תודה שביקרת ב-Nature.com.לגרסת הדפדפן שבה אתה משתמש יש תמיכת CSS מוגבלת.לקבלת החוויה הטובה ביותר, אנו ממליצים להשתמש בדפדפן מעודכן (או להשבית את מצב תאימות ב-Internet Explorer).בינתיים, כדי להבטיח תמיכה מתמשכת, נעבד את האתר ללא סגנונות ו-JavaScript.
שיטות אימונולוגיות וספקטרומטריות חדשות לניתוח מורכב של אוליגוסכרידים מתמשכים בתנור תירס שעבר טיפול מוקדם ב-AFEX.ביומסה ליגנו-תאית היא חלופה בת קיימא לדלקים מאובנים ונמצאת בשימוש נרחב לפיתוח ביוטכנולוגיות לייצור מוצרים כגון מזון, מזון, דלקים וכימיקלים.המפתח לטכנולוגיות אלו הוא פיתוח תהליכים במחירים תחרותיים להמרת פחמימות מורכבות הקיימות בדפנות תאי הצמח לסוכרים פשוטים כגון גלוקוז, קסילוז וארבינוז.מכיוון שביומסה ליגנו-תאית היא עקשנית מאוד, יש לעבור עליה טיפולים תרמוכימיים (למשל, פילינג סיבי אמוניה (AFEX), חומצות מדוללות (DA), נוזלים יוניים (IL)) וטיפולים ביולוגיים (למשל, הידרוליזה אנזימטית ותסיסה מיקרוביאלית) בשילוב כדי להשיג את המוצר הרצוי..עם זאת, כאשר נעשה שימוש באנזימים פטרייתיים מסחריים בתהליך ההידרוליזה, רק 75-85% מהסוכרים המסיסים הנוצרים הם חד-סוכרים, ו-15-25% הנותרים הם אוליגוסוכרים מסיסים ובלתי ניתנים לפתרון, שאינם תמיד זמינים למיקרואורגניזמים.בעבר, בידדנו וטיהרו בהצלחה אוליגוסכרידים עקשניים מסיסים באמצעות שילוב של הפרדת פחמן ואדמה דיאטומית וכרומטוגרפיה של אי-הכללת גודל, וכן חקרנו את תכונות מעכבי האנזים שלהם.מצאנו שאוליגוסכרידים המכילים תחליפי חומצה אורונית מתילית (DP) גבוהים יותר לעיבוד עם תערובות אנזימים מסחריות מאשר DP נמוך ואוליגוסכרידים ניטרליים.כאן אנו מדווחים על השימוש במספר שיטות נוספות, כולל פרופיל גליקן באמצעות נוגדנים חד שבטיים (mAbs) ספציפיים לגליקנים ביו-מסה צמחיים כדי לאפיין קשרים גליקניים בדפנות תאים צמחיים והידרוליזטים אנזימטיים, יינון בפיזור לייזר בעזרת מטריקס, ספקטרומטריית מסה בזמן טיסה..MALDI-TOF-MS) משתמשת בפסגות אבחון אינפורמטיביות המתקבלות בספקטרוסקופיה לאחר דעיכה משנית של יונים שליליים, כרומטוגרפיה גז וספקטרומטריית מסה (GC-MS) כדי לאפיין קשרים של אוליגוסכרידים עם ובלי נגזרת.בשל הגודל הקטן של אוליגוסכרידים (DP 4-20), מולקולות אלו קשות לשימוש לקשירה ואפיון mAb.כדי להתגבר על בעיה זו, יישמנו שיטת אימוביליזציה חדשה המבוססת על צימוד ביוטין, שסימנה בהצלחה את רוב האוליגוסכרידים המסיסים ב-DP נמוך על פני השטח של המיקרו-לוחית, אשר שימשה לאחר מכן במערכת mAb עם תפוקה גבוהה לניתוח קשירה ספציפי.שיטה חדשה זו תקל על פיתוח מבחני גליקום מתקדמים יותר בעתיד שיוכלו לשמש כדי לבודד ולאפיין אוליגוסכרידים הנמצאים בסמנים ביולוגיים למטרות אבחון.
ביומסה ליגנו-תאית, המורכבת מחומרים חקלאיים, ייעור, דשא וחומרי עצים, היא חומר מוצא פוטנציאלי לייצור מוצרים מבוססי ביו, לרבות מזון, מזון, דלק וחומרים מבשרים כימיים לייצור מוצרים בעלי ערך גבוה יותר1.פחמימות (כגון תאית והמיצלולוזה) המצויות בדפנות תאי הצמח עוברות דה-פולימר לחד-סוכרים על ידי עיבוד כימי וביו-טרנספורמציה (כגון הידרוליזה אנזימטית ותסיסה מיקרוביאלית).טיפולים מקדימים נפוצים כוללים התרחבות סיבי אמוניה (AFEX), חומצה מדוללת (DA), נוזל יוני (IL) ופיצוץ קיטור (SE), המשתמשים בשילוב של כימיקלים וחום כדי להפחית את ייצור הליגנוצלולוזה על ידי פתיחת דפנות תאי הצמח3,4.עקשנות של חומר, 5. הידרוליזה אנזימטית מתבצעת בעומס מוצקים גבוה באמצעות אנזימים מסחריים המכילים פחמימות אקטיביות (CAZymes) ותסיסה מיקרוביאלית באמצעות שמרים או חיידקים מהונדסים לייצור דלקים וכימיקלים מבוססי ביו 6 .
CAZymes באנזימים מסחריים מורכבים מתערובת מורכבת של אנזימים המבקעים באופן סינרגטי קשרי פחמימה-סוכר מורכבים ליצירת חד-סוכרים2,7.כפי שדיווחנו קודם לכן, הרשת המורכבת של פולימרים ארומטיים של ליגנין עם פחמימות הופכת אותם לבלתי ניתנים לפתרון, מה שמוביל להמרה לא מלאה של סוכר, וצוברת 15-25% מאוליגוסכרידים מיניים שאינם מיוצרים במהלך הידרוליזה אנזימטית של הביומסה שטופלה מראש.זוהי בעיה נפוצה בשיטות שונות לטיפול מקדים ביומסה.כמה סיבות לצוואר בקבוק זה כוללות עיכוב אנזימים במהלך הידרוליזה, או היעדר או רמות נמוכות של אנזימים חיוניים הדרושים לשבירת קשרי סוכר בביומסה צמחית.הבנת ההרכב והמאפיינים המבניים של סוכרים, כמו קשרי הסוכר באוליגוסכרידים, תעזור לנו לשפר את המרת הסוכר במהלך ההידרוליזה, מה שהופך תהליכים ביוטכנולוגיים לתחרותיים בעלות עם מוצרים שמקורם בנפט.
קביעת מבנה הפחמימות היא מאתגרת ודורשת שילוב של שיטות כגון כרומטוגרפיה נוזלית (LC)11,12, ספקטרוסקופיה של תהודה מגנטית גרעינית (NMR)13, אלקטרופורזה נימית (CE)14,15,16 וספקטרומטריית מסה (MS)17.,שמונה עשרה.שיטות טרשת נפוצה כגון ספקטרומטריית מסה בזמן טיסה עם ספיחה ויינון בלייזר באמצעות מטריצה ​​(MALDI-TOF-MS) הן שיטה רב-תכליתית לזיהוי מבני פחמימות.לאחרונה, התנגשות-Induced Dissociation (CID) טנדם MS של adducts יוני נתרן היה בשימוש נרחב ביותר כדי לזהות טביעות אצבע התואמות עמדות מצורף אוליגוסכרידים, תצורות אנומריות, רצפים, עמדות הסתעפות 20, 21.
ניתוח גליקן הוא כלי מצוין לזיהוי מעמיק של קשרי פחמימות22.שיטה זו משתמשת בנוגדנים חד שבטיים (mAbs) המכוונים לגליקן בדופן התא בצמח כבדיקות להבנת קישורים מורכבים של פחמימות.יותר מ-250 mAbs זמינים ברחבי העולם, מתוכננים נגד אוליגוסכרידים ליניאריים ומסועפים שונים באמצעות סכרידים שונים24.נעשה שימוש נרחב במספר mAbs כדי לאפיין את המבנה, ההרכב והשינויים של דופן תא הצמח, שכן ישנם הבדלים משמעותיים בהתאם לסוג תא הצמח, איבר, גיל, שלב התפתחותי וסביבת גדילה25,26.לאחרונה, שיטה זו שימשה להבנת אוכלוסיות שלפוחית ​​במערכות צמחים ובעלי חיים ותפקידיהם בהתאמה בהובלת גליקן כפי שנקבע על ידי סמנים תת-תאיים, שלבי התפתחות או גירויים סביבתיים, ולקביעת פעילות אנזימטית.חלק מהמבנים השונים של גליקנים וקסילאנים שזוהו כוללים פקטין (P), קסילן (X), מנאן (M), קסילוגלוקנים (XylG), גלוקנים מעורבים בקשר (MLG), ארבינוקסילאן (ArbX), גלקטומנן (GalG), חומצה גלוקורונית-ארבינוקסילאן (GArbinoX) ו-2Galanar.
עם זאת, למרות כל מאמצי המחקר הללו, רק מחקרים מעטים התמקדו באופי הצטברות אוליגוסכרידים במהלך הידרוליזה של עומס מוצקים גבוה (HSL), כולל שחרור אוליגוסכרידים, שינויים באורך השרשרת האוליגומרית במהלך ההידרוליזה, פולימרים שונים ב-DP נמוך, והקימורים שלהם.הפצות 30,31,32.בינתיים, למרות שניתוח גליקן הוכיח את עצמו ככלי שימושי לניתוח מקיף של מבנה הגליקן, קשה להעריך אוליגוסכרידים נמוכים DP מסיסים במים באמצעות שיטות נוגדנים.אוליגוסכרידים DP קטנים יותר עם משקל מולקולרי של פחות מ-5-10 kDa אינם נקשרים ללוחות ELISA 33, 34 ונשטפים לפני הוספת נוגדנים.
כאן, בפעם הראשונה, אנו מדגימים מבחן ELISA על צלחות מצופות אבידין באמצעות נוגדנים חד שבטיים, המשלב הליך ביוטינילציה חד-שלבי לאוליגוסכרידים מסיסים עקשן עם ניתוח גליקום.הגישה שלנו לניתוח גליקום אומתה על ידי ניתוח מבוסס MALDI-TOF-MS ו-GC-MS של קישורים משלימים של אוליגוסכרידים באמצעות נגזרת טרימתילסיליל (TMS) של תרכובות סוכר שעבר הידרוליזה.ניתן לפתח גישה חדשנית זו כשיטת תפוקה גבוהה בעתיד ולמצוא יישום רחב יותר במחקר ביו-רפואי35.
שינויים פוסט-תרגום של אנזימים ונוגדנים, כגון גליקוזילציה,36 משפיעים על פעילותם הביולוגית.לדוגמה, שינויים בגליקוזילציה של חלבוני סרום ממלאים תפקיד חשוב בדלקת מפרקים דלקתית, ושינויים בגליקוזילציה משמשים כסמנים אבחנתיים37.בספרות דווח כי גליקנים שונים מופיעים בקלות במגוון מחלות, כולל מחלות דלקתיות כרוניות של מערכת העיכול והכבד, זיהומים ויראליים, סרטן השחלות, השד והערמונית38,39,40.הבנת מבנה הגליקנים באמצעות שיטות גליקן ELISA מבוססות נוגדנים תספק ביטחון נוסף באבחון מחלה ללא שימוש בשיטות טרשת נפוצה מורכבות.
המחקר הקודם שלנו הראה שאוליגוסכרידים עקשניים נותרו ללא הידרוליזה לאחר טיפול מקדים והידרוליזה אנזימטית (איור 1).בעבודתנו שפורסמה בעבר, פיתחנו שיטת מיצוי פאזה מוצקה של פחם פעיל לבידוד אוליגוסכרידים מהידרוליזט תירס (ACSH)8 שטופל מראש ב-AFEX.לאחר מיצוי והפרדה ראשוניים, האוליגוסכרידים חולקו עוד יותר על ידי כרומטוגרפיה של אי הכללה בגודל (SEC) ונאספו לפי סדר משקל מולקולרי.מונומרים ואוליגומרים של סוכר ששוחררו מטיפולים מקדימים שונים נותחו על ידי ניתוח הרכב הסוכר.כאשר משווים בין תכולת אוליגומרים סוכרים המתקבלים בשיטות טיפול מוקדם שונות, נוכחותם של אוליגוסוכרים עיקשים היא בעיה נפוצה בהפיכת ביומסה לחד סוכרים ועלולה להביא להפחתה בתפוקת הסוכר של לפחות 10-15% ואף עד 18%.לָנוּ.שיטה זו משמשת לייצור נוסף בקנה מידה גדול של שברי אוליגוסכרידים.ה-ACH שהתקבל והשברים הבאים שלו עם משקלים מולקולריים שונים שימשו כחומר ניסיוני לאפיון אוליגוסכרידים בעבודה זו.
לאחר טיפול מקדים והידרוליזה אנזימטית, אוליגוסכרידים מתמשכים נותרו ללא הידרוליזה.הנה (א) היא שיטת הפרדת אוליגוסוכרים שבה מבודדים אוליגוסוכרים מהידרוליזט של תירס תירס שטופל מראש ב-AFEX (ACSH) באמצעות מצע ארוז של פחם פעיל ואדמה דיאטומית;(ב) שיטה להפרדה של אוליגוסכרידים.האוליגוסכרידים הופרדו עוד יותר על ידי כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל (SEC);(ג) מונומרים ואוליגומרים של סכרידים המשתחררים מטיפולים מקדימים שונים (חומצה מדוללת: DA, נוזל יוני: IL ו-AFEX).תנאי הידרוליזה אנזימטית: העמסת מוצקים גבוהה של 25% (w/w) (כ-8% העמסת גלוקן), הידרוליזה של 96 שעות, העמסת אנזימים מסחריים של 20 מ"ג/ג (יחס Ctec2:Htec2:MP-2:1:1) ו- (D) מונומרים של סוכר ואוליגומרים של גלוקוז, פרה-אוזקסילוז (AFS) משוחרר מ-AFS.
ניתוח גליקן הוכח ככלי שימושי לניתוח מבני מקיף של גליקנים בתמציות מבודדות משאריות ביומסה מוצקות.עם זאת, סכרידים מסיסים במים מיוצגים בחסר בשיטה מסורתית זו 41 מכיוון שקשה לבטל אוליגוסכרידים במשקל מולקולרי נמוך בצלחות ELISA והם נשטפים לפני הוספת נוגדנים.לכן, לקשירת נוגדנים ואפיון, נעשה שימוש בשיטת ביוטינילציה חד-שלבית לציפוי אוליגוסכרידים מסיסים שאינם תואמים על גבי לוחות ELISA מצופות אבידין.שיטה זו נבדקה באמצעות ACSH שיוצרו בעבר ושבר על בסיס משקלו המולקולרי (או דרגת הפילמור, DP).ביוטינילציה חד-שלבית שימשה להגברת הזיקה לקשירת אוליגוסכרידים על ידי הוספת ביוטין-LC-hydrazide לקצה המפחית של הפחמימה (איור 2).בתמיסה, קבוצת ההמיאצטל בקצה המצמצם מגיבה עם קבוצת ההידראזידים של ביוטין-LC-הידראזיד ליצירת קשר הידרזון.בנוכחות החומר המפחית NaCNBH3, קשר ההידרזון מופחת לתוצר סופי ביוטיניל יציב.עם השינוי של הקצה המפחית את הסוכר, התאפשרה קשירה של אוליגוסכרידים עם DP נמוך לצלחות ELISA, ובמחקר שלנו זה נעשה על צלחות מצופות אבידין באמצעות mAbs ממוקדי גליקן.
סקר נוגדנים חד שבטיים על בסיס ELISA לאוליגוסכרידים ביוטיניל.כאן (א) משולב ביוטינילציה של אוליגוסכרידים והקרנת ELISA שלאחר מכן עם mAbs ממוקדי גליקן על צלחות מצופות NeutrAvidin ו-(B) מציג הליך חד-שלבי לביוטינילציה של תוצרי תגובה.
צלחות מצופות אבידין עם נוגדנים מצומדים אוליגוסכרידים נוספו לאחר מכן לנוגדנים ראשוניים ומשניים ונשטפו במדיום רגיש לאור ולזמן.לאחר השלמת קשירת הנוגדנים, הוסף מצע TMB כדי לדגור את הצלחת.התגובה הופסקה לבסוף עם חומצה גופרתית.הצלחות המודגרות נותחו באמצעות קורא ELISA כדי לקבוע את חוזק הקישור של כל נוגדן כדי לזהות קישור צולב ספציפי לנוגדן.לפרטים ופרמטרים של הניסוי, עיין בסעיף המתאים "חומרים ושיטות".
אנו מדגימים את התועלת של שיטה זו שפותחה לאחרונה עבור יישומים ספציפיים על ידי אפיון האוליגוסכרידים המסיסים הקיימים ב-ACSH וכן בשברי אוליגוסכרידים גולמיים ומטוהרים המבודדים מהידרוליזטים של ליגנו-תא.כפי שמוצג באיור 3, הקסילנים המוחלפים באפיטופים הנפוצים ביותר שזוהו ב-ACSH באמצעות שיטות בדיקת גליקום ביו-אציל הם בדרך כלל אורוני (U) או מתילורוני (MeU) ו-arabinogalactans פקטי.רובם נמצאו גם במחקר הקודם שלנו על ניתוח גליקנים של מוצקים לא-הידרוליזים (UHS)43.
זיהוי אפיטופים אוליגוסכרידים סוררים באמצעות נוגדן חד שבטי המכוון לגליקן דופן התא.השבר ה"נייטרלי" הוא שבר ACN והשבר ה"חומצי" הוא שבר FA.אדום בוהק יותר במפת החום מצביע על תוכן אפיטופ גבוה יותר, וכחולים בהירים יותר מציינים רקע ריק.ערכי הצבע בסולם מבוססים על ערכי OD גולמיים עבור ניסוחים N=2.האפיטופים העיקריים המוכרים על ידי הנוגדנים מוצגים בצד ימין.
מבנים שאינם תאית אלו לא ניתנו לבקע על ידי הצלולאזות וההמיצלולאזות הנפוצות ביותר בתערובת האנזים המסחרית שנבדקה, הכוללת את האנזימים המסחריים הנפוצים ביותר.לכן נדרשים אנזימים עזר חדשים להידרוליזה שלהם.ללא האנזימים הנחוצים נלווים שאינם תאית, קשרים אלו שאינם תאית מונעים המרה מלאה לחד סוכרים, גם אם פולימרי הסוכר האב שלהם עוברים הידרוליזה נרחבת לשברים קצרים יותר ומומסים באמצעות תערובות אנזימים מסחריות.
מחקר נוסף של התפלגות האות וחוזק הקישור שלו הראה שהאפיטופים הקישורים היו נמוכים יותר בשברי סוכר עם DP גבוה (A, B, C, DP עד 20+) מאשר בשברי DP נמוך (D, E, F, DP) בדימרים) (איור 1).שברי חומצה נפוצים יותר באפיטופים שאינם תאית מאשר שברים ניטרליים.תופעות אלה עולות בקנה אחד עם הדפוס שנצפה במחקר הקודם שלנו, שבו חלקי DP גבוהים וחומצה היו עמידים יותר להידרוליזה אנזימטית.לכן, נוכחותם של אפיטופים גליקניים שאינם תאית ותחליפים של U ו-MeU יכולים לתרום רבות ליציבות האוליגוסכרידים.יש לציין שיעילות הקישור והזיהוי עלולה להיות בעייתית עבור אוליגוסוכרים עם DP נמוך, במיוחד אם האפיטופ הוא אוליגוסכריד דימרי או טרימרי.ניתן לבדוק זאת באמצעות אוליגוסכרידים מסחריים באורכים שונים, כל אחד מכיל רק אפיטופ אחד שנקשר ל-mAb ספציפי.
לפיכך, השימוש בנוגדנים ספציפיים למבנה חשף סוגים מסוימים של קשרים סוררים.בהתאם לסוג הנוגדן בו נעשה שימוש, דפוס הקשירה המתאים וחוזק האות שהוא מייצר (הכי הרבה והפחות שופע), ניתן לזהות אנזימים חדשים ולהוסיף באופן חצי כמותי לתערובת האנזים להמרה גליקו-שלמה יותר.אם ניקח לדוגמא את הניתוח של אוליגוסכרידים ACSH, נוכל ליצור מסד נתונים של קשרי גליקן עבור כל חומר ביומסה.יש לציין כאן כי יש לקחת בחשבון את הזיקה השונה של נוגדנים, ואם הזיקה שלהם אינה ידועה, הדבר ייצור קשיים מסוימים בהשוואת האותות של נוגדנים שונים.בנוסף, השוואה של קשרי גליקן עשויה לעבוד בצורה הטובה ביותר בין דגימות לאותו נוגדן.לאחר מכן ניתן לקשר את הקשרים העיקשים הללו למסד הנתונים של CAZyme, שממנו נוכל לזהות אנזימים, לבחור אנזימים מועמדים ולבדוק אנזימים שוברי קשר, או לפתח מערכות מיקרוביאליות לבטא אנזימים אלה לשימוש בבתי זיקוק44.
כדי להעריך כיצד שיטות אימונולוגיות משלימות שיטות חלופיות לאפיון אוליגוסכרידים במשקל מולקולרי נמוך הקיימים בהידרוליזטים של ליגנו-תא, ביצענו MALDI (איור 4, S1-S8) וניתוח של סכרידים שמקורם ב-TMS על בסיס GC-MS על אותו חלק של אוליגוסכרידים (איור 5).MALDI משמש כדי להשוות אם התפלגות המסה של מולקולות אוליגוסכרידים תואמת את המבנה המיועד.על איור.4 מציג את ה-MC של הרכיבים הנייטרליים ACN-A ו-ACN-B.ניתוח ACN-A אישר מגוון של סוכרים פנטוזים החל מ-DP 4-8 (איור 4) ל-DP 22 (איור S1), אשר משקלם תואם לאוליגוסכרידים MeU-xylan.ניתוח ACN-B אישר את סדרת הפנטוז והגלוקוקסילאן עם DP 8-15.בחומר משלים כגון איור S3, מפות התפלגות מסה חומצית של FA-C מציגות מגוון של סוכרי פנטוז מוחלפים (Me)U עם DP של 8-15, התואמים את הקסילנים המוחלפים שנמצאו בהקרנת mAb מבוסס ELISA.האפיטופים עקביים.
ספקטרום MALDI-MS של אוליגוסכרידים מסיסים שאינם תואמים הקיימים ב-ACS.כאן, (A) חלקי משקל נמוך של ACN-A המכילים חומצה אורונית מתילתית (DP 4-8) אוליגוסכרידים גלוקורוקסילין מוחלפים ו- (B) קסילן ACN-B ואוליגוסכרידים של חומצה אורונית מתילתית שהוחלפו בגלוקורוקסילן (DP 8-15).
ניתוח ההרכב של שאריות הגליקן של אוליגוסכרידים עקשן.כאן (א) הרכב סוכר TMS של שברי אוליגוסכרידים שונים שהושגו באמצעות ניתוח GC-MS.(ב) מבנים של סוכרים שונים שמקורם ב-TMS הקיימים באוליגוסכרידים.ACN – שבריר אצטוןטריל המכיל אוליגוסכרידים ניטרליים ו-FA – שבריר חומצה ferulic המכיל אוליגוסכרידים חומציים.
מסקנה מעניינת נוספת הופקה מניתוח LC-MS של חלק האוליגוסכריד, כפי שמוצג באיור S9 (ניתן לראות שיטות בחומר המשלים האלקטרוני).שברים של קבוצות hexose ו-OAc נצפו שוב ושוב במהלך קשירה של חלק ACN-B.ממצא זה לא רק מאשר את הפיצול שנצפה באנליזה של גליקום ו-MALDI-TOF, אלא גם מספק מידע חדש על נגזרות פוטנציאליות של פחמימות בביומסה ליגנו-תאית שטופלה מראש.
כמו כן, ניתחנו את הרכב הסוכר של חלק האוליגוסכריד באמצעות נגזרת סוכר TMS.באמצעות GC-MS, קבענו את ההרכב של סוכרים עצביים (לא נגזרים) וחומציים (GluA ו-GalA) בשבר האוליגוסכרידים (איור 5).חומצה גלוקורונית נמצאת ברכיבים חומציים C ו-D, בעוד שחומצה גלקטורונית נמצאת ברכיבים חומציים A ו-B, שניהם רכיבי DP גבוהים של סוכרים חומציים.תוצאות אלו לא רק מאשרות את נתוני ה-ELISA וה-MALDI שלנו, אלא גם תואמות את המחקרים הקודמים שלנו על הצטברות אוליגוסכרידים.לכן, אנו מאמינים ששיטות אימונולוגיות מודרניות המשתמשות בביוטינילציה של אוליגוסכרידים והקרנת ELISA שלאחר מכן מספיקות כדי לזהות אוליגוסכרידים סוררים מסיסים בדגימות ביולוגיות שונות.
מאחר ששיטות סקר mAb מבוססות ELISA אושרו על ידי מספר שיטות שונות, רצינו להמשיך ולחקור את הפוטנציאל של שיטה כמותית חדשה זו.שני אוליגוסכרידים מסחריים, xylohexasaccharide oligosaccharide (XHE) ו-23-α-L-arabinofuranosyl-xylotriose (A2XX), נרכשו ונבדקו באמצעות גישת mAb חדשה המכוונת לגליקן דופן התא.איור 6 מציג מתאם ליניארי בין אות הקישור הביוטיניל לבין ריכוז הלוג של ריכוז אוליגוסכרידים, מה שמרמז על מודל ספיחה אפשרי של Langmuir.בין ה-mAbs, CCRC-M137, CCRC-M138, CCRC-M147, CCRC-M148 ו-CCRC-M151 נמצאו בקורלציה עם XHE, ו-CCRC-M108, CCRC-M109 ו-LM11 בקורלציה עם A2XX בטווח של 100nnm.בשל הזמינות המוגבלת של נוגדנים במהלך הניסוי, בוצעו ניסויים מוגבלים עם כל ריכוז אוליגוסכריד.יש לציין כאן שחלק מהנוגדנים מגיבים בצורה שונה מאוד לאותו אוליגוסכריד כמצע, ככל הנראה בגלל שהם נקשרים לאפיטופים מעט שונים ויכולים להיות בעלי זיקות קשירה שונות מאוד.המנגנונים וההשלכות של זיהוי אפיטופים מדויק יהיו הרבה יותר מורכבים כאשר הגישה החדשה של mAb תיושם על דגימות אמיתיות.
שני אוליגוסכרידים מסחריים שימשו לקביעת טווח הגילוי של mAbs שונים המכוונים לגליקנים.כאן, מתאמים ליניאריים עם ריכוז לוג של ריכוז אוליגוסכרידים מצביעים על דפוסי ספיחה של Langmuir עבור (A) XHE עם mAb ו- (B) A2XX עם mAb.האפיטופים המתאימים מציינים את המבנים של האוליגוסכרידים המסחריים המשמשים כמצעים בבדיקה.
השימוש בנוגדנים חד שבטיים ממוקדי גליקן (אנליזה גליקוקומית או בדיקת mAb מבוססת ELISA) הוא כלי רב עוצמה לאפיון מעמיק של רוב הגליקנים העיקריים של דופן התא המרכיבים את הביומסה של הצמח.עם זאת, ניתוח גליקן קלאסי מאפיין רק גליקנים גדולים יותר בדופן התא, מכיוון שרוב האוליגוסכרידים אינם מקובעים ביעילות על לוחות ELISA.במחקר זה, תנור תירס שטופל מראש ב-AFEX עבר הידרוליזה אנזימטית בתכולת מוצקים גבוהה.נעשה שימוש בניתוח סוכר כדי לקבוע את ההרכב של פחמימות דופן תא סוררות בהידרוליזט.עם זאת, ניתוח mAb של אוליגוסכרידים קטנים יותר בהידרוליזטים אינו מוערך, ונדרשים כלים נוספים כדי לשתק ביעילות אוליגוסכרידים בצלחות ELISA.
אנו מדווחים כאן על שיטת אימוביליזציה חדשה ויעילה של אוליגוסכרידים להקרנת mAb על ידי שילוב ביוטינילציה של אוליגוסכרידים ואחריה בדיקת ELISA על צלחות מצופות NeutrAvidin™.האוליגוסכרידים המקובעים ביוטיניל הראו זיקה מספקת לנוגדן כדי לאפשר זיהוי מהיר ויעיל של אוליגוסכרידים סוררים.ניתוח ההרכב של אוליגוסכרידים עקשניים אלו על בסיס ספקטרומטריית מסה אישרה את התוצאות של גישה חדשה זו לסריקה חיסונית.לפיכך, מחקרים אלו מוכיחים כי ניתן להשתמש בשילוב של ביוטינילציה של אוליגוסכרידים והקרנת ELISA עם נוגדנים חד שבטיים ממוקדי גליקאן לזיהוי קישורים צולבים באוליגוסכרידים וניתן ליישם אותו באופן נרחב במחקרים ביוכימיים אחרים המאפיינים את מבנה האוליגוסכרידים.
שיטת פרופיל גליקן מבוססת ביוטין זו היא הדו"ח הראשון המסוגל לחקור את קשרי הפחמימות הסוררים של אוליגוסכרידים מסיסים בביומסה צמחית.זה עוזר להבין מדוע חלקים מסוימים של ביומסה הם כל כך עקשנים כשזה מגיע לייצור דלק ביולוגי.שיטה זו ממלאת פער חשוב בשיטות ניתוח גליקום ומרחיבה את היישום שלה למגוון רחב יותר של מצעים מעבר לאוליגוסכרידים צמחיים.בעתיד, אנו עשויים להשתמש ברובוטיקה לביוטינילציה ולהשתמש בשיטה שפיתחנו לניתוח תפוקה גבוהה של דגימות באמצעות ELISA.
קש תירס (CS) שגדל מזרעים היברידיים של Pioneer 33A14 נקצר בשנת 2010 מחוות קרמר בריי, קולורדו.באישור בעל הקרקע ניתן להשתמש בביומסה זו למחקר. הדגימות אוחסנו יבשות < 6% לחות בשקיות רוכסן בטמפרטורת החדר. הדגימות אוחסנו יבשות < 6% לחות בשקיות רוכסן בטמפרטורת החדר. הורד את מערכות ההפעלה בטווח של < 6% בשירותים של המשרדים. דגימות אוחסנו יבשות ב<6% לחות בשקיות עם רוכסן בטמפרטורת החדר.样品在室温下以干燥< 6% 的水分储存在自封袋中。样品在室温下以干燥< 6% התקנות מובילות בשירותים של < 6%. דגימות מאוחסנות בשקיות רוכסן בטמפרטורת החדר עם לחות < 6%.המחקר עמד בהנחיות מקומיות וארציות.ניתוח קומפוזיציוני בוצע באמצעות פרוטוקול NREL.נמצא שההרכב מכיל 31.4% גלוקן, 18.7% קסילן, 3.3% ארבינן, 1.2% גלקטן, 2.2% אצטיל, 14.3% ליגנין, 1.7% חלבון ו-13.4% אפר.
Cellic® CTec2 (138 מ"ג חלבון/מ"ל, מנה VCNI 0001) היא תערובת מורכבת של צלולאז, β-glucosidase ו- Cellic® HTec2 (157 מ"ג חלבון/מ"ל, מנה VHN00001) מבית Novozymes (פרנקינטון, NC, ארה"ב)).Multifect Pectinase® (72 מ"ג חלבון/מ"ל), תערובת מורכבת של אנזימים מפרקי פקטין, נתרמה על ידי DuPont Industrial Biosciences (פאלו אלטו, קליפורניה, ארה"ב).ריכוזי חלבון האנזים נקבעו על ידי הערכת תכולת החלבון (והפחתת התרומה של חנקן שאינו חלבוני) באמצעות ניתוח חנקן Kjeldahl (שיטת AOAC 2001.11, Dairy One Cooperative Inc., Ithaca, NY, ארה"ב).אדמה דיאטומית 545 נרכשה מ-EMD Millipore (Billerica, MA).פחם פעיל (DARCO, גרגירי רשת 100), אביצל (PH-101), קסילן אשור, וכל שאר הכימיקלים נרכשו מסיגמא-אלדריץ' (סנט לואיס, מוסקבה).
טיפול מקדים ב-AFEX בוצע ב-GLBRC (מעבדת המחקר להמרה ביולוגית, MSU, Lansing, MI, ארה"ב).הטיפול המקדים בוצע ב-140 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.46 זמן שהייה ביחס של 1:1 של אמוניה מימית לביומסה בטעינה של 60% (w/w) בכור אצווה מפלדת אל חלד (Parr Instruments Company).זה לקח 30 דקות.הכור הובא ל-140 מעלות צלזיוס והאמוניה שוחררה במהירות, מה שאפשר לביומסה לחזור במהירות לטמפרטורת החדר.ההרכב של תנור תירס מטופל מראש (ACS) היה דומה לזה של תנור תירס לא מטופל (UT-CS).
מוצקים גבוהים ACSH 25% (w/w) (כ-8% העמסת דקסטרן) הוכן כחומר מוצא לייצור בקנה מידה גדול של אוליגוסכרידים.הידרוליזה אנזימטית של ACS בוצעה באמצעות תערובת אנזימים מסחרית הכוללת Cellic® Ctec2 10 מ"ג חלבון/גרם גלוקן (בביומסה מטופלת מראש), Htec2 (Novozymes, Franklinton, NC), 5 מ"ג חלבון/גרם גלוקן ו-Multifect Pectinase (Genencor Inc, ארה"ב).).), 5 מ"ג חלבון/גרם דקסטרן.הידרוליזה אנזימטית בוצעה בביוריאקטור של 5 ליטר עם נפח עבודה של 3 ליטר, pH 4.8, 50°C ו-250 סל"ד.לאחר הידרוליזה במשך 96 שעות, ההידרוליז נאסף על ידי צנטריפוגה ב-6000 סל"ד למשך 30 דקות ולאחר מכן ב-14000 סל"ד למשך 30 דקות כדי להסיר מוצקים לא הידרוליזים.לאחר מכן הועבר ההידרוליז לסינון סטרילי דרך כוס פילטר 0.22 מ"מ.ההידרוליזט המסונן אוחסן בבקבוקים סטריליים ב-4 מעלות צלזיוס ולאחר מכן חולק על פחמן.
ניתוח הרכב דגימות ביומסה מבוססות תמצית לפי נוהלי ניתוח מעבדה של NREL: הכנת דגימות לניתוח הרכב (NREL/TP-510-42620) וקביעת פחמימות מבניות וליגנין בביומסה (NREL/TP-510 – 42618)47.
ניתוח אוליגוסכרידים של זרם ההידרוליזה בוצע בקנה מידה של 2 מ"ל בשיטת הידרוליזה חומצית מבוססת אוטוקלאב.מערבבים את דגימת ההידרוליז עם 69.7 μl של חומצה גופרתית 72% בצינורית תרבית מכסה בורג בנפח 10 מ"ל ודגירה במשך שעה אחת על גבי ספסל ב-121 מעלות צלזיוס, צננו על קרח וסנן לתוך בקבוקון כרומטוגרפיה נוזלית (HPLC) עם ביצועים גבוהים.ריכוז האוליגוסכרידים נקבע על ידי הפחתת ריכוז החד-סוכרים בדגימה הלא-הידרוליזה מריכוז הסוכר הכולל בדגימה שעברה הידרוליזה בחומצה.
ריכוזי הגלוקוז, הקסילוז והארבינוז בביומסה שעברה הידרוליזה בחומצה נותחו באמצעות מערכת Shimadzu HPLC המצוידת בדגימה אוטומטית, מחמם עמודים, משאבה איזוקרטית וגלאי אינדקס השבירה על עמודת Bio-Rad Aminex HPX-87H.העמודה נשמרה ב-50 מעלות צלזיוס ונפלטה עם 0.6 מ"ל/דקה 5 מ"מ H2SO4 במים.זְרִימָה.
הסופרנטנט של ההידרוליזה היה מדולל ונותח עבור תכולת מונומרים ואוליגוסכרידים.סוכרים מונומריים שהתקבלו לאחר הידרוליזה אנזימטית נותחו על ידי HPLC מצויד בעמודת Bio-Rad (Hercules, CA) Aminex HPX-87P ועמודת שמירה על אפר.טמפרטורת העמודה נשמרה על 80 מעלות צלזיוס, מים שימשו כשלב הנייד עם קצב זרימה של 0.6 מ"ל לדקה.אוליגוסכרידים נקבעו על ידי הידרוליזה בחומצה מדוללת ב-121 מעלות צלזיוס לפי השיטות המתוארות ב- refs.41, 48, 49.
אנליזה של סכרידים בוצעה על שאריות ביומסה גולמיות, שטופלו מראש ב-AFEX ועל כל שאריות ביומסה שאינן הידרוליזה (כולל ייצור תמציות דופן תא טוריות והקרנת mAb שלהן) תוך שימוש בהליכים שתוארו קודם לכן 27, 43, 50, 51.לצורך ניתוח גליקום, מכינים שאריות בלתי מסיסות באלכוהול של חומרי דופן תא צמחי משאריות ביומסה ונתונים למיצוי סדרתי עם ריאגנטים אגרסיביים יותר ויותר כגון אמוניום אוקסלט (50 מ"מ), נתרן קרבונט (50 מ"מ ו-0.5% w/v), CON.(1M ו-4M, שניהם עם 1% w/v נתרן בורוהידריד) וחומצה כלוריט כפי שתואר קודם52,53.התמציות עברו לאחר מכן ל-ELISA כנגד פאנל מורכב של mAb50s המכוון לגליקן דופן התא, ותגובות ה-mAb מחייבות הוצגו כמפת חום.mAbs המכוונים לגליקן בדופן התא הצמחי נרכשו ממניות מעבדה (סדרות CCRC, JIM ו-MAC).
ביוטינילציה של אוליגוסכרידים בשלב אחד.הצימוד של פחמימות עם ביוטין-LC-hydrazide בוצע באמצעות ההליך הבא.ביוטין-LC-הידראזיד (4.6 מ"ג/12 מיקרומול) הומס ב-dimethyl sulfoxide (DMSO, 70 μl) על ידי ערבוב נמרץ וחימום ב-65 מעלות צלזיוס למשך דקה אחת.חומצה אצטית קרחונית (30 μl) נוספה והתערובת יוצקה על נתרן ציאנובורוהיריד (6.4 מ"ג/100 μmol) והומסה לחלוטין לאחר חימום ב-65 מעלות צלזיוס למשך כדקה אחת.לאחר מכן, 5 עד 8 μl מתערובת התגובה נוספה לאוליגוסכריד המיובש (1-100 ננומול) כדי להשיג עודף טוחני של פי 10 או יותר של התווית על הקצה המפחית.התגובה בוצעה ב-65 מעלות צלזיוס למשך שעתיים, ולאחר מכן הדגימות טוהרו מיד.לא נעשה שימוש בנתרן ציאנובורהידריד בניסויי התיוג ללא הפחתה, והדגימות הגיבו ב-65 מעלות צלזיוס למשך 2.5 שעות.
ציפוי ELISA ושטיפת דגימות של אוליגוסכרידים ביוטיניל.25 μl של דגימות biotinylated (100 μl מכל דגימה מרוכזת מדולל ב-5 מ"ל של 0.1 M Tris חיץ פתרון (TBS)) נוספו לכל באר של הצלחת המצופה אבידין.בארות הבקרה צופו ב-50 μl של ביוטין בריכוז של 10 μg/ml ב-0.1 M TBS.מים דה-יונים שימשו כציפוי למדידות ריקים.הטבליה הודגרה במשך שעתיים בטמפרטורת החדר בחושך.שטפו את הצלחת 3 פעמים עם 0.1% חלב רזה ב-0.1 M TBS באמצעות תוכנית מס.11 עבור דירה Grenier 3A.
הוספה ושטיפת נוגדנים ראשוניים.הוסף 40 μl של נוגדן ראשוני לכל באר.דגירה על המיקרופלייט למשך שעה בטמפרטורת החדר בחושך.הצלחות נשטפו 3 פעמים עם 0.1% חלב ב-0.1M TBS באמצעות תוכנית שטיפה מס' 11 עבור Grenier Flat 3A.
הוסף נוגדן משני ושטוף.הוסף 50 μl של נוגדן משני לעכבר/עכברושים (מדולל 1:5000 בחלב של 0.1% ב-0.1 M TBS) לכל באר.דגירה על המיקרופלייט למשך שעה בטמפרטורת החדר בחושך.לאחר מכן, המיקרו-פלטות נשטפו 5 פעמים עם 0.1% חלב ב-0.1 M TBS באמצעות תוכנית שטיפת הצלחות של Grenier Flat 5A #12.
הוספת מצע.הוסף 50 μl של 3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine (TMB) למצע הבסיס (על ידי הוספת 2 טיפות חוצץ, 3 טיפות TMB, 2 טיפות מי חמצן ל-15 מ"ל מים מפושטים).הכן את מצע ה-TMB.ומערבבים לפני השימוש).דגירה של המיקרופלייט בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.בחושך.
השלם את השלב וקרא את הטאבלט.הוסף 50 μl של חומצה גופרתית 1 N לכל באר ורשום את הספיגה מ-450 עד 655 ננומטר באמצעות קורא ELISA.
הכן תמיסות של 1 מ"ג/מ"ל של אנליטים אלה במים מופחתים: ארבינוז, רמנוזה, פוקוז, קסילוזה, חומצה גלקטורונית (GalA), חומצה גלוקורונית (GlcA), מנוז, גלוקוז, גלקטוז, לקטוז, N-אצטילמנוזאמין (manNAc), N-אצטילגלוקוזאמין.(glcNAc), N-acetylgalactosamine (galNAc), אינוזיטול (תקן פנימי).שני תקנים הוכנו על ידי הוספת תמיסות הסוכר של 1 מ"ג/מ"ל המוצגות בטבלה 1. הדגימות מוקפאות ומופכות ב-80 מעלות צלזיוס עד שכל המים מוסרים (בדרך כלל כ-12-18 שעות).
הוסף 100-500 מיקרוגרם של דגימה לצינורות הברגה במאזן אנליטי.רשום את הכמות שנוספה.עדיף להמיס את הדגימה בריכוז מסוים של ממס ולהוסיף אותה לצינור כמנה נוזלית.השתמש ב-20 μl של 1 מ"ג/מ"ל אינוזיטול כתקן פנימי עבור כל צינורית דגימה.כמות התקן הפנימי שנוסף לדגימה חייבת להיות זהה לכמות התקן הפנימי שנוספה לצינור הסטנדרטי.
הוסף 8 מ"ל של מתנול נטול מים לבקבוקון מכסה בורג.לאחר מכן 4 מ"ל של תמיסת HCl 3 N. מתנולית, מכסה ומעורער.תהליך זה אינו משתמש במים.
הוסף 500 μl של תמיסת מתנול 1 M HCl לדגימות האוליגוסכריד ולצינורות TMS סטנדרטיים.דגימות הודגרו במשך הלילה (168 שעות) ב-80 מעלות צלזיוס בבלוק תרמי.יבש את המוצר מתנוליזה בטמפרטורת החדר באמצעות סעפת ייבוש.הוסף 200 μl MeOH ויבש שוב.תהליך זה חוזר על עצמו פעמיים.הוסף 200 µl של מתנול, 100 µl של פירידין ו-100 µl של אנהידריד אצטית לדגימה וערבב היטב.דגימות הודגרו בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.ומיובש.הוסף 200 μl מתנול ויבש שוב.
הוסף 200 μl של Tri-Sil וחמם צינור עם מכסה למשך 20 דקות.80 מעלות צלזיוס, ואז מקורר לטמפרטורת החדר.השתמש בסעפת ייבוש כדי לייבש עוד יותר את הדגימה לנפח של כ-50 μl.חשוב לציין שלא אפשרנו לדגימות להתייבש לחלוטין.
הוסף 2 מ"ל של הקסאן וערבב היטב על ידי מערבולת.מלאו את קצות פיפטות פסטר (5-8 מ"מ) בחתיכת צמר זכוכית על ידי הכנסת צמר הזכוכית על גבי פיפטה בקוטר 5-3/4 אינץ'.דגימות עברו צנטריפוגה ב-3000 גרם למשך 2 דקות.כל השאריות הבלתי מסיסות מושקעות.יבש את המדגם ל-100-150 μl.נפח של כ-1 μl הוזרק ל-GC-MS בטמפרטורה התחלתית של 80 מעלות צלזיוס ובזמן ראשוני של 2.0 דקות (טבלה 2).