Nature.com сайтына киргениңиз үчүн рахмат. Сиз колдонуп жаткан браузердин версиясында CSS колдоосу чектелүү. Эң жакшы тажрыйба алуу үчүн, жаңыртылган браузерди колдонууну сунуштайбыз (же Internet Explorerде шайкештик режимин өчүрүңүз). Ошол эле учурда, үзгүлтүксүз колдоону камсыз кылуу үчүн, биз сайтты стилдерсиз жана JavaScriptсиз көрсөтөбүз.
Дары-дармектерди текшерүү үчүн жүрөктүн физиологиялык чөйрөсүн так кайра чыгара алган ишенимдүү in vitro системасына муктаждык бар. Адамдын жүрөк ткандарын өстүрүү системаларынын чектелүү болушу жүрөк дарыларынын таасирин туура эмес чечмелөөгө алып келди. Бул жерде биз жүрөк кесимдерин электромеханикалык түрдө стимулдай турган жана жүрөк циклинин систолалык жана диастоликалык фазаларында физиологиялык созулууга дуушар болгон жүрөк ткандарын өстүрүү моделин (CTCM) иштеп чыктык. 12 күндүк өстүрүүдөн кийин, бул ыкма жүрөк кесимдеринин жашоого жөндөмдүүлүгүн жарым-жартылай жакшыртты, бирок алардын структуралык бүтүндүгүн толук сактай алган жок. Ошондуктан, кичинекей молекулалык скринингден кийин, биздин чөйрөгө 100 нМ трийодтиронин (T3) жана 1 мкМ дексаметазон (Dex) кошуу кесимдердин микроструктурасын 12 күн бою сактап калганын аныктадык. T3/Dex дарылоо менен айкалыштырып, CTCM системасы транскрипциялык профилдерди, жашоого жөндөмдүүлүктү, зат алмашуу активдүүлүгүн жана структуралык бүтүндүгүн 12 күн бою жаңы жүрөк тканы менен бирдей деңгээлде сактады. Мындан тышкары, жүрөк тканынын ашыкча чоюлушу жүрөктүн гипертрофиялык сигнализациясын пайда кылат, бул CTCMдин жүрөктүн чоюлушунан келип чыккан гипертрофиялык шарттарды туурай ала тургандыгынын далили болуп саналат. Жыйынтыктап айтканда, CTCM жүрөктүн физиологиясын жана патофизиологиясын узак убакыт бою культурада моделдей алат, бул ишенимдүү дары-дармек скринингин жүргүзүүгө мүмкүндүк берет.
Клиникалык изилдөөлөргө чейин адамдын жүрөгүнүн физиологиялык чөйрөсүн так чагылдыра алган ишенимдүү in vitro системалары керек. Мындай системалар өзгөртүлгөн механикалык созулууну, жүрөктүн кагышын жана электрофизиологиялык касиеттерин туурашы керек. Жаныбарлардын моделдери көбүнчө жүрөк физиологиясын скринингдик платформа катары колдонулат, адамдын жүрөгүндөгү дары-дармектердин таасирин чагылдырууда ишенимдүүлүгү чектелүү1,2. Акыр-аягы, Идеалдуу жүрөк ткандарынын культурасынын эксперименталдык модели (CTCM) - бул ар кандай терапиялык жана фармакологиялык кийлигишүүлөр үчүн өтө сезгич жана спецификалык модель, адамдын жүрөгүнүн физиологиясын жана патофизиологиясын так чагылдырат3. Мындай системанын жоктугу жүрөк жетишсиздигин дарылоонун жаңы ыкмаларын ачууга тоскоол болот4,5 жана рыноктон чыгуунун негизги себеби катары дары-дармектердин кардиоуулуулугуна алып келди6.
Акыркы он жылдыкта сегиз жүрөк-кан тамыр эмес дары клиникалык колдонуудан алынып салынган, анткени алар QT аралыгынын узарышына алып келип, карынча аритмиясына жана күтүүсүз өлүмгө алып келет7. Ошентип, жүрөк-кан тамыр системасынын натыйжалуулугун жана уулуулугун баалоо үчүн ишенимдүү клиникага чейинки скрининг стратегияларына болгон муктаждык жогорулоодо. Жакында адамдар тарабынан индукцияланган плюрипотенттүү өзөк клеткаларынан алынган кардиомиоциттердин (hiPS-CM) дары-дармектерди скринингде жана уулуулугун текшерүүдө колдонулушу бул көйгөйгө жарым-жартылай чечим берет. Бирок, hiPS-CMдердин жетиле элек мүнөзү жана жүрөк тканынын көп клеткалуу татаалдыгынын жоктугу бул ыкманын негизги чектөөлөрү болуп саналат. Акыркы изилдөөлөр көрсөткөндөй, бул чектөөнү эрте hiPS-CMди колдонуп, жүрөк тканынын гидрогелдерин спонтандык жыйрылуулар башталгандан көп өтпөй пайда кылуу жана убакыттын өтүшү менен электрдик стимуляцияны акырындык менен жогорулатуу менен жарым-жартылай жоюуга болот. Бирок, бул hiPS-CM микроткандарында чоңдордун миокардынын жетилген электрофизиологиялык жана жыйрылуу касиеттери жок. Мындан тышкары, адамдын жүрөк тканы татаалыраак түзүлүшкө ээ, ал эндотелий клеткаларын, нейрондорду жана стромалдык фибробласттарды камтыган ар кандай клетка түрлөрүнүн гетерогендүү аралашмасынан турат, алар клеткадан тышкаркы матрица белокторунун белгилүү бир топтомдору менен байланышкан. Чоң сүт эмүүчүлөрдүн жүрөгүндөгү кардиомиоцит эмес популяциялардын11,12,13 мындай гетерогендүүлүгү жүрөк тканын жеке клетка түрлөрүн колдонуу менен моделдөөдө негизги тоскоолдук болуп саналат. Бул негизги чектөөлөр физиологиялык жана патологиялык шарттарда бүтүн миокард тканын өстүрүү ыкмаларын иштеп чыгуунун маанилүүлүгүн баса белгилейт.
Адам жүрөгүнүн өстүрүлгөн жука (300 мкм) кесимдери бүтүн адамдын миокардынын келечектүү модели болуп чыкты. Бул ыкма адамдын жүрөк тканына окшош толук 3D көп клеткалуу системага жетүүнү камсыз кылат. Бирок, 2019-жылга чейин өстүрүлгөн жүрөк кесимдерин колдонуу кыска (24 саат) өстүрүүнүн сакталышы менен чектелген. Бул физикалык-механикалык созулуунун жоктугу, аба-суюктук интерфейси жана жүрөк тканынын муктаждыктарын колдобогон жөнөкөй чөйрөлөрдү колдонуу сыяктуу бир катар факторлорго байланыштуу. 2019-жылы бир нече изилдөө топтору жүрөк тканынын өстүрүү системаларына механикалык факторлорду киргизүү өстүрүүнүн мөөнөтүн узарта аларын, жүрөктүн экспрессиясын жакшырта аларын жана жүрөк патологиясын туурай аларын көрсөтүштү. Эки көркөм изилдөө 17 жана 18 бир октуу механикалык жүктөм өстүрүү учурунда жүрөк фенотипине оң таасирин тийгизерин көрсөтөт. Бирок, бул изилдөөлөр жүрөк циклинин динамикалык үч өлчөмдүү физикалык-механикалык жүктөмүн колдонгон эмес, анткени жүрөк кесимдери изометриялык тартуу күчтөрү 17 же сызыктуу ауксотоникалык жүктөм 18 менен жүктөлдү. Ткандарды чоюунун бул ыкмалары көптөгөн жүрөк гендеринин басылышына же анормалдуу чоюлуу реакциялары менен байланышкан гендердин ашыкча экспрессиясына алып келди. Белгилей кетчү нерсе, Питулис жана башкалар 19 күч өзгөрткүчүнүн кайтарым байланышын жана чыңалуу кыймылдаткычтарын колдонуу менен жүрөк циклин калыбына келтирүү үчүн динамикалык жүрөк кесимдерин өстүрүүчү ваннаны иштеп чыгышкан. Бул система in vitro жүрөк циклин так моделдөөгө мүмкүндүк бергени менен, ыкманын татаалдыгы жана төмөн өткөрүү жөндөмдүүлүгү бул системаны колдонууну чектейт. Жакында эле биздин лаборатория чочконун жана адамдын жүрөк ткандарынын кесимдеринин жашоого жөндөмдүүлүгүн 6 күнгө чейин сактоо үчүн электрдик стимуляцияны жана оптималдаштырылган чөйрөнү колдонуп, жөнөкөйлөтүлгөн өстүрүү системасын иштеп чыкты20,21.
Учурдагы кол жазмада биз жүрөк цикли учурунда үч өлчөмдүү жүрөк физиологиясын жана патофизиологиялык чоюлууну кайталоо үчүн гуморалдык белгилерди камтыган чочконун жүрөгүнүн бөлүктөрүн колдонуп, жүрөк ткандарынын культурасынын моделин (CTCM) сүрөттөйбүз. Бул CTCM клиникага чейинки дары-дармектерди текшерүү үчүн сүт эмүүчүлөрдүн жүрөгүнүн физиологиясын/патофизиологиясын туураган үнөмдүү, орточо өткөрүү жөндөмдүүлүгүндөгү жүрөк системасын камсыз кылуу менен клиникага чейинки дары-дармектерди болжолдоонун тактыгын мурда болуп көрбөгөн деңгээлге чейин жогорулата алат.
Гемодинамикалык механикалык сигналдар in vitro шартында кардиомиоциттердин функциясын сактоодо маанилүү ролду ойнойт 22,23,24. Учурдагы кол жазмада биз физиологиялык жыштыктарда (1,2 Гц, мүнөтүнө 72 согуу) электрдик жана механикалык стимулдаштырууну индукциялоо менен чоңдордун жүрөк чөйрөсүн туурай алган CTCM (1a-сүрөт) иштеп чыктык. Диастола учурунда ткандардын ашыкча чоюлушун болтурбоо үчүн ткандардын өлчөмүн 25% га көбөйтүү үчүн 3D басып чыгаруу түзмөгү колдонулган (1b-сүрөт). C-PACE системасы тарабынан индукцияланган электрдик стимул жүрөк циклин толук кайра чыгаруу үчүн маалыматтарды чогултуу системасын колдонуу менен систоладан 100 мс мурун баштоо үчүн убакытка коюлган. Ткандарды өстүрүү системасы жогорку камерадагы жүрөк кесимдеринин кеңейишине алып келүү үчүн ийкемдүү силикон мембрананы циклдик түрдө кеңейтүү үчүн программалануучу пневматикалык кыймылдаткычты (LB Engineering, Германия) колдонот. Система басым өзгөрткүчү аркылуу тышкы аба линиясына туташтырылган, бул басымды (± 1 мм рт.ст.) жана убакытты (± 1 мс) так жөнгө салууга мүмкүндүк берген (1c-сүрөт).
а Ткань бөлүгүн аспаптын өстүрүү камерасынын ичиндеги көк түстө көрсөтүлгөн 7 мм тирөөч шакекке бекитиңиз. Өстүрүү камерасы аба камерасынан жука ийкемдүү силикон мембрана менен бөлүнгөн. Агып кетүүнүн алдын алуу үчүн ар бир камеранын ортосуна прокладка коюңуз. Аппараттын капкагында электрдик стимулдаштырууну камсыз кылган графит электроддору бар. b Чоң ткань түзүлүшүнүн, жетектөөчү шакекченин жана таяныч шакекченин схемалык көрүнүшү. Ткань бөлүктөр (күрөң) чоң өлчөмдөгү аспапка жайгаштырылган, ал эми жетектөөчү шакекче аспаптын сырткы четиндеги оюкка жайгаштырылган. Жетектөөчүнү колдонуп, ткань акрил желими менен капталган таяныч шакекчени жүрөк тканынын кесилишинин үстүнө этияттык менен коюңуз. c Программалануучу пневматикалык кыймылдаткыч (PPD) тарабынан башкарылуучу аба камерасынын басымынын функциясы катары электрдик стимулдаштыруу убактысын көрсөткөн график. Басым сенсорлорун колдонуп, электрдик стимулдаштырууну синхрондоштуруу үчүн маалыматтарды чогултуу түзүлүшү колдонулган. Өстүрүү камерасындагы басым белгиленген босогого жеткенде, электрдик стимулдаштырууну иштетүү үчүн C-PACE-EMге импульстук сигнал жөнөтүлөт. d Инкубатордун текчесине коюлган төрт CTCMдин сүрөтү. Пневматикалык чынжыр аркылуу бир PPDге төрт түзүлүш туташтырылган жана пневматикалык чынжырдагы басымды көзөмөлдөө үчүн гемостатикалык клапанга басым сенсорлору орнотулган. Ар бир түзүлүш алты ткань бөлүгүнөн турат.
Бир пневматикалык кыймылдаткычты колдонуп, биз ар бири 6 ткань бөлүгүн кармай алган 4 CTCM түзүлүшүн башкара алдык (1d-сүрөт). CTCMде аба камерасындагы аба басымы суюктук камерасындагы синхрондуу басымга айландырылат жана жүрөк кесиминин физиологиялык кеңейишин шарттайт (2a-сүрөт жана 1-кошумча тасма). 80 мм рт.ст. ткандардын чоюлушун баалоодо ткань бөлүктөрүнүн 25% га чоюлушу көрсөтүлгөн (2b-сүрөт). Бул пайыздык чоюлуу кадимки жүрөк кесиминин жыйрылуу жөндөмдүүлүгү үчүн 2,2–2,3 мкм физиологиялык саркомер узундугуна туура келери көрсөтүлгөн17,19,25. Ткандардын кыймылы атайын камера жөндөөлөрүн колдонуу менен бааланган (1-кошумча сүрөт). Ткандардын кыймылынын амплитудасы жана ылдамдыгы (2c, d-сүрөт) жүрөк циклиндеги чоюлууга жана систола жана диастола учурундагы убакытка туура келген (2b-сүрөт). Жыйрылуу жана релаксация учурунда жүрөк тканынын чоюлушу жана ылдамдыгы культурада 12 күн бою туруктуу бойдон калган (2f-сүрөт). Өстүрүү учурунда электрдик стимуляциянын жыйрылуучулукка тийгизген таасирин баалоо үчүн, биз көлөкө алгоритмин колдонуу менен активдүү деформацияны аныктоо ыкмасын иштеп чыктык (2a,b кошумча сүрөттөр) жана электрдик стимуляциясы бар жана ансыз деформацияларды айырмалай алдык. Жүрөктүн ошол эле бөлүгү (2f сүрөт). Кесилген жердин кыймылдуу аймагында (R6-9) электрдик стимуляция учурундагы чыңалуу электрдик стимуляция жок болгон учурга караганда 20% жогору болгон, бул электрдик стимуляциянын жыйрылуу функциясына кошкон салымын көрсөтүп турат.
Аба камерасынын басымынын, суюктук камерасынын басымынын жана ткандардын кыймылын өлчөөнүн типтүү издери камеранын басымы суюктук камерасынын басымын өзгөртүп, ткандын кесиндисинин тиешелүү кыймылын пайда кыларын тастыктайт. b Ткандын кесиндилеринин пайыздык чоюлушунун (көк) типтүү издери пайыздык чоюлушка (кызгылт сары) туура келет. c Жүрөк кесиндисинин өлчөнгөн кыймылы кыймылдын өлчөнгөн ылдамдыгына дал келет. (d) Жүрөктүн кесиндисиндеги циклдик кыймылдын (көк сызык) жана ылдамдыктын (кызгылт сары пунктир сызык) типтүү траекториялары. e Цикл убактысын (ар бир топко n = 19 кесим, ар бир чочкодон), жыйрылуу убактысын (ар бир топко n = 19 кесим, ар бир чочкодон), релаксация убактысын (ар бир топко n = 19 кесим, ар бир чочкодон), ткандардын кыймылын (n = 25), ар бир чочкодон 25 (D0) кесим/топ), систоликалык максималдуу ылдамдыкты (n = 24 (D0), ар бир чочкодон 25 (D12) кесим/топ) жана релаксациянын максималдуу ылдамдыгын (n = 24 (D0), ар бир чочкодон 25 (D12) кесим/топ) сандык аныктоо. Эки тараптуу Стьюденттин t-тестинде эч кандай параметрде олуттуу айырмачылыктар байкалган жок. f Электрдик стимулдаштыруу менен (кызыл) жана (көк) ткандардын кесилиштеринин репрезентативдик деформация анализинин издери, ошол эле кесилиштен алынган ткандардын кесилиштеринин он аймактык аймагы. Төмөнкү панелдерде ар кандай кесилиштерден алынган он аймакта электрдик стимулдаштыруу менен жана стимулдаштыруусуз ткандардын кесилиштериндеги деформациянын пайыздык айырмасынын сандык көрсөткүчү көрсөтүлгөн. (n = ар кандай чочколордон алынган 8 кесим/топ, Эки куйруктуу Студенттин t-тести аткарылат; ****p < 0.0001, **p < 0.01, *p < 0.05). (n = ар кандай чочколордон алынган 8 кесим/топ, Эки куйруктуу Студенттин t-тести аткарылат; ****p < 0.0001, **p < 0.01, *p < 0.05). (n = 8 срезов/группу от разных свиней, проводится двусторонний t-критерий Стьюдента; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05). (n = ар кандай чочколордон алынган 8 бөлүк/топ, эки куйруктуу Стьюденттин t-тест; ****p<0.0001, **p<0.01, *p<0.05). （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p < 0,0001，**p <0,01，*5）0. （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p < 0,0001，**p <0,01，*5）0. (n = 8 срезов/группу, от разных свиней, двусторонний критерий Стьюдента; ****p <0,0001, **p <0,01, *p <0,05). (n = 8 бөлүк/топ, ар кандай чочколордон, эки куйруктуу Стьюденттин t-тест; ****p<0.0001, **p<0.01, *p<0.05).Ката тилкелери орточо ± стандарттык четтөөнү билдирет.
Мурунку статикалык биомиметикалык жүрөк кесимдерин өстүрүү системабызда [20, 21] биз электрдик стимуляцияны колдонуу жана чөйрөнүн курамын оптималдаштыруу аркылуу жүрөк кесимдеринин жашоого жөндөмдүүлүгүн, функциясын жана структуралык бүтүндүгүн 6 күн бою сактап келгенбиз. Бирок, 10 күндөн кийин бул көрсөткүчтөр кескин төмөндөдү. Биз мурунку статикалык биомиметикалык өстүрүү системабызда 20, 21 башкаруу шарттарында (Ctrl) өстүрүлгөн кесимдерге кайрылабыз жана мурда оптималдаштырылган чөйрөбүздү MC шарттары жана бир эле учурда механикалык жана электрдик стимуляция (CTCM) астында өстүрүү катары колдонобуз. деп аталат. Биринчиден, биз электрдик стимуляциясыз механикалык стимуляция ткандардын жашоого жөндөмдүүлүгүн 6 күн бою сактоо үчүн жетишсиз экенин аныктадык (кошумча сүрөт 3a, b). Кызыгы, STCMди колдонуу менен физикалык-механикалык жана электрдик стимуляцияны киргизүү менен, 12 күндүк жүрөк кесимдеринин жашоого жөндөмдүүлүгү MS шарттарында жаңы жүрөк кесимдериндегидей эле калды, бирок MTT анализи көрсөткөндөй (1-сүрөт). 3a). Бул жүрөк циклинин механикалык стимуляциясы жана симуляциясы ткандардын кесимдерин мурунку статикалык өстүрүү системабызда билдирилгенден эки эсе узак жашоого жөндөмдүү кыла аларын көрсөтүп турат. Бирок, жүрөк тропонини Т жана коннексин 43 иммундук белгилөө жолу менен ткандардын бөлүктөрүнүн структуралык бүтүндүгүн баалоо 12-күнү MC ткандарында ошол эле күндөгү контролдук топко караганда бир кыйла жогору болгонун көрсөттү. Бирок, бирдиктүү connexin 43 экспрессиясы жана Z-дискинин пайда болушу толук сакталган эмес (3b-сүрөт). Биз ткандардын структуралык бүтүндүгүн сандык жактан аныктоо үчүн жасалма интеллект (AI) алкагын колдонобуз26, тропонин-Т жана коннексин боёгуна негизделген сүрөткө негизделген терең окутуу түтүгү43 жүрөк кесимдеринин структуралык бүтүндүгүн жана флуоресценциясын локализациянын күчү жагынан автоматтык түрдө сандык жактан аныктоо үчүн. Бул ыкма шилтемеде сүрөттөлгөндөй, жүрөк тканынын структуралык бүтүндүгүн автоматташтырылган жана калыс түрдө ишенимдүү түрдө сандык жактан аныктоо үчүн Конволюциялык Нейрон Тармагын (CNN) жана терең окутуу алкагын колдонот. 26. MC тканы статикалык контролдук бөлүмдөргө салыштырмалуу 0-күнгө карата структуралык окшоштуктун жакшырганын көрсөттү. Мындан тышкары, Массондун трихромдук боёгу склероздук склероз шарттарында фиброздун 12-күнүндөгү контролдук шарттарга салыштырмалуу бир кыйла төмөн пайызын көрсөттү (3c-сүрөт). CTCM жүрөк ткандарынын кесиндилеринин жашоого жөндөмдүүлүгүн 12-күнү жаңы жүрөк ткандарынын жашоого жөндөмдүүлүгүнө окшош деңгээлге чейин жогорулатса да, жүрөк кесиндилеринин структуралык бүтүндүгүн олуттуу жакшырткан жок.
Сызык диаграммасында жаңы жүрөк кесимдеринин (D0) же жүрөк кесимдеринин MTT жашоого жөндөмдүүлүгүнүн сандык баалоосу 12 күн бою статикалык культурада (D12 Ctrl) же CTCMде (D12 MC) көрсөтүлгөн (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) ар кандай чочколордон алынган кесимдер/топтордо, бир тараптуу ANOVA тести жүргүзүлөт; ####p < 0.0001 D0 менен салыштырганда жана **p < 0.01 D12 Ctrl менен салыштырганда). Сызык диаграммасында жаңы жүрөк кесимдеринин (D0) же жүрөк кесимдеринин MTT жашоого жөндөмдүүлүгүнүн сандык баалоосу 12 күн бою статикалык культурада (D12 Ctrl) же CTCMде (D12 MC) көрсөтүлгөн (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) кесимдер/топтордо ар кандай чочколордон алынган, бир тараптуу ANOVA тести жүргүзүлөт; ####p < 0.0001 D0 менен салыштырганда жана **p < 0.01 D12 Ctrl менен салыштырганда).гистограмма ар кандай чочколордон алынган MTT жаңы жүрөк кесиндилеринин (D0) жашоого жөндөмдүүлүгүнүн сандык баалоосун же жүрөк кесиндилерин статикалык культурада (D12 контролдоо) же CTCMде (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 контролдоо). ), 12 (D12 MC) кесиндилерде/топто 12 күн бою өстүрүүнү көрсөтөт, бир тараптуу ANOVA тести жүргүзүлөт;####p < 0,0001 по сравнению с D0 и **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p < D0 менен салыштырганда 0.0001 жана **p < D12 Ctrl менен салыштырганда 0.01). a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切(D0)片或心脏切片培养12 天的MTT 活力的量化)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，切片/组，卛运测试；与D0 相比，####p < 0,0001，与D12 Ctrl 相比，**p <0,01)。 a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切(D0)片，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；与D0 相比，####p < 0.001D C，与1D相比，**p。)ар кандай чочколордон алынган жаңы жүрөк кесиндилеринде (D0) же статикалык культурада (D12 контролдоо) же CTCMде (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 контролдоо)), 12 (D12 MC) кесиндилерде/топто 12 күн өстүрүлгөн жүрөк кесиндилериндеги MTT жашоого жөндөмдүүлүгүн сандык жактан аныктоону көрсөткөн гистограмма, бир тараптуу ANOVA тести;####p < 0,0001 по сравнению с D0, **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p < D0 менен салыштырганда 0.0001, **p < D12 менен салыштырганда 0.01 Ctrl).b Тропонин-Т (жашыл), коннексин 43 (кызыл) жана DAPI (көк) жаңы бөлүнүп алынган жүрөк кесимдеринде (D0) же жүрөк кесимдеринде статикалык шарттарда (Ctrl) же CTCM шарттарында (MC) 12 күн бою өстүрүлгөн) репрезентативдик иммунофлуоресценция сүрөттөрүндө (бош шкала = 100 мкм). Жүрөк тканынын структуралык бүтүндүгүн жасалма интеллект менен сандык баалоо (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) ар биринин кесимдери/топтору ар биринен ар бири ар бир чочконун этинен алынган, бир тараптуу ANOVA тести жүргүзүлгөн; ####p < 0.0001 D0го салыштырмалуу жана ****p < 0.0001 D12 Ctrlга салыштырмалуу). Жүрөк тканынын структуралык бүтүндүгүн жасалма интеллект менен сандык аныктоо (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) ар биринен ар бир кесим/топ, бир тараптуу ANOVA тести аткарылат; ####p < 0.0001 D0 менен салыштырганда жана ****p < 0.0001 D12 Ctrl менен салыштырганда). Количественная оценка структурной целостности сердечной ткани искусственным интеллектом (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) срезов/групп от разных свиней, проводится однофакторный тест ANOVA < с#0#0; с #0#0 ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). Жүрөк тканынын структуралык бүтүндүгүн жасалма интеллект аркылуу сандык баалоо (ар кандай чочколордон алынган n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) бөлүмдөр/топтор, бир тараптуу ANOVA тести аткарылды; ####p < 0.0001, D0 жана ****p < 0.0001 менен D12 Ctrl менен салыштырганда).人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) ар кандай чочконун тилимдери/топтору, бир тараптуу ANOVA тести #0#0.#0;相比，****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）。人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) ар кандай чочколордун тилимдери/топтору, бир тараптуу ANOVA#01;#0#0;与D0相比，****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）。 Искусственный интеллект для количественной оценки структурной целостности сердечной ткани (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) срезов/группу каждой из разных свиней, односторонний тест ANOVA; #0#0#p <0 vs D#0#p1. < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). Жүрөк тканынын структуралык бүтүндүгүн сандык жактан баалоо үчүн жасалма интеллект (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) ар кандай чочколордун ар биринин бөлүктөрү/топтору, бир тараптуу ANOVA тести; ####p<0.0001 vs. D0 Салыштыруу үчүн ****p < 0.0001 D12 Ctrl менен салыштырганда). c Массондун трихром боёгу менен боёлгон жүрөк кесимдеринин репрезентативдик сүрөттөрү (солдо) жана сандык көрсөткүчтөрү (оңдо) (ар бир чочкодон алынган n = 10 кесим/топ, бир тараптуу ANOVA тести аткарылды; ####p < D0 менен салыштырганда 0.0001 жана ***p < D12 Ctrl менен салыштырганда 0.001). c Массондун трихром боёгу менен боёлгон жүрөк кесимдеринин репрезентативдик сүрөттөрү (солдо) жана сандык көрсөткүчтөрү (оңдо) (ар кандай чочколордон алынган n = 10 кесим/топ, бир тараптуу ANOVA тести жүргүзүлдү; #### p < 0.0001 D0 менен салыштырганда жана ***p < 0.001 D12 Ctrl менен салыштырганда). c Репрезентативные изображения (слева) и количественная оценка (справа) срезов сердца, окрашенных трихромным красителем Массона (масштаб без покрытия = 500 мкм) (n = 10 срезов/группу от разных свиней, выпностний тест ANO# #; 0,0001 по сравнению с D0 и ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Массондун трихром боёгу менен боёлгон жүрөк кесимдеринин репрезентативдик сүрөттөрү (солдо) жана сандык көрсөткүчү (оңдо) (ар кандай чочколордон алынган n = 10 кесим/топ, бир тараптуу ANOVA тести аткарылды; #### D0 менен салыштырганда p < 0.0001 жана D12 Ctrl менен салыштырганда ***p < 0.001). c 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像（左）和量化（右）（裸=m =（右）（裸=尺0Ｚ 10 个切片/组，每组来自不同的猪，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0,0001 与D0 ，每组来自不同的猪，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0,0001 与D0 ，每组来自不同的猪， Ctrl 相比）. C 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 （左 左） 量化 （右） 裸尺庺度裸尺度 = 500 μm） （n = 10 个 切片 组 每 组 来自 不同 猪 ， 进行 单向 单向 单向 # # p # 0,0001 与D0 相比，***p < 0,001 与D12 Ctrl 相比）。 c Репрезентативные изображения (слева) и количественный анализ (справа) срезов сердца, окрашенных трихромным красителем Массона (чистая шкала = 500 мкм) (n = 10 срезов/группа, каждый от другой свиньовой свиньи, потеснические протестических протестических специальности) анализа ;### #p < 0,0001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Массондун трихром боёгу менен боёлгон жүрөк кесиндилеринин репрезентативдик сүрөттөрү (солдо) жана сандык көрсөткүчү (оңдо) (бош = 500 мкм) (n = 10 кесинди/топ, ар бири ар башка чочкодон алынган, дисперсиянын бир тараптуу анализи менен текшерилген;### # p < 0.0001 D0 менен салыштырганда, ***p < 0.001 D12 Ctrl менен салыштырганда).Ката тилкелери орточо ± стандарттык четтөөнү билдирет.
Биз өстүрүү чөйрөсүнө кичинекей молекулаларды кошуу менен CTCM өстүрүү учурунда кардиомиоциттердин бүтүндүгүн жакшыртууга жана фиброздун өнүгүшүн азайтууга болот деген гипотеза койдук. Ошондуктан, биз аралаштыруучу факторлордун саны аз болгондуктан, статикалык контролдук өстүрүүлөрүбүздү колдонуп, кичинекей молекулаларды скринингден өткөрдүк20,21. Бул скрининг үчүн дексаметазон (Dex), трийодтиронин (T3) жана SB431542 (SB) тандалып алынган. Бул кичинекей молекулалар мурда hiPSC-CM өстүрүүлөрүндө саркомеранын узундугун, Т-түтүкчөлөрүн жана өткөрүү ылдамдыгын жогорулатуу менен кардиомиоциттердин жетилүүсүн индукциялоо үчүн колдонулган. Мындан тышкары, Dex (глюкокортикоид) жана SB экөө тең сезгенүүнү басары белгилүү29,30. Ошондуктан, биз бул кичинекей молекулалардын бирин же айкалышын кошуу жүрөк бөлүктөрүнүн структуралык бүтүндүгүн жакшыртабы же жокпу, текшердик. Баштапкы скрининг үчүн ар бир кошулманын дозасы клетка өстүрүү моделдеринде кеңири колдонулган концентрациялардын негизинде тандалып алынган (1 мкМ Dex27, 100 нМ T327 жана 2,5 мкМ SB31). 12 күндүк өстүрүүдөн кийин, Т3 жана Декстин айкалышы кардиомиоциттердин оптималдуу структуралык бүтүндүгүнө жана фиброздук ремоделизациянын минималдуу болушуна алып келген (4 жана 5-кошумча сүрөттөр). Мындан тышкары, Т3 жана Декстин бул концентрацияларын эки эсе же эки эсе көп колдонуу кадимки концентрацияларга салыштырмалуу зыяндуу таасирлерди жараткан (6a, b-кошумча сүрөттөр).
Баштапкы скринингден кийин, биз 4 өстүрүү шартын бетме-бет салыштырдык (4a-сүрөт): Ctrl: мурда сүрөттөлгөн статикалык өстүрүүдө оптималдаштырылган чөйрөбүздү колдонуп өстүрүлгөн жүрөк кесимдери; 20.21 TD: Шаршемби күнү T3 жана Ctrl кошулган Dex; MC: мурда оптималдаштырылган чөйрөбүздү колдонуп CTCMде өстүрүлгөн жүрөк кесимдери; жана MT: чөйрөгө T3 жана Dex кошулган CTCM. 12 күн өстүрүүдөн кийин, MS жана MT ткандарынын жашоого жөндөмдүүлүгү MTT анализи менен бааланган жаңы ткандардагыдай эле калган (4b-сүрөт). Кызыгы, трансвелл өстүрүүлөрүнө (TD) T3 жана Dex кошуу Ctrl шарттарына салыштырмалуу жашоого жөндөмдүүлүктүн олуттуу жакшырышына алып келген жок, бул жүрөк кесимдеринин жашоого жөндөмдүүлүгүн сактоодо механикалык стимулдаштыруунун маанилүү ролун көрсөтүп турат.
12 күн бою чөйрөдө механикалык стимулдаштыруунун жана T3/Dex кошулмасынын таасирин баалоо үчүн колдонулган төрт өстүрүү шартын чагылдырган эксперименталдык долбоорлоо диаграммасы. b Тилкелүү диаграммада 4 өстүрүү шартында (Ctrl, TD, MC жана MT) өстүрүүдөн 12 күндөн кийинки жашоого жөндөмдүүлүктүн сандык көрсөткүчү жаңы жүрөк кесимдери (D0) менен салыштырылган (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD жана D12 MT), 12 (D12 MC) кесим/топ ар кандай чочколордон алынган, бир тараптуу ANOVA тести жүргүзүлгөн; ####p < 0.0001, ###p < D0 менен салыштырганда 0.001 жана **p < D12 Ctrl менен салыштырганда 0.01). b Сызыкча диаграммасында 4 өстүрүү шартында (Ctrl, TD, MC жана MT) өстүрүүдөн 12 күндөн кийинки жашоого жөндөмдүүлүктүн сандык көрсөткүчү жаңы жүрөк кесимдери (D0) менен салыштырылган (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD жана D12 MT), 12 (D12 MC) кесим/топ ар кандай чочколордон алынган, бир тараптуу ANOVA тести жүргүзүлгөн; ####p < 0.0001, ###p < D0 менен салыштырганда 0.001 жана **p < D12 ctrl менен салыштырганда 0.01). b Гистограмма показывает количественную оценку жизнеспособности через 12 дней после культивирование всех 4 условиях культивирование (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 18) (D0, 18), TD и D12 MT), 12 (D12 MC) срезов/группу от разных свиней, проводится односторонний тест ANOVA; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 по сравнению с D0 и **p < 0,01 сравнению D2). b Тилкелүү диаграммада 4 өстүрүү шартынын баарында (контролдук, TD, MC жана MT) жаңы жүрөк кесимдери (D0) менен салыштырылганда, өстүрүүдөн кийинки 12 күндө жашоого жөндөмдүүлүктүн сандык көрсөткүчү көрсөтүлгөн (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD жана D12 MT), 12 (D12 MC) ар кандай чочколордон алынган кесимдер/топ, бир тараптуу ANOVA тести; ####p < 0.0001, ###p < 0.001 vs. D0 жана **p < 0.01 vs. D12 Ctrl). b 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) (n = 18 (D12Dl)) TD 和D12 MT)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；####p < 0.0001；####p < 0.0001；#0.0.0.相比，**p < 0,01 与D12控制）。b 4 12 (D12 MC) b Гистограмма, показывающая все 4 условия культивирование (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD и D12 MT) срезы/группа, односторонний тест ANOVA ####p <0,0001, ###p <0,001 по сравнению с D0, **p <0,01 по сравнению с контролем D12). b Гистограмма жүрөктүн жаңы кесиндилери (D0) менен салыштырылган бардык 4 өстүрүү шартын (контролдук, TD, MC жана MT) көрсөткөн гистограмма (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD жана D12 MT), ар кандай чочколордон алынган 12 (D12 MC) кесинди/топ, бир тараптуу ANOVA тести; ####p<0.0001, ###p<0.001 vs. D0, **p<0.01 vs. контролдук D12). c Тилкелүү диаграммада 4 өстүрүү шартында (Ctrl, TD, MC жана MT) өстүрүүдөн 12 күн өткөндөн кийин глюкоза агымынын сандык көрсөткүчү жаңы жүрөк кесимдери (D0) менен салыштырылган (ар кандай чочколордон алынган n = 6 кесим/топ, бир тараптуу ANOVA тести жүргүзүлдү; ###p < 0,001, D0 менен салыштырганда жана ***p < 0,001 D12 Ctrl менен салыштырганда). c Тилкелүү диаграммада 4 өстүрүү шартында (Ctrl, TD, MC жана MT) өстүрүүдөн 12 күн өткөндөн кийин глюкоза агымынын сандык көрсөткүчү жаңы жүрөк кесимдери (D0) менен салыштырылган (ар кандай чочколордон алынган n = 6 кесим/топ, бир тараптуу ANOVA тести жүргүзүлдү; ###p < 0,001, D0 менен салыштырганда жана ***p < 0,001 D12 Ctrl менен салыштырганда). c Гистограмма показывает количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после культивирования всех 4 условиях культивирование (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 6 срезовые отпуск) Выполняется тест ANOVA; ###p < 0,001 по сравнению с D0 и ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Гистограммада 4 өстүрүү шартында (контролдук, TD, MC жана MT) өстүрүлгөндөн кийинки 12 күндөн кийинки глюкоза агымынын сандык көрсөткүчү жүрөктүн жаңы кесиндилери (D0) менен салыштырылган (n = 6 кесинди/топ, бир тараптуу ANOVA тести жүргүзүлдү; ###p < D0 менен салыштырганда 0,001 жана ***p < D12 Ctrl менен салыштырганда 0,001). c 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) 相比1）天的葡萄糖通量定量（n = 6 片/组，来自不同猪，单向执行ANOVA 测试；###p < 0 丛##01，相比，***p < 0,001 与D12 Ctrl 相比）。 C 条形图 显示 所有 4 种 条件 （（ctrl 、 td 、 mc 和 mt） 新鲜 心脏 切片 切片 切片 切片 切片， 培养 后 后 12 天 的 通量 定量 （n = 6 片/组 ， 来自 猪 ， ， ， ， ， ， ，猪单向执行ANOVA 测试；###p < 0,001，与D0 相比，***p < 0,001 与D12 Ctrl 相比）。 c Гистограмма, показывающая количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после культивирования для всех 4 условий (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n =/ односторонний Были проведены тесты ANOVA ###p < 0,001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению с D12 (контроль). c Гистограммада 4 өстүрүү шартынын баары (контролдук, TD, MC жана MT) үчүн жаңы жүрөк кесимдери (D0) менен салыштырылгандан кийин 12 күндө глюкоза агымынын сандык аныкталышы көрсөтүлгөн (n = 6 кесим/топ, ар кандай чочколордон, бир тараптуу. ANOVA тесттери жүргүзүлдү, ###p < 0,001 D0 менен салыштырганда, ***p < 0,001 D12 менен салыштырганда (контролдук).d Он аймактык ткань кесүү чекитиндеги жаңы (көк), 12-күндүк MC (жашыл) жана 12-күндүк MT (кызыл) ткандардын штамм анализинин графиктери (n = 4 кесим/топ, бир тараптуу ANOVA тести; топтордун ортосунда эч кандай олуттуу айырмачылык болгон жок). e Статикалык шарттарда (Ctrl) же MT шарттарында (MT) 10-12 күн бою өстүрүлгөн жүрөк кесимдерине салыштырмалуу жаңы жүрөк кесимдериндеги (D0) дифференциалдуу экспрессияланган гендерди көрсөткөн жанар тоо графиги. f Ар бир өстүрүү шартында өстүрүлгөн жүрөк кесимдери үчүн саркомер гендеринин жылуулук картасы. Ката тилкелери орточо ± стандарттык четтөөнү билдирет.
Май кислотасынын кычкылдануусунан гликолизге өтүүгө метаболикалык көз карандылык кардиомиоциттердин дедифференциациясынын негизги белгиси болуп саналат. Жетиле элек кардиомиоциттер негизинен глюкозаны АТФ өндүрүү үчүн колдонушат жана гипопластикалык митохондрияларга ээ, алардын курамында кристаллдар аз 5,32. Глюкозаны пайдалануу анализдери көрсөткөндөй, MC жана MT шарттарында глюкозаны пайдалануу 0-күнкү ткандардагыга окшош болгон (4c-сүрөт). Бирок, Ctrl үлгүлөрүндө жаңы ткандарга салыштырмалуу глюкозаны пайдаланууда олуттуу өсүш байкалган. Бул CTCM жана T3/Dex айкалышы ткандардын жашоого жөндөмдүүлүгүн жогорулатып, 12 күндүк өстүрүлгөн жүрөк кесимдеринин метаболикалык фенотипин сактай тургандыгын көрсөтүп турат. Мындан тышкары, штамм анализи штамм деңгээли MT жана MS шарттарында 12 күн бою жаңы жүрөк тканындагыдай эле калганын көрсөттү (4d-сүрөт).
CTCM жана T3/Dexтин жүрөк кесим тканынын глобалдык транскрипциялык ландшафтына жалпы таасирин талдоо үчүн, биз төрт башка өстүрүү шарттарынан жүрөк кесимдерине RNAseq жүргүздүк (Кошумча маалыматтар 1). Кызыгы, MT кесимдери жаңы жүрөк тканына транскрипциялык окшоштукту жогору көрсөттү, 13 642 гендин ичинен 16сы гана дифференциалдуу түрдө экспрессияланган. Бирок, мурда көрсөткөндөй, Ctrl кесимдери 10–12 күндөн кийин өстүрүүдө 1229 дифференциалдуу түрдө экспрессияланган генди көрсөттү (4e-сүрөт). Бул маалыматтар жүрөк жана фибробласт гендеринин qRT-ПТР менен тастыкталды (7a-c кошумча сүрөт). Кызыгы, Ctrl кесимдери жүрөк жана клетка циклинин гендеринин төмөндөшүн жана сезгенүү ген программаларынын активдешүүсүн көрсөттү. Бул маалыматтар узак мөөнөттүү өстүрүүдөн кийин пайда болгон дедифференциация MT шарттарында толугу менен басаңдай турганын көрсөтүп турат (8a,b кошумча сүрөт). Саркомер гендерин кылдат изилдөө көрсөткөндөй, MT шарттарында гана саркомераны (4f-сүрөт) жана ион каналын (кошумча 9-сүрөт) коддогон гендер сакталып, аларды Ctrl, TD жана MC шарттарында басуудан коргойт. Бул маалыматтар механикалык жана гуморалдык стимуляциянын (T3/Dex) айкалышы менен жүрөк кесиминин транскриптому 12 күндөн кийин өстүрүлгөндөн кийин жаңы жүрөк кесимдерине окшош бойдон кала аларын көрсөтүп турат.
Бул транскрипциялык ачылыштар жүрөк кесилиштериндеги кардиомиоциттердин структуралык бүтүндүгү бүтүн жана локалдашкан коннексин 43 көрсөткөндөй, MT шарттарында 12 күн бою эң жакшы сакталаары менен тастыкталат (5a-сүрөт). Мындан тышкары, MT шарттарында жүрөк кесилиштериндеги фиброз Ctrl менен салыштырганда бир кыйла азайган жана жаңы жүрөк кесилиштерине окшош болгон (5b-сүрөт). Бул маалыматтар механикалык стимуляциянын жана T3/Dex дарылоонун айкалышы жүрөк кесилиштеринде жүрөктүн түзүлүшүн натыйжалуу сактай тургандыгын көрсөтүп турат.
Жаңы бөлүнүп алынган жүрөк кесимдериндеги (D0) же жүрөк кесиминин бардык төрт шартында 12 күн бою өстүрүлгөн тропонин-Т (жашыл), коннексин 43 (кызыл) жана DAPI (көк) иммунофлуоресценциясынын репрезентативдик сүрөттөрү (масштаб тилкеси = 100 мкм). Жүрөк тканынын структуралык бүтүндүгүн жасалма интеллект менен сандык аныктоо (n = 7 (D0 жана D12 Ctrl), ар кандай чочколордон алынган 5 (D12 TD, D12 MC жана D12 MT) кесим/топ, бир тараптуу ANOVA тести аткарылат; ####p < 0.0001 D0 жана *p < 0.05 менен салыштырганда, же ****p < 0.0001 D12 Ctrl менен салыштырганда). Жүрөк тканынын структуралык бүтүндүгүн жасалма интеллект менен сандык аныктоо (n = 7 (D0 жана D12 Ctrl), ар кандай чочколордон алынган 5 (D12 TD, D12 MC жана D12 MT) кесим/топ, бир тараптуу ANOVA тести аткарылды; #### p < 0.0001 D0 жана *p < 0.05 менен салыштырганда, же ****p < 0.0001 D12 Ctrl менен салыштырганда). Количественная оценка структурной целостности ткани сердца с помощью искусственного интеллект (n = 7 (D0 и D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC и D12 MT) срезов/группу от разных свиней, проведенный A# ##NOVA; 0,0001 по сравнению с D0 и *p < 0,05 же ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). Жүрөк тканынын структуралык бүтүндүгүн жасалма интеллект (n = 7 (D0 жана D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC жана D12 MT) ар кандай чочколордон алынган кесилиштер/топтор, бир тараптуу ANOVA тести жүргүзүлдү; #### D0 менен салыштырганда p < 0.0001 жана *p < 0.05 же D12 Ctrl менен салыштырганда ****p < 0.0001).对不同猪的心脏组织结构完整性（n = 7（D0 和D12 Ctrl）、5（D12 TD、D12 MC 和D12 MT）切片/组）进行人工智能量化，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0.0001 与D0 和*5 減p <0.）切片0.0001 与D12 Ctrl 相比）。对 不同 猪 的 心脏 结构 完整性 （n = 7 （d0 和 d12 ctrl） （5 （d12 td 、 d12） mc 缉 缉人工 智能量 化 进行 单向 单向 单向 测试 ； ######### p < 0,0001 与D0 和撌*p < 0,05p 0.0001 与D12 Ctrl 相比）。Ар кандай чочколордо (n = 7 (D0 жана D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC жана D12 MT) бөлүмдөр/топтор) бир тараптуу ANOVA тести менен жасалма интеллектти колдонуу менен жүрөк тканынын структуралык бүтүндүгүн сандык жактан аныктоо;#### p < 0,0001 по сравнению с D0 и *p < 0,05 же ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). #### D0 менен салыштырганда p < 0.0001 жана *p < 0.05 же D12 Ctrl менен салыштырганда ****p < 0.0001). b Массондун трихром боёгу менен боёлгон жүрөк кесимдеринин репрезентативдик сүрөттөрү жана сандык көрсөткүчтөрү (масштаб тилкеси = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD жана D12 MC), ар кандай чочколордон алынган 9 (D12 MT) кесим/топ, бир тараптуу ANOVA тести аткарылды; ####p < 0.0001 D0 жана ***p < 0.001 менен салыштырганда, же ****p < 0.0001 D12 Ctrl менен салыштырганда). b Массондун трихром боёгу менен боёлгон жүрөк кесимдеринин репрезентативдик сүрөттөрү жана сандык көрсөткүчтөрү (масштаб тилкеси = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD жана D12 MC), ар кандай чочколордон алынган 9 (D12 MT) кесим/топ, бир тараптуу ANOVA тести аткарылды; ####p < 0.0001 D0 жана ***p < 0.001 менен салыштырганда, же ****p < 0.0001 D12 Ctrl менен салыштырганда). б Репрезентативные изображения жана количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромным красителем Массона (масштабная линейка = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD и D12 MT разг12), 9 с рупх () свиней, выполняется односторонний тест ANOVA ####p < 0,0001 по сравнению с D0 и ***p < 0,001 же ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). b Массондун трихром боёгу менен боёлгон жүрөк кесиндилеринин репрезентативдик сүрөттөрү жана сандык көрсөткүчтөрү (масштаб тилкеси = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD жана D12 MC), ар кандай чочколордон алынган 9 (D12 MT) кесинди/топ, бир тараптуу ANOVA менен аткарылган; ####p < 0.0001 vs. D0 жана ***p < 0.001 же ****p < 0.0001 vs. D12 Ctrl). b 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像和量化（比例尺= 500 µm）1（D10（2D Ctrl、D12 TD 和D12 MC），来自不同猪的9 个（D12 MT）切片/组，进行单因素方差）0#p#0#p.与D0 相比，***p < 0,001，或****p <0,0001 与D12 Ctrl 相比）。 b 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 和 量化 （比例 尺 尺 尺 = 500 （（0dn = 500（0dn d12 ctrl 、 d12 td 和 d12 mc） 来自 不同 的 9 个 d12 mt 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 өткөндүтүдүъ edin haber yararlanine切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片/组，进行单因素方差分析；####p < 0,0001 与D0 相比，**0 <0.**p 0.0001 与D12 Ctrl 相比）。 б Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромом Массона (масштабная линейка = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD и D12 MC), 9 (D12 от MT) способ ANOVA; ####p < 0,0001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 же ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). b Массондун трихрому (масштаб тилкеси = 500 мкм) менен боёлгон жүрөк кесимдеринин репрезентативдик сүрөттөрү жана сандык көрсөткүчтөрү (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD жана D12 MC), ар кандай чочколордон/топтордон алынган 9 (D12 MT) кесимдер, бир ANOVA ыкмасы; ####p < 0.0001 D0 менен салыштырганда, ***p < 0.001 же ****p < 0.0001 D12 Ctrl менен салыштырганда).Ката тилкелери орточо ± стандарттык четтөөнү билдирет.
Акырында, жүрөк тканынын чоюлушун көбөйтүү менен CTCMдин жүрөк гипертрофиясын туурай билүү жөндөмү бааланган. CTCMде аба камерасынын эң жогорку басымы 80 мм рт.ст.ден 80 мм рт.ст.ге чейин (нормалдуу созулуш) 140 мм рт.ст.ге чейин жогорулаган (6а-сүрөт). Бул созулуунун 32%га көбөйүшүнө туура келет (6б-сүрөт), ал мурда жүрөк кесилиштери үчүн гипертрофияда байкалгандай саркомер узундугуна жетүү үчүн талап кылынган тиешелүү пайыздык созулуш катары көрсөтүлгөн. Жыйрылуу жана релаксация учурунда жүрөк тканынын созулушу жана ылдамдыгы алты күндүк өстүрүү учурунда туруктуу бойдон калган (6в-сүрөт). MT шарттарындагы жүрөк тканы алты күн бою нормалдуу созулууга (MT (нормалдуу)) же ашыкча созулууга (MT (OS)) дуушар болгон. Төрт күн өстүрүүдөн кийин, гипертрофиялык биомаркер NT-ProBNP MT (нормалдуу) шарттарга салыштырмалуу чөйрөдө MT (OS) шарттарында бир кыйла жогорулаган (7а-сүрөт). Мындан тышкары, алты күндүк өстүрүүдөн кийин, MT (OS) клеткаларынын өлчөмү (7b-сүрөт) MT жүрөгүнүн бөлүктөрүнө салыштырмалуу бир кыйла жогорулаган (нормалдуу). Мындан тышкары, ашыкча чоюлуп кеткен ткандарда NFATC4 ядролук транслокациясы бир кыйла жогорулаган (7c-сүрөт). Бул жыйынтыктар гипер чоюлуудан кийин патологиялык ремоделдөөнүн прогрессивдүү өнүгүшүн көрсөтүп турат жана CTCM түзмөгү чоюлуудан улам пайда болгон жүрөк гипертрофиясынын сигнализациясын изилдөө үчүн платформа катары колдонулушу мүмкүн деген концепцияны колдойт.
Аба камерасынын басымынын, суюктук камерасынын басымынын жана ткандардын кыймылын өлчөөнүн типтүү издери камеранын басымы суюктук камерасынын басымын өзгөртүп, ткандын кесилишинин тиешелүү кыймылын пайда кыларын тастыктайт. b Нормалдуу созулган (кызгылт сары) жана ашыкча созулган (көк) ткандардын кесилиштери үчүн типтүү созулуунун пайыздык жана созулуунун ылдамдык ийри сызыктары. c Цикл убактысын (ар бир топко n = 19 кесим, ар бир чочкодон), жыйрылуу убактысын (ар бир топко n = 18-19 кесим, ар бир чочкодон), релаксация убактысын (ар бир топко n = 19 кесим, ар бир чочкодон), ткандардын кыймылынын амплитудасын (ар бир чочкодон n = 14 кесим/топ), систоликалык ылдамдыктын эң жогорку чокусун (ар бир чочкодон n = 14 кесим/топ) жана релаксациянын эң жогорку чегинин (ар бир чочкодон n = 14 (D0), 15 (D6)) кесимдер/топтор) көрсөткөн тилкелүү график, эки куйруктуу Стьюденттин t-тестинде эч кандай параметрде олуттуу айырмачылыктар болгон жок, бул параметрлер ашыкча чыңалуу менен 6 күндүк өстүрүү учурунда туруктуу бойдон калганын көрсөтүп турат. Ката тилкелери орточо ± стандарттык четтөөнү билдирет.
а) ар кандай чочколордун MT кадимки созулушу (Норм) же ашыкча созулушу (OS) шарттарында (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm жана D4 MTOS) кесимдер/топторунда өстүрүлгөн жүрөк кесимдеринен алынган өстүрүү чөйрөсүндөгү NT-ProBNP концентрациясынын баганалык графиктеги сандык көрсөткүчү, Эки тараптуу ANOVA жүргүзүлөт; **нормалдуу созулууга салыштырмалуу p < 0.01). а) ар кандай чочколордун MT кадимки созулушу (Норм) же ашыкча созулушу (OS) шарттарында (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm жана D4 MTOS) кесимдери/топторунда өстүрүлгөн жүрөк кесимдеринен алынган өстүрүү чөйрөсүндөгү NT-ProBNP концентрациясынын гистограммадагы сандык көрсөткүчү, эки тараптуу ANOVA жүргүзүлөт; **нормалдуу созулууга салыштырмалуу p < 0.01).Кадимки MT созулушу (нормалдуу) же ашыкча созулушу (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm жана D4).MTOS) кесимдери/топтору шарттарында өстүрүлгөн жүрөк кесимдеринен алынган культуралык чөйрөдөгү NT-ProBNP концентрациясынын сандык гистограммасы, дисперсиянын эки факторлуу анализи жүргүзүлдү;**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **кадимки созулууга салыштырмалуу p < 0,01). a 在MT 正常拉伸(Norm) 或过度拉伸(OS) 条件下培养的心脏切片培养基中NT-ProBNP浓度的条形图量化（n = 4 (D2 MTNorm)、3（D2 MTOS、D4 MTNorm 和D4 MTOS）来自不同猪的切片/组，进行双向方差分析；**与正常拉伸相比，p < 0.01 MT нормалдуу созулган (Норм) же ашкере созулган (OS) шарттарында (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm和D4 MTOS) ар түрдүүчө өстүрүлгөн жүрөк тилкелериндеги NT-ProBNP концентрациясынын сандык көрсөткүчү.猪的切片/组，可以双向方方发发动;гистограмма Ар кандай чочколордун кадимки MT созулушу (нормалдуу) же ашыкча созулушу (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm) жана D4 MTOS) кесимдери/топтору шарттарында өстүрүлгөн жүрөк кесимдериндеги NT-ProBNP концентрациясын сандык аныктоо, дисперсиянын эки тараптуу анализи;**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **кадимки созулууга салыштырмалуу p < 0,01). b Тропонин-Т жана WGA менен боёлгон жүрөк кесимдеринин репрезентативдик сүрөттөрү (солдо) жана клетканын өлчөмүн сандык жактан аныктоо (оңдо) (n = 330 (D6 MTOS), ар кандай чочколордун 10 ар кандай кесимдеринен алынган 369 (D6 MTNorm) клетка/топ, Эки куйруктуу Студенттин t-тестинин жыйынтыгы чыгарылды; кадимки созулууга салыштырмалуу ****p < 0.0001). b Тропонин-Т жана WGA менен боёлгон жүрөк кесимдеринин репрезентативдик сүрөттөрү (солдо) жана клеткалардын өлчөмүн сандык жактан аныктоо (оңдо) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) клетка/топ ар кандай чочколордун 10 ар кандай кесимдеринен алынган, Эки куйруктуу Студенттин t-тестинин жыйынтыгы чыгарылды; кадимки созулууга салыштырмалуу ****p < 0.0001). b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слева) жана количественного определения размера клеток (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) два- проводится хвостовой t-критерий Стьюдента ****p < 0,0001 по сравнению с нормальным растяжением). b Тропонин-Т жана AZP менен боёлгон жүрөк кесиндилеринин репрезентативдик сүрөттөрү (солдо) жана клеткалардын өлчөмүн сандык жактан аныктоо (оңдо) (n = 330 (D6 MTOS), ар кандай чочколордун 10 ар кандай кесиндисинен алынган 369 (D6 MTNorm) клетка/топ, эки куйруктуу Студенттин t-тестинин жыйынтыгы чыгарылды; кадимки штаммга салыштырмалуу ****p < 0.0001). б MTOS），来自不同猪的10 个不同切片的369（D6 MTNorm）细胞/组，两进行有尾t学检验；与正常拉伸相比，****p <0,0001）。 b Кальцареин-Т жана WGA менен боёлгон жүрөк кесимдеринин репрезентативдик сүрөттөрү (солдо) жана клетканын өлчөмү (оңдо) (n = 330 (D6 MTOS), 10 ар кандай кесимден 369 (D6 MTNorm)) Клеткалар/Клеткалар, кадимки созулуш менен салыштырганда, ****p < 0.0001). b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слева) жана количественная оценка размера клеток (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) двусторонние критерий Стьюдента; b Тропонин-Т жана AZP менен боёлгон жүрөк кесиндилеринин репрезентативдик сүрөттөрү (солдо) жана клетканын өлчөмүн сандык жактан аныктоо (оңдо) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) ар кандай чочколордун 10 ар кандай кесиндисинен алынган) Клеткалар/топ, эки куйруктуу критерий Студенттин t; ****p < 0.0001 кадимки штаммга салыштырмалуу). c Тропонин-T жана NFATC4 үчүн иммундук белгиленген MTOS жүрөк кесимдеринин 0 жана 6-күндөрү үчүн типтүү сүрөттөр жана NFATC4тин CM ядролоруна транслокациясын сандык жактан аныктоо (n = 4 (D0), ар кандай чочколордон алынган 3 (D6 MTOS) кесим/топ, Эки куйруктуу Студенттин t-тестинин жыйынтыгы чыгарылды; *p <0.05). c Тропонин-T жана NFATC4 үчүн иммундук белгиленген MTOS жүрөк кесимдеринин 0 жана 6-күндөрү үчүн типтүү сүрөттөр жана NFATC4тин CM ядролоруна транслокациясын сандык жактан аныктоо (n = 4 (D0), ар кандай чочколордон алынган 3 (D6 MTOS) кесим/топ, Эки куйруктуу Студенттин t-тестинин жыйынтыгы чыгарылды; *p <0.05). c Репрезентативные изображения үчүн срезов сердца 0 жана 6 дней MTOS, иммуномеченых үчүн тропонина-Т жана NFATC4, жана количественная оценка транслокации NFATC4 в ядра кавернозных клеток (n = 4 (D0), 3D срезгны срезговые MTOS) , выполняется двусторонний t-критерий Стьюдента *p < 0,05). c 0 жана 6-күнкү MTOS учурунда жүрөк кесилиштери үчүн репрезентативдик сүрөттөр, тропонин-T жана NFATC4 үчүн иммуномодулдандырылган жана каверноздук клеткалардын ядросундагы NFATC4 транслокациясынын сандык баалоосу (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) кесимдер/ар кандай чочколордон алынган топ) эки куйруктуу Студенттин t-тестинде аткарылган; *p <0.05). c 用于肌钙蛋白-T 和NFATC4 免疫标记的第0 天和第6 天MTOS心脏切片的代表性图像，以及来自不同猪的NFATC4 易位至CM 细胞核的量化（6(MT4（6)切片/组, 进行双尾学生t 检验；*p < 0,05)。 c Калканин-T жана NFATC4 иммунобелгиленген 第0天和第6天MTOS жүрөк тилкелеринин жана NFATC4 ар кандай NFATC4 易位至CM клетка ядросунан 的quantity化 的quantity化 (n = 4 (D0), 3 MT 爻, 缄 D)时间双尾学生et 电影；*p <0,05). c Репрезентативные изображения срезов сердца MTOS на 0 жана 6 деннь үчүн иммуномаркировки тропонином-Т жана NFATC4 жана количественная оценка транслокации NFATC4 в ядра CM от разных свиней (n = 4 (D0), 3 (D6/MTOS) t-критерий Стьюдента; *p < 0,05). c Ар кандай чочколордун CM ядросундагы тропонин-T жана NFATC4 иммунологиялык белгилөөсү жана NFATC4 транслокациясын сандык аныктоо үчүн 0 жана 6-күндөрү MTOS жүрөк кесимдеринин типтүү сүрөттөрү (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) кесим/топ, эки куйруктуу t-критерийи Студенттики; *p <0.05).Ката тилкелери орточо ± стандарттык четтөөнү билдирет.
Трансляциялык жүрөк-кан тамыр изилдөөлөрү жүрөк чөйрөсүн так кайра чыгарган клеткалык моделдерди талап кылат. Бул изилдөөдө жүрөктүн өтө жука бөлүктөрүн стимулдай алган CTCM түзмөгү иштелип чыгып, мүнөздөлгөн. CTCM системасы физиологиялык жактан синхрондоштурулган электромеханикалык стимулдаштырууну жана Т3 жана Декс суюктугун байытууну камтыйт. Чочконун жүрөгүнүн бөлүктөрүнө ушул факторлор таасир эткенде, алардын жашоого жөндөмдүүлүгү, структуралык бүтүндүгү, зат алмашуу активдүүлүгү жана транскрипциялык экспрессиясы 12 күндүк өстүрүүдөн кийин жаңы жүрөк тканындагыдай эле калган. Мындан тышкары, жүрөк тканынын ашыкча чоюлушу гиперэкстензиядан улам жүрөктүн гипертрофиясын пайда кылышы мүмкүн. Жалпысынан алганда, бул жыйынтыктар физиологиялык өстүрүү шарттарынын кадимки жүрөк фенотипин сактоодогу маанилүү ролун колдойт жана дары-дармектерди текшерүү үчүн платформа түзөт.
Кардиомиоциттердин иштеши жана жашоосу үчүн оптималдуу чөйрөнү түзүүгө көптөгөн факторлор салым кошот. Бул факторлордун эң көрүнүктүүсү (1) клеткалар аралык өз ара аракеттенүүлөр, (2) электромеханикалык стимуляция, (3) гуморалдык факторлор жана (4) зат алмашуу субстраттар менен байланыштуу. Физиологиялык клеткалардын ортосундагы өз ара аракеттенүүлөр клеткадан тышкаркы матрица менен колдоого алынган бир нече клетка түрлөрүнүн татаал үч өлчөмдүү тармактарын талап кылат. Мындай татаал клеткалык өз ара аракеттенүүлөрдү in vitro шартында жеке клетка түрлөрүн биргелешип өстүрүү аркылуу калыбына келтирүү кыйын, бирок жүрөк бөлүктөрүнүн органотиптик мүнөзүн колдонуу менен оңой эле ишке ашырууга болот.
Кардиомиоциттердин механикалык созулушу жана электрдик стимуляциясы жүрөктүн фенотипин сактоо үчүн абдан маанилүү33,34,35. Механикалык стимуляция hiPSC-CM шарттоо жана жетилүү үчүн кеңири колдонулуп келгени менен, жакында эле бир нече көрктүү изилдөөлөр жүрөктүн кесимдерин культурада бир октуу жүктөмдү колдонуу менен механикалык стимуляциялоого аракет кылышкан. Бул изилдөөлөр 2D бир октуу механикалык жүктөм культура учурунда жүрөктүн фенотипине оң таасирин тийгизерин көрсөтүп турат. Бул изилдөөлөрдө жүрөктүн бөлүктөрүнө изометриялык созулуучу күчтөр17, сызыктуу аукотоникалык жүктөм18 жүктөлгөн же жүрөк цикли күч өзгөрткүчүнүн кайтарым байланышы жана чыңалуу кыймылдаткычтары аркылуу кайра түзүлгөн. Бирок, бул ыкмалар айлана-чөйрөнү оптималдаштырбастан бир октуу ткандардын созулушун колдонот, бул көптөгөн жүрөк гендеринин басылышына же анормалдуу созулуучу реакциялар менен байланышкан гендердин ашыкча экспрессиясына алып келет. Бул жерде сүрөттөлгөн CTCM цикл убактысы жана физиологиялык созулушу жагынан табигый жүрөк циклин туураган 3D электромеханикалык стимулду камсыз кылат (25% созулуш, 40% систола, 60% диастола жана мүнөтүнө 72 согуу). Бул үч өлчөмдүү механикалык стимулдаштыруунун өзү эле ткандардын бүтүндүгүн сактоо үчүн жетишсиз болсо да, ткандардын жашоого жөндөмдүүлүгүн, функциясын жана бүтүндүгүн жетиштүү деңгээлде сактоо үчүн T3/Dex колдонуу менен гуморалдык жана механикалык стимулдаштыруунун айкалышы талап кылынат.
Гуморалдык факторлор чоңдордун жүрөк фенотипин модуляциялоодо маанилүү ролду ойнойт. Бул HiPS-CM изилдөөлөрүндө баса белгиленген, анда клетканын жетилүүсүн тездетүү үчүн өстүрүүчү чөйрөгө T3 жана Dex кошулган. T3 аминокислоталардын, канттардын жана кальцийдин клетка мембраналары аркылуу ташылышына таасир этиши мүмкүн36. Мындан тышкары, T3 MHC-α экспрессиясын жана MHC-β төмөндөшүн күчөтөт, түйүлдүктүн CMдеги жай тартылуучу миофибриллдерге салыштырмалуу жетилген кардиомиоциттерде тез тартылуучу миофибриллдердин пайда болушуна өбөлгө түзөт. Гипотиреоз менен ооругандарда T3 жетишсиздиги миофибриллардык тилкелердин жоголушуна жана тонустун өнүгүү ылдамдыгынын төмөндөшүнө алып келет37. Dex глюкокортикоиддик рецепторлорго таасир этет жана обочолонгон перфузияланган жүрөктөрдө миокарддын жыйрылуусун жогорулатары көрсөтүлгөн;38 бул жакшыруу кальцийдин топтолушуна (SOCE) тийгизген таасири менен байланыштуу деп эсептелет39,40. Мындан тышкары, Dex өзүнүн рецепторлоруна байланып, иммундук функцияны жана сезгенүүнү басуучу кеңири клетка ичиндеги реакцияны пайда кылат30.
Биздин жыйынтыктар көрсөткөндөй, физикалык механикалык стимуляция (MS) Ctrlге салыштырмалуу жалпы культуранын натыйжалуулугун жакшырткан, бирок культурада 12 күндүн ичинде жашоого жөндөмдүүлүктү, структуралык бүтүндүктү жана жүрөктүн экспрессиясын сактай алган эмес. Ctrlге салыштырмалуу, CTCM (MT) культураларына T3 жана Dex кошуу жашоого жөндөмдүүлүктү жакшыртып, 12 күн бою жаңы жүрөк ткандары менен окшош транскрипция профилдерин, структуралык бүтүндүктү жана зат алмашуу активдүүлүгүн сактап калган. Мындан тышкары, ткандардын чоюлуу даражасын көзөмөлдөө менен, STCMди колдонуу менен гиперэкстензиядан улам пайда болгон жүрөк гипертрофиясынын модели түзүлгөн, бул STCM системасынын ар тараптуулугун көрсөтөт. Белгилей кетүүчү нерсе, жүрөктүн ремоделизациясы жана фиброз, адатта, кан айлануучу клеткалары тиешелүү цитокиндерди, ошондой эле фагоцитозду жана башка ремоделизациялоочу факторлорду камсыз кыла алган бүтүн органдарды камтыса да, жүрөктүн бөлүктөрү стресске жана травмага жооп катары фиброздук процессти туурай алат. миофибробласттарга. Бул мурда жүрөк кесиминин моделинде бааланган. Белгилей кетүүчү нерсе, CTCM параметрлерин тахикардия, брадикардия жана механикалык кан айланууну колдоо (механикалык жүктөлбөгөн жүрөк) сыяктуу көптөгөн шарттарды симуляциялоо үчүн басымды/электрдик амплитудасын жана жыштыгын өзгөртүү менен модуляциялоого болот. Бул системаны дары-дармектерди текшерүү үчүн орточо өткөрүү жөндөмдүүлүгүнө айлантат. CTCMдин ашыкча чыңалуунун натыйжасында пайда болгон жүрөк гипертрофиясын моделдөө жөндөмү бул системаны жекелештирилген терапия үчүн сыноого жол ачат. Жыйынтыктап айтканда, бул изилдөө механикалык созуу жана гуморалдык стимуляция жүрөк тканынын кесилиштеринин культурасын сактоо үчүн абдан маанилүү экенин көрсөтүп турат.
Бул жерде келтирилген маалыматтар CTCM бүтүн миокардды моделдөө үчүн абдан келечектүү платформа экенин көрсөтүп турса да, бул культура ыкмасынын айрым чектөөлөрү бар. CTCM культурасынын негизги чектөөсү - ал кесимдерге үзгүлтүксүз динамикалык механикалык чыңалууларды киргизет, бул ар бир цикл учурунда жүрөк кесимдеринин жыйрылууларын активдүү көзөмөлдөө мүмкүнчүлүгүн жокко чыгарат. Мындан тышкары, жүрөк кесимдеринин кичинекей өлчөмүнөн (7 мм) улам, салттуу күч сенсорлорун колдонуп, культура системаларынан тышкары систоликалык функцияны баалоо мүмкүнчүлүгү чектелүү. Учурдагы кол жазмада биз оптикалык чыңалууну жыйрылуу функциясынын индикатору катары баалоо менен бул чектөөнү жарым-жартылай жеңебиз. Бирок, бул чектөө андан ары иштөөнү талап кылат жана келечекте кальций жана чыңалууга сезгич боёкторду колдонуу менен оптикалык карта түзүү сыяктуу культурада жүрөк кесимдеринин функциясын оптикалык мониторинг жүргүзүү ыкмаларын киргизүү менен чечилиши мүмкүн. CTCMдин дагы бир чектөөсү - жумушчу модел физиологиялык стрессти (алдын ала жүктөө жана андан кийинки жүктөө) манипуляциялабайт. CTCMде басым карама-каршы багыттар боюнча индукцияланып, өтө чоң ткандарда диастолада (толук созулуу) жана систолада (электрдик стимулдаштыруу учурундагы жыйрылуу узактыгы) 25% физиологиялык созулууну кайра жаратты. Бул чектөө келечектеги CTCM долбоорлорунда жүрөк тканына эки тараптан тең жетиштүү басым жасоо жана жүрөктүн камераларында пайда болгон басым-көлөм байланыштарын так колдонуу менен алынып салынышы керек.
Бул кол жазмада баяндалган ашыкча созулуунун натыйжасында пайда болгон кайра түзүү гипертрофиялык гиперсозулуунун сигналдарын туураганга гана байланыштуу. Ошентип, бул модель гуморалдык же нейрондук факторлордун (бул системада жок) кереги жок эле созулуунун натыйжасында пайда болгон гипертрофиялык сигнал берүүнү изилдөөгө жардам бере алат. CTCMдин көптүгүн көбөйтүү үчүн андан ары изилдөөлөр талап кылынат, мисалы, иммундук клеткалар менен бирге өстүрүү, плазманын айлануучу гуморалдык факторлору жана нейрондук клеткалар менен бирге өстүрүлгөндө иннервация CTCM менен ооруну моделдөө мүмкүнчүлүктөрүн жакшыртат.
Бул изилдөөдө он үч чочко колдонулган. Жаныбарлар менен жүргүзүлгөн бардык процедуралар мекеменин көрсөтмөлөрүнө ылайык жүргүзүлүп, Луисвилл университетинин Институционалдык жаныбарларды багуу жана пайдалануу комитети тарабынан бекитилген. Аорта аркасы кысылып, жүрөккө 1 л стерилдүү кардиоплегия (110 мМ NaCl, 1,2 мМ CaCl2, 16 мМ KCl, 16 мМ MgCl2, 10 мМ NaHCO3, 5 U/мл гепарин, рН 7,4кө чейин) куюлган; Жүрөктөр муздак кардиоплегиялык эритмеде сакталып, лабораторияга муз үстүндө жеткирилгенге чейин, адатта <10 мүнөт. Жүрөктөр муздак кардиоплегиялык эритмеде сакталып, лабораторияга муз үстүндө жеткирилгенге чейин, адатта <10 мүнөт. сердца хранили в ледяном кардиоплегическом расстворе до транспортировки в лабораторию на льду, что обычно занимает <10 мин. Жүрөктөр муздак кардиоплегиялык эритмеде сакталып, лабораторияга муз менен жеткирилген, бул адатта 10 мүнөттөн аз убакытты талап кылат.将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10刂钟将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10刂钟 Держите сердца в ледяной кардиоплегии до транспортировки в лабораторию на льду, обычно <10 мин. Жүрөктөрдү муз үстүндөгү кардиоплегиядан кийин лабораторияга муз менен жеткирилгенге чейин, адатта 10 мүнөттөн аз убакытка чейин музда кармаңыз.
CTCM түзмөгү SolidWorks компьютердик жардам менен долбоорлоо (CAD) программасында иштелип чыккан. Культуралык камералар, бөлгүчтөр жана аба камералары CNC тунук акрил пластиктен жасалган. Диаметри 7 мм болгон камдык шакекче ортосунда жогорку тыгыздыктагы полиэтиленден (HDPE) жасалган жана астындагы чөйрөнү жабуу үчүн колдонулган силикон о-шакекчесин жайгаштыруу үчүн о-шакекче оюгу бар. Жука кремний мембранасы культуралык камераны бөлүүчү пластинадан бөлүп турат. Силикон мембранасы 0,02 дюйм калыңдыктагы силикон барактан лазер менен кесилген жана катуулугу 35 А. Астыңкы жана үстүнкү силикон прокладкалары 1/16 дюйм калыңдыктагы силикон барактан лазер менен кесилген жана катуулугу 50 А. Блокту бекитүү жана аба өткөрбөгөн пломбаны түзүү үчүн 316L дат баспас болоттон жасалган бурама жана канат гайкалары колдонулат.
Атайын басылган схемалык такта (БСБ) C-PACE-EM системасы менен интеграциялануу үчүн иштелип чыккан. БСБдагы швейцариялык машинанын туташтыргычтарынын розеткалары күмүш жалатылган жез зымдар жана электроддорго бурамаланган коло 0-60 бурамалары аркылуу графит электроддоруна туташтырылган. Басылган схемалык такта 3D принтердин капкагына жайгаштырылган.
CTCM түзмөгү жүрөк циклине окшош башкарылуучу кан айлануу басымын түзгөн программалануучу пневматикалык аткаруучу (PPD) тарабынан башкарылат. Аба камерасынын ичиндеги басым жогорулаган сайын, ийкемдүү силикон кабыкча өйдө карай кеңейип, чөйрөнү ткандын астына түртөт. Андан кийин ткандын аймагы суюктуктун бул чыгарылышы менен чоюлат, диастола учурунда жүрөктүн физиологиялык кеңейишин туурайт. Релаксациянын туу чокусунда графит электроддору аркылуу электрдик стимулдаштыруу колдонулган, бул аба камерасындагы басымды төмөндөтүп, ткандардын бөлүктөрүнүн жыйрылышына алып келген. Түтүктүн ичинде аба системасындагы басымды аныктоо үчүн басым сенсору бар гемостатикалык клапан бар. Басым сенсору тарабынан сезилген басым ноутбукка туташтырылган маалымат чогулткучка берилет. Бул газ камерасынын ичиндеги басымды үзгүлтүксүз көзөмөлдөөгө мүмкүндүк берет. Максималдуу камера басымына жеткенде (стандарттык 80 мм рт.ст., 140 мм рт.ст. OS), маалыматтарды чогултуу түзмөгүнө C-PACE-EM системасына сигнал жөнөтүп, 4 Вга коюлган 2 мс үчүн эки фазалуу чыңалуу сигналын түзүү буйругу берилген.
Жүрөк кесиндилери алынып, 6 кудукта өстүрүү шарттары төмөнкүдөй жүргүзүлдү: Чогултулган жүрөктөрдү которуу идишинен муздак (4°C) кардиоплегия салынган табакка которуштуруңуз. Сол карынча стерилдүү бычак менен бөлүнүп алынып, 1-2 см3 бөлүктөргө кесилген. Бул ткань блоктору ткань желими менен ткань таянычтарына бекитилип, Тирод эритмеси бар титиреген микротом ткань ваннасына салынып, үзгүлтүксүз кычкылтек менен байытылган (3 г/л 2,3-бутандион монооксими (BDM), 140 мМ NaCl (8,18 г) ), 6 мМ KCl (0,447 г), 10 мМ D-глюкоза (1,86 г), 10 мМ HEPES (2,38 г), 1 мМ MgCl2 (1 мл 1 М эритме), 1,8 мМ CaCl2 (1,8 мл 1 М эритме), 1 л ddH2O чейин). Вибрациялык микротом 80 Гц жыштыкта, горизонталдык термелүү амплитудасы 2 мм жана алдыга жылуу ылдамдыгы 0,03 мм/с болгон 300 мкм калыңдыктагы кесимдерди кесүүгө коюлган. Эритмени муздак кармоо үчүн ткань ваннасы муз менен курчалган жана температура 4°Cде кармалып турган. Микротом ваннасынан ткань бөлүктөрүн бир культуралык плита үчүн жетиштүү кесимдер алынганга чейин музда үзгүлтүксүз кычкылтек менен камсыздалган Тирод эритмесин камтыган инкубациялык ваннага которуңуз. Трансвелл культуралары үчүн ткань бөлүктөрүн стерилденген 6 мм туурасындагы полиуретан таянычтарына бекитип, 6 мл оптималдаштырылган чөйрөгө (199 чөйрө, 1x ITS кошумчасы, 10% FBS, 5 нг/мл VEGF, 10 нг/мл FGF-щелочтуу жана 2X антибиотик-грибокко каршы) жайгаштырылган. C-Pace аркылуу ткань бөлүктөрүнө электрдик стимуляция (10 В, жыштыгы 1,2 Гц) колдонулган. TD шарттары үчүн ар бир чөйрөнү алмаштырганда жаңы T3 жана Dex 100 нМ жана 1 мкМ кошулган. Орточо чөйрө күнүнө 3 жолу алмаштыруудан мурун кычкылтек менен каныккан. Ткандардын кесиндилери инкубатордо 37°C жана 5% CO2 температурада өстүрүлгөн.
CTCM культуралары үчүн ткандардын кесимдери модификацияланган Тирод эритмеси бар Петри табагындагы атайын жасалган 3D принтерге жайгаштырылган. Түзмөк жүрөктүн кесиминин өлчөмүн тирөөч шакекчесинин аянтынын 25% га көбөйтүү үчүн иштелип чыккан. Бул Тирод эритмесинен чөйрөгө которулгандан кийин жана диастола учурунда жүрөктүн кесимдери чоюлуп кетпеши үчүн жасалат. Гистоакрил желимин колдонуп, диаметри 7 мм болгон тирөөч шакекке 300 мкм калыңдыктагы кесимдер бекитилген. Ткандардын кесимдерин тирөөч шакекке бекиткенден кийин, ашыкча ткандардын кесимдерин кесип, бекитилген ткандардын кесимдерин бир түзмөк үчүн жетиштүү кесимдер даярдалганга чейин муздун үстүндөгү (4°C) Тирод эритмесинин ваннасына кайра салыңыз. Бардык түзмөктөр үчүн жалпы иштетүү убактысы 2 сааттан ашпашы керек. 6 ткандын кесими тирөөч шакекчелерине бекитилгенден кийин, CTCM түзүлүшү чогултулган. CTCM культура камерасы 21 мл алдын ала кычкылтек менен толтурулган. Ткандардын кесимдерин культура камерасына өткөрүп, аба көбүкчөлөрүн пипетка менен этияттык менен алып салыңыз. Андан кийин ткань бөлүгү тешикке багытталып, акырын ордуна басылат. Акырында, электроддун капкагын түзмөккө коюп, түзмөктү инкубаторго өткөрүңүз. Андан кийин CTCMди аба түтүгүнө жана C-PACE-EM системасына туташтырыңыз. Пневматикалык кыймылдаткыч ачылат жана аба клапаны CTCMди ачат. C-PACE-EM системасы эки фазалуу стимуляция учурунда 2 мс бою 1,2 Гц жыштыкта ​​4 В берүү үчүн конфигурацияланган. Электроддордо графиттин топтолушун болтурбоо үчүн чөйрө күнүнө эки жолу, ал эми электроддор күнүнө бир жолу алмаштырылып турган. Зарыл болсо, алардын астына түшүп калган аба көбүкчөлөрүн чыгаруу үчүн ткань бөлүктөрүн өстүрүү кудуктарынан алып салууга болот. MT иштетүү шарттары үчүн, ар бир чөйрөнү алмаштырганда T3/Dex 100 нМ T3 жана 1 мкМ Dex менен жаңы кошулган. CTCM түзмөктөрү 37°C жана 5% CO2 инкубаторунда өстүрүлгөн.
Жүрөк кесимдеринин созулган траекторияларын алуу үчүн атайын камера системасы иштелип чыккан. Navitar Zoom 7000 18-108 мм макро линзасы (Navitar, Сан-Франциско, Калифорния) менен SLR камера (Canon Rebel T7i, Canon, Токио, Япония) колдонулган. Орточо сүрөттү жаңы орточо менен алмаштыргандан кийин визуализация бөлмө температурасында жүргүзүлдү. Камера 51° бурчта жайгаштырылып, видео секундасына 30 кадр менен жазылат. Алгач, жүрөк кесимдеринин кыймылын сандык жактан аныктоо үчүн Image-J менен ачык булактуу программалык камсыздоо (MUSCLEMOTION43) колдонулган. Маска ызы-чуудан качуу үчүн жүрөк кесимдеринин согуп турган аймактарын аныктоо максатында MATLAB (MathWorks, Natick, MA, АКШ) аркылуу түзүлгөн. Кол менен сегменттелген маскалар кадр ырааттуулугундагы бардык сүрөттөргө колдонулат жана андан кийин MUSCLEMOTION плагинине өткөрүлүп берилет. Muscle Motion ар бир кадрдагы пикселдердин орточо интенсивдүүлүгүн колдонуп, анын шилтеме кадрына карата кыймылын сандык жактан аныктайт. Маалыматтар жазылып, чыпкаланып, цикл убактысын сандык жактан аныктоо жана жүрөк цикли учурунда ткандардын созулушун баалоо үчүн колдонулган. Жаздырылган видео биринчи тартиптеги нөлдүк фазалуу санариптик чыпканы колдонуу менен кайра иштетилген. Ткандардын созулушун (чокудан чокуга чейин) сандык жактан аныктоо үчүн, жазылган сигналдагы чокуларды жана төмөндөөлөрдү айырмалоо үчүн чокудан чокуга чейин анализ жүргүзүлгөн. Мындан тышкары, сигналдын дрейфин жок кылуу үчүн 6-тартиптеги полиномду колдонуу менен трендди детекторлоо жүргүзүлөт. Глобалдык ткандардын кыймылын, цикл убактысын, релаксация убактысын жана жыйрылуу убактысын аныктоо үчүн MATLABда программалык код иштелип чыккан (Кошумча программалык код 44).
Деформацияны анализдөө үчүн, механикалык созулууну баалоо үчүн түзүлгөн ошол эле видеолорду колдонуп, алгач MUSCLEMOTION программасына ылайык кыймыл чокуларын (кыймылдын эң жогорку (жогорку) жана эң төмөнкү (төмөнкү) чекиттерин) чагылдырган эки сүрөттү байкадык. Андан кийин ткандардын аймактарын сегменттеп, сегменттелген тканга көлөкө түшүрүү алгоритминин бир түрүн колдондук (2a-кошумча сүрөт). Андан кийин сегменттелген ткань он субстратка бөлүндү жана ар бир беттеги чыңалуу төмөнкү теңдемени колдонуу менен эсептелди: Деформация = (Sup-Sdown)/Sdown, мында Sup жана Sdown - тиешелүүлүгүнө жараша кездеменин үстүнкү жана астыңкы көлөкөлөрүнөн форманын аралыктары (2b-кошумча сүрөт).
Жүрөк кесимдери 4% параформальдегидде 48 саат бою фиксацияланган. Фиксацияланган ткандар 1 саат бою 10% жана 20% сахарозада кургатылган, андан кийин түнү бою 30% сахарозада кургатылган. Андан кийин кесимдер оптималдуу кесүү температурасына ээ кошулмага (OCT кошулмасы) салынып, акырындык менен изопентан/кургак муз ваннасында тоңдурулган. OCT киргизүү блокторун бөлүнгөнгө чейин -80 °C температурада сактаңыз. Слайддар 8 мкм калыңдыктагы кесимдер катары даярдалган.
Жүрөк бөлүктөрүнөн OCT алып салуу үчүн, слайддарды жылытуу блогунда 95 °C температурада 5 мүнөт ысытыңыз. Ар бир слайдга 1 мл PBS кошуп, бөлмө температурасында 30 мүнөт инкубациялаңыз, андан кийин бөлмө температурасында 15 мүнөт PBSке 0,1% Triton-X куюп, кесимдерди сиңириңиз. Спецификалык эмес антителолордун үлгүгө байланышуусуна жол бербөө үчүн, слайддарга 1 мл 3% BSA эритмесин кошуп, бөлмө температурасында 1 саат инкубациялаңыз. Андан кийин BSA алынып, слайддар PBS менен жуулган. Ар бир үлгүнү карандаш менен белгилеңиз. Баштапкы антителолор (1% BSAда 1:200 суюлтулган) (connexin 43 (Abcam; #AB11370), NFATC4 (Abcam; #AB99431) жана тропонин-T (Thermo Scientific; #MA5-12960) 90 мүнөттүн ичинде кошулган, андан кийин кошумча 90 мүнөт чычкан Alexa Fluor 488 (Thermo Scientific; #A16079), коён Alexa Fluor 594 (Thermo Scientific; #T6391) каршы экинчилик антителолор (1% BSAда 1:200 суюлтулган) кошулган. Максаттуу боёону фондон айырмалоо үчүн, биз контролдук катары экинчилик антителону гана колдондук. Акырында, DAPI ядролук боёгу кошулуп, слайддар vectashieldге (Vector Laboratories) жайгаштырылып, тырмак боёгу менен бекитилген. -x чоңойтуу) жана 40x чоңойтуу менен Кейнс микроскобу менен бекитилген.
WGA боёгу үчүн PBSте 5 мкг/мл концентрациясындагы WGA-Alexa Fluor 555 (Thermo Scientific; #W32464) колдонулуп, бөлмө температурасында 30 мүнөт бою бекитилген кесимдерге колдонулган. Андан кийин слайддар PBS менен жуулуп, ар бир слайдга Судан карасы кошулуп, 30 мүнөт инкубацияланган. Андан кийин слайддар PBS менен жуулуп, векташиелдди киргизүүчү чөйрө кошулган. Слайддар Кейнс микроскобунда 40 эсе чоңойтуу менен көрсөтүлдү.
Жогоруда сүрөттөлгөндөй үлгүлөрдөн OCT алынып салынды. OCT алынып салынгандан кийин, слайддар Буин эритмесине түнү бою чөмүлдүрүлдү. Андан кийин слайддар 1 саат бою дистилденген суу менен чайкалып, андан кийин Бибрих алоэ кислотасынын фуксин эритмесине 10 мүнөткө салынды. Андан кийин слайддар дистилденген суу менен жуулуп, 5% фосфомолибден/5% фосфовольфрам кислотасынын эритмесине 10 мүнөткө салынды. Чайкабастан, слайддарды түз эле анилин көк эритмесине 15 мүнөткө которуңуз. Андан кийин слайддар дистилденген суу менен жуулуп, 1% уксус кислотасынын эритмесине 2 мүнөткө салынды. Слайддар 200 Н этанолдо кургатылып, ксилолго которулду. Боёлгон слайддар 10x объективдүү Кейнс микроскобу менен көрсөтүлдү. Фиброз аянтынын пайызы Кейнс анализаторунун программасын колдонуу менен сандык жактан аныкталды.
CyQUANT™ MTT клеткаларынын жашоого жөндөмдүүлүгүн анализдөөчү тест (Invitrogen, Карлсбад, Калифорния), каталог номери V13154, өндүрүүчүнүн протоколуна ылайык, бир нече өзгөртүүлөрү менен. Атап айтканда, MTT анализи учурунда ткандардын бирдей өлчөмүн камсыз кылуу үчүн диаметри 6 мм болгон хирургиялык тешик колдонулган. Ткандар өндүрүүчүнүн протоколуна ылайык MTT субстратын камтыган 12 кудуктуу пластинанын кудуктарына өзүнчө жайгаштырылган. Кесимдиктер 37°C температурада 3 саат инкубацияланат жана тирүү ткандар MTT субстратын метаболиздеп, кызгылт көк формазан кошулмасын пайда кылат. Жүрөк кесимдеринен кызгылт көк формазанды алуу үчүн MTT эритмесин 1 мл DMSO менен алмаштырып, 37°C температурада 15 мүнөт инкубациялаңыз. Үлгүлөр 96 кудуктуу тунук түпкү пластиналарда DMSOдо 1:10 катышында суюлтулуп, кызгылт көк түстүн интенсивдүүлүгү 570 нмде Cytation пластина окугучун (BioTek) колдонуп өлчөнгөн. Көрсөткүчтөр жүрөктүн ар бир кесиминин салмагына жараша нормалдаштырылган.
Жүрөк кесиндисинин чөйрөсү мурда сүрөттөлгөндөй глюкозаны пайдалануу анализи үчүн 1 мкКи/мл [5-3Н]-глюкоза (Moravek Biochemicals, Brea, CA, АКШ) камтыган чөйрө менен алмаштырылды. 4 сааттык инкубациядан кийин, 100 мкл 0,2 Н HCl камтыган ачык микроцентрифуга түтүгүнө 100 мкл чөйрө кошуңуз. Андан кийин түтүк 37°C температурада 72 саат бою [3Н]2О буулантуу үчүн 500 мкл dH2O камтыган сцинтилляциялык түтүккө салынды. Андан кийин микроцентрифугалык түтүктү сцинтилляциялык түтүктөн алып чыгып, 10 мл сцинтилляциялык суюктук кошуңуз. Сцинтилляцияны эсептөө Tri-Carb 2900TR суюк сцинтилляциялык анализаторун (Packard Bioscience Company, Meriden, CT, АКШ) колдонуу менен жүргүзүлдү. Андан кийин глюкозанын пайдаланылышы [5-3H]-глюкозага тиешелүү активдүүлүктү, толук эмес тең салмактуулукту жана фонду, [5-3H]-ди белгиленбеген глюкозага суюлтууну жана сцинтилляцияга каршы натыйжалуулукту эске алуу менен эсептелген. Маалыматтар жүрөктүн бөлүктөрүнүн массасына нормалдаштырылган.
Тризолдо ткандарды гомогендештиргенден кийин, РНК жүрөктүн кесиндилеринен өндүрүүчүнүн протоколуна ылайык Qiagen miRNeasy Micro Kit #210874 колдонуп бөлүнүп алынган. RNAsec китепканасын даярдоо, ырааттуулукту аныктоо жана маалыматтарды талдоо төмөнкүдөй жүргүзүлдү:
РНК китепканасын даярдоо үчүн баштапкы материал катары ар бир үлгүгө 1 мкг РНК колдонулган. Өндүрүүчүнүн сунуштарына ылайык, NEBNext UltraTM RNA китепканасын даярдоо комплектисин (NEB, АКШ) колдонуп, секвенирлөө китепканалары түзүлгөн жана ар бир үлгү үчүн атрибут ырааттуулуктарына индекс коддору кошулган. Кыскача айтканда, мРНК поли-Т олигонуклеотиддери менен бекитилген магниттик мончокторду колдонуу менен жалпы РНКдан тазаланган. Фрагментация NEBNext биринчи тизмек синтезинин реакция буферинде (5X) жогорку температурада эки валенттүү катиондорду колдонуу менен жүргүзүлөт. Биринчи тизмек кДНКсы кокустук гексамер праймерлерин жана M-MuLV тескери транскриптазасын (RNase H-) колдонуу менен синтезделген. Андан кийин экинчи тизмек кДНКсы ДНК полимераза I жана RNase H колдонуу менен синтезделет. Калган үстүнкү катмарлар экзонуклеаза/полимераза активдүүлүгү менен мокок учтарга айландырылат. ДНК фрагментинин 3' учун аденилдегенден кийин, аны гибриддештирүүгө даярдоо үчүн ага чач сымал илмек түзүлүшү бар NEBNext адаптери бекитилет. Артыкчылыктуу узундугу 150-200 б.п. болгон кДНК фрагменттерин тандоо үчүн китепкана фрагменттери AMPure XP системасы (Бекман Коултер, Беверли, АКШ) аркылуу тазаланган. Андан кийин, ПТР алдында өлчөмү тандалган кДНК менен адаптер менен байланган 3 мкл USER ферменти (NEB, АКШ) 37°C температурада 15 мүнөт, андан кийин 95°C температурада 5 мүнөт колдонулган. Андан кийин ПТР Phusion High-Fidelity ДНК полимеразасын, универсалдуу ПТР праймерлерин жана Index (X) праймерлерин колдонуу менен жүргүзүлдү. Акырында, ПТР продуктулары тазаланып (AMPure XP системасы), китепкананын сапаты Agilent Bioanalyzer 2100 системасында бааланган. Андан кийин кДНК китепканасы Novaseq секвенсорун колдонуу менен секвенирленген. Illuminaдан алынган чийки сүрөт файлдары CASAVA Base Calling аркылуу чийки окууларга айландырылган. Чийки маалыматтар окуу ырааттуулугун жана тиешелүү базалык сапаттарды камтыган FASTQ(fq) форматындагы файлдарда сакталат. Чыпкаланган секвенирлөө окумдарын Sscrofa11.1 шилтеме геномуна дал келтирүү үчүн HISAT2 тандаңыз. Жалпысынан алганда, HISAT2 4 миллиард базадан чоң геномдорду кошо алганда, каалаган өлчөмдөгү геномдорду колдойт жана көпчүлүк параметрлер үчүн демейки маанилер коюлат. РНК Seq маалыматтарынан сплайсинг окумдарын учурдагы эң ылдам система болгон HISAT2 аркылуу башка ыкмаларга караганда бирдей же андан жакшыраак тактык менен натыйжалуу тегиздөөгө болот.
Транскрипттердин көптүгү гендин экспрессиясынын деңгээлин түздөн-түз чагылдырат. Гендин экспрессиясынын деңгээли геном же экзондор менен байланышкан транскрипттердин көптүгү (секвенирлөө саны) менен бааланат. Окуулардын саны гендин экспрессиясынын деңгээлине, гендин узундугуна жана секвенирлөөнүн тереңдигине пропорционалдуу. FPKM (миллион базалык жуптарга секвенирленген транскрипттин миң базалык жуптарына фрагменттер) эсептелген жана дифференциалдык экспрессиянын P-маанилери DESeq2 пакетин колдонуу менен аныкталган. Андан кийин биз орнотулган "p.adjust" R-функциясына негизделген Бенджамини-Хохберг ыкмасын9 колдонуп, ар бир P мааниси үчүн жалган ачылыш ылдамдыгын (FDR) эсептедик.
Жүрөк кесиндилеринен бөлүнүп алынган РНК Thermo компаниясынын SuperScript IV Vilo Master аралашмасын (Thermo, кат. № 11756050) колдонуу менен 200 нг/мкл концентрациясында кДНКга айландырылган. Сандык RT-ПЦР Applied Biosystems Endura Plate Microamp 384-кудукчалуу тунук реакция пластинасын (Thermo, кат. № 4483319) жана микроампер оптикалык желимин (Thermo, кат. № 4311971) колдонуу менен жүргүзүлдү. Реакция аралашмасы 5 мкл Taqman Fast Advanced Master аралашмасынан (Thermo, кат. № 4444557), 0,5 мкл Taqman Primer жана ар бир кудукка аралаштырылган 3,5 мкл H2Oдон турган. Стандарттык qPCR циклдери иштетилип, КТ маанилери Applied Biosystems Quantstudio 5 реалдуу убакыттагы ПЦР инструменти (384-кудукчалуу модуль; продукт № A28135) менен өлчөнгөн. Taqman праймерлери Thermo (GAPDH (Ss03375629_u1), PARP12 (Ss06908795_m1), PKDCC (Ss06903874_m1), CYGB (Ss06900188_m1), RGL1 (Ss06868890_m1), ACTN1 (Ss01009508_mH), GATA4 (Ss03383805_u1), GJA1 (Ss03374839_u1), COL1A2 (Ss03375009_u1), COL3A1 (Ss04323794_m1), ACTA2 (Ss04245588_m1) компанияларынан сатылып алынган. Бардык үлгүлөрдүн КТ маанилери GAPDH үй чарбачылыгы генине нормалдаштырылган.
NT-ProBNPтин медиадагы чыгарылышы өндүрүүчүнүн протоколуна ылайык NT-ProBNP комплекти (чочко) (категория № MBS2086979, MyBioSource) аркылуу бааланган. Кыскача айтканда, ар бир кудукка ар бир үлгүдөн жана стандарттан 250 мкл эки нускада кошулган. Үлгүнү кошкондон кийин дароо ар бир кудукка 50 мкл А анализ реагентин кошуңуз. Пластинканы акырын чайкап, герметик менен жабыңыз. Андан кийин таблеткалар 37°C температурада 1 саат инкубацияланган. Андан кийин эритмени сордуруп, кудуктарды 350 мкл 1X жуугуч эритме менен 4 жолу жууңуз, ар бир жолу жуугуч эритмени 1-2 мүнөттөн инкубациялаңыз. Андан кийин ар бир кудукка 100 мкл В анализ реагентин кошуп, пластина герметиги менен жабыңыз. Таблетка акырын чайкалып, 37°C температурада 30 мүнөт инкубацияланган. Эритмени сордуруп, кудуктарды 350 мкл 1X жуугуч эритме менен 5 жолу жууңуз. Ар бир кудукка 90 мкл субстрат эритмесин кошуп, пластинаны жабыңыз. Пластинаны 37°C температурада 10-20 мүнөт инкубациялаңыз. Ар бир кудукка 50 мкл токтотуучу эритме кошуңуз. Пластинка дароо 450 нмге орнотулган Cytation (BioTek) пластина окугучу менен өлчөнгөн.
Параметрдеги 10% абсолюттук өзгөрүүнү аныктоо үчүн 5% I типтеги ката көрсөткүчү менен >80% кубаттуулукту камсыз кыла турган топтун өлчөмдөрүн тандоо үчүн кубаттуулук анализи жүргүзүлдү. Параметрдеги 10% абсолюттук өзгөрүүнү аныктоо үчүн 5% I типтеги ката көрсөткүчү менен >80% кубаттуулукту камсыз кыла турган топтун өлчөмдөрүн тандоо үчүн кубаттуулукту талдоо жүргүзүлдү. Анализ мощности выполнен для выбора размеров группа, которые обеспечат >80% мощности үчүн обнаружения 10% абсолюттук изменения параметра с 5% частотой ошибок типа I. I типтеги ката көрсөткүчү 5% болгон абсолюттук параметрдин өзгөрүшүн аныктоо үчүн 10% дан ашык кубаттуулукту камсыз кыла турган топтун өлчөмдөрүн тандоо максатында кубаттуулукту талдоо жүргүзүлдү.进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％I型错误率的组大小。进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％I型错误率的组大小。 Был проведен анализ мощности для выбора размера группы, который обеспечил бы > 80% мощности үчүн обнаружения 10% абсолютного изменения параметров жана 5% частоты ошибок типа I. Абсолюттук параметрдин өзгөрүшүнүн 10% жана I типтеги ката көрсөткүчүнүн 5% аныктоо үчүн >80% кубаттуулукту камсыз кыла турган топтун өлчөмүн тандоо максатында кубаттуулук анализи жүргүзүлдү.Экспериментке чейин ткандардын кесиндилери кокустук түрдө тандалып алынган. Бардык анализдер шарттуу түрдө жүргүзүлүп, үлгүлөр бардык маалыматтар талдангандан кийин гана декоддолгон. Бардык статистикалык анализдерди жүргүзүү үчүн GraphPad Prism программасы (Сан-Диего, Калифорния) колдонулган. Бардык статистика боюнча, p-маанилери <0,05 маанилеринде маанилүү деп эсептелген. Бардык статистика боюнча, p-маанилери <0,05 маанилеринде маанилүү деп эсептелген. Для всей статистики p-значения считались значимими при значениях <0,05. Бардык статистика боюнча, p-маанилери <0,05 маанилеринде маанилүү деп эсептелген.对于所有统计数据，p 值在值<0.05 时被认为是显着的。对于所有统计数据，p 值在值<0.05 时被认为是显着的。 Для всей статистики p-значения считались значимими при значениях <0,05. Бардык статистика боюнча, p-маанилери <0,05 маанилеринде маанилүү деп эсептелген.Эки тараптуу Студенттин t-тестинин маалыматтары эки гана салыштыруу менен жүргүзүлдү. Бир нече топтордун ортосундагы маанини аныктоо үчүн бир тараптуу же эки тараптуу ANOVA колдонулган. Post hoc тесттерин жүргүзүүдө, бир нече салыштырууларды эске алуу үчүн Тукинин коррекциясы колдонулган. RNAsec маалыматтары FDR жана p.adjust эсептөөдө "Методдор" бөлүмүндө сүрөттөлгөндөй атайын статистикалык эске алууларга ээ.
Изилдөөнүн дизайны боюнча көбүрөөк маалымат алуу үчүн, ушул макалага шилтеме берген Nature Research Report рефератын караңыз.