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Nuevos métodos inmunológicos y de espectrometría de masas para el análisis complejo de oligosacáridos persistentes en rastrojo de maíz pretratado con AFEX.La biomasa lignocelulósica es una alternativa sostenible a los combustibles fósiles y se utiliza ampliamente para desarrollar biotecnologías para la producción de productos como alimentos, piensos, combustibles y productos químicos.La clave de estas tecnologías es el desarrollo de procesos rentables para convertir los carbohidratos complejos presentes en las paredes celulares de las plantas en azúcares simples como glucosa, xilosa y arabinosa.Debido a que la biomasa lignocelulósica es muy resistente, debe someterse a tratamientos termoquímicos (p. ej., exfoliación de fibra de amoníaco (AFEX), ácidos diluidos (DA), líquidos iónicos (IL)) y tratamientos biológicos (p. ej., hidrólisis enzimática y fermentación microbiana) en combinación para obtener el producto deseado..Sin embargo, cuando se utilizan enzimas fúngicas comerciales en el proceso de hidrólisis, solo el 75-85% de los azúcares solubles formados son monosacáridos, y el 15-25% restante son oligosacáridos intratables solubles, que no siempre están disponibles para los microorganismos.Anteriormente, hemos aislado y purificado con éxito oligosacáridos persistentes solubles mediante una combinación de cromatografía de exclusión por tamaño y separación de tierra de diatomeas y carbón, y también investigamos sus propiedades inhibidoras de enzimas.Hemos encontrado que los oligosacáridos que contienen sustituciones de ácido urónico metilado de mayor grado de polimerización (DP) son más difíciles de procesar con mezclas de enzimas comerciales que los oligosacáridos neutrales y de bajo DP.Aquí informamos el uso de varios métodos adicionales, incluido el perfilado de glicanos usando anticuerpos monoclonales (mAb) específicos de glicanos de biomasa vegetal para caracterizar los enlaces de glicanos en las paredes celulares de las plantas y los hidrolizados enzimáticos, ionización por desorción láser asistida por matriz, espectrometría de masas de tiempo de vuelo..MALDI-TOF-MS) utiliza picos de diagnóstico informativos de la estructura obtenidos por espectroscopia después de la descomposición secundaria de iones negativos, cromatografía de gases y espectrometría de masas (GC-MS) para caracterizar enlaces de oligosacáridos con y sin derivatización.Debido al pequeño tamaño de los oligosacáridos (DP 4-20), estas moléculas son difíciles de usar para la caracterización y la unión de mAb.Para superar este problema, aplicamos un nuevo método de inmovilización de oligosacáridos basado en la conjugación de biotina que marcó con éxito la mayoría de los oligosacáridos solubles de bajo DP en la superficie de la microplaca, que luego se utilizó en un sistema mAb de alto rendimiento para el análisis de ligadura específico.Este nuevo método facilitará el desarrollo de ensayos de glicoma de alto rendimiento más avanzados en el futuro que se pueden usar para aislar y caracterizar oligosacáridos presentes en biomarcadores con fines de diagnóstico.
La biomasa lignocelulósica, compuesta de materiales agrícolas, forestales, herbáceos y leñosos, es una materia prima potencial para la producción de bioproductos, incluidos alimentos, piensos, combustibles y precursores químicos para producir productos de mayor valor1.Los carbohidratos (como la celulosa y la hemicelulosa) presentes en las paredes celulares de las plantas se despolimerizan en monosacáridos mediante procesamiento químico y biotransformación (como la hidrólisis enzimática y la fermentación microbiana).Los pretratamientos comunes incluyen expansión de fibra de amoníaco (AFEX), ácido diluido (DA), líquido iónico (IL) y explosión de vapor (SE), que utilizan una combinación de productos químicos y calor para reducir la producción de lignocelulosa al abrir las paredes celulares de las plantas3,4.terquedad de la materia, 5. La hidrólisis enzimática se lleva a cabo con una alta carga de sólidos usando enzimas comerciales que contienen carbohidratos activos (CAZymes) y fermentación microbiana usando levaduras o bacterias transgénicas para producir biocombustibles y productos químicos 6 .
Las CAZimas de las enzimas comerciales están compuestas por una mezcla compleja de enzimas que escinden sinérgicamente enlaces complejos de carbohidratos y azúcares para formar monosacáridos2,7.Como informamos anteriormente, la compleja red de polímeros aromáticos de la lignina con los carbohidratos los hace altamente intratables, lo que conduce a una conversión incompleta del azúcar, acumulando entre el 15 y el 25 % de los oligosacáridos sexuales que no se producen durante la hidrólisis enzimática de la biomasa pretratada.Este es un problema común con varios métodos de pretratamiento de biomasa.Algunas razones de este cuello de botella incluyen la inhibición de enzimas durante la hidrólisis, o la ausencia o bajos niveles de enzimas esenciales esenciales que se requieren para romper los enlaces de azúcar en la biomasa vegetal.Comprender la composición y las características estructurales de los azúcares, como los enlaces de azúcar en los oligosacáridos, nos ayudará a mejorar la conversión de azúcar durante la hidrólisis, lo que hará que los procesos biotecnológicos sean competitivos en costos con los productos derivados del petróleo.
Determinar la estructura de los carbohidratos es un desafío y requiere una combinación de métodos como la cromatografía líquida (LC)11,12, la espectroscopia de resonancia magnética nuclear (NMR)13, la electroforesis capilar (CE)14,15,16 y la espectrometría de masas (MS)17.,dieciocho.Los métodos de MS como la espectrometría de masas de tiempo de vuelo con desorción láser e ionización usando una matriz (MALDI-TOF-MS) son un método versátil para identificar estructuras de carbohidratos.Recientemente, la MS en tándem de disociación inducida por colisión (CID) de aductos de iones de sodio se ha utilizado más ampliamente para identificar huellas dactilares correspondientes a posiciones de unión de oligosacáridos, configuraciones anoméricas, secuencias y posiciones de ramificación 20, 21 .
El análisis de glicanos es una excelente herramienta para la identificación profunda de enlaces de carbohidratos22.Este método utiliza anticuerpos monoclonales (mAb) dirigidos al glicano de la pared celular vegetal como sondas para comprender los enlaces de carbohidratos complejos.Más de 250 mAbs están disponibles en todo el mundo, diseñados contra varios oligosacáridos lineales y ramificados utilizando varios sacáridos24.Varios mAb han sido ampliamente utilizados para caracterizar la estructura, composición y modificaciones de la pared celular vegetal, ya que existen diferencias significativas según el tipo de célula vegetal, el órgano, la edad, la etapa de desarrollo y el entorno de crecimiento25,26.Más recientemente, este método se ha utilizado para comprender las poblaciones de vesículas en los sistemas de plantas y animales y sus funciones respectivas en el transporte de glicanos según lo determinado por marcadores subcelulares, etapas de desarrollo o estímulos ambientales, y para determinar la actividad enzimática.Algunas de las diferentes estructuras de glicanos y xilanos que se han identificado incluyen pectina (P), xilano (X), manano (M), xiloglucanos (XylG), glucanos de enlaces mixtos (MLG), arabinoxilano (ArbX), galactomanano (GalG), ácido glucurónico-arabinoxilano (GArbX) y arabino-galactano (ArbG)29.
Sin embargo, a pesar de todos estos esfuerzos de investigación, solo unos pocos estudios se han centrado en la naturaleza de la acumulación de oligosacáridos durante la hidrólisis con alta carga de sólidos (HSL), incluida la liberación de oligosacáridos, los cambios en la longitud de la cadena oligomérica durante la hidrólisis, varios polímeros de bajo DP y sus curvas.distribuciones 30,31,32.Mientras tanto, aunque el análisis de glicanos ha demostrado ser una herramienta útil para un análisis integral de la estructura de los glicanos, es difícil evaluar los oligosacáridos solubles en agua de bajo DP utilizando métodos de anticuerpos.Los oligosacáridos DP más pequeños con un peso molecular inferior a 5-10 kDa no se unen a las placas ELISA 33, 34 y se eliminan por lavado antes de la adición del anticuerpo.
Aquí, por primera vez, demostramos un ensayo ELISA en placas recubiertas de avidina usando anticuerpos monoclonales, combinando un procedimiento de biotinilación de un solo paso para oligosacáridos refractarios solubles con análisis de glucoma.Nuestro enfoque para el análisis de glucoma fue validado por el análisis basado en MALDI-TOF-MS y GC-MS de enlaces de oligosacáridos complementarios utilizando la derivatización de trimetilsililo (TMS) de composiciones de azúcar hidrolizadas.Este enfoque innovador puede desarrollarse como un método de alto rendimiento en el futuro y encontrar una aplicación más amplia en la investigación biomédica35.
Las modificaciones postraduccionales de enzimas y anticuerpos, como la glicosilación,36 afectan su actividad biológica.Por ejemplo, los cambios en la glicosilación de las proteínas séricas juegan un papel importante en la artritis inflamatoria y los cambios en la glicosilación se utilizan como marcadores de diagnóstico37.Se ha informado en la literatura que varios glucanos aparecen fácilmente en una variedad de enfermedades, incluidas enfermedades inflamatorias crónicas del tracto gastrointestinal y el hígado, infecciones virales, cáncer de ovario, mama y próstata38,39,40.La comprensión de la estructura de los glucanos utilizando métodos ELISA de glucanos basados ​​en anticuerpos proporcionará una confianza adicional en el diagnóstico de enfermedades sin el uso de métodos complejos de EM.
Nuestro estudio anterior mostró que los oligosacáridos obstinados permanecieron sin hidrolizar después del pretratamiento y la hidrólisis enzimática (Figura 1).En nuestro trabajo publicado anteriormente, desarrollamos un método de extracción en fase sólida con carbón activado para aislar oligosacáridos del hidrolizado de rastrojo de maíz (ACSH)8 pretratado con AFEX.Después de la extracción y separación iniciales, los oligosacáridos se fraccionaron adicionalmente mediante cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) y se recolectaron en orden de peso molecular.Los monómeros y oligómeros de azúcar liberados de varios pretratamientos se analizaron mediante análisis de composición de azúcar.Al comparar el contenido de oligómeros de azúcar obtenidos por varios métodos de pretratamiento, la presencia de oligosacáridos persistentes es un problema común en la conversión de biomasa a monosacáridos y puede conducir a una reducción en el rendimiento de azúcar de al menos 10-15 % e incluso hasta 18 %.A NOSOTROS.Este método se utiliza para la producción a gran escala de fracciones de oligosacáridos.El ACH resultante y sus fracciones posteriores con diferentes pesos moleculares se utilizaron como material experimental para la caracterización de los oligosacáridos en este trabajo.
Después del pretratamiento y la hidrólisis enzimática, los oligosacáridos persistentes permanecieron sin hidrolizar.Aquí (A) es un método de separación de oligosacáridos en el que los oligosacáridos se aíslan del hidrolizado de rastrojo de maíz (ACSH) pretratado con AFEX utilizando un lecho compacto de carbón activado y tierra de diatomeas;(B) Método para la separación de oligosacáridos.Los oligosacáridos se separaron adicionalmente mediante cromatografía de exclusión por tamaño (SEC);(C) Monómeros y oligómeros sacáridos liberados de varios pretratamientos (ácido diluido: DA, líquido iónico: IL y AFEX).Condiciones de hidrólisis enzimática: alta carga de sólidos del 25 % (p/p) (aproximadamente 8 % de carga de glucano), 96 horas de hidrólisis, 20 mg/g de carga de enzima comercial (relación Ctec2:Htec2:MP-2:1:1) y (D) Monómeros de azúcar y oligómeros de glucosa, xilosa y arabinosa liberados del rastrojo de maíz (ACS) pretratado con AFEX.
El análisis de glicanos ha demostrado ser una herramienta útil para un análisis estructural integral de glicanos en extractos aislados de residuos sólidos de biomasa.Sin embargo, los sacáridos solubles en agua están subrepresentados con este método tradicional41 porque los oligosacáridos de bajo peso molecular son difíciles de inmovilizar en las placas ELISA y se eliminan por lavado antes de la adición del anticuerpo.Por lo tanto, para la unión y caracterización de anticuerpos, se utilizó un método de biotinilación de un solo paso para recubrir oligosacáridos solubles no compatibles en placas ELISA recubiertas con avidina.Este método se probó utilizando nuestro ACSH producido anteriormente y una fracción basada en su peso molecular (o grado de polimerización, DP).Se usó la biotinilación en un solo paso para aumentar la afinidad de unión de los oligosacáridos mediante la adición de biotina-LC-hidrazida al extremo reductor del carbohidrato (Fig. 2).En solución, el grupo hemiacetal en el extremo reductor reacciona con el grupo hidrazida de biotina-LC-hidrazida para formar un enlace hidrazona.En presencia del agente reductor NaCNBH3, el enlace de hidrazona se reduce a un producto final biotinilado estable.Con la modificación del extremo reductor de azúcar, se hizo posible la unión de oligosacáridos de bajo DP a las placas ELISA, y en nuestro estudio esto se realizó en placas recubiertas de avidina usando mAbs dirigidos a glicanos.
Cribado de anticuerpos monoclonales basado en ELISA para oligosacáridos biotinilados.Aquí (A) se combina la biotinilación de oligosacáridos y el examen ELISA posterior con mAbs dirigidos a glicanos en placas recubiertas con NeutrAvidin y (B) se muestra un procedimiento de un solo paso para la biotinilación de los productos de reacción.
A continuación, se añadieron placas recubiertas de avidina con anticuerpos conjugados con oligosacáridos a los anticuerpos primarios y secundarios y se lavaron en un medio sensible a la luz y al tiempo.Una vez completada la unión del anticuerpo, agregue sustrato TMB para incubar la placa.La reacción se detuvo finalmente con ácido sulfúrico.Las placas incubadas se analizaron usando un lector de ELISA para determinar la fuerza de unión de cada anticuerpo para detectar el entrecruzamiento específico del anticuerpo.Para detalles y parámetros del experimento, ver la sección correspondiente “Materiales y Métodos”.
Demostramos la utilidad de este método recientemente desarrollado para aplicaciones específicas al caracterizar los oligosacáridos solubles presentes en ACSH, así como en fracciones de oligosacáridos crudos y purificados aislados de hidrolizados lignocelulósicos.Como se muestra en la Figura 3, los xilanos sustituidos con epítopo más comunes identificados en ACSH mediante métodos de ensayo de glicoma bioacilado suelen ser arabinogalactanos urónicos (U) o metilurónicos (MeU) y pécticos.La mayoría de ellos también se encontraron en nuestro estudio previo sobre el análisis de glicanos de sólidos no hidrolizados (UHS)43.
Detección de epítopos de oligosacáridos recalcitrantes usando un anticuerpo monoclonal dirigido al glicano de la pared celular.La fracción "neutra" es la fracción ACN y la fracción "ácida" es la fracción FA.Los rojos más brillantes en el mapa de calor indican un mayor contenido de epítopos y los azules más brillantes indican un fondo en blanco.Los valores de color en la escala se basan en valores de OD sin procesar para formulaciones N=2.Los principales epítopos reconocidos por los anticuerpos se muestran a la derecha.
Estas estructuras que no son de celulosa no pudieron ser escindidas por las celulasas y hemicelulasas más comunes en la mezcla de enzimas comerciales probada, que incluye las enzimas comerciales más comúnmente utilizadas.Por lo tanto, se requieren nuevas enzimas auxiliares para su hidrólisis.Sin las enzimas accesorias necesarias que no son de celulosa, estos enlaces que no son de celulosa evitan la conversión completa en monosacáridos, incluso si sus polímeros de azúcar originales se hidrolizan extensamente en fragmentos más cortos y se disuelven usando mezclas de enzimas comerciales.
Un estudio adicional de la distribución de la señal y su fuerza de unión mostró que los epítopos de unión eran más bajos en las fracciones de azúcar con alto DP (A, B, C, DP hasta 20+) que en las fracciones de bajo DP (D, E, F, DP) en dímeros) (Fig. 1).Los fragmentos ácidos son más comunes en los epítopos no celulósicos que los fragmentos neutros.Estos fenómenos son consistentes con el patrón observado en nuestro estudio anterior, donde los restos ácidos y de alto DP eran más resistentes a la hidrólisis enzimática.Por lo tanto, la presencia de epítopos de glucano que no son de celulosa y sustituciones de U y MeU pueden contribuir en gran medida a la estabilidad de los oligosacáridos.Cabe señalar que la eficiencia de unión y detección puede ser problemática para los oligosacáridos de bajo DP, especialmente si el epítopo es un oligosacárido dimérico o trimérico.Esto se puede probar utilizando oligosacáridos comerciales de diferentes longitudes, cada uno con un solo epítopo que se une a un mAb específico.
Por lo tanto, el uso de anticuerpos específicos de estructura reveló ciertos tipos de enlaces recalcitrantes.Según el tipo de anticuerpo utilizado, el patrón de ligamiento apropiado y la fuerza de la señal que produce (más y menos abundante), se pueden identificar nuevas enzimas y agregarlas semicuantitativamente a la mezcla de enzimas para una glicoconversión más completa.Tomando el análisis de los oligosacáridos ACSH como ejemplo, podemos crear una base de datos de enlaces de glucano para cada material de biomasa.Cabe señalar aquí que se debe tener en cuenta la diferente afinidad de los anticuerpos, y si se desconoce su afinidad, esto creará ciertas dificultades al comparar las señales de diferentes anticuerpos.Además, la comparación de los enlaces de glucano puede funcionar mejor entre muestras para el mismo anticuerpo.Estos enlaces obstinados se pueden vincular a la base de datos CAZyme, desde la cual podemos identificar enzimas, seleccionar enzimas candidatas y probar enzimas que rompen enlaces, o desarrollar sistemas microbianos para expresar estas enzimas para su uso en biorrefinerías44.
Para evaluar cómo los métodos inmunológicos complementan los métodos alternativos para caracterizar oligosacáridos de bajo peso molecular presentes en hidrolizados lignocelulósicos, realizamos MALDI (Fig. 4, S1-S8) y análisis de sacáridos derivados de TMS basados ​​en GC-MS en el mismo panel (Fig. 5) parte de oligosacáridos.MALDI se utiliza para comparar si la distribución de masa de las moléculas de oligosacáridos coincide con la estructura deseada.En la fig.4 muestra el CM de los componentes neutros ACN-A y ACN-B.El análisis de ACN-A confirmó una variedad de azúcares de pentosa que van desde DP 4–8 (Fig. 4) hasta DP 22 (Fig. S1), cuyos pesos corresponden a los oligosacáridos MeU-xylan.El análisis de ACN-B confirmó la serie de pentosa y glucoxilano con DP 8-15.En material complementario, como la Figura S3, los mapas de distribución de masas de fracciones ácidas FA-C muestran un rango de azúcares de pentosa sustituidos con (Me)U con un DP de 8-15 que son consistentes con los xilanos sustituidos que se encuentran en la detección de mAb basada en ELISA.Los epítopos son consistentes.
Espectro MALDI-MS de oligosacáridos no conformes solubles presentes en ACS.Aquí, (A) fracciones de rango de bajo peso de ACN-A que contienen oligosacáridos de glucuroxilano sustituidos con ácido urónico metilado (DP 4-8) y (B) xilano ACN-B y oligosacáridos de ácido urónico metilado sustituidos con glucuroxilano (DP 8-15).
Análisis de la composición del residuo de glicano de oligosacáridos refractarios.Aquí (A) Composición de sacáridos TMS de varias fracciones de oligosacáridos obtenidas mediante análisis GC-MS.(B) Estructuras de varios azúcares derivados de TMS presentes en oligosacáridos.ACN: fracción de acetonitrilo que contiene oligosacáridos neutros y FA: fracción de ácido ferúlico que contiene oligosacáridos ácidos.
Se extrajo otra conclusión interesante del análisis LC-MS de la fracción de oligosacáridos, como se muestra en la Figura S9 (los métodos se pueden ver en el material complementario electrónico).Fragmentos de grupos hexosa y -OAc se observaron repetidamente durante la ligadura de la fracción ACN-B.Este hallazgo no solo confirma la fragmentación observada en el análisis de glucoma y MALDI-TOF, sino que también proporciona nueva información sobre posibles derivados de carbohidratos en la biomasa lignocelulósica pretratada.
También analizamos la composición de azúcar de la fracción de oligosacáridos utilizando la derivatización de azúcar TMS.Usando GC-MS, determinamos la composición de azúcares neurales (no derivados) y ácidos (GluA y GalA) en la fracción de oligosacáridos (Fig. 5).El ácido glucurónico se encuentra en los componentes ácidos C y D, mientras que el ácido galacturónico se encuentra en los componentes ácidos A y B, los cuales son componentes de alto DP de azúcares ácidos.Estos resultados no solo confirman nuestros datos de ELISA y MALDI, sino que también son consistentes con nuestros estudios previos de acumulación de oligosacáridos.Por lo tanto, creemos que los métodos inmunológicos modernos que utilizan la biotinilación de oligosacáridos y la posterior detección ELISA son suficientes para detectar oligosacáridos recalcitrantes solubles en diversas muestras biológicas.
Dado que los métodos de detección de mAb basados ​​en ELISA han sido validados por varios métodos diferentes, queríamos explorar más a fondo el potencial de este nuevo método cuantitativo.Se compraron dos oligosacáridos comerciales, el oligosacárido xilohexasacárido (XHE) y la 23-α-L-arabinofuranosil-xilotriosa (A2XX), y se probaron utilizando un nuevo enfoque de mAb dirigido al glicano de la pared celular.La figura 6 muestra una correlación lineal entre la señal de unión biotinilada y la concentración logarítmica de la concentración de oligosacáridos, lo que sugiere un posible modelo de adsorción de Langmuir.Entre los mAbs, CCRC-M137, CCRC-M138, CCRC-M147, CCRC-M148 y CCRC-M151 se correlacionaron con XHE, y CCRC-M108, CCRC-M109 y LM11 se correlacionaron con A2XX en un rango de 1 nm a 100 nano.Debido a la disponibilidad limitada de anticuerpos durante el experimento, se realizaron experimentos limitados con cada concentración de oligosacárido.Cabe señalar aquí que algunos anticuerpos reaccionan de manera muy diferente al mismo oligosacárido como sustrato, presumiblemente porque se unen a epítopos ligeramente diferentes y pueden tener afinidades de unión muy diferentes.Los mecanismos y las implicaciones de la identificación precisa de epítopos serán mucho más complejos cuando el nuevo enfoque de mAb se aplique a muestras reales.
Se usaron dos oligosacáridos comerciales para determinar el rango de detección de varios mAb dirigidos a glicanos.Aquí, las correlaciones lineales con la concentración logarítmica de la concentración de oligosacáridos indican los patrones de adsorción de Langmuir para (A) XHE con mAb y (B) A2XX con mAb.Los epítopos correspondientes indican las estructuras de los oligosacáridos comerciales utilizados como sustratos en el ensayo.
El uso de anticuerpos monoclonales dirigidos contra glicanos (análisis glucocomómico o cribado de mAb basado en ELISA) es una herramienta poderosa para la caracterización en profundidad de la mayoría de los glicanos principales de la pared celular que componen la biomasa vegetal.Sin embargo, el análisis clásico de glicanos solo caracteriza los glicanos de pared celular más grandes, ya que la mayoría de los oligosacáridos no se inmovilizan de manera eficiente en las placas ELISA.En este estudio, el rastrojo de maíz pretratado con AFEX se hidrolizó enzimáticamente a un alto contenido de sólidos.Se usó el análisis de azúcar para determinar la composición de carbohidratos recalcitrantes de la pared celular en el hidrolizado.Sin embargo, el análisis de mAb de oligosacáridos más pequeños en hidrolizados está subestimado y se necesitan herramientas adicionales para inmovilizar de manera efectiva los oligosacáridos en las placas ELISA.
Presentamos aquí un método de inmovilización de oligosacáridos novedoso y eficiente para la detección de mAb mediante la combinación de biotinilación de oligosacáridos seguida de detección ELISA en placas recubiertas con NeutrAvidin™.Los oligosacáridos biotinilados inmovilizados mostraron suficiente afinidad por el anticuerpo para permitir una detección rápida y eficiente de oligosacáridos recalcitrantes.El análisis de la composición de estos oligosacáridos obstinados basado en espectrometría de masas confirmó los resultados de este nuevo enfoque de inmunodetección.Por lo tanto, estos estudios demuestran que la combinación de biotinilación de oligosacáridos y cribado ELISA con anticuerpos monoclonales dirigidos contra glicanos puede usarse para detectar entrecruzamientos en oligosacáridos y puede aplicarse ampliamente en otros estudios bioquímicos que caracterizan la estructura de los oligosacáridos.
Este método de perfilado de glicanos basado en biotina es el primer informe capaz de investigar los enlaces de carbohidratos recalcitrantes de los oligosacáridos solubles en la biomasa vegetal.Esto ayuda a comprender por qué algunas partes de la biomasa son tan obstinadas cuando se trata de la producción de biocombustibles.Este método llena un vacío importante en los métodos de análisis de glicomas y extiende su aplicación a una gama más amplia de sustratos más allá de los oligosacáridos vegetales.En el futuro, podemos utilizar la robótica para la biotinilación y utilizar el método que hemos desarrollado para el análisis de alto rendimiento de muestras mediante ELISA.
La paja de maíz (CS) cultivada a partir de semillas híbridas Pioneer 33A14 se cosechó en 2010 en Kramer Farms en Ray, Colorado.Con el permiso del propietario de la tierra, esta biomasa se puede utilizar para la investigación. Las muestras se almacenaron secas <6% de humedad en bolsas con cierre hermético a temperatura ambiente. Las muestras se almacenaron secas <6% de humedad en bolsas con cierre hermético a temperatura ambiente. Образцы хранились сухими при влажности < 6% в пакетах с застежкой-молнией при комнатной темпера tur. Las muestras se almacenaron secas a <6% de humedad en bolsas con cremallera a temperatura ambiente.样品在室温下以干燥< 6% 的水分储存在自封袋中。样品在室温下以干燥< 6% Образцы хранят в пакетах с застежкой-молнией при комнатной температуре с влажностью < 6%. Las muestras se almacenan en bolsas con cremallera a temperatura ambiente con una humedad < 6%.El estudio cumplió con las directrices locales y nacionales.El análisis composicional se realizó utilizando el protocolo NREL.Se encontró que la composición contenía 31,4 % de glucano, 18,7 % de xilano, 3,3 % de arabino, 1,2 % de galactano, 2,2 % de acetilo, 14,3 % de lignina, 1,7 % de proteína y 13,4 % de ceniza.
Cellic® CTec2 (138 mg proteína/ml, lote VCNI 0001) es una mezcla compleja de celulasa, β-glucosidasa y Cellic® HTec2 (157 mg proteína/ml, lote VHN00001) de Novozymes (Franklinton, NC, EE. UU.)).DuPont Industrial Biosciences (Palo Alto, CA, EE. UU.) donó Multifect Pectinasa® (72 mg de proteína/mL), una mezcla compleja de enzimas que degradan la pectina.Las concentraciones de proteína enzimática se determinaron estimando el contenido de proteína (y restando la contribución de nitrógeno no proteico) utilizando el análisis de nitrógeno Kjeldahl (método AOAC 2001.11, Dairy One Cooperative Inc., Ithaca, NY, EE. UU.).La tierra de diatomeas 545 se adquirió de EMD Millipore (Billerica, MA).El carbón activado (DARCO, gránulos de malla 100), Avicel (PH-101), xilano de haya y todos los demás productos químicos se adquirieron de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).
El pretratamiento AFEX se realizó en GLBRC (Laboratorio de Investigación de Conversión de Biomasa, MSU, Lansing, MI, EE. UU.).El pretratamiento se llevó a cabo a 140 ºC durante 15 minutos.46 tiempo de residencia a una relación 1:1 de amoníaco anhidro a biomasa con una carga del 60% (p/p) en un reactor por lotes de sobremesa de acero inoxidable (Parr Instruments Company).Tomó 30 minutos.El reactor se llevó a 140°C y el amoníaco se liberó rápidamente, lo que permitió que la biomasa volviera rápidamente a la temperatura ambiente.La composición del rastrojo de maíz pretratado (ACS) de AFEX fue similar a la del rastrojo de maíz sin tratar (UT-CS).
Se preparó ACSH con alto contenido de sólidos al 25 % (p/p) (aproximadamente 8 % de carga de dextrano) como material de partida para la producción a gran escala de oligosacáridos.La hidrólisis enzimática de ACS se realizó utilizando una mezcla de enzimas comercial que incluía Cellic® Ctec2 10 mg de proteína/g de glucano (en biomasa pretratada), Htec2 (Novozymes, Franklinton, NC), 5 mg de proteína/g de glucano y Multifect Pectinasa (Genencor Inc, EE. UU.).).), 5 mg de proteína/g de dextrano.La hidrólisis enzimática se llevó a cabo en un biorreactor de 5 litros con un volumen de trabajo de 3 litros, pH 4,8, 50°C y 250 rpm.Después de la hidrólisis durante 96 horas, el hidrolizado se recogió por centrifugación a 6000 rpm durante 30 minutos y luego a 14000 rpm durante 30 minutos para eliminar los sólidos no hidrolizados.A continuación, el hidrolizado se sometió a filtración estéril a través de un vaso de precipitados con filtro de 0,22 mm.El hidrolizado filtrado se almacenó en botellas estériles a 4ºC y luego se fraccionó sobre carbón.
Análisis de la composición de muestras de biomasa a base de extractos según procedimientos de análisis de laboratorio NREL: preparación de muestras para análisis de composición (NREL/TP-510-42620) y determinación de carbohidratos estructurales y lignina en biomasa (NREL/TP-510 – 42618)47.
El análisis de oligosacáridos de la corriente de hidrolizado se realizó en una escala de 2 ml utilizando un método de hidrólisis ácida basado en autoclave.Mezcle la muestra de hidrolizado con 69,7 µl de ácido sulfúrico al 72 % en un tubo de cultivo con tapón de rosca de 10 ml e incube durante 1 h en una mesa de trabajo a 121 °C, enfríe en hielo y filtre en un vial de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC).La concentración de oligosacáridos se determinó restando la concentración de monosacáridos en la muestra no hidrolizada de la concentración de azúcar total en la muestra hidrolizada con ácido.
Las concentraciones de glucosa, xilosa y arabinosa en la biomasa hidrolizada con ácido se analizaron utilizando un sistema HPLC Shimadzu equipado con un muestreador automático, un calentador de columna, una bomba isocrática y un detector de índice de refracción en una columna Bio-Rad Aminex HPX-87H.La columna se mantuvo a 50°C y se eluyó con 0,6 ml/min de H2SO4 5 mM en agua.fluir.
El sobrenadante de hidrolizado se diluyó y se analizó el contenido de monómeros y oligosacáridos.Los azúcares monoméricos obtenidos después de la hidrólisis enzimática se analizaron mediante HPLC equipada con una columna Bio-Rad (Hercules, CA) Aminex HPX-87P y una columna de protección contra cenizas.La temperatura de la columna se mantuvo a 80°C, se utilizó agua como fase móvil con un caudal de 0,6 ml/min.Los oligosacáridos se determinaron por hidrólisis en ácido diluido a 121 °C según los métodos descritos en las refs.41, 48, 49.
El análisis de sacáridos se realizó en residuos de biomasa crudos, pretratados con AFEX y todos los residuos de biomasa no hidrolizados (incluida la producción de extractos de pared celular en serie y su detección de mAb) utilizando los procedimientos descritos anteriormente 27, 43, 50, 51.Para el análisis de glicoma, los residuos insolubles en alcohol del material de la pared celular vegetal se preparan a partir de residuos de biomasa y se someten a extracción en serie con reactivos cada vez más agresivos, como oxalato de amonio (50 mM), carbonato de sodio (50 mM y 0,5 % p/v), CON.(1M y 4M, ambos con borohidruro de sodio al 1% p/v) y clorito ácido como se describió previamente52,53.Luego, los extractos se sometieron a ELISA contra un panel complejo de mAb50 dirigidos al glicano de la pared celular, y las reacciones de unión de mAb se presentaron como un mapa de calor.Los mAb dirigidos al glucano de la pared celular vegetal se adquirieron de existencias de laboratorio (series CCRC, JIM y MAC).
Biotinilación en un solo paso de oligosacáridos.La conjugación de carbohidratos con biotina-LC-hidrazida se realizó utilizando el siguiente procedimiento.Se disolvió biotina-LC-hidrazida (4,6 mg/12 μmol) en sulfóxido de dimetilo (DMSO, 70 μl) mediante agitación vigorosa y calentamiento a 65 ºC durante 1 min.Se añadió ácido acético glacial (30 µl) y la mezcla se vertió sobre cianoborohidruro de sodio (6,4 mg/100 µmol) y se disolvió por completo después de calentar a 65ºC durante aproximadamente 1 minuto.Luego, se añadieron de 5 a 8 µl de la mezcla de reacción al oligosacárido seco (1-100 nmol) para obtener un exceso molar de 10 veces o más del marcador sobre el extremo reductor.La reacción se llevó a cabo a 65°C durante 2 h, tras lo cual las muestras se purificaron inmediatamente.No se usó cianoborohidruro de sodio en los experimentos de marcado sin reducción, y las muestras se hicieron reaccionar a 65ºC durante 2,5 horas.
Recubrimiento ELISA y lavado de muestras de oligosacáridos biotinilados.Se añadieron 25 μl de muestras biotiniladas (100 μl de cada muestra concentrada diluida en 5 ml de solución tampón Tris 0,1 M (TBS)) a cada pocillo de la placa recubierta con avidina.Los pocillos de control se recubrieron con 50 μl de biotina a una concentración de 10 μg/ml en TBS 0,1 M.Se usó agua desionizada como recubrimiento para las mediciones en blanco.La tableta se incubó durante 2 horas a temperatura ambiente en la oscuridad.Lave la placa 3 veces con leche desnatada al 0,1% en TBS 0,1 M con el programa n.11 para Grenier plano 3A.
Adición y lavado de anticuerpos primarios.Agregue 40 µl de anticuerpo primario a cada pocillo.Incube la microplaca durante 1 hora a temperatura ambiente en la oscuridad.A continuación, las placas se lavaron 3 veces con leche al 0,1 % en TBS 0,1 M usando el programa de lavado n.º 11 para Grenier Flat 3A.
Añadir anticuerpo secundario y lavar.Añadir 50 l de anticuerpo secundario de ratón/rata (diluido 1:5000 en leche al 0,1 % en TBS 0,1 M) a cada pocillo.Incube la microplaca durante 1 hora a temperatura ambiente en la oscuridad.A continuación, las microplacas se lavaron 5 veces con leche al 0,1 % en TBS 0,1 M utilizando el programa de lavado de placas #12 Grenier Flat 5A.
Adición de un sustrato.Añadir 50 µl de 3,3′,5,5′-tetrametilbencidina (TMB) al sustrato base (añadiendo 2 gotas de tampón, 3 gotas de TMB, 2 gotas de peróxido de hidrógeno a 15 ml de agua desionizada).Preparar el sustrato TMB.y agitar antes de usar).Incube la microplaca a temperatura ambiente durante 30 minutos.En la oscuridad.
Complete el paso y lea la tableta.Agregue 50 µl de ácido sulfúrico 1 N a cada pozo y registre la absorbancia de 450 a 655 nm usando un lector de ELISA.
Preparar soluciones de 1 mg/ml de estos analitos en agua desionizada: arabinosa, ramnosa, fucosa, xilosa, ácido galacturónico (GalA), ácido glucurónico (GlcA), manosa, glucosa, galactosa, lactosa, N-acetilmanosamina (manNAc), N-acetilglucosamina.(glcNAc), N-acetilgalactosamina (galNAc), inositol (patrón interno).Se prepararon dos patrones añadiendo las soluciones de azúcar de 1 mg/ml que se muestran en la Tabla 1. Las muestras se congelan y liofilizan a -80ºC hasta que se elimina toda el agua (normalmente unas 12-18 horas).
Agregue 100–500 µg de muestra a tubos con tapón de rosca en una balanza analítica.Registre la cantidad añadida.Lo mejor es disolver la muestra en una concentración específica de solvente y agregarla al tubo como una alícuota líquida.Utilice 20 µl de inositol de 1 mg/ml como estándar interno para cada tubo de muestra.La cantidad de estándar interno que se agrega a la muestra debe ser la misma que la cantidad de estándar interno que se agrega al tubo estándar.
Agregue 8 ml de metanol anhidro a un vial con tapa de rosca.Luego 4 ml de solución metanólica de HCl 3 N, tapada y agitada.Este proceso no utiliza agua.
Añadir 500 l de solución de metanol HCl 1 M a las muestras de oligosacáridos y tubos TMS estándar.Las muestras se incubaron durante la noche (168 horas) a 80 ºC en un bloque térmico.Seque el producto de metanólisis a temperatura ambiente utilizando un colector de secado.Añadir 200 l de MeOH y secar de nuevo.Este proceso se repite dos veces.Agregue 200 µl de metanol, 100 µl de piridina y 100 µl de anhídrido acético a la muestra y mezcle bien.Las muestras se incubaron a temperatura ambiente durante 30 minutos.y secado.Añadir 200 µl de metanol y secar de nuevo.
Agregue 200 µl de Tri-Sil y caliente el tubo tapado durante 20 minutos.80°C, luego se enfrió a temperatura ambiente.Utilice un colector de secado para secar aún más la muestra hasta un volumen de aproximadamente 50 µl.Es importante tener en cuenta que no permitimos que las muestras se sequen por completo.
Añadir 2 ml de hexano y mezclar bien mediante agitación vorticial.Llene las puntas de las pipetas Pasteur (5-8 mm) con un trozo de lana de vidrio insertando la lana de vidrio en la parte superior de una pipeta de 5-3/4 pulgadas de diámetro.Las muestras se centrifugaron a 3000 g durante 2 minutos.Cualquier residuo insoluble se precipita.Seque la muestra a 100-150 l.Se inyectó un volumen de aproximadamente 1 μl en la GC-MS a una temperatura inicial de 80 °C y un tiempo inicial de 2,0 minutos (Tabla 2).