Nature.com'u ziyaret ettiğiniz için teşekkür ederiz. Kullandığınız tarayıcı sürümü sınırlı CSS desteğine sahiptir. En iyi deneyim için güncellenmiş bir tarayıcı kullanmanızı (veya Internet Explorer'da Uyumluluk Modunu devre dışı bırakmanızı) öneririz. Bu arada, sürekli desteği sağlamak için siteyi stiller ve JavaScript olmadan sunacağız.
İlaç testleri için kalbin fizyolojik ortamını doğru bir şekilde yeniden üretebilen güvenilir bir in vitro sisteme ihtiyaç vardır. İnsan kalp doku kültürü sistemlerinin sınırlı bulunabilirliği, kardiyak ilaç etkilerinin yanlış yorumlanmasına yol açmıştır. Burada, kalp dilimlerini elektromekanik olarak uyaran ve kardiyak döngünün sistolik ve diyastolik fazları sırasında fizyolojik gerilmeye uğrayan bir kardiyak doku kültürü modeli (CTCM) geliştirdik. 12 günlük kültürden sonra, bu yaklaşım kalp kesitlerinin canlılığını kısmen iyileştirdi, ancak yapısal bütünlüklerini tam olarak korumadı. Bu nedenle, küçük molekül taramasından sonra, ortamımıza 100 nM triiyodotironin (T3) ve 1 μM deksametazon (Dex) eklenmesinin kesitlerin mikro yapısını 12 gün boyunca koruduğunu bulduk. T3/Dex tedavisiyle birlikte, CTCM sistemi transkripsiyonel profilleri, canlılığı, metabolik aktiviteyi ve yapısal bütünlüğü 12 gün boyunca taze kalp dokusuyla aynı seviyede korudu. Ek olarak, kültürdeki kardiyak dokunun aşırı gerilmesi hipertrofik kardiyak sinyalizasyonu indükler ve bu da CTCM'nin kardiyak gerilmeyle indüklenen hipertrofik koşulları taklit etme yeteneğine dair kanıt sağlar. Sonuç olarak, CTCM uzun zaman dilimleri boyunca kültürdeki kalbin fizyolojisini ve patofizyolojisini modelleyebilir ve bu da güvenilir ilaç taramasına olanak tanır.
Klinik araştırmalardan önce, insan kalbinin fizyolojik ortamını doğru bir şekilde yeniden üretebilen güvenilir in vitro sistemlere ihtiyaç duyulmaktadır. Bu tür sistemler, değiştirilmiş mekanik gerginliği, kalp hızını ve elektrofizyolojik özellikleri taklit etmelidir. Hayvan modelleri, insan kalbindeki ilaçların etkilerini yansıtmada sınırlı güvenilirliğe sahip kardiyak fizyoloji için bir tarama platformu olarak yaygın olarak kullanılmaktadır1,2. Sonuç olarak, İdeal Kardiyak Doku Kültürü Deneysel Modeli (CTCM), çeşitli terapötik ve farmakolojik müdahaleler için oldukça hassas ve spesifik olan, insan kalbinin fizyolojisini ve patofizyolojisini doğru bir şekilde yeniden üreten bir modeldir3. Böyle bir sistemin yokluğu, kalp yetmezliği için yeni tedavilerin keşfini sınırlar4,5 ve piyasadan çıkmanın başlıca nedeni olarak ilaç kardiyotoksisitesine yol açmıştır6.
Son on yılda, QT aralığının uzamasına ve bunun sonucunda ventriküler aritmilere ve ani ölüme neden olan sekiz kardiyovasküler olmayan ilaç klinik kullanımdan çekildi7. Bu nedenle, kardiyovasküler etkinliği ve toksisiteyi değerlendirmek için güvenilir klinik öncesi tarama stratejilerine olan ihtiyaç artmaktadır. İlaç taramasında ve toksisite testinde insan kaynaklı pluripotent kök hücre türevi kardiyomiyositlerin (hiPS-CM) son zamanlarda kullanılması bu soruna kısmi bir çözüm sağlamaktadır. Ancak, hiPS-CM'lerin olgunlaşmamış yapısı ve kardiyak dokunun çok hücreli karmaşıklığının olmaması bu yöntemin başlıca sınırlamalarıdır. Son çalışmalar, bu sınırlamanın, kendiliğinden kasılmaların başlangıcından kısa bir süre sonra kardiyak doku hidrojelleri oluşturmak için erken hiPS-CM kullanılarak ve zamanla kademeli olarak artan elektriksel uyarımla kısmen aşılabileceği gösterilmiştir. Ancak, bu hiPS-CM mikro dokuları yetişkin miyokardın olgun elektrofizyolojik ve kasılma özelliklerinden yoksundur. Ek olarak, insan kalp dokusu, endotel hücreleri, nöronlar ve stromal fibroblastlar dahil olmak üzere farklı hücre tiplerinin heterojen bir karışımından oluşan ve belirli hücre dışı matris proteinleri setleriyle birbirine bağlanan daha karmaşık bir yapıya sahiptir. Yetişkin memeli kalbindeki kardiyomiyosit olmayan popülasyonların bu heterojenliği11,12,13, bireysel hücre tiplerini kullanarak kalp dokusunu modellemenin önündeki önemli bir engeldir. Bu önemli sınırlamalar, fizyolojik ve patolojik koşullar altında sağlam miyokardiyal doku kültürü için yöntemler geliştirmenin önemini vurgular.
Kültürlenmiş ince (300 µm) insan kalp kesitleri, sağlam insan miyokardının umut verici bir modeli olduğunu kanıtlamıştır. Bu yöntem, insan kalp dokusuna benzer tam bir 3B çok hücreli sisteme erişim sağlar. Ancak, 2019 yılına kadar, kültürlenmiş kalp kesitlerinin kullanımı kısa (24 saat) kültür sağkalımı ile sınırlıydı. Bunun nedeni, fiziksel-mekanik gerilmenin olmaması, hava-sıvı arayüzü ve kardiyak dokunun ihtiyaçlarını desteklemeyen basit ortamların kullanımı gibi bir dizi faktördür. 2019 yılında, çeşitli araştırma grupları, mekanik faktörlerin kardiyak doku kültürü sistemlerine dahil edilmesinin kültür ömrünü uzatabileceğini, kardiyak ifadeyi iyileştirebileceğini ve kardiyak patolojiyi taklit edebileceğini göstermiştir. İki zarif çalışma 17 ve 18, tek eksenli mekanik yüklemenin kültür sırasında kardiyak fenotipe olumlu bir etkisi olduğunu göstermektedir. Ancak, bu çalışmalar kardiyak döngünün dinamik üç boyutlu fiziko-mekanik yüklemesini kullanmamıştır, çünkü kalp kesitleri izometrik çekme kuvvetleri 17 veya doğrusal oksotonik yükleme 18 ile yüklenmiştir. Bu doku germe yöntemleri birçok kardiyak genin baskılanması veya anormal germe tepkileriyle ilişkili genlerin aşırı ekspresyonuyla sonuçlandı. Özellikle, Pitoulis ve ark. 19 kuvvet dönüştürücü geri bildirimi ve gerilim sürücüleri kullanarak kardiyak döngü rekonstrüksiyonu için dinamik bir kalp dilimi kültür banyosu geliştirdi. Bu sistem daha doğru in vitro kardiyak döngü modellemesine izin verse de, yöntemin karmaşıklığı ve düşük verimi bu sistemin uygulanmasını sınırlar. Laboratuvarımız yakın zamanda, domuz ve insan kalp dokusu kesitlerinin 6 güne kadar canlılığını korumak için elektriksel uyarım ve optimize edilmiş bir ortam kullanan basitleştirilmiş bir kültür sistemi geliştirdi20,21.
Mevcut yazıda, kardiyak döngü sırasında üç boyutlu kardiyak fizyoloji ve patofizyolojik distansiyonu özetlemek için humoral ipuçlarını içeren domuz kalbinin kesitlerini kullanan bir kardiyak doku kültürü modeli (CTCM) tanımlıyoruz. Bu CTCM, klinik öncesi ilaç testleri için memeli kalbinin fizyolojisini/patofizyolojisini taklit eden uygun maliyetli, orta verimli bir kardiyak sistem sağlayarak klinik öncesi ilaç tahmininin doğruluğunu daha önce hiç elde edilmemiş bir düzeye çıkarabilir.
Hemodinamik mekanik sinyaller, in vitro kardiyomiyosit fonksiyonunun sürdürülmesinde kritik bir rol oynar 22,23,24. Mevcut yazıda, fizyolojik frekanslarda (1,2 Hz, dakikada 72 atım) hem elektriksel hem de mekanik uyarım indükleyerek yetişkin kardiyak ortamını taklit edebilen bir CTCM (Şekil 1a) geliştirdik. Diyastol sırasında aşırı doku gerilmesini önlemek için, doku boyutunu %25 oranında artırmak için bir 3D baskı cihazı kullanıldı (Şekil 1b). C-PACE sistemi tarafından indüklenen elektriksel uyarım, kardiyak döngüyü tam olarak yeniden üretmek için bir veri toplama sistemi kullanılarak sistolden 100 ms önce başlayacak şekilde zamanlandı. Doku kültürü sistemi, üst bölmedeki kalp dilimlerinin genişlemesine neden olmak için esnek bir silikon membranı döngüsel olarak genişletmek için programlanabilir bir pnömatik aktüatör (LB Engineering, Almanya) kullanır. Sistem, basıncı (± 1 mmHg) ve zamanı (± 1 ms) doğru bir şekilde ayarlamayı mümkün kılan bir basınç dönüştürücüsü aracılığıyla harici bir hava hattına bağlandı (Şekil 1c).
a Doku bölümünü, cihazın kültür haznesinin içindeki mavi renkle gösterilen 7 mm destek halkasına takın. Kültür haznesi, hava haznesinden ince, esnek bir silikon membranla ayrılır. Sızıntıları önlemek için her hazne arasına bir conta yerleştirin. Cihazın kapağı, elektriksel uyarım sağlayan grafit elektrotlar içerir. b Büyük doku cihazının, kılavuz halkanın ve destek halkasının şematik gösterimi. Doku bölümleri (kahverengi), kılavuz halka cihazın dış kenarındaki oyuğa yerleştirilerek büyük boy cihaza yerleştirilir. Kılavuzu kullanarak, doku akrilik yapıştırıcısıyla kaplanmış destek halkasını dikkatlice kardiyak doku bölümünün üzerine yerleştirin. c Programlanabilir pnömatik aktüatör (PPD) tarafından kontrol edilen hava haznesi basıncının bir fonksiyonu olarak elektriksel uyarımın süresini gösteren grafik. Basınç sensörleri kullanılarak elektriksel uyarımı senkronize etmek için bir veri toplama cihazı kullanıldı. Kültür haznesindeki basınç ayarlanan eşiğe ulaştığında, elektriksel uyarımı tetiklemek için C-PACE-EM'ye bir darbe sinyali gönderilir. d Bir inkübatör rafına yerleştirilmiş dört CTCM'nin görüntüsü. Dört cihaz bir PPD'ye pnömatik devre aracılığıyla bağlanır ve pnömatik devredeki basıncı izlemek için hemostatik valfe basınç sensörleri yerleştirilir. Her cihaz altı doku bölümü içerir.
Tek bir pnömatik aktüatör kullanarak, her biri 6 doku kesiti tutabilen 4 CTCM cihazını kontrol edebildik (Şekil 1d). CTCM'de, hava odasındaki hava basıncı, sıvı odasındaki senkron basınca dönüştürülür ve kalp diliminin fizyolojik genişlemesini sağlar (Şekil 2a ve Ek Film 1). 80 mm Hg'de doku gerilmesinin değerlendirilmesi. Sanat, doku kesitlerinin %25 oranında gerildiğini gösterdi (Şekil 2b). Bu gerilme yüzdesinin, normal kardiyak kesit kontraktilitesi için 2,2-2,3 µm'lik bir fizyolojik sarkomer uzunluğuna karşılık geldiği gösterilmiştir17,19,25. Doku hareketi, özel kamera ayarları kullanılarak değerlendirildi (Ek Şekil 1). Doku hareketinin genliği ve hızı (Şekil 2c, d), kardiyak döngü sırasında gerilmeye ve sistol ve diyastol sırasında zamana karşılık geldi (Şekil 2b). Kasılma ve gevşeme sırasında kardiyak dokunun gerilmesi ve hızı kültürde 12 gün boyunca sabit kaldı (Şekil 2f). Kültür sırasında elektriksel uyarımın kasılma üzerindeki etkisini değerlendirmek için, bir gölgeleme algoritması kullanarak aktif deformiteyi belirlemek için bir yöntem geliştirdik (Ek Şekil 2a,b) ve elektriksel uyarımlı ve uyarımsız deformiteler arasında ayrım yapabildik. Kalbin aynı kesiti (Şekil 2f). Kesiğin hareketli bölgesinde (R6-9), elektriksel uyarım sırasında voltaj, elektriksel uyarım olmadığında olduğundan %20 daha yüksekti; bu, elektriksel uyarımın kasılma fonksiyonuna katkısını göstermektedir.
Hava odası basıncı, sıvı odası basıncı ve doku hareketi ölçümlerinin temsili izleri, oda basıncının sıvı odası basıncını değiştirdiğini ve doku diliminin buna karşılık gelen hareketine neden olduğunu doğrulamaktadır. b Yüzde esnemeye (turuncu) karşılık gelen doku kesitlerinin temsili izleri (mavi). c Kalp diliminin ölçülen hareketi, ölçülen hareket hızıyla tutarlıdır. (d) Kalbin bir diliminde döngüsel hareketin (mavi çizgi) ve hızın (turuncu noktalı çizgi) temsili yörüngeleri. e Döngü süresinin (n = grup başına 19 dilim, farklı domuzlardan), kasılma süresinin (n = grup başına 19 dilim, farklı domuzlardan), gevşeme süresinin (n = grup başına 19 dilim, farklı domuzlardan), doku hareketinin (n = 25. dilim)/grup, farklı domuzlardan), tepe sistolik hızın (n = 24(D0), 25(D12) dilim/grup, farklı domuzlardan) ve tepe gevşeme hızının (n = 24(D0), 25(D12) dilim/grup, farklı domuzlardan) nicelenmesi. İki kuyruklu Student t-testi hiçbir parametrede anlamlı bir fark göstermedi. f Temsili gerilim analizi izleri, elektrik uyarımlı (kırmızı) ve elektrik uyarımsız (mavi) doku kesitleri, aynı kesitten on bölgesel doku kesiti alanı. Alt paneller, farklı kesitlerden on alanda elektrik uyarımlı ve elektrik uyarımsız doku kesitlerindeki gerilim farkının yüzdelik miktarını göstermektedir. (n = farklı domuzlardan 8 dilim/grup, İki kuyruklu Öğrenci t-testi uygulandı; ****p < 0,0001, **p < 0,01, *p < 0,05). (n = farklı domuzlardan 8 dilim/grup, İki kuyruklu Öğrenci t-testi uygulandı; ****p < 0,0001, **p < 0,01, *p < 0,05). (n = 8 срезов/группу от разных свиней, проводится двусторонний t-критерий Стьюдента; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05). (n = farklı domuzlardan 8 kesit/grup, iki kuyruklu Student t-testi; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05). (n = 8 片/组,来自不同的猪,进行双尾学生t 检验;****p < 0,0001，**p < 0,01，*p < 0,05）。 (n = 8 片/组,来自不同的猪,进行双尾学生t 检验;****p < 0,0001，**p < 0,01，*p < 0,05）。 (n = 8 срезов/группу, от разных свиней, двусторонний критерий Стьюдента; ****p <0,0001, **p <0,01, *p <0,05). (n = 8 bölüm/grup, farklı domuzlardan, iki kuyruklu Student t-testi; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05).Hata çubukları ortalama ± standart sapmayı temsil eder.
Önceki statik biyomimetik kalp dilimi kültür sistemimizde [20, 21], elektriksel uyarı uygulayarak ve ortam bileşimini optimize ederek 6 gün boyunca kalp dilimlerinin canlılığını, işlevini ve yapısal bütünlüğünü koruduk. Ancak, 10 gün sonra bu rakamlar keskin bir şekilde düştü. Önceki statik biyomimetik kültür sistemimizde kültürlenen kesitlere 20, 21 kontrol koşulları (Ctrl) olarak atıfta bulunacağız ve daha önce optimize edilmiş ortamımızı MC koşulları ve eş zamanlı mekanik ve elektriksel uyarım (CTCM) altında kültür olarak kullanacağız. olarak adlandırılır. İlk olarak, elektriksel uyarım olmadan mekanik uyarımın 6 gün boyunca doku canlılığını korumak için yeterli olmadığını belirledik (Ek Şekil 3a,b). İlginç bir şekilde, STCM kullanılarak fizyo-mekanik ve elektriksel uyarımın tanıtılmasıyla, 12 günlük kalp kesitlerinin canlılığı, MTT analiziyle gösterildiği gibi, MS koşulları altında taze kalp kesitleriyle aynı kaldı, ancak Ctrl koşulları altında aynı kalmadı (Şekil 1). 3a). Bu, kardiyak döngünün mekanik uyarımı ve simülasyonunun, doku kesitlerini önceki statik kültür sistemimizde bildirilenden iki kat daha uzun süre canlı tutabileceğini göstermektedir. Bununla birlikte, kardiyak troponin T ve konneksin 43'ün immünoetiketlenmesiyle doku kesitlerinin yapısal bütünlüğünün değerlendirilmesi, konneksin 43 ekspresyonunun 12. günde MC dokularında aynı gün kontrollerden önemli ölçüde daha yüksek olduğunu göstermiştir. Ancak, tekdüze konneksin 43 ekspresyonu ve Z-disk oluşumu tam olarak korunmamıştır (Şekil 3b). Doku yapısal bütünlüğünü ölçmek için bir yapay zeka (AI) çerçevesi26, yerelleştirme gücü açısından kalp dilimlerinin yapısal bütünlüğünü ve floresansını otomatik olarak ölçmek için troponin-T ve konneksin boyamaya dayalı bir görüntü tabanlı derin öğrenme hattı43 kullanıyoruz. Bu yöntem, referansta açıklandığı gibi, kardiyak dokunun yapısal bütünlüğünü otomatik ve tarafsız bir şekilde güvenilir bir şekilde ölçmek için bir Evrişimli Sinir Ağı (CNN) ve bir derin öğrenme çerçevesi kullanır. 26. MC dokusu, statik kontrol kesitlerine kıyasla 0. günde yapısal benzerlikte iyileşme gösterdi. Ek olarak, Masson'un trikrom boyaması, kültürün 12. gününde kontrol koşullarına kıyasla MS koşullarında önemli ölçüde daha düşük bir fibroz yüzdesi ortaya koydu (Şekil 3c). CTCM, 12. günde kalp dokusu kesitlerinin canlılığını taze kalp dokusuna benzer bir düzeye çıkarırken, kalp kesitlerinin yapısal bütünlüğünü önemli ölçüde iyileştirmedi.
Bir çubuk grafik, 12 gün boyunca taze kalp dilimlerinin (D0) veya kalp dilimleri kültürünün statik kültürde (D12 Ctrl) veya CTCM'de (D12 MC) MTT canlılığının niceliğini göstermektedir (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) dilim/grup, farklı domuzlardan, tek yönlü ANOVA testi gerçekleştirilir; ####p < 0,0001 D0 ile karşılaştırıldığında ve **p < 0,01 D12 Ctrl ile karşılaştırıldığında). Bir çubuk grafik, 12 gün boyunca taze kalp dilimlerinin (D0) veya kalp dilimi kültürünün statik kültürde (D12 Ctrl) veya CTCM'de (D12 MC) MTT canlılığının niceliğini gösterir (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) dilim/grup, farklı domuzlardan, tek yönlü ANOVA testi gerçekleştirilir; ####p < 0,0001, D0 ile karşılaştırıldığında ve **p < 0,01, D12 Ctrl ile karşılaştırıldığında).Histogram, MTT taze kalp kesitlerinin (D0) veya 12 gün boyunca statik kültürde (D12 kontrol) veya CTCM'de (D12 MC) kalp kesitlerinin kültürünün canlılığının niceliğini gösterir (n = 18 (D0), 15 (D12 kontrol). ) ), farklı domuzlardan 12 (D12 MC) kesit/grup, tek yönlü ANOVA testi gerçekleştirilir;####p < 0,0001, D0'a göre ve **p < 0,01, D12 Ctrl'ye göre). ####p < 0,0001, D0'a kıyasla ve **p < 0,01, D12'ye kıyasla Ctrl). a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切片(D0) (D12 MC) 切片/组,进行单向ANOVA测试；与D0 相比，####p < 0,0001，与D12 Ctrl 相比，**p < 0,01)。 a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切片(D0) ，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；与D0 相比，####p < 0.0001,与D12 Ctrl相比，**p。)taze kalp kesitlerinde (D0) veya 12 gün boyunca statik kültürde (D12 kontrol) veya CTCM'de (D12 MC) kültüre edilen kalp kesitlerinde MTT canlılığının kantifikasyonunu gösteren histogram (n = 18 (D0), 15 (D12 kontrol)), farklı domuzlardan 12 (D12 MC) kesit/grup, tek yönlü ANOVA testi;####p < 0,0001, D0'a göre, **p < 0,01, D12 Ctrl'ye göre). ####p < 0,0001, D0 ile karşılaştırıldığında, **p < 0,01, D12 ile karşılaştırıldığında Ctrl).b Taze izole edilmiş kalp kesitlerinde (D0) veya statik koşullar altında (Ctrl) veya CTCM koşulları altında (MC) 12 gün boyunca kültüre edilen kalp kesitlerinde (temsili immünofloresan görüntüleri (boş ölçek = 100 µm) Troponin-T (yeşil), konneksin 43 (kırmızı) ve DAPI (mavi). Yapay zeka ile kalp dokusunun yapısal bütünlüğünün kantifikasyonu (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) dilim/grup her biri farklı domuzdan, tek yönlü ANOVA testi gerçekleştirildi; ####p < 0.0001 D0 ile karşılaştırıldığında ve ****p < 0.0001 D12 Ctrl ile karşılaştırıldığında). Yapay zeka ile kalp dokusunun yapısal bütünlüğünün kantifikasyonu (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) dilim/grup, her biri farklı domuzdan, tek yönlü ANOVA testi gerçekleştirildi; ####p < 0.0001 D0 ile karşılaştırıldığında ve ****p < 0.0001 D12 Ctrl ile karşılaştırıldığında). Количественная оценка структурной целостности сердечной ткани искусственным интеллектом (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12) MC) разных свиней, проводится однофакторный test ANOVA'ya göre срезов/групп ####p < 0,0001 сравнению с D0 ve ****p < 0,0001 по; сравнению ile D12 Ctrl). Yapay zeka ile kalp dokusunun yapısal bütünlüğünün kantifikasyonu (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) farklı domuzlardan alınan kesitler/gruplar, tek yönlü ANOVA testi uygulandı; ####p < 0.0001, D0 ile karşılaştırıldığında ve ****p < 0.0001, D12 Ctrl ile karşılaştırıldığında).人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) dilim/her biri farklı domuzdan oluşan grup, tek yönlü ANOVA testi;####p < 0,0001 与D0相比，****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）。人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) dilim/her biri farklı domuzlardan oluşan grup, tek yönlü ANOVA testi;####p < 0,0001与D0相比，****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）。 Искусственный интеллект для количественной оценки структурной целостности сердечной ткани (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) срезов/группу каждой из разных свиней, односторонний тест ANOVA; ####p <0,0001 vs. D0 Для сравнения ****p < 0,0001 по сравнению ile D12 Ctrl). Kalp dokusunun yapısal bütünlüğünü ölçmek için yapay zeka (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) kesit/grup her birinden farklı domuzlar, tek yönlü ANOVA testi; ####p<0.0001 vs. .D0 Karşılaştırma için ****p < 0.0001, D12 Ctrl ile karşılaştırıldığında). c Masson'un trikrom boyasıyla boyanmış kalp dilimlerinin temsili görüntüleri (sol) ve kantifikasyonu (sağ) (Ölçek çıplak = 500 µm) (n = her grupta farklı domuzlardan 10 dilim, tek yönlü ANOVA testi gerçekleştirildi; ####p < 0,0001, D0 ile karşılaştırıldığında ve ***p < 0,001, D12 Ctrl ile karşılaştırıldığında). c Masson'un trikrom boyasıyla boyanmış kalp dilimlerinin temsili görüntüleri (sol) ve kantifikasyonu (sağ) (Ölçek çıplak = 500 µm) (n = her grupta farklı domuzlardan 10 dilim, tek yönlü ANOVA testi gerçekleştirildi; #### p < 0,0001, D0 ile karşılaştırıldığında ve ***p < 0,001, D12 Ctrl ile karşılaştırıldığında). c Репрезентативные изображения (слева) и количественная оценка (справа) срезов сердца, окрашенных трихромным красителем Массона (масштаб без покрытия = 500 мкм) (n = 10 срезов/группу от разных свиней, выполняется односторонний тест ANOVA; #### p < 0,0001 по сравнению с D0 и ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Masson'un trikrom boyasıyla boyanmış kalp kesitlerinin temsili görüntüleri (sol) ve kantifikasyonu (sağ) (kaplanmamış ölçek = 500 µm) (n = farklı domuzlardan 10 kesit/grup, tek yönlü ANOVA testi uygulandı; #### p < 0,0001, D0 ile karşılaştırıldığında ve ***p < 0,001, D12 Ctrl ile karşılaştırıldığında). c 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像（左）和量化（右）（裸尺度= 500 µm）（n = 10个切片/组，每组来自不同的猪，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0.0001 与D0 相比，***p < 0.001 与D12 Ctrl evet. C 用 mason 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 （左 左） 量化 （右） 裸尺度 裸尺度 裸尺度裸尺度 = 500 µm） （n = 10 个 切片 组 每 组 来自 不同 猪 ， 进行 单向 单向 Anova 测试；#### p < 0,0001 与D0 相比，***p < 0,001 与D12 Ctrl 相比）。 c Репрезентативные изображения (слева) и количественный анализ (справа) срезов сердца, окрашенных трихромным красителем Массона (чистая шкала = 500 мкм) (n = 10 срезов/группа, каждый от другой свиньи, потестировано с помощью однофакторного дисперсионного анализа ;### #p < 0,0001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Masson'un trikrom boyasıyla boyanmış kalp kesitlerinin temsili görüntüleri (sol) ve kantifikasyonu (sağ) (boş = 500 µm) (n = 10 kesit/grup, her biri farklı bir domuzdan, tek yönlü varyans analizi ile test edildi ;### # p < 0,0001 D0 ile karşılaştırıldığında, ***p < 0,001 D12 ile karşılaştırıldığında Ctrl).Hata çubukları ortalama ± standart sapmayı temsil eder.
Kültür ortamına küçük moleküller ekleyerek kardiyomiyosit bütünlüğünün iyileştirilebileceği ve CTCM kültürü sırasında fibrozis gelişiminin azaltılabileceği hipotezini öne sürdük. Bu nedenle, karıştırıcı faktörlerin az sayıda olması nedeniyle statik kontrol kültürlerimizi20,21 kullanarak küçük molekülleri taradık. Bu tarama için deksametazon (Dex), triiyodotironin (T3) ve SB431542 (SB) seçildi. Bu küçük moleküller daha önce hiPSC-CM kültürlerinde sarkomer uzunluğunu, T-tübüllerini ve iletim hızını artırarak kardiyomiyositlerin olgunlaşmasını sağlamak için kullanılmıştı. Ek olarak, hem Dex'in (bir glukokortikoid) hem de SB'nin iltihabı baskıladığı bilinmektedir29,30. Bu nedenle, bu küçük moleküllerden birinin veya bir kombinasyonunun dahil edilmesinin kalp bölümlerinin yapısal bütünlüğünü iyileştirip iyileştirmeyeceğini test ettik. İlk tarama için, her bileşiğin dozu hücre kültürü modellerinde yaygın olarak kullanılan konsantrasyonlara (1 μM Dex27, 100 nM T327 ve 2,5 μM SB31) göre seçildi. 12 günlük kültürden sonra, T3 ve Dex kombinasyonu optimum kardiyomiyosit yapısal bütünlüğü ve minimal lifli yeniden şekillenme ile sonuçlandı (Ek Şekiller 4 ve 5). Ek olarak, bu T3 ve Dex konsantrasyonlarının iki katı veya daha fazlasının kullanılması normal konsantrasyonlara kıyasla zararlı etkiler üretti (Ek Şekil 6a,b).
İlk taramadan sonra, 4 kültür koşulunun başa baş karşılaştırmasını gerçekleştirdik (Şekil 4a): Ctrl: daha önce açıkladığımız statik kültürümüzde optimize edilmiş ortamımızı kullanarak kültüre alınan kalp kesitleri; 20.21 TD: Çarşamba günü T3 ve Ctrl s Eklenen Dex; MC: daha önce optimize edilmiş ortamımızı kullanarak CTCM'de kültüre alınan kalp kesitleri; ve MT: ortama T3 ve Dex eklenmiş CTCM. 12 günlük kültürden sonra, MS ve MT dokularının canlılığı, MTT testi ile değerlendirilen taze dokulardakiyle aynı kaldı (Şekil 4b). İlginç bir şekilde, T3 ve Dex'in transwell kültürlerine (TD) eklenmesi, Ctrl koşullarına kıyasla canlılıkta önemli bir iyileşmeye yol açmadı ve bu da kalp kesitlerinin canlılığını sürdürmede mekanik stimülasyonun önemli bir rol oynadığını gösterdi.
12 gün boyunca ortamda mekanik uyarım ve T3/Dex takviyesinin etkilerini değerlendirmek için kullanılan dört kültür koşulunu gösteren deneysel tasarım diyagramı. b Çubuk grafik, tüm 4 kültür koşulunda (Ctrl, TD, MC ve MT) kültürden 12 gün sonra canlılığın, taze kalp dilimleriyle (D0) karşılaştırılmasını göstermektedir (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD ve D12 MT), 12 (D12 MC) dilim/grup, farklı domuzlardan, tek yönlü ANOVA testi gerçekleştirilir; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 D0 ile karşılaştırıldığında ve **p < 0,01 D12 Ctrl ile karşılaştırıldığında). b Çubuk grafik, tüm 4 kültür koşulunda (Ctrl, TD, MC ve MT) kültürden 12 gün sonra canlılığın, taze kalp dilimleriyle (D0) karşılaştırılmasını göstermektedir (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD ve D12 MT), 12 (D12 MC) dilim/grup, farklı domuzlardan, tek yönlü ANOVA testi gerçekleştirilir; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 D0 ile karşılaştırıldığında ve **p < 0,01 D12 ctrl ile karşılaştırıldığında). b Гистограмма показывает количественную оценку жизнеспособности через 12 gün önce культивирования во всех 4 grup (kontrolü, TD, MC и MT) сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD ve D12 MT), 12 (D12 MC) разных свиней'den срезов/группу, проводится односторонний test ANOVA; ####p < 0,0001, ###p < 0,001, D0 ve **p < 0,01, D12 Ctrl için). b Çubuk grafik, tüm 4 kültür koşulunda (kontrol, TD, MC ve MT) kültür sonrası 12. gündeki canlılığın kantifikasyonunu, taze kalp kesitleriyle (D0) karşılaştırır (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD ve D12 MT), farklı domuzlardan 12 (D12 MC) kesit/grup, tek yönlü ANOVA testi; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 D0'a karşı ve **p < 0,01 D12 Ctrl'ye karşı). b 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC veMT）与新鲜心脏切片(D0) (n = 18 (D0)、15 (D12 Ctrl、D12 TD)和D12 MT),来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组,进行单向ANOVA 测试；####p < 0.0001，###p < 0.001 与D0相比,**p < 0,01 × D12 değer）.b 4 12 (D12 MC) b Гистограмма, показывающая все 4 условия культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD ve D12 MT), разных свиней 12 (D12 MC) срезы/группа, односторонний test ANOVA; ####p <0,0001, ###p <0,001 önce сравнению с D0, **p <0,01 по сравнению с контролем D12). b Tüm 4 kültür koşulunu (kontrol, TD, MC ve MT) taze kalp kesitleriyle (D0) karşılaştıran histogram (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD ve D12 MT), farklı domuzlardan 12 (D12 MC) kesit/grup, tek yönlü ANOVA testi; ####p<0,0001, ###p<0,001 vs. D0, **p<0,01 vs. kontrol D12). c Çubuk grafik, tüm 4 kültür koşulunda (Ctrl, TD, MC ve MT) kültürden 12 gün sonra glikoz akışının kantifikasyonunu taze kalp dilimleriyle (D0) karşılaştırır (n = farklı domuzlardan 6 dilim/grup, tek yönlü ANOVA testi gerçekleştirilir; ###p < 0,001, D0 ile karşılaştırıldığında ve ***p < 0,001, D12 Ctrl ile karşılaştırıldığında). c Çubuk grafik, tüm 4 kültür koşulunda (Ctrl, TD, MC ve MT) kültürden 12 gün sonra glikoz akışının kantifikasyonunu taze kalp dilimleriyle (D0) karşılaştırır (n = farklı domuzlardan 6 dilim/grup, tek yönlü ANOVA testi gerçekleştirilir; ###p < 0,001, D0 ile karşılaştırıldığında ve ***p < 0,001, D12 Ctrl ile karşılaştırıldığında). c Гистограмма показывает количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после культивирования во всех 4 условиях культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 6 срезов/группу от разных свиней, односторонний ANOVA testi; ###p < 0,001, D0 için и ***p < 0,001, D12 Ctrl için). c Histogram, tüm 4 kültür koşulunda (kontrol, TD, MC ve MT) kültürden 12 gün sonra glikoz akışının, taze kalp kesitleriyle (D0) karşılaştırılmasını gösterir (n = farklı domuzlardan alınan 6 kesit/grup, tek yönlü ANOVA testi uygulandı; ###p < 0,001 D0 ile karşılaştırıldığında ve ***p < 0,001 D12 Ctrl ile karşılaştırıldığında). c 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) 相比，培养后12天的葡萄糖通量定量（n = 6 片/组，来自不同猪，单向执行ANOVA 测试；###p < 0,001,与D0相比，***p < 0,001 与D12 Ctrl evet. C 条形图 显示 所有 4 种 条件 （（ctrl 、 td 、 mc 和 mt） 新鲜 心脏 切片 切片 切片 相比 ，培养 后 后 12 天 的 通量 定量 （n = 6 片/组 ， 来自 猪 ， ， ， ， ， ， ， ， 猪ANOVA 测试；###p < 0.001，与D0 相比，***p < 0.001 与D12 Ctrl 相比）。 c Гистограмма, показывающая количественную оценку потока глюкозы через 12 gün sonra культивирования для всех 4 условий культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 6 срезов/группа, разных свиней'den, односторонний Были проведены тесты ANOVA; ###p < 0,001, D0'a göre, ***p < 0,001, D12'ye göre (контроль). c Tüm 4 kültür koşulu (kontrol, TD, MC ve MT) için kültür sonrası 12. günde glikoz akışının kantifikasyonunu gösteren histogram, taze kalp kesitleriyle (D0) karşılaştırılmıştır (n = 6 kesit/grup, farklı domuzlardan, tek taraflı ANOVA testleri yapılmıştır, ###p < 0,001 D0 ile karşılaştırıldığında, ***p < 0,001 D12 (kontrol) ile karşılaştırıldığında).d Taze (mavi), 12. gün MC (yeşil) ve 12. gün MT (kırmızı) dokuların on bölgesel doku kesit noktasındaki suş analizi çizimleri (n = 4 dilim/grup, tek yönlü ANOVA testi; gruplar arasında anlamlı bir fark yoktu). e Taze kalp kesitlerinde (D0) statik koşullar altında (Ctrl) veya MT koşulları altında (MT) 10-12 gün boyunca kültüre alınan kalp kesitlerine kıyasla farklı şekilde ifade edilen genleri gösteren volkan çizimi. f Her bir kültür koşulu altında kültüre alınan kalp kesitleri için sarkomer genlerinin ısı haritası. Hata çubukları ortalama ± standart sapmayı temsil eder.
Yağ asidi oksidasyonundan glikolize geçişe metabolik bağımlılık, kardiyomiyosit dediferansiasyonunun bir özelliğidir. Olgunlaşmamış kardiyomiyositler öncelikle ATP üretimi için glikoz kullanır ve az sayıda krista içeren hipoplastik mitokondrilere sahiptir5,32. Glikoz kullanım analizleri, MC ve MT koşulları altında glikoz kullanımının 0. gün dokularındakine benzer olduğunu gösterdi (Şekil 4c). Ancak, Ctrl örnekleri taze dokuya kıyasla glikoz kullanımında önemli bir artış gösterdi. Bu, CTCM ve T3/Dex kombinasyonunun doku canlılığını artırdığını ve 12 günlük kültürlü kalp kesitlerinin metabolik fenotipini koruduğunu gösterir. Ek olarak, suş analizi suş seviyelerinin MT ve MS koşulları altında 12 gün boyunca taze kalp dokusundakiyle aynı kaldığını gösterdi (Şekil 4d).
CTCM ve T3/Dex'in kardiyak dilim dokusunun genel transkripsiyonel manzarası üzerindeki genel etkisini analiz etmek için, dört farklı kültür koşulunun hepsinden kardiyak dilimler üzerinde RNAseq gerçekleştirdik (Ek Veri 1). İlginç bir şekilde, MT kesitleri taze kalp dokusuna yüksek transkripsiyonel benzerlik gösterdi ve 13.642 genden sadece 16'sı farklı şekilde ifade edildi. Ancak, daha önce gösterdiğimiz gibi, Ctrl dilimleri kültürde 10-12 gün sonra 1229 farklı şekilde ifade edilen gen gösterdi (Şekil 4e). Bu veriler kalp ve fibroblast genlerinin qRT-PCR'si ile doğrulandı (Ek Şekil 7a-c). İlginç bir şekilde, Ctrl kesitleri kardiyak ve hücre döngüsü genlerinin aşağı regülasyonunu ve inflamatuar gen programlarının aktivasyonunu gösterdi. Bu veriler, normalde uzun süreli kültürlemeden sonra oluşan dediferansiasyonun MT koşulları altında tamamen zayıfladığını göstermektedir (Ek Şekil 8a,b). Sarkomer genlerinin dikkatli bir şekilde incelenmesi, yalnızca MT koşulları altında sarkomeri (Şekil 4f) ve iyon kanalını (Ek Şekil 9) kodlayan genlerin korunduğunu ve bunların Ctrl, TD ve MC koşulları altında baskılanmaktan korunduğunu göstermiştir. Bu veriler, mekanik ve humoral uyarının (T3/Dex) bir kombinasyonu ile kalp dilimi transkriptomunun kültürde 12 gün sonra bile taze kalp dilimlerine benzer kalabileceğini göstermektedir.
Bu transkripsiyonel bulgular, kalp kesitlerindeki kardiyomiyositlerin yapısal bütünlüğünün, sağlam ve lokalize konneksin 43'ün (Şekil 5a) gösterdiği gibi, MT koşulları altında 12 gün boyunca en iyi şekilde korunduğu gerçeğiyle desteklenmektedir. Ek olarak, MT koşulları altındaki kalp kesitlerindeki fibrozis, Ctrl ile karşılaştırıldığında önemli ölçüde azalmış ve taze kalp kesitlerine benzerdir (Şekil 5b). Bu veriler, mekanik stimülasyon ve T3/Dex tedavisinin kombinasyonunun, kültürdeki kalp kesitlerindeki kardiyak yapıyı etkili bir şekilde koruduğunu göstermektedir.
Taze izole edilmiş kalp kesitlerinde (D0) veya dört kalp kesiti kültür koşulunda 12 gün boyunca kültüre edilmiş troponin-T (yeşil), konneksin 43 (kırmızı) ve DAPI'nin (mavi) temsili immünofloresan görüntüleri (ölçek çubuğu = 100 µm). Yapay zeka ile kalp dokusu yapısal bütünlüğünün kantifikasyonu (n = 7 (D0 ve D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC ve D12 MT) dilim/grup farklı domuzlardan, tek yönlü ANOVA testi gerçekleştirildi; ####p < 0.0001 D0'a kıyasla ve *p < 0.05, veya ****p < 0.0001 D12 Ctrl'ye kıyasla). Yapay zeka ile kalp dokusu yapısal bütünlüğünün kantifikasyonu (n = 7 (D0 ve D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC ve D12 MT) dilim/grup farklı domuzlardan, tek yönlü ANOVA testi gerçekleştirildi; #### p < 0.0001, D0'a kıyasla ve *p < 0.05, veya ****p < 0.0001, D12 Ctrl'ye kıyasla). Количественная оценка структурной целостности ткани сердца с помощью искусственного интеллекта (n = 7 (D0 ve D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC ve D12 MT) разных свиней'den срезов/группу, проведен однофакторный тест ANOVA; #### p < 0,0001 по сравнению с; D0 ve *p < 0,05 veya ****p < 0,0001 D12 Ctrl ile uyumludur). Yapay zeka kullanılarak kalp dokusunun yapısal bütünlüğünün kantifikasyonu (n = 7 (D0 ve D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC ve D12 MT) kesit/farklı domuzlardan grup, tek yönlü ANOVA testi uygulandı; #### p < 0.0001, D0 ile karşılaştırıldığında ve *p < 0.05 veya ****p < 0.0001, D12 Ctrl ile karşılaştırıldığında).对不同猪的心脏组织结构完整性（n = 7（D0 和D12 Ctrl）、5（D12 TD、D12 MC ve D12 MT）切片/组）进行人工智能量化，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0.0001 与D0 和*p < 0.05 相比，或****p < 0,0001 ve D12 Ctrl tuşu).对 不同 猪 的 心脏 结构 完整性 （n = 7 （d0 和 d12 ctrl） （5 （d12 td 、 d12 mc 和 d12 mt） 组）人工 智能量 化 进行 单向 单向 单向 测试 ； ########## p < 0.0001 与D0 和*p < 0.05 相比，或****p < 0,0001 与D12 Ctrl evet.Farklı domuzlarda (n = 7 (D0 ve D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC ve D12 MT) kesit/grup) yapay zeka kullanılarak kalp dokusunun yapısal bütünlüğünün tek yönlü ANOVA testi ile kantifikasyonu;#### p < 0,0001, D0 ve *p < 0,05 veya ****p < 0,0001, D12 Ctrl için). #### D0 ile karşılaştırıldığında p < 0,0001 ve D12 ile karşılaştırıldığında *p < 0,05 veya ****p < 0,0001 (Ctrl). b Masson'un trikrom boyasıyla boyanmış kalp dilimlerinin temsili görüntüleri ve kantifikasyonu (Ölçek çubuğu = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD ve D12 MC), farklı domuzlardan 9 (D12 MT) dilim/grup, tek yönlü ANOVA testi gerçekleştirildi; ####p < 0,0001 D0'a kıyasla ve ***p < 0,001 veya ****p < 0,0001 D12 Ctrl'ye kıyasla). b Masson'un trikrom boyasıyla boyanmış kalp dilimlerinin temsili görüntüleri ve kantifikasyonu (Ölçek çubuğu = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD ve D12 MC), farklı domuzlardan 9 (D12 MT) dilim/grup, tek yönlü ANOVA testi gerçekleştirildi; ####p < 0,0001 D0'a kıyasla ve ***p < 0,001 veya ****p < 0,0001 D12 Ctrl'ye kıyasla). b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромным красителем Массона (масштабная линейка = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD и D12 MC), 9 (D12 MT) разных свиней срезов/группу, выполняется односторонний test ANOVA; ####p < 0,0001, D0'a göre ve ***p < 0,001 veya ****p < 0,0001, D12'ye göre Ctrl). b Masson'un trikrom boyasıyla boyanmış kalp kesitlerinin temsili görüntüleri ve kantifikasyonu (ölçek çubuğu = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD ve D12 MC), farklı domuzlardan 9 (D12 MT) kesit/grup, tek yönlü ANOVA gerçekleştirildi; ####p < 0,0001 vs. D0 ve ***p < 0,001 veya ****p < 0,0001 vs. D12 Ctrl). b 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像和量化（比例尺= 500 µm）（n = 10（D0、D12 Ctrl、D12 TD ve D12 MC），来自不同猪的9 个（D12 MT）切片/组，进行单因素方差分析；####p < 0.0001 与D0相比,***p < 0,001，或****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）。 b 用 mason 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 和 量化 （比例 尺 尺 尺 = 500 µm） （n = 10 （d0 、 d12 ctrl 、 d12 td ve d12 mc） 来自 不同 的 9 个 d12 mt 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片切 fotoğrafları 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片/组,进行单因素方差分析；####p < 0.0001与D0 相比，***p < 0,001，或****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）。 b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромом Массона (масштабная линейка = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD и D12 MC), 9 (D12 MT) разных свиней / группы, один- способ ANOVA; ####p < 0,0001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 veya ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). b Masson trikromuyla boyanmış kalp kesitlerinin temsili görüntüleri ve kantifikasyonu (ölçek çubuğu = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD ve D12 MC), farklı domuzlardan/gruptan 9 (D12 MT), bir ANOVA yöntemi; ####p < 0,0001, D0 ile karşılaştırıldığında, ***p < 0,001 veya ****p < 0,0001, D12 Ctrl ile karşılaştırıldığında).Hata çubukları ortalama ± standart sapmayı temsil eder.
Son olarak, CTCM'nin kardiyak hipertrofiyi taklit etme yeteneği, kardiyak doku gerginliğini artırarak değerlendirildi. CTCM'de, en yüksek hava odası basıncı 80 mmHg'den 80 mmHg'ye çıktı. Sanat. (normal gerginlik) 140 mmHg'ye kadar Sanat. (Şekil 6a). Bu, daha önce hipertrofide görülen sarkomer uzunluğuna benzer bir sarkomer uzunluğuna ulaşmak için kalp bölümleri için gereken karşılık gelen gerginlik yüzdesi olarak gösterilen gerginlikte %32'lik bir artışa karşılık gelir (Şekil 6b). Kasılma ve gevşeme sırasında kardiyak dokunun gerginliği ve hızı, altı günlük kültür boyunca sabit kaldı (Şekil 6c). MT koşullarından elde edilen kardiyak doku, altı gün boyunca normal gerginliğe (MT (Normal)) veya aşırı gerginlik koşullarına (MT (OS)) tabi tutuldu. Kültürde dört gün sonra bile, hipertrofik biyobelirteç NT-ProBNP, MT (normal) koşullarına kıyasla MT (OS) koşullarında ortamda önemli ölçüde yükselmişti (Şekil 7a). Ek olarak, altı günlük kültürlemeden sonra, MT'deki (OS) hücre boyutu (Şekil 7b) MT kalp bölümlerine (normal) kıyasla önemli ölçüde arttı. Ek olarak, NFATC4 nükleer translokasyonu aşırı gerilmiş dokularda önemli ölçüde arttı (Şekil 7c). Bu sonuçlar, hiperdistansiyondan sonra patolojik yeniden şekillendirmenin ilerleyici gelişimini gösterir ve CTCM cihazının gerilme kaynaklı kardiyak hipertrofi sinyallemesini incelemek için bir platform olarak kullanılabileceği kavramını destekler.
Hava odası basıncı, sıvı odası basıncı ve doku hareketi ölçümlerinin temsili izleri, oda basıncının sıvı odası basıncını değiştirdiğini ve doku diliminin buna karşılık gelen hareketine neden olduğunu doğrulamaktadır. b Normal şekilde gerilen (turuncu) ve aşırı gerilen (mavi) doku kesitleri için temsili gerilme yüzdesi ve gerilme oranı eğrileri. c Döngü süresini (n = grup başına 19 dilim, farklı domuzlardan), kasılma süresini (n = grup başına 18-19 dilim, farklı domuzlardan), gevşeme süresini (n = grup başına 19 dilim, farklı domuzlardan)), doku hareketinin genliğini (n = grup başına 14 dilim, farklı domuzlardan), pik sistolik hızı (n = grup başına 14 dilim, farklı domuzlardan) ve pik gevşeme oranını (n = 14 (D0), 15 (D6)) gösteren çubuk grafik, iki kuyruklu Student t-testi hiçbir parametrede anlamlı bir fark göstermedi ve bu parametrelerin aşırı voltajla 6 günlük kültür boyunca sabit kaldığını gösterdi. Hata çubukları ortalama ± standart sapmayı temsil eder.
MT normal gerilme (Norm) veya aşırı gerilme (OS) koşulları altında kültüre edilen kalp dilimlerinden alınan kültür ortamlarındaki NT-ProBNP konsantrasyonunun çubuk grafik kantifikasyonu (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm ve D4 MTOS) dilim/farklı domuzlardan grup, İki yönlü ANOVA gerçekleştirildi; **p < 0,01 normal gerilmeye kıyasla). MT normal gerilme (Norm) veya aşırı gerilme (OS) koşulları altında kültüre edilen kalp dilimlerinden alınan kültür ortamlarındaki NT-ProBNP konsantrasyonunun çubuk grafik kantifikasyonu (n ​​= 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm ve D4 MTOS) dilim/farklı domuzlardan grup, İki yönlü ANOVA gerçekleştirildi; **p < 0,01 normal gerilmeye kıyasla).Normal MT gerilmesi (norm) veya aşırı gerilme (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm ve D4).MTOS) dilimleri/grup koşulları altında kültüre edilen kalp dilimlerinden alınan kültür ortamındaki NT-ProBNP konsantrasyonunun kantitatif histogramı, farklı domuzlardan iki faktörlü varyans analizi gerçekleştirildi;**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p < 0,01 normal gerilmeye kıyasla). a 在MT 正常拉伸(Norm) 或过度拉伸(OS) 条件下培养的心脏切片培养基中NT-ProBNP浓度的条形图量化（n = 4 (D2 MTNorm)、3（D2 MTOS, D4 MTNorm ve D4 MTOS）来自不同猪的切片/组,进行双向方差分析；**与正常拉伸相比,p < 0,01）。 a Farklı bölgelerden MT normal germe (Norm) veya aşırı germe (OS) koşulları (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm和D4 MTOS) altında kültürlenen kalp dilimlerindeki NT-ProBNP konsantrasyonunun niceliği猪的切片/组，可以双向方方发发动; **normal esnemeyle karşılaştırıldığında, p < 0,01).Histogram Normal MT gerilmesi (norm) veya aşırı gerilme (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm) ve D4 MTOS) dilim/grup koşulları altında kültüre edilen kalp dilimlerindeki NT-ProBNP konsantrasyonlarının kantifikasyonu, farklı domuzlardan, iki yönlü varyans analizi;**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p < 0,01 normal gerilmeye kıyasla). b Troponin-T ve WGA ile boyanmış kalp dilimlerinin temsili görüntüleri (sol) ve hücre boyutu ölçümü (sağ) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) hücre/grup, farklı domuzlardan alınan 10 farklı dilimden, İki kuyruklu Student t-testi uygulandı; ****p < 0,0001 normal gerilmeye kıyasla). b Troponin-T ve WGA ile boyanmış kalp dilimlerinin temsili görüntüleri (sol) ve hücre boyutu ölçümü (sağ) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) hücre/grup, farklı domuzlardan alınan 10 farklı dilimden, İki kuyruklu Student t-testi uygulandı; ****p < 0,0001 normal gerilmeye kıyasla). b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т ve АЗП (слева) и количественного определения размера клеток (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) клеток/группу из 10 разных срезов от разных свиней, два- проводится хвостовой t-критерий Стьюдента; ****p < 0,0001 по сравнению с нормальным растяжением). b Troponin-T ve AZP ile boyanmış kalp kesitlerinin temsili görüntüleri (sol) ve hücre boyutu ölçümü (sağ) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) hücre/grup, farklı domuzlardan alınan 10 farklı kesitten, iki kuyruklu Student t-testi uygulandı; ****p < 0,0001 normal suşa kıyasla). b 用肌钙蛋白-T 和WGA（左）和细胞大小量化（右）染色的心脏切片的代表性图像（n = 330（D6 MTOS），来自不同猪的10 个不同切片的369（D6 MTNorm）细胞/组,两进行有尾学生t 检验；与正常拉伸相比，****p < 0,0001）。 b Kalcarein-T ve WGA ile boyanmış kalp dilimlerinin temsili görüntüleri (sol) ve hücre boyutu (sağ) (n = 330 (D6 MTOS), 10 farklı dilimden 369 (D6 MTNorm)) Hücreler/组，两方法有尾学生t testi；normal germe ile karşılaştırıldığında，****p < 0,0001). b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т ve АЗП (слева) и количественная оценка размера клеток (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) ve 10 различных срезов от разных свиней Клетки/группа, двусторонние критерий Стьюдента; ****p < 0,0001 по сравнению с нормальным растяжением). b Troponin-T ve AZP ile boyanmış kalp kesitlerinin temsili görüntüleri (sol) ve hücre boyutunun kantifikasyonu (sağ) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) farklı domuzlardan alınan 10 farklı kesitten) Hücre/grup, iki kuyruklu kriter Student's t; ****p < 0,0001 normal suşa kıyasla). c Troponin-T ve NFATC4 için immüno-etiketli 0. ve 6. gün MTOS kalp dilimlerinin temsili görüntüleri ve NFATC4'ün CM çekirdeklerine taşınmasının kantifikasyonu (farklı domuzlardan n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) dilim/grup, İki kuyruklu Öğrenci t-testi uygulandı; *p < 0,05). c Troponin-T ve NFATC4 için immüno-etiketli 0. ve 6. gün MTOS kalp dilimlerinin temsili görüntüleri ve NFATC4'ün CM çekirdeklerine taşınmasının kantifikasyonu (farklı domuzlardan n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) dilim/grup, İki kuyruklu Öğrenci t-testi uygulandı; *p < 0,05). c MTOS için 0 ve 6 numaralı sunucular için Репрезентативные изображения, тропонина-Т ve NFATC4 için иммуномеченых, ve количественная оценка транслокации NFATC4, ядра кавернозных клеток (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) разных срезов/группу свиней выполняется двусторонний t-критерий Стьюдента; *p < 0,05). c Troponin-T ve NFATC4 için immüno-etiketli, 0 ve 6 günlük MTOS'ta kalp kesitlerine ait temsili görüntüler ve kavernöz hücrelerin çekirdeğindeki NFATC4 translokasyonunun kantifikasyonu (farklı domuzlardan n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) dilim/grup) iki kuyruklu Student's t-testi ile gerçekleştirildi; *p < 0,05). c 用于肌钙蛋白-T ve NFATC4 免疫标记的第0 天和第6 天MTOS NFATC4 CM 细胞核的量化（n = 4 (D0)、3 (D6 MTOS)切片/组, 进行双尾学生t 检验；*p < 0,05)。 c Kalkanin-T ve NFATC4 immün etiketleme 6天MTOS kalp dilimlerinin ve farklı NFATC4 CM hücre çekirdeği miktarından NFATC4'ün temsili görüntüleri (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) 切礼/组,时间双尾学生et 电影；*p < 0,05). c Репрезентативные изображения срезов сердца MTOS на 0 и 6 для иммуномаркировки тропонином-Т ve NFATC4 ve количественная оценка транслокации NFATC4 в ядра CM от разных свиней (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срез/группа, два- хвостатый t-критерий Стьюдента; *p < 0,05). c Farklı domuzların CM çekirdeğinde troponin-T ve NFATC4 immünoetiketleme ve NFATC4 translokasyonunun kantifikasyonu için 0. ve 6. günlerdeki MTOS kalp dilimlerinin temsili görüntüleri (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) dilim/grup, iki kuyruklu t-kriteri Öğrenci; *p < 0,05).Hata çubukları ortalama ± standart sapmayı göstermektedir.
Translasyonel kardiyovasküler araştırma, kardiyak ortamı doğru bir şekilde yeniden üreten hücresel modeller gerektirir. Bu çalışmada, kalbin ultra ince kesitlerini uyarabilen bir CTCM cihazı geliştirildi ve karakterize edildi. CTCM sistemi, fizyolojik olarak senkronize elektromekanik stimülasyon ve T3 ve Dex sıvı zenginleştirmesini içerir. Domuz kalp kesitleri bu faktörlere maruz bırakıldığında, canlılıkları, yapısal bütünlükleri, metabolik aktiviteleri ve transkripsiyonel ifadeleri, kültürden 12 gün sonra taze kalp dokusundakiyle aynı kaldı. Ek olarak, kardiyak dokunun aşırı gerilmesi, hiperekstansiyondan kaynaklanan kalp hipertrofisine neden olabilir. Genel olarak, bu sonuçlar, fizyolojik kültür koşullarının normal bir kardiyak fenotipi sürdürmedeki kritik rolünü destekler ve ilaç taraması için bir platform sağlar.
Kardiyomiyositlerin işleyişi ve hayatta kalması için en uygun ortamın yaratılmasına birçok faktör katkıda bulunur. Bu faktörlerin en belirginleri (1) hücreler arası etkileşimler, (2) elektromekanik uyarım, (3) humoral faktörler ve (4) metabolik substratlarla ilgilidir. Fizyolojik hücre-hücre etkileşimleri, hücre dışı bir matris tarafından desteklenen birden fazla hücre tipinin karmaşık üç boyutlu ağlarını gerektirir. Bu tür karmaşık hücresel etkileşimlerin, tek tek hücre tiplerinin eş-kültürüyle in vitro yeniden yapılandırılması zordur, ancak kalp bölümlerinin organotipik doğası kullanılarak kolayca elde edilebilir.
Kardiyomiyositlerin mekanik gerilmesi ve elektriksel stimülasyonu, kardiyak fenotipin korunması için kritik öneme sahiptir33,34,35. Mekanik stimülasyon hiPSC-CM koşullandırma ve olgunlaşması için yaygın olarak kullanılsa da, son zamanlarda birkaç zarif çalışma, tek eksenli yükleme kullanılarak kültürde kalp dilimlerinin mekanik stimülasyonunu denedi. Bu çalışmalar, 2D tek eksenli mekanik yüklemenin kültür sırasında kalbin fenotipi üzerinde olumlu bir etkiye sahip olduğunu göstermektedir. Bu çalışmalarda, kalbin bölümleri izometrik çekme kuvvetleri17, doğrusal oksotonik yükleme18 ile yüklendi veya kardiyak döngü, kuvvet dönüştürücü geri bildirimi ve gerilim tahrikleri kullanılarak yeniden oluşturuldu. Ancak, bu yöntemler çevresel optimizasyon olmadan tek eksenli doku gerilmesini kullanır ve bu da birçok kardiyak genin baskılanması veya anormal gerilme tepkileriyle ilişkili genlerin aşırı ekspresyonu ile sonuçlanır. Burada açıklanan CTCM, döngü süresi ve fizyolojik gerilme (yüzde 25 gerilme, yüzde 40 sistol, yüzde 60 diyastol ve dakikada 72 atım) açısından doğal kardiyak döngüyü taklit eden bir 3D elektromekanik uyarı sağlar. Bu üç boyutlu mekanik uyarım tek başına doku bütünlüğünün korunması için yeterli olmasa da, doku canlılığını, fonksiyonunu ve bütünlüğünü yeterli düzeyde korumak için T3/Dex kullanılarak humoral ve mekanik uyarımın bir kombinasyonu gereklidir.
Humoral faktörler yetişkin kalp fenotipinin düzenlenmesinde önemli bir rol oynar. Bu, hücre olgunlaşmasını hızlandırmak için T3 ve Dex'in kültür ortamına eklendiği HiPS-CM çalışmalarında vurgulanmıştır. T3, amino asitlerin, şekerlerin ve kalsiyumun hücre zarları boyunca taşınmasını etkileyebilir36. Ek olarak, T3, MHC-α ekspresyonunu ve MHC-β aşağı regülasyonunu teşvik ederek, fetal CM'deki yavaş kasılan miyofibrillere kıyasla olgun kardiyomiyositlerde hızlı kasılan miyofibrillerin oluşumunu teşvik eder. Hipotiroid hastalarda T3 eksikliği, miyofibriler bantların kaybına ve ton geliştirme oranının azalmasına neden olur37. Dex, glukokortikoid reseptörleri üzerinde etki eder ve izole perfüze kalplerde miyokardiyal kontraktiliteyi artırdığı gösterilmiştir; 38 bu iyileşmenin kalsiyum birikimiyle yönlendirilen giriş (SOCE) üzerindeki etkiyle ilişkili olduğu düşünülmektedir39,40. Ek olarak, Dex reseptörlerine bağlanarak bağışıklık fonksiyonunu ve iltihabı baskılayan geniş bir hücre içi yanıta neden olur30.
Bulgularımız fiziksel mekanik stimülasyonun (MS) Ctrl ile karşılaştırıldığında genel kültür performansını iyileştirdiğini, ancak kültürde 12 gün boyunca canlılığı, yapısal bütünlüğü ve kardiyak ifadeyi korumayı başaramadığını göstermektedir. Ctrl ile karşılaştırıldığında, CTCM (MT) kültürlerine T3 ve Dex eklenmesi canlılığı iyileştirmiş ve 12 gün boyunca taze kalp dokusuyla benzer transkripsiyon profillerini, yapısal bütünlüğü ve metabolik aktiviteyi korumuştur. Ek olarak, doku gerginliğinin derecesini kontrol ederek, STCM kullanılarak hiperekstansiyon kaynaklı bir kardiyak hipertrofi modeli oluşturulmuş ve STCM sisteminin çok yönlülüğü gösterilmiştir. Kardiyak yeniden şekillenme ve fibrozisin genellikle dolaşımdaki hücreleri uygun sitokinleri ve fagositozu ve diğer yeniden şekillenme faktörlerini sağlayabilen sağlam organları içermesine rağmen, kalbin bölümlerinin stres ve travmaya yanıt olarak fibrotik süreci taklit edebileceği unutulmamalıdır. miyofibroblastlara. Bu daha önce bu kardiyak dilim modelinde değerlendirilmiştir. CTCM parametrelerinin, taşikardi, bradikardi ve mekanik dolaşım desteği (mekanik yüklenmemiş kalp) gibi birçok durumu simüle etmek için basınç/elektriksel genlik ve frekans değiştirilerek modüle edilebileceği belirtilmelidir. Bu, sistemi ilaç testi için orta düzeyde verimli hale getirir. CTCM'nin aşırı eforla indüklenen kardiyak hipertrofiyi modelleme yeteneği, bu sistemin kişiselleştirilmiş tedavi için test edilmesinin önünü açar. Sonuç olarak, mevcut çalışma, mekanik germe ve humoral uyarımın kardiyak doku kesitlerinin kültürünü korumak için kritik olduğunu göstermektedir.
Burada sunulan veriler CTCM'nin sağlam miyokard modellemesi için çok umut verici bir platform olduğunu gösterse de, bu kültür yönteminin bazı sınırlamaları vardır. CTCM kültürünün temel sınırlaması, dilimler üzerinde sürekli dinamik mekanik stresler oluşturmasıdır; bu da her döngü sırasında kardiyak dilim kasılmalarını aktif olarak izleme yeteneğini engeller. Ek olarak, kardiyak kesitlerin küçük boyutu (7 mm) nedeniyle, geleneksel kuvvet sensörleri kullanarak kültür sistemleri dışında sistolik işlevi değerlendirme yeteneği sınırlıdır. Mevcut yazıda, optik voltajı kasılma işlevinin bir göstergesi olarak değerlendirerek bu sınırlamayı kısmen aştık. Ancak, bu sınırlama daha fazla çalışma gerektirecektir ve gelecekte kalsiyum ve voltaja duyarlı boyalar kullanılarak optik haritalama gibi kültürdeki kalp dilimlerinin işlevini optik olarak izlemek için yöntemler tanıtılarak ele alınabilir. CTCM'nin bir diğer sınırlaması da çalışma modelinin fizyolojik stresi (ön yük ve son yük) manipüle etmemesidir. CTCM'de, çok büyük dokularda diyastolde (tam gerilme) ve sistolde (elektriksel uyarım sırasında kasılma uzunluğu) %25 fizyolojik gerginliği yeniden üretmek için zıt yönlerde basınç oluşturuldu. Gelecekteki CTCM tasarımlarında bu sınırlamanın, kalp dokusuna her iki taraftan yeterli basınç uygulanması ve kalbin odacıklarında oluşan basınç-hacim ilişkilerinin tam olarak uygulanmasıyla ortadan kaldırılması beklenmektedir.
Bu yazıda bildirilen aşırı gerilme kaynaklı yeniden şekillendirme, hipertrofik hipergerilme sinyallerini taklit etmekle sınırlıdır. Bu nedenle, bu model, humoral veya nöral faktörlere (bu sistemde bulunmayan) ihtiyaç duymadan gerilme kaynaklı hipertrofik sinyallemenin incelenmesine yardımcı olabilir. Örneğin, bağışıklık hücreleriyle birlikte kültürleme, dolaşan plazma humoral faktörleri ve nöronal hücrelerle birlikte kültürleme sırasında innervasyon gibi CTCM'nin çokluğunu artırmak için daha fazla çalışmaya ihtiyaç vardır. Bu, CTCM ile hastalık modelleme olasılıklarını iyileştirecektir.
Bu çalışmada on üç domuz kullanıldı. Tüm hayvan prosedürleri kurumsal yönergelere uygun olarak gerçekleştirildi ve Louisville Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanım Komitesi tarafından onaylandı. Aort arkı klemplendi ve kalp 1 L steril kardiyopleji (110 mM NaCl, 1,2 mM CaCl2, 16 mM KCl, 16 mM MgCl2, 10 mM NaHCO3, 5 U/mL heparin, pH 7,4'e kadar) ile perfüze edildi; Kalpler, genellikle 10 dakikadan az süren buz üzerinde laboratuvara taşınana kadar buzlu kardiyopleji solüsyonunda muhafaza edildi. Kalpler, genellikle 10 dakikadan az süren buz üzerinde laboratuvara taşınana kadar buzlu kardiyopleji solüsyonunda muhafaza edildi. сердца хранили в ледяном кардиоплегическом растворе до транспортировки в лабораторию на льду, что обычно занимает <10 dk. Kalpler, genellikle 10 dakikadan az süren buz üzerindeki laboratuvara nakledilene kadar buzlu kardiyopleji solüsyonunda saklandı.将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室,通常<10分钟。将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室,通常<10分钟。 Держите сердца в ледяной кардиоплегии до лаборатортировки в лаборатортировки на лабораторию на льду, обычно <10 dakika. Kalpleri buz üzerinde laboratuvara nakledene kadar buz kardiyoplejisi üzerinde tutun, genellikle <10 dk.
CTCM cihazı SolidWorks bilgisayar destekli tasarım (CAD) yazılımında geliştirilmiştir. Kültür odaları, bölücüler ve hava odaları CNC şeffaf akrilik plastikten yapılmıştır. 7 mm çapındaki destek halkası merkezde yüksek yoğunluklu polietilenden (HDPE) yapılmıştır ve altındaki ortamı kapatmak için kullanılan silikon o-ringi yerleştirmek için bir o-ring oluğuna sahiptir. İnce bir silika membran, kültür odasını ayırma plakasından ayırır. Silikon membran, 0,02 inç kalınlığındaki silikon levhadan lazerle kesilmiştir ve 35A sertliğine sahiptir. Alt ve üst silikon contalar, 1/16 inç kalınlığındaki silikon levhadan lazerle kesilmiştir ve 50A sertliğine sahiptir. Bloğu sabitlemek ve hava geçirmez bir conta oluşturmak için 316L paslanmaz çelik vidalar ve kanatlı somunlar kullanılır.
C-PACE-EM sistemiyle entegre olacak şekilde özel bir baskılı devre kartı (PCB) tasarlanmıştır. PCB üzerindeki İsviçre makinesi konnektör soketleri, gümüş kaplamalı bakır teller ve elektrotlara vidalanmış bronz 0-60 vidalarla grafit elektrotlara bağlanır. Baskılı devre kartı 3D yazıcının kapağına yerleştirilir.
CTCM cihazı, kardiyak döngüye benzer şekilde kontrollü bir dolaşım basıncı oluşturan programlanabilir pnömatik aktüatör (PPD) tarafından kontrol edilir. Hava odasının içindeki basınç arttıkça, esnek silikon membran yukarı doğru genişler ve doku bölgesinin altındaki ortamı zorlar. Doku alanı daha sonra bu sıvı atılımıyla gerilir ve diyastol sırasında kalbin fizyolojik genişlemesini taklit eder. Gevşemenin zirvesinde, hava odasındaki basıncı azaltan ve doku bölümlerinin büzülmesine neden olan grafit elektrotlar aracılığıyla elektriksel uyarım uygulandı. Borunun içinde, hava sistemindeki basıncı algılamak için bir basınç sensörlü hemostatik bir valf bulunur. Basınç sensörü tarafından algılanan basınç, dizüstü bilgisayara bağlı bir veri toplayıcıya uygulanır. Bu, gaz odasının içindeki basıncın sürekli izlenmesini sağlar. Maksimum oda basıncına ulaşıldığında (standart 80 mmHg, 140 mmHg OS), veri toplama cihazına C-PACE-EM sistemine 2 ms boyunca 4 V'a ayarlanmış iki fazlı bir voltaj sinyali üretmesi için bir sinyal göndermesi emredildi.
Kalp kesitleri alındı ​​ve 6 kuyudaki kültür koşulları şu şekilde gerçekleştirildi: Hasat edilen kalpleri transfer kabından soğuk (4 ° C.) kardiyopleji içeren bir tepsiye aktarın. Sol ventrikül steril bir bıçakla izole edildi ve 1-2 cm3'lük parçalara kesildi. Bu doku blokları doku yapıştırıcısı ile doku desteklerine tutturuldu ve Tyrode solüsyonu içeren ve sürekli oksijenlenmiş (3 g/L 2,3-bütandion monooksim (BDM), 140 mM NaCl (8.18 g) . ), 6 mM KCl (0.447 g), 10 mM D-glikoz (1.86 g), 10 mM HEPES (2.38 g), 1 mM MgCl2 (1 ml 1 M solüsyon), 1.8 mM CaCl2 ( 1.8 ml 1 M solüsyon), 1 L ddH2O'ya kadar) titreşimli bir mikrotom doku banyosuna yerleştirildi. Titreşimli mikrotom, 80 Hz frekansta, 2 mm yatay titreşim genliğinde ve 0,03 mm/s ilerleme hızında 300 µm kalınlığında dilimler kesecek şekilde ayarlandı. Çözeltiyi soğuk tutmak için doku banyosu buzla çevrildi ve sıcaklık 4°C'de tutuldu. Doku kesitlerini mikrotom banyosundan buz üzerinde sürekli oksijenlenmiş Tyrode çözeltisi içeren bir inkübasyon banyosuna, bir kültür plakası için yeterli kesit elde edilene kadar aktarın. Transwell kültürleri için, doku kesitleri steril 6 mm genişliğinde poliüretan desteklere tutturuldu ve 6 ml optimize edilmiş ortama (199 ortam, 1x ITS takviyesi, %10 FBS, 5 ng/ml VEGF, 10 ng/ml FGF-alkali ve 2X antibiyotik-antifungal) yerleştirildi. Doku kesitlerine C-Pace aracılığıyla elektriksel uyarım (10 V, frekans 1,2 Hz) uygulandı. TD koşulları için, her ortam değişiminde 100 nM ve 1 μM'de taze T3 ve Dex eklendi. Ortam, günde 3 kez değiştirilmeden önce oksijenle doyurulur. Doku kesitleri 37°C ve %5 CO2'de bir inkübatörde kültüre edildi.
CTCM kültürleri için doku kesitleri, modifiye edilmiş Tyrode solüsyonu içeren bir Petri kabında özel yapım bir 3D yazıcıya yerleştirildi. Cihaz, kalp diliminin boyutunu destek halkasının alanının %25'i kadar artırmak için tasarlanmıştır. Bu, kalbin kesitlerinin Tyrode solüsyonundan ortama aktarıldıktan sonra ve diyastol sırasında gerilmemesi için yapılır. Histoakrilik yapıştırıcı kullanılarak, 300 µm kalınlığındaki kesitler, 7 mm çapındaki bir destek halkasına sabitlendi. Doku kesitlerini destek halkasına bağladıktan sonra, fazla doku kesitlerini kesin ve bağlı doku kesitlerini, bir cihaz için yeterli kesit hazırlanana kadar buz üzerindeki Tyrode solüsyonu banyosuna (4 ° C) geri koyun. Tüm cihazlar için toplam işlem süresi 2 saati geçmemelidir. 6 doku kesiti destek halkalarına bağlandıktan sonra, CTCM cihazı monte edildi. CTCM kültür odası, 21 ml önceden oksijenlenmiş ortamla önceden doldurulur. Doku kesitlerini kültür odasına aktarın ve pipetle hava kabarcıklarını dikkatlice çıkarın. Daha sonra doku kesiti deliğe yönlendirilir ve yavaşça yerine bastırılır. Son olarak, elektrot kapağını cihaza yerleştirin ve cihazı inkübatöre aktarın. Daha sonra CTCM'yi hava tüpüne ve C-PACE-EM sistemine bağlayın. Pnömatik aktüatör açılır ve hava valfi CTCM'yi açar. C-PACE-EM sistemi, 2 ms boyunca bifazik hızlandırma sırasında 1,2 Hz'de 4 V verecek şekilde yapılandırılmıştır. Ortam günde iki kez değiştirildi ve elektrotlar, elektrotlarda grafit birikmesini önlemek için günde bir kez değiştirildi. Gerekirse, doku kesitleri altlarına düşmüş olabilecek hava kabarcıklarını çıkarmak için kültür kuyularından çıkarılabilir. MT tedavi koşulları için, her ortam değişiminde 100 nM T3 ve 1 μM Dex ile T3/Dex taze olarak eklendi. CTCM cihazları 37°C ve %5 CO2'li bir inkübatörde kültürlendi.
Kalp dilimlerinin uzatılmış yörüngelerini elde etmek için özel bir kamera sistemi geliştirildi. Bir SLR kamera (Canon Rebel T7i, Canon, Tokyo, Japonya) bir Navitar Zoom 7000 18-108mm makro lens (Navitar, San Francisco, CA) ile kullanıldı. Görselleştirme, ortam taze ortamla değiştirildikten sonra oda sıcaklığında gerçekleştirildi. Kamera 51° açıyla konumlandırıldı ve video saniyede 30 kare hızında kaydedildi. İlk olarak, kalp dilimlerinin hareketini ölçmek için Image-J ile açık kaynaklı yazılım (MUSCLEMOTION43) kullanıldı. Gürültüyü önlemek için atan kalp dilimleri için ilgi bölgelerini tanımlamak amacıyla maske MATLAB (MathWorks, Natick, MA, ABD) kullanılarak oluşturuldu. Manuel olarak segmentlere ayrılmış maskeler bir kare dizisindeki tüm görüntülere uygulandı ve ardından MUSCLEMOTION eklentisine geçirildi. Muscle Motion, her karedeki piksellerin ortalama yoğunluğunu kullanarak referans kareye göre hareketini ölçer. Veriler kaydedildi, filtrelendi ve döngü süresini ölçmek ve kardiyak döngü sırasında doku gerginliğini değerlendirmek için kullanıldı. Kaydedilen video birinci dereceden sıfır fazlı bir dijital filtre kullanılarak son işleme tabi tutuldu. Doku gerginliğini ölçmek için (tepeden tepeye), kaydedilen sinyaldeki tepeler ve çukurlar arasında ayrım yapmak için tepeden tepeye analiz gerçekleştirildi. Ek olarak, sinyal kaymasını ortadan kaldırmak için 6. dereceden bir polinom kullanılarak eğilim giderme gerçekleştirildi. Program kodu, küresel doku hareketini, döngü süresini, gevşeme süresini ve kasılma süresini belirlemek için MATLAB'da geliştirildi (Ek Program Kodu 44).
Gerilim analizi için, mekanik gerilim değerlendirmesi için oluşturulan aynı videoları kullanarak, önce MUSCLEMOTION yazılımına göre hareket zirvelerini (hareketin en yüksek (üst) ve en düşük (alt) noktaları) temsil eden iki görüntüyü izledik. Daha sonra doku bölgelerini parçalara ayırdık ve parçalara ayrılmış dokuya bir gölgeleme algoritması biçimi uyguladık (Ek Şekil 2a). Parçalanmış doku daha sonra on alt yüzeye bölündü ve her yüzeydeki gerilim aşağıdaki denklem kullanılarak hesaplandı: Gerilim = (Sup-Sdown)/Sdown, burada Sup ve Sdown, şeklin kumaşın üst ve alt gölgelerinden olan uzaklıklarıdır (Ek Şekil .2b).
Kalp kesitleri 48 saat boyunca %4 paraformaldehitte sabitlendi. Sabitlenen dokular 1 saat boyunca %10 ve %20 sakarozda, ardından bir gece boyunca %30 sakarozda dehidrate edildi. Kesitler daha sonra optimum kesme sıcaklığı bileşiğine (OCT bileşiği) gömüldü ve kademeli olarak bir izopentan/kuru buz banyosunda donduruldu. OCT gömme bloklarını ayrılana kadar -80 °C'de saklayın. Slaytlar 8 μm kalınlığında kesitler olarak hazırlandı.
Kalp kesitlerinden OCT'yi çıkarmak için, slaytları 95 °C'de 5 dakika boyunca bir ısıtma bloğunda ısıtın. Her bir slayta 1 ml PBS ekleyin ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin, ardından PBS'de %0,1 Triton-X'i 15 dakika boyunca oda sıcaklığında ayarlayarak kesitleri geçirin. Spesifik olmayan antikorların numuneye bağlanmasını önlemek için, slaytlara %3'lük BSA solüsyonundan 1 ml ekleyin ve oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin. Daha sonra BSA çıkarıldı ve slaytlar PBS ile yıkandı. Her bir numuneyi bir kalemle işaretleyin. Birincil antikorlar (%1 BSA'da 1:200 oranında seyreltilmiş) (konneksin 43 (Abcam; #AB11370), NFATC4 (Abcam; #AB99431) ve troponin-T (Thermo Scientific; #MA5-12960) 90 dakika boyunca eklendi, ardından fare Alexa Fluor 488'e (Thermo Scientific; #A16079) karşı ikincil antikorlar (%1 BSA'da 1:200 oranında seyreltilmiş), tavşan Alexa Fluor 594'e (Thermo Scientific; #T6391) karşı ek 90 dakika boyunca eklendi. PBS ile 3 kez yıkandı. Hedef boyamayı arka plandan ayırt etmek için kontrol olarak yalnızca ikincil antikoru kullandık. Son olarak, DAPI nükleer boyası eklendi ve slaytlar bir vectashield'e (Vector Laboratories) yerleştirildi ve tırnak cilasıyla kapatıldı. -x büyütme) ve 40x büyütmeli Keyence mikroskobu.
PBS'de 5 μg/ml'de WGA-Alexa Fluor 555 (Thermo Scientific; #W32464) WGA boyama için kullanıldı ve oda sıcaklığında 30 dakika boyunca sabitlenmiş kesitlere uygulandı. Daha sonra slaytlar PBS ile yıkandı ve her slayta Sudan black eklendi ve 30 dakika inkübe edildi. Daha sonra slaytlar PBS ile yıkandı ve vectashield gömme ortamı eklendi. Slaytlar bir Keyence mikroskobunda 40x büyütmede görüntülendi.
OCT, yukarıda açıklandığı gibi örneklerden çıkarıldı. OCT'yi çıkardıktan sonra, slaytları bir gece boyunca Bouin solüsyonuna daldırın. Slaytlar daha sonra 1 saat boyunca damıtılmış suyla durulandı ve ardından 10 dakika boyunca bir Bibrich aloe asit fuksin solüsyonuna yerleştirildi. Daha sonra slaytlar damıtılmış suyla yıkandı ve 10 dakika boyunca %5 fosfomolibden/%5 fosfotungstik asit solüsyonuna yerleştirildi. Durulamadan, slaytları doğrudan 15 dakika boyunca anilin mavisi solüsyonuna aktarın. Daha sonra slaytlar damıtılmış suyla yıkandı ve 2 dakika boyunca %1 asetik asit solüsyonuna yerleştirildi. Slaytlar 200 N etanolde kurutuldu ve ksilene aktarıldı. Boyalı slaytlar 10x objektifli bir Keyence mikroskobu kullanılarak görüntülendi. Fibrozis alan yüzdesi, Keyence Analyzer yazılımı kullanılarak ölçüldü.
CyQUANT™ MTT Hücre Canlılık Testi (Invitrogen, Carlsbad, CA), katalog numarası V13154, üreticinin protokolüne göre bazı değişikliklerle. Özellikle, MTT analizi sırasında tekdüze doku boyutunu sağlamak için 6 mm çapında bir cerrahi delgeç kullanıldı. Dokular, üreticinin protokolüne göre MTT substratı içeren 12 kuyulu bir plakanın kuyularına ayrı ayrı yerleştirildi. Kesitler 37° C'de 3 saat inkübe edilir ve canlı doku, MTT substratını metabolize ederek mor bir formazan bileşiği oluşturur. MTT solüsyonunu 1 ml DMSO ile değiştirin ve kalp kesitlerinden mor formazanı çıkarmak için 37° C'de 15 dakika inkübe edin. Örnekler 96 kuyulu şeffaf tabanlı plakalarda DMSO'da 1:10 oranında seyreltildi ve mor renk yoğunluğu bir Cytation plaka okuyucusu (BioTek) kullanılarak 570 nm'de ölçüldü. Okumalar, kalbin her bir diliminin ağırlığına göre normalleştirildi.
Kalp dilimi ortamı, daha önce açıklandığı gibi glikoz kullanım testi için 1 μCi/ml [5-3H]-glikoz (Moravek Biochemicals, Brea, CA, ABD) içeren ortamla değiştirildi. 4 saatlik inkübasyondan sonra, 100 µl 0,2 N HCl içeren açık bir mikro santrifüj tüpüne 100 µl ortam ekleyin. Daha sonra tüp, 37°C'de 72 saat boyunca [3H]2O'yu buharlaştırmak için 500 µl dH2O içeren bir sintilasyon tüpüne yerleştirildi. Daha sonra mikro santrifüj tüpünü sintilasyon tüpünden çıkarın ve 10 ml sintilasyon sıvısı ekleyin. Sintilasyon sayımları bir Tri-Carb 2900TR sıvı sintilasyon analizörü (Packard Bioscience Company, Meriden, CT, ABD) kullanılarak gerçekleştirildi. Daha sonra glikoz kullanımı [5-3H]-glikoz özgül aktivitesi, eksik denge ve arka plan, [5-3H]-etiketlenmemiş glikozun seyreltilmesi ve sintilasyon sayacı verimliliği dikkate alınarak hesaplandı. Veriler kalbin bölümlerinin kütlesine göre normalize edildi.
Trizol'de doku homojenizasyonundan sonra, RNA, üreticinin protokolüne göre Qiagen miRNeasy Micro Kit #210874 kullanılarak kalp kesitlerinden izole edildi. RNAsec kütüphanesinin hazırlanması, dizilenmesi ve veri analizi aşağıdaki şekilde gerçekleştirildi:
Örnek başına 1 μg RNA, RNA kütüphanesinin hazırlanması için başlangıç ​​materyali olarak kullanıldı. Dizileme kütüphaneleri, üreticinin önerileri doğrultusunda Illumina için NEBNext UltraTM RNA Kütüphane Hazırlama Kiti (NEB, ABD) kullanılarak oluşturuldu ve her örnek için nitelik dizilerine endeks kodları eklendi. Kısaca, mRNA, poli-T oligonükleotidlerle tutturulmuş manyetik boncuklar kullanılarak toplam RNA'dan saflaştırıldı. Parçalanma, NEBNext Birinci Zincir Sentez Reaksiyon Tamponu'nda (5X) yüksek sıcaklıkta iki değerlikli katyonlar kullanılarak gerçekleştirilir. Birinci zincir cDNA'sı, rastgele hekzamer primerleri ve M-MuLV ters transkriptaz (RNase H-) kullanılarak sentezlendi. İkinci zincir cDNA'sı daha sonra DNA polimeraz I ve RNase H kullanılarak sentezlenir. Geriye kalan çıkıntılar, ekzonükleaz/polimeraz aktivitesi ile kör uçlara dönüştürülür. DNA parçasının 3' ucunun adenilasyonu sonrasında, hibridizasyona hazırlamak için saç tokası halka yapısına sahip bir NEBNext Adaptörü eklenir. Tercih edilen uzunluk 150-200 bp olan cDNA parçalarının seçimi için, kütüphane parçaları AMPure XP sistemi (Beckman Coulter, Beverly, ABD) kullanılarak saflaştırıldı. Daha sonra, adaptörle bağlanmış boyuta göre seçilmiş cDNA içeren 3 μl USER Enzimi (NEB, ABD) 37°C'de 15 dakika ve ardından PCR'den önce 95°C'de 5 dakika kullanıldı. Daha sonra PCR, Phusion Yüksek Sadakatli DNA polimeraz, evrensel PCR primerleri ve İndeks (X) primerleri kullanılarak gerçekleştirildi. Son olarak, PCR ürünleri saflaştırıldı (AMPure XP sistemi) ve kütüphane kalitesi bir Agilent Bioanalyzer 2100 sisteminde değerlendirildi. Daha sonra cDNA kütüphanesi bir Novaseq sekanslayıcı kullanılarak dizilendi. Illumina'dan gelen ham görüntü dosyaları, CASAVA Base Calling kullanılarak ham okumalara dönüştürüldü. Ham veriler, okuma dizilerini ve karşılık gelen baz niteliklerini içeren FASTQ(fq) biçimli dosyalarda saklanır. Filtrelenmiş dizileme okumalarını Sscrofa11.1 referans genomuyla eşleştirmek için HISAT2'yi seçin. Genel olarak, HISAT2 4 milyar bazdan daha büyük genomlar dahil olmak üzere her boyuttaki genomu destekler ve çoğu parametre için varsayılan değerler ayarlanır. RNA Seq verilerinden gelen ekleme okumaları, şu anda mevcut olan en hızlı sistem olan HISAT2 kullanılarak, diğer herhangi bir yöntemden aynı veya daha iyi doğrulukla verimli bir şekilde hizalanabilir.
Transkriptlerin bolluğu doğrudan gen ifadesinin seviyesini yansıtır. Gen ifadesi seviyeleri, genom veya ekzonlarla ilişkili transkriptlerin bolluğu (dizileme sayısı) ile değerlendirilir. Okuma sayısı, gen ifadesi seviyeleri, gen uzunluğu ve dizileme derinliği ile orantılıdır. FPKM (milyon baz çifti başına dizilenen transkriptin bin baz çifti başına fragmanları) hesaplandı ve DESeq2 paketi kullanılarak diferansiyel ifadenin P değerleri belirlendi. Daha sonra, yerleşik R fonksiyonu “p.adjust”a dayalı Benjamini-Hochberg yöntemi9 kullanılarak her P değeri için yanlış keşif oranını (FDR) hesapladık.
Kalp kesitlerinden izole edilen RNA, Thermo'dan SuperScript IV Vilo Master karışımı (Thermo, kat. no. 11756050) kullanılarak 200 ng/μl konsantrasyonda cDNA'ya dönüştürüldü. Kantitatif RT-PCR, Applied Biosystems Endura Plate Microamp 384-kuyulu şeffaf reaksiyon plakası (Thermo, kat. no. 4483319) ve microamp optik yapıştırıcı (Thermo, kat. no. 4311971) kullanılarak gerçekleştirildi. Reaksiyon karışımı, 5 µl Taqman Fast Advanced Master karışımı (Thermo, kat. no. 4444557), 0,5 µl Taqman Primer ve kuyu başına karıştırılmış 3,5 µl H2O'dan oluşuyordu. Standart qPCR döngüleri çalıştırıldı ve CT değerleri Applied Biosystems Quantstudio 5 gerçek zamanlı PCR cihazı (384-kuyulu modül; ürün # A28135) kullanılarak ölçüldü. Taqman primerleri Thermo firmasından satın alındı ​​(GAPDH (Ss03375629_u1), PARP12 (Ss06908795_m1), PKDCC (Ss06903874_m1), CYGB (Ss06900188_m1), RGL1 (Ss06868890_m1), ACTN1 (Ss01009508_mH), GATA4 (Ss03383805_u1), GJA1 (Ss03374839_u1), COL1A2 (Ss03375009_u1), COL3A1 (Ss04323794_m1), ACTA2 (Ss04245588_m1). Tüm örneklerin CT değerleri housekeeping gen GAPDH'ye göre normalize edildi.
NT-ProBNP'nin medya salınımı, üreticinin protokolüne göre NT-ProBNP kiti (domuz) (Kat. No. MBS2086979, MyBioSource) kullanılarak değerlendirildi. Kısaca, her bir kuyuya her numuneden ve standarttan 250 µl iki kez eklendi. Numune eklendikten hemen sonra, her bir kuyuya 50 µl Assay Reagent A ekleyin. Plakayı hafifçe çalkalayın ve sızdırmazlık maddesiyle kapatın. Daha sonra tabletler 37°C'de 1 saat inkübe edildi. Daha sonra çözeltiyi aspire edin ve kuyuları 350 µl 1X yıkama çözeltisiyle 4 kez yıkayın, her seferinde yıkama çözeltisini 1-2 dakika inkübe edin. Daha sonra kuyu başına 100 µl Assay Reagent B ekleyin ve plaka sızdırmazlık maddesiyle kapatın. Tablet hafifçe çalkalandı ve 37°C'de 30 dakika inkübe edildi. Çözeltiyi aspire edin ve kuyuları 350 µl 1X yıkama solüsyonuyla 5 kez yıkayın. Her kuyuya 90 µl substrat solüsyonu ekleyin ve plakayı kapatın. Plakayı 37°C'de 10-20 dakika inkübe edin. Her kuyuya 50 µl Durdurma Solüsyonu ekleyin. Plaka hemen 450 nm'ye ayarlanmış bir Cytation (BioTek) plaka okuyucusu kullanılarak ölçüldü.
Parametredeki %10'luk mutlak değişimi %5 Tip I hata oranıyla tespit etmek için >%80 güç sağlayacak grup büyüklüklerini seçmek amacıyla güç analizleri yapıldı. Parametredeki %10'luk mutlak değişimi %5 Tip I hata oranıyla tespit etmek için >%80 güç sağlayacak grup büyüklüklerini seçmek amacıyla güç analizleri yapıldı. Анализ мощности был выполнен для выбора размеров групп, которые обеспечат >80% мощности обнаружения % 10'luk alkolsüz parametre ve %5'lik zehirli bitki türü I. %10 mutlak parametre değişimini %5 Tip I hata oranıyla tespit etmek için >%80 güç sağlayacak grup büyüklüklerini seçmek amacıyla güç analizi yapıldı.Daha Fazla Bilgi> 80%功效以检测参数中10%绝对变化和5%I型错误率的组大小。Daha Fazla Bilgi> 80%功效以检测参数中10%绝对变化和5%I型错误率的组大小。 Был проведен анализ мощности для выбора размера группы, который обеспечил бы > 80% мощности для обнаружения 10% абсолютного изменения параметров и 5% частоты ошибок типа I. %10 mutlak parametre değişimini ve %5 tip I hata oranını tespit etmek için >%80 güç sağlayacak bir grup büyüklüğü seçmek amacıyla bir güç analizi yapıldı.Deneyden önce doku kesitleri rastgele seçildi. Tüm analizler koşula bağlı değildi ve örnekler yalnızca tüm veriler analiz edildikten sonra kodlandı. Tüm istatistiksel analizleri gerçekleştirmek için GraphPad Prism yazılımı (San Diego, CA) kullanıldı. Tüm istatistikler için p değerleri 0,05'ten küçük değerlerde anlamlı kabul edildi. Tüm istatistikler için p-değerleri 0,05'ten küçük değerlerde anlamlı kabul edildi. Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. Tüm istatistikler için p-değerleri 0,05'ten küçük değerlerde anlamlı kabul edildi.对于所有统计数据,p 值在值<0.05 时被认为是显着的。对于所有统计数据,p 值在值<0.05 时被认为是显着的。 Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. Tüm istatistikler için p-değerleri 0,05'ten küçük değerlerde anlamlı kabul edildi.Verilerde yalnızca 2 karşılaştırma ile iki kuyruklu Student t-testi uygulandı. Birden fazla grup arasındaki önemi belirlemek için tek yönlü veya iki yönlü ANOVA kullanıldı. Post hoc testleri gerçekleştirirken, birden fazla karşılaştırmayı hesaba katmak için Tukey düzeltmesi uygulandı. RNAsec verileri, Yöntemler bölümünde açıklandığı gibi FDR ve p.adjust hesaplanırken özel istatistiksel hususlara sahiptir.
Çalışma tasarımı hakkında daha fazla bilgi için bu makaleye bağlantısı verilen Nature Research Report özetine bakın.