Dankon pro vizito de Nature.com.La retumila versio, kiun vi uzas, havas limigitan CSS-subtenon.Por la plej bona sperto, ni rekomendas, ke vi uzu ĝisdatigitan retumilon (aŭ malŝaltu Kongruo-Reĝimon en Internet Explorer).Intertempe, por certigi daŭran subtenon, ni redonos la retejon sen stiloj kaj JavaScript.
Novaj imunologiaj kaj mas-spektrometriaj metodoj por kompleksa analizo de persistaj oligosakaridoj en maizforno antaŭtraktita kun AFEX.Lignoceluloza biomaso estas daŭrigebla alternativo al fosiliaj fueloj kaj estas vaste uzita por evoluigi bioteknologiojn por la produktado de produktoj kiel ekzemple manĝaĵo, furaĝo, fueloj kaj kemiaĵoj.La ŝlosilo al tiuj teknologioj estas la evoluo de kostkonkurencaj procezoj por konverti kompleksajn karbonhidratojn ĉeestantajn en plantĉelaj muroj en simplajn sukerojn kiel ekzemple glukozo, ksilozo kaj arabinozo.Ĉar lignoceluloza biomaso estas tre obstina, ĝi devas esti submetita al termokemiaj traktadoj (ekz., amonia fibro-eksfoliado (AFEX), diluitaj acidoj (DA), jonaj likvaĵoj (IL)) kaj biologiaj traktadoj (ekz., enzima hidrolizo kaj mikroba fermentado) en kombinaĵo por akiri la deziratan produkton..Tamen, kiam komercaj fungaj enzimoj estas uzataj en la hidrolizprocezo, nur 75-85% de la solveblaj sukeroj formitaj estas monosakaridoj, kaj la ceteraj 15-25% estas solveblaj, nesolveblaj oligosakaridoj, kiuj ne ĉiam estas haveblaj al mikroorganismoj.Antaŭe, ni sukcese izolis kaj purigis solveblajn obstinajn oligosakaridojn uzante kombinaĵon de karbono kaj diatomea tero apartigo kaj grandekskluda kromatografio, kaj ankaŭ esploris iliajn enzimajn inhibiciajn ecojn.Ni trovis, ke oligosakaridoj enhavantaj pli altan gradon de polimerigo (DP) metiligitaj uronacidaj anstataŭaĵoj estas pli malfacile prilaboreblaj kun komercaj enzimmiksaĵoj ol malaltaj DP kaj neŭtralaj oligosakaridoj.Ĉi tie ni raportas la uzon de pluraj pliaj metodoj, inkluzive de profilado de glikanoj uzante unuklonaj antikorpoj (mAbs) specifaj por plantaj biomasaj glikanoj por karakterizi glikanajn ligojn en plantĉelaj muroj kaj enzimecaj hidrolizatoj, matrico-helpata lasera malsorba jonigo, mas-spektrometrio de tempo de flugo..MALDI-TOF-MS) uzas struktur-informajn diagnozajn pintojn akiritajn per spektroskopio post sekundara kadukiĝo de negativaj jonoj, gaskromatografio kaj mas-spektrometrio (GC-MS) por karakterizi oligosakaridobligaciojn kun kaj sen derivado.Pro la eta grandeco de oligosakaridoj (DP 4-20), tiujn molekulojn malfacilas uzi por mAb-ligado kaj karakterizado.Por venki ĉi tiun problemon, ni aplikis novan biotin-konjugacio-bazitan oligosakaridan senmovigigan metodon, kiu sukcese etikedis la plimulton de malaltaj DP-solveblaj oligosakaridoj sur la mikroplatsurfaco, kiu tiam estis uzita en alta traflua mAb-sistemo por specifa liga analizo.Ĉi tiu nova metodo faciligos la evoluon de pli altnivelaj altproduktaj gliko-analizoj en la estonteco, kiuj povas esti uzataj por izoli kaj karakterizi oligosakaridojn ĉeestantajn en biosignoj por diagnozaj celoj.
Lignoceluloza biomaso, kunmetita de agrikulturaj, arbaraj, herbaj kaj lignomaterialoj, estas ebla krudmaterialo por la produktado de biobazitaj produktoj, inkluzive de manĝaĵo, furaĝo, fuelo kaj kemiaj antaŭuloj por produkti pli altvalorajn produktojn1.Karbonhidratoj (kiel ekzemple celulozo kaj hemicelulozo) ĉeestantaj en plantĉelmuroj estas malpolimerizitaj en monosakaridojn per kemia pretigo kaj biotransformado (kiel ekzemple enzimeca hidrolizo kaj mikroba fermentado).Oftaj antaŭtraktadoj inkluzivas amoniako-fibran ekspansion (AFEX), diluitan acidon (DA), jonan likvaĵon (IL), kaj vaporeksplodon (SE), kiuj uzas kombinaĵon de kemiaĵoj kaj varmo por redukti lignocelulozan produktadon malfermante plantĉelmurojn3,4.obstineco de materio, 5. Enzimata hidrolizo estas farata ĉe alta solida ŝarĝo uzante komercajn aktivajn karbonhidratajn enzimojn (CAZymes) kaj mikroban fermentadon uzante transgenajn gistojn aŭ bakteriojn por produkti biobazajn brulaĵojn kaj kemiaĵojn 6 .
CAZymes en komercaj enzimoj estas kunmetitaj de kompleksa miksaĵo de enzimoj kiuj sinergie fendas kompleksajn karbonhidrat-sukerajn ligojn por formi monosakaridojn2,7.Kiel ni raportis antaŭe, la kompleksa reto de aromaj polimeroj de lignino kun karbonhidratoj faras ilin tre netrakteblaj, kio kondukas al nekompleta sukera konvertiĝo, amasigante 15-25% de seksaj oligosakaridoj, kiuj ne estas produktitaj dum enzima hidrolizo de la antaŭtraktita biomaso.Tio estas ofta problemo kun diversaj biomasaj antaŭtraktadmetodoj.Kelkaj kialoj de ĉi tiu proplemkolo inkludas enziminhibicion dum hidrolizo, aŭ la foresto aŭ malaltaj niveloj de esencaj esencaj enzimoj kiuj estas postulataj por rompi sukerligojn en plantbiomaso.Kompreni la konsiston kaj strukturajn trajtojn de sukeroj, kiel la sukeraj ligoj en oligosakaridoj, helpos nin plibonigi sukerkonverton dum hidrolizo, igante bioteknologiajn procezojn kostkonkurencivaj kun nafto-devenaj produktoj.
Determini la strukturon de karbonhidratoj estas malfacila kaj postulas kombinaĵon de metodoj kiel ekzemple likva kromatografio (LC)11,12, nuklea magneta resonanca spektroskopio (NMR)13, kapilara elektroforezo (CE)14,15,16 kaj mas-spektrometrio (MS)17.,dekok.MS-metodoj kiel ekzemple temp-de-fluga mas-spektrometrio kun lasera malsorbado kaj jonigo uzanta matricon (MALDI-TOF-MS) estas multflanka metodo por identigado de karbonhidratstrukturoj.Lastatempe, Kolizio-Induktita Dissociation (CID) tandem MS de natriaj jonaj aduktoj estis plej vaste uzata por identigi fingrospurojn respondajn al oligosakaridaj alligaj pozicioj, anomeraj agordoj, sekvencoj kaj branĉaj pozicioj 20, 21 .
Glycan-analizo estas bonega ilo por profunda identigo de karbonhidrataj ligoj22.Tiu metodo uzas unuklonalajn antikorpojn (mAbs) direktitajn al plantĉelmuro glicano kiel enketojn por kompreni kompleksajn karbonhidratajn ligojn.Pli ol 250 mAb-oj estas haveblaj tutmonde, dezajnitaj kontraŭ diversaj liniaj kaj branĉitaj oligosakaridoj uzante diversajn sakaridojn24.Pluraj mAbs estis vaste uzitaj por karakterizi la strukturon, kunmetaĵon kaj modifojn de la plantĉela muro, ĉar ekzistas signifaj diferencoj depende de plantĉeltipo, organo, aĝo, evolustadio kaj kreskmedio25,26.Pli lastatempe, tiu metodo estis uzita por kompreni vezikpopulaciojn en planto kaj bestsistemoj kaj iliajn respektivajn rolojn en glikantransporto kiel determinite per subĉelaj signoj, evolustadioj, aŭ mediaj stimuloj, kaj por determini enzimecan agadon.Kelkaj el la malsamaj strukturoj de glikanoj kaj ksilanoj kiuj estis identigitaj inkludas pektinon (P), ksilanon (X), mananon (M), ksiloglucan'ojn (XylG), miksitajn ligajn glukanojn (MLG), arabinoksilanon (ArbX), galaktomannan (GalG), glukuronan acido-arabinoksilan (GArbX) kaj arabino-galactan (ArbX) 2.
Tamen, malgraŭ ĉiuj tiuj esplorklopodoj, nur kelkaj studoj temigis la naturon de oligosakaridamasiĝo dum alta solidŝarĝo (HSL) hidrolizo, inkluzive de oligosakaridliberigo, oligomeraj ĉenlongoŝanĝoj dum hidrolizo, diversaj malaltaj DP-polimeroj, kaj iliaj kurboj.distribuoj 30,31,32.Dume, kvankam glikananalizo pruvis esti utila ilo por ampleksa analizo de glikanstrukturo, estas malfacile taksi akvosolveblajn malaltajn DP-oligosakaridojn uzante antikorpmetodojn.Pli malgrandaj DP-oligosakaridoj kun molekula pezo de malpli ol 5-10 kDa ne ligas al ELISA-platoj 33, 34 kaj estas forlavitaj antaŭ antikorpa aldono.
Ĉi tie, por la unua fojo, ni pruvas ELISA-teston sur avidin-tegitaj platoj uzante unuklonajn antikorpojn, kombinante unupaŝan biotiniligan proceduron por solveblaj obstinaj oligosakaridoj kun glikoma analizo.Nia aliro al glikoma analizo estis validigita de analizo bazita en MALDI-TOF-MS kaj GC-MS de komplementaj oligosakaridaj ligoj uzante trimetilsilil (TMS) derivadon de hidroligitaj sukeraj komponaĵoj.Ĉi tiu noviga aliro povas esti evoluigita kiel alt-produkta metodo en la estonteco kaj trovi pli larĝan aplikon en biomedicina esplorado35.
Post-tradukaj modifoj de enzimoj kaj antikorpoj, kiel ekzemple glikozilado,36 influas ilian biologian agadon.Ekzemple, ŝanĝoj en glikozilado de serumproteinoj ludas gravan rolon en inflama artrito, kaj ŝanĝoj en glikozilado estas utiligitaj kiel diagnozaj signoj37.Diversaj glikanoj estis raportitaj en la literaturo facile aperi en diversaj malsanoj, inkluzive de kronikaj inflamaj malsanoj de la gastrointestina vojo kaj hepato, virusaj infektoj, ovariaj, mamaj kaj prostaj kanceroj38,39,40.Kompreni la strukturon de glikanoj uzantaj antikorp-bazitajn glikanajn ELISA-metodojn provizos plian fidon pri malsandiagnozo sen la uzo de kompleksaj MS-metodoj.
Nia antaŭa studo montris, ke obstinaj oligosakaridoj restis nehidroligitaj post antaŭtraktado kaj enzima hidrolizo (Figuro 1).En nia antaŭe eldonita laboro, ni evoluigis aktivigitan karbon solid-fazan eltiran metodon por izoli oligosakaridojn de AFEX-pretraktita maiza stover hidrolizato (ACSH)8.Post komenca ekstraktado kaj apartigo, la oligosakaridoj estis plu frakciigitaj per grandekskluda kromatografio (SEC) kaj kolektitaj en ordo de molekula pezo.Sukermonomeroj kaj oligomeroj liberigitaj de diversaj antaŭtraktadoj estis analizitaj per sukerkonsista analizo.Komparante la enhavon de sukeroligomeroj akiritaj per diversaj antaŭtraktaj metodoj, la ĉeesto de obstinaj oligosakaridoj estas ofta problemo en la konvertiĝo de biomaso al monosakaridoj kaj povas konduki al redukto de sukerrendimento de almenaŭ 10-15% kaj eĉ ĝis 18%.Usono.Ĉi tiu metodo estas uzata por plia grandskala produktado de oligosakaridfrakcioj.La rezulta ACH kaj ĝiaj postaj frakcioj kun malsamaj molekulaj pezoj estis utiligitaj kiel eksperimenta materialo por la karakterizado de oligosakaridoj en tiu laboro.
Post antaŭtraktado kaj enzima hidrolizo, persistaj oligosakaridoj restis nehidroligitaj.Ĉi tie (A) estas oligosakarida apartigmetodo, en kiu oligosakaridoj estas izolitaj de AFEX-pretraktita maiza stover-hidrolizato (ACSH) uzante plenplenan liton de aktivigita karbono kaj diatomea tero;(B) Metodo por apartigo de oligosakaridoj.La oligosakaridoj estis plu apartigitaj per grandekskluda kromatografio (SEC);(C) Sakaridaj monomeroj kaj oligomeroj liberigitaj de diversaj antaŭtraktadoj (diluita acido: DA, jona likvaĵo: IL kaj AFEX).Enzimatikaj hidrolizaj kondiĉoj: alta solida ŝarĝo de 25% (p/w) (ĉirkaŭ 8% glukano-ŝarĝado), 96-hora hidrolizo, 20 mg/g komerca enzima ŝarĝo (Ctec2:Htec2:MP-2:1:1-proporcio) kaj (D) Sukermonomeroj kaj oligomeroj de glukozo, EX xylose-eldonita de glukozo, EX xylose-s-eldonita de arabino kaj xylosea stovero.
Glycan-analizo pruvis esti utila ilo por ampleksa struktura analizo de glikanoj en eltiraĵoj izolitaj de solidaj biomasrestaĵoj.Tamen, hidrosolveblaj sakaridoj estas subreprezentitaj uzante tiun tradician metodon41 ĉar malaltmolekulaj pezaj oligosakaridoj estas malfacile senmovigeblaj sur ELISA-platoj kaj estas ellavitaj antaŭ antikorpaldono.Tial, por antikorpa ligado kaj karakterizado, unu-paŝa biotiniladmetodo estis uzita por kovri solveblajn, ne-observantajn oligosakaridojn sur avidin-tegitaj ELISA-platoj.Ĉi tiu metodo estis testita uzante nian antaŭe produktitan ACSH kaj frakcion bazitan sur ĝia molekula pezo (aŭ grado de polimerigo, DP).Unu-paŝa biotinilado estis uzata por pliigi oligosakaridan ligan afinecon aldonante biotin-LC-hidrazidon al la reduktanta fino de la karbonhidrato (Fig. 2).En solvaĵo, la hemiacetal-grupo ĉe la reduktanta fino reagas kun la hidrazidgrupo de biotin-LC-hidrazido por formi hidrazonligon.En la ĉeesto de la reduktanta agento NaCNBH3, la hidrazona ligo estas reduktita al stabila biotinilateita finprodukto.Kun la modifo de la sukerredukta fino, ligado de malaltaj DP-oligosakaridoj al ELISA-platoj fariĝis ebla, kaj en nia studo tio estis farita sur avidin-tegitaj platoj uzante glikan-celajn mAbs.
Rastrumo de unuklonaj antikorpoj bazitaj sur ELISA por biotinilateitaj oligosakaridoj.Ĉi tie (A) kombinita biotinilado de oligosakaridoj kaj posta ELISA-rastrumo kun glikan-celitaj mAbs sur NeutrAvidin-tegitaj platoj kaj (B) montras unupaŝan proceduron por biotinilado de reagproduktoj.
Avidin-tegitaj platoj kun oligosakarid-konjugaciitaj antikorpoj tiam estis aldonitaj al primaraj kaj sekundaraj antikorpoj kaj lavitaj en lum- kaj temp-sentema medio.Post kiam antikorpa ligado estas kompleta, aldonu TMB-substraton por kovi la teleron.La reago estis finfine ĉesigita kun sulfata acido.La kovataj platoj estis analizitaj uzante ELISA-leganton por determini la ligan forton de ĉiu antikorpo por detekti antikorp-specifan krucligon.Por detaloj kaj parametroj de la eksperimento, vidu la respondan sekcion "Materialoj kaj Metodoj".
Ni pruvas la utilecon de ĉi tiu lastatempe evoluinta metodo por specifaj aplikoj per karakterizado de la solveblaj oligosakaridoj ĉeestantaj en ACSH kaj ankaŭ en krudaj kaj purigitaj oligosakaridaj frakcioj izolitaj de lignocelulozaj hidrolizatoj.Kiel montrite en Figuro 3, la plej oftaj epitop-anstataŭigitaj ksilanoj identigitaj en ACSH uzantaj bioaciligitajn glikomajn analizmetodojn estas kutime uronaj (U) aŭ metiluronaj (MeU) kaj pektaj arabinogalaktanoj.La plej multaj el ili ankaŭ estis trovitaj en nia antaŭa studo pri la analizo de glikanoj de ne-hidroligitaj solidoj (UHS)43.
Detekto de obstinaj oligosakaridaj epitopoj uzantaj unuklonan antikorpon direktitan al la ĉela muro glikano.La "neŭtrala" frakcio estas la ACN-frakcio kaj la "acida" frakcio estas la FA-frakcio.Pli brilaj ruĝecoj sur la varmomapo indikas pli altan epitopenhavon, kaj pli helaj bluoj indikas malplenan fonon.Koloraj valoroj sur la skalo baziĝas sur krudaj OD-valoroj por formuliĝoj N=2.La ĉefaj epitopoj rekonitaj de la antikorpoj estas montritaj dekstre.
Tiuj ne-celulozaj strukturoj ne povus esti fenditaj per la plej oftaj celulazoj kaj hemicelulazoj en la testita komerca enzimmiksaĵo, kiu inkludas la plej ofte uzitajn komercajn enzimojn.Tial, novaj helpenzimoj estas postulataj por sia hidrolizo.Sen la necesaj ne-celulozaj akcesoraj enzimoj, tiuj ne-celulozaj ligoj malhelpas kompletan konvertiĝon al monosakaridoj, eĉ se iliaj gepatraj sukerpolimeroj estas grandskale hidroligitaj en pli mallongajn fragmentojn kaj dissolvitaj uzante komercajn enzimmiksaĵojn.
Plia studo de signala distribuo kaj ĝia liga forto montris, ke ligaj epitopoj estis pli malaltaj en altaj DP-sukerfrakcioj (A, B, C, DP ĝis 20+) ol en malaltaj DP-frakcioj (D, E, F, DP) en dimeroj) (Fig. 1).Acidaj fragmentoj estas pli oftaj en ne-celulozaj epitopoj ol neŭtralaj fragmentoj.Ĉi tiuj fenomenoj kongruas kun la ŝablono observita en nia antaŭa studo, kie altaj DP kaj acidaj partoj estis pli rezistemaj al enzima hidrolizo.Tial, la ĉeesto de ne-celulozaj glikanepitopoj kaj U kaj MeU-anstataŭaĵoj povas multe kontribui al la stabileco de la oligosakaridoj.Devus notiĝi ke ligado kaj detektefikeco povas esti problema por malaltaj DP-oligosakaridoj, precipe se la epitopo estas dimera aŭ trimera oligosakarido.Tio povas esti testita uzante komercajn oligosakaridojn de malsamaj longoj, ĉiu enhavante nur unu epitopon kiu ligas al specifa mAb.
Tiel, la uzo de struktur-specifaj antikorpoj rivelis certajn specojn de obstinaj ligoj.Depende de la speco de antikorpo uzita, la konvena ligaĵpadrono, kaj la forto de la signalo kiun ĝi produktas (plej kaj malplej abunda), novaj enzimoj povas esti identigitaj kaj aldonitaj duonkvante al la enzimmiksaĵo por pli kompleta glikokonverto.Prenante la analizon de ACSH-oligosakaridoj kiel ekzemplon, ni povas krei datumbazon de glikanaj ligoj por ĉiu biomasmaterialo.Oni devas rimarki ĉi tie, ke la malsama afineco de antikorpoj devas esti konsiderata, kaj se ilia afineco estas nekonata, tio kreos certajn malfacilaĵojn kiam oni komparas la signalojn de malsamaj antikorpoj.Krome, komparo de glikanaj ligoj povas funkcii plej bone inter provaĵoj por la sama antikorpo.Tiuj obstinaj ligoj tiam povas esti ligitaj al la datumbazo CAZyme, el kiu ni povas identigi enzimojn, elekti kandidatojn enzimojn kaj testi pri ligaj enzimoj, aŭ evoluigi mikrobajn sistemojn por esprimi tiujn enzimojn por uzo en biorafinejoj44.
Por taksi kiel imunologiaj metodoj kompletigas alternativajn metodojn por karakterizi malaltajn molekulajn pezoligosakaridojn ĉeestantajn en lignocelulosaj hidrolizatoj, ni faris MALDI (Fig. 4, S1-S8) kaj analizon de TMS-devenitaj sakaridoj bazitaj sur GC-MS sur la sama panelo (Fig. 5) oligosakarida parto.MALDI kutimas kompari ĉu la amasdistribuo de oligosakaridmolekuloj kongruas kun la celita strukturo.Sur fig.4 montras la MC de la neŭtralaj komponentoj ACN-A kaj ACN-B.ACN-A-analizo konfirmis gamon da pentozaj sukeroj intervalantaj de DP 4-8 (Fig. 4) ĝis DP 22 (Fig. S1), kies pezoj egalrilatas al MeU-xylan oligosakaridoj.ACN-B-analizo konfirmis la pentozon kaj glukoksilanan serion kun DP 8-15.En suplementa materialo kiel ekzemple Figuro S3, FA-C acidaj duonaj amasdistribuaj mapoj montras gamon da (Me) U anstataŭigitaj pentozaj sukeroj kun DP de 8-15 kiuj estas kongruaj kun la anstataŭigitaj ksilanoj trovitaj en ELISA-bazita mAb-rastrumo.La epitopoj estas konsekvencaj.
MALDI-MS-spektro de solveblaj nekonformaj oligosakaridoj ĉeestantaj en ACS.Ĉi tie, (A) ACN-A malalta pezo-intervalaj frakcioj enhavantaj metiligitan uronan acidon (DP 4-8) anstataŭigis glukuroksilan-oligosakaridojn kaj (B) ACN-B-ksilanon kaj metiligitajn uronacidajn oligosakaridojn anstataŭigitajn kun glukuroksilano (DP 8-15).
Analizo de la konsisto de la glikan-restaĵo de obstinaj oligosakaridoj.Ĉi tie (A) TMS-sakaridkonsisto de diversaj oligosakaridaj frakcioj akiritaj per GC-MS-analizo.(B) Strukturoj de diversaj TMS-derivitaj sukeroj ĉeestantaj en oligosakaridoj.ACN - acetonitrila frakcio enhavanta neŭtrajn oligosakaridojn kaj FA - ferulacida frakcio enhavanta acidajn oligosakaridojn.
Alia interesa konkludo estis desegnita el la analizo LC-MS de la oligosakarida frakcio, kiel montrite en Figuro S9 (metodoj videblas en la elektronika suplementa materialo).Fragmentoj de heksozo kaj -OAc-grupoj estis plurfoje observitaj dum ligado de la ACN-B-frakcio.Ĉi tiu trovo ne nur konfirmas la fragmentiĝon observitan en glikomo kaj MALDI-TOF-analizo, sed ankaŭ disponigas novajn informojn pri eblaj karbonhidrataj derivaĵoj en antaŭtraktita lignoceluloza biomaso.
Ni ankaŭ analizis la sukeran komponadon de la oligosakarida frakcio uzante TMS-sukeron-derivigon.Uzante GC-MS, ni determinis la komponadon de neŭralaj (ne-derivataj) kaj acidaj sukeroj (GluA kaj GalA) en la oligosakarida frakcio (Fig. 5).Glukurona acido troviĝas en acidaj komponentoj C kaj D, dum galaktorona acido troviĝas en acidaj komponentoj A kaj B, kiuj ambaŭ estas altaj DP-komponentoj de acidaj sukeroj.Ĉi tiuj rezultoj ne nur konfirmas niajn ELISA kaj MALDI-datumojn, sed ankaŭ kongruas kun niaj antaŭaj studoj pri amasiĝo de oligosakaridoj.Tial, ni kredas, ke modernaj imunologiaj metodoj uzantaj biotiniladon de oligosakaridoj kaj posta ELISA kribrado sufiĉas por detekti solveblajn recalcitrajn oligosakaridojn en diversaj biologiaj specimenoj.
Ĉar ELISA-bazitaj mAb-kribraj metodoj estis validigitaj per pluraj malsamaj metodoj, ni volis plu esplori la potencialon de ĉi tiu nova kvanta metodo.Du komercaj oligosakaridoj, xylohexasaccharide oligosakarido (XHE) kaj 23-α-L-arabinofuranosyl-xylotriose (A2XX), estis aĉetitaj kaj testitaj uzante novan mAb-aliron celantan la ĉelmuron glikanon.Figuro 6 montras linearan korelacion inter la biotinilateita liga signalo kaj la logkoncentriĝo de oligosakaridkoncentriĝo, sugestante eblan Langmuir-adsorbadmodelon.Inter la mAbs, CCRC-M137, CCRC-M138, CCRC-M147, CCRC-M148, kaj CCRC-M151 korelaciis kun XHE, kaj CCRC-M108, CCRC-M109, kaj LM11 korelaciis kun A2XX super intervalo de 1 nm ĝis 100 nano.Pro la limigita havebleco de antikorpoj dum la eksperimento, limigitaj eksperimentoj estis faritaj kun ĉiu oligosakaridkoncentriĝo.Devus notiĝi ĉi tie ke kelkaj antikorpoj reagas tre alimaniere al la sama oligosakarido kiel substrato, supozeble ĉar ili ligas al iomete malsamaj epitopoj kaj povas havi tre malsamajn ligajn afinecojn.La mekanismoj kaj implicoj de preciza epitopidentigo estos multe pli kompleksaj kiam la nova mAb-aliro estas aplikita al realaj provaĵoj.
Du komercaj oligosakaridoj estis uzitaj por determini la detektintervalon de diversaj glikan-celaj mAbs.Ĉi tie, liniaj korelacioj kun logkoncentriĝo de oligosakaridkoncentriĝo indikas Langmuir-adsorbadpadronojn por (A) XHE kun mAb kaj (B) A2XX kun mAb.La ekvivalentaj epitopoj indikas la strukturojn de la komercaj oligosakaridoj utiligitaj kiel substratoj en la analizo.
La uzo de glikan-celitaj unuklonaj antikorpoj (glikokomika analizo aŭ ELISA-bazita mAb-rastrumo) estas potenca ilo por profunda karakterizado de la plej multaj el la plej gravaj ĉelmuraj glikanoj kiuj konsistigas plantbiomason.Tamen, klasika glikananalizo nur karakterizas pli grandajn ĉelmurajn glikanojn, ĉar la plej multaj oligosakaridoj ne estas efike senmovigitaj sur ELISA-platoj.En ĉi tiu studo, AFEX-pretraktita maizforno estis enzime hidroligita ĉe alta solida enhavo.Sukeranalizo estis uzata por determini la konsiston de refleksivaj ĉelmuraj karbonhidratoj en la hidrolizato.Tamen, mAb-analizo de pli malgrandaj oligosakaridoj en hidrolizatoj estas subtaksita, kaj kromaj iloj estas necesaj por efike senmovigi oligosakaridojn sur ELISA-platoj.
Ni raportas ĉi tie novan kaj efikan oligosakaridan senmovigigan metodon por mAb-kribrado kombinante oligosakaridan biotiniladon sekvitan de ELISA-rastrumo sur NeutrAvidin™ tegitaj platoj.La senmovigitaj biotinilateitaj oligosakaridoj montris sufiĉan afinecon por la antikorpo por ebligi rapidan kaj efikan detekton de obstinaj oligosakaridoj.Analizo de la kunmetaĵo de tiuj obstinaj oligosakaridoj bazitaj sur mas-spektrometrio konfirmis la rezultojn de tiu nova aliro al imunkribrado.Tiel, tiuj studoj pruvas ke la kombinaĵo de oligosakaridbiotiniligo kaj ELISA rastrumo kun glikan-celitaj unuklonaj antikorpoj povas esti uzita por detekti krucligojn en oligosakaridoj kaj povas esti vaste aplikita en aliaj biokemiaj studoj karakterizantaj la strukturon de oligosakaridoj.
Tiu biotin-bazita glikan profila metodo estas la unua raporto kapabla je esplorado de la obstinaj karbonhidrataj ligoj de solveblaj oligosakaridoj en plantbiomaso.Ĉi tio helpas kompreni kial iuj partoj de biomaso estas tiel obstinaj kiam temas pri produktado de biofuelaĵo.Tiu metodo plenigas gravan interspacon en glikomaj analizmetodoj kaj etendas sian aplikon al pli larĝa gamo da substratoj preter plantoligosakaridoj.En la estonteco, ni eble uzos robotikon por biotiniligo kaj uzos la metodon, kiun ni evoluigis por altprodukta analizo de provaĵoj uzante ELISA.
Maizpajlo (CS) kultivita de Pioneer 33A14 hibridaj semoj estis rikoltita en 2010 de Kramer Farms en Ray, Kolorado.Kun la permeso de la bienulo, ĉi tiu biomaso povas esti uzata por esplorado. La specimenoj estis stokitaj sekaj < 6% da humideco en zip-seruraj sakoj en ĉambra temperaturo. La specimenoj estis stokitaj sekaj < 6% da humideco en zip-seruraj sakoj en ĉambra temperaturo. Образцы хранились сухими при влажности < 6% в пакетах с застежкой-молнией при комтнатной комтнахп. Specimenoj estis stokitaj sekaj je <6% humido en zipitaj sakoj ĉe ĉambra temperaturo.样品在室温下以干燥< 6% 的水分储存在自封袋中。样品在室温下以干燥< 6% Образцы хранят в пакетах с застежкой-молнией при комнатной температуре с влажностью < 6%. Specimenoj estas stokitaj en zipperaj sakoj ĉe ĉambra temperaturo kun humideco < 6%.La studo observis lokajn kaj naciajn gvidliniojn.Kompozicia analizo estis farita per la NREL-protokolo.La kunmetaĵo estis trovita enhavi 31.4% glukanon, 18.7% ksilanon, 3.3% arabinanon, 1.2% galaktanon, 2.2% acetilon, 14.3% ligninon, 1.7% proteinon kaj 13.4% cindron.
Cellic® CTec2 (138 mg proteino/ml, loto VCNI 0001) estas kompleksa miksaĵo de celulazo, β-glucosidase kaj Cellic® HTec2 (157 mg proteino/ml, loto VHN00001) de Novozymes (Franklinton, NC, Usono)).Multifect Pectinase® (72 mg proteino/mL), kompleksa miksaĵo de pektinaj degradaj enzimoj, estis donacita de DuPont Industrial Biosciences (Palo Alto, CA, Usono).Enzimaj proteinkoncentriĝoj estis determinitaj taksante proteinenhavon (kaj subtrahante la kontribuon de ne-proteina nitrogeno) uzante Kjeldahl-nitrogenanalizon (AOAC-metodo 2001.11, Dairy One Cooperative Inc., Ithaca, NY, Usono).Diatomea tero 545 estis aĉetita de EMD Millipore (Billerica, MA).Aktivigita karbono (DARCO, 100 mesh grajnetoj), Avicel (PH-101), fagoksilano, kaj ĉiuj aliaj kemiaĵoj estis aĉetitaj de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).
AFEX-antaŭtraktado estis farita ĉe GLBRC (Biomass Conversion Research Laboratory, MSU, Lansing, MI, Usono).Antaŭtraktado estis farita je 140° C dum 15 minutoj.46 restadtempo ĉe 1:1 rilatumo de anhidra amoniako al biomaso ĉe 60% (w/w) ŝarĝado en rustorezistaŝtala benktop raktoro (Parr Instruments Company).Ĝi daŭris 30 minutojn.La reaktoro estis alportita al 140 °C kaj la amoniako estis rapide liberigita, permesante al la biomaso rapide reveni al ĉambra temperaturo.La kunmetaĵo de AFEX antaŭtraktita maizfornaĵo (ACS) estis simila al tiu de netraktita maizfornaĵo (UT-CS).
Altaj solidoj ACSH 25% (w/w) (ĉirkaŭ 8% dekstrana ŝarĝo) estis preparita kiel startmaterialo por grandskala produktado de oligosakaridoj.Enzimata hidrolizo de ACS estis farita uzante komercan enzimmiksaĵon inkluzive de Cellic® Ctec2 10 mg proteino/g glukano (en antaŭtraktita biomaso), Htec2 (Novozymes, Franklinton, NC), 5 mg proteino/g glucano, kaj Multifect Pectinase (Genencor Inc, Usono).).), 5 mg proteino/g dekstrano.Enzimata hidrolizo estis farita en 5-litra bioreaktoro kun laborkvanto de 3 litroj, pH 4,8, 50 °C kaj 250 rpm.Post hidrolizo dum 96 horoj, la hidrolizato estis kolektita per centrifugado je 6000 rpm dum 30 minutoj kaj tiam je 14000 rpm dum 30 minutoj por forigi nehidrolizatajn solidojn.La hidrolizato tiam estis submetita al sterila filtrado tra 0.22 mm filtrila beko.La filtrita hidrolizato estis konservita en sterilaj boteloj je 4°C kaj poste frakciita sur karbono.
Analizo de la konsisto de ekstraktaj biomasaj specimenoj laŭ NREL-laboratoriaj analizaj proceduroj: preparado de specimenoj por kompona analizo (NREL/TP-510-42620) kaj determino de strukturaj karbonhidratoj kaj lignino en biomaso (NREL/TP-510 - 42618)47.
Oligosakaridanalizo de la hidroliza fluo estis farita sur 2 ml-skalo uzante aŭtoklav-bazitan acidan hidrolizan metodon.Miksu la hidrolizan specimenon kun 69,7 µl de 72% sulfata acido en 10 ml ŝraŭbĉapo kulturtubo kaj kovu dum 1 h sur benktop je 121 °C, malvarmetigu sur glacio kaj filtri en alta rendimento likva kromatografio (HPLC) fiolo.La koncentriĝo de oligosakaridoj estis determinita per subtrahado de la koncentriĝo de monosakaridoj en la ne-hidroligita specimeno de la totala sukerkoncentriĝo en la acid-hidroligita specimeno.
Glukozo, ksilozo kaj arabinozo-koncentriĝoj en la acida hidrolizita biomaso estis analizitaj uzante Shimadzu HPLC-sistemon ekipitan per aŭtospecimplilo, kolonhejtilo, izokrata pumpilo kaj refrakta indekso-detektilo sur Bio-Rad Aminex HPX-87H-kolumno.La kolono estis konservita je 50 °C kaj eluita kun 0,6 ml/min 5 mM H2SO4 en akvo.flui.
La hidroliza supernatant estis diluita kaj analizita por monomero kaj oligosakaridenhavo.Monomeraj sukeroj akiritaj post enzimeca hidrolizo estis analizitaj per HPLC ekipita per Bio-Rad (Hercules, CA) Aminex HPX-87P-kolumno kaj cindro-gardkolono.La kolumna temperaturo estis konservita je 80 °C, akvo estis uzata kiel movebla fazo kun flukvanto de 0,6 ml/min.Oligosakaridoj estis determinitaj per hidrolizo en diluita acido je 121 °C laŭ la metodoj priskribitaj en refs.41, 48, 49.
Sakarida analizo estis farita sur krudaj, AFEX-antaŭtraktitaj kaj ĉiuj ne-hidrolizaj biomasaj restaĵoj (inkluzive de produktado de seriaj ĉelaj murekstraktaĵoj kaj ilia mAb-kribrado) uzante antaŭe priskribitajn procedurojn 27, 43, 50, 51.Por glikomanalizo, alkohol-nesolveblaj restaĵoj de plantĉela muro materialo estas preparitaj de biomasrestaĵoj kaj submetitaj al seria eltiro kun ĉiam pli agresemaj reakciiloj kiel ekzemple amonioksalato (50 mM), natria karbonato (50 mM kaj 0.5% p/v), CON.(1M kaj 4M, ambaŭ kun 1% p/v natria borohidrido) kaj acida klorito kiel antaŭe priskribite52,53.La eltiraĵoj tiam estis submetitaj al ELISA kontraŭ kompleksa panelo de mAb50s direktitaj al la ĉela muro glicano, kaj la mAb-ligaj reagoj estis prezentitaj kiel varmomapo.mAbs celantaj plantĉelmuron glikanon estis aĉetitaj de laboratoriaj akcioj (CCRC, JIM kaj MAC-serioj).
Unupaŝa biotinilado de oligosakaridoj.La konjugacio de karbonhidratoj kun biotino-LC-hidrazido estis farita per la sekva proceduro.Biotin-LC-hidrazido (4,6 mg/12 μmol) estis solvita en dimetilsulfoksido (DMSO, 70 μl) per vigla kirlado kaj varmigado je 65° C dum 1 min.Glacia acetacido (30 µl) estis aldonita kaj la miksaĵo estis verŝita sur natria cianoborohidrido (6,4 mg/100 µmol) kaj tute dissolvita post varmigado je 65°C dum ĉirkaŭ 1 minuto.Tiam, de 5 ĝis 8 μl de la reakcia miksaĵo estis aldonitaj al la sekigita oligosakarido (1-100 nmol) por akiri 10-oblan aŭ pli molan troon de la etikedo super la reduktanta fino.La reago estis farita je 65 °C dum 2 horoj, post kio la specimenoj estis tuj purigitaj.Neniu natria cianoborohidrido estis uzita en la etikedaj eksperimentoj sen redukto, kaj la specimenoj estis reagis je 65° C. dum 2,5 horoj.
ELISA tegaĵo kaj lavado de specimenoj de biotinilate oligosakaridoj.25 μl da biotinilataj specimenoj (100 μl da ĉiu koncentrita specimeno diluita en 5 ml da 0,1 M Tris-buffersolvo (TBS)) estis aldonitaj al ĉiu puto de la avidin-tegita plato.Kontrolputoj estis kovritaj per 50 μl da biotino je koncentriĝo de 10 μg/ml en 0.1 M TBS.Dejonigita akvo estis utiligita kiel tegaĵo por malplenaj mezuradoj.La tablojdo estis kovita dum 2 horoj ĉe ĉambra temperaturo en la mallumo.Lavu la teleron 3 fojojn kun 0,1% skimigita lakto en 0,1 M TBS uzante programon n-ro.11 por Grenier flat 3A.
Aldono kaj lavado de primaraj antikorpoj.Aldonu 40 µl da primara antikorpo al ĉiu puto.Kovu la mikroplaton dum 1 horo ĉe ĉambra temperaturo en la mallumo.La teleroj tiam estis lavitaj 3 fojojn kun 0.1% lakto en 0.1M TBS uzante lavprogramon numero 11 por Grenier Flat 3A.
Aldonu malĉefan antikorpon kaj lavu.Aldonu 50 µl da muso/rata sekundara antikorpo (diluita 1:5000 en 0,1% lakto en 0,1 M TBS) al ĉiu puto.Kovu la mikroplaton dum 1 horo ĉe ĉambra temperaturo en la mallumo.La mikroplatoj tiam estis lavitaj 5 fojojn kun 0.1% lakto en 0.1 M TBS uzante Grenier Flat 5A platlavprogramon #12.
Aldonante substraton.Aldonu 50 µl de 3,3′,5,5′-tetrametilbenzidino (TMB) al la baza substrato (aldonante 2 gutojn da bufro, 3 gutojn da TMB, 2 gutojn da hidrogena peroksido al 15 ml da dejonigita akvo).Preparu la substraton de TMB.kaj vortico antaŭ uzo).Kovu la mikroplaton ĉe ĉambra temperaturo dum 30 minutoj.En la mallumo.
Kompletigu la paŝon kaj legu la tablojdon.Aldonu 50 µl da 1 N-sulfura acido al ĉiu puto kaj registri la absorbadon de 450 ĝis 655 nm per ELISA-legilo.
Preparu 1 mg/ml solvojn de ĉi tiuj analitoj en dejonigita akvo: arabinozo, ramnozo, fukozo, ksilozo, galaktorona acido (GalA), glukurona acido (GlcA), manozo, glukozo, galaktozo, laktozo, N-acetilmanosamino (manNAc), N-acetilglukozamino.(glcNAc), N-acetilgalaktozamino (galNAc), inositol (interna normo).Du normoj estis preparitaj per aldonado de la 1 mg/mL sukersolvoj montritaj en Tabelo 1. Specimenoj estas frostigitaj kaj liofiligitaj je -80 ° C. ĝis ĉio akvo estas forigita (kutime proksimume 12-18 horoj).
Aldonu 100–500 µg da specimeno al ŝraŭbkaptuboj sur analiza pesilo.Notu la aldonitan kvanton.Plej bone estas solvi la specimenon en specifa koncentriĝo de solvilo kaj aldoni ĝin al la tubo kiel likva alikvoto.Uzu 20 µl da 1 mg/ml inositol kiel internan normon por ĉiu prova tubo.La kvanto de interna normo aldonita al la provaĵo devas esti la sama kiel la kvanto de interna normo aldonita al la norma tubo.
Aldonu 8 ml da anhidra metanolo al ŝraŭbkapa fiolo.Poste 4 ml da 3 N. metanola HCl-solvo, kovritaj kaj skuitaj.Ĉi tiu procezo ne uzas akvon.
Aldonu 500 µl da 1 M HCl metanolsolvo al la oligosakaridaj specimenoj kaj normaj TMS-tuboj.Specimenoj estis kovataj dum la nokto (168 horoj) je 80° C. en termika bloko.Sekigu la metanolizan produkton ĉe ĉambra temperaturo per sekiga dukto.Aldonu 200 µl de MeOH kaj sekigu denove.Ĉi tiu procezo estas ripetita dufoje.Aldonu 200 µl da metanolo, 100 µl da piridino kaj 100 µl da aceta anhidrido al la specimeno kaj miksi bone.Specimenoj estis kovataj ĉe ĉambra temperaturo dum 30 minutoj.kaj sekigita.Aldonu 200 µl da metanolo kaj sekigi denove.
Aldonu 200 µl da Tri-Sil kaj varmigu kovritan tubon dum 20 minutoj.80 °C, poste malvarmigite al ĉambra temperaturo.Uzu sekigan dukto por plu sekigi la specimenon al volumeno de proksimume 50 µl.Gravas noti, ke ni ne permesis al la specimenoj sekiĝi tute.
Aldonu 2 ml da heksano kaj miksu bone per vortexado.Plenigu la pintojn de pipetoj Pasteur (5-8 mm) per peco da vitra lano enmetante la vitran lanon sur 5-3/4 colojn de diametra pipeto.Specimenoj estis centrifugitaj je 3000 g dum 2 minutoj.Ajnaj nesolveblaj restaĵoj precipitiĝas.Sekigi la specimenon al 100-150 µl.Volumo de proksimume 1 μl estis injektita en la GC-MS je komenca temperaturo de 80 °C kaj komenca tempo de 2.0 minutoj (Tablo 2).