Nature.com saýtyna gireniňiz üçin sag boluň. Ulanýan brauzeriňiziň wersiýasynda CSS goldawy çäkli. Iň gowy tejribe üçin täzelenen brauzer ulanmagyňyzy maslahat berýäris (ýa-da Internet Explorer-de Gatnaşyklyk Režimini öçüriň). Şol bir wagtyň özünde, yzygiderli goldawy üpjün etmek üçin saýty stillersiz we JavaScript-siz görkezeris.
Derman barlaglary üçin ýüregiň fiziologiki gurşawyny takyk gaýtalap bilýän ygtybarly in vitro ulgamyna zerurlyk bar. Adam ýürek dokumalarynyň medeniýet ulgamlarynyň çäkli elýeterliligi ýürek dermanlarynyň täsirleriniň nädogry düşündirilmegine getirdi. Bu ýerde biz ýürek böleklerini elektromehaniki usulda höweslendirýän we ýürek sikliniň sistolik we diastolik fazalarynda fiziologiki uzalmalara sezewar edýän ýürek dokumalarynyň medeniýet modelini (CTCM) işläp düzdik. 12 günlük medeniýetden soň, bu çemeleşme ýürek bölekleriniň ýaşaýyş ukybyny bölekleýin gowulandyrdy, ýöne olaryň gurluş bitewüligini doly saklamady. Şonuň üçin, kiçi molekula barlagyndan soň, biziň gurşawymyza 100 nM triiodotironiniň (T3) we 1 μM deksametazonyň (Dex) goşulmagynyň bölekleriň mikrostrukturasyny 12 günläp saklaýandygyny anykladyk. T3/Dex bejergisi bilen utgaşdyrylanda, CTCM ulgamy transkripsiýa profillerini, ýaşaýyş ukybyny, metabolik işjeňligi we gurluş bitewüligini 12 günläp täze ýürek dokumasy bilen bir derejede saklady. Mundan başga-da, medeniýetde ýürek dokumasynyň aşa köp uzaldylmagy gipertrofiki ýürek signallaşdyrmasyny döredýär we bu bolsa KTCM-iň ýüregiň uzaldylmagy sebäpli döreýän gipertrofiki ýagdaýlary gaýtalamak ukybynyň subutnamasyny berýär. Netijede, KTCM uzak wagtlap medeniýetde ýüregiň fiziologiýasyny we patofiziologiýasyny modelleşdirip biler we bu bolsa dermanlaryň ygtybarly barlagyny geçirmäge mümkinçilik berýär.
Kliniki barlaglardan öň, adam ýüreginiň fiziologiki gurşawyny takyk gaýtalap bilýän ygtybarly in vitro ulgamlary gerek. Şeýle ulgamlar üýtgedilen mehaniki dartgynlygy, ýürek urşy we elektrofiziologiki häsiýetleri gaýtalamaly. Haýwan modelleri, adatça, adam ýüreginde dermanlaryň täsirini görkezmekde çäkli ygtybarlylygy bilen ýürek fiziologiýasy üçin skrining platformasy hökmünde ulanylýar1,2. Ahyrsoňy, Ideal Ýürek Dokumalarynyň Ösdürilmegi boýunça Eksperimental Model (CTCM) dürli terapewtiki we farmakologiki çäreler üçin ýokary derejede duýgur we ýörite bolan, adam ýüreginiň fiziologiýasyny we patofiziologiýasyny takyk gaýtalaýan modeldir3. Şeýle ulgamyň ýoklugy ýürek ýetmezçiligi üçin täze bejeriş usullarynyň açylmagyny çäklendirýär4,5 we dermanlaryň kardiotoksikligine bazardan çykmagyň esasy sebäbi hökmünde getirdi6.
Soňky on ýylyň dowamynda ýürek-damar ulgamynda ulanylmaýan sekiz derman kliniki ulanylyşdan aýryldy, sebäbi olar QT aralygynyň uzaldylmagyna sebäp bolýar we bu bolsa ýürek aritmiýalaryna we duýdansyz ölüme getirýär7. Şeýlelik bilen, ýürek-damar netijeliligini we zäherliligini bahalandyrmak üçin ygtybarly klinikadan öňki barlag strategiýalaryna zerurlyk artýar. Adam tarapyndan döredilen pluripotent kök öýjüklerinden alynýan kardiomiositleriň (hiPS-CM) derman barlagynda we zäherliligini barlamakda ýakynda ulanylmagy bu meseläniň bölekleýin çözgüdini üpjün edýär. Şeýle-de bolsa, hiPS-CM-leriň kämil däl tebigaty we ýürek dokumasynyň köp öýjükli çylşyrymlylygynyň ýoklugy bu usulyň esasy çäklendirmeleridir. Soňky barlaglar bu çäklendirmeleriň öz-özünden gysga wagt soň ýürek dokumalarynyň gidrogellerini döretmek üçin irki hiPS-CM ulanyp we wagtyň geçmegi bilen elektrik stimulýasiýasyny kem-kemden artdyrmak arkaly bölekleýin çözülip bilinjekdigini görkezdi. Şeýle-de bolsa, bu hiPS-CM mikrodokumalarynda ulular miokardynyň ösen elektrofiziologiki we dartgynlylyk häsiýetleri ýok. Mundan başga-da, adamyň ýürek dokumasy has çylşyrymly gurluşa eýe bolup, dürli öýjük görnüşleriniň, şol sanda endotelial öýjükleriň, neýronlaryň we stromal fibroblastlaryň dürli garyndysyndan ybarat bolup, olar öýjük daşyndaky matrisa beloklarynyň belli bir toplumy bilen özara baglanyşyklydyr. Uly süýt emdirijileriň ýüreginde kardiomiosit däl populýasiýalaryň11,12,13 bu dürliligi ýürek dokumasyny aýratyn öýjük görnüşlerini ulanyp modelleşdirmekde esasy päsgelçilik bolup durýar. Bu esasy çäklendirmeler fiziologiki we patologiki şertlerde bitewi miokard dokumasyny ösdürip ýetişdirmek üçin usullaryň işlenip düzülmeginiň möhümdigini nygtaýar.
Adam ýüreginiň ösdürilip ýetişdirilen inçe (300 µm) bölekleri, ynsan miokardynyň bitewi nusgasy bolup çykdy. Bu usul adamyň ýürek dokumasyna meňzeş doly 3D köp öýjükli ulgama elýeterliligi üpjün edýär. Şeýle-de bolsa, 2019-njy ýyla çenli ösdürilip ýetişdirilen ýürek bölekleriniň ulanylyşy gysga (24 sagat) medeniýetiň ýaşamagy bilen çäklendirildi. Bu birnäçe faktorlar, şol sanda fiziki-mehaniki uzalmanyň ýoklugy, howa-suwuklyk serhedi we ýürek dokumasynyň zerurlyklaryny goldamaýan ýönekeý serişdeleriň ulanylmagy bilen baglanyşyklydyr. 2019-njy ýylda birnäçe ylmy-barlag toparlary ýürek dokumalarynyň medeniýet ulgamlaryna mehaniki faktorlaryň goşulmagynyň medeniýetiň ömrüni uzaldyp, ýürek ekspresiýasyny gowulandyryp we ýürek patologiýasyny gaýtalap biljekdigini görkezdiler. Iki ajaýyp ylmy-barlag 17 we 18 bir okly mehaniki ýüklemegiň medeniýet wagtynda ýürek fenotipine oňyn täsir edýändigini görkezýär. Şeýle-de bolsa, bu ylmy-barlaglar ýürek sikliniň dinamiki üç ölçegli fiziki-mehaniki ýüklemesini ulanmady, sebäbi ýürek bölekleri izometrik dartgynlyk güýçleri 17 ýa-da çyzykly auksotonik ýükleme 18 bilen ýüklendi. Dokumalary uzaltmagyň bu usullary köp ýürek genleriniň basylyp ýatyrylmagyna ýa-da adatdan daşary uzalma reaksiýalary bilen baglanyşykly genleriň artykmaç ekspresiýasyna getirdi. Pitoulis we beýlekiler 19 güýç öwrüjisiniň yzyna gaýtaryşyny we dartgynlyk hereketlendirijilerini ulanyp, ýürek siklini dikeltmek üçin dinamiki ýürek diliminiň medeniýet wannasyny işläp düzdüler. Bu ulgam in vitro ýürek siklini has takyk modelirlemäge mümkinçilik berse-de, usulyň çylşyrymlylygy we pes öndürijiligi bu ulgamyň ulanylyşyny çäklendirýär. Biziň laboratoriýamyz ýakynda elektrik stimulýasiýasyny we optimizirlenen gurşawy ulanyp, doňuz we adam ýürek dokumalarynyň bölekleriniň ýaşaýyş ukybyny 6 güne çenli saklamak üçin optimizirlenen gurşawy ulanyp, ýönekeýleşdirilen medeniýet ulgamyny işläp düzdi20,21.
Häzirki golýazmada biz ýürek sikliniň dowamynda üç ölçegli ýürek fiziologiýasyny we patofiziologiki giňelmäni gaýtalamak üçin gumoral alamatlary öz içine alýan doňuz ýüreginiň böleklerini ulanyp, ýürek dokumalarynyň medeniýet modelini (CTCM) beýan edýäris. Bu CTCM, klinikadan öňki derman synagy üçin süýdemdirijileriň ýüreginiň fiziologiýasyny/patofiziologiýasyny gaýtalaýan, tygşytly, orta derejeli ýürek ulgamyny üpjün etmek arkaly, klinikadan öňki derman çaklamasynyň takyklygyny öň hiç haçan gazanylmadyk derejä çenli ýokarlandyryp biler.
Gemodinamik mehaniki signallar in vitro 22,23,24 şertlerinde kardiomiosit funksiýasyny saklamakda möhüm rol oýnaýar. Häzirki golýazmada biz fiziologiki ýygylyklarda (1,2 Hz, minutda 72 urgy) elektrik we mehaniki stimulýasiýany döretmek arkaly ulularyň ýürek gurşawyny gaýtalap bilýän CTCM (1a surat) işläp düzdik. Diastola wagtynda dokumalaryň aşa köp dartylmagynyň öňüni almak üçin dokumalaryň ölçegini 25% artdyrmak üçin 3D çap ediş enjamy ulanyldy (1b surat). C-PACE ulgamy tarapyndan döredilen elektrik stimulyatory ýürek siklini doly gaýtalamak üçin maglumat toplamak ulgamyny ulanyp, sistoladan 100 ms öň başlamak üçin wagtlaşdyryldy. Dokumalaryň medeniýet ulgamy ýokarky kameradaky ýürek bölekleriniň giňelmegine sebäp bolmak üçin çeýe silikon membranany sikliki taýdan giňeltmek üçin programmalaşdyrylýan pnewmatik aktuatory (LB Engineering, Germaniýa) ulanýar. Ulgam basyş öwrüjisi arkaly daşarky howa geçirijisine birikdirildi, bu bolsa basyşy (± 1 mm Hg) we wagty (± 1 ms) takyk sazlamaga mümkinçilik berdi (1c surat).
a Dokuma bölegini enjamyň medeniýet kamerasynyň içinde gök reňkde görkezilen 7 mm goldaw halkasyna birikdiriň. Medeniýet kamerasy howa kamerasyndan inçe çeýe silikon membrana bilen bölünýär. Syzyklaryň öňüni almak üçin her kameranyň arasyna prokladka goýuň. Enjamyň gapagynda elektrik stimullaşdyryşyny üpjün edýän grafit elektrodlary bar. b Uly dokuma enjamynyň, gönükdiriji halkanyň we goldaw halkasynyň shematiki görkezilişi. Dokuma bölekleri (goňur) uly ölçegli enjama ýerleşdirilýär, gönükdiriji halka bolsa enjamyň daşky gyrasyndaky oýuga ýerleşdirilýär. Gollanmany ulanyp, dokuma akril ýelim bilen örtülen goldaw halkasyny ýürek dokumasynyň böleginiň üstüne üns bilen ýerleşdiriň. c Programmalaşdyrylýan pnewmatik aktuator (PPD) tarapyndan dolandyrylýan howa kamerasynyň basyşynyň funksiýasy hökmünde elektrik stimullaşdyryş wagtyny görkezýän grafik. Basyş datçiklerini ulanyp elektrik stimullaşdyryşyny sinhronlaşdyrmak üçin maglumat toplaýan enjam ulanyldy. Medeniýet kamerasyndaky basyş bellenen derejä ýetende, elektrik stimullaşdyryşyny işletmek üçin C-PACE-EM-e impuls signaly iberilýär. d Inkubator tekjesine ýerleşdirilen dört CTCM-iň suraty. Pnewmatiki zynjyr arkaly bir PPD-e dört enjam birikdirilendir we pnewmatiki zynjyrdaky basyşy gözegçilikde saklamak üçin gemostatik klapana basyş datçikleri goýulýar. Her enjamda alty dokuma bölegi bar.
Bir pnewmatik aktuatory ulanyp, biz her biri 6 dokuma bölegini saklap bilýän 4 sany CTCM enjamyna gözegçilik edip bildik (1d surat). CTCM-de howa kamerasyndaky howa basyşy suwuklyk kamerasyndaky sinhron basyşa öwrülýär we ýürek böleginiň fiziologiki giňelmegine sebäp bolýar (2a surat we Goşmaça film 1). 80 mm Hg-de dokumanyň uzaldylmagynyň bahalandyrylmagy. Art. dokumalaryň bölekleriniň 25% uzaldylmagyny görkezdi (2b surat). Bu göterim uzaldylmagynyň ýürek böleginiň adaty gysgaldylmagy üçin 2,2–2,3 µm fiziologiki sarkomer uzynlygyna gabat gelýändigi görkezildi17,19,25. Dokumalaryň hereketi ýörite kamera sazlamalary arkaly bahalandyryldy (Goşmaça surat 1). Dokumalaryň hereketiniň amplitudasy we tizligi (2c, d surat) ýürek sikliniň dowamyndaky uzaldylmagyna we sistola we diastolanyň dowamyndaky wagta gabat geldi (2b surat). Ýürek dokumasynyň gysgaldylmagy we boşalmagy mahalyndaky uzaldylmagy we tizligi medeniýetde 12 günläp üýtgewsiz galdy (2f surat). Ösdürmek wagtynda elektrik stimulýasiýasynyň ýygrylma ukybyna täsirini bahalandyrmak üçin, biz kölege algoritmini ulanyp işjeň deformasiýany kesgitlemek usulyny işläp düzdik (Goşmaça surat 2a, b) we elektrik stimulýasiýasy bolan we bolmadyk deformasiýalary tapawutlandyryp bildik. Ýüregiň şol bir bölegi (2f surat). Kesigiň hereketli sebitinde (R6-9) elektrik stimulýasiýasy wagtyndaky naprýaženiýe elektrik stimulýasiýasy bolmadyk wagtdakydan 20% ýokary boldy, bu bolsa elektrik stimulýasiýasynyň ýygrylma funksiýasyna goşýan goşandyny görkezýär.
Howa kamerasynyň basyşynyň, suwuklyk kamerasynyň basyşynyň we dokumalaryň hereket ölçegleriniň wekilçilikli yzlary kameranyň basyşynyň suwuklyk kamerasynyň basyşyny üýtgedip, dokuma böleginiň degişli hereketine sebäp bolýandygyny tassyklaýar. b Dokuma bölekleriniň göteriminiň uzalmasynyň (gök) wekilçilikli yzlary göterimine (mämişi) degişli. c Ýürek böleginiň ölçenen hereketi hereketiň ölçenen tizligine gabat gelýär. (d) Ýüregiň bir böleginde sikliki hereketiň (gök çyzyk) we tizligiň (mämişi nokatly çyzyk) wekilçilikli traektoriýalary. e Sikl wagtynyň (dürli doňuzlardan her toparda n = 19 bölek), gysylma wagtynyň (her toparda n = 19 bölek), relaksasiýa wagtynyň (dürli doňuzlardan her toparda n = 19 bölek), dokumalaryň hereketiniň (dürli doňuzlardan n = 25), dürli doňuzlardan iň ýokary sistolik tizligiň (n = 24 (D0), dürli doňuzlardan 25 (D12) bölek/topar) we iň ýokary relaksasiýa tizliginiň (n = 24 (D0), dürli doňuzlardan 25 (D12) bölek/topar) mukdary. Iki guýrukly Studentiň t-testi hiç bir parametrde düýpli tapawut görkezmedi. f (gyzyl) we (gök) elektrik stimulýasiýasy bolan dokuma bölekleriniň wekilçilikli dartgynlylyk analiziniň yzlary, şol bir bölekden dokuma bölekleriniň on sebit meýdany. Aşakdaky paneller dürli böleklerden on sebitde elektrik stimulýasiýasy bolan we bolmadyk dokuma böleklerindäki dartgynlylygyň göterim tapawudynyň mukdaryny görkezýär. (n = dürli doňuzlardan 8 bölek/topar, Iki guýrukly Student t-testi geçirilýär; ****p < 0.0001, **p < 0.01, *p < 0.05). (n = dürli doňuzlardan 8 bölek/topar, Iki guýrukly Student t-testi geçirilýär; ****p < 0.0001, **p < 0.01, *p < 0.05). . (n = dürli doňuzlardan 8 bölek/topar, iki guýrukly Studentiň t-testi; ****p<0.0001, **p<0.01, *p<0.05). （N = 8 片 / 组，来自不同的猪，进行双尾学生 t 检验； **** p <0.0001 ， ** p <0.01 ， * p <0.05 ）。 （N = 8 片 / 组，来自不同的猪，进行双尾学生 t 检验； **** p <0.0001 ， ** p <0.01 ， * p <0.05 ）。 (n = 8 срезов / группу, от разных свиней, дву зононний критерий Стьюдента; **** p <0,0001, ** p <0,01, * p <0,05). (n = 8 bölüm/topar, dürli doňuzlardan, iki guýrukly Studentiň t-testi; ****p<0.0001, **p<0.01, *p<0.05).Ýalňyşlyk sütunlary ortaça ± standart çykylyşy görkezýär.
Öňki statik biomimetik ýürek böleklerini ösdürip ýetişdirmek ulgamymyzda [20, 21], elektrik stimulýasiýasyny ulanmak we gurşawyň düzümini optimizirlemek arkaly ýürek bölekleriniň ýaşaýyş ukybyny, funksiýasyny we gurluş bitewüligini 6 günläp sakladyk. Şeýle-de bolsa, 10 günden soň bu sanlar ep-esli pese gaçdy. Öňki statik biomimetik ösdürip ýetişdirmek ulgamymyzda 20, 21 gözegçilik şertlerinde (Ctrl) ösdürilip ýetişdirilen bölekleri salgylanarys we öň optimizirlenen gurşawymyzy MC şertleri we bir wagtyň özünde mehaniki we elektrik stimulýasiýasy (CTCM) astynda ösdürip ýetişdirmek hökmünde ulanarys. Ilki bilen, elektrik stimulýasiýasyz mehaniki stimulýasiýanyň dokumalaryň ýaşaýyş ukybyny 6 günläp saklamak üçin ýeterlik däldigini anykladyk (Goşmaça surat 3a, b). Gyzykly tarapy, STCM ulanyp fizio-mehaniki we elektrik stimulýasiýasynyň girizilmegi bilen, 12 günlük ýürek bölekleriniň ýaşaýyş ukyby MS şertlerinde täze ýürek böleklerindäki ýaly galdy, ýöne MTT seljermesinde görkezilişi ýaly Ctrl şertlerinde däl (1-nji surat). Bu, ýürek sikliniň mehaniki stimulýasiýasynyň we simulýasiýasynyň dokuma bölekleriniň öňki statik ösdürip ýetişdirmek ulgamymyzda habar berleninden iki esse köp ýaşaýşa ukyply bolup biljekdigini görkezýär. Şeýle-de bolsa, ýürek troponini T we konneksin 43-iň immunobelgilemesi arkaly dokumalaryň bölekleriniň gurluş bitewüliginiň bahalandyrmasy, 12-nji günde MC dokumalarynda şol bir gün gözegçilik toparyna garanyňda has ýokary bolandygyny görkezdi. Şeýle-de bolsa, birmeňzeş connexin 43 ekspresiýasy we Z-disk emele gelmegi doly saklanmady (3b-nji surat). Dokumalaryň gurluş bitewüligini kesgitlemek üçin emeli intellekt (AI) çarçuwasyny26, ýürek bölekleriniň gurluş bitewüligini we fluoresensiýasyny lokalizasiýa güýji babatda awtomatiki usulda kesgitlemek üçin troponin-T we konneksin boýagyna43 esaslanýan surat esasynda çuňňur öwrenmek turbageçirijisini ulanýarys. Bu usul, salgylanmada beýan edilişi ýaly, ýürek dokumalarynyň gurluş bitewüligini awtomatlaşdyrylan we tarapsyz usulda ygtybarly kesgitlemek üçin Konwolusiýa Neýron Toruny (CNN) we çuňňur öwrenmek çarçuwasyny ulanýar. 26. MC dokumasy statik gözegçilik bölümlerine garanyňda 0-njy güne çenli gurluş meňzeşliginiň gowulanandygyny görkezdi. Mundan başga-da, Massonyň trihrom boýagy MS şertlerinde 12-nji gündäki gözegçilik şertlerine garanyňda fibrozyň ep-esli pes göterimini ýüze çykardy (3c-nji surat). CTCM 12-nji gün ýürek dokumasynyň bölekleriniň ýaşaýyş ukybyny täze ýürek dokumasynyň derejesine meňzeş derejä çenli ýokarlandyrsa-da, ýürek bölekleriniň gurluş bitewüligini düýpli gowulandyrmady.
Sütun grafiki täze ýürek bölekleriniň (D0) ýa-da ýürek bölekleriniň MTT ýaşaýşynyň mukdaryny 12 günläp ýa-da statik medeniýetde (D12 Ctrl) ýa-da CTCM-de (D12 MC) görkezýär (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) dürli doňuzlardan alnan bölekler/topar, bir taraplaýyn ANOVA synagy geçirilýär; ####p < 0.0001 D0 bilen deňeşdirilende we **p < 0.01 D12 Ctrl bilen deňeşdirilende). Sütun grafiki täze ýürek bölekleriniň (D0) ýa-da ýürek bölekleriniň MTT ýaşaýşynyň 12 günläp statik medeniýetde (D12 Ctrl) ýa-da CTCM-de (D12 MC) MTT ýaşaýşynyň mukdaryny görkezýär (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) dürli doňuzlardan alnan bölekler/topar, bir taraplaýyn ANOVA synagy geçirilýär; ####p < 0.0001 D0 bilen deňeşdirilende we **p < 0.01 D12 Ctrl bilen deňeşdirilende).gistogramma dürli doňuzlardan alnan MTT täze ýürek bölekleriniň (D0) ýa-da ýürek bölekleriniň 12 günläp statik medeniýetde (D12 gözegçilik) ýa-da CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 gözegçilik). ), 12 (D12 MC) böleklerde/toparda ösdürilip ýetişdirilmeginiň mukdaryny görkezýär, bir taraply ANOVA synagy geçirilýär;#### p <0,0001 по сравнению с D0 и ** p <0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p < D0 bilen deňeşdirilende 0.0001 we **p < D12 Ctrl bilen deňeşdirilende 0.01). a 条形图显示在静态培养 (D12 Ctrl) 或 CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切片 (D0) 或心脏切片培养 12 天的 MTT 活力的量化) ，来自不同猪的 12 (D12 MC) 切片 / 组，进行单向 ANOVA 测试；与 D0 相比， #### p <0.0001 ，与 D12 Ctrl 相比， ** a 条形图显示在静态培养 (D12 Ctrl) 或 CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切片 (D0) ，来自不同猪的 12 (D12 MC) 切片 / 组，进行单向 ANOVA 测试；与 D0 相比， #### p <0.0001 ，与 D12 Ctrl 相比， ** p。)täze ýürek böleklerinde (D0) ýa-da statik medeniýetde (D12 gözegçilik) ýa-da CTCM-de (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 gözegçilik)), dürli doňuzlardan alnan 12 (D12 MC) böleklerde/toparda 12 günläp ösdürilip ýetişdirilen ýürek böleklerinde MTT-niň ýaşaýyş ukybynyň mukdaryny görkezýän gistogramma, bir taraply ANOVA synagy;#### p <0,0001 по сравнению с D0, ** p <0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p < D0 bilen deňeşdirilende 0.0001, **p < D12 bilen deňeşdirilende 0.01 Ctrl).b Troponin-T (ýaşyl), connexin 43 (gyzyl) we DAPI (gök) täze bölünip alnan ýürek böleklerinde (D0) ýa-da ýürek böleklerinde statik şertlerde (Ctrl) ýa-da CTCM şertlerinde (MC) 12 günläp ösdürilip ýetişdirilen) wekilçilikli immunofluoresensiýa suratlarynda (boş ölçeg = 100 µm). Ýürek dokumasynyň gurluş bitewüliginiň emeli intellekt arkaly kesgitlenmegi (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), dürli doňuzlardan 5 (D12 MC) bölek/topar, birtaraplaýyn ANOVA synagy geçirilýär; ####p < 0.0001 D0 bilen deňeşdirilende we ****p < 0.0001 D12 Ctrl bilen deňeşdirilende). Ýürek dokumasynyň gurluş bitewüliginiň emeli intellekt arkaly mukdaryny kesgitlemek (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), dürli doňuzlardan 5 (D12 MC) bölek/topar, birtaraplaýyn ANOVA synagy geçirilýär; ####p < 0.0001 D0 bilen deňeşdirilende we ****p < 0.0001 D12 Ctrl bilen deňeşdirilende). Количественная оценка структурной целостности сердечной ткани искусственным интеллектом (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) срезов/групп от разных свиней, проводится однофакторный тест ANOVA; ####p < 0,0001 по сравнению с D0 и **** p <0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). Ýürek dokumasynyň gurluş bitewüliginiň emeli intellekt arkaly mukdarynyň kesgitlenmegi (dürli doňuzlardan n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) bölümler/toparlar, birtaraplaýyn ANOVA synagy geçirildi; ####p < 0.0001, D0 we ****p < 0.0001 bilen deňeşdirilende, D12 Ctrl bilen deňeşdirilende).人工智能量化心脏组织结构完整性（ n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) dilim / dürli doňuzyň hersi, bir taraplaýyn ANOVA synagy; #### p <0.0001 与 D0 相比， **** p <0.0001 与 D12 Ctrl 相比）。人工智能量化心脏组织结构完整性（ n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) dilim / dürli doňuzlaryň hersi, bir taraplaýyn ANOVA synagy; #### p <0.0001 与 D0 相比， **** p <0.0001 与 D12 Ctrl 相比）。 Искусственный интеллект для количественной оценки адной целостности сердечной ткани (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) срезов / группу каждой из разных свиней, одностороны сравнения **** p <0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). Ýürek dokumasynyň gurluş bitewüligini kesgitlemek üçin emeli intellekt (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) dürli doňuzlaryň her biriniň bölümleri/toparlary, birtaraplaýyn ANOVA synagy; ####p<0.0001 vs .D0 Deňeşdirmek üçin ****p < 0.0001 D12 Ctrl bilen deňeşdirilende). c Massonyň trihrom boýagy bilen boýalan ýürek bölekleri üçin wekilçilikli suratlar (çepde) we mukdaryň kesgitlenmegi (sagda) (dürli doňuzdan her biri n = 10 bölek/topar, bir taraply ANOVA synagy geçirilýär; ####p < 0.0001 D0 bilen deňeşdirilende we ***p < 0.001 D12 Ctrl bilen deňeşdirilende). c Massonyň trihrom boýagy bilen boýalan ýürek bölekleri üçin wekilçilikli suratlar (çepde) we mukdaryň kesgitlenmegi (sagda) (dürli doňuzlardan her biri n = 10 bölek/topar, bir taraplaýyn ANOVA synagy geçirilýär; #### D0 bilen deňeşdirilende p < 0.0001 we D12 Ctrl bilen deňeşdirilende ***p < 0.001). c Репрезент Канные изображения (слева) һәм количественная оценка (справа) срезов сердца, окрашенных трихромным красителем Масонаа (чи покрития = 500 мкм) ANOVA #### p <0,0001 по сравненю с D0 и *** p <0,001 по сравненюю с D12 Ctrl) c Massonyň trihrom boýagy bilen boýalan ýürek bölekleriniň wekilçilikli suratlary (çepde) we mukdarynyň kesgitlenmegi (sagda) (dürli doňuzlardan n = 10 bölek/topar, birtaraplaýyn ANOVA synagy geçirildi; #### D0 bilen deňeşdirilende p < 0.0001 we D12 Ctrl bilen deňeşdirilende ***p < 0.001). c 用 Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像（左）和量化（右）（裸尺度 = 500 µm ）（ n = 10 个切片 / 组，每组来自不同的猪，进行单向 ANOWA 测试； #### p <0.0001 与 D0 相比， *** p <0,001 与 D12 Ctrl 相比）。 C 用 masson 三 色 染料 的 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 相比）。 c Репрезент Канные изображения (слева) һәм количественный мат (справа) срезов сердца, окрашенных трихромным красителем Мас адоа (чя шкала = 500 мкм) однофакторного ди зирного мата; ### #p <0,0001 по сравнению с D0, *** p <0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Massonyň trihrom boýagy bilen boýalan ýürek bölekleriniň wekilçilikli suratlary (çepde) we mukdary (sagda) (boşluk = 500 µm) (n = 10 bölek/topar, her biri dürli doňuzdan, birtaraplaýyn dispersiýa seljermesi arkaly synagdan geçirildi ;### # p < 0.0001 D0 bilen deňeşdirilende, ***p < 0.001 D12 Ctrl bilen deňeşdirilende).Ýalňyşlyk sütunlary ortaça ± standart çykylyşy görkezýär.
Biz kiçi molekulalary medeniýet gurşawyna goşmak arkaly CTCM medeniýetinde kardiomiositleriň bitewüligini gowulandyryp we fibrozyň ösüşini azaldyp boljakdygyny çakladyk. Şonuň üçin garyşdyryjy faktorlaryň azlygy sebäpli statik gözegçilik medeniýetlerimizi ulanyp kiçi molekulalary barladyk20,21. Bu barlag üçin deksametazon (Dex), triiodotironin (T3) we SB431542 (SB) saýlandy. Bu kiçi molekulalar öň hiPSC-CM medeniýetlerinde sarkomerleriň uzynlygyny, T-tubulalaryny we geçirijilik tizligini artdyrmak arkaly kardiomiositleriň ýetişmegini höweslendirmek üçin ulanylypdy. Mundan başga-da, Dex (glýukokortikoid) we SB-niň ikisiniň hem çişmäni basyp ýatyrýandygy mälim29,30. Şonuň üçin biz bu kiçi molekulalaryň biriniň ýa-da olaryň utgaşmasynyň goşulmagynyň ýürek bölekleriniň gurluş bitewüligini gowulandyrjakdygyny barladyk. Ilkinji barlag üçin her bir birleşmäniň dozasy öýjük medeniýeti modellerinde giňden ulanylýan konsentrasiýalara esaslanyp saýlandy (1 μM Dex27, 100 nM T327 we 2.5 μM SB31). 12 günlük medeniýetden soň, T3 we Dex-iň utgaşmasy kardiomiositleriň gurluş bitewüliginiň iň gowy derejesine we süýümli remodelleşdirmegiň minimal derejesine ýetdi (Goşmaça suratlar 4 we 5). Mundan başga-da, bu konsentrasiýalaryň iki esse ýa-da iki esse ulanylmagy adaty konsentrasiýalara garanyňda zyýanly täsirleri döretdi (Goşmaça suratlar 6a, b).
Ilkinji barlagdan soň, biz 4 sany medeniýet şertleriniň ýüzbe-ýüz deňeşdirmesini geçirdik (4a-njy surat): Ctrl: optimizirlenen gurşawymyz arkaly öň beýan edilen statik medeniýetimizde ösdürilip ýetişdirilen ýürek bölekleri; 20.21 TD: Çarşenbe güni T3 we Ctrl goşulan Dex; MC: öň optimizirlenen gurşawymyz arkaly CTCM-de ösdürilip ýetişdirilen ýürek bölekleri; we MT: gurşawa T3 we Dex goşulan CTCM. 12 günlük ösdürilip ýetişdirilenden soň, MS we MT dokumalarynyň ýaşaýyş ukyby MTT synagy bilen baha berlen täze dokumalardaky ýaly galdy (4b-nji surat). Gyzykly tarapy, transwell medeniýetlerine (TD) T3 we Dex goşulmagy Ctrl şertleri bilen deňeşdirilende ýaşaýyş ukybynyň düýpli gowulaşmagyna getirmedi, bu bolsa ýürek bölekleriniň ýaşaýyş ukybyny saklamakda mehaniki stimullaşdyrmagyň möhüm roluny görkezýär.
12 günläp gurşawda mehaniki stimulýasiýa we T3/Dex goşundysynyň täsirini bahalandyrmak üçin ulanylan dört medeniýet şertini suratlandyrýan eksperimental dizaýn diagrammasy. b Sütun grafiki 4 medeniýet şertleriniň hemmesinde (Ctrl, TD, MC we MT) dürli doňuzlardan alnan täze ýürek bölekleri (D0) bilen deňeşdirilende 12 günlük ýaşaýyş ukybynyň mukdaryny görkezýär (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD we D12 MT), 12 (D12 MC) dürli doňuzlardan alnan bölek/topar, bir taraply ANOVA synagy geçirilýär; ####p < 0.0001, ###p < D0 bilen deňeşdirilende 0.001 we **p < 0.01 D12 Ctrl bilen deňeşdirilende). b Sütun grafiki dürli doňuzlardan alnan täze ýürek bölekleri (D0) bilen deňeşdirilende, ähli 4 medeniýet şertlerinde (Ctrl, TD, MC we MT) 12 günlük ösüş mümkinçiliginiň mukdaryny görkezýär (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD we D12 MT), 12 (D12 MC) bölek/topar, bir taraply ANOVA synagy geçirilýär; ####p < 0.0001, ###p < D0 bilen deňeşdirilende 0.001 we **p < 0.01 D12 ctrl bilen deňeşdirilende). b Гистограмма показывает количественную оценку жизнеспособности через 12 дней после митингированя восех 4 условиях мцитервированя (dar, TD, MC we MT) по сравнению со свежим срезами срджа (D0) D12 TD и D12 MT), 12 (D12 MC) срезов / группу от разных свиней, про проитится односторонний те ANOVA; b Sütun grafik 4 medeniýet şertleriniň hemmesinde (gözegçilik, TD, MC we MT) täze ýürek bölekleri (D0) bilen deňeşdirilende, 12 günlük ýaşaýyş ukybynyň mukdaryny görkezýär (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD we D12 MT), 12 (D12 MC) dürli doňuzlardan alnan bölekler/topar, birtaraplaýyn ANOVA synagy; ####p < 0.0001, ###p < 0.001 garşy D0 we **p < 0.01 D12 Ctrl bilen deňeşdirilende). b 条形图显示所有 4 种培养条件（ Ctrl 、 TD 、 MC 和 MT ）与新鲜心脏切片 (D0) (n = 18 (D0) 、 15 (D12 Ctrl 、 D12 TD 和 D12 MT) ，来自不同猪的 12 (D12 MC) 切片 / 组，进行单向 ANOVA 测试； #### p <0.0001 ， ### p <0.001 与 D0 相比，b 4 12 (D12 MC) b Гистограмма, показывающая все 4 условия консервированя (كان, TD, MC и MT) по сравнению со свежим срезами сердца (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD we D12 MT), от разныч односторонний тест ANOVA #### p <0,0001, ### p <0,001 по сравнению с D0, ** p <0,01 по сравнению с шәмлем D12) b Täze ýürek bölekleri (D0) bilen deňeşdirilende, ähli 4 medeniýet şertlerini (gözegçilik, TD, MC we MT) görkezýän gistogramma (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD we D12 MT), dürli doňuzlardan 12 (D12 MC) bölek/topar, bir taraply ANOVA synagy; ####p<0.0001, ###p<0.001 D0-a garşy, **p<0.01 gözegçilik D12-a garşy). c Sütun grafigi 4 medeniýet şertleriniň hemmesinde (Ctrl, TD, MC we MT) täze ýürek bölekleri (D0) bilen deňeşdirilende 12 günden soň glýukoza akymynyň mukdaryny görkezýär (dürli doňuzlardan alnan n = 6 bölek/topar, bir taraplaýyn ANOVA synagy geçirilýär; ###p < 0.001, D0 bilen deňeşdirilende we ***p < 0.001 D12 Ctrl bilen deňeşdirilende). c Sütun grafigi 4 medeniýet şertleriniň hemmesinde (Ctrl, TD, MC we MT) täze ýürek bölekleri (D0) bilen deňeşdirilende 12 günden soň glýukoza akymynyň mukdaryny görkezýär (dürli doňuzlardan alnan n = 6 bölek/topar, bir taraplaýyn ANOVA synagy geçirilýär; ###p < 0.001, D0 bilen deňeşdirilende we ***p < 0.001 D12 Ctrl bilen deňeşdirilende). c Гистограмма показывает количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после митингированя восех 4 условиях чатировированя (мар, TD, MC we MT) по сравнению со свежим срезами с свиней, односторонний Выполняется то ANOVA ### p <0,001 по сравнению с D0 и *** p <0,001 по сравнению с D12 Ctrl); c Gistogrammada 4 medeniýet şertleriniň hemmesinde (gözegçilik, TD, MC we MT) täze ýürek bölekleri (D0) bilen deňeşdirilende, 12 günlük ösüşden soňky glýukoza akymynyň mukdary görkezilýär (n = dürli doňuzlardan alnan topar/6 bölek, birtaraplaýyn ANOVA synagy geçirildi; ###p < 0.001 D0 bilen deňeşdirilende we ***p < 0.001 D12 Ctrl bilen deňeşdirilende). c 条形图显示所有 4 种培养条件（ Ctrl 、 TD 、 MC 和 MT ）与新鲜心脏切片 (D0) 相比，培养后 12 天的葡萄糖通量定量（ n = 6 片 / 组，来自不同猪，单向执行 ANOVA 测试； ### p <0,001 ，与 D0 相比， *** p <0,001 与 D12 Ctrl 相比）。 ... <0,001 与 D12 Ctrl 相比）。 c Гистограмма, показывающая количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после мгитерированя для всех 4 условий митервированя (ис, TD, MC we MT) по сравнению со свеж ср сәм разных свиней, односторонний Были проведены Тыы ANOVA ### p <0,001 по сравнению с D0, *** p <0,001 по сравнению с D12 (ат) c Gistogramma, täze ýürek bölekleri (D0) bilen deňeşdirilende, ähli 4 medeniýet şertlerinde (gözegçilik, TD, MC we MT) 12 günlük ösüşden soň glýukoza akymynyň mukdaryny görkezýär (n = 6 bölek/topar, dürli doňuzlardan, birtaraplaýyn). ANOVA synaglary geçirildimi, ###p < 0.001 D0 bilen deňeşdirilende, ***p < 0.001 D12 bilen deňeşdirilende (gözegçilik).d Täze (gök), 12-nji gün MC (ýaşyl) we 12-nji gün MT (gyzyl) dokumalarynyň on sebitleýin dokuma kesiş nokadynda (n = 4 bölek/topar, bir taraply ANOVA synagy; toparlaryň arasynda düýpli tapawut ýokdy) ştamm analiz grafikleri. e Statik şertlerde (Ctrl) ýa-da MT şertlerinde (MT) 10-12 günläp ösdürilip ýetişdirilen ýürek bölekleri bilen deňeşdirilende, täze ýürek böleklerinde (D0) dürli görnüşde ekspresirlenen genleri görkezýän Wulkan grafikasy. f Her bir ösdürilip ýetişdirilen ýürek bölekleri üçin sarkomer genleriniň ýylylyk kartasy. Ýalňyşlyk çyzyklary ortaça ± standart çykylyşy görkezýär.
Ýag kislotasynyň oksidlenmesinden glikolize geçişine metabolik garaşlylyk kardiomiositleriň dedifferensiýasiýasynyň alamatydyr. Ýetişen kardiomiositler esasan ATF öndürmek üçin glýukozany ulanýarlar we az sanly krista5,32 bilen gipoplastik mitohondriýalara eýedirler. Glýukozany ulanmak seljermeleri MC we MT şertlerinde glýukozany ulanmaklygyň 0-njy gün dokumalaryndaky ýaly bolandygyny görkezdi (4c surat). Şeýle-de bolsa, Ctrl nusgalary täze dokumalara garanyňda glýukozany ulanmakda ep-esli artyş görkezdi. Bu CTCM we T3/Dex-iň utgaşmasynyň dokumalaryň ýaşaýyş ukybyny ýokarlandyrýandygyny we 12 günlük ösdürilip ýetişdirilen ýürek bölekleriniň metabolik fenotipini saklaýandygyny görkezýär. Mundan başga-da, ştamm seljermesi ştamm derejesiniň MT we MS şertlerinde 12 günläp täze ýürek dokumalaryndaky ýaly galandygyny görkezdi (4d surat).
Ýürek kesim dokumasynyň global transkripsiýa landşaftyna CTCM we T3/Dex-iň umumy täsirini seljermek üçin, biz dört dürli medeniýet şertlerinden ýürek kesimlerinde RNAseq geçirdik (Goşmaça maglumatlar 1). Gyzykly tarapy, MT bölekleri täze ýürek dokumasyna ýokary transkripsiýa meňzeşligini görkezdi, 13,642 geniň diňe 16-sy dürli görnüşde ekspresirlendi. Şeýle-de bolsa, öň görkezşimiz ýaly, Ctrl kesimleri medeniýetde 10-12 günden soň 1229 dürli görnüşde ekspresirlendi gen görkezdi (4e surat). Bu maglumatlar ýürek we fibroblast genleriniň qRT-PCR arkaly tassyklanyldy (Goşmaça surat 7a-c). Gyzykly tarapy, Ctrl kesimleri ýürek we öýjük sikli genleriniň peselmegini we iltihap gen programmalarynyň işjeňleşdirilmegini görkezdi. Bu maglumatlar, adatça, uzak möhletli medeniýetden soň ýüze çykýan dedifferensiýasiýanyň MT şertlerinde doly gowşaýandygyny görkezýär (Goşmaça surat 8a, b). Sarkomer genleriniň ünsli öwrenilmegi, diňe MT şertlerinde sarkomeri (4f-nji surat) we ion kanalyny (Goşmaça surat 9) kodlaýan genleriň saklanyp galýandygyny we olary Ctrl, TD we MC şertlerinde basylyp ýatyrylmagyndan goraýandygyny görkezdi. Bu maglumatlar mehaniki we gumoral stimulýasiýa (T3/Dex) utgaşmasy bilen ýürek bölegi transkriptomasynyň 12 günlük medeniýetde saklanandan soň täze ýürek böleklerine meňzeş bolup biljekdigini görkezýär.
Bu transkripsiýa netijeleri, ýürek böleklerindäki kardiomiositleriň gurluş bitewüliginiň MT şertlerinde 12 günläp iň gowy saklanýandygy bilen tassyklanýar, bu bolsa bitewi we ýerli konneksin 43-de görkezilýär (5a-njy surat). Mundan başga-da, MT şertlerinde ýürek böleklerinde fibroz Ctrl bilen deňeşdirilende we täze ýürek böleklerine meňzeş derejede ep-esli azaldy (5b-nji surat). Bu maglumatlar mehaniki stimulýasiýa we T3/Dex bejergisiniň utgaşdyrylmagynyň medeniýetde ýürek böleklerinde ýürek gurluşyny netijeli goraýandygyny görkezýär.
a Täze bölünip alnan ýürek böleklerinde (D0) ýa-da ýürek böleginiň ähli dört medeniýet şertlerinde 12 günläp ösdürilip ýetişdirilen troponin-T (ýaşyl), connexin 43 (gyzyl) we DAPI-nyň (gök) wekilçilikli immunofluoresensiýa suratlary (ölçeg çyzygy = 100 µm). Ýürek dokumasynyň gurluş bitewüliginiň süni intellekt arkaly mukdaryny kesgitlemek (n = 7 (D0 we D12 Ctrl), dürli doňuzlardan 5 (D12 TD, D12 MC we D12 MT) bölek/topar, birtaraplaýyn ANOVA synagy geçirilýär; ####p < 0.0001 D0 we *p < 0.05 bilen deňeşdirilende ýa-da ****p < 0.0001 D12 Ctrl bilen deňeşdirilende). Ýürek dokumasynyň gurluş bitewüliginiň süni intellekt arkaly mukdaryny kesgitlemek (n = 7 (D0 we D12 Ctrl), dürli doňuzlardan 5 (D12 TD, D12 MC we D12 MT) bölek/topar, birtaraplaýyn ANOVA synagy geçirilýär; #### D0 we *p < 0.05 bilen deňeşdirilende p < 0.0001 ýa-da D12 Ctrl bilen deňeşdirilende ****p < 0.0001). Количественная оценка структурной целостности ткани сердца с помощью искусственного интеллекта (n = 7 (D0 и D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC и D12 MT) срезов/группу от разных свиней, проведен однофакторный тест ANOVA; #### p < 0,0001 по сравнению с D0 и * p <0,05 или **** p <0,0001 по сравненю с с D12 Ctrl). Ýürek dokumasynyň gurluş bitewüliginiň dürli doňuzlardan alnan emeli intellekt (n = 7 (D0 we D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC we D12 MT) bölümleri/toparlary ulanyp mukdaryny kesgitlemek, birtaraplaýyn ANOVA synagy geçirildi; #### D0 bilen deňeşdirilende p < 0.0001 we *p < 0.05 ýa-da D12 Ctrl bilen deňeşdirilende ****p < 0.0001).对不同猪的心脏组织结构完整性（ n = 7 （D0 和 D12 Ctrl ）、 5 （D12 TD 、 D12 MC 和 D12 MT ）切片 / 组）进行人工智能量化，进行单向 ANOVA 测试； #### p <0.0001 与 D0 和 * p <0.05 相比，或 **** p <0.0001 与 D12 Ctrl 相比）。对 不同 猪 的 = 完整性 = n = 7 （d0 和 d12 ctrl） （5 （d12 td 、 d12 mc 和 d12 mt） 组） 人工 # # # # # ########## p <0.0001 Ctrl 相比）。Bir taraplaýyn ANOVA synagy bilen dürli doňuzlarda (n = 7 (D0 we D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC we D12 MT) bölümler/topar) emeli intellekt arkaly ýürek dokumasynyň gurluş bitewüliginiň mukdaryny kesgitlemek;#### p <0,0001 по сравнению с D0 и * p <0,05 или **** p <0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). #### D0 bilen deňeşdirilende p < 0.0001 we *p < 0.05 ýa-da D12 Ctrl bilen deňeşdirilende ****p < 0.0001). b Massonyň trihrom boýagy bilen boýalan ýürek bölekleriniň wekilçilikli suratlary we mukdary (Mikrometrik çyzyk = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD we D12 MC), dürli doňuzlardan 9 (D12 MT) bölek/topar, bir taraply ANOVA synagy geçirilýär; ####p < 0.0001 D0 we ***p < 0.001 bilen deňeşdirilende, ýa-da ****p < 0.0001 D12 Ctrl bilen deňeşdirilende). b Massonyň trihrom boýagy bilen boýalan ýürek bölekleriniň wekilçilikli suratlary we mukdary (Mikrometrik çyzyk = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD we D12 MC), dürli doňuzlardan 9 (D12 MT) bölek/topar, bir taraply ANOVA synagy geçirilýär; ####p < 0.0001 D0 we ***p < 0.001 bilen deňeşdirilende, ýa-da ****p < 0.0001 D12 Ctrl bilen deňeşdirilende). b Репрезент Канные изображения һәм количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромным красителем Масона (чиная чейейка = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD and D12 MC) сц 2012; выполняется односторонний тест ANOVA #### p <0,0001 по сравнению с D0 и *** p <0,001 или **** p <0,0001 по сравнению с D12 Ctrl) b Massonyň trihrom boýagy bilen boýalan ýürek bölekleriniň wekilçilikli suratlary we mukdary (ölçeg çyzygy = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD we D12 MC), dürli doňuzlardan 9 (D12 MT) bölek/topar, bir taraply ANOVA ýerine ýetirildi; ####p < 0.0001 garşy D0 we ***p < 0.001 ýa-da ****p < 0.0001 garşy D12 Ctrl). b 用 Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像和量化（比例尺 = 500 µm ）（ n = 10 （D0 、 D12 Ctrl 、 D12 TD 和 D12 MC ），来自不同猪的 9 个（ D12 MT ）切片 / 组，进行单因素方差分析； #### p <0.0001 与 D0 相比， *** p <0,001 ，或 **** p <0.0001 与 D12 Ctrl 相比）。 b 用 masson 切片 切片 切片 切片 / 组，进行单因素方差分析； #### p <0.0001 与 D0 相比， *** p <0,001 ，或 **** p <0.0001 与 D12 Ctrl 相比）。 b Репрезент Канные изображения һәм количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромом Масона (чиная чейейка = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD we D12 MC), 9 (D12 MT рин) ANOVA #### p <0,0001 по сравненю с D0, *** p <0,001 или **** p <0,0001 по сравненюю с D12 Ctrl). b Massonyň trihromy (ölçeg çyzygy = 500 µm) bilen boýalan ýürek bölekleriniň wekilçilikli suratlary we mukdary (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD we D12 MC), dürli doňuzlardan/toparlardan 9 (D12 MT) bölekler, bir ANOVA usuly; ####p < 0.0001 D0 bilen deňeşdirilende, ***p < 0.001 ýa-da ****p < 0.0001 D12 Ctrl bilen deňeşdirilende).Ýalňyşlyk sütunlary ortaça ± standart çykylyşy görkezýär.
Ahyrsoňy, ýürek dokumasynyň dartylmagyny artdyrmak arkaly CTCM-iň ýürek gipertrofiýasyny gaýtalamak ukyby bahalandyryldy. CTCM-de howa kamerasynyň iň ýokary basyşy 80 mmHg-den 80 mmHg-e çenli ýokarlandy. Art. (kadaly dartylma) Art. 140 mmHg-e çenli ýokarlandy (6a-njy surat). Bu dartylmanyň 32% artmagyna gabat gelýär (6b-njy surat), bu öň gipertrofiýada görülýän sarkomer uzynlygyna ýetmek üçin ýürek bölekleri üçin zerur bolan degişli göterim dartylmasy hökmünde görkezildi. Ýürek dokumasynyň dartylma we boşalma wagtynda dartylma we tizlik alty günlük medeniýet döwründe üýtgewsiz galdy (6c-njy surat). MT şertlerinden alnan ýürek dokumasy alty günläp kadaly dartylma (MT (Kadaly)) ýa-da artykmaç dartylma şertlerine (MT (OS)) sezewar edildi. Kulturada dört gün geçenden soň, gipertrofik biomarker NT-ProBNP MT (OS) şertlerinde gurşawda MT (kadaly) şertlerine garanyňda ep-esli ýokarlandy (7a-njy surat). Mundan başga-da, alty günlük medeniýetleşdirmeden soň, MT-däki (OS) öýjük ölçegi (7b-nji surat) MT ýüreginiň böleklerine garanyňda ep-esli artdy (kadaly). Mundan başga-da, NFATC4 ýadro translokasiýasynyň artykmaç dartgynly dokumalarda ep-esli artandygy anyklandy (7c-nji surat). Bu netijeler aşa dartgynlylykdan soň patologiki täzeden gurluşyň progressiw ösüşini görkezýär we CTCM enjamynyň dartgynlylyk sebäpli ýürek gipertrofiýasynyň signallaşdyrmasyny öwrenmek üçin platforma hökmünde ulanylyp bilinjekdigi baradaky düşünjäni goldaýar.
Howa kamerasynyň basyşynyň, suwuklyk kamerasynyň basyşynyň we dokumalaryň hereket ölçegleriniň wekilçilikli yzlary kameranyň basyşynyň suwuklyk kamerasynyň basyşyny üýtgedýändigini we dokumanyň degişli hereketine sebäp bolýandygyny tassyklaýar. b Adaty dartylan (mämişi) we aşa dartylan (gök) dokuma bölekleri üçin wekilçilikli dartylma göterimi we dartylma tizligi egrileri. c Sikl wagtyny (dürli doňuzlardan her topar üçin n = 19 bölek), dartylma wagtyny (dürli doňuzlardan her topar üçin n = 18-19 bölek), relaksasiýa wagtyny (dürli doňuzlardan her topar üçin n = 19 bölek), dokumalaryň hereketiniň amplitudasyny (dürli doňuzlardan n = 14 bölek/topar), iň ýokary sistolik tizligi (dürli doňuzlardan n = 14 bölek/topar) we iň ýokary relaksasiýa tizligini (dürli doňuzlardan n = 14 (D0), 15 (D6)) bölekler/toparlar) görkezýän sütün grafigi, iki guýrukly Studentiň t-testi hiç bir parametrde düýpli tapawut görkezmedi, bu bolsa bu parametrleriň aşa naprýaženiýe bilen 6 günüň dowamynda üýtgewsiz galandygyny görkezýär. Ýalňyşlyk sütünleri ortaça ± standart çykylyşy görkezýär.
a MT-niň adaty uzaldyş (Norm) ýa-da artykmaç uzaldyş (OS) şertlerinde (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm we D4 MTOS) dürli doňuzlardan alnan ýürek böleklerinden/toparyndan alynýan medeniýet gurşawynda NT-ProBNP konsentrasiýasynyň sütün grafiki mukdary, Iki taraplaýyn ANOVA geçirilýär; **normal uzaldyş bilen deňeşdirilende p < 0.01). a) Dürli doňuzlardan MT-niň adaty uzaldyş (Norm) ýa-da artykmaç uzaldyş (OS) şertlerinde (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm we D4 MTOS) bölek/toparda ösdürilip ýetişdirilen ýürek böleklerinden ösdürilip ýetişdirilýän gurşawlarda NT-ProBNP konsentrasiýasynyň sütün grafiki mukdary, Iki taraplaýyn ANOVA geçirilýär; **normal uzaldyş bilen deňeşdirilende p < 0.01).Dürli doňuzlardan adaty MT uzalma (normal) ýa-da artykmaç uzalma (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm we D4).MTOS) bölekleri / topary şertlerinde ösdürilip ýetişdirilen ýürek böleklerinden alynýan medeniýet gurşawyndaky NT-ProBNP konsentrasiýasynyň mukdar gistogrammasy, iki faktorly dispersiýa seljermesi geçirilýär;** p <0,01 по сравнению с кәкныным раст адением). **normal uzalma bilen deňeşdirilende p < 0.01). a 在 MT Norm (Norm) 或过度拉伸 (OS) 条件下培养的心脏切片培养基中 NT-ProBNP 浓度的条形图量化（ n = 4 (D2 MTNorm) 、 3 （D2 MTOS 、 D4 MTNorm 和 D4 MTOS ）来自不同猪的切片 / 组，进行双向方差分析； ** 与正常拉伸相比， p <0.01 ）。 MT adaty uzalma (Norm) ýa-da aşa uzaldylan (OS) şertlerinde (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm 和 D4 MTOS), adaty uzalma bilen deňeşdirilende, ýürek dilimlerinde NT-ProBNP konsentrasiýasynyň mukdary, p <0.01).gistogramma Dürli doňuzlardan alnan kadaly MT uzalma (normal) ýa-da artykmaç uzalma (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm) we D4 MTOS) bölekleri/topar şertlerinde ösdürilip ýetişdirilen ýürek böleklerinde NT-ProBNP konsentrasiýalarynyň mukdaryny kesgitlemek, dispersiýanyň iki taraplaýyn seljermesi;** p <0,01 по сравнению с кәкныным раст адением). **normal uzalma bilen deňeşdirilende p < 0.01). b Troponin-T we WGA bilen boýalan ýürek bölekleriniň (çepde) we öýjük ölçegleriniň mukdarynyň kesgitlenmegi (sagda) üçin wekilçilikli suratlar (n = 330 (D6 MTOS), dürli doňuzlardan alynýan 10 dürli bölekden alnan 369 (D6 MTNorm) öýjük/topar, Iki guýrukly Student t-testi geçirilýär; adaty uzalma bilen deňeşdirilende ****p < 0.0001). b Troponin-T we WGA bilen boýalan ýürek bölekleriniň (çepde) we öýjük ölçegleriniň mukdarynyň kesgitlenmegi (sagda) üçin wekilçilikli suratlar (n = 330 (D6 MTOS), dürli doňuzlardan alynýan 10 dürli bölekden alnan 369 (D6 MTNorm) öýjük/topar, Iki guýrukly Student t-testi geçirilýär; adaty uzalma bilen deňeşdirilende ****p < 0.0001). b Репрезент Канные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слева) һәм количественного определения размера клеток (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm ск рок) свиней, два- про проитится хвостовой т-критерий Стьюдента **** p <0,0001 по сравнению с чанным раст ченением); b Troponin-T we AZP bilen boýalan ýürek bölekleriniň wekilçilikli suratlary (çepde) we öýjük ölçegleriniň mukdary (sagda) (n = 330 (D6 MTOS), dürli doňuzlaryň 10 dürli böleginden 369 (D6 MTNorm) öýjük/topar, iki guýrukly Studentiň t-testi geçirildi; adaty ştamm bilen deňeşdirilende ****p < 0.0001). b 用肌钙蛋白 -T 和 WGA （左）和细胞大小量化（右）染色的心脏切片的代表性图像（ n = 330 （D6 MTOS ），来自不同猪的 10 个不同切片的 369 （D6 MTNorm ）细胞 / 组，两进行有尾学生 t 检验；与正常拉伸相比， **** p <0.0001 ）。 b Kalkarein-T we WGA bilen boýalan ýürek bölekleriniň (çepde) we öýjük ölçegleriniň (sagda) wekilçilikli suratlary (n = 330 (D6 MTOS), 10 dürli bölekden 369 (D6 MTNorm)) Öýjükler/Hüjreler, adaty uzalma bilen deňeşdirilende, ****p < 0.0001). b Репрезент Канные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слева) һәм количественная оценка размера клеток (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) из 10 скрччич дву зононние критерий Стьюдента **** p <0,0001 по сравненюю с чанным раст зенением); b Troponin-T we AZP bilen boýalan ýürek bölekleriniň wekilçilikli suratlary (çepde) we öýjük ölçegleriniň mukdarynyň kesgitlenmegi (sagda) (dürli doňuzlardan alnan 10 dürli bölekden n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm)) Öýjükler/topar, iki guýrukly kriteriýa Studentiň t; ****p < 0.0001 adaty ştamm bilen deňeşdirilende). c 0-njy we 6-njy günler üçin troponin-T we NFATC4 üçin immunokortikasiýa edilen MTOS ýürek bölekleriniň we NFATC4-iň CM-leriň ýadrolaryna translokasiýasynyň mukdarynyň kesgitlenmegi üçin wekilçilikli suratlar (n = 4 (D0), dürli doňuzlardan 3 (D6 MTOS) bölek/topar, Iki guýrukly Student t-testi geçirilýär; *p < 0.05). c 0-njy we 6-njy günler üçin troponin-T we NFATC4 üçin immunokortikasiýa edilen MTOS ýürek bölekleriniň we NFATC4-iň CM-leriň ýadrolaryna translokasiýasynyň mukdarynyň kesgitlenmegi üçin wekilçilikli suratlar (n = 4 (D0), dürli doňuzlardan 3 (D6 MTOS) bölek/topar, Iki guýrukly Student t-testi geçirilýär; *p < 0.05). c Репрезент Кансные изображения для срезов сердца 0 и 6 дней MTOS, им адомеченых для тропонина-Т и NFATC4, и количественная оценка числокации NFATC4 в ядра кавернозных клеток (n = 4) разных свиней, виполняется дву зононний т-критерий Стьюдента * p <0,05); c 0 we 6-njy günlerdäki MTOS-da ýürek bölekleri üçin wekilçilikli suratlar, troponin-T we NFATC4 üçin immunobelliklenen we kawernöz öýjükleriň ýadrosynda NFATC4 translokasiýasynyň mukdaryny kesgitlemek (n = 4 (D0), dürli doňuzlardan 3 (D6 MTOS) bölek/topar) iki guýrukly Student t-testi bilen ýerine ýetirildi; *p < 0.05). c 用于肌钙蛋白 -T 和 NFATC4 免疫标记的第 0 天和第 6 天 MTOS 心脏切片的代表性图像，以及来自不同猪的 NFATC4 易位至 CM 细胞核的量化（ n = 4 (D0) 、 3 (D6 MTOS) 切片 / 组, 进行双尾学生 t 检验； * p <0.05)。 c Kalkanin-T we NFATC4 immunolabelingiň şekilleri 第 0 天和第 6 天 MTOS ýürek dilimleri, we dürli NFATC4 易位至 CM öýjük ýadrosy 的 mukdary NF (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) 切礼 / 组, 时间双尾学生 et 电影； * p <0.05). c Репрезент Кансные изображения срезов сердца MTOS на 0 и 6 день для Им имомомарировки тропонином-Т и NFATC4 и количественная оценка чолокации NFATC4 в ядра CM от разных свиней (n = 4 (D0)) хвостатый t-критерий Стьюдента * p <0,05); c Troponin-T we NFATC4 immunokabellemesi we dürli doňuzlardan (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) bölek/topar, iki guýrukly t-kriteriýasy Studentiňki; *p < 0.05) CM ýadrosynda NFATC4 translokasiýasynyň mukdaryny kesgitlemek üçin 0-njy we 6-njy günlerde MTOS ýürek bölekleriniň wekilçilikli suratlary.Ýalňyşlyk sütunlary ortaça ± standart çykylyşy görkezýär.
Translýasiýa ýürek-damar barlaglary ýürek gurşawyny takyk gaýtalaýan öýjük modellerini talap edýär. Bu barlagda ýüregiň örän inçe böleklerini höweslendirip bilýän CTCM enjamy işlenip düzüldi we häsiýetlendirildi. CTCM ulgamy fiziologiki taýdan sinhronlaşdyrylan elektromehaniki höweslendirmäni we T3 we Dex suwuklygyny baýlaşdyrmagy öz içine alýar. Doňuz ýüreginiň bölekleri bu faktorlara sezewar edilende, olaryň ýaşaýyş ukyby, gurluş bitewüligi, metabolik işjeňligi we transkripsiýanyň ekspresiýasy 12 günlük medeniýetden soň täze ýürek dokumasyndaky ýaly galdy. Mundan başga-da, ýürek dokumasynyň aşa uzaldylmagy giperekstenziýa sebäpli ýüregiň gipertrofiýasyna sebäp bolup biler. Umuman alanyňda, bu netijeler fiziologiki medeniýet şertleriniň kadaly ýürek fenotipini saklamakdaky möhüm roluny goldaýar we derman barlagy üçin platforma döredýär.
Kardiomiositleriň işlemegi we ýaşamagy üçin iň amatly gurşawy döretmäge köp faktorlar goşant goşýar. Bu faktorlaryň iň aýdyňlary (1) hüjreara özara täsirler, (2) elektromehaniki stimulýasiýa, (3) gumoral faktorlar we (4) metabolik substratlar bilen baglanyşyklydyr. Fiziologiki hüjreara özara täsirler hüjreden daşary matrisa tarapyndan goldanylýan köp sanly hüjre görnüşleriniň çylşyrymly üç ölçegli torlaryny talap edýär. Şeýle çylşyrymly hüjre özara täsirlerini aýry-aýry hüjre görnüşlerini bilelikde ösdürmek arkaly in vitro dikeltmek kyn, ýöne ýürek bölekleriniň organotipik tebigatyny ulanyp aňsatlyk bilen gazanyp bolýar.
Kardiomiositleriň mehaniki uzalma we elektrik stimulýasiýasy ýürek fenotipini saklamak üçin örän möhümdir33,34,35. Mehaniki stimulýasiýa hiPSC-CM şertlendirmek we ýetişmek üçin giňden ulanylsa-da, ýakynda birnäçe ajaýyp gözlegler bir okly ýükleme ulanyp medeniýetde ýürek bölekleriniň mehaniki stimulýasiýasyny synanyşdy. Bu gözlegler 2D bir okly mehaniki ýüklemesiniň medeniýet wagtynda ýüregiň fenotipine oňyn täsir edýändigini görkezýär. Bu gözleglerde ýüregiň bölekleri ýa izometrik dartgynlyk güýçleri17, çyzykly auksotonik ýükleme18 bilen ýüklendi ýa-da ýürek sikli güýç öwrüjiniň yzyna gaýtarma we dartgynlyk hereketlendirijileri arkaly täzeden döredildi. Şeýle-de bolsa, bu usullar daşky gurşaw optimizasiýasyny ulanmazdan bir okly dokumalaryň uzalmasyny ulanýar, bu bolsa köp ýürek genleriniň basylyp ýatyrylmagyna ýa-da anomal dartgynlyk jogaplary bilen baglanyşykly genleriň aşa köp ekspresiýasyna getirýär. Bu ýerde beýan edilen CTCM sikliň wagty we fiziologiki uzalma (25% uzalma, 40% sistola, 60% diastola we minutda 72 urma) babatda tebigy ýürek siklini gaýtalaýan 3D elektromehaniki stimuly üpjün edýär. Bu üç ölçegli mehaniki stimulýasiýa dokumalaryň bitewüligini saklamak üçin ýeterlik bolmasa-da, dokumalaryň ýaşaýşyny, işini we bitewüligini ýeterlik derejede saklamak üçin T3/Dex ulanyp gumoral we mehaniki stimulýasiýalaryň utgaşmasy zerurdyr.
Gumoral faktorlar ulularyň ýürek fenotipini modullaşdyrmakda möhüm rol oýnaýar. Bu, öýjükleriň ýetişmegini çaltlaşdyrmak üçin T3 we Dex medeniýet gurşawlaryna goşulan HiPS-CM barlaglarynda nygtaldy. T3 aminokislotalaryň, şekerler we kalsiýiň öýjük membranalary arkaly daşalmagyna täsir edip biler36. Mundan başga-da, T3 MHC-α ekspresiýasyny we MHC-β peselmegini höweslendirýär, bu bolsa fetal CM-de haýal çekilýän miofibrillere garanyňda, ýetişen kardiomiositlerde çalt çekilýän miofibrilleriň emele gelmegine ýardam edýär. Gipotiroid näsaglarynda T3 ýetmezçiligi miofibrillar zolaklarynyň ýitmegine we tonusyň ösüş tizliginiň peselmegine getirýär37. Dex glýukokortikoid reseptorlaryna täsir edýär we izolýasiýa edilen perfuzirlenen ýüreklerde miokardyň ýygrylma güýjüni artdyrýandygy görkezildi;38 bu gowulaşmanyň kalsiý çökündilerine esaslanýan girişe (SOCE) täsiri bilen baglanyşyklydygy çak edilýär39,40. Mundan başga-da, Dex öz reseptorlaryna baglanýar we immun funksiýasyny we iltihaplanmany basyp ýatyrýan giň öýjük içi reaksiýa döredýär30.
Netijelerimiz fiziki mehaniki stimulýasiýanyň (MS) Ctrl bilen deňeşdirilende umumy medeniýet işini gowulandyrandygyny, ýöne medeniýetde 12 günüň dowamynda ýaşaýyş ukybyny, gurluş bitewüligini we ýürek ekspresiýasyny saklap bilmedi. Ctrl bilen deňeşdirilende, CTCM (MT) medeniýetlerine T3 we Dex goşulmagy ýaşaýyş ukybyny gowulandyrdy we täze ýürek dokumasy bilen 12 günüň dowamynda meňzeş transkripsiýa profillerini, gurluş bitewüligini we metabolik işjeňligi saklady. Mundan başga-da, dokumalaryň dartylmagynyň derejesini gözegçilikde saklamak arkaly, STCM ulanyp, giperekstenziýa sebäpli ýürek gipertrofiýasynyň modeli döredildi, bu bolsa STCM ulgamynyň köpugurlylygyny görkezýär. Ýüregiň täzeden gurulmagy we fibroz adatça aýlanýan öýjükleri degişli sitokinleri, şeýle hem fagositozy we beýleki täzeden gurulýan faktorlary üpjün edip bilýän bitewi organlary öz içine alsa-da, ýüregiň bölekleriniň stresse we trawma jogap hökmünde fibrotik prosesi gaýtalap biljekdigini bellemelidiris. miofibroblastlara. Bu öň bu ýürek dilim modelinde bahalandyryldy. Tahikardiýa, bradikardiýa we mehaniki aýlanyş goldawy (mehaniki ýüksüz ýürek) ýaly köp ýagdaýlary simulýasiýa etmek üçin CTCM parametrleriniň basyşy/elektrik amplitudasyny we ýygylygyny üýtgetmek arkaly modulýasiýa edilip bilinjekdigini bellemelidiris. Bu bolsa ulgamy derman synaglary üçin orta öndürijilikli edýär. CTCM-iň aşa köp dartgynlyk sebäpli ýürek gipertrofiýasyny modelleşdirmek ukyby bu ulgamy şahsylaşdyrylan terapiýa üçin synagdan geçirmek üçin ýol açýar. Netijede, şu barlag ýürek dokumalarynyň bölekleriniň medeniýetini saklamak üçin mehaniki dartgynmagyň we gumoral stimulýasiýanyň möhümdigini görkezýär.
Bu ýerde görkezilen maglumatlar CTCM-iň miokardyň bitewiligini modelleşdirmek üçin örän geljegi uly platformadygyny görkezse-de, bu medeniýet usulynyň käbir çäklendirmeleri bar. CTCM medeniýetiniň esasy çäklendirmesi, onuň kesiklere yzygiderli dinamiki mehaniki stresleri salmagydyr, bu bolsa her bir siklde ýürek kesikleriniň gysgalmalaryny işjeň gözegçilikde saklamak mümkinçiligine päsgel berýär. Mundan başga-da, ýürek bölekleriniň kiçi ölçegliligi (7 mm) sebäpli, däp bolan güýç datçiklerini ulanyp, medeniýet ulgamlaryndan daşarda sistolik funksiýany bahalandyrmak mümkinçiligi çäkli. Häzirki golýazmada biz optiki naprýaženiýeni gysgalma funksiýasynyň görkezijisi hökmünde bahalandyrmak arkaly bu çäklendirmeleri bölekleýin ýeňip geçýäris. Şeýle-de bolsa, bu çäklendirme has köp işlemegi talap eder we geljekde kalsiý we naprýaženiýe duýgur boýaglary ulanyp optiki kartalaşdyrmak ýaly medeniýetde ýürek kesikleriniň funksiýasyny optiki gözegçilik etmek usullaryny girizmek arkaly çözülip bilner. CTCM-iň başga bir çäklendirmesi, iş modeliniň fiziologiki stresi (öňünden ýükleme we soň ýükleme) dolandyrmaýandygydyr. CTCM-de, örän uly dokumalarda diastolada (doly uzalma) we sistolada (elektrik stimulýasiýasy wagtynda gysgalmanyň uzynlygy) 25% fiziologiki uzalmany köpeltmek üçin basyş ters ugurlarda induksiýa edildi. Bu çäklendirme geljekki CTCM dizaýnlarynda ýürek dokumalaryna iki tarapdan ýeterlik basyş etmek we ýüregiň kameralarynda ýüze çykýan basyş-göwrüm gatnaşyklaryny takyk ulanmak arkaly aýrylmaly.
Bu golýazmada habar berlen artykmaç dartgynma sebäpli täzeden gurluş gipertrofiki giperdargynma signallaryny gaýtalamak bilen çäklenýär. Şeýlelik bilen, bu model gumoral ýa-da neýr faktorlaryna (bu ulgamda ýok) mätäçlik bolmazdan dartgynma sebäpli gipertrofiki signallaşdyrmany öwrenmäge kömek edip biler. CTCM-iň köp sanlylygyny artdyrmak üçin goşmaça barlaglar gerek, mysal üçin, immun öýjükleri, aýlanýan plazma gumoral faktorlary we neýron öýjükleri bilen bilelikde ösdürilende innerwasiýa CTCM bilen kesel modelirlemegiň mümkinçiliklerini gowulandyrar.
Bu gözlegde on üç doňuz ulanyldy. Haýwanlar bilen geçirilýän ähli amallar edara görkezmelerine laýyklykda ýerine ýetirildi we Luiswill uniwersitetiniň haýwanlara ideg etmek we ulanmak boýunça edara komiteti tarapyndan tassyklanyldy. Aorta kemeri berkidildi we ýürek 1 litr steril kardioplegiýa (110 mM NaCl, 1.2 mM CaCl2, 16 mM KCl, 16 mM MgCl2, 10 mM NaHCO3, 5 U/ml geparin, pH 7.4-e çenli) bilen perfuziasiýa edildi; ýürekler buz ýaly sowuk kardioplegik erginde saklanyp, adatça 10 minutdan az wagt dowam edýän buzuň üstünde laboratoriýa äkidildi. ýürekler buz ýaly sowuk kardioplegik erginde saklanyp, adatça 10 minutdan az wagt dowam edýän buzuň üstünde laboratoriýa äkidildi. сердца хранили в ледяном кардиоп огиическом растворе до сировировки в лабораторию на льду, что обонно занимает <10 мин. ýürekler buz ýaly sowuk kardioplegik erginde saklanyp, adatça 10 minutdan az wagt alýan buzuň üstünde laboratoriýa äkidildi.将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常 <10 分钟。将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常 <10 分钟。 Держите сердца в ледяной кардиопгии до зировировки в лаборатораторю на льду, обикно <10 мин. Kardioplegiýa bolanda, adatça 10 minutdan az wagtdan soň, buzda laboratoriýa äkidilýänçä, ýürekleri buzda saklaň.
CTCM enjamy SolidWorks kompýuter kömekli dizaýn (CAD) programma üpjünçiliginde işlenip düzüldi. Kultura kameralary, bölüjiler we howa kameralary CNC arassa akril plastmassadan ýasalýar. 7 mm diametrli ätiýaçlyk halkasy merkezinde ýokary dykyzlykly polietilenden (HDPE) ýasalýar we aşagyndaky serişdeleri ýapmak üçin ulanylýan silikon O-halkasyny ýerleşdirmek üçin O-halka oýugy bar. Inçe silika membranasy medeniýet kamerasyny bölüji plastinkadan bölýär. Silikon membrana 0,02 дюйm galyňlykdaky silikon listden lazer bilen kesilýär we 35A gatylygyna eýedir. Aşakdaky we ýokarky silikon prokladkalar 1/16 дюйm galyňlykdaky silikon listden lazer bilen kesilýär we 50A gatylygyna eýedir. Bloky berkitmek we howa geçirmeýän möhür döretmek üçin 316L poslamaýan polat wintler we gaýkalar ulanylýar.
C-PACE-EM ulgamy bilen birleşdirilmek üçin ýörite çap edilen elektron plata (PCB) döredildi. PCB-däki şweýsar maşynynyň birleşdiriji rozetkalary kümüş örtülen mis simler we elektrodlara burlup goýlan bürünç 0-60 wintler arkaly grafit elektrodlaryna birikdirilendir. Çap edilen elektron plata 3D printeriň gapagynda ýerleşdirilendir.
CTCM enjamy ýürek sikline meňzeş dolandyrylýan aýlanyş basyşyny döredýän programmalaşdyrylýan pnewmatik aktuator (PPD) tarapyndan dolandyrylýar. Howa kamerasynyň içindäki basyş ýokarlananda, çeýe silikon membrana ýokaryk giňelýär we gurşawy dokumanyň aşagyndan geçirýär. Soňra dokumanyň meýdany suwuklygyň bu çykarylyşy bilen uzalyp, diastola wagtynda ýüregiň fiziologiki giňelmesini gaýtalaýar. Relaksasiýanyň iň ýokary derejesinde, howa kamerasyndaky basyşy peseldýän we dokuma bölekleriniň gysylmagyna sebäp bolýan grafit elektrodlary arkaly elektrik stimullaşdyrmasy ulanyldy. Turbanyň içinde howa ulgamyndaky basyşy anyklamak üçin basyş datçigi bolan gemostatik klapan bar. Basyş datçigi tarapyndan duýulan basyş noutbuka birikdirilen maglumat ýygnaýjysyna berilýär. Bu gaz kamerasynyň içindäki basyşy yzygiderli gözegçilik etmäge mümkinçilik berýär. Maksimum kamera basyşyna ýetende (standart 80 mmHg, 140 mmHg OS), maglumat ýygnaýjy enjama 4 V-a goýlan 2 ms üçin iki fazaly naprýaženiýe signalyny döretmek üçin C-PACE-EM ulgamyna signal ibermek tabşyryldy.
Ýürek bölekleri alyndy we 6 guýuda medeniýet şertleri aşakdaky ýaly ýerine ýetirildi: Ýygnalan ýürekleri geçiriji gapdan sowuk (4° C) kardioplegiýa saklaýan tabaga geçirip goýuň. Çep garynja steril pyçak bilen bölünip alyndy we 1-2 sm3 böleklere bölündi. Bu dokuma bloklary dokumalaryň daýançlaryna dokumalaryň ýelmeşdirijisi bilen berkidildi we Tyrode ergini saklaýan titreýän mikrotom dokuma wannasyna ýerleşdirildi we yzygiderli kislorod bilen üpjün edildi (3 g/L 2,3-butandion monooksim (BDM), 140 mM NaCl (8.18 g) ), 6 mM KCl (0.447 g), 10 mM D-glýukoza (1.86 g), 10 mM HEPES (2.38 g), 1 mM MgCl2 (1 ml 1 M ergini), 1.8 mM CaCl2 (1.8 ml 1 M ergini), 1 L ddH2O çenli). Titreýän mikrotom 80 Gts ýygylykda, gorizontal titreme amplitudasy 2 mm we öňe ilerleme tizligi 0,03 mm/s bolan 300 µm galyňlykdaky bölekleri kesmek üçin sazlandy. Ergin sowuk saklamak üçin dokuma wannasy buz bilen gurşalyp alyndy we temperatura 4°C-de saklandy. Mikrotom wannasyndan dokuma böleklerini bir medeniýet plastinkasy üçin ýeterlik bölekler alynýança buzda üznüksiz kislorodly Tyrode erginini öz içine alýan inkubasiýa wannasyna geçiriň. Transwell medeniýetleri üçin dokuma bölekleri steril 6 mm giňlikdäki poliuretan daýançlara berkidildi we 6 ml optimizirlenen gurşawa (199 gurşaw, 1x ITS goşundysy, 10% FBS, 5 ng/ml VEGF, 10 ng/ml FGF-şer we 2X antibiotik-gömeleklere garşy serişde) ýerleşdirildi. C-Pace arkaly dokuma böleklerine elektrik stimullaşdyrmasy (10 V, ýygylygy 1,2 Hz) berildi. TD şertleri üçin, her bir gurşaw çalşygynda 100 nM we 1 μM-de täze T3 we Dex goşuldy. Gurşaw günde 3 gezek çalşyrmazdan öň kislorod bilen doýgunlaşdyrylýar. Dokumalaryň bölekleri 37°C we 5% CO2-de inkubatorda ösdürilip ýetişdirildi.
CTCM medeniýetleri üçin dokumalaryň bölekleri üýtgedilen Tyrode erginini öz içine alýan Petri çanagyndaky ýörite ýasalan 3D printerde ýerleşdirildi. Enjam ýüregiň kesiminiň ölçegini goldaw halkasynyň meýdanynyň 25% -ine çenli artdyrmak üçin niýetlenendir. Bu, Tyrode ergininden gurşawa geçirilenden soň we diastola wagtynda ýüregiň bölekleriniň uzalmazlygy üçin edilýär. Gistoakril ýelimi ulanyp, 300 µm galyňlykdaky bölekler diametri 7 mm bolan goldaw halkasyna berkidildi. Dokumalaryň böleklerini goldaw halkasyna birikdirenden soň, artykmaç dokuma böleklerini kesip, birikdirilen dokuma böleklerini bir enjam üçin ýeterlik bölekler taýýarlanýança buzuň üstünde (4°C) Tyrode ergininiň wannasyna gaýtaryň. Ähli enjamlar üçin umumy işleme wagty 2 sagatdan geçmeli däl. 6 dokuma bölegi goldaw halkalaryna birikdirilenden soň, CTCM enjamy ýygnaldy. CTCM medeniýet kamerasy öňünden 21 ml öňünden kislorodlanan gurşaw bilen dolduryldy. Dokumalaryň böleklerini medeniýet kamerasyna geçirip, howa köpürjiklerini pipetka bilen üns bilen aýyryň. Soňra dokuma bölegi deşige gönükdirilýär we ýerine ýuwaşlyk bilen basylýar. Ahyrsoňy, elektrod gapagyny enjama goýuň we enjamy inkubatora geçiriň. Soňra CTCM-i howa turbasyna we C-PACE-EM ulgamyna birikdiriň. Pnewmatiki hereketlendiriji açylýar we howa klapany CTCM-i açýar. C-PACE-EM ulgamy iki fazaly stimulyatorda 2 ms üçin 1,2 Gts-de 4 V bermek üçin konfigurirlendi. Elektrodlarda grafit toplanmagynyň öňüni almak üçin gurşaw günde iki gezek çalşyryldy we elektrodlar günde bir gezek çalşyryldy. Zerur bolanda, dokuma böleklerini olaryň aşagyna düşen howa köpürjiklerini çykarmak üçin olaryň medeniýet guýularyndan aýryp bolýar. MT bejeriş şertleri üçin her bir gurşaw çalşylanda T3/Dex 100 nM T3 we 1 μM Dex bilen täze goşuldy. CTCM enjamlary inkubatorda 37°C we 5% CO2-de ösdürilip ýetişdirildi.
Ýürek bölekleriniň uzalan traýektoriýalaryny almak üçin ýörite kamera ulgamy işlenip düzüldi. Navitar Zoom 7000 18-108mm makro linzasy (Navitar, San-Fransisko, Kaliforniýa) bilen SLR kamera (Canon Rebel T7i, Canon, Tokio, Ýaponiýa) ulanyldy. Surat täze serişde bilen çalşylandan soň, wizualizasiýa otagyň temperaturasynda ýerine ýetirildi. Kamera 51° burçda ýerleşdirilýär we wideo sekuntda 30 kadr tizlikde ýazylýar. Ilki bilen, ýürek bölekleriniň hereketini ölçemek üçin Image-J bilen açyk kodly programma üpjünçiligi (MUSCLEMOTION43) ulanyldy. Maska sesden gaça durmak üçin urýan ýürek bölekleri üçin gyzyklanma sebitlerini kesgitlemek maksady bilen MATLAB (MathWorks, Natick, MA, ABŞ) ulanylyp döredildi. El bilen segmentlenen maskalar kadr yzygiderliligindäki ähli suratlara ulanylýar we soňra MUSCLEMOTION plaginine geçirilýär. Muscle Motion her kadrdaky pikselleriň ortaça intensiwligini ulanyp, onuň hereketini salgylanma kadryna görä ölçeýär. Maglumatlar ýazylyp alyndy, süzüldi we sikl wagtyny kesgitlemek we ýürek sikliniň dowamynda dokumalaryň uzalyp gitmegini bahalandyrmak üçin ulanyldy. Ýazylyp alnan wideo birinji derejeli nol fazaly sanly süzgüç arkaly gaýtadan işlenildi. Dokumalaryň uzalyp gitmegini (depeden depesine) kesgitlemek üçin, ýazylan signaldaky depeleri we pese gaçyşlary tapawutlandyrmak üçin depeden depesine seljerme geçirildi. Mundan başga-da, signalyň süýşmegini aradan aýyrmak üçin 6-njy derejeli polinom ulanylyp, detrendleşdirme geçirilýär. Global dokumalaryň hereketini, sikl wagtyny, relaksasiýa wagtyny we daralma wagtyny kesgitlemek üçin MATLAB-da programma kody işlenip düzüldi (Goşmaça programma kody 44).
Gatnaşyk seljermesi üçin, mehaniki dartgynlyk bahalandyrmasy üçin döredilen şol bir wideolary ulanyp, ilki bilen MUSCLEMOTION programma üpjünçiligine laýyklykda hereket depelerini (hereketiň iň ýokary (ýokarky) we iň pes (aşaky) nokatlaryny) görkezýän iki suraty yzarladyk. Soňra dokumalaryň sebitlerini segmentleşdirdik we segmentlenen dokuma kölege algoritminiň bir görnüşini ulandyk (Goşmaça surat 2a). Soňra segmentlenen dokuma on sany aşagy gatlaga bölündi we her ýüzdäki stres aşakdaky deňleme arkaly hasaplanyldy: Gatnaşyk = (Ýokary-Aşak)/Aşak, bu ýerde Ýokary we Aşak degişlilikde matanyň ýokarky we aşaky kölegelerinden görnüşiň aralygydyr (Goşmaça surat 2b).
Ýürek bölekleri 4% paraformaldegidde 48 sagatlap berkidildi. Fiksirlenen dokumalar 1 sagatlap 10% we 20% saharozada, soňra 30% saharozada gijesine suwsuzlandyryldy. Soňra bölekler optimal kesiş temperaturasyna (OCT birleşmesi) goýuldy we izopentan/gurak buzly wannada ýuwaş-ýuwaşdan doňduryldy. OCT goýulýan bloklary aýrylýança -80 °C-de saklaň. Slaýdlar 8 μm galyňlykdaky bölekler hökmünde taýýarlanyldy.
Ýürek böleklerinden OCT-ni aýyrmak üçin, slaýdlary gyzdyryjy blokda 95 °C-da 5 minutlap gyzdyryň. Her slaýda 1 ml PBS goşuň we otag temperaturasynda 30 minutlap inkubasiýa ediň, soňra PBS-de 0.1% Triton-X-i 15 minutlap otag temperaturasynda goýup, bölekleriň içine siňdiriň. Spesifik däl antitelalaryň nusga bilen baglanmagynyň öňüni almak üçin, slaýdlara 1 ml 3% BSA erginini goşuň we otag temperaturasynda 1 sagatlap inkubasiýa ediň. Soňra BSA aýryldy we slaýdlar PBS bilen ýuwuldy. Her nusgany galam bilen belläň. Ilkinji antitela (1% BSA-da 1:200 garyndysynda suwuklandyrylan) (connexin 43 (Abcam; #AB11370), NFATC4 (Abcam; #AB99431) we troponin-T (Thermo Scientific; #MA5-12960) 90 minutlap goşuldy, soňra ikinji antitela (1% BSA-da 1:200 garyndysynda suwuklandyrylan) syçan Alexa Fluor 488-e (Thermo Scientific; #A16079), towşan Alexa Fluor 594-e (Thermo Scientific; #T6391) garşy goşmaça 90 minut goşuldy. PBS bilen 3 gezek ýuwuldy. Nyşana boýagy fondan tapawutlandyrmak üçin, biz diňe ikinji antitela gözegçilik hökmünde ulandyk. Ahyrsoňy, DAPI ýadro boýagy goşuldy we slaýdlar wektashield-e (Vector Laboratories) ýerleşdirildi we dyrnak lak bilen möhürlendi. -x ulaldyş) we 40x ulaldyşly Keyence mikroskopy bilen ýapyldy.
WGA boýamak üçin PBS-de 5 μg/ml bolan WGA-Alexa Fluor 555 (Thermo Scientific; #W32464) ulanyldy we otagyň temperaturasynda 30 minutlap berk böleklere çalyndy. Soňra slaýdlar PBS bilen ýuwuldy we her slaýda Sudan garasy goşuldy we 30 minutlap inkubasiýa edildi. Soňra slaýdlar PBS bilen ýuwuldy we wectashield gömüji serişdesi goşuldy. Slaýdlar Keyence mikroskopynda 40x ulaldyşda görkezildi.
OCT ýokarda beýan edilişi ýaly nusgalardan aýryldy. OCT aýrylandan soň, slaýdlary Buin erginine bir gije batyryň. Soňra slaýdlar 1 sagatlap distillenen suw bilen çaýkalyp, soňra 10 minutlap Bibrih aloe kislotasynyň fuksin erginine goýuldy. Soňra slaýdlar distillenen suw bilen ýuwuldy we 10 minutlap 5% fosfomolibden / 5% fosfowolfstik kislotasynyň erginine goýuldy. Çaýkamazdan, slaýdlary 15 minutlap gönüden-göni anilin gök erginine geçiriň. Soňra slaýdlar distillenen suw bilen ýuwuldy we 2 minutlap 1% sirke kislotasynyň erginine goýuldy. Slaýdlar 200 N etanolda guradyldy we ksilol geçirildi. Boýalan slaýdlar 10x obýektiwli Keýens mikroskopy arkaly görkezildi. Fibroz meýdanynyň göterimi Keýens analizator programma üpjünçiligi arkaly ölçeldi.
CyQUANT™ MTT Öýjükleriniň Ýaşaýyş Synagy (Invitrogen, Carlsbad, CA), katalog belgisi V13154, öndürijiň protokolyna laýyklykda, käbir üýtgetmeler bilen. Hususan-da, MTT analizi wagtynda dokumalaryň deň ölçegini üpjün etmek üçin diametri 6 mm bolan hirurgiki deşiji ulanyldy. Dokumalar öndürijiň protokolyna laýyklykda MTT substratyny öz içine alýan 12 guýulyk plastinkanyň guýularyna aýratynlykda ýerleşdirildi. Bölekler 37° C-de 3 sagatlap inkubasiýa edilýär we diri dokuma MTT substratyny metabolizirläp, gyrmyzy formazan birleşmesini emele getirýär. MTT erginini 1 ml DMSO bilen çalşyryň we ýürek böleklerinden gyrmyzy formazany çykarmak üçin 37°C-de 15 minutlap inkubasiýa ediň. Nusgalar 96 guýulyk aýdyň düýp plastinkalarda DMSO-da 1:10 gatnaşygynda suwlandyryldy we gyrmyzy reňkiň intensiwligi 570 nm-de Cytation plastinka okyjysy (BioTek) arkaly ölçeldi. Okuwlar ýüregiň her bir böleginiň agramyna kadalaşdyryldy.
Ýürek dilimleriniň ortalary öň beýan edilişi ýaly glýukoza ulanylyş synagy üçin 1 μCi/ml [5-3H]-glýukoza (Moravek Biochemicals, Brea, CA, ABŞ) saklaýan ortalar bilen çalşyryldy. 4 sagat inkubasiýadan soň, 100 µl 0,2 N HCl saklaýan açyk mikrosentrifuga turbasyna 100 µl ortalyk goşuň. Soňra turba 37°C-da 72 sagatlap [3H]2O bugartmak üçin 500 μl dH2O saklaýan sintilýasiýa turbasyna ýerleşdirildi. Soňra mikrosentrifuga turbasyny sintilýasiýa turbasyndan çykaryň we 10 ml sintilýasiýa suwuklygyny goşuň. Sintilýasiýa sanlary Tri-Carb 2900TR suwuk sintilýasiýa analizatory (Packard Bioscience Company, Meriden, CT, ABŞ) arkaly geçirildi. Soňra glýukozanyň ulanylyşyny [5-3H]-glýukozanyň özüne mahsus işjeňligini, doly däl deňagramlylygy we fonuny, [5-3H]-iň belliksiz glýukoza çenli suwuklandyrylmagyny we sintilýasiýa garşy netijeliligini hasaba almak bilen hasapladylar. Maglumatlar ýüregiň bölekleriniň massasyna kadalaşdyrylýar.
Trizol-da dokumalaryň gomogenizasiýasyndan soň, önüm öndürijiň protokolyna laýyklykda Qiagen miRNeasy Micro Kit #210874 ulanyp, ýürek böleklerinden RNK bölünip alyndy. RNK kitaphanasyny taýýarlamak, yzygiderlik we maglumat seljermesi aşakdaky ýaly geçirildi:
RNK kitaphanasyny taýýarlamak üçin başlangyç material hökmünde her nusga üçin 1 μg RNK ulanyldy. Öndürijiniň maslahatlaryna laýyklykda, NEBNext UltraTM RNK kitaphanasyny taýýarlamak üçin Illumina (NEB, ABŞ) gurallaryny ulanyp, yzygiderlik kitaphanalary döredildi we her nusga üçin atribut yzygiderliklerine indeks kodlary goşuldy. Gysgaça aýdylanda, mRNK poli-T oligonukleotidleri bilen berkidilen magnit munçuklary ulanyp umumy RNK-dan arassalandy. Fragmentasiýa NEBNext Birinji Zerde Sintez Reaksiýa Buferinde (5X) ýokary temperaturada iki walentli kationlary ulanyp amala aşyrylýar. Birinji zerde kDNK tötänleýin geksamer praýmerleri we M-MuLV ters transkriptazasy (RNase H-) ulanylyp sintez edildi. Ikinji zerde kDNK soňra DNK polimeraza I we RNase H ulanylyp sintez edilýär. Galan çykyndylar eksonukleaza/polimeraza işjeňligi arkaly küt uçlara öwrülýär. DNK fragmentiniň 3' ujunyň adenilleşdirilmeginden soň, ony gibridleşdirmäge taýýarlamak üçin oňa saçly halka gurluşy bolan NEBNext Adapteri berkidilýär. 150-200 bp uzynlykdaky kDNK böleklerini saýlamak üçin kitaphana bölekleri AMPure XP ulgamy (Beckman Coulter, Beverly, ABŞ) arkaly arassalanyldy. Soňra, PCR-den öň, ululygy saýlanan kDNK bilen adapter bilen baglanan 3 μl USER fermenti (NEB, ABŞ) 37°C-da 15 minut, soňra bolsa 95°C-da 5 minut ulanyldy. Soňra PCR Phusion High-Fidelity DNK polimerazasy, universal PCR praýmerleri we Index (X) praýmerleri ulanylyp geçirildi. Ahyrsoňy, PCR önümleri arassalanyldy (AMPure XP ulgamy) we kitaphananyň hili Agilent Bioanalyzer 2100 ulgamynda bahalandyryldy. Soňra kDNK kitaphanasy Novaseq sekwenseri arkaly sekwensirlendi. Illumina-dan çig surat faýllary CASAVA Base Calling arkaly çig okalyşa öwrüldi. Çig maglumatlar okalyş sekwensirlerini we degişli esasy häsiýetleri öz içine alýan FASTQ(fq) formatly faýllarda saklanýar. Süzgüçden geçirilen yzygiderlik okalyşlaryny Sscrofa11.1 salgylanma genomyna deňleşdirmek üçin HISAT2 saýlaň. Umuman, HISAT2 4 milliard esasdan uly genomlary goşmak bilen islendik ululykdaky genomlary goldaýar we köp parametrler üçin standart gymmatlyklar kesgitlenýär. RNA yzygiderlik maglumatlaryndan birleşdirilen okalyşlary häzirki wagtda elýeterli iň çalt ulgam bolan HISAT2 arkaly beýleki islendik usul bilen deň ýa-da has gowy takyklyk bilen netijeli deňleşdirip bolýar.
Transkriptleriň köp bolmagy gen ekspresiýasynyň derejesini gönüden-göni görkezýär. Gen ekspresiýasynyň derejeleri genom ýa-da ekzonlar bilen baglanyşykly transkriptleriň köp bolmagy (yzygiderlik sany) bilen bahalandyrylýar. Okalyşlaryň sany gen ekspresiýasynyň derejelerine, gen uzynlygyna we yzygiderlik çuňlugyna proporsionaldyr. FPKM (million baza jübütlerine yzygiderliklenen transkriptiň müň esasy jübütlerine düşýän bölekleri) hasaplanyldy we differensial ekspresiýanyň P-bahalary DESeq2 bukjasyny ulanyp kesgitlenildi. Soňra biz her bir P gymmaty üçin Benjamini-Hochberg usuly9 ulanyp, gurlan "p.adjust" R-funksiýasyna esaslanyp, ýalňyş açylyş tizligini (FDR) hasapladyk.
Ýürek böleklerinden bölünip alnan RNK, Thermo-dan SuperScript IV Vilo Master garyndysyny (Thermo, cat. no. 11756050) ulanyp, 200 ng/μl konsentrasiýada kDNK-a öwrüldi. Mukdar taýdan RT-PCR Applied Biosystems Endura Plate Microamp 384-guýuly açyk reaksiýa plastinkasyny (Thermo, cat. no. 4483319) we mikroamp optiki ýelimleýjisini (Thermo, cat. no. 4311971) ulanyp geçirildi. Reaksiýa garyndysy 5 µl Taqman Fast Advanced Master garyndysyndan (Thermo, cat # 4444557), 0.5 µl Taqman Primerinden we her guýuda garylan 3.5 µl H2O-dan ybaratdy. Standart qPCR siklleri geçirildi we KT gymmatlyklary Applied Biosystems Quantstudio 5 real wagt PCR guraly (384-guýuly modul; önüm # A28135) arkaly ölçeldi. Taqman praýmerleri Thermo (GAPDH (Ss03375629_u1), PARP12 (Ss06908795_m1), PKDCC (Ss06903874_m1), CYGB (Ss06900188_m1), RGL1 (Ss06868890_m1), ACTN1 (Ss01009508_mH), GATA4 (Ss03383805_u1), GJA1 (Ss03374839_u1), COL1A2 (Ss03375009_u1), COL3A1 (Ss04323794_m1), ACTA2 (Ss04245588_m1) kompaniýalaryndan satyn alyndy. Ähli nusgalaryň KT gymmatlyklary GAPDH öý hojalyk genine kadalaşdyryldy.
NT-ProBNP-niň mediada ýaýradylmagy öndürijiň protokolyna laýyklykda NT-ProBNP toplumy (doňuz) (Kat. № MBS2086979, MyBioSource) arkaly bahalandyryldy. Gysgaça aýdylanda, her bir guýuja iki gezek her nusgadan we standartdan 250 µl goşuldy. Nusga goşulandan derrew soň, her guýuja 50 µl synag reagent A goşuň. Plastinkany ýuwaşlyk bilen silkäň we germetik bilen ýapyň. Soňra tabletkalar 37°C-da 1 sagatlap inkubasiýa edildi. Soňra ergini soruň we guýulary 350 µl 1X ýuwujy ergin bilen 4 gezek ýuwuň, her gezek ýuwujy ergini 1-2 minutlap inkubasiýa ediň. Soňra her guýuja 100 µl synag reagent B goşuň we plastinka germetik bilen ýapyň. Tabletka ýuwaşlyk bilen silkäldi we 37°C-da 30 minutlap inkubasiýa edildi. Ergini soruň we guýulary 350 µl 1X ýuwujy ergin bilen 5 gezek ýuwuň. Her guýuja 90 µl substrat erginini goşuň we plastinkany ýapyň. Plastinany 37°C-de 10-20 minutlap inkubasiýa ediň. Her guýuja 50 µl Stop erginini goşuň. Plastinka derrew 450 nm-de oturdylan Cytation (BioTek) plastinka okaýjysy arkaly ölçeldi.
Parametrde 10% absolýut üýtgeşmäni 5% I görnüşli ýalňyşlyk derejesi bilen anyklamak üçin >80% güýç üpjün etjek toparyň ölçeglerini saýlamak üçin güýç seljermeleri geçirildi. Parametrde 10% absolýut üýtgeşmäni 5% I görnüşli ýalňyşlyk derejesi bilen ýüze çykarmak üçin >80% güýç üpjün etjek toparyň ölçeglerini saýlamak üçin güýç seljermeleri geçirildi. Аназ мощности был выполнен для выбора размеров группасы, кот че обеспечат> 80% мощности для обнаружения 10% абсолтного изменения Параметра с 5% частотой сихибок чипа I. I görnüşli ýalňyşlyk derejesi 5% bolan 10% absolýut parametr üýtgeşmesini anyklamak üçin >80% güýç üpjün etjek topar ölçeglerini saýlamak üçin güýç seljermesi geçirildi.进行功效分析以选择将提供> 80 ％功效以检测参数中 10 ％绝对变化和 5 ％ I 型错误率的组大小。进行功效分析以选择将提供> 80 ％功效以检测参数中 10 ％绝对变化和 5 ％ I 型错误率的组大小。 Был проекты 10% absolýut parametr üýtgeşmesini we 5% I görnüşli ýalňyşlyk derejesini anyklamak üçin >80% güýç üpjün etjek toparyň ululygyny saýlamak üçin güýç seljermesi geçirildi.Eksperimentden öň dokumalaryň bölekleri tötänleýin saýlanyldy. Ähli analizler şertli däldi we nusgalar diňe ähli maglumatlar seljerilenden soň dekodlandy. Ähli statistik analizleri geçirmek üçin GraphPad Prism programma üpjünçiligi (San-Diego, Kaliforniýa) ulanyldy. Ähli statistikalar üçin p-bahalary <0.05 bahalarynda möhüm hasaplandy. Ähli statistikalar üçin p-bahalary <0.05 bahalarynda möhüm hasaplandy. Для всей стати пи-значения сититались значимыми при значениях <0,05. Ähli statistikalar üçin p-bahalary <0.05 bahalarynda möhüm hasaplandy.对于所有统计数据， p 值在值 <0.05 时被认为是显着的。对于所有统计数据， p 值在值 <0.05 时被认为是显着的。 Для всей стати пи-значения сититались значимыми при значениях <0,05. Ähli statistikalar üçin p-bahalary <0.05 bahalarynda möhüm hasaplandy.Iki taraply Studentiň t-testi maglumatlarda diňe 2 deňeşdirme bilen geçirildi. Birnäçe toparlaryň arasyndaky ähmiýeti kesgitlemek üçin bir taraply ýa-da iki taraply ANOVA ulanyldy. Post-hoc synaglary geçirilende, köp sanly deňeşdirmeleri hasaba almak üçin Tukeýiň düzedişi ulanyldy. Usullar bölüminde beýan edilişi ýaly, FDR we p.adjust hasaplananda RNAsec maglumatlarynyň aýratyn statistik garaýyşlary bar.
Okuw dizaýny barada has giňişleýin maglumat üçin şu makala bilen baglanyşykly Tebigy barlag hasabatynyň gysgaça mazmunyna serediň.