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薬物試験において、心臓の生理的環境を正確に再現できる信頼性の高いin vitroシステムが求められています。ヒト心臓組織培養システムの利用可能性が限られているため、心臓に対する薬物効果の解釈が不正確になるという問題がありました。そこで、我々は心臓スライスを電気機械的に刺激し、心周期の収縮期と拡張期に生理的な伸展を起こさせる心臓組織培養モデル（CTCM）を開発しました。12日間の培養後、この手法は心臓切片の生存率を部分的に改善しましたが、構造的完全性を完全に維持することはできませんでした。そこで、低分子スクリーニングを行った結果、培地に100 nMのトリヨードチロニン（T3）と1 μMのデキサメタゾン（Dex）を添加することで、切片の微細構造を12日間維持できることが分かりました。T3/Dex処理と組み合わせることで、CTCMシステムは転写プロファイル、生存率、代謝活性、および構造的完全性を新鮮な心臓組織と同レベルで12日間維持することができました。さらに、培養心臓組織の過度の伸展は肥大性心臓シグナルを誘導し、CTCMが心臓伸展によって誘発される肥大状態を模倣する能力があることを示唆している。結論として、CTCMは長期間にわたって培養心臓の生理機能および病態生理をモデル化することができ、信頼性の高い薬剤スクリーニングを可能にする。
臨床研究に先立ち、ヒトの心臓の生理的環境を正確に再現できる信頼性の高いin vitroシステムが必要である。このようなシステムは、機械的伸展の変化、心拍数、および電気生理学的特性を模倣する必要がある。動物モデルは心臓生理学のスクリーニングプラットフォームとして一般的に使用されているが、ヒトの心臓における薬剤の効果を反映する信頼性は限られている1,2。究極的には、理想的な心臓組織培養実験モデル（CTCM）は、さまざまな治療的および薬理学的介入に対して非常に感度が高く特異的であり、ヒトの心臓の生理学および病態生理学を正確に再現するモデルである3。このようなシステムがないと、心不全の新しい治療法の発見が制限され4,5、薬剤の心毒性が市場からの撤退の主な理由となっている6。
過去 10 年間で、QT 間隔延長を引き起こし、心室性不整脈や突然死につながるため、8 種類の非心血管系薬剤が臨床使用から撤退しました 7。そのため、心血管系の有効性と毒性を評価するための信頼性の高い前臨床スクリーニング戦略の必要性が高まっています。薬剤スクリーニングおよび毒性試験におけるヒト誘導多能性幹細胞由来心筋細胞 (hiPS-CM) の最近の使用は、この問題に対する部分的な解決策を提供します。しかし、hiPS-CM の未成熟な性質と心臓組織の多細胞複雑性の欠如は、この方法の大きな制限です。最近の研究では、自発収縮の開始直後に初期の hiPS-CM を使用して心臓組織ハイドロゲルを形成し、時間の経過とともに徐々に電気刺激を増加させることで、この制限を部分的に克服できることが示されています。しかし、これらの hiPS-CM マイクロ組織は、成人心筋の成熟した電気生理学的特性と収縮特性を欠いています。さらに、ヒトの心臓組織はより複雑な構造を持ち、内皮細胞、ニューロン、間質線維芽細胞など、さまざまな細胞型が混在し、特定の細胞外マトリックスタンパク質によって相互に連結されています。成体哺乳類の心臓におけるこのような非心筋細胞集団の多様性11,12,13は、個々の細胞型を用いて心臓組織をモデル化する上で大きな障壁となっています。これらの大きな制約は、生理的および病理的条件下で無傷の心筋組織を培養する方法を開発することの重要性を強調しています。
培養したヒト心臓の薄切片（300 µm）は、ヒト心筋の完全なモデルとして有望であることが証明されています。この方法により、ヒト心臓組織に類似した完全な 3D 多細胞システムにアクセスできるようになります。しかし、2019 年までは、培養心臓切片の使用は、培養生存期間が短い（24 時間）ことによって制限されていました。これは、物理的機械的な伸展の欠如、気液界面、心臓組織のニーズをサポートしない単純な培地の使用など、多くの要因によるものです。2019 年に、いくつかの研究グループが、心臓組織培養システムに機械的要因を組み込むことで、培養寿命を延ばし、心臓の発現を改善し、心臓病理を模倣できることを示しました。2 つの優れた研究 17 および 18 は、培養中に一軸機械的負荷が心臓表現型にプラスの効果をもたらすことを示しています。しかし、これらの研究では、心臓切片に等尺性引張力17または線形等張性負荷18のいずれかを負荷したため、心臓周期の動的な三次元物理機械的負荷は使用されていませんでした。これらの組織伸展法は、多くの心臓遺伝子の抑制または異常な伸展反応に関連する遺伝子の過剰発現をもたらしました。注目すべきことに、Pitoulisら19は、力変換器フィードバックと張力駆動を使用して心臓周期を再構築するための動的な心臓切片培養バスを開発しました。このシステムは、より正確なin vitro心臓周期モデリングを可能にしますが、この方法の複雑さとスループットの低さにより、このシステムの適用は制限されます。私たちの研究室は最近、電気刺激と最適化された培地を使用して、ブタとヒトの心臓組織の切片の生存率を最大6日間維持する簡略化された培養システムを開発しました20,21。
本稿では、体液性因子を組み込んだブタ心臓組織培養モデル（CTCM）について述べる。このモデルは、心周期中の三次元的な心臓生理機能と病態生理学的拡張を再現する。CTCMは、費用対効果が高く、中程度の処理能力を持つ心臓システムを提供することで、哺乳類の心臓の生理機能／病態生理を模倣し、前臨床薬物試験における薬物予測の精度をかつてないレベルまで高めることができる。
血行動態的機械的信号は、体外での心筋細胞機能の維持に重要な役割を果たします 22,23,24。本稿では、生理的周波数 (1.2 Hz、毎分 72 拍) で電気的刺激と機械的刺激の両方を誘発することにより、成人の心臓環境を模倣できる CTCM (図 1a) を開発しました。拡張期中の組織の過伸展を避けるため、3D プリンティング装置を使用して組織サイズを 25% 増加させました (図 1b)。C-PACE システムによって誘発される電気的ペーシングは、心周期を完全に再現するために、データ収集システムを使用して収縮期の 100 ms 前に開始するようにタイミングが調整されました。組織培養システムは、プログラム可能な空気圧アクチュエータ (LB Engineering、ドイツ) を使用して、柔軟なシリコーン膜を周期的に拡張し、上部チャンバー内の心臓スライスを拡張します。システムは圧力変換器を介して外部の空気ラインに接続されており、圧力（±1 mmHg）と時間（±1 ms）を正確に調整することが可能であった（図1c）。
a デバイスの培養チャンバー内の、青色で示されている 7 mm サポートリングに組織切片を取り付けます。培養チャンバーは、薄く柔軟なシリコン膜によって空気チャンバーから分離されています。漏れを防ぐために、各チャンバーの間にガスケットを配置します。デバイスの蓋には、電気刺激を提供するグラファイト電極が含まれています。 b 大型組織デバイス、ガイドリング、およびサポートリングの概略図。組織切片（茶色）は、デバイスの外縁の溝にガイドリングを配置した特大デバイス上に置かれます。ガイドを使用して、組織アクリル接着剤でコーティングされたサポートリングを心臓組織の切片の上に慎重に配置します。 c プログラム可能な空気圧アクチュエータ（PPD）によって制御される空気チャンバー圧力の関数としての電気刺激の時間を示すグラフ。圧力センサーを使用して電気刺激を同期するために、データ収集デバイスが使用されました。培養チャンバー内の圧力が設定された閾値に達すると、パルス信号が C-PACE-EM に送信され、電気刺激がトリガーされます。 d インキュベーター棚に置かれた 4 つの CTCM の画像。 4つのデバイスが空気圧回路を介して1つのPPDに接続され、止血弁に圧力センサーが挿入されて空気圧回路内の圧力を監視する。各デバイスには6つの組織切片が含まれている。
単一の空気圧アクチュエータを使用して、それぞれが 6 つの組織切片を保持できる 4 つの CTCM デバイスを制御することができました (図 1d)。CTCM では、空気室の空気圧が流体室の同期圧力に変換され、心臓切片の生理的拡張を誘発します (図 2a および補足動画 1)。80 mm Hg での組織伸展の評価。Art. では、組織切片が 25% 伸展していることが示されました (図 2b)。この伸展率は、正常な心臓切片の収縮性の場合、生理的サルコメア長 2.2～2.3 µm に相当することが示されています 17,19,25。カスタム カメラ設定を使用して組織の動きを評価しました (補足図 1)。組織の動きの振幅と速度 (図 2c、d) は、心周期中の伸展と収縮期および拡張期の時間に対応しています (図 2b)。培養中の収縮および弛緩時の心筋組織の伸展と速度は、12 日間一定のままであった (図 2f)。培養中の収縮性に対する電気刺激の影響を評価するために、シェーディング アルゴリズムを使用して能動的変形を決定する方法を開発し (補足​​図 2a、b)、電気刺激の有無による変形を区別することができた。心臓の同じセクション (図 2f)。切断部の可動領域 (R6-9) では、電気刺激中の電圧は電気刺激がない場合よりも 20% 高く、これは電気刺激が収縮機能に寄与していることを示している。
空気室圧力、流体室圧力、および組織の動きの測定の代表的なトレースは、室圧力が流体室圧力を変化させ、それに応じて組織切片が動くことを確認しています。 b 伸長率 (オレンジ) に対応する組織切片の伸長率 (青) の代表的なトレース。 c 心臓切片の測定された動きは、測定された動きの速度と一致しています。 (d) 心臓切片における周期的な動き (青線) と速度 (オレンジの点線) の代表的な軌跡。 e サイクル時間 (n = 19 切片/グループ、異なるブタ由来)、収縮時間 (n = 19 切片/グループ、異なるブタ由来)、組織の動き (n = 25 切片/グループ、異なるブタ由来)、収縮期ピーク速度 (n = 24 (D0)、25 (D12) 切片/グループ、異なるブタ由来)、および弛緩期ピーク速度 (n = 24 (D0)、25 (D12) 切片/グループ、異なるブタ由来) の定量化。両側t検定では、どのパラメータにも有意差は認められなかった。f 電気刺激あり（赤）と電気刺激なし（青）の組織切片の代表的な歪み解析トレース。同じ切片から抽出した10の領域を示す。下部のパネルは、異なる切片の10の領域における、電気刺激ありとなしの組織切片の歪みのパーセント差の定量化を示す。 (n = 異なる豚から採取した8枚のスライス/グループ、両側t検定を実施。****p < 0.0001、**p < 0.01、*p < 0.05)。 (n = 異なる豚から採取した8枚のスライス/グループ、両側t検定を実施。****p < 0.0001、**p < 0.01、*p < 0.05)。 (n = 8 срезов/группу от разных свиней, проводится двусторонний t-критерий Стьюдента; ****p<0,0001、**p<0,01、*p<0,05)。 (n = 異なる豚からの8つのセクション/グループ、両側スチューデントt検定; ****p<0.0001、**p<0.01、*p<0.05)。 （n = 8 枚/グループ、異なるブタ由来、双尾動物試験を実施；****p < 0.0001、**p < 0.01、*p < 0.05）。 （n = 8 枚/グループ、異なるブタ由来、双尾動物試験を実施；****p < 0.0001、**p < 0.01、*p < 0.05）。 (n = 8 срезов/группу, от разных свиней, двусторонний критерий Стьюдента; ****p <0,0001、**p <0,01、*p <0,05)。 (n = 8 セクション/グループ、異なる豚由来、両側スチューデント t 検定; ****p<0.0001、**p<0.01、*p<0.05)。誤差範囲は平均値±標準偏差を表します。
以前の静的生体模倣心臓スライス培養システム [20, 21] では、電気刺激を適用し培地組成を最適化することにより、心臓スライスの生存率、機能、および構造的完全性を 6 日間維持しました。しかし、10 日後にはこれらの数値は急激に低下しました。以前の静的生体模倣培養システム 20, 21 で培養した切片をコントロール条件 (Ctrl) とし、以前に最適化した培地を MC 条件として使用し、機械的刺激と電気的刺激を同時に与えた (CTCM) で培養します。まず、電気刺激なしの機械的刺激では、組織の生存率を 6 日間維持するには不十分であることがわかりました (補足図 3a,b)。興味深いことに、STCM を使用した生理学的および電気的刺激を導入すると、MTT 分析で示されるように、12 日後の心臓切片の生存率は MS 条件下では新鮮な心臓切片と同じでしたが、Ctrl 条件下ではそうではありませんでした (図 1)。3a)。これは、機械的刺激と心周期のシミュレーションにより、組織切片を以前の静的培養システムで報告されたよりも2倍長く生存させることができることを示唆しています。しかし、心筋トロポニンTとコネキシン43の免疫標識による組織切片の構造的完全性の評価では、12日目のMC組織におけるコネキシン43の発現は、同日のコントロールよりも有意に高いことが示されました。しかし、均一なコネキシン43の発現とZディスクの形成は完全には維持されませんでした（図3b）。私たちは、人工知能（AI）フレームワークを使用して組織の構造的完全性を定量化26、トロポニンTとコネキシン染色に基づく画像ベースの深層学習パイプライン43を使用して、心臓切片の構造的完全性と蛍光を局在の強度の観点から自動的に定量化します。この方法は、参照文献に記載されているように、畳み込みニューラルネットワーク（CNN）と深層学習フレームワークを使用して、心臓組織の構造的完全性を自動的かつバイアスのない方法で確実に定量化します。 26. MC組織は、静的対照切片と比較して、0日目との構造的類似性が向上した。さらに、マッソントリクローム染色により、培養12日目のMS条件下では、対照条件と比較して線維化の割合が有意に低いことが明らかになった（図3c）。CTCMは、12日目の心臓組織切片の生存率を新鮮な心臓組織と同程度のレベルまで高めたが、心臓切片の構造的完全性は有意に改善しなかった。
棒グラフは、新鮮な心臓切片（D0）または静置培養（D12 Ctrl）もしくはCTCM（D12 MC）で12日間培養した心臓切片のMTT生存率の定量化を示しています（異なるブタ由来の切片18枚（D0）、15枚（D12 Ctrl）、12枚（D12 MC）/グループ、一元配置分散分析を実施。####p < 0.0001はD0と比較して有意差あり、**p < 0.01はD12 Ctrlと比較して有意差あり）。 棒グラフは、新鮮な心臓切片（D0）または静置培養（D12 Ctrl）もしくはCTCM（D12 MC）で12日間培養した心臓切片のMTT生存率の定量化を示しています（異なるブタ由来の切片18枚（D0）、15枚（D12 Ctrl）、12枚（D12 MC）/グループ、一元配置分散分析を実施。####p < 0.0001はD0と比較して有意差あり、**p < 0.01はD12 Ctrlと比較して有意差あり）。ヒストグラムは、MTT 新鮮な心臓切片 (D0) または静的培養 (D12 コントロール) または CTCM (D12 MC) で 12 日間培養した心臓切片の生存率の定量化を示しています (n = 18 (D0)、15 (D12 コントロール) ）」」」）」）」 ）」）」 ）」）」 打）」 打）」 打）」 打）」 ―）」 打）」 打）」 ―）」 ―）」 打）」打打打打打打）」打打打打）」打打打打）」 ―打）」打）」 ―打）」打打打打通り####p < 0,0001 по сравнению с D0 または **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl)。 ####p < 0.0001（D0との比較）、**p < 0.01（D12 Ctrlとの比較）。 静的培養（D12 Ctrl）またはCTCM（D12 MC）（n = 18（D0）、15（D12 Ctrl）中の新しい心脛切片（D0）または心芬切片培養12天のMTTの生存量の量化）を示す、異なるブタ12（D12 MC）由来の帯状図。切片／組織について、単方向分散分析を行った；Ｄ０との比較、＃＃＃ｐ＜０．０００１、Ｄ１２ Ｃｔｒｌとの比較、**ｐ＜０．０１）。 静的培養 (D12 Ctrl) または CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0)、15 (D12 Ctrl) 中の新しい心脏切片 (D0) 、異なる雄豚からの 12 (D12 MC) 切片 / 集団での単一方向分散分析を示す縞模様の図試験；D0 との比較、####p < 0.0001、D12 Ctrl との比較、**p。)新鮮な心臓切片（D0）または静的培養で12日間培養した心臓切片（D12コントロール）またはCTCM（D12 MC）におけるMTT生存率の定量化を示すヒストグラム（n = 18（D0）、15（D12コントロール））、異なるブタからの12（D12 MC）切片/グループ、一元配置分散分析検定。####p < 0,0001 по сравнению с D0、**p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl)。 ####p < 0.0001（D0との比較）、**p < 0.01（D12 Ctrlとの比較）。b 新鮮に分離した心臓切片（D0）、または静的条件下（Ctrl）もしくはCTCM条件下（MC）で12日間培養した心臓切片におけるトロポニンT（緑）、コネキシン43（赤）、およびDAPI（青）の代表的な免疫蛍光画像（ブランクスケール＝100µm）。 人工知能による心臓組織の構造的完全性の定量化（n = 7（D0）、7（D12 Ctrl）、5（D12 MC）スライス/グループ、それぞれ異なるブタから、一元配置分散分析を実施。####p < 0.0001（D0と比較）、****p < 0.0001（D12 Ctrlと比較）。 人工知能による心臓組織の構造的完全性の定量化（n = 7（D0）、7（D12 Ctrl）、5（D12 MC）スライス/グループ、それぞれ異なるブタから、一元配置分散分析を実施。####p < 0.0001はD0と比較、****p < 0.0001はD12 Ctrlと比較）。 Количественная оценка структурной целостности сердечной ткани искусственным интеллектом (n = 7 (D0)、7 (D12 Ctrl)、5 (D12 MC) срезов/групп от разных свиней, проводится однофакторный тест ANOVA; ####p < 0,0001 по сравнению с D0 и ****p < 0,0001 по最高 D12 Ctrl) 人工知能による心臓組織の構造的完全性の定量化（異なるブタからのn = 7（D0）、7（D12 Ctrl）、5（D12 MC）のセクション/グループ、一元配置分散分析を実施；####p < 0.0001（D0との比較）、****p < 0.0001（D12 Ctrlとの比較）。人工知能化心臓組織の構造の完全性（異なるブタの各グループ当たり n = 7 (D0)、7 (D12 Ctrl)、5 (D12 MC) スライス、一元配置 ANOVA 検定;####p < 0.0001 対 D0 相対比、****p < 0.0001 対 D12 Ctrl 相対比)。人工知能化心臓組織構造の完全性（n = 7 (D0)、7 (D12 Ctrl)、5 (D12 MC) スライス/グループ、それぞれ異なるブタ、一元配置分散分析試験;####p < 0.0001 と D0 の比較、****p < 0.0001 と D12 Ctrl の比較)。 Искусственный интеллект для количественной оценки структурной целостности сердечной ткани (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) срезов/группу каждой из разных свиней, односторонний тест ANOVA; ####p <0,0001 vs. D0 Для сравнения ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl)。 人工知能による心臓組織の構造的完全性の定量化（n = 7（D0）、7（D12 Ctrl）、5（D12 MC）セクション/グループ、それぞれ異なるブタ、一元配置分散分析検定；####p<0.0001 vs. D0 比較の場合 ****p < 0.0001、D12 Ctrlと比較）。 c マッソントリクローム染色を施した心臓切片の代表的な画像（左）と定量化（右）（スケールバー＝500 µm）（n＝異なるブタから各グループ10枚の切片、一元配置分散分析を実施；####p < 0.0001はD0と比較、***p < 0.001はD12 Ctrlと比較）。 c マッソントリクローム染色を施した心臓切片の代表的な画像（左）と定量化（右）（スケールバー＝500 µm）（n = 異なるブタから各グループ10枚の切片、一元配置分散分析を実施；#### p < 0.0001はD0と比較、***p < 0.001はD12 Ctrlと比較）。 c Репрезентативные изображения (слева) и количественная оценка (справа) срезов сердца, окразенных трихромным красителем Массона (маслняется односторонний) (n = 10 срезов/группу от разных свиней, выполняется односторонний)分散分析 #### p < 0,0001 по сравнению с D0 または ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl)。 c マッソントリクローム染色を施した心臓切片の代表的な画像（左）と定量化（右）（非コーティングスケール＝500 µm）（n＝異なるブタ由来の10切片/グループ、一元配置分散分析を実施；#### p < 0.0001はD0と比較、***p < 0.001はD12 Ctrlと比較）。 c マッソン三色染料で染色した心臓切片の代表的な画像（左）と量化（右）（尺度= 500 μm）（n = 10 枚/組、各組は異なるブタからのものであり、単方向分散分析を行った。#### p < 0.0001 と D0相対比、***p < 0.001 と D12 Ctrl の相対比）。 C マッソン三色染料を使用した心脏切片の代表性 （左 左） 量化 （右） 裸度尺度 裸尺度 裸尺度 = 500 μm） （n = 10 枚の切片群を異なる猪から単方向分散分析したもの）試験；#### p < 0.0001 と D0 の比較、***p < 0.001 と D12 Ctrl の比較）。 c Репрезентативные изображения (слева) и количественный анализ (справа) срезов сердца, окразенных трихромным красителем Массона (чистая зкала = 500 мкм) (n = 10 срезов/группа, каждый от другой свиньи, протестировано с помощью однофакторного дисперсионного анализа ;### #p < 0,0001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl)。 c マッソントリクローム染色を施した心臓切片の代表的な画像（左）と定量化（右）（ブランク＝500 µm）（n＝10切片/グループ、それぞれ異なるブタ由来、一元配置分散分析により検定；### # p < 0.0001（D0と比較）、***p < 0.001（D12 Ctrlと比較）。誤差範囲は平均値±標準偏差を表します。
我々は、培養培地に低分子化合物を加えることで、CTCM培養中の心筋細胞の完全性を改善し、線維化の発生を抑制できると仮説を立てた。そのため、交絡因子が少ない静的コントロール培養20,21を用いて低分子化合物のスクリーニングを行った。このスクリーニングには、デキサメタゾン（Dex）、トリヨードチロニン（T3）、およびSB431542（SB）を選択した。これらの低分子化合物は、サルコメア長、T細管、および伝導速度を増加させることで心筋細胞の成熟を誘導するために、これまでhiPSC-CM培養で使用されてきた。さらに、Dex（グルココルチコイド）とSBはともに炎症を抑制することが知られている29,30。そこで、これらの低分子化合物の1つまたは組み合わせを添加することで、心臓切片の構造的完全性が改善されるかどうかを検証した。初期スクリーニングでは、各化合物の投与量は、細胞培養モデルで一般的に使用される濃度（1 μM Dex27、100 nM T327、および 2.5 μM SB31）に基づいて選択されました。12 日間の培養後、T3 と Dex の組み合わせにより、最適な心筋細胞の構造的完全性と最小限の線維性リモデリングが実現しました（補足図 4 および 5）。さらに、これらの濃度の 2 倍または 2 倍の T3 および Dex を使用すると、通常の濃度と比較して有害な影響が生じました（補足図 6a、b）。
初期スクリーニングの後、4 つの培養条件を直接比較しました (図 4a): Ctrl: 最適化した培地を使用して、以前に説明した静的培養で培養した心臓切片。20.21 TD: Ctrl s に水曜日に Dex を追加。MC: 以前に最適化した培地を使用して CTCM で培養した心臓切片。MT: CTCM に T3 と Dex を追加した培地。12 日間の培養後、MS および MT 組織の生存率は、MTT アッセイで評価した新鮮な組織と同じままでした (図 4b)。興味深いことに、トランスウェル培養 (TD) に T3 と Dex を追加しても、Ctrl 条件と比較して生存率が大幅に改善されなかったため、心臓切片の生存率を維持するには機械的刺激が重要な役割を果たしていることが示されました。
機械的刺激とT3/Dex補給が培地に及ぼす影響を12日間評価するために使用した4つの培養条件を示す実験計画図。 b 棒グラフは、新鮮な心臓スライス（D0）と比較した、培養後12日目の生存率の定量化を4つの培養条件（Ctrl、TD、MC、およびMT）すべてについて示しています（n = 18（D0）、15（D12 Ctrl、D12 TDおよびD12 MT）、12（D12 MC）スライス/グループ、異なるブタ由来、一元配置分散分析を実施。####p < 0.0001、###p < 0.001はD0と比較、**p < 0.01はD12 Ctrlと比較）。 b 棒グラフは、新鮮な心臓スライス（D0）と比較した、培養後12日目の4つの培養条件（Ctrl、TD、MC、およびMT）すべての生存率の定量化を示しています（n = 18（D0）、15（D12 Ctrl、D12 TDおよびD12 MT）、12（D12 MC）スライス/グループ、異なるブタ由来、一元配置分散分析を実施。####p < 0.0001、###p < 0.001はD0と比較、**p < 0.01はD12 ctrlと比較）。 b Гистограмма показывает количественную оценку жизнеспособности через 12 dayней после культивирования во всех 4 условиях культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD) и D12 MT)、12 (D12 MC) срезов/группу от разных свиней, проводится односторонний тест ANOVA; ####p < 0,0001、###p < 0,001 по сравнению с D0 または **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl)。 b 棒グラフは、新鮮な心臓切片（D0）と比較した、培養後12日目の4つの培養条件（コントロール、TD、MC、およびMT）すべての生存率の定量化を示しています（n = 18（D0）、15（D12 Ctrl、D12 TD、およびD12 MT）、12（D12 MC）切片/グループ、異なるブタ、一元配置分散分析検定；####p < 0.0001、###p < 0.001 vs. D0、**p < 0.01 vs. D12 Ctrl）。 b ストライプ図は、4 つの培養条件すべて (Ctrl、TD、MC、MT) と新しい心臓切片 (D0) (n = 18 (D0)、15 (D12 Ctrl、D12 TD および D12 MT)、異なる雄牛の 12 (D12 MC) 切片/群からの単一方向分散分析を示しています)試験；####p < 0.0001、###p < 0.001 と D0 の比較、**p < 0.01 と D12 制御）。b 4 12 (D12 MC) b Гистограмма, показывающая все 4 условия культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD и D12 MT), от разных свиней 12 (D12 MC) срезы/группа, односторонний тест ANOVA; ####p <0,0001、###p <0,001 по сравнению с D0, **p <0,01 по сравнению с контролем D12)。 b 4つの培養条件（コントロール、TD、MC、MT）すべてを新鮮な心臓切片（D0）と比較したヒストグラム（n = 18（D0）、15（D12 Ctrl、D12 TD、D12 MT）、異なるブタ12（D12 MC）切片/グループ、一元配置分散分析検定；####p<0.0001、###p<0.001 vs. D0、**p<0.01 vs. コントロールD12）。 c 棒グラフは、新鮮な心臓スライス（D0）と比較した、培養後12日目の4つの培養条件（Ctrl、TD、MC、およびMT）におけるグルコースフラックスの定量化を示しています（n = 6スライス/グループ、異なるブタ由来、一元配置分散分析を実施。###p < 0.001、D0と比較、***p < 0.001、D12 Ctrlと比較）。 c 棒グラフは、新鮮な心臓スライス（D0）と比較した、培養後12日目の4つの培養条件（Ctrl、TD、MC、およびMT）におけるグルコースフラックスの定量化を示しています（n = 6スライス/グループ、異なるブタ由来、一元配置分散分析を実施。###p < 0.001、D0と比較、***p < 0.001、D12 Ctrlと比較）。 c Гистограмма показывает количественную оценку потока глюкозы через 12 dayней после культивирования во всех 4 условиях культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 6 срезов/группу от)ロシア、 односторонний Выполняется тест ANOVA; ###p < 0,001 по сравнению с D0 または ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl)。 c ヒストグラムは、新鮮な心臓切片（D0）と比較した、培養後12日目のグルコースフラックスの定量化を4つの培養条件（コントロール、TD、MC、MT）すべてについて示しています（n = 6切片/グループ、異なるブタ由来、一元配置分散分析を実施。###p < 0.001はD0と比較、***p < 0.001はD12コントロールと比較）。 c 棒グラフは、4 つのすべての培養条件 (Ctrl、TD、MC および MT) と新しい心臓切片 (D0) との比較、培養後の 12 日間のブドウ糖通量の定量化を示しています (n = 6 枚/群、異なるブタから、単方向分散分析を実行; ###p < 0.001、D0 との比較、***p < 0.001、D12 Ctrl との比較）。 C の線図は 4 つの条件すべてを示します ((ctrl 、 td 、 mc 、 mt) 新心経切片 切片 切片 比較、培養後 12 日の通量定量 (n = 6 枚/群、豚由来、 、 、 、 、 、 、ブタは単独で分散分析を実行した；###p < 0.001、D0 との比較、***p < 0.001、D12 Ctrl との比較）。 c Гистограмма, показывающая количественную оценку потока глюкозы через 12 dayней после культивирования для всех 4 условий культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 6 срезов/группа, от разных свиней、分散分析 (ANOVA) を実行します。 ###p < 0,001 по сравнению с D0、***p < 0,001 по сравнению с D12 (контроль)。 c 培養後 12 日におけるすべての 4 つの培養条件 (コントロール、TD、MC、および MT) のグルコースフラックスの定量化を示すヒストグラム。新鮮な心臓切片 (D0) と比較 (n = 6 切片/グループ、異なるブタ由来、片側)。ANOVA 検定を実施しました。###p < 0.001 (D0 と比較)、***p < 0.001 (D12 (コントロール) と比較)。d 新鮮組織（青）、12日目MC組織（緑）、および12日目MT組織（赤）の10の領域組織切片ポイントにおける歪み解析プロット（n = 4スライス/グループ、一元配置分散分析検定；グループ間に有意差はなかった）。 e 新鮮心臓切片（D0）と、静的条件下（Ctrl）またはMT条件下（MT）で10～12日間培養した心臓切片との比較における、発現差のある遺伝子を示すボルケーノプロット。 f 各培養条件下で培養した心臓切片のサルコメア遺伝子のヒートマップ。エラーバーは平均±標準偏差を表す。
脂肪酸酸化から解糖への代謝的切り替えへの依存は、心筋細胞の脱分化の特徴である。未成熟心筋細胞は主にグルコースをATP産生に利用し、クリステが少ない低形成ミトコンドリアを有する5,32。グルコース利用分析では、MCおよびMT条件下では、グルコース利用は0日目の組織と同様であることが示された（図4c）。しかし、Ctrlサンプルでは、​​新鮮組織と比較してグルコース利用が有意に増加した。これは、CTCMとT3/Dexの組み合わせが組織の生存率を高め、12日間培養した心臓切片の代謝表現型を維持することを示している。さらに、歪み分析では、MTおよびMS条件下で12日間、歪みレベルは新鮮心臓組織と同じままであることが示された（図4d）。
CTCMとT3/Dexが心臓切片組織の全体的な転写ランドスケープに及ぼす影響を分析するために、4つの異なる培養条件すべてから得られた心臓切片に対してRNAseqを実施しました（補足データ1）。興味深いことに、MT切片は新鮮な心臓組織と高い転写類似性を示し、13,642個の遺伝子のうち差次的発現を示したのはわずか16個でした。しかし、先に示したように、Ctrl切片は培養10～12日後に1229個の差次的発現遺伝子を示しました（図4e）。これらのデータは、心臓および線維芽細胞遺伝子のqRT-PCRによって確認されました（補足図7a-c）。興味深いことに、Ctrl切片は心臓および細胞周期遺伝子のダウンレギュレーションと炎症遺伝子プログラムの活性化を示しました。これらのデータは、通常長期培養後に起こる脱分化がMT条件下では完全に抑制されることを示唆しています（補足図8a、b）。サルコメア遺伝子の詳細な研究により、MT条件下でのみサルコメア（図4f）およびイオンチャネル（補足図9）をコードする遺伝子が維持され、Ctrl、TD、およびMC条件下での抑制から保護されることが示された。これらのデータは、機械的刺激と体液性刺激（T3/Dex）の組み合わせにより、心臓切片のトランスクリプトームが培養12日後も新鮮な心臓切片と同様の状態を維持できることを示している。
これらの転写解析結果は、心臓切片中の心筋細胞の構造的完全性が、MT条件下で12日間最も良好に維持されるという事実によって裏付けられています（図5a）。これは、コネキシン43が損傷を受けずに局在していることから明らかです。さらに、MT条件下での心臓切片の線維化は、対照群と比較して有意に減少し、新鮮な心臓切片と同程度でした（図5b）。これらのデータは、機械的刺激とT3/Dex処理の組み合わせが、培養中の心臓切片における心臓構造を効果的に維持することを示しています。
a 新鮮に分離した心臓切片（D0）または4つの心臓切片培養条件すべてで12日間培養した心臓切片における、トロポニンT（緑）、コネキシン43（赤）、およびDAPI（青）の代表的な免疫蛍光画像（スケールバー＝100 µm）。 人工知能による心臓組織の構造的完全性の定量化（n = 7（D0およびD12 Ctrl）、5（D12 TD、D12 MCおよびD12 MT）スライス/グループ、異なるブタ由来、一元配置分散分析を実施；####p < 0.0001はD0と比較して有意差あり、*p < 0.05、または****p < 0.0001はD12 Ctrlと比較して有意差あり）。 人工知能による心臓組織の構造的完全性の定量化（n = 7（D0およびD12 Ctrl）、5（D12 TD、D12 MCおよびD12 MT）スライス/グループ、異なるブタ由来、一元配置分散分析を実施；#### p < 0.0001（D0と比較）、*p < 0.05、または****p < 0.0001（D12 Ctrlと比較）。 Количественная оценка структурной целостности ткани сердца с помощью искусственного интеллекта (n = 7 (D0 и D12) Ctrl)、5 (D12 TD、D12 MC および D12 MT) срезов/группу от разных свиней、проведен однофакторный тест ANOVA; #### p < 0,0001 по сравнению с D0 и *p < 0,05 ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl)。 人工知能を用いた心臓組織の構造的完全性の定量化（異なるブタ由来のn = 7（D0およびD12 Ctrl）、5（D12 TD、D12 MCおよびD12 MT）セクション/グループ、一元配置分散分析を実施；#### p < 0.0001はD0と比較、*p < 0.05または****p < 0.0001はD12 Ctrlと比較）。異なる猪の心臓組織構造の完全性（n = 7（D0 および D12 Ctrl）、5（D12 TD、D12 MC および D12 MT）切片/組）に対して、手動智能量化を実行し、一方向分散分析を実行；#### p < 0.0001 および D0 (*p < 0.05 相対比、または ***p < 0.0001 と D12 Ctrl 相対比)。異なる猪の心脏構造の完全性 (n = 7 (d0 および d12 ctrl) (5 (d12 td 、 d12 mc および d12 mt) 組） 人工智能量化進行 单方向 单方向 测试 ; ########## p < 0.0001 と D0 および *p < 0.05 の比較、または ****p < 0.0001 と D12 Ctrl の比較）。人工知能を用いて、異なるブタ（n = 7（D0およびD12 Ctrl）、5（D12 TD、D12 MCおよびD12 MT）セクション/グループ）の心臓組織の構造的完全性を一元配置分散分析で定量化する。#### p < 0,0001 по сравнению с D0 и *p < 0,05 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl)。 #### p < 0.0001 (D0と比較)、*p < 0.05 または ****p < 0.0001 (D12 Ctrlと比較)。 b マッソントリクローム染色を施した心臓切片の代表的な画像と定量化（スケールバー = 500 µm）（n = 10（D0、D12 Ctrl、D12 TD、およびD12 MC）、9（D12 MT）の切片/グループ、異なるブタ由来、一元配置分散分析を実施；####p < 0.0001はD0と比較、***p < 0.001はD12 Ctrlと比較、****p < 0.0001）。 b マッソントリクローム染色を施した心臓切片の代表的な画像と定量化（スケールバー = 500 µm）（n = 10（D0、D12 Ctrl、D12 TD、およびD12 MC）、9（D12 MT）の切片/グループ、異なるブタ由来、一元配置分散分析を実施；####p < 0.0001はD0と比較、***p < 0.001はD12 Ctrlと比較、****p < 0.0001）。 b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окраленных трихромным красителем Массона (маслытабная линейка = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD и D12 MC), 9 (D12 MT) срезов/группу от разных свиней, выполняется односторонний分散分析; ####p < 0,0001 по сравнению с D0 または ***p < 0,001 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl)。 b マッソントリクローム染色を施した心臓切片の代表的な画像と定量化（スケールバー = 500 µm）（n = 10（D0、D12 Ctrl、D12 TD、D12 MC）、9（D12 MT）切片/グループ、異なるブタから、一元配置分散分析を実施；####p < 0.0001 vs. D0、***p < 0.001または****p < 0.0001 vs. D12 Ctrl）。 b マッソン三色染料で染色した心臓切片の代表的な画像と量化（比尺 = 500 μm）（n = 10（D0、D12 Ctrl、D12 TD および D12 MC）、異なる雄豚の 9 頭（D12 MT）切片/群からの単因方位差分析を実施；####p < 0.0001 と D0 の比較、***p < 0.001、または ***p < 0.0001 と D12 Ctrl の比較）。 b マッソン三色染料を使用した心脛切片の代表性と量化 （比寸法 = 500 μm） （n = 10 （d0 、 d12 ctrl 、 d12 td および d12 mc） 異なる 9 枚からの d12 mt 切片 切片 切片 切片 切片切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 / グループを対象に、要素方差分析を実行します；####p < 0.0001 対 D0 相対比、***p < 0.001、または ***p < 0.0001 対 D12 Ctrl 相対比）。 b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окраленных трихромом Массона (масbolичественная) линейка = 500 мкм) (n = 10 (D0、D12 Ctrl、D12 TD および D12 MC)、9 (D12 MT) срезов от разных свиней / группы, один- способ ANOVA; ####p < 0,0001 ポンドсравнению с D0、***p < 0,001 または ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl)。 b マッソントリクローム染色を施した心臓切片の代表的な画像と定量化（スケールバー = 500 µm）（n = 10（D0、D12 Ctrl、D12 TD、D12 MC）、9（D12 MT）の切片を異なるブタ/グループから採取、1つのANOVA法を使用。####p < 0.0001はD0と比較、***p < 0.001または****p < 0.0001はD12 Ctrlと比較）。誤差範囲は平均値±標準偏差を表します。
最後に、CTCMが心肥大を模倣する能力を、心筋組織の伸展を増加させることによって評価した。CTCMでは、ピーク空気室圧は80 mmHgから80 mmHg. Art.（正常伸展）から140 mmHg. Art.まで増加した（図6a）。これは伸展の32%増加に相当する（図6b）。これは、以前に心筋切片が肥大で見られるのと同様のサルコメア長を達成するために必要な対応する伸展率として示された。収縮および弛緩中の心筋組織の伸展と速度は、6日間の培養の間一定であった（図6c）。MT条件からの心筋組織を、6日間、正常伸展（MT（Normal））または過伸展条件（MT（OS））に曝露した。培養開始後4日目には、MT（OS）条件下の培地中の肥大バイオマーカーNT-proBNPがMT（normal）条件下と比較して有意に上昇していた（図7a）。さらに、培養6日後には、MT（OS）の細胞サイズ（図7b）はMT心臓（正常）の切片と比較して有意に増加した。また、NFATC4の核移行は過伸展組織で有意に増加した（図7c）。これらの結果は、過伸展後の病理学的リモデリングの進行を示しており、CTCM装置が伸展誘発性心肥大シグナル伝達の研究プラットフォームとして使用できるという概念を裏付けている。
空気室圧力、流体室圧力、および組織の動きの測定値の代表的なトレースは、室圧力が流体室圧力を変化させ、それに応じて組織切片が動くことを確認しています。 b 正常に伸展した (オレンジ) および過度に伸展した (青) 組織切片の代表的な伸展率と伸展速度の曲線。 c サイクル時間 (n = 19 切片/グループ、異なる豚由来)、収縮時間 (n = 18-19 切片/グループ、異なる豚由来)、弛緩時間 (n = 19 切片/グループ、異なる豚由来)、組織の動きの振幅 (n = 14 切片/グループ、異なる豚由来)、最大収縮速度 (n = 14 切片/グループ、異なる豚由来)、および最大弛緩速度 (n = 14 (D0)、15 (D6) ) 切片/グループ) を示す棒グラフ (異なる豚由来)、両側スチューデント t 検定では、いずれのパラメータにも有意差は見られず、これらのパラメータは過電圧での 6 日間の培養中一定であったことを示しています。誤差範囲は平均値±標準偏差を表します。
a MT正常伸展（Norm）または過伸展（OS）条件下で培養した心臓スライスの培養液中のNT-proBNP濃度を棒グラフで定量化（異なるブタ由来のn = 4（D2 MTNorm）、3（D2 MTOS、D4 MTNorm、およびD4 MTOS）スライス/グループ、二元配置分散分析を実施；**p < 0.01（正常伸展と比較）。 a MT正常伸展（Norm）または過伸展（OS）条件下で培養した心臓切片の培養液中のNT-proBNP濃度を棒グラフで定量化（n ​​= 4（D2 MTNorm）、3（D2 MTOS、D4 MTNorm、およびD4 MTOS）切片/グループ、異なるブタ由来、二元配置分散分析を実施；**p < 0.01、正常伸展と比較）。正常MT伸展（norm）または過伸展（OS）条件下で培養した心臓スライス（n = 4（D2 MTNorm）、3（D2 MTOS、D4 MTNorm、およびD4 MTOS）/グループ、異なるブタ由来）の培養培地中のNT-proBNP濃度の定量的ヒストグラム、2要因分散分析を実施。**p < 0,01 は сравнению с нормальным растяжением)。 （通常の伸展と比較してp < 0.01）。 a MT 正常伸長 (Norm) または過度伸長 (OS) 条件下で培養した心臓切片培養基における NT-ProBNP 濃度の縞状図量化（n = 4 (D2 MTNorm)、3 (D2 MTOS、D4 MTNorm および D4) MTOS）異なるブタの切片/集合から採取し、双方向差分析を実施；** 正常伸長との比較、p < 0.01）。 a MT ノーマルストレッチ (Norm) またはオーバーストレッチ (OS) 条件下で培養した心臓切片中の NT-ProBNP 濃度の定量化 (n = 4 (D2 MTNorm)、3 (D2 MTOS、D4 MTNorm および D4 MTOS)、異なる豚の切片/グループから、双方向に発行可能; **通常のストレッチと比較、p < 0.01)。ヒストグラム 正常MT伸展（norm）または過伸展（OS）条件下で培養した心臓スライス中のNT-proBNP濃度の定量化（n = 4（D2 MTNorm）、3（D2 MTOS、D4 MTNorm）およびD4 MTOS）異なるブタ由来のスライス/グループ、二元配置分散分析。**p < 0,01 は сравнению с нормальным растяжением)。 （通常の伸展と比較してp < 0.01）。 b トロポニンTとWGAで染色した心臓切片の代表的な画像（左）と細胞サイズの定量化（右）（異なるブタの10枚の異なる切片から、n = 330（D6 MTOS）、369（D6 MTNorm）細胞/グループ、両側スチューデントt検定を実施；****p < 0.0001（正常伸展と比較）。 b トロポニンTとWGAで染色した心臓切片の代表的な画像（左）と細胞サイズの定量化（右）（n = 330（D6 MTOS）、369（D6 MTNorm）細胞/グループ、異なるブタの10種類の切片から、両側スチューデントt検定を実施；****p < 0.0001、正常伸展と比較）。 b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрагенных тропонином-Т и АЗП (слева) и количественного определения размера клеток (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) клеток/группу из 10 разных срезов от разных свиней, два- проводится хвостовой t-критерий Стьюдента; ****p < 0,0001 は сравнению с нормальным растяжением)。 b トロポニンTとAZPで染色した心臓切片の代表的な画像（左）と細胞サイズの定量化（右）（異なるブタの10種類の切片から、グループあたり330個（D6 MTOS）、369個（D6 MTNorm）の細胞を採取し、両側スチューデントt検定を実施。****p < 0.0001は正常系統と比較）。 b 筋肉タンパク質-TおよびWGA（左）および細胞サイズ化（右）で染色した心臓切片の代表的な画像（n = 330（D6 MTOS）、異なる豚の10個の異なる切片からの369（D6 MTNorm）細胞/グループ、2つは尾学生を含む）検査；通常の伸長との比較、****p < 0.0001）。 b カルカレイン-TとWGAで染色した心臓切片の代表的な画像（左）と細胞サイズ（右）（n = 330（D6 MTOS）、10種類の切片から369（D6 MTNorm）） Cells/group，2方法有尾学生t検定；正常伸展と比較，****p < 0.0001）。 b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрагенных тропонином-Т и АЗП (слева) и количественная оценка размера клеток (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) из 10 различных срезов от разных свиней Клетки/группа, двусторонние критерий Стьюдента; ****p < 0,0001 は сравнению с нормальным растяжением)。 b トロポニンTとAZPで染色した心臓切片の代表的な画像（左）と細胞サイズの定量化（右）（異なるブタの10の異なる切片からn = 330（D6 MTOS）、369（D6 MTNorm））細胞数/グループ、両側検定基準スチューデントt検定；****p < 0.0001（正常系統と比較）。 c 0日目と6日目のMTOS心臓切片の代表的な画像。トロポニンTとNFATC4で免疫標識し、NFATC4のCM核への移行を定量化した（n = 4（D0）、3（D6 MTOS）切片/グループ、異なるブタ由来、両側t検定を実施；*p < 0.05）。 c 0日目と6日目のMTOS心臓切片の代表的な画像。トロポニンTとNFATC4で免疫標識し、NFATC4のCM核への移行を定量化した（n = 4（D0）、3（D6 MTOS）切片/グループ、異なるブタ由来、両側t検定を実施；*p < 0.05）。 c Репрезентативные изображения для срезов сердца 0 и 6 dayней MTOS, иммуномеченых для тропонина-Т и NFATC4, и количественная оценка транслокации NFATC4 в ядра кавернозных клеток (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срезов/группу от разных Свиней , выполняется двусторонний t-критерий Стьюдента; *p < 0,05)。 c 0日目と6日目のMTOSにおける心臓切片の代表的な画像。トロポニンTとNFATC4で免疫染色し、海綿状細胞の核におけるNFATC4の転座を定量化した（n = 4（D0）、3（D6 MTOS）スライス/グループ、異なるブタ由来）。両側スチューデントt検定を実施；*p < 0.05）。 c 筋肉タンパク質-TおよびNFATC4免疫標識に使用される第0天および第6天MTOS心臓切片の代表的な画像、および異なるブタ由来のNFATC4のCM細胞核への容易な量化（n = 4（D0）、3（D6 MTOS）切片/組、双尾研究を実施）検査；*p < 0.05)。 c カルカニン T および NFATC4 免疫標識の 0 日目および 6 日目の MTOS 心臓スライス、および異なる NFATC4 からの NFATC4 の CM 細胞核への容易な定量化の代表的な画像 (n = 4 (D0)、3 (D6 MTOS) 切礼/組織、時間双尾学生電影；*p < 0.05)。 c Репрезентативные изображения срезов сердца MTOS на 0 и 6 день для иммуномаркировки тропонином-Т и NFATC4 и количественная оценка транслокации NFATC4 в ядра CM от разных свиней (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срез/группа, два- хвостатый t-критерий Стьюдента *p < 0.05) c 異なるブタの心筋細胞核におけるトロポニンTおよびNFATC4の免疫標識とNFATC4転座の定量化のための、0日目と6日目のMTOS心臓切片の代表的な画像（n = 4（D0）、3（D6 MTOS）切片/グループ、両側t基準スチューデント検定；*p < 0.05）。エラーバーは平均値±標準偏差を表します。
トランスレーショナルな心血管研究には、心臓環境を正確に再現する細胞モデルが不可欠です。本研究では、心臓の超薄切片を刺激できるCTCM装置を開発し、その特性を明らかにしました。CTCMシステムは、生理学的に同期した電気機械的刺激と、T3およびデキサメタゾンを含む液の添加から構成されています。ブタの心臓切片をこれらの因子に曝露したところ、12日間の培養後も、生存率、構造的完全性、代謝活性、および転写発現は新鮮な心臓組織と変わらず維持されました。さらに、心臓組織の過伸展は、過伸展による心臓肥大を引き起こす可能性があります。これらの結果は、正常な心臓表現型を維持する上で生理学的培養条件が重要な役割を果たすことを裏付けており、薬剤スクリーニングのための基盤を提供します。
心筋細胞の機能と生存に最適な環境を作り出すには、多くの要因が関与している。これらの要因の中で最も明白なものは、（1）細胞間相互作用、（2）電気機械的刺激、（3）体液性因子、および（4）代謝基質に関連するものである。生理的な細胞間相互作用には、細胞外マトリックスによって支えられた複数の細胞型からなる複雑な三次元ネットワークが必要となる。このような複雑な細胞間相互作用は、個々の細胞型を共培養することで試験管内で再現することは困難であるが、心臓切片の器官的性質を利用すれば容易に実現できる。
心筋細胞の機械的伸展と電気刺激は、心臓表現型の維持に不可欠である33,34,35。機械的刺激は、hi​​PSC-CMのコンディショニングと成熟に広く用いられてきたが、近年、培養中の心臓スライスに一軸負荷を用いて機械的刺激を与える試みがいくつか行われている。これらの研究では、2D一軸機械的負荷が培養中の心臓の表現型にプラスの効果をもたらすことが示されている。これらの研究では、心臓の切片に等尺性引張力17、線形等張性負荷18をかけるか、力変換器フィードバックと張力駆動を用いて心周期を再現した。しかし、これらの方法は環境最適化を行わずに一軸組織伸展を行うため、多くの心臓遺伝子の抑制や異常な伸展反応に関連する遺伝子の過剰発現を引き起こす。ここで説明するCTCMは、心拍周期と生理的伸展（伸展率25%、収縮期40%、拡張期60%、心拍数72回/分）において自然な心拍周期を模倣した3次元電気機械的刺激を提供する。この3次元機械的刺激だけでは組織の完全性を維持するには不十分であり、組織の生存能力、機能、および完全性を適切に維持するには、T3/Dexを用いた体液性刺激と機械的刺激の組み合わせが必要となる。
体液性因子は、成人の心臓表現型の調節において重要な役割を果たします。これは、細胞成熟を促進するために培養培地にT3とDexを添加したHiPS-CM研究で強調されました。T3は、細胞膜を介したアミノ酸、糖、カルシウムの輸送に影響を与える可能性があります36。さらに、T3はMHC-αの発現とMHC-βのダウンレギュレーションを促進し、胎児CMの遅筋線維と比較して、成熟心筋細胞における速筋線維の形成を促進します。甲状腺機能低下症患者におけるT3欠乏は、筋線維帯の喪失と緊張発達速度の低下をもたらします37。Dexはグルココルチコイド受容体に作用し、単離灌流心臓における心筋収縮力を増加させることが示されています38。この改善は、カルシウム沈着駆動型流入（SOCE）への影響に関連していると考えられています39,40。さらに、デキサメタゾンは受容体に結合し、免疫機能と炎症を抑制する広範な細胞内反応を引き起こします30。
我々の結果は、物理的機械的刺激（MS）が対照群と比較して培養全体のパフォーマンスを向上させたものの、12日間の培養において生存率、構造的完全性、および心臓発現を維持できなかったことを示している。対照群と比較して、CTCM（MT）培養にT3とDexを加えると、生存率が向上し、12日間新鮮な心臓組織と同様の転写プロファイル、構造的完全性、および代謝活性が維持された。さらに、組織の伸展度を制御することにより、STCMを使用して過伸展誘発性心肥大モデルが作成され、STCMシステムの汎用性が示された。心臓リモデリングと線維化は通常、循環細胞が適切なサイトカイン、貪食作用、およびその他のリモデリング因子を提供できる無傷の臓器に関与するが、心臓の切片はストレスや外傷に反応して線維化プロセスを模倣することができることに留意すべきである。筋線維芽細胞へ。これは以前にこの心臓スライスモデルで評価されている。 CTCMのパラメータは、圧力/電気振幅と周波数を変化させることで調整でき、頻脈、徐脈、機械的循環補助（機械的負荷軽減心臓）など、さまざまな状態をシミュレートできることに留意すべきである。これにより、このシステムは薬剤試験において中程度のスループットを実現できる。CTCMが過労誘発性心肥大をモデル化できることは、このシステムを個別化治療に応用するための道を開くものである。結論として、本研究は、機械的伸展と体液性刺激が心臓組織切片の培養維持に不可欠であることを示している。
ここで提示されたデータは、CTCMが完全な心筋をモデル化するための非常に有望なプラットフォームであることを示唆していますが、この培養法にはいくつかの制限があります。CTCM培養の主な制限は、スライスに継続的な動的機械的ストレスがかかるため、各サイクル中に心臓スライスの収縮を能動的にモニタリングすることができないことです。さらに、心臓切片のサイズが小さい（7 mm）ため、従来の力センサーを使用して培養システム外で収縮機能を評価する能力が制限されます。本稿では、収縮機能の指標として光電圧を評価することで、この制限を部分的に克服しています。しかし、この制限にはさらなる研究が必要であり、カルシウムや電圧感受性色素を使用した光マッピングなど、培養中の心臓スライスの機能を光学的にモニタリングする方法を導入することで、将来的に対処できる可能性があります。CTCMのもう1つの制限は、作業モデルが生理的ストレス（前負荷と後負荷）を操作しないことです。 CTCMでは、非常に大きな組織において、拡張期（完全伸展）と収縮期（電気刺激中の収縮時間）に生理的な伸展率25%を再現するために、逆方向から圧力が加えられていました。今後のCTCM設計では、心臓組織に両側から適切な圧力を加え、心臓の各腔で実際に生じる圧力-容積関係を正確に適用することで、この制約を解消する必要があります。
本稿で報告されている過伸展誘発性リモデリングは、肥大性過伸展シグナルの模倣に限定されています。したがって、このモデルは、体液性因子や神経因子（このシステムには存在しない）を必要とせずに、伸展誘発性肥大シグナルの研究に役立ちます。CTCMの多様性を高めるためには、さらなる研究が必要です。例えば、免疫細胞、循環血漿体液性因子との共培養、神経細胞との共培養時の神経支配などにより、CTCMを用いた疾患モデリングの可能性が高まります。
この研究では13頭のブタが使用されました。すべての動物実験は施設のガイドラインに従って実施され、ルイビル大学動物実験委員会によって承認されました。大動脈弓をクランプし、1 Lの滅菌心筋保護液（110 mM NaCl、1.2 mM CaCl2、16 mM KCl、16 mM MgCl2、10 mM NaHCO3、5 U/mLヘパリン、pH最大7.4）で心臓を灌流しました。 心臓は氷冷した心筋保護液に保存され、氷上で研究室へ輸送された。輸送時間は通常10分未満である。 心臓は氷冷した心筋保護液に保存され、氷上で研究室へ輸送された。輸送時間は通常10分未満である。 Лердца хранили в ледяном кардиоплегическом растворе до транспортировки в лабораторию на льду, что обычно所要時間 <10 分 心臓は氷冷した心筋保護液に浸して保存し、その後氷上で研究室へ輸送した。輸送時間は通常10分未満である。心臓は、実験室に送られるまで、通常１０分未満の間、冷たい心臓滞留液中に保存される。心臓は、実験室に送られるまで、通常１０分未満の間、冷たい心臓滞留液中に保存される。 所要時間は 10 分以内です。 心臓は氷上で心筋保護液をかけたまま、氷上で実験室へ輸送されるまで保管してください。通常10分以内です。
CTCM装置は、SolidWorksコンピュータ支援設計（CAD）ソフトウェアで開発されました。培養チャンバー、仕切り、およびエアチャンバーは、CNC加工された透明アクリル樹脂でできています。直径7mmのバックアップリングは、中央に高密度ポリエチレン（HDPE）でできており、下の培地を密閉するために使用されるシリコンOリングを収容するためのOリング溝があります。薄いシリカ膜が培養チャンバーと分離プレートを隔てています。シリコン膜は、厚さ0.02インチのシリコンシートからレーザーカットされており、硬度は35Aです。底部と上部のシリコンガスケットは、厚さ1/16インチのシリコンシートからレーザーカットされており、硬度は50Aです。ブロックを固定し、気密シールを作成するために、316Lステンレス鋼のネジと蝶ナットが使用されています。
C-PACE-EMシステムとの統合を前提とした専用プリント基板（PCB）が設計されています。PCB上のスイス型機械コネクタソケットは、銀メッキ銅線と、電極にねじ込まれたブロンズ0-60ネジによってグラファイト電極に接続されています。このプリント基板は3Dプリンターのカバー内に設置されます。
CTCM装置は、心臓の周期に似た制御された循環圧を生成するプログラム可能な空気圧アクチュエータ（PPD）によって制御されます。空気室内の圧力が上昇すると、柔軟なシリコン膜が上方に膨張し、組織部位の下に媒体を押し込みます。この流体の排出により組織領域が伸展し、拡張期における心臓の生理的な拡張を模倣します。弛緩のピーク時に、グラファイト電極を介して電気刺激が加えられ、空気室内の圧力が低下し、組織部分が収縮します。パイプ内には、空気システムの圧力を検出する圧力センサーを備えた止血弁があります。圧力センサーによって検出された圧力は、ラップトップに接続されたデータコレクタに送信されます。これにより、ガス室内の圧力を継続的に監視できます。チャンバー内の最大圧力（標準80mmHg、OS 140mmHg）に達すると、データ収集装置にC-PACE-EMシステムに信号を送信し、4Vに設定された2msの二相性電圧信号を生成するように指示した。
心臓切片を採取し、6ウェルで培養条件を以下のように実施した：採取した心臓を移送容器から冷たい（4℃）心筋保護液の入ったトレイに移す。左心室を滅菌刃で分離し、1～2cm³の断片に切断した。これらの組織ブロックを組織接着剤で組織支持体に取り付け、タイロード溶液を含む振動ミクロトーム組織浴槽に入れ、連続的に酸素供給した（3g/L 2,3-ブタンジオンモノオキシム（BDM）、140mM NaCl（8.18g）、6mM KCl（0.447g）、10mM D-グルコース（1.86g）、10mM HEPES（2.38g）、1mM MgCl2（1ml 1M溶液）、1.8mM CaCl2（1.8ml 1M溶液）、最大1L ddH2O）。振動ミクロトームは、周波数80 Hz、水平振動振幅2 mm、送り速度0.03 mm/sで厚さ300 µmの切片を切断するように設定した。組織バスは溶液を冷たく保つために氷で囲まれ、温度は4°Cに維持された。ミクロトームバスから組織切片を、氷上で連続的に酸素化されたタイロード溶液を含むインキュベーションバスに移し、1枚の培養プレートに十分な切片が得られるまで続けた。トランスウェル培養の場合、組織切片を滅菌済みの6 mm幅のポリウレタン支持具に取り付け、6 mlの最適化された培地（199培地、1x ITSサプリメント、10% FBS、5 ng/ml VEGF、10 ng/ml FGF-アルカリ、2X抗生物質-抗真菌剤）に置いた。C-Paceを介して組織切片に電気刺激（10 V、周波数1.2 Hz）を加えた。 TD条件下では、培地交換のたびに新鮮なT3とDexをそれぞれ100 nMと1 μMの濃度で添加した。培地は1日3回交換する前に酸素で飽和させた。組織切片は37℃、5% CO2のインキュベーターで培養した。
CTCM培養では、組織切片を改変タイロード溶液の入ったペトリ皿内の特注3Dプリンターに置いた。この装置は、心臓切片のサイズを支持リングの面積の25%増やすように設計されている。これは、心臓切片がタイロード溶液から培地に移された後、拡張期に伸びないようにするためである。ヒストアクリル接着剤を使用して、厚さ300 µmの切片を直径7 mmの支持リングに固定した。組織切片を支持リングに取り付けた後、余分な組織切片を切り取り、取り付けた組織切片を氷（4°C）上のタイロード溶液の浴槽に戻し、1つの装置に必要な切片が準備されるまで待つ。すべての装置の総処理時間は2時間を超えてはならない。6つの組織切片を支持リングに取り付けた後、CTCM装置を組み立てた。CTCM培養チャンバーには、あらかじめ21 mlの酸素化培地が充填されている。組織切片を培養チャンバーに移し、ピペットで気泡を注意深く除去します。次に、組織切片を穴に誘導し、軽く押して所定の位置に固定します。最後に、電極キャップをデバイスに取り付け、デバイスをインキュベーターに移します。次に、CTCMをエアチューブとC-PACE-EMシステムに接続します。空気圧アクチュエータが開き、エアバルブがCTCMを開きます。C-PACE-EMシステムは、2msの二相性ペーシング中に1.2Hzで4Vを供給するように構成されました。電極へのグラファイトの蓄積を避けるため、培地は1日2回、電極は1日1回交換しました。必要に応じて、組織切片を培養ウェルから取り出して、その下に落ちた可能性のある気泡を排出することができます。MT処理条件では、100nM T3と1μM Dexを含むT3/Dexを培地交換ごとに新たに添加しました。CTCMデバイスは、37℃、5% CO2のインキュベーターで培養しました。
心臓スライスの伸長軌跡を取得するために、特別なカメラシステムが開発されました。SLRカメラ（Canon Rebel T7i、キヤノン、東京、日本）とNavitar Zoom 7000 18-108mmマクロレンズ（Navitar、サンフランシスコ、カリフォルニア州）を使用しました。培地を新しい培地に交換した後、室温で可視化を行いました。カメラは51°の角度に配置され、ビデオは毎秒30フレームで記録されます。まず、オープンソースソフトウェア（MUSCLEMOTION43）をImage-Jで使用して、心臓スライスの動きを定量化しました。ノイズを避けるために、拍動する心臓スライスの関心領域を定義するために、MATLAB（MathWorks、ナティック、マサチューセッツ州、米国）を使用してマスクを作成しました。手動でセグメント化されたマスクは、フレームシーケンス内のすべての画像に適用され、MUSCLEMOTIONプラグインに渡されます。Muscle Motionは、各フレームのピクセルの平均強度を使用して、参照フレームに対する動きを定量化します。データは記録され、フィルタリングされ、心周期中のサイクル時間を定量化し、組織の伸展を評価するために使用されました。記録されたビデオは、1次ゼロ位相デジタルフィルタを使用して後処理されました。組織の伸展（ピーク間）を定量化するために、記録された信号のピークとトラフを区別するためにピーク間分析が実行されました。さらに、信号のドリフトを排除するために、6次多項式を使用してデトレンドが実行されます。全体的な組織の動き、サイクル時間、弛緩時間、および収縮時間を決定するために、MATLABでプログラムコードが開発されました（補足プログラムコード44）。
ひずみ解析では、機械的伸張評価用に作成した同じビデオを使用して、まずMUSCLEMOTIONソフトウェアに従って、動作ピーク（動作の最高点（上）と最低点（下））を表す2つの画像をトレースしました。次に、組織領域をセグメント化し、セグメント化された組織にシェーディングアルゴリズムを適用しました（補足図2a）。セグメント化された組織は10個のサブサーフェスに分割され、各サーフェスの応力は次の式を使用して計算されました：ひずみ = (Sup-Sdown)/Sdown、ここでSupとSdownは、それぞれ布地の上下の影からの形状までの距離です（補足図2b）。
心臓組織切片を4%パラホルムアルデヒドで48時間固定した。固定した組織を10%および20%スクロース溶液で1時間脱水し、その後30%スクロース溶液で一晩脱水した。切片を最適切断温度コンパウンド（OCTコンパウンド）に包埋し、イソペンタン/ドライアイス浴で徐々に凍結した。OCT包埋ブロックは分離するまで-80℃で保存した。スライドは厚さ8μmの切片として作製した。
心臓切片からOCTを除去するには、スライドを加熱ブロック上で95℃で5分間加熱します。各スライドに1 mlのPBSを加え、室温で30分間インキュベートした後、室温で15分間0.1% Triton-Xを含むPBSで切片を透過させます。非特異的抗体がサンプルに結合するのを防ぐため、スライドに1 mlの3% BSA溶液を加え、室温で1時間インキュベートします。その後、BSAを除去し、スライドをPBSで洗浄します。各サンプルに鉛筆で印を付けます。一次抗体（1% BSAで1:200に希釈）（コネキシン43（Abcam; #AB11370）、NFATC4（Abcam; #AB99431）、トロポニンT（Thermo Scientific; #MA5-12960））を90分かけて添加し、次に二次抗体（1% BSAで1:200に希釈）マウスAlexa Fluor 488（Thermo Scientific; #A16079）、ウサギAlexa Fluor 594（Thermo Scientific; #T6391）に対する抗体をさらに90分間添加した。PBSで3回洗浄した。ターゲット染色とバックグラウンドを区別するために、コントロールとして二次抗体のみを使用した。最後に、DAPI核染色剤を添加し、スライドをvectashield（Vector Laboratories）に入れ、マニキュアで密封した。
WGA染色には、PBSに溶解した5 μg/mlのWGA-Alexa Fluor 555（Thermo Scientific社製、#W32464）を用い、固定した切片に室温で30分間作用させた。その後、スライドをPBSで洗浄し、各スライドにスーダンブラックを添加して30分間インキュベートした。さらにスライドをPBSで洗浄し、ベクタシールド包埋剤を添加した。スライドはキーエンス社製顕微鏡を用いて40倍の倍率で観察した。
上記のようにサンプルからOCTを除去した。OCTを除去した後、スライドをブアン液に一晩浸した。次に、スライドを蒸留水で1時間すすぎ、ビブリッヒアロエ酸フクシン溶液に10分間浸した。次に、スライドを蒸留水で洗浄し、5%リンモリブデン/5%リンタングステン酸溶液に10分間浸した。すすぎをせずに、スライドを直接アニリンブルー溶液に15分間浸した。次に、スライドを蒸留水で洗浄し、1%酢酸溶液に2分間浸した。スライドを200 Nエタノールで乾燥させ、キシレンに移した。染色したスライドは、10倍対物レンズを備えたキーエンス顕微鏡を使用して観察した。線維化面積の割合は、キーエンスアナライザーソフトウェアを使用して定量化した。
CyQUANT™ MTT細胞生存率アッセイ（Invitrogen、Carlsbad、CA）、カタログ番号V13154を、製造元のプロトコルに従って、一部変更を加えて実施した。特に、MTT分析中に組織のサイズが均一になるように、直径6 mmの外科用パンチを使用した。組織は、製造元のプロトコルに従って、MTT基質を含む12ウェルプレートのウェルに個別に播種した。切片を37℃で3時間インキュベートすると、生組織がMTT基質を代謝して紫色のホルマザン化合物を生成する。MTT溶液を1 mlのDMSOに置き換え、37℃で15分間インキュベートして、心臓切片から紫色のホルマザンを抽出した。サンプルを96ウェル透明底プレートでDMSOで1:10に希釈し、Cytationプレートリーダー（BioTek）を使用して570 nmで紫色の強度を測定した。測定値は、心臓の各切片の重量で正規化した。
心臓切片培地を、以前に記載したように、1 μCi/ml [5-3H]-グルコース（Moravek Biochemicals、Brea、CA、USA）を含む培地に交換し、グルコース利用アッセイを行った。4 時間インキュベートした後、100 µl の培地を 100 µl の 0.2 N HCl を含む開いたマイクロ遠心チューブに加えた。次に、チューブを 500 μl の dH2O を含むシンチレーションチューブに入れ、37 °C で 72 時間 [3H]2O を蒸発させた。次に、マイクロ遠心チューブをシンチレーションチューブから取り出し、10 ml のシンチレーション液を加えた。シンチレーションカウントは、Tri-Carb 2900TR 液体シンチレーションアナライザー（Packard Bioscience Company、Meriden、CT、USA）を使用して行った。グルコース利用率は、[5-3H]-グルコースの比放射能、不完全な平衡状態とバックグラウンド、[5-3H]-グルコースと非標識グルコースの希釈、およびシンチレーションカウンターの効率を考慮して計算された。データは心臓切片の質量で正規化されている。
Trizolで組織を均質化した後、製造元のプロトコルに従ってQiagen miRNeasy Micro Kit #210874を使用して心臓切片からRNAを分離した。RNAsecライブラリーの調製、シーケンス、およびデータ解析は、以下のように実施した。
RNAライブラリーの調製には、サンプルあたり1 μgのRNAを出発材料として使用した。シーケンスライブラリーは、NEBNext UltraTM RNAライブラリー調製キット（NEB、米国）を使用して製造元の推奨に従って作成し、各サンプルの属性配列にインデックスコードを追加した。簡単に説明すると、mRNAは、ポリTオリゴヌクレオチドが結合した磁気ビーズを使用して総RNAから精製した。断片化は、NEBNext First Strand Synthesis Reaction Buffer（5X）中で二価カチオンを使用して高温で実行した。ファーストストランドcDNAは、ランダムヘキサマープライマーとM-MuLV逆転写酵素（RNase H-）を使用して合成した。セカンドストランドcDNAは、DNAポリメラーゼIとRNase Hを使用して合成した。残りのオーバーハングは、エキソヌクレアーゼ/ポリメラーゼ活性によって平滑末端に変換した。DNA断片の3'末端をアデニル化した後、ハイブリダイゼーションの準備として、ヘアピンループ構造を持つNEBNextアダプターをそれに結合した。好ましい長さ 150～200 bp の cDNA 断片を選択するために、ライブラリー断片は AMPure XP システム (Beckman Coulter、米国ビバリー) を使用して精製されました。次に、サイズ選択された cDNA にアダプターをライゲーションした 3 μl の USER 酵素 (NEB、米国) を 37 °C で 15 分間、続いて 95 °C で 5 分間使用してから PCR を行いました。その後、Phusion High-Fidelity DNA ポリメラーゼ、ユニバーサル PCR プライマー、および Index (X) プライマーを使用して PCR を実行しました。最後に、PCR 産物を精製 (AMPure XP システム) し、ライブラリーの品質を Agilent Bioanalyzer 2100 システムで評価しました。次に、cDNA ライブラリーを Novaseq シーケンサーを使用してシーケンスしました。Illumina からの生画像ファイルは、CASAVA Base Calling を使用して生リードに変換されました。生データは、リード配列と対応する塩基品質を含む FASTQ(fq) フォーマットファイルに保存されます。 HISAT2を選択して、フィルタリングされたシーケンスリードをSscrofa11.1参照ゲノムにマッチングさせます。一般的に、HISAT2は40億塩基を超えるゲノムを含むあらゆるサイズのゲノムをサポートしており、ほとんどのパラメータにデフォルト値が設定されています。RNA Seqデータからのスプライシングリードは、現在利用可能な最速のシステムであるHISAT2を使用することで、他のどの方法よりも同等以上の精度で効率的にアライメントできます。
転写産物の豊富さは、遺伝子発現レベルを直接反映します。遺伝子発現レベルは、ゲノムまたはエクソンに関連付けられた転写産物の豊富さ（シーケンスカウント）によって評価されます。リード数は、遺伝子発現レベル、遺伝子長、およびシーケンス深度に比例します。FPKM（100万塩基対あたりにシーケンスされた転写産物の1000塩基対あたりのフラグメント）を計算し、DESeq2パッケージを使用して差次的発現のP値を決定しました。次に、組み込みのR関数「p.adjust」に基づいて、Benjamini-Hochberg法9を使用して各P値の偽発見率（FDR）を計算しました。
心臓切片から分離したRNAは、Thermo社のSuperScript IV Vilo Master mix（Thermo、カタログ番号11756050）を使用して、200 ng/μlの濃度でcDNAに変換した。定量的RT-PCRは、Applied Biosystems Endura Plate Microamp 384ウェル透明反応プレート（Thermo、カタログ番号4483319）とmicroamp光学接着剤（Thermo、カタログ番号4311971）を使用して実施した。反応混合物は、5 µlのTaqman Fast Advanced Master mix（Thermo、カタログ番号4444557）、0.5 µlのTaqmanプライマー、および3.5 µlのH2Oを各ウェルに混合したものから構成された。標準的なqPCRサイクルを実行し、Applied Biosystems Quantstudio 5リアルタイムPCR装置（384ウェルモジュール、製品番号A28135）を使用してCT値を測定した。 TaqmanプライマーはThermoから購入した（GAPDH（Ss03375629_u1）、PARP12（Ss06908795_m1）、PKDCC（Ss06903874_m1）、CYGB（Ss06900188_m1）、RGL1（Ss06868890_m1）、ACTN1（Ss01009508_mH）、GATA4（Ss03383805_u1）、GJA1（Ss03374839_u1）、COL1A2（Ss03375009_u1）、COL3A1（Ss04323794_m1）、ACTA2（Ss04245588_m1）。すべてのサンプルのCT値はハウスキーピング遺伝子GAPDHで正規化した。
NT-ProBNPのメディア放出は、製造元のプロトコルに従ってNT-ProBNPキット（ブタ）（カタログ番号MBS2086979、MyBioSource）を使用して評価した。簡単に説明すると、各サンプルと標準液250 µlを各ウェルに2回ずつ添加した。サンプル添加後すぐに、アッセイ試薬A 50 µlを各ウェルに添加した。プレートを軽く振ってシーラントで密封した。次に、錠剤を37℃で1時間インキュベートした。次に、溶液を吸引し、1X洗浄液350 µlでウェルを4回洗浄し、毎回洗浄液を1～2分間インキュベートした。次に、アッセイ試薬B 100 µlを各ウェルに添加し、プレートシーラントで密封した。錠剤を軽く振って、37℃で30分間インキュベートした。溶液を吸引除去し、350 µlの1X洗浄液でウェルを5回洗浄します。各ウェルに90 µlの基質溶液を加え、プレートを密封します。プレートを37℃で10～20分間インキュベートします。各ウェルに50 µlの停止液を加えます。プレートは、450 nmに設定したCytation（BioTek）プレートリーダーを使用して直ちに測定しました。
検出力分析を実施し、パラメータの絶対値で10%の変化を5%の第一種過誤率で検出するために、80%以上の検出力が得られるようなグループサイズを選択した。 検出力分析を実施し、5%の第一種過誤率でパラメータの10%の絶対変化を検出するために80%以上の検出力を提供するグループサイズを選択した。 Анализ мощности был выполнен для выбора размеров группп, которые обеспечат >80% мощности для обнаружения 10% абсолютного изменения параметра с 5% частотой обсток типа I. 検出力分析を実施し、5%の第一種過誤率で10%の絶対パラメータ変化を検出するために80%以上の検出力を提供するグループサイズを選択した。性能分析を行って、測定パラメータ中の１０％の変化および５％のＩ型試薬率で８０％を超える電力を提供するものを選択した。性能分析を行って、測定パラメータ中の１０％の変化および５％のＩ型試薬率で８０％を超える電力を提供するものを選択した。 Был проведен анализ мощности для выбора размера группы, который обеспечил бы > 80% мощности для обнаружения 10% абсолютного изменения параметров и 5% частоты озибок типа I. 検出力分析を実施し、絶対パラメータ変化率10%と第一種過誤率5%を検出するために80%以上の検出力が得られるグループサイズを選択した。実験前に組織切片を無作為に選択した。すべての分析は条件を伏せた状態で行われ、サンプルはすべてのデータの分析が完了した後にのみ解読された。すべての統計解析にはGraphPad Prismソフトウェア（カリフォルニア州サンディエゴ）を使用した。 すべての統計において、p値が0.05未満の場合に有意とみなした。 すべての統計において、p値が0.05未満の場合に有意とみなした。 Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. すべての統計において、p値が0.05未満の場合に有意とみなした。すべての記録データについて、p 値は値 < 0.05 であると見なされます。すべての記録データについて、p 値は値 < 0.05 であると見なされます。 Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. すべての統計において、p値が0.05未満の場合に有意とみなした。2つの比較のみのデータに対して、両側t検定を実施しました。複数のグループ間の有意差を判定するために、一元配置分散分析または二元配置分散分析を用いました。事後検定を実施する際には、多重比較を考慮してTukey補正を適用しました。RNAsecデータについては、方法の項で説明するように、FDRおよびp.adjustの計算において特別な統計的考慮事項があります。
研究デザインの詳細については、この記事にリンクされているNature Research Reportの要約を参照してください。