ຂໍ​ຂອບ​ໃຈ​ທ່ານ​ສໍາ​ລັບ​ການ​ຢ້ຽມ​ຢາມ Nature.com​.ເວີຊັນຂອງຕົວທ່ອງເວັບທີ່ທ່ານກໍາລັງໃຊ້ມີການສະຫນັບສະຫນູນ CSS ຈໍາກັດ.ເພື່ອປະສົບການທີ່ດີທີ່ສຸດ, ພວກເຮົາແນະນຳໃຫ້ທ່ານໃຊ້ບຣາວເຊີທີ່ອັບເດດແລ້ວ (ຫຼືປິດການນຳໃຊ້ໂໝດຄວາມເຂົ້າກັນໄດ້ໃນ Internet Explorer).ໃນເວລານີ້, ເພື່ອຮັບປະກັນການສະຫນັບສະຫນູນຢ່າງຕໍ່ເນື່ອງ, ພວກເຮົາຈະສະແດງເວັບໄຊທ໌ໂດຍບໍ່ມີຮູບແບບແລະ JavaScript.
ວິທີການ immunological ແລະມະຫາຊົນ spectrometric ໃຫມ່ສໍາລັບການວິເຄາະສະລັບສັບຊ້ອນຂອງ oligosaccharides ຄົງຢູ່ໃນເຕົາສາລີ pretreated ກັບ AFEX.ຊີວະມວນ Lignocellulosic ເປັນທາງເລືອກທີ່ຍືນຍົງຂອງເຊື້ອໄຟຟອດຊິວທໍາແລະຖືກນໍາໃຊ້ຢ່າງກວ້າງຂວາງເພື່ອພັດທະນາເຕັກໂນໂລຢີຊີວະພາບສໍາລັບການຜະລິດຜະລິດຕະພັນເຊັ່ນອາຫານ, ອາຫານ, ນໍ້າມັນເຊື້ອໄຟແລະສານເຄມີ.ກຸນແຈຂອງເຕັກໂນໂລຢີເຫຼົ່ານີ້ແມ່ນການພັດທະນາຂະບວນການແຂ່ງຂັນດ້ານຄ່າໃຊ້ຈ່າຍສໍາລັບການປ່ຽນທາດຄາໂບໄຮເດດສະລັບສັບຊ້ອນທີ່ມີຢູ່ໃນຝາຈຸລັງຂອງພືດເປັນນໍ້າຕານງ່າຍໆເຊັ່ນ: glucose, xylose ແລະ arabinose.ເນື່ອງຈາກວ່າຊີວະມວນຂອງ lignocellulosic ມີຄວາມແຂງກະດ້າງຫຼາຍ, ມັນຕ້ອງໄດ້ຮັບການປິ່ນປົວດ້ວຍທາງເຄມີ (ຕົວຢ່າງເຊັ່ນ, ການຂັດເສັ້ນໄຍແອມໂມເນຍ (AFEX), ອາຊິດເຈືອຈາງ (DA), ທາດແຫຼວ ionic (IL)) ແລະການປິ່ນປົວດ້ວຍທາງຊີວະພາບ (e. g. enzymatic hydrolysis ແລະການຫມັກຈຸລິນຊີ) ປະສົມປະສານເພື່ອໃຫ້ໄດ້ຜະລິດຕະພັນທີ່ຕ້ອງການ..ຢ່າງໃດກໍຕາມ, ໃນເວລາທີ່ enzymes fungal ການຄ້າຖືກນໍາໃຊ້ໃນຂະບວນການ hydrolysis, ພຽງແຕ່ 75-85% ຂອງນ້ໍາຕານທີ່ລະລາຍທີ່ສ້າງຂຶ້ນແມ່ນ monosaccharides, ແລະ 15-25% ທີ່ຍັງເຫຼືອແມ່ນ oligosaccharides ທີ່ລະລາຍ, intractable, ແມ່ນບໍ່ສະເຫມີໄປຈຸລິນຊີ.ກ່ອນຫນ້ານີ້, ພວກເຮົາໄດ້ແຍກອອກຢ່າງສໍາເລັດຜົນແລະຊໍາລະລ້າງ oligosaccharides stubborn ທີ່ລະລາຍໂດຍໃຊ້ການປະສົມປະສານຂອງກາກບອນແລະການແຍກແຜ່ນດິນໂລກ diatomaceous ແລະ chromatography ການຍົກເວັ້ນຂະຫນາດ, ແລະຍັງໄດ້ສືບສວນຄຸນສົມບັດ inhibitory enzyme ຂອງເຂົາເຈົ້າ.ພວກເຮົາໄດ້ພົບເຫັນວ່າ oligosaccharides ທີ່ມີລະດັບສູງຂອງ polymerization (DP) ການທົດແທນອາຊິດ uronic methylated ແມ່ນມີຄວາມຫຍຸ້ງຍາກຫຼາຍທີ່ຈະປຸງແຕ່ງດ້ວຍການຜະສົມ enzymes ການຄ້າຫຼາຍກ່ວາ DP ຕ່ໍາແລະ oligosaccharides ເປັນກາງ.ໃນທີ່ນີ້ພວກເຮົາລາຍງານການນໍາໃຊ້ວິທີການເພີ່ມເຕີມຈໍານວນຫນຶ່ງ, ລວມທັງ glycan profiling ໂດຍໃຊ້ monoclonal antibodies (mAbs) ສະເພາະກັບ glycans ຊີວະມວນຂອງພືດເພື່ອລັກສະນະຂອງພັນທະບັດ glycan ໃນຝາຈຸລັງຂອງພືດແລະ enzymatic hydrolysates, matrix-assisted laser desorption ionization, time-of-flight mass-spectrometry..MALDI-TOF-MS) ໃຊ້ຈຸດສູງສຸດຂອງການວິນິດໄສໂຄງສ້າງຂໍ້ມູນທີ່ໄດ້ຮັບໂດຍ spectroscopy ຫຼັງຈາກການເສື່ອມຕົວຂັ້ນສອງຂອງ ions ລົບ, chromatography ອາຍແກັສແລະ spectrometry ມະຫາຊົນ (GC-MS) ເພື່ອສະແດງຕົວຜູກພັນ oligosaccharide ທີ່ມີແລະບໍ່ມີການແຜ່ກະຈາຍ.ເນື່ອງຈາກມີຂະໜາດນ້ອຍຂອງ oligosaccharides (DP 4–20), ໂມເລກຸນເຫຼົ່ານີ້ຍາກທີ່ຈະໃຊ້ສໍາລັບການຜູກມັດ mAb ແລະລັກສະນະ.ເພື່ອເອົາຊະນະບັນຫານີ້, ພວກເຮົາໄດ້ນໍາໃຊ້ວິທີການ immobilization oligosaccharide ທີ່ອີງໃສ່ biotin ໃໝ່ ທີ່ໄດ້ຕິດສະຫຼາກຢ່າງສໍາເລັດຜົນຂອງ oligosaccharides ທີ່ລະລາຍຂອງ DP ຕໍ່າສ່ວນໃຫຍ່ຢູ່ເທິງຫນ້າ microplate, ເຊິ່ງຫຼັງຈາກນັ້ນຖືກນໍາໃຊ້ໃນລະບົບ mAb ທີ່ມີຄວາມໄວສູງສໍາລັບການວິເຄາະການຜູກມັດສະເພາະ.ວິທີການໃຫມ່ນີ້ຈະສ້າງຄວາມສະດວກໃນການພັດທະນາການວິເຄາະ glycome ທີ່ມີລະດັບສູງທີ່ກ້າວຫນ້າໃນອະນາຄົດທີ່ສາມາດນໍາໃຊ້ເພື່ອແຍກແລະລັກສະນະຂອງ oligosaccharides ທີ່ມີຢູ່ໃນ biomarkers ສໍາລັບຈຸດປະສົງການວິນິດໄສ.
ຊີວະມວນ Lignocellulosic, ປະກອບດ້ວຍວັດສະດຸກະສິກໍາ, ປ່າໄມ້, ຫຍ້າແລະໄມ້, ເປັນອາຫານທີ່ມີທ່າແຮງສໍາລັບການຜະລິດຜະລິດຕະພັນຊີວະພາບ, ລວມທັງອາຫານ, ອາຫານ, ນໍ້າມັນເຊື້ອໄຟແລະທາດເຄມີເພື່ອຜະລິດຜະລິດຕະພັນທີ່ມີຄຸນຄ່າສູງ1.ຄາໂບໄຮເດຣດ (ເຊັ່ນ: cellulose ແລະ hemicellulose) ທີ່ມີຢູ່ໃນຝາຈຸລັງຂອງພືດແມ່ນ depolymerized ເຂົ້າໄປໃນ monosaccharides ໂດຍການປຸງແຕ່ງທາງເຄມີແລະ biotransformation (ເຊັ່ນ: enzymatic hydrolysis ແລະການຫມັກຈຸລິນຊີ).ການປິ່ນປົວເບື້ອງຕົ້ນທົ່ວໄປປະກອບມີການຂະຫຍາຍເສັ້ນໄຍແອມໂມເນຍ (AFEX), ອາຊິດເຈືອຈາງ (DA), ທາດແຫຼວ ionic (IL), ແລະການລະເບີດຂອງອາຍ (SE), ເຊິ່ງໃຊ້ການປະສົມປະສານຂອງສານເຄມີແລະຄວາມຮ້ອນເພື່ອຫຼຸດຜ່ອນການຜະລິດ lignocellulose ໂດຍການເປີດຝາຈຸລັງພືດ3,4.stubbornness of matter, 5. enzymatic hydrolysis ແມ່ນດໍາເນີນຢູ່ໃນການໂຫຼດຂອງແຂງສູງໂດຍໃຊ້ enzymes ທີ່ມີຄາໂບໄຮເດດທີ່ມີການເຄື່ອນໄຫວທາງການຄ້າ (CAZymes) ແລະການຫມັກຈຸລິນຊີໂດຍໃຊ້ເຊື້ອລາຫຼືເຊື້ອແບັກທີເຣັຍ transgenic ເພື່ອຜະລິດນໍ້າມັນເຊື້ອໄຟຊີວະພາບແລະສານເຄມີ 6 .
CAZymes ໃນ enzymes ການຄ້າແມ່ນປະກອບດ້ວຍການປະສົມທີ່ຊັບຊ້ອນຂອງ enzymes ທີ່ແຍກທາດແປ້ງທາດແປ້ງ - ້ໍາຕານສະລັບສັບຊ້ອນເພື່ອສ້າງເປັນ monosaccharides2,7.ດັ່ງທີ່ພວກເຮົາໄດ້ລາຍງານກ່ອນຫນ້ານີ້, ເຄືອຂ່າຍສະລັບສັບຊ້ອນຂອງໂພລີເມີທີ່ມີກິ່ນຫອມຂອງ lignin ທີ່ມີຄາໂບໄຮເດດເຮັດໃຫ້ພວກມັນມີຄວາມເຄັ່ງຕຶງສູງ, ເຊິ່ງນໍາໄປສູ່ການປ່ຽນ້ໍາຕານທີ່ບໍ່ສົມບູນ, ສະສົມ 15-25% ຂອງ oligosaccharides ທາງເພດທີ່ບໍ່ໄດ້ຜະລິດໃນລະຫວ່າງ enzymatic hydrolysis ຂອງຊີວະມວນ pretreated.ນີ້ແມ່ນບັນຫາທົ່ວໄປກັບວິທີການຮັກສາຊີວະມວນຕ່າງໆ.ບາງເຫດຜົນສໍາລັບຄໍຂວດນີ້ປະກອບມີການຍັບຍັ້ງ enzyme ໃນລະຫວ່າງການ hydrolysis, ຫຼືການຂາດຫຼືລະດັບຕ່ໍາຂອງ enzymes ທີ່ຈໍາເປັນທີ່ຈໍາເປັນເພື່ອທໍາລາຍພັນທະບັດ້ໍາຕານໃນຊີວະມວນພືດ.ຄວາມເຂົ້າໃຈອົງປະກອບແລະລັກສະນະໂຄງສ້າງຂອງ້ໍາຕານ, ເຊັ່ນ: ພັນທະບັດ້ໍາຕານໃນ oligosaccharides, ຈະຊ່ວຍໃຫ້ພວກເຮົາປັບປຸງການປ່ຽນນ້ໍາຕານໃນລະຫວ່າງການ hydrolysis, ເຮັດໃຫ້ຂະບວນການທາງຊີວະພາບມີຄ່າໃຊ້ຈ່າຍໃນການແຂ່ງຂັນກັບຜະລິດຕະພັນທີ່ມາຈາກນໍ້າມັນ.
ການກໍານົດໂຄງສ້າງຂອງຄາໂບໄຮເດຣດແມ່ນສິ່ງທ້າທາຍແລະຮຽກຮ້ອງໃຫ້ມີການປະສົມປະສານຂອງວິທີການເຊັ່ນ: chromatography ແຫຼວ (LC)11,12, nuclear magnetic resonance spectroscopy (NMR)13, capillary electrophoresis (CE)14,15,16 ແລະ mass spectrometry (MS)17.,ສິບແປດ.ວິທີການ MS ເຊັ່ນ: ການວັດແທກມວນສານເວລາຂອງການບິນດ້ວຍການດູດຊຶມດ້ວຍເລເຊີ ແລະ ionization ໂດຍໃຊ້ມາຕຣິກເບື້ອງ (MALDI-TOF-MS) ແມ່ນວິທີການທີ່ຫຼາກຫຼາຍໃນການກໍານົດໂຄງສ້າງຄາໂບໄຮເດດ.ບໍ່ດົນມານີ້, Collision-Induced Dissociation (CID) tandem MS ຂອງ sodium ion adducts ໄດ້ຖືກນໍາໃຊ້ຢ່າງກວ້າງຂວາງທີ່ສຸດເພື່ອກໍານົດລາຍນິ້ວມືທີ່ສອດຄ້ອງກັບຕໍາແຫນ່ງການຕິດ oligosaccharide, ການຕັ້ງຄ່າ anomeric, ລໍາດັບ, ແລະຕໍາແຫນ່ງສາຂາ 20, 21 .
ການວິເຄາະ Glycan ແມ່ນເຄື່ອງມືທີ່ດີເລີດສໍາລັບການກໍານົດຄວາມເລິກຂອງພັນທະບັດຄາໂບໄຮເດດ22.ວິທີການນີ້ໃຊ້ monoclonal antibodies (mAbs) ມຸ້ງໄປຫາ glycan ຝາຂອງເຊນພືດເປັນ probes ເພື່ອເຂົ້າໃຈການເຊື່ອມໂຍງຄາໂບໄຮເດດສະລັບສັບຊ້ອນ.ຫຼາຍກວ່າ 250 mAbs ແມ່ນມີຢູ່ທົ່ວໂລກ, ອອກແບບຕໍ່ກັບ oligosaccharides ເສັ້ນ ແລະງ່າຕ່າງໆ ໂດຍໃຊ້ saccharides24 ຕ່າງໆ.mAbs ຫຼາຍໆອັນໄດ້ຖືກນໍາໃຊ້ຢ່າງກວ້າງຂວາງເພື່ອກໍານົດລັກສະນະໂຄງສ້າງ, ອົງປະກອບ, ແລະການດັດແປງຂອງກໍາແພງຈຸລັງຂອງພືດ, ຍ້ອນວ່າມີຄວາມແຕກຕ່າງກັນຢ່າງຫຼວງຫຼາຍຂຶ້ນກັບປະເພດຈຸລັງຂອງພືດ, ອະໄວຍະວະ, ອາຍຸ, ຂັ້ນຕອນການພັດທະນາ, ແລະສະພາບແວດລ້ອມການຂະຫຍາຍຕົວ25,26.ບໍ່ດົນມານີ້, ວິທີການນີ້ໄດ້ຖືກນໍາໃຊ້ເພື່ອເຂົ້າໃຈປະຊາກອນ vesicle ໃນລະບົບພືດແລະສັດແລະພາລະບົດບາດຂອງເຂົາເຈົ້າໃນການຂົນສົ່ງ glycan ຕາມການກໍານົດໂດຍເຄື່ອງຫມາຍ subcellular, ຂັ້ນຕອນການພັດທະນາ, ຫຼືການກະຕຸ້ນສິ່ງແວດລ້ອມ, ແລະກໍານົດກິດຈະກໍາ enzymatic.ບາງໂຄງສ້າງທີ່ແຕກຕ່າງກັນຂອງ glycans ແລະ xylans ທີ່ໄດ້ຖືກກໍານົດປະກອບມີ pectin (P), xylan (X), mannan (M), xyloglucans (XylG), ພັນທະບັດປະສົມ glucans (MLG), arabinoxylan (ArbX), galactomannan (GalG), glucuronic acid-arabinoxylan (GArabinogalan (GarbX) 2).
ຢ່າງໃດກໍຕາມ, ເຖິງວ່າຈະມີຄວາມພະຍາຍາມຄົ້ນຄ້ວາທັງຫມົດເຫຼົ່ານີ້, ມີພຽງແຕ່ການສຶກສາຈໍານວນຫນ້ອຍໄດ້ສຸມໃສ່ລັກສະນະຂອງການສະສົມຂອງ oligosaccharide ໃນໄລຍະການໂຫຼດຂອງແຂງສູງ (HSL) hydrolysis, ລວມທັງການປ່ອຍ oligosaccharide, ການປ່ຽນແປງຄວາມຍາວລະບົບຕ່ອງໂສ້ oligomeric ໃນລະຫວ່າງການ hydrolysis, ໂພລີເມີ DP ຕ່ໍາຕ່າງໆ, ແລະເສັ້ນໂຄ້ງຂອງພວກເຂົາ.ແຈກ 30,31,32.ໃນຂະນະດຽວກັນ, ເຖິງແມ່ນວ່າການວິເຄາະ glycan ໄດ້ພິສູດວ່າເປັນເຄື່ອງມືທີ່ເປັນປະໂຫຍດສໍາລັບການວິເຄາະທີ່ສົມບູນແບບຂອງໂຄງສ້າງ glycan, ມັນຍາກທີ່ຈະປະເມີນ DP oligosaccharides ຕ່ໍາທີ່ລະລາຍໃນນ້ໍາໂດຍໃຊ້ວິທີພູມຕ້ານທານ.DP oligosaccharides ຂະໜາດນ້ອຍທີ່ມີນ້ຳໜັກໂມເລກຸນຕ່ຳກວ່າ 5-10 kDa ບໍ່ຜູກມັດກັບແຜ່ນ ELISA 33, 34 ແລະຖືກລ້າງອອກກ່ອນທີ່ຈະເພີ່ມພູມຕ້ານທານ.
ໃນທີ່ນີ້, ເປັນຄັ້ງທໍາອິດ, ພວກເຮົາສະແດງໃຫ້ເຫັນການວິເຄາະ ELISA ກ່ຽວກັບແຜ່ນເຄືອບ avidin ໂດຍໃຊ້ antibodies monoclonal, ປະສົມປະສານຂັ້ນຕອນ biotinylation ຫນຶ່ງຂັ້ນຕອນສໍາລັບ oligosaccharides refractory ທີ່ລະລາຍດ້ວຍການວິເຄາະ glycome.ວິທີການຂອງພວກເຮົາໃນການວິເຄາະ glycome ໄດ້ຖືກກວດສອບໂດຍການວິເຄາະ MALDI-TOF-MS ແລະ GC-MS ຂອງການເຊື່ອມໂຍງ oligosaccharide ເສີມໂດຍໃຊ້ trimethylsilyl (TMS) derivatization ຂອງອົງປະກອບ້ໍາຕານ hydrolyzed.ວິທີການປະດິດສ້າງນີ້ສາມາດຖືກພັດທະນາເປັນວິທີການທີ່ມີຄວາມໄວສູງໃນອະນາຄົດແລະຊອກຫາຄໍາຮ້ອງສະຫມັກທີ່ກວ້າງຂວາງໃນການຄົ້ນຄວ້າຊີວະວິທະຍາ35.
ການປ່ຽນແປງຫຼັງການແປຂອງເອນໄຊ ແລະພູມຕ້ານທານ, ເຊັ່ນ: glycosylation,36 ມີຜົນກະທົບຕໍ່ກິດຈະກໍາທາງຊີວະພາບຂອງເຂົາເຈົ້າ.ສໍາລັບຕົວຢ່າງ, ການປ່ຽນແປງຂອງ glycosylation ຂອງທາດໂປຼຕີນຈາກ serum ມີບົດບາດສໍາຄັນໃນຂໍ້ອັກເສບອັກເສບ, ແລະການປ່ຽນແປງຂອງ glycosylation ຖືກນໍາໃຊ້ເປັນເຄື່ອງຫມາຍການວິນິດໄສ37.glycans ຕ່າງໆໄດ້ຖືກລາຍງານຢູ່ໃນວັນນະຄະດີເພື່ອກຽມພ້ອມໃນຫຼາຍໆພະຍາດ, ລວມທັງພະຍາດອັກເສບຊໍາເຮື້ອຂອງກະເພາະລໍາໄສ້ແລະຕັບ, ການຕິດເຊື້ອໄວຣັດ, ຮວຍໄຂ່, ເຕົ້ານົມ, ແລະມະເຮັງ prostate38,39,40.ຄວາມເຂົ້າໃຈໂຄງສ້າງຂອງ glycans ໂດຍໃຊ້ວິທີ glycan ELISA ທີ່ອີງໃສ່ພູມຕ້ານທານຈະໃຫ້ຄວາມຫມັ້ນໃຈເພີ່ມເຕີມໃນການວິນິດໄສພະຍາດໂດຍບໍ່ມີການນໍາໃຊ້ວິທີການ MS ສະລັບສັບຊ້ອນ.
ການສຶກສາທີ່ຜ່ານມາຂອງພວກເຮົາໄດ້ສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າ oligosaccharides ທີ່ແຂງກະດ້າງຍັງຄົງບໍ່ໄດ້ຮັບການ hydrolyzed ຫຼັງຈາກ pretreatment ແລະ enzymatic hydrolysis (ຮູບ 1).ໃນວຽກງານຂອງພວກເຮົາທີ່ໄດ້ພິມເຜີຍແຜ່ກ່ອນຫນ້ານີ້, ພວກເຮົາໄດ້ພັດທະນາວິທີການສະກັດເອົາໄລຍະແຂງຂອງຖ່ານ activated ເພື່ອແຍກ oligosaccharides ຈາກ AFEX-pretreated corn stover hydrolyzate (ACSH)8.ຫຼັງຈາກການສະກັດເອົາແລະການແຍກອອກໃນເບື້ອງຕົ້ນ, oligosaccharides ໄດ້ຖືກແຍກອອກຕື່ມອີກໂດຍການຍົກເວັ້ນ chromatography (SEC) ແລະເກັບກໍາຕາມລໍາດັບຂອງນ້ໍາໂມເລກຸນ.monomers ້ໍາຕານແລະ oligomers ປ່ອຍອອກມາຈາກ pretreatments ຕ່າງໆໄດ້ຖືກວິເຄາະໂດຍການວິເຄາະອົງປະກອບ້ໍາຕານ.ເມື່ອປຽບທຽບເນື້ອໃນຂອງ oligomers ້ໍາຕານທີ່ໄດ້ຮັບໂດຍວິທີການ pretreatment ຕ່າງໆ, ການປະກົດຕົວຂອງ oligosaccharides ແຂງກະດ້າງເປັນບັນຫາທົ່ວໄປໃນການປ່ຽນຊີວະມວນເປັນ monosaccharides ແລະສາມາດນໍາໄປສູ່ການຫຼຸດລົງຂອງຜົນຜະລິດ້ໍາຕານຢ່າງຫນ້ອຍ 10-15% ແລະເຖິງແມ່ນເຖິງ 18%.ພວກ​ເຮົາ.ວິທີການນີ້ຖືກນໍາໃຊ້ສໍາລັບການຜະລິດຂະຫນາດໃຫຍ່ຕື່ມອີກຂອງຊິ້ນສ່ວນ oligosaccharide.ACH ທີ່ໄດ້ຮັບຜົນແລະຊິ້ນສ່ວນຕໍ່ມາຂອງມັນທີ່ມີນ້ໍາຫນັກໂມເລກຸນທີ່ແຕກຕ່າງກັນໄດ້ຖືກນໍາໃຊ້ເປັນອຸປະກອນການທົດລອງສໍາລັບການກໍານົດລັກສະນະຂອງ oligosaccharides ໃນວຽກງານນີ້.
ຫຼັງຈາກການປິ່ນປົວດ້ວຍ pretreatment ແລະ enzymatic hydrolysis, oligosaccharides ຄົງທີ່ຍັງຄົງບໍ່ມີນ້ໍາ.ທີ່ນີ້ (A) ແມ່ນວິທີການແຍກ oligosaccharide ເຊິ່ງ oligosaccharides ຖືກແຍກອອກຈາກ AFEX-pretreated corn stover hydrolyzate (ACSH) ໂດຍໃຊ້ຕຽງບັນຈຸຂອງຄາບອນ activated ແລະແຜ່ນດິນໂລກ diatomaceous;(B) ວິທີການແຍກ oligosaccharides.oligosaccharides ໄດ້ຖືກແຍກອອກຕື່ມອີກໂດຍການຍົກເວັ້ນ chromatography (SEC);(C) Saccharide monomers ແລະ oligomers ປ່ອຍອອກມາຈາກ pretreatments ຕ່າງໆ (ອາຊິດ diluted: DA, ionic liquid: IL ແລະ AFEX).ເງື່ອນ​ໄຂ hydrolysis enzymatic: ການໂຫຼດຂອງແຂງສູງ 25% (w/w) (ປະມານ 8% ການໂຫຼດ glucan), hydrolysis 96 ຊົ່ວໂມງ, ການໂຫຼດ enzyme 20 mg/g (Ctec2:Htec2:MP-2:1:1 ອັດຕາສ່ວນ) ແລະ (D) ້ໍາຕານ monomers ແລະ oligomers ຂອງ glucoseara AF, xylostre ເຕົາອົບແລະ AC ປ່ອຍອອກມາ.
ການວິເຄາະ Glycan ໄດ້ພິສູດວ່າເປັນເຄື່ອງມືທີ່ເປັນປະໂຫຍດສໍາລັບການວິເຄາະໂຄງສ້າງທີ່ສົມບູນແບບຂອງ glycans ໃນສານສະກັດຈາກທີ່ແຍກອອກຈາກການຕົກຄ້າງຂອງຊີວະມວນແຂງ.ຢ່າງໃດກໍ່ຕາມ, saccharides ທີ່ລະລາຍໃນນ້ໍາແມ່ນບໍ່ມີການສະແດງໂດຍໃຊ້ວິທີການແບບດັ້ງເດີມນີ້ 41 ເນື່ອງຈາກວ່າ oligosaccharides ທີ່ມີນ້ໍາຫນັກໂມເລກຸນຕ່ໍາແມ່ນຍາກທີ່ຈະ immobilize ໃນແຜ່ນ ELISA ແລະຖືກລ້າງອອກກ່ອນທີ່ຈະເພີ່ມພູມຕ້ານທານ.ດັ່ງນັ້ນ, ສໍາລັບການຜູກມັດຂອງພູມຕ້ານທານແລະການກໍານົດລັກສະນະ, ວິທີການ biotinylation ຂັ້ນຕອນດຽວໄດ້ຖືກນໍາໃຊ້ເພື່ອເຄືອບ oligosaccharides ທີ່ລະລາຍ, ທີ່ບໍ່ສອດຄ່ອງກັນໃນແຜ່ນ ELISA ທີ່ມີ avidin.ວິທີການນີ້ໄດ້ຖືກທົດສອບໂດຍໃຊ້ ACSH ທີ່ຜະລິດໃນເມື່ອກ່ອນຂອງພວກເຮົາແລະສ່ວນຫນຶ່ງໂດຍອີງໃສ່ນ້ໍາຫນັກໂມເລກຸນຂອງມັນ (ຫຼືລະດັບຂອງໂພລີເມີ, DP).biotinylation ຂັ້ນຕອນດຽວໄດ້ຖືກນໍາໃຊ້ເພື່ອເພີ່ມຄວາມຜູກພັນການຜູກມັດ oligosaccharide ໂດຍການເພີ່ມ biotin-LC-hydrazide ໃນການຫຼຸດຜ່ອນຄາໂບໄຮເດດ (ຮູບ 2).ໃນການແກ້ໄຂ, ກຸ່ມ hemiacetal ໃນຕອນທ້າຍຂອງການຫຼຸດຜ່ອນປະຕິກິລິຍາກັບກຸ່ມ hydrazide ຂອງ biotin-LC-hydrazide ເພື່ອສ້າງເປັນພັນທະບັດ hydrazone.ໃນທີ່ປະທັບຂອງຕົວແທນການຫຼຸດຜ່ອນ NaCNBH3, ພັນທະບັດ hydrazone ຖືກຫຼຸດລົງເປັນຜະລິດຕະພັນສຸດທ້າຍ biotinylated ທີ່ຫມັ້ນຄົງ.ດ້ວຍການດັດແປງການຫຼຸດຜ່ອນນໍ້າຕານ, ການຜູກມັດຂອງ DP oligosaccharides ຕ່ໍາກັບແຜ່ນ ELISA ເປັນໄປໄດ້, ແລະໃນການສຶກສາຂອງພວກເຮົານີ້ໄດ້ຖືກເຮັດໃນແຜ່ນທີ່ເຄືອບ avidin ໂດຍໃຊ້ glycan-targeted mAbs.
ການກວດສອບພູມຕ້ານທານ monoclonal ໂດຍອີງໃສ່ ELISA ສໍາລັບ biotinylated oligosaccharides.ທີ່ນີ້ (A) ປະສົມປະສານ biotinylation ຂອງ oligosaccharides ແລະການກວດ ELISA ຕໍ່ມາກັບ mAbs ເປົ້າຫມາຍ glycan ໃນແຜ່ນເຄືອບ NeutrAvidin ແລະ (B) ສະແດງໃຫ້ເຫັນຂັ້ນຕອນຫນຶ່ງຂັ້ນຕອນສໍາລັບ biotinylation ຂອງຜະລິດຕະພັນຕິກິຣິຍາ.
ຫຼັງຈາກນັ້ນ, ແຜ່ນທີ່ເຄືອບ Avidin ກັບ oligosaccharide-conjugated antibodies ໄດ້ຖືກເພີ່ມເຂົ້າໄປໃນພູມຕ້ານທານປະຖົມແລະມັດທະຍົມແລະລ້າງໃນຂະຫນາດກາງທີ່ອ່ອນໄຫວແລະເວລາ.ຫຼັງ​ຈາກ​ການ​ຜູກ​ມັດ​ພູມ​ຕ້ານ​ທານ​ສໍາ​ເລັດ​ສົມ​ບູນ​, ເພີ່ມ TMB substrate ເພື່ອ incubate ແຜ່ນ​.ສຸດທ້າຍປະຕິກິລິຍາໄດ້ຖືກຢຸດເຊົາດ້ວຍອາຊິດຊູນຟູຣິກ.ແຜ່ນ incubated ໄດ້ຖືກວິເຄາະໂດຍໃຊ້ ELISA reader ເພື່ອກໍານົດຄວາມເຂັ້ມແຂງຜູກມັດຂອງແຕ່ລະ antibody ເພື່ອກວດຫາການເຊື່ອມຕໍ່ຂ້າມຂອງ antibody ສະເພາະ.ສໍາລັບລາຍລະອຽດແລະຕົວກໍານົດການຂອງການທົດລອງ, ເບິ່ງພາກສ່ວນທີ່ສອດຄ້ອງກັນ "ວັດສະດຸແລະວິທີການ".
ພວກເຮົາສະແດງໃຫ້ເຫັນເຖິງຜົນປະໂຫຍດຂອງວິທີການທີ່ພັດທະນາໃຫມ່ນີ້ສໍາລັບຄໍາຮ້ອງສະຫມັກສະເພາະໂດຍລັກສະນະຂອງ oligosaccharides ທີ່ລະລາຍທີ່ມີຢູ່ໃນ ACSH ເຊັ່ນດຽວກັນກັບຊິ້ນສ່ວນ oligosaccharide ດິບແລະບໍລິສຸດທີ່ແຍກອອກຈາກ hydrolysates lignocellulosic.ດັ່ງທີ່ສະແດງຢູ່ໃນຮູບທີ 3, xylans ທີ່ຖືກທົດແທນໂດຍ epitope ທົ່ວໄປທີ່ສຸດທີ່ຖືກລະບຸໄວ້ໃນ ACSH ໂດຍໃຊ້ວິທີການກວດສອບ glycome bioacylated ປົກກະຕິແລ້ວແມ່ນ uronic (U) ຫຼື methyluronic (MeU) ແລະ pectic arabinogalactans.ພວກມັນສ່ວນໃຫຍ່ຍັງໄດ້ຖືກພົບເຫັນຢູ່ໃນການສຶກສາທີ່ຜ່ານມາຂອງພວກເຮົາກ່ຽວກັບການວິເຄາະ glycans ຂອງແຂງທີ່ບໍ່ແມ່ນ hydrolyzed (UHS)43.
ການກວດພົບຂອງ epitopes oligosaccharide recalcitrant ໂດຍໃຊ້ antibody monoclonal ມຸ້ງໄປຫາ glycan ກໍາແພງຈຸລັງ.ສ່ວນ “ເປັນກາງ” ແມ່ນສ່ວນ ACN ແລະສ່ວນ “ອາຊິດ” ແມ່ນສ່ວນຂອງ FA.ສີແດງສົດໃສກວ່າຢູ່ໃນແຜນທີ່ຄວາມຮ້ອນຊີ້ໃຫ້ເຫັນເຖິງເນື້ອໃນ epitope ສູງກວ່າ, ແລະສີຟ້າສົດໃສຊີ້ໃຫ້ເຫັນພື້ນຫລັງຫວ່າງເປົ່າ.ຄ່າສີໃນຂະໜາດແມ່ນອີງໃສ່ຄ່າ OD ດິບສຳລັບສູດ N=2.epitopes ຕົ້ນຕໍທີ່ຮັບຮູ້ໂດຍພູມຕ້ານທານແມ່ນສະແດງຢູ່ເບື້ອງຂວາ.
ໂຄງສ້າງທີ່ບໍ່ແມ່ນ cellulose ເຫຼົ່ານີ້ບໍ່ສາມາດຖືກຕັດອອກໂດຍ cellulases ແລະ hemicellulases ທົ່ວໄປທີ່ສຸດໃນການປະສົມ enzyme ການຄ້າທີ່ທົດສອບ, ເຊິ່ງປະກອບມີ enzymes ການຄ້າທີ່ໃຊ້ທົ່ວໄປທີ່ສຸດ.ດັ່ງນັ້ນ, enzymes ເສີມໃຫມ່ແມ່ນຕ້ອງການສໍາລັບການ hydrolysis ຂອງເຂົາເຈົ້າ.ຖ້າບໍ່ມີ enzymes ທີ່ບໍ່ແມ່ນ cellulose ທີ່ຈໍາເປັນ, ພັນທະບັດທີ່ບໍ່ແມ່ນ cellulose ເຫຼົ່ານີ້ປ້ອງກັນການປ່ຽນເປັນ monosaccharides ຢ່າງສົມບູນ, ເຖິງແມ່ນວ່າໂພລີເມີນ້ໍາຕານຂອງພໍ່ແມ່ຂອງພວກເຂົາຖືກ hydrolyzed ຢ່າງກວ້າງຂວາງເຂົ້າໄປໃນຊິ້ນທີ່ສັ້ນກວ່າແລະຖືກລະລາຍໂດຍໃຊ້ການປະສົມ enzyme ການຄ້າ.
ການສຶກສາການແຜ່ກະຈາຍສັນຍານເພີ່ມເຕີມແລະຄວາມເຂັ້ມແຂງການຜູກມັດຂອງມັນໄດ້ສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າ epitopes ຜູກມັດແມ່ນຕ່ໍາໃນອັດຕາສ່ວນນ້ໍາຕານ DP ສູງ (A, B, C, DP ເຖິງ 20+) ກ່ວາໃນສ່ວນຂອງ DP ຕ່ໍາ (D, E, F, DP) ໃນ dimers) (ຮູບ 1).ຊິ້ນສ່ວນອາຊິດແມ່ນພົບເລື້ອຍໃນ epitopes ທີ່ບໍ່ແມ່ນ cellulose ຫຼາຍກ່ວາຊິ້ນທີ່ເປັນກາງ.ປະກົດການເຫຼົ່ານີ້ແມ່ນສອດຄ່ອງກັບຮູບແບບທີ່ສັງເກດເຫັນໃນການສຶກສາທີ່ຜ່ານມາຂອງພວກເຮົາ, ບ່ອນທີ່ DP ສູງແລະ moieties ອາຊິດແມ່ນທົນທານຕໍ່ hydrolysis enzymatic ຫຼາຍ.ດັ່ງນັ້ນ, ການປະກົດຕົວຂອງ epitopes glycan ທີ່ບໍ່ແມ່ນ cellulose ແລະການທົດແທນ U ແລະ MeU ສາມາດປະກອບສ່ວນຢ່າງຫຼວງຫຼາຍຕໍ່ຄວາມຫມັ້ນຄົງຂອງ oligosaccharides.ມັນຄວນຈະສັງເກດວ່າປະສິດທິພາບການຜູກມັດແລະການກວດພົບສາມາດເປັນບັນຫາສໍາລັບ DP oligosaccharides ຕ່ໍາ, ໂດຍສະເພາະຖ້າ epitope ແມ່ນ dimeric ຫຼື trimeric oligosaccharide.ນີ້ສາມາດຖືກທົດສອບໂດຍໃຊ້ oligosaccharides ການຄ້າທີ່ມີຄວາມຍາວແຕກຕ່າງກັນ, ແຕ່ລະຄົນມີພຽງຫນຶ່ງ epitope ທີ່ຜູກມັດກັບ mAb ສະເພາະ.
ດັ່ງນັ້ນ, ການນໍາໃຊ້ antibodies ໂຄງສ້າງສະເພາະໄດ້ເປີດເຜີຍບາງປະເພດຂອງພັນທະບັດ recalcitrant.ອີງຕາມປະເພດຂອງພູມຕ້ານທານທີ່ໃຊ້, ຮູບແບບການຜູກມັດທີ່ເຫມາະສົມ, ແລະຄວາມເຂັ້ມແຂງຂອງສັນຍານທີ່ມັນຜະລິດ (ຫຼາຍທີ່ສຸດແລະຫນ້ອຍທີ່ສຸດ), ເອນໄຊໃຫມ່ສາມາດຖືກກໍານົດແລະເພີ່ມເຄິ່ງປະລິມານເຂົ້າໄປໃນສ່ວນປະສົມຂອງ enzyme ສໍາລັບການປ່ຽນ glycoconversion ຢ່າງສົມບູນ.ເອົາການວິເຄາະຂອງ ACSH oligosaccharides ເປັນຕົວຢ່າງ, ພວກເຮົາສາມາດສ້າງຖານຂໍ້ມູນຂອງພັນທະບັດ glycan ສໍາລັບແຕ່ລະວັດສະດຸຊີວະມວນ.ມັນຄວນຈະສັງເກດເຫັນໃນທີ່ນີ້ວ່າຄວາມກ່ຽວຂ້ອງທີ່ແຕກຕ່າງກັນຂອງພູມຕ້ານທານຄວນໄດ້ຮັບການພິຈາລະນາ, ແລະຖ້າຫາກວ່າຄວາມໃກ້ຊິດຂອງເຂົາເຈົ້າແມ່ນບໍ່ຮູ້ຈັກ, ນີ້ຈະສ້າງຄວາມຫຍຸ້ງຍາກສະເພາະໃດຫນຶ່ງໃນເວລາທີ່ການປຽບທຽບສັນຍານຂອງພູມຕ້ານທານທີ່ແຕກຕ່າງກັນ.ນອກຈາກນັ້ນ, ການປຽບທຽບຂອງພັນທະບັດ glycan ອາດຈະເຮັດວຽກທີ່ດີທີ່ສຸດລະຫວ່າງຕົວຢ່າງສໍາລັບພູມຕ້ານທານດຽວກັນ.ພັນທະບັດທີ່ແຂງກະດ້າງເຫຼົ່ານີ້ຫຼັງຈາກນັ້ນສາມາດເຊື່ອມຕໍ່ກັບຖານຂໍ້ມູນ CAZyme, ຈາກທີ່ພວກເຮົາສາມາດກໍານົດ enzymes, ເລືອກ enzymes ຜູ້ສະຫມັກແລະການທົດສອບສໍາລັບ enzymes ທໍາລາຍພັນທະບັດ, ຫຼືພັດທະນາລະບົບຈຸລິນຊີເພື່ອສະແດງ enzymes ເຫຼົ່ານີ້ສໍາລັບການນໍາໃຊ້ໃນ biorefineries44.
ເພື່ອປະເມີນວິທີການເສີມພູມຄຸ້ມກັນໃຫ້ສົມບູນແບບວິທີການທາງເລືອກສໍາລັບລັກສະນະ oligosaccharides ທີ່ມີນ້ໍາຫນັກໂມເລກຸນຕ່ໍາທີ່ມີຢູ່ໃນ lignocellulosic hydrolysates, ພວກເຮົາໄດ້ປະຕິບັດ MALDI (ຮູບ 4, S1-S8) ແລະການວິເຄາະຂອງ saccharides ທີ່ມາຈາກ TMS ໂດຍອີງໃສ່ GC-MS ໃນກະດານດຽວກັນ (ຮູບ 5) part oligo.MALDI ຖືກນໍາໃຊ້ເພື່ອປຽບທຽບວ່າການກະຈາຍມະຫາຊົນຂອງໂມເລກຸນ oligosaccharide ກົງກັບໂຄງສ້າງທີ່ມີຈຸດປະສົງ.ໃນຮູບ.4 ສະແດງໃຫ້ເຫັນ MC ຂອງອົງປະກອບທີ່ເປັນກາງ ACN-A ແລະ ACN-B.ການວິເຄາະ ACN-A ໄດ້ຢືນຢັນລະດັບນໍ້າຕານ pentose ຕັ້ງແຕ່ DP 4–8 (ຮູບ 4) ຫາ DP 22 (ຮູບ S1), ນໍ້າໜັກຂອງມັນມີປະລິມານເທົ່າກັບ MeU-xylan oligosaccharides.ການວິເຄາະ ACN-B ໄດ້ຢືນຢັນຊຸດ pentose ແລະ glucoxylan ກັບ DP 8-15.ໃນອຸປະກອນເສີມເຊັ່ນຮູບ S3, ແຜນທີ່ການແຜ່ກະຈາຍມະຫາຊົນຂອງອາຊິດ moiety ຂອງ FA-C ສະແດງໃຫ້ເຫັນລະດັບຂອງ (Me)U ແທນນ້ໍາຕານ pentose ທີ່ມີ DP ຂອງ 8-15 ທີ່ສອດຄ່ອງກັບ xylans ທົດແທນທີ່ພົບໃນການກວດສອບ mAb ທີ່ອີງໃສ່ ELISA.epitopes ແມ່ນສອດຄ່ອງ.
MALDI-MS spectrum ຂອງ oligosaccharides ທີ່ລະລາຍທີ່ບໍ່ສອດຄ່ອງກັນທີ່ມີຢູ່ໃນ ACS.ທີ່ນີ້, (A) ACN-A ຊິ້ນສ່ວນທີ່ມີນ້ໍາຫນັກຕ່ໍາທີ່ມີອາຊິດ uronic methylated (DP 4-8) ທົດແທນ glucuroxylan oligosaccharides ແລະ (B) ACN-B xylan ແລະ methylated uronic acid oligosaccharides ທົດແທນດ້ວຍ glucuroxylan (DP 8-15).
ການວິເຄາະອົງປະກອບຂອງ residue glycan ຂອງ refractory oligosaccharides.ທີ່ນີ້ (A) ອົງປະກອບຂອງ TMS saccharide ຂອງຊິ້ນສ່ວນ oligosaccharide ຕ່າງໆທີ່ໄດ້ຮັບໂດຍໃຊ້ການວິເຄາະ GC-MS.(B) ໂຄງສ້າງຂອງນໍ້າຕານທີ່ມາຈາກ TMS ຕ່າງໆທີ່ມີຢູ່ໃນ oligosaccharides.ACN – ຊິ້ນສ່ວນຂອງອາເຊໂຕໄນໄຕທີ່ບັນຈຸເປັນກາງ oligosaccharides ແລະ FA – ຊິ້ນສ່ວນອາຊິດ ferulic ທີ່ບັນຈຸອາຊິດ oligosaccharides.
ການສະຫລຸບທີ່ຫນ້າສົນໃຈອີກອັນຫນຶ່ງແມ່ນໄດ້ມາຈາກການວິເຄາະ LC-MS ຂອງສ່ວນ oligosaccharide, ດັ່ງທີ່ສະແດງຢູ່ໃນຮູບ S9 (ວິທີການສາມາດເຫັນໄດ້ໃນອຸປະກອນເສີມເອເລັກໂຕຣນິກ).ຊິ້ນສ່ວນຂອງກຸ່ມ hexose ແລະ -OAc ໄດ້ຖືກສັງເກດເຫັນເລື້ອຍໆໃນລະຫວ່າງການຜູກມັດຂອງສ່ວນ ACN-B.ການຄົ້ນພົບນີ້ບໍ່ພຽງແຕ່ຢືນຢັນການແຕກແຍກທີ່ສັງເກດເຫັນໃນການວິເຄາະ glycome ແລະ MALDI-TOF, ແຕ່ຍັງໃຫ້ຂໍ້ມູນໃຫມ່ກ່ຽວກັບອະນຸພັນຄາໂບໄຮເດດທີ່ມີທ່າແຮງໃນຊີວະມວນຂອງ lignocellulosic pretreated.
ພວກເຮົາຍັງໄດ້ວິເຄາະສ່ວນປະກອບຂອງນໍ້າຕານຂອງສ່ວນ oligosaccharide ໂດຍໃຊ້ TMS derivatization ້ໍາຕານ.ການນໍາໃຊ້ GC-MS, ພວກເຮົາໄດ້ກໍານົດອົງປະກອບຂອງ neural (ບໍ່ແມ່ນອະນຸພັນ) ແລະນ້ໍາຕານອາຊິດ (GluA ແລະ GalA) ໃນສ່ວນ oligosaccharide (ຮູບ 5).ອາຊິດ Glucuronic ພົບເຫັນຢູ່ໃນອົງປະກອບທີ່ເປັນກົດ C ແລະ D, ໃນຂະນະທີ່ອາຊິດ galacturonic ພົບເຫັນຢູ່ໃນອົງປະກອບທີ່ເປັນກົດ A ແລະ B, ທັງສອງແມ່ນອົງປະກອບ DP ສູງຂອງນໍ້າຕານທີ່ເປັນກົດ.ຜົນໄດ້ຮັບເຫຼົ່ານີ້ບໍ່ພຽງແຕ່ຢືນຢັນຂໍ້ມູນ ELISA ແລະ MALDI ຂອງພວກເຮົາ, ແຕ່ຍັງສອດຄ່ອງກັບການສຶກສາທີ່ຜ່ານມາຂອງພວກເຮົາກ່ຽວກັບການສະສົມ oligosaccharide.ດັ່ງນັ້ນ, ພວກເຮົາເຊື່ອວ່າວິທີການພູມຕ້ານທານທີ່ທັນສະໄຫມໂດຍໃຊ້ biotinylation ຂອງ oligosaccharides ແລະການກວດ ELISA ຕໍ່ມາແມ່ນພຽງພໍເພື່ອກວດພົບ oligosaccharides recalcitrant ທີ່ລະລາຍໃນຕົວຢ່າງທາງຊີວະພາບຕ່າງໆ.
ນັບຕັ້ງແຕ່ວິທີການກວດສອບ mAb ທີ່ອີງໃສ່ ELISA ໄດ້ຖືກກວດສອບໂດຍວິທີການທີ່ແຕກຕ່າງກັນຫຼາຍ, ພວກເຮົາຕ້ອງການຄົ້ນຫາທ່າແຮງຂອງວິທີການປະລິມານໃຫມ່ນີ້ຕື່ມອີກ.ສອງ oligosaccharides ການຄ້າ, xylohexasaccharide oligosaccharide (XHE) ແລະ 23-α-L-arabinofuranosyl-xylotriose (A2XX), ຖືກຊື້ແລະທົດສອບໂດຍໃຊ້ວິທີການ mAb ໃໝ່ ແນໃສ່ glycan ກໍາແພງຈຸລັງ.ຮູບທີ 6 ສະແດງໃຫ້ເຫັນຄວາມສຳພັນເສັ້ນຊື່ລະຫວ່າງສັນຍານການຜູກມັດ biotinylated ແລະຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນຂອງ log ຂອງຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນຂອງ oligosaccharide, ແນະນໍາຮູບແບບການດູດຊຶມ Langmuir ທີ່ເປັນໄປໄດ້.ໃນບັນດາ mAbs, CCRC-M137, CCRC-M138, CCRC-M147, CCRC-M148, ແລະ CCRC-M151 ກ່ຽວຂ້ອງກັບ XHE, ແລະ CCRC-M108, CCRC-M109, ແລະ LM11 ກ່ຽວຂ້ອງກັບ A2XX ໃນຂອບເຂດຂອງ n 1010.ເນື່ອງຈາກການມີພູມຕ້ານທານທີ່ຈໍາກັດໃນລະຫວ່າງການທົດລອງ, ການທົດລອງຈໍາກັດໄດ້ຖືກປະຕິບັດດ້ວຍຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນຂອງ oligosaccharide ແຕ່ລະຄົນ.ມັນຄວນຈະສັງເກດເຫັນໃນທີ່ນີ້ວ່າບາງພູມຕ້ານທານປະຕິກິລິຍາແຕກຕ່າງກັນຫຼາຍກັບ oligosaccharide ດຽວກັນເປັນສານຍ່ອຍ, ອາດຈະເປັນຍ້ອນວ່າພວກມັນຜູກມັດກັບ epitopes ທີ່ແຕກຕ່າງກັນເລັກນ້ອຍແລະສາມາດມີຄວາມກ່ຽວຂ້ອງທີ່ແຕກຕ່າງກັນຫຼາຍ.ກົນໄກແລະຜົນສະທ້ອນຂອງການກໍານົດ epitope ທີ່ຖືກຕ້ອງຈະສັບສົນຫຼາຍເມື່ອວິທີການ mAb ໃຫມ່ຖືກນໍາໃຊ້ກັບຕົວຢ່າງທີ່ແທ້ຈິງ.
ສອງ oligosaccharides ການຄ້າຖືກໃຊ້ເພື່ອກໍານົດຂອບເຂດການກວດພົບຂອງ mAbs ເປົ້າຫມາຍ glycan ຕ່າງໆ.ໃນທີ່ນີ້, ການພົວພັນແບບເສັ້ນກັບຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນຂອງບັນທຶກຂອງຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນຂອງ oligosaccharide ຊີ້ໃຫ້ເຫັນຮູບແບບການດູດຊຶມ Langmuir ສໍາລັບ (A) XHE ກັບ mAb ແລະ (B) A2XX ກັບ mAb.epitopes ທີ່ສອດຄ້ອງກັນຊີ້ໃຫ້ເຫັນໂຄງສ້າງຂອງ oligosaccharides ການຄ້າທີ່ໃຊ້ເປັນຊັ້ນຍ່ອຍໃນການວິເຄາະ.
ການນໍາໃຊ້ພູມຕ້ານທານ monoclonal ເປົ້າຫມາຍ glycan (ການວິເຄາະ glycocomic ຫຼືການກວດສອບ mAb ທີ່ອີງໃສ່ ELISA) ແມ່ນເຄື່ອງມືທີ່ມີປະສິດທິພາບສໍາລັບການກໍານົດລັກສະນະໃນຄວາມເລິກຂອງ glycans ຝາຈຸລັງທີ່ສໍາຄັນສ່ວນໃຫຍ່ທີ່ປະກອບເປັນຊີວະມວນຂອງພືດ.ຢ່າງໃດກໍຕາມ, ການວິເຄາະ glycan ຄລາສສິກພຽງແຕ່ມີລັກສະນະ glycans ກໍາແພງຫີນຂະຫນາດໃຫຍ່, ເນື່ອງຈາກວ່າ oligosaccharides ສ່ວນໃຫຍ່ບໍ່ໄດ້ຖືກ immobilized ປະສິດທິພາບໃນແຜ່ນ ELISA.ໃນການສຶກສານີ້, ເຕົາສາລີທີ່ເຮັດກ່ອນ AFEX ໄດ້ຖືກ hydrolyzed enzymatically ທີ່ມີເນື້ອໃນຂອງແຂງສູງ.ການວິເຄາະ້ໍາຕານຖືກນໍາໃຊ້ເພື່ອກໍານົດອົງປະກອບຂອງຄາໂບໄຮເດຣດຂອງກໍາແພງຈຸລັງ recalcitrant ໃນ hydrolyzate.ຢ່າງໃດກໍ່ຕາມ, ການວິເຄາະ mAb ຂອງ oligosaccharides ຂະຫນາດນ້ອຍກວ່າໃນ hydrolysates ແມ່ນຄາດຄະເນຫນ້ອຍ, ແລະເຄື່ອງມືເພີ່ມເຕີມແມ່ນຈໍາເປັນເພື່ອ immobilize oligosaccharides ໃນແຜ່ນ ELISA ຢ່າງມີປະສິດທິຜົນ.
ພວກເຮົາລາຍງານຢູ່ທີ່ນີ້ວິທີການ immobilization oligosaccharide ທີ່ມີປະສິດຕິພາບແລະມີປະສິດທິພາບສໍາລັບການກວດສອບ mAb ໂດຍການລວມເອົາ biotinylation oligosaccharide ຕິດຕາມດ້ວຍການກວດ ELISA ໃນແຜ່ນເຄືອບ NeutrAvidin™.oligosaccharides biotinylated immobilized ສະແດງໃຫ້ເຫັນຄວາມໃກ້ຊິດທີ່ພຽງພໍສໍາລັບພູມຕ້ານທານເພື່ອເຮັດໃຫ້ການກວດພົບຢ່າງໄວວາແລະປະສິດທິພາບຂອງ oligosaccharides recalcitrant.ການວິເຄາະອົງປະກອບຂອງ oligosaccharides ທີ່ແຂງກະດ້າງເຫຼົ່ານີ້ໂດຍອີງໃສ່ spectrometry ມະຫາຊົນໄດ້ຢືນຢັນຜົນໄດ້ຮັບຂອງວິທີການໃຫມ່ນີ້ເພື່ອ immunoscreening.ດັ່ງນັ້ນ, ການສຶກສາເຫຼົ່ານີ້ສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າການປະສົມປະສານຂອງ biotinylation oligosaccharide ແລະການກວດ ELISA ກັບພູມຕ້ານທານ monoclonal ເປົ້າຫມາຍ glycan ສາມາດນໍາໃຊ້ເພື່ອກວດພົບການເຊື່ອມຕໍ່ຂ້າມໃນ oligosaccharides ແລະສາມາດຖືກນໍາໃຊ້ຢ່າງກວ້າງຂວາງໃນການສຶກສາຊີວະເຄມີອື່ນໆທີ່ມີລັກສະນະໂຄງສ້າງຂອງ oligosaccharides.
ວິທີການ profile glycan ທີ່ອີງໃສ່ biotin ນີ້ແມ່ນບົດລາຍງານທໍາອິດທີ່ສາມາດສືບສວນພັນທະບັດຄາໂບໄຮເດດ recalcitrant ຂອງ oligosaccharides ທີ່ລະລາຍໃນຊີວະມວນພືດ.ອັນນີ້ຊ່ວຍໃຫ້ເຂົ້າໃຈວ່າເປັນຫຍັງບາງສ່ວນຂອງຊີວະມວນຈຶ່ງແຂງກະດ້າງເມື່ອເວົ້າເຖິງການຜະລິດນໍ້າມັນເຊື້ອໄຟຊີວະພາບ.ວິທີການນີ້ຕື່ມຊ່ອງຫວ່າງທີ່ສໍາຄັນໃນວິທີການວິເຄາະ glycome ແລະຂະຫຍາຍການນໍາໃຊ້ຂອງມັນໄປສູ່ຊັ້ນຍ່ອຍທີ່ກວ້າງກວ່າ oligosaccharides ຂອງພືດ.ໃນອະນາຄົດ, ພວກເຮົາອາດຈະນໍາໃຊ້ຫຸ່ນຍົນສໍາລັບ biotinylation ແລະນໍາໃຊ້ວິທີການທີ່ພວກເຮົາໄດ້ພັດທະນາສໍາລັບການວິເຄາະຜ່ານສູງຂອງຕົວຢ່າງໂດຍໃຊ້ ELISA.
ເຟືອງສາລີ (CS) ທີ່ປູກຈາກແກ່ນລູກປະສົມ Pioneer 33A14 ໄດ້ຖືກເກັບກ່ຽວໃນປີ 2010 ຈາກ Kramer Farms ໃນ Ray, Colorado.ດ້ວຍການອະນຸຍາດຂອງເຈົ້າຂອງທີ່ດິນ, ຊີວະມວນນີ້ສາມາດຖືກນໍາໃຊ້ເພື່ອການຄົ້ນຄວ້າ. ຕົວຢ່າງໄດ້ຖືກເກັບຮັກສາໄວ້ແຫ້ງ < 6% ຄວາມຊຸ່ມໃນຖົງ zip-lock ໃນອຸນຫະພູມຫ້ອງ. ຕົວຢ່າງໄດ້ຖືກເກັບຮັກສາໄວ້ແຫ້ງ < 6% ຄວາມຊຸ່ມໃນຖົງ zip-lock ໃນອຸນຫະພູມຫ້ອງ. Образцы хранились сухими при влажности < 6% в пакетах с застежкой-молнией при комнатной температуре. ຕົວຢ່າງໄດ້ຖືກເກັບໄວ້ແຫ້ງຢູ່ທີ່ຄວາມຊຸ່ມຊື່ນ <6% ໃນຖົງ zippered ຢູ່ໃນອຸນຫະພູມຫ້ອງ.样品在室温下以干燥< 6% 的水分储存在自封袋中。样品在室温下以干燥< 6% Образцы хранят в пакетах с застежкой-молнией при комнатной температуре с влажностью < 6%. ຕົວຢ່າງຖືກເກັບໄວ້ໃນຖົງ zipper ຢູ່ທີ່ອຸນຫະພູມຫ້ອງທີ່ມີຄວາມຊຸ່ມຊື່ນ < 6%.ການສຶກສາປະຕິບັດຕາມຄໍາແນະນໍາທ້ອງຖິ່ນແລະລະດັບຊາດ.ການວິເຄາະອົງປະກອບໄດ້ຖືກປະຕິບັດໂດຍໃຊ້ໂປໂຕຄອນ NREL.ອົງປະກອບໄດ້ຖືກພົບເຫັນວ່າມີ 31.4% glucan, 18.7% xylan, 3.3% arabinan, 1.2% galactan, 2.2% acetyl, 14.3% lignin, 1.7% ທາດໂປຼຕີນແລະ 13. 4% ຂີ້ເທົ່າ.
Cellic® CTec2 (138 mg protein/ml, lot VCNI 0001) ແມ່ນສ່ວນປະສົມຂອງ cellulase, β-glucosidase ແລະ Cellic® HTec2 (157 mg protein/ml, lot VHN00001) ຈາກ Novozymes (Franklinton, NC, USA).Multifect Pectinase® (72 mg protein/mL), ທາດປະສົມທີ່ຊັບຊ້ອນຂອງ enzymes degrading pectin, ຖືກບໍລິຈາກໂດຍ DuPont Industrial Biosciences (Palo Alto, CA, USA).ຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນຂອງທາດໂປຼຕີນຈາກເອນໄຊໄດ້ຖືກກໍານົດໂດຍການຄາດຄະເນເນື້ອໃນຂອງທາດໂປຼຕີນ (ແລະລົບການປະກອບສ່ວນຂອງໄນໂຕຣເຈນທີ່ບໍ່ມີທາດໂປຼຕີນ) ໂດຍໃຊ້ການວິເຄາະໄນໂຕຣເຈນ Kjeldahl (ວິທີການ AOAC 2001.11, Dairy One Cooperative Inc., Ithaca, NY, USA).Diatomaceous earth 545 ໄດ້ຊື້ຈາກ EMD Millipore (Billerica, MA).ກາກບອນທີ່ເປີດໃຊ້ງານ (DARCO, 100 mesh granules), Avicel (PH-101), beech xylan, ແລະສານເຄມີອື່ນໆທັງຫມົດແມ່ນໄດ້ຊື້ຈາກ Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).
ການປິ່ນປົວ AFEX ໄດ້ຖືກປະຕິບັດຢູ່ GLBRC (ຫ້ອງທົດລອງການຄົ້ນຄວ້າການປ່ຽນແປງຊີວະມວນ, MSU, Lansing, MI, USA).ການປິ່ນປົວເບື້ອງຕົ້ນແມ່ນດໍາເນີນຢູ່ທີ່ 140 ° C. ສໍາລັບ 15 ນາທີ.46 ເວລາທີ່ຢູ່ອາໄສໃນອັດຕາສ່ວນ 1: 1 ຂອງແອມໂມເນຍທີ່ບໍ່ມີນ້ໍາກັບຊີວະມວນຢູ່ທີ່ 60% (w/w) ການໂຫຼດຢູ່ໃນເຕົາປະຕິກອນ benchtop ສະແຕນເລດ (ບໍລິສັດ Parr Instruments).ມັນໃຊ້ເວລາ 30 ນາທີ.ເຕົາປະຕິກອນໄດ້ຖືກນໍາມາຢູ່ທີ່ 140 ° C ແລະແອມໂມເນຍໄດ້ຖືກປ່ອຍອອກມາຢ່າງໄວວາ, ເຮັດໃຫ້ຊີວະມວນກັບຄືນສູ່ອຸນຫະພູມຫ້ອງຢ່າງໄວວາ.ອົງປະກອບຂອງເຕົາສາລີທີ່ປິ່ນປົວກ່ອນ AFEX (ACS) ແມ່ນຄ້າຍຄືກັນກັບເຕົາສາລີທີ່ບໍ່ໄດ້ຮັບການປິ່ນປົວ (UT-CS).
ທາດແຂງສູງ ACSH 25% (w/w) (ປະມານ 8% ການໂຫຼດ dextran) ໄດ້ຖືກກະກຽມເປັນວັດສະດຸເລີ່ມຕົ້ນສໍາລັບການຜະລິດຂະຫນາດໃຫຍ່ຂອງ oligosaccharides.enzymatic hydrolysis ຂອງ ACS ໄດ້ຖືກປະຕິບັດໂດຍໃຊ້ສ່ວນປະສົມຂອງ enzyme ການຄ້າລວມທັງ Cellic® Ctec2 10 mg protein/g glucan (ໃນຊີວະມວນທີ່ເຮັດກ່ອນ), Htec2 (Novozymes, Franklinton, NC), 5 mg protein/g glucan, ແລະ Multifect Pectinase (Genencor Inc, USA).).), ໂປຣຕີນ 5 mg/g dextran.ການ​ລະ​ເຫີຍ​ຂອງ​ເອນ​ໄຊ​ໄດ້​ຖືກ​ປະ​ຕິ​ບັດ​ໃນ bioreactor 5 ລິດ​ທີ່​ມີ​ປະ​ລິ​ມານ​ການ​ເຮັດ​ວຽກ​ຂອງ 3 ລິດ​, pH 4.8​, 50 ° C ແລະ 250 rpm​.ຫຼັງຈາກ hydrolysis ສໍາລັບ 96 ຊົ່ວໂມງ, hydrolyzate ໄດ້ຖືກເກັບກໍາໂດຍການ centrifugation ທີ່ 6000 rpm ສໍາລັບ 30 ນາທີແລະຫຼັງຈາກນັ້ນຢູ່ທີ່ 14000 rpm ສໍາລັບ 30 ນາທີເພື່ອເອົາຂອງແຂງ unhydrolysed.ຫຼັງຈາກນັ້ນ, hydrolyzate ໄດ້ຖືກນໍາໄປໃສ່ການກັ່ນຕອງເປັນຫມັນໂດຍຜ່ານ beaker ການກັ່ນຕອງ 0.22 ມມ.hydrolyzate ທີ່ຖືກກັ່ນຕອງຖືກເກັບໄວ້ໃນຂວດທີ່ບໍ່ສະອາດຢູ່ທີ່ 4 ° C. ແລະຫຼັງຈາກນັ້ນແບ່ງສ່ວນໃສ່ຄາບອນ.
ການວິເຄາະອົງປະກອບຂອງຕົວຢ່າງຊີວະມວນສານສະກັດຈາກຕາມຂັ້ນຕອນການວິເຄາະຫ້ອງທົດລອງ NREL: ການກະກຽມຕົວຢ່າງສໍາລັບການວິເຄາະອົງປະກອບ (NREL/TP-510-42620) ແລະການກໍານົດທາດຄາໂບໄຮເດດໂຄງສ້າງແລະລິກນິນໃນຊີວະມວນ (NREL/TP-510 – 42618)47.
ການວິເຄາະ Oligosaccharide ຂອງສາຍນ້ໍາ hydrolyzate ໄດ້ຖືກປະຕິບັດໃນຂະຫນາດ 2 ml ໂດຍໃຊ້ວິທີການ hydrolysis ອາຊິດ autoclave.ປະສົມຕົວຢ່າງ hydrolyzate ກັບ 69.7 µl ຂອງອາຊິດຊູນຟູຣິກ 72% ໃນທໍ່ປູກຝັງ screw 10 ml ແລະ incubate ສໍາລັບ 1 ຊົ່ວໂມງເທິງ benchtop ຢູ່ທີ່ 121 °C, ເຢັນເທິງກ້ອນແລະການກັ່ນຕອງເຂົ້າໄປໃນ vial ຂອງແຫຼວ chromatography (HPLC) ປະສິດທິພາບສູງ.ຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນຂອງ oligosaccharides ໄດ້ຖືກກໍານົດໂດຍການຫັກລົບຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນຂອງ monosaccharides ໃນຕົວຢ່າງທີ່ບໍ່ແມ່ນ hydrolyzed ຈາກຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນຂອງນ້ໍາຕານທັງຫມົດໃນຕົວຢ່າງອາຊິດ hydrolyzed.
ຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນຂອງ Glucose, xylose, ແລະ arabinose ໃນຊີວະມວນອາຊິດ hydrolysed ໄດ້ຖືກວິເຄາະໂດຍໃຊ້ລະບົບ Shimadzu HPLC ທີ່ມີເຄື່ອງເກັບຕົວຢ່າງອັດຕະໂນມັດ, ເຄື່ອງເຮັດຄວາມຮ້ອນຖັນ, ປັ໊ມ isocratic, ແລະເຄື່ອງກວດຈັບດັດຊະນີ refractive ໃນຖັນ Bio-Rad Aminex HPX-87H.ຖັນໄດ້ຖືກຮັກສາໄວ້ທີ່ 50 ° C ແລະ eluted ດ້ວຍ 0.6 ml / min 5 mM H2SO4 ໃນນ້ໍາ.ໄຫຼ.
supernatant hydrolyzate ໄດ້ຖືກເຈືອຈາງແລະວິເຄາະສໍາລັບເນື້ອໃນ monomer ແລະ oligosaccharide.ນໍ້າຕານ monomeric ທີ່ໄດ້ຮັບຫຼັງຈາກ enzymatic hydrolysis ໄດ້ຖືກວິເຄາະໂດຍ HPLC ທີ່ຕິດຕັ້ງດ້ວຍຖັນ Bio-Rad (Hercules, CA) Aminex HPX-87P ແລະຖັນກອງຂີ້ເທົ່າ.ອຸນຫະພູມຖັນໄດ້ຖືກຮັກສາໄວ້ຢູ່ທີ່ 80 ° C, ນ້ໍາຖືກນໍາໃຊ້ເປັນໄລຍະມືຖືທີ່ມີອັດຕາການໄຫຼຂອງ 0.6 ml / ນາທີ.Oligosaccharides ຖືກກໍານົດໂດຍ hydrolysis ໃນອາຊິດເຈືອຈາງຢູ່ທີ່ 121 ° C ອີງຕາມວິທີການທີ່ອະທິບາຍໄວ້ໃນ refs.41, 48, 49.
ການວິເຄາະ saccharide ໄດ້ຖືກປະຕິບັດໃນວັດຖຸດິບ, AFEX ທີ່ໄດ້ຮັບການປິ່ນປົວກ່ອນແລະທັງຫມົດທີ່ຕົກຄ້າງຊີວະມວນທີ່ບໍ່ແມ່ນ hydrolysed (ລວມທັງການຜະລິດສານສະກັດຈາກກໍາແພງເຊນ serial ແລະການກວດສອບ mAb ຂອງພວກມັນ) ໂດຍໃຊ້ຂັ້ນຕອນທີ່ໄດ້ອະທິບາຍໄວ້ກ່ອນຫນ້ານີ້ 27, 43, 50, 51 .ສໍາລັບການວິເຄາະ glycome, ສານຕົກຄ້າງທີ່ບໍ່ລະລາຍຂອງເຫຼົ້າຂອງວັດສະດຸຝາຜະຫນັງຂອງພືດແມ່ນໄດ້ຖືກກະກຽມຈາກສານຕົກຄ້າງຂອງຊີວະມວນແລະໄດ້ຮັບການສະກັດຈາກ serial ດ້ວຍ reagents ທີ່ຮຸກຮານເພີ່ມຂຶ້ນເຊັ່ນ ammonium oxalate (50 mM), sodium carbonate (50 mM ແລະ 0.5% w / v), CON.(1M ແລະ 4M, ທັງ​ສອງ​ທີ່​ມີ 1% w/v sodium borohydride​) ແລະ​ອາ​ຊິດ chlorite ດັ່ງ​ທີ່​ອະ​ທິ​ບາຍ​ໃນ​ເມື່ອ​ກ່ອນ 52,53​.ສານສະກັດຈາກຫຼັງຈາກນັ້ນໄດ້ຖືກສົ່ງກັບ ELISA ຕໍ່ກັບແຜງສະລັບສັບຊ້ອນຂອງ mAb50s ທີ່ມຸ້ງໄປຫາ glycan ກໍາແພງເຊນ, ແລະປະຕິກິລິຍາການຜູກມັດ mAb ໄດ້ຖືກນໍາສະເຫນີເປັນແຜນທີ່ຄວາມຮ້ອນ.mAbs ເປົ້າໝາຍ glycan ຝາເຊລຂອງພືດໄດ້ຖືກຊື້ຈາກຮຸ້ນຫ້ອງທົດລອງ (CCRC, JIM ແລະ MAC ຊຸດ).
biotinylation ຫນຶ່ງຂັ້ນຕອນຂອງ oligosaccharides.ການປະສົມປະສານຂອງຄາໂບໄຮເດດກັບ biotin-LC-hydrazide ໄດ້ຖືກປະຕິບັດໂດຍໃຊ້ຂັ້ນຕອນຕໍ່ໄປນີ້.Biotin-LC-hydrazide (4.6 mg/12 μmol) ຖືກລະລາຍໃນ dimethyl sulfoxide (DMSO, 70 μl) ໂດຍການ stirring ຢ່າງແຂງແຮງແລະການໃຫ້ຄວາມຮ້ອນທີ່ 65 ° C. ສໍາລັບ 1 ນາທີ.Glacial acetic acid (30 µl) ໄດ້ຖືກເພີ່ມແລະສ່ວນປະສົມໄດ້ຖືກຖອກລົງໃສ່ sodium cyanoborohydride (6.4 mg/100 µmol) ແລະລະລາຍຫມົດຫຼັງຈາກໃຫ້ຄວາມຮ້ອນຢູ່ທີ່ 65 ° C. ປະມານ 1 ນາທີ.ຫຼັງຈາກນັ້ນ, ຈາກ 5 ຫາ 8 μlຂອງປະສົມປະຕິກິລິຢາໄດ້ຖືກເພີ່ມໃສ່ oligosaccharide ແຫ້ງ (1-100 nmol) ເພື່ອໃຫ້ໄດ້ຮັບການເກີນ 10-ເທົ່າຂອງ molar ຂອງປ້າຍຊື່ໃນໄລຍະການຫຼຸດຜ່ອນ.ປະຕິກິລິຍາໄດ້ຖືກປະຕິບັດຢູ່ທີ່ 65 ° C ເປັນເວລາ 2 ຊົ່ວໂມງ, ຫຼັງຈາກນັ້ນຕົວຢ່າງໄດ້ຖືກເຮັດຄວາມສະອາດທັນທີ.ບໍ່ມີ sodium cyanoborohydride ຖືກນໍາໃຊ້ໃນການທົດລອງການຕິດສະຫຼາກໂດຍບໍ່ມີການຫຼຸດລົງ, ແລະຕົວຢ່າງໄດ້ຖືກປະຕິກິລິຍາຢູ່ທີ່ 65 ° C. ສໍາລັບ 2.5 ຊົ່ວໂມງ.
ການເຄືອບ ELISA ແລະການລ້າງຕົວຢ່າງຂອງ biotinylated oligosaccharides.25 μlຂອງຕົວຢ່າງ biotinylated (100 μlຂອງແຕ່ລະຕົວຢ່າງເຂັ້ມຂຸ້ນ diluted ໃນ 5 ml ຂອງ 0.1 M Tris buffer solution (TBS)) ໄດ້ຖືກເພີ່ມໃສ່ແຕ່ລະດີຂອງແຜ່ນ avidin-coated.ຂຸມຄວບຄຸມໄດ້ຖືກເຄືອບດ້ວຍ 50 μlຂອງ biotin ທີ່ມີຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນຂອງ 10 μg / ml ໃນ 0.1 M TBS.ນ້ໍາ Deionized ໄດ້ຖືກນໍາໃຊ້ເປັນການເຄືອບສໍາລັບການວັດແທກເປົ່າ.ເມັດໄດ້ຖືກອົບເປັນເວລາ 2 ຊົ່ວໂມງໃນອຸນຫະພູມຫ້ອງໃນບ່ອນມືດ.ລ້າງຈານ 3 ເທື່ອດ້ວຍນົມ skimmed 0.1% ໃນ 0.1 M TBS ໂດຍໃຊ້ program no.11 ສໍາລັບ Grenier flat 3A.
ການເພີ່ມແລະການລ້າງພູມຕ້ານທານຂັ້ນຕົ້ນ.ເພີ່ມ 40 µl ຂອງພູມຕ້ານທານຂັ້ນຕົ້ນໃສ່ແຕ່ລະຂຸມ.ອົບ microplate ເປັນເວລາ 1 ຊົ່ວໂມງໃນອຸນຫະພູມຫ້ອງໃນບ່ອນມືດ.ຫຼັງຈາກນັ້ນ, ແຜ່ນໄດ້ຖືກລ້າງ 3 ເທື່ອດ້ວຍນົມ 0.1% ໃນ 0.1M TBS ໂດຍໃຊ້ໂຄງການລ້າງ #11 ສໍາລັບ Grenier Flat 3A.
ເພີ່ມພູມຕ້ານທານຮອງແລະລ້າງ.ເພີ່ມ 50 µl ຂອງພູມຕ້ານທານຂັ້ນສອງຂອງຫນູ / ຫນູ (ເຈືອຈາງ 1: 5000 ໃນນົມ 0.1% ໃນ 0.1 M TBS) ໃສ່ແຕ່ລະຂຸມ.ອົບ microplate ເປັນເວລາ 1 ຊົ່ວໂມງໃນອຸນຫະພູມຫ້ອງໃນບ່ອນມືດ.ຫຼັງຈາກນັ້ນ, microplates ໄດ້ຖືກລ້າງ 5 ເທື່ອດ້ວຍນົມ 0.1% ໃນ 0.1 M TBS ໂດຍໃຊ້ Grenier Flat 5A plate wash program #12.
ການເພີ່ມ substrate.ຕື່ມ 50 µl ຂອງ 3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine (TMB) ກັບ substrate ພື້ນຖານ (ໂດຍການເພີ່ມ 2 ຢອດຂອງ buffer, 3 ຢອດຂອງ TMB, 2 ຢອດ hydrogen peroxide ກັບ 15 ml ຂອງນ້ໍາ deionized).ກະກຽມ substrate TMB.ແລະ vortex ກ່ອນທີ່ຈະນໍາໃຊ້).Incubate microplate ໃນອຸນຫະພູມຫ້ອງສໍາລັບ 30 ນາທີ.ໃນຄວາມມືດ.
ສໍາເລັດຂັ້ນຕອນແລະອ່ານແທັບເລັດ.ຕື່ມ 50 µl ຂອງອາຊິດຊູນຟູຣິກ 1 N ໃສ່ແຕ່ລະຂຸມແລະບັນທຶກການດູດຊຶມຈາກ 450 ຫາ 655 nm ໂດຍໃຊ້ເຄື່ອງອ່ານ ELISA.
ກະກຽມວິທີແກ້ໄຂ 1 mg/ml ຂອງການວິເຄາະເຫຼົ່ານີ້ໃນນ້ໍາ deionized: arabinose, rhamnose, fucose, xylose, ອາຊິດ galacturonic (GalA), ອາຊິດ glucuronic (GlcA), mannose, glucose, galactose, lactose, N-acetylmannosamine (manNAc), N-acetylglucose.(glcNAc), N-acetylgalactosamine (galNAc), inositol (ມາດຕະຖານພາຍໃນ).ສອງມາດຕະຖານໄດ້ຖືກກະກຽມໂດຍການເພີ່ມການແກ້ໄຂນ້ໍາຕານ 1 mg/mL ທີ່ສະແດງຢູ່ໃນຕາຕະລາງ 1. ຕົວຢ່າງໄດ້ຖືກແຊ່ແຂງແລະ lyophilized ຢູ່ທີ່ -80 ° C. ຈົນກ່ວານ້ໍາທັງຫມົດຈະຖືກລຶບອອກ (ປົກກະຕິແລ້ວປະມານ 12-18 ຊົ່ວໂມງ).
ເພີ່ມ 100–500 µg ຂອງຕົວຢ່າງໃສ່ທໍ່ screw cap ກ່ຽວກັບການດຸ່ນດ່ຽງການວິເຄາະ.ບັນທຶກຈໍານວນທີ່ເພີ່ມ.ມັນດີທີ່ສຸດທີ່ຈະລະລາຍຕົວຢ່າງໃນຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນສະເພາະຂອງສານລະລາຍແລະຕື່ມໃສ່ທໍ່ເປັນ aliquot ແຫຼວ.ໃຊ້ 20 µl ຂອງ 1 mg/ml inositol ເປັນມາດຕະຖານພາຍໃນສໍາລັບແຕ່ລະທໍ່ຕົວຢ່າງ.ປະລິມານມາດຕະຖານພາຍໃນທີ່ເພີ່ມໃສ່ຕົວຢ່າງຕ້ອງເທົ່າກັບປະລິມານມາດຕະຖານພາຍໃນທີ່ເພີ່ມໃສ່ທໍ່ມາດຕະຖານ.
ຕື່ມ 8 ມລຂອງ methanol ທີ່ບໍ່ມີນ້ໍາໃສ່ໃນຂວດສະກູ.ຫຼັງຈາກນັ້ນ, 4 ml ຂອງ 3 N. ການແກ້ໄຂ methanolic HCl, capped ແລະ shaken.ຂະບວນການນີ້ບໍ່ໄດ້ໃຊ້ນ້ໍາ.
ເພີ່ມ 500 µl ຂອງ 1 M HCl methanol solution ເຂົ້າໄປໃນຕົວຢ່າງ oligosaccharide ແລະທໍ່ TMS ມາດຕະຖານ.ຕົວຢ່າງຖືກອົບຄ້າງຄືນ (168 ຊົ່ວໂມງ) ຢູ່ທີ່ 80 ° C. ໃນຖັງຄວາມຮ້ອນ.ຕາກໃຫ້ແຫ້ງຜະລິດຕະພັນ methanolysis ໃນອຸນຫະພູມຫ້ອງໂດຍໃຊ້ manifold ແຫ້ງ.ຕື່ມ 200 µl MeOH ແລະແຫ້ງອີກເທື່ອຫນຶ່ງ.ຂະບວນການນີ້ແມ່ນຊ້ໍາສອງຄັ້ງ.ຕື່ມ 200 µl ຂອງ methanol, 100 µl ຂອງ pyridine ແລະ 100 µl ຂອງ acetic anhydride ກັບຕົວຢ່າງແລະປົນກັນ.ຕົວຢ່າງໄດ້ຖືກອົບຢູ່ໃນອຸນຫະພູມຫ້ອງສໍາລັບ 30 ນາທີ.ແລະຕາກໃຫ້ແຫ້ງ.ຕື່ມ 200 µl ຂອງ methanol ແລະແຫ້ງອີກເທື່ອຫນຶ່ງ.
ຕື່ມ 200 µl ຂອງ Tri-Sil ແລະທໍ່ລະບາຍຄວາມຮ້ອນສໍາລັບ 20 ນາທີ.80°C, ຫຼັງຈາກນັ້ນເຮັດໃຫ້ເຢັນກັບອຸນຫະພູມຫ້ອງ.ໃຊ້ manifold ອົບແຫ້ງເພື່ອໃຫ້ຕົວຢ່າງແຫ້ງຕື່ມອີກໃນປະລິມານປະມານ 50 µl.ມັນເປັນສິ່ງສໍາຄັນທີ່ຈະສັງເກດວ່າພວກເຮົາບໍ່ໄດ້ອະນຸຍາດໃຫ້ຕົວຢ່າງແຫ້ງຫມົດ.
ຕື່ມ 2 ມລຂອງ hexane ແລະປົນກັນໂດຍ vortexing.ຕື່ມຂໍ້ມູນໃສ່ປາຍຂອງທໍ່ Pasteur (5-8 ມມ) ດ້ວຍຜ້າຂົນແກະແກ້ວໂດຍການໃສ່ຂົນແກ້ວໃສ່ເທິງຂອງທໍ່ເສັ້ນຜ່າສູນກາງ 5-3/4 ນິ້ວ.ຕົວຢ່າງໄດ້ຖືກ centrifuged ຢູ່ 3000 g ສໍາລັບ 2 ນາທີ.ໃດໆທີ່ຕົກຄ້າງທີ່ບໍ່ລະລາຍຈະຖືກ precipitated.ເຊັດຕົວຢ່າງໃຫ້ແຫ້ງ 100-150 µl.ປະລິມານປະມານ 1 μlໄດ້ຖືກສີດເຂົ້າໄປໃນ GC-MS ຢູ່ທີ່ອຸນຫະພູມເບື້ອງຕົ້ນຂອງ 80 ° C ແລະເວລາເບື້ອງຕົ້ນຂອງ 2.0 ນາທີ (ຕາຕະລາງ 2).