Nature.com'u ziyaret ettiğiniz için teşekkür ederiz. Kullandığınız tarayıcı sürümünün CSS desteği sınırlıdır. En iyi deneyim için, güncel bir tarayıcı kullanmanızı (veya Internet Explorer'da Uyumluluk Modunu devre dışı bırakmanızı) öneririz. Bu süre zarfında, desteğin devamlılığını sağlamak için siteyi stiller ve JavaScript olmadan görüntüleyeceğiz.
İlaç testleri için kalbin fizyolojik ortamını doğru bir şekilde yeniden üretebilen güvenilir bir in vitro sisteme ihtiyaç vardır. İnsan kalp dokusu kültür sistemlerinin sınırlı bulunabilirliği, kardiyak ilaç etkilerinin yanlış yorumlanmasına yol açmıştır. Burada, kalp dilimlerini elektromekanik olarak uyaran ve kardiyak döngünün sistolik ve diyastolik fazlarında fizyolojik gerilmeye maruz kalan bir kardiyak doku kültürü modeli (CTCM) geliştirdik. 12 günlük kültürden sonra, bu yaklaşım kalp kesitlerinin canlılığını kısmen iyileştirdi, ancak yapısal bütünlüklerini tam olarak koruyamadı. Bu nedenle, küçük molekül taramasından sonra, ortamımıza 100 nM triiyodotironin (T3) ve 1 μM deksametazon (Dex) eklenmesinin, kesitlerin mikro yapısını 12 gün boyunca koruduğunu bulduk. T3/Dex tedavisiyle birlikte, CTCM sistemi, transkripsiyonel profilleri, canlılığı, metabolik aktiviteyi ve yapısal bütünlüğü 12 gün boyunca taze kalp dokusuyla aynı seviyede korudu. Ek olarak, kültür ortamında kalp dokusunun aşırı gerilmesi hipertrofik kardiyak sinyalleşmeye neden olur ve bu da CTCM'nin kardiyak gerilmenin neden olduğu hipertrofik koşulları taklit etme yeteneğine dair kanıt sağlar. Sonuç olarak, CTCM, uzun süreler boyunca kültür ortamında kalbin fizyolojisini ve patofizyolojisini modelleyebilir ve güvenilir ilaç taramasına olanak tanır.
Klinik araştırmalardan önce, insan kalbinin fizyolojik ortamını doğru bir şekilde yeniden üretebilen güvenilir in vitro sistemlere ihtiyaç duyulmaktadır. Bu sistemler, değiştirilmiş mekanik gerilmeyi, kalp atış hızını ve elektrofizyolojik özellikleri taklit etmelidir. Hayvan modelleri, kardiyak fizyoloji için tarama platformu olarak yaygın olarak kullanılmaktadır, ancak ilaçların insan kalbindeki etkilerini yansıtma konusunda güvenilirlikleri sınırlıdır1,2. Sonuç olarak, İdeal Kardiyak Doku Kültürü Deneysel Modeli (CTCM), çeşitli terapötik ve farmakolojik müdahaleler için son derece hassas ve spesifik olan, insan kalbinin fizyolojisini ve patofizyolojisini doğru bir şekilde yeniden üreten bir modeldir3. Böyle bir sistemin yokluğu, kalp yetmezliği için yeni tedavilerin keşfini sınırlamakta4,5 ve ilaçların kardiyotoksisitesinin piyasadan çekilmesinin önemli bir nedeni olmasına yol açmaktadır6.
Son on yılda, ventriküler aritmilere ve ani ölüme yol açan QT aralığı uzamasına neden oldukları için sekiz kardiyovasküler olmayan ilaç klinik kullanımdan çekilmiştir.7 Bu nedenle, kardiyovasküler etkinlik ve toksisiteyi değerlendirmek için güvenilir preklinik tarama stratejilerine olan ihtiyaç giderek artmaktadır. İnsan kaynaklı indüklenmiş pluripotent kök hücrelerden türetilen kardiyomiyositlerin (hiPS-CM) ilaç tarama ve toksisite testlerinde son zamanlarda kullanımı bu soruna kısmi bir çözüm sunmaktadır. Bununla birlikte, hiPS-CM'lerin olgunlaşmamış yapısı ve kalp dokusunun çok hücreli karmaşıklığının olmaması bu yöntemin başlıca sınırlamalarıdır. Son çalışmalar, bu sınırlamanın, spontan kasılmaların başlamasından kısa bir süre sonra kalp dokusu hidrojelleri oluşturmak için erken hiPS-CM'lerin kullanılması ve zamanla elektriksel uyarımın kademeli olarak artırılmasıyla kısmen aşılabileceğini göstermiştir. Bununla birlikte, bu hiPS-CM mikro dokuları, yetişkin miyokardın olgun elektrofizyolojik ve kasılma özelliklerinden yoksundur. Ayrıca, insan kalp dokusu, endotel hücreleri, nöronlar ve stromal fibroblastlar da dahil olmak üzere farklı hücre tiplerinin heterojen bir karışımından oluşan ve belirli hücre dışı matris protein setleriyle birbirine bağlanan daha karmaşık bir yapıya sahiptir. Yetişkin memeli kalbindeki kardiyomiyosit olmayan popülasyonların bu heterojenliği11,12,13, bireysel hücre tipleri kullanılarak kalp dokusunun modellenmesinde önemli bir engel teşkil etmektedir. Bu önemli sınırlamalar, fizyolojik ve patolojik koşullar altında sağlam miyokard dokusunun kültürlenmesi için yöntemler geliştirmenin önemini vurgulamaktadır.
İnsan kalbinin ince (300 µm) kesitlerinin kültürlenmesi, sağlam insan miyokardının umut vadeden bir modeli olduğunu kanıtlamıştır. Bu yöntem, insan kalp dokusuna benzer eksiksiz bir 3 boyutlu çok hücreli sisteme erişim sağlar. Bununla birlikte, 2019 yılına kadar, kültürlenmiş kalp kesitlerinin kullanımı, kısa (24 saat) kültür ömrü ile sınırlıydı. Bu, fiziksel-mekanik gerilmenin olmaması, hava-sıvı arayüzü ve kalp dokusunun ihtiyaçlarını desteklemeyen basit ortamların kullanımı gibi bir dizi faktörden kaynaklanmaktadır. 2019 yılında, çeşitli araştırma grupları, mekanik faktörlerin kalp dokusu kültür sistemlerine dahil edilmesinin kültür ömrünü uzatabileceğini, kalp ifadesini iyileştirebileceğini ve kalp patolojisini taklit edebileceğini göstermiştir. İki zarif çalışma 17 ve 18, tek eksenli mekanik yüklemenin kültür sırasında kalp fenotipi üzerinde olumlu bir etkiye sahip olduğunu göstermektedir. Bununla birlikte, bu çalışmalar, kalp kesitleri ya izometrik çekme kuvvetleri 17 ya da doğrusal auxotonik yükleme 18 ile yüklendiğinden, kalp döngüsünün dinamik üç boyutlu fiziksel-mekanik yüklemesini kullanmamıştır. Bu doku germe yöntemleri, birçok kalp geninin baskılanmasına veya anormal germe yanıtlarıyla ilişkili genlerin aşırı ifadesine yol açmıştır. Özellikle, Pitoulis ve ark. 19, kuvvet dönüştürücü geri beslemesi ve gerilim sürücüleri kullanarak kardiyak döngü rekonstrüksiyonu için dinamik bir kalp dilimi kültür banyosu geliştirmiştir. Bu sistem, in vitro kardiyak döngü modellemesinde daha doğru sonuçlar sağlasa da, yöntemin karmaşıklığı ve düşük verimliliği, bu sistemin uygulamasını sınırlamaktadır. Laboratuvarımız yakın zamanda, domuz ve insan kalp dokusu kesitlerinin canlılığını 6 güne kadar korumak için elektriksel uyarım ve optimize edilmiş bir ortam kullanan basitleştirilmiş bir kültür sistemi geliştirmiştir20,21.
Bu makalede, kalp döngüsü sırasında üç boyutlu kardiyak fizyolojiyi ve patofizyolojik genişlemeyi yeniden oluşturmak için humoral sinyalleri içeren domuz kalbi kesitlerini kullanan bir kardiyak doku kültürü modeli (CTCM) tanımlıyoruz. Bu CTCM, klinik öncesi ilaç testleri için memeli kalbinin fizyolojisini/patofizyolojisini taklit eden, uygun maliyetli, orta düzeyde verimli bir kardiyak sistem sağlayarak, klinik öncesi ilaç tahmininin doğruluğunu daha önce hiç ulaşılmamış bir seviyeye çıkarabilir.
Hemodinamik mekanik sinyaller, in vitro kardiyomiyosit fonksiyonunun korunmasında kritik bir rol oynar 22,23,24. Bu çalışmada, fizyolojik frekanslarda (1,2 Hz, dakikada 72 atım) hem elektriksel hem de mekanik uyarım sağlayarak yetişkin kalp ortamını taklit edebilen bir CTCM (Şekil 1a) geliştirdik. Diyastol sırasında aşırı doku gerilmesini önlemek için, doku boyutunu %25 artırmak amacıyla 3 boyutlu baskı cihazı kullanıldı (Şekil 1b). C-PACE sistemi tarafından indüklenen elektriksel uyarı, kalp döngüsünü tam olarak yeniden üretmek için bir veri toplama sistemi kullanılarak sistolden 100 ms önce başlayacak şekilde zamanlandı. Doku kültürü sistemi, üst odadaki kalp dilimlerinin genişlemesine neden olmak için esnek bir silikon membranı döngüsel olarak genişletmek üzere programlanabilir bir pnömatik aktüatör (LB Engineering, Almanya) kullanır. Sistem, basıncı (± 1 mmHg) ve zamanı (± 1 ms) doğru bir şekilde ayarlamayı mümkün kılan bir basınç dönüştürücü aracılığıyla harici bir hava hattına bağlandı (Şekil 1c).
a Doku kesitini, cihazın kültür haznesinin içindeki mavi renkte gösterilen 7 mm'lik destek halkasına takın. Kültür haznesi, ince ve esnek bir silikon membran ile hava haznesinden ayrılmıştır. Sızıntıları önlemek için her hazne arasına bir conta yerleştirin. Cihazın kapağı, elektriksel uyarım sağlayan grafit elektrotlar içerir. b Büyük doku cihazının, kılavuz halkasının ve destek halkasının şematik gösterimi. Doku kesitleri (kahverengi), kılavuz halkası cihazın dış kenarındaki oluğa yerleştirilerek büyük boyutlu cihaza yerleştirilir. Kılavuzu kullanarak, doku akrilik yapıştırıcısı ile kaplanmış destek halkasını kalp dokusu kesitinin üzerine dikkatlice yerleştirin. c Programlanabilir pnömatik aktüatör (PPD) tarafından kontrol edilen hava haznesi basıncının bir fonksiyonu olarak elektriksel uyarım süresini gösteren grafik. Basınç sensörleri kullanılarak elektriksel uyarımı senkronize etmek için bir veri toplama cihazı kullanıldı. Kültür haznesindeki basınç ayarlanan eşiğe ulaştığında, elektriksel uyarımı tetiklemek için C-PACE-EM'ye bir darbe sinyali gönderilir. d Bir inkübatör rafına yerleştirilmiş dört CTCM'nin görüntüsü. Dört cihaz, pnömatik bir devre aracılığıyla bir PPD'ye bağlanır ve pnömatik devredeki basıncı izlemek için hemostatik valfe basınç sensörleri yerleştirilir. Her cihaz altı doku kesiti içerir.
Tek bir pnömatik aktüatör kullanarak, her biri 6 doku kesiti tutabilen 4 CTCM cihazını kontrol edebildik (Şekil 1d). CTCM'de, hava haznesindeki hava basıncı, sıvı haznesindeki senkronize basınca dönüştürülür ve kalp diliminin fizyolojik genişlemesini sağlar (Şekil 2a ve Ek Video 1). 80 mm Hg'de doku gerilmesinin değerlendirilmesi, doku kesitlerinin %25 oranında gerildiğini gösterdi (Şekil 2b). Bu gerilme yüzdesinin, normal kalp kesiti kasılabilirliği için 2,2–2,3 µm'lik fizyolojik bir sarkomer uzunluğuna karşılık geldiği gösterilmiştir17,19,25. Doku hareketi, özel kamera ayarları kullanılarak değerlendirildi (Ek Şekil 1). Doku hareketinin genliği ve hızı (Şekil 2c, d), kardiyak döngü sırasındaki gerilmeye ve sistol ve diyastol sırasındaki zamana karşılık geldi (Şekil 2b). Kasılma ve gevşeme sırasında kalp dokusunun gerilmesi ve hızı, kültürde 12 gün boyunca sabit kaldı (Şekil 2f). Kültürleme sırasında elektriksel uyarımın kasılma üzerindeki etkisini değerlendirmek için, bir gölgeleme algoritması kullanarak aktif deformiteyi belirleme yöntemi geliştirdik (Ek Şekil 2a,b) ve elektriksel uyarım olan ve olmayan deformiteleri ayırt edebildik. Kalbin aynı kesiti (Şekil 2f). Kesitin hareketli bölgesinde (R6-9), elektriksel uyarım sırasında voltaj, elektriksel uyarım yokluğuna göre %20 daha yüksekti; bu da elektriksel uyarımın kasılma fonksiyonuna katkısını göstermektedir.
Hava odası basıncı, sıvı odası basıncı ve doku hareketi ölçümlerinin temsili izleri, oda basıncının sıvı odası basıncını değiştirdiğini ve buna karşılık gelen doku dilimi hareketine neden olduğunu doğrulamaktadır. b Doku kesitlerinin yüzde gerilmesinin (mavi) temsili izleri, yüzde gerilmeye (turuncu) karşılık gelmektedir. c Kalp diliminin ölçülen hareketi, ölçülen hareket hızıyla tutarlıdır. (d) Kalp diliminde döngüsel hareketin (mavi çizgi) ve hızın (turuncu noktalı çizgi) temsili yörüngeleri. e Döngü süresinin (her gruptan 19 dilim, farklı domuzlardan), kasılma süresinin (her gruptan 19 dilim), gevşeme süresinin (her gruptan 19 dilim, farklı domuzlardan), doku hareketinin (her gruptan 25 dilim), tepe sistolik hızının (her gruptan 24 (D0), 25 (D12) dilim, farklı domuzlardan) ve tepe gevşeme hızının (her gruptan 24 (D0), 25 (D12) dilim, farklı domuzlardan) nicel olarak belirlenmesi. İki kuyruklu Student's t-testi, herhangi bir parametrede anlamlı bir fark göstermedi. f Elektriksel uyarım uygulanan (kırmızı) ve uygulanmayan (mavi) doku kesitlerinin temsili gerinim analizi izleri, aynı kesitten on bölgesel doku kesiti alanı. Alt paneller, farklı kesitlerden on alanda elektriksel uyarım uygulanan ve uygulanmayan doku kesitlerindeki gerinimdeki yüzde farkının nicelleştirilmesini göstermektedir. (n = farklı domuzlardan grup başına 8 dilim, İki yönlü Student t-testi uygulandı; ****p < 0.0001, **p < 0.01, *p < 0.05). (n = farklı domuzlardan grup başına 8 dilim, İki yönlü Student t-testi uygulandı; ****p < 0.0001, **p < 0.01, *p < 0.05). (n = 8 срезов/группу от разных свиней, проводится двусторонний t-критерий Стьюдента; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05). (n = farklı domuzlardan her gruptan 8 kesit, iki yönlü Student's t-testi; ****p<0.0001, **p<0.01, *p<0.05). (n = 8 片/组,来自不同的猪,进行双尾学生t 检验;****p < 0,0001，**p < 0,01，*p < 0,05）。 (n = 8 片/组,来自不同的猪,进行双尾学生t 检验;****p < 0,0001，**p < 0,01，*p < 0,05）。 (n = 8 срезов/группу, от разных свиней, двусторонний критерий Стьюдента; ****p <0,0001, **p <0,01, *p <0,05). (n = 8 bölüm/grup, farklı domuzlardan, iki yönlü Student's t-testi; ****p<0.0001, **p<0.01, *p<0.05).Hata çubukları ortalama ± standart sapmayı temsil eder.
Önceki statik biyomimetik kalp dilimi kültür sistemimizde [20, 21], elektriksel uyarım uygulayarak ve ortam bileşimini optimize ederek kalp dilimlerinin canlılığını, işlevini ve yapısal bütünlüğünü 6 gün boyunca koruduk. Ancak 10 gün sonra bu değerler keskin bir şekilde düştü. Önceki statik biyomimetik kültür sistemimizde 20, 21 kontrol koşullarında (Ctrl) kültürlenen kesitlere MC koşulları olarak atıfta bulunacağız ve daha önce optimize ettiğimiz ortamı eş zamanlı mekanik ve elektriksel uyarım altında kültürleme (CTCM) olarak adlandıracağız. İlk olarak, elektriksel uyarım olmadan mekanik uyarımın doku canlılığını 6 gün boyunca korumak için yetersiz olduğunu belirledik (Ek Şekil 3a,b). İlginç bir şekilde, STCM kullanılarak fizyo-mekanik ve elektriksel uyarımın uygulanmasıyla, 12 günlük kalp kesitlerinin canlılığı, MS koşulları altında taze kalp kesitlerindekiyle aynı kaldı, ancak MTT analiziyle gösterildiği gibi Ctrl koşulları altında aynı kalmadı (Şekil 1). 3a). Bu, mekanik uyarım ve kardiyak döngünün simülasyonunun, doku kesitlerini önceki statik kültür sistemimizde bildirilen sürenin iki katı kadar daha uzun süre canlı tutabileceğini göstermektedir. Bununla birlikte, kardiyak troponin T ve konneksin 43'ün immün etiketlenmesiyle doku kesitlerinin yapısal bütünlüğünün değerlendirilmesi, konneksin 43 ekspresyonunun 12. günde MC dokularında aynı günkü kontrollere göre anlamlı derecede daha yüksek olduğunu göstermiştir. Ancak, homojen konneksin 43 ekspresyonu ve Z-disk oluşumu tam olarak korunmamıştır (Şekil 3b). Doku yapısal bütünlüğünü ölçmek için yapay zeka (YZ) çerçevesi26, troponin-T ve konneksin boyamasına dayalı görüntü tabanlı derin öğrenme hattı43 kullanarak, lokalizasyon gücü açısından kalp dilimlerinin yapısal bütünlüğünü ve floresansını otomatik olarak ölçüyoruz. Bu yöntem, referansta açıklandığı gibi, kardiyak dokunun yapısal bütünlüğünü otomatik ve tarafsız bir şekilde güvenilir bir şekilde ölçmek için Evrişimsel Sinir Ağı (CNN) ve derin öğrenme çerçevesi kullanmaktadır. 26. MC dokusu, statik kontrol kesitlerine kıyasla 0. güne göre yapısal benzerlikte iyileşme gösterdi. Ek olarak, Masson'un trikrom boyaması, kültürün 12. gününde MS koşulları altında kontrol koşullarına kıyasla önemli ölçüde daha düşük bir fibroz yüzdesi ortaya koydu (Şekil 3c). CTCM, 12. günde kalp dokusu kesitlerinin canlılığını taze kalp dokusuna benzer bir seviyeye yükseltirken, kalp kesitlerinin yapısal bütünlüğünü önemli ölçüde iyileştirmedi.
Çubuk grafiği, taze kalp dilimlerinin (D0) veya 12 gün boyunca statik kültürde (D12 Ctrl) veya CTCM'de (D12 MC) kültürlenen kalp dilimlerinin MTT canlılığının nicel değerlendirmesini göstermektedir (farklı domuzlardan alınan her gruptan n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) dilim, tek yönlü ANOVA testi yapılmıştır; ####p < 0,0001, D0 ile karşılaştırıldığında ve **p < 0,01, D12 Ctrl ile karşılaştırıldığında). Çubuk grafiği, taze kalp dilimlerinin (D0) veya 12 gün boyunca statik kültürde (D12 Ctrl) veya CTCM'de (D12 MC) kültürlenen kalp dilimlerinin MTT canlılığının nicel değerlendirmesini göstermektedir (farklı domuzlardan alınan her gruptan n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) dilim, tek yönlü ANOVA testi yapılmıştır; ####p < 0,0001, D0 ile karşılaştırıldığında ve **p < 0,01, D12 Ctrl ile karşılaştırıldığında).Histogram, MTT taze kalp kesitlerinin (D0) veya 12 gün boyunca statik kültürde (D12 kontrol) veya CTCM'de (D12 MC) kültürlenen kalp kesitlerinin canlılığının nicelleştirilmesini göstermektedir (n = 18 (D0), 15 (D12 kontrol)), farklı domuzlardan her gruptan 12 (D12 MC) kesit için tek yönlü ANOVA testi uygulanmıştır;####p < 0,0001, D0'a göre ve **p < 0,01, D12 Ctrl'ye göre). ####p < 0.0001, D0 ile karşılaştırıldığında ve **p < 0.01, D12 Ctrl ile karşılaştırıldığında). a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切片(D0) (D12 MC) 切片/组,进行单向ANOVA测试；与D0 相比，####p < 0,0001，与D12 Ctrl 相比，**p < 0,01)。 a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切片(D0) ，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；与D0 相比，####p < 0.0001,与D12 Ctrl相比，**p。)Taze kalp kesitlerinde (D0) veya statik kültürde (D12 kontrol) veya CTCM'de (D12 MC) 12 gün boyunca kültüre edilmiş kalp kesitlerinde MTT canlılığının nicelleştirilmesini gösteren histogram (n = 18 (D0), 15 (D12 kontrol)), farklı domuzlardan her gruptan 12 (D12 MC) kesit, tek yönlü ANOVA testi;####p < 0,0001, D0'a göre, **p < 0,01, D12 Ctrl'ye göre). ####p < 0.0001, D0 ile karşılaştırıldığında; **p < 0.01, D12 Ctrl ile karşılaştırıldığında).b) Yeni izole edilmiş kalp kesitlerinde (D0) veya 12 gün boyunca statik koşullar altında (Ctrl) veya CTCM koşulları altında (MC) kültürlenmiş kalp kesitlerinde Troponin-T (yeşil), konneksin 43 (kırmızı) ve DAPI (mavi) (temsili immünofloresans görüntüleri) (boş ölçek = 100 µm). Kalp dokusunun yapısal bütünlüğünün yapay zekâ ile nicelendirilmesi (her grupta farklı domuzlardan 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) dilim, tek yönlü ANOVA testi uygulandı; ####p < 0.0001 D0 ile karşılaştırıldığında ve ****p < 0.0001 D12 Ctrl ile karşılaştırıldığında). Kalp dokusunun yapısal bütünlüğünün yapay zekâ ile nicelendirilmesi (farklı domuzlardan her gruptan 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) dilim, tek yönlü ANOVA testi uygulandı; ####p < 0.0001 D0 ile karşılaştırıldığında ve ****p < 0.0001 D12 Ctrl ile karşılaştırıldığında). Количественная оценка структурной целостности сердечной ткани искусственным интеллектом (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12) MC) разных свиней, проводится однофакторный тест ANOVA'ya göre срезов/групп ####p < 0,0001 сравнению с D0 ve ****p < 0,0001 по; сравнению ile D12 Ctrl). Yapay zekâ ile kalp dokusunun yapısal bütünlüğünün nicel olarak belirlenmesi (farklı domuzlardan 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) kesit/grup, tek yönlü ANOVA testi uygulandı; ####p < 0.0001 D0 ile karşılaştırıldığında ve ****p < 0.0001 D12 Ctrl ile karşılaştırıldığında).人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) dilim/her biri farklı domuzdan oluşan grup, tek yönlü ANOVA testi;####p < 0,0001 与D0相比，****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）。人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) dilim/her biri farklı domuzlardan oluşan grup, tek yönlü ANOVA testi;####p < 0,0001与D0相比，****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）。 Искусственный интеллект для количественной оценки структурной целостности сердечной ткани (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) срезов/группу каждой из разных свиней, односторонний тест ANOVA; ####p <0,0001 vs. D0 Для сравнения ****p < 0,0001 по сравнению ile D12 Ctrl). Kalp dokusunun yapısal bütünlüğünü ölçmek için yapay zeka (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) kesit/grup, farklı domuzlar, tek yönlü ANOVA testi; ####p<0.0001, D0 ile karşılaştırma için ****p < 0.0001, D12 Ctrl ile karşılaştırıldığında). c Masson trikrom boyasıyla boyanmış kalp dilimlerine ait temsili görüntüler (sol) ve nicel analiz (sağ) (Ölçek = 500 µm) (her grupta farklı domuzlardan 10 dilim, tek yönlü ANOVA testi uygulandı; ####p < 0,0001 D0 ile karşılaştırıldığında ve ***p < 0,001 D12 Ctrl ile karşılaştırıldığında). c Masson trikrom boyasıyla boyanmış kalp dilimleri için temsili görüntüler (sol) ve nicel analiz (sağ) (Ölçek = 500 µm) (her gruptan farklı domuzlardan 10 dilim, tek yönlü ANOVA testi yapılmıştır; #### D0 ile karşılaştırıldığında p < 0,0001 ve ***D12 Ctrl ile karşılaştırıldığında p < 0,001). c Репрезентативные изображения (слева) и количественная оценка (справа) срезов сердца, окрашенных трихромным красителем Массона (масштаб без покрытия = 500 мкм) (n = 10 срезов/группу от разных свиней, выполняется односторонний тест ANOVA; #### p < 0,0001 по; сравнению с D0 и ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Masson trikrom boyasıyla boyanmış kalp kesitlerinin temsili görüntüleri (sol) ve nicel değerlendirmesi (sağ) (kaplanmamış ölçek = 500 µm) (farklı domuzlardan her gruptan 10 kesit, tek yönlü ANOVA testi yapıldı; #### D0 ile karşılaştırıldığında p < 0,0001 ve ***D12 Ctrl ile karşılaştırıldığında p < 0,001). c 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像（左）和量化（右）（裸尺度= 500 µm）（n = 10个切片/组，每组来自不同的猪，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0.0001 与D0 相比，***p < 0.001 与D12 Ctrl evet. C 用 mason 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 （左 左） 量化 （右） 裸尺度 裸尺度 裸尺度裸尺度 = 500 µm） （n = 10 个 切片 组 每 组 来自 不同 猪 ， 进行 单向 单向 Anova 测试；#### p < 0,0001 与D0 相比，***p < 0,001 与D12 Ctrl 相比）。 c Репрезентативные изображения (слева) и количественный анализ (справа) срезов сердца, окрашенных трихромным красителем Массона (чистая шкала = 500 мкм) (n = 10 срезов/группа, каждый от другой свиньи, потестировано с помощью однофакторного дисперсионного анализа ;### #p < 0,0001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Masson trikrom boyasıyla boyanmış kalp kesitlerinin temsili görüntüleri (sol) ve nicel değerlendirmesi (sağ) (boş = 500 µm) (n = 10 kesit/grup, her biri farklı bir domuzdan, tek yönlü varyans analizi ile test edildi; ### # p < 0,0001 D0 ile karşılaştırıldığında, ***p < 0,001 D12 Ctrl ile karşılaştırıldığında).Hata çubukları ortalama ± standart sapmayı temsil eder.
CTCM kültürü sırasında kardiyomiyosit bütünlüğünün iyileştirilebileceğini ve fibrozis gelişiminin azaltılabileceğini varsaydık. Bu nedenle, karıştırıcı faktörlerin azlığı nedeniyle statik kontrol kültürlerimizi20,21 kullanarak küçük molekülleri taradık. Bu tarama için deksametazon (Dex), triiyodotironin (T3) ve SB431542 (SB) seçildi. Bu küçük moleküller daha önce hiPSC-CM kültürlerinde sarkomer uzunluğunu, T-tübüllerini ve iletim hızını artırarak kardiyomiyositlerin olgunlaşmasını sağlamak için kullanılmıştır. Ek olarak, hem Dex (bir glukokortikoid) hem de SB'nin iltihabı baskıladığı bilinmektedir29,30. Bu nedenle, bu küçük moleküllerden birinin veya bir kombinasyonunun eklenmesinin kalp kesitlerinin yapısal bütünlüğünü iyileştirip iyileştirmeyeceğini test ettik. İlk tarama için, her bir bileşiğin dozu, hücre kültürü modellerinde yaygın olarak kullanılan konsantrasyonlara (1 μM Dex27, 100 nM T327 ve 2,5 μM SB31) göre seçildi. 12 günlük kültürden sonra, T3 ve Dex kombinasyonu, optimal kardiyomiyosit yapısal bütünlüğü ve minimal lifli yeniden yapılanma ile sonuçlandı (Ek Şekiller 4 ve 5). Ek olarak, bu konsantrasyonların iki katı veya daha fazlasının kullanılması, normal konsantrasyonlara kıyasla zararlı etkilere yol açtı (Ek Şekil 6a,b).
İlk taramadan sonra, 4 kültür koşulunun doğrudan karşılaştırmasını gerçekleştirdik (Şekil 4a): Ctrl: Daha önce tanımladığımız statik kültürde optimize edilmiş ortamımız kullanılarak kültüre alınan kalp kesitleri; 20.21 TD: Çarşamba günü T3 ve Ctrl'ye Dex eklendi; MC: Daha önce optimize edilmiş ortamımız kullanılarak CTCM'de kültüre alınan kalp kesitleri; ve MT: Ortama T3 ve Dex eklenmiş CTCM. 12 günlük kültürden sonra, MS ve MT dokularının canlılığı, MTT testi ile değerlendirildiğinde taze dokulardakiyle aynı kaldı (Şekil 4b). İlginç bir şekilde, transwell kültürlerine (TD) T3 ve Dex eklenmesi, Ctrl koşullarına kıyasla canlılıkta önemli bir iyileşmeye yol açmadı; bu da mekanik uyarımın kalp kesitlerinin canlılığını korumada önemli bir rol oynadığını göstermektedir.
Deney tasarımı şeması, mekanik uyarımın ve T3/Dex takviyesinin ortam üzerindeki etkilerini 12 gün boyunca değerlendirmek için kullanılan dört kültür koşulunu göstermektedir. b Çubuk grafiği, 4 kültür koşulunun (Kontrol, TD, MC ve MT) tümünde, taze kalp dilimlerine (D0) kıyasla kültürden 12 gün sonraki canlılığın nicel değerlendirmesini göstermektedir (n = 18 (D0), 15 (D12 Kontrol, D12 TD ve D12 MT), 12 (D12 MC) dilim/grup, farklı domuzlardan, tek yönlü ANOVA testi yapılmıştır; ####p < 0.0001, ###p < 0.001 D0 ile karşılaştırıldığında ve **p < 0.01 D12 Kontrol ile karşılaştırıldığında). b Çubuk grafiği, 4 kültür koşulunun (Kontrol, TD, MC ve MT) tümünde, taze kalp dilimlerine (D0) kıyasla kültürden 12 gün sonraki canlılığın nicel değerlendirmesini göstermektedir (n = 18 (D0), 15 (D12 Kontrol, D12 TD ve D12 MT), 12 (D12 MC) dilim/grup, farklı domuzlardan, tek yönlü ANOVA testi yapılmıştır; ####p < 0.0001, ###p < 0.001 D0 ile karşılaştırıldığında ve **p < 0.01 D12 kontrol ile karşılaştırıldığında). b Гистограмма показывает количественную оценку жизнеспособности через 12 gün önce культивирования во всех 4 kişi (kontrolü, TD, MC ve MT) сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD ve D12 MT), 12 (D12 MC) разных свиней'den срезов/группу, проводится односторонний test ANOVA; ####p < 0,0001, ###p < 0,001, D0 ve **p < 0,01, D12 Ctrl için). b Çubuk grafik, 4 kültür koşulunun (kontrol, TD, MC ve MT) tümünde, taze kalp kesitleriyle (D0) karşılaştırıldığında, kültürden 12 gün sonraki canlılığın nicel değerlendirmesini göstermektedir (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD ve D12 MT), 12 (D12 MC) kesit/grup, farklı domuzlardan, tek yönlü ANOVA testi; ####p < 0.0001, ###p < 0.001 D0'a karşı ve **p < 0.01 D12 Ctrl ile karşılaştırıldığında). b 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC veMT）与新鲜心脏切片(D0) (n = 18 (D0)、15 (D12 Ctrl、D12 TD)和D12 MT),来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组,进行单向ANOVA 测试；####p < 0.0001，###p < 0.001 与D0相比，**p < 0.01 D12 gibi.b 4 12 (D12 MC) b Гистограмма, показывающая все 4 условия культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD ve D12 MT), разных свиней 12 (D12 MC) срезы/группа, односторонний test ANOVA; ####p <0,0001, ###p <0,001 önce сравнению с D0, **p <0,01 по сравнению с контролем D12). b Tüm 4 kültür koşulunu (kontrol, TD, MC ve MT) taze kalp kesitleriyle (D0) karşılaştıran histogram (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD ve D12 MT), farklı domuzlardan 12 (D12 MC) kesit/grup, tek yönlü ANOVA testi; ####p<0.0001, ###p<0.001 D0'a karşı, **p<0.01 kontrol D12'ye karşı). c Çubuk grafiği, 4 kültür koşulunun (Kontrol, TD, MC ve MT) tümünde, taze kalp dilimlerine (D0) kıyasla, kültürden 12 gün sonraki glikoz akışının nicelleştirilmesini göstermektedir (farklı domuzlardan her gruptan 6 dilim, tek yönlü ANOVA testi yapılmıştır; ###p < 0,001, D0 ile karşılaştırıldığında ve ***p < 0,001, D12 Kontrol ile karşılaştırıldığında). c Çubuk grafiği, 4 kültür koşulunun (Kontrol, TD, MC ve MT) tümünde, taze kalp dilimlerine (D0) kıyasla, kültürden 12 gün sonraki glikoz akışının nicelleştirilmesini göstermektedir (farklı domuzlardan her gruptan 6 dilim, tek yönlü ANOVA testi yapılmıştır; ###p < 0,001, D0 ile karşılaştırıldığında ve ***p < 0,001, D12 Kontrol ile karşılaştırıldığında). c Гистограмма показывает количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после культивирования во всех 4 условиях культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 6 срезов/группу от разных свиней, односторонний ANOVA testi; ###p < 0,001, D0 için и ***p < 0,001, D12 Ctrl için). c Histogram, 4 kültür koşulunun (kontrol, TD, MC ve MT) tümü altında, taze kalp kesitleriyle (D0) karşılaştırıldığında, kültürden 12 gün sonraki glikoz akışının nicelleştirilmesini göstermektedir (farklı domuzlardan her gruptan 6 kesit, tek yönlü ANOVA testi yapılmıştır; ###p < 0,001 D0 ile karşılaştırıldığında ve ***p < 0,001 D12 Ctrl ile karşılaştırıldığında). c 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) 相比，培养后12天的葡萄糖通量定量（n = 6 片/组，来自不同猪，单向执行ANOVA 测试；###p < 0,001,与D0相比，***p < 0,001 与D12 Ctrl evet. C 条形图 显示 所有 4 种 条件 （（ctrl 、 td 、 mc 和 mt） 新鲜 心脏 切片 切片 切片 相比 ，培养 后 后 12 天 的 通量 定量 （n = 6 片/组 ， 来自 猪 ， ， ， ， ， ， ， ， 猪ANOVA 测试；###p < 0.001，与D0 相比，***p < 0.001 与D12 Ctrl 相比）。 c Гистограмма, показывающая количественную оценку потока глюкозы через 12 gün sonra культивирования для всех 4 условий культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 6 срезов/группа, разных свиней'den, односторонний Были проведены тесты ANOVA; ###p < 0,001, D0'a göre, ***p < 0,001, D12'ye göre (контроль). c Tüm 4 kültür koşulu (kontrol, TD, MC ve MT) için kültür sonrası 12. günde glikoz akışının nicelleştirilmesini gösteren histogram, taze kalp kesitleriyle (D0) karşılaştırılmıştır (n = 6 kesit/grup, farklı domuzlardan, tek taraflı). ANOVA testleri yapılmıştır, ###p < 0,001 D0 ile karşılaştırıldığında, ***p < 0,001 D12 (kontrol) ile karşılaştırıldığında.d Taze (mavi), 12. gün MC (yeşil) ve 12. gün MT (kırmızı) dokularının on bölgesel doku kesit noktasındaki gerilim analizi grafikleri (n = 4 dilim/grup, tek yönlü ANOVA testi; gruplar arasında anlamlı bir fark yoktu). e Taze kalp kesitlerinde (D0), statik koşullar altında (Kontrol) veya MT koşulları altında (MT) 10-12 gün boyunca kültürlenen kalp kesitleriyle karşılaştırıldığında farklı şekilde ifade edilen genleri gösteren volkan grafiği. f Her bir kültür koşulu altında kültürlenen kalp kesitleri için sarkomer genlerinin ısı haritası. Hata çubukları ortalama ± standart sapmayı temsil eder.
Yağ asidi oksidasyonundan glikolize geçişe metabolik bağımlılık, kardiyomiyosit farklılaşmasının bir özelliğidir. Olgunlaşmamış kardiyomiyositler öncelikle ATP üretimi için glikoz kullanır ve az sayıda krista içeren hipoplastik mitokondrilere sahiptir5,32. Glikoz kullanım analizleri, MC ve MT koşulları altında glikoz kullanımının 0. gün dokularındakiyle benzer olduğunu göstermiştir (Şekil 4c). Bununla birlikte, Ctrl örnekleri, taze dokuya kıyasla glikoz kullanımında önemli bir artış göstermiştir. Bu, CTCM ve T3/Dex kombinasyonunun doku canlılığını artırdığını ve 12 günlük kültürlenmiş kalp kesitlerinin metabolik fenotipini koruduğunu göstermektedir. Ek olarak, gerilim analizi, gerilim seviyelerinin MT ve MS koşulları altında 12 gün boyunca taze kalp dokusundakiyle aynı kaldığını göstermiştir (Şekil 4d).
CTCM ve T3/Dex'in kalp dilimi dokusunun global transkripsiyonel manzarası üzerindeki genel etkisini analiz etmek için, dört farklı kültür koşulunun tümünden elde edilen kalp dilimlerinde RNAseq gerçekleştirdik (Ek Veri 1). İlginç bir şekilde, MT kesitleri, 13.642 genin yalnızca 16'sının farklı şekilde ifade edilmesiyle, taze kalp dokusuna yüksek transkripsiyonel benzerlik gösterdi. Bununla birlikte, daha önce gösterdiğimiz gibi, Ctrl kesitleri 10-12 günlük kültürden sonra 1229 farklı şekilde ifade edilen gen sergiledi (Şekil 4e). Bu veriler, kalp ve fibroblast genlerinin qRT-PCR'ı ile doğrulandı (Ek Şekil 7a-c). İlginç bir şekilde, Ctrl kesitleri, kalp ve hücre döngüsü genlerinin aşağı regülasyonunu ve inflamatuar gen programlarının aktivasyonunu gösterdi. Bu veriler, normalde uzun süreli kültürlemeden sonra meydana gelen farklılaşmanın kaybının, MT koşulları altında tamamen azaldığını göstermektedir (Ek Şekil 8a,b). Sarkomer genlerinin dikkatli incelenmesi, yalnızca MT koşulları altında sarkomeri (Şekil 4f) ve iyon kanalını (Ek Şekil 9) kodlayan genlerin korunduğunu ve bu sayede Ctrl, TD ve MC koşulları altında baskılanmaya karşı korunduğunu göstermiştir. Bu veriler, mekanik ve humoral uyarımın (T3/Dex) bir kombinasyonuyla, kalp dilimi transkriptomunun kültürde 12 gün sonra taze kalp dilimlerine benzer kalabileceğini göstermektedir.
Bu transkripsiyonel bulgular, kalp kesitlerindeki kardiyomiyositlerin yapısal bütünlüğünün, MT koşulları altında 12 gün boyunca en iyi şekilde korunduğu gerçeğiyle desteklenmektedir; bu durum, sağlam ve lokalize konneksin 43 ile gösterilmiştir (Şekil 5a). Ek olarak, MT koşulları altındaki kalp kesitlerindeki fibrozis, Ctrl'ye kıyasla önemli ölçüde azalmış ve taze kalp kesitlerine benzer olmuştur (Şekil 5b). Bu veriler, mekanik uyarım ve T3/Dex tedavisinin kombinasyonunun, kültürdeki kalp kesitlerinde kalp yapısını etkili bir şekilde koruduğunu göstermektedir.
a Yeni izole edilmiş kalp kesitlerinde (D0) veya dört kalp kesiti kültür koşulunun tümünde 12 gün boyunca kültüre edilmiş kalp kesitlerinde troponin-T (yeşil), konneksin 43 (kırmızı) ve DAPI'nin (mavi) temsili immünofloresans görüntüleri (ölçek çubuğu = 100 µm). Kalp dokusunun yapısal bütünlüğünün yapay zekâ ile nicelendirilmesi (n = 7 (D0 ve D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC ve D12 MT) dilim/grup, farklı domuzlardan, tek yönlü ANOVA testi yapıldı; ####p < 0.0001, D0 ile karşılaştırıldığında ve *p < 0.05 veya ****p < 0.0001, D12 Ctrl ile karşılaştırıldığında). Kalp dokusunun yapısal bütünlüğünün yapay zekâ ile nicelendirilmesi (n = 7 (D0 ve D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC ve D12 MT) dilim/grup, farklı domuzlardan, tek yönlü ANOVA testi yapıldı; #### p < 0.0001, D0 ile karşılaştırıldığında ve *p < 0.05 veya ****p < 0.0001, D12 Ctrl ile karşılaştırıldığında). Количественная оценка структурной целостности ткани сердца с помощью искусственного интеллекта (n = 7 (D0 ve D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC ve D12 MT) разных свиней'den срезов/группу, проведен однофакторный тест ANOVA; #### p < 0,0001 по сравнению с; D0 ve *p < 0,05 veya ****p < 0,0001 D12 Ctrl ile uyumludur). Yapay zekâ kullanılarak kalp dokusunun yapısal bütünlüğünün nicel olarak belirlenmesi (n = 7 (D0 ve D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC ve D12 MT) farklı domuzlardan alınan kesitler/gruplar, tek yönlü ANOVA testi uygulandı; #### p < 0.0001 D0 ile karşılaştırıldığında ve *p < 0.05 veya ****p < 0.0001 D12 Ctrl ile karşılaştırıldığında).对不同猪的心脏组织结构完整性（n = 7（D0 和D12 Ctrl）、5（D12 TD、D12 MC ve D12 MT）切片/组）进行人工智能量化，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0.0001 与D0 和*p < 0.05 相比，或****p < 0,0001 ve D12 Ctrl tuşu).对 不同 猪 的 心脏 结构 完整性 （n = 7 （d0 和 d12 ctrl） （5 （d12 td 、 d12 mc 和 d12 mt） 组）人工 智能量 化 进行 单向 单向 单向 测试 ； ########## p < 0.0001 与D0 和*p < 0.05 相比，或****p < 0,0001 与D12 Ctrl evet.Farklı domuzlarda (n = 7 (D0 ve D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC ve D12 MT) kesit/grup) yapay zekâ kullanılarak kalp dokusunun yapısal bütünlüğünün tek yönlü ANOVA testi ile nicelendirilmesi;#### p < 0,0001, D0 ve *p < 0,05 veya ****p < 0,0001, D12 Ctrl için). #### p < 0.0001, D0 ile karşılaştırıldığında ve *p < 0.05 veya ****p < 0.0001, D12 Ctrl ile karşılaştırıldığında). b Masson trikrom boyasıyla boyanmış kalp dilimlerinin temsili görüntüleri ve nicel değerlendirmesi (Ölçek çubuğu = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD ve D12 MC), farklı domuzlardan grup başına 9 (D12 MT) dilim, tek yönlü ANOVA testi yapılmıştır; ####p < 0,0001 D0 ile karşılaştırıldığında ve ***p < 0,001 veya ****p < 0,0001 D12 Ctrl ile karşılaştırıldığında). b Masson trikrom boyasıyla boyanmış kalp dilimlerinin temsili görüntüleri ve nicel değerlendirmesi (Ölçek çubuğu = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD ve D12 MC), farklı domuzlardan grup başına 9 (D12 MT) dilim, tek yönlü ANOVA testi yapılmıştır; ####p < 0,0001 D0 ile karşılaştırıldığında ve ***p < 0,001 veya ****p < 0,0001 D12 Ctrl ile karşılaştırıldığında). b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромным красителем Массона (масштабная линейка = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD и D12 MC), 9 (D12 MT) разных свиней срезов/группу, выполняется односторонний тест ANOVA ####p < D0 için 0,0001 ve ***p < 0,001 veya ****p < D12 Ctrl için 0,0001. b Masson trikrom boyasıyla boyanmış kalp kesitlerinin temsili görüntüleri ve nicel değerlendirmesi (ölçek çubuğu = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD ve D12 MC), farklı domuzlardan grup başına 9 (D12 MT) kesit, tek yönlü ANOVA uygulandı; ####p < 0.0001, D0'a karşı ve ***p < 0.001 veya ****p < 0.0001, D12 Ctrl'ye karşı). b 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像和量化（比例尺= 500 µm）（n = 10（D0、D12 Ctrl、D12 TD ve D12 MC），来自不同猪的9 个（D12 MT）切片/组，进行单因素方差分析；####p < 0.0001 与D0相比,***p < 0,001，或****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）。 b 用 mason 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 和 量化 （比例 尺 尺 尺 = 500 µm） （n = 10 （d0 、 d12 ctrl 、 d12 td ve d12 mc） 来自 不同 的 9 个 d12 mt 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片/组，进行单因素方差分析；####p < 0.0001 与D0相比，***p < 0,001，或****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）。 b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромом Массона (масштабная линейка = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD и D12 MC), 9 (D12 MT) разных свиней / группы, один- способ ANOVA; ####p < 0,0001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 veya ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). b Masson trikrom boyasıyla boyanmış kalp kesitlerinin temsili görüntüleri ve nicel değerlendirmesi (ölçek çubuğu = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD ve D12 MC), her gruptan farklı domuzlardan 9 (D12 MT) kesit, tek ANOVA yöntemi; ####p < 0.0001 D0 ile karşılaştırıldığında, ***p < 0.001 veya ****p < 0.0001 D12 Ctrl ile karşılaştırıldığında).Hata çubukları ortalama ± standart sapmayı temsil eder.
Son olarak, CTCM'nin kardiyak hipertrofiyi taklit etme yeteneği, kardiyak doku geriliminin artırılmasıyla değerlendirildi. CTCM'de, tepe hava odası basıncı 80 mmHg'den 80 mmHg'ye (normal gerilim) kadar 140 mmHg'ye kadar arttı (Şekil 6a). Bu, daha önce hipertrofide görülen sarkomer uzunluğuna benzer bir uzunluğa ulaşmak için gereken karşılık gelen gerilim yüzdesi olarak gösterilen %32'lik bir gerilim artışına karşılık gelir (Şekil 6b). Kasılma ve gevşeme sırasında kardiyak dokunun gerilimi ve hızı, altı günlük kültür boyunca sabit kaldı (Şekil 6c). MT koşullarından alınan kardiyak doku, altı gün boyunca normal gerilime (MT (Normal)) veya aşırı gerilim koşullarına (MT (OS)) maruz bırakıldı. Kültürde dört gün sonra bile, hipertrofik biyobelirteç NT-ProBNP, MT (normal) koşullarına kıyasla MT (OS) koşulları altında ortamda önemli ölçüde yükseldi (Şekil 7a). Ek olarak, altı günlük kültürleme sonrasında, MT (OS)'deki hücre boyutu (Şekil 7b), MT kalbinin (normal) kesitlerine kıyasla önemli ölçüde artmıştır. Ayrıca, aşırı gerilmiş dokularda NFATC4 nükleer translokasyonu önemli ölçüde artmıştır (Şekil 7c). Bu sonuçlar, hiperdistensiyondan sonra patolojik yeniden yapılanmanın ilerleyici gelişimini göstermekte ve CTCM cihazının gerilme kaynaklı kardiyak hipertrofi sinyallemesini incelemek için bir platform olarak kullanılabileceği kavramını desteklemektedir.
Hava odası basıncı, sıvı odası basıncı ve doku hareketi ölçümlerinin temsili izleri, oda basıncının sıvı odası basıncını değiştirdiğini ve buna bağlı olarak doku diliminin hareketine neden olduğunu doğrulamaktadır. b Normal gerilmiş (turuncu) ve aşırı gerilmiş (mavi) doku kesitleri için temsili gerilme yüzdesi ve gerilme hızı eğrileri. c Döngü süresini (her gruptan 19 dilim, farklı domuzlardan), kasılma süresini (her gruptan 18-19 dilim, farklı domuzlardan), gevşeme süresini (her gruptan 19 dilim, farklı domuzlardan), doku hareketinin genliğini (her gruptan 14 dilim, farklı domuzlardan), tepe sistolik hızını (her gruptan 14 dilim, farklı domuzlardan) ve tepe gevşeme hızını (her gruptan 14 (D0), 15 (D6) kesit) gösteren çubuk grafik. İki yönlü Student's t-testi, herhangi bir parametrede anlamlı bir fark olmadığını göstererek, bu parametrelerin aşırı gerilimle 6 günlük kültür süresince sabit kaldığını belirtmektedir. Hata çubukları ortalama ± standart sapmayı temsil etmektedir.
a Normal germe (Norm) veya aşırı germe (OS) koşulları altında kültürlenen kalp dilimlerinden elde edilen kültür ortamındaki NT-ProBNP konsantrasyonunun çubuk grafikle nicelendirilmesi (farklı domuzlardan her gruptan 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm ve D4 MTOS) dilim, İki yönlü ANOVA uygulandı; **p < 0,01 normal germe ile karşılaştırıldığında). a Normal germe (Norm) veya aşırı germe (OS) koşulları altında kültürlenen kalp dilimlerinden elde edilen kültür ortamındaki NT-ProBNP konsantrasyonunun çubuk grafikle nicelendirilmesi (n ​​= 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm ve D4 MTOS) dilim/grup, farklı domuzlardan, İki yönlü ANOVA uygulandı; **p < 0,01 normal germe ile karşılaştırıldığında).Normal MT gerilmesi (norm) veya aşırı gerilme (OS) koşulları altında kültürlenen kalp dilimlerinden elde edilen kültür ortamındaki NT-ProBNP konsantrasyonunun kantitatif histogramı (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm ve D4).MTOS) dilim/grup, farklı domuzlardan, iki faktörlü varyans analizi yapılmıştır;**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p < 0,01 normal germe ile karşılaştırıldığında). a 在MT 正常拉伸(Norm) 或过度拉伸(OS) 条件下培养的心脏切片培养基中NT-ProBNP浓度的条形图量化（n = 4 (D2 MTNorm)、3（D2 MTOS, D4 MTNorm ve D4 MTOS）来自不同猪的切片/组,进行双向方差分析；**与正常拉伸相比,p < 0,01）。 a Farklı bölgelerden MT normal germe (Norm) veya aşırı germe (OS) koşulları (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm和D4 MTOS) altında kültürlenen kalp dilimlerindeki NT-ProBNP konsantrasyonunun niceliği猪的切片/组，可以双向方方发发动; **normal esnemeyle karşılaştırıldığında, p < 0,01).Normal MT gerilmesi (norm) veya aşırı gerilme (OS) koşulları altında kültürlenen kalp dilimlerindeki NT-ProBNP konsantrasyonlarının histogram ile nicelendirilmesi (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm) ve D4 MTOS) farklı domuzlardan alınan dilimler/gruplar, iki yönlü varyans analizi;**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p < 0,01 normal germe ile karşılaştırıldığında). b Troponin-T ve WGA ile boyanmış kalp dilimlerine ait temsili görüntüler (solda) ve hücre boyutu ölçümü (sağda) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) hücre/grup, farklı domuzlardan 10 farklı dilimden, İki kuyruklu Student t-testi uygulandı; ****p < 0,0001 normal gerilmeye kıyasla). b Troponin-T ve WGA ile boyanmış kalp dilimlerine ait temsili görüntüler (solda) ve hücre boyutu ölçümü (sağda) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) hücre/grup, farklı domuzlardan 10 farklı dilimden, İki kuyruklu Student t-testi uygulandı; ****p < 0,0001 normal gerilmeye kıyasla). b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т ve АЗП (слева) и количественного определения размера клеток (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) клеток/группу из 10 разных срезов от разных свиней, два- проводится хвостовой t-критерий Стьюдента; ****p < 0,0001 по сравнению с нормальным растяжением). b Troponin-T ve AZP ile boyanmış kalp kesitlerinin temsili görüntüleri (sol) ve hücre boyutu ölçümü (sağ) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) hücre/grup, farklı domuzlardan 10 farklı kesitten, iki kuyruklu Student's t-testi uygulandı; ****p < 0.0001 normal suş ile karşılaştırıldığında). b 用肌钙蛋白-T 和WGA（左）和细胞大小量化（右）染色的心脏切片的代表性图像（n = 330（D6 MTOS），来自不同猪的10 个不同切片的369（D6 MTNorm）细胞/组,两进行有尾学生t 检验；与正常拉伸相比，****p < 0,0001）。 b Kalkarin-T ve WGA ile boyanmış kalp dilimlerinin temsili görüntüleri (solda) ve hücre boyutu (sağda) (n = 330 (D6 MTOS), 10 farklı dilimden 369 (D6 MTNorm)) Hücreler/grup, iki yöntem de öğrenci başına t testi; normal germe ile karşılaştırıldığında, ****p < 0.0001). b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т ve АЗП (слева) и количественная оценка размера клеток (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) ve 10 различных срезов от разных свиней Клетки/группа, двусторонние критерий Стьюдента ****p; < 0,0001 по сравнению с нормальным растяжением). b Troponin-T ve AZP ile boyanmış kalp kesitlerinin temsili görüntüleri (sol) ve hücre boyutunun nicelendirilmesi (sağ) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm), farklı domuzlardan 10 farklı kesitten) Hücre/grup, iki kuyruklu kriter Student's t; ****p < 0,0001 normal suş ile karşılaştırıldığında). c Troponin-T ve NFATC4 için immün etiketlenmiş ve NFATC4'ün CM'lerin çekirdeklerine translokasyonunun nicel olarak belirlendiği 0. ve 6. gün MTOS kalp dilimlerine ait temsili görüntüler (farklı domuzlardan her gruptan 4 (D0), 3 (D6 MTOS) dilim, İki kuyruklu Student t-testi uygulandı; *p < 0,05). c Troponin-T ve NFATC4 için immün etiketlenmiş ve NFATC4'ün CM'lerin çekirdeklerine translokasyonunun nicel olarak belirlendiği 0. ve 6. gün MTOS kalp dilimlerine ait temsili görüntüler (farklı domuzlardan her gruptan 4 (D0), 3 (D6 MTOS) dilim, İki kuyruklu Student t-testi uygulandı; *p < 0,05). c MTOS için 0 ve 6 numaralı sunucular için Репрезентативные изображения, тропонина-Т ve NFATC4 için иммуномеченых, ve количественная оценка транслокации NFATC4, ядра кавернозных клеток (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) разных срезов/группу свиней выполняется двусторонний t-критерий Стьюдента; *p < 0,05). c Troponin-T ve NFATC4 için immün etiketlenmiş ve kavernöz hücrelerin çekirdeğindeki NFATC4 translokasyonunun nicel olarak belirlendiği 0 ve 6 günlük MTOS'taki kalp kesitlerine ait temsili görüntüler (farklı domuzlardan her gruptan n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) dilim) iki yönlü Student's t-testi uygulandı; *p < 0,05). c 用于肌钙蛋白-T ve NFATC4 免疫标记的第0 天和第6 天MTOS NFATC4 CM 细胞核的量化（n = 4 (D0)、3 (D6 MTOS)切片/组, 进行双尾学生t 检验；*p < 0,05)。 c Kalkanin-T ve NFATC4 immün etiketleme 6天MTOS kalp dilimlerinin ve farklı NFATC4 CM hücre çekirdeği miktarından NFATC4'ün temsili görüntüleri (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) 切礼/组,时间双尾学生et 电影；*p < 0,05). c Репрезентативные изображения срезов сердца MTOS на 0 и 6 для иммуномаркировки тропонином-Т ve NFATC4 ve количественная оценка транслокации NFATC4 в ядра CM от разных свиней (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срез/группа, два- хвостатый t-критерий Стьюдента; *p < 0,05). c Farklı domuzlardan alınan MTOS kalp dilimlerinin 0. ve 6. günlerdeki temsili görüntüleri; troponin-T ve NFATC4 immün etiketlemesi ve CM çekirdeğindeki NFATC4 translokasyonunun nicelendirilmesi (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) dilim/grup, iki yönlü t-kriteri Student's testi; *p < 0,05).Hata çubukları ortalama ± standart sapmayı temsil eder.
Translasyonel kardiyovasküler araştırmalar, kalp ortamını doğru bir şekilde yeniden üreten hücresel modellere ihtiyaç duyar. Bu çalışmada, kalbin ultra ince kesitlerini uyarabilen bir CTCM cihazı geliştirildi ve karakterize edildi. CTCM sistemi, fizyolojik olarak senkronize edilmiş elektromekanik uyarım ve T3 ve Dex sıvı zenginleştirmesini içerir. Domuz kalbi kesitleri bu faktörlere maruz bırakıldığında, 12 günlük kültürden sonra canlılıkları, yapısal bütünlükleri, metabolik aktiviteleri ve transkripsiyonel ekspresyonları taze kalp dokusundakiyle aynı kaldı. Ek olarak, kalp dokusunun aşırı gerilmesi, aşırı gerilmeden kaynaklanan kalp hipertrofisine neden olabilir. Genel olarak, bu sonuçlar, normal bir kardiyak fenotipin korunmasında fizyolojik kültür koşullarının kritik rolünü desteklemekte ve ilaç taraması için bir platform sağlamaktadır.
Kardiyomiyositlerin işlev görmesi ve hayatta kalması için optimal bir ortam oluşturmaya birçok faktör katkıda bulunur. Bu faktörlerin en belirgin olanları (1) hücreler arası etkileşimler, (2) elektromekanik uyarım, (3) humoral faktörler ve (4) metabolik substratlarla ilgilidir. Fizyolojik hücreden hücreye etkileşimler, hücre dışı bir matris tarafından desteklenen çok sayıda hücre tipinin karmaşık üç boyutlu ağlarını gerektirir. Bu tür karmaşık hücresel etkileşimlerin, tek tek hücre tiplerinin birlikte kültürüyle in vitro olarak yeniden oluşturulması zordur, ancak kalp kesitlerinin organotipik doğası kullanılarak kolayca elde edilebilir.
Kardiyomiyositlerin mekanik gerilmesi ve elektriksel uyarımı, kardiyak fenotipin korunması için kritik öneme sahiptir33,34,35. Mekanik uyarım, hiPSC-CM koşullandırması ve olgunlaşması için yaygın olarak kullanılırken, son zamanlarda birkaç zarif çalışma, tek eksenli yükleme kullanılarak kültürdeki kalp dilimlerinin mekanik uyarımını denemiştir. Bu çalışmalar, 2 boyutlu tek eksenli mekanik yüklemenin kültür sırasında kalbin fenotipi üzerinde olumlu bir etkiye sahip olduğunu göstermektedir. Bu çalışmalarda, kalbin bölümleri ya izometrik çekme kuvvetleriyle17, doğrusal auxotonik yüklemeyle18 yüklendi ya da kuvvet dönüştürücü geri beslemesi ve gerilim sürücüleri kullanılarak kardiyak döngü yeniden oluşturuldu. Bununla birlikte, bu yöntemler, çevresel optimizasyon olmadan tek eksenli doku gerilmesi kullanır ve bu da birçok kardiyak genin baskılanmasına veya anormal gerilme yanıtlarıyla ilişkili genlerin aşırı ifadesine neden olur. Burada açıklanan CTCM, döngü süresi ve fizyolojik gerilme ( %25 gerilme, %40 sistol, %60 diyastol ve dakikada 72 atım) açısından doğal kardiyak döngüyü taklit eden 3 boyutlu bir elektromekanik uyarı sağlar. Üç boyutlu mekanik uyarım tek başına doku bütünlüğünü korumak için yeterli olmasa da, doku canlılığını, işlevini ve bütünlüğünü yeterince korumak için T3/Dex kullanılarak humoral ve mekanik uyarımın bir kombinasyonu gereklidir.
Hümoral faktörler, yetişkin kalp fenotipinin modülasyonunda önemli bir rol oynar. Bu durum, hücre olgunlaşmasını hızlandırmak için kültür ortamına T3 ve Dex'in eklendiği HiPS-CM çalışmalarında vurgulanmıştır. T3, hücre zarları boyunca amino asitlerin, şekerlerin ve kalsiyumun taşınmasını etkileyebilir36. Ek olarak, T3, MHC-α ekspresyonunu ve MHC-β downregülasyonunu teşvik ederek, fetal kardiyomiyositlerdeki yavaş kasılan miyofibrillere kıyasla olgun kardiyomiyositlerde hızlı kasılan miyofibrillerin oluşumunu destekler. Hipotiroidi hastalarında T3 eksikliği, miyofibril bantlarının kaybına ve ton gelişim hızının azalmasına neden olur37. Dex, glukokortikoid reseptörleri üzerinde etki gösterir ve izole perfüze kalplerde miyokardiyal kasılmayı artırdığı gösterilmiştir38; bu iyileşmenin, kalsiyum birikimiyle yönlendirilen giriş (SOCE) üzerindeki etkiyle ilişkili olduğu düşünülmektedir39,40. Ek olarak, Dex reseptörlerine bağlanarak, bağışıklık fonksiyonunu ve inflamasyonu baskılayan geniş bir hücre içi yanıtı tetikler30.
Sonuçlarımız, fiziksel mekanik uyarımın (MS) kontrol grubuna kıyasla genel kültür performansını iyileştirdiğini, ancak 12 günlük kültür süresi boyunca canlılığı, yapısal bütünlüğü ve kardiyak ekspresyonu koruyamadığını göstermektedir. Kontrol grubuna kıyasla, CTCM (MT) kültürlerine T3 ve Dex eklenmesi, canlılığı iyileştirmiş ve 12 gün boyunca taze kalp dokusuyla benzer transkripsiyon profillerini, yapısal bütünlüğü ve metabolik aktiviteyi korumuştur. Ek olarak, doku gerilme derecesini kontrol ederek, STCM kullanılarak aşırı gerilme kaynaklı kardiyak hipertrofi modeli oluşturulmuş ve STCM sisteminin çok yönlülüğü gösterilmiştir. Kardiyak yeniden şekillenme ve fibrozun genellikle dolaşımdaki hücreleri uygun sitokinleri, fagositozu ve diğer yeniden şekillenme faktörlerini sağlayabilen sağlam organları içerdiği, ancak kalbin bölümlerinin stres ve travmaya yanıt olarak fibrotik süreci taklit edebileceği belirtilmelidir. Bu, daha önce bu kardiyak dilim modelinde değerlendirilmiştir. CTCM parametrelerinin, taşikardi, bradikardi ve mekanik dolaşım desteği (mekanik olarak yüklenmemiş kalp) gibi birçok durumu simüle etmek için basınç/elektrik genliği ve frekans değiştirilerek ayarlanabileceği belirtilmelidir. Bu, sistemi ilaç testleri için orta düzeyde verimli hale getirir. CTCM'nin aşırı efor kaynaklı kardiyak hipertrofiyi modelleme yeteneği, bu sistemin kişiselleştirilmiş tedavi için test edilmesinin önünü açmaktadır. Sonuç olarak, bu çalışma, mekanik gerilme ve humoral uyarımın kardiyak doku kesitlerinin kültürünü sürdürmek için kritik öneme sahip olduğunu göstermektedir.
Burada sunulan veriler, CTCM'nin sağlam miyokard modellemesi için çok umut vadeden bir platform olduğunu öne sürse de, bu kültür yönteminin bazı sınırlamaları vardır. CTCM kültürünün ana sınırlaması, dilimlere sürekli dinamik mekanik stresler uygulamasıdır; bu da her döngü sırasında kalp dilimi kasılmalarını aktif olarak izleme yeteneğini engeller. Ek olarak, kalp bölümlerinin küçük boyutu (7 mm) nedeniyle, geleneksel kuvvet sensörleri kullanılarak kültür sistemleri dışında sistolik fonksiyonu değerlendirme yeteneği sınırlıdır. Bu makalede, kasılma fonksiyonunun bir göstergesi olarak optik voltajı değerlendirerek bu sınırlamanın kısmen üstesinden geldik. Bununla birlikte, bu sınırlama daha fazla çalışma gerektirecektir ve gelecekte kalsiyum ve voltaja duyarlı boyalar kullanılarak optik haritalama gibi kültürdeki kalp dilimlerinin fonksiyonunun optik olarak izlenmesi için yöntemler getirilerek ele alınabilir. CTCM'nin bir diğer sınırlaması ise, çalışma modelinin fizyolojik stresi (ön yük ve art yük) manipüle etmemesidir. CTCM'de, çok büyük dokularda diyastolde (tam gerilme) ve sistolde (elektriksel uyarım sırasında kasılma uzunluğu) %25 fizyolojik gerilmeyi yeniden üretmek için zıt yönlerde basınç uygulandı. Gelecekteki CTCM tasarımlarında bu sınırlama, kalp dokusuna her iki taraftan yeterli basınç uygulanarak ve kalbin odacıklarında meydana gelen tam basınç-hacim ilişkileri uygulanarak ortadan kaldırılmalıdır.
Bu makalede bildirilen aşırı gerilme kaynaklı yeniden şekillenme, hipertrofik aşırı gerilme sinyallerini taklit etmekle sınırlıdır. Bu nedenle, bu model, humoral veya nöral faktörlere (bu sistemde mevcut olmayan) ihtiyaç duymadan gerilme kaynaklı hipertrofik sinyalleşmenin incelenmesine yardımcı olabilir. CTCM'nin çeşitliliğini artırmak için daha fazla çalışmaya ihtiyaç vardır; örneğin, bağışıklık hücreleriyle birlikte kültürleme, dolaşımdaki plazma humoral faktörleri ve nöronal hücrelerle birlikte kültürleme sırasında sinirsel bağlantı, CTCM ile hastalık modellemesi olanaklarını geliştirecektir.
Bu çalışmada on üç domuz kullanılmıştır. Tüm hayvan prosedürleri kurumsal yönergelere uygun olarak gerçekleştirilmiş ve Louisville Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanmıştır. Aort kemeri klemplenmiş ve kalp 1 L steril kardiyopleji (110 mM NaCl, 1,2 mM CaCl2, 16 mM KCl, 16 mM MgCl2, 10 mM NaHCO3, 5 U/mL heparin, pH 7,4'e kadar) ile perfüze edilmiştir; Kalpler, laboratuvara buz üzerinde taşınana kadar (genellikle 10 dakikadan az sürer) buz gibi soğuk kardiyoplejik solüsyon içinde muhafaza edildi. Kalpler, laboratuvara buz üzerinde taşınana kadar (genellikle 10 dakikadan az sürer) buz gibi soğuk kardiyoplejik solüsyon içinde muhafaza edildi. сердца хранили в ледяном кардиоплегическом растворе до транспортировки в лабораторию на льду, что обычно занимает <10 dk. Kalpler, laboratuvara buz üzerinde taşınana kadar buz gibi soğuk kardiyoplejik solüsyonda saklandı; bu işlem genellikle 10 dakikadan az sürer.将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室,通常<10分钟。将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室,通常<10分钟。 Держите сердца в ледяной кардиоплегии до лаборатортировки в лаборатортировки на лабораторию на льду, обычно <10 dakika. Kalpler, laboratuvara taşınana kadar (genellikle 10 dakikadan az sürer) buz üzerinde kardiyopleji altında tutulmalıdır.
CTCM cihazı, SolidWorks bilgisayar destekli tasarım (CAD) yazılımında geliştirilmiştir. Kültür odaları, ayırıcılar ve hava odaları CNC şeffaf akrilik plastikten yapılmıştır. 7 mm çapındaki destek halkası, merkezde yüksek yoğunluklu polietilenden (HDPE) yapılmıştır ve altındaki ortamı sızdırmaz hale getirmek için kullanılan silikon o-ringi yerleştirmek üzere bir o-ring yuvasına sahiptir. İnce bir silika membran, kültür odasını ayırma plakasından ayırır. Silikon membran, 0,02 inç kalınlığında silikon levhadan lazerle kesilmiştir ve 35A sertliğe sahiptir. Alt ve üst silikon contalar, 1/16 inç kalınlığında silikon levhadan lazerle kesilmiştir ve 50A sertliğe sahiptir. Bloğu sabitlemek ve hava geçirmez bir sızdırmazlık oluşturmak için 316L paslanmaz çelik vidalar ve kelebek somunlar kullanılmıştır.
C-PACE-EM sistemiyle entegre edilecek özel bir baskılı devre kartı (PCB) tasarlanmıştır. PCB üzerindeki İsviçre tipi konektör soketleri, gümüş kaplı bakır teller ve elektrotlara vidalanmış bronz 0-60 vidalar ile grafit elektrotlara bağlanır. Baskılı devre kartı, 3D yazıcının kapağına yerleştirilir.
CTCM cihazı, kalp döngüsüne benzer kontrollü bir dolaşım basıncı oluşturan programlanabilir bir pnömatik aktüatör (PPD) tarafından kontrol edilir. Hava haznesinin içindeki basınç arttıkça, esnek silikon membran yukarı doğru genişleyerek doku bölgesinin altındaki ortamı zorlar. Bu sıvı atılımı ile doku alanı gerilir ve diyastol sırasında kalbin fizyolojik genişlemesini taklit eder. Gevşemenin zirvesinde, grafit elektrotlar aracılığıyla elektriksel uyarım uygulanır; bu da hava haznesindeki basıncı düşürür ve doku bölümlerinin kasılmasına neden olur. Borunun içinde, hava sistemindeki basıncı algılamak için bir basınç sensörüne sahip bir hemostatik valf bulunur. Basınç sensörü tarafından algılanan basınç, dizüstü bilgisayara bağlı bir veri toplayıcıya uygulanır. Bu, gaz haznesinin içindeki basıncın sürekli olarak izlenmesini sağlar. Maksimum hazne basıncına ulaşıldığında (standart 80 mmHg, 140 mmHg OS), veri toplama cihazına, 4 V'a ayarlanmış 2 ms'lik çift fazlı bir voltaj sinyali üretmek için C-PACE-EM sistemine bir sinyal göndermesi emredilir.
Kalp kesitleri elde edildi ve 6 kuyucukta kültür koşulları şu şekilde uygulandı: Hasat edilen kalpler transfer kabından soğuk (4°C) kardiyopleji içeren bir tepsiye aktarıldı. Sol ventrikül steril bir bıçakla izole edildi ve 1-2 cm³'lük parçalara ayrıldı. Bu doku blokları doku yapıştırıcısı ile doku desteklerine yapıştırıldı ve Tyrode çözeltisi içeren ve sürekli oksijenlendirilmiş (3 g/L 2,3-bütanedion monooksim (BDM), 140 mM NaCl (8,18 g), 6 mM KCl (0,447 g), 10 mM D-glukoz (1,86 g), 10 mM HEPES (2,38 g), 1 mM MgCl2 (1 ml 1 M çözelti), 1,8 mM CaCl2 (1,8 ml 1 M çözelti), 1 L'ye kadar ddH2O) titreşimli mikrotom doku banyosuna yerleştirildi. Titreşimli mikrotom, 80 Hz frekansta, 2 mm yatay titreşim genliğinde ve 0,03 mm/s ilerleme hızında 300 µm kalınlığında dilimler kesmek üzere ayarlandı. Doku banyosu, çözeltiyi soğuk tutmak için buzla çevriliydi ve sıcaklık 4°C'de sabit tutuldu. Doku kesitleri, bir kültür plakası için yeterli sayıda kesit elde edilene kadar, sürekli oksijenlendirilmiş Tyrode çözeltisi içeren buz üzerindeki bir inkübasyon banyosuna aktarıldı. Transwell kültürleri için, doku kesitleri steril 6 mm genişliğinde poliüretan desteklere yapıştırıldı ve 6 ml optimize edilmiş ortama (199 ortamı, 1x ITS takviyesi, %10 FBS, 5 ng/ml VEGF, 10 ng/ml FGF-alkali ve 2X antibiyotik-antifungal) yerleştirildi. C-Pace aracılığıyla doku kesitlerine elektriksel uyarım (10 V, frekans 1,2 Hz) uygulandı. TD koşulları için, her ortam değişiminde 100 nM ve 1 μM konsantrasyonlarında taze T3 ve Dex eklendi. Ortam, günde 3 kez değiştirilmeden önce oksijenle doyuruldu. Doku kesitleri, 37°C ve %5 CO2'li bir inkübatörde kültüre edildi.
CTCM kültürleri için, doku kesitleri, modifiye Tyrode çözeltisi içeren bir Petri kabına özel yapım bir 3D yazıcı üzerine yerleştirildi. Cihaz, destek halkasının alanının %25'i kadar kalp diliminin boyutunu artırmak üzere tasarlanmıştır. Bu, kalp kesitlerinin Tyrode çözeltisinden ortama aktarıldıktan sonra ve diyastol sırasında gerilmemesi için yapılır. Histoakrilik yapıştırıcı kullanılarak, 300 µm kalınlığındaki kesitler 7 mm çapında bir destek halkasına sabitlendi. Doku kesitleri destek halkasına yapıştırıldıktan sonra, fazla doku kesitleri kesilerek, yeterli sayıda kesit bir cihaz için hazırlanana kadar, yapıştırılmış doku kesitleri buz üzerinde (4°C) Tyrode çözeltisi banyosuna geri yerleştirildi. Tüm cihazlar için toplam işlem süresi 2 saati geçmemelidir. 6 doku kesiti destek halkalarına yapıştırıldıktan sonra, CTCM cihazı monte edildi. CTCM kültür odası 21 ml önceden oksijenlendirilmiş ortamla önceden doldurulur. Doku kesitleri kültür odasına aktarılır ve pipetle hava kabarcıkları dikkatlice çıkarılır. Doku kesiti daha sonra deliğe yönlendirilir ve nazikçe yerine bastırılır. Son olarak, elektrot kapağı cihaza yerleştirilir ve cihaz inkübatöre aktarılır. Ardından CTCM, hava tüpüne ve C-PACE-EM sistemine bağlanır. Pnömatik aktüatör açılır ve hava valfi CTCM'yi açar. C-PACE-EM sistemi, 2 ms boyunca bifazik pacing sırasında 1,2 Hz'de 4 V verecek şekilde yapılandırılmıştır. Ortam günde iki kez, elektrotlar ise elektrotlar üzerinde grafit birikmesini önlemek için günde bir kez değiştirilmiştir. Gerekirse, doku kesitleri, altlarına düşmüş olabilecek hava kabarcıklarını gidermek için kültür kuyucuklarından çıkarılabilir. MT tedavi koşulları için, her ortam değişiminde 100 nM T3 ve 1 μM Dex ile taze T3/Dex eklenmiştir. CTCM cihazları 37°C ve %5 CO2'li bir inkübatörde kültüre edilmiştir.
Kalp dilimlerinin gerilmiş yörüngelerini elde etmek için özel bir kamera sistemi geliştirildi. Bir SLR kamera (Canon Rebel T7i, Canon, Tokyo, Japonya) ve Navitar Zoom 7000 18-108mm makro lens (Navitar, San Francisco, CA) kullanıldı. Görüntüleme, ortam taze ortamla değiştirildikten sonra oda sıcaklığında gerçekleştirildi. Kamera 51° açıyla konumlandırıldı ve video saniyede 30 kare hızında kaydedildi. İlk olarak, kalp dilimlerinin hareketini ölçmek için Image-J ile açık kaynaklı bir yazılım (MUSCLEMOTION43) kullanıldı. Gürültüyü önlemek için atan kalp dilimleri için ilgi alanlarını tanımlamak üzere MATLAB (MathWorks, Natick, MA, ABD) kullanılarak maske oluşturuldu. Manuel olarak bölümlenmiş maskeler, bir kare dizisindeki tüm görüntülere uygulandı ve ardından MUSCLEMOTION eklentisine iletildi. Muscle Motion, her karedeki piksellerin ortalama yoğunluğunu kullanarak referans kareye göre hareketini ölçer. Veriler kaydedildi, filtrelendi ve kalp döngüsü sırasında döngü süresini ölçmek ve doku gerilmesini değerlendirmek için kullanıldı. Kaydedilen video, birinci dereceden sıfır fazlı dijital filtre kullanılarak sonradan işlendi. Doku gerilmesini (tepeden tepeye) ölçmek için, kaydedilen sinyaldeki tepeler ve çukurlar arasında ayrım yapmak üzere tepeden tepeye analiz yapıldı. Ek olarak, sinyal kaymasını ortadan kaldırmak için 6. dereceden bir polinom kullanılarak eğilim giderme işlemi gerçekleştirildi. Küresel doku hareketini, döngü süresini, gevşeme süresini ve kasılma süresini belirlemek için MATLAB'da program kodu geliştirildi (Ek Program Kodu 44).
Gerinim analizi için, mekanik gerilme değerlendirmesi için oluşturulan aynı videoları kullanarak, öncelikle MUSCLEMOTION yazılımına göre hareket tepe noktalarını (hareketin en yüksek (üst) ve en düşük (alt) noktaları) temsil eden iki görüntü çizdik. Daha sonra doku bölgelerini segmentlere ayırdık ve segmentlere ayrılmış dokuya bir tür gölgelendirme algoritması uyguladık (Ek Şekil 2a). Segmentlere ayrılmış doku daha sonra on alt yüzeye bölündü ve her yüzeydeki gerilim aşağıdaki denklem kullanılarak hesaplandı: Gerinim = (Sup-Sdown)/Sdown, burada Sup ve Sdown, şeklin kumaşın üst ve alt gölgelerinden olan mesafeleridir (Ek Şekil 2b).
Kalp kesitleri 48 saat boyunca %4 paraformaldehit içinde sabitlendi. Sabitlenmiş dokular 1 saat boyunca %10 ve %20 sukrozda, ardından gece boyunca %30 sukrozda dehidrate edildi. Daha sonra kesitler optimum kesme sıcaklığı bileşiğine (OCT bileşiği) gömüldü ve izopentan/kuru buz banyosunda kademeli olarak donduruldu. OCT gömme blokları ayrılana kadar -80 °C'de saklandı. Slaytlar 8 μm kalınlığında kesitler halinde hazırlandı.
Kalp kesitlerinden OCT'yi uzaklaştırmak için, slaytları 95 °C'de 5 dakika boyunca ısıtma bloğunda ısıtın. Her slayta 1 ml PBS ekleyin ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin, ardından kesitleri oda sıcaklığında 15 dakika boyunca PBS içinde %0,1 Triton-X ile geçirgen hale getirin. Spesifik olmayan antikorların örneğe bağlanmasını önlemek için, slaytlara 1 ml %3 BSA çözeltisi ekleyin ve oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin. Daha sonra BSA uzaklaştırıldı ve slaytlar PBS ile yıkandı. Her örneği bir kalemle işaretleyin. Birincil antikorlar (1:200 oranında %1 BSA'da seyreltilmiş) (konneksin 43 (Abcam; #AB11370), NFATC4 (Abcam; #AB99431) ve troponin-T (Thermo Scientific; #MA5-12960)) 90 dakika boyunca eklendi, ardından ikincil antikorlar (1:200 oranında %1 BSA'da seyreltilmiş) fare Alexa Fluor 488'e (Thermo Scientific; #A16079) ve tavşan Alexa Fluor 594'e (Thermo Scientific; #T6391) karşı 90 dakika daha uygulandı. PBS ile 3 kez yıkandı. Hedef boyamayı arka plandan ayırt etmek için sadece ikincil antikor kontrol olarak kullanıldı. Son olarak, DAPI nükleer boyası eklendi ve slaytlar bir vectashield'e (Vector Laboratories) yerleştirilerek oje ile kapatıldı. -x büyütme) ve 40x büyütmeli Keyence mikroskobu kullanıldı.
WGA boyaması için PBS içinde 5 μg/ml konsantrasyonda WGA-Alexa Fluor 555 (Thermo Scientific; #W32464) kullanıldı ve sabitlenmiş kesitlere oda sıcaklığında 30 dakika süreyle uygulandı. Daha sonra slaytlar PBS ile yıkandı ve her slayta Sudan siyahı eklendi ve 30 dakika inkübe edildi. Slaytlar daha sonra PBS ile yıkandı ve Vectashield gömme ortamı eklendi. Slaytlar, Keyence mikroskobunda 40x büyütme ile görüntülendi.
Yukarıda açıklandığı gibi, örneklerden OCT çıkarıldı. OCT çıkarıldıktan sonra, slaytlar gece boyunca Bouin çözeltisine daldırıldı. Daha sonra slaytlar 1 saat boyunca damıtılmış su ile durulandı ve ardından 10 dakika boyunca Bibrich aloe asit fuksin çözeltisine yerleştirildi. Ardından slaytlar damıtılmış su ile yıkandı ve 10 dakika boyunca %5 fosfomolibden/%5 fosfotungstik asit çözeltisine yerleştirildi. Durulama yapılmadan, slaytlar doğrudan 15 dakika boyunca anilin mavisi çözeltisine aktarıldı. Daha sonra slaytlar damıtılmış su ile yıkandı ve 2 dakika boyunca %1 asetik asit çözeltisine yerleştirildi. Slaytlar 200 N etanolde kurutuldu ve ksilene aktarıldı. Boyanmış slaytlar, 10x objektifli bir Keyence mikroskobu kullanılarak görüntülendi. Fibrozis alanı yüzdesi, Keyence Analyzer yazılımı kullanılarak ölçüldü.
CyQUANT™ MTT Hücre Canlılığı Testi (Invitrogen, Carlsbad, CA), katalog numarası V13154, üreticinin protokolüne bazı değişiklikler yapılarak uygulandı. Özellikle, MTT analizi sırasında homojen doku boyutunu sağlamak için 6 mm çapında cerrahi bir zımba kullanıldı. Dokular, üreticinin protokolüne göre MTT substratı içeren 12 kuyucuklu bir plakanın kuyucuklarına ayrı ayrı yerleştirildi. Kesitler 37°C'de 3 saat inkübe edildi ve canlı doku, MTT substratını metabolize ederek mor bir formazan bileşiği oluşturdu. MTT çözeltisi 1 ml DMSO ile değiştirildi ve kalp kesitlerinden mor formazanı çıkarmak için 37°C'de 15 dakika inkübe edildi. Numuneler, 96 kuyucuklu şeffaf tabanlı plakalarda DMSO içinde 1:10 oranında seyreltildi ve mor renk yoğunluğu, bir Cytation plaka okuyucu (BioTek) kullanılarak 570 nm'de ölçüldü. Okumalar, kalbin her bir diliminin ağırlığına göre normalize edildi.
Kalp dilimi ortamı, daha önce açıklandığı gibi glikoz kullanım analizi için 1 μCi/ml [5-3H]-glikoz (Moravek Biochemicals, Brea, CA, ABD) içeren ortamla değiştirildi. 4 saatlik inkübasyondan sonra, 100 µl 0,2 N HCl içeren açık bir mikro santrifüj tüpüne 100 µl ortam eklendi. Daha sonra tüp, 37°C'de 72 saat boyunca [3H]2O'yu buharlaştırmak için 500 µl dH2O içeren bir sintilasyon tüpüne yerleştirildi. Ardından mikro santrifüj tüpü sintilasyon tüpünden çıkarıldı ve 10 ml sintilasyon sıvısı eklendi. Sintilasyon sayımları, Tri-Carb 2900TR sıvı sintilasyon analizörü (Packard Bioscience Company, Meriden, CT, ABD) kullanılarak gerçekleştirildi. Daha sonra, [5-3H]-glikoz spesifik aktivitesi, eksik denge ve arka plan, [5-3H]-glikozun etiketlenmemiş glikoza seyreltilmesi ve sintilasyon sayacı verimliliği dikkate alınarak glikoz kullanımı hesaplandı. Veriler, kalbin bölümlerinin kütlesine göre normalize edildi.
Trizol içinde doku homojenizasyonundan sonra, üreticinin protokolüne göre Qiagen miRNeasy Micro Kit #210874 kullanılarak kalp kesitlerinden RNA izole edildi. RNAsec kütüphanesi hazırlığı, sekanslama ve veri analizi aşağıdaki gibi gerçekleştirildi:
RNA kütüphanesinin hazırlanması için başlangıç ​​materyali olarak örnek başına 1 μg RNA kullanıldı. Dizileme kütüphaneleri, üreticinin önerilerine uygun olarak NEBNext UltraTM RNA Kütüphanesi Hazırlama Kiti (NEB, ABD) kullanılarak oluşturuldu ve her örnek için öznitelik dizilerine indeks kodları eklendi. Kısaca, mRNA, poli-T oligonükleotidlere bağlı manyetik boncuklar kullanılarak toplam RNA'dan saflaştırıldı. Parçalanma, NEBNext Birinci Zincir Sentez Reaksiyon Tamponunda (5X) yüksek sıcaklıkta iki değerlikli katyonlar kullanılarak gerçekleştirildi. Birinci zincir cDNA, rastgele hekzamer primerler ve M-MuLV ters transkriptaz (RNase H-) kullanılarak sentezlendi. İkinci zincir cDNA daha sonra DNA polimeraz I ve RNase H kullanılarak sentezlendi. Kalan çıkıntılar, eksonükleaz/polimeraz aktivitesi ile künt uçlara dönüştürüldü. DNA parçasının 3' ucunun adenilasyonundan sonra, hibridizasyona hazırlanması için saç tokası şeklinde bir yapıya sahip NEBNext Adaptörü ona bağlanır. Tercih edilen 150-200 bp uzunluğundaki cDNA parçalarının seçimi için, kütüphane parçaları AMPure XP sistemi (Beckman Coulter, Beverly, ABD) kullanılarak saflaştırıldı. Daha sonra, adaptörle bağlanmış boyut seçilmiş cDNA içeren 3 μl USER Enzimi (NEB, ABD), PCR'dan önce 37°C'de 15 dakika ve ardından 95°C'de 5 dakika süreyle kullanıldı. PCR daha sonra Phusion High-Fidelity DNA polimeraz, evrensel PCR primerleri ve İndeks (X) primerleri kullanılarak gerçekleştirildi. Son olarak, PCR ürünleri saflaştırıldı (AMPure XP sistemi) ve kütüphane kalitesi Agilent Bioanalyzer 2100 sistemi üzerinde değerlendirildi. cDNA kütüphanesi daha sonra Novaseq sekanslayıcı kullanılarak sekanslandı. Illumina'dan alınan ham görüntü dosyaları, CASAVA Base Calling kullanılarak ham okumalara dönüştürüldü. Ham veriler, okuma dizilerini ve karşılık gelen baz kalitelerini içeren FASTQ(fq) formatındaki dosyalarda saklanır. Filtrelenmiş sıralama okumalarını Sscrofa11.1 referans genomuna eşleştirmek için HISAT2'yi seçin. Genel olarak, HISAT2, 4 milyar bazdan daha büyük genomlar da dahil olmak üzere her boyuttaki genomları destekler ve çoğu parametre için varsayılan değerler ayarlanmıştır. RNA Seq verilerinden elde edilen ekleme okumaları, şu anda mevcut en hızlı sistem olan HISAT2 kullanılarak, diğer herhangi bir yöntemle aynı veya daha iyi doğrulukla verimli bir şekilde hizalanabilir.
Transkriptlerin bolluğu, gen ekspresyon seviyesini doğrudan yansıtır. Gen ekspresyon seviyeleri, genom veya ekzonlarla ilişkili transkriptlerin bolluğu (sekanslama sayısı) ile değerlendirilir. Okuma sayısı, gen ekspresyon seviyeleri, gen uzunluğu ve sekanslama derinliği ile orantılıdır. FPKM (milyon baz çifti başına sekanslanan transkriptin bin baz çifti başına düşen fragman sayısı) hesaplandı ve DESeq2 paketi kullanılarak diferansiyel ekspresyonun P değerleri belirlendi. Daha sonra, yerleşik R fonksiyonu "p.adjust"a dayalı Benjamini-Hochberg yöntemi9 kullanılarak her P değeri için yanlış keşif oranı (FDR) hesaplandı.
Kalp kesitlerinden izole edilen RNA, Thermo'nun SuperScript IV Vilo Master mix'i (Thermo, katalog no. 11756050) kullanılarak 200 ng/μl konsantrasyonunda cDNA'ya dönüştürüldü. Kantitatif RT-PCR, Applied Biosystems Endura Plate Microamp 384 kuyucuklu şeffaf reaksiyon plakası (Thermo, katalog no. 4483319) ve microamp optik yapıştırıcı (Thermo, katalog no. 4311971) kullanılarak gerçekleştirildi. Reaksiyon karışımı, her bir kuyucuğa 5 µl Taqman Fast Advanced Master mix (Thermo, katalog no. 4444557), 0,5 µl Taqman Primer ve 3,5 µl H2O karıştırılarak hazırlandı. Standart qPCR döngüleri çalıştırıldı ve CT değerleri, Applied Biosystems Quantstudio 5 gerçek zamanlı PCR cihazı (384 kuyucuklu modül; ürün no. A28135) kullanılarak ölçüldü. Taqman primerleri Thermo'dan satın alındı ​​(GAPDH (Ss03375629_u1), PARP12 (Ss06908795_m1), PKDCC (Ss06903874_m1), CYGB (Ss06900188_m1), RGL1 (Ss06868890_m1), ACTN1 (Ss01009508_mH), GATA4 (Ss03383805_u1), GJA1 (Ss03374839_u1), COL1A2 (Ss03375009_u1), COL3A1 (Ss04323794_m1), ACTA2 (Ss04245588_m1)). Tüm örneklerin CT değerleri, referans gen GAPDH'ye göre normalize edildi.
NT-ProBNP'nin medya salınımı, üreticinin protokolüne göre NT-ProBNP kiti (domuz) (Kat. No. MBS2086979, MyBioSource) kullanılarak değerlendirildi. Kısaca, her bir örnek ve standarttan 250 µl, her bir kuyuya ikişer kez eklendi. Örnek eklendikten hemen sonra, her bir kuyuya 50 µl Assay Reagent A eklendi. Plaka hafifçe çalkalandı ve sızdırmazlık malzemesi ile kapatıldı. Daha sonra tabletler 37°C'de 1 saat inkübe edildi. Ardından çözelti aspire edildi ve kuyular 350 µl 1X yıkama çözeltisi ile 4 kez yıkandı, yıkama çözeltisi her seferinde 1-2 dakika inkübe edildi. Daha sonra her bir kuyuya 100 µl Assay Reagent B eklendi ve plaka sızdırmazlık malzemesi ile kapatıldı. Tablet hafifçe çalkalandı ve 37°C'de 30 dakika inkübe edildi. Çözeltiyi aspire edin ve kuyucukları 350 µl 1X yıkama çözeltisi ile 5 kez yıkayın. Her kuyucuğa 90 µl substrat çözeltisi ekleyin ve plakayı kapatın. Plakayı 37°C'de 10-20 dakika inkübe edin. Her kuyucuğa 50 µl Durdurma Çözeltisi ekleyin. Plaka, 450 nm'ye ayarlanmış bir Cytation (BioTek) plaka okuyucu kullanılarak hemen ölçüldü.
Parametrede %10'luk mutlak bir değişimi %5'lik Tip I hata oranıyla tespit etmek için %80'den fazla güç sağlayacak grup boyutlarını seçmek amacıyla güç analizleri yapılmıştır. Parametrede %10'luk mutlak bir değişimi %5'lik Tip I hata oranıyla tespit etmek için %80'den fazla güç sağlayacak grup boyutlarını seçmek amacıyla güç analizleri yapılmıştır. Анализ мощности был выполнен для выбора размеров групп, которые обеспечат >80% мощности обнаружения % 10'luk alkolsüz parametre ve %5'lik zehirli bitki türü I. %10'luk mutlak parametre değişimini %5'lik Tip I hata oranıyla tespit etmek için %80'den fazla güç sağlayacak grup boyutlarını seçmek amacıyla güç analizi yapılmıştır.Daha Fazla Bilgi> 80%功效以检测参数中10%绝对变化和5%I型错误率的组大小。Daha Fazla Bilgi> 80%功效以检测参数中10%绝对变化和5%I型错误率的组大小。 Был проведен анализ мощности для выбора размера группы, который обеспечил бы > 80% мощности для обнаружения 10% абсолютного изменения параметров и 5% частоты ошибок типа I. %10'luk mutlak parametre değişimini ve %5'lik tip I hata oranını tespit etmek için %80'den fazla güç sağlayacak bir grup boyutu seçmek amacıyla bir güç analizi gerçekleştirildi.Deney öncesinde doku kesitleri rastgele seçildi. Tüm analizler koşuldan bağımsız olarak yapıldı ve örnekler ancak tüm veriler analiz edildikten sonra çözümlendi. Tüm istatistiksel analizler GraphPad Prism yazılımı (San Diego, CA) kullanılarak gerçekleştirildi. Tüm istatistikler için p değerleri 0,05'ten küçük olduğunda anlamlı kabul edildi. Tüm istatistikler için p değerleri <0,05 olduğunda anlamlı kabul edildi. Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. Tüm istatistikler için p değerleri <0,05 olduğunda anlamlı kabul edildi.对于所有统计数据,p 值在值<0.05 时被认为是显着的。对于所有统计数据,p 值在值<0.05 时被认为是显着的。 Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. Tüm istatistikler için p değerleri <0,05 olduğunda anlamlı kabul edildi.Veriler üzerinde yalnızca 2 karşılaştırma içeren iki kuyruklu Student's t-testi uygulandı. Çoklu gruplar arasındaki anlamlılığı belirlemek için tek yönlü veya iki yönlü ANOVA kullanıldı. Post hoc testler yapılırken, çoklu karşılaştırmaları hesaba katmak için Tukey düzeltmesi uygulandı. RNAsec verileri, Yöntemler bölümünde açıklandığı gibi FDR ve p.adjust hesaplanırken özel istatistiksel hususlara sahiptir.
Çalışma tasarımına ilişkin daha fazla bilgi için, bu makaleye bağlantılı Nature Research Report özetine bakınız.