Tack för att du besöker Nature.com.Webbläsarversionen du använder har begränsat CSS-stöd.För bästa upplevelse rekommenderar vi att du använder en uppdaterad webbläsare (eller inaktiverar kompatibilitetsläge i Internet Explorer).Under tiden, för att säkerställa fortsatt support, kommer vi att rendera webbplatsen utan stilar och JavaScript.
Nya immunologiska och masspektrometriska metoder för komplex analys av persistenta oligosackarider i majsstover förbehandlad med AFEX.Lignocellulosabiomassa är ett hållbart alternativ till fossila bränslen och används i stor utsträckning för att utveckla bioteknik för produktion av produkter som livsmedel, foder, bränslen och kemikalier.Nyckeln till dessa teknologier är utvecklingen av kostnadskonkurrenskraftiga processer för att omvandla komplexa kolhydrater som finns i växternas cellväggar till enkla sockerarter som glukos, xylos och arabinos.Eftersom lignocellulosabiomassa är mycket envis måste den utsättas för termokemiska behandlingar (t.ex. ammoniakfiberexfoliering (AFEX), utspädda syror (DA), joniska vätskor (IL)) och biologiska behandlingar (t.ex. enzymatisk hydrolys och mikrobiell fermentering) i kombination för att erhålla den önskade produkten..Men när kommersiella svampenzymer används i hydrolysprocessen är endast 75-85% av de lösliga sockerarterna som bildas monosackarider, och de återstående 15-25% är lösliga, svårbehandlade oligosackarider, som inte alltid är tillgängliga för mikroorganismer.Tidigare har vi framgångsrikt isolerat och renat lösliga envisa oligosackarider med en kombination av kol- och kiselgurseparation och storleksuteslutningskromatografi, och även undersökt deras enzymhämmande egenskaper.Vi har funnit att oligosackarider innehållande högre grad av polymerisation (DP) metylerade uronsyrasubstitutioner är svårare att bearbeta med kommersiella enzymblandningar än låg DP och neutrala oligosackarider.Här rapporterar vi användningen av flera ytterligare metoder, inklusive glykanprofilering med monoklonala antikroppar (mAbs) specifika för växtbiomasglykaner för att karakterisera glykanbindningar i växtcellväggar och enzymatiska hydrolysat, matrisassisterad laserdesorptionjonisering, masspektrometri under flygning..MALDI-TOF-MS) använder strukturinformativa diagnostiska toppar erhållna genom spektroskopi efter sekundärt sönderfall av negativa joner, gaskromatografi och masspektrometri (GC-MS) för att karakterisera oligosackaridbindningar med och utan derivatisering.På grund av den lilla storleken på oligosackarider (DP 4–20) är dessa molekyler svåra att använda för mAb-bindning och karakterisering.För att övervinna detta problem tillämpade vi en ny biotinkonjugationsbaserad oligosackaridimmobiliseringsmetod som framgångsrikt märkte majoriteten av låg-DP-lösliga oligosackarider på mikroplattans yta, som sedan användes i ett högkapacitets mAb-system för specifik ligeringsanalys.Denna nya metod kommer att underlätta utvecklingen av mer avancerade glykomanalyser med hög genomströmning i framtiden som kan användas för att isolera och karakterisera oligosackarider som finns i biomarkörer för diagnostiska ändamål.
Lignocellulosabiomassa, sammansatt av jordbruks-, skogsbruks-, gräs- och trämaterial, är ett potentiellt råmaterial för produktion av biobaserade produkter, inklusive livsmedel, foder, bränsle och kemiska prekursorer för att producera produkter med högre värde1.Kolhydrater (såsom cellulosa och hemicellulosa) som finns i växtcellväggar depolymeriseras till monosackarider genom kemisk bearbetning och biotransformation (såsom enzymatisk hydrolys och mikrobiell fermentering).Vanliga förbehandlingar inkluderar ammoniakfiberexpansion (AFEX), utspädd syra (DA), jonisk vätska (IL) och ångexplosion (SE), som använder en kombination av kemikalier och värme för att minska produktionen av lignocellulosa genom att öppna växtcellväggar3,4.materias envishet, 5. Enzymatisk hydrolys utförs vid en hög belastning av fasta ämnen med användning av kommersiella enzymer som innehåller aktiva kolhydrater (CAZymes) och mikrobiell fermentering med hjälp av transgena jästsvampar eller bakterier för att producera biobaserade bränslen och kemikalier 6 .
CAZymer i kommersiella enzymer är sammansatta av en komplex blandning av enzymer som synergistiskt klyver komplexa kolhydrat-sockerbindningar för att bilda monosackarider2,7.Som vi rapporterade tidigare gör det komplexa nätverket av aromatiska polymerer av lignin med kolhydrater dem mycket svårbehandlade, vilket leder till ofullständig sockeromvandling, ackumulerar 15-25% av könsoligosackarider som inte produceras under enzymatisk hydrolys av den förbehandlade biomassan.Detta är ett vanligt problem med olika förbehandlingsmetoder för biomassa.Några orsaker till denna flaskhals inkluderar enzymhämning under hydrolys, eller frånvaron eller låga nivåer av essentiella enzymer som krävs för att bryta sockerbindningar i växtbiomassa.Att förstå sockerarters sammansättning och strukturella egenskaper, såsom sockerbindningarna i oligosackarider, kommer att hjälpa oss att förbättra sockeromvandlingen under hydrolys, vilket gör biotekniska processer kostnadskonkurrenskraftiga med petroleumbaserade produkter.
Att bestämma strukturen av kolhydrater är utmanande och kräver en kombination av metoder som vätskekromatografi (LC)11,12, kärnmagnetisk resonansspektroskopi (NMR)13, kapillärelektrofores (CE)14,15,16 och masspektrometri (MS)17.,arton.MS-metoder som masspektrometri under flygning med laserdesorption och jonisering med hjälp av en matris (MALDI-TOF-MS) är en mångsidig metod för att identifiera kolhydratstrukturer.Nyligen har Collision-Induced Dissociation (CID) tandem-MS av natriumjonaddukter använts mest för att identifiera fingeravtryck som motsvarar oligosackaridfästpositioner, anomera konfigurationer, sekvenser och förgreningspositioner 20, 21.
Glykananalys är ett utmärkt verktyg för djupgående identifiering av kolhydratbindningar22.Denna metod använder monoklonala antikroppar (mAbs) riktade mot växtcellväggsglykan som prober för att förstå komplexa kolhydratbindningar.Mer än 250 mAbs finns tillgängliga över hela världen, designade mot olika linjära och grenade oligosackarider med användning av olika sackarider24.Flera mAbs har använts i stor utsträckning för att karakterisera strukturen, sammansättningen och modifieringarna av växtcellväggen, eftersom det finns betydande skillnader beroende på växtcellstyp, organ, ålder, utvecklingsstadium och tillväxtmiljö25,26.På senare tid har denna metod använts för att förstå vesikelpopulationer i växt- och djursystem och deras respektive roller i glykantransport som bestäms av subcellulära markörer, utvecklingsstadier eller miljöstimuli, och för att bestämma enzymatisk aktivitet.Några av de olika strukturerna av glykaner och xylaner som har identifierats inkluderar pektin (P), xylan (X), mannan (M), xyloglukaner (XylG), blandade bindningsglukaner (MLG), arabinoxylan (ArbX), galaktomannan (GalG) , glukuronsyra-arabinoxylan (GArbinoX) (GarbinoX) och 2-galanar.
Men trots alla dessa forskningsansträngningar har endast ett fåtal studier fokuserat på arten av oligosackaridackumulering under hydrolys med hög fasta ämnen (HSL), inklusive oligosackaridfrisättning, oligomera kedjelängdsförändringar under hydrolys, olika låg-DP-polymerer och deras kurvor.utdelningar 30,31,32.Samtidigt, även om glykananalys har visat sig vara ett användbart verktyg för en omfattande analys av glykanstruktur, är det svårt att utvärdera vattenlösliga oligosackarider med låg DP med hjälp av antikroppsmetoder.Mindre DP-oligosackarider med en molekylvikt på mindre än 5-10 kDa binder inte till ELISA-plattorna 33, 34 och tvättas bort före antikroppstillsats.
Här demonstrerar vi för första gången en ELISA-analys på avidinbelagda plattor med användning av monoklonala antikroppar, som kombinerar ett biotinyleringsförfarande i ett steg för lösliga eldfasta oligosackarider med glykomanalys.Vårt tillvägagångssätt för glykomanalys validerades av MALDI-TOF-MS och GC-MS-baserad analys av komplementära oligosackaridkopplingar med användning av trimetylsilyl (TMS) derivatisering av hydrolyserade sockerkompositioner.Detta innovativa tillvägagångssätt kan utvecklas som en metod med hög genomströmning i framtiden och få bredare tillämpning inom biomedicinsk forskning35.
Posttranslationella modifieringar av enzymer och antikroppar, såsom glykosylering,36 påverkar deras biologiska aktivitet.Till exempel spelar förändringar i glykosylering av serumproteiner en viktig roll vid inflammatorisk artrit, och förändringar i glykosylering används som diagnostiska markörer37.Olika glykaner har rapporterats i litteraturen att lätt uppträda i en mängd olika sjukdomar, inklusive kroniska inflammatoriska sjukdomar i mag-tarmkanalen och levern, virusinfektioner, äggstockscancer, bröst- och prostatacancer38,39,40.Att förstå strukturen av glykaner med hjälp av antikroppsbaserade glykan ELISA-metoder kommer att ge ytterligare förtroende för sjukdomsdiagnostik utan användning av komplexa MS-metoder.
Vår tidigare studie visade att envisa oligosackarider förblev ohydrolyserade efter förbehandling och enzymatisk hydrolys (Figur 1).I vårt tidigare publicerade arbete utvecklade vi en fastfasextraktionsmetod för aktivt kol för att isolera oligosackarider från AFEX-förbehandlat majsstoverhydrolysat (ACSH)8.Efter initial extraktion och separation fraktionerades oligosackariderna ytterligare genom storleksexklusionskromatografi (SEC) och uppsamlades i molekylviktsordning.Sockermonomerer och oligomerer frisatta från olika förbehandlingar analyserades genom analys av sockersammansättning.När man jämför innehållet av sockeroligomerer som erhållits genom olika förbehandlingsmetoder är förekomsten av envisa oligosackarider ett vanligt problem vid omvandlingen av biomassa till monosackarider och kan leda till en minskning av sockerutbytet med minst 10-15% och till och med upp till 18%.USA.Denna metod används för ytterligare storskalig produktion av oligosackaridfraktioner.Den resulterande ACH och dess efterföljande fraktioner med olika molekylvikter användes som experimentmaterial för karakterisering av oligosackarider i detta arbete.
Efter förbehandling och enzymatisk hydrolys förblev persistenta oligosackarider ohydrolyserade.Här (A) är en oligosackaridseparationsmetod där oligosackarider isoleras från AFEX-förbehandlat majsstoverhydrolysat (ACSH) med användning av en packad bädd av aktivt kol och kiselgur;(B) Metod för separation av oligosackarider.Oligosackariderna separerades ytterligare genom storleksexklusionskromatografi (SEC);(C) Sackaridmonomerer och oligomerer frisatta från olika förbehandlingar (utspädd syra: DA, jonisk vätska: IL och AFEX).Enzymatisk hydrolys: hög belastning av fasta ämnen på 25 % (vikt/vikt) (cirka 8 % glukanladdning), 96 timmars hydrolys, 20 mg/g kommersiell enzymbelastning (Ctec2:Htec2:MP-2:1:1-förhållande) och (D) Sockermonomerer och oligomerer av glukos, preosexylos frisatt från AF-majs och frisatt från AF-majs-frisatts från AFS-majs.
Glykananalys har visat sig vara ett användbart verktyg för en omfattande strukturanalys av glykaner i extrakt isolerade från fasta biomassarester.Vattenlösliga sackarider är dock underrepresenterade med denna traditionella metod41 eftersom oligosackarider med låg molekylvikt är svåra att immobilisera på ELISA-plattor och tvättas ut före antikroppstillsats.För antikroppsbindning och karakterisering användes därför en biotinyleringsmetod i ett steg för att belägga lösliga, icke-kompatibla oligosackarider på avidinbelagda ELISA-plattor.Denna metod testades med vår tidigare producerade ACSH och en fraktion baserad på dess molekylvikt (eller polymerisationsgrad, DP).Enstegsbiotinylering användes för att öka oligosackaridbindningsaffiniteten genom att tillsätta biotin-LC-hydrazid till den reducerande änden av kolhydraten (Fig. 2).I lösning reagerar hemiacetalgruppen vid den reducerande änden med hydrazidgruppen av biotin-LC-hydrazid för att bilda en hydrazonbindning.I närvaro av reduktionsmedlet NaCNBH3 reduceras hydrazonbindningen till en stabil biotinylerad slutprodukt.Med modifieringen av den sockerreducerande änden blev bindning av oligosackarider med låg DP till ELISA-plattor möjlig, och i vår studie gjordes detta på avidinbelagda plattor med användning av glykanriktade mAbs.
Screening av monoklonala antikroppar baserad på ELISA för biotinylerade oligosackarider.Här (A) kombinerad biotinylering av oligosackarider och efterföljande ELISA-screening med glykanriktade mAbs på NeutrAvidin-belagda plattor och (B) visar en enstegsprocedur för biotinylering av reaktionsprodukter.
Avidin-belagda plattor med oligosackaridkonjugerade antikroppar sattes sedan till primära och sekundära antikroppar och tvättades i ett ljus- och tidskänsligt medium.När antikroppsbindningen är klar, tillsätt TMB-substrat för att inkubera plattan.Reaktionen stoppades slutligen med svavelsyra.De inkuberade plattorna analyserades med användning av en ELISA-läsare för att bestämma bindningsstyrkan för varje antikropp för att detektera antikroppsspecifik tvärbindning.För detaljer och parametrar för experimentet, se motsvarande avsnitt "Material och metoder".
Vi visar användbarheten av denna nyutvecklade metod för specifika tillämpningar genom att karakterisera de lösliga oligosackarider som finns i ACSH såväl som i råa och renade oligosackaridfraktioner isolerade från lignocellulosahydrolysat.Som visas i figur 3 är de vanligaste epitopsubstituerade xylanerna som identifieras i ACSH med användning av bioacylerade glykomanalysmetoder vanligtvis uron- (U) eller metyluron- (MeU) och pektiska arabinogalaktaner.De flesta av dem hittades också i vår tidigare studie om analys av glykaner av icke-hydrolyserade fasta ämnen (UHS)43.
Detektion av motsträviga oligosackaridepitoper med användning av en monoklonal antikropp riktad mot cellväggens glykan.Den "neutrala" fraktionen är ACN-fraktionen och den "sura" fraktionen är FA-fraktionen.Ljusare röda färger på värmekartan indikerar högre epitopinnehåll, och ljusare blått indikerar en tom bakgrund.Färgvärdena på skalan är baserade på råa OD-värden för formuleringar N=2.De huvudsakliga epitoperna som känns igen av antikropparna visas till höger.
Dessa icke-cellulosastrukturer kunde inte klyvas av de vanligaste cellulaserna och hemicellulaserna i den testade kommersiella enzymblandningen, som inkluderar de vanligast använda kommersiella enzymerna.Därför krävs nya hjälpenzymer för deras hydrolys.Utan de nödvändiga icke-cellulosaaccessoriska enzymerna förhindrar dessa icke-cellulosabindningar fullständig omvandling till monosackarider, även om deras modersockerpolymerer i stor utsträckning hydrolyseras till kortare fragment och löses upp med användning av kommersiella enzymblandningar.
Ytterligare studier av signalfördelning och dess bindningsstyrka visade att bindningsepitoper var lägre i sockerfraktioner med hög DP (A, B, C, DP upp till 20+) än i fraktioner med låg DP (D, E, F, DP) i dimerer) (Fig. 1).Syrafragment är vanligare i icke-cellulosaepitoper än neutrala fragment.Dessa fenomen överensstämmer med mönstret som observerades i vår tidigare studie, där hög DP och syradelar var mer resistenta mot enzymatisk hydrolys.Därför kan närvaron av icke-cellulosaglykanepitoper och U- och MeU-substitutioner i hög grad bidra till oligosackaridernas stabilitet.Det bör noteras att bindnings- och detektionseffektivitet kan vara problematiskt för oligosackarider med låg DP, speciellt om epitopen är en dimer eller trimer oligosackarid.Detta kan testas med användning av kommersiella oligosackarider av olika längder, som var och en innehåller endast en epitop som binder till en specifik mAb.
Således avslöjade användningen av strukturspecifika antikroppar vissa typer av motsträviga bindningar.Beroende på vilken typ av antikropp som används, lämpligt ligeringsmönster och styrkan på signalen som den producerar (mest och minst rikligt), kan nya enzymer identifieras och läggas till semikvantitativt till enzymblandningen för mer fullständig glykokonvertering.Med analysen av ACSH-oligosackarider som exempel kan vi skapa en databas med glykanbindningar för varje biomassamaterial.Det bör noteras här att antikroppars olika affinitet bör beaktas, och om deras affinitet är okänd kommer detta att skapa vissa svårigheter när man jämför signalerna från olika antikroppar.Dessutom kan jämförelse av glykanbindningar fungera bäst mellan prover för samma antikropp.Dessa envisa bindningar kan sedan länkas till CAZyme-databasen, från vilken vi kan identifiera enzymer, välja kandidatenzymer och testa för bindningsbrytande enzymer, eller utveckla mikrobiella system för att uttrycka dessa enzymer för användning i bioraffinaderier44.
För att utvärdera hur immunologiska metoder kompletterar alternativa metoder för att karakterisera lågmolekylära oligosackarider som finns i lignocellulosahydrolysat, utförde vi MALDI (Fig. 4, S1-S8) och analys av TMS-härledda sackarider baserat på GC-MS på samma panel (Fig. 5) oligosackariddel.MALDI används för att jämföra om massfördelningen av oligosackaridmolekyler matchar den avsedda strukturen.På fig.4 visar MC för de neutrala komponenterna ACN-A och ACN-B.ACN-A-analys bekräftade en rad pentossocker från DP 4-8 (Fig. 4) till DP 22 (Fig. S1), vars vikter motsvarar MeU-xylanoligosackarider.ACN-B-analys bekräftade pentos- och glukoxylanserien med DP 8-15.I tilläggsmaterial som figur S3 visar kartor över FA-C sura delmassfördelningskartor en rad (Me)U-substituerade pentossocker med en DP på ​​8-15 som överensstämmer med de substituerade xylanerna som finns i ELISA-baserad mAb-screening.Epitoperna är konsekventa.
MALDI-MS-spektrum av lösliga icke-kompatibla oligosackarider som finns i ACS.Här, (A) ACN-A lågviktsfraktioner innehållande metylerad uronsyra (DP 4-8) substituerade glukuroxylanoligosackarider och (B) ACN-B xylan och metylerade uronsyraoligosackarider substituerade med glukuroxylan (DP 8-15).
Analys av sammansättningen av glykanresten av eldfasta oligosackarider.Här (A) TMS-sackaridsammansättning av olika oligosackaridfraktioner erhållna med GC-MS-analys.(B) Strukturer av olika TMS-härledda sockerarter som finns i oligosackarider.ACN – acetonitrilfraktion som innehåller neutrala oligosackarider och FA – ferulsyrafraktion som innehåller sura oligosackarider.
En annan intressant slutsats drogs från LC-MS-analysen av oligosackaridfraktionen, som visas i figur S9 (metoder kan ses i det elektroniska tilläggsmaterialet).Fragment av hexos- och -OAc-grupper observerades upprepade gånger under ligering av ACN-B-fraktionen.Detta fynd bekräftar inte bara fragmenteringen som observerats i glykom- och MALDI-TOF-analys, utan ger också ny information om potentiella kolhydratderivat i förbehandlad lignocellulosabiomassa.
Vi analyserade också sockersammansättningen av oligosackaridfraktionen med hjälp av TMS-sockerderivatisering.Med hjälp av GC-MS bestämde vi sammansättningen av neurala (icke-derivat) och sura sockerarter (GluA och GalA) i oligosackaridfraktionen (Fig. 5).Glukuronsyra finns i sura komponenter C och D, medan galakturonsyra finns i sura komponenter A och B, som båda är komponenter med hög DP av sura sockerarter.Dessa resultat bekräftar inte bara våra ELISA- och MALDI-data, utan överensstämmer också med våra tidigare studier av oligosackaridackumulering.Därför tror vi att moderna immunologiska metoder som använder biotinylering av oligosackarider och efterföljande ELISA-screening är tillräckliga för att detektera lösliga motsträviga oligosackarider i olika biologiska prover.
Eftersom ELISA-baserade mAb-screeningsmetoder har validerats med flera olika metoder, ville vi ytterligare utforska potentialen för denna nya kvantitativa metod.Två kommersiella oligosackarider, xylohexasackarid-oligosackarid (XHE) och 23-a-L-arabinofuranosyl-xylotrios (A2XX), köptes och testades med användning av en ny mAb-metod riktad mot cellväggsglykanen.Figur 6 visar en linjär korrelation mellan den biotinylerade bindningssignalen och log-koncentrationen av oligosackaridkoncentration, vilket antyder en möjlig Langmuir-adsorptionsmodell.Bland mAbs korrelerade CCRC-M137, CCRC-M138, CCRC-M147, CCRC-M148 och CCRC-M151 med XHE, och CCRC-M108, CCRC-M109 och LM11 korrelerade med A2XX över ett intervall av 100n namno.På grund av den begränsade tillgängligheten av antikroppar under experimentet, utfördes begränsade experiment med varje oligosackaridkoncentration.Det bör noteras här att vissa antikroppar reagerar mycket olika på samma oligosackarid som ett substrat, förmodligen för att de binder till något olika epitoper och kan ha mycket olika bindningsaffiniteter.Mekanismerna och implikationerna av exakt epitopidentifiering kommer att bli mycket mer komplexa när den nya mAb-metoden tillämpas på verkliga prover.
Två kommersiella oligosackarider användes för att bestämma detektionsintervallet för olika glykaninriktade mAbs.Här indikerar linjära korrelationer med log-koncentrationen av oligosackaridkoncentrationen Langmuirs adsorptionsmönster för (A) XHE med mAb och (B) A2XX med mAb.Motsvarande epitop indikerar strukturerna för de kommersiella oligosackarider som används som substrat i analysen.
Användningen av glykaninriktade monoklonala antikroppar (glykokomisk analys eller ELISA-baserad mAb-screening) är ett kraftfullt verktyg för djupgående karakterisering av de flesta av de viktigaste cellväggsglykanerna som utgör växtbiomassa.Klassisk glykananalys karakteriserar dock endast glykaner med större cellväggar, eftersom de flesta oligosackarider inte är effektivt immobiliserade på ELISA-plattor.I denna studie hydrolyserades AFEX-förbehandlad majsstover enzymatiskt vid en hög torrhalt.Sockeranalys användes för att bestämma sammansättningen av motsträviga cellväggskolhydrater i hydrolysatet.MAb-analys av mindre oligosackarider i hydrolysat är dock underskattad, och ytterligare verktyg behövs för att effektivt immobilisera oligosackarider på ELISA-plattor.
Vi rapporterar här en ny och effektiv oligosackaridimmobiliseringsmetod för mAb-screening genom att kombinera oligosackaridbiotinylering följt av ELISA-screening på NeutrAvidin™-belagda plattor.De immobiliserade biotinylerade oligosackariderna visade tillräcklig affinitet för antikroppen för att möjliggöra snabb och effektiv detektering av motsträviga oligosackarider.Analys av sammansättningen av dessa envisa oligosackarider baserad på masspektrometri bekräftade resultaten av denna nya metod för immunoscreening.Således visar dessa studier att kombinationen av oligosackaridbiotinylering och ELISA-screening med glykaninriktade monoklonala antikroppar kan användas för att detektera tvärbindningar i oligosackarider och kan användas i stor utsträckning i andra biokemiska studier som karakteriserar strukturen av oligosackarider.
Denna biotinbaserade glykanprofileringsmetod är den första rapporten som kan undersöka de motsträviga kolhydratbindningarna av lösliga oligosackarider i växtbiomassa.Detta hjälper till att förstå varför vissa delar av biomassa är så envisa när det gäller produktion av biobränsle.Denna metod fyller en viktig lucka i glykomanalysmetoder och utökar dess tillämpning till ett bredare spektrum av substrat bortom växtoligosackarider.I framtiden kan vi komma att använda robotteknik för biotinylering och använda den metod vi har utvecklat för högkapacitetsanalys av prover med hjälp av ELISA.
Majshalm (CS) odlat från Pioneer 33A14 hybridfrön skördades 2010 från Kramer Farms i Ray, Colorado.Med markägarens tillstånd kan denna biomassa användas för forskning. Proverna förvarades torrt < 6 % fukt i zip-lock-påsar i rumstemperatur. Proverna förvarades torrt < 6 % fukt i zip-lock-påsar i rumstemperatur. Optimera betalningar för anläggningar < 6 % i paket med byggnadsautomater. Prover förvarades torrt vid <6% fuktighet i dragkedjeförsedda påsar vid rumstemperatur.样品在室温下以干燥< 6% 的水分储存在自封袋中。样品在室温下以干燥< 6 % Tjänster försörjs med anläggningar och anläggningar som har en strömförsörjning med < 6 %. Proverna förvaras i blixtlåspåsar i rumstemperatur med luftfuktighet < 6 %.Studien följde lokala och nationella riktlinjer.Sammansättningsanalys utfördes med användning av NREL-protokollet.Kompositionen visade sig innehålla 31,4 % glukan, 18,7 % xylan, 3,3 % arabinan, 1,2 % galaktan, 2,2 % acetyl, 14,3 % lignin, 1,7 % protein och 13,4 % aska.
Cellic® CTec2 (138 mg protein/ml, parti VCNI 0001) är en komplex blandning av cellulas, β-glukosidas och Cellic® HTec2 (157 mg protein/ml, parti VHN00001) från Novozymes (Franklinton, NC, USA)).Multifect Pectinase® (72 mg protein/ml), en komplex blandning av pektinnedbrytande enzymer, donerades av DuPont Industrial Biosciences (Palo Alto, CA, USA).Enzymproteinkoncentrationer bestämdes genom att uppskatta proteininnehåll (och subtrahera bidraget från icke-proteinkväve) med användning av Kjeldahl-kväveanalys (AOAC-metod 2001.11, Dairy One Cooperative Inc., Ithaca, NY, USA).Kiselgur 545 köptes från EMD Millipore (Billerica, MA).Aktivt kol (DARCO, 100 mesh granulat), Avicel (PH-101), bokxylan och alla andra kemikalier köptes från Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).
AFEX-förbehandling utfördes vid GLBRC (Biomass Conversion Research Laboratory, MSU, Lansing, MI, USA).Förbehandling utfördes vid 140°C under 15 minuter.46 uppehållstid vid 1:1 förhållande vattenfri ammoniak till biomassa vid 60 % (vikt/vikt) laddning i en bänkreaktor av rostfritt stål (Parr Instruments Company).Det tog 30 minuter.Reaktorn bringades till 140°C och ammoniaken frigjordes snabbt, vilket tillät biomassan att snabbt återgå till rumstemperatur.Sammansättningen av AFEX pre-treated corn stover (ACS) liknade den för obehandlad corn stover (UT-CS).
ACSH 25 % (vikt/vikt) med hög fast substans (ungefär 8 % dextranladdning) framställdes som ett utgångsmaterial för storskalig produktion av oligosackarider.Enzymatisk hydrolys av ACS utfördes med användning av en kommersiell enzymblandning inklusive Cellic® Ctec2 10 mg protein/g glukan (i förbehandlad biomassa), Htec2 (Novozymes, Franklinton, NC), 5 mg protein/g glukan och Multifect Pectinase (Genencor Inc, USA).).5 mg protein/g dextran.Enzymatisk hydrolys utfördes i en 5-liters bioreaktor med en arbetsvolym på 3 liter, pH 4,8, 50°C och 250 rpm.Efter hydrolys under 96 timmar uppsamlades hydrolysatet genom centrifugering vid 6000 rpm under 30 minuter och sedan vid 14000 rpm under 30 minuter för att avlägsna ohydrolyserade fasta ämnen.Hydrolysatet utsattes sedan för sterilfiltrering genom en 0,22 mm filterbägare.Det filtrerade hydrolysatet lagrades i sterila flaskor vid 4°C och fraktionerades sedan på kol.
Analys av sammansättningen av extraktbaserade biomassaprover enligt NREL laboratorieanalysprocedurer: beredning av prover för sammansättningsanalys (NREL/TP-510-42620) och bestämning av strukturella kolhydrater och lignin i biomassa (NREL/TP-510 – 42618)47.
Oligosackaridanalys av hydrolysatströmmen utfördes i en 2 ml skala med användning av en autoklavbaserad syrahydrolysmetod.Blanda hydrolysatprovet med 69,7 µl 72 % svavelsyra i ett 10 ml odlingsrör med skruvkork och inkubera i 1 timme på en bänk vid 121 °C, kyl på is och filtrera in i en flaska med högpresterande vätskekromatografi (HPLC).Koncentrationen av oligosackarider bestämdes genom att subtrahera koncentrationen av monosackarider i det icke-hydrolyserade provet från den totala sockerkoncentrationen i det syrahydrolyserade provet.
Glukos-, xylos- och arabinoskoncentrationer i den syrahydrolyserade biomassan analyserades med användning av ett Shimadzu HPLC-system utrustat med en autosampler, kolonnvärmare, isokratisk pump och brytningsindexdetektor på en Bio-Rad Aminex HPX-87H-kolonn.Kolonnen hölls vid 50°C och eluerades med 0,6 ml/min 5 mM H2S04 i vatten.flöde.
Hydrolysatsupernatanten späddes ut och analyserades med avseende på monomer- och oligosackaridhalt.Monomera sockerarter erhållna efter enzymatisk hydrolys analyserades med HPLC utrustad med en Bio-Rad (Hercules, CA) Aminex HPX-87P-kolonn och en askskyddskolonn.Kolonntemperaturen hölls vid 80°C, vatten användes som den mobila fasen med en flödeshastighet av 0,6 ml/min.Oligosackarider bestämdes genom hydrolys i utspädd syra vid 121°C enligt metoderna som beskrivs i ref.41, 48, 49.
Sackaridanalys utfördes på rå, AFEX-förbehandlade och alla icke-hydrolyserade biomassarester (inklusive produktion av seriella cellväggsextrakt och deras mAb-screening) med användning av tidigare beskrivna procedurer 27, 43, 50, 51.För glykomanalys framställs alkohololösliga rester av växtcellväggsmaterial från biomassarester och utsätts för serieextraktion med allt mer aggressiva reagens såsom ammoniumoxalat (50 mM), natriumkarbonat (50 mM och 0,5 % w/v), CON.(1M och 4M, båda med 1% vikt/volym natriumborhydrid) och syraklorit som tidigare beskrivits52,53.Extrakten utsattes sedan för ELISA mot en komplex panel av mAb50s riktade mot cellväggsglykanen, och mAb-bindningsreaktionerna presenterades som en värmekarta.mAbs riktade mot växtcellväggglykan köptes från laboratorielager (CCRC-, JIM- och MAC-serier).
Enstegsbiotinylering av oligosackarider.Konjugeringen av kolhydrater med biotin-LC-hydrazid utfördes med användning av följande procedur.Biotin-LC-hydrazid (4,6 mg/12 μmol) löstes i dimetylsulfoxid (DMSO, 70 μl) genom kraftig omrörning och upphettning vid 65°C under 1 min.Isättika (30 µl) tillsattes och blandningen hälldes på natriumcyanoborhydrid (6,4 mg/100 µmol) och löstes fullständigt efter upphettning vid 65°C under cirka 1 minut.Sedan sattes från 5 till 8 μl av reaktionsblandningen till den torkade oligosackariden (1-100 nmol) för att erhålla ett 10-faldigt eller mer molärt överskott av märkningen över den reducerande änden.Reaktionen utfördes vid 65°C under 2 timmar, varefter proverna omedelbart renades.Ingen natriumcyanoborhydrid användes i märkningsexperimenten utan reduktion, och proverna fick reagera vid 65°C under 2,5 timmar.
ELISA-beläggning och tvättning av prover av biotinylerade oligosackarider.25 μl biotinylerade prover (100 μl av varje koncentrerat prov utspätt i 5 ml 0,1 M Tris-buffertlösning (TBS)) sattes till varje brunn på den avidinbelagda plattan.Kontrollbrunnar belades med 50 μl biotin i en koncentration av 10 μg/ml i 0,1 M TBS.Avjoniserat vatten användes som beläggning för blankmätningar.Tabletten inkuberades i 2 timmar vid rumstemperatur i mörker.Tvätta plattan 3 gånger med 0,1 % skummjölk i 0,1 M TBS med program nr.11 för Grenier lägenhet 3A.
Tillsats och tvättning av primära antikroppar.Tillsätt 40 µl primär antikropp till varje brunn.Inkubera mikroplattan i 1 timme i rumstemperatur i mörker.Plattorna tvättades sedan 3 gånger med 0,1 % mjölk i 0,1 M TBS med användning av tvättprogram #11 för Grenier Flat 3A.
Tillsätt sekundär antikropp och tvätta.Tillsätt 50 µl sekundär antikropp från mus/råtta (utspädd 1:5000 i 0,1 % mjölk i 0,1 M TBS) till varje brunn.Inkubera mikroplattan i 1 timme i rumstemperatur i mörker.Mikroplattorna tvättades sedan 5 gånger med 0,1 % mjölk i 0,1 M TBS med användning av Grenier Flat 5A platttvättprogram #12.
Lägga till ett substrat.Tillsätt 50 µl 3,3′,5,5′-tetrametylbensidin (TMB) till bassubstratet (genom att tillsätta 2 droppar buffert, 3 droppar TMB, 2 droppar väteperoxid till 15 ml avjoniserat vatten).Förbered TMB-substratet.och vortexa före användning).Inkubera mikroplattan vid rumstemperatur i 30 minuter.I mörkret.
Slutför steget och läs surfplattan.Tillsätt 50 µl 1 N svavelsyra till varje brunn och registrera absorbansen från 450 till 655 nm med hjälp av en ELISA-läsare.
Bered 1 mg/ml lösningar av dessa analyter i avjoniserat vatten: arabinos, ramnos, fukos, xylos, galakturonsyra (GalA), glukuronsyra (GlcA), mannos, glukos, galaktos, laktos, N-acetylmannosamin (manNAc), N-acetylglukosamin.(glcNAc), N-acetylgalaktosamin (galNAc), inositol (intern standard).Två standarder framställdes genom att tillsätta 1 mg/ml sockerlösningar som visas i Tabell 1. Prover fryses och lyofiliseras vid -80°C tills allt vatten har avlägsnats (vanligtvis ca 12-18 timmar).
Tillsätt 100–500 µg prov till skruvlocksrör på en analytisk våg.Anteckna det tillsatta beloppet.Det är bäst att lösa provet i en specifik koncentration av lösningsmedel och tillsätta det till röret som en flytande alikvot.Använd 20 µl 1 mg/ml inositol som intern standard för varje provrör.Mängden intern standard som tillsätts till provet måste vara densamma som mängden intern standard som tillsätts till standardröret.
Tillsätt 8 ml vattenfri metanol till en flaska med skruvlock.Därefter 4 ml 3 N metanolisk HCl-lösning, förseglad och skakad.Denna process använder inte vatten.
Tillsätt 500 µl 1 M HCl-metanollösning till oligosackaridproverna och standard TMS-rör.Prover inkuberades över natten (168 timmar) vid 80°C i ett termiskt block.Torka metanolysprodukten vid rumstemperatur med användning av ett torkrör.Tillsätt 200 µl MeOH och torka igen.Denna process upprepas två gånger.Tillsätt 200 µl metanol, 100 µl pyridin och 100 µl ättiksyraanhydrid till provet och blanda väl.Prover inkuberades vid rumstemperatur under 30 minuter.och torkades.Tillsätt 200 µl metanol och torka igen.
Tillsätt 200 µl Tri-Sil och värm röret med lock i 20 minuter.80°C, kyldes sedan till rumstemperatur.Använd ett torkrör för att ytterligare torka provet till en volym av cirka 50 µl.Det är viktigt att notera att vi inte lät proverna torka helt.
Tillsätt 2 ml hexan och blanda väl genom att vortexa.Fyll spetsarna på Pasteurpipetter (5-8 mm) med en bit glasull genom att föra in glasullen ovanpå en pipett med en diameter på 5-3/4 tum.Prover centrifugerades vid 3000 g under 2 minuter.Eventuella olösliga rester fälls ut.Torka provet till 100-150 µl.En volym på cirka 1 μl injicerades i GC-MS vid en initial temperatur på 80 ° C och en initial tid på 2,0 minuter (tabell 2).