Salamat sa pagbisita sa Nature.com.Ang bersyon sa browser nga imong gigamit adunay limitado nga suporta sa CSS.Alang sa labing kaayo nga kasinatian, among girekomenda nga mogamit ka usa ka bag-ong browser (o i-disable ang Compatibility Mode sa Internet Explorer).Sa kasamtangan, aron masiguro ang padayon nga suporta, among ihatag ang site nga walay mga estilo ug JavaScript.
Bag-ong immunological ug mass spectrometric nga mga pamaagi alang sa komplikadong pag-analisa sa padayon nga oligosaccharides sa corn stover nga pretreated sa AFEX.Ang Lignocellulosic biomass usa ka malungtarong alternatibo sa fossil fuel ug kaylap nga gigamit sa pagpalambo sa biotechnologies alang sa produksyon sa mga produkto sama sa pagkaon, feed, fuel ug kemikal.Ang yawe sa kini nga mga teknolohiya mao ang pag-uswag sa mga proseso nga kompetisyon sa gasto alang sa pag-convert sa mga komplikado nga carbohydrates nga anaa sa mga bungbong sa selula sa tanum ngadto sa yano nga mga asukal sama sa glucose, xylose ug arabinose.Tungod kay ang lignoscellulosic biomass gahi kaayo, kinahanglan nga ipailalom kini sa thermochemical treatments (eg, ammonia fiber exfoliation (AFEX), dilute acids (DA), ionic liquids (IL)) ug biological treatments (eg, enzymatic hydrolysis ug microbial fermentation) sa kombinasyon aron makuha ang gusto nga produkto..Bisan pa, kung ang komersyal nga fungal enzymes gigamit sa proseso sa hydrolysis, 75-85% ra sa mga matunaw nga asukal nga naporma mga monosaccharides, ug ang nahabilin nga 15-25% mga matunaw, dili mabalhin nga oligosaccharides, nga dili kanunay magamit sa mga microorganism.Kaniadto, malampuson namong gilain ug giputli ang matunaw nga gahi nga oligosaccharides gamit ang kombinasyon sa carbon ug diatomaceous earth separation ug size exclusion chromatography, ug gisusi usab ang ilang enzyme inhibitory properties.Among nakaplagan nga ang mga oligosaccharides nga adunay mas taas nga lebel sa polymerization (DP) methylated uronic acid substitutions mas lisod iproseso sa commercial enzyme blends kay sa ubos nga DP ug neutral oligosaccharides.Dinhi among gitaho ang paggamit sa daghang dugang nga mga pamaagi, lakip ang glycan profiling gamit ang monoclonal antibodies (mAbs) nga espesipiko sa pagtanom og biomass glycans aron mahulagway ang glycan bonds sa mga bungbong sa selula sa tanom ug enzymatic hydrolysates, matrix-assisted laser desorption ionization, time-of-flight mass-spectrometry..Ang MALDI-TOF-MS) naggamit sa structure-informative diagnostic peaks nga nakuha pinaagi sa spectroscopy human sa secondary decay sa mga negatibong ions, gas chromatography ug mass spectrometry (GC-MS) aron mahulagway ang oligosaccharide bond nga adunay ug walay derivatization.Tungod sa gamay nga gidak-on sa oligosaccharides (DP 4-20), kini nga mga molekula lisod gamiton alang sa mAb binding ug characterization.Aron mabuntog kini nga problema, gipadapat namo ang usa ka bag-ong biotin conjugation-based oligosaccharide immobilization nga pamaagi nga malampuson nga nagmarka sa kadaghanan sa ubos nga DP nga matunaw nga oligosaccharides sa ibabaw sa microplate, nga gigamit dayon sa usa ka taas nga throughput nga mAb nga sistema alang sa piho nga pagtuki sa ligation.Kini nga bag-ong pamaagi makapadali sa pag-uswag sa labi ka abante nga high throughput glycome assays sa umaabot nga magamit aron ihimulag ug mailhan ang mga oligosaccharides nga naa sa mga biomarker alang sa mga katuyoan sa pagdayagnos.
Lignocellulosic biomass, nga gilangkuban sa agrikultura, kalasangan, sagbot ug kahoy nga mga materyales, usa ka potensyal nga feedstock alang sa produksyon sa bio-based nga mga produkto, lakip na ang pagkaon, feed, sugnod ug kemikal nga precursors sa paghimo sa mas taas nga bili nga mga produkto1.Ang mga carbohydrate (sama sa cellulose ug hemicellulose) nga anaa sa mga bungbong sa selula sa tanom ma-depolymerized ngadto sa monosaccharides pinaagi sa kemikal nga pagproseso ug biotransformation (sama sa enzymatic hydrolysis ug microbial fermentation).Ang kasagarang pre-treatment naglakip sa ammonia fiber expansion (AFEX), dilute acid (DA), ionic liquid (IL), ug steam explosion (SE), nga naggamit sa kombinasyon sa mga kemikal ug kainit aron makunhuran ang produksiyon sa lignoselulo pinaagi sa pag-abli sa mga bungbong sa selula sa tanom3,4.katig-a sa materya, 5. Ang enzymatic hydrolysis gihimo sa taas nga solido nga load gamit ang commercial active carbohydrate-containing enzymes (CAZymes) ug microbial fermentation gamit ang transgenic yeasts o bacteria aron makagama og bio-based fuels ug chemicals 6 .
Ang mga CAZyme sa komersyal nga mga enzyme gilangkuban sa usa ka komplikado nga sagol nga mga enzyme nga synergistically nagputol sa komplikado nga carbohydrate-sugar bonds aron mahimong monosaccharides2,7.Sama sa among gitaho sa sayo pa, ang komplikado nga network sa mga aromatic polymers sa lignin nga adunay mga carbohydrates naghimo kanila nga dili kaayo mapugngan, nga nagdala sa dili kompleto nga pagkakabig sa asukal, nga nagtigum sa 15-25% sa sex oligosaccharides nga wala gihimo sa panahon sa enzymatic hydrolysis sa pretreated biomass.Kini usa ka sagad nga problema sa lainlaing mga pamaagi sa pretreatment sa biomass.Ang pipila ka mga rason alang niini nga bottleneck naglakip sa enzyme inhibition sa panahon sa hydrolysis, o ang pagkawala o ubos nga lebel sa importante nga mga enzyme nga gikinahanglan aron maputol ang mga sugar bond sa biomass sa tanum.Ang pagsabut sa komposisyon ug istruktura nga mga kinaiya sa mga asukal, sama sa mga bugkos sa asukal sa oligosaccharides, makatabang kanato nga mapauswag ang pagkakabig sa asukal sa panahon sa hydrolysis, nga maghimo sa mga proseso sa biotechnological nga kompetisyon sa gasto sa mga produkto nga nakuha sa petrolyo.
Ang pagtino sa istruktura sa carbohydrates mahagiton ug nagkinahanglan ug kombinasyon sa mga pamaagi sama sa liquid chromatography (LC)11,12, nuclear magnetic resonance spectroscopy (NMR)13, capillary electrophoresis (CE)14,15,16 ug mass spectrometry (MS)17., napulog walo.Ang mga pamaagi sa MS sama sa time-of-flight mass spectrometry nga adunay laser desorption ug ionization gamit ang matrix (MALDI-TOF-MS) usa ka versatile nga pamaagi sa pag-ila sa mga istruktura sa carbohydrate.Bag-ohay lang, ang Collision-Induced Dissociation (CID) tandem MS sa sodium ion adducts kay kaylap nga gigamit sa pag-ila sa mga fingerprint nga katumbas sa oligosaccharide attachment positions, anomeric configurations, sequences, ug branching positions 20, 21.
Ang pag-analisa sa glycan usa ka maayo kaayo nga himan alang sa lawom nga pag-ila sa mga bugkos sa carbohydrate22.Kini nga pamaagi naggamit sa monoclonal antibodies (mAbs) nga gitumong sa pagtanom sa cell wall glycan isip mga pagsusi aron masabtan ang komplikadong carbohydrate linkages.Labaw sa 250 mAbs anaa sa tibuok kalibutan, gidisenyo batok sa nagkalain-laing linear ug branched oligosaccharides gamit ang nagkalain-laing saccharides24.Daghang mga mAb ang kaylap nga gigamit aron mailhan ang istruktura, komposisyon, ug mga pagbag-o sa dingding sa selula sa tanum, tungod kay adunay daghang mga kalainan depende sa tipo sa selula sa tanum, organ, edad, yugto sa paglambo, ug palibot sa pagtubo25,26.Bag-ohay lang, kini nga pamaagi gigamit aron masabtan ang mga populasyon sa vesicle sa mga sistema sa tanum ug hayop ug ang ilang tagsa-tagsa nga mga papel sa transportasyon sa glycan ingon nga gitino sa mga subcellular marker, mga yugto sa pag-uswag, o pagpukaw sa kinaiyahan, ug aron mahibal-an ang kalihokan sa enzymatic.Pipila sa lain-laing mga istruktura sa glycans ug xylans nga nailhan naglakip sa pectin (P), xylan (X), mannan (M), xyloglucans (XylG), mixed bond glucans (MLG), arabinoxylan (ArbX), galactomannan (GalG) , glucuronic acid-arabinoxylan (GArbXgaan) ug arabinoxylan (GArbXga29).
Bisan pa, bisan pa niining tanan nga mga paningkamot sa panukiduki, pipila lamang ka mga pagtuon ang naka-focus sa kinaiya sa oligosaccharide accumulation sa panahon sa high solids load (HSL) hydrolysis, lakip ang oligosaccharide release, oligomeric chain nga mga kausaban sa panahon sa hydrolysis, nagkalain-laing ubos nga DP polymers, ug ang ilang mga kurba.apod-apod 30,31,32.Samtang, bisan kung ang pag-analisar sa glycan napamatud-an nga usa ka mapuslanon nga himan alang sa usa ka komprehensibo nga pag-analisar sa istruktura sa glycan, lisud ang pagtimbang-timbang sa matunaw sa tubig nga ubos nga DP oligosaccharides gamit ang mga pamaagi sa antibody.Ang gagmay nga DP oligosaccharides nga adunay gibug-aton nga molekula nga ubos sa 5-10 kDa dili mogapos sa mga plato sa ELISA 33, 34 ug mahugasan sa wala pa pagdugang sa antibody.
Dinhi, sa unang higayon, gipakita namo ang usa ka ELISA assay sa avidin-coated plates gamit ang monoclonal antibodies, nga naghiusa sa usa ka lakang nga biotinylation procedure alang sa soluble refractory oligosaccharides nga adunay glycome analysis.Ang among pamaagi sa pag-analisa sa glycome gi-validate sa MALDI-TOF-MS ug GC-MS nga gibase sa pag-analisar sa mga komplementaryong oligosaccharide linkage gamit ang trimethylsilyl (TMS) derivatization sa hydrolyzed sugar compositions.Kini nga bag-ong pamaagi mahimong maugmad ingon nga usa ka high-throughput nga pamaagi sa umaabot ug makit-an ang mas lapad nga aplikasyon sa biomedical nga panukiduki35.
Ang post-translational nga mga pagbag-o sa mga enzyme ug antibodies, sama sa glycosylation,36 makaapekto sa ilang biological nga kalihokan.Pananglitan, ang mga pagbag-o sa glycosylation sa serum nga mga protina adunay importante nga papel sa makapahubag nga arthritis, ug ang mga pagbag-o sa glycosylation gigamit isip diagnostic marker37.Nagkalainlain nga glycans ang gitaho sa literatura nga dali nga makita sa lainlaing mga sakit, lakip ang mga laygay nga makapahubag nga mga sakit sa gastrointestinal tract ug atay, mga impeksyon sa virus, ovarian, suso, ug mga kanser sa prostate38,39,40.Ang pagsabut sa istruktura sa mga glycan gamit ang antibody-based glycan ELISA nga mga pamaagi maghatag dugang nga pagsalig sa pagdayagnos sa sakit nga wala gigamit ang komplikado nga mga pamaagi sa MS.
Ang among miaging pagtuon nagpakita nga ang matig-a nga oligosaccharides nagpabilin nga unhydrolyzed pagkahuman sa pretreatment ug enzymatic hydrolysis (Figure 1).Sa nauna namong gimantala nga trabaho, nakahimo mi og activated charcoal solid-phase extraction method aron ihimulag ang oligosaccharides gikan sa AFEX-pretreated corn stover hydrolyzate (ACSH)8.Pagkahuman sa inisyal nga pagkuha ug pagbulag, ang mga oligosaccharides dugang nga gibahin sa gidak-on nga eksklusyon chromatography (SEC) ug gikolekta sa han-ay sa gibug-aton sa molekula.Ang mga monomer sa asukal ug mga oligomer nga gipagawas gikan sa lainlaing mga pretreatment gisusi pinaagi sa pag-analisar sa komposisyon sa asukal.Kung itandi ang sulud sa mga oligomer sa asukal nga nakuha sa lainlaing mga pamaagi sa pretreatment, ang presensya sa gahi nga oligosaccharides usa ka sagad nga problema sa pagbag-o sa biomass sa monosaccharides ug mahimong mosangput sa pagkunhod sa ani sa asukal nga labing menos 10-15% ug bisan hangtod sa 18%.US.Kini nga pamaagi gigamit alang sa dugang nga dinagkong produksiyon sa oligosaccharide fractions.Ang resulta nga ACH ug ang sunod-sunod nga mga fraction niini nga adunay lain-laing mga molekular nga gibug-aton gigamit ingon nga eksperimento nga materyal alang sa kinaiya sa oligosaccharides niini nga buhat.
Human sa pretreatment ug enzymatic hydrolysis, ang padayon nga oligosaccharides nagpabilin nga unhydrolysed.Dinhi ang (A) usa ka pamaagi sa pagbulag sa oligosaccharide diin ang oligosaccharides gilain gikan sa AFEX-pretreated corn stover hydrolyzate (ACSH) gamit ang usa ka packed bed sa activated carbon ug diatomaceous earth;(B) Pamaagi sa pagbulag sa oligosaccharides.Ang mga oligosaccharides dugang nga gibulag pinaagi sa gidak-on nga eksklusyon chromatography (SEC);(C) Saccharide monomers ug oligomer nga gipagawas gikan sa nagkalain-laing pretreatment (diluted acid: DA, ionic liquid: IL ug AFEX).Kondisyon sa Enzymatic hydrolysis: taas nga solido nga loading nga 25% (w/w) (gibana-bana nga 8% glucan loading), 96 oras nga hydrolysis, 20 mg/g commercial enzyme loading (Ctec2:Htec2:MP-2:1:1 ratio) ug ( D) Sugar monomers ug oligomer sa glucose, xylose ug arabinose-gipagawas gikan sa AFEX presttreated nga AFEX .
Ang pag-analisa sa Glycan napamatud-an nga usa ka mapuslanon nga himan alang sa usa ka komprehensibo nga pagtuki sa istruktura sa mga glycans sa mga extract nga nahimulag gikan sa solidong biomass residues.Bisan pa, ang mga saccharides nga matunaw sa tubig wala kaayo girepresentahan gamit kini nga tradisyonal nga pamaagi41 tungod kay ang ubos nga gibug-aton sa molekula nga oligosaccharides lisud nga ma-immobilize sa mga plato sa ELISA ug mahugasan sa wala pa pagdugang sa antibody.Busa, alang sa antibody binding ug characterization, usa ka lakang nga biotinylation nga pamaagi ang gigamit sa pagsul-ob sa mga soluble, non-compliant nga oligosaccharides sa avidin-coated ELISA plates.Kini nga pamaagi gisulayan gamit ang among gihimo kaniadto nga ACSH ug usa ka tipik base sa gibug-aton sa molekula niini (o degree sa polymerization, DP).Ang usa ka lakang nga biotinylation gigamit aron madugangan ang oligosaccharide binding affinity pinaagi sa pagdugang sa biotin-LC-hydrazide sa pagkunhod sa tumoy sa carbohydrate (Fig. 2).Sa solusyon, ang hemiacetal nga grupo sa pagkunhod sa katapusan mo-react sa hydrazide nga grupo sa biotin-LC-hydrazide aron maporma ang hydrazone bond.Sa presensya sa pagkunhod sa ahente nga NaCNBH3, ang hydrazone bond gipakunhod ngadto sa usa ka lig-on nga biotinylated nga katapusan nga produkto.Uban sa pagbag-o sa katapusan sa pagkunhod sa asukal, ang pagbugkos sa ubos nga DP oligosaccharides sa mga plato sa ELISA nahimong posible, ug sa among pagtuon kini gihimo sa avidin-coated plates gamit ang glycan-targeted mAbs.
Pagsusi sa monoclonal antibodies base sa ELISA alang sa biotinylated oligosaccharides.Dinhi (A) hiniusa nga biotinylation sa oligosaccharides ug sunod nga ELISA screening nga adunay glycan-targeted mAbs sa NeutrAvidin coated plates ug (B) nagpakita sa usa ka lakang nga pamaagi alang sa biotinylation sa mga produkto sa reaksyon.
Ang mga plato nga adunay sapaw sa Avidin nga adunay oligosaccharide-conjugated antibodies unya gidugang sa panguna ug sekondaryang mga antibodies ug gihugasan sa usa ka medium nga sensitibo sa kahayag ug oras.Human makompleto ang pagbugkos sa antibody, idugang ang TMB substrate aron malumlom ang plato.Ang reaksyon sa katapusan nahunong sa sulfuric acid.Ang mga incubated plates gisusi gamit ang ELISA reader aron mahibal-an ang kalig-on sa pagbugkos sa matag antibody aron mahibal-an ang antibody-specific nga cross-linking.Alang sa mga detalye ug mga parameter sa eksperimento, tan-awa ang katugbang nga seksyon nga "Mga Materyal ug Pamaagi".
Gipakita namo ang kapuslanan niining bag-ong naugmad nga pamaagi alang sa piho nga mga aplikasyon pinaagi sa pag-ila sa matunaw nga oligosaccharides nga anaa sa ACSH ingon man sa krudo ug giputli nga oligosaccharide nga mga tipik nga nahimulag gikan sa lignoscellulosic hydrolysates.Ingon sa gipakita sa Figure 3, ang labing komon nga epitope-substituted xylans nga giila sa ACSH gamit ang bioacylated glycome assay nga mga pamaagi kasagaran uronic (U) o methyluronic (MeU) ug pectic arabinogalactans.Kadaghanan kanila nakit-an usab sa among miaging pagtuon sa pagtuki sa glycans sa non-hydrolyzed solids (UHS)43.
Detection sa recalcitrant oligosaccharide epitopes gamit ang monoclonal antibody nga gitumong sa cell wall glycan.Ang "neutral" nga fraction mao ang ACN fraction ug ang "acidic" fraction mao ang FA fraction.Ang mas hayag nga pula sa heatmap nagpaila sa mas taas nga sulod sa epitope, ug ang mas hayag nga asul nagpaila sa blangko nga background.Ang mga kantidad sa kolor sa sukdanan gibase sa hilaw nga mga kantidad sa OD alang sa mga pormulasyon N=2.Ang mga nag-unang epitope nga giila sa mga antibodies gipakita sa tuo.
Kini nga mga non-cellulose nga istruktura dili mabuak sa kasagarang mga selula ug hemicellulase sa gisulayan nga commercial enzyme mixture, nga naglakip sa labing kasagarang gigamit nga commercial enzymes.Busa, gikinahanglan ang bag-ong auxiliary enzymes alang sa ilang hydrolysis.Kung wala ang gikinahanglan nga non-cellulose accessory enzymes, kini nga mga non-cellulose bonds makapugong sa hingpit nga pagkakabig ngadto sa monosaccharides, bisan kung ang ilang ginikanan nga sugar polymers kay kaylap nga na-hydrolyzed ngadto sa mas mugbo nga mga tipik ug natunaw gamit ang commercial enzyme mixtures.
Ang dugang nga pagtuon sa pag-apod-apod sa signal ug ang kalig-on sa pagbugkos niini nagpakita nga ang mga epitope sa pagbugkos mas ubos sa taas nga mga tipik sa asukal sa DP (A, B, C, DP hangtod sa 20+) kay sa ubos nga mga tipik sa DP (D, E, F, DP) sa mga dimer) (Fig. 1).Ang mga tipik sa acid mas komon sa mga non-cellulose epitope kay sa mga neutral nga tipik.Kini nga mga panghitabo nahiuyon sa sumbanan nga naobserbahan sa among miaging pagtuon, diin ang taas nga DP ug acid moieties mas makasugakod sa enzymatic hydrolysis.Busa, ang presensya sa mga non-cellulose glycan epitopes ug U ug MeU nga mga substitusyon makatampo og dako sa kalig-on sa oligosaccharides.Kinahanglan nga hinumdoman nga ang pagbugkos ug pagkaayo sa pagkakita mahimong problema alang sa ubos nga DP oligosaccharides, labi na kung ang epitope usa ka dimeric o trimeric oligosaccharide.Mahimo kini nga sulayan gamit ang komersyal nga oligosaccharides nga lainlain ang gitas-on, ang matag usa adunay usa ra ka epitope nga nagbugkos sa usa ka piho nga mAb.
Busa, ang paggamit sa espesipikong estruktura nga mga antibodies nagpadayag sa pipila ka matang sa mga bugkos nga mabasol.Depende sa matang sa antibody nga gigamit, ang angay nga ligation pattern, ug ang kalig-on sa signal nga gipatungha niini (kadaghanan ug pinakagamay nga abunda), ang mga bag-ong enzyme mahimong mailhan ug idugang sa semi-quantitatively sa enzyme mixture para sa mas kompleto nga glycoconversion.Ang pagkuha sa pagtuki sa ACSH oligosaccharides isip usa ka pananglitan, makahimo kita og database sa glycan bonds alang sa matag biomass nga materyal.Kini kinahanglan nga matikdan dinhi nga ang lain-laing mga affinity sa mga antibodies kinahanglan nga tagdon, ug kon ang ilang kalambigitan wala mahibaloi, kini makahimo sa pipila ka mga kalisdanan sa diha nga itandi ang mga signal sa lain-laing mga antibodies.Dugang pa, ang pagtandi sa mga glycan bond mahimong labing maayo nga molihok tali sa mga sample alang sa parehas nga antibody.Kini nga mga gahi nga mga gapos mahimo unya nga ma-link sa database sa CAZyme, diin mahimo naton mailhan ang mga enzyme, pagpili sa mga kandidato nga enzyme ug pagsulay alang sa mga enzyme nga nagbungkag sa bono, o paghimo og mga microbial system aron ipahayag kini nga mga enzyme aron magamit sa mga biorefineries44.
Aron sa pagtimbang-timbang kon sa unsang paagi ang immunological nga mga pamaagi makadugang sa alternatibong mga pamaagi alang sa pag-ila sa ubos nga molekular nga gibug-aton nga oligosaccharides nga anaa sa lignoscellulosic hydrolysates, among gihimo ang MALDI (Fig. 4, S1-S8) ug pagtuki sa TMS-derived saccharides base sa GC-MS sa samang panel (Fig. 5) oligosaccharide nga bahin.Gigamit ang MALDI aron itandi kung ang pag-apod-apod sa masa sa mga molekula sa oligosaccharide nahiuyon sa gituyo nga istruktura.Sa fig.Ang 4 nagpakita sa MC sa mga neutral nga sangkap nga ACN-A ug ACN-B.Ang pag-analisar sa ACN-A nagpamatuod sa usa ka lain-laing mga pentose sugars gikan sa DP 4-8 (Fig. 4) ngadto sa DP 22 (Fig. S1), kansang mga gibug-aton katumbas sa MeU-xylan oligosaccharides.Gikumpirma sa pag-analisa sa ACN-B ang serye sa pentose ug glucoxylan nga adunay DP 8-15.Sa dugang nga materyal sama sa Figure S3, ang FA-C acidic moiety mass distribution nga mga mapa nagpakita sa usa ka han-ay sa (Me) U nga gipuli nga pentose sugars nga adunay DP nga 8-15 nga nahiuyon sa gipuli nga xylans nga makita sa ELISA-based mAb screening.Ang mga epitope managsama.
MALDI-MS spectrum sa matunaw nga non-compliant oligosaccharides nga anaa sa ACS.Dinhi, (A) ACN-A ubos nga gibug-aton range fractions nga adunay methylated uronic acid (DP 4-8) gipuli sa glucuroxylan oligosaccharides ug (B) ACN-B xylan ug methylated uronic acid oligosaccharides gipuli sa glucuroxylan (DP 8-15).
Pagtuki sa komposisyon sa glycan residue sa refractory oligosaccharides.Dinhi (A) TMS saccharide nga komposisyon sa nagkalain-laing oligosaccharide fractions nakuha gamit ang GC-MS analysis.(B) Mga istruktura sa lainlaing mga asukal nga nakuha sa TMS nga naa sa oligosaccharides.ACN - acetonitrile fraction nga adunay neyutral nga oligosaccharides ug FA - ferulic acid fraction nga adunay acid oligosaccharides.
Ang laing makapaikag nga konklusyon gikuha gikan sa LC-MS analysis sa oligosaccharide fraction, sama sa gipakita sa Figure S9 (mga pamaagi makita sa electronic supplementary material).Ang mga tipik sa hexose ug -OAc nga mga grupo balik-balik nga naobserbahan sa panahon sa ligation sa ACN-B fraction.Kini nga pagpangita dili lamang nagpamatuod sa fragmentation nga nakita sa glycome ug MALDI-TOF analysis, apan naghatag usab og bag-ong impormasyon mahitungod sa potensyal nga carbohydrate derivatives sa pretreated lignoscellulosic biomass.
Gisusi usab namo ang komposisyon sa asukal sa oligosaccharide fraction gamit ang TMS sugar derivatization.Gamit ang GC-MS, among gitino ang komposisyon sa neural (non-derivative) ug acidic sugars (GluA ug GalA) sa oligosaccharide fraction (Fig. 5).Ang Glucuronic acid makita sa acidic nga mga sangkap C ug D, samtang ang galacturonic acid makita sa acidic nga mga sangkap A ug B, nga pareho nga taas nga DP nga sangkap sa acidic nga asukal.Kini nga mga resulta dili lamang nagpamatuod sa among ELISA ug MALDI nga datos, apan nahiuyon usab sa among nangaging mga pagtuon sa oligosaccharide accumulation.Busa, kami nagtuo nga ang modernong immunological nga mga pamaagi gamit ang biotinylation sa oligosaccharides ug ang sunod nga ELISA screening igo na aron makit-an ang matunaw nga recalcitrant oligosaccharides sa nagkalain-laing biological sample.
Tungod kay ang mga pamaagi sa screening sa mAb nga nakabase sa ELISA gipamatud-an sa daghang lain-laing mga pamaagi, gusto namong masusi pa ang potensyal niining bag-ong quantitative nga pamaagi.Duha ka komersyal nga oligosaccharides, xylohexasaccharide oligosaccharide (XHE) ug 23-α-L-arabinofuranosyl-xylotriose (A2XX), gipalit ug gisulayan gamit ang usa ka bag-ong pamaagi sa mAb nga nagpunting sa cell wall glycan.Ang Figure 6 nagpakita sa usa ka linear correlation tali sa biotinylated binding signal ug sa log concentration sa oligosaccharide concentration, nga nagsugyot sa usa ka posible nga Langmuir adsorption model.Lakip sa mga mAbs, CCRC-M137, CCRC-M138, CCRC-M147, CCRC-M148, ug CCRC-M151 nga may kalabutan sa XHE, ug CCRC-M108, CCRC-M109, ug LM11 nga may kalabutan sa A2XX sa usa ka range nga 1 nm ngadto sa 100 nano.Tungod sa limitado nga pagkaanaa sa mga antibodies sa panahon sa eksperimento, limitado nga mga eksperimento ang gihimo sa matag konsentrasyon sa oligosaccharide.Kinahanglang matikdan dinhi nga ang pipila ka mga antibodies lahi kaayog reaksiyon sa samang oligosaccharide isip substrate, lagmit tungod kay sila mogapos sa gamayng kalainan sa mga epitope ug mahimong magkalahi kaayog mga kadugtongan.Ang mga mekanismo ug mga implikasyon sa tukma nga pag-ila sa epitope mahimong mas komplikado kung ang bag-ong pamaagi sa mAb magamit sa tinuod nga mga sample.
Duha ka komersyal nga oligosaccharides ang gigamit aron mahibal-an ang hanay sa pagkakita sa lainlaing mga mAb nga target sa glycan.Dinhi, ang linear correlations nga adunay log nga konsentrasyon sa oligosaccharide nga konsentrasyon nagpakita sa Langmuir adsorption patterns alang sa (A) XHE nga adunay mAb ug (B) A2XX nga adunay mAb.Ang katugbang nga mga epitope nagpaila sa mga istruktura sa komersyal nga oligosaccharides nga gigamit ingon mga substrate sa assay.
Ang paggamit sa glycan-targeted monoclonal antibodies (glycocomic analysis o ELISA-based mAb screening) usa ka gamhanan nga himan alang sa lawom nga paghulagway sa kadaghanan sa mga mayor nga cell wall glycans nga naglangkob sa biomass sa tanum.Bisan pa, ang klasikal nga pag-analisa sa glycan nagpaila lamang sa mas dagkong mga cell wall glycans, tungod kay ang kadaghanan sa mga oligosaccharides dili maayo nga dili mapalihok sa mga plato sa ELISA.Niini nga pagtuon, ang AFEX-pretreated corn stover kay enzymatically hydrolyzed sa taas nga solids content.Ang pag-analisa sa asukal gigamit aron mahibal-an ang komposisyon sa mga recalcitrant cell wall carbohydrates sa hydrolyzate.Bisan pa, ang pag-analisa sa mAb sa gagmay nga mga oligosaccharides sa hydrolysates gipakaubos, ug ang dugang nga mga himan gikinahanglan aron epektibo nga ma-immobilize ang mga oligosaccharides sa mga plato sa ELISA.
Gi-report namo dinhi ang usa ka nobela ug episyente nga oligosaccharide immobilization nga pamaagi para sa mAb screening pinaagi sa paghiusa sa oligosaccharide biotinylation nga gisundan sa ELISA screening sa NeutrAvidin™ coated plates.Ang immobilized biotinylated oligosaccharides nagpakita ug igong kalambigitan alang sa antibody aron makahimo sa paspas ug episyente nga pagkakita sa mga recalcitrant oligosaccharides.Ang pagtuki sa komposisyon niining gahi nga mga oligosaccharides base sa mass spectrometry nagpamatuod sa mga resulta niining bag-ong pamaagi sa immunoscreening.Sa ingon, kini nga mga pagtuon nagpakita nga ang kombinasyon sa oligosaccharide biotinylation ug ELISA screening nga adunay glycan-targeted monoclonal antibodies mahimong magamit aron makit-an ang mga crosslink sa oligosaccharides ug mahimong kaylap nga magamit sa ubang mga biochemical nga pagtuon nga nagpaila sa istruktura sa oligosaccharides.
Kini nga biotin-based glycan profiling nga pamaagi mao ang unang report nga makahimo sa pag-imbestigar sa recalcitrant carbohydrate bonds sa soluble oligosaccharides sa biomass sa tanom.Nakatabang kini nga masabtan kung ngano nga ang pipila ka bahin sa biomass gahi kaayo kung bahin sa produksiyon sa biofuel.Kini nga pamaagi nagpuno sa usa ka hinungdanon nga kal-ang sa mga pamaagi sa pag-analisa sa glycome ug gipalapdan ang aplikasyon niini sa usa ka mas lapad nga sakup sa mga substrate lapas sa mga oligosaccharides sa tanum.Sa umaabot, mahimo namong gamiton ang mga robotics para sa biotinylation ug gamiton ang pamaagi nga among gihimo para sa high-throughput analysis sa mga sample gamit ang ELISA.
Ang mais nga dagami (CS) nga gipatubo gikan sa Pioneer 33A14 hybrid nga mga liso giani niadtong 2010 gikan sa Kramer Farms sa Ray, Colorado.Uban sa pagtugot sa tag-iya sa yuta, kini nga biomass mahimong magamit alang sa panukiduki. Ang mga sample gitipigan nga uga <6% nga kaumog sa mga bag nga naka-zip sa temperatura sa kwarto. Ang mga sample gitipigan nga uga <6% nga kaumog sa mga bag nga naka-zip sa temperatura sa kwarto. Образцы хранились сухими при влажности < 6% sa пакетах с застежкой-молнией при комнатной температуре. Ang mga sample gitipigan nga uga sa <6% humidity sa mga zippered bag sa temperatura sa kwarto.样品在室温下以干燥< 6% 的水分储存在自封袋中。样品在室温下以干燥< 6% Образцы хранят в пакетах с застежкой-молнией при комнатной температуре с влажностью < 6%. Ang mga sample gitipigan sa mga bag sa zipper sa temperatura sa kwarto nga adunay humidity <6%.Ang pagtuon misunod sa lokal ug nasyonal nga mga giya.Ang pag-analisar sa komposisyon gihimo gamit ang NREL protocol.Ang komposisyon nakit-an nga adunay 31.4% glucan, 18.7% xylan, 3.3% arabinan, 1.2% galactan, 2.2% acetyl, 14.3% lignin, 1.7% protina ug 13. 4% abo.
Ang Cellic® CTec2 (138 mg protein/ml, lot VCNI 0001) usa ka komplikadong sagol sa cellulase, β-glucosidase ug Cellic® HTec2 (157 mg protein/ml, lot VHN00001) gikan sa Novozymes (Franklinton, NC, USA)).Ang Multifect Pectinase® (72 mg protein/mL), usa ka komplikadong pagsagol sa pectin degrading enzymes, gidonar sa DuPont Industrial Biosciences (Palo Alto, CA, USA).Ang mga konsentrasyon sa protina sa enzyme gitino pinaagi sa pagbanabana sa sulod sa protina (ug pagkunhod sa kontribusyon sa non-protein nitrogen) gamit ang Kjeldahl nitrogen analysis (AOAC method 2001.11, Dairy One Cooperative Inc., Ithaca, NY, USA).Ang diatomaceous earth 545 gipalit gikan sa EMD Millipore (Billerica, MA).Ang aktibo nga carbon (DARCO, 100 mesh granules), Avicel (PH-101), beech xylan, ug tanang ubang mga kemikal gipalit gikan sa Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).
Ang AFEX pretreatment gihimo sa GLBRC (Biomass Conversion Research Laboratory, MSU, Lansing, MI, USA).Ang pre-treatment gihimo sa 140 ° C. sulod sa 15 minutos.46 residence time sa 1:1 ratio sa anhydrous ammonia ngadto sa biomass sa 60% (w/w) loading sa usa ka stainless steel benchtop batch reactor (Parr Instruments Company).Nagkinahanglan kini og 30 minutos.Ang reaktor gidala ngadto sa 140 ° C ug ang ammonia paspas nga gipagawas, nga nagtugot sa biomass nga dali nga makabalik sa temperatura sa kwarto.Ang komposisyon sa AFEX pre-treated corn stover (ACS) susama sa untreated corn stover (UT-CS).
Taas nga solido ACSH 25% (w/w) (gibana-bana nga 8% dextran loading) giandam isip usa ka materyal nga panugod alang sa dako nga scale produksyon sa oligosaccharides.Ang Enzymatic hydrolysis sa ACS gihimo gamit ang commercial enzyme mixture lakip ang Cellic® Ctec2 10 mg protein/g glucan (sa pretreated biomass), Htec2 (Novozymes, Franklinton, NC), 5 mg protein/g glucan, ug Multifect Pectinase (Genencor Inc, USA).).), 5 mg protina/g dextran.Ang enzymatic hydrolysis gihimo sa usa ka 5-litro nga bioreactor nga adunay working volume nga 3 ka litro, pH 4.8, 50°C ug 250 rpm.Human sa hydrolysis sulod sa 96 ka oras, ang hydrolyzate nakolekta pinaagi sa centrifugation sa 6000 rpm sulod sa 30 minutos ug dayon sa 14000 rpm sulod sa 30 minutos aron makuha ang unhydrolysed solids.Ang hydrolyzate dayon gipailalom sa sterile filtration pinaagi sa 0.22 mm filter beaker.Ang sinala nga hydrolyzate gitipigan sa sterile nga mga botelya sa 4 ° C. ug dayon gibahin sa carbon.
Pag-analisar sa komposisyon sa mga sample nga biomass nga gibase sa kinuha sumala sa mga pamaagi sa pag-analisar sa laboratoryo sa NREL: pag-andam sa mga sample alang sa pag-analisa sa komposisyon (NREL/TP-510-42620) ug pagdeterminar sa structural carbohydrates ug lignin sa biomass (NREL/TP-510 - 42618)47.
Ang pag-analisa sa oligosaccharide sa hydrolyzate stream gihimo sa usa ka 2 ml nga sukdanan gamit ang usa ka paagi sa hydrolysis nga acid nga nakabase sa autoclave.Sagola ang hydrolyzate sample nga adunay 69.7 µl sa 72% sulfuric acid sa 10 ml screw cap culture tube ug i-incubate sulod sa 1 ka oras sa benchtop sa 121 °C, pabugnawa sa yelo ug salain ngadto sa high performance liquid chromatography (HPLC) nga panaksan.Ang konsentrasyon sa oligosaccharides gitino pinaagi sa pagkunhod sa konsentrasyon sa monosaccharides sa non-hydrolyzed sample gikan sa kinatibuk-ang konsentrasyon sa asukal sa acid-hydrolyzed sample.
Ang glucose, xylose, ug arabinose nga konsentrasyon sa acid hydrolysed biomass gisusi gamit ang Shimadzu HPLC system nga adunay autosampler, column heater, isocratic pump, ug refractive index detector sa usa ka Bio-Rad Aminex HPX-87H column.Ang kolum gipadayon sa 50 ° C ug gi-eluted sa 0.6 ml / min 5 mM H2SO4 sa tubig.modagayday.
Ang hydrolyzate supernatant gitunaw ug gisusi alang sa monomer ug oligosaccharide nga sulod.Ang mga monomeric nga asukal nga nakuha pagkahuman sa enzymatic hydrolysis gisusi sa HPLC nga adunay sulud nga Bio-Rad (Hercules, CA) Aminex HPX-87P nga kolum ug usa ka kolum sa abo nga guwardiya.Ang temperatura sa kolum gipabilin sa 80 ° C, ang tubig gigamit isip mobile phase nga adunay flow rate nga 0.6 ml / min.Ang mga oligosaccharides gitino pinaagi sa hydrolysis sa dilute acid sa 121 ° C sumala sa mga pamaagi nga gihulagway sa ref.41, 48, 49.
Ang pag-analisa sa saccharide gihimo sa hilaw, AFEX nga pre-treated ug tanan nga non-hydrolysed biomass residues (lakip na ang produksyon sa serial cell wall extracts ug ang ilang mAb screening) gamit ang naunang gihulagway nga mga pamaagi 27, 43, 50, 51.Alang sa pag-analisa sa glycome, ang mga residu sa alkohol nga dili matunaw sa materyal sa dingding sa cell sa tanum giandam gikan sa mga residu sa biomass ug gipailalom sa serial extraction nga adunay labi nga agresibo nga mga reagents sama sa ammonium oxalate (50 mM), sodium carbonate (50 mM ug 0.5% w / v), CON.(1M ug 4M, parehong adunay 1% w/v sodium borohydride) ug acid chlorite sama sa gihulagway kaniadto52,53.Ang mga extract dayon gipailalom sa ELISA batok sa usa ka komplikadong panel sa mAb50s nga gitumong sa cell wall glycan, ug ang mga reaksyon sa pagbugkos sa mAb gipresentar isip usa ka mapa sa kainit.Ang mAbs nga nagpunting sa plant cell wall glycan gipalit gikan sa mga stock sa laboratoryo (CCRC, JIM ug MAC series).
Usa ka lakang nga biotinylation sa oligosaccharides.Ang conjugation sa carbohydrates nga adunay biotin-LC-hydrazide gihimo gamit ang mosunod nga pamaagi.Ang Biotin-LC-hydrazide (4.6 mg / 12 μmol) natunaw sa dimethyl sulfoxide (DMSO, 70 μl) pinaagi sa kusog nga pagpalihok ug pagpainit sa 65 ° C. sulod sa 1 min.Ang glacial acetic acid (30 µl) gidugang ug ang sagol gibubo ngadto sa sodium cyanoborohydride (6.4 mg/100 µmol) ug hingpit nga natunaw human sa pagpainit sa 65° C. sulod sa mga 1 ka minuto.Dayon, gikan sa 5 ngadto sa 8 μl sa reaksyon nga timpla gidugang ngadto sa uga nga oligosaccharide (1-100 nmol) aron makakuha og 10-pilo o labaw pa nga molar nga sobra sa label sa ibabaw sa pagkunhod sa tumoy.Ang reaksyon gihimo sa 65 ° C sulod sa 2 ka oras, pagkahuman ang mga sample gilimpyohan dayon.Walay sodium cyanoborohydride ang gigamit sa mga eksperimento sa pag-label nga walay pagkunhod, ug ang mga sample gi-react sa 65 ° C. sulod sa 2.5 ka oras.
ELISA coating ug paghugas sa mga sample sa biotinylated oligosaccharides.Ang 25 μl nga biotinylated nga mga sample (100 μl sa matag concentrated sample nga lasaw sa 5 ml sa 0.1 M Tris buffer solution (TBS)) gidugang sa matag atabay sa avidin-coated plate.Ang mga atabay sa pagkontrol gitabonan sa 50 μl nga biotin sa konsentrasyon nga 10 μg/ml sa 0.1 M TBS.Ang deionized nga tubig gigamit ingon nga usa ka taklap alang sa mga blangko nga pagsukod.Ang papan gilumlom sa 2 ka oras sa temperatura sa kwarto sa kangitngit.Hugasi ang plato 3 ka beses gamit ang 0.1% nga skimmed milk sa 0.1 M TBS gamit ang program no.11 alang sa Grenier flat 3A.
Pagdugang ug paghugas sa panguna nga mga antibodies.Idugang ang 40 µl nga panguna nga antibody sa matag atabay.Paglumlum sa microplate sulod sa 1 ka oras sa temperatura sa lawak sa ngitngit.Gihugasan dayon ang mga plato 3 ka beses gamit ang 0.1% nga gatas sa 0.1M TBS gamit ang wash program #11 para sa Grenier Flat 3A.
Idugang ang secondary antibody ug hugasi.Idugang ang 50 µl sa mouse/rat secondary antibody (natunaw nga 1:5000 sa 0.1% nga gatas sa 0.1 M TBS) sa matag atabay.Paglumlum sa microplate sulod sa 1 ka oras sa temperatura sa lawak sa ngitngit.Ang mga microplate dayon gihugasan 5 ka beses gamit ang 0.1% nga gatas sa 0.1 M TBS gamit ang Grenier Flat 5A plate wash program #12.
Pagdugang usa ka substrate.Idugang ang 50 µl sa 3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine (TMB) sa base substrate (pinaagi sa pagdugang 2 tulo sa buffer, 3 tulo sa TMB, 2 tulo sa hydrogen peroxide ngadto sa 15 ml nga deionized nga tubig).Pag-andam sa TMB substrate.ug vortex sa dili pa gamiton).Ilumlom ang microplate sa temperatura sa kwarto sulod sa 30 minutos.Sa kangitngit.
Kompletoha ang lakang ug basaha ang tablet.Idugang ang 50 µl sa 1 N sulfuric acid sa matag atabay ug irekord ang absorbance gikan sa 450 hangtod 655 nm gamit ang ELISA reader.
Pag-andam og 1 mg/ml nga solusyon niini nga mga analytes sa deionized nga tubig: arabinose, rhamnose, fucose, xylose, galacturonic acid (GalA), glucuronic acid (GlcA), mannose, glucose, galactose, lactose, N-acetylmannosamine (manNAc), N-acetylglucosamine .(glcNAc), N-acetylgalactosamine (galNAc), inositol (internal nga sumbanan).Duha ka mga sumbanan ang giandam pinaagi sa pagdugang sa 1 mg/mL nga solusyon sa asukal nga gipakita sa Talaan 1. Ang mga sample gi-frozen ug gi-lyophilize sa -80 ° C. hangtod ang tanan nga tubig makuha (kasagaran mga 12-18 ka oras).
Idugang ang 100–500 µg nga sample sa screw cap tubes sa analytical balance.Irekord ang kantidad nga gidugang.Labing maayo nga dissolve ang sample sa usa ka piho nga konsentrasyon sa solvent ug idugang kini sa tubo ingon usa ka likido nga aliquot.Gamita ang 20 µl sa 1 mg/ml nga inositol isip internal nga sumbanan sa matag sample tube.Ang kantidad sa internal nga sumbanan nga idugang sa sample kinahanglan nga parehas sa kantidad sa internal nga sumbanan nga gidugang sa standard nga tubo.
Idugang ang 8 ml nga anhydrous methanol sa usa ka screw cap vial.Unya 4 ml sa 3 N. methanolic HCl solusyon, gitakpan ug giuyog.Kini nga proseso wala maggamit ug tubig.
Idugang ang 500 µl sa 1 M HCl methanol solution sa oligosaccharide sample ug standard TMS tubes.Ang mga sample gilumlum sa tibuok gabii (168 ka oras) sa 80 ° C. sa usa ka thermal block.Pauga ang produkto sa methanolysis sa temperatura sa kwarto gamit ang drying manifold.Idugang ang 200 µl MeOH ug uga pag-usab.Kini nga proseso gisubli sa makaduha.Idugang ang 200 µl nga methanol, 100 µl nga pyridine ug 100 µl nga acetic anhydride sa sample ug isagol nga maayo.Ang mga sample gilumlum sa temperatura sa kwarto sulod sa 30 minuto.ug gipauga.Idugang ang 200 µl nga methanol ug uga pag-usab.
Idugang ang 200 µl sa Tri-Sil ug init nga gitabonan sa tubo sulod sa 20 minutos.80 ° C, dayon gipabugnaw sa temperatura sa kwarto.Gamit ug drying manifold aron mas mamala ang sample sa gidaghanon nga gibana-bana nga 50 µl.Importante nga timan-an nga wala namo tugoti ang mga sample nga mamala sa hingpit.
Idugang ang 2 ml nga hexane ug isagol nga maayo pinaagi sa vortexing.Pun-a ang tumoy sa Pasteur pipettes (5-8 mm) sa usa ka piraso sa bildo nga balhibo pinaagi sa pagsal-ot sa bildo nga balhibo sa ibabaw sa 5-3/4 ka pulgada nga diametro nga pipette.Ang mga sample gi-centrifuge sa 3000 g sulod sa 2 ka minuto.Ang bisan unsang dili matunaw nga mga salin gipa-precipitated.Pauga ang sample sa 100-150 µl.Ang usa ka gidaghanon sa gibana-bana nga 1 μl gi-injected ngadto sa GC-MS sa usa ka inisyal nga temperatura sa 80 ° C ug usa ka inisyal nga panahon sa 2.0 minutos (Table 2).