Nature.com сайтына киргениңиз үчүн рахмат.Сиз колдонуп жаткан серепчинин версиясы чектелген CSS колдоосуна ээ.Мыкты тажрыйба үчүн жаңыртылган браузерди колдонууну сунуштайбыз (же Internet Explorerдеги Шайкештик режимин өчүрүү).Ал ортодо, үзгүлтүксүз колдоону камсыз кылуу үчүн биз сайтты стилдерсиз жана JavaScriptсиз көрсөтөбүз.
Баңги заттарды сыноо үчүн жүрөктүн физиологиялык чөйрөсүн так көбөйтүү керек болгон VITRO тутумунда ишенимдүү бирдиктүү зарылчылык керек.Адамдын жүрөк ткандардын маданиятынын чектелген маданиятынын чектелүү болушу жүрөк дары каражаттарынын таасирин тийгизген таасирин тийгизет.Бул жерде биз жүрөк ткандарынын маданиятынын моделин (КТКМ) иштеп чыктык, ал электромеханикалык жүрөк кесимдерин стимулдайт жана жүрөк циклинин систолалык жана диастоликалык фазаларында физиологиялык сунууга дуушар болот.12 күндүк маданияттан кийин бул ыкма жүрөк бөлүмдөрүнүн жашоо жөндөмдүүлүгүн жарым-жартылай жакшыртса да, алардын структуралык бүтүндүгүн толук сактаган эмес.Ошондуктан, чакан молекула скринингден кийин, биз 100 нМ трийодтиронин (T3) жана 1 мкМ дексаметазон (Декс) биздин чөйрөгө кошуу 12 күн бою бөлүмдөрдүн микроструктурасын сактап деп табылган.T3 / Dex дарылоо менен бирге, CTCM системасы 12 күн бою жаңы жүрөк кыртыштары менен бирдей денгээлде транскрипция профилдерин, жашоого жөндөмдүүлүгүн, зат алмашуу активдүүлүгүн жана структуралык бүтүндүгүн сактап калды.Мындан тышкары, маданиятта жүрөк кыртышынын ашыкча созулушу гипертрофиялык жүрөк сигналын индукциялайт, бул CTCMнин жүрөктүн созулушу менен шартталган гипертрофиялык шарттарды туурай алгандыгын далилдейт.Жыйынтыктап айтканда, CTCM узак убакыт бою маданиятта жүрөктүн физиологиясын жана патофизиологиясын моделдештирип, дары-дармектерди ишенимдүү текшерүүгө мүмкүндүк берет.
Клиникалык изилдөөлөргө чейин, Витро системаларындагы ишенимдүү, адамдын жүрөгүн физиологиялык чөйрөнү так көбөйтүүгө болот.Мындай системалар механикалык созулган, жүрөктүн скулдарын жана электрофизиологиялык касиеттерин өзгөртүшү керек.Жаныбарлардын моделдери, адатта, адамдын жүрөгүнө дарылардын таасирин чагылдырууда ишенимдүүлүгү чектелген жүрөк физиологиясы үчүн скрининг платформасы катары колдонулат1,2.Акыр-аягы, Идеалдуу жүрөк кыртышынын маданиятынын эксперименталдык модели (КТКМ) адамдын жүрөгүнүн физиологиясын жана патофизиологиясын так чагылдырган ар кандай терапевтикалык жана фармакологиялык кийлигишүүлөр үчүн өтө сезгич жана спецификалык үлгү болуп саналат3.Мындай системанын жоктугу жүрөк жетишсиздигинин жаңы дарылоо ыкмаларын ачууну чектейт4,5 жана рыноктон чыгуунун негизги себеби катары дары-дармектердин кардиотоксикасына алып келди6.
Акыркы он жылдын ичинде сегиз жүрөк-кан тамыр эмес дарылар клиникалык колдонуудан алынып салынды, анткени алар QT аралыгын узартып, карынчалык аритмияга жана капыстан өлүмгө алып келет7.Ошентип, жүрөк-кан тамыр натыйжалуулугун жана уулуулугун баалоо үчүн алдын-ала так скринингдик стратегиялардын жогорулашы керек.Дары-дармек скринингинде жана уулуулугун текшерүүдө адам тарабынан пайда болгон pluripotent өзөк клеткасынан алынган кардиомиоциттердин (hiPS-CM) жакында колдонулушу бул маселени жарым-жартылай чечет.Бирок, хипс-CMSтин жетилбеген мүнөзү жана жүрөк ткандарынын көп антилулярдык татаалдыгынын жоктугу бул ыкманын негизги мүмкүнчүлүктөрү.Акыркы изилдөөлөр бул чектөө жарым-жартылай өз алдынча жыйрылуу башталгандан кийин жүрөк кыртышынын hydrogels түзүү үчүн эрте hiPS-CM колдонуу жана убакыттын өтүшү менен бара-бара электрдик стимулдаштырууну жогорулатуу мүмкүн экенин көрсөттү.Бирок, бул белдер-см мкротибиялар бойго жеткен миокарддын жетилген электрофизиологиялык жана контракттык касиеттери жок.Мындан тышкары, адамдын жүрөк ткандары клеткадан тышкары матрицалык белоктордун белгилүү бир топтомдору менен байланышкан эндотелийдик клеткаларды, нейрондорду жана стромдук фибробласттарды камтыган ар кандай клетка типтеринин гетерогендүү аралашмасынан турган татаал түзүлүшкө ээ.бойго жеткен сүт эмүүчүлөрдүн жүрөгүндө кардиомиоцит эмес популяциялардын11,12,13 бул гетерогендүүлүгү жеке клетка түрлөрүн колдонуу менен жүрөк кыртышын моделдөө үчүн негизги тоскоолдук болуп саналат.Бул негизги чектөөлөр физиологиялык жана патологиялык шарттарда бузулбаган миокард ткандарын өстүрүү ыкмаларын иштеп чыгуунун маанилүүлүгүн баса белгилейт.
Адамдын жүрөгүн (300 метр) схема бөлүмдөрүнүн сөөктөрү адам миокардын бузуу модели деп эсептешкен.Бул ыкма адамдын жүрөк ткандарына окшош 3D көп баскычтуу системага кирүүнү камсыз кылат.Бирок, 2019-жылга чейин маданияттуу жүрөк бөлүмдөрүн колдонуу (24 саат) маданиятынын өмүрү менен чектелген.Бул физикалык-механикалык сунуунун жоктугу, аба-суюктук интерфейси жана жүрөк кыртышынын муктаждыктарын колдобогон жөнөкөй медианы колдонуу сыяктуу бир катар факторлорго байланыштуу.2019-жылы бир нече изилдөө топтору механикалык факторлорду жүрөк кыртышынын маданиятынын системаларына киргизүү маданияттын өмүрүн узартып, жүрөктүн экспрессиясын жакшыртып, жүрөк патологиясын туурай аларын көрсөтүштү.17 жана 18-аяттагы эки жарашыктуу изилдөө, маданият учурунда жүрөк фенотипке оң таасирин тийгизет.Бирок, бул изилдөөлөр жүрөк бөлүктөрү да изометрдик чыңалуу күчтөрү 17 же сызыктуу auxotonic жүктөө 18 менен жүктөлгөн, анткени, жүрөк циклинин динамикалык үч өлчөмдүү физикалык-механикалык жүктү колдонгон эмес.Бул кыртыштарды сунуу ыкмалары көптөгөн жүрөк гендерин басууга же анормалдуу сунуу жооптору менен байланышкан гендердин ашыкча экспрессиясына алып келген.Белгилей кетсек, Pitoulis et al.19 Force Transkuctions Pridsiback жана чыңалуу дисктерин колдонуп, жүрөктүн циклинин селюптору үчүн күчтүү жүрөк маданият маданиятынын динамикалык маданият ваннасын иштеп чыккан.Бул система жүрөк циклинин in vitro моделин тактоого мүмкүндүк берет да, методдун татаалдыгы жана төмөн өткөрүү жөндөмдүүлүгү бул системаны колдонууну чектейт.Биздин лаборатория жакында 6 күнгө чейин чочко жана адамдын жүрөк кыртышынын бөлүмдөрүнүн жашоого жөндөмдүүлүгүн сактоо үчүн электрдик стимулдаштыруу жана оптималдаштырылган чөйрөнү колдонуу менен жөнөкөйлөштүрүлгөн маданият системасын иштеп чыкты 20,21.
Учурдагы кол жазмада биз жүрөк циклинин учурунда үч өлчөмдүү жүрөк физиологиясын жана патофизиологиялык дистензияны кайталоо үчүн гуморалдык сигналдарды камтыган чочко жүрөгүнүн бөлүмдөрүн колдонуу менен жүрөк кыртышынын маданиятынын моделин (CTCM) сүрөттөйбүз.Бул CTCM дары-дармектерди клиникага чейинки тестирлөө үчүн сүт эмүүчүлөрдүн жүрөгүнүн физиологиясын/патофизиологиясын туураган рентабелдүү, орто ылдамдыктагы кардиохирургиялык системаны камсыз кылуу аркылуу клиникага чейинки дары-дармекти алдын ала айтуунун тактыгын буга чейин болуп көрбөгөндөй жогорулата алат.
Гемодинамикалык механикалык сигналдар Витро 22,23,24деги кардиомиоцит функциясын сактоодо маанилүү ролду ойношот.Учурдагы кол жазмада биз физиологиялык жыштыктарда (1,2 Гц, мүнөтүнө 72 согуу) электрдик жана механикалык стимулдаштыруу аркылуу чоңдордун жүрөк чөйрөсүн туурай турган CTCM (Figure 1a) иштеп чыктык.Диастоль учурунда ашыкча кыртышка жол бербөө үчүн, 3D басып чыгаруу шайманы 25% га чейин 25% га көбөйтүү үчүн колдонулган (1b. 1b).C-PACE тутуму тарабынан индукцияланган электрдик темпи жүрөк циклин толугу менен кайра жаратуу үчүн маалымат алуу тутумун колдонуу менен систоладан 100 мс мурун баштоого убакыт берилди.Кыртыш маданият системасы ийкемдүү силикон мембрананы циклдик түрдө кеңейтүү үчүн программалануучу пневматикалык кыймылдаткычты (LB Engineering, Германия) колдонот, бул жогорку камерадагы жүрөк тилкелеринин кеңейишине алып келет.Система басымды өзгөрткүч аркылуу тышкы аба линиясына туташтырылган, бул басымды (± 1 мм рт.б.) жана убакытты (± 1 мс) так жөнгө салууга мүмкүндүк берген (1c-сүрөт).
Туура, түзмөктүн маданият палатасынын ичинде көрсөтүлгөн 7 мм колдоочу шакекчасына чейин, көк түстөгү шыңгыраган шакекке тиркеңиз.Маданият палатасы аба палатасынан ичке ийкемдүү силикон мембранасы менен бөлүнгөн.Ар бир палатанын ортосунда агып кетүүнү жайгаштырыңыз.Түзмөктүн капкагы электрдик стимулдаштыруучу графит электроддор бар.б чоң кыртыш түзмөктүн, гид шакек жана колдоо шакегинин схемалык өкүлчүлүгү.Туудулган ткандардын бөлүктөрү (күрөң) шайманынын сырткы четине карама-каршылыкка жайгаштырылган гидроюлдар шайманына жайгаштырылган.Көрсөтмөдү колдонуу, жакшылап, колдоо шакегин Жүрөк ткандары бөлүмүнүн үстүнөн тканей акрил менен жабышып туруңуз.Программалык пневматикалык кыймылдаткыч (PPD) тарабынан көзөмөлдөнгөн аба стимуляторунун функциясы катары электр стимуляциясын көрсөткөн график.Электрдик стимуляцияны басым сэндорлорун колдонуп, электрдик стимулдаштыруу үчүн маалыматтарды алуу үчүн колдонулган.Маданият бөлмөсүндөгү басым топтун босогосуна жеткенде, импульс сигналы электр стимуляциясын тригировкалоо үчүн C-Pace-EMге жөнөтүлөт.D сүрөтчөсүнүн сүрөтү инкубатор текчесине жайгаштырылган.Бир PPDге төрт аппарат пневматикалык схема аркылуу туташтырылган жана пневматикалык чынжырдагы басымды көзөмөлдөө үчүн гемостатикалык клапанга басым датчиктер киргизилген.Ар бир аппарат алты кыртыш бөлүмүн камтыйт.
Бир пневматикалык кыймылдаткычты колдонуу менен биз 4 CTCM аппаратын башкара алдык, алардын ар бири 6 кыртыш бөлүмдөрүн кармай алган (сүрөт 1d).80 мм Hg ткандардын созулушун баалоо.Art.кыртыш бөлүмдөрүнүн 25%га созулушун көрсөткөн (2б-сүрөт).Кыртыштын кыймылы атайын камера орнотуулары менен бааланган (Кошумча 1-сүрөт).Жыйыруу жана эс учурунда жүрөк кыртышынын Stretch жана ылдамдыгы маданият 12 күн бою туруктуу бойдон калган (сүрөт. 2f).Маданият учурундагы жыйрылышына электрдик стимулдаштыруунун таасирин баалоо үчүн, биз көлөкөлүү алгоритмди колдонуу менен активдүү деформацияны аныктоо ыкмасын иштеп чыктык (Кошумча 2a,b-сүрөт) жана электрдик стимулдаштыруу менен жана жок деформацияларды айырмалай алдык.Жүрөктүн ошол эле бөлүмү (сүрөт 2f).Кесүүнүн кыймылдуу аймагында (R6-9) электрдик стимулдаштыруу учурундагы чыңалуу электрдик стимуляция болбогонго караганда 20% жогору болгон, бул электрдик стимулдаштыруунун жыйрылуу функциясына кошкон салымын көрсөтөт.
Аба камерасынын басымынын, суюктук камерасынын басымынын жана кыртыштын кыймылынын өлчөөлөрүнүн өкүлдөрүнүн издери камеранын басымы суюктук камерасынын басымын өзгөртүп, кыртыш кесиминин тиешелүү кыймылын пайда кылаарын тастыктайт.В пунктунун (көк) ткандардын соруучу бөлүктөрүнүн пайызы (көк) төмөнкүлөргө туура келет (кызгылт сары).C жүрөктүн кесилишинин ченемдүү кыймылы кыймылдын өлчөнгөн ылдамдыкына дал келет.(d) Циклдик кыймылдын (көк сызыктын) өкүлчүлүгү (көк сызык) жана ылдамдык (кызгылт сары чекиттүү сызык) жүрөктүн кесиминен.е Цикл убактысынын сандык көрсөткүчү (n = 19 ар кандай чочколордун ар бир кесимдери), жыйрылуу убактысы (n = 19 тобуна кесимдери), эс алуу убактысы (n = 19 кесим тобуна, ар кандай чочколордун), кыртыш кыймылы (n = 25).тилимдер) / ар кандай чочколордун тобу), чокусу систолалык ылдамдыгы (n = 24 (D0), 25 (D12) ар кандай чочколордун тилим / топ) жана чокусу релаксация курсу (n = 24 (D0), 25 (D12) ар кандай чочколордун тилим / топ).Эки куйруктуу студенттин Т-сынагы эч кандай параметрде олуттуу айырмачылык жок экендигин көрсөттү.f Өкүл штамм талдоо кыртыш бөлүмдөрүнүн издери (кызыл) жана жок (көк) электрдик стимулдаштыруу, ошол эле бөлүмдөн кыртыш бөлүмдөрүнүн он аймактык аймактары.Төмөнкү панелдер ар кандай секциялардан он аймакта электрдик стимуляциясы бар жана жок кыртыш бөлүмдөрүндөгү штаммдын пайыздык айырмасынын сандык көрсөткүчтөрүн көрсөтөт. (N = 8 кесим / ар кандай чочколордон / тобу, эки куйруктуу студент т-сыноо жүргүзүлөт; **** p <0.0001, ** p <0.01, * P <0.05). (N = 8 кесим / ар кандай чочколордон / тобу, эки куйруктуу студент т-сыноо жүргүзүлөт; **** p <0.0001, ** p <0.01, * P <0.05). (n = 8 срезов/группу от разных свиней, проводится двусторонний t-критерий Стьюдента; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05). (N = 8 секундалардан ар башка чочколордон / тобу) эки куйруктуу студент тест; **** P <0.0001, ** p <0.01, * P <0.05). (N = 8 片 / 组, 来自来自 的学生, 进行 双尾 学生 t 检验; **** p <0.0001, ** p <0.01, * P <0.05). (N = 8 片 / 组, 来自来自 的学生, 进行 双尾 学生 t 检验; **** p <0.0001, ** p <0.01, * P <0.05). (n = 8 срезов/группу, от разных свиней, двусторонний критерий Стьюдента; ****p <0,0001, **p <0,01, *p <0,05). (N = 8 секундалар / тобу, ар кандай чочколордон, эки куйруктуу студенттик студенттин те тести; **** p <0.0001, ** p <0.01, * P <0.05).Ката тилкелери орточо ± стандарттык четтөөнү билдирет.
Биздин мурунку статикалык биомиметикалык жүрөк кесим маданият системасында [20, 21], биз электрдик стимуляцияны колдонуу жана орто курамын оптималдаштыруу аркылуу 6 күн бою жүрөк кесимдердин жашоо жөндөмдүүлүгүн, функциясын жана структуралык бүтүндүгүн сактап калды.Бирок, 10 күндөн кийин, бул көрсөткүчтөр кескин төмөндөдү.Биз мурунку статикалык биомиметикалык маданият системасында өстүрүлгөн бөлүмдөргө кайрылабыз 20, 21 башкаруу шарттарында (Ctrl) жана биз мурда оптималдаштырылган чөйрөбүздү MC шарттары жана бир эле убакта механикалык жана электрдик стимулдаштыруу (CTCM) астында маданият катары колдонобуз.чакырды.Биринчиден, биз электрдик стимулдоосуз механикалык стимулдоо 6 күн бою ткандардын жашоо жөндөмдүүлүгүн сактоо үчүн жетишсиз экендигин аныктадык (Кошумча фиг. 3a, b).Кызыктуусу, STCMди колдонуу менен физикалык-механикалык жана электрдик стимулдаштырууну киргизүү менен, 12 күндүк жүрөк бөлүмдөрүнүн жашоо жөндөмдүүлүгү MS шарттарында жаңы жүрөк бөлүмдөрүндөй эле, бирок MTT анализи көрсөткөндөй, Ctrl шарттарында эмес (сүрөт 1).3a).Бирок, бирдиктүү connexin 43 туюнтмасы жана Z-дискинин түзүлүшү толук сакталган эмес (сүрөт 3b).26. MC кыртыш статикалык башкаруу бөлүмдөрүнө салыштырмалуу күнү 0 жакшыртылган структуралык окшоштугун көрсөттү.
Таза маданият (D0) же CTCM (D12 Ctrl) же HTC (D12 Ctrl), 12 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC), 12 (D12 MC) (D12 MC). TRL). Таза маданият (D0) же CTCM (D12 Ctrl) же HTC (D12 Ctrl), 12 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC), 12 (D12 MC) (D12 MC). TRL).гистограмма статикалык культурада (D12 контролдоо) же CTCMде (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 контролдоо). ) ), 12 (D12 MC) 12 күн бою MTT жаңы жүрөк бөлүмдөрүнүн (D0) же жүрөк бөлүмдөрүнүн маданиятынын сандык көрсөткүчүн көрсөтөт.#### p <0,0001 по сравнению с D0 и ** p <0,01 по сравнению с D12 Ctrl). #### p <0.0001 D0 жана ** p <0.01 D12 Ctrlге салыштырмалуу). a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏刟养(D12 Ctrl) 12 天的MTT 活力的量化)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测行单向ANOVA 测行单向ANOVA 测行单向ANOVA 测行单向ANOVA 测行单向ANOVA 测行单向ANOVA 测行单向ANOVA 测行单向ANOVA 测行单向ANOVA 测 12 12 来自不同猪的12 (D12 MC) 来自不同猪的12 01，与D12 Ctrl 相比，**p <0,01)。 A 条形图 显示 静态 静态 培养 (D12 Ctrl) 或 CTCM (D12 MC)12 күн бою статикалык культурада (D12 контролдоо) же CTCMде (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 контролдоо)) , 12 (D12 MC) бөлүмдөрүндө/топто 12 күн бою өстүрүлгөн жаңы жүрөк бөлүмдөрүндө (D0) же жүрөк бөлүмдөрүндө MTT жашоо жөндөмдүүлүгүнүн сандык көрсөткүчтөрүн көрсөткөн гистограмма, ар кандай ANOVA жолдорунан алынган тест;#### p <0,0001 по сравнению с D0, ** P <0,01 по сравнению с D12 Ctrl). #### p <0.0001 D0ге салыштырмалуу D0ге салыштырмалуу D12 Ctrlга салыштырмалуу D1,01).b Troponin-T (жашыл), коннексин 43 (кызыл) жана DAPI (көк) жаңы бөлүнгөн жүрөк бөлүмдөрүндө (D0) же статикалык шарттарда (Ctrl) же CTCM шарттарында (MC) 12 күн бою өстүрүлгөн жүрөк бөлүмдөрүндө репрезентативдик иммунофлуоресценттик сүрөттөр (бош шкала = 100 мкм). Жүрөк кыртышынын түзүмдүк бүтүндүгүн жасалма интеллект сандык аныктоо (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) ар кандай чочконун кесиндилери/топ, бир тараптуу ANOVA сыноо жүргүзүлөт; ####p <0.0001 салыштырганда D0 жана ****0 C1.0 салыштырганда). Жүрөк кыртышынын структуралык бүтүндүгүн жасалма интеллект сандык аныктоо (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) ар кандай чочколордун ар бири кесимдер/группа, бир тараптуу ANOVA сыноо жүргүзүлөт; ####p <0.0001 салыштырганда D0 жана D0.0 ****p <01 салыштырганда). Количественная оценка структурной целостности сердечной ткани искусственным интеллектом (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) срезов/групп от ар түрдүү свиней, проводится однофакторный тест ANOVA проводится <0#00; с****1ию <0#0 ,0001 по сравнению с D12 Ctrl). Жасалма интеллект (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) ар кандай чочколордун бөлүктөрү/группалары, бир жактуу ANOVA тести аткарылган; ####p <0.0001, D0 жана D0.0.0 менен салыштырылган). Искусственный интеллект для количественной оценки структурной целостности сердечной ткани (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) срезов/группу каждой из разных свиней, односторонний тест ANOVA; ##0#p <0 vs D0#0****p. 001 по сравнению с D12 Ctrl). c 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像（左）和量化（右）（裸（右）（裸（右）（裸（右）（裸=m（0µn（裸=尺0Ｚ切片/组，每组来自不同的猪，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0,0001 与D0 相比， 0.0.0*p ). C 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 （左 左） 量化 （右） 量化 （右） 裸尺度度度 = 500 μm） （n = 10 个 切片 组 每 组 来自 不同 猪 ， 进行 单向 单向 Anova （0#0#0.相比，***p < 0,001 与D12 Ctrl 相比）。 с Өкүл сүрөттөрү (солдо) жана жүрөк бөлүмдөрүнүн сандык (оң) Массондун трихром тагы (бош = 500 мкм) менен боёлгон (n = 10 бөлүм/топ, ар бир башка чочко, дисперсия бир жактуу талдоо менен сыналган ;### # p <0.0001 салыштырганда C1.0, ***p <1.0 салыштырганда).Ката тилкелери орточо ± стандарттык четтөөнү билдирет.
Биз маданият чөйрөсүнө чакан молекулаларды кошуу менен кардиомиоциттердин бүтүндүгүн жакшыртса жана CTCM маданиятында фиброздун өнүгүшүн азайтууга болот деп божомолдодук.Бул кичинекей молекулалар мурда sarcomere узундугун, T-түтүкчөлөрүн жана өткөрүү ылдамдыгын жогорулатуу менен кардиомиоциттердин жетилишине түрткү берүү үчүн hiPSC-CM маданияттарында колдонулган.Ошондуктан, биз бир же бул кичинекей молекулалардын айкалышы киргизүү жүрөк бөлүмдөрүнүн структуралык бүтүндүгүн жакшыртат, жокпу, сыналган.Баштапкы скрининг үчүн, ар бир кошулмада клетка маданият моделдеринде колдонулган концентрациялардын негизинде тандалып алынган (1 μm dex27, 100 NM T327 жана 2.5 μM SB31).12 күн маданиятынан кийин, Т3 менен Декстин айкалышы жана Декстин айкалышы оптималдуу кардиомиоциттин оптималдуу структуралык бүтүндүгүнө жана минималдуу фибрикалык оңдоп-түзөө (4 жана 5-сүрөттөр).Мындан тышкары, бул концентрациялардын ушул концентрациялануусун кош же эки эселенген натыйжаларды кадимки концентрацияга салыштырганда, кемчиликсиз бир нече эффекттерди пайда кылды (6a, b).
Баштапкы скринингден кийин, биз 4 маданият шартын башма-баш салыштырып көрдүк (Figure 4a): Ctrl: биздин оптималдаштырылган чөйрөнү колдонуу менен мурда сүрөттөлгөн статикалык маданиятыбызда өстүрүлгөн жүрөк бөлүмдөрү;20.21 TD: Шаршемби күнү T3 жана Ctrl s Added Dex;MC: биздин мурда оптималдаштырылган чөйрөнү колдонуу менен CTCMде өстүрүлгөн жүрөк бөлүмдөрү;жана MT: T3 жана Dex менен CTCM ортого кошулду.12 күндүк өстүрүүдөн кийин, MS жана MT кыртыштарынын жашоо жөндөмдүүлүгү MTT анализи менен бааланган жаңы кыртыштардагыдай эле калган (сүрөт 4b).Кызыктуусу, T3 жана Dexтин трансвелл культураларына (TD) кошулушу Ctrl шарттарына салыштырмалуу жашоо жөндөмдүүлүгүн олуттуу жакшыртууга алып келген жок, бул жүрөк бөлүмдөрүнүн жашоо жөндөмдүүлүгүн сактоодо механикалык стимулдаштыруунун маанилүү ролун көрсөтүп турат.
механикалык стимулдаштыруунун жана T3/Dex кошумчаларынын 12 күн бою чөйрөгө таасирин баалоо үчүн колдонулган төрт маданият шарттарын чагылдырган эксперименталдык дизайн диаграммасы. B Гистограмма показывает количественнува оценку жизнеспособнусти черич 12 дней после ккьцивирования кымыз 4 условиях ккььятивировировирования (контроль, TD, mt) по сравнению со свежими срезами с ардца (D0) (N = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD жана D12 MT), 12 (D12 MC) Срезов / гр РАВНЕНИЮ С D12 CTRL). b 4 12 (D12 MC) b Гистограмма, показывающая все 4 условия культивирование (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD и D12 MT (D12 Ctrl, D12 TD и D12 MT), од MC2, от разных MC2) оронний тест ANOVA;####p <0,0001, ###p <0,001 по сравнению с D0, **p <0,01 по сравнению с контролем D12). б Гистограмма бардык 4 маданият шарттарын (башкаруу, TD, MC жана MT) жаңы жүрөк бөлүмдөрүнө (D0) салыштырганда (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD жана D12 MT), ар кандай чочколордун 12 (D12 MC) бөлүмдөрүнүн/топтун, бир тараптуу ANOVA сыноосу #0#0, #0 #0.<1.<0. 0, **p<0,01 каршы башкаруу D12). c Бар диаграмма глюкоза агымынын 12 күндөн кийинки маданияттын бардык 4 маданият шарттарында (Ctrl, TD, MC жана MT) жаңы жүрөк тилкелерине (D0) салыштырмалуу сандык көрсөткүчүн көрсөтөт (n = 6 тилим/ар түрдүү чочколордун тобу, бир тараптуу ANOVA тести жүргүзүлөт; ###p <0,001 жана ***p D1 салыштырганда D1.0). c Бар диаграмма глюкоза агымынын 12 күндөн кийинки маданияттын бардык 4 маданият шарттарында (Ctrl, TD, MC жана MT) жаңы жүрөк тилкелерине (D0) салыштырмалуу сандык көрсөткүчүн көрсөтөт (n = 6 тилим/ар түрдүү чочколордун тобу, бир тараптуу ANOVA тести жүргүзүлөт; ###p <0,001 жана ***p D1 салыштырганда D1.0). C гистограмма показывает количественнува оценку потока глюкозы через 12 дней после ккьвихвивирования кымых 4 условиях ккььятивировировировировирования (контроль, td, mt) по сравнению со свежими срезами Сндца (D0) (N = 6 Срезов / группу от разных свитпу от разных свуд. C глюкозанын сандык 12 күнгө чейинки маданиятынын (D0 контролдоо, TD, mc жана mt жана mt жана mt жана mt) сандыктардан (D0 контролдоо, TD, mt жана mt) сандыктардан кийин, бир тараптуу ANOVA тестине (D0 жана *** P <0.001 D12 Ctrlга салыштырмалуу). C гистограмма, показывающая количественную оценку Потазывенную оценку потока глюкозы через 12 дней после ккьтивирования для всехвивировировировировировировировировировировировировировировировировировировировировки (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими Срезами Сердца (D0) (N = 6 Срезов / Группа, Одностеронний были проведен были проведены Тесты Ала; ### П <0,001 по сравнению с D0, *** P <0,001 по сравнению с D12 (контроль). В Глюкоза агымынын санынын 12 күндүк маданиятынын санына (D0 контролдоо, TD, MT) (D0) ар кандай чочколордун / тобу, D0-ге салыштырмалуу бир тараптуу субъект / тобу, D0ге салыштырмалуу, бир тараптуу.Драйн анализделиши Жаңы (Көк), 12-күндүк (жашыл) участоктордун жана 12 Мт (кызыл) кыртыштардын он регионалдык ткандары упайлары (N = 4 кесим / топ, бир тараптуу ANOVA тест; топтордун ортосунда олуттуу айырма жок).Вулкандык сюжет (D0) Сотикалык бөлүмдөргө (Ctrl) маданиятынан (Ctrl) маданиятына салыштырганда, дифференцияланган гендерди (D0) сюжети (D0)Ката тилкелери орточо ± стандарттык четтөөнү билдирет.
Бул CTCM жана T3 / DEX айкалышы кыртышты жарамдуулукту жогорулатат жана 12 күндүк маданияттуу жүрөк бөлүмдөрүнүн зат алмашуу фенотиптерин сактайт.Мындан тышкары, штаммды талдоо көрсөткөндөй, мТ жана MS жана MS. 4D сүрөтү (4D сүрөт).
CTCM жана T3 / DEXтин жалпы таасирин анализдөө үчүн жүрөк кесүү кыртышынын глобалдык транскрипцияланган ландшафт боюнча талдоосу үчүн, биз Жүрөктүн кесими РСАЕК ЖАРДАМЧЫ ТӨРТҮНДӨГҮ ТӨРТҮНЧҮЛӨРҮНҮН ТӨРТҮНЧҮ ШАРТТАРЫ (Кошумча маалыматтар 1).Кызыктуусу, МТ бөлүмдөрү жаңы жүрөк ткандарына жогорку транскрипттык окшоштукту көрсөтүштү, 13,642 генден 16 жаштан 1642 ген.Бирок, биз мурда көрсөткөндөй, Ctrl кесимдери маданиятта 10-12 күндөн кийин 1229 дифференциалдуу экспрессияланган гендерди көрсөттү (сүрөт 4e).Бул маалыматтар жүрөк жана фибробласт гендердин qRT-PCR менен тастыкталган (Кошумча сүрөт 7a-c).Кызыктуусу, Ctrl бөлүмдөрү жүрөк жана клетка циклинин гендеринин төмөндөшүн жана сезгенүү гендик программаларын активдештирген.Бул маалыматтар, адатта, узак мөөнөттүү тарбиялоодон өткөндөн кийин, адаттагыдай болуп өткөн деп эсептеген маалыматтар, адатта, MT шарттарында толугу менен жараланат (8a, b).Акылдуу гендерди кылдаттык менен изилдөө үчүн мт шарттарында гана, ал эми ион-канал (9F) жана ион каналын (9-сүрөт) (9-сүрөт).Бул маалыматтар механикалык жана гуморалдык стимулдаштыруу (T3 / DEX) айкалышы менен, жүрөк кесмекчи транскриптому 12 күндөн кийин маданияттагы 12 күн өткөндөн кийин, жаңы жүрөк кесимдерге окшош бойдон кала алат.
Бул транскрипттердин жүрөк бөлүмдөрүндө жүрөк бөлүмдөрүндө түзүмдүк акыйкаттыгынын жүрөк -лөрүнүн түзүмдүк акыйкаттыгы, ал эми бузулган туташуу жана локалдаштырылган туташуу жана локалдаштырылган Conchonsin 43 (5-сүрөт).Мындан тышкары, MT шарттарынын алкагында жүрөк бөлүмдөрүндө фиброзу CTRLге салыштырмалуу бир кыйла төмөндөгөн жана жаңы жүрөк бөлүмдөрүнө окшош (5b) окшош.Бул маалыматтар механикалык стимуляциянын жана T3 / DEX дарылоонун айкалышы маданияттагы жүрөк бөлүмдөрүндө жүрөктүн бөлүмдөрүндө жүрөктүн структурасын натыйжалуу сактайт деп көрсөтүп турат.
Өкүлчүлүктүү иммунофлуклосценциясынын фопсонофлуклук-т (жашыл), туташкан 43 (кызыл) (кызыл) (D0) (D0) (D0) (D0) (D0), Төрт Төрт Бөлүмдүн Төрт бөлүмүндө 12 күндүк маданият (грина) (D0) (D0) (D0) (D0);). Жүргүзгү ткандардын жасалма интеллектиктиги (N = 7 (D0 жана D0 Ctrl), 5 (D0 жана D0 Ctrl), 5 (D.00 TD, D12 MC жана D12 MC жана D12 MC). Жүргүзгү ткандардын жасалма интеллектиктиги (N = 7 (D0 жана D0 Ctrl), 5 (D0 жана D0 Ctrl), 5 (D.00 TD, D12 MC жана D12 MC жана D12 MC). Ткани сердца с помощью табличественной целлоственности искусственного интеллекте (N = 7 (D0 и D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC и D12 MT) Срезов / грвуппа, проведен Однофак Торный Тэт-Анова; #### p <0,0001 по сравнению с D0 и * P <0,05 или **** p <0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). Жасалма интеллектти колдонуп, жүрөк ткандардын структуралык актыкты сандандыруу (N = 7), 5 (D12 TD, D12 CTRL), 5 (D12 TD, D12 MC жана D12 MC жана D12) Бөлүмдөр / Топ;对不同猪的心脏组织结构完整性（n = 7（D0 和D12 Ctrl）、5（D12 TD、D12 MC 和D12 和D12工智能量化，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0,0001 与D0 和*p < 0,05 相比，或****p < 0,000 相比，或****p < 0,0000对 不同 猪 的 心脏 结构 完整性 （n = 7 （d0 和 d12 ctrl） （5 （d12 td 、 d12 mc 、 d12 mc 强缉智能量 化 进行 单向 单向 单向 测试 ； ######### p < 0,0001 与D0 和*p < 0,05 済02 C 済02p相比）。Ар кандай чочколордо жасалма интеллектди колдонуп, жүрөк ткандарынын структуралык интеллектинин (N = 7 (D0 жана D0 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC жана D12) бөлүмдөр / топ / топ);#### p < 0,0001 по сравнению с D0 и *p < 0,05 же ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). #### p < 0,0001 D0 жана *p < 0,05 же ****p < 0,0001 салыштырмалуу D12 Ctrl). Биптиканын сүрөттөрү жана жүрөк тибиндеги баскычтар жана сандык масондун тегиз тагы (шкала бар = 500 метр) (N = 10). л). Биптиканын сүрөттөрү жана жүрөк тибиндеги баскычтар жана сандык масондун тегиз тагы (шкала бар = 500 метр) (N = 10). л). B Репрезентативные изображения жана колличественная оценка срихром сердца, окрашенных трихромным красителем массона (Масшбная линека = 500 мкм) ОВ / группу от разных свондук, выплняется Одностороннил ТЭТ АНОВА; #### p <0,0001 по сравнению с D0 и *** П <0,001 или **** p <0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). В өкүлчүлүктөрү жана Маслондун Тричромдун тубаса бети (N = 10) (N = 10). b 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像和量化（比例尺= 500 µm）1！lD1D1D）1！lD1D和D12 MC），来自不同猪的9 个（D12 MT）切片/组，进行单因素方差分析；###0**01；0.#0#0D p < 0,001，或****p <0,0001 与D12 Ctrl 相比）。 B 用 Массон 三 色 代表性 和 心脏 切片 切片 切片 代表性 和 量化 切片 切片 切片 切片 和 量化 心脏 切片 切片 切片 切片 尺 尺 尺 尺 尺 10 个 个 个 个 个 个 个 个 个 个 切片 切片 切片 切片 切片 切片 组 组 组 组 组 组 切片 切片 切片 切片 组 组 组 组 组 切片方差 分析; #### p <0.0001 与 D0 相比, *** P <0.001, 或 **** p <0.0001 与 d12 ctrl 相比). B Репрезентатативные изображения жана колличественная оценка срихром сердца, окрашенных трихромом массона (Масшбная линека = 500 мкм) Сваней / группы, один- Способ ANOVA; #### p <0,0001 по сравнению с D0, *** P <0,001 или **** p <0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). В өкүлчүлүктөрү жана жүрөк бөлүмдөрүнүн (шкаласы бар барктуу) (N = 10) (d0, d0, d12 ctrl), бир г.Ката тилкелери орточо ± стандарттык четтөөнү билдирет.
Акырында, CTCMдин кардиох гипертрофияны жөргөмүштүн гипертрофиясына чукул, жүрөк ткандарын көбөйтүү менен бааланган.CTCMде, аба палатасынын чокусу 80 ммгг чейин 80 ммггга чейин өскөн.Art.(нормалдуу созуу) 140 мм рт.ст.(6а-сүрөт).Буга чейин созулган 32% га төмөнкүлөргө туура келет (6b. 6b), бул жүрөк бөлүмдөрүнө талап кылынганга жетишүү үчүн, гипертрофияда көрүнүп тургандай, жүрөк бөлүктөрү үчүн талап кылынган максатта талап кылынган партия үчүн талап кылынган.Жүрөк кыртышынын жыйрылуу жана эс алуу учурундагы созулушу жана ылдамдыгы маданияттын алты күн бою туруктуу бойдон калган (сүрөт 6c).MT шарттарынан жүрөк кыртыштары алты күн бою нормалдуу сунуп (MT (Нормалдуу)) же overstretch шарттарына (MT (OS)) дуушар болгон.Маданиятта төрт күндөн кийин, гипертрофиялык биомаркер NT-ProBNP MT (нормалдуу) шарттарга салыштырмалуу MT (OS) шарттарында чөйрөдө кыйла жогорулаган (сүрөт 7a).Мындан тышкары, алты күн өстүрүү кийин, MT (OS) клетка өлчөмү (сүрөт. 7b) олуттуу MT жүрөк (нормалдуу) бөлүмдөрүнө салыштырмалуу көбөйгөн.Мындан тышкары, NFATC4 өзөктүк көчүрүү кыйла overstretched кыртыштарда көбөйгөн (сүрөт. 7c).Бул жыйынтыктар гипердистенсиядан кийин патологиялык ремоделизациянын прогрессивдүү өнүгүшүн көрсөтүп турат жана CTCM аппараты созулган жүрөк гипертрофиясынын сигналын изилдөө үчүн платформа катары колдонулушу мүмкүн деген түшүнүктү колдойт.
Эйр Палатасынын басымынын, суюктук палатасынын премьеринин, суюктук басымын жана кыртышын өлчөөлөрүн жана кыртышынын басымын тастыктаган ткандардын скважинасынын кысымын өзгөрттү, кыртыштын кесиминин тийиштүү кыймылынын суюктук басымын өзгөрттү.В өкүлчүлүгү, кадимки сунулган (кызгылт сары) жана ашыкча (көк) кыртыштын (көк) ткандары үчүн ийри сызыктар.c Цикл убактысын көрсөткөн тилке (n = 19 ар кандай чочколордон), жыйрылуу убактысы (n = 18-19 ар бир топко, ар кандай чочколорго), релаксация убактысы (n = 19 ар бир топко, ар кандай чочколорго) ), ткандардын кыймылынын амплитудасы (n = 14, ар кандай чочколордон) тилимдер / топ, ар кандай чочколордон) жана чокусу релаксация курсу (n = 14 (D0), 15 (D6) ) бөлүмдөрү / топтору) ар кандай чочко), эки куйруктуу Студенттин t-тест кандайдыр бир параметрде олуттуу айырманы көрсөткөн эмес, бул параметрлер ашыкча чыңалуу менен маданияттын 6 күн ичинде туруктуу бойдон калганын көрсөтүп турат.Ката тилкелери орточо ± стандарттык четтөөнү билдирет.
МТ-Нурлан Нормалдуу (Нормал) (N = 4) шартында маданият маданиятынан NT-PROMNP концентрациясынын графикасы (N = 4), 3 (D2 MTS, D2 MTNONS), ар башка чочколордун (N-mtos) кесимдери / тизме), кадимки сунулганга салыштырмалуу. МТ-Нурлан Нормалдуу (Нормал) (N = 4) шартында маданият маданиятынан NT-PROMNP концентрациясынын графикасы (N = 4), 3 (D2 MTS, D2 MTNONS), ар башка чочколордун (N-mtos) кесимдери / тизме), кадимки сунулганга салыштырмалуу.НТ-Пробнп маданиятындагы сандык гистограммада сандык гистограмма (норма) же ашыкча (OS)** p <0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **п <0,01 кадимки созулганга салыштырмалуу). A 在 Mt 正常 拉伸 (Норм) 或 过度 拉伸 (OS) . MT нормалдуу созулган (норма) же ашыкча (es) шарттарында NT-PRONP маданиятынын сандыгы (N = 4), 3 (D2 mtos, d4 mtnorm 和 d4 mtos)Кадимки МТ (норма) же ашкананын шартында маданият маданияттуу нТ-пробнттун концентрациясынын сандыгы (N = 4) (D2 MTO), 3 (D2 mtos, d2 mtnorm) жана D4 MTS) ар кандай чочколор / дисперсияны эки тараптуу талдоо;** p <0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **п <0,01 кадимки созулганга салыштырмалуу). В.А. ВГАнын кесимдери тропонин-т жана WGA (солдо) жана клетканын көлөмүн сандык (оңдо) (N = 330), ар кандай чочколордон, 369 (D6 mtos) клеткалары / Топтук клеткаларды / Топтолгон эки ар кандай тилкелерден / тобу өткөрүлөт; **** p <0.0001 B Репрезентативные изображения Сропонином-тропонином-тропонином-магистика (слева) жана количественного определения размер (N = 330), 369 (D6 Mtnorm) клеток / групп Свазных свизов, хвостовой, два- Проводится хвостовой т-Критерий стюдента; **** p <0,0001 по сравнению срматия В ТРОПОНИН-Т жана AZP (солдо) жана клетканын көлөмүн сандык боёлгон жүрөктүн өкүлдөрү (N = 330), ар кандай чочколордон келген 10 ар кандай бөлүмдөн турган (N = 330) клеткалар / 369 (D6 MTO)). B 用 肌钙 蛋白 蛋白 蛋白 和 bga 和 和 和 和 和 和 和 染色 代表性 代表性 代表性 代表性 代表性 代表性 代表性 代表性 代表性 代表性 代表性 代表性 代表性 图像 来自 切片 切片 的 的 来自 来自 切片 的 的 来自 来自 来自 切片 的 的 的 学生 检验 切片 切片 的 的 学生 学生 检验 切片 切片 的 学生 学生 检验 检验 切片 的 的 学生 / 组, 两 正常 有尾 学生 检验 检验 组, 与 正常 有尾 学生 检验; 与 正常 正常进行, **** P <0.0001 б Калкареин-T жана WGA (солдо) жана клетканын өлчөмү (оң) менен боёлгон жүрөк тилкелеринин репрезентативдик сүрөттөрү (n = 330 (D6 MTOS), 10 түрдүү кесимден 369 (D6 MTNorm)) Cells/组，两方组，两方t，两方组，两方组，两方组，两方t（唰t，两方t） ，****p <0,0001). B Репрезентатативные изображения Сропонином-тропонином-тропонином-магистика (слева) жана количественная оценка размера (N = 330), 369 (D6 Mtnorm) из 10 различный срезов о Т разных свинней клетки / группа, двусторонние Критерийние КРИТЕРИЙ СТЬЮДЕНТА; **** P <0,0001 по сравнению сравный растяжением). б troponin-T жана AZP (солдо) менен боёлгон жүрөк бөлүмдөрүнүн өкүлү сүрөттөрү жана клетка өлчөмүн (оңдо) сандык аныктоо (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) ар кандай чочколордун 10 ар кандай бөлүмдөрдөн) Клеткалар / топ, эки куйруктуу Студенттик критерийи;****p <0,0001 кадимки штаммга салыштырмалуу). с өкүлү сүрөттөр күнү 0 жана күн 6 MTOS жүрөк тилкелери troponin-T жана NFATC4 үчүн immunolabeled жана NFATC4 CMs ядролоруна көчүрүү сандык аныктоо (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) ар кандай чочколордун кесиндилери / топтун, эки-студенттер аткарылган * t <p0.0). c Репрезентативные изображения үчүн срезов сердца 0 жана 6 дней MTOS, иммуномеченых үчүн тропонина-Т и NFATC4, жана количественная оценка транслокации NFATC4 в ядра кавернозных клеток (n = 4 (D0), 3D сруповов в МТ, 3D) няется двусторонний t-критериий Стьюдента; *p < 0,05). c 0 жана 6 күн MTOS боюнча жүрөк бөлүмдөрүнүн өкүлү сүрөттөрү, troponin-T жана NFATC4 үчүн immunolabeled жана каверноздук клеткалардын ядросунда NFATC4 көчүрүү сандык аныктоо (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) ар кандай чочколордун тилим / топ) Студенттин эки куйруктуу сыналышы;*p <0,05). c 用于肌钙蛋白-T 和NFATC4 免疫标记的第0 天和第6 天MTOS 心脏切片的代表性白-T 和NFATC4的NFATC4 易位至CM 细胞核的量化（n = 4 (D0)、3 (D6 MTOS) 切片/组, 进行双尾学生t ＀05*p. c Калканин-T жана NFATC4 иммунобелгилөө 第0天和第6天MTOS жүрөк тилкелеринин жана NFATC4 易位至CM клетка ядросунан 的quantity化 的quantity化 (n = 4 (D0), 3.双尾学生et 电影；*p < 0,05). с Репрезентативные изображения срезов сердца MTOS на 0 жана 6 деннь үчүн иммуномаркировки тропонином-Т жана NFATC4 жана количественная оценка транслокации NFATC4 в ядра CM от разных свиней (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) ьюдента; *p < 0,05). с 0 жана 6 күнү MTOS жүрөк тилкелердин өкүлү сүрөттөрү troponin-T жана NFATC4 immunolabeling жана сандык NFATC4 көчүрүү NFATC4 ар кандай чочколордун (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) тилимдер / топтун, эки куйруктуу Студенттик * 0.cs).Ката тилкелери орточо ± стандарттык четтөөнү билдирет.
Котормо жүрөк-кан тамыр изилдөө так жүрөк чөйрөсүн кайра уюлдук моделдерин талап кылат.Бул изилдөөдө CTCM аппараты иштелип чыккан жана жүрөктүн өтө ичке бөлүктөрүн стимулдайт.CTCM системасы физиологиялык синхрондуу электромеханикалык стимулдаштырууну жана T3 жана Dex суюктуктарын байытууну камтыйт.Чочконун жүрөк бөлүмдөрү бул факторлорго дуушар болгондо, алардын жашоо жөндөмдүүлүгү, структуралык бүтүндүгү, зат алмашуу активдүүлүгү жана транскрипциялык экспрессиясы 12 күндөн кийин маданияттын жаңы жүрөк кыртышындагыдай эле калган.Мындан тышкары, жүрөк кыртышынын ашыкча чоюлуп, гиперэкстензия менен шартталган жүрөктүн гипертрофиясын алып келиши мүмкүн.Жалпысынан алганда, бул жыйынтыктар жүрөктүн нормалдуу фенотипти сактоодо физиологиялык маданият шарттарынын маанилүү ролун колдойт жана дары-дармектерди текшерүү үчүн аянтчаны камсыз кылат.
Кардиомиоциттердин иштеши жана жашоосу үчүн оптималдуу шарттарды түзүүгө көптөгөн факторлор көмөктөшөт.Бул факторлордун эң көрүнүктүүлөрү (1) клетка аралык өз ара аракеттенүү, (2) электромеханикалык стимул, (3) гуморалдык факторлор жана (4) метаболизмдик субстраттарга байланыштуу.Физиологиялык клеткадан клеткага өз ара аракеттенүү клеткадан тышкаркы матрица тарабынан колдоого алынган бир нече клетка типтеринин татаал үч өлчөмдүү тармактарын талап кылат.Мындай татаал клеткалык өз ара аракеттенүүлөрдү in vitro шартында клетканын айрым түрлөрүн биргелешип өстүрүү жолу менен калыбына келтирүү кыйын, бирок жүрөк бөлүмдөрүнүн органотиптик табиятын колдонуу менен оңой жетүүгө болот.
Кардиомиоциттердин механикалык сунуусу жана электрдик стимуляциясы жүрөктүн фенотибин сактоо үчүн маанилүү болуп саналат33,34,35.Механикалык стимулдаштыруу hiPSC-CM кондициялоо жана жетилүү үчүн кеңири колдонулуп келгени менен, бир нече көрктүү изилдөөлөр жакында бир огунан жүктөөнүн жардамы менен маданиятта жүрөк тилкелерин механикалык стимулдаштырууга аракет кылышкан.Бул изилдөөлөр көрсөткөндөй, 2D uniaxial механикалык жүктөө маданият учурунда жүрөктүн фенотипине оң таасирин тийгизет.Бул изилдөөлөрдө жүрөктүн бөлүктөрү же изометрдик чыңалуу күчтөрү менен17, сызыктуу ауксотоникалык жүктөм менен18 жүктөлгөн же жүрөк цикли күч өзгөрткүчүнүн пикири жана чыңалуу дисктери аркылуу кайра түзүлгөн.Бирок, бул ыкмалар айлана-чөйрөнү оптималдаштыруусуз бир октуу кыртыштын созулушун колдонушат, натыйжада көптөгөн жүрөк гендери басылышы же анормалдуу созуу реакциялары менен байланышкан гендердин ашыкча экспрессиясы.Бул жерде сүрөттөлгөн CTCM цикл убактысы жана физиологиялык сунуу (25% сунуу, 40% систола, 60% диастола жана мүнөтүнө 72 согуу) боюнча табигый жүрөк циклин туураган 3D электромеханикалык стимул менен камсыз кылат.Бул үч өлчөмдүү механикалык стимулдоо ткандардын бүтүндүгүн сактоо үчүн жетиштүү болбосо да, ткандардын жашоо жөндөмдүүлүгүн, функциясын жана бүтүндүгүн адекваттуу сактоо үчүн T3/Dex аркылуу гуморалдык жана механикалык стимулдаштыруунун айкалышы талап кылынат.
Гуморалдык факторлор чоңдордун жүрөк фенотипинин модуляциясында маанилүү роль ойнойт.Бул HiPS-CM изилдөөлөрүндө баса белгиленди, анда T3 жана Dex клетканын жетилишин тездетүү үчүн маданий медиага кошулган.T3 аминокислоталардын, канттардын жана кальцийдин клетка мембраналары аркылуу ташылышына таасир этиши мүмкүн36.Мындан тышкары, T3 MHC-α туюнтма жана MHC-β downregulation өбөлгө түзөт, түйүлдүктүн CM жай тармал myofibrils салыштырганда жетилген кардиомиоциттердин тез Twitch myofibrils пайда болушуна өбөлгө түзөт.Гипотиреоз менен ооруган бейтаптарда T3 жетишсиздиги миофибриллярдык тилкелердин жоголушуна жана тондун өнүгүү ылдамдыгынын төмөндөшүнө алып келет37.Декс глюкокортикоиддик рецепторлорго таасир этет жана обочолонгон перфузиялуу жүрөктөрдүн миокарддын жыйрылышын жогорулатат;38 бул жакшыртуу кальций кени менен шартталган киришине (SOCE) 39,40 таасири менен байланыштуу деп эсептелет.Мындан тышкары, Dex анын рецепторлору менен байланышып, иммундук функцияны жана сезгенүүнү30 басуучу кеңири клетка ичиндеги жоопту пайда кылат.
Биздин натыйжалар физикалык механикалык стимулдаштыруу (MS) Ctrl салыштырмалуу жалпы маданият көрсөткүчтөрүн жакшырды, бирок маданият 12 күндүн ичинде жашоого жөндөмдүүлүгүн, структуралык бүтүндүгүн жана жүрөк экспрессиясын сактап кала алган жок экенин көрсөтүп турат.миофибробласттарга кирет.Бул мурун бул кардиологиялык кесим моделинде бааланган.Белгилей кетсек, CTCM параметрлери тахикардия, брадикардия жана механикалык кан айланууну колдоо (механикалык жүксүз жүрөк) сыяктуу көптөгөн шарттарды симуляциялоо үчүн басымды/электрдик амплитуданы жана жыштыкты өзгөртүү жолу менен модуляцияланышы мүмкүн.Бул системаны дары-дармекти текшерүү үчүн орточо өткөрүү жөндөмдүүлүгүнө ээ кылат.CTCMнин ашыкча стресстен келип чыккан жүрөк гипертрофиясын моделдөө жөндөмү бул системаны жекече терапия үчүн сыноого жол ачат.
Бул жерде берилген маалыматтар CTCM бузулбаган миокардды моделдөө үчүн абдан келечектүү платформа экенин көрсөтүп турат да, бул маданият ыкмасы кээ бир чектөөлөр бар.CTCM маданиятынын негизги чектөөсү, ал кесимдерге үзгүлтүксүз динамикалык механикалык стресстерди киргизет, бул ар бир цикл учурунда жүрөк тилкесинин жыйрылышына активдүү мониторинг жүргүзүү мүмкүнчүлүгүн жокко чыгарат.Мындан тышкары, жүрөк бөлүмдөрүнүн (7 мм) кичинекей өлчөмүнө байланыштуу, салттуу күч сенсорлорун колдонуу менен маданият системаларынан тышкары систолалык функцияны баалоо мүмкүнчүлүгү чектелген.Учурдагы кол жазмада биз оптикалык чыңалууну жыйрылуу функциясынын көрсөткүчү катары баалоо менен бул чектөөнү жарым-жартылай жеңебиз.Бирок, бул чектөө мындан аркы иштерди талап кылат жана келечекте, мисалы, кальций жана чыңалуу сезгич боёкторду колдонуу менен оптикалык карта түзүү сыяктуу маданиятта жүрөк тилкелеринин иштешине оптикалык мониторинг жүргүзүү ыкмаларын киргизүү менен чечилиши мүмкүн.CTCM дагы бир чектөө жумушчу модели физиологиялык стресс (алдын ала жана кийин жүктөө) манипуляциялоо эмес.CTCMде басым 25% физиологиялык сунууну диастолада (толук сунуу) жана систолада (электрдик стимулдоо учурундагы жыйрылуу узундугу) өтө чоң ткандарда кайра жаратуу үчүн карама-каршы багыттар боюнча индукцияланган.Бул чектөө келечектеги CTCM конструкцияларында эки тараптан жүрөк кыртышына адекваттуу басым жасоо жана жүрөк камераларында пайда болгон басым-көлөм мамилелерин колдонуу менен алынып салынышы керек.
Бул кол жазмада билдирилген ашыкча созулган кайра куруу гипертрофиялык гиперстрейч сигналдарын имитациялоо менен чектелет.Ошентип, бул модель гуморалдык же нервдик факторлорго муктаж болбостон (бул системада жок) созулган гипертрофиялык сигнализацияны изилдөөгө жардам берет.КТКМдин көптүгүн жогорулатуу үчүн кошумча изилдөөлөр керек, мисалы, иммундук клеткалар менен биргелешип өстүрүү, циркуляциядагы плазманын гуморалдык факторлору жана нейрондук клеткалар менен бирге өстүрүү учурунда иннервация CTCM менен ооруну моделдөөнүн мүмкүнчүлүктөрүн жакшыртат.
Бул изилдөөдө он үч чочко колдонулган.Бардык жаныбарлар жол-жоболору институттук көрсөтмөлөргө ылайык аткарылган жана Louisville институттук жаныбарларды сактоо жана пайдалануу боюнча комитети тарабынан бекитилген.Аорта аркасы кысып, жүрөккө 1 л стерилдүү кардиоплегия куюлган (110 мМ NaCl, 1,2 мМ CaCl2, 16 мМ KCl, 16 мМ MgCl2, 10 мМ NaHCO3, 5 U/мл гепарин, рН 4 чейин.); жүрөктөр муздак муздак кардиоплегиялык эритмеде муздун үстүндө лабораторияга жеткирилгенге чейин сакталган, ал адатта <10 мүнөт. жүрөктөр муздак муздак кардиоплегиялык эритмеде муздун үстүндө лабораторияга жеткирилгенге чейин сакталган, ал адатта <10 мүнөт. сердца хранили в ледяном кардиоплегическом расстворе до транспортировки в лабораторию на льду, что обычно занимает <10 мин. жүрөктөр муздак муздак кардиоплегиялык эритмеде муз үстүндө лабораторияга жеткирилгенге чейин сакталган, бул адатта <10 мүнөттү талап кылат.将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10刂钟将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10刂钟 Держите сердца в ледяной кардиоплегии до транспортировки в лабораторию на льду, обычно <10 мин. Лабораторияга муз үстүндө ташыганга чейин жүрөктөрдү муз кардиоплегиясында сактаңыз, адатта <10 мин.
CTCM аппараты SolidWorks компьютердик дизайн (CAD) программасында иштелип чыккан.Маданият камералары, бөлгүчтөр жана аба камералары CNC тунук акрил пластиктен жасалган.Жука кремнезем кабыкчасы маданият камерасын бөлүүчү плитадан бөлүп турат.Силикон мембранасы 0,02 ″ калың силикон барактан лазер менен кесилген жана катуулугу 35А.Төмөнкү жана үстүнкү силикон прокладкалар 1/16 ″ калың силикон барактан лазер менен кесилген жана катуулугу 50А.316L дат баспас болоттон жасалган бурамалар жана канат гайкалар блокту бекитүү жана герметикалык пломбаны түзүү үчүн колдонулат.
Атайын басма схемасы (PCB) C-PACE-EM системасы менен бириктирүү үчүн иштелип чыккан.Басылып чыккан схема 3D принтеринин капкагына жайгаштырылат.
CTCM аппараты жүрөк циклине окшош башкарылуучу кан айлануу басымын түзгөн программалануучу пневматикалык кыймылдаткыч (PPD) тарабынан башкарылат.Аба палатанын ичиндеги басым жогорулап, ийкемдүү силикон кабыкчасы жогору көтөрүлүп, момундарды кыртыш сайттын астына мажбурлайт.Андан кийин ткандардын аянты ушул суюктуктун чыгарылышына чейин созулат, диастол учурунда жүрөктүн физиологиялык кеңейишин басаңдатат.Релаксациянын туу чокусунда графит электроддор аркылуу электрдик стимуляция жасалды, бул аба камерасындагы басымды төмөндөтүп, кыртыш бөлүмдөрүнүн кысылышын шарттады.Түтүн ичинде - бул гемостатикалык клапан - басым сэнсору, аба тутумундагы басымды аныктоо.Басым сенсору тарабынан сезилген басым ноутбукка туташтырылган маалымат жыйноочуга колдонулат.Бул газ камерасынын ичиндеги басымды үзгүлтүксүз көзөмөлдөөгө мүмкүндүк берет.Камерадагы максималдуу басымга жеткенде (стандарттык 80 мм Hg, 140 mmHg OS), маалыматтарды чогултуу аппаратына C-PACE-EM системасына 2 мс үчүн эки фазалуу чыңалуу сигналын түзүү үчүн сигнал жөнөтүү буйругу берилди, 4 В.
Жүрөк бөлүмдөрү алынган жана 6 скважинадагы маданият шарттары төмөнкүдөй аткарылган: жыйналган жүрөктөрдү өткөрүп берүүчү идиштен муздак (4° С) кардиоплегия камтыган легенге өткөрүңүз.Сол карынша стерилдүү бычак менен изоляцияланып, 1-2 см3 өлчөмүндө кесилген.Дирилдөөчү микротом 80 Гц жыштыгында, горизонталдык термелүү амплитудасы 2 мм жана 0,03 мм/с алдын ала ылдамдыкта 300 мкм калың кесимдерди кесүүгө коюлган.Эритмени муздатуу үчүн кыртыш ваннасы муз менен курчалган жана температура 4°Сде сакталган.Микротомдук ваннадан кыртыштын секцияларын муздун үстүндө үзгүлтүксүз кычкылтектелген Тирод эритмеси бар инкубациялоочу ваннага бир культура табакчасы үчүн жетиштүү бөлүмдөр алынганга чейин өткөрүңүз.Трансвелл культуралары үчүн кыртыш бөлүмдөрү стерилдүү 6 мм кеңдиктеги полиуретан таянычтарга бекитилип, 6 мл оптималдаштырылган чөйрөгө (199 орто, 1x ITS кошумчасы, 10% FBS, 5 нг/мл VEGF, 10 нг/мл FGF-щелочтук жана 2Х антибиотик-грибокко каршы) жайгаштырылды.Электрдик стимулдаштыруу (10 V, жыштыгы 1,2 Гц) C-Pace аркылуу кыртыш бөлүмдөрүнө колдонулган.TD шарттары үчүн, жаңы T3 жана Dex 100 нМ жана 1 μM ар бир орто өзгөртүү боюнча кошулган.Орто суткасына 3 жолу алмаштыруу алдында кычкылтек менен каныккан.Кыртыш кесимдери инкубатордо 37°С жана 5% СО2 менен өстүрүлдү.
CTCM культуралары үчүн кыртыш бөлүмдөрү модификацияланган Тироддун эритмеси камтылган Петри табакчасында атайын жасалган 3D принтерге жайгаштырылды.Аппарат жүрөктүн кесиминин өлчөмүн колдоо шакекчесинин аянтынын 25% га көбөйтүү үчүн иштелип чыккан.Бул Тирод эритмесинен чөйрөгө өткөндөн кийин жана диастола учурунда жүрөктүн бөлүмдөрү созулуп кетпеши үчүн жасалат.Гистоакрилдик клейди колдонуу менен калыңдыгы 300 мкм болгон секциялар диаметри 7 мм болгон таяныч шакекчеге бекитилди.Бардык түзмөктөр үчүн жалпы иштетүү убактысы 2 сааттан ашпашы керек.6 кыртыш бөлүмдөрү алардын колдоо шакекчелери менен бекитилгенден кийин, CTCM аппараты чогултулган.CTCM маданият камерасы 21 мл алдын ала кычкылтектелген чөйрө менен алдын ала толтурулган.Кыртыш бөлүмдөрүн маданият камерасына өткөрүп, аба көбүктөрүн пипетка менен кылдаттык менен алып салыңыз.Андан кийин кыртыш бөлүмү тешикке киргизилип, акырын ордуна басылган.Акырында, электроддун капкагын аппаратка коюп, аппаратты инкубаторго өткөрүңүз.Андан кийин CTCMди аба түтүгүнө жана C-PACE-EM тутумуна туташтырыңыз.Пневматикалык кыймылдаткыч ачылат жана аба клапаны CTCMди ачат.C-PACE-EM системасы эки фазалуу темпте 2 мс учурунда 1,2 Гцте 4 В жеткирүү үчүн конфигурацияланган.Электроддордо графит топтолуп калбашы үчүн чөйрөнү суткасына эки жолу, ал эми электроддорду күнүнө бир жолу алмаштырып турушту.Зарыл болсо, кыртыш бөлүмдөрү алардын астына түшүп калышы мүмкүн болгон аба көбүктөрүн чыгаруу үчүн алардын маданий кудуктарынан алынып салынышы мүмкүн.MT дарылоо шарттары үчүн, T3/Dex 100 нМ T3 жана 1 μM Dex менен ар бир орточо өзгөртүү менен жаңы кошулду.CTCM аппараттары инкубатордо 37°C жана 5% СО2 менен өстүрүлгөн.
Жүрөк тилкелеринин созулган траекторияларын алуу үчүн атайын камера системасы иштелип чыккан.SLR камерасы (Canon Rebel T7i, Canon, Токио, Япония) Navitar Zoom 7000 18-108 мм макро линза менен колдонулган (Navitar, Сан-Франциско, Калифорния).Визуализация чөйрөнү жаңы чөйрөгө алмаштыргандан кийин бөлмө температурасында аткарылды.Камера 51° бурчта жайгашкан жана видео секундасына 30 кадр менен жазылат.Биринчиден, ачык булактуу программалык камсыздоо (MUSCLEMOTION43) жүрөк тилкелеринин кыймылынын санын аныктоо үчүн Image-J менен колдонулган.Маска MATLAB (MathWorks, Natick, MA, АКШ) аркылуу ызы-чуу болбош үчүн жүрөк кесимдерин согуу үчүн кызыккан аймактарды аныктоо үчүн түзүлгөн.Кол менен сегменттелген маскалар бардык сүрөттөргө кадр ырааттуулугунда колдонулат жана андан кийин MUSCLEMOTION плагинине өткөрүлөт.Muscle Motion анын кыймылынын маалымдама алкагына салыштырмалуу санын аныктоо үчүн ар бир кадрдагы пикселдердин орточо интенсивдүүлүгүн колдонот.Маалыматтар жазылган, чыпкаланган жана цикл убактысын эсептөө жана жүрөк циклинин учурунда кыртыштын созулушун баалоо үчүн колдонулган.Жазылган видео биринчи даражадагы нөл фазалуу санарип чыпкасынын жардамы менен кайра иштетилген.Кыртыштын созулушун (чокудан чокуга) сандык баалоо үчүн жазылган сигналдагы чокуларды жана ылдыйларды айырмалоо үчүн чокудан чокуга анализ жүргүзүлдү.Кошумчалай кетсек, детрендинг сигналдын дрейфин жок кылуу үчүн 6-даражадагы полиномияны колдонуу менен жүргүзүлөт.
Андан кийин биз кыртыш аймактарын сегменттерге бөлдүк жана сегменттелген кыртыштарга көлөкөлөө алгоритминин түрүн колдондук (Кошумча 2а сүрөт).
Жүрөк бөлүмдөрү 4% параформальдегидде 48 саатка бекитилди.Туруктуу ткандар 10% жана 20% сахарозада 1 саат, андан кийин 30% сахарозада түн ичинде суусуздандырылды.Андан кийин бөлүмдөр оптималдуу кесүүчү температура кошулмасына (OCT кошулмасына) салынып, акырындык менен изопентан/кургак муз ваннасында тоңдурулган.OCT кыстаруу блокторун -80 °Cде бөлүнгөнгө чейин сактаңыз.Слайддар 8 мкм калыңдыгы менен бөлүктөр катары даярдалган.
Жүрөк бөлүмдөрүнөн OCT алып салуу үчүн, слайддарды жылытуу блогунда 95 °C 5 мүнөткө ысытуу.Ар бир слайдга 1 мл PBS кошуу жана бөлмө температурасында 30 мүнөт инкубациялоо, андан кийин бөлмө температурасында 15 мүнөт PBS ичинде 0,1% Triton-X коюу менен бөлүмдөрдү өткөрөт.Спецификалык эмес антителолордун үлгү менен байланышуусуна жол бербөө үчүн слайддарга 1 мл 3% BSA эритмесин кошуп, бөлмө температурасында 1 саат инкубациялоо керек.Андан кийин BSA алынып салынды жана слайддар PBS менен жуулду.Ар бир үлгүнү карандаш менен белгилеңиз.
Андан кийин слайддар PBS менен жуулуп, ар бир слайдга судан карасы кошулуп, 30 мүнөт инкубацияланды.Андан кийин слайддар PBS менен жуулду жана vectashheld кыстаруу чөйрөсү кошулду.Слайддар Keyence микроскопунда 40 эсе чоңойтууда көрүлгөн.
OCT жогоруда сүрөттөлгөндөй үлгүлөрдөн алынып салынды.OCTти алып салгандан кийин, слайддарды түнү бою Буиндин эритмеси менен чөмтүрүңүз.Андан кийин слайддар дистилденген суу менен 1 саат чайкалып, андан кийин 10 мүнөткө Bibrich алоэ кислотасынын фуксин эритмесинде жайгаштырылды.Андан кийин слайддар дистилденген суу менен жууп, 5% фосфомолибден/5% фосфотунгсти кислотасынын эритмесинде 10 мүнөткө жайгаштырылды.Чайкоосуз, слайддарды түздөн-түз Түздөн-түз Анилине көк эритмеге 15 мүнөткө өткөрүп бериңиз.Андан кийин слайддарды дистилденген суу менен жууп, 1% уксус кислотасынын эритмесинде 2 мүнөткө коюшту.Слайддар 200 Н этанолдо кургатылган жана ксилолго которулган.Боялган слайддар 10x объективдүү Keyence микроскопунун жардамы менен көрүлгөн.Фиброз аянтынын пайызы Keyence Analyzer программалык камсыздоосу аркылуу сандык аныкталды.
Атап айтканда, 6 мм диаметри менен хирургиялык сокку MTT талдоо учурунда бирдиктүү ткандардын өлчөмүн камсыз кылуу үчүн колдонулган.Кыртыштар өндүрүүчүнүн протоколуна ылайык MTT субстраты камтыган 12 скважиналуу пластинанын скважиналарына жекече капталган.Бөлүмдөр 37°С температурада 3 саат бою инкубацияланат жана тирүү кыртыш MTT субстратын метаболизмге алып, кызгылт көк формазан кошулмасын пайда кылат.МТТ эритмени 1 мл DMSO менен алмаштырып, жүрөк бөлүмдөрүнөн кызгылт көк формазанды бөлүп алуу үчүн 15 мүнөт 37 °C температурада инкубациялаңыз.Окуулар жүрөктүн ар бир кесиминин салмагына нормалдаштырылган.
Жүрөктүн кесиндилери 1 мкСи/мл [5-3Н]-глюкоза (Moravek Biochemicals, Brea, CA, АКШ) камтыган медиа менен алмаштырылды, мурда сүрөттөлгөндөй глюкозаны колдонуу анализи үчүн.4 саат инкубациялоодон кийин, 100 мкл 0,2 Н HCl камтыган ачык микроцентрифуга түтүкчөсүнө 100 мкл чөйрөнү кошуңуз.Андан кийин түтүктү 500 мкл dH2O камтыган сцинтилляциялык түтүккө салып, 37°C температурада 72 саат бою [3H]2O бууланды.Андан соң микроцентрифуга түтүгүн сцинтилляциялык түтүкчөдөн чыгарып, ага 10 мл сцинтилляция суюктугун кошуңуз.Сцинтилляцияны эсептөө Tri-Carb 2900TR суюк сцинтилляциялык анализатордун (Packard Bioscience Company, Meriden, CT, АКШ) жардамы менен аткарылган.Маалыматтар жүрөктүн бөлүмдөрүнүн массасына нормалдаштырылган.
RNAsec китепканасын даярдоо, секвенирлөө жана маалыматтарды талдоо төмөнкүдөй аткарылды:
РНК китепканасын даярдоо үчүн баштапкы материал катары ар бир үлгүгө 1 мкг РНК колдонулган.Өндүрүүчүнүн сунуштарынан кийин Illumina (NEB, АКШ) үчүн NEBNext UltraTM РНК китепканасын даярдоо комплектинин жардамы менен секвенирлөө китепканалары түзүлдү жана ар бир үлгү үчүн атрибут ырааттуулугуна индекс коддору кошулду.Кыскача айтканда, мРНК поли-Т олигонуклеотиддери менен туташтырылган магниттик мончоктордун жардамы менен жалпы РНКдан тазаланган.Фрагментация NEBNext First Strand Synthesis Reaction Reaction Buffer (5X) ичинде жогорку температурада эки валенттүү катиондорду колдонуу менен жүргүзүлөт.Биринчи катар cDNA кокус гексамердик праймерлер жана M-MuLV тескери транскриптаза (RNase H-) аркылуу синтезделген.Экинчи катар cDNA андан кийин ДНК-полимераза I жана RNase H аркылуу синтезделет. Калган ашыкчалар экзонуклеаза/полимераза активдүүлүгү менен туюк учтарга айланат.ДНК фрагментинин 3′ учу аденилдештирилгенден кийин, аны гибриддештирүү үчүн даярдоо үчүн ага чач кычкачынын илмек түзүлүшү менен NEBNext адаптери тиркелет.150-200 bp артыкчылыктуу узундуктагы cDNA фрагменттерин тандоо үчүн.китепкана фрагменттери AMPure XP тутумунун жардамы менен тазаланган (Бекман Култер, Беверли, АКШ).Андан кийин, адаптер менен байланган өлчөмү боюнча тандалган cDNA менен 3 мкл USER Enzyme (NEB, АКШ) ПТРге чейин 37°Cде 15 мүнөт, андан кийин 95°Cде 5 мүнөт колдонулган.Андан кийин ПТР Phusion High-Fidelity ДНК полимеразасы, универсалдуу ПТР праймерлери жана Индекс (X) праймерлери менен аткарылган.Акырында, ПТР өнүмдөрү тазаланган (AMPure XP системасы) жана китепкананын сапаты Agilent Bioanalyzer 2100 тутумунда бааланган.Андан кийин cDNA китепканасы Novaseq секвенеринин жардамы менен тизилди.Illumina'дан чийки сүрөт файлдары CASAVA Base Calling аркылуу чийки окууга айландырылган.Чийки маалыматтар окуу ырааттуулугун жана тиешелүү базалык сапаттарды камтыган FASTQ(fq) форматындагы файлдарда сакталат.Чыпкаланган секвенирлөө окууларын Sscrofa11.1 шилтеме геномуна дал келтирүү үчүн HISAT2 тандаңыз.
Транскрипттердин көптүгү гендин экспрессия деңгээлин түздөн-түз чагылдырат.Ген экспрессиясынын деңгээли геном же экзондор менен байланышкан транскрипттердин көптүгү (секвенирлөө саны) менен бааланат.Окулгандардын саны гендин экспрессия деңгээлине, гендин узундугуна жана секвенирлөө тереңдигине пропорционалдуу.FPKM (миллион базалык жупка тизилген транскрипттин миң базалык жупуна фрагменттер) эсептелген жана DESeq2 пакетинин жардамы менен дифференциалдык туюнтуунун P-маанилери аныкталган.Андан кийин биз орнотулган R-функциясынын “p.adjust” негизинде Бенжамин-Хочберг методун9 колдонуп, ар бир P мааниси үчүн жалган ачылыш ылдамдыгын (FDR) эсептеп чыктык.
Жүрөк бөлүмдөрүнөн бөлүнүп алынган РНК Thermo (Thermo, кат. № 11756050) SuperScript IV Vilo Master аралашмасын колдонуу менен 200 нг/мкл концентрациясында cDNAга айландырылды.Сандык RT-PCR Колдонмо Biosystems Endura Plate Microamp 384 көзөнөктүү тунук реакция плитасын (Термо, кат. № 4483319) жана микроамп оптикалык клей (Thermo, кат. № 4311971) колдонуу менен аткарылган.Реакция аралашмасы 5 мкл Taqman Fast Advanced Master миксинен (Thermo, cat № 4444557), 0,5 мкл Taqman Primer жана 3,5 мкл H2O ар бир скважинага аралашкан.Taqman праймерлери Thermo (GAPDH (Ss03375629_u1), PARP12 (Ss06908795_m1), PKDCC (Ss06903874_m1), CYGB (Ss06900188_m1), RGL1 (S89106), RGL1 (S8901s) сатып алынган 8_mH), GATA4 (Ss03383805_u1), GJA1 (Ss03374839_u1), COL1A2 (Ss03375009_u1), COL3A1 (Ss04323794_m1), ACTA2 (Ss042415 үлгүсүндөгү бардык үлгүдөгү GATA2 (Ss042415) APDH.
NT-ProBNP медиа-релизинин баасы өндүрүүчүнүн протоколуна ылайык NT-ProBNP комплекти (чочко) (Cat. No. MBS2086979, MyBioSource) менен бааланган.Кыскача айтканда, ар бир үлгүдөн жана стандарттан 250 мкл ар бир скважинага эки нускада кошулган.Үлгүнү кошкондон кийин дароо ар бир скважинага 50 мкл анализ реагент A кошуңуз.Пластинканы акырын силкип, герметик менен жабыңыз.Андан кийин таблеткалар 37°С температурада 1 саатка инкубацияланган.Андан кийин эритмени соруңуз жана скважиналарды 350 мкл 1X жуу эритмеси менен 4 жолу жууп, ар бир жолу 1-2 мүнөт жуугуч эритмени инкубациялаңыз.Андан кийин ар бир скважинага 100 мкл Анализ реагенти В кошуп, пластиналык герметик менен жабыңыз.Планшет акырын чайкалып, 37°C температурада 30 мүнөткө инкубацияланган.Эритмени соруңуз жана скважиналарды 5 жолу 350 мкл 1X жуу эритмеси менен жууңуз.Ар бир кудукка 90 мкл субстрат эритмесин кошуп, пластинканы бекитиңиз.Пластина 37°С температурада 10-20 мүнөт инкубацияланат.Ар бир кудукка 50 мкл Stop Solution кошуңуз.Пластина дароо 450 нмде орнотулган Cytation (BioTek) пластина окугучунун жардамы менен өлчөнгөн.
Power талдоо 5% түрү I ката чен менен 10% абсолюттук параметр өзгөрүшүн аныктоо үчүн> 80% бийликти камсыз кыла турган топ өлчөмдөрүн тандоо үчүн жүргүзүлдү.进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％行变化和5％I变化和错参型进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％行变化和5％I变化和错参型 Был проведен анализ мощности для выбора размера группы, который обеспечил бы > 80% мощности үчүн обнаружения 10% абсолютного изменения параметров жана 5% частоты ошибок типа I. 10% абсолюттук параметр өзгөртүү жана 5% түрү I ката курсун аныктоо үчүн> 80% бийликти камсыз кыла турган топ өлчөмүн тандоо үчүн күч талдоо жүргүзүлдү.Эксперименттин алдында ткандардын бөлүмдөрү туш келди тандалган.Бардык анализдердин абалы сокур жана үлгүлөр болсо, бардык маалыматтар анализделгенден кийин гана чечмеленген.Графпад призма программасы (Сан-Диего, CA) бардык статистикалык анализдерди жасоодо колдонулган. Бардык статистикалык маалыматтар үчүн p-баалуулуктар <0.05 маанисинде маанилүү деп эсептелген. Бардык статистикалык маалыматтар үчүн p-маанилери <0,05 маанисинде маанилүү деп эсептелген. Для всей статистии P-значения считались значимыми при значениях <0,05. Бардык статистикалык маалыматтар үчүн p-маанилери <0,05 маанисинде маанилүү деп эсептелген.对于 所有 数据, p 值 在值 <0.05 时 被 认为 是 是 的 的 是.对于 所有 数据, p 值 在值 <0.05 时 被 认为 是 是 的 的 是. Для всей статистии P-значения считались значимыми при значениях <0,05. Бардык статистикалык маалыматтар үчүн p-маанилери <0,05 маанисинде маанилүү деп эсептелген.Эки куйруктуу Студенттин t-сынагы маалыматтарга 2 гана салыштыруу менен аткарылган.Бир тараптуу же эки тараптуу ANOVA бир нече топтордун ортосундагы маанилүүлүгүн аныктоо үчүн колдонулган.Пост-хок тесттерин аткарууда Тукейдин оңдоосу бир нече салыштырууларды эсепке алуу үчүн колдонулган.RNAsec маалыматтары Методдор бөлүмүндө сүрөттөлгөндөй FDR жана p.adjust эсептөөдө өзгөчө статистикалык ойлорго ээ.
Изилдөө дизайны боюнча көбүрөөк маалымат алуу үчүн, бул макалага шилтемеленген Табиятты изилдөө отчетунун абстракттуулугун караңыз.