DP thấp (D, E, F, DP trong các dimer) (Hình 1). Các mảnh axit phổ biến hơn ở các epitope không phải cellulose so với các mảnh trung tính. Những hiện tượng này phù hợp với mô hình quan sát được trong nghiên cứu trước đây của chúng tôi, trong đó DP cao và các phần tử axit có khả năng chống thủy phân enzyme cao hơn. Do đó, sự hiện diện của các epitope glycan không phải cellulose và các chất thay thế U và MeU có thể góp phần đáng kể vào sự ổn định của các oligosaccharide. Cần lưu ý rằng hiệu quả liên kết và phát hiện có thể gặp vấn đề đối với các oligosaccharide có DP thấp, đặc biệt nếu epitope là oligosaccharide dimer hoặc trimer. Điều này có thể được kiểm tra bằng cách sử dụng các oligosaccharide thương mại có độ dài khác nhau, mỗi oligosaccharide chỉ chứa một epitope liên kết với một mAb cụ thể.
Do đó, việc sử dụng kháng thể đặc hiệu cấu trúc đã giúp phát hiện một số loại liên kết khó phân hủy. Tùy thuộc vào loại kháng thể được sử dụng, kiểu liên kết phù hợp và cường độ tín hiệu mà nó tạo ra (nhiều nhất và ít nhất), các enzyme mới có thể được xác định và bổ sung bán định lượng vào hỗn hợp enzyme để chuyển hóa đường hoàn chỉnh hơn. Lấy phân tích oligosaccharide ACSH làm ví dụ, chúng ta có thể tạo cơ sở dữ liệu về các liên kết glycan cho mỗi vật liệu sinh khối. Cần lưu ý rằng cần phải tính đến ái lực khác nhau của kháng thể, và nếu ái lực của chúng không được biết, điều này sẽ gây ra một số khó khăn khi so sánh tín hiệu của các kháng thể khác nhau. Ngoài ra, việc so sánh các liên kết glycan có thể hiệu quả nhất giữa các mẫu đối với cùng một kháng thể. Sau đó, các liên kết khó phân hủy này có thể được liên kết với cơ sở dữ liệu CAZyme, từ đó chúng ta có thể xác định các enzyme, chọn các enzyme ứng cử viên và kiểm tra các enzyme phá vỡ liên kết, hoặc phát triển các hệ thống vi sinh để biểu hiện các enzyme này để sử dụng trong các nhà máy lọc sinh học44.
Để đánh giá xem các phương pháp miễn dịch bổ sung cho các phương pháp thay thế như thế nào trong việc xác định đặc điểm của các oligosaccharide có trọng lượng phân tử thấp có trong dịch thủy phân lignocellulose, chúng tôi đã thực hiện phân tích MALDI (Hình 4, S1-S8) và phân tích các saccharide có nguồn gốc từ TMS dựa trên GC-MS trên cùng một bảng (Hình 5) phần oligosaccharide. MALDI được sử dụng để so sánh xem sự phân bố khối lượng của các phân tử oligosaccharide có phù hợp với cấu trúc dự định hay không. Hình 4 cho thấy MC của các thành phần trung tính ACN-A và ACN-B. Phân tích ACN-A xác nhận một loạt các đường pentose có DP từ 4–8 (Hình 4) đến DP 22 (Hình S1), có trọng lượng tương ứng với các oligosaccharide MeU-xylan. Phân tích ACN-B xác nhận chuỗi pentose và glucoxylan với DP 8-15. Trong tài liệu bổ sung như Hình S3, bản đồ phân bố khối lượng phần axit FA-C cho thấy một loạt các đường pentose được thay thế bằng (Me)U với DP từ 8-15, phù hợp với các xylan được thay thế được tìm thấy trong sàng lọc mAb dựa trên ELISA. Các epitope cũng nhất quán.
Phổ MALDI-MS của các oligosaccharide hòa tan không đạt chuẩn có trong ACS. Ở đây, (A) ACN-A là các phân đoạn có khối lượng phân tử thấp chứa oligosaccharide glucuroxylan thay thế bằng axit uronic metyl hóa (DP 4-8) và (B) ACN-B là các oligosaccharide xylan và axit uronic metyl hóa được thay thế bằng glucuroxylan (DP 8-15).
Phân tích thành phần cặn glycan của các oligosaccharide khó phân hủy. Hình (A) thể hiện thành phần saccharide TMS của các phân đoạn oligosaccharide khác nhau thu được bằng phương pháp phân tích GC-MS. Hình (B) thể hiện cấu trúc của các loại đường có nguồn gốc từ TMS có trong oligosaccharide. ACN – phân đoạn acetonitrile chứa oligosaccharide trung tính và FA – phân đoạn axit ferulic chứa oligosaccharide axit.
Một kết luận thú vị khác được rút ra từ phân tích LC-MS của phần oligosaccharide, như thể hiện trong Hình S9 (phương pháp có thể xem trong tài liệu bổ sung điện tử). Các mảnh hexose và nhóm -OAc được quan sát thấy nhiều lần trong quá trình liên kết phần ACN-B. Phát hiện này không chỉ xác nhận sự phân mảnh được quan sát thấy trong phân tích glycome và MALDI-TOF, mà còn cung cấp thông tin mới về các dẫn xuất carbohydrate tiềm năng trong sinh khối lignocellulose đã được xử lý sơ bộ.
Chúng tôi cũng đã phân tích thành phần đường của phần oligosaccharide bằng cách sử dụng dẫn xuất đường TMS. Sử dụng GC-MS, chúng tôi đã xác định thành phần của đường trung tính (không dẫn xuất) và đường axit (GluA và GalA) trong phần oligosaccharide (Hình 5). Axit glucuronic được tìm thấy trong các thành phần axit C và D, trong khi axit galacturonic được tìm thấy trong các thành phần axit A và B, cả hai đều là các thành phần có DP cao của đường axit. Những kết quả này không chỉ xác nhận dữ liệu ELISA và MALDI của chúng tôi mà còn phù hợp với các nghiên cứu trước đây của chúng tôi về sự tích lũy oligosaccharide. Do đó, chúng tôi tin rằng các phương pháp miễn dịch hiện đại sử dụng biotin hóa oligosaccharide và sàng lọc ELISA tiếp theo là đủ để phát hiện các oligosaccharide khó phân hủy hòa tan trong các mẫu sinh học khác nhau.
Vì các phương pháp sàng lọc kháng thể đơn dòng (mAb) dựa trên ELISA đã được xác nhận bằng nhiều phương pháp khác nhau, chúng tôi muốn khám phá thêm tiềm năng của phương pháp định lượng mới này. Hai oligosaccharide thương mại, xylohexasaccharide oligosaccharide (XHE) và 23-α-L-arabinofuranosyl-xylotriose (A2XX), đã được mua và thử nghiệm bằng cách sử dụng phương pháp mAb mới nhắm mục tiêu vào glycan thành tế bào. Hình 6 cho thấy mối tương quan tuyến tính giữa tín hiệu liên kết biotin hóa và logarit nồng độ oligosaccharide, cho thấy mô hình hấp phụ Langmuir khả thi. Trong số các mAb, CCRC-M137, CCRC-M138, CCRC-M147, CCRC-M148 và CCRC-M151 tương quan với XHE, và CCRC-M108, CCRC-M109 và LM11 tương quan với A2XX trong phạm vi từ 1 nm đến 100 nano. Do số lượng kháng thể có sẵn trong thí nghiệm bị hạn chế, nên chỉ có một số thí nghiệm được thực hiện với mỗi nồng độ oligosaccharide. Cần lưu ý rằng một số kháng thể phản ứng rất khác nhau với cùng một oligosaccharide làm chất nền, có lẽ vì chúng liên kết với các epitope hơi khác nhau và có thể có ái lực liên kết rất khác nhau. Cơ chế và ý nghĩa của việc xác định epitope chính xác sẽ phức tạp hơn nhiều khi phương pháp kháng thể đơn dòng mới được áp dụng cho các mẫu thực tế.
Hai oligosaccharide thương mại đã được sử dụng để xác định phạm vi phát hiện của các kháng thể đơn dòng nhắm mục tiêu glycan khác nhau. Ở đây, mối tương quan tuyến tính với logarit nồng độ oligosaccharide cho thấy mô hình hấp phụ Langmuir đối với (A) XHE với kháng thể đơn dòng và (B) A2XX với kháng thể đơn dòng. Các epitope tương ứng cho biết cấu trúc của các oligosaccharide thương mại được sử dụng làm chất nền trong xét nghiệm.
Việc sử dụng kháng thể đơn dòng nhắm mục tiêu vào glycan (phân tích glycan học hoặc sàng lọc kháng thể đơn dòng dựa trên ELISA) là một công cụ mạnh mẽ để đặc trưng hóa chuyên sâu hầu hết các glycan thành tế bào chính cấu thành nên sinh khối thực vật. Tuy nhiên, phân tích glycan cổ điển chỉ đặc trưng hóa các glycan thành tế bào lớn hơn, vì hầu hết các oligosaccharide không được cố định hiệu quả trên các đĩa ELISA. Trong nghiên cứu này, thân cây ngô được xử lý trước bằng AFEX đã được thủy phân bằng enzym ở hàm lượng chất rắn cao. Phân tích đường được sử dụng để xác định thành phần của carbohydrate thành tế bào khó phân hủy trong dịch thủy phân. Tuy nhiên, việc phân tích kháng thể đơn dòng đối với các oligosaccharide nhỏ hơn trong dịch thủy phân bị đánh giá thấp, và cần thêm các công cụ khác để cố định oligosaccharide hiệu quả trên các đĩa ELISA.
Chúng tôi báo cáo ở đây một phương pháp cố định oligosaccharide mới và hiệu quả để sàng lọc kháng thể đơn dòng bằng cách kết hợp quá trình biotin hóa oligosaccharide tiếp theo là sàng lọc ELISA trên các đĩa phủ NeutrAvidin™. Các oligosaccharide được biotin hóa cố định cho thấy ái lực đủ mạnh với kháng thể để cho phép phát hiện nhanh chóng và hiệu quả các oligosaccharide khó phân hủy. Phân tích thành phần của các oligosaccharide khó phân hủy này dựa trên phép đo khối phổ đã xác nhận kết quả của phương pháp sàng lọc miễn dịch mới này. Do đó, các nghiên cứu này chứng minh rằng sự kết hợp giữa quá trình biotin hóa oligosaccharide và sàng lọc ELISA với các kháng thể đơn dòng nhắm mục tiêu vào glycan có thể được sử dụng để phát hiện các liên kết chéo trong oligosaccharide và có thể được ứng dụng rộng rãi trong các nghiên cứu sinh hóa khác nhằm xác định cấu trúc của oligosaccharide.
Phương pháp phân tích cấu hình glycan dựa trên biotin này là báo cáo đầu tiên có khả năng nghiên cứu các liên kết carbohydrate khó phân hủy của oligosaccharide hòa tan trong sinh khối thực vật. Điều này giúp hiểu tại sao một số thành phần của sinh khối lại khó phân hủy đến vậy khi nói đến sản xuất nhiên liệu sinh học. Phương pháp này lấp đầy một khoảng trống quan trọng trong các phương pháp phân tích glycome và mở rộng ứng dụng của nó cho nhiều loại chất nền hơn ngoài oligosaccharide thực vật. Trong tương lai, chúng ta có thể sử dụng robot để biotin hóa và sử dụng phương pháp đã phát triển để phân tích mẫu với năng suất cao bằng ELISA.
Rơm ngô (CS) được trồng từ hạt giống lai Pioneer 33A14 đã được thu hoạch vào năm 2010 từ trang trại Kramer ở ​​Ray, Colorado. Với sự cho phép của chủ đất, sinh khối này có thể được sử dụng cho mục đích nghiên cứu. Các mẫu được bảo quản khô ráo với độ ẩm < 6% trong túi zip-lock ở nhiệt độ phòng. Các mẫu được bảo quản khô ráo với độ ẩm < 6% trong túi zip-lock ở nhiệt độ phòng. Tỷ lệ người dân có thể kiếm được nhiều tiền hơn < 6% trong số tiền bạn có thể kiếm được từ việc mua sắm của bạn. Các mẫu được bảo quản khô ráo ở độ ẩm <6% trong túi có khóa kéo ở nhiệt độ phòng.样品在室温下以干燥< 6% 的水分储存在自封袋中。样品在室温下以干燥< 6% Tỷ lệ người tiêu dùng có thể đạt được mức lợi nhuận dưới 6%. Các mẫu được bảo quản trong túi có khóa kéo ở nhiệt độ phòng với độ ẩm < 6%.Nghiên cứu tuân thủ các hướng dẫn của địa phương và quốc gia. Phân tích thành phần được thực hiện bằng cách sử dụng quy trình của NREL. Thành phần được xác định bao gồm 31,4% glucan, 18,7% xylan, 3,3% arabinan, 1,2% galactan, 2,2% acetyl, 14,3% lignin, 1,7% protein và 13,4% tro.
Cellic® CTec2 (138 mg protein/ml, lô VCNI 0001) là hỗn hợp phức hợp của cellulase, β-glucosidase và Cellic® HTec2 (157 mg protein/ml, lô VHN00001) từ Novozymes (Franklinton, NC, Hoa Kỳ). Multifect Pectinase® (72 mg protein/mL), một hỗn hợp phức hợp các enzyme phân giải pectin, được DuPont Industrial Biosciences (Palo Alto, CA, Hoa Kỳ) tặng. Nồng độ protein của enzyme được xác định bằng cách ước tính hàm lượng protein (và trừ đi phần đóng góp của nitơ phi protein) bằng phương pháp phân tích nitơ Kjeldahl (phương pháp AOAC 2001.11, Dairy One Cooperative Inc., Ithaca, NY, Hoa Kỳ). Đất tảo cát 545 được mua từ EMD Millipore (Billerica, MA). Than hoạt tính (DARCO, dạng hạt 100 mesh), Avicel (PH-101), xylan từ gỗ sồi và tất cả các hóa chất khác được mua từ Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).
Quá trình tiền xử lý AFEX được thực hiện tại GLBRC (Phòng thí nghiệm Nghiên cứu Chuyển đổi Sinh khối, MSU, Lansing, MI, Hoa Kỳ). Quá trình tiền xử lý được tiến hành ở 140°C trong 15 phút, với thời gian lưu 46 giây ở tỷ lệ 1:1 giữa amoniac khan và sinh khối, ở nồng độ 60% (w/w) trong lò phản ứng mẻ để bàn bằng thép không gỉ (Công ty Parr Instruments). Tổng thời gian phản ứng là 30 phút. Lò phản ứng được đưa về 140°C và amoniac được giải phóng nhanh chóng, cho phép sinh khối nhanh chóng trở lại nhiệt độ phòng. Thành phần của thân cây ngô được tiền xử lý AFEX (ACS) tương tự như thân cây ngô chưa được xử lý (UT-CS).
ACSH có hàm lượng chất rắn cao 25% (w/w) (khoảng 8% dextran) được chuẩn bị làm nguyên liệu ban đầu cho sản xuất oligosaccharide quy mô lớn. Quá trình thủy phân enzym của ACS được thực hiện bằng cách sử dụng hỗn hợp enzym thương mại bao gồm Cellic® Ctec2 10 mg protein/g glucan (trong sinh khối đã xử lý sơ bộ), Htec2 (Novozymes, Franklinton, NC), 5 mg protein/g glucan, và Multifect Pectinase (Genencor Inc, USA). Quá trình thủy phân enzym được thực hiện trong lò phản ứng sinh học 5 lít với thể tích làm việc 3 lít, pH 4,8, 50°C và 250 vòng/phút. Sau 96 giờ thủy phân, dịch thủy phân được thu thập bằng cách ly tâm ở 6000 vòng/phút trong 30 phút và sau đó ở 14000 vòng/phút trong 30 phút để loại bỏ chất rắn chưa bị thủy phân. Dịch thủy phân sau đó được lọc vô trùng qua cốc lọc có kích thước lỗ 0,22 mm. Dịch thủy phân đã lọc được bảo quản trong các chai vô trùng ở 4°C và sau đó được phân tách trên than hoạt tính.
Phân tích thành phần của các mẫu sinh khối dựa trên chiết xuất theo quy trình phân tích phòng thí nghiệm NREL: chuẩn bị mẫu để phân tích thành phần (NREL/TP-510-42620) và xác định carbohydrate cấu trúc và lignin trong sinh khối (NREL/TP-510 – 42618)47.
Phân tích oligosaccharide của dòng thủy phân được thực hiện trên quy mô 2 ml bằng phương pháp thủy phân axit dựa trên nồi hấp. Trộn mẫu thủy phân với 69,7 µl axit sulfuric 72% trong ống nghiệm có nắp vặn 10 ml và ủ trong 1 giờ trên bàn thí nghiệm ở 121 °C, làm nguội trên đá và lọc vào lọ sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Nồng độ oligosaccharide được xác định bằng cách trừ nồng độ monosaccharide trong mẫu không thủy phân khỏi tổng nồng độ đường trong mẫu thủy phân axit.
Nồng độ glucose, xylose và arabinose trong sinh khối thủy phân bằng axit được phân tích bằng hệ thống HPLC Shimadzu được trang bị bộ lấy mẫu tự động, bộ gia nhiệt cột, bơm đẳng áp và đầu dò chỉ số khúc xạ trên cột Bio-Rad Aminex HPX-87H. Cột được duy trì ở 50°C và được rửa giải bằng dòng 0,6 ml/phút dung dịch H2SO4 5 mM trong nước.
Dịch chiết thủy phân được pha loãng và phân tích hàm lượng monome và oligosaccharide. Các đường monome thu được sau quá trình thủy phân bằng enzyme được phân tích bằng HPLC trang bị cột Bio-Rad (Hercules, CA) Aminex HPX-87P và cột bảo vệ tro. Nhiệt độ cột được duy trì ở 80°C, nước được sử dụng làm pha động với tốc độ dòng chảy 0,6 ml/phút. Oligosaccharide được xác định bằng phương pháp thủy phân trong axit loãng ở 121°C theo các phương pháp được mô tả trong tài liệu tham khảo 41, 48, 49.
Phân tích saccharide được thực hiện trên nguyên liệu thô, nguyên liệu được xử lý trước bằng AFEX và tất cả các cặn sinh khối không bị thủy phân (bao gồm cả việc sản xuất các chiết xuất vách tế bào nối tiếp và sàng lọc mAb của chúng) bằng cách sử dụng các quy trình đã được mô tả trước đây 27, 43, 50, 51. Đối với phân tích glycome, cặn không tan trong cồn của vật liệu vách tế bào thực vật được chuẩn bị từ cặn sinh khối và được chiết xuất nối tiếp với các thuốc thử có độ mạnh tăng dần như amoni oxalat (50 mM), natri cacbonat (50 mM và 0,5% w/v), CON. (1M và 4M, cả hai đều có 1% w/v natri borohydride) và clorit axit như đã mô tả trước đây52,53. Sau đó, các chất chiết xuất được tiến hành ELISA chống lại một bảng phức hợp các mAb50 hướng đến glycan vách tế bào, và các phản ứng liên kết mAb được trình bày dưới dạng bản đồ nhiệt. Các mAb nhắm mục tiêu glycan vách tế bào thực vật được mua từ kho dự trữ của phòng thí nghiệm (dòng CCRC, JIM và MAC).
Phương pháp biotin hóa oligosaccharide một bước. Quá trình liên kết carbohydrate với biotin-LC-hydrazide được thực hiện theo quy trình sau: Hòa tan biotin-LC-hydrazide (4,6 mg/12 μmol) trong dimethyl sulfoxide (DMSO, 70 μl) bằng cách khuấy mạnh và đun nóng ở 65°C trong 1 phút. Thêm axit axetic băng (30 µl) và đổ hỗn hợp vào natri cyanoborohydride (6,4 mg/100 µmol) và hòa tan hoàn toàn sau khi đun nóng ở 65°C trong khoảng 1 phút. Sau đó, thêm từ 5 đến 8 μl hỗn hợp phản ứng vào oligosaccharide đã sấy khô (1-100 nmol) để thu được lượng chất đánh dấu dư gấp 10 lần hoặc hơn so với đầu khử. Phản ứng được thực hiện ở 65°C trong 2 giờ, sau đó các mẫu được tinh chế ngay lập tức. Không sử dụng natri cyanoborohydride trong các thí nghiệm gắn nhãn mà không qua quá trình khử, và các mẫu được phản ứng ở 65°C trong 2,5 giờ.
Chuẩn bị và rửa mẫu oligosaccharide biotin hóa cho xét nghiệm ELISA. Cho 25 μl mẫu biotin hóa (100 μl mỗi mẫu đậm đặc được pha loãng trong 5 ml dung dịch đệm Tris 0,1 M (TBS)) vào mỗi giếng của đĩa được phủ avidin. Các giếng đối chứng được phủ 50 μl biotin ở nồng độ 10 μg/ml trong dung dịch TBS 0,1 M. Nước khử ion được sử dụng làm lớp phủ cho các phép đo mẫu trắng. Đĩa được ủ trong 2 giờ ở nhiệt độ phòng trong bóng tối. Rửa đĩa 3 lần với sữa tách kem 0,1% trong dung dịch TBS 0,1 M bằng chương trình số 11 cho máy Grenier flat 3A.
Thêm và rửa kháng thể chính. Thêm 40 µl kháng thể chính vào mỗi giếng. Ủ đĩa vi giếng trong 1 giờ ở nhiệt độ phòng trong bóng tối. Sau đó, rửa đĩa 3 lần với dung dịch sữa 0,1% trong dung dịch TBS 0,1M bằng chương trình rửa số 11 dành cho Grenier Flat 3A.
Thêm kháng thể thứ cấp và rửa. Thêm 50 µl kháng thể thứ cấp chuột/chuột cống (pha loãng 1:5000 trong dung dịch sữa 0,1% trong dung dịch TBS 0,1 M) vào mỗi giếng. Ủ đĩa vi giếng trong 1 giờ ở nhiệt độ phòng trong bóng tối. Sau đó, rửa đĩa vi giếng 5 lần với dung dịch sữa 0,1% trong dung dịch TBS 0,1 M bằng chương trình rửa đĩa Grenier Flat 5A số 12.
Thêm chất nền. Thêm 50 µl 3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine (TMB) vào chất nền cơ bản (bằng cách thêm 2 giọt dung dịch đệm, 3 giọt TMB, 2 giọt hydro peroxide vào 15 ml nước khử ion). Chuẩn bị chất nền TMB và lắc đều trước khi sử dụng. Ủ đĩa vi giếng ở nhiệt độ phòng trong 30 phút trong bóng tối.
Hoàn thành bước này và đọc hướng dẫn trên viên thuốc. Thêm 50 µl axit sulfuric 1 N vào mỗi giếng và ghi lại độ hấp thụ từ 450 đến 655 nm bằng máy đọc ELISA.
Chuẩn bị dung dịch 1 mg/ml của các chất phân tích sau trong nước khử ion: arabinose, rhamnose, fucose, xylose, axit galacturonic (GalA), axit glucuronic (GlcA), mannose, glucose, galactose, lactose, N-acetylmannosamine (manNAc), N-acetylglucosamine (glcNAc), N-acetylgalactosamine (galNAc), inositol (chất chuẩn nội). Hai dung dịch chuẩn được chuẩn bị bằng cách thêm các dung dịch đường 1 mg/mL được hiển thị trong Bảng 1. Các mẫu được đông lạnh và sấy thăng hoa ở -80°C cho đến khi loại bỏ hết nước (thường khoảng 12-18 giờ).
Thêm 100–500 µg mẫu vào các ống có nắp vặn trên cân phân tích. Ghi lại lượng đã thêm. Tốt nhất là hòa tan mẫu trong dung môi có nồng độ xác định và thêm vào ống dưới dạng dung dịch. Sử dụng 20 µl inositol 1 mg/ml làm chất chuẩn nội cho mỗi ống mẫu. Lượng chất chuẩn nội thêm vào mẫu phải bằng lượng chất chuẩn nội thêm vào ống chuẩn.
Thêm 8 ml metanol khan vào lọ có nắp vặn. Sau đó thêm 4 ml dung dịch HCl metanol 3 N, đậy nắp và lắc đều. Quá trình này không sử dụng nước.
Thêm 500 µl dung dịch methanol HCl 1 M vào các mẫu oligosaccharide và ống TMS chuẩn. Các mẫu được ủ qua đêm (168 giờ) ở 80°C trong khối gia nhiệt. Làm khô sản phẩm methanolysis ở nhiệt độ phòng bằng thiết bị sấy. Thêm 200 µl MeOH và làm khô lại. Quá trình này được lặp lại hai lần. Thêm 200 µl methanol, 100 µl pyridine và 100 µl anhydrit acetic vào mẫu và trộn đều. Các mẫu được ủ ở nhiệt độ phòng trong 30 phút và làm khô. Thêm 200 µl methanol và làm khô lại.
Thêm 200 µl Tri-Sil và đậy kín ống nghiệm, đun nóng trong 20 phút ở 80°C, sau đó làm nguội đến nhiệt độ phòng. Sử dụng thiết bị sấy để làm khô mẫu thêm nữa đến thể tích khoảng 50 µl. Điều quan trọng cần lưu ý là chúng tôi không để mẫu khô hoàn toàn.
Thêm 2 ml hexane và trộn đều bằng máy khuấy vortex. Dùng bông thủy tinh nhét vào đầu ống nhỏ giọt Pasteur (5-8 mm) bằng cách đặt bông thủy tinh lên trên ống nhỏ giọt có đường kính 5-3/4 inch. Ly tâm mẫu ở 3000 g trong 2 phút. Kết tủa các cặn không tan. Làm khô mẫu đến thể tích 100-150 µl. Tiêm khoảng 1 μl vào máy GC-MS ở nhiệt độ ban đầu 80 °C và thời gian ban đầu là 2,0 phút (Bảng 2).