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Il existe un besoin pour un système in vitro fiable capable de reproduire fidèlement l'environnement physiologique du cœur afin de tester des médicaments. La disponibilité limitée des systèmes de culture de tissus cardiaques humains a conduit à des interprétations erronées des effets des médicaments sur le cœur. Nous avons développé un modèle de culture de tissus cardiaques (CTCM) qui stimule électromécaniquement des coupes cardiaques et les soumet à un étirement physiologique pendant les phases systolique et diastolique du cycle cardiaque. Après 12 jours de culture, cette approche a partiellement amélioré la viabilité des coupes cardiaques, mais n'a pas totalement préservé leur intégrité structurelle. Par conséquent, après un criblage de petites molécules, nous avons constaté que l'ajout de 100 nM de triiodothyronine (T3) et de 1 μM de dexaméthasone (Dex) à notre milieu maintenait la microstructure des coupes pendant 12 jours. Associé au traitement T3/Dex, le système CTCM a maintenu les profils transcriptionnels, la viabilité, l'activité métabolique et l'intégrité structurelle au même niveau que le tissu cardiaque frais pendant 12 jours. De plus, l'étirement excessif du tissu cardiaque en culture induit une signalisation cardiaque hypertrophique, ce qui prouve la capacité du CTCM à reproduire les conditions hypertrophiques induites par l'étirement cardiaque. En conclusion, le CTCM peut modéliser la physiologie et la physiopathologie du cœur en culture sur de longues périodes, permettant ainsi un criblage fiable des médicaments.
Avant toute recherche clinique, des systèmes in vitro fiables, capables de reproduire fidèlement l'environnement physiologique du cœur humain, sont nécessaires. Ces systèmes doivent reproduire l'étirement mécanique, la fréquence cardiaque et les propriétés électrophysiologiques modifiées. Les modèles animaux sont couramment utilisés comme plateforme de criblage de la physiologie cardiaque, mais leur fiabilité pour refléter les effets des médicaments sur le cœur humain est limitée1,2. En définitive, le modèle expérimental de culture tissulaire cardiaque idéale (CTCM) est un modèle hautement sensible et spécifique pour diverses interventions thérapeutiques et pharmacologiques, reproduisant fidèlement la physiologie et la physiopathologie du cœur humain3. L'absence d'un tel système limite la découverte de nouveaux traitements contre l'insuffisance cardiaque4,5 et a fait de la cardiotoxicité des médicaments l'une des principales raisons de leur retrait du marché6.
Au cours de la dernière décennie, huit médicaments non cardiovasculaires ont été retirés de l'utilisation clinique car ils provoquent un allongement de l'intervalle QT conduisant à des arythmies ventriculaires et à la mort subite7. Il existe donc un besoin croissant de stratégies de dépistage préclinique fiables pour évaluer l'efficacité et la toxicité cardiovasculaires. L'utilisation récente de cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes induites humaines (hiPS-CM) dans le criblage de médicaments et les tests de toxicité apporte une solution partielle à ce problème. Cependant, la nature immature des hiPS-CM et le manque de complexité multicellulaire du tissu cardiaque constituent des limites majeures de cette méthode. Des études récentes ont montré que cette limitation peut être partiellement surmontée en utilisant des hiPS-CM précoces pour former des hydrogels de tissu cardiaque peu après le début des contractions spontanées et en augmentant progressivement la stimulation électrique au fil du temps. Cependant, ces microtissus hiPS-CM ne possèdent pas les propriétés électrophysiologiques et contractiles matures du myocarde adulte. De plus, le tissu cardiaque humain présente une structure plus complexe, constituée d'un mélange hétérogène de différents types cellulaires, notamment des cellules endothéliales, des neurones et des fibroblastes stromaux, interconnectés par des ensembles spécifiques de protéines de la matrice extracellulaire. Cette hétérogénéité des populations non cardiomyocytaires11,12,13 dans le cœur des mammifères adultes constitue un obstacle majeur à la modélisation du tissu cardiaque à l'aide de types cellulaires individuels. Ces limitations majeures soulignent l'importance de développer des méthodes de culture de tissu myocardique intact dans des conditions physiologiques et pathologiques.
Les coupes minces (300 µm) cultivées de cœur humain se sont révélées être un modèle prometteur de myocarde humain intact. Cette méthode donne accès à un système multicellulaire 3D complet, similaire au tissu cardiaque humain. Cependant, jusqu'en 2019, l'utilisation de coupes cardiaques cultivées était limitée par la courte survie de la culture (24 h). Cela est dû à un certain nombre de facteurs, notamment l'absence d'étirement physico-mécanique, l'interface air-liquide et l'utilisation de milieux simples qui ne répondent pas aux besoins du tissu cardiaque. En 2019, plusieurs groupes de recherche ont démontré que l'intégration de facteurs mécaniques dans les systèmes de culture de tissus cardiaques peut prolonger la durée de vie de la culture, améliorer l'expression cardiaque et imiter la pathologie cardiaque. Deux études élégantes 17 et 18 montrent qu'une charge mécanique uniaxiale a un effet positif sur le phénotype cardiaque pendant la culture. Cependant, ces études n'ont pas utilisé la charge physico-mécanique tridimensionnelle dynamique du cycle cardiaque, car les coupes cardiaques ont été chargées soit avec des forces de traction isométriques 17, soit avec une charge auxotonique linéaire 18 . Ces méthodes d'étirement des tissus ont entraîné la suppression de nombreux gènes cardiaques ou la surexpression de gènes associés à des réponses anormales à l'étirement. Pitoulis et al. 19 ont notamment développé un bain de culture dynamique de tranches de cœur pour la reconstruction du cycle cardiaque en utilisant la rétroaction d'un transducteur de force et des entraînements de tension. Bien que ce système permette une modélisation plus précise du cycle cardiaque in vitro, la complexité et le faible débit de la méthode en limitent l'application. Notre laboratoire a récemment développé un système de culture simplifié utilisant la stimulation électrique et un milieu optimisé pour maintenir la viabilité de sections de tissu cardiaque porcin et humain jusqu'à 6 jours 20,21.
Dans le présent manuscrit, nous décrivons un modèle de culture tissulaire cardiaque (CTCM) utilisant des sections de cœur porcin. Ce modèle intègre des signaux humoraux pour reproduire la physiologie cardiaque tridimensionnelle et la distension physiopathologique au cours du cycle cardiaque. Ce CTCM peut accroître la précision de la prédiction préclinique des médicaments à un niveau jamais atteint auparavant, en fournissant un système cardiaque économique à débit moyen reproduisant la physiologie et la physiopathologie du cœur de mammifère pour les tests précliniques de médicaments.
Français Les signaux mécaniques hémodynamiques jouent un rôle essentiel dans le maintien de la fonction des cardiomyocytes in vitro 22,23,24. Dans le présent manuscrit, nous avons développé un CTCM (Figure 1a) capable d'imiter l'environnement cardiaque adulte en induisant une stimulation électrique et mécanique à des fréquences physiologiques (1,2 Hz, 72 battements par minute). Afin d'éviter un étirement excessif des tissus pendant la diastole, un dispositif d'impression 3D a été utilisé pour augmenter la taille des tissus de 25 % (Fig. 1b). La stimulation électrique induite par le système C-PACE a été programmée pour démarrer 100 ms avant la systole à l'aide d'un système d'acquisition de données afin de reproduire intégralement le cycle cardiaque. Le système de culture tissulaire utilise un actionneur pneumatique programmable (LB Engineering, Allemagne) pour dilater cycliquement une membrane flexible en silicone afin de provoquer l'expansion des tranches de cœur dans la chambre supérieure. Le système était relié à une ligne d'air externe par l'intermédiaire d'un transducteur de pression, ce qui permettait d'ajuster avec précision la pression (± 1 mmHg) et le temps (± 1 ms) (Fig. 1c).
a Fixez la section de tissu à l'anneau de support de 7 mm, représenté en bleu, à l'intérieur de la chambre de culture du dispositif. La chambre de culture est séparée de la chambre à air par une fine membrane en silicone flexible. Placez un joint entre chaque chambre pour éviter les fuites. Le couvercle du dispositif contient des électrodes en graphite qui fournissent une stimulation électrique. b Représentation schématique du grand dispositif pour tissus, de l'anneau de guidage et de l'anneau de support. Les sections de tissu (marron) sont placées sur le dispositif surdimensionné, l'anneau de guidage étant placé dans la rainure sur le bord extérieur du dispositif. À l'aide du guide, placez soigneusement l'anneau de support enduit d'adhésif acrylique pour tissus sur la section de tissu cardiaque. c Graphique montrant le temps de stimulation électrique en fonction de la pression de la chambre à air contrôlée par un actionneur pneumatique programmable (PPD). Un dispositif d'acquisition de données a été utilisé pour synchroniser la stimulation électrique à l'aide de capteurs de pression. Lorsque la pression dans la chambre de culture atteint le seuil défini, un signal d'impulsion est envoyé au C-PACE-EM pour déclencher la stimulation électrique. d Image de quatre CTCM placés sur une étagère d'incubateur. Quatre dispositifs sont reliés à un PPD via un circuit pneumatique, et des capteurs de pression sont insérés dans la valve hémostatique pour surveiller la pression du circuit pneumatique. Chaque dispositif contient six sections de tissu.
Français À l'aide d'un seul actionneur pneumatique, nous avons pu contrôler 4 dispositifs CTCM, chacun pouvant contenir 6 coupes de tissu (Fig. 1d). En CTCM, la pression d'air dans la chambre à air est convertie en pression synchrone dans la chambre à fluide et induit une expansion physiologique de la coupe cardiaque (Figure 2a et Film supplémentaire 1). L'évaluation de l'étirement des tissus à 80 mm Hg. Art. a montré un étirement des coupes de tissu de 25 % (Fig. 2b). Il a été démontré que ce pourcentage d'étirement correspond à une longueur de sarcomère physiologique de 2,2 à 2,3 µm pour une contractilité normale de la coupe cardiaque17,19,25. Le mouvement des tissus a été évalué à l'aide de paramètres de caméra personnalisés (Figure supplémentaire 1). L'amplitude et la vitesse du mouvement des tissus (Fig. 2c, d) correspondaient à l'étirement pendant le cycle cardiaque et au temps pendant la systole et la diastole (Fig. 2b). L'étirement et la vitesse du tissu cardiaque pendant la contraction et la relaxation sont restés constants pendant 12 jours en culture (Fig. 2f). Pour évaluer l'effet de la stimulation électrique sur la contractilité pendant la culture, nous avons développé une méthode permettant de déterminer la déformation active à l'aide d'un algorithme d'ombrage (Fig. 2a, b supplémentaire) et avons pu distinguer les déformations avec et sans stimulation électrique. La même section du cœur (Fig. 2f). Dans la région mobile de la coupe (R6-9), la tension pendant la stimulation électrique était 20 % plus élevée qu'en l'absence de stimulation électrique, ce qui indique la contribution de la stimulation électrique à la fonction contractile.
Français Des traces représentatives de la pression de la chambre à air, de la pression de la chambre à fluide et des mesures du mouvement des tissus confirment que la pression de la chambre modifie la pression de la chambre à fluide, provoquant un mouvement correspondant de la tranche de tissu. b Traces représentatives du pourcentage d'étirement (bleu) des sections de tissu correspondant au pourcentage d'étirement (orange). c Le mouvement mesuré de la tranche cardiaque est cohérent avec la vitesse de mouvement mesurée. (d) Trajectoires représentatives du mouvement cyclique (ligne bleue) et de la vitesse (ligne pointillée orange) dans une tranche du cœur. e Quantification du temps de cycle (n = 19 tranches par groupe, provenant de différents porcs), du temps de contraction (n = 19 tranches par groupe), du temps de relaxation (n = 19 tranches par groupe, provenant de différents porcs), du mouvement des tissus (n = 25 tranches)/groupe provenant de différents porcs), de la vitesse systolique maximale (n = 24(D0), 25(D12) tranches/groupe provenant de différents porcs) et du taux de relaxation maximal (n = 24(D0), 25(D12) tranches/groupe provenant de différents porcs). Le test t bilatéral de Student n'a montré aucune différence significative dans aucun paramètre. f Traces d'analyse de contrainte représentatives de sections de tissus avec (rouge) et sans (bleu) stimulation électrique, dix zones régionales de sections de tissus de la même section. Les panneaux inférieurs montrent la quantification de la différence de pourcentage de contrainte dans les sections de tissus avec et sans stimulation électrique dans dix zones de sections différentes. (n = 8 tranches/groupe de porcs différents, un test t de Student à deux queues est effectué ; ****p < 0,0001, **p < 0,01, *p < 0,05). (n = 8 tranches/groupe de porcs différents, un test t de Student à deux queues est effectué ; ****p < 0,0001, **p < 0,01, *p < 0,05). (n = 8 срезов/группу от разных свиней, проводится двусторонний t-критерий Стьюдента; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05). (n = 8 sections/groupe de porcs différents, test t de Student bilatéral ; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05). （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p < 0,0001，**p < 0,01，*p < 0,05）。 （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p < 0,0001，**p < 0,01，*p < 0,05）。 (n = 8 срезов/группу, от разных свиней, двусторонний критерий Стьюдента; ****p <0,0001, **p <0,01, *p <0,05). (n = 8 sections/groupe, provenant de porcs différents, test t de Student bilatéral ; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05).Les barres d’erreur représentent la moyenne ± l’écart type.
Dans notre précédent système de culture de tranches de cœur biomimétique statique [20, 21], nous avons maintenu la viabilité, la fonction et l'intégrité structurelle des tranches de cœur pendant 6 jours en appliquant une stimulation électrique et en optimisant la composition du milieu. Cependant, après 10 jours, ces chiffres ont fortement chuté. Nous nous référerons aux sections cultivées dans notre précédent système de culture biomimétique statique 20, 21 en conditions de contrôle (Ctrl) et nous utiliserons notre milieu précédemment optimisé comme conditions MC et culture sous stimulation mécanique et électrique simultanée (CTCM). appelé . Tout d'abord, nous avons déterminé que la stimulation mécanique sans stimulation électrique était insuffisante pour maintenir la viabilité des tissus pendant 6 jours (Fig. 3a,b supplémentaire). Il est intéressant de noter qu'avec l'introduction de la stimulation physio-mécanique et électrique à l'aide de STCM, la viabilité des sections de cœur à 12 jours est restée la même que celle des sections de cœur frais dans des conditions MS, mais pas dans des conditions Ctrl, comme le montre l'analyse MTT (Fig. 1). 3a). Français Cela suggère que la stimulation mécanique et la simulation du cycle cardiaque peuvent maintenir les coupes de tissu viables deux fois plus longtemps que ce qui était rapporté dans notre précédent système de culture statique. Cependant, l'évaluation de l'intégrité structurelle des coupes de tissu par immunomarquage de la troponine T cardiaque et de la connexine 43 a montré que l'expression de la connexine 43 était significativement plus élevée dans les tissus MC au jour 12 que dans les témoins le même jour. Cependant, l'expression uniforme de la connexine 43 et la formation du disque Z n'ont pas été entièrement maintenues (Fig. 3b). Nous utilisons un cadre d'intelligence artificielle (IA) pour quantifier l'intégrité structurelle des tissus26, un pipeline d'apprentissage profond basé sur l'image basé sur la coloration de la troponine T et de la connexine43 pour quantifier automatiquement l'intégrité structurelle et la fluorescence des coupes de cœur en termes de force de localisation. Cette méthode utilise un réseau neuronal convolutif (CNN) et un cadre d'apprentissage profond pour quantifier de manière fiable l'intégrité structurelle du tissu cardiaque de manière automatisée et impartiale, comme décrit dans la référence. 26. Le tissu MC a montré une similitude structurelle améliorée au jour 0 par rapport aux coupes témoins statiques. De plus, la coloration au trichrome de Masson a révélé un pourcentage de fibrose significativement plus faible dans les conditions de MS par rapport aux conditions témoins au jour 12 de la culture (Fig. 3c). Bien que le CTCM ait augmenté la viabilité des coupes de tissu cardiaque au jour 12 à un niveau similaire à celui du tissu cardiaque frais, il n'a pas amélioré significativement l'intégrité structurelle des coupes cardiaques.
un graphique à barres montre la quantification de la viabilité MTT de tranches de cœur fraîches (J0) ou de cultures de tranches de cœur pendant 12 jours soit en culture statique (J12 Ctrl) soit en CTCM (J12 MC) (n = 18 (J0), 15 (J12 Ctrl), 12 (J12 MC) tranches/groupe de différents porcs, un test ANOVA à un facteur est effectué ; ####p < 0,0001 par rapport à J0 et **p < 0,01 par rapport à J12 Ctrl). un graphique à barres montre la quantification de la viabilité MTT de tranches de cœur fraîches (J0) ou de cultures de tranches de cœur pendant 12 jours soit en culture statique (J12 Ctrl) soit en CTCM (J12 MC) (n = 18 (J0), 15 (J12 Ctrl), 12 (J12 MC) tranches/groupe de différents porcs, un test ANOVA à un facteur est effectué ; ####p < 0,0001 par rapport à J0 et **p < 0,01 par rapport à J12 Ctrl).l'histogramme montre la quantification de la viabilité des sections de cœur frais MTT (J0) ou de la culture de sections de cœur pendant 12 jours en culture statique (témoin J12) ou CTCM (J12 MC) (n = 18 (J0), 15 (témoin J12). ) ), 12 (J12 MC) sections/groupe provenant de différents porcs, un test ANOVA à un facteur est effectué ;####p < 0,0001 lors de la sélection avec D0 et **p < 0,01 lors de la sélection avec D12 Ctrl). ####p < 0,0001 par rapport à D0 et **p < 0,01 par rapport à D12 Ctrl). a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切片(D0) (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；与D0相比，####p < 0,0001，与D12 Ctrl 相比，**p < 0,01)。 a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切片(D0) ，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；与D0 相比，####p < 0.0001，与D12 Ctrl 相比，**p。)histogramme montrant la quantification de la viabilité du MTT dans des sections de cœur frais (J0) ou des sections de cœur cultivées pendant 12 jours en culture statique (témoin J12) ou CTCM (MC J12) (n = 18 (J0), 15 (témoin J12)), 12 (MC J12) sections/groupe de différents porcs, test ANOVA à un facteur ;####p < 0,0001 pour la sélection avec D0, **p < 0,01 pour la sélection avec D12 Ctrl). ####p < 0,0001 par rapport à D0, **p < 0,01 par rapport à D12 Ctrl).b Troponine-T (vert), connexine 43 (rouge) et DAPI (bleu) dans des coupes cardiaques fraîchement isolées (D0) ou des coupes cardiaques cultivées dans des conditions statiques (Ctrl) ou des conditions CTCM (MC) pendant 12 jours) d'images d'immunofluorescence représentatives (échelle vierge = 100 µm). Quantification par intelligence artificielle de l'intégrité structurelle du tissu cardiaque (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) tranches/groupe chacune provenant de porcs différents, un test ANOVA à un facteur est effectué ; ####p < 0,0001 par rapport à D0 et ****p < 0,0001 par rapport à D12 Ctrl). Quantification par intelligence artificielle de l'intégrité structurelle du tissu cardiaque (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) tranches/groupe chacune provenant de porcs différents, un test ANOVA à un facteur est effectué ; ####p < 0,0001 par rapport à D0 et ****p < 0,0001 par rapport à D12 Ctrl). La structure de la structure de l'ouverture de session est composée d'un seul ordinateur (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) niveaux/groupe de разных свиней, проводится однофакторный test ANOVA; ####p < 0,0001 pour la sélection avec D0 et ****p < 0,0001 pour la sélection avec D12 Ctrl). Quantification de l'intégrité structurelle du tissu cardiaque par intelligence artificielle (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) sections/groupes de différents porcs, test ANOVA à un facteur effectué ; ####p < 0,0001 vs. avec D0 et ****p < 0,0001 par rapport à D12 Ctrl).人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) tranches/groupe de chacun de porcs différents, test ANOVA unidirectionnel ; ####p < 0,0001 与D0相比，****p < 0.0001 与D12 Ctrl 相比）。人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) tranches/groupe de chacun de porcs différents, test ANOVA unidirectionnel ; ####p < 0,0001与D0相比，****p < 0.0001 与D12 Ctrl 相比）。 Искусственный интеллект для количественной оценки структурной целостности сердечной ткани (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) срезов/группу каждой из разных свиней, односторонний test ANOVA; ####p <0,0001 vs. D0 Pour la sélection ****p < 0,0001 pour la sélection avec D12 Ctrl). Intelligence artificielle pour quantifier l'intégrité structurelle du tissu cardiaque (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) sections/groupe de porcs différents, test ANOVA à un facteur ; ####p<0,0001 vs .D0 Pour comparaison ****p < 0,0001 par rapport à D12 Ctrl). c Images représentatives (à gauche) et quantification (à droite) pour les tranches de cœur colorées avec la coloration trichrome de Masson (échelle nue = 500 µm) (n = 10 tranches/groupe provenant chacune d'un porc différent, un test ANOVA à un facteur est effectué ; ####p < 0,0001 par rapport à D0 et ***p < 0,001 par rapport à D12 Ctrl). c Images représentatives (à gauche) et quantification (à droite) pour les tranches de cœur colorées avec la coloration trichrome de Masson (échelle nue = 500 µm) (n = 10 tranches/groupe provenant chacune de porcs différents, un test ANOVA à un facteur est effectué ; #### p < 0,0001 par rapport à D0 et ***p < 0,001 par rapport à D12 Ctrl). c Représentation de la société (sleva) et de la collection d'expositions (sprezov) de la région de Massone (масштаб без покрытия = 500 мкм) (n = 10 срезов/группу от разных свиней, выполняется односторонний test ANOVA; #### p < 0,0001 по сравнению с D0 и ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Images représentatives (à gauche) et quantification (à droite) de sections cardiaques colorées avec la coloration trichrome de Masson (échelle non revêtue = 500 µm) (n = 10 sections/groupe de différents porcs, test ANOVA à un facteur effectué ; #### p < 0,0001 par rapport à J0 et ***p < 0,001 par rapport à J12 Ctrl). c Masson = 500 µm）（n = 10个切片/组，每组来自不同的猪，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0.0001 与D0 相比，***p < 0.001 与D12 Ctrl相比）。 C Masson裸尺度 = 500 µm） （n = 10 个 切片 组 每 组 来自 不同 猪 , 进行 单向 单向 Anova 测试；#### p < 0.0001与D0 相比，***p < 0.001 与D12 Ctrl 相比）。 c Репрезентативные изображения (слева) и количественный анализ (справа) срезов сердца, окрашенных трихромным красителем Массона (n = 500 mcm) (n = 10 срезов/группа, каждый от другой свиньи, протестировано с помощью однофакторного дисперсионного analyse ;### #p < 0,0001 pour le réglage avec D0, ***p < 0,001 pour le réglage avec D12 Ctrl). c Images représentatives (à gauche) et quantification (à droite) de sections cardiaques colorées avec la coloration trichrome de Masson (blanc = 500 µm) (n = 10 sections/groupe, chacune provenant d'un porc différent, testées par analyse de variance à un facteur ;### # p < 0,0001 par rapport à D0, ***p < 0,001 par rapport à D12 Ctrl).Les barres d’erreur représentent la moyenne ± l’écart type.
Nous avons émis l'hypothèse qu'en ajoutant de petites molécules au milieu de culture, l'intégrité des cardiomyocytes pourrait être améliorée et le développement de la fibrose réduit pendant la culture de CTCM. Nous avons donc recherché de petites molécules à l'aide de nos cultures témoins statiques20,21 en raison du faible nombre de facteurs de confusion. La dexaméthasone (Dex), la triiodothyronine (T3) et le SB431542 (SB) ont été choisis pour ce criblage. Ces petites molécules ont déjà été utilisées dans des cultures de hiPSC-CM pour induire la maturation des cardiomyocytes en augmentant la longueur des sarcomères, les tubules T et la vitesse de conduction. De plus, le Dex (un glucocorticoïde) et le SB sont connus pour supprimer l'inflammation29,30. Par conséquent, nous avons testé si l'inclusion d'une ou d'une combinaison de ces petites molécules améliorerait l'intégrité structurelle des sections cardiaques. Pour le criblage initial, la dose de chaque composé a été sélectionnée en fonction des concentrations couramment utilisées dans les modèles de culture cellulaire (1 μM de Dex27, 100 nM de T327 et 2,5 μM de SB31). Après 12 jours de culture, l'association de T3 et de Dex a permis d'obtenir une intégrité structurelle optimale des cardiomyocytes et un remodelage fibreux minimal (Figures supplémentaires 4 et 5). De plus, l'utilisation de concentrations doubles ou doublées de T3 et de Dex a produit des effets délétères par rapport aux concentrations normales (Figures supplémentaires 6a, b).
Français Après un premier criblage, nous avons effectué une comparaison directe de 4 conditions de culture (Figure 4a) : Ctrl : sections cardiaques cultivées dans notre culture statique décrite précédemment en utilisant notre milieu optimisé ; 20.21 TD : T3 et Ctrl avec Dex ajouté le mercredi ; MC : sections cardiaques cultivées dans CTCM en utilisant notre milieu optimisé précédemment ; et MT : CTCM avec T3 et Dex ajoutés au milieu. Après 12 jours de culture, la viabilité des tissus MS et MT est restée la même que dans les tissus frais évalués par le test MTT (Fig. 4b). Il est intéressant de noter que l'ajout de T3 et Dex aux cultures transwell (TD) n'a pas entraîné d'amélioration significative de la viabilité par rapport aux conditions Ctrl, indiquant un rôle important de la stimulation mécanique dans le maintien de la viabilité des sections cardiaques.
un diagramme de conception expérimentale décrivant les quatre conditions de culture utilisées pour évaluer les effets de la stimulation mécanique et de la supplémentation en T3/Dex sur le milieu pendant 12 jours. b Le graphique à barres montre la quantification de la viabilité 12 jours après la culture dans les 4 conditions de culture (Ctrl, TD, MC et MT) par rapport aux tranches de cœur frais (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD et D12 MT), 12 (D12 MC) tranches/groupe de différents porcs, un test ANOVA à un facteur est effectué ; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 par rapport à D0 et **p < 0,01 par rapport à D12 Ctrl). b Le graphique à barres montre la quantification de la viabilité 12 jours après la culture dans les 4 conditions de culture (Ctrl, TD, MC et MT) par rapport aux tranches de cœur frais (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD et D12 MT), 12 (D12 MC) tranches/groupe de différents porcs, un test ANOVA à un facteur est effectué ; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 par rapport à D0 et **p < 0,01 par rapport à D12 ctrl). b L'historique des ventes de colis d'affaires dure 12 jours après la culture de nos 4 employés. Cultivation (contrôle, TD, MC et MT) en fonction de la vitesse de rotation (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD et D12 MT), 12 (D12 MC) срезов/группу от разных свиней, проводится односторонний test ANOVA ; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 en appuyant sur D0 et **p < 0,01 en appuyant sur D12 Ctrl). b Le graphique à barres montre la quantification de la viabilité à 12 jours après la culture dans les 4 conditions de culture (témoin, TD, MC et MT) par rapport aux sections de cœur frais (J0) (n = 18 (J0), 15 (J12 Ctrl, J12 TD et J12 MT), 12 (J12 MC) sections/groupe de différents porcs, test ANOVA à un facteur ; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 par rapport à J0 et **p < 0,01 par rapport à J12 Ctrl). b 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC et MT）与新鲜心脏切片(D0) (n = 18 (D0)、15 (D12 Ctrl、D12 TD et D12 MT), 来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；####p < 0.0001，###p < 0.001 与D0 相比，**p < 0.01 与D12控制）。b 4 12 (D12 MC) b Гистограмма, показывающая все 4 условия культивирования (contrôle, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD et D12 MT), Pour la tranche 12 (D12 MC) saison/groupe, test ANOVA ; ####p <0,0001, ###p <0,001 pour le réglage avec D0, **p <0,01 pour le réglage avec D12). b Histogramme montrant les 4 conditions de culture (témoin, TD, MC et MT) comparées aux sections de cœur frais (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD et D12 MT), provenant de porcs différents 12 (D12 MC) sections/groupe, test ANOVA à un facteur ; ####p<0,0001, ###p<0,001 vs. D0, **p<0,01 vs. témoin D12). c Le graphique à barres montre la quantification du flux de glucose 12 jours après la culture dans les 4 conditions de culture (Ctrl, TD, MC et MT) par rapport aux tranches de cœur frais (D0) (n = 6 tranches/groupe de porcs différents, un test ANOVA à un facteur est effectué ; ###p < 0,001, par rapport à D0 et ***p < 0,001 par rapport à D12 Ctrl). c Le graphique à barres montre la quantification du flux de glucose 12 jours après la culture dans les 4 conditions de culture (Ctrl, TD, MC et MT) par rapport aux tranches de cœur frais (D0) (n = 6 tranches/groupe de porcs différents, un test ANOVA à un facteur est effectué ; ###p < 0,001, par rapport à D0 et ***p < 0,001 par rapport à D12 Ctrl). c L'historique des ventes de colis pour les clients a eu lieu il y a 12 jours après la culture de nos 4 employés. Cultivation (contrôle, TD, MC et MT) pour la sélection de la première partie de la population (D0) (n = 6 parties/groupe de la race animale Выполняется test ANOVA ; ###p < 0,001 pour la sélection avec D0 et ***p < 0,001 pour la sélection avec D12 Ctrl). c L'histogramme montre la quantification du flux de glucose 12 jours après la culture dans les 4 conditions de culture (témoin, TD, MC et MT) par rapport aux sections de cœur frais (D0) (n = 6 sections/groupe de porcs différents, test ANOVA à un facteur effectué ; ###p < 0,001 par rapport à D0 et ***p < 0,001 par rapport à D12 Ctrl). c 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) 相比，培养后12天的葡萄糖通量定量（n = 6 片/组，来自不同猪，单向执行ANOVA 测试；###p < 0.001，与D0 相比，***p < 0.001与D12 Ctrl 相比）。 C 条形图 显示 所有 4 种 条件 （（ctrl 、 td 、 mc et mt） 新鲜 心脏 切片 切片 切片 相比 ， 培养后 后 12 天 的 通量 定量 （n = 6 片/组 ， 来自 猪 ， ， ， ， ， ， ， 猪 猪单向执行ANOVA 测试；###p < 0.001，与D0 相比，***p < 0.001 与D12 Ctrl 相比）。 c Гистограмма, показывающая количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после культивирования всех 4 условий Culture (contrôle, TD, MC et MT) pour la sélection de la première partie de la population (D0) (n = 6 parties/groupe, de la race animale la plus proche, la plus proche Bouilli проведены тесты ANOVA; ###p < 0,001 pour le réglage avec D0, ***p < 0,001 pour le réglage avec D12 (contrôle). c Histogramme montrant la quantification du flux de glucose à 12 jours après la culture pour les 4 conditions de culture (témoin, TD, MC et MT) par rapport aux sections de cœur frais (D0) (n = 6 sections/groupe, provenant de différents porcs, unilatéraux). Des tests ANOVA ont été effectués, ###p < 0,001 par rapport à D0, ***p < 0,001 par rapport à D12 (témoin).d Graphiques d'analyse de la souche de tissus frais (bleu), MC du jour 12 (vert) et MT du jour 12 (rouge) à dix points de coupe de tissu régional (n = 4 tranches/groupe, test ANOVA à un facteur ; il n'y avait pas de différence significative entre les groupes). e Graphique du volcan montrant les gènes différentiellement exprimés dans les coupes de cœur frais (D0) par rapport aux coupes de cœur cultivées dans des conditions statiques (Ctrl) ou dans des conditions MT (MT) pendant 10 à 12 jours. f Carte thermique des gènes des sarcomères pour les coupes de cœur cultivées dans chacune des conditions de culture. Les barres d'erreur représentent la moyenne ± l'écart type.
Français La dépendance métabolique au passage de l'oxydation des acides gras à la glycolyse est une caractéristique de la dédifférenciation des cardiomyocytes. Les cardiomyocytes immatures utilisent principalement le glucose pour la production d'ATP et présentent des mitochondries hypoplasiques avec peu de crêtes5,32. Les analyses d'utilisation du glucose ont montré que dans les conditions MC et MT, l'utilisation du glucose était similaire à celle des tissus du jour 0 (Figure 4c). Cependant, les échantillons Ctrl ont montré une augmentation significative de l'utilisation du glucose par rapport aux tissus frais. Cela indique que la combinaison de CTCM et de T3/Dex améliore la viabilité tissulaire et préserve le phénotype métabolique des coupes cardiaques en culture de 12 jours. De plus, l'analyse de la contrainte a montré que les niveaux de contrainte sont restés les mêmes que dans le tissu cardiaque frais pendant 12 jours dans les conditions MT et MS (Fig. 4d).
Afin d'analyser l'impact global du CTCM et de la T3/Dex sur le paysage transcriptionnel global des coupes cardiaques, nous avons réalisé un séquençage d'ARN sur des coupes cardiaques issues des quatre conditions de culture (Données supplémentaires 1). Il est intéressant de noter que les coupes MT présentaient une forte similarité transcriptionnelle avec le tissu cardiaque frais, avec seulement 16 gènes différentiellement exprimés sur 13 642. Cependant, comme nous l'avons montré précédemment, les coupes Ctrl présentaient 1 229 gènes différentiellement exprimés après 10 à 12 jours de culture (Fig. 4e). Ces données ont été confirmées par qRT-PCR des gènes cardiaques et fibroblastiques (Fig. 7a-c supplémentaires). Il est intéressant de noter que les coupes Ctrl présentaient une régulation négative des gènes cardiaques et du cycle cellulaire et une activation des programmes génétiques inflammatoires. Ces données suggèrent que la dédifférenciation, qui survient normalement après une culture à long terme, est complètement atténuée dans les conditions MT (Fig. 8a,b supplémentaires). Une étude approfondie des gènes du sarcomère a montré que seules les conditions de MT préservent les gènes codant pour le sarcomère (Fig. 4f) et le canal ionique (Fig. 9 supplémentaire), les protégeant ainsi de la suppression dans les conditions Ctrl, TD et MC. Ces données démontrent qu'avec une combinaison de stimulation mécanique et humorale (T3/Dex), le transcriptome des tranches de cœur peut rester similaire à celui des tranches de cœur fraîches après 12 jours de culture.
Ces résultats transcriptionnels sont corroborés par le fait que l'intégrité structurelle des cardiomyocytes dans les coupes cardiaques est mieux préservée en conditions MT pendant 12 jours, comme le montre la connexine 43 intacte et localisée (Fig. 5a). De plus, la fibrose dans les coupes cardiaques en conditions MT était significativement réduite par rapport au Ctrl et similaire à celle des coupes cardiaques fraîches (Fig. 5b). Ces données démontrent que l'association d'une stimulation mécanique et d'un traitement T3/Dex préserve efficacement la structure cardiaque dans les coupes cardiaques en culture.
a Images d'immunofluorescence représentatives de la troponine-T (vert), de la connexine 43 (rouge) et du DAPI (bleu) dans des sections cardiaques fraîchement isolées (J0) ou cultivées pendant 12 jours dans les quatre conditions de culture de sections cardiaques (barre d'échelle = 100 µm). ). Quantification par intelligence artificielle de l'intégrité structurelle du tissu cardiaque (n = 7 (D0 et D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC et D12 MT) tranches/groupe de différents porcs, un test ANOVA à un facteur est effectué ; ####p < 0,0001 par rapport à D0 et *p < 0,05, ou ****p < 0,0001 par rapport à D12 Ctrl). Quantification par intelligence artificielle de l'intégrité structurelle du tissu cardiaque (n = 7 (D0 et D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC et D12 MT) tranches/groupe de différents porcs, un test ANOVA à un facteur est effectué ; #### p < 0,0001 par rapport à D0 et *p < 0,05, ou ****p < 0,0001 par rapport à D12 Ctrl). La structure de la structure de l'environnement de travail du groupe est composée d'un ordinateur de jeu (n = 7 (D0 et D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC et D12 MT) срезов/группу En ce qui concerne la peau du sang, le test d'ANOVA a été prouvé ; #### p < 0,0001 en appuyant sur D0 et *p < 0,05 ou ****p < 0,0001 en appuyant sur D12 Ctrl). Quantification de l'intégrité structurelle du tissu cardiaque à l'aide de l'intelligence artificielle (n = 7 (D0 et D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC et D12 MT) sections/groupe de différents porcs, test ANOVA à un facteur effectué ; #### p < 0,0001 par rapport à D0 et *p < 0,05 ou ****p < 0,0001 par rapport à D12 Ctrl).N = 7 (D0 et D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC et D12) MT）切片/组）进行人工智能量化，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0,0001 与D0 和*p < 0,05 相比，或****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）。对 不同 猪 的 心脏 结构 完整性 （n = 7 （d0 和 d12 ctrl） （5 （d12 td 、 d12 mc 和 d12 mt） 组） 人工智能量 化 进行 单向 单向 单向 测试 ； ########## p < 0,0001 与D0 和*p < 0,05 相比，或****p < 0,0001与D12 Ctrl 相比）。Quantification de l'intégrité structurelle du tissu cardiaque à l'aide de l'intelligence artificielle chez différents porcs (n = 7 (D0 et D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC et D12 MT) sections/groupe) avec un test ANOVA à un facteur ;#### p < 0,0001 en appuyant sur D0 et *p < 0,05 ou ****p < 0,0001 en appuyant sur D12 Ctrl). #### p < 0,0001 par rapport à D0 et *p < 0,05 ou ****p < 0,0001 par rapport à D12 Ctrl). b Images représentatives et quantification des tranches de cœur colorées avec la coloration trichrome de Masson (barre d'échelle = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD et D12 MC), 9 (D12 MT) tranches/groupe de différents porcs, un test ANOVA à un facteur est effectué ; ####p < 0,0001 par rapport à D0 et ***p < 0,001, ou ****p < 0,0001 par rapport à D12 Ctrl). b Images représentatives et quantification des tranches de cœur colorées avec la coloration trichrome de Masson (barre d'échelle = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD et D12 MC), 9 (D12 MT) tranches/groupe de différents porcs, un test ANOVA à un facteur est effectué ; ####p < 0,0001 par rapport à D0 et ***p < 0,001, ou ****p < 0,0001 par rapport à D12 Ctrl). b Représentation de l'installation et de la collecte des eaux usées, des trichromes de la planète Massone (ligne de transport) = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD et D12 MC), 9 (D12 MT) срезов/группу от разных свиней, выполняется односторонний тест ANOVA; ####p < 0,0001 pour la valeur D0 et ***p < 0,001 ou ****p < 0,0001 pour сравнению с D12 Ctrl). b Images représentatives et quantification de sections cardiaques colorées avec la coloration trichrome de Masson (barre d'échelle = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD et D12 MC), 9 (D12 MT) sections/groupe de différents porcs, ANOVA à un facteur réalisée ; ####p < 0,0001 vs. D0 et ***p < 0,001 ou ****p < 0,0001 vs. D12 Ctrl). b Masson = 500 µm）（n = 10（D0、D12 Ctrl、D12 TD和D12 MC），来自不同猪的9 个（D12 MT）切片/组，进行单因素方差分析；####p < 0.0001 与D0 相比，***p < 0,001，或****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）。 b 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 和 量化 （比例 尺 尺 尺 = 500 µm） （n = 10 （d0 、 d12 ctrl 、 d12 td et d12 mc） 来自 不同 的 9 个 d12 mt 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片/组，进行单因素方差分析；####p < 0.0001 与D0相比，***p < 0.001，或****p < 0.0001 与D12 Ctrl 相比）。 b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромом Массона (масштабная линейка = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD et D12 MC), 9 (D12 MT) срезов от разных свиней / группы, один- способ ANOVA ; ####p < 0,0001 pour la sélection avec D0, ***p < 0,001 ou ****p < 0,0001 pour la sélection avec D12 Ctrl). b Images représentatives et quantification de sections cardiaques colorées au trichrome de Masson (barre d'échelle = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD et D12 MC), 9 (D12 MT) sections de différents porcs/groupe, une méthode ANOVA ; ####p < 0,0001 par rapport à D0, ***p < 0,001 ou ****p < 0,0001 par rapport à D12 Ctrl).Les barres d’erreur représentent la moyenne ± l’écart type.
Français Enfin, la capacité du CTCM à imiter l'hypertrophie cardiaque a été évaluée en augmentant l'étirement du tissu cardiaque. Dans le CTCM, la pression maximale de la chambre à air est passée de 80 mmHg à 80 mmHg. Art. (étirement normal) jusqu'à 140 mmHg Art. (Fig. 6a). Cela correspond à une augmentation de 32 % de l'étirement (Fig. 6b), qui a été précédemment montré comme le pourcentage d'étirement correspondant requis pour que les sections cardiaques atteignent une longueur de sarcomère similaire à celle observée dans l'hypertrophie. L'étirement et la vitesse du tissu cardiaque pendant la contraction et la relaxation sont restés constants pendant six jours de culture (Fig. 6c). Le tissu cardiaque issu des conditions MT a été soumis à des conditions d'étirement normal (MT (Normal)) ou de surétirement (MT (OS)) pendant six jours. Déjà après quatre jours de culture, le biomarqueur hypertrophique NT-ProBNP était significativement élevé dans le milieu dans les conditions MT (OS) par rapport aux conditions MT (normales) (Fig. 7a). De plus, après six jours de culture, la taille des cellules dans le MT (OS) (Fig. 7b) a significativement augmenté par rapport aux coupes de cœur MT (normal). De plus, la translocation nucléaire de NFATC4 a été significativement augmentée dans les tissus surétirés (Fig. 7c). Ces résultats montrent le développement progressif d'un remodelage pathologique après hyperdistension et étayent l'idée que le dispositif CTCM peut être utilisé comme plateforme pour étudier la signalisation de l'hypertrophie cardiaque induite par l'étirement.
Français Des traces représentatives de la pression de la chambre à air, de la pression de la chambre à fluide et des mesures de mouvement des tissus confirment que la pression de la chambre modifie la pression de la chambre à fluide, provoquant un mouvement correspondant de la tranche de tissu. b Courbes représentatives du pourcentage d'étirement et du taux d'étirement pour les coupes de tissu normalement étirées (orange) et surétirées (bleu). c Graphique à barres montrant le temps de cycle (n = 19 coupes par groupe, de différents porcs), le temps de contraction (n = 18-19 coupes par groupe, de différents porcs), le temps de relaxation (n = 19 coupes par groupe, de différents porcs), l'amplitude du mouvement des tissus (n = 14 coupes/groupe, de différents porcs), la vitesse systolique maximale (n = 14 coupes/groupe, de différents porcs) et le taux de relaxation maximal (n = 14 (D0), 15 (D6)) coupes/groupes) de différents porcs), le test t de Student bilatéral n'a montré aucune différence significative dans aucun paramètre, indiquant que ces paramètres sont restés constants pendant 6 jours de culture avec surtension. Les barres d’erreur représentent la moyenne ± l’écart type.
a Quantification graphique à barres de la concentration de NT-ProBNP dans les milieux de culture à partir de tranches de cœur cultivées dans des conditions d'étirement normal (Norm) ou d'étirement excessif (OS) du MT (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm et D4 MTOS) tranches/groupe de porcs différents, une ANOVA à deux facteurs est réalisée ; **p < 0,01 par rapport à l'étirement normal). a Quantification graphique à barres de la concentration de NT-ProBNP dans les milieux de culture à partir de tranches de cœur cultivées dans des conditions d'étirement normal (Norm) ou d'étirement excessif (OS) du MT (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm et D4 MTOS) tranches/groupe de porcs différents, une ANOVA à deux facteurs est réalisée ; **p < 0,01 par rapport à l'étirement normal).Histogramme quantitatif de la concentration de NT-ProBNP dans le milieu de culture à partir de tranches de cœur cultivées dans des conditions d'étirement MT normal (norme) ou d'étirement excessif (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm et D4).MTOS) tranches/groupe de différents porcs, une analyse de variance à deux facteurs est réalisée ;**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p < 0,01 par rapport à l'étirement normal). a Système MT (Norm) Système (OS) Système NT-ProBNP浓度的条形图量化（n = 4 (D2 MTNorm)、3（D2 MTOS、D4 MTNorm et D4 MTOS）来自不同猪的切片/组，进行双向方差分析；**与正常拉伸相比，p < 0,01）. une Quantification de la concentration de NT-ProBNP dans des tranches de cœur cultivées dans des conditions d'étirement normal (Norm) ou de surétirement (OS) de MT (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm et D4 MTOS) provenant de différents 猪的切片/组，可以双向方方发发动 ; **par rapport à un étirement normal, p < 0,01).histogramme Quantification des concentrations de NT-ProBNP dans des tranches de cœur cultivées dans des conditions d'étirement normal (norme) ou d'étirement excessif (OS) des MT (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm) et D4 MTOS) tranches/groupe provenant de différents porcs, analyse de variance à deux facteurs ;**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p < 0,01 par rapport à l'étirement normal). b Images représentatives des tranches de cœur colorées avec de la troponine-T et du WGA (à gauche) et quantification de la taille des cellules (à droite) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) cellules/groupe provenant de 10 tranches différentes provenant de porcs différents, un test t de Student à deux queues est effectué ; ****p < 0,0001 par rapport à l'étirement normal). b Images représentatives des tranches de cœur colorées avec de la troponine-T et du WGA (à gauche) et quantification de la taille des cellules (à droite) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) cellules/groupe provenant de 10 tranches différentes provenant de porcs différents, un test t de Student à deux queues est effectué ; ****p < 0,0001 par rapport à l'étirement normal). b Représentation de la pression exercée sur la peau, sur le troponinum-Т et АЗП (слева) et количественного определения размера клеток (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) клеток/группу из 10 разных срезов от разных свиней, два- проводится хвостовой t-критерий Стьюдента; ****p < 0,0001 po сравнению с нормальным растяжением). b Images représentatives de sections cardiaques colorées avec de la troponine-T et de l'AZP (à gauche) et quantification de la taille des cellules (à droite) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) cellules/groupe provenant de 10 sections différentes provenant de différents porcs, un test t de Student à deux queues a été réalisé ; ****p < 0,0001 par rapport à la souche normale). b 用肌钙蛋白-T 和WGA（左）和细胞大小量化（右）染色的心脏切片的代表性图像（n = 330（D6 MTOS），来自不同猪的10 不同切片的369（D6 MTNorm）细胞/组，两进行有尾学生t 检验；与正常拉伸相比，****p < 0.0001）。 b Images représentatives de tranches de cœur colorées avec de la calcaréine-T et du WGA (à gauche) et taille des cellules (à droite) (n = 330 (D6 MTOS), 369 provenant de 10 tranches différentes (D6 MTNorm)) Cellules/Test t；comparé à un étirement normal，****p < 0,0001). b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слева) и количественная оценка размера клеток (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) avec 10 niveaux de tranche de la carte/groupe, selon les critères d'établissement ; ****p < 0,0001 pour une utilisation normale (répartition). b Images représentatives de sections cardiaques colorées avec de la troponine-T et de l'AZP (à gauche) et quantification de la taille des cellules (à droite) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) à partir de 10 sections différentes provenant de porcs différents) Cellules/groupe, critère bilatéral Student's t ; ****p < 0,0001 par rapport à la souche normale). c Images représentatives des tranches de cœur MTOS du jour 0 et du jour 6 immunomarquées pour la troponine-T et NFATC4 et quantification de la translocation de NFATC4 vers les noyaux des CM (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) tranches/groupe de différents porcs, un test t de Student à deux queues est effectué ; *p < 0,05). c Images représentatives des tranches de cœur MTOS du jour 0 et du jour 6 immunomarquées pour la troponine-T et NFATC4 et quantification de la translocation de NFATC4 vers les noyaux des CM (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) tranches/groupe de différents porcs, un test t de Student bilatéral est effectué ; *p < 0,05). c Réglage des paramètres pour les cycles de pression 0 et 6 jours MTOS, immunisations pour la tropone-Т et NFATC4 et l'ouverture de cycle translocation NFATC4 dans le clavier à écran large (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срезов/группу от разных свиней , выполняется двусторонний t-критерий Стьюдента; *p < 0,05). c Images représentatives des sections cardiaques à 0 et 6 jours MTOS, immunomarquées pour la troponine-T et NFATC4, et quantification de la translocation de NFATC4 dans le noyau des cellules caverneuses (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) tranches/groupe de différents porcs) réalisées avec un test t bilatéral de Student ; *p < 0,05). c 用于肌钙蛋白-T et NFATC4 免疫标记的第0 天和第6 天MTOS N = 4 (D0) 、 3 (D6 MTOS)切片/组, 进行双尾学生t 检验；*p < 0.05)。 c Images représentatives de l'immunomarquage calcanine-T et NFATC4 de tranches de cœur 0 et 6 MTOS, et de NFATC4 provenant de différentes quantités de noyaux cellulaires NFATC4 易位至CM (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) 切礼/组,时间双尾学生et 电影；*p < 0,05). c Représentant les niveaux de service MTOS à 0 et 6 jours pour les immunomarquages ​​troponiques-Т et NFATC4 et les services de police transmission NFATC4 dans l'écran CM de la région de la peau (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срез/группа, два- хвостатый t-критерий Стьюдента; *p < 0,05). c Images représentatives de tranches de cœur MTOS aux jours 0 et 6 pour l'immunomarquage de la troponine-T et du NFATC4 et la quantification de la translocation du NFATC4 dans le noyau du CM de différents porcs (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) tranches/groupe, critère t bilatéral de Student ; *p < 0,05).Les barres d’erreur représentent la moyenne ± l’écart type.
La recherche cardiovasculaire translationnelle nécessite des modèles cellulaires reproduisant fidèlement l'environnement cardiaque. Dans cette étude, un dispositif CTCM a été développé et caractérisé pour stimuler des sections ultrafines du cœur. Ce système comprend une stimulation électromécanique physiologiquement synchronisée et un enrichissement en liquide T3 et Dex. Lorsque des sections de cœur porcin ont été exposées à ces facteurs, leur viabilité, leur intégrité structurelle, leur activité métabolique et leur expression transcriptionnelle sont restées identiques à celles du tissu cardiaque frais après 12 jours de culture. De plus, un étirement excessif du tissu cardiaque peut entraîner une hypertrophie cardiaque par hyperextension. Globalement, ces résultats confirment le rôle crucial des conditions de culture physiologiques dans le maintien d'un phénotype cardiaque normal et offrent une plateforme pour le criblage de médicaments.
De nombreux facteurs contribuent à créer un environnement optimal pour le fonctionnement et la survie des cardiomyocytes. Les plus évidents sont liés aux interactions intercellulaires, à la stimulation électromécanique, aux facteurs humoraux et aux substrats métaboliques. Les interactions physiologiques intercellulaires nécessitent des réseaux tridimensionnels complexes de plusieurs types cellulaires, soutenus par une matrice extracellulaire. Ces interactions cellulaires complexes sont difficiles à reconstituer in vitro par co-culture de types cellulaires individuels, mais peuvent être facilement obtenues grâce à la nature organotypique des coupes cardiaques.
L'étirement mécanique et la stimulation électrique des cardiomyocytes sont essentiels au maintien du phénotype cardiaque33,34,35. Bien que la stimulation mécanique ait été largement utilisée pour le conditionnement et la maturation des hiPSC-CM, plusieurs études élégantes ont récemment tenté la stimulation mécanique de tranches de cœur en culture à l'aide d'une charge uniaxiale. Ces études montrent que la charge mécanique uniaxiale 2D a un effet positif sur le phénotype du cœur pendant la culture. Dans ces études, des sections du cœur ont été chargées soit avec des forces de traction isométriques17, soit avec une charge auxotonique linéaire18, soit le cycle cardiaque a été recréé à l'aide d'un retour d'information par transducteur de force et de commandes de tension. Cependant, ces méthodes utilisent l'étirement uniaxial des tissus sans optimisation environnementale, ce qui entraîne la suppression de nombreux gènes cardiaques ou la surexpression de gènes associés à des réponses anormales à l'étirement. Le CTCM décrit ici fournit un stimulus électromécanique 3D qui imite le cycle cardiaque naturel en termes de temps de cycle et d'étirement physiologique (25 % d'étirement, 40 % de systole, 60 % de diastole et 72 battements par minute). Bien que cette stimulation mécanique tridimensionnelle à elle seule ne soit pas suffisante pour maintenir l’intégrité des tissus, une combinaison de stimulation humorale et mécanique utilisant T3/Dex est nécessaire pour maintenir adéquatement la viabilité, la fonction et l’intégrité des tissus.
Les facteurs humoraux jouent un rôle important dans la modulation du phénotype cardiaque adulte. Ceci a été mis en évidence dans des études HiPS-CM dans lesquelles T3 et Dex ont été ajoutés aux milieux de culture pour accélérer la maturation cellulaire. T3 pourrait influencer le transport des acides aminés, des sucres et du calcium à travers les membranes cellulaires36. De plus, T3 favorise l'expression du CMH-α et la régulation négative du CMH-β, favorisant la formation de myofibrilles à contraction rapide dans les cardiomyocytes matures par rapport aux myofibrilles à contraction lente dans le CM fœtal. Le déficit en T3 chez les patients hypothyroïdiens entraîne la perte des bandes myofibrillaires et un ralentissement du développement du tonus37. Dex agit sur les récepteurs des glucocorticoïdes et il a été démontré qu'il augmente la contractilité myocardique dans les cœurs perfusés isolés ;38 cette amélioration serait liée à l'effet sur l'entrée induite par les dépôts de calcium (SOCE)39,40. De plus, Dex se lie à ses récepteurs, provoquant une large réponse intracellulaire qui supprime la fonction immunitaire et l'inflammation30.
Nos résultats indiquent que la stimulation mécanique physique (SM) a amélioré les performances globales de la culture par rapport à la Ctrl, mais n'a pas réussi à maintenir la viabilité, l'intégrité structurelle et l'expression cardiaque sur 12 jours en culture. Par rapport à la Ctrl, l'ajout de T3 et de Dex aux cultures CTCM (MT) a amélioré la viabilité et maintenu des profils de transcription, une intégrité structurelle et une activité métabolique similaires avec du tissu cardiaque frais pendant 12 jours. De plus, en contrôlant le degré d'étirement des tissus, un modèle d'hypertrophie cardiaque induite par hyperextension a été créé à l'aide de la STCM, illustrant la polyvalence du système STCM. Il convient de noter que, bien que le remodelage cardiaque et la fibrose impliquent généralement des organes intacts dont les cellules circulantes peuvent fournir les cytokines appropriées ainsi que la phagocytose et d'autres facteurs de remodelage, des sections du cœur peuvent encore imiter le processus fibrotique en réponse au stress et aux traumatismes dans les myofibroblastes. Ceci a été précédemment évalué dans ce modèle de coupe cardiaque. Il convient de noter que les paramètres du CTCM peuvent être modulés en modifiant la pression, l'amplitude électrique et la fréquence afin de simuler de nombreuses pathologies telles que la tachycardie, la bradycardie et l'assistance circulatoire mécanique (cœur mécanique à vide). Ce système offre ainsi un débit moyen pour les tests de médicaments. La capacité du CTCM à modéliser l'hypertrophie cardiaque induite par le surmenage ouvre la voie à des tests de ce système pour une thérapie personnalisée. En conclusion, la présente étude démontre que l'étirement mécanique et la stimulation humorale sont essentiels au maintien de la culture de coupes de tissu cardiaque.
Bien que les données présentées ici suggèrent que la CTCM constitue une plateforme très prometteuse pour la modélisation du myocarde intact, cette méthode de culture présente certaines limites. La principale limite de la culture CTCM est qu'elle impose des contraintes mécaniques dynamiques continues aux coupes, ce qui empêche la surveillance active des contractions des coupes cardiaques à chaque cycle. De plus, en raison de la petite taille des coupes cardiaques (7 mm), la capacité d'évaluer la fonction systolique en dehors des systèmes de culture à l'aide de capteurs de force traditionnels est limitée. Dans le présent manuscrit, nous avons partiellement surmonté cette limite en évaluant la tension optique comme indicateur de la fonction contractile. Cependant, cette limitation nécessitera des travaux supplémentaires et pourrait être résolue à l'avenir par l'introduction de méthodes de surveillance optique de la fonction des coupes cardiaques en culture, telles que la cartographie optique utilisant du calcium et des colorants sensibles à la tension. Une autre limite de la CTCM est que le modèle de travail ne manipule pas les contraintes physiologiques (précharge et postcharge). En CTCM, la pression a été induite dans des directions opposées pour reproduire un étirement physiologique de 25 % en diastole (étirement complet) et en systole (durée de contraction pendant la stimulation électrique) dans de très grands tissus. Cette limitation devrait être supprimée dans les futures conceptions de CTCM en exerçant une pression adéquate sur le tissu cardiaque des deux côtés et en appliquant les relations pression-volume exactes qui se produisent dans les cavités du cœur.
Le remodelage induit par l'hyperétirement décrit dans ce manuscrit se limite à imiter les signaux d'hyperétirement hypertrophique. Ce modèle peut donc contribuer à l'étude de la signalisation hypertrophique induite par l'étirement sans recourir à des facteurs humoraux ou neuronaux (qui n'existent pas dans ce système). D'autres études sont nécessaires pour accroître la multiplicité des CTCM, par exemple, la co-culture avec des cellules immunitaires, des facteurs humoraux plasmatiques circulants et l'innervation, lorsque la co-culture avec des cellules neuronales améliorera les possibilités de modélisation de la maladie par CTCM.
Treize porcs ont été utilisés dans cette étude. Toutes les procédures animales ont été réalisées conformément aux directives institutionnelles et ont été approuvées par le Comité institutionnel de protection et d'utilisation des animaux de l'Université de Louisville. La crosse aortique a été clampée et le cœur a été perfusé avec 1 L de cardioplégie stérile (110 mM NaCl, 1,2 mM CaCl2, 16 mM KCl, 16 mM MgCl2, 10 mM NaHCO3, 5 U/mL d'héparine, pH jusqu'à 7,4) ; les cœurs ont été conservés dans une solution cardioplégique glacée jusqu'à leur transport au laboratoire sur glace, ce qui prend généralement moins de 10 minutes. les cœurs ont été conservés dans une solution cardioplégique glacée jusqu'à leur transport au laboratoire sur glace, ce qui prend généralement moins de 10 minutes. сердца хранили в ледяном кардиоплегическом растворе до транспортировки в LABораторию на льду, что обычно занимает <10 min. les cœurs ont été conservés dans une solution cardioplégique glacée jusqu'au transport au laboratoire sur glace, ce qui prend généralement moins de 10 minutes.将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钟。将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钟。 Prenez le service de cardio-training en charge du transport vers le laboratoire de votre enfant, généralement <10 minutes. Garder les cœurs sur glace en cardioplégie jusqu'au transport au laboratoire sur glace, généralement < 10 min.
Le dispositif CTCM a été développé avec le logiciel de conception assistée par ordinateur (CAO) SolidWorks. Les chambres de culture, les séparateurs et les chambres à air sont fabriqués en plastique acrylique transparent CNC. La bague d'appui de 7 mm de diamètre est en polyéthylène haute densité (PEHD) au centre et comporte une rainure pour joint torique destinée à recevoir le joint torique en silicone servant à l'étanchéité du milieu situé en dessous. Une fine membrane de silice sépare la chambre de culture de la plaque de séparation. Cette membrane est découpée au laser dans une feuille de silicone de 0,02 pouce d'épaisseur et présente une dureté de 35A. Les joints inférieur et supérieur en silicone sont découpés au laser dans une feuille de silicone de 1/16 pouce d'épaisseur et présentent une dureté de 50A. Des vis et des écrous à oreilles en acier inoxydable 316L assurent l'étanchéité du bloc.
Un circuit imprimé dédié est conçu pour être intégré au système C-PACE-EM. Les connecteurs de la machine suisse sont reliés aux électrodes en graphite par des fils de cuivre argentés et des vis en bronze 0-60 vissées dans les électrodes. Le circuit imprimé est placé dans le capot de l'imprimante 3D.
Le dispositif CTCM est contrôlé par un actionneur pneumatique programmable (PPD) qui crée une pression circulatoire contrôlée, similaire à un cycle cardiaque. À mesure que la pression à l'intérieur de la chambre à air augmente, la membrane flexible en silicone se dilate vers le haut, forçant le fluide sous le tissu. La zone de tissu est alors étirée par cette expulsion de liquide, imitant l'expansion physiologique du cœur pendant la diastole. Au pic de relaxation, une stimulation électrique a été appliquée via des électrodes en graphite, ce qui a réduit la pression dans la chambre à air et provoqué la contraction des sections de tissu. À l'intérieur du tube se trouve une valve hémostatique équipée d'un capteur de pression pour détecter la pression du système d'air. La pression détectée par le capteur est transmise à un collecteur de données connecté à l'ordinateur portable. Cela permet une surveillance continue de la pression à l'intérieur de la chambre à gaz. Lorsque la pression maximale de la chambre est atteinte (norme 80 mmHg, 140 mmHg OS), le dispositif d'acquisition de données reçoit l'ordre d'envoyer un signal au système C-PACE-EM afin de générer un signal de tension biphasique pendant 2 ms, réglé à 4 V.
Français Des sections cardiaques ont été obtenues et les conditions de culture dans 6 puits ont été réalisées comme suit : Transférer les cœurs récoltés du récipient de transfert vers un plateau contenant de la cardioplégie froide (4 °C). Le ventricule gauche a été isolé avec une lame stérile et coupé en morceaux de 1 à 2 cm3. Ces blocs de tissu ont été fixés à des supports de tissu avec de la colle tissulaire et placés dans un bain de tissu de microtome vibrant contenant une solution de Tyrode et continuellement oxygénée (3 g/L de 2,3-butanedione monooxime (BDM), 140 mM NaCl (8,18 g) . ), 6 mM KCl (0,447 g), 10 mM D-glucose (1,86 g), 10 mM HEPES (2,38 g), 1 mM MgCl2 (1 ml de solution 1 M), 1,8 mM CaCl2 (1,8 ml de solution 1 M), jusqu'à 1 L ddH2O). Le microtome vibrant a été réglé pour couper des tranches de 300 µm d'épaisseur à une fréquence de 80 Hz, une amplitude de vibration horizontale de 2 mm et une vitesse d'avancement de 0,03 mm/s. Le bain de tissus était entouré de glace pour maintenir la solution froide et la température était maintenue à 4 °C. Les coupes de tissus ont été transférées du bain du microtome vers un bain d'incubation contenant une solution de Tyrode oxygénée en continu sur glace jusqu'à obtention d'un nombre suffisant de coupes pour une plaque de culture. Pour les cultures transwell, les coupes de tissus ont été fixées sur des supports stériles en polyuréthane de 6 mm de large et placées dans 6 ml de milieu optimisé (milieu 199, supplément ITS 1x, FBS 10 %, VEGF 5 ng/ml, FGF alcalin 10 ng/ml et antifongique 2X). Une stimulation électrique (10 V, fréquence 1,2 Hz) a été appliquée aux coupes de tissus via le C-Pace. Pour les conditions TD, de la T3 et de la Dex fraîches ont été ajoutées à 100 nM et 1 μM à chaque changement de milieu. Le milieu est saturé en oxygène avant d'être remplacé trois fois par jour. Les coupes de tissus ont été cultivées dans un incubateur à 37 °C et 5 % de CO2.
Pour les cultures CTCM, des coupes de tissus ont été placées sur une imprimante 3D sur mesure dans une boîte de Petri contenant une solution de Tyrode modifiée. Le dispositif est conçu pour augmenter la taille de la tranche de cœur de 25 % de la surface de l'anneau de support. Ceci permet d'éviter que les coupes de cœur ne s'étirent après leur transfert de la solution de Tyrode au milieu et pendant la diastole. À l'aide de colle histoacrylique, des coupes de 300 µm d'épaisseur ont été fixées sur un anneau de support de 7 mm de diamètre. Après avoir fixé les coupes de tissus à l'anneau de support, coupez les coupes excédentaires et replacez-les dans le bain de solution de Tyrode sur glace (4 °C) jusqu'à ce que suffisamment de coupes soient préparées pour un dispositif. Le temps de traitement total pour tous les dispositifs ne doit pas dépasser 2 heures. Après avoir fixé 6 coupes de tissus à leurs anneaux de support, le dispositif CTCM a été assemblé. La chambre de culture CTCM est pré-remplie de 21 ml de milieu préoxygéné. Transférez les coupes de tissus dans la chambre de culture et éliminez soigneusement les bulles d'air à l'aide d'une pipette. La coupe de tissu est ensuite guidée dans l'orifice et délicatement pressée. Enfin, placez le capuchon de l'électrode sur le dispositif et transférez-le dans l'incubateur. Connectez ensuite le CTCM au tube à air et au système C-PACE-EM. L'actionneur pneumatique s'ouvre et la vanne d'air ouvre le CTCM. Le système C-PACE-EM a été configuré pour délivrer 4 V à 1,2 Hz pendant une stimulation biphasique de 2 ms. Le milieu de culture a été changé deux fois par jour et les électrodes une fois par jour afin d'éviter l'accumulation de graphite sur les électrodes. Si nécessaire, les coupes de tissu peuvent être retirées de leurs puits de culture pour éliminer les bulles d'air qui auraient pu se loger sous elles. Pour le traitement MT, du T3/Dex frais a été ajouté à chaque changement de milieu avec 100 nM de T3 et 1 μM de Dex. Les dispositifs CTCM ont été cultivés dans un incubateur à 37 °C et 5 % de CO2.
Pour obtenir des trajectoires étirées de tranches de cœur, un système de caméra spécifique a été développé. Un appareil photo reflex (Canon Rebel T7i, Canon, Tokyo, Japon) a été utilisé avec un objectif macro Navitar Zoom 7000 18-108 mm (Navitar, San Francisco, CA). La visualisation a été réalisée à température ambiante après remplacement du milieu par un milieu neuf. La caméra est positionnée à un angle de 51° et la vidéo est enregistrée à 30 images par seconde. Un logiciel open source (MUSCLEMOTION43) a d'abord été utilisé avec Image-J pour quantifier le mouvement des tranches de cœur. Le masque a été créé avec MATLAB (MathWorks, Natick, MA, États-Unis) afin de définir les régions d'intérêt pour les tranches de cœur battant afin d'éviter le bruit. Des masques segmentés manuellement sont appliqués à toutes les images d'une séquence d'images, puis transmis au plug-in MUSCLEMOTION. Muscle Motion utilise l'intensité moyenne des pixels de chaque image pour quantifier son mouvement par rapport à l'image de référence. Les données ont été enregistrées, filtrées et utilisées pour quantifier la durée du cycle et évaluer l'étirement des tissus pendant le cycle cardiaque. La vidéo enregistrée a été post-traitée à l'aide d'un filtre numérique à phase zéro du premier ordre. Pour quantifier l'étirement des tissus (crête à crête), une analyse crête à crête a été réalisée afin de distinguer les pics des creux dans le signal enregistré. De plus, une correction de tendance est effectuée à l'aide d'un polynôme du sixième ordre pour éliminer la dérive du signal. Un code a été développé sous MATLAB pour déterminer le mouvement global des tissus, la durée du cycle, le temps de relaxation et le temps de contraction (code de programme supplémentaire 44).
Pour l'analyse de la déformation, en utilisant les mêmes vidéos créées pour l'évaluation de l'étirement mécanique, nous avons d'abord tracé deux images représentant les pics de mouvement (les points de mouvement les plus élevés (supérieur) et les plus bas (inférieurs)) selon le logiciel MUSCLEMOTION. Nous avons ensuite segmenté les régions tissulaires et appliqué un algorithme d'ombrage au tissu segmenté (Fig. 2a supplémentaire). Le tissu segmenté a ensuite été divisé en dix sous-surfaces, et la contrainte sur chaque surface a été calculée à l'aide de l'équation suivante : Déformation = (Sup-Sdown)/Sdown, où Sup et Sdown sont les distances de la forme par rapport aux ombres supérieure et inférieure du tissu, respectivement (Fig. 2b supplémentaire).
Les coupes cardiaques ont été fixées dans du paraformaldéhyde à 4 % pendant 48 heures. Les tissus fixés ont été déshydratés dans du saccharose à 10 % et 20 % pendant 1 h, puis dans du saccharose à 30 % pendant la nuit. Les coupes ont ensuite été incluses dans un composé à température de coupe optimale (composé OCT) et progressivement congelées dans un bain d'isopentane/glace sèche. Conserver les blocs d'inclusion OCT à -80 °C jusqu'à leur séparation. Les lames ont été préparées sous forme de coupes de 8 μm d'épaisseur.
Pour éliminer l'OCT des coupes cardiaques, chauffer les lames sur un bloc chauffant à 95 °C pendant 5 minutes. Ajouter 1 ml de PBS à chaque lame et incuber 30 minutes à température ambiante, puis imprégner les coupes en ajoutant 0,1 % de Triton-X dans du PBS pendant 15 minutes à température ambiante. Pour empêcher la liaison des anticorps non spécifiques à l'échantillon, ajouter 1 ml de solution de BSA à 3 % aux lames et incuber 1 heure à température ambiante. La BSA a ensuite été retirée et les lames ont été lavées avec du PBS. Marquer chaque échantillon au crayon. Des anticorps primaires (dilués à 1:200 dans 1 % de BSA) (connexine 43 (Abcam ; #AB11370), NFATC4 (Abcam ; #AB99431) et troponine-T (Thermo Scientific ; #MA5-12960) ont été ajoutés sur 90 minutes, puis des anticorps secondaires (dilués à 1:200 dans 1 % de BSA) contre la souris Alexa Fluor 488 (Thermo Scientific ; #A16079), contre le lapin Alexa Fluor 594 (Thermo Scientific ; #T6391) pendant 90 minutes supplémentaires. Lavés 3 fois avec du PBS. Pour distinguer la coloration cible du bruit de fond, nous avons utilisé uniquement l'anticorps secondaire comme contrôle. Enfin, une coloration nucléaire DAPI a été ajoutée et les lames ont été placées dans un vectashield (Vector Laboratories) et scellées avec du vernis à ongles. -x grossissement) et microscope Keyence avec un grossissement 40x.
Le WGA-Alexa Fluor 555 (Thermo Scientific ; n° W32464) à 5 µg/ml dans du PBS a été utilisé pour la coloration WGA et appliqué sur des coupes fixées pendant 30 minutes à température ambiante. Les lames ont ensuite été lavées avec du PBS, puis du noir Soudan a été ajouté à chaque lame et incubées pendant 30 minutes. Les lames ont ensuite été lavées avec du PBS et du milieu d'inclusion Vectashield a été ajouté. Les lames ont été visualisées au microscope Keyence avec un grossissement de 40 x.
L'OCT a été retiré des échantillons comme décrit ci-dessus. Après avoir retiré l'OCT, les lames ont été immergées dans la solution de Bouin pendant une nuit. Les lames ont ensuite été rincées à l'eau distillée pendant 1 heure, puis placées dans une solution de fuchsine acide d'aloès Bibrich pendant 10 minutes. Les lames ont ensuite été lavées à l'eau distillée et placées dans une solution de 5 % de phosphomolybdène/5 % d'acide phosphotungstique pendant 10 minutes. Sans rinçage, les lames ont été transférées directement dans la solution de bleu d'aniline pendant 15 minutes. Les lames ont ensuite été lavées à l'eau distillée et placées dans une solution d'acide acétique à 1 % pendant 2 minutes. Les lames ont été séchées dans de l'éthanol 200 N, puis transférées dans du xylène. Les lames colorées ont été visualisées à l'aide d'un microscope Keyence avec un objectif 10x. Le pourcentage de fibrose a été quantifié à l'aide du logiciel Keyence Analyzer.
Test de viabilité cellulaire CyQUANT™ MTT (Invitrogen, Carlsbad, CA), référence V13154, conforme au protocole du fabricant avec quelques modifications. Un poinçon chirurgical de 6 mm de diamètre a notamment été utilisé pour garantir une taille de tissu uniforme lors de l'analyse MTT. Les tissus ont été étalés individuellement dans les puits d'une plaque 12 puits contenant le substrat MTT, conformément au protocole du fabricant. Les coupes sont incubées à 37 °C pendant 3 heures et le tissu vivant métabolise le substrat MTT pour former un composé formazan violet. Remplacer la solution de MTT par 1 ml de DMSO et incuber à 37 °C pendant 15 minutes pour extraire le formazan violet des coupes cardiaques. Les échantillons ont été dilués au 1/10 dans du DMSO dans des plaques 96 puits à fond transparent et l'intensité de la coloration violette a été mesurée à 570 nm à l'aide d'un lecteur de plaques Cytation (BioTek). Les mesures ont été normalisées en fonction du poids de chaque coupe cardiaque.
Le milieu de culture en tranches de cœur a été remplacé par un milieu contenant 1 μCi/ml de [5-3H]-glucose (Moravek Biochemicals, Brea, CA, États-Unis) pour le dosage de l'utilisation du glucose, comme décrit précédemment. Après 4 heures d'incubation, ajouter 100 µl de milieu à un tube à microcentrifugation ouvert contenant 100 µl de HCl 0,2 N. Le tube a ensuite été placé dans un tube à scintillation contenant 500 µl de dH2O pour évaporer le [3H]2O pendant 72 heures à 37 °C. Retirer ensuite le tube à microcentrifugation du tube à scintillation et ajouter 10 ml de liquide de scintillation. Les numérations par scintillation ont été réalisées à l'aide d'un analyseur à scintillation liquide Tri-Carb 2900TR (Packard Bioscience Company, Meriden, CT, États-Unis). L'utilisation du glucose a ensuite été calculée en tenant compte de l'activité spécifique du glucose [5-3H], de l'équilibre incomplet et du bruit de fond, de la dilution du glucose [5-3H] en glucose non marqué et de l'efficacité du compteur à scintillation. Les données sont normalisées en fonction de la masse des sections cardiaques.
Après homogénéisation des tissus dans du Trizol, l'ARN a été isolé des coupes cardiaques à l'aide du kit Qiagen miRNeasy Micro Kit n° 210874, conformément au protocole du fabricant. La préparation de la banque d'ARNsec, le séquençage et l'analyse des données ont été réalisés comme suit :
1 μg d'ARN par échantillon a servi de matériel de départ pour la préparation de la banque d'ARN. Les banques de séquençage ont été générées à l'aide du kit de préparation de banque d'ARN NEBNext UltraTM pour Illumina (NEB, États-Unis), conformément aux recommandations du fabricant, et des codes d'index ont été ajoutés aux séquences d'attributs de chaque échantillon. En bref, l'ARNm a été purifié à partir de l'ARN total à l'aide de billes magnétiques fixées par des oligonucléotides poly-T. La fragmentation est réalisée à haute température à l'aide de cations divalents dans le tampon de réaction de synthèse du premier brin NEBNext (5X). L'ADNc du premier brin a été synthétisé à l'aide d'amorces hexamères aléatoires et de la transcriptase inverse M-MuLV (ARNase H-). L'ADNc du second brin est ensuite synthétisé à l'aide d'ADN polymérase I et d'ARNase H. Les extrémités restantes sont converties en extrémités franches par l'activité exonucléase/polymérase. Après adénylation de l'extrémité 3' du fragment d'ADN, un adaptateur NEBNext avec une structure en épingle à cheveux lui est fixé afin de le préparer à l'hybridation. Pour la sélection de fragments d'ADNc de longueur préférée (150-200 pb), les fragments de la banque ont été purifiés à l'aide du système AMPure XP (Beckman Coulter, Beverly, États-Unis). Ensuite, 3 μl d'enzyme USER (NEB, États-Unis) avec de l'ADNc de taille sélectionnée et ligaturé avec un adaptateur ont été utilisés pendant 15 minutes à 37 °C, puis pendant 5 minutes à 95 °C avant la PCR. La PCR a ensuite été réalisée à l'aide de l'ADN polymérase haute fidélité Phusion, d'amorces PCR universelles et d'amorces Index (X). Enfin, les produits de PCR ont été purifiés (système AMPure XP) et la qualité de la banque a été évaluée sur un système Agilent Bioanalyzer 2100. La banque d'ADNc a ensuite été séquencée à l'aide d'un séquenceur Novaseq. Les fichiers d'images brutes d'Illumina ont été convertis en lectures brutes grâce à CASAVA Base Calling. Les données brutes sont stockées dans des fichiers au format FASTQ(fq) contenant les séquences de lecture et les qualités de bases correspondantes. Sélectionnez HISAT2 pour faire correspondre les lectures de séquençage filtrées au génome de référence Sscrofa11.1. En général, HISAT2 prend en charge les génomes de toutes tailles, y compris ceux de plus de 4 milliards de bases, et des valeurs par défaut sont définies pour la plupart des paramètres. HISAT2, le système le plus rapide actuellement disponible, permet d'aligner efficacement les lectures d'épissage issues des données de séquençage d'ARN, avec une précision égale ou supérieure à celle de toute autre méthode.
L'abondance des transcrits reflète directement le niveau d'expression génique. Les niveaux d'expression génique sont évalués par l'abondance des transcrits (nombre de séquençages) associés au génome ou aux exons. Le nombre de lectures est proportionnel aux niveaux d'expression génique, à la longueur du gène et à la profondeur de séquençage. Les FPKM (fragments par millier de paires de bases de transcrit séquencés par million de paires de bases) ont été calculés et les valeurs de p de l'expression différentielle ont été déterminées à l'aide du package DESeq2. Nous avons ensuite calculé le taux de fausses découvertes (FDR) pour chaque valeur de p en utilisant la méthode Benjamini-Hochberg9 basée sur la fonction R intégrée « p.adjust ».
Français L'ARN isolé de sections cardiaques a été converti en ADNc à une concentration de 200 ng/μl en utilisant le SuperScript IV Vilo Master mix de Thermo (Thermo, n° de catalogue 11756050). La RT-PCR quantitative a été réalisée en utilisant une plaque de réaction transparente Applied Biosystems Endura Plate Microamp 384 puits (Thermo, n° de catalogue 4483319) et un adhésif optique Microamp (Thermo, n° de catalogue 4311971). Le mélange réactionnel était composé de 5 µl de Taqman Fast Advanced Master mix (Thermo, n° de catalogue 4444557), 0,5 µl de Taqman Primer et 3,5 µl d'H2O mélangés par puits. Des cycles de qPCR standard ont été exécutés et les valeurs CT ont été mesurées à l'aide d'un instrument de PCR en temps réel Applied Biosystems Quantstudio 5 (module 384 puits ; produit n° A28135). Les amorces Taqman ont été achetées auprès de Thermo (GAPDH (Ss03375629_u1), PARP12 (Ss06908795_m1), PKDCC (Ss06903874_m1), CYGB (Ss06900188_m1), RGL1 (Ss06868890_m1), ACTN1 (Ss01009508_mH), GATA4 (Ss03383805_u1), GJA1 (Ss03374839_u1), COL1A2 (Ss03375009_u1), COL3A1 (Ss04323794_m1), ACTA2 (Ss04245588_m1) Les valeurs CT de tous les échantillons ont été normalisées par rapport au gène de ménage GAPDH.
La libération du NT-ProBNP dans le milieu a été évaluée à l'aide du kit NT-ProBNP (porc) (réf. MBS2086979, MyBioSource) conformément au protocole du fabricant. 250 µl de chaque échantillon et étalon ont été ajoutés en double dans chaque puits. Immédiatement après l'ajout de l'échantillon, ajouter 50 µl de réactif de dosage A dans chaque puits. Agiter délicatement la plaque et sceller avec un produit d'étanchéité. Les comprimés ont ensuite été incubés à 37 °C pendant 1 heure. La solution a ensuite été aspirée et les puits ont été lavés 4 fois avec 350 µl de solution de lavage 1X, en incubant la solution de lavage pendant 1 à 2 minutes à chaque fois. Ajouter ensuite 100 µl de réactif de dosage B par puits et sceller avec un produit d'étanchéité. Le comprimé a été agité délicatement et incubé à 37 °C pendant 30 minutes. Aspirer la solution et laver les puits 5 fois avec 350 µl de solution de lavage 1X. Ajouter 90 µl de solution de substrat dans chaque puits et sceller la plaque. Incuber la plaque à 37 °C pendant 10 à 20 minutes. Ajouter 50 µl de solution d'arrêt dans chaque puits. La plaque a été immédiatement mesurée à l'aide d'un lecteur de plaques Cytation (BioTek) réglé à 450 nm.
Des analyses de puissance ont été effectuées pour choisir les tailles de groupe qui fourniront une puissance > 80 % pour détecter un changement absolu de 10 % dans le paramètre avec un taux d'erreur de type I de 5 %. Des analyses de puissance ont été effectuées pour choisir les tailles de groupe qui fourniront une puissance > 80 % pour détecter un changement absolu de 10 % dans le paramètre avec un taux d'erreur de type I de 5 %. L'analyse des revenus du groupe de travail est de >80% pour l'exploitation 10% absolus параметра с 5% частотой ошибок типа I. Une analyse de puissance a été réalisée pour sélectionner des tailles de groupe qui fourniraient une puissance > 80 % pour détecter un changement de paramètre absolu de 10 % avec un taux d'erreur de type I de 5 %.进行功效分析以选择将提供> 80% de réduction pour 10% de réduction et 5% de réduction pour moi.进行功效分析以选择将提供> 80% de réduction pour 10% de réduction et 5% de réduction pour moi. Il est prouvé que l'analyse des avantages pour les groupes de votre secteur d'activité est supérieure à 80 % pour l'exploitation de 10 % d'absolu. изменения параметров и 5% частоты ошибок типа I. Une analyse de puissance a été réalisée pour sélectionner une taille de groupe qui fournirait une puissance > 80 % pour détecter un changement de paramètre absolu de 10 % et un taux d'erreur de type I de 5 %.Des coupes de tissus ont été sélectionnées aléatoirement avant l'expérience. Toutes les analyses ont été réalisées en aveugle et les échantillons n'ont été décodés qu'après l'analyse de toutes les données. Le logiciel GraphPad Prism (San Diego, Californie) a été utilisé pour réaliser toutes les analyses statistiques. Pour toutes les statistiques, les valeurs p ont été considérées comme significatives à des valeurs < 0,05. Pour toutes les statistiques, les valeurs p ont été considérées comme significatives à des valeurs < 0,05. Pour toutes les statistiques, la valeur est définie pour des valeurs <0,05. Pour toutes les statistiques, les valeurs p ont été considérées comme significatives à des valeurs < 0,05.对于所有统计数据，p 值在值<0.05 时被认为是显着的。对于所有统计数据，p 值在值<0.05 时被认为是显着的。 Pour toutes les statistiques, la valeur est définie pour des valeurs <0,05. Pour toutes les statistiques, les valeurs p ont été considérées comme significatives à des valeurs < 0,05.Un test t bilatéral de Student a été réalisé sur les données avec seulement deux comparaisons. Une ANOVA unidirectionnelle ou bidirectionnelle a été utilisée pour déterminer la significativité entre plusieurs groupes. Lors des tests post-hoc, la correction de Tukey a été appliquée pour tenir compte des comparaisons multiples. Les données RNAsec nécessitent des considérations statistiques particulières pour le calcul du FDR et du p.adjust, comme décrit dans la section Méthodes.
Pour plus d’informations sur la conception de l’étude, consultez le résumé du rapport de recherche Nature lié à cet article.