Hatur nuhun parantos nganjang ka Nature.com. Versi browser anu anjeun anggo gaduh dukungan CSS anu terbatas. Pikeun pangalaman anu pangsaéna, kami nyarankeun anjeun nganggo browser anu diénggalan (atanapi mareuman Modeu Kompatibilitas dina Internet Explorer). Samentawis waktos, pikeun mastikeun dukungan anu terus-terusan, kami bakal ngarender situs tanpa gaya sareng JavaScript.
Aya kabutuhan pikeun sistem in vitro anu tiasa dipercaya anu tiasa sacara akurat ngahasilkeun deui lingkungan fisiologis jantung pikeun uji ubar. Kasadiaan sistem kultur jaringan jantung manusa anu terbatas parantos nyababkeun interpretasi anu teu akurat ngeunaan épék ubar jantung. Di dieu, kami parantos ngembangkeun modél kultur jaringan jantung (CTCM) anu sacara éléktromékanis ngarangsang irisan jantung sareng ngalaman peregangan fisiologis salami fase sistolik sareng diastolik tina siklus jantung. Saatos 12 dinten kultur, pendekatan ieu sabagian ningkatkeun daya tahan bagian jantung, tapi henteu sapinuhna ngajaga integritas strukturalna. Ku alatan éta, saatos panyaringan molekul leutik, kami mendakan yén panambahan 100 nM triiodothyronine (T3) sareng 1 μM dexamethasone (Dex) kana média kami ngajaga mikrostruktur bagian salami 12 dinten. Dikombinasikeun sareng perawatan T3/Dex, sistem CTCM ngajaga profil transkripsi, daya tahan, aktivitas métabolik, sareng integritas struktural dina tingkat anu sami sareng jaringan jantung seger salami 12 dinten. Salaku tambahan, peregangan jaringan jantung anu kaleuleuwihi dina kultur ngainduksi sinyal jantung hipertrofik, nyayogikeun bukti pikeun kamampuan CTCM pikeun niru kaayaan hipertrofik anu diinduksi ku peregangan jantung. Kasimpulanana, CTCM tiasa modél fisiologi sareng patofisiologi jantung dina kultur salami waktos anu lami, anu ngamungkinkeun panyaringan ubar anu tiasa dipercaya.
Sateuacan panalungtikan klinis, diperyogikeun sistem in vitro anu tiasa dipercaya anu tiasa sacara akurat ngahasilkeun deui lingkungan fisiologis jantung manusa. Sistem sapertos kitu kedah niru parobahan regangan mékanis, denyut jantung, sareng sipat éléktrofisiologis. Modél sato umumna dianggo salaku platform panyaringan pikeun fisiologi jantung kalayan reliabilitas anu terbatas dina ngagambarkeun pangaruh ubar dina jantung manusa1,2. Pamustunganana, Modél Ékspériméntal Kultur Jaringan Jantung Ideal (CTCM) mangrupikeun modél anu sénsitip pisan sareng spésifik pikeun rupa-rupa intervensi terapi sareng farmakologis, sacara akurat ngahasilkeun deui fisiologi sareng patofisiologi jantung manusa3. Henteuna sistem sapertos kitu ngawatesan panemuan pangobatan énggal pikeun gagal jantung4,5 sareng parantos nyababkeun kardiotoksikitas ubar salaku alesan utama pikeun kaluar ti pasar6.
Salila dasawarsa ka tukang, dalapan ubar non-kardiovaskular parantos ditarik tina panggunaan klinis sabab nyababkeun perpanjangan interval QT anu ngarah kana aritmia ventrikel sareng maot dadakan7. Ku kituna, aya kabutuhan anu ningkat pikeun strategi skrining praklinis anu tiasa dipercaya pikeun meunteun khasiat sareng toksisitas kardiovaskular. Panggunaan kardiomiosit turunan sél stém pluripotent anu diinduksi ku manusa (hiPS-CM) anyar-anyar ieu dina skrining ubar sareng uji toksisitas nyayogikeun solusi parsial pikeun masalah ieu. Nanging, sifat hiPS-CM anu teu dewasa sareng kurangna kompleksitas multisélular jaringan jantung mangrupikeun watesan utama tina metode ieu. Panilitian anyar nunjukkeun yén watesan ieu tiasa diatasi sabagian ku ngagunakeun hiPS-CM awal pikeun ngabentuk hidrogel jaringan jantung teu lila saatos awal kontraksi spontan sareng laun-laun ningkatkeun stimulasi listrik kana waktosna. Nanging, mikrojaringan hiPS-CM ieu kakurangan sipat éléktrofisiologis sareng kontraktil dewasa tina miokardium déwasa. Salaku tambahan, jaringan jantung manusa ngagaduhan struktur anu langkung rumit, anu diwangun ku campuran hétérogén tina jinis sél anu béda, kalebet sél endotel, neuron, sareng fibroblas stromal, anu saling dihubungkeun ku sét protéin matriks ékstrasélulér khusus. Heterogenitas populasi non-kardiomiosit ieu11,12,13 dina jantung mamalia déwasa mangrupikeun halangan utama pikeun modél jaringan jantung nganggo jinis sél individu. Watesan utama ieu nekenkeun pentingna ngembangkeun metode pikeun ngakultur jaringan miokardial anu utuh dina kaayaan fisiologis sareng patologis.
Bagian ipis (300 µm) jantung manusa anu dikultur parantos kabuktosan janten modél miokardium manusa anu utuh sareng ngajangjikeun. Métode ieu nyayogikeun aksés kana sistem multisélular 3D lengkep anu sami sareng jaringan jantung manusa. Nanging, dugi ka taun 2019, panggunaan bagian jantung anu dikultur diwatesan ku survival budaya anu pondok (24 jam). Ieu disababkeun ku sababaraha faktor kalebet kurangna peregangan fisik-mékanis, antarmuka hawa-cair, sareng panggunaan média saderhana anu henteu ngadukung kabutuhan jaringan jantung. Dina taun 2019, sababaraha kelompok panalungtikan nunjukkeun yén ngagabungkeun faktor mékanis kana sistem kultur jaringan jantung tiasa manjangkeun umur kultur, ningkatkeun éksprési jantung, sareng niru patologi jantung. Dua panilitian anu elegan 17 sareng 18 nunjukkeun yén pemuatan mékanis uniaxial gaduh pangaruh positip kana fenotipe jantung salami kultur. Nanging, panilitian ieu henteu nganggo pemuatan fisiko-mékanis tilu diménsi dinamis tina siklus jantung, kumargi bagian jantung dieusian ku gaya tarik isometrik 17 atanapi pemuatan auksotonik linier 18. Métode-métode peregangan jaringan ieu nyababkeun panurunan seueur gén jantung atanapi éksprési gén anu kaleuleuwihi anu aya hubunganana sareng réspon peregangan anu teu normal. Anu penting, Pitoulis et al. 19 ngembangkeun rendaman kultur irisan jantung dinamis pikeun rekonstruksi siklus jantung nganggo eupan balik transduser gaya sareng dorongan tegangan. Sanaos sistem ieu ngamungkinkeun modél siklus jantung in vitro anu langkung akurat, kompleksitas sareng throughput anu handap tina metode ieu ngawatesan aplikasi sistem ieu. Laboratorium kami nembe ngembangkeun sistem kultur anu disederhanakeun nganggo stimulasi listrik sareng média anu dioptimalkeun pikeun ngajaga viabilitas bagian jaringan jantung babi sareng manusa dugi ka 6 dinten20,21.
Dina naskah ayeuna, urang ngajelaskeun modél kultur jaringan jantung (CTCM) ngagunakeun bagian jantung babi anu ngagabungkeun isyarat humoral pikeun ngarékapitasi fisiologi jantung tilu diménsi sareng distensi patofisiologis salami siklus jantung. CTCM ieu tiasa ningkatkeun akurasi prediksi ubar praklinis ka tingkat anu teu acan pernah kahontal ku cara nyayogikeun sistem jantung mid-throughput anu hemat biaya anu niru fisiologi/patofisiologi jantung mamalia pikeun uji ubar praklinis.
Sinyal mékanis hémodinamik maénkeun peran penting dina ngajaga fungsi kardiomiosit in vitro 22,23,24. Dina naskah ayeuna, urang parantos ngembangkeun CTCM (Gambar 1a) anu tiasa niru lingkungan jantung déwasa ku cara ngainduksi stimulasi listrik sareng mékanis dina frékuénsi fisiologis (1,2 Hz, 72 denyut per menit). Pikeun nyingkahan manteng jaringan anu kaleuleuwihi salami diastole, alat percetakan 3D dianggo pikeun ningkatkeun ukuran jaringan ku 25% (Gambar 1b). Pacing listrik anu diinduksi ku sistem C-PACE dijadwalkeun pikeun ngamimitian 100 ms sateuacan sistol nganggo sistem akuisisi data pikeun ngahasilkeun deui siklus jantung sacara lengkep. Sistem kultur jaringan nganggo aktuator pneumatik anu tiasa diprogram (LB Engineering, Jerman) pikeun sacara siklik ngalegaan mémbran silikon fléksibel pikeun nyababkeun ékspansi irisan jantung di rohangan luhur. Sistem ieu disambungkeun ka jalur hawa éksternal ngalangkungan transduser tekanan, anu ngamungkinkeun pikeun nyaluyukeun tekanan (± 1 mmHg) sareng waktos (± 1 ms) sacara akurat (Gambar 1c).
a Pasangkeun bagian jaringan kana cingcin pangrojong 7 mm, anu dipidangkeun dina warna biru, di jero rohangan kultur alat éta. Rohangan kultur dipisahkeun tina rohangan hawa ku mémbran silikon fléksibel anu ipis. Pasang gasket di antara unggal rohangan pikeun nyegah bocor. Tutup alat éta ngandung éléktroda grafit anu nyayogikeun stimulasi listrik. b Gambaran skematis tina alat jaringan ageung, cingcin pituduh sareng cingcin pangrojong. Bagian jaringan (coklat) disimpen dina alat anu ukuranana ageung kalayan cingcin pituduh disimpen dina alur di sisi luar alat. Nganggo pituduh, sacara saksama tempatkeun cingcin pangrojong anu dilapis ku perekat akrilik jaringan di luhur bagian jaringan jantung. c Grafik anu nunjukkeun waktos stimulasi listrik salaku fungsi tekanan rohangan hawa anu dikontrol ku aktuator pneumatik anu tiasa diprogram (PPD). Alat akuisisi data dianggo pikeun nyingkronkeun stimulasi listrik nganggo sénsor tekanan. Nalika tekanan dina rohangan kultur ngahontal ambang anu disetel, sinyal pulsa dikirim ka C-PACE-EM pikeun micu stimulasi listrik. d Gambar opat CTCM disimpen dina rak inkubator. Opat alat disambungkeun kana hiji PPD ngalangkungan sirkuit pneumatik, sareng sensor tekanan dipasang kana klep hemostatik pikeun ngawas tekanan dina sirkuit pneumatik. Unggal alat ngandung genep bagian jaringan.
Ngagunakeun hiji aktuator pneumatik, urang tiasa ngontrol 4 alat CTCM, anu masing-masing tiasa nahan 6 bagian jaringan (Gambar 1d). Dina CTCM, tekanan hawa dina rohangan hawa dirobih janten tekanan sinkron dina rohangan cairan sareng ngainduksi ékspansi fisiologis tina irisan jantung (Gambar 2a sareng Pilem Tambahan 1). Evaluasi peregangan jaringan dina 80 mm Hg. Art. nunjukkeun peregangan bagian jaringan ku 25% (Gambar 2b). Persentase peregangan ieu parantos dipidangkeun cocog sareng panjang sarkomer fisiologis 2,2–2,3 µm pikeun kontraktilitas bagian jantung normal17,19,25. Gerakan jaringan dipeunteun nganggo setélan kaméra khusus (Gambar Tambahan 1). Amplitudo sareng kecepatan gerakan jaringan (Gambar 2c, d) pakait sareng peregangan salami siklus jantung sareng waktos salami sistol sareng diastol (Gambar 2b). Peregangan sareng kecepatan jaringan jantung salami kontraksi sareng rélaksasi tetep konstan salami 12 dinten dina kultur (Gambar 2f). Pikeun meunteun pangaruh stimulasi listrik kana kontraktilitas salami kultur, kami ngembangkeun metode pikeun nangtukeun deformitas aktif nganggo algoritma shading (Gambar Tambahan 2a, b) sareng tiasa ngabédakeun antara deformitas kalayan sareng tanpa stimulasi listrik. Bagian jantung anu sami (Gambar 2f). Dina daérah potongan anu tiasa dipindahkeun (R6-9), tegangan salami stimulasi listrik 20% langkung luhur tibatan henteuna stimulasi listrik, anu nunjukkeun kontribusi stimulasi listrik kana fungsi kontraktil.
Retakan répréséntatif tina tekanan rohangan hawa, tekanan rohangan cairan, sareng pangukuran gerakan jaringan mastikeun yén tekanan rohangan ngarobih tekanan rohangan cairan, nyababkeun gerakan anu saluyu tina irisan jaringan. b Retakan répréséntatif tina persén regangan (biru) tina bagian jaringan anu saluyu sareng persén regangan (oranyeu). c Gerakan irisan jantung anu diukur saluyu sareng kecepatan gerakan anu diukur. (d) Lintasan répréséntatif tina gerakan siklik (garis biru) sareng kecepatan (garis putus-putus oranyeu) dina irisan jantung. e Kuantifikasi waktos siklus (n = 19 irisan per grup, ti babi anu béda), waktos kontraksi (n = 19 irisan per grup), waktos rélaksasi (n = 19 irisan per grup, ti babi anu béda), gerakan jaringan (n = 25 ). irisan)/grup ti babi anu béda), kecepatan sistolik puncak (n = 24(D0), 25(D12) irisan/grup ti babi anu béda) sareng laju rélaksasi puncak (n=24(D0), 25(D12) irisan/grup ti babi anu béda). Uji-t Student Dua Sisi henteu nunjukkeun bédana anu signifikan dina parameter naon waé. f Analisis galur répréséntatif tina sésa-sésa jaringan kalayan stimulasi listrik (beureum) sareng tanpa (biru), sapuluh daérah régional tina sésa jaringan tina bagian anu sami. Panel handap nunjukkeun kuantifikasi bédana perséntase dina galur dina sésa jaringan kalayan sareng tanpa stimulasi listrik dina sapuluh daérah tina bagian anu béda. (n = 8 irisan/grup ti babi anu béda, dilaksanakeun uji-t Two-tailed Student; ****p < 0.0001, **p < 0.01, *p < 0.05). (n = 8 irisan/grup ti babi anu béda, dilaksanakeun uji-t Two-tailed Student; ****p < 0.0001, **p < 0.01, *p < 0.05). (n = 8 срезов/группу от разных свиней, проводится двусторонний t-критерий Стьюдента; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05). (n = 8 bagian/grup ti babi anu béda, uji-t Student dua-sisi; ****p<0.0001, **p<0.01, *p<0.05). （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p < 0,0001，**p < 0,01，*p < 0,05）. （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p < 0,0001，**p < 0,01，*p < 0,05）. (n = 8 срезов/группу, tina разных свиней, двусторонний критерий Стьюдента; ****p <0,0001, **p <0,01, *p <0,05). (n = 8 bagian/grup, ti babi anu béda, uji-t Student dua sisi; ****p<0.0001, **p<0.01, *p<0.05).Batang kasalahan ngagambarkeun rata-rata ± simpangan baku.
Dina sistem kultur irisan jantung biomimetik statis kami sateuacanna [20, 21], kami ngajaga viabilitas, fungsi, sareng integritas struktural irisan jantung salami 6 dinten ku cara nerapkeun stimulasi listrik sareng ngaoptimalkeun komposisi média. Nanging, saatos 10 dinten, angka-angka ieu turun drastis. Kami bakal ngarujuk kana bagian anu dibudidayakeun dina sistem kultur biomimetik statis kami sateuacanna 20, 21 kaayaan kontrol (Ctrl) sareng kami bakal nganggo média anu dioptimalkeun sateuacanna salaku kaayaan MC sareng kultur dina stimulasi mékanis sareng listrik simultan (CTCM). disebut . Mimiti, kami nangtukeun yén stimulasi mékanis tanpa stimulasi listrik henteu cekap pikeun ngajaga viabilitas jaringan salami 6 dinten (Gambar Tambahan 3a, b). Anu pikaresepeun, kalayan diwanohkeunana stimulasi fisio-mékanis sareng listrik nganggo STCM, viabilitas bagian jantung 12 dinten tetep sami sareng bagian jantung seger dina kaayaan MS, tapi henteu dina kaayaan Ctrl, sapertos anu dipidangkeun ku analisis MTT (Gambar 1). 3a). Ieu nunjukkeun yén stimulasi mékanis sareng simulasi siklus jantung tiasa ngajaga bagian jaringan tetep hirup dua kali langkung lami tibatan anu dilaporkeun dina sistem kultur statis kami sateuacanna. Nanging, penilaian integritas struktural bagian jaringan ku cara imunolabel troponin T jantung sareng connexin 43 nunjukkeun yén éksprési connexin 43 sacara signifikan langkung luhur dina jaringan MC dina dinten ka-12 tibatan dina kontrol dina dinten anu sami. Nanging, éksprési connexin 43 anu seragam sareng formasi cakram-Z henteu dijaga sapinuhna (Gambar 3b). Kami nganggo kerangka kecerdasan buatan (AI) pikeun ngitung integritas struktural jaringan26, pipa pembelajaran jero berbasis gambar dumasar kana troponin-T sareng pewarnaan connexin43 pikeun sacara otomatis ngitung integritas struktural sareng fluoresensi irisan jantung dina hal kakuatan lokalisasi. Métode ieu nganggo Jaringan Saraf Konvolusional (CNN) sareng kerangka pembelajaran jero pikeun ngitung integritas struktural jaringan jantung sacara otomatis sacara otomatis sareng henteu bias, sapertos anu dijelaskeun dina rujukan. 26. Jaringan MC nunjukkeun kamiripan struktural anu ningkat sareng dinten ka-0 dibandingkeun sareng bagian kontrol statis. Salaku tambahan, pewarnaan trikrom Masson ngungkabkeun persentase fibrosis anu langkung handap dina kaayaan MS dibandingkeun sareng kaayaan kontrol dina dinten ka-12 kultur (Gambar 3c). Sanaos CTCM ningkatkeun daya tahan bagian jaringan jantung dina dinten ka-12 ka tingkat anu sami sareng jaringan jantung seger, éta henteu ningkatkeun integritas struktural bagian jantung sacara signifikan.
Grafik batang nunjukkeun kuantifikasi viabilitas MTT tina irisan jantung seger (D0) atanapi kultur irisan jantung salami 12 dinten boh dina kultur statis (D12 Ctrl) atanapi dina CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) irisan/grup ti babi anu béda, tés ANOVA hiji arah dilaksanakeun; ####p < 0,0001 dibandingkeun sareng D0 sareng **p < 0,01 dibandingkeun sareng D12 Ctrl). Grafik batang nunjukkeun kuantifikasi viabilitas MTT tina irisan jantung seger (D0) atanapi kultur irisan jantung salami 12 dinten boh dina kultur statis (D12 Ctrl) atanapi dina CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) irisan/grup ti babi anu béda, tés ANOVA hiji arah dilaksanakeun; ####p < 0,0001 dibandingkeun sareng D0 sareng **p < 0,01 dibandingkeun sareng D12 Ctrl).histogram nunjukkeun kuantifikasi viabilitas potongan jantung seger MTT (D0) atanapi kultur potongan jantung salami 12 dinten boh dina kultur statis (kontrol D12) atanapi CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (kontrol D12). ) ), 12 (D12 MC) bagian/grup ti babi anu béda, tés ANOVA hiji arah dilaksanakeun;####p < 0,0001 по сравнению с D0 и **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p < 0.0001 dibandingkeun sareng D0 sareng **p < 0.01 dibandingkeun sareng D12 Ctrl). a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切)片(D0)片或心脏切片培养12 天的MTT 活力的量化)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单后行单后与相比，####p < 0.0001，与D12 Ctrl 相比，**p < 0.01). a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切)片(D0)片，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；与D0 相比，####p < 0,0001，与 组画)，D12 Ctrl)histogram nu némbongkeun kuantifikasi viabilitas MTT dina potongan jantung seger (D0) atawa potongan jantung nu dibudidayakeun salila 12 poé dina kultur statis (kontrol D12) atawa CTCM (MC D12) (n = 18 (D0), 15 (kontrol D12)), 12 (MC D12) bagian/grup ti babi nu béda, uji ANOVA hiji arah;####p < 0,0001 по сравнению с D0, **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p < 0.0001 dibandingkeun sareng D0, **p < 0.01 dibandingkeun sareng D12 Ctrl).b Troponin-T (héjo), connexin 43 (beureum) sareng DAPI (biru) dina bagian jantung anu nembé diisolasi (D0) atanapi bagian jantung anu dibudidayakeun dina kaayaan statis (Ctrl) atanapi kaayaan CTCM (MC) salami 12 dinten) tina gambar imunofluoresensi anu representatif (skala kosong = 100 µm). Kuantifikasi kecerdasan jieunan tina integritas struktural jaringan jantung (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) irisan/grup masing-masing tina babi anu béda, tés ANOVA hiji arah dilaksanakeun; ####p < 0,0001 dibandingkeun sareng D0 sareng ****p < 0,0001 dibandingkeun sareng D12 Ctrl). Kuantifikasi kecerdasan jieunan tina integritas struktural jaringan jantung (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) irisan/kelompok masing-masing tina babi anu béda, uji ANOVA hiji arah dilaksanakeun; ####p < 0,0001 dibandingkeun sareng D0 sareng ****p < 0,0001 dibandingkeun sareng D12 Ctrl). Количественная оценка структурной целостности сердечной ткани искусственным интеллектом (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl, 7 (D12 Ctrl) tina разных свиней, проводится однофакторный тест ANOVA; Kuantifikasi integritas struktural jaringan jantung ku kecerdasan jieunan (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) bagian/grup ti babi anu béda, uji ANOVA hiji arah dilaksanakeun; ####p < 0,0001 vs. sareng D0 sareng ****p < 0,0001 dibandingkeun sareng D12 Ctrl).人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) keureutan/grup masing-masing babi anu béda, uji ANOVA hiji arah;####p01 相0##p01 相0##00 相0. < 0.0001 与D12 Ctrl 相比）.人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) keureutan/grup masing-masing babi anu béda-béda, uji ANOVA saarah;##p0 ， 0##p < 0. < 0.0001 与D12 Ctrl 相比）. Искусственный интеллект для количественной оценки структурной целостности сердечной ткани (n = 7 (D0), 7 (D0) Ctrl (D12), MC (D12) срезов/группу каждой из разных свиней, односторонний тест ANOVA; Kecerdasan jieunan pikeun ngukur integritas struktural jaringan jantung (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) bagian/kelompokkeun masing-masing babi anu béda, uji ANOVA hiji arah; ####p<0,0001 vs .D0 Pikeun babandingan ****p < 0,0001 dibandingkeun sareng D12 Ctrl). c Gambar répréséntatif (kénca) sareng kuantifikasi (katuhu) pikeun irisan jantung anu diwarnaan ku pewarnaan trikrom Masson (Skala polos = 500 µm) (n = 10 irisan/grup masing-masing ti babi anu béda, tés ANOVA hiji arah dilaksanakeun; ####p < 0,0001 dibandingkeun sareng D0 sareng ***p < 0,001 dibandingkeun sareng D12 Ctrl). c Gambar répréséntatif (kénca) sareng kuantifikasi (katuhu) pikeun irisan jantung anu diwarnaan ku pewarnaan trikrom Masson (Skala polos = 500 µm) (n = 10 irisan/grup masing-masing ti babi anu béda, tés ANOVA hiji arah dilaksanakeun; #### p < 0,0001 dibandingkeun sareng D0 sareng ***p < 0,001 dibandingkeun sareng D12 Ctrl). c Репрезентативные изображения (слева) и количественная оценка (справа) срезов сердца, окрашенных трихромным кмрасималет без покрытия = 500 мкм) (n = 10 срезов/группу от разных свиней, выполняется односторонний тест ANOVA; #### p < 0,00001 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Gambar répréséntatif (kénca) sareng kuantifikasi (katuhu) bagian jantung anu diwarnaan ku pewarna trikrom Masson (skala anu teu dilapis = 500 µm) (n = 10 bagian/grup ti babi anu béda, uji ANOVA hiji arah dilaksanakeun; #### p < 0 .0001 dibandingkeun sareng D0 sareng ***p < 0.001 dibandingkeun sareng D12 Ctrl). c 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像（左）和量化（右）（裸尺度 （裸尺度 （裸尺度 = 5个切片/组，每组来自不同的猪，进桌单向ANOVA 测试；#### p < 0.0001 与D0 相比，***p < 0.001 C 。 C 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 （左 左） 量化 （右） 裸尺度 裸尺度 裸尺度裸尺度 = 500 µm） （n = 10 个 切片 组 每 组 来自 不同 猪 ， 进行 单向 单向 单向 0##0.与D0 相比，***p < 0,001 与D12 Ctrl 相比）. c Репрезентативные изображения (слева) и количественный анализ (справа) срезов сердца, окрашенных трихроямным красителка = 500 мкм) (n = 10 срезов/группа, каждый от другой свиньи, протестировано с помощью однофакторного доного дисперси <##; 0,0001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Gambar répréséntatif (kénca) sareng kuantifikasi (katuhu) bagian jantung anu diwarnaan ku pewarna trikrom Masson (kosong = 500 µm) (n = 10 bagian/grup, masing-masing ti babi anu béda, diuji ku analisis varian hiji arah;### # p < 0,0001 dibandingkeun sareng D0, ***p < 0,001 dibandingkeun sareng D12 Ctrl).Batang kasalahan ngagambarkeun rata-rata ± simpangan baku.
Kami ngahipotesiskeun yén ku cara nambihan molekul leutik kana média kultur, integritas kardiomiosit tiasa ningkat sareng kamekaran fibrosis dikirangan salami kultur CTCM. Ku kituna, kami nyaring molekul leutik nganggo kultur kontrol statis kami20,21 kusabab jumlah faktor pangganggu anu sakedik. Deksametason (Dex), triiodotironin (T3), sareng SB431542 (SB) dipilih pikeun panyaringan ieu. Molekul leutik ieu sateuacanna parantos dianggo dina kultur hiPSC-CM pikeun ngainduksi pematangan kardiomiosit ku cara ningkatkeun panjang sarkomer, tubulus-T, sareng kecepatan konduksi. Salaku tambahan, duanana Dex (glukokortikoid) sareng SB dipikanyaho pikeun ngurangan peradangan29,30. Ku alatan éta, kami nguji naha kaasupna hiji atanapi kombinasi molekul leutik ieu bakal ningkatkeun integritas struktural bagian jantung. Pikeun panyaringan awal, dosis unggal sanyawa dipilih dumasar kana konsentrasi anu umumna dianggo dina modél kultur sél (1 μM Dex27, 100 nM T327, sareng 2,5 μM SB31). Saatos 12 dinten dikultur, kombinasi T3 sareng Dex ngahasilkeun integritas struktural kardiomiosit anu optimal sareng remodeling serat minimal (Gambar Tambahan 4 sareng 5). Salaku tambahan, panggunaan konsentrasi T3 sareng Dex anu dua kali atanapi dua kali lipat ieu ngahasilkeun épék anu ngabahayakeun dibandingkeun sareng konsentrasi normal (Gambar Tambahan 6a, b).
Saatos panyaringan awal, kami ngalaksanakeun perbandingan head-to-head tina 4 kaayaan kultur (Gambar 4a): Ctrl: bagian jantung anu dibudidayakeun dina kultur statis anu parantos dijelaskeun sateuacanna nganggo média anu dioptimalkeun; 20.21 TD: T3 sareng Ctrl s Nambahkeun Dex dina dinten Rebo; MC: bagian jantung anu dibudidayakeun dina CTCM nganggo média anu parantos dioptimalkeun sateuacanna; sareng MT: CTCM sareng T3 sareng Dex ditambahkeun kana média. Saatos 12 dinten budidaya, viabilitas jaringan MS sareng MT tetep sami sareng dina jaringan seger anu ditaksir ku uji MTT (Gambar 4b). Anu pikaresepeun, panambahan T3 sareng Dex kana kultur transwell (TD) henteu nyababkeun paningkatan anu signifikan dina viabilitas dibandingkeun sareng kaayaan Ctrl, nunjukkeun peran penting tina stimulasi mékanis dina ngajaga viabilitas bagian jantung.
Diagram desain ékspériméntal anu ngagambarkeun opat kaayaan kultur anu dianggo pikeun meunteun pangaruh stimulasi mékanis sareng suplementasi T3/Dex kana média salami 12 dinten. Grafik batang b nunjukkeun kuantifikasi viabilitas 12 dinten saatos kultur dina sadaya 4 kaayaan kultur (Ctrl, TD, MC, sareng MT) dibandingkeun sareng irisan jantung seger (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD sareng D12 MT), 12 (D12 MC) irisan/grup ti babi anu béda, uji ANOVA hiji arah dilaksanakeun; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 dibandingkeun sareng D0 sareng **p < 0,01 dibandingkeun sareng D12 Ctrl). Grafik batang b nunjukkeun kuantifikasi viabilitas 12 dinten saatos kultur dina sadaya 4 kaayaan kultur (Ctrl, TD, MC, sareng MT) dibandingkeun sareng irisan jantung seger (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD sareng D12 MT), 12 (D12 MC) irisan/grup ti babi anu béda, uji ANOVA hiji arah dilaksanakeun; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 dibandingkeun sareng D0 sareng **p < 0,01 dibandingkeun sareng D12 ctrl). b Гистограмма показывает количественную оценку жизнеспособности через 12 дней после культивирования во всельникових 4 (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD и D12 MT), 12)/D12 зопп. разных свиней, проводится односторонний тест ANOVA; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 по сравнению с D0 и **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). b Grafik batang nunjukkeun kuantifikasi viabilitas dina 12 dinten saatos kultur dina sadaya 4 kaayaan kultur (kontrol, TD, MC, sareng MT) dibandingkeun sareng potongan jantung seger (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD, sareng D12 MT), 12 (D12 MC) potongan/grup ti babi anu béda, uji ANOVA hiji arah; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 vs. D0 sareng **p < 0,01 dibandingkeun sareng D12 Ctrl). b 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) (n = 18 (D0) 、 TD0和D12 MT)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；####p < 0.0001，###p < 0.001 ，p 0.001 ，p 0.001 与与D12控制）.b 4 12 (D12 MC) b Гистограмама, показывающая все 4 условия культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими серди серди (сежими сирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими среди серди сердин (сежими серди) (8 DIRI) 15 (D12 Ctrl, D12 TD и D12 MT), от разных свиней 12 (D12 MC) срезы/группа, односторонний тест ANOVA ####p <0,0001, ####p <0,0001, ###p по <0,0001, ###p <0. <0,01 по сравнению с контролем D12). b Histogram nu némbongkeun sadaya 4 kaayaan kultur (kontrol, TD, MC sareng MT) dibandingkeun sareng potongan jantung seger (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD sareng D12 MT), ti babi anu béda 12 (D12 MC) bagian/grup, uji ANOVA hiji arah; ####p<0,0001, ###p<0,001 vs. D0, **p<0,01 vs. kontrol D12). Grafik batang c nunjukkeun kuantifikasi fluks glukosa 12 dinten saatos kultur dina sadaya 4 kaayaan kultur (Ctrl, TD, MC, sareng MT) dibandingkeun sareng irisan jantung seger (D0) (n = 6 irisan/grup ti babi anu béda, uji ANOVA hiji arah dilaksanakeun; ###p < 0,001, dibandingkeun sareng D0 sareng ***p < 0,001 dibandingkeun sareng D12 Ctrl). Grafik batang c nunjukkeun kuantifikasi fluks glukosa 12 dinten saatos kultur dina sadaya 4 kaayaan kultur (Ctrl, TD, MC, sareng MT) dibandingkeun sareng irisan jantung seger (D0) (n = 6 irisan/grup ti babi anu béda, uji ANOVA hiji arah dilaksanakeun; ###p < 0,001, dibandingkeun sareng D0 sareng ***p < 0,001 dibandingkeun sareng D12 Ctrl). c Гистограмма показывает количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после культивирования во всенку потока глюкозы через 12 дней после культивирования во всенко 4 лусков (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 6 срезов/группу от разных свиней, родниностяйство ANOVA; ###p < 0,001 по сравнению с D0 jeung ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Histogram nunjukkeun kuantifikasi fluks glukosa 12 dinten saatos kultur dina sadaya 4 kaayaan kultur (kontrol, TD, MC sareng MT) dibandingkeun sareng potongan jantung seger (D0) (n = 6 potongan/grup ti babi anu béda, tés ANOVA hiji arah dilaksanakeun; ###p < 0,001 dibandingkeun sareng D0 sareng ***p < 0,001 dibandingkeun sareng D12 Ctrl). c 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) 相比，厹天的葡萄糖通量定量（n = 6 片/组，来自不同猪，单向执行ANOVA 测试；###p < 0.001 ，盎所 0.001 ，盎所0与D12 Ctrl 相比）. C 条形图 显示 所有 4 种 条件 （（ctrl 、 td 、 mc 和 mt） 新鲜 心脏 切 切片 切片培养 后 后 12 天 的 通量 定量 （n = 6 片/组 ， 来自 猪 ， ， ， ， ， ， ， ， ， 猪 猪单行行< 0,001，与D0 相比，***p < 0.001 与D12 Ctrl 相比）. c Гистограмама, показывающая количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после культивирования для 4 всех культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 6 срезов/группа, от разинной Были проведены тесты ANOVA ###p < 0,001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению с D12 (контроль). c Histogram nu némbongkeun kuantifikasi fluks glukosa dina 12 poé pasca-kultur pikeun sadaya 4 kaayaan kultur (kontrol, TD, MC, sareng MT) dibandingkeun sareng potongan jantung seger (D0) (n = 6 potongan/grup, ti babi anu béda, unilateral. Nalika tés ANOVA dilaksanakeun, ###p < 0,001 dibandingkeun sareng D0, ***p < 0,001 dibandingkeun sareng D12 (kontrol).d Plot analisis galur jaringan seger (biru), MC dinten ka-12 (héjo), sareng MT dinten ka-12 (beureum) dina sapuluh titik potongan jaringan régional (n = 4 irisan/grup, uji ANOVA hiji arah; teu aya béda anu signifikan antara grup). e Plot gunungapi anu nunjukkeun gén anu diekspresikeun sacara béda dina bagian jantung seger (D0) dibandingkeun sareng bagian jantung anu dibudidayakeun dina kaayaan statis (Ctrl) atanapi dina kaayaan MT (MT) salami 10-12 dinten. f Peta panas gén sarkomer pikeun bagian jantung anu dibudidayakeun dina unggal kaayaan kultur. Batang kasalahan ngagambarkeun rata-rata ± simpangan baku.
Gumantungna métabolik kana parobahan tina oksidasi asam lemak ka glikolisis mangrupikeun ciri khas dediferensiasi kardiomiosit. Kardiomiosit anu teu dewasa utamina nganggo glukosa pikeun produksi ATP sareng gaduh mitokondria hipoplastik kalayan sababaraha krista5,32. Analisis panggunaan glukosa nunjukkeun yén dina kaayaan MC sareng MT, panggunaan glukosa sami sareng dina jaringan dinten ka-0 (Gambar 4c). Nanging, sampel Ctrl nunjukkeun paningkatan anu signifikan dina panggunaan glukosa dibandingkeun sareng jaringan seger. Ieu nunjukkeun yén kombinasi CTCM sareng T3/Dex ningkatkeun viabilitas jaringan sareng ngajaga fenotipe métabolik tina bagian jantung anu dikultur 12 dinten. Salaku tambahan, analisis galur nunjukkeun yén tingkat galur tetep sami sareng dina jaringan jantung seger salami 12 dinten dina kaayaan MT sareng MS (Gambar 4d).
Pikeun nganalisis dampak sakabéh CTCM sareng T3/Dex kana bentang transkripsi global jaringan irisan jantung, kami ngalaksanakeun RNAseq dina irisan jantung tina opat kaayaan kultur anu béda (Data Tambahan 1). Anu pikaresepeun, bagian MT nunjukkeun kamiripan transkripsi anu luhur sareng jaringan jantung seger, kalayan ngan ukur 16 anu diekspresikeun sacara béda tina 13.642 gén. Nanging, sapertos anu kami tunjukkeun sateuacanna, irisan Ctrl nampilkeun 1229 gén anu diekspresikeun sacara béda saatos 10-12 dinten dina kultur (Gambar 4e). Data ieu dikonfirmasi ku qRT-PCR gén jantung sareng fibroblast (Gambar Tambahan 7a-c). Anu pikaresepeun, bagian Ctrl nunjukkeun downregulation gén jantung sareng siklus sél sareng aktivasi program gén radang. Data ieu nunjukkeun yén dediferensiasi, anu biasana lumangsung saatos kultur jangka panjang, dilemahkeun sapinuhna dina kaayaan MT (Gambar Tambahan 8a, b). Panilitian anu saksama ngeunaan gén sarkomer nunjukkeun yén ngan ukur dina kaayaan MT gén anu ngodekeun sarkomer (Gambar 4f) sareng saluran ion (Gambar Tambahan 9) anu dijaga, ngajagi aranjeunna tina panurunan dina kaayaan Ctrl, TD, sareng MC. Data ieu nunjukkeun yén kalayan kombinasi stimulasi mékanis sareng humoral (T3/Dex), transkriptom irisan jantung tiasa tetep sami sareng irisan jantung seger saatos 12 dinten dina kultur.
Panemuan transkripsi ieu dirojong ku kanyataan yén integritas struktural kardiomiosit dina bagian jantung paling saé dijaga dina kaayaan MT salami 12 dinten, sapertos anu dipidangkeun ku connexin 43 anu utuh sareng terlokalisasi (Gambar 5a). Salaku tambahan, fibrosis dina bagian jantung dina kaayaan MT turun sacara signifikan dibandingkeun sareng Ctrl sareng sami sareng bagian jantung seger (Gambar 5b). Data ieu nunjukkeun yén kombinasi stimulasi mékanis sareng perawatan T3/Dex sacara efektif ngajaga struktur jantung dina bagian jantung dina kultur.
Gambar imunofluoresensi representatif troponin-T (héjo), connexin 43 (beureum), sareng DAPI (biru) dina bagian jantung anu nembé diisolasi (D0) atanapi dikultur salami 12 dinten dina sadaya opat kaayaan kultur bagian jantung (skala bar = 100 µm). ). Kuantifikasi kecerdasan jieunan tina integritas struktural jaringan jantung (n = 7 (D0 sareng D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC sareng D12 MT) irisan/grup tina babi anu béda, uji ANOVA hiji arah dilaksanakeun; ####p < 0,0001 dibandingkeun sareng D0 sareng *p < 0,05, atanapi ****p < 0,0001 dibandingkeun sareng D12 Ctrl). Kuantifikasi kecerdasan jieunan tina integritas struktural jaringan jantung (n = 7 (D0 sareng D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC sareng D12 MT) irisan/grup tina babi anu béda, uji ANOVA hiji arah dilaksanakeun; #### p < 0,0001 dibandingkeun sareng D0 sareng *p < 0,05, atanapi ****p < 0,0001 dibandingkeun sareng D12 Ctrl). Количественная оценка структурной целостности ткани сердца с помощью искусственного интеллекта (n = 7 (D0 2 и D12), TD (D0 2 D12) D12 MT) срезов/группу от разных свиней, проведен однофакторный тест ANOVA #### p < 0,0001 по сравнению с D0 ,**** и по < 0,**** и по < 0,**** и по < 0,**** и по < 0,**** и по сравнению ku D12 Ctrl). Kuantifikasi integritas struktural jaringan jantung nganggo kecerdasan buatan (n = 7 (D0 sareng D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC sareng D12 MT) bagian/grup ti babi anu béda, uji ANOVA hiji arah dilaksanakeun; #### p < 0,0001 dibandingkeun sareng D0 sareng *p < 0,05 atanapi ****p < 0,0001 dibandingkeun sareng D12 Ctrl).对不同猪的心脏组织结构完整性（n = 7（D0 和D12 Ctrl）、5（D12 TD,D12 MC 和D12 MT）切片/组）进行人工智能量化，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0.0001 与D0 和*p < 0.05 ，書戰 0.05 ，書我05与D12 Ctrl 相比）.对 不同 猪 的 心脏 结构 完整性 （n = 7 （d0 和 d12 ctrl） （5 （d12 td 、 d12 mc 组） d1智能量 化 进行 单向 单向 单向 测试 ； ########## p < 0.0001 与D0 和*p < 0.05 相比 ， 我l 0.05 相比 ， 戸l 0.05 相比 ， 戸l 0.相比）.Kuantifikasi integritas struktural jaringan jantung nganggo kecerdasan jieunan dina babi anu béda (n = 7 (D0 sareng D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC sareng D12 MT) bagian/grup) nganggo uji ANOVA hiji arah;#### p < 0,0001 по сравнению с D0 и *p < 0,05 atawa ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). #### p < 0.0001 dibandingkeun sareng D0 sareng *p < 0.05 atanapi ****p < 0.0001 dibandingkeun sareng D12 Ctrl). b Gambar répréséntatif sareng kuantifikasi pikeun irisan jantung anu diwarnaan ku pewarnaan trikrom Masson (Skala bar = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD, sareng D12 MC), 9 (D12 MT) irisan/grup ti babi anu béda, uji ANOVA hiji arah dilaksanakeun; ####p < 0,0001 dibandingkeun sareng D0 sareng ***p < 0,001, atanapi ****p < 0,0001 dibandingkeun sareng D12 Ctrl). b Gambar répréséntatif sareng kuantifikasi pikeun irisan jantung anu diwarnaan ku pewarnaan trikrom Masson (Skala bar = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD, sareng D12 MC), 9 (D12 MT) irisan/grup ti babi anu béda, uji ANOVA hiji arah dilaksanakeun; ####p < 0,0001 dibandingkeun sareng D0 sareng ***p < 0,001, atanapi ****p < 0,0001 dibandingkeun sareng D12 Ctrl). b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромным красителем Массов сердца ( мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD и D12 MC), 9 (D12 MT) срезов/группу от разных свиней, выполняется односторонний терновий ##0, ##0 ANOVA; сравнению с D0 jeung ***p < 0,001 atawa ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). b Gambar répréséntatif sareng kuantifikasi bagian jantung anu diwarnaan ku pewarnaan trikrom Masson (skala bar = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD sareng D12 MC), 9 (D12 MT) bagian/grup ti babi anu béda, dilakukeun ANOVA hiji arah; ####p < 0,0001 vs. D0 sareng ***p < 0,001 atanapi ****p < 0,0001 vs. D12 Ctrl). b 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像和量化（比例尺= 500 µm）！n = 2、Dl10！ TD 和D12 MC），来自不同猪的9 个（D12 MT）切片/组，进行单因素方差分析；####p < 0.0001 0.001，或****p < 0.0001 与D12 Ctrl 相比）. b 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 和 量化 （比例 尺 尺 尺 = 500 µm） = 500 µm） ） ctrl 、 d12 td 和 d12 mc） 来自 不同 的 9 个 d12 mt 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片/组，进行单因素方差分析；####p < 0,0001 与D0 相比 ， *0****p < . 0.0001 与D12 Ctrl 相比）. b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромом Массона (мастабная = 50) (D0, D12 Ctrl, D12 TD и D12 MC), 9 (D12 MT) срезов от разных свиней / группы, один- способ ANOVA ####p < 0,0001 по, *** сравил 0,0001 по, *** сравию срают < 0,0001 свиней; ****p < 0,0001 по сравнению ku D12 Ctrl). b Gambar répréséntatif sareng kuantifikasi bagian jantung anu diwarnaan ku trikrom Masson (skala bar = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD sareng D12 MC), 9 bagian (D12 MT) ti babi/grup anu béda, hiji metode ANOVA; ####p < 0,0001 dibandingkeun sareng D0, ***p < 0,001 atanapi ****p < 0,0001 dibandingkeun sareng D12 Ctrl).Batang kasalahan ngagambarkeun rata-rata ± simpangan baku.
Pamungkas, kamampuan CTCM pikeun niru hipertrofi jantung dipeunteun ku cara ningkatkeun regangan jaringan jantung. Dina CTCM, tekanan ruang hawa puncak ningkat ti 80 mmHg ka 80 mmHg. Art. (regangan normal) dugi ka 140 mmHg Art. (Gambar 6a). Ieu pakait sareng paningkatan 32% dina regangan (Gambar 6b), anu sateuacanna dipidangkeun salaku persentase regangan anu saluyu anu diperyogikeun pikeun bagian jantung pikeun ngahontal panjang sarkomer anu sami sareng anu katingali dina hipertrofi. Regangan sareng kecepatan jaringan jantung nalika kontraksi sareng relaksasi tetep konstan salami genep dinten kultur (Gambar 6c). Jaringan jantung tina kaayaan MT dikenaan regangan normal (MT (Normal)) atanapi kaayaan overstretch (MT (OS)) salami genep dinten. Saatos opat dinten dina kultur, biomarker hipertrofik NT-ProBNP ningkat sacara signifikan dina medium dina kaayaan MT (OS) dibandingkeun sareng kaayaan MT (normal) (Gambar 7a). Salaku tambahan, saatos genep dinten kultur, ukuran sél dina MT (OS) (Gambar 7b) ningkat sacara signifikan dibandingkeun sareng bagian jantung MT (normal). Salian ti éta, translokasi nuklir NFATC4 ningkat sacara signifikan dina jaringan anu kaleuleuwihi manteng (Gambar 7c). Hasil ieu nunjukkeun kamekaran progresif tina remodeling patologis saatos hiperdistensi sareng ngadukung konsép yén alat CTCM tiasa dianggo salaku platform pikeun nalungtik sinyal hipertrofi jantung anu diinduksi ku manteng.
Retakan répréséntatif tina tekanan rohangan hawa, tekanan rohangan cairan, sareng pangukuran gerakan jaringan mastikeun yén tekanan rohangan ngarobih tekanan rohangan cairan, nyababkeun gerakan anu saluyu tina irisan jaringan. b Persentase regangan répréséntatif sareng kurva laju regangan pikeun bagian jaringan anu diulur sacara normal (oranyeu) sareng anu diulur kaleuleuwihi (biru). c Grafik batang anu nunjukkeun waktos siklus (n = 19 irisan per grup, ti babi anu béda), waktos kontraksi (n = 18-19 irisan per grup, ti babi anu béda), waktos rélaksasi (n = 19 irisan per grup, ti babi anu béda) ), amplitudo gerakan jaringan (n = 14 irisan/grup, ti babi anu béda), kecepatan puncak sistolik (n = 14 irisan/grup, ti babi anu béda) sareng laju rélaksasi puncak (n = 14 (D0), 15 (D6) ) bagian/grup) ti babi anu béda), uji-t Student dua sisi henteu nunjukkeun béda anu signifikan dina parameter naon waé, nunjukkeun yén parameter ieu tetep konstan salami 6 dinten kultur kalayan overvoltage. Batang kasalahan ngagambarkeun rata-rata ± simpangan baku.
Kuantifikasi grafik batang tina konsentrasi NT-ProBNP dina média kultur tina irisan jantung anu dibudidayakeun dina kaayaan MT normal stretch (Norm) atanapi overstretching (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, sareng D4 MTOS) irisan/grup tina babi anu béda, ANOVA dua arah dilaksanakeun; **p < 0,01 dibandingkeun sareng stretch normal). Kuantifikasi grafik batang tina konsentrasi NT-ProBNP dina média kultur tina irisan jantung anu dibudidayakeun dina kaayaan MT normal stretch (Norm) atanapi overstretching (OS) (n ​​= 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, sareng D4 MTOS) irisan/grup ti babi anu béda, ANOVA dua arah dilaksanakeun; **p < 0,01 dibandingkeun sareng stretch normal).Histogram kuantitatif konsentrasi NT-ProBNP dina média kultur tina irisan jantung anu dibudidayakeun dina kaayaan MT stretch normal (norm) atanapi overstretch (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, sareng D4).MTOS) irisan /grup tina babi anu béda, analisis varian dua faktor dilaksanakeun;**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p < 0,01 dibandingkeun sareng regangan normal). a 在MT 正常拉伸(Norm) 或过度拉伸(OS) 条件下培养的心脏切片培养基中NT-ProBNP 浓度的曾度4 (D2 MTNorm)、3（D2 MTOS、D4 MTNorm 和D4 MTOS）来自不同猪的切片/组，进行双向方差分析；p中方差分析；来自不同猪的切片/组，进行双向方差分析；p中中与与与0.01). a Kuantifikasi konsentrasi NT-ProBNP dina irisan jantung anu dibudidayakeun dina kaayaan manteng normal (Norm) atanapi overstretch (OS) MT (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm和D4 MTOS) tina béda 猪的切片/组，可以喌双; ** dibandingkeun sareng manjang normal, p <0.01).histogram Kuantifikasi konsentrasi NT-ProBNP dina irisan jantung anu dibudidayakeun dina kaayaan MT stretch normal (norm) atanapi overstretch (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm) sareng D4 MTOS) irisan/grup ti babi anu béda, analisis varian dua arah;**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p < 0,01 dibandingkeun sareng regangan normal). b Gambar répréséntatif pikeun irisan jantung anu diwarnaan ku troponin-T sareng WGA (kénca) sareng kuantifikasi ukuran sél (katuhu) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) sél/grup tina 10 irisan anu béda ti babi anu béda, Uji-t Student Dua-buntut dilakukeun; ****p < 0,0001 dibandingkeun sareng regangan normal). b Gambar répréséntatif pikeun irisan jantung anu diwarnaan ku troponin-T sareng WGA (kénca) sareng kuantifikasi ukuran sél (katuhu) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) sél/grup tina 10 irisan anu béda tina babi anu béda, Uji-t Student Dua buntut dilakukeun; ****p < 0,0001 dibandingkeun sareng regangan normal). b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слева) и количественного опеникрадрадца (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) клеток/группу из 10 разных срезов от разных свиней, два- проводится хтвоться ****p < 0.0001 по сравнению с нормальным растяжением). b Gambar répréséntatif tina bagian jantung anu diwarnaan ku troponin-T sareng AZP (kénca) sareng kuantifikasi ukuran sél (katuhu) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) sél/grup ti 10 bagian anu béda ti babi anu béda, uji-t Student dua sisi dilakukeun; ****p < 0,0001 dibandingkeun sareng galur normal). b 用肌钙蛋白-T 和WGA（左）和细胞大小量化（右）染色的心脏切片的代表性片的代表性片的代表性（3n3图图MTOS），来自不同猪的10 个不同切片的369（D6 MTNorm）细胞/组，两进行有尾学生t检验；与正常拉伸相比，****p < 0.0001）。 b Gambar répréséntatif tina irisan jantung anu diwarnaan ku calcarein-T sareng WGA (kénca) sareng ukuran sél (katuhu) (n = 330 (D6 MTOS), 369 tina 10 irisan anu béda (D6 MTNorm)) Sél/组，uji t 两方法有尾学；dibandingkeun sareng peregangan normal，****p < 0,0001). b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слева) и количественная оцленка (разменка) 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) из 10 различных срезов от разных свиней Клетки/группа, двусторонние критерий С;0,0**** критерий С;0**** сравнению с нормальным растяжением). b Gambar répréséntatif tina bagian jantung anu diwarnaan ku troponin-T sareng AZP (kénca) sareng kuantifikasi ukuran sél (katuhu) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) tina 10 bagian anu béda tina babi anu béda) Sél/grup, kriteria dua sisi Student's t; ****p < 0,0001 dibandingkeun sareng galur normal). c Gambar répréséntatif pikeun irisan jantung MTOS dinten ka-0 sareng dinten ka-6 anu diimunolabel pikeun troponin-T sareng NFATC4 sareng kuantifikasi translokasi NFATC4 kana inti CM (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) irisan/grup ti babi anu béda, t-test Two-tailed Student dilaksanakeun; *p < 0,05). c Gambar répréséntatif pikeun irisan jantung MTOS dinten ka-0 sareng dinten ka-6 anu diimunolabel pikeun troponin-T sareng NFATC4 sareng kuantifikasi translokasi NFATC4 kana inti CM (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) irisan/grup ti babi anu béda, t-test Two-tailed Student dilaksanakeun; *p < 0,05). c Репрезентативные изображения для срезов сердца 0 и 6 дней MTOS, иммуномеченых для тропонина-Т и NFATC4, и колицич транслокации NFATC4 в ядра кавернозных клеток (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срезов/группу от разных свиней , вылнядяетсятся Стьюдента; *p < 0,05). c Gambar répréséntatif pikeun bagian jantung dina MTOS 0 sareng 6 dinten, diimunolabel pikeun troponin-T sareng NFATC4, sareng kuantifikasi translokasi NFATC4 dina inti sél kavernosa (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) irisan/grup ti babi anu béda) dilakukeun uji-t Student dua sisi; *p < 0,05). c 用于肌钙蛋白-T 和NFATC4 免疫标记的第0 天和第6 天MTOS心脏切片的代表性图像，以及来自不同猪的NFATC4 易位至CM 细胞核的量化（n = 4 (D0)片, N = 4 (D0)片进行双尾学生t 检验；*p < 0.05). c Gambar wawakil calcanin-T sareng immunolabeling NFATC4 第0天和第6天MTOS keureut jantung, sareng NFATC4 tina béda NFATC4 易位至CM inti sél 的 quantity化 (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) 切时间双尾学生et 电影；*p < 0.05). c Репрезентативные изображения срезов сердца MTOS dina 0 и 6 день для иммуномаркировки тропонином-Т и NFATC4 и колинч транслокации NFATC4 в ядра CM от разных свиней (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срез/группа, два- хвостатый t-критерий Сюден 0, *0). c Gambar répréséntatif tina irisan jantung MTOS dina dinten ka-0 sareng ka-6 pikeun imunolabel troponin-T sareng NFATC4 sareng kuantifikasi translokasi NFATC4 dina inti CM tina babi anu béda (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) irisan/grup, t-kriteria dua sisi Student's; *p < 0,05).Batang kasalahan ngagambarkeun rata-rata ± simpangan baku.
Panalungtikan kardiovaskular translasi meryogikeun modél sélular anu sacara akurat ngahasilkeun deui lingkungan jantung. Dina ieu panilitian, alat CTCM dikembangkeun sareng dicirikeun anu tiasa ngarangsang bagian jantung anu ipis pisan. Sistem CTCM kalebet stimulasi éléktromékanis anu disinkronkeun sacara fisiologis sareng pengayaan cairan T3 sareng Dex. Nalika bagian jantung babi kakeunaan faktor-faktor ieu, viabilitas, integritas struktural, aktivitas métabolik, sareng éksprési transkripsi tetep sami sareng dina jaringan jantung seger saatos 12 dinten kultur. Salaku tambahan, peregangan jaringan jantung anu kaleuleuwihi tiasa nyababkeun hipertrofi jantung anu disababkeun ku hiperékstensi. Sacara umum, hasil ieu ngadukung peran penting kaayaan kultur fisiologis dina ngajaga fenotipe jantung normal sareng nyayogikeun platform pikeun panyaringan ubar.
Seueur faktor anu nyumbang kana nyiptakeun lingkungan anu optimal pikeun fungsi sareng salametna kardiomiosit. Faktor anu paling atra nyaéta aya hubunganana sareng (1) interaksi antar sél, (2) stimulasi éléktromékanis, (3) faktor humoral, sareng (4) substrat métabolik. Interaksi sél-ka-sél fisiologis meryogikeun jaringan tilu diménsi anu rumit tina sababaraha jinis sél anu dirojong ku matriks ékstrasélulér. Interaksi sélular anu rumit sapertos kitu hésé diwangun deui sacara in vitro ku cara ko-kultur tina jinis sél individu, tapi tiasa gampang kahontal nganggo sifat organotipik tina bagian jantung.
Peregangan mékanis sareng stimulasi listrik kardiomiosit penting pisan pikeun ngajaga fenotipe jantung33,34,35. Sanaos stimulasi mékanis parantos seueur dianggo pikeun pangondisian sareng pematangan hiPSC-CM, sababaraha panilitian anu elegan nembe nyobian stimulasi mékanis irisan jantung dina kultur nganggo pemuatan uniaxial. Panilitian ieu nunjukkeun yén pemuatan mékanis uniaxial 2D gaduh pangaruh positip kana fenotipe jantung salami kultur. Dina panilitian ieu, bagian jantung boh dieusian ku gaya tarik isometrik17, pemuatan auksotonik linier18, atanapi siklus jantung diciptakeun deui nganggo eupan balik transduser gaya sareng dorongan tegangan. Nanging, metode ieu nganggo peregangan jaringan uniaxial tanpa optimasi lingkungan, anu ngahasilkeun supresi seueur gén jantung atanapi overéksprési gén anu aya hubunganana sareng réspon peregangan abnormal. CTCM anu dijelaskeun di dieu nyayogikeun stimulus éléktromékanis 3D anu niru siklus jantung alami dina hal waktos siklus sareng peregangan fisiologis (peregangan 25%, sistol 40%, diastol 60%, sareng 72 ketukan per menit). Sanaos stimulasi mékanis tilu diménsi ieu nyalira teu cekap pikeun ngajaga integritas jaringan, kombinasi stimulasi humoral sareng mékanis nganggo T3/Dex diperyogikeun pikeun ngajaga viabilitas, fungsi, sareng integritas jaringan sacara nyukupan.
Faktor humoral maénkeun peran penting dina modulasi fenotipe jantung déwasa. Ieu disorot dina panilitian HiPS-CM dimana T3 sareng Dex ditambahkeun kana média kultur pikeun ngagancangkeun pematangan sél. T3 tiasa mangaruhan transportasi asam amino, gula sareng kalsium dina mémbran sél36. Salaku tambahan, T3 ngamajukeun éksprési MHC-α sareng downregulation MHC-β, ngamajukeun formasi miofibril kedutan gancang dina kardiomiosit dewasa dibandingkeun sareng miofibril kedutan laun dina CM fétal. Kakurangan T3 dina pasien hipotiroid nyababkeun leungitna pita miofibril sareng turunna laju kamekaran nada37. Dex meta dina reséptor glukokortikoid sareng parantos dipidangkeun ningkatkeun kontraktilitas miokard dina jantung perfusi anu diisolasi; 38 pamutahiran ieu dianggap aya hubunganana sareng pangaruh kana éntri anu didorong ku deposit kalsium (SOCE) 39,40. Salaku tambahan, Dex ngabeungkeut kana reséptorna, nyababkeun réspon intraseluler anu lega anu ngirangan fungsi imun sareng peradangan30.
Hasil panilitian kami nunjukkeun yén stimulasi mékanis fisik (MS) ningkatkeun kinerja kultur sacara umum dibandingkeun sareng Ctrl, tapi gagal ngajaga viabilitas, integritas struktural, sareng éksprési jantung salami 12 dinten dina kultur. Dibandingkeun sareng Ctrl, panambahan T3 sareng Dex kana kultur CTCM (MT) ningkatkeun viabilitas sareng ngajaga profil transkripsi, integritas struktural, sareng aktivitas métabolik anu sami sareng jaringan jantung seger salami 12 dinten. Salaku tambahan, ku cara ngontrol tingkat peregangan jaringan, modél hipertrofi jantung anu diinduksi hiperékstensi didamel nganggo STCM, anu ngagambarkeun versatility sistem STCM. Perlu dicatet yén sanaos remodeling jantung sareng fibrosis biasana ngalibatkeun organ anu utuh anu sél sirkulasina tiasa nyayogikeun sitokin anu pas ogé fagositosis sareng faktor remodeling sanésna, bagian jantung masih tiasa niru prosés fibrotik dina réspon kana setrés sareng trauma. kana miofibroblas. Ieu parantos dievaluasi sateuacanna dina modél irisan jantung ieu. Perlu dicatet yén parameter CTCM tiasa dimodulasi ku cara ngarobih amplitudo tekanan/listrik sareng frékuénsi pikeun simulasi seueur kaayaan sapertos takikardia, bradikardia, sareng dukungan sirkulasi mékanis (jantung mékanis anu teu dimuat). Ieu ngajantenkeun sistem ieu janten throughput sedeng pikeun uji coba ubar. Kamampuh CTCM pikeun modél hipertrofi jantung anu diinduksi ku kaleuleuwihan latihan muka jalan pikeun nguji sistem ieu pikeun terapi anu dipersonalisasi. Dina kacindekanana, panilitian ieu nunjukkeun yén peregangan mékanis sareng stimulasi humoral penting pisan pikeun ngajaga kultur bagian jaringan jantung.
Sanaos data anu dipidangkeun di dieu nunjukkeun yén CTCM mangrupikeun platform anu ngajangjikeun pisan pikeun modél miokardium anu utuh, metode kultur ieu ngagaduhan sababaraha watesan. Watesan utama kultur CTCM nyaéta maksa setrés mékanis dinamis kontinyu dina irisan, anu nyegah kamampuan pikeun sacara aktif ngawas kontraksi irisan jantung salami unggal siklus. Salaku tambahan, kusabab ukuran bagian jantung anu alit (7 mm), kamampuan pikeun meunteun fungsi sistolik di luar sistem kultur nganggo sensor gaya tradisional diwatesan. Dina naskah ayeuna, urang sabagian ngungkulan watesan ieu ku cara meunteun tegangan optik salaku indikator fungsi kontraktil. Nanging, watesan ieu bakal meryogikeun padamelan salajengna sareng tiasa diatasi di hareup ku cara ngenalkeun metode pikeun ngawaskeun optik fungsi irisan jantung dina kultur, sapertos pemetaan optik nganggo kalsium sareng pewarna sénsitip tegangan. Watesan CTCM anu sanés nyaéta modél kerja henteu ngamanipulasi setrés fisiologis (preload sareng afterload). Dina CTCM, tekanan diinduksi dina arah anu sabalikna pikeun ngahasilkeun 25% peregangan fisiologis dina diastole (peregangan pinuh) sareng sistole (panjang kontraksi salami stimulasi listrik) dina jaringan anu ageung pisan. Watesan ieu kedah dihapus dina desain CTCM ka hareup ku cara masihan tekanan anu nyukupan kana jaringan jantung ti dua sisi sareng ku cara nerapkeun hubungan tekanan-volume anu pasti anu lumangsung dina bilik jantung.
Remodeling anu diinduksi ku overstretch anu dilaporkeun dina naskah ieu diwatesan pikeun niru sinyal hyperstretch hipertrofik. Ku kituna, modél ieu tiasa ngabantosan dina panilitian sinyal hipertrofik anu diinduksi ku peregangan tanpa peryogi faktor humoral atanapi saraf (anu teu aya dina sistem ieu). Panilitian salajengna diperyogikeun pikeun ningkatkeun multiplisitas CTCM, contona, ko-kultur sareng sél imun, faktor humoral plasma anu bersirkulasi, sareng persarafan nalika ko-kultur sareng sél neuronal bakal ningkatkeun kamungkinan modél panyakit sareng CTCM.
Tilu belas babi dianggo dina ieu panilitian. Sadaya prosedur sato dilaksanakeun saluyu sareng pedoman institusional sareng disatujuan ku Komite Perawatan sareng Panggunaan Sato Institusional Universitas Louisville. Lengkungan aorta dijepit sareng jantung diperfusi ku 1 L kardioplegia steril (110 mM NaCl, 1,2 mM CaCl2, 16 mM KCl, 16 mM MgCl2, 10 mM NaHCO3, 5 U/mL heparin, pH dugi ka 7,4); Jantung-jantungna diawetkeun dina larutan kardioplegik anu tiis pisan nepi ka diangkut ka laboratorium dina és anu biasana <10 menit. Jantung-jantungna diawetkeun dina larutan kardioplegik anu tiis pisan nepi ka diangkut ka laboratorium dina és anu biasana <10 menit. сердца хранили в ледяном кардиоплегическом растворе до транспортировки в лабораторию на льду, что обычно занимат <. Jantung disimpen dina larutan kardioplegik anu tiis pisan dugi ka diangkut ka laboratorium nganggo és, anu biasana peryogi waktos <10 menit.将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钟。将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钟。 Держите сердца в ледяной кардиоплегии до транспортировки в лабораторию на льду, обычно <10 мин. Jaga jantung tetep dina kaayaan és pikeun kardioplegia nepi ka diangkut ka laboratorium dina kaayaan és, biasana <10 menit.
Alat CTCM dikembangkeun nganggo perangkat lunak desain anu dibantuan komputer (CAD) SolidWorks. Ruang kultur, pembagi, sareng ruang hawa didamel tina plastik akrilik bening CNC. Cincin cadangan diaméter 7mm didamel tina polietilen kapadetan luhur (HDPE) di tengahna sareng gaduh alur o-ring pikeun nampung o-ring silikon anu dianggo pikeun ngégél média di handapna. Mémbran silika ipis misahkeun ruang kultur tina pelat pamisah. Mémbran silikon dipotong laser tina lambaran silikon kandel 0,02″ sareng gaduh karasa 35A. Gasket silikon handap sareng luhur dipotong laser tina lambaran silikon kandel 1/16″ sareng gaduh karasa 50A. Sekrup baja tahan karat 316L sareng mur jangjang dianggo pikeun ngencangkeun blok sareng nyiptakeun segel kedap udara.
Papan sirkuit citak (PCB) khusus dirancang pikeun diintegrasikeun sareng sistem C-PACE-EM. Soket konektor mesin Swiss dina PCB disambungkeun kana éléktroda grafit ku kawat tambaga berlapis pérak sareng sekrup perunggu 0-60 anu disekrup kana éléktroda. Papan sirkuit citak disimpen dina panutup printer 3D.
Alat CTCM dikontrol ku aktuator pneumatik anu tiasa diprogram (PPD) anu nyiptakeun tekanan sirkulasi anu dikontrol sapertos siklus jantung. Nalika tekanan di jero rohangan hawa ningkat, mémbran silikon anu fléksibel ngalegaan ka luhur, maksa média ka handapeun situs jaringan. Daérah jaringan teras bakal diulur ku pangusiran cairan ieu, niru ékspansi fisiologis jantung nalika diastole. Dina puncak relaksasi, stimulasi listrik diterapkeun ngalangkungan éléktroda grafit, anu ngirangan tekanan dina rohangan hawa sareng nyababkeun kontraksi bagian jaringan. Di jero pipa aya klep hemostatik kalayan sénsor tekanan pikeun ngadeteksi tekanan dina sistem hawa. Tekanan anu dirasa ku sénsor tekanan diterapkeun kana kolektor data anu nyambung ka laptop. Ieu ngamungkinkeun pangawasan tekanan di jero rohangan gas sacara kontinyu. Nalika tekanan rohangan maksimum kahontal (standar 80 mmHg, 140 mmHg OS), alat akuisisi data diparentahkeun pikeun ngirim sinyal ka sistem C-PACE-EM pikeun ngahasilkeun sinyal tegangan bifasik salami 2 ms, disetel ka 4 V.
Bagian jantung dicandak sareng kaayaan kultur dina 6 sumur dilaksanakeun sapertos kieu: Pindahkeun jantung anu dipanén tina wadah transfer ka baki anu ngandung kardioplegia tiis (4°C). Ventrikel kénca diisolasi nganggo bilah steril sareng dipotong-potong 1-2 cm3. Blok jaringan ieu dipasangkeun kana pangrojong jaringan nganggo perekat jaringan sareng disimpen dina bak jaringan mikrotom anu ngageter anu ngandung larutan Tyrode sareng terus-terusan dioksigénasi (3 g/L 2,3-butanedione monooxime (BDM), 140 mM NaCl (8,18 g). , 6 mM KCl (0,447 g), 10 mM D-glukosa (1,86 g), 10 mM HEPES (2,38 g), 1 mM MgCl2 (larutan 1 ml 1 M), 1,8 mM CaCl2 (larutan 1,8 ml 1 M), dugi ka 1 L ddH2O). Mikrotom anu ngageter disetel pikeun motong irisan kandel 300 µm dina frékuénsi 80 Hz, amplitudo geter horizontal 2 mm, sareng laju maju 0,03 mm/s. Bak jaringan dikurilingan ku és pikeun ngajaga larutan tetep tiis sareng suhu dijaga dina 4°C. Pindahkeun bagian jaringan tina bak mikrotom ka bak inkubasi anu ngandung larutan Tyrode anu terus-terusan dioksigénasi dina és dugi ka bagian anu cekap didapet pikeun hiji pelat kultur. Pikeun kultur transwell, bagian jaringan dipasangkeun kana pangrojong poliuretan steril lébar 6 mm sareng disimpen dina 6 ml média anu dioptimalkeun (199 média, 1x suplemen ITS, 10% FBS, 5 ng/ml VEGF, 10 ng/ml FGF-alkali sareng 2X antibiotik-antifungal). Stimulasi listrik (10 V, frékuénsi 1,2 Hz) diterapkeun kana bagian jaringan ngalangkungan C-Pace. Pikeun kaayaan TD, T3 sareng Dex seger ditambahkeun dina 100 nM sareng 1 μM dina unggal pergantian média. Médium ieu dijenuh ku oksigén sateuacan diganti 3 kali sapoé. Bagian jaringan dibudidayakeun dina inkubator dina suhu 37°C sareng 5% CO2.
Pikeun kultur CTCM, potongan jaringan disimpen dina printer 3D anu didamel khusus dina piring Petri anu ngandung larutan Tyrode anu dimodifikasi. Alat ieu dirancang pikeun ningkatkeun ukuran irisan jantung ku 25% tina luas cincin pangrojong. Ieu dilakukeun supados bagian jantung henteu manteng saatos dipindahkeun tina larutan Tyrode ka média sareng salami diastole. Nganggo lem histoakrilik, potongan anu kandelna 300 µm dipasang dina cincin pangrojong diaméterna 7 mm. Saatos ngagantelkeun bagian jaringan kana cincin pangrojong, potong bagian jaringan anu kaleuleuwihi sareng tempatkeun deui bagian jaringan anu napel kana bak larutan Tyrode dina és (4°C) dugi ka bagian anu cekap disiapkeun pikeun hiji alat. Total waktos pamrosésan pikeun sadaya alat henteu kedah ngaleuwihan 2 jam. Saatos 6 bagian jaringan dipasang kana cincin pangrojongna, alat CTCM dirakit. Ruang kultur CTCM dieusi sateuacanna ku 21 ml média anu tos dioksigénasi. Pindahkeun bagian jaringan kana ruang kultur sareng ati-ati miceun gelembung hawa naon waé nganggo pipet. Bagian jaringan teras diarahkeun kana liang sareng dipencet lalaunan kana tempatna. Pamungkas, pasang tutup éléktroda dina alat teras pindahkeun alat ka inkubator. Teras sambungkeun CTCM kana tabung hawa sareng sistem C-PACE-EM. Aktuator pneumatik muka sareng klep hawa muka CTCM. Sistem C-PACE-EM dikonfigurasi pikeun nganteurkeun 4 V dina 1,2 Hz salami pacing bifasik salami 2 ms. Médium diganti dua kali sadinten sareng éléktroda diganti sakali sadinten pikeun nyingkahan akumulasi grafit dina éléktroda. Upami diperyogikeun, bagian jaringan tiasa dipiceun tina sumur kulturna pikeun ngaluarkeun gelembung hawa anu mungkin murag di handapeunna. Pikeun kaayaan perlakuan MT, T3/Dex ditambahkeun seger kalayan unggal parobahan média ku 100 nM T3 sareng 1 μM Dex. Alat CTCM dibudidayakeun dina inkubator dina suhu 37°C sareng 5% CO2.
Pikeun kéngingkeun lintasan anu diulur tina irisan jantung, sistem kaméra khusus dikembangkeun. Kaméra SLR (Canon Rebel T7i, Canon, Tokyo, Jepang) dianggo nganggo lensa makro Navitar Zoom 7000 18-108mm (Navitar, San Francisco, CA). Visualisasi dilakukeun dina suhu kamar saatos ngagentos média ku média anu énggal. Kaméra diposisikan dina sudut 51° sareng pidéo dirékam dina 30 pigura per detik. Mimitina, parangkat lunak sumber terbuka (MUSCLEMOTION43) dianggo nganggo Image-J pikeun ngitung gerakan irisan jantung. Topéng ieu didamel nganggo MATLAB (MathWorks, Natick, MA, USA) pikeun nangtukeun daérah anu dipikaresep pikeun ngéléhkeun irisan jantung pikeun nyingkahan noise. Topéng anu disegméntasi sacara manual diterapkeun kana sadaya gambar dina runtuyan pigura teras disalurkeun ka plug-in MUSCLEMOTION. Muscle Motion nganggo inténsitas rata-rata piksel dina unggal pigura pikeun ngitung gerakanana relatif ka pigura rujukan. Data dirékam, disaring sareng dianggo pikeun ngitung waktos siklus sareng meunteun manteng jaringan salami siklus jantung. Video anu direkam diolah deui nganggo filter digital fase nol orde kahiji. Pikeun ngitung regangan jaringan (puncak-ka-puncak), analisis puncak-ka-puncak dilakukeun pikeun ngabédakeun antara puncak sareng palung dina sinyal anu direkam. Salian ti éta, detrending dilakukeun nganggo polinomial orde ka-6 pikeun ngaleungitkeun panyimpangan sinyal. Kode program dikembangkeun dina MATLAB pikeun nangtukeun gerakan jaringan global, waktos siklus, waktos rélaksasi, sareng waktos kontraksi (Kode Program Tambahan 44).
Pikeun analisis galur, nganggo pidéo anu sami anu didamel pikeun penilaian regangan mékanis, mimitina urang ngalacak dua gambar anu ngagambarkeun puncak gerakan (titik gerakan pangluhurna (luhur) sareng panghandapna (handap)) numutkeun parangkat lunak MUSCLEMOTION. Teras urang ngabagi daérah jaringan sareng nerapkeun bentuk algoritma bayangan kana jaringan anu dibagi (Gambar Tambahan 2a). Jaringan anu dibagi teras dibagi kana sapuluh handapeun permukaan, sareng setrés dina unggal permukaan diitung nganggo persamaan ieu: Galur = (Sup-Sdown)/Sdown, dimana Sup sareng Sdown nyaéta jarak bentuk tina kalangkang luhur sareng handap lawon, masing-masing (Gambar Tambahan .2b).
Bagian jantung difiksasi dina 4% paraformaldehida salami 48 jam. Jaringan anu difiksasi didehidrasi dina 10% sareng 20% ​​sukrosa salami 1 jam, teras dina 30% sukrosa sapeuting. Bagian-bagian éta teras dilebetkeun kana sanyawa suhu motong optimal (sanyawa OCT) sareng laun-laun dibekukeun dina bak isopentana/és garing. Simpen blok panyisipan OCT dina suhu -80 °C dugi ka dipisahkeun. Slide disiapkeun salaku bagian kalayan ketebalan 8 μm.
Pikeun miceun OCT tina bagian jantung, panasan slide dina blok pemanas dina suhu 95 °C salami 5 menit. Tambahkeun 1 ml PBS kana unggal slide sareng inkubasi salami 30 menit dina suhu kamar, teras permeate bagian ku cara nyetel 0,1% Triton-X dina PBS salami 15 menit dina suhu kamar. Pikeun nyegah antibodi non-spésifik ngabeungkeut kana sampel, tambahkeun 1 ml larutan BSA 3% kana slide sareng inkubasi salami 1 jam dina suhu kamar. BSA teras dipiceun sareng slide dikumbah ku PBS. Tandaan unggal sampel nganggo pensil. Antibodi primér (diéncérkeun 1:200 dina 1% BSA) (connexin 43 (Abcam; #AB11370), NFATC4 (Abcam; #AB99431) sareng troponin-T (Thermo Scientific; #MA5-12960) ditambahkeun salami 90 menit, teras antibodi sekundér (diéncérkeun 1:200 dina 1% BSA) ngalawan beurit Alexa Fluor 488 (Thermo Scientific; #A16079), ngalawan kelenci Alexa Fluor 594 (Thermo Scientific; #T6391) salami 90 menit tambahan Dikumbah 3 kali nganggo PBS Pikeun ngabédakeun pewarnaan target tina latar tukang, urang ngan ukur nganggo antibodi sekundér salaku kontrol. Pamungkas, pewarnaan nuklir DAPI ditambahkeun sareng slide disimpen dina vectashield (Vector Laboratories) sareng disegel ku cat kuku. pembesaran -x) sareng mikroskop Keyence kalayan pembesaran 40x.
WGA-Alexa Fluor 555 (Thermo Scientific; #W32464) dina 5 μg/ml dina PBS dianggo pikeun pewarnaan WGA sareng diterapkeun kana bagian anu tetep salami 30 menit dina suhu kamar. Slide teras dikumbah ku PBS sareng Sudan black ditambahkeun kana unggal slide sareng diinkubasi salami 30 menit. Slide teras dikumbah ku PBS sareng média embedding vectashield ditambahkeun. Slide divisualisasikeun dina mikroskop Keyence dina pembesaran 40x.
OCT dikaluarkeun tina sampel sapertos anu dijelaskeun di luhur. Saatos ngaluarkeun OCT, celupkan slide kana larutan Bouin sapeuting. Slide teras dibilas ku cai sulingan salami 1 jam teras disimpen dina larutan fuchsin asam aloe Bibrich salami 10 menit. Teras slide dikumbah ku cai sulingan teras disimpen dina larutan 5% fosfomolibdenum/5% asam fosfotungstat salami 10 menit. Tanpa dibilas, pindahkan slide langsung kana larutan biru anilin salami 15 menit. Teras slide dikumbah ku cai sulingan teras disimpen dina larutan asam asetat 1% salami 2 menit. Slide dikeringkeun dina 200 N étanol teras dipindahkeun kana xiléna. Slide anu diwarnaan divisualisasikeun nganggo mikroskop Keyence kalayan objektif 10x. Persentase luas fibrosis diukur nganggo perangkat lunak Keyence Analyzer.
CyQUANT™ MTT Cell Viability Assay (Invitrogen, Carlsbad, CA), nomer katalog V13154, numutkeun protokol produsén kalayan sababaraha modifikasi. Khususna, punch bedah kalayan diaméter 6 mm dianggo pikeun mastikeun ukuran jaringan anu seragam salami analisis MTT. Jaringan dilapis sacara individual kana sumur pelat 12-sumur anu ngandung substrat MTT numutkeun protokol produsén. Bagian-bagian éta diinkubasi dina suhu 37° C salami 3 jam sareng jaringan hirup ngametabolisme substrat MTT pikeun ngabentuk sanyawa formazan wungu. Ganti larutan MTT ku 1 ml DMSO sareng inkubasi dina suhu 37°C salami 15 menit pikeun ngekstrak formazan wungu tina bagian jantung. Sampel diéncérkeun 1:10 dina DMSO dina pelat handap anu jelas 96-sumur sareng inténsitas warna wungu diukur dina 570 nm nganggo pamaca pelat Cytation (BioTek). Bacaan dinormalisasi kana beurat unggal irisan jantung.
Média irisan jantung diganti ku média anu ngandung 1 μCi/ml [5-3H]-glukosa (Moravek Biochemicals, Brea, CA, USA) pikeun uji panggunaan glukosa sapertos anu parantos dijelaskeun sateuacanna. Saatos 4 jam inkubasi, tambahkeun 100 µl média kana tabung mikrosentrifugasi kabuka anu ngandung 100 µl 0,2 N HCl. Teras tabung disimpen dina tabung sintilasi anu ngandung 500 μl dH2O pikeun nguapkeun [3H]2O salami 72 jam dina suhu 37°C. Teras cabut tabung mikrosentrifugasi tina tabung sintilasi sareng tambahkeun 10 ml cairan sintilasi. Itungan sintilasi dilakukeun nganggo penganalisis sintilasi cair Tri-Carb 2900TR (Packard Bioscience Company, Meriden, CT, USA). Panggunaan glukosa teras diitung kalayan merhatikeun aktivitas spésifik [5-3H]-glukosa, kasaimbangan sareng latar anu teu lengkep, pangenceran [5-3H]-ka glukosa anu teu dilabélan, sareng efisiensi counter scintillation. Data dinormalisasi kana massa bagian jantung.
Saatos homogenisasi jaringan dina Trizol, RNA diisolasi tina bagian jantung nganggo Qiagen miRNeasy Micro Kit #210874 numutkeun protokol produsén. Persiapan perpustakaan RNAsec, sekuensing sareng analisis data dilaksanakeun sapertos kieu:
1 μg RNA per sampel dianggo salaku bahan awal pikeun persiapan perpustakaan RNA. Perpustakaan sekuensing dihasilkeun nganggo Kit Persiapan Perpustakaan RNA NEBNext UltraTM pikeun Illumina (NEB, AS) nuturkeun rekomendasi produsén, sareng kode indéks ditambahkeun kana runtuyan atribut pikeun unggal sampel. Sacara singget, mRNA dimurnikeun tina total RNA nganggo manik-manik magnét anu dipasangkeun sareng oligonukleotida poli-T. Fragmentasi dilaksanakeun nganggo kation divalen dina suhu anu luhur dina Buffer Réaksi Sintésis Untaian Kahiji NEBNext (5X). cDNA untaian kahiji disintésis nganggo primer heksamer acak sareng transkriptase terbalik M-MuLV (RNase H-). cDNA untaian kadua teras disintésis nganggo DNA polimérase I sareng RNase H. Overhang anu sésana dirobih janten tungtung tumpul ku aktivitas éksonuklease/polimérase. Saatos adénilasi tungtung 3′ tina fragmen DNA, Adaptor NEBNext kalayan struktur loop hairpin dipasangkeun kana éta pikeun nyiapkeun hibridisasi. Pikeun pamilihan fragmen cDNA anu panjangna dipikaresep 150-200 bp. Fragmen perpustakaan dimurnikeun nganggo sistem AMPure XP (Beckman Coulter, Beverly, AS). Teras, 3 μl USER Enzyme (NEB, AS) sareng cDNA anu dipilih ukuranana diikat nganggo adaptor dianggo salami 15 menit dina suhu 37°C teras salami 5 menit dina suhu 95°C sateuacan PCR. PCR teras dilaksanakeun nganggo Phusion High-Fidelity DNA polymerase, primer PCR universal, sareng primer Index (X). Pamungkas, produk PCR dimurnikeun (sistem AMPure XP) sareng kualitas perpustakaan ditaksir dina sistem Agilent Bioanalyzer 2100. Perpustakaan cDNA teras diurutkeun nganggo sequencer Novaseq. File gambar atah ti Illumina dirobih janten bacaan atah nganggo CASAVA Base Calling. Data atah disimpen dina file format FASTQ(fq) anu ngandung runtuyan bacaan sareng kualitas basa anu saluyu. Pilih HISAT2 pikeun cocogkeun bacaan sekuensing anu disaring sareng génom rujukan Sscrofa11.1. Sacara umum, HISAT2 ngadukung génom tina sagala ukuran, kalebet génom anu langkung ageung tibatan 4 milyar basa, sareng nilai standar disetel pikeun kaseueuran parameter. Bacaan splicing tina data RNA Seq tiasa disaluyukeun sacara efisien nganggo HISAT2, sistem panggancangna anu sayogi ayeuna, kalayan akurasi anu sami atanapi langkung saé tibatan metode anu sanés.
Seueurna transkrip sacara langsung ngagambarkeun tingkat éksprési gén. Tingkat éksprési gén ditaksir ku seueurna transkrip (jumlah sekuensing) anu aya hubunganana sareng génom atanapi ékson. Jumlah bacaan sabanding sareng tingkat éksprési gén, panjang gén, sareng jerona sekuensing. FPKM (fragmen per sarébu pasangan basa tina transkrip anu diurutkeun per juta pasangan basa) diitung sareng nilai-P tina éksprési diferensial ditangtukeun nganggo pakét DESeq2. Teras kami ngitung laju kapanggihna palsu (FDR) pikeun unggal nilai P nganggo metode Benjamini-Hochberg9 dumasar kana fungsi-R bawaan "p.adjust".
RNA anu diisolasi tina potongan jantung dirobah jadi cDNA dina konsentrasi 200 ng/μl nganggo campuran SuperScript IV Vilo Master ti Thermo (Thermo, cat. no. 11756050). RT-PCR kuantitatif dilakukeun nganggo pelat réaksi transparan Applied Biosystems Endura Plate Microamp 384-well (Thermo, cat. no. 4483319) sareng perekat optik microamp (Thermo, cat. no. 4311971). Campuran réaksi diwangun ku 5 µl campuran Taqman Fast Advanced Master (Thermo, cat # 4444557), 0,5 µl Taqman Primer sareng 3,5 µl H2O anu dicampur per sumur. Siklus qPCR standar dijalankeun sareng nilai CT diukur nganggo instrumen PCR real-time Applied Biosystems Quantstudio 5 (modul 384-well; produk # A28135). Primer Taqman dipésér ti Thermo (GAPDH (Ss03375629_u1), PARP12 (Ss06908795_m1), PKDCC (Ss06903874_m1), CYGB (Ss06900188_m1), RGL1 (Ss06868890_m1), ACTN1 (Ss01009508_mH), GATA4 (Ss03383805_u1), GJA1 (Ss03374839_u1), COL1A2 (Ss03375009_u1), COL3A1 (Ss04323794_m1), ACTA2 (Ss04245588_m1). Nilai CT sadaya sampel dinormalisasi kana gén housekeeping GAPDH.
Pelepasan média NT-ProBNP dipeunteun nganggo kit NT-ProBNP (pig) (Cat. No. MBS2086979, MyBioSource) numutkeun protokol produsén. Sacara singget, 250 µl tina unggal sampel sareng standar ditambahkeun dua kali kana unggal sumur. Langsung saatos nambihan sampel, tambahkeun 50 µl Assay Reagent A kana unggal sumur. Kocok pelat sacara lalaunan sareng segel ku sealant. Teras tablet diinkubasi dina suhu 37°C salami 1 jam. Teras aspirasi larutan sareng kumbah sumur 4 kali nganggo 350 µl larutan cuci 1X, inkubasi larutan cuci salami 1-2 menit unggal waktos. Teras tambahkeun 100 µl Assay Reagent B per sumur sareng segel ku sealant pelat. Tablet dikocok lalaunan sareng diinkubasi dina suhu 37°C salami 30 menit. Aspirasi larutan sareng kumbah sumur 5 kali nganggo 350 µl larutan cuci 1X. Tambahkeun 90 µl larutan substrat kana unggal sumur teras tutup pelat. Inkubasi pelat dina suhu 37°C salami 10-20 menit. Tambahkeun 50 µl Stop Solution kana unggal sumur. Pelat langsung diukur nganggo pembaca pelat Cytation (BioTek) anu disetel dina 450 nm.
Analisis daya dilaksanakeun pikeun milih ukuran grup anu bakal nyayogikeun daya >80% pikeun ngadeteksi parobahan absolut 10% dina parameter kalayan tingkat kasalahan Tipe I 5%. Analisis daya dilaksanakeun pikeun milih ukuran grup anu bakal nyayogikeun daya >80% pikeun ngadeteksi parobahan absolut 10% dina parameter kalayan tingkat kasalahan Tipe I 5%. Анализ мощности был выполнен для выбора размеров групп, которые обеспечат >80% мощности для обнаружения 10% изменения параметра с 5% частотой ошибок типа I. Analisis daya dilaksanakeun pikeun milih ukuran grup anu bakal nyayogikeun daya >80% pikeun ngadeteksi parobahan parameter absolut 10% kalayan tingkat kasalahan Tipe I 5%.进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％I功效以检测参数中10％绝对变化和5％I寎田用。进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％I功效以检测参数中10％绝对变化和5％I寎田用。 Был проведен анализ мощности для выбора размера группы, который обеспечил бы > 80% мощности для обнаруглютяба 10% изменения параметров и 5% частоты ошибок типа I. Analisis daya dilaksanakeun pikeun milih ukuran grup anu bakal nyayogikeun daya >80% pikeun ngadeteksi parobahan parameter absolut 10% sareng tingkat kasalahan tipe I 5%.Bagian jaringan dipilih sacara acak sateuacan ékspérimén. Sadaya analisis dilakukeun tanpa ningali kaayaan sareng sampel didekodekeun ngan saatos sadaya data dianalisis. Parangkat lunak GraphPad Prism (San Diego, CA) dianggo pikeun ngalaksanakeun sadaya analisis statistik. Pikeun sadaya statistik, nilai-p dianggap signifikan dina nilai <0,05. Pikeun sadaya statistik, nilai-p dianggap signifikan dina nilai <0,05. Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. Pikeun sadaya statistik, nilai-p dianggap signifikan dina nilai <0,05.对于所有统计数据，p 值在值<0.05 时被认为是显着的。对于所有统计数据，p 值在值<0.05 时被认为是显着的。 Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. Pikeun sadaya statistik, nilai-p dianggap signifikan dina nilai <0,05.Uji-t Student dua sisi dilakukeun kana data kalayan ngan ukur 2 babandingan. ANOVA hiji arah atanapi dua arah dianggo pikeun nangtukeun signifikansi antara sababaraha kelompok. Nalika ngalaksanakeun tés post hoc, koréksi Tukey diterapkeun pikeun ngitung sababaraha babandingan. Data RNAsec gaduh pertimbangan statistik khusus nalika ngitung FDR sareng p.adjust sapertos anu dijelaskeun dina bagian Métode.
Kanggo inpormasi lengkep ngeunaan desain panilitian, tingali abstrak Laporan Panilitian Alam anu numbu ka artikel ieu.