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Il est nécessaire de disposer d'un système in vitro fiable capable de reproduire fidèlement l'environnement physiologique du cœur pour les essais de médicaments. La disponibilité limitée des systèmes de culture de tissu cardiaque humain a conduit à des interprétations erronées des effets des médicaments sur le cœur. Nous avons développé un modèle de culture de tissu cardiaque (MCTC) qui stimule électromécaniquement des tranches de cœur et les soumet à un étirement physiologique durant les phases systolique et diastolique du cycle cardiaque. Après 12 jours de culture, cette approche a partiellement amélioré la viabilité des tranches de cœur, sans toutefois préserver pleinement leur intégrité structurale. Par conséquent, après un criblage de petites molécules, nous avons constaté que l'ajout de 100 nM de triiodothyronine (T3) et de 1 μM de dexaméthasone (Dex) à notre milieu permettait de maintenir la microstructure des tranches pendant 12 jours. Associé au traitement T3/Dex, le système MCTC a maintenu les profils transcriptionnels, la viabilité, l'activité métabolique et l'intégrité structurale au même niveau que le tissu cardiaque frais pendant 12 jours. De plus, l'étirement excessif du tissu cardiaque en culture induit une signalisation hypertrophique, démontrant ainsi la capacité du modèle CTCM à reproduire les conditions hypertrophiques induites par l'étirement cardiaque. En conclusion, le modèle CTCM permet de modéliser la physiologie et la physiopathologie du cœur en culture sur de longues périodes, rendant possible un criblage de médicaments fiable.
Avant toute recherche clinique, il est nécessaire de disposer de systèmes in vitro fiables capables de reproduire fidèlement l'environnement physiologique du cœur humain. Ces systèmes doivent imiter les variations d'étirement mécanique, de fréquence cardiaque et de propriétés électrophysiologiques. Les modèles animaux sont couramment utilisés comme plateforme de criblage pour l'étude de la physiologie cardiaque, mais leur fiabilité pour refléter les effets des médicaments sur le cœur humain reste limitée^1,2. Idéalement, le modèle expérimental de culture de tissu cardiaque (CTCM) serait un modèle hautement sensible et spécifique pour diverses interventions thérapeutiques et pharmacologiques, reproduisant fidèlement la physiologie et la physiopathologie du cœur humain³. L'absence d'un tel système limite la découverte de nouveaux traitements pour l'insuffisance cardiaque^4,5 et a fait de la cardiotoxicité des médicaments une cause majeure de leur retrait du marché⁶.
Au cours de la dernière décennie, huit médicaments non cardiovasculaires ont été retirés du marché car ils provoquent un allongement de l'intervalle QT, pouvant entraîner des arythmies ventriculaires et une mort subite⁷. Il existe donc un besoin croissant de stratégies de criblage préclinique fiables pour évaluer l'efficacité et la toxicité cardiovasculaires. L'utilisation récente de cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes induites humaines (hiPS-CM) dans le criblage de médicaments et les tests de toxicité apporte une solution partielle à ce problème. Cependant, l'immaturité des hiPS-CM et l'absence de complexité multicellulaire du tissu cardiaque constituent des limitations majeures de cette méthode. Des études récentes ont montré que cette limitation peut être partiellement surmontée en utilisant des hiPS-CM précoces pour former des hydrogels de tissu cardiaque peu après le début des contractions spontanées, puis en augmentant progressivement la stimulation électrique au fil du temps. Toutefois, ces microtissus de hiPS-CM ne possèdent pas les propriétés électrophysiologiques et contractiles matures du myocarde adulte. De plus, le tissu cardiaque humain présente une structure plus complexe, constituée d'un mélange hétérogène de différents types cellulaires, notamment des cellules endothéliales, des neurones et des fibroblastes stromaux, interconnectés par des ensembles spécifiques de protéines de la matrice extracellulaire. Cette hétérogénéité des populations non cardiomyocytaires^11,12,13 dans le cœur adulte des mammifères constitue un obstacle majeur à la modélisation du tissu cardiaque à partir de types cellulaires individuels. Ces limitations importantes soulignent l'importance de développer des méthodes de culture de tissu myocardique intact dans des conditions physiologiques et pathologiques.
Des coupes minces (300 µm) de cœur humain cultivées se sont révélées être un modèle prometteur de myocarde humain intact. Cette méthode permet d'accéder à un système multicellulaire 3D complet, similaire au tissu cardiaque humain. Cependant, jusqu'en 2019, l'utilisation de ces coupes était limitée par leur courte durée de vie (24 h). Ceci est dû à plusieurs facteurs, notamment l'absence d'étirement physico-mécanique, l'interface air-liquide et l'utilisation de milieux de culture simples, inadaptés aux besoins du tissu cardiaque. En 2019, plusieurs équipes de recherche ont démontré que l'intégration de facteurs mécaniques dans les systèmes de culture de tissu cardiaque permet d'allonger la durée de culture, d'améliorer l'expression cardiaque et de reproduire la pathologie cardiaque. Deux études remarquables^17,18 montrent qu'une charge mécanique uniaxiale a un effet positif sur le phénotype cardiaque en culture. Toutefois, ces études n'ont pas exploité la dynamique tridimensionnelle des charges physico-mécaniques du cycle cardiaque, les coupes de cœur étant soumises soit à des forces de traction isométriques¹⁷, soit à une charge auxotonique linéaire¹⁸. Ces méthodes d'étirement tissulaire ont entraîné la suppression de nombreux gènes cardiaques ou la surexpression de gènes associés à des réponses anormales à l'étirement. Notamment, Pitoulis et al.¹⁹ ont mis au point un bain de culture dynamique pour tranches de cœur permettant la reconstruction du cycle cardiaque grâce à un système de rétroaction par transducteur de force et à des dispositifs de tension. Bien que ce système permette une modélisation in vitro plus précise du cycle cardiaque, sa complexité et son faible débit en limitent l'application. Notre laboratoire a récemment développé un système de culture simplifié utilisant une stimulation électrique et un milieu optimisé pour maintenir la viabilité de sections de tissu cardiaque porcin et humain pendant une durée allant jusqu'à 6 jours^20,21.
Dans le présent manuscrit, nous décrivons un modèle de culture de tissu cardiaque (MCTC) utilisant des sections de cœur porcin et intégrant des signaux humoraux afin de reproduire la physiologie cardiaque tridimensionnelle et la distension physiopathologique au cours du cycle cardiaque. Ce MCTC permet d'accroître la précision des prédictions précliniques de médicaments à un niveau inédit, grâce à un système cardiaque économique à débit moyen qui imite la physiologie et la physiopathologie du cœur de mammifère pour les essais précliniques de médicaments.
Les signaux hémodynamiques mécaniques jouent un rôle crucial dans le maintien de la fonction des cardiomyocytes in vitro^22,23,24. Dans le présent manuscrit, nous avons développé un modèle de culture tissulaire (CTCM) (Figure 1a) capable de reproduire l'environnement cardiaque adulte en induisant une stimulation électrique et mécanique à des fréquences physiologiques (1,2 Hz, 72 battements par minute). Afin d'éviter un étirement tissulaire excessif pendant la diastole, un dispositif d'impression 3D a été utilisé pour augmenter la taille du tissu de 25 % (Figure 1b). La stimulation électrique induite par le système C-PACE a été synchronisée pour débuter 100 ms avant la systole, grâce à un système d'acquisition de données permettant de reproduire fidèlement le cycle cardiaque. Le système de culture tissulaire utilise un actionneur pneumatique programmable (LB Engineering, Allemagne) pour dilater cycliquement une membrane flexible en silicone, provoquant ainsi l'expansion des tranches de cœur dans la chambre supérieure. Le système était relié à une conduite d'air externe par un transducteur de pression, ce qui a permis d'ajuster précisément la pression (± 1 mmHg) et le temps (± 1 ms) (Figure 1c).
a) Fixez le fragment de tissu à l'anneau de support de 7 mm (en bleu) à l'intérieur de la chambre de culture du dispositif. La chambre de culture est séparée de la chambre à air par une fine membrane flexible en silicone. Placez un joint entre les deux chambres pour éviter les fuites. Le couvercle du dispositif contient des électrodes en graphite qui assurent la stimulation électrique. b) Représentation schématique du dispositif pour tissus de grande taille, de l'anneau de guidage et de l'anneau de support. Les fragments de tissu (en marron) sont placés sur le dispositif surdimensionné, l'anneau de guidage étant positionné dans la rainure située sur le bord extérieur du dispositif. À l'aide du guide, placez délicatement l'anneau de support, enduit d'adhésif acrylique pour tissus, sur le fragment de tissu cardiaque. c) Graphique montrant la durée de la stimulation électrique en fonction de la pression dans la chambre à air, contrôlée par un actionneur pneumatique programmable (PPD). Un système d'acquisition de données a été utilisé pour synchroniser la stimulation électrique à l'aide de capteurs de pression. Lorsque la pression dans la chambre de culture atteint le seuil défini, un signal d'impulsion est envoyé au C-PACE-EM pour déclencher la stimulation électrique. d) Image de quatre CTCM placés sur une étagère d'incubateur. Quatre dispositifs sont reliés à un PPD par un circuit pneumatique, et des capteurs de pression sont insérés dans la valve hémostatique pour surveiller la pression dans le circuit pneumatique. Chaque dispositif contient six sections de tissu.
À l'aide d'un seul actionneur pneumatique, nous avons pu contrôler quatre dispositifs CTCM, chacun pouvant contenir six coupes de tissu (Fig. 1d). Dans le CTCM, la pression de l'air dans la chambre à air est convertie en une pression synchrone dans la chambre à fluide, induisant une expansion physiologique de la tranche de cœur (Figure 2a et Vidéo supplémentaire 1). L'évaluation de l'étirement tissulaire à 80 mmHg a montré un étirement des coupes de tissu de 25 % (Fig. 2b). Ce pourcentage d'étirement correspond à une longueur physiologique de sarcomère de 2,2 à 2,3 µm pour une contractilité cardiaque normale^17,19,25. Le mouvement tissulaire a été évalué à l'aide de paramètres de caméra personnalisés (Figure supplémentaire 1). L'amplitude et la vitesse du mouvement tissulaire (Fig. 2c, d) correspondaient à l'étirement au cours du cycle cardiaque et au temps pendant la systole et la diastole (Fig. 2b). L'étirement et la vitesse du tissu cardiaque pendant la contraction et la relaxation sont restés constants pendant 12 jours de culture (Fig. 2f). Pour évaluer l'effet de la stimulation électrique sur la contractilité en culture, nous avons développé une méthode de détermination des déformations actives à l'aide d'un algorithme de coloration (Fig. S2a,b) et avons pu distinguer les déformations avec et sans stimulation électrique. La même section du cœur (Fig. 2f) a été étudiée. Dans la région mobile de la coupe (R6-9), la tension était 20 % plus élevée lors de la stimulation électrique qu'en son absence, ce qui indique la contribution de la stimulation électrique à la fonction contractile.
Les tracés représentatifs des mesures de pression dans la chambre à air, de pression dans la chambre à fluide et de mouvement tissulaire confirment que la pression dans la chambre à fluide modifie cette dernière, entraînant un mouvement correspondant de la tranche de tissu. b Tracés représentatifs du pourcentage d'étirement (bleu) des sections de tissu correspondant au pourcentage d'étirement (orange). c Le mouvement mesuré de la tranche cardiaque est cohérent avec la vitesse de mouvement mesurée. d) Trajectoires représentatives du mouvement cyclique (ligne bleue) et de la vitesse (ligne pointillée orange) dans une tranche de cœur. e Quantification du temps de cycle (n = 19 tranches par groupe, provenant de différents porcs), du temps de contraction (n = 19 tranches par groupe), du temps de relaxation (n = 19 tranches par groupe, provenant de différents porcs), du mouvement tissulaire (n = 25 tranches/groupe, provenant de différents porcs), de la vitesse systolique de pointe (n = 24 (J0), 25 (J12) tranches/groupe, provenant de différents porcs) et du taux de relaxation de pointe (n = 24 (J0), 25 (J12) tranches/groupe, provenant de différents porcs). Le test t de Student bilatéral n'a révélé aucune différence significative pour aucun paramètre. f Tracés représentatifs de l'analyse de déformation de coupes de tissu avec (rouge) et sans (bleu) stimulation électrique, dix zones régionales de coupes de tissu issues d'une même section. Les panneaux inférieurs montrent la quantification du pourcentage de différence de déformation dans les coupes de tissu avec et sans stimulation électrique dans dix zones issues de différentes sections. (n = 8 tranches/groupe provenant de différents porcs, un test t de Student bilatéral est effectué ; ****p < 0,0001, **p < 0,01, *p < 0,05). (n = 8 tranches/groupe provenant de différents porcs, un test t de Student bilatéral est effectué ; ****p < 0,0001, **p < 0,01, *p < 0,05). (n = 8 срезов/группу от разных свиней, проводится двусторонний t-критерий Стьюдента; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05). (n = 8 sections/groupe provenant de différents porcs, test t de Student bilatéral ; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05). （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p < 0,0001，**p < 0,01，*p < 0,05）。 （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p < 0,0001，**p < 0,01，*p < 0,05）。 (n = 8 срезов/группу, от разных свиней, двусторонний критерий Стьюдента; ****p <0,0001, **p <0,01, *p <0,05). (n = 8 sections/groupe, provenant de différents porcs, test t de Student bilatéral ; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05).Les barres d'erreur représentent la moyenne ± l'écart type.
Dans notre précédent système de culture biomimétique statique de tranches de cœur [20, 21], nous avons maintenu la viabilité, la fonction et l'intégrité structurale des tranches de cœur pendant 6 jours grâce à une stimulation électrique et à l'optimisation de la composition du milieu. Cependant, après 10 jours, ces paramètres ont chuté brutalement. Nous désignerons les sections cultivées dans notre précédent système de culture biomimétique statique [20, 21] comme conditions témoins (Ctrl) et nous utiliserons notre milieu optimisé précédemment comme conditions MC et culture sous stimulation mécanique et électrique simultanée (CTCM). Nous avons d'abord déterminé que la stimulation mécanique seule était insuffisante pour maintenir la viabilité tissulaire pendant 6 jours (Fig. S3a,b). De manière intéressante, avec l'introduction d'une stimulation physiomécanique et électrique (CTCM), la viabilité des tranches de cœur de 12 jours est restée identique à celle des tranches de cœur fraîches en conditions MS, mais pas en conditions Ctrl, comme le montre l'analyse MTT (Fig. 1a). Ceci suggère que la stimulation mécanique et la simulation du cycle cardiaque permettent de maintenir la viabilité des coupes de tissu deux fois plus longtemps que ce qui avait été observé dans notre système de culture statique précédent. Cependant, l'évaluation de l'intégrité structurale des coupes de tissu par immunomarquage de la troponine T cardiaque et de la connexine 43 a montré que l'expression de la connexine 43 était significativement plus élevée dans les tissus MC au jour 12 que dans les témoins au même jour. Néanmoins, l'expression uniforme de la connexine 43 et la formation du disque Z n'étaient pas totalement maintenues (Fig. 3b). Nous utilisons un système d'intelligence artificielle (IA) pour quantifier l'intégrité structurale des tissus²⁶, un pipeline d'apprentissage profond basé sur l'imagerie et la coloration de la troponine T et de la connexine⁴³, afin de quantifier automatiquement l'intégrité structurale et la fluorescence des tranches de cœur en termes de force de localisation. Cette méthode utilise un réseau de neurones convolutif (CNN) et un système d'apprentissage profond pour quantifier de manière fiable et automatisée l'intégrité structurale du tissu cardiaque, comme décrit dans la référence 26. Le tissu MC a présenté une similarité structurale améliorée avec le jour 0 par rapport aux coupes témoins statiques. De plus, la coloration au trichrome de Masson a révélé un pourcentage de fibrose significativement plus faible en conditions MS qu'en conditions témoins au 12e jour de culture (Fig. 3c). Bien que le CTCM ait augmenté la viabilité des coupes de tissu cardiaque au 12e jour à un niveau similaire à celui du tissu cardiaque frais, il n'a pas amélioré significativement l'intégrité structurale de ces coupes.
un graphique à barres montre la quantification de la viabilité MTT de tranches de cœur fraîches (D0) ou de tranches de cœur cultivées pendant 12 jours soit en culture statique (D12 Ctrl) soit en CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) tranches/groupe provenant de différents porcs, un test ANOVA à un facteur est effectué ; ####p < 0,0001 par rapport à D0 et **p < 0,01 par rapport à D12 Ctrl). un graphique à barres montre la quantification de la viabilité MTT de tranches de cœur fraîches (D0) ou de tranches de cœur cultivées pendant 12 jours soit en culture statique (D12 Ctrl) soit en CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) tranches/groupe provenant de différents porcs, un test ANOVA à un facteur est effectué ; ####p < 0,0001 par rapport à D0 et **p < 0,01 par rapport à D12 Ctrl).l'histogramme montre la quantification de la viabilité des sections de cœur frais MTT (D0) ou de la culture de sections de cœur pendant 12 jours en culture statique (contrôle D12) ou CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (contrôle D12). ) ), 12 (D12 MC) sections/groupe provenant de différents porcs, un test ANOVA à un facteur est effectué ;####p < 0,0001 lors de la sélection avec D0 et **p < 0,01 lors de la sélection avec D12 Ctrl). ####p < 0,0001 par rapport à D0 et **p < 0,01 par rapport à D12 Ctrl). a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切片(D0) (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；与D0相比，####p < 0,0001，与D12 Ctrl 相比，**p < 0,01)。 a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切片(D0) ，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；与D0 相比，####p < 0.0001，与D12 Ctrl 相比，**p。)histogramme montrant la quantification de la viabilité du MTT dans des sections de cœur fraîches (D0) ou des sections de cœur cultivées pendant 12 jours en culture statique (contrôle D12) ou CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (contrôle D12)), 12 (D12 MC) sections/groupe provenant de différents porcs, test ANOVA à un facteur ;####p < 0,0001 pour la sélection avec D0, **p < 0,01 pour la sélection avec D12 Ctrl). ####p < 0,0001 par rapport à D0, **p < 0,01 par rapport à D12 Ctrl).b Troponine-T (vert), connexine 43 (rouge) et DAPI (bleu) dans des sections de cœur fraîchement isolées (D0) ou des sections de cœur cultivées dans des conditions statiques (Ctrl) ou dans des conditions CTCM (MC) pendant 12 jours) d'images d'immunofluorescence représentatives (échelle blanche = 100 µm). Quantification par intelligence artificielle de l'intégrité structurelle du tissu cardiaque (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) tranches/groupe chacune provenant d'un porc différent, un test ANOVA à un facteur est effectué ; ####p < 0,0001 par rapport à D0 et ****p < 0,0001 par rapport à D12 Ctrl). Quantification par intelligence artificielle de l'intégrité structurelle du tissu cardiaque (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) tranches/groupe chacune provenant de différents porcs, un test ANOVA à un facteur est effectué ; ####p < 0,0001 par rapport à D0 et ****p < 0,0001 par rapport à D12 Ctrl). La structure de la structure de l'ouverture de session est composée d'un seul ordinateur (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) niveaux/groupe de разных свиней, проводится однофакторный test ANOVA; ####p < 0,0001 pour la sélection avec D0 et ****p < 0,0001 pour la sélection avec D12 Ctrl). Quantification de l'intégrité structurelle du tissu cardiaque par intelligence artificielle (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) sections/groupes de différents porcs, test ANOVA à un facteur effectué ; ####p < 0,0001 vs. avec D0 et ****p < 0,0001 par rapport à D12 Ctrl).人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) tranches/groupe de chacun de porcs différents, test ANOVA unidirectionnel ; ####p < 0,0001 与D0相比，****p < 0.0001 与D12 Ctrl 相比）。人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) tranches/groupe de chacun de porcs différents, test ANOVA unidirectionnel ; ####p < 0,0001与D0相比，****p < 0.0001 与D12 Ctrl 相比）。 Искусственный интеллект для количественной оценки структурной целостности сердечной ткани (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) срезов/группу каждой из разных свиней, односторонний test ANOVA; ####p <0,0001 vs. D0 Pour la sélection ****p < 0,0001 pour la sélection avec D12 Ctrl). Intelligence artificielle pour quantifier l'intégrité structurelle du tissu cardiaque (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) sections/groupe chacun de différents porcs, test ANOVA à un facteur ; ####p<0,0001 vs .D0 Pour comparaison ****p < 0,0001 par rapport à D12 Ctrl). c Images représentatives (à gauche) et quantification (à droite) pour des tranches de cœur colorées au trichrome de Masson (échelle = 500 µm) (n = 10 tranches/groupe provenant de porcs différents, un test ANOVA à un facteur est effectué ; ####p < 0,0001 par rapport à D0 et ***p < 0,001 par rapport à D12 Ctrl). c Images représentatives (à gauche) et quantification (à droite) pour des tranches de cœur colorées au trichrome de Masson (échelle = 500 µm) (n = 10 tranches/groupe provenant de différents porcs, un test ANOVA à un facteur est effectué ; #### p < 0,0001 par rapport à D0 et ***p < 0,001 par rapport à D12 Ctrl). c Représentation de la société (sleva) et de la collection d'expositions (sprezov) de la région de Massone (масштаб без покрытия = 500 мкм) (n = 10 срезов/группу от разных свиней, выполняется односторонний test ANOVA; #### p < 0,0001 по сравнению с D0 и ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Images représentatives (à gauche) et quantification (à droite) de sections de cœur colorées au trichrome de Masson (échelle non revêtue = 500 µm) (n = 10 sections/groupe provenant de différents porcs, test ANOVA à un facteur effectué ; #### p < 0,0001 par rapport à D0 et ***p < 0,001 par rapport à D12 Ctrl). c Masson = 500 µm）（n = 10个切片/组，每组来自不同的猪，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0.0001 与D0 相比，***p < 0.001 与D12 Ctrl相比）。 C Masson裸尺度 = 500 µm） （n = 10 个 切片 组 每 组 来自 不同 猪 , 进行 单向 单向 Anova 测试；#### p < 0.0001与D0 相比，***p < 0.001 与D12 Ctrl 相比）。 c Репрезентативные изображения (слева) и количественный анализ (справа) срезов сердца, окрашенных трихромным красителем Массона (чистая шкала = 500 мкм) (n = 10 срезов/группа, каждый от другой свиньи, протестировано с помощью однофакторного дисперсионного analyse ;### #p < 0,0001 po сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Images représentatives (à gauche) et quantification (à droite) de sections de cœur colorées au trichrome de Masson (blanc = 500 µm) (n = 10 sections/groupe, chacune provenant d'un porc différent, testées par analyse de variance à un facteur ;### # p < 0,0001 par rapport à D0, ***p < 0,001 par rapport à D12 Ctrl).Les barres d'erreur représentent la moyenne ± l'écart type.
Nous avons émis l'hypothèse que l'ajout de petites molécules au milieu de culture pourrait améliorer l'intégrité des cardiomyocytes et réduire le développement de la fibrose lors de la culture de cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes induites (CTCM). Nous avons donc réalisé un criblage de petites molécules à l'aide de nos cultures témoins statiques^20,21, en raison du faible nombre de facteurs de confusion. La dexaméthasone (Dex), la triiodothyronine (T3) et le SB431542 (SB) ont été sélectionnés pour ce criblage. Ces petites molécules ont déjà été utilisées dans des cultures de cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes induites (hiPSC-CM) pour induire la maturation des cardiomyocytes en augmentant la longueur des sarcomères, des tubules T et la vitesse de conduction. De plus, la Dex (un glucocorticoïde) et le SB sont connus pour leurs propriétés anti-inflammatoires^29,30. Nous avons donc testé si l'ajout d'une ou plusieurs de ces petites molécules améliorerait l'intégrité structurale des sections cardiaques. Pour le criblage initial, la dose de chaque composé a été sélectionnée en fonction des concentrations couramment utilisées dans les modèles de culture cellulaire (1 μM de Dex27, 100 nM de T327 et 2,5 μM de SB31). Après 12 jours de culture, l'association de T3 et de Dex a permis d'obtenir une intégrité structurale optimale des cardiomyocytes et un remodelage fibreux minimal (Figures supplémentaires 4 et 5). Par ailleurs, l'utilisation de concentrations deux fois supérieures ou deux fois supérieures de T3 et de Dex a induit des effets délétères par rapport aux concentrations normales (Figures supplémentaires 6a et 6b).
Après un premier tri, nous avons comparé directement quatre conditions de culture (Figure 4a) : Ctrl : sections cardiaques cultivées dans notre milieu de culture statique optimisé, comme décrit précédemment ; TD : cultures statiques avec ajout de T3 et de Dex le mercredi ; MC : sections cardiaques cultivées dans du CTCM avec notre milieu optimisé ; et MT : CTCM avec ajout de T3 et de Dex. Après 12 jours de culture, la viabilité des tissus MS et MT est restée identique à celle des tissus frais, évaluée par le test MTT (Figure 4b). Fait intéressant, l’ajout de T3 et de Dex aux cultures en transwell (TD) n’a pas entraîné d’amélioration significative de la viabilité par rapport aux conditions Ctrl, ce qui souligne le rôle important de la stimulation mécanique dans le maintien de la viabilité des sections cardiaques.
Un schéma de conception expérimentale illustrant les quatre conditions de culture utilisées pour évaluer les effets de la stimulation mécanique et de la supplémentation en T3/Dex sur le milieu pendant 12 jours. b Le graphique à barres montre la quantification de la viabilité 12 jours après la culture dans les 4 conditions de culture (Ctrl, TD, MC et MT) par rapport aux tranches de cœur fraîches (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD et D12 MT), 12 (D12 MC) tranches/groupe provenant de différents porcs, un test ANOVA à un facteur est effectué ; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 par rapport à D0 et **p < 0,01 par rapport à D12 Ctrl). b Le graphique à barres montre la quantification de la viabilité 12 jours après la culture dans les 4 conditions de culture (Ctrl, TD, MC et MT) par rapport aux tranches de cœur fraîches (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD et D12 MT), 12 (D12 MC) tranches/groupe provenant de différents porcs, un test ANOVA à un facteur est effectué ; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 par rapport à D0 et **p < 0,01 par rapport à D12 ctrl). b L'historique des ventes de colis d'affaires dure 12 jours après la culture de nos 4 employés. Cultivation (contrôle, TD, MC et MT) en fonction de la vitesse de rotation (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD et D12 MT), 12 (D12 MC) срезов/группу от разных свиней, проводится односторонний test ANOVA ; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 en appuyant sur D0 et **p < 0,01 en appuyant sur D12 Ctrl). b Le graphique à barres montre la quantification de la viabilité 12 jours après la mise en culture dans les 4 conditions de culture (contrôle, TD, MC et MT) par rapport aux sections de cœur fraîches (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD et D12 MT), 12 (D12 MC) sections/groupe provenant de différents porcs, test ANOVA à un facteur ; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 vs. D0 et **p < 0,01 par rapport à D12 Ctrl). b 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC et MT）与新鲜心脏切片(D0) (n = 18 (D0)、15 (D12 Ctrl、D12 TD et D12 MT), 来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；####p < 0.0001，###p < 0.001 与D0 相比，**p < 0.01 与D12控制）。b 4 12 (D12 MC) b Гистограмма, показывающая все 4 условия культивирования (contrôle, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD et D12 MT), à partir de разных свиней 12 (D12 MC) срезы/группа, односторонний test ANOVA ; ####p <0,0001, ###p <0,001 pour le réglage avec D0, **p <0,01 pour le réglage avec D12). b Histogramme montrant les 4 conditions de culture (contrôle, TD, MC et MT) comparées à des sections de cœur fraîches (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD et D12 MT), provenant de différents porcs 12 (D12 MC) sections/groupe, test ANOVA à un facteur ; ####p<0,0001, ###p<0,001 vs. D0, **p<0,01 vs. contrôle D12). c Le graphique à barres montre la quantification du flux de glucose 12 jours après la culture dans les 4 conditions de culture (Ctrl, TD, MC et MT) par rapport aux tranches de cœur fraîches (D0) (n = 6 tranches/groupe provenant de différents porcs, un test ANOVA à un facteur est effectué ; ###p < 0,001, par rapport à D0 et ***p < 0,001 par rapport à D12 Ctrl). c Le graphique à barres montre la quantification du flux de glucose 12 jours après la culture dans les 4 conditions de culture (Ctrl, TD, MC et MT) par rapport aux tranches de cœur fraîches (D0) (n = 6 tranches/groupe provenant de différents porcs, un test ANOVA à un facteur est effectué ; ###p < 0,001, par rapport à D0 et ***p < 0,001 par rapport à D12 Ctrl). c L'historique des ventes de produits d'exploitation est disponible depuis 12 jours après la culture de nos 4 employés. (contrôle, TD, MC et MT) pour le contrôle du temps de réponse (D0) (n = 6 parties/groupe de la peau du chien, test optimal ANOVA ; ###p < 0,001 pour сравнению с D0 и ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c L'histogramme montre la quantification du flux de glucose 12 jours après la culture dans les 4 conditions de culture (contrôle, TD, MC et MT) par rapport aux sections de cœur fraîches (D0) (n = 6 sections/groupe provenant de différents porcs, test ANOVA à un facteur effectué ; ###p < 0,001 par rapport à D0 et ***p < 0,001 par rapport à D12 Ctrl). c 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) 相比，培养后12天的葡萄糖通量定量（n = 6 片/组，来自不同猪，单向执行ANOVA 测试；###p < 0.001，与D0 相比，***p < 0.001与D12 Ctrl 相比）。 C 条形图 显示 所有 4 种 条件 （（ctrl 、 td 、 mc et mt） 新鲜 心脏 切片 切片 切片 相比 ， 培养后 后 12 天 的 通量 定量 （n = 6 片/组 ， 来自 猪 ， ， ， ， ， ， ， 猪 猪单向执行ANOVA 测试；###p < 0.001，与D0 相比，***p < 0.001 与D12 Ctrl 相比）。 c Гистограмма, показывающая количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после культивирования всех 4 условий Culture (contrôle, TD, MC et MT) pour la sélection de la première partie de la population (D0) (n = 6 parties/groupe, de la race animale la plus proche, la plus proche Bouilli проведены тесты ANOVA; ###p < 0,001 pour le réglage avec D0, ***p < 0,001 pour le réglage avec D12 (contrôle). c Histogramme montrant la quantification du flux de glucose 12 jours après la culture pour les 4 conditions de culture (contrôle, TD, MC et MT) par rapport aux sections de cœur fraîches (D0) (n = 6 sections/groupe, provenant de différents porcs, unilatérales). Des tests ANOVA ont été effectués, ###p < 0,001 par rapport à D0, ***p < 0,001 par rapport à D12 (contrôle).d. Graphiques d'analyse de la déformation des tissus frais (bleu), des tissus MC à J12 (vert) et des tissus MT à J12 (rouge) à dix points de coupe régionaux (n = 4 coupes/groupe, test ANOVA à un facteur ; aucune différence significative n'a été observée entre les groupes). e. Diagramme en volcan montrant les gènes différentiellement exprimés dans les coupes de cœur fraîches (J0) par rapport aux coupes de cœur cultivées en conditions statiques (Ctrl) ou en conditions MT (MT) pendant 10 à 12 jours. f. Carte thermique des gènes du sarcomère pour les coupes de cœur cultivées dans chacune des conditions de culture. Les barres d'erreur représentent la moyenne ± l'écart-type.
La dépendance métabolique au passage de l'oxydation des acides gras à la glycolyse est une caractéristique de la dédifférenciation des cardiomyocytes. Les cardiomyocytes immatures utilisent principalement le glucose pour la production d'ATP et présentent des mitochondries hypoplasiques avec peu de crêtes^5,32. Les analyses d'utilisation du glucose ont montré que, dans les conditions MC et MT, cette utilisation était similaire à celle des tissus du jour 0 (Figure 4c). Cependant, les échantillons témoins (Ctrl) ont montré une augmentation significative de l'utilisation du glucose par rapport au tissu frais. Ceci indique que la combinaison de CTCM et de T3/Dex améliore la viabilité tissulaire et préserve le phénotype métabolique des sections cardiaques cultivées pendant 12 jours. De plus, l'analyse de la déformation a montré que les niveaux de déformation restaient identiques à ceux du tissu cardiaque frais pendant 12 jours dans les conditions MT et MS (Fig. 4d).
Afin d'analyser l'impact global du CTCM et du T3/Dex sur le profil transcriptionnel global de tranches de tissu cardiaque, nous avons réalisé un séquençage d'ARN (RNAseq) sur des tranches cardiaques issues des quatre conditions de culture (Données supplémentaires 1). De façon intéressante, les sections MT présentaient une forte similarité transcriptionnelle avec le tissu cardiaque frais, avec seulement 16 gènes différentiellement exprimés sur 13 642. Cependant, comme nous l'avons montré précédemment, les tranches Ctrl présentaient 1 229 gènes différentiellement exprimés après 10 à 12 jours de culture (Fig. 4e). Ces données ont été confirmées par qRT-PCR des gènes cardiaques et fibroblastiques (Fig. supplémentaires 7a-c). Fait intéressant, les tranches Ctrl présentaient une sous-expression des gènes cardiaques et du cycle cellulaire, ainsi qu'une activation des programmes géniques inflammatoires. Ces données suggèrent que la dédifférenciation, qui survient normalement après une culture prolongée, est totalement atténuée dans les conditions MT (Fig. supplémentaires 8a,b). L'étude approfondie des gènes du sarcomère a révélé que seuls les gènes codant pour le sarcomère (Fig. 4f) et le canal ionique (Fig. suppl. 9) sont préservés dans des conditions de stimulation mécanique (MT), les protégeant ainsi de la suppression observée dans les conditions Ctrl, TD et MC. Ces résultats démontrent qu'une stimulation mécanique et humorale combinée (T3/Dex) permet de maintenir le transcriptome des tranches de cœur similaire à celui des tranches de cœur fraîches après 12 jours de culture.
Ces résultats transcriptionnels sont corroborés par le fait que l'intégrité structurale des cardiomyocytes dans les coupes de cœur est mieux préservée en conditions de stimulation mécanique (MT) pendant 12 jours, comme le montre la présence de connexine 43 intacte et localisée (Fig. 5a). De plus, la fibrose dans les coupes de cœur en conditions de MT était significativement réduite par rapport au groupe témoin (Ctrl) et similaire à celle observée dans les coupes de cœur fraîches (Fig. 5b). Ces données démontrent que la combinaison de la stimulation mécanique et du traitement T3/Dex préserve efficacement la structure cardiaque dans les coupes de cœur en culture.
a Images représentatives d'immunofluorescence de la troponine-T (vert), de la connexine 43 (rouge) et du DAPI (bleu) dans des sections de cœur fraîchement isolées (D0) ou cultivées pendant 12 jours dans les quatre conditions de culture de sections de cœur (barre d'échelle = 100 µm). ). Quantification par intelligence artificielle de l'intégrité structurelle du tissu cardiaque (n = 7 (D0 et D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC et D12 MT) tranches/groupe provenant de différents porcs, un test ANOVA à un facteur est effectué ; ####p < 0,0001 par rapport à D0 et *p < 0,05, ou ****p < 0,0001 par rapport à D12 Ctrl). Quantification par intelligence artificielle de l'intégrité structurelle du tissu cardiaque (n = 7 (D0 et D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC et D12 MT) tranches/groupe provenant de différents porcs, un test ANOVA à un facteur est effectué ; #### p < 0,0001 par rapport à D0 et *p < 0,05, ou ****p < 0,0001 par rapport à D12 Ctrl). La structure de la structure de l'environnement de travail du groupe est composée d'un ordinateur de jeu (n = 7 (D0 et D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC et D12 MT) срезов/группу En ce qui concerne la peau du sang, le test d'ANOVA a été prouvé ; #### p < 0,0001 en appuyant sur D0 et *p < 0,05 ou ****p < 0,0001 en appuyant sur D12 Ctrl). Quantification de l'intégrité structurelle du tissu cardiaque à l'aide de l'intelligence artificielle (n = 7 (D0 et D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC et D12 MT) sections/groupe provenant de différents porcs, test ANOVA à un facteur effectué ; #### p < 0,0001 par rapport à D0 et *p < 0,05 ou ****p < 0,0001 par rapport à D12 Ctrl).N = 7 (D0 et D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC et D12) MT）切片/组）进行人工智能量化，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0,0001 与D0 和*p < 0,05 相比，或****p < 0.0001 与D12 Ctrl 相比）。对 不同 猪 的 心脏 结构 完整性 （n = 7 （d0 和 d12 ctrl） （5 （d12 td 、 d12 mc 和 d12 mt） 组） 人工智能量 化 进行 单向 单向 单向 测试 ； ########## p < 0,0001 与D0 和*p < 0,05 相比，或****p < 0,0001与D12 Ctrl 相比）。Quantification de l'intégrité structurelle du tissu cardiaque à l'aide de l'intelligence artificielle chez différents porcs (n = 7 (D0 et D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC et D12 MT) sections/groupe) avec un test ANOVA à un facteur ;#### p < 0,0001 en appuyant sur D0 et *p < 0,05 ou ****p < 0,0001 en appuyant sur D12 Ctrl). #### p < 0,0001 par rapport à D0 et *p < 0,05 ou ****p < 0,0001 par rapport à D12 Ctrl). b Images représentatives et quantification des tranches de cœur colorées au trichrome de Masson (barre d'échelle = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD et D12 MC), 9 (D12 MT) tranches/groupe provenant de différents porcs, un test ANOVA à un facteur est effectué ; ####p < 0,0001 par rapport à D0 et ***p < 0,001, ou ****p < 0,0001 par rapport à D12 Ctrl). b Images représentatives et quantification des tranches de cœur colorées au trichrome de Masson (barre d'échelle = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD et D12 MC), 9 (D12 MT) tranches/groupe provenant de différents porcs, un test ANOVA à un facteur est effectué ; ####p < 0,0001 par rapport à D0 et ***p < 0,001, ou ****p < 0,0001 par rapport à D12 Ctrl). b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромным красителем Массона (масштабная линейка = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD et D12 MC), 9 (D12 MT) срезов/группу от разных свиней, выполняется односторонний тест ANOVA; ####p < 0,0001 по сравнению с D0 и ***p < 0,001 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). b Images représentatives et quantification des sections de cœur colorées au trichrome de Masson (barre d'échelle = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD et D12 MC), 9 (D12 MT) sections/groupe provenant de différents porcs, ANOVA à un facteur effectuée ; ####p < 0,0001 vs. D0 et ***p < 0,001 ou ****p < 0,0001 vs. D12 Ctrl). b Masson = 500 µm）（n = 10（D0、D12 Ctrl、D12 TD和D12 MC），来自不同猪的9 个（D12 MT）切片/组，进行单因素方差分析；####p < 0.0001 与D0 相比，***p < 0,001，或****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）。 b 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 和 量化 （比例 尺 尺 尺 = 500 µm） （n = 10 （d0 、 d12 ctrl 、 d12 td et d12 mc） 来自 不同 的 9 个 d12 mt 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片photo 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片/组，进行单因素方差分析；####p < 0.0001 与D0相比，***p < 0.001，或****p < 0.0001 与D12 Ctrl 相比）。 b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромом Массона (масштабная линейка = 500 мкм) (n = 10 (J0, J12 Ctrl, D12 TD et D12 MC), 9 (D12 MT) срезов от разных свиней / группы, один- способ ANOVA ; ####p < 0,0001 pour la sélection avec D0, ***p < 0,001 ou ****p < 0,0001 pour la sélection avec D12 Ctrl). b Images représentatives et quantification des sections de cœur colorées au trichrome de Masson (barre d'échelle = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD et D12 MC), 9 (D12 MT) sections de différents porcs/groupe, une méthode ANOVA ; ####p < 0,0001 par rapport à D0, ***p < 0,001 ou ****p < 0,0001 par rapport à D12 Ctrl).Les barres d'erreur représentent la moyenne ± l'écart type.
Enfin, la capacité du CTCM à reproduire l'hypertrophie cardiaque a été évaluée en augmentant l'étirement du tissu cardiaque. Dans le CTCM, la pression maximale dans la chambre à air est passée de 80 mmHg (étirement normal) à 140 mmHg (Fig. 6a). Ceci correspond à une augmentation de 32 % de l'étirement (Fig. 6b), valeur précédemment démontrée comme étant le pourcentage d'étirement nécessaire pour que des sections de cœur atteignent une longueur de sarcomère similaire à celle observée lors d'une hypertrophie. L'étirement et la vitesse du tissu cardiaque pendant la contraction et la relaxation sont restés constants pendant six jours de culture (Fig. 6c). Le tissu cardiaque issu de conditions MT a été soumis à un étirement normal (MT (Normal)) ou à un étirement excessif (MT (OS)) pendant six jours. Dès le quatrième jour de culture, le biomarqueur d'hypertrophie NT-proBNP était significativement plus élevé dans le milieu sous conditions MT (OS) que sous conditions MT (normales) (Fig. 7a). De plus, après six jours de culture, la taille des cellules dans MT (OS) (Fig. 7b) a augmenté significativement par rapport aux sections de cœur MT (normal). Par ailleurs, la translocation nucléaire de NFATC4 était significativement accrue dans les tissus hyperdistendus (Fig. 7c). Ces résultats démontrent le développement progressif d'un remodelage pathologique après hyperdistension et confortent l'idée que le dispositif CTCM peut servir de plateforme pour étudier la signalisation de l'hypertrophie cardiaque induite par l'étirement.
Les tracés représentatifs de la pression dans la chambre à air, de la pression dans la chambre à fluide et des mesures de mouvement tissulaire confirment que la pression dans la chambre à fluide modifie la pression dans la chambre à fluide, induisant un mouvement correspondant de la tranche de tissu. b Courbes représentatives du pourcentage et de la vitesse d'étirement pour des sections de tissu normalement étirées (orange) et sur-étirées (bleu). c Graphique à barres montrant le temps de cycle (n = 19 tranches par groupe, provenant de différents porcs), le temps de contraction (n = 18-19 tranches par groupe, provenant de différents porcs), le temps de relaxation (n = 19 tranches par groupe, provenant de différents porcs), l'amplitude du mouvement tissulaire (n = 14 tranches/groupe, provenant de différents porcs), la vitesse systolique de pointe (n = 14 tranches/groupe, provenant de différents porcs) et la vitesse de relaxation de pointe (n = 14 (J0), 15 (J6) tranches/groupes) provenant de différents porcs). Le test t de Student bilatéral n'a révélé aucune différence significative pour aucun paramètre, indiquant que ces paramètres sont restés constants pendant les 6 jours de culture sous surtension. Les barres d'erreur représentent la moyenne ± l'écart type.
a Quantification graphique à barres de la concentration de NT-ProBNP dans les milieux de culture de tranches de cœur cultivées dans des conditions d'étirement normal MT (Norm) ou de surétirement (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm et D4 MTOS) tranches/groupe provenant de différents porcs, une ANOVA à deux facteurs est effectuée ; **p < 0,01 par rapport à l'étirement normal). a Quantification graphique à barres de la concentration de NT-ProBNP dans les milieux de culture de tranches de cœur cultivées dans des conditions d'étirement normal MT (Norm) ou de surétirement (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm et D4 MTOS) tranches/groupe provenant de différents porcs, une ANOVA à deux facteurs est effectuée ; **p < 0,01 par rapport à l'étirement normal).Histogramme quantitatif de la concentration de NT-ProBNP dans le milieu de culture de tranches de cœur cultivées dans des conditions d'étirement MT normal (norm) ou de sur-étirement (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm et D4).MTOS) tranches /groupe provenant de différents porcs, une analyse de variance à deux facteurs est effectuée ;**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p < 0,01 par rapport à l'étirement normal). a Système MT (Norm) Système (OS) Système NT-ProBNP浓度的条形图量化（n = 4 (D2 MTNorm)、3（D2 MTOS、D4 MTNorm et D4 MTOS）来自不同猪的切片/组，进行双向方差分析；**与正常拉伸相比，p < 0,01). une Quantification de la concentration de NT-ProBNP dans des tranches de cœur cultivées dans des conditions d'étirement normal (Norm) ou de surétirement (OS) de MT (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm et D4 MTOS) provenant de différents 猪的切片/组，可以双向方方发发动 ; **par rapport à un étirement normal, p < 0,01).Quantification histogramme des concentrations de NT-ProBNP dans des tranches de cœur cultivées dans des conditions d'étirement MT normal (norm) ou de sur-étirement (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm) et D4 MTOS) tranches/groupe provenant de différents porcs, analyse de variance à deux facteurs ;**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p < 0,01 par rapport à l'étirement normal). b Images représentatives de tranches de cœur colorées à la troponine-T et WGA (à gauche) et quantification de la taille des cellules (à droite) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) cellules/groupe provenant de 10 tranches différentes de porcs différents, un test t de Student bilatéral est effectué ; ****p < 0,0001 par rapport à l'étirement normal). b Images représentatives de tranches de cœur colorées à la troponine-T et WGA (à gauche) et quantification de la taille des cellules (à droite) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) cellules/groupe provenant de 10 tranches différentes de porcs différents, un test t de Student bilatéral est effectué ; ****p < 0,0001 par rapport à l'étirement normal). b Représentation de la pression exercée sur la peau, sur le troponinum-Т et АЗП (слева) et количественного определения размера клеток (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) клеток/группу из 10 разных срезов от разных свиней, два- проводится хвостовой t-критерий Стьюдента; ****p < 0,0001 po сравнению с нормальным растяжением). b Images représentatives de sections de cœur colorées à la troponine-T et à l'AZP (à gauche) et quantification de la taille des cellules (à droite) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) cellules/groupe provenant de 10 sections différentes de différents porcs, un test t de Student bilatéral a été effectué ; ****p < 0,0001 par rapport à la souche normale). b 用肌钙蛋白-T 和WGA（左）和细胞大小量化（右）染色的心脏切片的代表性图像（n = 330（D6 MTOS），来自不同猪的10 不同切片的369（D6 MTNorm）细胞/组，两进行有尾学生t 检验；与正常拉伸相比，****p < 0.0001）。 b Images représentatives de tranches de cœur colorées à la calcaréine-T et WGA (à gauche) et taille des cellules (à droite) (n = 330 (D6 MTOS), 369 provenant de 10 tranches différentes (D6 MTNorm)) Cells/组，两方法有尾学生t test；comparé à l'étirement normal，****p < 0,0001). b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слева) и количественная оценка размера клеток (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) sur 10 tranches de chaque tranche de peau/groupe, selon le critère de sélection de l'étudiant ; ****p < 0,0001 pour une utilisation normale растяжением). b Images représentatives de sections de cœur colorées à la troponine-T et à l'AZP (à gauche) et quantification de la taille des cellules (à droite) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) provenant de 10 sections différentes de différents porcs) Cellules/groupe, critère bilatéral Student t ; ****p < 0,0001 par rapport à la souche normale). c Images représentatives des tranches de cœur MTOS du jour 0 et du jour 6 immunomarquées pour la troponine-T et NFATC4 et quantification de la translocation de NFATC4 vers les noyaux des CM (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) tranches/groupe provenant de différents porcs, un test t de Student bilatéral est effectué ; *p < 0,05). c Images représentatives des tranches de cœur MTOS du jour 0 et du jour 6 immunomarquées pour la troponine-T et NFATC4 et quantification de la translocation de NFATC4 vers les noyaux des CM (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) tranches/groupe provenant de différents porcs, un test t de Student bilatéral est effectué ; *p < 0,05). c Réglage des paramètres pour les cycles de pression 0 et 6 jours MTOS, immunisations pour la tropone-Т et NFATC4 et l'ouverture de cycle translocation NFATC4 dans le clavier à écran large (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срезов/группу от разных свиней , выполняется двусторонний t-критерий Стьюдента; *p < 0,05). c Images représentatives des sections cardiaques à 0 et 6 jours MTOS, immunomarquées pour la troponine-T et NFATC4, et quantification de la translocation de NFATC4 dans le noyau des cellules caverneuses (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) tranches/groupe provenant de différents porcs) ont effectué un test t de Student bilatéral ; *p < 0,05). c 用于肌钙蛋白-T et NFATC4 免疫标记的第0 天和第6 天MTOS N = 4 (D0) 、 3 (D6 MTOS)切片/组, 进行双尾学生t 检验；*p < 0.05)。 c Images représentatives de l'immunomarquage calcanine-T et NFATC4 de tranches de cœur 0 et 6 MTOS, et de NFATC4 provenant de différentes quantités de noyaux cellulaires NFATC4 易位至CM (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) 切礼/组,时间双尾学生et 电影；*p < 0,05). c Représentant les niveaux de service MTOS à 0 et 6 jours pour les immunomarquages ​​troponiques-Т et NFATC4 et les services de police transmission NFATC4 dans l'écran CM de la région de la peau (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срез/группа, два- хвостатый t-критерий Стьюдента; *p < 0,05). c Images représentatives de tranches de cœur MTOS aux jours 0 et 6 pour l'immunomarquage de la troponine-T et du NFATC4 et la quantification de la translocation du NFATC4 dans le noyau des CM de différents porcs (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) tranches/groupe, test t bilatéral de Student ; *p < 0,05).Les barres d'erreur représentent la moyenne ± l'écart type.
La recherche cardiovasculaire translationnelle nécessite des modèles cellulaires reproduisant fidèlement l'environnement cardiaque. Dans cette étude, un dispositif CTCM a été développé et caractérisé pour stimuler des coupes ultrafines de cœur. Le système CTCM comprend une stimulation électromécanique physiologiquement synchronisée et un enrichissement du fluide en T3 et dexaméthasone. Après 12 jours de culture, la viabilité, l'intégrité structurale, l'activité métabolique et l'expression transcriptionnelle de coupes de cœur porcin exposées à ces facteurs sont restées identiques à celles du tissu cardiaque frais. De plus, un étirement excessif du tissu cardiaque peut induire une hypertrophie cardiaque par hyperextension. Globalement, ces résultats soulignent le rôle crucial des conditions de culture physiologiques dans le maintien d'un phénotype cardiaque normal et offrent une plateforme pour le criblage de médicaments.
De nombreux facteurs contribuent à créer un environnement optimal pour le fonctionnement et la survie des cardiomyocytes. Parmi les plus importants, on peut citer : (1) les interactions intercellulaires, (2) la stimulation électromécanique, (3) les facteurs humoraux et (4) les substrats métaboliques. Les interactions physiologiques entre cellules nécessitent des réseaux tridimensionnels complexes composés de plusieurs types cellulaires, soutenus par une matrice extracellulaire. Ces interactions cellulaires complexes sont difficiles à reproduire in vitro par co-culture de différents types cellulaires, mais peuvent être facilement obtenues grâce à la nature organotypique de coupes de cœur.
L'étirement mécanique et la stimulation électrique des cardiomyocytes sont essentiels au maintien du phénotype cardiaque^33,34,35. Si la stimulation mécanique est largement utilisée pour le conditionnement et la maturation des cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes induites (hiPSC-CM), plusieurs études élégantes ont récemment tenté de stimuler mécaniquement des tranches de cœur en culture par une charge uniaxiale. Ces études montrent qu'une charge mécanique uniaxiale bidimensionnelle a un effet positif sur le phénotype du cœur en culture. Dans ces études, des sections de cœur ont été soumises soit à des forces de traction isométriques¹⁷, soit à une charge auxotonique linéaire¹⁸, soit encore le cycle cardiaque a été recréé à l'aide d'un capteur de force et d'un système de tension. Cependant, ces méthodes utilisent un étirement tissulaire uniaxial sans optimisation environnementale, ce qui entraîne la suppression de nombreux gènes cardiaques ou la surexpression de gènes associés à des réponses anormales à l'étirement. Le CTCM décrit ici fournit une stimulation électromécanique tridimensionnelle qui imite le cycle cardiaque naturel en termes de durée et d'étirement physiologique (25 % d'étirement, 40 % de systole, 60 % de diastole et 72 battements par minute). Bien que cette stimulation mécanique tridimensionnelle à elle seule ne soit pas suffisante pour maintenir l'intégrité des tissus, une combinaison de stimulation humorale et mécanique utilisant T3/Dex est nécessaire pour maintenir adéquatement la viabilité, la fonction et l'intégrité des tissus.
Les facteurs humoraux jouent un rôle important dans la modulation du phénotype cardiaque adulte. Ceci a été mis en évidence dans des études sur les cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes induites (HiPS-CM) où la T3 et la dexaméthasone (Dex) ont été ajoutées aux milieux de culture pour accélérer la maturation cellulaire. La T3 pourrait influencer le transport des acides aminés, des sucres et du calcium à travers les membranes cellulaires³⁶. De plus, la T3 favorise l'expression de la MHC-α et la régulation négative de la MHC-β, stimulant ainsi la formation de myofibrilles à contraction rapide dans les cardiomyocytes matures, contrairement aux myofibrilles à contraction lente présentes dans les cardiomyocytes fœtaux. Chez les patients hypothyroïdiens, la carence en T3 entraîne la disparition des bandes myofibrillaires et un ralentissement du développement du tonus myocardique³⁷. La Dex agit sur les récepteurs des glucocorticoïdes et il a été démontré qu'elle augmente la contractilité myocardique dans les cœurs perfusés isolés³⁸ ; cette amélioration serait liée à son effet sur l'entrée de calcium induite par les dépôts (SOCE)^39,40. Par ailleurs, la Dex se lie à ses récepteurs, induisant une large réponse intracellulaire qui supprime la fonction immunitaire et l'inflammation³⁰.
Nos résultats indiquent que la stimulation mécanique (SM) a amélioré les performances globales de la culture par rapport au groupe témoin (Ctrl), mais n'a pas permis de maintenir la viabilité, l'intégrité structurale et l'expression cardiaque sur une période de 12 jours. Comparativement au groupe témoin, l'ajout de T3 et de Dex aux cultures CTCM (MT) a amélioré la viabilité et maintenu des profils de transcription, une intégrité structurale et une activité métabolique similaires à ceux du tissu cardiaque frais pendant 12 jours. De plus, en contrôlant le degré d'étirement du tissu, un modèle d'hypertrophie cardiaque induite par hyperextension a été créé à l'aide de la STCM, illustrant la polyvalence du système STCM. Il convient de noter que, bien que le remodelage cardiaque et la fibrose impliquent généralement des organes intacts dont les cellules circulantes peuvent fournir les cytokines appropriées ainsi que la phagocytose et d'autres facteurs de remodelage, des sections de cœur peuvent néanmoins reproduire le processus fibrotique en réponse au stress et aux traumatismes. Il convient de noter que les paramètres du CTCM peuvent être modulés en modifiant la pression/l'amplitude électrique et la fréquence afin de simuler diverses conditions telles que la tachycardie, la bradycardie et l'assistance circulatoire mécanique (cœur déchargé mécaniquement). Ceci confère au système un débit moyen pour les essais de médicaments. La capacité du CTCM à modéliser l'hypertrophie cardiaque induite par le surmenage ouvre la voie à l'évaluation de ce système pour une thérapie personnalisée. En conclusion, la présente étude démontre que l'étirement mécanique et la stimulation humorale sont essentiels au maintien de la culture de coupes de tissu cardiaque.
Bien que les données présentées ici suggèrent que la culture CTCM soit une plateforme très prometteuse pour la modélisation du myocarde intact, cette méthode de culture présente certaines limitations. La principale limitation de la culture CTCM réside dans les contraintes mécaniques dynamiques continues qu'elle impose aux tranches, empêchant ainsi le suivi actif des contractions cardiaques au cours de chaque cycle. De plus, la petite taille des sections cardiaques (7 mm) limite l'évaluation de la fonction systolique hors des systèmes de culture à l'aide de capteurs de force traditionnels. Dans le présent manuscrit, nous surmontons partiellement cette limitation en évaluant la tension optique comme indicateur de la fonction contractile. Cependant, cette limitation nécessitera des travaux supplémentaires et pourra être résolue ultérieurement par l'introduction de méthodes de suivi optique de la fonction des tranches cardiaques en culture, telles que la cartographie optique utilisant des colorants sensibles au calcium et à la tension. Une autre limitation de la culture CTCM est que le modèle utilisé ne permet pas de manipuler les contraintes physiologiques (précharge et postcharge). Dans la culture CTCM, la pression est induite dans des directions opposées afin de reproduire un étirement physiologique de 25 % en diastole (étirement maximal) et en systole (longueur de contraction lors de la stimulation électrique) dans des tissus de très grande taille. Cette limitation devrait être levée dans les futures conceptions de CTCM en appliquant une pression adéquate sur le tissu cardiaque des deux côtés et en respectant les relations pression-volume exactes qui se produisent dans les cavités du cœur.
Le remodelage induit par l'étirement excessif décrit dans ce manuscrit se limite à la reproduction des signaux d'hypertrophie induits par l'étirement excessif. Ce modèle peut donc contribuer à l'étude de la signalisation hypertrophique induite par l'étirement sans nécessiter de facteurs humoraux ou neuronaux (qui sont absents de ce système). Des études complémentaires sont nécessaires pour accroître la multiplicité du CTCM, par exemple la co-culture avec des cellules immunitaires, l'introduction de facteurs humoraux plasmatiques circulants et l'innervation lors de la co-culture avec des cellules neuronales. Ces études amélioreront les possibilités de modélisation des maladies avec le CTCM.
Treize porcs ont été utilisés dans cette étude. Toutes les procédures animales ont été réalisées conformément aux directives institutionnelles et ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux de l'Université de Louisville. La crosse aortique a été clampée et le cœur a été perfusé avec 1 L de cardioplégie stérile (110 mM NaCl, 1,2 mM CaCl2, 16 mM KCl, 16 mM MgCl2, 10 mM NaHCO3, 5 U/mL d'héparine, pH jusqu'à 7,4) ; Les cœurs ont été conservés dans une solution cardioplégique glacée jusqu'à leur transport au laboratoire sur glace, ce qui prend généralement moins de 10 minutes. Les cœurs ont été conservés dans une solution cardioplégique glacée jusqu'à leur transport au laboratoire sur glace, ce qui prend généralement moins de 10 minutes. сердца хранили в ледяном кардиоплегическом растворе до транспортировки в LABораторию на льду, что обычно занимает <10 min. Les cœurs ont été conservés dans une solution cardioplégique glacée jusqu'à leur transport au laboratoire sur glace, ce qui prend généralement moins de 10 minutes.将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钟。将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钟。 Prenez le service de cardio-training en charge du transport vers le laboratoire de votre enfant, généralement <10 minutes. Maintenir les cœurs sur de la glace (cardioplégie) jusqu'à leur transport au laboratoire sur glace, généralement <10 min.
Le dispositif CTCM a été conçu à l'aide du logiciel de conception assistée par ordinateur (CAO) SolidWorks. Les chambres de culture, les séparateurs et les chambres à air sont fabriqués en acrylique transparent usiné CNC. L'anneau de support central de 7 mm de diamètre est en polyéthylène haute densité (PEHD) et comporte une gorge pour joint torique destinée à recevoir le joint torique en silicone assurant l'étanchéité du milieu de culture. Une fine membrane de silice sépare la chambre de culture de la plaque de séparation. Cette membrane est découpée au laser dans une feuille de silicone de 0,5 mm d'épaisseur et présente une dureté de 35A. Les joints en silicone supérieur et inférieur sont découpés au laser dans une feuille de silicone de 1,5 mm d'épaisseur et présentent une dureté de 50A. Des vis et des écrous papillon en acier inoxydable 316L permettent de fixer le bloc et d'assurer son étanchéité.
Une carte de circuit imprimé (PCB) dédiée est conçue pour être intégrée au système C-PACE-EM. Les connecteurs de type « machine suisse » de la PCB sont reliés à des électrodes en graphite par des fils de cuivre argentés et des vis en bronze 0-60 vissées dans les électrodes. La carte de circuit imprimé est placée dans le boîtier de l'imprimante 3D.
Le dispositif CTCM est contrôlé par un actionneur pneumatique programmable (PPD) qui génère une pression circulatoire contrôlée similaire à un cycle cardiaque. Lorsque la pression à l'intérieur de la chambre à air augmente, la membrane flexible en silicone se dilate vers le haut, refoulant le milieu sous le tissu. La zone de tissu est alors étirée par cette expulsion de fluide, imitant la dilatation physiologique du cœur pendant la diastole. Au pic de relaxation, une stimulation électrique est appliquée via des électrodes en graphite, ce qui réduit la pression dans la chambre à air et provoque la contraction des segments de tissu. À l'intérieur du tube se trouve une valve hémostatique équipée d'un capteur de pression permettant de mesurer la pression dans le système d'air. La pression mesurée par le capteur est transmise à un système d'acquisition de données connecté à un ordinateur portable. Ceci permet une surveillance continue de la pression à l'intérieur de la chambre à gaz. Lorsque la pression maximale de la chambre est atteinte (80 mmHg en standard, 140 mmHg en externe), le dispositif d'acquisition de données envoie un signal au système C-PACE-EM afin de générer un signal de tension biphasique de 4 V pendant 2 ms.
Des sections de cœur ont été obtenues et les conditions de culture dans 6 puits ont été réalisées comme suit : les cœurs prélevés ont été transférés du récipient de transfert vers un plateau contenant une solution de cardioplégie froide (4 °C). Le ventricule gauche a été isolé à l’aide d’une lame stérile et découpé en fragments de 1 à 2 cm³. Ces blocs de tissu ont été fixés à des supports tissulaires avec un adhésif tissulaire et placés dans un bain de microtome vibrant contenant une solution de Tyrode et continuellement oxygénée (3 g/L de 2,3-butanedione monooxime (BDM), 140 mM de NaCl (8,18 g), 6 mM de KCl (0,447 g), 10 mM de D-glucose (1,86 g), 10 mM d’HEPES (2,38 g), 1 mM de MgCl₂ (1 ml de solution 1 M), 1,8 mM de CaCl₂ (1,8 ml de solution 1 M), jusqu’à 1 L d’eau distillée). Le microtome vibrant a été réglé pour découper des tranches de 300 µm d'épaisseur à une fréquence de 80 Hz, une amplitude de vibration horizontale de 2 mm et une vitesse d'avance de 0,03 mm/s. Le bain de tissu était entouré de glace pour maintenir la solution à basse température, et la température était maintenue à 4 °C. Les coupes de tissu ont été transférées du bain du microtome vers un bain d'incubation contenant une solution de Tyrode continuellement oxygénée et placée sur glace, jusqu'à obtention d'un nombre suffisant de coupes pour une plaque de culture. Pour les cultures en transwell, les coupes de tissu ont été fixées sur des supports stériles en polyuréthane de 6 mm de large et placées dans 6 ml de milieu optimisé (milieu 199, supplément ITS 1X, 10 % de FBS, 5 ng/ml de VEGF, 10 ng/ml de FGF alcalin et 2X d'antibiotique-antifongique). Une stimulation électrique (10 V, fréquence 1,2 Hz) a été appliquée aux coupes de tissu via le C-Pace. Pour les conditions TD, du T3 et du Dex frais ont été ajoutés à des concentrations respectives de 100 nM et 1 μM à chaque renouvellement du milieu. Le milieu est saturé en oxygène avant d'être remplacé trois fois par jour. Les coupes de tissu ont été cultivées dans un incubateur à 37 °C et 5 % de CO2.
Pour les cultures CTCM, des coupes de tissu ont été placées sur une imprimante 3D conçue sur mesure, dans une boîte de Petri contenant une solution de Tyrode modifiée. Le dispositif est conçu pour augmenter la taille de la tranche de cœur de 25 % de la surface de l'anneau de support. Ceci permet d'éviter l'étirement des coupes de cœur lors de leur transfert de la solution de Tyrode au milieu de culture et pendant la diastole. À l'aide de colle histoacrylique, des coupes de 300 µm d'épaisseur ont été fixées sur un anneau de support de 7 mm de diamètre. Après fixation des coupes de tissu sur l'anneau de support, l'excédent de tissu a été retiré et les coupes fixées ont été replacées dans un bain de solution de Tyrode sur glace (4 °C) jusqu'à obtention d'un nombre suffisant de coupes pour un dispositif. La durée totale de traitement pour tous les dispositifs ne doit pas excéder 2 heures. Une fois 6 coupes de tissu fixées à leurs anneaux de support, le dispositif CTCM a été assemblé. La chambre de culture CTCM est pré-remplie avec 21 ml de milieu pré-oxygéné. Les coupes de tissu ont été transférées dans la chambre de culture et les bulles d'air ont été soigneusement éliminées à l'aide d'une pipette. Le fragment de tissu est ensuite inséré dans l'orifice et délicatement mis en place. Enfin, le capuchon d'électrode est placé sur le dispositif, puis ce dernier est transféré dans l'incubateur. Le CTCM est ensuite connecté au tube d'air et au système C-PACE-EM. L'actionneur pneumatique s'ouvre et la vanne d'air ouvre le CTCM. Le système C-PACE-EM a été configuré pour délivrer 4 V à 1,2 Hz lors d'une stimulation biphasique de 2 ms. Le milieu de culture a été renouvelé deux fois par jour et les électrodes une fois par jour afin d'éviter l'accumulation de graphite. Si nécessaire, les fragments de tissu peuvent être retirés de leurs puits de culture pour éliminer les bulles d'air qui auraient pu se former en dessous. Pour les conditions de traitement MT, du T3/Dex a été ajouté à chaque renouvellement de milieu à une concentration de 100 nM pour le T3 et de 1 μM pour le Dex. Les dispositifs CTCM ont été cultivés dans un incubateur à 37 °C et 5 % de CO₂.
Pour obtenir les trajectoires étirées de coupes de cœur, un système de caméra spécifique a été développé. Un appareil photo reflex (Canon Rebel T7i, Canon, Tokyo, Japon) a été utilisé avec un objectif macro Navitar Zoom 7000 18-108 mm (Navitar, San Francisco, CA, États-Unis). La visualisation a été réalisée à température ambiante après renouvellement du milieu de culture. La caméra est positionnée à un angle de 51° et la vidéo est enregistrée à 30 images par seconde. Dans un premier temps, le logiciel libre MUSCLEMOTION43 a été utilisé avec ImageJ pour quantifier le mouvement des coupes de cœur. Un masque a été créé à l'aide de MATLAB (MathWorks, Natick, MA, États-Unis) afin de définir les régions d'intérêt pour les coupes de cœur battant et ainsi éviter le bruit. Les masques segmentés manuellement sont appliqués à toutes les images d'une séquence, puis transmis au plugin MUSCLEMOTION. Muscle Motion utilise l'intensité moyenne des pixels de chaque image pour quantifier son mouvement par rapport à l'image de référence. Les données ont été enregistrées, filtrées et utilisées pour quantifier la durée du cycle et évaluer l'étirement tissulaire au cours du cycle cardiaque. La vidéo enregistrée a été post-traitée à l'aide d'un filtre numérique à phase nulle du premier ordre. Afin de quantifier l'étirement tissulaire (amplitude crête à crête), une analyse crête à crête a été réalisée pour distinguer les pics et les creux du signal enregistré. De plus, une correction de tendance a été effectuée à l'aide d'un polynôme du 6e degré pour éliminer la dérive du signal. Un programme a été développé sous MATLAB pour déterminer le mouvement tissulaire global, la durée du cycle, le temps de relaxation et le temps de contraction (Programme supplémentaire 44).
Pour l'analyse des déformations, à partir des mêmes vidéos créées pour l'évaluation de l'étirement mécanique, nous avons d'abord tracé deux images représentant les pics de mouvement (les points haut et bas) à l'aide du logiciel MUSCLEMOTION. Nous avons ensuite segmenté les régions tissulaires et appliqué un algorithme d'ombrage aux tissus segmentés (Fig. S2a). Le tissu segmenté a ensuite été divisé en dix sous-surfaces, et la contrainte sur chaque surface a été calculée à l'aide de l'équation suivante : Déformation = (Sup - Sdown) / Sdown, où Sup et Sdown représentent les distances de la forme par rapport aux ombres supérieure et inférieure du tissu, respectivement (Fig. S2b).
Des coupes de cœur ont été fixées dans du paraformaldéhyde à 4 % pendant 48 heures. Les tissus fixés ont été déshydratés dans des solutions de saccharose à 10 % et 20 % pendant 1 heure, puis dans une solution de saccharose à 30 % pendant une nuit. Les coupes ont ensuite été incluses dans un milieu d'inclusion OCT (Optimal Cutting Temperature) et congelées progressivement dans un bain d'isopentane/glace carbonique. Les blocs d'inclusion OCT ont été conservés à -80 °C jusqu'à leur séparation. Les lames ont été préparées sous forme de coupes de 8 μm d'épaisseur.
Pour éliminer l'OCT des coupes de cœur, chauffer les lames sur un bloc chauffant à 95 °C pendant 5 min. Ajouter 1 ml de PBS sur chaque lame et incuber pendant 30 min à température ambiante, puis perméabiliser les coupes en fixant une solution de Triton X-100 à 0,1 % dans du PBS pendant 15 min à température ambiante. Afin d'empêcher la fixation d'anticorps non spécifiques à l'échantillon, ajouter 1 ml d'une solution de BSA à 3 % sur les lames et incuber pendant 1 h à température ambiante. La BSA est ensuite éliminée et les lames sont lavées au PBS. Marquer chaque échantillon au crayon. Des anticorps primaires (dilués à 1:200 dans 1 % de BSA) (connexine 43 (Abcam ; réf. AB11370), NFATC4 (Abcam ; réf. AB99431) et troponine T (Thermo Scientific ; réf. MA5-12960)) ont été ajoutés pendant 90 minutes, puis des anticorps secondaires (dilués à 1:200 dans 1 % de BSA) anti-Alexa Fluor 488 de souris (Thermo Scientific ; réf. A16079) et anti-Alexa Fluor 594 de lapin (Thermo Scientific ; réf. T6391) pendant 90 minutes supplémentaires. Après trois lavages au PBS, l'anticorps secondaire seul a été utilisé comme témoin afin de distinguer le marquage de la cible du bruit de fond. Enfin, le DAPI a été ajouté pour la coloration nucléaire, et les lames ont été placées dans un Vectashield (Vector Laboratories) et scellées avec du vernis à ongles. L'observation a été réalisée à l'aide d'un microscope électronique à balayage (MEB) à grossissement x10 et d'un microscope Keyence à grossissement x40.
La WGA-Alexa Fluor 555 (Thermo Scientific ; réf. W32464) à 5 µg/ml dans du PBS a été utilisée pour la coloration WGA et appliquée sur les coupes fixées pendant 30 minutes à température ambiante. Après lavage au PBS, du noir Soudan a été ajouté sur chaque lame et incubé pendant 30 minutes supplémentaires. Les lames ont ensuite été lavées au PBS et le milieu d’inclusion Vectashield a été ajouté. L’observation des lames a été réalisée au microscope Keyence à un grossissement de 40x.
L'OCT a été éliminé des échantillons comme décrit précédemment. Après élimination de l'OCT, les lames ont été immergées dans la solution de Bouin pendant une nuit. Elles ont ensuite été rincées à l'eau distillée pendant 1 heure, puis placées dans une solution de fuchsine acide à l'aloès Bibrich pendant 10 minutes. Après lavage à l'eau distillée, les lames ont été placées dans une solution de phosphomolybdène à 5 % et d'acide phosphotungstique à 5 % pendant 10 minutes. Sans rinçage, elles ont été transférées directement dans une solution de bleu d'aniline pendant 15 minutes. Après lavage à l'eau distillée, les lames ont été placées dans une solution d'acide acétique à 1 % pendant 2 minutes. Elles ont été séchées dans de l'éthanol 200 N et transférées dans du xylène. Les lames colorées ont été observées au microscope Keyence avec un objectif 10x. Le pourcentage de surface de fibrose a été quantifié à l'aide du logiciel Keyence Analyzer.
Le test de viabilité cellulaire CyQUANT™ MTT (Invitrogen, Carlsbad, CA), référence V13154, a été réalisé selon le protocole du fabricant, avec quelques modifications. Un emporte-pièce chirurgical de 6 mm de diamètre a notamment été utilisé pour garantir une taille de tissu uniforme lors de l'analyse MTT. Les tissus ont été ensemencés individuellement dans les puits d'une plaque 12 puits contenant le substrat MTT, conformément au protocole du fabricant. Les coupes ont été incubées à 37 °C pendant 3 heures, permettant ainsi au tissu vivant de métaboliser le substrat MTT et de former un composé formazan violet. La solution de MTT a ensuite été remplacée par 1 ml de DMSO et incubée à 37 °C pendant 15 minutes afin d'extraire le formazan violet des coupes de cœur. Les échantillons ont été dilués au 1/10e dans du DMSO dans des plaques 96 puits à fond transparent, et l'intensité de la coloration violette a été mesurée à 570 nm à l'aide d'un lecteur de plaques Cytation (BioTek). Les valeurs obtenues ont été normalisées par rapport au poids de chaque coupe de cœur.
Le milieu de culture des tranches de cœur a été remplacé par un milieu contenant 1 μCi/ml de [5-3H]-glucose (Moravek Biochemicals, Brea, CA, États-Unis) pour le dosage de l'utilisation du glucose, comme décrit précédemment. Après 4 heures d'incubation, 100 µl de milieu ont été ajoutés à un tube à microcentrifugation ouvert contenant 100 µl de HCl 0,2 N. Le tube a ensuite été placé dans un tube à scintillation contenant 500 µl d'eau distillée pour évaporer le [3H]₂O pendant 72 heures à 37 °C. Le tube à microcentrifugation a ensuite été retiré du tube à scintillation et 10 ml de liquide de scintillation ont été ajoutés. Les mesures de scintillation ont été effectuées à l'aide d'un analyseur de scintillation liquide Tri-Carb 2900TR (Packard Bioscience Company, Meriden, CT, États-Unis). L'utilisation du glucose a ensuite été calculée en tenant compte de l'activité spécifique du [5-3H]-glucose, de l'équilibre incomplet et du bruit de fond, de la dilution du [5-3H]-glucose en glucose non marqué et du rendement du compteur à scintillation. Les données sont normalisées par rapport à la masse des sections de cœur.
Après homogénéisation des tissus dans du Trizol, l'ARN a été extrait de coupes de cœur à l'aide du kit Qiagen miRNeasy Micro n° 210874, conformément au protocole du fabricant. La préparation de la bibliothèque RNAsec, le séquençage et l'analyse des données ont été réalisés comme suit :
Un microgramme d'ARN par échantillon a été utilisé comme matériel de départ pour la préparation de la banque d'ARN. Les banques de séquençage ont été générées à l'aide du kit NEBNext Ultra™ RNA Library Preparation pour Illumina (NEB, États-Unis), conformément aux recommandations du fabricant. Des index ont été ajoutés aux séquences d'attributs de chaque échantillon. Brièvement, l'ARNm a été purifié à partir de l'ARN total à l'aide de billes magnétiques couplées à des oligonucléotides poly-T. La fragmentation a été réalisée à haute température avec des cations divalents dans le tampon de réaction NEBNext First Strand Synthesis Reaction Buffer (5X). L'ADNc de premier brin a été synthétisé à l'aide d'amorces hexamères aléatoires et de la transcriptase inverse M-MuLV (RNase H-). L'ADNc de second brin a ensuite été synthétisé à l'aide de l'ADN polymérase I et de la RNase H. Les extrémités cohésives restantes ont été rendues franches par activité exonucléase/polymérase. Après adénylation de l'extrémité 3′ du fragment d'ADN, un adaptateur NEBNext à structure en épingle à cheveux y est fixé afin de le préparer à l'hybridation. Pour la sélection des fragments d'ADNc de longueur optimale (150-200 pb), les fragments de la banque ont été purifiés à l'aide du système AMPure XP (Beckman Coulter, Beverly, États-Unis). Ensuite, 3 μl d'enzyme USER (NEB, États-Unis) contenant l'ADNc sélectionné en fonction de sa taille et ligaturé à l'adaptateur ont été utilisés pendant 15 minutes à 37 °C, puis pendant 5 minutes à 95 °C avant la PCR. La PCR a ensuite été réalisée à l'aide de la polymérase Phusion High-Fidelity, d'amorces PCR universelles et d'amorces Index (X). Enfin, les produits de PCR ont été purifiés (système AMPure XP) et la qualité de la banque a été évaluée sur un système Agilent Bioanalyzer 2100. La banque d'ADNc a ensuite été séquencée à l'aide d'un séquenceur NovaSeq. Les fichiers d'images brutes provenant d'Illumina ont été convertis en lectures brutes à l'aide de CASAVA Base Calling. Les données brutes sont stockées dans des fichiers au format FASTQ (fq) contenant les séquences de lecture et leurs qualités de base correspondantes. Sélectionnez HISAT2 pour aligner les séquences de lecture filtrées sur le génome de référence Sscrofa11.1. HISAT2 prend en charge les génomes de toute taille, y compris ceux de plus de 4 milliards de bases, et la plupart des paramètres utilisent des valeurs par défaut. L'alignement des lectures issues du séquençage d'ARN (RNA-Seq) est réalisé efficacement avec HISAT2, le système le plus rapide actuellement disponible, offrant une précision égale ou supérieure à celle de toute autre méthode.
L'abondance des transcrits reflète directement le niveau d'expression génique. Ce niveau est évalué par l'abondance des transcrits (nombre de séquences) associés au génome ou aux exons. Le nombre de lectures est proportionnel au niveau d'expression génique, à la longueur du gène et à la profondeur de séquençage. Les FPKM (fragments pour mille paires de bases de transcrit séquencées par million de paires de bases) ont été calculés et les valeurs p d'expression différentielle ont été déterminées à l'aide du package DESeq2. Le taux de faux positifs (FDR) a ensuite été calculé pour chaque valeur p selon la méthode de Benjamini-Hochberg⁹, implémentée dans la fonction R intégrée « p.adjust ».
L'ARN extrait de coupes de cœur a été converti en ADNc à une concentration de 200 ng/µl à l'aide du kit SuperScript IV Vilo Master Mix (Thermo, réf. 11756050). La RT-PCR quantitative a été réalisée sur une plaque de réaction transparente 384 puits Endura Plate Microamp (Applied Biosystems, Thermo, réf. 4483319) avec adhésif optique Microamp (Thermo, réf. 4311971). Le mélange réactionnel était composé de 5 µl de TaqMan Fast Advanced Master Mix (Thermo, réf. 4444557), 0,5 µl d'amorce TaqMan et 3,5 µl d'eau par puits. Les cycles de qPCR standard ont été effectués et les valeurs de CT ont été mesurées à l'aide d'un appareil de PCR en temps réel QuantStudio 5 (Applied Biosystems, module 384 puits ; réf. A28135). Les amorces Taqman ont été achetées chez Thermo (GAPDH (Ss03375629_u1), PARP12 (Ss06908795_m1), PKDCC (Ss06903874_m1), CYGB (Ss06900188_m1), RGL1 (Ss06868890_m1), ACTN1 (Ss01009508_mH), GATA4 (Ss03383805_u1), GJA1 (Ss03374839_u1), COL1A2 (Ss03375009_u1), COL3A1 (Ss04323794_m1), ACTA2 (Ss04245588_m1). Les valeurs CT de tous les échantillons ont été normalisées par rapport au gène de ménage GAPDH.
La libération de NT-proBNP dans le milieu de culture a été évaluée à l'aide du kit NT-proBNP (porc) (réf. MBS2086979, MyBioSource) selon le protocole du fabricant. Brièvement, 250 µl de chaque échantillon et étalon ont été ajoutés en double dans chaque puits. Immédiatement après l'ajout de l'échantillon, 50 µl de réactif A ont été ajoutés dans chaque puits. La plaque a été agitée doucement et scellée. Les plaquettes ont ensuite été incubées à 37 °C pendant 1 heure. Après aspiration de la solution, les puits ont été lavés 4 fois avec 350 µl de solution de lavage 1X, en incubant la solution de lavage pendant 1 à 2 minutes à chaque fois. 100 µl de réactif B ont ensuite été ajoutés dans chaque puits et la plaque a été scellée. La plaque a été agitée doucement et incubée à 37 °C pendant 30 minutes. Aspirer la solution et laver les puits 5 fois avec 350 µl de solution de lavage 1X. Ajouter 90 µl de solution de substrat dans chaque puits et sceller la plaque. Incuber la plaque à 37 °C pendant 10 à 20 minutes. Ajouter 50 µl de solution d'arrêt dans chaque puits. La plaque a été immédiatement mesurée à l'aide d'un lecteur de plaques Cytation (BioTek) réglé à 450 nm.
Des analyses de puissance ont été réalisées pour choisir les tailles de groupe qui fourniront une puissance > 80 % pour détecter un changement absolu de 10 % du paramètre avec un taux d'erreur de type I de 5 %. Des analyses de puissance ont été réalisées pour choisir les tailles de groupe qui fourniront une puissance > 80 % pour détecter un changement absolu de 10 % du paramètre avec un taux d'erreur de type I de 5 %. L'analyse des revenus du groupe de travail est de >80% pour l'exploitation 10% absolus параметра с 5% частотой ошибок типа I. Une analyse de puissance a été réalisée pour sélectionner les tailles de groupe qui permettraient d'obtenir une puissance > 80 % pour détecter une variation absolue de 10 % des paramètres avec un taux d'erreur de type I de 5 %.进行功效分析以选择将提供> 80% de réduction pour 10% de réduction et 5% de réduction pour moi.进行功效分析以选择将提供> 80% de réduction pour 10% de réduction et 5% de réduction pour moi. Il est prouvé que l'analyse des avantages pour les groupes de votre secteur d'activité est supérieure à 80 % pour l'exploitation de 10 % d'absolu. изменения параметров и 5% частоты ошибок типа I. Une analyse de puissance a été réalisée pour sélectionner une taille de groupe qui fournirait une puissance >80% pour détecter une variation absolue des paramètres de 10% et un taux d'erreur de type I de 5%.Les coupes de tissu ont été sélectionnées aléatoirement avant l'expérience. Toutes les analyses ont été réalisées en aveugle et les échantillons n'ont été décodés qu'après l'analyse complète des données. Le logiciel GraphPad Prism (San Diego, CA) a été utilisé pour toutes les analyses statistiques. Pour toutes les statistiques, les valeurs p ont été considérées comme significatives pour des valeurs < 0,05. Pour toutes les statistiques, les valeurs p ont été considérées comme significatives pour des valeurs < 0,05. Pour toutes les statistiques, la valeur est définie pour des valeurs <0,05. Pour toutes les statistiques, les valeurs p ont été considérées comme significatives pour des valeurs < 0,05.对于所有统计数据，p 值在值<0.05 时被认为是显着的。对于所有统计数据，p 值在值<0.05 时被认为是显着的。 Pour toutes les statistiques, la valeur est définie pour des valeurs <0,05. Pour toutes les statistiques, les valeurs p ont été considérées comme significatives pour des valeurs < 0,05.Un test t de Student bilatéral a été réalisé sur les données comportant seulement deux comparaisons. Une ANOVA à un ou deux facteurs a été utilisée pour déterminer la significativité des différences entre plusieurs groupes. Lors des tests post hoc, la correction de Tukey a été appliquée pour tenir compte des comparaisons multiples. Les données RNAsec nécessitent des considérations statistiques particulières pour le calcul du FDR et du p-ajustement, comme décrit dans la section Méthodes.
Pour plus d'informations sur la méthodologie de l'étude, veuillez consulter le résumé du rapport de recherche de Nature lié à cet article.