Vă mulțumim că ați vizitat Nature.com.Versiunea de browser pe care o utilizați are suport limitat pentru CSS.Pentru cea mai bună experiență, vă recomandăm să utilizați un browser actualizat (sau să dezactivați Modul de compatibilitate în Internet Explorer).Între timp, pentru a asigura suport continuu, vom reda site-ul fără stiluri și JavaScript.
Noi metode imunologice și spectrometrice de masă pentru analiza complexă a oligozaharidelor persistente în stover de porumb pretratat cu AFEX.Biomasa lignocelulozică este o alternativă durabilă la combustibilii fosili și este utilizată pe scară largă pentru dezvoltarea biotehnologiilor pentru producerea de produse precum alimente, furaje, combustibili și substanțe chimice.Cheia acestor tehnologii este dezvoltarea unor procese competitive din punct de vedere al costurilor pentru transformarea carbohidraților complecși prezenți în pereții celulelor plantelor în zaharuri simple, cum ar fi glucoza, xiloza și arabinoza.Deoarece biomasa lignocelulozică este foarte încăpățânată, aceasta trebuie supusă tratamentelor termochimice (de exfoliere cu fibre de amoniac (AFEX), acizi diluați (DA), lichide ionice (IL)) și tratamente biologice (de exemplu, hidroliză enzimatică și fermentație microbiană) în combinație pentru a obține produsul dorit..Cu toate acestea, atunci când enzimele fungice comerciale sunt utilizate în procesul de hidroliză, doar 75-85% din zaharurile solubile formate sunt monozaharide, iar restul de 15-25% sunt oligozaharide solubile, intratable, care nu sunt întotdeauna disponibile pentru microorganisme.Anterior, am izolat și purificat cu succes oligozaharide încăpățânate solubile folosind o combinație de separare a carbonului și pământului de diatomee și cromatografia de excludere a mărimii și, de asemenea, am investigat proprietățile lor inhibitoare enzimatice.Am descoperit că oligozaharidele care conțin substituții de acid uronic metilat cu grad mai mare de polimerizare (DP) sunt mai dificil de prelucrat cu amestecuri de enzime comerciale decât oligozaharidele neutre și cu DP scăzut.Aici raportăm utilizarea mai multor metode suplimentare, inclusiv profilarea glicanilor folosind anticorpi monoclonali (mAbs) specifici glicanilor din biomasă vegetală pentru a caracteriza legăturile glicanilor din pereții celulelor plantelor și hidrolizate enzimatice, ionizare cu desorbție laser asistată de matrice, spectrometrie de masă în timp de zbor..MALDI-TOF-MS) utilizează vârfuri de diagnostic informative de structură obținute prin spectroscopie după dezintegrarea secundară a ionilor negativi, cromatografia în gaz și spectrometria de masă (GC-MS) pentru a caracteriza legăturile oligozaharide cu și fără derivatizare.Datorită dimensiunii mici a oligozaharidelor (DP 4–20), aceste molecule sunt dificil de utilizat pentru legarea și caracterizarea mAb.Pentru a depăși această problemă, am aplicat o nouă metodă de imobilizare a oligozaharidelor bazată pe conjugarea biotinei care a etichetat cu succes majoritatea oligozaharidelor solubile cu DP scăzut de pe suprafața microplăcii, care a fost apoi utilizată într-un sistem mAb de mare capacitate pentru analiza de ligatură specifică.Această nouă metodă va facilita dezvoltarea unor teste mai avansate de glicom de mare capacitate în viitor, care pot fi utilizate pentru a izola și caracteriza oligozaharidele prezente în biomarkeri în scopuri de diagnostic.
Biomasa lignocelulozică, compusă din materiale agricole, forestiere, iarbă și lemnoase, este o materie primă potențială pentru producția de produse pe bază de bio, inclusiv alimente, furaje, combustibili și precursori chimici pentru a produce produse de valoare mai mare1.Carbohidrații (cum ar fi celuloza și hemiceluloza) prezenți în pereții celulelor plantelor sunt depolimerizați în monozaharide prin procesare chimică și biotransformare (cum ar fi hidroliza enzimatică și fermentația microbiană).Pre-tratările obișnuite includ expansiunea fibrei de amoniac (AFEX), acidul diluat (DA), lichidul ionic (IL) și explozia cu abur (SE), care utilizează o combinație de substanțe chimice și căldură pentru a reduce producția de lignoceluloză prin deschiderea pereților celulelor plantelor3,4.încăpățânarea materiei, 5. Hidroliza enzimatică se efectuează la o încărcătură mare de solide utilizând enzime comerciale care conțin carbohidrați activi (CAZymes) și fermentația microbiană folosind drojdii sau bacterii transgenice pentru a produce combustibili și substanțe chimice pe bază de bio6.
CAZymes din enzimele comerciale sunt compuse dintr-un amestec complex de enzime care scindează sinergic legăturile complexe carbohidrați-zahar pentru a forma monozaharide2,7.După cum am raportat mai devreme, rețeaua complexă de polimeri aromatici ai ligninei cu carbohidrați îi face foarte intratabili, ceea ce duce la conversia incompletă a zahărului, acumulând 15-25% din oligozaharide sexuale care nu sunt produse în timpul hidrolizei enzimatice a biomasei pretratate.Aceasta este o problemă comună cu diferite metode de pretratare a biomasei.Unele motive pentru acest blocaj includ inhibarea enzimelor în timpul hidrolizei sau absența sau nivelurile scăzute de enzime esențiale esențiale care sunt necesare pentru a rupe legăturile de zahăr din biomasa vegetală.Înțelegerea compoziției și a caracteristicilor structurale ale zaharurilor, cum ar fi legăturile de zahăr din oligozaharide, ne va ajuta să îmbunătățim conversia zahărului în timpul hidrolizei, făcând procesele biotehnologice competitive din punct de vedere al costurilor cu produsele derivate din petrol.
Determinarea structurii carbohidraților este o provocare și necesită o combinație de metode precum cromatografia lichidă (LC)11,12, spectroscopie de rezonanță magnetică nucleară (RMN)13, electroforeza capilară (CE)14,15,16 și spectrometria de masă (MS)17.,optsprezece.Metodele MS, cum ar fi spectrometria de masă în timp de zbor cu desorbție cu laser și ionizare folosind o matrice (MALDI-TOF-MS) sunt o metodă versatilă pentru identificarea structurilor carbohidraților.Recent, MS tandem de disociere indusă de coliziune (CID) a aducților de ioni de sodiu a fost utilizat pe scară largă pentru a identifica amprentele corespunzătoare pozițiilor de atașare a oligozaharidelor, configurațiilor anomerice, secvențelor și pozițiilor de ramificare 20, 21.
Analiza glicanilor este un instrument excelent pentru identificarea în profunzime a legăturilor de carbohidrați22.Această metodă utilizează anticorpi monoclonali (mAb) direcționați către glicanul din peretele celular al plantei ca sonde pentru a înțelege legăturile complexe de carbohidrați.Peste 250 de mAbs sunt disponibile în întreaga lume, proiectați împotriva diferitelor oligozaharide liniare și ramificate folosind diferite zaharide24.Mai multe mAbs au fost utilizate pe scară largă pentru a caracteriza structura, compoziția și modificările peretelui celular al plantei, deoarece există diferențe semnificative în funcție de tipul celulei plantei, organ, vârstă, stadiul de dezvoltare și mediul de creștere25,26.Mai recent, această metodă a fost utilizată pentru a înțelege populațiile de vezicule din sistemele vegetale și animale și rolurile lor respective în transportul glicanului, determinate de markeri subcelulari, stadii de dezvoltare sau stimuli de mediu și pentru a determina activitatea enzimatică.Unele dintre diferitele structuri ale glicanilor și xilanilor care au fost identificate includ pectina (P), xilanul (X), mananul (M), xiloglucanii (XylG), glucanii cu legătură mixtă (MLG), arabinoxilanul (ArbX), galactomananul (GalG), acidul glucuronic-arabinoxilanul (GArbX) și arabino-galactanul (ArbX)2 (ArbX)2.
Cu toate acestea, în ciuda tuturor acestor eforturi de cercetare, doar câteva studii s-au concentrat asupra naturii acumulării de oligozaharide în timpul hidrolizei cu încărcare mare cu solide (HSL), inclusiv eliberarea de oligozaharide, modificările lungimii lanțului oligomeric în timpul hidrolizei, diverși polimeri cu DP scăzut și curbele acestora.distributii 30,31,32.Între timp, deși analiza glicanilor s-a dovedit a fi un instrument util pentru o analiză cuprinzătoare a structurii glicanilor, este dificil să se evalueze oligozaharidele cu DP scăzut, solubile în apă, folosind metode cu anticorpi.Oligozaharidele DP mai mici cu o greutate moleculară mai mică de 5-10 kDa nu se leagă la plăcile ELISA 33, 34 și sunt spălate înainte de adăugarea anticorpului.
Aici, pentru prima dată, demonstrăm un test ELISA pe plăci acoperite cu avidină folosind anticorpi monoclonali, combinând o procedură de biotinilare într-o singură etapă pentru oligozaharide refractare solubile cu analiza glicomului.Abordarea noastră privind analiza glicomului a fost validată prin analiza bazată pe MALDI-TOF-MS și GC-MS a legăturilor oligozaharide complementare folosind derivatizarea trimetilsilil (TMS) a compozițiilor de zahăr hidrolizat.Această abordare inovatoare poate fi dezvoltată ca metodă de mare debit în viitor și poate găsi o aplicare mai largă în cercetarea biomedicală35.
Modificările post-translaționale ale enzimelor și anticorpilor, cum ar fi glicozilarea,36 afectează activitatea lor biologică.De exemplu, modificările de glicozilare a proteinelor serice joacă un rol important în artrita inflamatorie, iar modificările de glicozilare sunt utilizate ca markeri de diagnostic37.În literatură s-a raportat că diferiți glicani apar cu ușurință într-o varietate de boli, inclusiv boli inflamatorii cronice ale tractului gastrointestinal și ficatului, infecții virale, cancer ovarian, de sân și de prostată38,39,40.Înțelegerea structurii glicanilor folosind metode ELISA de glican pe bază de anticorpi va oferi încredere suplimentară în diagnosticul bolii fără utilizarea metodelor complexe de MS.
Studiul nostru anterior a arătat că oligozaharidele încăpățânate au rămas nehidrolizate după pretratare și hidroliza enzimatică (Figura 1).În munca noastră publicată anterior, am dezvoltat o metodă de extracție în fază solidă a cărbunelui activat pentru a izola oligozaharidele din hidrolizatul de porumb pretratat cu AFEX (ACSH)8.După extracția și separarea inițială, oligozaharidele au fost fracționate în continuare prin cromatografie de excludere dimensională (SEC) și colectate în ordinea greutății moleculare.Monomerii și oligomerii de zahăr eliberați din diferite pretratări au fost analizați prin analiza compoziției zahărului.Când se compară conținutul de oligomeri de zahăr obținuți prin diferite metode de pretratare, prezența oligozaharidelor încăpățânate este o problemă comună în conversia biomasei în monozaharide și poate duce la o reducere a randamentului de zahăr de cel puțin 10-15% și chiar până la 18%.NE.Această metodă este utilizată pentru producția ulterioară la scară largă de fracții de oligozaharide.ACH rezultat și fracțiile sale ulterioare cu greutăți moleculare diferite au fost utilizate ca material experimental pentru caracterizarea oligozaharidelor în această lucrare.
După pretratament și hidroliza enzimatică, oligozaharidele persistente au rămas nehidrolizate.Aici (A) este o metodă de separare a oligozaharidelor în care oligozaharidele sunt izolate din hidrolizat de porumb pretratat cu AFEX (ACSH) folosind un pat pliat de cărbune activat și pământ de diatomee;(B) Metoda de separare a oligozaharidelor.Oligozaharidele au fost separate în continuare prin cromatografie de excludere dimensională (SEC);(C) Monomeri și oligomeri zaharidici eliberați din diferite pretratări (acid diluat: DA, lichid ionic: IL și AFEX).Condiții de hidroliză enzimatică: încărcare mare cu solide de 25% (g/g) (aproximativ 8% încărcare glucan), hidroliză 96 de ore, încărcare cu enzime comerciale de 20 mg/g (raport Ctec2:Htec2:MP-2:1:1) și (D) Monomeri de zahăr și oligomeri ai glucozei, eliberarea de glucoză, xylose pre-strat de AF și de porumb.
Analiza glicanilor s-a dovedit a fi un instrument util pentru o analiză structurală cuprinzătoare a glicanilor din extractele izolate din reziduurile solide de biomasă.Cu toate acestea, zaharidele solubile în apă sunt subreprezentate folosind această metodă tradițională41 deoarece oligozaharidele cu greutate moleculară mică sunt dificil de imobilizat pe plăcile ELISA și sunt spălate înainte de adăugarea anticorpilor.Prin urmare, pentru legarea și caracterizarea anticorpilor, a fost utilizată o metodă de biotinilare într-o singură etapă pentru a acoperi oligozaharidele solubile, neconforme pe plăcile ELISA acoperite cu avidină.Această metodă a fost testată folosind ACSH produs anterior și o fracție bazată pe greutatea sa moleculară (sau gradul de polimerizare, DP).Biotinilarea într-o singură etapă a fost utilizată pentru a crește afinitatea de legare a oligozaharidelor prin adăugarea de biotină-LC-hidrazidă la capătul reducător al carbohidratului (Fig. 2).În soluție, gruparea hemiacetală de la capătul reducător reacționează cu gruparea hidrazidă a biotină-LC-hidrazidă pentru a forma o legătură hidrazonă.În prezența agentului reducător NaCNBH3, legătura hidrazonă este redusă la un produs final biotinilat stabil.Odată cu modificarea capătului de reducere a zahărului, a devenit posibilă legarea oligozaharidelor cu DP scăzut la plăcile ELISA, iar în studiul nostru acest lucru s-a făcut pe plăci acoperite cu avidină utilizând mAb-uri țintite pe glican.
Screeningul anticorpilor monoclonali pe baza ELISA pentru oligozaharide biotinilate.Aici (A) biotinilarea combinată a oligozaharidelor și screeningul ELISA ulterioară cu mAb-uri țintite pe glican pe plăci acoperite cu NeutrAvidin și (B) arată o procedură într-un singur pas pentru biotinilarea produselor de reacție.
Plăcile acoperite cu avidină cu anticorpi conjugați cu oligozaharide au fost apoi adăugate la anticorpii primari și secundari și spălate într-un mediu sensibil la lumină și timp.După ce legarea anticorpilor este completă, adăugați substrat TMB pentru a incuba placa.Reacția a fost în cele din urmă oprită cu acid sulfuric.Plăcile incubate au fost analizate utilizând un cititor ELISA pentru a determina puterea de legare a fiecărui anticorp pentru a detecta reticulare specifică anticorpului.Pentru detalii și parametri ai experimentului, consultați secțiunea corespunzătoare „Materiale și metode”.
Demonstrăm utilitatea acestei metode nou dezvoltate pentru aplicații specifice prin caracterizarea oligozaharidelor solubile prezente în ACSH, precum și în fracțiile de oligozaharide brute și purificate izolate din hidrolizate lignocelulozice.Așa cum se arată în Figura 3, cei mai obișnuiți xilani substituiți cu epitop identificați în ACSH folosind metode de testare a glicomului bioacilat sunt de obicei uronic (U) sau metiluronic (MeU) și arabinogalactani pectici.Cele mai multe dintre ele au fost găsite și în studiul nostru anterior privind analiza glicanilor solidelor nehidrolizate (UHS)43.
Detectarea epitopilor de oligozaharide recalcitranți utilizând un anticorp monoclonal îndreptat către glicanul peretelui celular.Fracția „neutră” este fracția ACN, iar fracția „acidă” este fracția FA.Roșul mai strălucitor de pe harta termică indică un conținut mai mare de epitop, iar albastrul mai strălucitor indică un fundal gol.Valorile culorii de pe scară se bazează pe valorile brute OD pentru formulările N=2.Epitopii principali recunoscuți de anticorpi sunt prezentați în dreapta.
Aceste structuri non-celulozice nu au putut fi scindate de cele mai comune celulaze și hemicelulaze din amestecul de enzime comerciale testat, care include cele mai frecvent utilizate enzime comerciale.Prin urmare, pentru hidroliza lor sunt necesare noi enzime auxiliare.Fără enzimele accesorii non-celulozice necesare, aceste legături non-celulozice împiedică conversia completă în monozaharide, chiar dacă polimerii lor de zahăr părinte sunt hidrolizați extensiv în fragmente mai scurte și dizolvați folosind amestecuri de enzime comerciale.
Studii suplimentare ale distribuției semnalului și ale puterii sale de legare au arătat că epitopii de legare au fost mai mici în fracțiile de zahăr cu DP ridicat (A, B, C, DP până la 20+) decât în ​​fracțiunile cu DP scăzut (D, E, F, DP) în dimeri) (Fig. 1).Fragmentele acide sunt mai frecvente în epitopii non-celulozici decât fragmentele neutre.Aceste fenomene sunt în concordanță cu modelul observat în studiul nostru anterior, unde DP ridicat și fragmente acide au fost mai rezistente la hidroliza enzimatică.Prin urmare, prezența epitopilor glicani non-celulozici și a substituțiilor U și MeU poate contribui în mare măsură la stabilitatea oligozaharidelor.Trebuie remarcat faptul că eficiența de legare și de detectare poate fi problematică pentru oligozaharidele cu DP scăzut, în special dacă epitopul este o oligozaharidă dimerică sau trimerică.Acest lucru poate fi testat folosind oligozaharide comerciale de lungimi diferite, fiecare conținând doar un epitop care se leagă la un mAb specific.
Astfel, utilizarea anticorpilor specifici structurii a relevat anumite tipuri de legături recalcitrante.În funcție de tipul de anticorp utilizat, modelul de ligare adecvat și puterea semnalului pe care îl produce (cel mai și cel mai puțin abundent), pot fi identificate noi enzime și adăugate semi-cantitativ la amestecul de enzime pentru o glicoconversie mai completă.Luând ca exemplu analiza oligozaharidelor ACSH, putem crea o bază de date de legături de glican pentru fiecare material de biomasă.Trebuie remarcat aici că trebuie luată în considerare afinitatea diferită a anticorpilor, iar dacă afinitatea lor este necunoscută, acest lucru va crea anumite dificultăți la compararea semnalelor diferiților anticorpi.În plus, compararea legăturilor de glican poate funcționa cel mai bine între probele pentru același anticorp.Aceste legături încăpățânate pot fi apoi legate la baza de date CAZyme, din care putem identifica enzimele, selecta enzimele candidate și testa enzimele de rupere a legăturilor sau putem dezvolta sisteme microbiene pentru a exprima aceste enzime pentru utilizare în biorafinării44.
Pentru a evalua modul în care metodele imunologice completează metodele alternative pentru caracterizarea oligozaharidelor cu greutate moleculară mică prezente în hidrolizatele lignocelulozice, am efectuat MALDI (Fig. 4, S1-S8) și analiza zaharidelor derivate din TMS pe baza GC-MS pe același panou (Fig. 5) o parte oligozaharidă.MALDI este utilizat pentru a compara dacă distribuția de masă a moleculelor de oligozaharide se potrivește cu structura dorită.Pe fig.4 prezintă MC-ul componentelor neutre ACN-A și ACN-B.Analiza ACN-A a confirmat o gamă de zaharuri pentoze variind de la DP 4-8 (Fig. 4) la DP 22 (Fig. S1), ale căror greutăți corespund oligozaharidelor MeU-xilan.Analiza ACN-B a confirmat seriile de pentoză și glucoxilan cu DP 8-15.În material suplimentar, cum ar fi Figura S3, hărțile de distribuție a masei fragmentului acid FA-C arată o gamă de zaharuri pentoze substituite (Me)U cu un DP de 8-15 care sunt în concordanță cu xilanii substituiți găsiți în screeningul mAb pe bază de ELISA.Epitopii sunt consecvenți.
Spectrul MALDI-MS al oligozaharidelor solubile neconforme prezente în ACS.Aici, (A) fracții din intervalul de greutate mică ACN-A care conțin acid uronic metilat (DP 4-8) oligozaharide glucuroxilan substituite și (B) oligozaharide ACN-B xilan și acid uronic metilat substituite cu glucuroxilan (DP 8-15).
Analiza compoziției reziduului de glican al oligozaharidelor refractare.Aici (A) compoziția zaharidă TMS a diferitelor fracții de oligozaharide obținute prin analiza GC-MS.(B) Structuri ale diferitelor zaharuri derivate din TMS prezente în oligozaharide.ACN – fracțiune de acetonitril care conține oligozaharide neutre și FA – fracțiune de acid ferulic care conține oligozaharide acide.
O altă concluzie interesantă a fost trasă din analiza LC-MS a fracției de oligozaharide, așa cum se arată în Figura S9 (metodele pot fi văzute în materialul electronic suplimentar).Fragmente de grupări hexoză și -OAc au fost observate în mod repetat în timpul ligării fracției ACN-B.Această constatare nu numai că confirmă fragmentarea observată în analiza glicomului și MALDI-TOF, dar oferă și noi informații despre potențialii derivați de carbohidrați din biomasa lignocelulozică pretratată.
De asemenea, am analizat compoziția de zahăr a fracției de oligozaharide folosind derivatizarea zahărului TMS.Folosind GC-MS, am determinat compoziția zaharurilor neurale (nederivate) și acide (GluA și GalA) în fracția de oligozaharidă (Fig. 5).Acidul glucuronic se găsește în componentele acide C și D, în timp ce acidul galacturonic se găsește în componentele acide A și B, ambele fiind componente cu DP ridicat ale zaharurilor acide.Aceste rezultate nu numai că confirmă datele noastre ELISA și MALDI, dar sunt, de asemenea, în concordanță cu studiile noastre anterioare privind acumularea de oligozaharide.Prin urmare, considerăm că metodele imunologice moderne care utilizează biotinilarea oligozaharidelor și screeningul ELISA ulterioar sunt suficiente pentru a detecta oligozaharide recalcitrante solubile în diferite probe biologice.
Deoarece metodele de screening mAb bazate pe ELISA au fost validate prin mai multe metode diferite, am dorit să explorăm în continuare potențialul acestei noi metode cantitative.Două oligozaharide comerciale, oligozaharidă xilohexazaharidă (XHE) și 23-α-L-arabinofuranozil-xilotrioză (A2XX), au fost achiziționate și testate folosind o nouă abordare mAb care vizează glicanul peretelui celular.Figura 6 prezintă o corelație liniară între semnalul de legare biotinilat și concentrația log a concentrației de oligozaharide, sugerând un posibil model de adsorbție Langmuir.Printre mAb, CCRC-M137, CCRC-M138, CCRC-M147, CCRC-M148 și CCRC-M151 s-au corelat cu XHE și CCRC-M108, CCRC-M109 și LM11 s-au corelat cu A2XX pe un interval de la 1 nm la 100 nano.Datorită disponibilității limitate a anticorpilor în timpul experimentului, au fost efectuate experimente limitate cu fiecare concentrație de oligozaharidă.Trebuie remarcat aici că unii anticorpi reacționează foarte diferit la aceeași oligozaharidă ca substrat, probabil pentru că se leagă la epitopi ușor diferiți și pot avea afinități de legare foarte diferite.Mecanismele și implicațiile identificării precise ale epitopilor vor fi mult mai complexe atunci când noua abordare mAb este aplicată probelor reale.
Două oligozaharide comerciale au fost utilizate pentru a determina intervalul de detecție a diferitelor mAb-uri care vizează glican.Aici, corelațiile liniare cu concentrația log a concentrației de oligozaharide indică modele de adsorbție Langmuir pentru (A) XHE cu mAb și (B) A2XX cu mAb.Epitopii corespunzători indică structurile oligozaharidelor comerciale utilizate ca substraturi în test.
Utilizarea anticorpilor monoclonali țintiți pe glican (analiza glicocomică sau screening-ul mAb pe bază de ELISA) este un instrument puternic pentru caracterizarea în profunzime a majorității glicanilor majori din peretele celular care alcătuiesc biomasa vegetală.Cu toate acestea, analiza glicanilor clasice caracterizează doar glicanii mai mari din peretele celular, deoarece majoritatea oligozaharidelor nu sunt imobilizate eficient pe plăcile ELISA.În acest studiu, aragazul de porumb pretratat cu AFEX a fost hidrolizat enzimatic la un conținut ridicat de solide.Analiza zahărului a fost utilizată pentru a determina compoziția carbohidraților recalcitranți din peretele celular din hidrolizat.Cu toate acestea, analiza mAb a oligozaharidelor mai mici din hidrolizate este subestimată și sunt necesare instrumente suplimentare pentru a imobiliza eficient oligozaharidele pe plăcile ELISA.
Raportăm aici o metodă nouă și eficientă de imobilizare a oligozaharidelor pentru screeningul mAb prin combinarea biotinilării oligozaharidelor urmată de screening ELISA pe plăci acoperite cu NeutrAvidin™.Oligozaharidele biotinilate imobilizate au arătat o afinitate suficientă pentru anticorp pentru a permite detectarea rapidă și eficientă a oligozaharidelor recalcitrante.Analiza compoziției acestor oligozaharide încăpățânate pe baza spectrometriei de masă a confirmat rezultatele acestei noi abordări a imunoscreeningului.Astfel, aceste studii demonstrează că combinația dintre biotinilarea oligozaharidelor și screeningul ELISA cu anticorpi monoclonali țintiți pe glican poate fi utilizată pentru a detecta legăturile încrucișate în oligozaharide și poate fi aplicată pe scară largă în alte studii biochimice care caracterizează structura oligozaharidelor.
Această metodă de profilare a glicanilor pe bază de biotină este primul raport capabil să investigheze legăturile de carbohidrați recalcitrante ale oligozaharidelor solubile din biomasa vegetală.Acest lucru ajută la înțelegerea de ce unele părți ale biomasei sunt atât de încăpățânate când vine vorba de producția de biocombustibil.Această metodă umple un gol important în metodele de analiză a glicomului și își extinde aplicarea la o gamă mai largă de substraturi dincolo de oligozaharidele plantelor.În viitor, putem folosi robotica pentru biotinilare și folosim metoda pe care am dezvoltat-o ​​pentru analiza de mare randament a probelor folosind ELISA.
Paiele de porumb (CS) crescute din semințe hibride Pioneer 33A14 au fost recoltate în 2010 de la Kramer Farms din Ray, Colorado.Cu permisiunea proprietarului terenului, această biomasă poate fi folosită pentru cercetare. Probele au fost depozitate uscate < 6% umiditate în pungi cu fermoar la temperatura camerei. Probele au fost depozitate uscate < 6% umiditate în pungi cu fermoar la temperatura camerei. Образцы хранились сухими при влажности < 6% в пакетах с застежкой-молнией при комтнат. Probele au fost depozitate uscate la <6% umiditate în pungi cu fermoar la temperatura camerei.样品在室温下以干燥< 6% 的水分储存在自封袋中。样品在室温下以干燥< 6% Образцы хранят в пакетах с застежкой-молнией при комнатной температуре с влажностью < 6%. Probele sunt depozitate în pungi cu fermoar la temperatura camerei cu umiditate < 6%.Studiul a respectat ghidurile locale și naționale.Analiza compozițională a fost efectuată folosind protocolul NREL.S-a descoperit că compoziția conține 31,4% glucan, 18,7% xilan, 3,3% arabinan, 1,2% galactan, 2,2% acetil, 14,3% lignină, 1,7% proteină și 13,4% cenușă.
Cellic® CTec2 (138 mg proteină/ml, lot VCNI 0001) este un amestec complex de celulază, β-glucozidază și Cellic® HTec2 (157 mg proteină/ml, lot VHN00001) de la Novozymes (Franklinton, NC, SUA)).Multifect Pectinase® (72 mg proteină/mL), un amestec complex de enzime de degradare a pectinei, a fost donat de DuPont Industrial Biosciences (Palo Alto, CA, SUA).Concentrațiile de proteine ​​​​enzimei au fost determinate prin estimarea conținutului de proteine ​​(și scăderea contribuției de azot non-proteic) utilizând analiza azotului Kjeldahl (metoda AOAC 2001.11, Dairy One Cooperative Inc., Ithaca, NY, SUA).Pământul de diatomee 545 a fost achiziționat de la EMD Millipore (Billerica, MA).Cărbune activat (DARCO, granule de 100 mesh), Avicel (PH-101), xilan de fag și toate celelalte substanțe chimice au fost achiziționate de la Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).
Pretratamentul AFEX a fost efectuat la GLBRC (Biomass Conversion Research Laboratory, MSU, Lansing, MI, SUA).Pretratarea a fost efectuată la 140°C timp de 15 minute.46 timp de rezidență la un raport 1:1 dintre amoniac anhidru și biomasă la o încărcare de 60% (g/g) într-un reactor discontinuu de banc din oțel inoxidabil (Parr Instruments Company).A durat 30 de minute.Reactorul a fost adus la 140°C și amoniacul a fost eliberat rapid, permițând biomasei să revină rapid la temperatura camerei.Compoziția țesăturii de porumb pre-tratate (ACS) AFEX a fost similară cu cea a țevilor de porumb netratate (UT-CS).
Conținut ridicat de solide ACSH 25% (g/g) (încărcare de aproximativ 8% dextran) a fost preparat ca materie primă pentru producția la scară largă de oligozaharide.Hidroliza enzimatică a ACS a fost efectuată folosind un amestec de enzime comercial care include Cellic® Ctec2 10 mg proteină/g glucan (în biomasă pretratată), Htec2 (Novozymes, Franklinton, NC), 5 mg proteină/g glucan și Multifect Pectinase (Genencor Inc, SUA).).), 5 mg proteină/g dextran.Hidroliza enzimatică a fost efectuată într-un bioreactor de 5 litri cu un volum de lucru de 3 litri, pH 4,8, 50°C și 250 rpm.După hidroliza timp de 96 de ore, hidrolizatul a fost colectat prin centrifugare la 6000 rpm timp de 30 de minute și apoi la 14000 rpm timp de 30 de minute pentru a îndepărta solidele nehidrolizate.Hidrolizatul a fost apoi supus la filtrare sterilă printr-un pahar cu filtru de 0,22 mm.Hidrolizatul filtrat a fost depozitat în sticle sterile la 4°C şi apoi fracţionat pe cărbune.
Analiza compoziției probelor de biomasă pe bază de extract conform procedurilor de analiză de laborator NREL: pregătirea probelor pentru analiza compoziției (NREL/TP-510-42620) și determinarea glucidelor structurale și a ligninei în biomasă (NREL/TP-510 – 42618)47.
Analiza oligozaharidelor a fluxului de hidrolizat a fost efectuată pe o scară de 2 ml folosind o metodă de hidroliză acidă pe bază de autoclavă.Se amestecă proba de hidrolizat cu 69,7 µl de acid sulfuric 72% într-un tub de cultură cu capac filetat de 10 ml și se incubează timp de 1 oră pe un banc la 121 °C, se răcește pe gheață și se filtrează într-un flacon de cromatografie lichidă de înaltă performanță (HPLC).Concentrația de oligozaharide a fost determinată prin scăderea concentrației de monozaharide din proba nehidrolizată din concentrația totală de zahăr din proba hidrolizată cu acid.
Concentrațiile de glucoză, xiloză și arabinoză din biomasa hidrolizată acidă au fost analizate folosind un sistem HPLC Shimadzu echipat cu un autosampler, încălzitor de coloană, pompă izocratică și detector de indice de refracție pe o coloană Bio-Rad Aminex HPX-87H.Coloana a fost menţinută la 50°C şi eluată cu 0,6 ml/min 5 mM H2S04 în apă.curgere.
Supernatantul hidrolizat a fost diluat și analizat pentru conținutul de monomer și oligozaharide.Zaharurile monomerice obținute în urma hidrolizei enzimatice au fost analizate prin HPLC echipat cu o coloană Bio-Rad (Hercules, CA) Aminex HPX-87P și o coloană de protecție a cenușii.Temperatura coloanei a fost menţinută la 80°C, a fost folosită apă ca fază mobilă cu un debit de 0,6 ml/min.Oligozaharidele au fost determinate prin hidroliză în acid diluat la 121°C conform metodelor descrise în ref.41, 48, 49.
Analiza zaharidelor a fost efectuată pe resturile de biomasă brute, pre-tratate cu AFEX și pe toate reziduurile de biomasă nehidrolizate (inclusiv producția de extracte în serie de perete celular și screening-ul lor mAb) utilizând procedurile descrise anterior 27, 43, 50, 51.Pentru analiza glicomului, reziduurile insolubile în alcool din materialul peretelui celular vegetal sunt preparate din reziduuri de biomasă și supuse extracției în serie cu reactivi din ce în ce mai agresivi, cum ar fi oxalat de amoniu (50 mM), carbonat de sodiu (50 mM și 0,5% g/v), CON.(1M și 4M, ambele cu borohidrură de sodiu 1% g/v) și clorit acid așa cum s-a descris anterior52,53.Extractele au fost apoi supuse ELISA împotriva unui panou complex de mAb50 direcționat către glicanul peretelui celular, iar reacțiile de legare a mAb au fost prezentate ca o hartă termică.mAb-urile care vizează glicanul peretelui celular al plantei au fost achiziționate din stocurile de laborator (seria CCRC, JIM și MAC).
Biotinilarea într-o singură etapă a oligozaharidelor.Conjugarea carbohidraților cu biotină-LC-hidrazidă a fost efectuată folosind următoarea procedură.Biotină-LC-hidrazida (4,6 mg/12 μmol) a fost dizolvată în dimetil sulfoxid (DMSO, 70 μl) prin agitare puternică și încălzire la 65°C timp de 1 min.S-a adăugat acid acetic glaciar (30 ui) şi amestecul a fost turnat pe cianoborohidrură de sodiu (6,4 mg/100 ui) şi complet dizolvat după încălzire la 65°C timp de aproximativ 1 minut.Apoi, de la 5 până la 8 pl de amestec de reacție s-au adăugat la oligozaharidă uscată (1-100 nmol) pentru a obține un exces molar de 10 ori sau mai mult de etichetă peste capătul reducător.Reacția a fost efectuată la 65°C timp de 2 ore, după care probele au fost imediat purificate.Nu s-a utilizat cianoborohidrură de sodiu în experimentele de etichetare fără reducere, iar probele au reacţionat la 65°C timp de 2,5 ore.
Acoperirea ELISA și spălarea probelor de oligozaharide biotinilate.În fiecare godeu al plăcii acoperite cu avidină s-au adăugat 25 μl de probe biotinilate (100 μl din fiecare probă concentrată diluată în 5 ml soluție tampon Tris 0,1 M (TBS)).Godeurile de control au fost acoperite cu 50 μl de biotină la o concentrație de 10 μg/ml în 0,1 M TBS.Apa deionizată a fost utilizată ca acoperire pentru măsurătorile martor.Tableta a fost incubată timp de 2 ore la temperatura camerei în întuneric.Se spală placa de 3 ori cu lapte degresat 0,1% în TBS 0,1 M folosind programul nr.11 pentru apartamentul Grenier 3A.
Adăugarea și spălarea anticorpilor primari.Se adaugă 40 µl de anticorp primar în fiecare godeu.Incubați microplaca timp de 1 oră la temperatura camerei în întuneric.Plăcile au fost apoi spălate de 3 ori cu lapte 0,1% în TBS 0,1 M utilizând programul de spălare #11 pentru Grenier Flat 3A.
Se adaugă anticorpul secundar și se spală.Se adaugă 50 pl de anticorp secundar de șoarece/șobolan (diluat 1:5000 în lapte 0,1% în TBS 0,1 M) în fiecare godeu.Incubați microplaca timp de 1 oră la temperatura camerei în întuneric.Microplăcile au fost apoi spălate de 5 ori cu lapte 0,1% în TBS 0,1 M utilizând programul de spălare a plăcilor Grenier Flat 5A #12.
Adăugarea unui substrat.Se adaugă 50 µl de 3,3′,5,5′-tetrametilbenzidină (TMB) la substratul de bază (prin adăugarea a 2 picături de tampon, 3 picături de TMB, 2 picături de peroxid de hidrogen la 15 ml de apă deionizată).Pregătiți substratul TMB.și vortex înainte de utilizare).Incubați microplaca la temperatura camerei timp de 30 de minute.In intuneric.
Finalizează pasul și citește tableta.Se adaugă 50 µl de acid sulfuric 1 N în fiecare godeu și se înregistrează absorbanța de la 450 la 655 nm folosind un cititor ELISA.
Se prepară 1 mg/ml soluții din acești analiți în apă deionizată: arabinoză, ramnoză, fucoză, xiloză, acid galacturonic (GalA), acid glucuronic (GlcA), manoză, glucoză, galactoză, lactoză, N-acetilmanozamină (manNAc), N-acetilglucozamină.(glcNAc), N-acetilgalactozamină (galNAc), inozitol (standard intern).Două standarde au fost preparate prin adăugarea soluţiilor de zahăr de 1 mg/mL prezentate în Tabelul 1. Probele sunt congelate şi liofilizate la -80°C până când toată apa este îndepărtată (de obicei aproximativ 12-18 ore).
Adăugați 100–500 µg de probă în tuburile cu capac filetat pe o balanță analitică.Înregistrați suma adăugată.Cel mai bine este să dizolvați proba într-o concentrație specifică de solvent și să o adăugați în tub ca o alicotă lichidă.Utilizați 20 µl de 1 mg/ml inozitol ca standard intern pentru fiecare tub de probă.Cantitatea de standard intern adăugată la probă trebuie să fie aceeași cu cantitatea de standard intern adăugată în tubul standard.
Adăugați 8 ml de metanol anhidru într-un flacon cu capac filetat.Apoi 4 ml de soluție metanolică 3 N de HCI, acoperiți și agitați.Acest proces nu folosește apă.
Se adaugă 500 µl de soluție de metanol 1 M HCI la probele de oligozaharide și la tuburile TMS standard.Probele au fost incubate peste noapte (168 ore) la 80°C într-un bloc termic.Se usucă produsul de metanoliză la temperatura camerei folosind un distribuitor de uscare.Se adaugă 200 µl de MeOH și se usucă din nou.Acest proces se repetă de două ori.Se adaugă 200 µl de metanol, 100 µl de piridină și 100 µl de anhidridă acetică la probă și se amestecă bine.Probele au fost incubate la temperatura camerei timp de 30 de minute.si uscate.Se adaugă 200 µl de metanol și se usucă din nou.
Se adaugă 200 µl de Tri-Sil și se încălzește tubul cu capac timp de 20 de minute.80°C, apoi răcit la temperatura camerei.Utilizați un distribuitor de uscare pentru a usca în continuare proba până la un volum de aproximativ 50 µl.Este important de reținut că nu am lăsat mostrele să se usuce complet.
Se adaugă 2 ml de hexan și se amestecă bine prin vortexare.Umpleți vârfurile pipetelor Pasteur (5-8 mm) cu o bucată de vată de sticlă introducând vata de sticlă deasupra unei pipete cu diametrul de 5-3/4 inci.Probele au fost centrifugate la 3000 g timp de 2 minute.Orice reziduuri insolubile sunt precipitate.Se usucă proba la 100-150 µl.Un volum de aproximativ 1 μl a fost injectat în GC-MS la o temperatură inițială de 80 ° C și un timp inițial de 2,0 minute (Tabelul 2).