Nature.com'u ziyaret ettiğiniz için teşekkür ederiz.Kullanmakta olduğunuz tarayıcı sürümü sınırlı CSS desteğine sahiptir.En iyi deneyim için güncellenmiş bir tarayıcı kullanmanızı (veya Internet Explorer'da Uyumluluk Modunu devre dışı bırakmanızı) öneririz.Bu arada, sürekli destek sağlamak için siteyi stiller ve JavaScript olmadan yapacağız.
İlaç testi için kalbin fizyolojik ortamını doğru bir şekilde yeniden üretebilen güvenilir bir in vitro sisteme ihtiyaç vardır.İnsan kalp doku kültürü sistemlerinin sınırlı mevcudiyeti, kardiyak ilaç etkilerinin yanlış yorumlanmasına yol açmıştır.Burada, kalp dilimlerini elektromekanik olarak uyaran ve kalp döngüsünün sistolik ve diyastolik fazları sırasında fizyolojik gerilmeye uğrayan bir kardiyak doku kültürü modeli (CTCM) geliştirdik.12 günlük kültürden sonra, bu yaklaşım kalp bölümlerinin yaşayabilirliğini kısmen iyileştirdi, ancak yapısal bütünlüklerini tam olarak korumadı.Bu nedenle, küçük molekül taramasından sonra, ortamımıza 100 nM triiyodotironin (T3) ve 1 uM deksametazon (Dex) ilavesinin, bölümlerin mikro yapısını 12 gün boyunca koruduğunu bulduk.T3/Dex tedavisi ile kombinasyon halinde CTCM sistemi, 12 gün boyunca taze kalp dokusu ile aynı seviyede transkripsiyon profillerini, canlılığı, metabolik aktiviteyi ve yapısal bütünlüğü korudu.Ek olarak, kültürde kardiyak dokunun aşırı gerilmesi, hipertrofik kardiyak sinyalleşmeyi indükleyerek, CTCM'nin kardiyak gerilmenin neden olduğu hipertrofik durumları taklit etme kabiliyetine dair kanıt sağlar.Sonuç olarak, CTCM, güvenilir ilaç taramasını mümkün kılarak, kültürde kalbin fizyolojisini ve patofizyolojisini uzun süreler boyunca modelleyebilir.
Klinik araştırmalardan önce, insan kalbinin fizyolojik ortamını doğru bir şekilde yeniden üretebilen güvenilir in vitro sistemlere ihtiyaç vardır.Bu tür sistemler, değiştirilmiş mekanik gerilmeyi, kalp atış hızını ve elektrofizyolojik özellikleri taklit etmelidir.Hayvan modelleri yaygın olarak kardiyak fizyoloji için bir tarama platformu olarak kullanılır ve ilaçların insan kalbindeki etkilerini yansıtmada güvenilirliği sınırlıdır1,2.Sonuç olarak, İdeal Kardiyak Doku Kültürü Deneysel Modeli (CTCM), çeşitli terapötik ve farmakolojik müdahaleler için son derece hassas ve spesifik olan, insan kalbinin fizyolojisini ve patofizyolojisini doğru bir şekilde yeniden üreten bir modeldir3.Böyle bir sistemin olmaması, kalp yetmezliği4,5 için yeni tedavilerin keşfini sınırlıyor ve piyasadan çıkmak için önemli bir neden olarak ilaç kardiyotoksisitesine yol açtı6.
Son on yılda sekiz kardiyovasküler olmayan ilaç, ventriküler aritmilere ve ani ölüme yol açan QT aralığı uzamasına neden oldukları için klinik kullanımdan çekilmiştir7.Bu nedenle, kardiyovasküler etkinlik ve toksisiteyi değerlendirmek için güvenilir klinik öncesi tarama stratejilerine artan bir ihtiyaç vardır.İlaç taraması ve toksisite testlerinde insan kaynaklı pluripotent kök hücre kaynaklı kardiyomiyositlerin (hiPS-CM) son zamanlarda kullanılması bu soruna kısmi bir çözüm sunmaktadır.Bununla birlikte, hiPS-CM'lerin olgunlaşmamış doğası ve kalp dokusunun çok hücreli karmaşıklığının olmaması bu yöntemin başlıca sınırlamalarıdır.Son araştırmalar, spontan kasılmaların başlamasından kısa bir süre sonra kardiyak doku hidrojelleri oluşturmak için erken hiPS-CM kullanılarak ve zaman içinde kademeli olarak artan elektriksel stimülasyonla bu sınırlamanın kısmen üstesinden gelinebileceğini göstermiştir.Bununla birlikte, bu hiPS-CM mikrodokuları yetişkin miyokardiyumun olgun elektrofizyolojik ve kontraktil özelliklerinden yoksundur.Ek olarak, insan kalp dokusu, spesifik hücre dışı matris protein setleri ile birbirine bağlanan endotel hücreleri, nöronlar ve stromal fibroblastlar dahil olmak üzere farklı hücre tiplerinin heterojen bir karışımından oluşan daha karmaşık bir yapıya sahiptir.Yetişkin memeli kalbindeki kardiyomiyosit olmayan popülasyonların11,12,13 bu heterojenliği, tek tek hücre türleri kullanılarak kalp dokusunun modellenmesinde önemli bir engeldir.Bu önemli sınırlamalar, fizyolojik ve patolojik koşullar altında bozulmamış miyokard dokusunun kültürlenmesi için yöntemler geliştirmenin önemini vurgulamaktadır.
İnsan kalbinin kültürlenmiş ince (300 µm) bölümlerinin bozulmamış insan miyokardiyumunun umut verici bir modeli olduğu kanıtlanmıştır.Bu yöntem, insan kalp dokusuna benzer eksiksiz bir 3B çok hücreli sisteme erişim sağlar.Bununla birlikte, 2019 yılına kadar kültürlenmiş kalp bölümlerinin kullanımı, kısa (24 saat) kültür sağkalımı nedeniyle sınırlıydı.Bu, fiziksel-mekanik esneme eksikliği, hava-sıvı ara yüzü ve kalp dokusunun ihtiyaçlarını desteklemeyen basit ortamların kullanımı dahil olmak üzere bir dizi faktörden kaynaklanmaktadır.2019'da birkaç araştırma grubu, mekanik faktörlerin kardiyak doku kültürü sistemlerine dahil edilmesinin kültür ömrünü uzatabileceğini, kardiyak ifadeyi iyileştirebileceğini ve kardiyak patolojiyi taklit edebileceğini gösterdi.İki zarif çalışma 17 ve 18, tek eksenli mekanik yüklemenin kültür sırasında kardiyak fenotip üzerinde olumlu bir etkiye sahip olduğunu göstermektedir.Bununla birlikte, kalp bölümleri izometrik gerilme kuvvetleri 17 veya doğrusal okotonik yükleme 18 ile yüklendiğinden, bu çalışmalar kalp döngüsünün dinamik üç boyutlu fiziko-mekanik yüklemesini kullanmadı.Bu doku germe yöntemleri, birçok kardiyak genin baskılanmasıyla veya anormal gerilme tepkileriyle ilişkili genlerin aşırı ekspresyonuyla sonuçlandı.Özellikle, Pitoulis ve ark.19, güç dönüştürücü geri bildirimi ve gerilim tahrikleri kullanarak kardiyak döngü yeniden yapılandırması için dinamik bir kalp dilimi kültür banyosu geliştirdi.Bu sistem daha doğru in vitro kardiyak döngü modellemesine izin verse de, yöntemin karmaşıklığı ve düşük çıktısı bu sistemin uygulanmasını sınırlar.Laboratuvarımız yakın zamanda elektrik stimülasyonu ve domuz ve insan kalp dokusu bölümlerinin canlılığını 6 güne20,21 kadar sürdürmek için optimize edilmiş bir ortam kullanan basitleştirilmiş bir kültür sistemi geliştirdi.
Mevcut el yazmasında, kalp döngüsü sırasında üç boyutlu kalp fizyolojisini ve patofizyolojik gerginliği özetlemek için hümoral ipuçları içeren domuz kalbinin bölümlerini kullanan bir kalp doku kültürü modelini (CTCM) açıklıyoruz.Bu CTCM, klinik öncesi ilaç testi için memeli kalbinin fizyolojisini/patofizyolojisini taklit eden uygun maliyetli, orta verimli bir kardiyak sistem sağlayarak klinik öncesi ilaç tahmininin doğruluğunu daha önce hiç ulaşılmamış bir düzeye çıkarabilir.
Hemodinamik mekanik sinyaller, in vitro 22,23,24 kardiyomiyosit işlevini sürdürmede kritik bir rol oynar.Mevcut el yazmasında, fizyolojik frekanslarda (dakikada 1,2 Hz, 72 atım) hem elektriksel hem de mekanik stimülasyonu indükleyerek yetişkin kalp ortamını taklit edebilen bir CTCM (Şekil 1a) geliştirdik.Diyastol sırasında aşırı doku gerilmesini önlemek için, doku boyutunu %25 oranında artırmak için bir 3D baskı cihazı kullanıldı (Şekil 1b).C-PACE sistemi tarafından indüklenen elektriksel pacing, kalp döngüsünü tamamen yeniden oluşturmak için bir veri toplama sistemi kullanılarak sistolden 100 ms önce başlayacak şekilde zamanlandı.Doku kültürü sistemi, üst bölmedeki kalp dilimlerinin genişlemesine neden olacak şekilde esnek bir silikon zarı döngüsel olarak genişletmek için programlanabilir bir pnömatik aktüatör (LB Engineering, Almanya) kullanır.Sistem, basıncı (± 1 mmHg) ve zamanı (± 1 ms) doğru bir şekilde ayarlamayı mümkün kılan bir basınç dönüştürücü aracılığıyla harici bir hava hattına bağlandı (Şekil 1c).
a Doku bölümünü, cihazın kültür odasının içindeki mavi renkle gösterilen 7 mm'lik destek halkasına takın.Kültür odası, hava odasından ince, esnek bir silikon zar ile ayrılır.Sızıntıları önlemek için her hazne arasına bir conta yerleştirin.Cihazın kapağında elektriksel stimülasyon sağlayan grafit elektrotlar bulunmaktadır.b Büyük doku cihazının, kılavuz halkanın ve destek halkasının şematik gösterimi.Doku kesitleri (kahverengi), cihazın dış kenarındaki oyuğa yerleştirilen kılavuz halka ile büyük boyutlu cihaza yerleştirilir.Kılavuzu kullanarak, doku akrilik yapıştırıcı ile kaplanmış destek halkasını kalp dokusu bölümünün üzerine dikkatlice yerleştirin.c Programlanabilir bir pnömatik aktüatör (PPD) tarafından kontrol edilen hava odası basıncının bir fonksiyonu olarak elektriksel stimülasyon süresini gösteren grafik.Basınç sensörleri kullanılarak elektriksel stimülasyonu senkronize etmek için bir veri toplama cihazı kullanıldı.Kültür odasındaki basınç ayarlanan eşiğe ulaştığında, elektrik stimülasyonunu tetiklemek için C-PACE-EM'ye bir darbe sinyali gönderilir.d Bir kuvöz rafına yerleştirilmiş dört CTCM'nin görüntüsü.Dört cihaz bir pnömatik devre yoluyla bir PPD'ye bağlanır ve pnömatik devredeki basıncı izlemek için hemostatik valfe basınç sensörleri yerleştirilir.Her cihaz altı doku bölümü içerir.
Tek bir pnömatik aktüatör kullanarak, her biri 6 doku bölümü alabilen 4 CTCM cihazını kontrol edebildik (Şekil 1d).CTCM'de hava odasındaki hava basıncı, sıvı odasında senkron basınca dönüştürülür ve kalp diliminin fizyolojik genişlemesine neden olur (Şekil 2a ve Ek Film 1).80 mm Hg'de doku gerilmesinin değerlendirilmesi.Sanat.doku bölümlerinin %25 oranında esnediğini gösterdi (Şekil 2b).Bu yüzde gerilmenin, normal kardiyak bölüm kontraktilite17,19,25 için 2,2–2,3 µm fizyolojik sarkomer uzunluğuna karşılık geldiği gösterilmiştir.Doku hareketi, özel kamera ayarları kullanılarak değerlendirildi (Ek Şekil 1).Doku hareketinin genliği ve hızı (Şekil 2c, d), kalp döngüsü sırasındaki gerilmeye ve sistol ve diyastol sırasındaki zamana (Şekil 2b) karşılık geldi.Kasılma ve gevşeme sırasında kalp dokusunun gerilmesi ve hızı, kültürde 12 gün boyunca sabit kalmıştır (Şekil 2f).Elektrik stimülasyonunun kültür sırasında kontraktilite üzerindeki etkisini değerlendirmek için, bir gölgeleme algoritması kullanarak aktif deformiteyi belirlemek için bir yöntem geliştirdik (Ek Şekil 2a,b) ve elektriksel stimülasyon olan ve olmayan deformiteleri ayırt edebildik.Kalbin aynı bölümü (Res. 2f).Kesiğin hareketli bölgesinde (R6-9), elektrik stimülasyonu sırasında voltaj, elektrik stimülasyonunun olmadığı duruma göre %20 daha yüksekti, bu da elektrik stimülasyonunun kasılma işlevine katkısını gösterir.
Hava odası basıncının, sıvı odası basıncının ve doku hareketi ölçümlerinin temsili izleri, oda basıncının sıvı odası basıncını değiştirdiğini ve doku diliminin karşılık gelen hareketine neden olduğunu doğrular.b Yüzde esnemeye (turuncu) karşılık gelen doku bölümlerinin esneme yüzdesinin (mavi) temsili izleri.c Kardiyak dilimin ölçülen hareketi, ölçülen hareket hızı ile tutarlıdır.(d) Kalbin bir dilimindeki döngüsel hareketin (mavi çizgi) ve hızın (turuncu noktalı çizgi) temsili yörüngeleri.e Döngü süresi (n = 19 dilim, farklı domuzlardan grup başına), kasılma süresi (n = grup başına 19 dilim), gevşeme süresi (n = 19 dilim, farklı domuzlardan grup başına), doku hareketi (n = 25).farklı domuzlardan dilimler)/grup), pik sistolik hız (n = 24(D0), 25(D12) dilim/farklı domuzlardan grup) ve pik gevşeme oranı (n=24(D0), 25(D12) dilim/farklı domuzlardan grup).İki kuyruklu Student t-testi, hiçbir parametrede anlamlı bir fark göstermedi.f Elektrik stimülasyonu olan (kırmızı) ve olmayan (mavi) doku bölümlerinin temsili gerinim analizi izleri, aynı bölümden on bölgesel doku bölümü alanı.Alt paneller, farklı bölümlerden on alanda elektrik stimülasyonu olan ve olmayan doku bölümlerindeki gerinimdeki yüzde farkının miktarını gösterir. (n = farklı domuzlardan 8 dilim/grup, Two-tailed Student t testi yapılır; ****p < 0,0001, **p < 0,01, *p < 0,05). (n = farklı domuzlardan 8 dilim/grup, Two-tailed Student t testi yapılır; ****p < 0,0001, **p < 0,01, *p < 0,05). (n = 8 срезов/группу от разных свиней, проводится двусторонний t-критерий Стьюдента; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05). (n = farklı domuzlardan 8 bölüm/grup, iki kuyruklu Student t testi; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05). (n = 8) (n = 8) (n = 8 срезов/группу, от разных свиней, двусторонний критерий Стьюдента; ****p <0,0001, **p <0,01, *p <0,05). (n = 8 bölüm/grup, farklı domuzlardan, iki kuyruklu Student t testi; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05).Hata çubukları, ortalama ± standart sapmayı temsil eder.
Önceki statik biyomimetik kalp dilimi kültür sistemimizde [20, 21], elektriksel stimülasyon uygulayarak ve besiyeri bileşimini optimize ederek kalp dilimlerinin canlılığını, işlevini ve yapısal bütünlüğünü 6 gün boyunca koruduk.Ancak 10 gün sonra bu rakamlar keskin bir şekilde düştü.Önceki statik biyomimetik kültür sistemimiz 20, 21 kontrol koşullarında (Ctrl) kültürlenen bölümlere atıfta bulunacağız ve daha önce optimize edilmiş ortamımızı MC koşulları ve eş zamanlı mekanik ve elektriksel stimülasyon (CTCM) altında kültür olarak kullanacağız.isminde .İlk olarak, elektrik stimülasyonu olmadan mekanik stimülasyonun doku canlılığını 6 gün boyunca sürdürmek için yetersiz olduğunu belirledik (Ek Şekil 3a,b).İlginç bir şekilde, STCM kullanılarak fizyo-mekanik ve elektriksel stimülasyonun getirilmesiyle, 12 günlük kalp kesitlerinin yaşayabilirliği, MTT analizinde gösterildiği gibi (Şekil 1), MS koşulları altında taze kalp kesitlerindekiyle aynı kaldı, ancak Ctrl koşulları altında değil.3 A).Bu, kalp döngüsünün mekanik stimülasyonunun ve simülasyonunun doku kesitlerini önceki statik kültür sistemimizde bildirilenden iki kat daha uzun süre canlı tutabileceğini düşündürmektedir.Bununla birlikte, kardiyak troponin T ve connexin 43'ün immüno-etiketlenmesi yoluyla doku bölümlerinin yapısal bütünlüğünün değerlendirilmesi, connexin 43 ekspresyonunun 12. günde MC dokularında aynı gün kontrollere göre anlamlı derecede yüksek olduğunu gösterdi.Bununla birlikte, tek biçimli connexin 43 ifadesi ve Z-disk oluşumu tam olarak korunmadı (Şekil 3b).Doku yapısal bütünlüğünü26 ölçmek için bir yapay zeka (AI) çerçevesi, lokalizasyonun gücü açısından kalp dilimlerinin yapısal bütünlüğünü ve floresansını otomatik olarak ölçmek için troponin-T ve connexin boyamaya43 dayalı görüntü tabanlı bir derin öğrenme boru hattı kullanıyoruz.Bu yöntem, referansta açıklandığı gibi kalp dokusunun yapısal bütünlüğünü otomatik ve tarafsız bir şekilde güvenilir bir şekilde ölçmek için bir Konvolüsyonel Sinir Ağı (CNN) ve derin bir öğrenme çerçevesi kullanır.26. MC dokusu, statik kontrol bölümlerine kıyasla 0. güne gelişmiş yapısal benzerlik gösterdi.Ek olarak, Masson'un trikrom boyaması, kültürün 12. gününde kontrol koşullarına kıyasla MS koşulları altında önemli ölçüde daha düşük bir fibroz yüzdesi ortaya çıkardı (Şekil 3c).CTCM, 12. günde kalp dokusu bölümlerinin canlılığını taze kalp dokusuna benzer bir düzeye çıkarırken, kalp bölümlerinin yapısal bütünlüğünü önemli ölçüde iyileştirmedi.
Bir Çubuk grafik, taze kalp dilimlerinin (D0) veya kalp dilimleri kültürünün 12 gün boyunca statik kültürde (D12 Ctrl) veya CTCM'de (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) dilim/grupta) MTT canlılığının miktarını gösterir, tek yönlü ANOVA testi yapılır; D0 ve **p < ile karşılaştırıldığında ####p < 0.0001 0,01, D12 Ctrl ile karşılaştırıldığında). Bir Çubuk grafik, taze kalp dilimlerinin (D0) veya kalp dilimleri kültürünün 12 gün boyunca statik kültürde (D12 Ctrl) veya CTCM'de (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl ), 12 (D12 MC) dilim/grupta) MTT canlılığının miktarını gösterir, tek yönlü ANOVA testi yapılır; D0 ve **p < ile karşılaştırıldığında ####p < 0.0001 0,01, D12 Ctrl ile karşılaştırıldığında).histogram, farklı domuzlardan alınan 12 (D12 MC) kesit/grupta statik kültür (D12 kontrol) veya CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 kontrol). ) ), 12 (D12 MC) kesit/grupta 12 gün boyunca MTT taze kalp kesitlerinin (D0) veya kalp kesitlerinin kültürünün canlılığının miktarını gösterir; tek yönlü ANOVA testi gerçekleştirilir;####p < 0,0001 по сравнению с D0 и **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p < 0.0001, D0'a kıyasla ve **p < 0.01, D12 Ctrl'ye kıyasla). a Ana Sayfa天的MTT 活力的量化)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；与D0 相比，####p < 0.0001 ，与D12 Ctrl 相比，**p < 0.01)。 a Ana Sayfa 12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；与D0 相比，####p < 0.0001，与D12 Ctrl 相比，**p。)taze kalp kesitlerinde (D0) veya statik kültürde (D12 kontrol) veya CTCM'de (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 kontrol)) 12 gün kültürlenmiş kalp kesitlerinde (D0) veya farklı domuzlardan 12 (D12 MC) kesit/grupta MTT canlılığının miktarını gösteren histogram, tek yönlü ANOVA testi;####p < 0,0001, D0'ta, **p < 0,01, D12 Ctrl'de). ####p < 0.0001, D0'a kıyasla, **p < 0.01, D12 Ctrl'ye kıyasla).b Troponin-T (yeşil), connexin 43 (kırmızı) ve DAPI (mavi), yeni izole edilmiş kalp kesitlerinde (D0) veya statik koşullarda (Ctrl) veya CTCM koşullarında (MC) 12 gün boyunca kültürlenmiş kalp bölümlerinde) temsili immünofloresan görüntüleri (boş ölçek = 100 µm). Kalp dokusunun yapısal bütünlüğünün yapay zeka ölçümü (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), her biri farklı domuzdan 5 (D12 MC) dilim/grup, tek yönlü ANOVA testi gerçekleştirilir; D0'a kıyasla ####p < 0.0001 ve D12 Ctrl'ye kıyasla ****p < 0.0001). Kalp dokusu yapısal bütünlüğünün yapay zeka ölçümü (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), her biri farklı domuzlardan 5 (D12 MC) dilim/grup, tek yönlü ANOVA testi gerçekleştirilir; D0'a kıyasla ####p < 0.0001 ve D12 Ctrl'ye kıyasla ****p < 0.0001). Количественная оценка структурной целостности сердечной ткани искусственным интеллектом (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) с резов/групп от разных свиней, проводится однофакторный тест ANOVA; ####p < 0,0001 по сравнению с D0 и ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). Kalp dokusunun yapısal bütünlüğünün yapay zeka ile ölçülmesi (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), farklı domuzlardan 5 (D12 MC) kesit/grup, yapılan tek yönlü ANOVA testi; D12 Ctrl ile karşılaştırıldığında D0 ve ****p < 0.0001'e karşı ####p < 0.0001).人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) dilim/grup, her biri farklı domuz, tek yönlü ANOVA testi;####p < 0.0001 与D0 相比，**** p < 0.0001 与D12 Ctrl 相比）。人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) farklı domuzlardan dilim/grup, tek yönlü ANOVA testi;####p < 0.0001 与D0相比，**** p < 0.0001 与D12 Ctrl 相比）。 Искусственный интеллект для количественной оценки структурной целостности сердечной ткани (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) срезов/группу каждой из разных свиней, односторонний тест ANOVA; ####p <0,0001 vs. 12 Ctrl). Kalp dokusunun yapısal bütünlüğünü ölçmek için yapay zeka (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), farklı domuzlardan 5 (D12 MC) bölüm/grup, tek yönlü ANOVA testi; ####p<0,0001 - .D0 Karşılaştırma için ****p < 0,0001, D12 Ctrl ile karşılaştırıldığında). c Masson'un trikrom boyası ile boyanmış kalp dilimleri için temsili görüntüler (solda) ve kantifikasyon (sağda) (Çıplak Ölçek = 500 µm) (n = her biri farklı domuzdan 10 dilim/grup, tek yönlü ANOVA testi yapılır; D0'a kıyasla ####p < 0.0001 ve D12 Ctrl'ye kıyasla ***p < 0.001). c Masson'un trikrom boyası (Çıplak Ölçek = 500 µm) ile boyanmış kalp dilimleri için temsili görüntüler (solda) ve kantifikasyon (sağda) (n = her biri farklı domuzlardan 10 dilim/grup, tek yönlü ANOVA testi yapılır; D0'a kıyasla #### p < 0.0001 ve D12 Ctrl'ye kıyasla ***p < 0.001). c Репрезентативные изображения (слева) и количественная оценка (справа) срезов сердца, окрашенных трихромным краси телем Массона (масштаб без покрытия = 500 мкм) (n = 10 срезов/группу от разных свиней, выполняется односторонний тест A) NOVA; #### p < 0,0001 по сравнению с D0 и ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Masson'un trikrom boyası (kaplanmamış ölçek = 500 µm) ile boyanmış kalp bölümlerinin temsili görüntüleri (solda) ve kantifikasyonu (sağda) (n = farklı domuzlardan 10 bölüm/grup, yapılan tek yönlü ANOVA testi; D0'a kıyasla #### p < 0 .0001 ve D12 Ctrl'ye kıyasla ***p < 0.001). c 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像（左）和量化（右）（裸尺度= 500 µm）（n = 10 个ANOVA 测试；#### p < 0.0001 与D0 相比，***p < 0.001 与D12 Ctrl 相比） . C 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 （左 左） 量化 （右） 裸尺度 裸尺度 裸尺度 裸尺度 = 500 µm） （n = 10比，**p < 0.001 与D12 Ctrl 相比）。 c Репрезентативные изображения (слева) и количественный анализ (справа) срезов сердца, окрашенных трихромным крас ителем Массона (чистая шкала = 500 мкм) (n = 10 срезов/группа, каждый от другой свиньи, протестировано с помощью однофак) торного дисперсионного анализа ;### #p < 0,0001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Masson'un trikrom boyası (boş = 500 µm) ile boyanmış kalp bölümlerinin temsili görüntüleri (solda) ve miktar tayini (sağda) (n = 10 bölüm/grup, her biri farklı bir domuzdan, tek yönlü varyans analizi ile test edilmiştir;### # D0'a kıyasla p < 0,0001, ***p < 0,001, D12 Ctrl'ye kıyasla).Hata çubukları, ortalama ± standart sapmayı temsil eder.
Kültür ortamına küçük moleküller ekleyerek kardiyomiyosit bütünlüğünün iyileştirilebileceğini ve CTCM kültürü sırasında fibroz gelişiminin azaltılabileceğini varsaydık.Bu nedenle, az sayıda karıştırıcı faktör nedeniyle statik kontrol kültürlerimizi20,21 kullanarak küçük molekülleri taradık.Bu tarama için deksametazon (Dex), triiyodotironin (T3) ve SB431542 (SB) seçilmiştir.Bu küçük moleküller daha önce hiPSC-CM kültürlerinde sarkomer uzunluğunu, T-tübüllerini ve iletim hızını artırarak kardiyomiyositlerin olgunlaşmasını sağlamak için kullanılmıştı.Ek olarak, hem Dex (bir glukokortikoid) hem de SB'nin inflamasyonu baskıladığı bilinmektedir29,30.Bu nedenle, bu küçük moleküllerden birinin veya bir kombinasyonunun dahil edilmesinin kalp bölümlerinin yapısal bütünlüğünü iyileştirip iyileştirmeyeceğini test ettik.İlk tarama için, her bir bileşiğin dozu, hücre kültürü modellerinde (1 uM Dex27, 100 nM T327 ve 2.5 uM SB31) yaygın olarak kullanılan konsantrasyonlara göre seçildi.12 günlük kültürden sonra, T3 ve Dex kombinasyonu, optimal kardiyomiyosit yapısal bütünlüğü ve minimum fibröz yeniden şekillenme ile sonuçlandı (Ek Şekiller 4 ve 5).Ek olarak, bu T3 ve Dex konsantrasyonlarının iki katı veya iki katı kullanılması, normal konsantrasyonlara kıyasla zararlı etkiler üretti (Ek Şekil 6a,b).
İlk taramadan sonra, 4 kültür koşulunun bire bir karşılaştırmasını yaptık (Şekil 4a): Ctrl: optimize edilmiş ortamımız kullanılarak daha önce açıklanan statik kültürümüzde kültürlenen kalp bölümleri;20.21 TD: Çarşamba günü T3 ve Ctrl s Dex Eklendi;MC: önceden optimize edilmiş ortamımız kullanılarak CTCM'de kültürlenen kalp bölümleri;ve MT: Ortama T3 ve Dex eklenmiş CTCM.12 günlük ekimden sonra, MS ve MT dokularının yaşayabilirliği, MTT tahlili ile değerlendirilen taze dokulardakiyle aynı kaldı (Şekil 4b).İlginç bir şekilde, T3 ve Dex'in transwell kültürlerine (TD) eklenmesi, Ctrl koşullarıyla karşılaştırıldığında canlılıkta önemli bir gelişmeye yol açmadı; bu, kalp bölümlerinin canlılığının korunmasında mekanik stimülasyonun önemli bir rolü olduğunu gösteriyor.
12 gün boyunca ortam üzerinde mekanik stimülasyon ve T3/Dex takviyesinin etkilerini değerlendirmek için kullanılan dört kültür koşulunu gösteren bir Deneysel tasarım diyagramı. b Çubuk grafik, farklı domuzlardan taze kalp dilimleri (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD ve D12 MT), 12 (D12 MC) dilim/grup, tek yönlü ANOVA testi ile karşılaştırıldığında 4 kültür koşulunun hepsinde (Ctrl, TD, MC ve MT) kültürden 12 gün sonra canlılığın miktarını gösterir; ####p < 0.0001, ### D0'a kıyasla p < 0,001 ve D12 Ctrl'ye kıyasla **p < 0,01). b Çubuk grafik, farklı domuzlardan taze kalp dilimleri (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD ve D12 MT), 12 (D12 MC) dilim/grup, tek yönlü ANOVA testi ile karşılaştırıldığında 4 kültür koşulunun hepsinde (Ctrl, TD, MC ve MT) kültürden 12 gün sonra canlılığın miktarını gösterir; ####p < 0.0001, ### D0'a kıyasla p < 0,001 ve **p < 0,01, D12 ctrl'ye kıyasla). b Гистограмма показывает количественную оценку жизнеспособности через 12 дней после культивирования во всех 4 ус (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD ve D12 MT), 12 (D1 2 MC) срезов/группу от разных свиней, проводится односторонний тест ANOVA; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 по сравнению с D0 и **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). b Çubuk grafik, taze kalp bölümleri (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD ve D12 MT), 12 (D12 MC) bölümleri/grubu, tek yönlü ANOVA testi; ####p < 0.0001, ###p < 0,001'e karşı D0 ve **p < 0,01, D12 Ctrl ile karşılaştırıldığında). b 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) (n = 18 (D0)、15 (D12 Ctrl、D12 TD 和D12 MT)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；####p < 0.0001，###p < 0.001 与D0 相比，**p < 0.01 与D12控制）。b 4 12 (D12 MC) b Гистограмма, показывающая все 4 усльтивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D 0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD ve D12 MT), 12 (D12 MC) срезы/групPA, односторонний тест ANOVA; ####p <0,0001, ###p <0,00 1 по сравнению с D0, **p <0,01 по сравнению с контролем D12). b Farklı domuzlardan 12 (D12 MC) kesit/grup, tek yönlü ANOVA testi; ####p<0.0001, ###p<0.001 vs. .kontrol D12). c Çubuk grafik, taze kalp dilimlerine (D0) kıyasla 4 kültür koşulunun tamamında (Ctrl, TD, MC ve MT) kültürden 12 gün sonra glikoz akışının miktarını gösterir (n = farklı domuzlardan 6 dilim/grup, tek yönlü ANOVA testi gerçekleştirilir; D0'a kıyasla ###p < 0,001 ve D12 Ctrl'ye kıyasla ***p < 0,001). c Çubuk grafik, taze kalp dilimlerine (D0) kıyasla 4 kültür koşulunun tamamında (Ctrl, TD, MC ve MT) kültürden 12 gün sonra glikoz akışının miktarını gösterir (n = farklı domuzlardan 6 dilim/grup, tek yönlü ANOVA testi gerçekleştirilir; D0'a kıyasla ###p < 0,001 ve D12 Ctrl'ye kıyasla ***p < 0,001). c Гистограмма показывает количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после культивирования во всех 4 услов иях культивирования (контроль, TD, MC и MT) со свежими срезами сердца (D0) (n = 6 срезов/группу от разных свиней, односторонний Выполняется tест ANOVA; ###p < 0,001 по сравнению с D0 и ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Histogram, taze kalp bölümlerine (D0) kıyasla 4 kültür koşulunun hepsinde (kontrol, TD, MC ve MT) kültürden 12 gün sonra glukoz akışının miktarını gösterir (n = farklı domuzlardan 6 bölüm/grup, yapılan tek yönlü ANOVA testi; D0'a kıyasla ###p < 0,001 ve D12 Ctrl'ye kıyasla ***p < 0,001). c 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) 相比，培养后12 天的葡萄糖ANOVA 测试；###p < 0.001，与D0 相比，***p < 0.001 与D12 Ctrl 相比) C 条形图 显示 所有 4 sayfa后 后 12 天 的 通量 定量 （n = 6 片/组 ， 来自 猪 ， ， ， ， ， ， ， ， 猪 猪单向执行ANOVA 测试；###p < 0.001，与D0 相比，***p < 0.001 与D12 Ctrl 相比）。 c Гистограмма, показывающая количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после культивирования для всех 4 условий культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 6 срезов/группа, от разных св иней, односторонний Были проведены тесты ANOVA; ###p < 0,001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению с D12 (conтроль). c Taze kalp bölümlerine (D0) (n = 6 bölüm/grup, farklı domuzlardan, tek taraflı ANOVA testleri yapıldı mı, D0'a kıyasla ###p < 0.001, D12'ye (kontrol) kıyasla ***p < 0.001 ile karşılaştırıldığında 4 kültür koşulunun tümü (kontrol, TD, MC ve MT) için kültürden 12 gün sonra glukoz akışının miktarını gösteren histogram.d On bölgesel doku kesit noktasında taze (mavi), 12. gün MC (yeşil) ve 12. gün MT (kırmızı) dokuların gerilme analizi grafikleri (n = 4 dilim/grup, tek yönlü ANOVA testi; gruplar arasında anlamlı bir fark yoktu).e 10-12 gün boyunca statik koşullar (Ctrl) veya MT koşulları (MT) altında kültürlenen kalp bölümlerine kıyasla taze kalp bölümlerinde (D0) diferansiyel olarak eksprese edilen genleri gösteren volkan grafiği.f Her kültür koşulu altında kültürlenen kalp bölümleri için sarkomer genlerinin ısı haritası.Hata çubukları, ortalama ± standart sapmayı temsil eder.
Yağ asidi oksidasyonundan glikolize geçişe metabolik bağımlılık, kardiyomiyosit farklılaşmasının ayırt edici özelliğidir.Olgunlaşmamış kardiyomiyositler, öncelikle ATP üretimi için glikoz kullanır ve az sayıda crista5,32 ile hipoplastik mitokondriye sahiptir.Glikoz kullanım analizleri, MC ve MT koşulları altında glikoz kullanımının 0. gün dokularındakine benzer olduğunu göstermiştir (Şekil 4c).Bununla birlikte, Ctrl numuneleri, taze dokuya kıyasla glikoz kullanımında önemli bir artış gösterdi.Bu, CTCM ve T3/Dex kombinasyonunun doku canlılığını arttırdığını ve 12 günlük kültürlenmiş kalp bölümlerinin metabolik fenotipini koruduğunu gösterir.Ek olarak, gerilme analizi, gerilme seviyelerinin MT ve MS koşulları altında 12 gün boyunca taze kalp dokusundaki ile aynı kaldığını göstermiştir (Şekil 4d).
CTCM ve T3/Dex'in kardiyak dilim dokusunun global transkripsiyonel manzarası üzerindeki genel etkisini analiz etmek için, dört farklı kültür koşulunun hepsinden kardiyak dilimler üzerinde RNAseq gerçekleştirdik (Ek Veri 1).İlginç bir şekilde, MT bölümleri, 13.642 genden yalnızca 16'sı farklı şekilde ifade edilerek, taze kalp dokusuna yüksek transkripsiyonel benzerlik gösterdi.Bununla birlikte, daha önce gösterdiğimiz gibi, Ctrl dilimleri, kültürde 10-12 gün sonra 1229 farklı şekilde eksprese edilmiş gen sergiledi (Şekil 4e).Bu veriler, kalp ve fibroblast genlerinin qRT-PCR'si ile doğrulandı (Ek Şekil 7a-c).İlginç bir şekilde, Ctrl bölümleri kardiyak ve hücre döngüsü genlerinin aşağı regülasyonunu ve enflamatuar gen programlarının aktivasyonunu gösterdi.Bu veriler, normalde uzun süreli kültürlemeden sonra meydana gelen farklılaşmanın MT koşulları altında tamamen zayıflatıldığını göstermektedir (Ek Şekil 8a,b).Sarkomer genlerinin dikkatli bir şekilde incelenmesi, yalnızca MT koşulları altında sarkomeri (Şekil 4f) ve iyon kanalını (Ek Şekil 9) kodlayan genlerin korunduğunu ve onları Ctrl, TD ve MC koşulları altında baskılanmaya karşı koruduğunu gösterdi.Bu veriler, mekanik ve hümoral stimülasyonun (T3/Dex) bir kombinasyonu ile kalp dilimi transkriptomunun kültürde 12 gün sonra taze kalp dilimlerine benzer kalabileceğini göstermektedir.
Bu transkripsiyonel bulgular, bozulmamış ve lokalize connexin 43 ile gösterildiği gibi, kalp kesitlerindeki kardiyomiyositlerin yapısal bütünlüğünün MT koşulları altında 12 gün boyunca en iyi şekilde korunduğu gerçeğiyle desteklenir (Şekil 5a).Ek olarak, MT koşulları altında kalp kesitlerindeki fibroz, Ctrl'ye kıyasla ve taze kalp kesitlerine benzer şekilde önemli ölçüde azaldı (Şekil 5b).Bu veriler, mekanik stimülasyon ve T3/Dex tedavisi kombinasyonunun, kültürdeki kalp kesitlerinde kardiyak yapıyı etkili bir şekilde koruduğunu göstermektedir.
a Taze izole kalp bölümlerinde (D0) troponin-T (yeşil), connexin 43 (kırmızı) ve DAPI'nin (mavi) temsili immünofloresan görüntüleri veya dört kalp bölümü kültür koşulunun hepsinde 12 gün boyunca kültürlendi (ölçek çubuğu = 100 µm).). Kalp dokusunun yapısal bütünlüğünün yapay zeka niceliği (n = 7 (D0 ve D12 Ctrl), farklı domuzlardan 5 (D12 TD, D12 MC ve D12 MT) dilim/grup, tek yönlü ANOVA testi yapılır; D0'a kıyasla ####p < 0.0001 ve *p < 0.05 veya ****p < 0.0001, D12 Ctrl'ye kıyasla). Kalp dokusunun yapısal bütünlüğünün yapay zeka niceliği (n = 7 (D0 ve D12 Ctrl), farklı domuzlardan 5 (D12 TD, D12 MC ve D12 MT) dilim/grup, tek yönlü ANOVA testi yapılır; D0'a kıyasla #### p < 0,0001 ve *p < 0,05 veya ****p < 0,0001, D12 Ctrl'ye kıyasla). Şu anda en çok kullanılan ekran kartlarının sayısı (n = 7 (D0 ve D12 Ctrl), 5 (D1) 2 TD, D12 MC ve D12 MT) срезов/группу от разных свиней, проведен однофакторный тест ANOVA; #### p < 0,0001 по сравнению с D0 и *p < 0,05 veya ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). Yapay zeka kullanılarak kalp dokusunun yapısal bütünlüğünün ölçülmesi (n = 7 (D0 ve D12 Ctrl), farklı domuzlardan 5 (D12 TD, D12 MC ve D12 MT) kesit/grup, yapılan tek yönlü ANOVA testi; D0'a kıyasla #### p < 0,0001 ve D12 Ctrl'ye kıyasla *p < 0,05 veya ****p < 0,0001).Ana Sayfa ANOVA 测试；#### p < 0.0001 与D0 和*p < 0.05 相比，或****p < 0.0001 与D12 Ctrl 相比）。智######### p < 0.0001 与D0 和*p < 0.05 相比，或****p < 0.0001 与D12 Ctrl 縸比)Tek yönlü ANOVA testi ile farklı domuzlarda (n = 7 (D0 ve D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC ve D12 MT) bölüm/grup) yapay zeka kullanılarak kalp dokusunun yapısal bütünlüğünün ölçülmesi;#### p < 0,0001 по сравнению с D0 и *p < 0,05 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). #### D0'a kıyasla p < 0,0001 ve D12 Ctrl'ye kıyasla *p < 0,05 veya ****p < 0,0001). b Masson'un trikrom boyası (Ölçek çubuğu = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD ve D12 MC), 9 (D12 MT) dilim/grup) ile boyanmış kalp dilimleri için temsili görüntüler ve niceleme, tek yönlü ANOVA testi yapılır; D0'a kıyasla ####p < 0,0001 ve ***p < 0,001 veya ****p < 0,0001, D12 Ctrl ile karşılaştırıldığında). b Masson'un trikrom boyası (Ölçek çubuğu = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD ve D12 MC), 9 (D12 MT) dilim/grup) ile boyanmış kalp dilimleri için temsili görüntüler ve niceleme, tek yönlü ANOVA testi yapılır; D0'a kıyasla ####p < 0,0001 ve ***p < 0,001 veya ****p < 0,0001, D12 Ctrl ile karşılaştırıldığında). b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромным красителем Массона (масштабная line = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD ve D12 MC), 9 (D12 MT) срезов/группу от разных свиней, выполняется одностор ANOVA'da; ####p < 0,0001, D0'da ve ***p < 0,001'de veya ****p < 0,0001, D12 Ctrl'de). b Masson'un trikrom boyası (ölçek çubuğu = 500 µm) ile boyanmış kalp bölümlerinin temsili görüntüleri ve niceliği (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD ve D12 MC), 9 (D12 MT) farklı domuzlardan kesit/grup, tek yönlü ANOVA uygulandı; ####p < 0,0001'e karşı D0 ve ***p < 0,001 veya ****p < 0,0001'e karşı .D12 Ctrl). b 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像和量化（比例尺= 500 µm）（n = 10（D0、D12 Ctrl、D12 TD 和D12 MC），来自不同猪的9 个（D12 MT）切片/组，进行单因素方差分析；####p < 0.0001 与D0 相比，***p < 0.001 ，或****p < 0.0001 与D12 Ctrl 相比）。 b 用 mason 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 和 量化 （比例 尺 尺 尺 = 500 µm） （n = 10 （d0 、 d12 ctrl 、 d12 td 和 d12 mc） 来自 不同 的 9 个 d12 mt 切片 切photos片 切 Photos 001，或****p < 0.0001 与D12 Ctrl 相比）。 b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромом Массона (масштабна я линейка = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD ve D12 MC), 9 (D12 MT) срезов от разных свиней / группы, один- способ ANOVA; ####p < 0,0001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 veya ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). b Masson trikromu (ölçek çubuğu = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD ve D12 MC), farklı domuzlardan/gruptan 9 (D12 MT) kesitleri, bir ANOVA yöntemi ile boyanmış kalp bölümlerinin temsili görüntüleri ve miktarının belirlenmesi; D0'a kıyasla ####p < 0,0001, ***p < 0,001 veya ****p < 0,0001, D1'e kıyasla 2 Ctrl).Hata çubukları, ortalama ± standart sapmayı temsil eder.
Son olarak, CTCM'nin kardiyak hipertrofiyi taklit etme yeteneği, kardiyak doku gerginliğini artırarak değerlendirildi.CTCM'de tepe hava odası basıncı 80 mmHg'den 80 mmHg'ye yükseldi.Sanat.(normal esneme) 140 mmHg'ye kadar Art.(Şekil 6a).Bu, daha önce kalp bölümlerinin hipertrofide görülene benzer bir sarkomer uzunluğu elde etmesi için gereken karşılık gelen gerilme yüzdesi olarak gösterilen gerilmede %32'lik bir artışa karşılık gelir (Şekil 6b).Kasılma ve gevşeme sırasında kalp dokusunun gerilmesi ve hızı altı günlük kültür boyunca sabit kaldı (Şekil 6c).MT koşullarındaki kardiyak doku, altı gün boyunca normal esneme (MT (Normal)) veya aşırı esneme koşullarına (MT (OS)) tabi tutuldu.Kültürde dört günden sonra, hipertrofik biyobelirteç NT-ProBNP, MT (OS) koşulları altında, MT (normal) koşulları ile karşılaştırıldığında ortamda önemli ölçüde yükselmiştir (Şekil 7a).Ek olarak, altı günlük kültürlemeden sonra, MT'deki (OS) hücre boyutu (Şekil 7b), MT kalbinin (normal) bölümlerine kıyasla önemli ölçüde arttı.Ek olarak, aşırı gerilmiş dokularda NFATC4 nükleer translokasyonu önemli ölçüde artmıştır (Şekil 7c).Bu sonuçlar, hiperdistansiyondan sonra patolojik yeniden yapılanmanın ilerleyici gelişimini gösterir ve CTCM cihazının, esneme kaynaklı kardiyak hipertrofi sinyalini incelemek için bir platform olarak kullanılabileceği kavramını destekler.
Hava odası basıncının, sıvı odası basıncının ve doku hareketi ölçümlerinin temsili izleri, oda basıncının sıvı odası basıncını değiştirdiğini ve doku diliminin karşılık gelen hareketine neden olduğunu doğrular.b Normalde gerilmiş (turuncu) ve aşırı gerilmiş (mavi) doku kesitleri için temsili germe yüzdesi ve germe oranı eğrileri.c Döngü süresini (n = grup başına 19 dilim, farklı domuzlardan), kasılma süresini (n = 18-19 dilim, farklı domuzlardan), gevşeme süresini (n = grup başına 19 dilim, farklı domuzlardan) ), doku hareketinin genliğini (n = 14 dilim/grup, farklı domuzlardan), tepe sistolik hızı (n = 14 dilim/grup, farklı domuzlardan) ve tepe gevşeme oranını (n = 14 (D0) gösteren çubuk grafik, 15 (D6) ) kesitler/gruplar), iki kuyruklu Student t-testi herhangi bir parametrede önemli bir fark göstermedi ve bu parametrelerin aşırı voltajlı 6 günlük kültür boyunca sabit kaldığını gösterdi.Hata çubukları, ortalama ± standart sapmayı temsil eder.
a MT normal germe (Norm) veya aşırı germe (OS) koşulları altında kültürlenen kalp dilimlerinden kültür ortamındaki NT-ProBNP konsantrasyonunun Çubuk grafik ölçümü (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm ve D4 MTOS) farklı domuzlardan dilim/grup, İki yönlü ANOVA gerçekleştirilir; **p < 0,01 normal esnemeye kıyasla). MT normal esneme (Norm) veya aşırı esneme (OS) koşulları altında kültürlenen kalp dilimlerinden kültür ortamındaki NT-ProBNP konsantrasyonunun çubuk grafik ölçümü (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm ve D4 MTOS) farklı domuzlardan dilim/grup, İki yönlü ANOVA gerçekleştirilir; **p < 0,01 normal esnemeye kıyasla).Normal MT esneme (norm) veya aşırı esneme (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm ve D4).MTOS) koşulları altında kültürlenen kalp dilimlerinden kültür ortamındaki NT-ProBNP konsantrasyonunun kantitatif histogramı farklı domuzlardan dilimler/grup, iki faktörlü varyans analizi yapılır;**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p < 0,01, normal esnemeye kıyasla). a 在MT 正常拉伸(Norm) 或过度拉伸(OS) 条件下培养的心脏切片培养基中NT-ProBNP 浓度的条形图量化（n = 4 (D2 MTNorm)、3（D2 MTOS、D4 MTNorm 和D4 MTOS）来自不同猪的切片/组，进行双向方差分析；**与正常拉伸相比，p < 0.01 ) a Farklı 猪的切片/组，可以双向方方发发动; **normal ile karşılaştırıldığında germe, p < 0.01).histogram Farklı domuzlardan normal MT esneme (norm) veya aşırı esneme (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm) ve D4 MTOS) dilim/grup koşulları altında kültürlenen kalp dilimlerinde NT-ProBNP konsantrasyonlarının miktarının belirlenmesi, iki yönlü varyans analizi;**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p < 0,01, normal esnemeye kıyasla). b Farklı domuzlardan 10 farklı dilimden troponin-T ve WGA (solda) ve hücre boyutu ölçümü (sağda) ile boyanmış kalp dilimleri için temsili görüntüler (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) hücre/grup, İki kuyruklu Student t-testi yapılır; normal esnemeye kıyasla ****p < 0,0001). b Farklı domuzlardan 10 farklı dilimden troponin-T ve WGA (solda) ve hücre boyutu ölçümü (sağda) ile boyanmış kalp dilimleri için temsili görüntüler (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) hücre/grup, Two-tailed Student t-testi yapılır; normal streç ile karşılaştırıldığında ****p < 0,0001). b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слева) и количественноо определе ния размера клеток (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) клеток/группу из 10 разных срезов от разных свиней, два- проводится х востовой t-критерий Стьюдента; ****p < 0,0001 по сравнению с нормальным растяжением). b Farklı domuzlardan 10 farklı kesitten troponin-T ve AZP (solda) ve hücre boyutu ölçümü (sağda) ile boyanmış kalp bölümlerinin temsili görüntüleri (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) hücre/grup, iki kuyruklu Student t-testi yapıldı; ****p < 0,0001, normal suşa kıyasla). b 用肌钙蛋白-T 和WGA（左）和细胞大小量化（右）染色的心脏切片的代表性图像（n = 330（D6 MTOS） ，来自不同猪的10 个不同切片的369（D6 MTNorm）细胞/组，两进行有尾学生t 检验；与正常拉伸相比，****p < 0.0001）。 b Calcarein-T ve WGA (solda) ve hücre boyutu (sağ) ile boyanmış kalp dilimlerinin temsili görüntüleri (n = 330 (D6 MTOS), 10 farklı dilimden 369 (D6 MTNorm)) Hücreler/normal germe ile karşılaştırıldığında，****p < 0.0001). b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слева) и количественная оценка ра змера клеток (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) veya 10 различных срезов from разных свиней Клетки/группа, двусторонние кит ерий Стьюдента; ****p < 0,0001 по сравнению с нормальным растяжением). b Troponin-T ve AZP ile boyanmış kalp bölümlerinin temsili görüntüleri (solda) ve hücre boyutunun ölçümü (sağda) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) farklı domuzlardan 10 farklı bölümden) Hücre/grup, iki kuyruklu kriter Student t;****p < 0,0001, normal gerilime kıyasla). c Troponin-T ve NFATC4 için immüno-etiketli 0. gün ve 6. gün MTOS kalp dilimleri için temsili görüntüler ve NFATC4'ün CM'lerin çekirdeklerine translokasyonunun nicelleştirilmesi (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) farklı domuzlardan dilim/grup, İki kuyruklu Student t-testi yapılır; *p < 0.05). c Troponin-T ve NFATC4 için immüno-etiketli 0. gün ve 6. gün MTOS kalp dilimleri için temsili görüntüler ve NFATC4'ün CM'lerin çekirdeklerine translokasyonunun miktarının belirlenmesi (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) farklı domuzlardan dilim/grup , İki kuyruklu Student t-testi yapılır; *p < 0.05). c Репрезентативные изображения для срезов сердца 0 и 6 дней MTOS, иммуномеченых для тропонина-Т и NFATC4 ve количеств енная оценка транслокации NFATC4'ü, разных свиней , выполняется'dan (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срезов/группу от разных свиней клеток (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS)) двусторонний t-критерий Стьюдента; *p < 0,05). c Troponin-T ve NFATC4 için immüno-etiketli MTOS'ta 0 ve 6 günlük kalp kesitleri için temsili görüntüler ve kavernöz hücrelerin çekirdeğindeki NFATC4 translokasyonunun ölçümü (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) farklı domuzlardan dilim/grup) iki kuyruklu Student t-testi gerçekleştirdi;*p < 0,05). c 用于肌钙蛋白-T 和NFATC4 免疫标记的第0 天和第6 天MTOS 心脏切片的代表性图像，以及来自不同猪的NFATC4 易位至CM 细胞核的量化（n = 4 (D0)、3 (D6 MTOS) 切片/组, 进行双尾学生t 检验；*p < 0.05)。 c Calcanin-T ve NFATC4 immün etiketleme 第0天和第6天MTOS kalp dilimleri ve NFATC4'ün farklı NFATC4 易位至CM hücre çekirdeğinin niceliği (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) 切礼/组, 时间双尾学生) temsili görüntüleri ve 电影；*p < 0.05). c Репрезентативные изображения срезов сердца MTOS на 0 и 6 для иммуномаркировки тропонином-Т и NFATC4 и количественн ая оценка транслокации NFATC4, CM'de разных свиней (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срез/группа, два- хвостатый t-критерий Стьюдент *p < 0,05). c Farklı domuzlardan (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) dilim/grup, iki kuyruklu t-kriteri Student; *p < 0.05) troponin-T ve NFATC4 immüno-etiketleme ve CM çekirdeğindeki NFATC4 translokasyonunun nicelleştirilmesi için 0. ve 6. günlerde MTOS kalp dilimlerinin temsili görüntüleri.Hata çubukları, ortalama ± standart sapmayı temsil eder.
Translasyonel kardiyovasküler araştırma, kardiyak ortamı doğru bir şekilde yeniden üreten hücresel modeller gerektirir.Bu çalışmada, kalbin ultra ince kesitlerini uyarabilen bir CTCM cihazı geliştirilmiş ve karakterize edilmiştir.CTCM sistemi, fizyolojik olarak senkronize elektromekanik stimülasyon ve T3 ve Dex sıvı zenginleştirme içerir.Domuz kalp kesitleri bu faktörlere maruz bırakıldığında canlılıkları, yapısal bütünlükleri, metabolik aktiviteleri ve transkripsiyonel ifadeleri, 12 günlük kültürden sonra taze kalp dokusundakiyle aynı kaldı.Ek olarak, kalp dokusunun aşırı gerilmesi, hiperekstansiyonun neden olduğu kalbin hipertrofisine neden olabilir.Genel olarak, bu sonuçlar fizyolojik kültür koşullarının normal bir kardiyak fenotipi korumadaki kritik rolünü destekler ve ilaç taraması için bir platform sağlar.
Kardiyomiyositlerin işleyişi ve hayatta kalması için en uygun ortamın yaratılmasına birçok faktör katkıda bulunur.Bu faktörlerin en bariz olanı (1) hücreler arası etkileşimler, (2) elektromekanik stimülasyon, (3) hümoral faktörler ve (4) metabolik substratlar ile ilgilidir.Fizyolojik hücreden hücreye etkileşimler, hücre dışı bir matris tarafından desteklenen çoklu hücre tiplerinden oluşan karmaşık üç boyutlu ağlar gerektirir.Bu tür karmaşık hücresel etkileşimlerin, tek tek hücre tiplerinin ortak kültürü ile in vitro olarak yeniden oluşturulması zordur, ancak kalp bölümlerinin organotipik doğası kullanılarak kolayca elde edilebilir.
Kardiyomiyositlerin mekanik gerilmesi ve elektriksel stimülasyonu, kardiyak fenotip33,34,35korumak için kritik öneme sahiptir.Mekanik stimülasyon, hiPSC-CM koşullandırması ve olgunlaşması için yaygın olarak kullanılırken, yakın zamanda birkaç zarif çalışma, tek eksenli yükleme kullanılarak kültürde kalp dilimlerinin mekanik stimülasyonunu denedi.Bu çalışmalar, kültür sırasında 2 boyutlu tek eksenli mekanik yüklemenin kalp fenotipi üzerinde olumlu bir etkiye sahip olduğunu göstermektedir.Bu çalışmalarda, kalbin bölümleri ya izometrik gerilme kuvvetleri17, lineer okotonik yükleme18 ile yüklendi ya da kuvvet dönüştürücü geri bildirimi ve gerilim tahrikleri kullanılarak kalp döngüsü yeniden yaratıldı.Bununla birlikte, bu yöntemler, çevresel optimizasyon olmadan tek eksenli doku gerilmesini kullanır, bu da birçok kardiyak genin baskılanmasına veya anormal gerilme tepkileriyle ilişkili genlerin aşırı ekspresyonuna neden olur.Burada açıklanan CTCM, döngü süresi ve fizyolojik esneme (%25 esneme, %40 sistol, %60 diyastol ve dakikada 72 atım) açısından doğal kalp döngüsünü taklit eden bir 3B elektromekanik uyarı sağlar.Bu üç boyutlu mekanik stimülasyon tek başına doku bütünlüğünü korumak için yeterli olmasa da, doku canlılığını, işlevini ve bütünlüğünü yeterince korumak için T3/Dex kullanan hümoral ve mekanik stimülasyonun bir kombinasyonu gereklidir.
Hümoral faktörler, yetişkin kalp fenotipinin modüle edilmesinde önemli bir rol oynar.Bu, hücre olgunlaşmasını hızlandırmak için kültür ortamına T3 ve Dex'in eklendiği HiPS-CM çalışmalarında vurgulanmıştır.T3, amino asitlerin, şekerlerin ve kalsiyumun hücre zarlarından taşınmasını etkileyebilir36.Ek olarak, T3, fetal CM'deki yavaş seğiren miyofibrillere kıyasla olgun kardiyomiyositlerde hızlı seğiren miyofibrillerin oluşumunu teşvik ederek MHC-α ekspresyonunu ve MHC-β aşağı regülasyonunu destekler.Hipotiroid hastalarında T3 eksikliği, miyofibriler bantların kaybına ve tonus gelişiminin azalmasına neden olur37.Dex, glukokortikoid reseptörleri üzerinde etki gösterir ve izole perfüze kalplerde miyokardiyal kontraktiliteyi arttırdığı gösterilmiştir;38 bu gelişmenin kalsiyum birikintisine dayalı giriş (SOCE) 39,40 üzerindeki etkisiyle ilişkili olduğu düşünülmektedir.Ek olarak, Dex, reseptörlerine bağlanarak, bağışıklık fonksiyonunu ve iltihaplanmayı baskılayan geniş bir hücre içi tepkiye neden olur30.
Sonuçlarımız, fiziksel mekanik stimülasyonun (MS), Ctrl'ye kıyasla genel kültür performansını iyileştirdiğini, ancak kültürde 12 gün boyunca canlılığı, yapısal bütünlüğü ve kardiyak ifadeyi korumada başarısız olduğunu gösteriyor.Ctrl ile karşılaştırıldığında, CTCM (MT) kültürlerine T3 ve Dex eklenmesi canlılığı iyileştirdi ve 12 gün boyunca taze kalp dokusuyla benzer transkripsiyon profillerini, yapısal bütünlüğü ve metabolik aktiviteyi korudu.Ek olarak, doku gerilme derecesi kontrol edilerek, STCM sisteminin çok yönlülüğünü gösteren, hiperekstansiyon kaynaklı bir kardiyak hipertrofi modeli STCM kullanılarak yaratıldı.Kardiyak yeniden şekillenme ve fibrozun genellikle dolaşımdaki hücreleri fagositoz ve diğer yeniden şekillenme faktörlerinin yanı sıra uygun sitokinleri sağlayabilen bozulmamış organları içermesine rağmen, kalbin bazı bölümleri stres ve travmaya yanıt olarak hala fibrotik süreci taklit edebilir.miyofibroblastlara dönüşür.Bu, daha önce bu kardiyak dilim modelinde değerlendirilmiştir.CTCM parametrelerinin, taşikardi, bradikardi ve mekanik dolaşım desteği (mekanik yüksüz kalp) gibi birçok durumu simüle etmek için basınç/elektrik genliği ve frekansı değiştirilerek modüle edilebileceği unutulmamalıdır.Bu, sistemi uyuşturucu testi için orta düzeyde bir çıktı haline getirir.CTCM'nin aşırı eforun neden olduğu kardiyak hipertrofiyi modelleme yeteneği, bu sistemin kişiselleştirilmiş terapi için test edilmesinin yolunu açar.Sonuç olarak, bu çalışma mekanik germe ve hümoral stimülasyonun kardiyak doku kesitlerinin kültürünü korumak için kritik olduğunu göstermektedir.
Burada sunulan veriler, CTCM'nin bozulmamış miyokardı modellemek için çok umut verici bir platform olduğunu öne sürse de, bu kültür yönteminin bazı sınırlamaları vardır.CTCM kültürünün ana sınırlaması, her döngü sırasında kardiyak dilim kasılmalarını aktif olarak izleme yeteneğini engelleyen dilimler üzerinde sürekli dinamik mekanik baskılar uygulamasıdır.Ek olarak, kardiyak bölümlerin küçük boyutu (7 mm) nedeniyle, geleneksel kuvvet sensörleri kullanılarak kültür sistemlerinin dışında sistolik işlevi değerlendirme yeteneği sınırlıdır.Mevcut el yazmasında, optik voltajı kasılma fonksiyonunun bir göstergesi olarak değerlendirerek bu sınırlamanın kısmen üstesinden geldik.Bununla birlikte, bu sınırlama daha fazla çalışma gerektirecektir ve gelecekte kalsiyum ve voltaja duyarlı boyalar kullanılarak optik haritalama gibi kültürde kalp dilimlerinin işlevinin optik olarak izlenmesi için yöntemler tanıtılarak ele alınabilir.CTCM'nin bir başka sınırlaması, çalışma modelinin fizyolojik stresi (ön yük ve son yük) manipüle etmemesidir.CTCM'de, çok büyük dokularda diyastolde (tam esneme) ve sistolde (elektriksel stimülasyon sırasındaki kasılma uzunluğu) %25 fizyolojik esnemeyi yeniden oluşturmak için zıt yönlerde basınç indüklendi.Bu sınırlama, gelecekteki CTCM tasarımlarında kalp dokusuna her iki taraftan yeterli basınç uygulanarak ve kalp odalarında meydana gelen tam basınç-hacim ilişkileri uygulanarak kaldırılmalıdır.
Bu el yazmasında bildirilen aşırı gerilme kaynaklı yeniden modelleme, hipertrofik hiper gerilme sinyallerini taklit etmekle sınırlıdır.Bu nedenle, bu model, hümoral veya nöral faktörlere (bu sistemde bulunmayan) ihtiyaç duymadan, esneme kaynaklı hipertrofik sinyal çalışmasında yardımcı olabilir.CTCM'nin çokluğunu artırmak için daha ileri çalışmalara ihtiyaç vardır, örneğin, bağışıklık hücreleriyle birlikte kültürleme, dolaşımdaki plazma hümoral faktörleri ve nöronal hücrelerle birlikte kültürleme CTCM ile hastalık modelleme olasılıklarını artıracağında innervasyon.
Bu çalışmada on üç domuz kullanıldı.Tüm hayvan prosedürleri, kurumsal yönergelere uygun olarak gerçekleştirildi ve Louisville Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylandı.Aortik ark klemplendi ve kalbe 1 L steril kardiyopleji (110 mM NaCl, 1.2 mM CaCl2, 16 mM KCI, 16 mM MgCl2, 10 mM NaHC03, 5 U/mL heparin, pH 7.4'e kadar) ile perfüze edildi; kalpler, genellikle <10 dakika olan buz üzerinde laboratuvara taşınana kadar buz gibi kardiyoplejik solüsyonda muhafaza edildi. kalpler, genellikle <10 dakika olan buz üzerinde laboratuvara taşınana kadar buz gibi kardiyoplejik solüsyonda muhafaza edildi. сердца хранили в ледяном кардиоплегическом растворе до транспортировки в лабораторию на льду, что обычно занимает <10 min. kalpler, genellikle <10 dakika süren buz üzerinde laboratuvara taşınana kadar buz gibi kardiyoplejik solüsyonda saklandı.将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钟。将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钟。 10 dakikadan kısa bir süre içinde, doğum günü kartına binen kredi kartlarını kullanın. Kardiyopleji kalpleri buz üzerinde laboratuvara taşınana kadar, genellikle <10 dakika buz üzerinde tutun.
CTCM cihazı, SolidWorks bilgisayar destekli tasarım (CAD) yazılımında geliştirilmiştir.Kültür odaları, bölücüler ve hava odaları CNC şeffaf akrilik plastikten yapılmıştır.7 mm çapındaki destek halkası, merkezde yüksek yoğunluklu polietilenden (HDPE) yapılmıştır ve altındaki medyayı kapatmak için kullanılan silikon o-ringi yerleştirmek için bir o-ring yivine sahiptir.İnce bir silika membran, kültür odasını ayırma plakasından ayırır.Silikon membran, 0.02" kalınlığındaki silikon levhadan lazerle kesilmiştir ve 35A sertliğe sahiptir.Alt ve üst silikon contalar 1/16" kalınlığında silikon levhadan lazer kesim ile 50A sertliğe sahiptir.Bloğu sabitlemek ve hava geçirmez bir conta oluşturmak için 316L paslanmaz çelik vidalar ve kelebek somunlar kullanılır.
Özel bir baskılı devre kartı (PCB), C-PACE-EM sistemiyle entegre olacak şekilde tasarlanmıştır.PCB üzerindeki swiss makine konektör soketleri, elektrotlara vidalanan gümüş kaplı bakır teller ve bronz 0-60 vidalarla grafit elektrotlara bağlanır.Baskılı devre kartı, 3D yazıcının kapağına yerleştirilir.
CTCM cihazı, kalp döngüsüne benzer kontrollü bir dolaşım basıncı oluşturan programlanabilir bir pnömatik aktüatör (PPD) tarafından kontrol edilir.Hava odasının içindeki basınç arttıkça, esnek silikon membran yukarı doğru genişleyerek ortamı doku bölgesinin altına zorlar.Doku alanı daha sonra diyastol sırasında kalbin fizyolojik genişlemesini taklit ederek bu sıvının dışarı atılmasıyla gerilir.Gevşemenin zirvesinde, hava odasındaki basıncı azaltan ve doku kesitlerinin kasılmasına neden olan grafit elektrotlar aracılığıyla elektrik stimülasyonu uygulandı.Borunun içinde, hava sistemindeki basıncı tespit etmek için basınç sensörlü bir hemostatik valf bulunur.Basınç sensörü tarafından algılanan basınç, dizüstü bilgisayara bağlı bir veri toplayıcıya uygulanır.Bu, gaz odası içindeki basıncın sürekli olarak izlenmesini sağlar.Maksimum hazne basıncına ulaşıldığında (standart 80 mmHg, 140 mmHg OS), veri toplama cihazına, 2 ms için 4 V'a ayarlanmış iki fazlı bir voltaj sinyali üretmek üzere C-PACE-EM sistemine bir sinyal göndermesi emredildi.
Kalp kesitleri alındı ​​ve 6 oyuktaki kültür koşulları şu şekilde yapıldı: Toplanan kalpleri transfer kabından soğuk (4°C) kardiyopleji içeren bir tepsiye aktarın.Sol ventrikül steril bir bıçakla izole edildi ve 1-2 cm3'lük parçalar halinde kesildi.Bu doku blokları, doku yapıştırıcısı ile doku desteklerine tutturulmuş ve içinde Tyrode solüsyonu bulunan ve sürekli oksijenlenmiş (3 g/L 2,3-bütanedion monooksim (BDM), 140 mM NaCl (8,18 g) . ), 6 mM KCl (0,447 g), 10 mM D-glikoz (1,86 g), 10 mM HEPES (2,38 g), titreşimli mikrotom doku banyosuna yerleştirilmiştir. 1 mM MgCl2 (1 ml 1 M solüsyon), 1,8 mM CaCl2 (1,8 ml 1 M solüsyon), 1 L'ye kadar ddH2O).Titreşimli mikrotom, 80 Hz frekansta, 2 mm yatay titreşim genliğinde ve 0.03 mm/s ilerleme hızında 300 um kalınlığında dilimler kesecek şekilde ayarlandı.Çözeltiyi soğuk tutmak için doku banyosu buzla çevrelendi ve sıcaklık 4°C'de tutuldu.Doku kesitlerini mikrotom banyosundan, bir kültür plakası için yeterli kesit elde edilene kadar buz üzerinde sürekli oksijenli Tyrode solüsyonu içeren bir inkübasyon banyosuna aktarın.Transwell kültürleri için doku kesitleri, steril 6 mm genişliğinde poliüretan desteklere tutturuldu ve 6 ml optimize edilmiş ortama (199 ortam, 1x ITS takviyesi, %10 FBS, 5 ng/ml VEGF, 10 ng/ml FGF-alkalin ve 2X antibiyotik-antifungal) yerleştirildi.Doku kesitlerine C-Pace aracılığıyla elektrik stimülasyonu (10 V, frekans 1,2 Hz) uygulandı.TD koşulları için, her ortam değişikliğinde 100 nM ve 1 uM'de taze T3 ve Dex eklendi.Ortam, günde 3 kez değiştirilmeden önce oksijen ile doyurulur.Doku kesitleri, bir inkübatörde 37°C'de ve %5 C02'de kültürlendi.
CTCM kültürleri için doku kesitleri, modifiye edilmiş Tyrode solüsyonu içeren bir Petri kabındaki özel yapım bir 3D yazıcıya yerleştirildi.Cihaz, kalp diliminin boyutunu destek halkasının alanının %25'i kadar büyütmek için tasarlanmıştır.Bu, kalbin bölümlerinin Tyrode solüsyonundan ortama aktarıldıktan sonra ve diyastol sırasında gerilmemesi için yapılır.Histoakrilik yapıştırıcı kullanılarak, 300 um kalınlığındaki kesitler, 7 mm çapındaki bir destek halkasına sabitlendi.Doku kesitlerini destek halkasına taktıktan sonra, fazla doku kesitlerini kesin ve bir cihaz için yeterli kesit hazırlanana kadar, bağlı doku kesitlerini tekrar buz üzerinde (4°C) Tyrode solüsyonu banyosuna yerleştirin.Tüm cihazlar için toplam işlem süresi 2 saati geçmemelidir.6 adet doku kesiti destek halkalarına takıldıktan sonra CTCM cihazı monte edildi.CTCM kültür odası, 21 ml önceden oksijenlenmiş ortam ile önceden doldurulmuştur.Doku kesitlerini kültür odasına aktarın ve hava kabarcıklarını bir pipetle dikkatlice çıkarın.Doku bölümü daha sonra deliğe yönlendirilir ve yavaşça yerine bastırılır.Son olarak elektrot kapağını cihaza yerleştirin ve cihazı kuvöze aktarın.Ardından CTCM'yi hava tüpüne ve C-PACE-EM sistemine bağlayın.Pnömatik aktüatör açılır ve hava valfi CTCM'yi açar.C-PACE-EM sistemi, 2 ms boyunca iki fazlı pacing sırasında 1,2 Hz'de 4 V iletmek üzere yapılandırıldı.Ortam günde iki kez değiştirildi ve elektrotlar üzerinde grafit birikmesini önlemek için elektrotlar günde bir kez değiştirildi.Gerekirse, altlarına düşmüş olabilecek hava kabarcıklarını atmak için kültür kuyularından doku kesitleri çıkarılabilir.MT tedavi koşulları için, 100 nM T3 ve 1 uM Dex ile her ortam değişikliğinde taze T3/Dex eklenmiştir.CTCM cihazları, bir inkübatörde 37°C'de ve %5 CO2'de kültürlendi.
Kalp dilimlerinin uzatılmış yörüngelerini elde etmek için özel bir kamera sistemi geliştirildi.Navitar Zoom 7000 18-108 mm makro lens (Navitar, San Francisco, CA) ile bir SLR kamera (Canon Rebel T7i, Canon, Tokyo, Japonya) kullanıldı.Görselleştirme, ortamın taze ortamla değiştirilmesinden sonra oda sıcaklığında gerçekleştirildi.Kamera 51° açıyla konumlandırılmıştır ve video saniyede 30 kare hızında kaydedilir.İlk olarak, kalp dilimlerinin hareketini ölçmek için Image-J ile birlikte açık kaynak yazılım (MUSCLEMOTION43) kullanıldı.Maske, gürültüyü önlemek için atan kalp dilimleri için ilgi alanlarını tanımlamak üzere MATLAB (MathWorks, Natick, MA, ABD) kullanılarak oluşturuldu.Manuel olarak bölümlere ayrılmış maskeler, bir çerçeve dizisindeki tüm görüntülere uygulanır ve ardından MUSCLEMOTION eklentisine iletilir.Muscle Motion, referans kareye göre hareketini ölçmek için her karedeki piksellerin ortalama yoğunluğunu kullanır.Veriler kaydedildi, filtrelendi ve döngü süresini ölçmek ve kalp döngüsü sırasında doku gerilmesini değerlendirmek için kullanıldı.Kaydedilen video, birinci dereceden bir sıfır fazlı dijital filtre kullanılarak sonradan işlendi.Doku gerginliğini ölçmek için (tepeden tepeye), kaydedilen sinyaldeki tepe noktaları ve çukurları ayırt etmek için tepeden tepeye analiz yapıldı.Ek olarak, sinyal kaymasını ortadan kaldırmak için 6. dereceden bir polinom kullanılarak eğilim azaltma gerçekleştirilir.MATLAB'de genel doku hareketini, döngü süresini, gevşeme süresini ve kasılma süresini belirlemek için program kodu geliştirilmiştir (Ek Program Kodu 44).
Gerinim analizi için, mekanik esneme değerlendirmesi için oluşturulan aynı videoları kullanarak, önce MUSCLEMOTION yazılımına göre hareket tepe noktalarını (hareketin en yüksek (üst) ve en alçak (alt) noktalarını) temsil eden iki görüntüyü izledik.Daha sonra doku bölgelerini bölümlere ayırdık ve bölümlenmiş dokuya bir tür gölgeleme algoritması uyguladık (Ek Şekil 2a).Parçalara ayrılan doku daha sonra on alt yüzeye bölündü ve her bir yüzeydeki stres aşağıdaki denklem kullanılarak hesaplandı: Gerinim = (Sup-Sdown)/Sdown, burada Sup ve Sdown, sırasıyla kumaşın üst ve alt gölgelerinden şeklin mesafeleridir (Ek Şekil .2b).
Kalp kesitleri 48 saat %4 paraformaldehit içinde sabitlendi.Sabit dokular %10 ve %20 sükrozda 1 saat süreyle, ardından gece boyunca %30 sükrozda dehidre edildi.Kesitler daha sonra optimum kesme sıcaklığı bileşiğine (OCT bileşiği) gömüldü ve kademeli olarak bir izopentan/kuru buz banyosunda donduruldu.Ayrılana kadar -80 °C'de OCT gömme bloklarını saklayın.Slaytlar 8 μm kalınlığında kesitler halinde hazırlandı.
OCT'yi kalp bölümlerinden çıkarmak için, 95 °C'de 5 dakika boyunca bir ısıtma bloğundaki slaytları ısıtın.Her slayta 1 ml PBS ekleyin ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin, ardından oda sıcaklığında 15 dakika PBS içinde %0,1 Triton-X ayarlayarak bölümlere nüfuz edin.Spesifik olmayan antikorların numuneye bağlanmasını önlemek için slaytlara 1 ml %3 BSA solüsyonu ekleyin ve oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin.BSA daha sonra çıkarıldı ve slaytlar, PBS ile yıkandı.Her numuneyi bir kalemle işaretleyin.Primer antikorlar (%1 BSA'da 1:200 oranında seyreltilmiş) (connexin 43 (Abcam; #AB11370), NFATC4 (Abcam; #AB99431) ve troponin-T (Thermo Scientific; #MA5-12960) 90 dakikada eklendi, ardından fare Alexa Fluor 488'e (Thermo Scientific; # A16079), tavşan Alexa Fluor 594'e (Thermo Scientific; #T6391) karşı 90 dakika daha 90 dakika PBS ile 3 kez yıkandı Hedef boyamayı arka plandan ayırt etmek için sadece ikincil antikoru kontrol olarak kullandık. Son olarak, DAPI nükleer boyası eklendi ve slaytlar bir vectashield (Vector Laboratories) içine yerleştirildi ve oje. -x büyütme) ve 40x büyütmeli Keyence mikroskobu ile kapatıldı.
WGA boyaması için PBS içinde 5 μg/ml'de WGA-Alexa Fluor 555 (Thermo Scientific; #W32464) kullanıldı ve sabit bölümlere oda sıcaklığında 30 dakika uygulandı.Slaytlar daha sonra PBS ile yıkandı ve her slayda Sudan siyahı ilave edildi ve 30 dakika inkübe edildi.Slaytlar daha sonra PBS ile yıkandı ve vectashield gömme ortamı eklendi.Slaytlar, 40x büyütmede bir Keyence mikroskobu üzerinde görselleştirildi.
OCT, yukarıda tarif edildiği gibi numunelerden çıkarıldı.OCT'yi çıkardıktan sonra, slaytları gece boyunca Bouin'in solüsyonuna daldırın.Slaytlar daha sonra 1 saat boyunca damıtılmış suyla durulandı ve ardından 10 dakika boyunca bir Bibrich aloe asit fuksin solüsyonuna yerleştirildi.Daha sonra lamlar, distile su ile yıkandı ve 10 dakika boyunca %5 fosfomolibden/%5 fosfotungstik asit çözeltisine yerleştirildi.Durulama yapmadan, slaytları 15 dakika boyunca doğrudan anilin mavisi solüsyonuna aktarın.Daha sonra lamlar distile su ile yıkandı ve %1'lik asetik asit solüsyonunda 2 dakika bekletildi.Slaytlar, 200 N etanol içinde kurutuldu ve ksilene aktarıldı.Lekeli slaytlar, 10x objektifli bir Keyence mikroskobu kullanılarak görselleştirildi.Fibroz alan yüzdesi, Keyence Analyzer yazılımı kullanılarak ölçüldü.
CyQUANT™ MTT Hücre Canlılığı Testi (Invitrogen, Carlsbad, CA), katalog numarası V13154, bazı modifikasyonlarla üreticinin protokolüne göre.Özellikle, MTT analizi sırasında tek tip doku boyutunu sağlamak için 6 mm çapında bir cerrahi zımba kullanıldı.Dokular, üreticinin protokolüne göre MTT substratı içeren 12 oyuklu bir plakanın oyuklarına ayrı ayrı kaplandı.Kesitler, 37°C'de 3 saat süreyle inkübe edilir ve canlı doku, mor bir formazan bileşiği oluşturmak üzere MTT substratını metabolize eder.MTT çözeltisini 1 ml DMSO ile değiştirin ve kalp bölümlerinden mor formazanı çıkarmak için 37 °C'de 15 dakika inkübe edin.Numuneler, 96 oyuklu şeffaf tabanlı plakalarda DMSO içinde 1:10 oranında seyreltildi ve mor renk yoğunluğu, bir Cytation plaka okuyucusu (BioTek) kullanılarak 570 nm'de ölçüldü.Okumalar, kalbin her diliminin ağırlığına göre normalleştirildi.
Kalp dilimi ortamı, daha önce tarif edildiği gibi glikoz kullanım tahlili için 1 uCi/ml [5-3H]-glikoz (Moravek Biochemicals, Brea, CA, ABD) içeren ortamla değiştirildi.4 saatlik inkübasyondan sonra, 100 µl 0,2 N HCI içeren açık bir mikrosantrifüj tüpüne 100 µl ortam ekleyin.Daha sonra tüp, 37°C'de 72 saat [3H]20 buharlaştırmak için 500 ul dH20 içeren bir sintilasyon tüpüne yerleştirildi.Daha sonra mikrosantrifüj tüpünü sintilasyon tüpünden çıkarın ve 10 ml sintilasyon sıvısı ekleyin.Sintilasyon sayımları, bir Tri-Carb 2900TR sıvı sintilasyon analiz cihazı (Packard Bioscience Company, Meriden, CT, ABD) kullanılarak yapıldı.Glikoz kullanımı daha sonra [5-3H]-glikoza özgü aktivite, eksik denge ve arka plan, [5-3H]-işaretlenmemiş glikoza seyreltme ve sintilasyon karşı etkinliği dikkate alınarak hesaplandı.Veriler, kalbin bölümlerinin kütlesine normalize edilir.
Trizol içinde doku homojenizasyonundan sonra, üreticinin protokolüne göre Qiagen miRNeasy Micro Kit #210874 kullanılarak kalp kesitlerinden RNA izole edildi.RNAsec kitaplığı hazırlama, sıralama ve veri analizi aşağıdaki gibi gerçekleştirildi:
RNA kütüphanesinin hazırlanması için başlangıç ​​materyali olarak numune başına 1 μg RNA kullanıldı.Dizileme kitaplıkları, üreticinin önerileri izlenerek NEBNext UltraTM RNA Kitaplığı Hazırlama Kiti for Illumina (NEB, ABD) kullanılarak oluşturuldu ve her numune için öznitelik dizilerine indeks kodları eklendi.Kısaca mRNA, poli-T oligonükleotitleri ile bağlanmış manyetik boncuklar kullanılarak toplam RNA'dan saflaştırıldı.Fragmentasyon, NEBNext First Strand Synthesis Reaction Buffer (5X) içinde yüksek sıcaklıkta iki değerlikli katyonlar kullanılarak gerçekleştirilir.Birinci sarmal cDNA, rastgele hekzamer primerler ve M-MuLV ters transkriptaz (RNaz H-) kullanılarak sentezlendi.İkinci sarmal cDNA daha sonra DNA polimeraz I ve RNaz H kullanılarak sentezlenir. Geriye kalan çıkıntılar, ekzonükleaz/polimeraz aktivitesi ile kör uçlara dönüştürülür.DNA fragmanının 3' ucunun adenilasyonundan sonra, onu hibridizasyona hazırlamak için ona saç tokası ilmek yapısına sahip bir NEBNext Adaptörü takılır.Tercih edilen uzunluk 150-200 bp olan cDNA fragmanlarının seçimi için.kütüphane fragmanları, AMPure XP sistemi (Beckman Coulter, Beverly, ABD) kullanılarak saflaştırıldı.Daha sonra, PCR'den önce 37°C'de 15 dakika ve ardından 95°C'de 5 dakika boyunca bir adaptörle lige edilmiş boyutu seçilmiş cDNA'ya sahip 3 µl USER Enzyme (NEB, ABD) kullanıldı.PCR daha sonra Phusion High-Fidelity DNA polimeraz, evrensel PCR primerleri ve İndeks (X) primerleri kullanılarak gerçekleştirildi.Son olarak PCR ürünleri saflaştırıldı (AMPure XP sistemi) ve kütüphane kalitesi bir Agilent Bioanalyzer 2100 sistemi üzerinde değerlendirildi.Daha sonra cDNA kitaplığı, bir Novaseq dizileyici kullanılarak dizilendi.Illumina'dan alınan ham görüntü dosyaları, CASAVA Base Calling kullanılarak ham okumalara dönüştürüldü.Ham veriler, okuma sıralarını ve karşılık gelen temel nitelikleri içeren FASTQ(fq) biçim dosyalarında depolanır.Filtrelenmiş sıralama okumalarını Sscrofa11.1 referans genomuyla eşleştirmek için HISAT2'yi seçin.Genel olarak HISAT2, 4 milyar bazdan büyük genomlar dahil her boyuttaki genomu destekler ve çoğu parametre için varsayılan değerler ayarlanmıştır.RNA Seq verilerinden yapılan ekleme okumaları, şu anda mevcut olan en hızlı sistem olan HISAT2 kullanılarak diğer tüm yöntemlerle aynı veya daha iyi doğrulukla verimli bir şekilde hizalanabilir.
Transkriptlerin bolluğu doğrudan gen ekspresyonunun seviyesini yansıtır.Gen ekspresyon seviyeleri, genom veya ekzonlarla ilişkili transkriptlerin bolluğu (dizileme sayısı) ile değerlendirilir.Okuma sayısı, gen ifade seviyeleri, gen uzunluğu ve sıralama derinliği ile orantılıdır.FPKM (milyon baz çifti başına dizilenen transkript bin baz çifti başına fragman) hesaplandı ve DESeq2 paketi kullanılarak diferansiyel ekspresyonun P değerleri belirlendi.Daha sonra yerleşik R-fonksiyonu "p.adjust"a dayalı Benjamini-Hochberg yöntemini9 kullanarak her bir P değeri için yanlış keşif oranını (FDR) hesapladık.
Kalp kesitlerinden izole edilen RNA, Thermo'dan SuperScript IV Vilo Master karışımı (Thermo, kat. no. 11756050) kullanılarak 200 ng/μl konsantrasyonda cDNA'ya dönüştürüldü.Kantitatif RT-PCR, bir Applied Biosystems Endura Plate Microamp 384 oyuklu şeffaf reaksiyon plakası (Thermo, kat. no. 4483319) ve mikroamp optik yapıştırıcı (Thermo, kat. no. 4311971) kullanılarak yapıldı.Reaksiyon karışımı, oyuk başına karıştırılan 5 ul Taqman Fast Advanced Master mix (Thermo, kat # 4444557), 0.5 ul Taqman Primer ve 3.5 ul H20'dan oluşuyordu.Standart qPCR döngüleri çalıştırıldı ve CT değerleri, bir Applied Biosystems Quantstudio 5 gerçek zamanlı PCR cihazı (384 kuyulu modül; ürün # A28135) kullanılarak ölçüldü.Taqman primerleri Thermo (GAPDH (Ss03375629_u1), PARP12 (Ss06908795_m1), PKDCC (Ss06903874_m1), CYGB (Ss06900188_m1), RGL1 (Ss06868890_m1), ACTN1 (Ss01009508_mH), GATA'dan satın alınmıştır) 4 (Ss03383805_u1), GJA1 (Ss03374839_u1), COL1A2 (Ss03375009_u1), COL3A1 (Ss04323794_m1), ACTA2 (Ss04245588_m1) Tüm numunelerin CT değerleri temizlik geni GAPDH'ye normalleştirildi.
NT-ProBNP'nin ortam salımı, üreticinin protokolüne göre NT-ProBNP kiti (domuz) (Kat. No. MBS2086979, MyBioSource) kullanılarak değerlendirildi.Kısaca, her numune ve standarttan 250 ul her kuyucuğa iki kopya halinde ilave edildi.Örneği ekledikten hemen sonra, her kuyucuğa 50 µl Tahlil Reaktifi A ekleyin.Plakayı hafifçe sallayın ve sızdırmazlık maddesi ile kapatın.Daha sonra tabletler 37°C'de 1 saat inkübe edildi.Daha sonra solüsyonu aspire edin ve her seferinde 1-2 dakika yıkama solüsyonunu inkübe ederek kuyucukları 350 µl 1X yıkama solüsyonu ile 4 kez yıkayın.Daha sonra kuyu başına 100 µl Tahlil Reaktifi B ekleyin ve plaka sızdırmazlık maddesi ile kapatın.Tablet hafifçe çalkalandı ve 37°C'de 30 dakika inkübe edildi.Solüsyonu aspire edin ve kuyucukları 5 kez 350 µl 1X yıkama solüsyonu ile yıkayın.Her kuyucuğa 90 µl substrat solüsyonu ekleyin ve plakayı kapatın.Plakayı 37°C'de 10-20 dakika inkübe edin.Her kuyucuğa 50 µl Stop Solution ekleyin.Plaka, 450 nm'ye ayarlanmış bir Cytation (BioTek) plaka okuyucu kullanılarak hemen ölçüldü.
%5 Tip I hata oranı ile parametredeki %10'luk mutlak değişimi tespit etmek için >%80 güç sağlayacak grup büyüklüklerini seçmek için güç analizleri yapıldı. %5 Tip I hata oranı ile parametredeki %10'luk mutlak değişimi tespit etmek için >%80 güç sağlayacak grup büyüklüklerini seçmek için güç analizleri yapıldı. Анализ мощности был выполнен для выбора размеров, которые обеспечат >80% мощности для обнаружения 10% а % 5'lik bir güvenlik önlemi oranı I. %5 Tip I hata oranıyla %10 mutlak parametre değişikliğini saptamak için >%80 güç sağlayacak grup boyutlarını seçmek için güç analizi yapıldı.进行功效分析以选择将提供> 80%功效以检测参数中10％绝对变化和5％I型错误率的组大小.进行功效分析以选择将提供> 80%功效以检测参数中10％绝对变化和5％I型错误率的组大小. 10. Yılda 10. Yılda 10% % абсолютного изменения параметров ve %5 частоты ошибок TİPа I. %10 mutlak parametre değişikliğini ve %5 tip I hata oranını saptamak için >%80 güç sağlayacak bir grup boyutunu seçmek için bir güç analizi yapıldı.Doku bölümleri deneyden önce rastgele seçildi.Tüm analizler kör koşulluydu ve numunelerin kodu ancak tüm veriler analiz edildikten sonra çözüldü.Tüm istatistiksel analizleri gerçekleştirmek için GraphPad Prism yazılımı (San Diego, CA) kullanıldı. Tüm istatistikler için, p-değerleri <0.05 değerlerinde anlamlı kabul edildi. Tüm istatistikler için, <0,05 değerlerinde p değerleri anlamlı kabul edildi. Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. Tüm istatistikler için, <0,05 değerlerinde p değerleri anlamlı kabul edildi.对于所有统计数据，p 值在值<0.05 时被认为是显着的。对于所有统计数据，p 值在值<0.05 时被认为是显着的。 Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. Tüm istatistikler için, <0,05 değerlerinde p değerleri anlamlı kabul edildi.Sadece 2 karşılaştırmalı veriler üzerinde iki kuyruklu Student t-testi yapıldı.Birden çok grup arasındaki önemi belirlemek için tek yönlü veya iki yönlü ANOVA kullanıldı.Post hoc testler yapılırken, çoklu karşılaştırmaları hesaba katmak için Tukey düzeltmesi uygulandı.RNAsec verilerinin, Yöntemler bölümünde açıklandığı gibi FDR ve p.adjust hesaplanırken özel istatistiksel değerlendirmeleri vardır.
Çalışma tasarımı hakkında daha fazla bilgi için, bu makaleye bağlı Doğa Araştırma Raporu özetine bakın.