Kiitos vierailustasi Nature.comissa.Käyttämässäsi selainversiossa on rajoitettu CSS-tuki.Parhaan kokemuksen saamiseksi suosittelemme käyttämään päivitettyä selainta (tai poistamaan Yhteensopivuustila käytöstä Internet Explorerissa).Sillä välin varmistaaksemme jatkuvan tuen hahmonnamme sivuston ilman tyylejä ja JavaScriptiä.
Uudet immunologiset ja massaspektrometriset menetelmät pysyvien oligosakkaridien monimutkaiseen analyysiin AFEX:llä esikäsitellyssä maississa.Lignoselluloosabiomassa on kestävä vaihtoehto fossiilisille polttoaineille, ja sitä käytetään laajalti bioteknologian kehittämiseen tuotteiden, kuten elintarvikkeiden, rehujen, polttoaineiden ja kemikaalien, tuotantoon.Avain näihin teknologioihin on kustannuskilpailukykyisten prosessien kehittäminen kasvien soluseinissä olevien monimutkaisten hiilihydraattien muuntamiseksi yksinkertaisiksi sokereiksi, kuten glukoosiksi, ksyloosiksi ja arabinoosiksi.Koska lignoselluloosabiomassa on erittäin sitkeää, se on alistettava lämpökemiallisiin käsittelyihin (esim. ammoniakkikuidun kuorinta (AFEX), laimeat hapot (DA), ioniset nesteet (IL)) ja biologiset käsittelyt (esim. entsymaattinen hydrolyysi ja mikrobifermentointi) halutun tuotteen saamiseksi..Kuitenkin, kun kaupallisia sienientsyymejä käytetään hydrolyysiprosessissa, vain 75-85 % muodostuneista liukoisista sokereista on monosakkarideja ja loput 15-25 % ovat liukoisia, vaikeasti hoidettavia oligosakkarideja, jotka eivät aina ole mikro-organismien käytettävissä.Aiemmin olemme onnistuneesti eristäneet ja puhdistaneet liukoisia sitkeitä oligosakkarideja käyttämällä hiili- ja piimaaerotuksen ja kokoekskluusiokromatografian yhdistelmää ja tutkineet myös niiden entsyymejä estäviä ominaisuuksia.Olemme havainneet, että oligosakkarideja, jotka sisältävät korkeamman polymerointiasteen (DP) metyloituja uronihapposubstituutioita, on vaikeampi käsitellä kaupallisilla entsyymisekoituksilla kuin matalan DP:n ja neutraaleja oligosakkarideja.Tässä raportoimme useiden lisämenetelmien käytöstä, mukaan lukien glykaanin profiloinnin käyttämällä kasvien biomassaglykaaneille spesifisiä monoklonaalisia vasta-aineita (mAb:t) kasvien soluseinien ja entsymaattisten hydrolysaattien glykaanisidosten karakterisoimiseksi, matriisiavusteisen laserdesorptioionisoinnin, lentoajan massaspektrometrian..MALDI-TOF-MS) käyttää rakenneinformatiivisia diagnostisia huippuja, jotka on saatu spektroskopialla negatiivisten ionien sekundaarisen hajoamisen, kaasukromatografian ja massaspektrometrian (GC-MS) jälkeen karakterisoidakseen oligosakkaridisidoksia derivatisoinnin kanssa ja ilman.Oligosakkaridien (DP 4–20) pienen koon vuoksi näitä molekyylejä on vaikea käyttää mAb:n sitomiseen ja karakterisointiin.Tämän ongelman ratkaisemiseksi käytimme uutta biotiinin konjugaatioon perustuvaa oligosakkaridien immobilisaatiomenetelmää, joka leimasi onnistuneesti suurimman osan matalan DP:n liukenevista oligosakkarideista mikrolevyn pinnalla, jota käytettiin sitten korkean suorituskyvyn mAb-järjestelmässä spesifiseen ligaatioanalyysiin.Tämä uusi menetelmä helpottaa kehittyneempien korkean suorituskyvyn glykoomimääritysten kehittämistä tulevaisuudessa, joita voidaan käyttää biomarkkereissa olevien oligosakkaridien eristämiseen ja karakterisoimiseen diagnostisiin tarkoituksiin.
Lignoselluloosabiomassa, joka koostuu maa-, metsä-, ruoho- ja puumateriaaleista, on mahdollinen raaka-aine biopohjaisten tuotteiden, mukaan lukien elintarvikkeiden, rehujen, polttoaineiden ja kemiallisten esiasteiden, valmistukseen arvokkaiden tuotteiden tuottamiseksi1.Kasvien soluseinissä olevat hiilihydraatit (kuten selluloosa ja hemiselluloosa) depolymeroidaan monosakkarideiksi kemiallisella prosessoinnilla ja biotransformaatiolla (kuten entsymaattisella hydrolyysillä ja mikrobifermentaatiolla).Yleisiä esikäsittelyjä ovat ammoniakkikuitupaisutus (AFEX), laimea happo (DA), ioninen neste (IL) ja höyryräjähdys (SE), joissa käytetään kemikaalien ja lämmön yhdistelmää lignoselluloosan tuotannon vähentämiseen avaamalla kasvien soluseiniä3,4.aineen itsepäisyys, 5. Entsymaattinen hydrolyysi suoritetaan suurella kiintoainekuormalla käyttämällä kaupallisia aktiivisia hiilihydraattipitoisia entsyymejä (CAZymes) ja mikrobifermentointia käyttämällä siirtogeenisiä hiivoja tai bakteereja biopohjaisten polttoaineiden ja kemikaalien tuottamiseksi 6 .
Kaupallisten entsyymien CAZymit koostuvat monimutkaisesta entsyymien seoksesta, joka katkaisee synergistisesti monimutkaisia ​​hiilihydraatti-sokerisidoksia muodostaen monosakkarideja2,7.Kuten aiemmin raportoimme, ligniinin aromaattisten polymeerien monimutkainen verkosto hiilihydraattien kanssa tekee niistä erittäin vaikeasti käsiteltäviä, mikä johtaa epätäydelliseen sokerikonversioon, joka kerää 15-25% sukupuolioligosakkarideista, joita ei tuoteta esikäsitellyn biomassan entsymaattisen hydrolyysin aikana.Tämä on yleinen ongelma erilaisissa biomassan esikäsittelymenetelmissä.Joitakin syitä tähän pullonkaulan ovat entsyymien estyminen hydrolyysin aikana tai välttämättömien välttämättömien entsyymien puuttuminen tai alhainen taso, joita tarvitaan sokerisidosten katkaisemiseen kasvibiomassassa.Sokereiden koostumuksen ja rakenteellisten ominaisuuksien, kuten oligosakkaridien sokerisidosten, ymmärtäminen auttaa meitä parantamaan sokerikonversiota hydrolyysin aikana, jolloin biotekniset prosessit ovat kustannuskilpailukykyisiä öljyperäisten tuotteiden kanssa.
Hiilihydraattien rakenteen määrittäminen on haastavaa ja vaatii yhdistelmän menetelmiä, kuten nestekromatografia (LC)11,12, ydinmagneettinen resonanssispektroskopia (NMR)13, kapillaarielektroforeesi (CE)14,15,16 ja massaspektrometria (MS)17.,kahdeksantoista.MS-menetelmät, kuten lentoaikamassaspektrometria laserdesorptiolla ja ionisaatiolla matriisia käyttäen (MALDI-TOF-MS), ovat monipuolinen menetelmä hiilihydraattirakenteiden tunnistamiseen.Viime aikoina natriumioniadduktien törmäys-indusoitua dissosiaatiota (CID) on käytetty laajimmin tunnistamaan sormenjälkiä, jotka vastaavat oligosakkaridien kiinnittymiskohtia, anomeerikonfiguraatioita, sekvenssejä ja haarautumiskohtia 20, 21.
Glykaanianalyysi on erinomainen työkalu hiilihydraattisidosten syvälliseen tunnistamiseen22.Tämä menetelmä käyttää monoklonaalisia vasta-aineita (mAb:t), jotka on suunnattu kasvin soluseinän glykaaniin koettimina monimutkaisten hiilihydraattisidosten ymmärtämiseksi.Maailmanlaajuisesti on saatavilla yli 250 mAb:tä, jotka on suunniteltu erilaisia ​​lineaarisia ja haarautuneita oligosakkarideja vastaan ​​käyttämällä erilaisia ​​sakkarideja24.Useita monoklonaalisia vasta-aineita on käytetty laajasti kasvien soluseinän rakenteen, koostumuksen ja modifikaatioiden karakterisoimiseksi, koska niissä on merkittäviä eroja riippuen kasvisolutyypistä, elimestä, iästä, kehitysvaiheesta ja kasvuympäristöstä25,26.Viime aikoina tätä menetelmää on käytetty ymmärtämään vesikkelipopulaatioita kasvi- ja eläinjärjestelmissä ja niiden vastaavia rooleja glykaanin kuljetuksessa solunsisäisten markkerien, kehitysvaiheiden tai ympäristön ärsykkeiden määrittämiseksi ja entsymaattisen aktiivisuuden määrittämiseksi.Joitakin tunnistettuja glykaanien ja ksylaanien eri rakenteita ovat pektiini (P), ksylaani (X), mannaani (M), ksyloglukaanit (XylG), sekasidosglukaanit (MLG), arabinoksylaani (ArbX), galaktomannaani (GalG), glukuronihappo-arabinoksylaani (GArbX) ja arabinoksylaani (GArbX)9.
Kaikista näistä tutkimusyrityksistä huolimatta vain muutamat tutkimukset ovat keskittyneet oligosakkaridien kertymisen luonteeseen korkean kiintoainekuorman (HSL) hydrolyysin aikana, mukaan lukien oligosakkaridien vapautuminen, oligomeerisen ketjun pituuden muutokset hydrolyysin aikana, erilaiset matalan DP:n polymeerit ja niiden käyrät.jakaumat 30,31,32.Sillä välin, vaikka glykaanianalyysi on osoittautunut käyttökelpoiseksi työkaluksi glykaanin rakenteen kattavaan analyysiin, on vaikea arvioida vesiliukoisia alhaisen DP:n oligosakkarideja käyttämällä vasta-ainemenetelmiä.Pienemmät DP-oligosakkaridit, joiden molekyylipaino on alle 5-10 kDa, eivät sitoudu ELISA-levyihin 33, 34 ja ne pestään pois ennen vasta-aineen lisäämistä.
Tässä ensimmäistä kertaa esitämme ELISA-määrityksen avidiinilla päällystetyillä levyillä käyttämällä monoklonaalisia vasta-aineita, yhdistäen yksivaiheisen biotinylaatiomenettelyn liukoisille tulenkestäviä oligosakkarideja varten glykomianalyysiin.Lähestymistapamme glykoomianalyysiin validoitiin MALDI-TOF-MS- ja GC-MS-pohjaisella komplementaaristen oligosakkaridisidosten analyysillä käyttämällä hydrolysoitujen sokerikoostumusten trimetyylisilyyli- (TMS) -johdannaista.Tämä innovatiivinen lähestymistapa voidaan kehittää korkean suorituskyvyn menetelmäksi tulevaisuudessa ja löytää laajempaa käyttöä biolääketieteellisessä tutkimuksessa35.
Entsyymien ja vasta-aineiden translaation jälkeiset modifikaatiot, kuten glykosylaatio36, vaikuttavat niiden biologiseen aktiivisuuteen.Esimerkiksi seerumiproteiinien glykosylaation muutoksilla on tärkeä rooli tulehduksellisessa niveltulehduksessa, ja muutoksia glykosylaatiossa käytetään diagnostisina markkereina37.Erilaisten glykaanien on raportoitu esiintyvän kirjallisuudessa helposti erilaisissa sairauksissa, mukaan lukien krooniset maha-suolikanavan ja maksan tulehdussairaudet, virusinfektiot, munasarja-, rinta- ja eturauhassyövät38, 39, 40.Glykaanien rakenteen ymmärtäminen vasta-ainepohjaisilla glykaani-ELISA-menetelmillä antaa lisää luottamusta sairauksien diagnosointiin ilman monimutkaisten MS-menetelmien käyttöä.
Edellinen tutkimuksemme osoitti, että sitkeät oligosakkaridit säilyivät hydrolysoitumattomina esikäsittelyn ja entsymaattisen hydrolyysin jälkeen (kuva 1).Aiemmin julkaistussa työssämme kehitimme aktiivihiilen kiinteän faasin uuttomenetelmän oligosakkaridien eristämiseksi AFEX-esikäsitellystä maissihydrolysaatista (ACSH)8.Alkuuuton ja erotuksen jälkeen oligosakkaridit fraktioitiin edelleen kokoekskluusiokromatografialla (SEC) ja kerättiin molekyylipainon mukaan.Eri esikäsittelyistä vapautuneet sokerimonomeerit ja oligomeerit analysoitiin sokerikoostumusanalyysillä.Erilaisilla esikäsittelymenetelmillä saatujen sokerioligomeerien pitoisuutta verrattaessa sitkeiden oligosakkaridien esiintyminen on yleinen ongelma biomassan muuntamisessa monosakkarideiksi ja voi johtaa sokerisaannon alenemiseen vähintään 10-15 % ja jopa 18 %.MEILLE.Tätä menetelmää käytetään oligosakkaridifraktioiden laajamittaiseen tuotantoon.Tuloksena saatua ACH:ta ja sen myöhempiä eri molekyylipainoisia fraktioita käytettiin kokeellisena materiaalina oligosakkaridien karakterisoinnissa tässä työssä.
Esikäsittelyn ja entsymaattisen hydrolyysin jälkeen pysyvät oligosakkaridit säilyivät hydrolysoitumattomina.Tässä (A) on oligosakkaridien erotusmenetelmä, jossa oligosakkaridit eristetään AFEX-esikäsitellystä maissipylväshydrolysaatista (ACSH) käyttämällä aktiivihiilen ja piimaan täytettyä kerrosta;(B) Menetelmä oligosakkaridien erottamiseksi.Oligosakkaridit erotettiin edelleen kokoekskluusiokromatografialla (SEC);(C) Sakkaridimonomeerit ja oligomeerit, jotka vapautuvat erilaisista esikäsittelyistä (laimennettu happo: DA, ioninen neste: IL ja AFEX).Entsymaattiset hydrolyysin olosuhteet: korkea kiintoainekuormitus 25 % (w/w) (noin 8 % glukaanikuormitus), 96 tunnin hydrolyysi, 20 mg/g kaupallinen entsyymilataus (suhde Ctec2:Htec2:MP-2:1:1) ja (D) Sokerimonomeerit ja -oligomeerit, jotka vapautuvat korroosio-AC:n esiglukoosista ja araroosista. S).
Glykaanianalyysi on osoittautunut hyödylliseksi työkaluksi kiinteistä biomassajäännöksistä eristettyjen uutteiden glykaanien kattavaan rakenneanalyysiin.Vesiliukoiset sakkaridit ovat kuitenkin aliedustettuina tätä perinteistä menetelmää käytettäessä41, koska alhaisen molekyylipainon oligosakkarideja on vaikea immobilisoida ELISA-levyille ja ne pestään pois ennen vasta-aineen lisäämistä.Siksi vasta-aineen sitoutumista ja karakterisointia varten käytettiin yksivaiheista biotinylaatiomenetelmää liukoisten, ei-yhteensopivien oligosakkaridien päällystämiseksi avidiinilla päällystetyillä ELISA-levyillä.Tämä menetelmä testattiin käyttämällä aiemmin tuotettua ACSH:ta ja fraktiota, joka perustuu sen molekyylipainoon (tai polymerointiasteeseen, DP).Yksivaiheista biotinylaatiota käytettiin lisäämään oligosakkaridien sitoutumisaffiniteettia lisäämällä biotiini-LC-hydratsidia hiilihydraatin pelkistävään päähän (kuvio 2).Liuoksessa pelkistävässä päässä oleva puoliasetaaliryhmä reagoi biotiini-LC-hydratsidin hydratsidiryhmän kanssa muodostaen hydratsonisidoksen.Pelkistävän aineen NaCNBH3:n läsnä ollessa hydratsonisidos pelkistyy stabiiliksi biotinyloiduksi lopputuotteeksi.Sokeria pelkistävän pään modifioinnilla tuli mahdolliseksi alhaisen DP:n oligosakkaridien sitoutuminen ELISA-levyihin, ja tutkimuksessamme tämä tehtiin avidiinilla päällystetyillä levyillä käyttämällä glykaaniin kohdistettuja mAb:itä.
ELISA-menetelmään perustuva monoklonaalisten vasta-aineiden seulonta biotinyloitujen oligosakkaridien varalta.Tässä (A) yhdistetty oligosakkaridien biotinylaatio ja sitä seuraava ELISA-seulonta glykaaniin kohdistetuilla mAb:illä NeutrAvidin-päällystetyillä levyillä ja (B) näyttää yksivaiheisen menetelmän reaktiotuotteiden biotinyloimiseksi.
Avidiinilla päällystetyt levyt, joissa oli oligosakkaridikonjugoituja vasta-aineita, lisättiin sitten primäärisiin ja sekundäärisiin vasta-aineisiin ja pestiin valo- ja aikaherkässä väliaineessa.Kun vasta-aineen sitoutuminen on valmis, lisää TMB-substraattia levyn inkuboimiseksi.Lopulta reaktio pysäytettiin rikkihapolla.Inkuboidut levyt analysoitiin käyttämällä ELISA-lukijaa kunkin vasta-aineen sitoutumisvoimakkuuden määrittämiseksi vasta-ainespesifisen silloittumisen havaitsemiseksi.Katso kokeen yksityiskohdat ja parametrit vastaavasta osiosta "Materiaalit ja menetelmät".
Osoitamme tämän äskettäin kehitetyn menetelmän käyttökelpoisuuden spesifisiin sovelluksiin karakterisoimalla ACSH:ssa sekä lignoselluloosahydrolysaateista eristetyissä raaka- ja puhdistetuissa oligosakkaridifraktioissa olevia liukoisia oligosakkarideja.Kuten kuvasta 3 näkyy, yleisimmät epitooppisubstituoidut ksylaanit, jotka on tunnistettu ACSH:ssa käyttämällä bioasyloitua glykoomimääritysmenetelmiä, ovat yleensä uroni- (U) tai metyyliuroni- (MeU) ja pektiini-arabinogalaktaanit.Suurin osa niistä löydettiin myös aiemmassa tutkimuksessamme hydrolysoimattomien kiintoaineiden (UHS) glykaanien analyysistä43.
Vastahakoisten oligosakkaridien epitooppien havaitseminen käyttämällä monoklonaalista vasta-ainetta, joka on suunnattu soluseinän glykaaniin."Neutraali" fraktio on ACN-fraktio ja "hapan" fraktio on FA-fraktio.Lämpökartan kirkkaammat punaiset osoittavat korkeampaa epitooppipitoisuutta ja kirkkaammat siniset tyhjää taustaa.Asteikon väriarvot perustuvat formulaatioiden N=2 raaka-OD-arvoihin.Vasta-aineiden tunnistamat pääepitoopit on esitetty oikealla.
Yleisimmät sellulaasit ja hemisellulaasit eivät pystyneet pilkkomaan näitä ei-selluloosarakenteita testatussa kaupallisessa entsyymiseoksessa, joka sisältää yleisimmin käytetyt kaupalliset entsyymit.Siksi niiden hydrolyysiin tarvitaan uusia apuentsyymejä.Ilman tarvittavia ei-selluloosaa lisäentsyymejä nämä ei-selluloosasidokset estävät täydellisen konversion monosakkarideiksi, vaikka niiden perussokeripolymeerit hydrolysoidaan laajasti lyhyemmiksi fragmenteiksi ja liuotetaan käyttämällä kaupallisia entsyymiseoksia.
Signaalin jakautumisen ja sen sitoutumisvoimakkuuden lisätutkimus osoitti, että sitoutumisepitoopit olivat alhaisempia korkean DP:n sokerifraktioissa (A, B, C, DP jopa 20+) kuin alhaisen DP:n fraktioissa (D, E, F, DP) dimeereissä) (kuvio 1).Happamat fragmentit ovat yleisempiä ei-selluloosaepitoopeissa kuin neutraaleissa fragmenteissa.Nämä ilmiöt ovat yhdenmukaisia ​​edellisessä tutkimuksessamme havaitun mallin kanssa, jossa korkean DP:n ja happamat osat olivat vastustuskykyisempiä entsymaattiselle hydrolyysille.Siksi ei-selluloosa-glykaaniepitooppien ja U- ja MeU-substituutioiden läsnäolo voi suuresti edistää oligosakkaridien stabiilisuutta.On huomattava, että sitoutumis- ja detektiotehokkuus voi olla ongelmallista alhaisen DP:n oligosakkarideille, erityisesti jos epitooppi on dimeerinen tai trimeerinen oligosakkaridi.Tämä voidaan testata käyttämällä kaupallisia eripituisia oligosakkarideja, joista jokainen sisältää vain yhden epitoopin, joka sitoutuu tiettyyn mAb:hen.
Siten rakennespesifisten vasta-aineiden käyttö paljasti tietyntyyppisiä vastahakoisia sidoksia.Riippuen käytetyn vasta-aineen tyypistä, sopivasta ligaatiokuviosta ja sen tuottaman signaalin voimakkuudesta (useimmin ja vähiten esiintyvä), uusia entsyymejä voidaan tunnistaa ja lisätä puolikvantitatiivisesti entsyymien seokseen täydellisemmän glykonversion aikaansaamiseksi.Ottamalla esimerkkinä ACSH-oligosakkaridien analyysin, voimme luoda tietokannan glykaanisidoksista kullekin biomassamateriaalille.Tässä on huomioitava, että vasta-aineiden erilainen affiniteetti tulee ottaa huomioon, ja jos niiden affiniteettia ei tunneta, tämä aiheuttaa tiettyjä vaikeuksia vertailtaessa eri vasta-aineiden signaaleja.Lisäksi glykaanisidosten vertailu voi toimia parhaiten saman vasta-aineen näytteiden välillä.Nämä sitkeät sidokset voidaan sitten linkittää CAZyme-tietokantaan, josta voimme tunnistaa entsyymejä, valita ehdokasentsyymejä ja testata sidoksia rikkovia entsyymejä tai kehittää mikrobijärjestelmiä näiden entsyymien ilmentämiseksi käytettäväksi biojalostamoissa44.
Arvioidaksemme, kuinka immunologiset menetelmät täydentävät vaihtoehtoisia menetelmiä lignoselluloosahydrolysaateissa olevien pienimolekyylisten oligosakkaridien karakterisoimiseksi, suoritimme MALDI:n (Kuva 4, S1-S8) ja TMS-peräisten sakkaridien GC-MS:ään perustuvan analyysin samassa paneelissa (Kuva 5) oligosakkaridiosassa.MALDIa käytetään vertaamaan, vastaako oligosakkaridimolekyylien massajakauma suunniteltua rakennetta.KuvassaKuvassa 4 on esitetty neutraalien komponenttien ACN-A ja ACN-B MC.ACN-A-analyysi vahvisti joukon pentoosisokereita, jotka vaihtelivat DP 4-8:sta (kuva 4) DP 22:een (kuva S1), joiden painot vastaavat MeU-ksylaanioligosakkarideja.ACN-B-analyysi vahvisti pentoosi- ja glukoksylaanisarjan DP 8-15:llä.Täydentävässä materiaalissa, kuten kuviossa S3, FA-C-happamien osien massajakaumakartat osoittavat joukon (Me)U-substituoituja pentoosisokereita, joiden DP on 8-15 ja jotka ovat yhdenmukaisia ​​ELISA-pohjaisessa mAb-seulonnassa löydettyjen substituoitujen ksylaanien kanssa.Epitoopit ovat johdonmukaisia.
ACS:ssä läsnä olevien liukoisten ei-yhteensopivien oligosakkaridien MALDI-MS-spektri.Tässä (A) ACN-A:n pienen painoalueen fraktiot, jotka sisältävät metyloitua uronihappoa (DP 4-8) substituoituja glukuroksylaanioligosakkarideja ja (B) ACN-B-ksylaania ja metyloitua uronihappooligosakkarideja, jotka on substituoitu glukuroksylaanilla (DP 8-15).
Tulenkestävien oligosakkaridien glykaanitähteen koostumuksen analyysi.Tässä (A) eri oligosakkaridifraktioiden TMS-sakkaridikoostumus, joka on saatu käyttämällä GC-MS-analyysiä.(B) Oligosakkarideissa esiintyvien erilaisten TMS-peräisten sokereiden rakenteet.ACN – asetonitriilifraktio, joka sisältää neutraaleja oligosakkarideja ja FA – ferulihappofraktio, joka sisältää happamia oligosakkarideja.
Toinen mielenkiintoinen johtopäätös tehtiin oligosakkaridifraktion LC-MS-analyysistä, kuten on esitetty kuviossa S9 (menetelmät näkyvät elektronisessa lisämateriaalissa).Heksoosi- ja -OAc-ryhmien fragmentteja havaittiin toistuvasti ACN-B-fraktion ligaation aikana.Tämä havainto ei ainoastaan ​​vahvista glykoomi- ja MALDI-TOF-analyysissä havaittua fragmentaatiota, vaan tarjoaa myös uutta tietoa mahdollisista hiilihydraattijohdannaisista esikäsitellyssä lignoselluloosabiomassassa.
Analysoimme myös oligosakkaridifraktion sokerikoostumusta käyttämällä TMS-sokerijohdannaista.GC-MS:n avulla määritimme hermosokereiden (ei-johdannaisten) ja happamien sokereiden (GluA ja GalA) koostumuksen oligosakkaridifraktiossa (kuvio 5).Glukuronihappoa löytyy happamista komponenteista C ja D, kun taas galakturonihappoa löytyy happamista komponenteista A ja B, jotka molemmat ovat happamien sokereiden korkean DP:n komponentteja.Nämä tulokset eivät ainoastaan ​​vahvista ELISA- ja MALDI-tietomme, vaan ovat myös yhdenmukaisia ​​aiempien oligosakkaridien kertymistä koskevien tutkimustemme kanssa.Siksi uskomme, että nykyaikaiset immunologiset menetelmät, joissa käytetään oligosakkaridien biotinylaatiota ja sitä seuraavaa ELISA-seulontaa, ovat riittäviä havaitsemaan liukoisia, vastahakoisia oligosakkarideja erilaisista biologisista näytteistä.
Koska ELISA-pohjaiset mAb-seulontamenetelmät on validoitu useilla eri menetelmillä, halusimme tutkia tarkemmin tämän uuden kvantitatiivisen menetelmän mahdollisuuksia.Kaksi kaupallista oligosakkaridia, ksyloheksasakkaridioligosakkaridi (XHE) ja 23-a-L-arabinofuranosyyliksylotrioosi (A2XX), ostettiin ja testattiin käyttämällä uutta mAb-lähestymistapaa, joka kohdistui soluseinän glykaaniin.Kuvio 6 esittää lineaarista korrelaatiota biotinyloidun sitoutumissignaalin ja oligosakkaridikonsentraation log-konsentraation välillä, mikä viittaa mahdolliseen Langmuir-adsorptiomalliin.monoklonaalisista vasta-aineista CCRC-M137, CCRC-M138, CCRC-M147, CCRC-M148 ja CCRC-M151 korreloivat XHE:n kanssa ja CCRC-M108, CCRC-M109 ja LM11 korreloivat A2XX:n kanssa alueella 100 nanometriä.Johtuen vasta-aineiden rajallisesta saatavuudesta kokeen aikana, rajoitettuja kokeita suoritettiin kullakin oligosakkaridipitoisuudella.Tässä on huomattava, että jotkut vasta-aineet reagoivat hyvin eri tavalla samaan oligosakkaridiin substraattina, oletettavasti siksi, että ne sitoutuvat hieman erilaisiin epitooppeihin ja niillä voi olla hyvin erilaiset sitoutumisaffiniteetit.Tarkan epitooppitunnistuksen mekanismit ja vaikutukset ovat paljon monimutkaisempia, kun uutta mAb-lähestymistapaa sovelletaan todellisiin näytteisiin.
Kahta kaupallista oligosakkaridia käytettiin erilaisten glykaaniin kohdistettujen mAb:iden havaitsemisalueen määrittämiseen.Tässä lineaariset korrelaatiot oligosakkaridikonsentraation log-konsentraation kanssa osoittavat Langmuirin adsorptiokuvioita (A) XHE:lle mAb:n kanssa ja (B) A2XX:lle mAb:n kanssa.Vastaavat epitoopit osoittavat määrityksessä substraatteina käytettyjen kaupallisten oligosakkaridien rakenteet.
Glykaaniin kohdistettujen monoklonaalisten vasta-aineiden käyttö (glykokominen analyysi tai ELISA-pohjainen mAb-seulonta) on tehokas työkalu useimpien tärkeimpien soluseinän glykaanien syvälliseen karakterisointiin, jotka muodostavat kasvien biomassan.Klassinen glykaanianalyysi luonnehtii kuitenkin vain suurempia soluseinän glykaaneja, koska useimpia oligosakkarideja ei immobilisoidu tehokkaasti ELISA-levyille.Tässä tutkimuksessa AFEX-esikäsitelty maissikeitin hydrolysoitiin entsymaattisesti korkealla kiintoainepitoisuudella.Sokerianalyysiä käytettiin hylkivien soluseinämän hiilihydraattien koostumuksen määrittämiseen hydrolysaatissa.Kuitenkin pienempien oligosakkaridien mAb-analyysi hydrolysaateissa on aliarvioitu, ja tarvitaan lisätyökaluja oligosakkaridien immobilisoimiseksi tehokkaasti ELISA-levyille.
Raportoimme tässä uudesta ja tehokkaasta oligosakkaridien immobilisaatiomenetelmästä mAb-seulonnassa yhdistämällä oligosakkaridibiotinylaatio, jota seuraa ELISA-seulonta NeutrAvidin™-päällystetyillä levyillä.Immobilisoidut biotinyloidut oligosakkaridit osoittivat riittävää affiniteettia vasta-aineeseen mahdollistaakseen vastahakoisten oligosakkaridien nopean ja tehokkaan havaitsemisen.Näiden itsepäisten oligosakkaridien koostumuksen analyysi massaspektrometrian perusteella vahvisti tämän uuden lähestymistavan immuno-seulonnassa.Siten nämä tutkimukset osoittavat, että oligosakkaridien biotinylaation ja ELISA-seulonnan yhdistelmää glykaaniin kohdistettujen monoklonaalisten vasta-aineiden kanssa voidaan käyttää havaitsemaan ristisidoksia oligosakkarideissa ja sitä voidaan soveltaa laajasti muissa biokemiallisissa tutkimuksissa, jotka karakterisoivat oligosakkaridien rakennetta.
Tämä biotiiniin perustuva glykaanin profilointimenetelmä on ensimmäinen raportti, joka pystyy tutkimaan liukoisten oligosakkaridien vastahakoisia hiilihydraattisidoksia kasvien biomassassa.Tämä auttaa ymmärtämään, miksi jotkin biomassan osat ovat niin itsepäisiä biopolttoaineiden tuotannossa.Tämä menetelmä täyttää tärkeän aukon glykoomianalyysimenetelmissä ja laajentaa sen soveltamisen laajempaan valikoimaan substraatteja kuin kasvioligosakkarideja.Jatkossa saatamme käyttää robotiikkaa biotinylaatioon ja kehittämäämme menetelmää näytteiden korkean suorituskyvyn analysointiin ELISA:lla.
Pioneer 33A14 -hybridin siemenistä kasvatettu maissin olki (CS) korjattiin vuonna 2010 Kramer Farmsilta Rayssa, Coloradossa.Maanomistajan luvalla tätä biomassaa voidaan käyttää tutkimukseen. Näytteet säilytettiin kuivassa < 6 % kosteudessa vetoketjullisissa pusseissa huoneenlämmössä. Näytteet säilytettiin kuivassa < 6 % kosteudessa vetoketjullisissa pusseissa huoneenlämmössä. Образцы хранились сухими при влажности < 6% в пакетах с застежкой-молнией при комнатной температуре. Näytteitä säilytettiin kuivana <6 % kosteudessa vetoketjullisissa pusseissa huoneenlämpötilassa.样品在室温下以干燥< 6% 的水分储存在自封袋中.样品在室温下以干燥< 6 % Образцы хранят в пакетах с застежкой-молнией при комнатной температуре с влажностью < 6%. Näytteitä säilytetään vetoketjullisissa pusseissa huoneenlämmössä, jonka kosteus on < 6 %.Tutkimus oli paikallisten ja kansallisten ohjeiden mukainen.Koostumusanalyysi suoritettiin käyttämällä NREL-protokollaa.Koostumuksen havaittiin sisältävän 31,4 % glukaania, 18,7 % ksylaania, 3,3 % arabinaania, 1,2 % galaktaania, 2,2 % asetyyliä, 14,3 % ligniiniä, 1,7 % proteiinia ja 13,4 % tuhkaa.
Cellic® CTec2 (138 mg proteiinia/ml, erä VCNI 0001) on monimutkainen seos sellulaasia, β-glukosidaasia ja Cellic® HTec2:ta (157 mg proteiinia/ml, erä VHN00001) Novozymesilta (Franklinton, NC, USA)).Multifect Pectinase® (72 mg proteiinia/ml), monimutkainen sekoitus pektiiniä hajottavia entsyymejä, lahjoitti DuPont Industrial Biosciences (Palo Alto, CA, USA).Entsyymiproteiinipitoisuudet määritettiin arvioimalla proteiinipitoisuus (ja vähentämällä ei-proteiinitypen osuus) käyttämällä Kjeldahlin typpianalyysiä (AOAC-menetelmä 2001.11, Dairy One Cooperative Inc., Ithaca, NY, USA).Piimaa 545 ostettiin EMD Milliporelta (Billerica, MA).Aktiivihiili (DARCO, 100 meshin rakeet), Avicel (PH-101), pyökkiksylaani ja kaikki muut kemikaalit ostettiin Sigma-Aldrichilta (St. Louis, MO).
AFEX-esikäsittely suoritettiin GLBRC:ssä (Biomass Conversion Research Laboratory, MSU, Lansing, MI, USA).Esikäsittely suoritettiin 140 °C:ssa 15 minuutin ajan.46 viipymäaika vedettömän ammoniakin ja biomassan 1:1-suhteessa 60 %:n (w/w) latauksella ruostumattomasta teräksestä valmistetussa pöytälevypanosreaktorissa (Parr Instruments Company).Kesti 30 minuuttia.Reaktori saatettiin 140 °C:seen ja ammoniakki vapautui nopeasti, mikä mahdollisti biomassan palata nopeasti huoneenlämpötilaan.AFEX esikäsitellyn maissikeittimen (ACS) koostumus oli samanlainen kuin käsittelemättömän maissikeittimen (UT-CS).
Korkean kiintoaineen omaava ACSH 25 % (w/w) (noin 8 % dekstraanilataus) valmistettiin lähtöaineena oligosakkaridien laajamittaista tuotantoa varten.ACS:n entsymaattinen hydrolyysi suoritettiin käyttämällä kaupallista entsyymiseosta, joka sisälsi Cellic® Ctec2 10 mg proteiinia/g glukaania (esikäsitellyssä biomassassa), Htec2 (Novozymes, Franklinton, NC), 5 mg proteiinia/g glukaania ja Multifect Pectinase (Genencor Inc, USA).).), 5 mg proteiinia/g dekstraania.Entsymaattinen hydrolyysi suoritettiin 5 litran bioreaktorissa, jonka työtilavuus oli 3 litraa, pH 4,8, 50 °C ja 250 rpm.96 tunnin hydrolyysin jälkeen hydrolysaatti kerättiin sentrifugoimalla nopeudella 6 000 rpm 30 minuuttia ja sitten nopeudella 14 000 rpm 30 minuuttia hydrolysoimattomien kiintoaineiden poistamiseksi.Hydrolysaatti steriilisuodatettiin sitten 0,22 mm:n suodatindekantterilasin läpi.Suodatettua hydrolysaattia säilytettiin steriileissä pulloissa 4 °C:ssa ja fraktioitiin sitten hiilellä.
Uutepohjaisten biomassanäytteiden koostumuksen analysointi NREL-laboratorioanalyysimenetelmillä: näytteiden valmistelu koostumusanalyysiä varten (NREL/TP-510-42620) ja rakenteellisten hiilihydraattien ja ligniinin määritys biomassasta (NREL/TP-510 – 42618)47.
Hydrolysaattivirran oligosakkaridianalyysi suoritettiin 2 ml:n mittakaavassa käyttämällä autoklaavipohjaista happohydrolyysimenetelmää.Sekoita hydrolysaattinäyte 69,7 µl:aan 72-prosenttista rikkihappoa 10 ml:n kierrekorkisessa viljelyputkessa ja inkuboi 1 tunti työpöydällä 121 °C:ssa, jäähdytä jäillä ja suodata korkean erotuskyvyn nestekromatografiapulloon (HPLC).Oligosakkaridien pitoisuus määritettiin vähentämällä monosakkaridien pitoisuus hydrolysoimattomassa näytteessä happohydrolysoidun näytteen sokerin kokonaispitoisuudesta.
Glukoosi-, ksyloosi- ja arabinoosipitoisuudet happohydrolysoidussa biomassassa analysoitiin käyttämällä Shimadzu HPLC -järjestelmää, joka oli varustettu automaattisella näytteenottimella, kolonnin lämmittimellä, isokraattisella pumpulla ja taitekerroindetektorilla Bio-Rad Aminex HPX-87H -kolonnissa.Pylväs pidettiin 50 °C:ssa ja eluoitiin 0,6 ml/min 5 mM H2S04 vedessä.virtaus.
Hydrolysaattisupernatantti laimennettiin ja analysoitiin monomeeri- ja oligosakkaridipitoisuuden suhteen.Entsymaattisen hydrolyysin jälkeen saadut monomeeriset sokerit analysoitiin HPLC:llä, joka oli varustettu Bio-Rad (Hercules, CA) Aminex HPX-87P -kolonnilla ja tuhkasuojakolonnilla.Kolonnin lämpötila pidettiin 80 °C:ssa, vettä käytettiin liikkuvana faasina virtausnopeudella 0,6 ml/min.Oligosakkaridit määritettiin hydrolyysillä laimeassa hapossa 121 °C:ssa viitteissä kuvattujen menetelmien mukaisesti.41, 48, 49.
Sakkaridianalyysi suoritettiin raaka-, AFEX-esikäsitellyille ja kaikille hydrolysoimattomille biomassajäännöksille (mukaan lukien sarjasolujen seinämäuutteiden tuotanto ja niiden mAb-seulonta) käyttämällä aiemmin kuvattuja menetelmiä 27, 43, 50, 51.Glykoomianalyysiä varten kasvien soluseinämateriaalin alkoholiin liukenemattomat jäännökset valmistetaan biomassajäännöksistä ja niille suoritetaan sarjauutto yhä aggressiivisemmilla reagensseilla, kuten ammoniumoksalaatti (50 mM), natriumkarbonaatti (50 mM ja 0,5 % w/v), CON.(1 M ja 4 M, molemmissa 1 % w/v natriumboorihydridiä) ja happokloriitti, kuten aiemmin on kuvattu52,53.Uutteet altistettiin sitten ELISA:lle monimutkaista mAb50-paneelia vastaan, joka oli suunnattu soluseinän glykaaniin, ja mAb:n sitoutumisreaktiot esitettiin lämpökartana.Kasvin soluseinän glykaaniin kohdistuvat mAb:t ostettiin laboratoriovarastoista (CCRC-, JIM- ja MAC-sarjat).
Oligosakkaridien yksivaiheinen biotinylaatio.Hiilihydraattien konjugointi biotiini-LC-hydratsidin kanssa suoritettiin käyttämällä seuraavaa menettelyä.Biotiini-LC-hydratsidia (4,6 mg/12 μmol) liuotettiin dimetyylisulfoksidiin (DMSO, 70 μl) voimakkaasti sekoittaen ja kuumentamalla 65 °C:ssa 1 minuutin ajan.Lisättiin jääetikkaa (30 ui) ja seos kaadettiin natriumsyaaniboorihydridiin (6,4 mg/100 umol) ja liuotettiin täydellisesti 65 °C:ssa noin 1 minuutin kuumentamisen jälkeen.Sitten 5-8 μl reaktioseosta lisättiin kuivattuun oligosakkaridiin (1-100 nmol), jotta saatiin 10-kertainen tai suurempi molaarinen ylimäärä leimaa pelkistävän pään yli.Reaktio suoritettiin 65 °C:ssa 2 tuntia, minkä jälkeen näytteet puhdistettiin välittömästi.Natriumsyaaniboorihydridiä ei käytetty leimauskokeissa ilman pelkistystä, ja näytteiden annettiin reagoida 65 °C:ssa 2,5 tuntia.
Biotinyloitujen oligosakkaridien näytteiden ELISA-pinnoitus ja pesu.25 μl biotinyloituja näytteitä (100 μl jokaista konsentroitua näytettä laimennettuna 5 ml:aan 0,1 M Tris-puskuriliuosta (TBS)) lisättiin jokaiseen avidiinilla päällystetyn levyn kuoppaan.Kontrollikuopat päällystettiin 50 μl:lla biotiinia pitoisuudella 10 μg/ml 0,1 M TBS:ssä.Deionisoitua vettä käytettiin pinnoitteena nollamittauksissa.Tablettia inkuboitiin 2 tuntia huoneenlämpötilassa pimeässä.Pese levy 3 kertaa 0,1 % rasvattomalla maidolla 0,1 M TBS:ssä käyttäen ohjelmaa nro.11 Grenier-asunnolle 3A.
Primaaristen vasta-aineiden lisääminen ja pesu.Lisää 40 µl primääristä vasta-ainetta kuhunkin kuoppaan.Inkuboi mikrolevyä 1 tunti huoneenlämmössä pimeässä.Levyt pestiin sitten 3 kertaa 0,1-prosenttisella maidolla 0,1 M TBS:ssä käyttäen pesuohjelmaa nro 11 Grenier Flat 3A:lle.
Lisää sekundäärinen vasta-aine ja pese.Lisää 50 µl hiiri/rotta sekundaarista vasta-ainetta (laimennettu 1:5000 0,1 % maidossa 0,1 M TBS:ssä) jokaiseen kuoppaan.Inkuboi mikrolevyä 1 tunti huoneenlämmössä pimeässä.Mikrolevyt pestiin sitten 5 kertaa 0,1-prosenttisella maidolla 0,1 M TBS:ssä käyttäen Grenier Flat 5A -levynpesuohjelmaa #12.
Substraatin lisääminen.Lisää 50 µl 3,3',5,5'-tetrametyylibentsidiiniä (TMB) perussubstraattiin (lisäämällä 2 tippaa puskuria, 3 tippaa TMB:tä, 2 tippaa vetyperoksidia 15 ml:aan deionisoitua vettä).Valmistele TMB-substraatti.ja vorteksoi ennen käyttöä).Inkuboi mikrolevyä huoneenlämmössä 30 minuuttia.Pimeässä.
Suorita vaihe loppuun ja lue tabletti.Lisää 50 µl 1 N rikkihappoa jokaiseen kuoppaan ja kirjaa absorbanssi 450 - 655 nm ELISA-lukijalla.
Valmista näistä analyyteistä 1 mg/ml liuoksia deionisoituun veteen: arabinoosi, ramnoosi, fukoosi, ksyloosi, galakturonihappo (GalA), glukuronihappo (GlcA), mannoosi, glukoosi, galaktoosi, laktoosi, N-asetyylimannosamiini (manNAc), N-asetyyliglukosamiini.(glcNAc), N-asetyyligalaktosamiini (galNAc), inositoli (sisäinen standardi).Kaksi standardia valmistettiin lisäämällä taulukossa 1 esitettyjä 1 mg/ml sokeriliuoksia. Näytteet pakastetaan ja lyofilisoidaan -80 °C:ssa, kunnes kaikki vesi on poistettu (yleensä noin 12-18 tuntia).
Lisää 100–500 µg näytettä analyysivaa'an kierrekorkkiin.Kirjaa lisätty määrä.On parasta liuottaa näyte tiettyyn liuotinkonsentraatioon ja lisätä se putkeen nestemäisenä eränä.Käytä 20 µl 1 mg/ml inositolia sisäisenä standardina jokaiseen näyteputkeen.Näytteeseen lisätyn sisäisen standardin määrän on oltava sama kuin standardiputkeen lisätyn sisäisen standardin määrän.
Lisää 8 ml vedetöntä metanolia kierrekorkiseen injektiopulloon.Sitten 4 ml 3 N metanolista HCl-liuosta, suljetaan ja ravistetaan.Tämä prosessi ei käytä vettä.
Lisää 500 µl 1 M HCl-metanoliliuosta oligosakkaridinäytteisiin ja standardi-TMS-putkiin.Näytteitä inkuboitiin yön yli (168 tuntia) 80 °C:ssa lämpölohkossa.Kuivaa metanolyysituote huoneenlämpötilassa käyttämällä kuivaussarjaa.Lisää 200 µl MeOH:ta ja kuivaa uudelleen.Tämä prosessi toistetaan kahdesti.Lisää näytteeseen 200 µl metanolia, 100 µl pyridiiniä ja 100 µl etikkahappoanhydridiä ja sekoita hyvin.Näytteitä inkuboitiin huoneenlämmössä 30 minuuttia.ja kuivattiin.Lisää 200 µl metanolia ja kuivaa uudelleen.
Lisää 200 µl Tri-Siliä ja kuumenna suljettua putkea 20 minuuttia.80 °C, sitten jäähdytetään huoneenlämpötilaan.Käytä kuivaussarjaa näytteen kuivaamiseen edelleen noin 50 µl:n tilavuuteen.On tärkeää huomata, että emme antaneet näytteiden kuivua kokonaan.
Lisää 2 ml heksaania ja sekoita hyvin vorteksoimalla.Täytä Pasteur-pipettien (5-8 mm) kärjet lasivillapalalla asettamalla lasivilla halkaisijaltaan 5-3/4 tuuman pipetin päälle.Näytteitä sentrifugoitiin 3000 g:ssä 2 minuuttia.Mahdolliset liukenemattomat jäännökset saostetaan.Kuivaa näyte 100-150 µl:ksi.Noin 1 µl:n tilavuus injektoitiin GC-MS:ään 80 °C:n alkulämpötilassa ja 2,0 minuutin alkuajassa (taulukko 2).