Bedankt voor uw bezoek aan Nature.com.De browserversie die u gebruikt heeft beperkte CSS-ondersteuning.Voor de beste ervaring raden we u aan een bijgewerkte browser te gebruiken (of Compatibiliteitsmodus uit te schakelen in Internet Explorer).In de tussentijd zullen we, om voortdurende ondersteuning te garanderen, de site weergeven zonder stijlen en JavaScript.
Nieuwe immunologische en massaspectrometrische methoden voor complexe analyse van persistente oligosacchariden in met AFEX voorbehandelde maïsstengels.Lignocellulosebiomassa is een duurzaam alternatief voor fossiele brandstoffen en wordt veel gebruikt om biotechnologieën te ontwikkelen voor de productie van producten zoals voedsel, diervoeders, brandstoffen en chemicaliën.De sleutel tot deze technologieën is de ontwikkeling van kostenconcurrerende processen voor het omzetten van complexe koolhydraten in plantencelwanden in enkelvoudige suikers zoals glucose, xylose en arabinose.Omdat lignocellulosebiomassa erg hardnekkig is, moet het worden onderworpen aan thermochemische behandelingen (bijv. Ammoniakvezelafschilfering (AFEX), verdunde zuren (DA), ionische vloeistoffen (IL)) en biologische behandelingen (bijv. Enzymatische hydrolyse en microbiële fermentatie) in combinatie om het gewenste product te verkrijgen..Wanneer echter commerciële schimmelenzymen worden gebruikt in het hydrolyseproces, zijn slechts 75-85% van de gevormde oplosbare suikers monosacchariden, en de resterende 15-25% zijn oplosbare, hardnekkige oligosacchariden, die niet altijd beschikbaar zijn voor micro-organismen.Eerder hebben we met succes oplosbare hardnekkige oligosacchariden geïsoleerd en gezuiverd met behulp van een combinatie van koolstof- en diatomeeënaardescheiding en grootte-uitsluitingschromatografie, en hebben we ook hun enzymremmende eigenschappen onderzocht.We hebben gevonden dat oligosacchariden die gemethyleerde uronzuursubstituties met een hogere polymerisatiegraad (DP) bevatten, moeilijker te verwerken zijn met commerciële enzymmengsels dan lage DP en neutrale oligosacchariden.Hier rapporteren we het gebruik van verschillende aanvullende methoden, waaronder glycaanprofilering met behulp van monoklonale antilichamen (mAbs) die specifiek zijn voor glycanen van plantenbiomassa om glycaanbindingen in plantencelwanden en enzymatische hydrolysaten te karakteriseren, matrixondersteunde laserdesorptie-ionisatie, time-of-flight massaspectrometrie..MALDI-TOF-MS) gebruikt structuurinformatieve diagnostische pieken verkregen door spectroscopie na secundair verval van negatieve ionen, gaschromatografie en massaspectrometrie (GC-MS) om oligosaccharidebindingen met en zonder derivatisering te karakteriseren.Vanwege de kleine omvang van oligosacchariden (DP 4-20) zijn deze moleculen moeilijk te gebruiken voor mAb-binding en karakterisering.Om dit probleem op te lossen, hebben we een nieuwe op biotineconjugatie gebaseerde oligosaccharide-immobilisatiemethode toegepast die met succes de meeste oplosbare oligosacchariden met lage DP op het microplaatoppervlak labelde, die vervolgens werd gebruikt in een mAb-systeem met hoge doorvoer voor specifieke ligatieanalyse.Deze nieuwe methode zal de ontwikkeling van meer geavanceerde glycoomassays met hoge doorvoer in de toekomst vergemakkelijken, die kunnen worden gebruikt voor het isoleren en karakteriseren van oligosacchariden die aanwezig zijn in biomarkers voor diagnostische doeleinden.
Lignocellulose-biomassa, bestaande uit landbouw-, bosbouw-, gras- en houtachtige materialen, is een potentiële grondstof voor de productie van biogebaseerde producten, waaronder voedsel, diervoeder, brandstof en chemische voorlopers om hoogwaardiger producten te produceren1.Koolhydraten (zoals cellulose en hemicellulose) aanwezig in plantencelwanden worden gedepolymeriseerd tot monosacchariden door chemische verwerking en biotransformatie (zoals enzymatische hydrolyse en microbiële fermentatie).Gebruikelijke voorbehandelingen zijn onder meer ammoniakvezelexpansie (AFEX), verdund zuur (DA), ionische vloeistof (IL) en stoomexplosie (SE), die een combinatie van chemicaliën en warmte gebruiken om de productie van lignocellulose te verminderen door celwanden van planten te openen3,4.koppigheid van de materie, 5. Enzymatische hydrolyse wordt uitgevoerd bij een hoge vaste-stofbelasting met behulp van commerciële actieve koolhydraatbevattende enzymen (CAZymes) en microbiële fermentatie met behulp van transgene gisten of bacteriën om biobased brandstoffen en chemicaliën te produceren 6 .
CAZymes in commerciële enzymen zijn samengesteld uit een complex mengsel van enzymen die synergetisch complexe koolhydraat-suikerbindingen splitsen om monosacchariden te vormen2,7.Zoals we eerder meldden, maakt het complexe netwerk van aromatische polymeren van lignine met koolhydraten ze zeer hardnekkig, wat leidt tot onvolledige suikerconversie, waarbij 15-25% van de geslachtsoligosacchariden worden verzameld die niet worden geproduceerd tijdens enzymatische hydrolyse van de voorbehandelde biomassa.Dit is een veel voorkomend probleem bij verschillende voorbehandelingsmethoden voor biomassa.Enkele redenen voor dit knelpunt zijn enzymremming tijdens hydrolyse, of de afwezigheid of lage niveaus van essentiële essentiële enzymen die nodig zijn om suikerbindingen in plantenbiomassa te verbreken.Inzicht in de samenstelling en structurele kenmerken van suikers, zoals de suikerbindingen in oligosacchariden, zal ons helpen de suikerconversie tijdens hydrolyse te verbeteren, waardoor biotechnologische processen kostenconcurrerend worden met van aardolie afgeleide producten.
Het bepalen van de structuur van koolhydraten is een uitdaging en vereist een combinatie van methoden zoals vloeistofchromatografie (LC)11,12, nucleaire magnetische resonantiespectroscopie (NMR)13, capillaire elektroforese (CE)14,15,16 en massaspectrometrie (MS)17.,achttien.MS-methoden zoals time-of-flight massaspectrometrie met laserdesorptie en ionisatie met behulp van een matrix (MALDI-TOF-MS) zijn een veelzijdige methode om koolhydraatstructuren te identificeren.Onlangs is Collision-Induced Dissociation (CID) tandem-MS van natriumion-adducten het meest gebruikt om vingerafdrukken te identificeren die overeenkomen met oligosaccharide-aanhechtingsposities, anomere configuraties, sequenties en vertakkingsposities 20, 21.
Glycan-analyse is een uitstekend hulpmiddel voor een grondige identificatie van koolhydraatbindingen22.Deze methode maakt gebruik van monoklonale antilichamen (mAbs) gericht op plantencelwandglycaan als sondes om complexe koolhydraatbindingen te begrijpen.Er zijn wereldwijd meer dan 250 mAb's beschikbaar, ontworpen tegen verschillende lineaire en vertakte oligosacchariden met behulp van verschillende sacchariden24.Verschillende mAb's zijn op grote schaal gebruikt om de structuur, samenstelling en modificaties van de plantencelwand te karakteriseren, aangezien er significante verschillen zijn afhankelijk van het plantenceltype, orgaan, leeftijd, ontwikkelingsstadium en groeiomgeving25,26.Meer recentelijk is deze methode gebruikt om blaasjespopulaties in planten- en dierensystemen en hun respectieve rollen in glycaantransport te begrijpen, zoals bepaald door subcellulaire markeringen, ontwikkelingsstadia of omgevingsstimuli, en om enzymatische activiteit te bepalen.Enkele van de verschillende structuren van glycanen en xylanen die zijn geïdentificeerd, zijn pectine (P), xylan (X), mannan (M), xyloglucanen (XylG), gemengde bindingsglucanen (MLG), arabinoxylaan (ArbX), galactomannan (GalG), glucuronzuur-arabinoxylaan (GArbX) en arabino-galactan (ArbG)29.
Ondanks al deze onderzoeksinspanningen hebben echter slechts enkele onderzoeken zich gericht op de aard van de accumulatie van oligosacchariden tijdens hydrolyse met een hoge vastestofbelasting (HSL), waaronder de afgifte van oligosacchariden, veranderingen in de oligomere ketenlengte tijdens hydrolyse, verschillende polymeren met een lage DP en hun krommen.uitkeringen 30,31,32.Ondertussen, hoewel glycaananalyse een nuttig hulpmiddel is gebleken voor een uitgebreide analyse van de glycaanstructuur, is het moeilijk om in water oplosbare oligosacchariden met lage DP te evalueren met behulp van antilichaammethoden.Kleinere DP-oligosacchariden met een molecuulgewicht van minder dan 5-10 kDa binden niet aan ELISA-platen 33, 34 en worden weggewassen voordat antilichaam wordt toegevoegd.
Hier demonstreren we voor het eerst een ELISA-assay op met avidine gecoate platen met behulp van monoklonale antilichamen, waarbij een biotinylatieprocedure in één stap voor oplosbare vuurvaste oligosacchariden wordt gecombineerd met glycoomanalyse.Onze benadering van glycoomanalyse werd gevalideerd door op MALDI-TOF-MS en GC-MS gebaseerde analyse van complementaire oligosaccharidebindingen met behulp van trimethylsilyl (TMS) derivatisering van gehydrolyseerde suikersamenstellingen.Deze innovatieve aanpak kan in de toekomst worden ontwikkeld als een high-throughput-methode en kan breder worden toegepast in biomedisch onderzoek35.
Posttranslationele modificaties van enzymen en antilichamen, zoals glycosylering,36 beïnvloeden hun biologische activiteit.Veranderingen in glycosylering van serumeiwitten spelen bijvoorbeeld een belangrijke rol bij inflammatoire artritis en veranderingen in glycosylering worden gebruikt als diagnostische markers37.In de literatuur is gemeld dat verschillende glycanen gemakkelijk voorkomen bij een verscheidenheid aan ziekten, waaronder chronische ontstekingsziekten van het maagdarmkanaal en de lever, virale infecties, eierstok-, borst- en prostaatkanker38,39,40.Het begrijpen van de structuur van glycanen met behulp van op antilichamen gebaseerde glycaan-ELISA-methoden zal extra vertrouwen geven in de diagnose van ziekten zonder het gebruik van complexe MS-methoden.
Onze eerdere studie toonde aan dat hardnekkige oligosacchariden niet gehydrolyseerd bleven na voorbehandeling en enzymatische hydrolyse (Figuur 1).In ons eerder gepubliceerde werk hebben we een vaste-fase-extractiemethode met geactiveerde houtskool ontwikkeld om oligosacchariden te isoleren uit met AFEX voorbehandeld maïsstoverhydrolysaat (ACSH) .Na aanvankelijke extractie en scheiding werden de oligosacchariden verder gefractioneerd door grootte-uitsluitingschromatografie (SEC) en verzameld in volgorde van molecuulgewicht.Suikermonomeren en -oligomeren die vrijkwamen uit verschillende voorbehandelingen werden geanalyseerd door analyse van de suikersamenstelling.Bij het vergelijken van het gehalte aan suikeroligomeren verkregen door verschillende voorbehandelingsmethoden, is de aanwezigheid van hardnekkige oligosachariden een veelvoorkomend probleem bij de omzetting van biomassa in monosachariden en kan dit leiden tot een vermindering van de suikeropbrengst van ten minste 10-15% en zelfs tot 18%.ONS.Deze methode wordt gebruikt voor verdere grootschalige productie van oligosaccharidefracties.Het resulterende ACH en de daaropvolgende fracties met verschillende molecuulgewichten werden gebruikt als experimenteel materiaal voor de karakterisering van oligosacchariden in dit werk.
Na voorbehandeling en enzymatische hydrolyse bleven persistente oligosacchariden ongehydrolyseerd.Hier is (A) een oligosaccharidescheidingsmethode waarbij oligosacchariden worden geïsoleerd uit AFEX-voorbehandeld maïsstoverhydrolysaat (ACSH) met behulp van een gepakt bed van actieve kool en diatomeeënaarde;(B) Methode voor scheiding van oligosacchariden.De oligosacchariden werden verder gescheiden door grootte-uitsluitingschromatografie (SEC);(C) Saccharidemonomeren en -oligomeren die vrijkomen uit verschillende voorbehandelingen (verdund zuur: DA, ionische vloeistof: IL en AFEX).Enzymatische hydrolyse-omstandigheden: hoog gehalte aan vaste stoffen van 25% (w/w) (ongeveer 8% glucaanbelading), 96 uur hydrolyse, 20 mg/g commerciële enzymbelading (verhouding Ctec2:Htec2:MP-2:1:1) en (D) Suikermonomeren en -oligomeren van glucose, xylose en arabinose die vrijkomen uit met AFEX voorbehandelde maïsstro (ACS).
Glycan-analyse heeft bewezen een nuttig hulpmiddel te zijn voor een uitgebreide structurele analyse van glycanen in extracten geïsoleerd uit vaste biomassa-residuen.In water oplosbare sacchariden zijn echter ondervertegenwoordigd met deze traditionele methode41 omdat oligosacchariden met een laag molecuulgewicht moeilijk te immobiliseren zijn op ELISA-platen en worden uitgewassen voordat antilichaam wordt toegevoegd.Daarom werd voor binding en karakterisering van antilichamen een biotinyleringsmethode in één stap gebruikt om oplosbare, niet-conforme oligosacchariden te coaten op met avidine gecoate ELISA-platen.Deze methode is getest met ons eerder geproduceerde ACSH en een fractie op basis van het molecuulgewicht (of polymerisatiegraad, DP).Biotinylering in één stap werd gebruikt om de bindingsaffiniteit van oligosacchariden te verhogen door biotine-LC-hydrazide toe te voegen aan het reducerende uiteinde van het koolhydraat (fig. 2).In oplossing reageert de hemiacetaalgroep aan het reducerende uiteinde met de hydrazidegroep van biotine-LC-hydrazide om een ​​hydrazonbinding te vormen.In aanwezigheid van het reductiemiddel NaCNBH3 wordt de hydrazonbinding gereduceerd tot een stabiel gebiotinyleerd eindproduct.Met de modificatie van het suikerreducerende uiteinde werd binding van oligosacchariden met lage DP aan ELISA-platen mogelijk, en in onze studie werd dit gedaan op met avidine gecoate platen met behulp van op glycaan gerichte mAb's.
Screening van monoklonale antilichamen op basis van ELISA voor gebiotinyleerde oligosacchariden.Hier (A) gecombineerde biotinylering van oligosacchariden en daaropvolgende ELISA-screening met glycan-gerichte mAb's op met NeutrAvidin gecoate platen en (B) toont een eenstapsprocedure voor biotinylering van reactieproducten.
Met avidine gecoate platen met aan oligosaccharide geconjugeerde antilichamen werden vervolgens toegevoegd aan primaire en secundaire antilichamen en gewassen in een licht- en tijdgevoelig medium.Nadat de antilichaambinding is voltooid, voegt u TMB-substraat toe om de plaat te incuberen.De reactie werd uiteindelijk gestopt met zwavelzuur.De geïncubeerde platen werden geanalyseerd met behulp van een ELISA-lezer om de bindingssterkte van elk antilichaam te bepalen om antilichaamspecifieke verknoping te detecteren.Voor details en parameters van het experiment, zie de overeenkomstige sectie "Materialen en methoden".
We demonstreren het nut van deze nieuw ontwikkelde methode voor specifieke toepassingen door de oplosbare oligosacchariden die aanwezig zijn in ACSH te karakteriseren, evenals in ruwe en gezuiverde oligosaccharidefracties geïsoleerd uit lignocellulosehydrolysaten.Zoals getoond in figuur 3, zijn de meest voorkomende epitoop-gesubstitueerde xylanen geïdentificeerd in ACSH met behulp van gebioacyleerde glycome-assaymethoden gewoonlijk uronzuur (U) of methyluronzuur (MeU) en pectine arabinogalactanen.De meeste werden ook gevonden in onze vorige studie over de analyse van glycanen van niet-gehydrolyseerde vaste stoffen (UHS)43.
Detectie van recalcitrante oligosaccharide-epitopen met behulp van een monoklonaal antilichaam gericht tegen de celwandglycaan.De "neutrale" fractie is de ACN-fractie en de "zure" fractie is de FA-fractie.Helderdere rode kleuren op de heatmap duiden op een hoger epitoopgehalte en helderdere blauwe kleuren duiden op een blanco achtergrond.Kleurwaarden op de schaal zijn gebaseerd op ruwe OD-waarden voor formuleringen N=2.De belangrijkste epitopen die door de antilichamen worden herkend, worden rechts weergegeven.
Deze niet-cellulosestructuren konden niet worden gesplitst door de meest voorkomende cellulasen en hemicellulasen in het geteste commerciële enzymmengsel, dat de meest gebruikte commerciële enzymen bevat.Daarom zijn nieuwe hulpenzymen nodig voor hun hydrolyse.Zonder de noodzakelijke niet-cellulose-accessoire-enzymen voorkomen deze niet-cellulosebindingen volledige omzetting in monosacchariden, zelfs als hun moedersuikerpolymeren uitgebreid worden gehydrolyseerd tot kortere fragmenten en opgelost met behulp van commerciële enzymmengsels.
Nader onderzoek van de signaalverdeling en de bindingssterkte toonde aan dat bindende epitopen lager waren in suikerfracties met een hoge DP (A, B, C, DP tot 20+) dan in fracties met een lage DP (D, E, F, DP) in dimeren) (Fig. 1).Zure fragmenten komen vaker voor in niet-cellulose-epitopen dan neutrale fragmenten.Deze verschijnselen komen overeen met het patroon dat werd waargenomen in onze vorige studie, waar hoge DP en zure delen beter bestand waren tegen enzymatische hydrolyse.Daarom kan de aanwezigheid van niet-cellulose-glycaanepitopen en U- en MeU-substituties in grote mate bijdragen aan de stabiliteit van de oligosacchariden.Opgemerkt moet worden dat bindings- en detectie-efficiëntie problematisch kan zijn voor oligosacchariden met een lage DP, vooral als het epitoop een dimeer of trimeer oligosaccharide is.Dit kan worden getest met behulp van in de handel verkrijgbare oligosacchariden van verschillende lengtes, die elk slechts één epitoop bevatten dat aan een specifiek mAb bindt.
Het gebruik van structuurspecifieke antilichamen bracht dus bepaalde soorten weerspannige bindingen aan het licht.Afhankelijk van het type antilichaam dat wordt gebruikt, het juiste ligatiepatroon en de sterkte van het signaal dat het produceert (meest en minst overvloedig), kunnen nieuwe enzymen worden geïdentificeerd en semi-kwantitatief aan het enzymmengsel worden toegevoegd voor een meer volledige glycoconversie.Als we de analyse van ACSH-oligosacchariden als voorbeeld nemen, kunnen we een database van glycaanbindingen voor elk biomassamateriaal maken.Hierbij moet worden opgemerkt dat rekening moet worden gehouden met de verschillende affiniteit van antilichamen, en als hun affiniteit onbekend is, zal dit bepaalde moeilijkheden opleveren bij het vergelijken van de signalen van verschillende antilichamen.Bovendien kan vergelijking van glycaanbindingen het beste werken tussen monsters voor hetzelfde antilichaam.Deze hardnekkige bindingen kunnen vervolgens worden gekoppeld aan de CAZyme-database, van waaruit we enzymen kunnen identificeren, kandidaat-enzymen kunnen selecteren en kunnen testen op bindingsbrekende enzymen, of microbiële systemen kunnen ontwikkelen om deze enzymen tot expressie te brengen voor gebruik in bioraffinaderijen44.
Om te evalueren hoe immunologische methoden alternatieve methoden aanvullen voor het karakteriseren van oligosacchariden met een laag molecuulgewicht die aanwezig zijn in lignocellulosehydrolysaten, hebben we MALDI (Fig. 4, S1-S8) en analyse van TMS-afgeleide sacchariden op basis van GC-MS op hetzelfde paneel (Fig. 5) uitgevoerd oligosaccharide deel.MALDI wordt gebruikt om te vergelijken of de massaverdeling van oligosaccharidemoleculen overeenkomt met de beoogde structuur.Op afb.4 toont de MC van de neutrale componenten ACN-A en ACN-B.ACN-A-analyse bevestigde een reeks pentosesuikers variërend van DP 4-8 (Fig. 4) tot DP 22 (Fig. S1), waarvan de gewichten overeenkomen met MeU-xylan-oligosacchariden.ACN-B-analyse bevestigde de pentose- en glucoxylanreeksen met DP 8-15.In aanvullend materiaal, zoals figuur S3, tonen de massaverdelingskaarten van de FA-C-zure delen een reeks van (Me)U-gesubstitueerde pentosesuikers met een DP van 8-15 die consistent zijn met de gesubstitueerde xylanen die worden gevonden in op ELISA gebaseerde mAb-screening.De epitopen zijn consistent.
MALDI-MS-spectrum van oplosbare niet-conforme oligosacchariden aanwezig in ACS.Hier, (A) ACN-A fracties met een laag gewichtsbereik die gemethyleerd uronzuur (DP 4-8) gesubstitueerde glucuroxylan-oligosacchariden bevatten en (B) ACN-B-xylaan en gemethyleerd uronzuur-oligosacchariden gesubstitueerd met glucuroxylaan (DP 8-15).
Analyse van de samenstelling van het glycaanresidu van vuurvaste oligosacchariden.Hier (A) TMS-saccharidesamenstelling van verschillende oligosaccharidefracties verkregen met behulp van GC-MS-analyse.(B) Structuren van verschillende van TMS afgeleide suikers aanwezig in oligosacchariden.ACN – acetonitrilfractie die neutrale oligosacchariden bevat en FA – ferulinezuurfractie die zure oligosacchariden bevat.
Een andere interessante conclusie werd getrokken uit de LC-MS-analyse van de oligosaccharidefractie, zoals weergegeven in figuur S9 (methoden zijn te zien in het elektronische aanvullende materiaal).Fragmenten van hexose- en -OAc-groepen werden herhaaldelijk waargenomen tijdens ligatie van de ACN-B-fractie.Deze bevinding bevestigt niet alleen de fragmentatie die wordt waargenomen in glycoom- en MALDI-TOF-analyse, maar biedt ook nieuwe informatie over mogelijke koolhydraatderivaten in voorbehandelde lignocellulosebiomassa.
We analyseerden ook de suikersamenstelling van de oligosaccharidefractie met behulp van TMS-suikerderivatisering.Met behulp van GC-MS bepaalden we de samenstelling van neurale (niet-afgeleide) en zure suikers (GluA en GalA) in de oligosaccharidefractie (fig. 5).Glucuronzuur wordt aangetroffen in zure componenten C en D, terwijl galacturonzuur wordt aangetroffen in zure componenten A en B, die beide hoge DP-componenten zijn van zure suikers.Deze resultaten bevestigen niet alleen onze ELISA- en MALDI-gegevens, maar komen ook overeen met onze eerdere onderzoeken naar de accumulatie van oligosacchariden.Daarom zijn wij van mening dat moderne immunologische methoden die gebruik maken van biotinylering van oligosacchariden en daaropvolgende ELISA-screening voldoende zijn om oplosbare recalcitrante oligosacchariden in verschillende biologische monsters te detecteren.
Aangezien op ELISA gebaseerde mAb-screeningsmethoden door verschillende methoden zijn gevalideerd, wilden we het potentieel van deze nieuwe kwantitatieve methode verder onderzoeken.Twee commerciële oligosacchariden, xylohexasaccharide-oligosaccharide (XHE) en 23-α-L-arabinofuranosyl-xylotriose (A2XX), werden gekocht en getest met behulp van een nieuwe mAb-benadering gericht op de celwandglycaan.Figuur 6 toont een lineaire correlatie tussen het gebiotinyleerde bindingssignaal en de log-concentratie van de oligosaccharideconcentratie, hetgeen een mogelijk Langmuir-adsorptiemodel suggereert.Onder de mAb's correleerden CCRC-M137, CCRC-M138, CCRC-M147, CCRC-M148 en CCRC-M151 met XHE, en CCRC-M108, CCRC-M109 en LM11 correleerden met A2XX over een bereik van 1 nm tot 100 nano.Vanwege de beperkte beschikbaarheid van antilichamen tijdens het experiment, werden beperkte experimenten uitgevoerd met elke oligosaccharideconcentratie.Hierbij moet worden opgemerkt dat sommige antilichamen heel anders reageren op hetzelfde oligosaccharide als substraat, vermoedelijk omdat ze binden aan enigszins verschillende epitopen en zeer verschillende bindingsaffiniteiten kunnen hebben.De mechanismen en implicaties van nauwkeurige epitoopidentificatie zullen veel complexer zijn wanneer de nieuwe mAb-benadering wordt toegepast op echte monsters.
Twee commerciële oligosacchariden werden gebruikt om het detectiebereik van verschillende op glycanen gerichte mAb's te bepalen.Hier geven lineaire correlaties met logconcentratie van oligosaccharideconcentratie Langmuir-adsorptiepatronen aan voor (A) XHE met mAb en (B) A2XX met mAb.De overeenkomstige epitopen geven de structuren aan van de in de handel verkrijgbare oligosacchariden die als substraten in de assay worden gebruikt.
Het gebruik van op glycaan gerichte monoklonale antilichamen (glycocomische analyse of op ELISA gebaseerde mAb-screening) is een krachtig hulpmiddel voor een diepgaande karakterisering van de meeste van de belangrijkste celwandglycanen waaruit de plantenbiomassa bestaat.Klassieke glycaananalyse kenmerkt echter alleen grotere celwandglycanen, aangezien de meeste oligosacchariden niet efficiënt op ELISA-platen worden geïmmobiliseerd.In deze studie werd met AFEX voorbehandelde maisstover enzymatisch gehydrolyseerd met een hoog gehalte aan vaste stoffen.Suikeranalyse werd gebruikt om de samenstelling van recalcitrante celwandkoolhydraten in het hydrolysaat te bepalen.De mAb-analyse van kleinere oligosacchariden in hydrolysaten wordt echter onderschat en er zijn aanvullende hulpmiddelen nodig om oligosacchariden effectief op ELISA-platen te immobiliseren.
We rapporteren hier een nieuwe en efficiënte oligosaccharide-immobilisatiemethode voor mAb-screening door oligosaccharidebiotinylering te combineren gevolgd door ELISA-screening op met NeutrAvidin™ gecoate platen.De geïmmobiliseerde gebiotinyleerde oligosacchariden vertoonden voldoende affiniteit voor het antilichaam om snelle en efficiënte detectie van recalcitrante oligosacchariden mogelijk te maken.Analyse van de samenstelling van deze hardnekkige oligosacchariden op basis van massaspectrometrie bevestigde de resultaten van deze nieuwe benadering van immunoscreening.Deze onderzoeken tonen dus aan dat de combinatie van oligosaccharidebiotinylering en ELISA-screening met op glycaan gerichte monoklonale antilichamen kan worden gebruikt om verknopingen in oligosacchariden te detecteren en op grote schaal kan worden toegepast in andere biochemische onderzoeken die de structuur van oligosacchariden karakteriseren.
Deze op biotine gebaseerde glycaanprofileringsmethode is het eerste rapport dat in staat is om de hardnekkige koolhydraatbindingen van oplosbare oligosacchariden in plantenbiomassa te onderzoeken.Dit helpt te begrijpen waarom sommige delen van biomassa zo koppig zijn als het gaat om de productie van biobrandstoffen.Deze methode vult een belangrijke leemte in glycoomanalysemethoden en breidt de toepassing ervan uit naar een breder scala aan substraten dan plantaardige oligosacchariden.In de toekomst kunnen we robotica gebruiken voor biotinylatie en de methode gebruiken die we hebben ontwikkeld voor high-throughput analyse van monsters met behulp van ELISA.
Maïsstro (CS) gekweekt uit Pioneer 33A14 hybride zaden werd in 2010 geoogst van Kramer Farms in Ray, Colorado.Met toestemming van de landeigenaar kan deze biomassa gebruikt worden voor onderzoek. De monsters werden droog < 6% vocht bewaard in zip-lock zakken bij kamertemperatuur. De monsters werden droog < 6% vocht bewaard in zip-lock zakken bij kamertemperatuur. Gemiddelde verkoopcijfers < 6% van het aantal klanten met een korting op de verkoop пературе. Monsters werden droog bewaard bij <6% vochtigheid in zakken met ritssluiting bij kamertemperatuur.样品在室温下以干燥< 6% 的水分储存在自封袋中。样品在室温下以干燥< 6% De kans op een stijging van de omzet met een daling van < 6%. Monsters worden bewaard in ritszakken bij kamertemperatuur met een luchtvochtigheid < 6%.De studie voldeed aan lokale en nationale richtlijnen.Samenstellingsanalyse werd uitgevoerd met behulp van het NREL-protocol.De samenstelling bleek 31,4% glucaan, 18,7% xylaan, 3,3% arabinan, 1,2% galactan, 2,2% acetyl, 14,3% lignine, 1,7% eiwit en 13,4% as te bevatten.
Cellic® CTec2 (138 mg eiwit/ml, partij VCNI 0001) is een complex mengsel van cellulase, β-glucosidase en Cellic® HTec2 (157 mg eiwit/ml, partij VHN00001) van Novozymes (Franklinton, NC, VS)).Multifect Pectinase® (72 mg eiwit/ml), een complex mengsel van pectine-afbrekende enzymen, werd geschonken door DuPont Industrial Biosciences (Palo Alto, CA, VS).Enzymeiwitconcentraties werden bepaald door het eiwitgehalte te schatten (en de bijdrage van niet-eiwitstikstof af te trekken) met behulp van Kjeldahl-stikstofanalyse (AOAC-methode 2001.11, Dairy One Cooperative Inc., Ithaca, NY, VS).Diatomeeënaarde 545 werd gekocht bij EMD Millipore (Billerica, MA).Actieve kool (DARCO, 100 mesh granules), Avicel (PH-101), beuken xylan en alle andere chemicaliën werden gekocht bij Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).
AFEX-voorbehandeling werd uitgevoerd bij GLBRC (Biomass Conversion Research Laboratory, MSU, Lansing, MI, VS).Voorbehandeling vond plaats bij 140°C gedurende 15 minuten.46 verblijftijd bij 1:1 verhouding van watervrije ammoniak tot biomassa bij 60% (w/w) belading in een roestvrijstalen tafelmodel batchreactor (Parr Instruments Company).Het duurde 30 minuten.De reactor werd op 140°C gebracht en de ammoniak kwam snel vrij waardoor de biomassa weer snel op kamertemperatuur kwam.De samenstelling van AFEX voorbehandelde maïsstengel (ACS) was vergelijkbaar met die van onbehandelde maïsstengel (UT-CS).
High solids ACSH 25% (w/w) (ongeveer 8% dextraanbelading) werd bereid als uitgangsmateriaal voor grootschalige productie van oligosacchariden.Enzymatische hydrolyse van ACS werd uitgevoerd met behulp van een commercieel enzymmengsel met inbegrip van Cellic® Ctec2 10 mg eiwit/g glucan (in voorbehandelde biomassa), Htec2 (Novozymes, Franklinton, NC), 5 mg eiwit/g glucan en Multifect Pectinase (Genencor Inc, VS).).), 5 mg eiwit/g dextran.Enzymatische hydrolyse werd uitgevoerd in een bioreactor van 5 liter met een werkvolume van 3 liter, pH 4,8, 50°C en 250 rpm.Na hydrolyse gedurende 96 uur werd het hydrolysaat verzameld door middel van centrifugatie bij 6000 rpm gedurende 30 minuten en vervolgens bij 14000 rpm gedurende 30 minuten om niet-gehydrolyseerde vaste stoffen te verwijderen.Het hydrolysaat werd vervolgens onderworpen aan steriele filtratie door een 0,22 mm filterbeker.Het gefiltreerde hydrolysaat werd in steriele flessen bij 4°C bewaard en vervolgens op koolstof gefractioneerd.
Analyse van de samenstelling van op extracten gebaseerde biomassamonsters volgens NREL-laboratoriumanalyseprocedures: voorbereiding van monsters voor samenstellingsanalyse (NREL/TP-510-42620) en bepaling van structurele koolhydraten en lignine in biomassa (NREL/TP-510 – 42618)47.
Oligosaccharide-analyse van de hydrolysaatstroom werd uitgevoerd op een schaal van 2 ml met behulp van een op een autoclaaf gebaseerde zure hydrolysemethode.Meng het hydrolysaatmonster met 69,7 µl 72% zwavelzuur in een kweekbuis van 10 ml met schroefdop en incubeer gedurende 1 uur op een tafelblad bij 121 °C, koel af op ijs en filtreer in een injectieflacon met hogedrukvloeistofchromatografie (HPLC).De concentratie van oligosacchariden werd bepaald door de concentratie van monosacchariden in het niet-gehydrolyseerde monster af te trekken van de totale suikerconcentratie in het zuur-gehydrolyseerde monster.
Glucose-, xylose- en arabinoseconcentraties in de met zuur gehydrolyseerde biomassa werden geanalyseerd met behulp van een Shimadzu HPLC-systeem uitgerust met een autosampler, kolomverwarmer, isocratische pomp en brekingsindexdetector op een Bio-Rad Aminex HPX-87H-kolom.De kolom werd op 50°C gehouden en geëlueerd met 0,6 ml/min 5 mM H2S04 in water.stroom.
Het supernatant van het hydrolysaat werd verdund en geanalyseerd op monomeer- en oligosaccharidegehalte.Monomere suikers verkregen na enzymatische hydrolyse werden geanalyseerd met HPLC uitgerust met een Bio-Rad (Hercules, CA) Aminex HPX-87P-kolom en een asbewakingskolom.De kolomtemperatuur werd op 80°C gehouden, water werd gebruikt als de mobiele fase met een stroomsnelheid van 0,6 ml/min.Oligosacchariden werden bepaald door hydrolyse in verdund zuur bij 121 °C volgens de methoden beschreven in ref.41, 48, 49.
Saccharide-analyse werd uitgevoerd op onbewerkte, met AFEX voorbehandelde en alle niet-gehydrolyseerde biomassaresiduen (inclusief productie van seriële celwandextracten en hun mAb-screening) met behulp van eerder beschreven procedures 27, 43, 50, 51.Voor glycoomanalyse worden in alcohol onoplosbare resten van plantencelwandmateriaal bereid uit biomassaresten en onderworpen aan seriële extractie met steeds agressievere reagentia zoals ammoniumoxalaat (50 mM), natriumcarbonaat (50 mM en 0,5% w/v), CON.(1M en 4M, beide met 1% w/v natriumboorhydride) en zuurchloriet zoals eerder beschreven52,53.De extracten werden vervolgens onderworpen aan ELISA tegen een complex panel van mAb50's gericht op de celwandglycaan, en de mAb-bindingsreacties werden gepresenteerd als een warmtekaart.mAb's gericht op plantencelwandglycaan werden gekocht uit laboratoriumvoorraden (CCRC-, JIM- en MAC-series).
Biotinylering in één stap van oligosacchariden.De conjugatie van koolhydraten met biotine-LC-hydrazide werd uitgevoerd met behulp van de volgende procedure.Biotine-LC-hydrazide (4,6 mg/12 μmol) werd opgelost in dimethylsulfoxide (DMSO, 70 μl) door krachtig te roeren en 1 minuut te verwarmen op 65°C.IJsazijn (30 µl) werd toegevoegd en het mengsel werd op natriumcyaanboorhydride (6,4 mg/100 µmol) gegoten en volledig opgelost na ongeveer 1 minuut verhitten op 65°C.Vervolgens werd 5 tot 8 µl van het reactiemengsel toegevoegd aan het gedroogde oligosaccharide (1-100 nmol) om een ​​10-voudige of meer molaire overmaat van het label over het reducerende uiteinde te verkrijgen.De reactie werd gedurende 2 uur bij 65°C uitgevoerd, waarna de monsters onmiddellijk werden gezuiverd.Bij de merkexperimenten zonder reductie werd geen natriumcyaanboorhydride gebruikt en men liet de monsters gedurende 2,5 uur reageren bij 65°C.
ELISA-coating en wassen van monsters van gebiotinyleerde oligosacchariden.25 µl gebiotinyleerde monsters (100 µl van elk geconcentreerd monster verdund in 5 ml 0,1 M Tris-bufferoplossing (TBS)) werd toegevoegd aan elk putje van de met avidine beklede plaat.Controleputjes werden gecoat met 50 μl biotine in een concentratie van 10 μg/ml in 0,1 M TBS.Gedeïoniseerd water werd gebruikt als coating voor blanco metingen.De tablet werd gedurende 2 uur bij kamertemperatuur in het donker geïncubeerd.Was de plaat 3 keer met 0,1% magere melk in 0,1 M TBS met programma nr.11 voor Grenier flat 3A.
Toevoeging en wassen van primaire antilichamen.Voeg 40 µl primair antilichaam toe aan elk putje.Incubeer de microtiterplaat gedurende 1 uur bij kamertemperatuur in het donker.De platen werden vervolgens 3 keer gewassen met 0,1% melk in 0,1 M TBS met wasprogramma #11 voor Grenier Flat 3A.
Secundair antilichaam toevoegen en wassen.Voeg 50 µl muis/rat secundair antilichaam (1:5000 verdund in 0,1% melk in 0,1 M TBS) toe aan elk putje.Incubeer de microtiterplaat gedurende 1 uur bij kamertemperatuur in het donker.De microplaten werden vervolgens 5 keer gewassen met 0,1% melk in 0,1 M TBS met Grenier Flat 5A plaatwasprogramma #12.
Een substraat toevoegen.Voeg 50 µl 3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine (TMB) toe aan het basissubstraat (door toevoeging van 2 druppels buffer, 3 druppels TMB, 2 druppels waterstofperoxide aan 15 ml gedeïoniseerd water).Bereid het TMB-substraat voor.en vortexen voor gebruik).Incubeer de microtiterplaat gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.In het donker.
Voltooi de stap en lees de tablet.Voeg 50 µl 1 N zwavelzuur toe aan elk putje en noteer de absorptie van 450 tot 655 nm met behulp van een ELISA-lezer.
Bereid 1 mg/ml oplossingen van deze analyten in gedeïoniseerd water: arabinose, rhamnose, fucose, xylose, galacturonzuur (GalA), glucuronzuur (GlcA), mannose, glucose, galactose, lactose, N-acetylmannosamine (manNAc), N-acetylglucosamine.(glcNAc), N-acetylgalactosamine (galNAc), inositol (interne standaard).Twee standaarden werden bereid door toevoeging van de 1 mg/ml suikeroplossingen getoond in Tabel 1. Monsters worden ingevroren en gelyofiliseerd bij -80°C totdat al het water is verwijderd (gewoonlijk ongeveer 12-18 uur).
Voeg 100–500 µg monster toe aan buisjes met schroefdop op een analytische balans.Noteer het toegevoegde bedrag.Het is het beste om het monster op te lossen in een specifieke concentratie oplosmiddel en het als een vloeibaar aliquot aan de buis toe te voegen.Gebruik 20 µl 1 mg/ml inositol als interne standaard voor elk monsterbuisje.De hoeveelheid interne standaard die aan het monster wordt toegevoegd, moet gelijk zijn aan de hoeveelheid interne standaard die aan het standaardbuisje wordt toegevoegd.
Voeg 8 ml watervrije methanol toe aan een injectieflacon met schroefdop.Vervolgens 4 ml 3 N methanolische HCl-oplossing, afgesloten en geschud.Bij dit proces wordt geen water gebruikt.
Voeg 500 µl 1 M HCl-methanoloplossing toe aan de oligosaccharidemonsters en standaard TMS-buisjes.Monsters werden overnacht (168 uur) bij 80°C in een thermisch blok geïncubeerd.Droog het methanolyseproduct bij kamertemperatuur met behulp van een droogverdeelstuk.Voeg 200 µl MeOH toe en droog opnieuw.Dit proces wordt twee keer herhaald.Voeg 200 µl methanol, 100 µl pyridine en 100 µl azijnzuuranhydride toe aan het monster en meng goed.Monsters werden 30 minuten bij kamertemperatuur geïncubeerd.en gedroogd.Voeg 200 µl methanol toe en droog opnieuw.
Voeg 200 µl Tri-Sil toe en verwarm het buisje met dop gedurende 20 minuten.80°C, daarna afgekoeld tot kamertemperatuur.Gebruik een droogverdeelstuk om het monster verder te drogen tot een volume van ongeveer 50 µl.Het is belangrijk op te merken dat we de monsters niet volledig hebben laten drogen.
Voeg 2 ml hexaan toe en meng goed door vortexen.Vul de uiteinden van Pasteur-pipetten (5-8 mm) met een stuk glaswol door de glaswol bovenop een pipet met een diameter van 5-3/4 inch te plaatsen.Monsters werden gedurende 2 minuten bij 3000 g gecentrifugeerd.Eventuele onoplosbare residuen worden neergeslagen.Droog het monster tot 100-150 µl.Een volume van ongeveer 1 μl werd in de GC-MS geïnjecteerd bij een begintemperatuur van 80 °C en een begintijd van 2,0 minuten (Tabel 2).