Faleminderit që vizituat Nature.com.Versioni i shfletuesit që po përdorni ka mbështetje të kufizuar për CSS.Për përvojën më të mirë, ju rekomandojmë të përdorni një shfletues të përditësuar (ose çaktivizoni modalitetin e përputhshmërisë në Internet Explorer).Ndërkohë, për të siguruar mbështetje të vazhdueshme, ne do ta bëjmë faqen pa stile dhe JavaScript.
Ekziston nevoja për një sistem të besueshëm in vitro që mund të riprodhojë me saktësi mjedisin fiziologjik të zemrës për testimin e drogës.Disponueshmëria e kufizuar e sistemeve të kulturës së indeve të zemrës njerëzore ka çuar në interpretime të pasakta të efekteve të barnave kardiake.Këtu, ne kemi zhvilluar një model të kulturës së indeve kardiake (CTCM) që stimulon elektromekanikisht fetat e zemrës dhe i nënshtrohet shtrirjes fiziologjike gjatë fazave sistolike dhe diastolike të ciklit kardiak.Pas 12 ditësh kulture, kjo qasje përmirësoi pjesërisht qëndrueshmërinë e seksioneve të zemrës, por nuk e ruajti plotësisht integritetin e tyre strukturor.Prandaj, pas shqyrtimit të molekulave të vogla, ne zbuluam se shtimi i 100 nM triiodothyronine (T3) dhe 1 μM dexamethasone (Dex) në mjedisin tonë ruajti mikrostrukturën e seksioneve për 12 ditë.Në kombinim me trajtimin T3/Dex, sistemi CTCM mbajti profilet e transkriptimit, qëndrueshmërinë, aktivitetin metabolik dhe integritetin strukturor në të njëjtin nivel me indet e freskëta të zemrës për 12 ditë.Përveç kësaj, shtrirja e tepërt e indit kardiak në kulturë shkakton sinjalizimin kardiak hipertrofik, duke ofruar dëshmi për aftësinë e CTCM për të imituar kushtet hipertrofike të shkaktuara nga shtrirja kardiake.Si përfundim, CTCM mund të modelojë fiziologjinë dhe patofiziologjinë e zemrës në kulturë për periudha të gjata kohore, duke mundësuar një ekzaminim të besueshëm të barnave.
Para kërkimit klinik, nevojiten sisteme të besueshme in vitro që mund të riprodhojnë me saktësi mjedisin fiziologjik të zemrës së njeriut.Sisteme të tilla duhet të imitojnë shtrirjen mekanike të ndryshuar, rrahjet e zemrës dhe vetitë elektrofiziologjike.Modelet e kafshëve zakonisht përdoren si një platformë ekzaminimi për fiziologjinë kardiake me besueshmëri të kufizuar në pasqyrimin e efekteve të barnave në zemrën e njeriut1,2.Në fund të fundit, Modeli Eksperimental Ideal i Kulturës së Indeve Kardiake (CTCM) është një model shumë i ndjeshëm dhe specifik për ndërhyrje të ndryshme terapeutike dhe farmakologjike, duke riprodhuar me saktësi fiziologjinë dhe patofiziologjinë e zemrës së njeriut3.Mungesa e një sistemi të tillë kufizon zbulimin e trajtimeve të reja për dështimin e zemrës4,5 dhe ka çuar në kardiotoksicitetin e barnave si një arsye kryesore për daljen nga tregu6.
Gjatë dekadës së fundit, tetë barna jo-kardiovaskulare janë tërhequr nga përdorimi klinik sepse ato shkaktojnë zgjatje të intervalit QT që çon në aritmi ventrikulare dhe vdekje të papritur7.Kështu, ekziston një nevojë në rritje për strategji të besueshme të shqyrtimit paraklinik për të vlerësuar efikasitetin dhe toksicitetin kardiovaskular.Përdorimi i kohëve të fundit i kardiomiociteve pluripotente me prejardhje nga qelizat burimore të induktuara nga njeriu (hiPS-CM) në ekzaminimin e barnave dhe testimin e toksicitetit ofron një zgjidhje të pjesshme për këtë problem.Megjithatë, natyra e papjekur e hiPS-CM dhe mungesa e kompleksitetit shumëqelizor të indit kardiak janë kufizimet kryesore të kësaj metode.Studimet e fundit kanë treguar se ky kufizim mund të kapërcehet pjesërisht duke përdorur hiPS-CM të hershme për të formuar hidrogele të indeve kardiake menjëherë pas fillimit të kontraktimeve spontane dhe duke rritur gradualisht stimulimin elektrik me kalimin e kohës.Megjithatë, këtyre mikroindeve hiPS-CM u mungojnë vetitë e pjekura elektrofiziologjike dhe kontraktuese të miokardit të rritur.Përveç kësaj, indi kardiak i njeriut ka një strukturë më komplekse, që përbëhet nga një përzierje heterogjene e llojeve të ndryshme të qelizave, duke përfshirë qelizat endoteliale, neuronet dhe fibroblastet stromale, të ndërlidhura nga grupe specifike të proteinave të matricës jashtëqelizore.Ky heterogjenitet i popullatave jo-kardiomiocitare11,12,13 në zemrën e gjitarëve të rritur është një pengesë kryesore për modelimin e indit kardiak duke përdorur lloje individuale të qelizave.Këto kufizime kryesore theksojnë rëndësinë e zhvillimit të metodave për kultivimin e indit të paprekur të miokardit në kushte fiziologjike dhe patologjike.
Seksione të holla (300 µm) të kultivuara të zemrës së njeriut janë provuar të jenë një model premtues i miokardit të paprekur njerëzor.Kjo metodë siguron akses në një sistem të plotë shumëqelizor 3D të ngjashëm me indin e zemrës së njeriut.Megjithatë, deri në vitin 2019, përdorimi i seksioneve të kultivuara të zemrës ishte i kufizuar nga mbijetesa e shkurtër e kulturës (24 orë).Kjo është për shkak të një sërë faktorësh duke përfshirë mungesën e shtrirjes fiziko-mekanike, ndërfaqen ajër-lëng dhe përdorimin e mediave të thjeshta që nuk mbështesin nevojat e indit kardiak.Në vitin 2019, disa grupe kërkimore demonstruan se përfshirja e faktorëve mekanikë në sistemet e kulturës së indeve kardiake mund të zgjasë jetën e kulturës, të përmirësojë shprehjen kardiake dhe të imitojë patologjinë kardiake.Dy studime elegante 17 dhe 18 tregojnë se ngarkesa mekanike njëaksiale ka një efekt pozitiv në fenotipin kardiak gjatë kulturës.Megjithatë, këto studime nuk përdorën ngarkimin fiziko-mekanik dinamik tre-dimensional të ciklit kardiak, pasi seksionet e zemrës ishin të ngarkuara ose me forca tërheqëse izometrike 17 ose me ngarkesë lineare austotonike 18 .Këto metoda të shtrirjes së indeve rezultuan në shtypjen e shumë gjeneve kardiake ose në mbishprehjen e gjeneve të shoqëruara me përgjigje jonormale të shtrirjes.Veçanërisht, Pitoulis et al.19 zhvilloi një banjë kulture dinamike me feta zemre për rindërtimin e ciklit kardiak duke përdorur reagimin e transduktorit të forcës dhe disqet e tensionit.Megjithëse ky sistem lejon modelim më të saktë të ciklit kardiak in vitro, kompleksiteti dhe xhiroja e ulët e metodës kufizon aplikimin e këtij sistemi.Laboratori ynë ka zhvilluar kohët e fundit një sistem të thjeshtuar kulture duke përdorur stimulimin elektrik dhe një mjedis të optimizuar për të ruajtur qëndrueshmërinë e seksioneve të indeve të zemrës së derrit dhe njeriut deri në 6 ditë20,21.
Në dorëshkrimin aktual, ne përshkruajmë një model të kulturës së indit kardiak (CTCM) duke përdorur seksione të zemrës së derrit që përfshin shenja humorale për të përmbledhur fiziologjinë kardiake tredimensionale dhe zgjerimin patofiziologjik gjatë ciklit kardiak.Ky CTCM mund të rrisë saktësinë e parashikimit paraklinik të barnave në një nivel të paarritur kurrë më parë, duke ofruar një sistem kardiak me kosto efektive, me shpejtësi mesatare që imiton fiziologjinë/patofiziologjinë e zemrës së gjitarëve për testimin paraklinik të barnave.
Sinjalet mekanike hemodinamike luajnë një rol kritik në ruajtjen e funksionit të kardiomiociteve in vitro 22,23,24.Në dorëshkrimin aktual, ne kemi zhvilluar një CTCM (Figura 1a) që mund të imitojë mjedisin kardiak të të rriturve duke nxitur stimulim elektrik dhe mekanik në frekuencat fiziologjike (1.2 Hz, 72 rrahje në minutë).Për të shmangur shtrirjen e tepërt të indeve gjatë diastolës, u përdor një pajisje printimi 3D për të rritur madhësinë e indeve me 25% (Fig. 1b).Ritmi elektrik i nxitur nga sistemi C-PACE u caktua në kohë për të filluar 100 ms përpara sistollës duke përdorur një sistem të marrjes së të dhënave për të riprodhuar plotësisht ciklin kardiak.Sistemi i kulturës së indeve përdor një aktivizues pneumatik të programueshëm (LB Engineering, Gjermani) për të zgjeruar në mënyrë ciklike një membranë fleksibël silikoni për të shkaktuar zgjerimin e fetave të zemrës në dhomën e sipërme.Sistemi u lidh me një linjë ajri të jashtëm nëpërmjet një dhënës presioni, i cili bëri të mundur rregullimin e saktë të presionit (± 1 mmHg) dhe kohës (± 1 ms) (Fig. 1c).
a Bashkangjisni seksionin e indit në unazën mbështetëse 7 mm, të treguar me ngjyrë blu, brenda dhomës së kulturës së pajisjes.Dhoma e kulturës është e ndarë nga dhoma e ajrit nga një membranë e hollë fleksibël silikoni.Vendosni një copë litari midis secilës dhomë për të parandaluar rrjedhjet.Kapaku i pajisjes përmban elektroda grafiti që ofrojnë stimulim elektrik.b Paraqitja skematike e pajisjes së madhe të indeve, unazës udhëzuese dhe unazës mbështetëse.Seksionet e indeve (kafe) vendosen në pajisjen me përmasa të mëdha me unazën udhëzuese të vendosur në brazdë në skajin e jashtëm të pajisjes.Duke përdorur udhëzuesin, vendosni me kujdes unazën mbështetëse të veshur me ngjitës akrilik indi mbi seksionin e indit kardiak.c Grafiku që tregon kohën e stimulimit elektrik si funksion i presionit të dhomës së ajrit të kontrolluar nga një aktivizues pneumatik i programueshëm (PPD).Një pajisje për marrjen e të dhënave është përdorur për të sinkronizuar stimulimin elektrik duke përdorur sensorë presioni.Kur presioni në dhomën e kulturës arrin pragun e caktuar, një sinjal pulsi dërgohet në C-PACE-EM për të shkaktuar stimulimin elektrik.d Imazhi i katër CTCM-ve të vendosura në një raft inkubator.Katër pajisje janë të lidhura me një PPD nëpërmjet një qarku pneumatik dhe sensorët e presionit futen në valvulën hemostatike për të monitoruar presionin në qarkun pneumatik.Çdo pajisje përmban gjashtë seksione të indeve.
Duke përdorur një aktivizues të vetëm pneumatik, ne ishim në gjendje të kontrollonim 4 pajisje CTCM, secila prej të cilave mund të mbante 6 seksione të indeve (Fig. 1d).Në CTCM, presioni i ajrit në dhomën e ajrit konvertohet në presion sinkron në dhomën e lëngut dhe nxit zgjerimin fiziologjik të fetës së zemrës (Figura 2a dhe Filmi Suplementar 1).Vlerësimi i shtrirjes së indeve në 80 mm Hg.Art.tregoi shtrirje të seksioneve të indeve me 25% (Fig. 2b).Kjo përqindje e shtrirjes është treguar se korrespondon me një gjatësi fiziologjike të sarkomerit prej 2.2-2.3 μm për tkurrjen normale të seksionit kardiak17,19,25.Lëvizja e indit u vlerësua duke përdorur cilësimet e personalizuara të kamerës (Figura plotësuese 1).Amplituda dhe shpejtësia e lëvizjes së indeve (Fig. 2c, d) korrespondonin me shtrirjen gjatë ciklit kardiak dhe kohën gjatë sistolës dhe diastolës (Fig. 2b).Shtrirja dhe shpejtësia e indit kardiak gjatë tkurrjes dhe relaksimit mbetën konstante për 12 ditë në kulturë (Fig. 2f).Për të vlerësuar efektin e stimulimit elektrik në kontraktueshmërinë gjatë kulturës, ne zhvilluam një metodë për përcaktimin e deformimit aktiv duke përdorur një algoritëm hijezues (Figura plotësuese 2a,b) dhe ishim në gjendje të dallonim midis deformimeve me dhe pa stimulim elektrik.I njëjti seksion i zemrës (Fig. 2f).Në zonën e lëvizshme të prerjes (R6-9), voltazhi gjatë stimulimit elektrik ishte 20% më i lartë se në mungesë të stimulimit elektrik, gjë që tregon kontributin e stimulimit elektrik në funksionin kontraktues.
Gjurmët përfaqësuese të presionit të dhomës së ajrit, presionit të dhomës së lëngut dhe matjeve të lëvizjes së indeve konfirmojnë se presioni i dhomës ndryshon presionin e dhomës së lëngut, duke shkaktuar një lëvizje përkatëse të fetës së indit.b Gjurmët përfaqësuese të përqindjes së shtrirjes (blu) të seksioneve të indeve që korrespondojnë me përqindjen e shtrirjes (portokalli).c Lëvizja e matur e fetës kardiake është në përputhje me shpejtësinë e matur të lëvizjes.(d) Trajektoret përfaqësuese të lëvizjes ciklike (vijë blu) dhe shpejtësisë (vijë me pika portokalli) në një pjesë të zemrës.e Sasia e kohës së ciklit (n = 19 feta për grup, nga derra të ndryshëm), koha e tkurrjes (n = 19 feta për grup), koha e relaksimit (n = 19 feta për grup, nga derra të ndryshëm), lëvizja e indeve (n = 25 ).feta)/grup nga derra të ndryshëm), shpejtësia maksimale sistolike (n = 24(D0), 25(D12) feta/grup nga derra të ndryshëm) dhe shkalla maksimale e relaksimit (n=24(D0), 25(D12) feta/grup nga derra të ndryshëm).T-testi Student me dy bishta nuk tregoi dallim të rëndësishëm në asnjë parametër.f Gjurmët e analizës përfaqësuese të sforcimit të seksioneve të indeve me stimulim elektrik (të kuq) dhe pa (blu), dhjetë zona rajonale të seksioneve të indeve nga i njëjti seksion.Panelet e poshtme tregojnë sasinë e ndryshimit të përqindjes në tendosje në seksionet e indeve me dhe pa stimulim elektrik në dhjetë zona nga seksione të ndryshme. (n = 8 feta/grup nga derra të ndryshëm, kryhet T-testi Student me dy bishta; ****p < 0,0001, **p < 0,01, *p < 0,05). (n = 8 feta/grup nga derra të ndryshëm, kryhet T-testi Student me dy bishta; ****p < 0,0001, **p < 0,01, *p < 0,05). (n = 8 срезов/группу от разных свиней, проводится двусторонний t-критерий Стьюдента; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05). (n = 8 seksione/grup nga derra të ndryshëm, T-test i Studentit me dy bishta; ****p<0.0001, **p<0.01, *p<0.05). （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p <0.0001，**p <0.01，5p <0.01，5 （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p <0.0001，**p <0.01，5p <0.01，5 (n = 8 срезов/группу, от разных свиней, двусторонний критерий Стьюдента; ****p <0,0001, **p <0,01, *p <0,05). (n = 8 seksione/grup, nga derra të ndryshëm, T-testi studentor me dy bishta; ****p<0.0001, **p<0.01, *p<0.05).Shiritat e gabimit përfaqësojnë mesataren ± devijimin standard.
Në sistemin tonë të mëparshëm të kulturës statike biomimetike të fetave të zemrës [20, 21], ne ruajtëm qëndrueshmërinë, funksionin dhe integritetin strukturor të fetave të zemrës për 6 ditë duke aplikuar stimulim elektrik dhe duke optimizuar përbërjen e mediumit.Megjithatë, pas 10 ditësh, këto shifra ranë ndjeshëm.Ne do t'i referohemi seksioneve të kultivuara në kushtet e kontrollit të sistemit tonë të mëparshëm biomimetik statik 20, 21 (Ctrl) dhe do të përdorim mjedisin tonë të optimizuar më parë si kushte MC dhe kulturë nën stimulimin e njëkohshëm mekanik dhe elektrik (CTCM).thirrur .Së pari, ne përcaktuam se stimulimi mekanik pa stimulim elektrik ishte i pamjaftueshëm për të ruajtur qëndrueshmërinë e indeve për 6 ditë (Figura plotësuese 3a,b).Është interesante se me futjen e stimulimit fiziko-mekanik dhe elektrik duke përdorur STCM, qëndrueshmëria e seksioneve të zemrës 12-ditore mbeti e njëjtë si në seksionet e zemrës së freskët në kushte MS, por jo në kushte Ctrl, siç tregohet nga analiza MTT (Fig. 1).3a).Kjo sugjeron që stimulimi mekanik dhe simulimi i ciklit kardiak mund t'i mbajë seksionet e indeve të qëndrueshme për dy herë më shumë sesa raportohet në sistemin tonë të mëparshëm të kulturës statike.Megjithatë, vlerësimi i integritetit strukturor të seksioneve të indeve me anë të imunoetiketimit të troponinës T kardiake dhe koneksinës 43 tregoi se shprehja e koneksinës 43 ishte dukshëm më e lartë në indet MC në ditën e 12-të sesa në kontrollet në të njëjtën ditë.Megjithatë, shprehja uniforme e koneksinës 43 dhe formimi i diskut Z nuk u mbajtën plotësisht (Fig. 3b).Ne përdorim një kornizë të inteligjencës artificiale (AI) për të përcaktuar sasinë e integritetit strukturor të indeve26, një tubacion mësimi i thellë i bazuar në imazhe i bazuar në troponin-T dhe ngjyrosjen e koneksinës43 për të përcaktuar automatikisht integritetin strukturor dhe fluoreshencën e fetave të zemrës për sa i përket forcës së lokalizimit.Kjo metodë përdor një Rrjet Neural Konvolutional (CNN) dhe një kornizë të të mësuarit të thellë për të përcaktuar në mënyrë të besueshme integritetin strukturor të indit kardiak në një mënyrë të automatizuar dhe të paanshme, siç përshkruhet në referencë.26. Indi MC tregoi ngjashmëri të përmirësuar strukturore me ditën 0 në krahasim me seksionet e kontrollit statik.Përveç kësaj, ngjyrosja me trikromin e Masson zbuloi një përqindje dukshëm më të ulët të fibrozës në kushtet e MS krahasuar me kushtet e kontrollit në ditën e 12 të kulturës (Fig. 3c).Ndërsa CTCM rriti qëndrueshmërinë e seksioneve të indit të zemrës në ditën e 12-të në një nivel të ngjashëm me atë të indeve të freskëta të zemrës, ai nuk përmirësoi ndjeshëm integritetin strukturor të seksioneve të zemrës.
një grafik me shirita tregon sasinë e qëndrueshmërisë MTT të fetave të freskëta të zemrës (D0) ose kulturës së fetave të zemrës për 12 ditë ose në kulturë statike (D12 Ctrl) ose në CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC, testet në një mënyrë kryhen nga #p. .0001 krahasuar me D0 dhe **p <0.01 krahasuar me D12 Ctrl). një grafik me shirita tregon sasinë e qëndrueshmërisë së MTT të fetave të freskëta të zemrës (D0) ose kulturës së fetave të zemrës për 12 ditë ose në kulturë statike (D12 Ctrl) ose në CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl ), 12 (D12 MC, testi i kryer në një mënyrë të ndryshme) 0.0001 krahasuar me D0 dhe **p <0.01 krahasuar me D12 Ctrl).histogrami tregon sasinë e qëndrueshmërisë së seksioneve të zemrës së freskët të MTT (D0) ose kulturës së seksioneve të zemrës për 12 ditë në kulturë statike (kontrolli D12) ose CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (kontrolli D12).####p < 0,0001 në сравнению со D0 dhe **p < 0,01 по сравнению со D12 Ctrl). ####p < 0.0001 krahasuar me D0 dhe **p <0.01 krahasuar me D12 Ctrl). një 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切燉养12 天的MTT 活力的量化)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向进行单向向他来自不同猪的12 001，与D12 Ctrl 相比，**p <0.01). një 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏(D0) 中新鲜心脏(D0)的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；与D0 相比，####p < 0.0001，与D12 Ctrl 相*)*)histograma që tregon sasinë e qëndrueshmërisë së MTT në seksione të freskëta të zemrës (D0) ose seksione zemre të kultivuara për 12 ditë në kulturë statike (kontrolli D12) ose CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (kontrolli D12)), 12 (D12 MC) seksione/grup nga teste të ndryshme ANOVA, një drejtim;####p < 0,0001 në сравнению со D0, **p < 0,01 në сравнению со D12 Ctrl). ####p < 0,0001 krahasuar me D0, **p < 0,01 krahasuar me D12 Ctrl).b Troponin-T (jeshile), koneksin 43 (e kuqe) dhe DAPI (blu) në seksione të sapoizoluara të zemrës (D0) ose seksione të zemrës të kultivuara në kushte statike (Ctrl) ose kushte CTCM (MC) për 12 ditë) të imazheve përfaqësuese të imunofluoreshencës (shkallë boshe = 100 µm). Është kryer përcaktimi sasior i inteligjencës artificiale të integritetit strukturor të indit të zemrës (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) feta/grup secila nga derra të ndryshëm, testi ANOVA njëkahëshe; ####p < 0,0001 krahasuar me D0 dhe ****p < 0,000 Ctrl). Përcaktimi sasior i inteligjencës artificiale të integritetit strukturor të indit të zemrës (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) feta/grup secila nga derra të ndryshëm, kryhet testi ANOVA në një drejtim; ####p < 0,0001 krahasuar me D0 dhe ****p <0,000 Ctrl). Количественная оценка структурной целостности сердечной ткани искусственным интеллектом (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) сорезов/групп со разных свиней, проводится однофакторн, проводится однофакторный, проводится однофакторный, проводится однофакторный, проводится однофакторный, проводится однофакторный D0 dhe ****p < 0,0001 по сравнению со D12 Ctrl). Kuantifikimi i integritetit strukturor të indit kardiak me anë të inteligjencës artificiale (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) seksione/grupe nga derra të ndryshëm, testi ANOVA njëkahësh i kryer; ####p < 0.0001 kundrejt D0 dhe ****p <1 Ctrl në krahasim me D100).人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) feta/grup secila nga derra të ndryshme, testi i njëanshëm 丛#0#00p <1-ANOVA.比，****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）.人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) feta/grup secila prej derrave të ndryshëm, testi njëkahëshe#0#00p ANOVA; ，****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）. Искусственный интеллект для количественной оценки структурной целостности сердечной ткани (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) срезов/группу каждой из разных свиней, raporti ##000 ANOVA1. внения ****p < 0,0001 по сравнению со D12 Ctrl). Inteligjenca artificiale për të përcaktuar sasinë e integritetit strukturor të indit kardiak (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) seksione/grup secilin prej derrave të ndryshëm, testi ANOVA në një drejtim; ####p<0.0001 vs .D0 Për krahasim ****p <1 Ctrl me D100). c Imazhe përfaqësuese (majtas) dhe përcaktimi sasior (djathtas) për fetat e zemrës të njollosura me njollën trikrome të Masson (Shkalla e zhveshur = 500 µm) (n = 10 feta/grup secila nga derra të ndryshëm, është kryer testi ANOVA njëkahëshe; ####p 0.0001 D <0.0001 dhe 1 D001 në krahasim me D1). c Imazhe përfaqësuese (majtas) dhe përcaktimi sasior (djathtas) për fetat e zemrës të njollosura me njollën trikrome të Masson (Shkalla e zhveshur = 500 µm) (n = 10 feta/grup secila nga derra të ndryshëm, kryhet testi ANOVA njëkahëshe; #### p <0.0001 dhe 1 D001 krahasuar me D1). c. ; #### p < 0,0001 në sравнению со D0 dhe ***p < 0,001 по сравнению со D12 Ctrl). c Imazhe përfaqësuese (majtas) dhe përcaktimi sasior (djathtas) i seksioneve të zemrës të njollosura me njollën trikrome të Masson (shkallë e pa veshur = 500 µm) (n = 10 seksione/grup nga derra të ndryshëm, testi ANOVA njëkahësh i kryer; #### p <0 .0001 krahasuar me D0 dhe 100p C). c 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像（左）和量化（右）（裸 50μ =切片/组，每组来自不同的猪，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0,0001 与D0 相比Ｘ0***P<0. . C 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 （左 左） 量化 （右） 裸尣庣度度度 = 500 μm） （n = 10 个 切片 组 每 组 来自 不同 猪 ， 进行 单向 单向 单向 单向 单向 单向 单向 单向 漋#00；比，***p < 0,001 与D12 Ctrl 相比）. c Репрезентативные изображения (слева) и количественный анализ (справа) сорезов сердца, окрашенных трихромным красителем Massona (чистая шкала = 500 mkm) (n = 10 sрезов/grupypa, si protestë tjetër. analiza кторного дисперсионного ;### #p < 0,0001 по сравнению со D0, ***p < 0,001 по сравнению со D12 Ctrl). c Imazhet përfaqësuese (majtas) dhe sasia (djathtas) e seksioneve të zemrës të ngjyrosura me njollën trikrome të Masson (bosh = 500 µm) (n = 10 seksione/grup, secila nga një derr i ndryshëm, testuar nga analiza e variancës njëkahëshe;### # p <0.0001 0.2 tr <1 C krahasuar me D0,).Shiritat e gabimit përfaqësojnë mesataren ± devijimin standard.
Ne supozuam se duke shtuar molekula të vogla në mjedisin e kulturës, integriteti i kardiomiociteve mund të përmirësohet dhe zhvillimi i fibrozës të reduktohet gjatë kulturës CTCM.Prandaj, ne ekzaminuam për molekula të vogla duke përdorur kulturat tona të kontrollit statik20,21 për shkak të numrit të vogël të faktorëve ngatërrues.Dexamethasone (Dex), triiodothyronine (T3) dhe SB431542 (SB) u zgjodhën për këtë ekran.Këto molekula të vogla janë përdorur më parë në kulturat hiPSC-CM për të nxitur maturimin e kardiomiociteve duke rritur gjatësinë e sarkomerëve, tubulat T dhe shpejtësinë e përcjelljes.Për më tepër, të dy Dex (një glukokortikoid) dhe SB janë të njohura për të shtypur inflamacionin29,30.Prandaj, ne testuam nëse përfshirja e një ose një kombinimi të këtyre molekulave të vogla do të përmirësonte integritetin strukturor të seksioneve të zemrës.Për shqyrtimin fillestar, doza e secilit përbërës u zgjodh bazuar në përqendrimet e përdorura zakonisht në modelet e kulturës qelizore (1 μM Dex27, 100 nM T327 dhe 2.5 μM SB31).Pas 12 ditësh kulture, kombinimi i T3 dhe Dex rezultoi në integritet strukturor optimal të kardiomiocitit dhe rimodelim minimal fijor (Figurat suplementare 4 dhe 5).Përveç kësaj, përdorimi i dyfishtë ose i dyfishtë i këtyre përqendrimeve të T3 dhe Dex prodhoi efekte të dëmshme në krahasim me përqendrimet normale (Figura plotësuese 6a,b).
Pas ekzaminimit fillestar, ne kryem një krahasim kokë më kokë të 4 kushteve të kulturës (Figura 4a): Ctrl: seksionet e zemrës të kultivuara në kulturën tonë statike të përshkruar më parë duke përdorur mjedisin tonë të optimizuar;20.21 TD: T3 dhe Ctrl s Shtuar Dex të Mërkurën;MC: seksione zemre të kultivuara në CTCM duke përdorur mjedisin tonë të optimizuar më parë;dhe MT: CTCM me T3 dhe Dex të shtuar në medium.Pas 12 ditësh kultivimi, qëndrueshmëria e indeve MS dhe MT mbeti e njëjtë si në indet e freskëta të vlerësuara nga analiza MTT (Fig. 4b).Është interesante se shtimi i T3 dhe Dex në kulturat transwell (TD) nuk rezultoi në një përmirësim të konsiderueshëm të qëndrueshmërisë në krahasim me kushtet Ctrl, duke treguar një rol të rëndësishëm të stimulimit mekanik në ruajtjen e qëndrueshmërisë së seksioneve të zemrës.
një diagram projektimi eksperimental që përshkruan katër kushtet e kulturës të përdorura për të vlerësuar efektet e stimulimit mekanik dhe plotësimin T3/Dex në mjedis për 12 ditë. b Grafiku me shtylla tregon sasinë e qëndrueshmërisë 12 ditë pas kulturës në të 4 kushtet e kulturës (Ctrl, TD, MC, dhe MT) krahasuar me feta të freskëta të zemrës (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD dhe D12 MT), 12 (D12 MC është e ndryshme nga testi i kryer ##p. 0,0001, ###p < 0,001 krahasuar me D0 dhe **p <0,01 krahasuar me D12 Ctrl). b Grafiku me shtylla tregon sasinë e qëndrueshmërisë 12 ditë pas kulturës në të 4 kushtet e kulturës (Ctrl, TD, MC, dhe MT) krahasuar me feta të freskëta të zemrës (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD dhe D12 MT), 12 (D12 MC është e ndryshme nga testi i kryer ##p. 0,0001, ###p < 0,001 krahasuar me D0 dhe **p <0,01 krahasuar me D12 ctrl). b Гистограмма показывает количественную оценку жизнеспособности через 12 ditë pas культивирования во 4 kushtetях культивирования (kontroll, TD, MC dhe MT) me sravneniyu me shikueshmërinë e rezami (D10, CrdD) =28 trD (D10, 10) (D10, 10) (D10, 2000) D12 TD dhe D12 MT), 12 (D12 MC) резов/группу от разных свиней, provoitsya raportorny test ANOVA; b Grafiku me shtylla tregon sasinë e qëndrueshmërisë në 12 ditë pas kulturës në të gjitha 4 kushtet e kulturës (kontrolli, TD, MC dhe MT) krahasuar me seksionet e freskëta të zemrës (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD dhe D12 MT), 12 (D12 MC-nëpërsëdrejti) seksione të ndryshme.#0 001, ###p < 0,001 kundrejt D0 dhe **p < 0,01 nga krahasuar me D12 Ctrl). b 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) (n = 18 、12 TD D12 MT)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；####p < 测试；####p < 0.0001，#0##0 0,01 与D12控制）.b 4 12 (D12 MC) b Гистограмма, показывающая се 4 условия культивирования (контрола, TD, MC dhe MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD2 dhe D12) gruppa, raportornniй тест ANOVA; ####p <0,0001, ###p <0,001 по сравнению со D0, **p <0,01 по сравнению со контролем D12). b Histogrami që tregon të 4 kushtet e kulturës (kontrolli, TD, MC dhe MT) krahasuar me seksionet e freskëta të zemrës (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD dhe D12 MT), nga derra të ndryshëm 12 (D12 MC) seksione/grup, test ANOVA njëkahëshe v.#0#0<0.#0<0. 0, **p<0.01 kundrejt kontrollit D12). c Grafiku me shtyllë tregon sasinë e fluksit të glukozës 12 ditë pas kulturës në të 4 kushtet e kulturës (Ctrl, TD, MC dhe MT) krahasuar me feta të freskëta të zemrës (D0) (n = 6 feta/grup nga derra të ndryshëm, është kryer testi ANOVA njëkahëshe; ###p <0.000 dhe 1 C krahasohet me D2001). c Grafiku me shtyllë tregon sasinë e fluksit të glukozës 12 ditë pas kulturës në të 4 kushtet e kulturës (Ctrl, TD, MC dhe MT) krahasuar me feta të freskëta të zemrës (D0) (n = 6 feta/grup nga derra të ndryshëm, është kryer testi ANOVA njëkahëshe; ###p <0.000 dhe 1 C krahasohet me D2001). c Гистограмма показывает количественную оценку потока глюкозы через 12 dite pas kultivirovania në të gjitha 4 kushtet e grupeve (kontrollь, TD, MC dhe MT) me sravneniyu me kultivirovanija (6 rrahje) й, односотронний Выполняется тест ANOVA; ###p < 0,001 по сравнению со D0 и ***p < 0,001 по сравнению со D12 Ctrl). c Histogrami tregon sasinë e fluksit të glukozës 12 ditë pas kulturës në të 4 kushtet e kulturës (kontrolli, TD, MC dhe MT) krahasuar me seksionet e freskëta të zemrës (D0) (n = 6 seksione/grup nga derra të ndryshëm, testi ANOVA njëkahësh i kryer; ###p <0,001 krahasuar me D0 dhe 100p <0.001). c 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) 相掹2，糖通量定量（n = 6 片/组，来自不同猪，单向执行ANOVA 测试；###p < 0.001，来自不同猪，单向执行ANOVA 测试；###p < 0.001，伌10 p. unë jam). C 条形图 显示 所有 4 种 条件 （（ctrl 、 td 、 mc 和 mt） 新鲜 心脏 切片 切片 切片 切片后 后 12 天 的 通量 定量 （n = 6 片 / 组试；###p < 0.001，与D0 相比，***p <0.001 与D12 Ctrl 相比）. c Гистограмма, показывающая кольчественную оценку потока глюкозы через 12 ditë pas kultivirovanija për të gjitha 4 kushtetй культивирования (kontrollь, TD, MC dhe MT) në lidhje me disa vjet (6, zv. от разных свиней, raportornniй Были проведены тесты ANOVA; ###p < 0,001 me sravneniyu со D0, ***p < 0,001 me sravneniyu me D12 (kontroll). c Histogram që tregon sasinë e fluksit të glukozës në 12 ditë pas kulturës për të 4 kushtet e kulturës (kontrolli, TD, MC dhe MT) krahasuar me seksionet e freskëta të zemrës (D0) (n = 6 seksione/grup, nga derra të ndryshëm, të njëanshëm U kryen testet ANOVA, ###p <0,001 krahasuar me kontrollin, ###p <0.0001).d Grafikët e analizës së tendosjes të indeve të freskëta (blu), të ditës 12 MC (jeshile) dhe të ditës 12 MT (të kuqe) në dhjetë pika rajonale të seksionit të indeve (n = 4 feta/grup, testi ANOVA në një drejtim; nuk kishte dallim të rëndësishëm midis grupeve).e Grafiku i vullkanit që tregon gjenet e shprehura në mënyrë diferenciale në seksione të freskëta të zemrës (D0) krahasuar me seksionet e zemrës të kultivuara në kushte statike (Ctrl) ose në kushte MT (MT) për 10-12 ditë.f Harta e nxehtësisë e gjeneve të sarkomerit për seksionet e zemrës të kultivuara në secilën prej kushteve të kulturës.Shiritat e gabimit përfaqësojnë mesataren ± devijimin standard.
Varësia metabolike nga kalimi nga oksidimi i acideve yndyrore në glikolizë është një shenjë dalluese e dediferencimit të kardiomiociteve.Kardiomiocitet e papjekur kryesisht përdorin glukozë për prodhimin e ATP dhe kanë mitokondri hipoplastike me pak krista5,32.Analizat e përdorimit të glukozës treguan se në kushtet e MC dhe MT, përdorimi i glukozës ishte i ngjashëm me atë në indet e ditës 0 (Figura 4c).Sidoqoftë, mostrat Ctrl treguan një rritje të konsiderueshme në përdorimin e glukozës në krahasim me indet e freskëta.Kjo tregon se kombinimi i CTCM dhe T3/Dex rrit qëndrueshmërinë e indeve dhe ruan fenotipin metabolik të seksioneve të kultivuara të zemrës 12-ditore.Përveç kësaj, analiza e tendosjes tregoi se nivelet e tendosjes mbetën të njëjta si në indet e freskëta të zemrës për 12 ditë në kushte MT dhe MS (Fig. 4d).
Për të analizuar ndikimin e përgjithshëm të CTCM dhe T3/Dex në peizazhin global transkriptues të indit të fetës kardiake, ne kryem RNAseq në feta kardiake nga të katër kushtet e ndryshme të kulturës (Të dhënat Suplementare 1).Është interesante se seksionet MT treguan ngjashmëri të lartë transkriptuese me indet e freskëta të zemrës, me vetëm 16 të shprehura në mënyrë diferenciale nga 13,642 gjene.Megjithatë, siç treguam më herët, fetat Ctrl shfaqën 1229 gjene të shprehura në mënyrë diferenciale pas 10-12 ditësh në kulturë (Fig. 4e).Këto të dhëna u konfirmuan me qRT-PCR të gjeneve të zemrës dhe fibroblasteve (Fig. Suplementare 7a-c).Interesante, seksionet Ctrl treguan uljen e rregullimit të gjeneve të ciklit kardiak dhe qelizor dhe aktivizimin e programeve të gjeneve inflamatore.Këto të dhëna sugjerojnë se dediferencimi, i cili normalisht ndodh pas kultivimit afatgjatë, zbutet plotësisht në kushtet e MT (Figura plotësuese 8a,b).Studimi i kujdesshëm i gjeneve të sarkomerëve tregoi se vetëm në kushte MT ruhen gjenet që kodojnë sarkomerin (Fig. 4f) dhe kanalin jonik (Fig. Suplementar 9), duke i mbrojtur ata nga shtypja nën kushtet e Ctrl, TD dhe MC.Këto të dhëna tregojnë se me një kombinim të stimulimit mekanik dhe humoral (T3/Dex), transkriptomi i fetës së zemrës mund të mbetet i ngjashëm me feta të freskëta të zemrës pas 12 ditësh në kulturë.
Këto gjetje transkriptuese mbështeten nga fakti se integriteti strukturor i kardiomiociteve në seksionet e zemrës ruhet më së miri në kushte MT për 12 ditë, siç tregohet nga koneksina 43 e paprekur dhe e lokalizuar (Fig. 5a).Përveç kësaj, fibroza në seksionet e zemrës në kushte MT u reduktua ndjeshëm në krahasim me Ctrl dhe e ngjashme me seksionet e zemrës së freskët (Fig. 5b).Këto të dhëna tregojnë se kombinimi i stimulimit mekanik dhe trajtimit T3/Dex ruan në mënyrë efektive strukturën kardiake në seksionet e zemrës në kulturë.
a Imazhe përfaqësuese të imunofluoreshencës të troponin-T (jeshile), koneksinës 43 (e kuqe) dhe DAPI (blu) në seksione të sapoizoluara të zemrës (D0) ose të kultivuara për 12 ditë në të katër kushtet e kulturës së seksionit të zemrës (shiriti i shkallës = 100 µm).). Përcaktimi sasior i inteligjencës artificiale të integritetit strukturor të indit të zemrës (n = 7 (D0 dhe D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC dhe D12 MT) feta/grup nga derra të ndryshëm, është kryer testi ANOVA në një drejtim; ####p < 0.0001 krahasuar me D0 dhe D12 <0. l). Përcaktimi sasior i inteligjencës artificiale të integritetit strukturor të indit të zemrës (n = 7 (D0 dhe D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC dhe D12 MT) feta/grup nga derra të ndryshëm, është kryer testi ANOVA i njëanshëm; #### p < 0.0001 krahasuar me D0 dhe D12 <0. l). Количественная оценка структурной целости ткани сердца со помощью искусственного интеллекта (n = 7 (D0 и D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC и D12 MT) тестови/группу од разных свиней, т.е. 01 по сравнению со D0 dhe *p < 0,05 ose ****p < 0,0001 по сравнению со D12 Ctrl). Përcaktimi sasior i integritetit strukturor të indit të zemrës duke përdorur inteligjencën artificiale (n = 7 (D0 dhe D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC dhe D12 MT) seksione/grup nga derra të ndryshëm, testi ANOVA në një drejtim i kryer; #### p < 0.0001 krahasuar me D0 dhe *p 05 <00p < .对不同猪的心脏组织结构完整性（n = 7（D0 和D12 Ctrl）、5（D12 TD、D12 MC 和D12 主工智能量化，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0,0001 与D0 和*p < 0,05 相比，或****p 2 tr1DC < 0,000对 不同 猪 的 心脏 结构 完整性 （n = 7 （d0 和 d12 ctrl） （5 （d12 td 、 d12 mＥ2 mc智能量 化 进行 单向 单向 单向 测试 ； ######### p < 0,0001 与D0 和*p < 0,05 缛 0 l相比）.Kuantifikimi i integritetit strukturor të indit kardiak duke përdorur inteligjencën artificiale në derra të ndryshëm (n = 7 (D0 dhe D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC dhe D12 MT) seksione/grup) me një test ANOVA të njëanshme;#### p < 0,0001 по сравнению со D0 dhe *p < 0,05 ose ****p < 0,0001 по сравнению со D12 Ctrl). #### p <0.0001 krahasuar me D0 dhe *p <0.05 ose ****p <0.0001 krahasuar me D12 Ctrl). b Imazhe përfaqësuese dhe përcaktimi sasior për feta zemre të njollosura me njollën trikrome të Masson (shiriti i shkallës = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD dhe D12 MC), 9 feta (D12 MT)/grupi nga derrat e ndryshëm. dhe ***p < 0,001, ose ****p < 0,0001 krahasuar me D12 Ctrl). b Imazhe përfaqësuese dhe përcaktimi sasior për feta zemre të njollosura me njollën trikrome të Masson (shiriti i shkallës = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD dhe D12 MC), 9 feta (D12 MT)/grupi nga derrat e ndryshëm. dhe ***p < 0,001, ose ****p < 0,0001 krahasuar me D12 Ctrl). b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромным красителем Massona (масштабная линейка = 500 mkm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD MT) dhe D12 TD ых свиней, выполняется односторонний тест ANOVA; ####p < 0,0001 me sravneniyu со D0 dhe ***p < 0,001 ose ****p < 0,0001 me sravneniyu me D12 Ctrl). b Imazhet përfaqësuese dhe përcaktimi sasior i seksioneve të zemrës të njollosura me njollën trikrome të Masson (shiriti i shkallës = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD dhe D12 MC), 9 (D12 MT) seksione/grup nga derra të ndryshëm, të kryera njëkahëshe v.#0p <0. 001 ose ****p < 0,0001 kundrejt D12 Ctrl). b.和D12 MC），来自不同猪的9 个（D12 MT）切片/组，进行单因素方差分析； 个（D12 MT）切片/组，进行单因素方差分析； <1####P 0,001，或****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）. b 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 和 量化l 、 d12 td 和 d12 mc） 来自 不同 的 9 个 d12 mt 切片 切片 切片 切片 切片 切燉 切燉 切燉 切燉片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片/组，进行单因素方差分方差分方差分析001. ***p < 0,001，或****p <0,0001 与D12 Ctrl 相比）. b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихром Massona (масштабная линейка = 500 mkm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD dhe D12 MC) , один- способ ANOVA; ####p < 0,0001 në sraвнению со D0, ***p < 0,001 ose ****p < 0,0001 по сравнению со D12 Ctrl). b Imazhe përfaqësuese dhe përcaktimi sasior i seksioneve të zemrës të ngjyrosura me trikromin e Masson-it (shiriti i shkallës = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD dhe D12 MC), 9 (D12 MT) seksione nga derra/grup të ndryshëm, një metodë ANOVA; #0, krahasuar me <0#0#0. ****p < 0,0001 krahasuar me D12 Ctrl).Shiritat e gabimit përfaqësojnë mesataren ± devijimin standard.
Më në fund, aftësia e CTCM për të imituar hipertrofinë kardiake u vlerësua duke rritur shtrirjen e indit kardiak.Në CTCM, presioni maksimal i dhomës së ajrit u rrit nga 80 mmHg në 80 mmHg.Art.(shtrirje normale) deri në 140 mmHg Art.(Fig. 6a).Kjo korrespondon me një rritje prej 32% në shtrirje (Fig. 6b), e cila u tregua më parë si përqindja përkatëse e shtrirjes që kërkohet për seksionet e zemrës për të arritur një gjatësi sarkomeri të ngjashme me atë që shihet në hipertrofi.Shtrirja dhe shpejtësia e indit kardiak gjatë tkurrjes dhe relaksimit mbetën konstante gjatë gjashtë ditëve të kulturës (Fig. 6c).Indet kardiake nga kushtet e MT iu nënshtruan shtrirjes normale (MT (Normal)) ose kushteve të mbishtrirjes (MT (OS)) për gjashtë ditë.Tashmë pas katër ditësh në kulturë, biomarkeri hipertrofik NT-ProBNP u ngrit ndjeshëm në mjedis në kushte MT (OS) krahasuar me kushtet MT (normale) (Fig. 7a).Përveç kësaj, pas gjashtë ditësh kultivimi, madhësia e qelizave në MT (OS) (Fig. 7b) u rrit ndjeshëm në krahasim me seksionet e zemrës MT (normale).Përveç kësaj, translokimi bërthamor i NFATC4 u rrit ndjeshëm në indet e tepërta (Fig. 7c).Këto rezultate tregojnë zhvillimin progresiv të rimodelimit patologjik pas hiperdistensionit dhe mbështesin konceptin se pajisja CTCM mund të përdoret si një platformë për të studiuar sinjalizimin e hipertrofisë kardiake të induktuar nga shtrirja.
Gjurmët përfaqësuese të presionit të dhomës së ajrit, presionit të dhomës së lëngut dhe matjeve të lëvizjes së indeve konfirmojnë se presioni i dhomës ndryshon presionin e dhomës së lëngut, duke shkaktuar një lëvizje përkatëse të fetës së indit.b Kurbat përfaqësuese të përqindjes së shtrirjes dhe shkallës së shtrirjes për seksionet e indeve të shtrira normalisht (portokalli) dhe të tepërta (blu).c Grafiku me shtylla që tregon kohën e ciklit (n = 19 feta për grup, nga derra të ndryshëm), kohën e tkurrjes (n = 18-19 feta për grup, nga derra të ndryshëm), kohën e relaksimit (n = 19 feta për grup, nga derra të ndryshëm) ), amplituda e lëvizjes së indeve (n = 14 feta/derra, vepërsia 1, grupi, nga të ndryshme nga derra të ndryshëm) dhe shpejtësia maksimale e relaksimit (n = 14 (D0), 15 (D6) ) seksione/grupe) nga derra të ndryshëm), testi studentor me dy bishta nuk tregoi ndonjë ndryshim domethënës në asnjë parametër, duke treguar se këto parametra mbetën konstante gjatë 6 ditëve të kulturës me mbitension.Shiritat e gabimit përfaqësojnë mesataren ± devijimin standard.
një grafik shiritor kuantifikimi i përqendrimit të NT-ProBNP në mjediset e kulturës nga feta zemre të kultivuara nën kushte MT shtrirje normale (Normale) ose mbishtrirje (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm dhe D4 MTOS) feta/grup nga derra të ndryshëm. **1 ANOVA është kryer në dy drejtime. një grafik shiritor kuantifikimi i përqendrimit të NT-ProBNP në mjediset e kulturës nga feta zemre të kultivuara në kushte MT shtrirje normale (Norm) ose mbishtrirje (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm dhe D4 MTOS) feta/grupi ** ANOVA në dy drejtime, krahasohet me normale të derrave.Histograma sasiore e përqendrimit të NT-ProBNP në mjedisin e kulturës nga feta zemre të kultivuara në kushte të shtrirjes normale të MT (norma) ose mbishtrirjes (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, dhe D4). MTOS) feta / grup nga derra të ndryshëm të kryer, analiza e dyfishtë.**p < 0,01 по сравнению со нормальным растяжением). **p < 0,01 krahasuar me shtrirjen normale). një 在MT 正常拉伸(Norm) 或过度拉伸(OS) 条件下培养的心脏切片培养基中NT-ProBNP = 4 (D2 MTNorm)、3（D2 MTOS、D4 MTNorm 和D4 MTOS）来自不同猪的切片/组，进行双向方差分分切片/组，进行双向方差分分，p < 0,01）. një kuantifikimi i përqendrimit të NT-ProBNP në feta zemre të kultivuara nën kushte të shtrirjes normale MT (Normale) ose mbishtrirjeje (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm和D4 MTOS) nga 猪的切片/组，动; **krahasuar me shtrirjen normale, p <0.01).Histogrami Kuantifikimi i përqendrimeve të NT-ProBNP në feta zemre të kultivuara në kushte të shtrirjes normale të MT (norma) ose mbishtrirjes (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm) dhe D4 MTOS) feta/grup nga derra të ndryshëm, analiza e dyanshme e variancës;**p < 0,01 по сравнению со нормальным растяжением). **p < 0,01 krahasuar me shtrirjen normale). b Imazhe përfaqësuese për feta zemre të njollosura me troponin-T dhe WGA (majtas) dhe kuantifikimi i madhësisë së qelizave (djathtas) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) qeliza/grup nga 10 feta të ndryshme nga derra të ndryshëm, Testi Student t-i me dy bisht është kryer në krahasim me 1 normale 000p. b Imazhe përfaqësuese për feta zemre të ngjyrosura me troponin-T dhe WGA (majtas) dhe kuantifikimi i madhësisë së qelizës (djathtas) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) qeliza/grup nga 10 feta të ndryshme nga derra të ndryshëm, Testi Student t-t-test me dy bishta është kryer krahasuar me t-testin me dy bisht <0 me normale; ****0). b Репрезентативные изображения сорезов сердца, окрашенных troponinom-Т и АЗП (слева) и колчественного përcaktimiя размера свиок (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) - проводится хвостовой t-критерий Стьюдента; ****p < 0,0001 по сравнению со нормальным растяжением). b Imazhet përfaqësuese të seksioneve të zemrës të ngjyrosura me troponin-T dhe AZP (majtas) dhe kuantifikimi i madhësisë së qelizës (djathtas) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) qeliza/grup nga 10 seksione të ndryshme nga derra të ndryshëm, testi studentor me dy bisht u krahasua me t-testin e Studentit <0 me 00p normale. b 用肌钙蛋白-T 和WGA（左）和细胞大小量化（右）染色的心脏切片的代表惞3 ），来自不同猪的10 个不同切片的369（D6 MTNorm）细胞/组，两进行有尾学甸t比，****p <0.0001）. b Imazhet përfaqësuese të fetave të zemrës të njollosura me kalkareinë-T dhe WGA (majtas) dhe madhësinë e qelizave (djathtas) (n = 330 (D6 MTOS), 369 nga 10 feta të ndryshme (D6 MTNorm)) Qeliza/组，两方法有得0.0001). b Репрезентативные изображения сорезов сердца, окрашенных troponinom-Т и АЗП (слева) и количественная оценка размера клеток (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm zvarritje) из10 , двусторонние критерий Стьюдента; ****p < 0,0001 по сравнению со нормальным растяжением). b Imazhe përfaqësuese të seksioneve të zemrës të ngjyrosura me troponin-T dhe AZP (majtas) dhe kuantifikimi i madhësisë së qelizës (djathtas) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) nga 10 seksione të ndryshme nga derra të ndryshëm) Qelizat/grupi, kriteri me dy bisht T Studenti;****p < 0.0001 krahasuar me sforcimin normal). c Imazhe përfaqësuese për fetat e zemrës MTOS të ditës 0 dhe 6 të imunoetiketuara për troponin-T dhe NFATC4 dhe përcaktimi sasior i zhvendosjes së NFATC4 në bërthamat e CM-ve (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) feta/grup nga derra të ndryshëm, kryhet test me dy bishta *5. c Imazhe përfaqësuese për fetat e zemrës MTOS të ditës 0 dhe të ditës 6 të imunoetiketuara për troponin-T dhe NFATC4 dhe përcaktimi sasior i zhvendosjes së NFATC4 në bërthamat e CMs (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) feta/grup nga derra të ndryshëm, është kryer testimi me dy bisht *5 Student tp <0 ; c. ных свиней , выполняется двусторонний t-критерий Стьюдента; *p < 0,05). c Imazhe përfaqësuese për seksionet e zemrës në MTOS 0 dhe 6 ditë, të imunizuara për troponin-T dhe NFATC4, dhe përcaktimi sasior i zhvendosjes së NFATC4 në bërthamën e qelizave kavernoze (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) feta/grup nga derra të ndryshëm) u kryen testime me dy bishta nga studentët;*p <0,05). c 用于肌钙蛋白-T 和NFATC4 免疫标记的第0 天和第6 天MTOS 心脏切片的代表性图天和第6 天MTOS 心脏切片的代表性叛的NFATC4 易位至CM 细胞核的量化（n = 4 (D0)、3 (D6 MTOS) 切片/组, 进行双尾学甪t 。* 5 . c Imazhe përfaqësuese të imunoetiketimit calcanin-T dhe NFATC4 第0天和第6天MTOS feta zemre, dhe NFATC4 nga bërthama e ndryshme e qelizave NFATC4 易位至CM的sasia化 (n = 4 (D6 MTOS),间双尾学生et 电影；*p <0,05). c. -критерий Стьюдента; *p < 0,05). c Imazhe përfaqësuese të fetave të zemrës MTOS në ditën 0 dhe 6 për etiketimin e imunitetit të troponin-T dhe NFATC4 dhe përcaktimin sasior të translokimit të NFATC4 në bërthamën e CM nga derra të ndryshëm (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) feta/grup, studentë me dy bishta <0'0 t -kriter).Shiritat e gabimit përfaqësojnë mesataren ± devijimin standard.
Hulumtimi përkthimor kardiovaskular kërkon modele qelizore që riprodhojnë me saktësi mjedisin kardiak.Në këtë studim, u zhvillua dhe u karakterizua një pajisje CTCM që mund të stimulojë seksione tepër të holla të zemrës.Sistemi CTCM përfshin stimulimin elektromekanik të sinkronizuar fiziologjikisht dhe pasurimin e lëngjeve T3 dhe Dex.Kur seksionet e zemrës së derrit u ekspozuan ndaj këtyre faktorëve, qëndrueshmëria e tyre, integriteti strukturor, aktiviteti metabolik dhe shprehja transkriptuese mbetën të njëjta si në indet e freskëta të zemrës pas 12 ditësh kulturë.Përveç kësaj, shtrirja e tepërt e indit kardiak mund të shkaktojë hipertrofi të zemrës të shkaktuar nga hiperekstensioni.Në përgjithësi, këto rezultate mbështesin rolin kritik të kushteve të kulturës fiziologjike në ruajtjen e një fenotipi normal kardiak dhe ofrojnë një platformë për shqyrtimin e barnave.
Shumë faktorë kontribuojnë në krijimin e një mjedisi optimal për funksionimin dhe mbijetesën e kardiomiociteve.Më të dukshmet nga këta faktorë lidhen me (1) ndërveprimet ndërqelizore, (2) stimulimin elektromekanik, (3) faktorët humoralë dhe (4) substratet metabolike.Ndërveprimet fiziologjike qelizë me qelizë kërkojnë rrjete komplekse tre-dimensionale të llojeve të shumta qelizore të mbështetura nga një matricë jashtëqelizore.Ndërveprime të tilla komplekse qelizore janë të vështira për t'u rindërtuar in vitro nga bashkëkultura e llojeve individuale të qelizave, por mund të arrihen lehtësisht duke përdorur natyrën organotipike të seksioneve të zemrës.
Shtrirja mekanike dhe stimulimi elektrik i kardiomiociteve janë kritike për ruajtjen e fenotipit kardiak33,34,35.Ndërsa stimulimi mekanik është përdorur gjerësisht për kondicionimin dhe maturimin e hiPSC-CM, disa studime elegante kanë tentuar kohët e fundit stimulimin mekanik të fetave të zemrës në kulturë duke përdorur ngarkimin njëaksial.Këto studime tregojnë se ngarkesa mekanike njëaksiale 2D ka një efekt pozitiv në fenotipin e zemrës gjatë kulturës.Në këto studime, seksionet e zemrës ose u ngarkuan me forca tërheqëse izometrike17, ngarkim linear austotonik18, ose cikli kardiak u rikrijua duke përdorur reagimin e dhënës të forcës dhe lëvizjet e tensionit.Megjithatë, këto metoda përdorin shtrirje uniaksiale të indeve pa optimizim mjedisor, duke rezultuar në shtypjen e shumë gjeneve kardiake ose në mbishprehje të gjeneve të shoqëruara me përgjigje jonormale të shtrirjes.CTCM i përshkruar këtu ofron një stimul elektromekanik 3D që imiton ciklin natyror kardiak për sa i përket kohës së ciklit dhe shtrirjes fiziologjike (25% shtrirje, 40% sistolë, 60% diastole dhe 72 rrahje në minutë).Megjithëse ky stimulim mekanik tredimensional i vetëm nuk është i mjaftueshëm për të ruajtur integritetin e indeve, një kombinim i stimulimit humoral dhe mekanik duke përdorur T3/Dex kërkohet për të ruajtur në mënyrë adekuate qëndrueshmërinë, funksionin dhe integritetin e indeve.
Faktorët humoralë luajnë një rol të rëndësishëm në modulimin e fenotipit të zemrës së të rriturve.Kjo u theksua në studimet e HiPS-CM në të cilat T3 dhe Dex u shtuan në mjediset e kulturës për të përshpejtuar maturimin e qelizave.T3 mund të ndikojë në transportin e aminoacideve, sheqernave dhe kalciumit nëpër membranat qelizore36.Përveç kësaj, T3 promovon shprehjen e MHC-α dhe uljen e MHC-β, duke nxitur formimin e miofibrileve me tkurrje të shpejtë në kardiomiocitet e pjekur krahasuar me miofibrilet me tkurrje të ngadaltë në CM fetale.Mungesa e T3 në pacientët me hipotiroide rezulton në humbjen e brezave miofibrilarë dhe një shkallë të reduktuar të zhvillimit të tonit37.Dex vepron në receptorët glukokortikoid dhe është treguar se rrit kontraktilitetin e miokardit në zemrat e izoluara të perfuzuara;38 ky përmirësim mendohet të jetë i lidhur me efektin në hyrjen e drejtuar nga depozitat e kalciumit (SOCE) 39,40.Përveç kësaj, Dex lidhet me receptorët e tij, duke shkaktuar një përgjigje të gjerë ndërqelizore që shtyp funksionin imunitar dhe inflamacionin30.
Rezultatet tona tregojnë se stimulimi fizik mekanik (MS) përmirësoi performancën e përgjithshme të kulturës në krahasim me Ctrl, por nuk arriti të ruajë qëndrueshmërinë, integritetin strukturor dhe shprehjen kardiake gjatë 12 ditëve në kulturë.Krahasuar me Ctrl, shtimi i kulturave T3 dhe Dex në CTCM (MT) përmirësoi qëndrueshmërinë dhe mbajti profile të ngjashme transkriptimi, integritet strukturor dhe aktivitet metabolik me indet e freskëta të zemrës për 12 ditë.Përveç kësaj, duke kontrolluar shkallën e shtrirjes së indeve, u krijua një model i hipertrofisë kardiake të induktuar nga hiperekstensioni duke përdorur STCM, duke ilustruar shkathtësinë e sistemit STCM.Duhet të theksohet se megjithëse rimodelimi kardiak dhe fibroza zakonisht përfshijnë organe të paprekura, qelizat qarkulluese të të cilave mund të ofrojnë citokinat e duhura, si dhe fagocitozën dhe faktorë të tjerë rimodelues, pjesët e zemrës mund të imitojnë ende procesin fibrotik në përgjigje të stresit dhe traumës.në miofibroblaste.Kjo është vlerësuar më parë në këtë model të fetës kardiake.Duhet të theksohet se parametrat CTCM mund të modulohen duke ndryshuar presionin/amplitudën elektrike dhe frekuencën për të simuluar shumë gjendje si takikardia, bradikardia dhe mbështetja mekanike e qarkullimit (zemra mekanike e pa ngarkuar).Kjo e bën sistemin një kapacitet mesatar për testimin e drogës.Aftësia e CTCM për të modeluar hipertrofinë kardiake të shkaktuar nga mbitensioni hap rrugën për testimin e këtij sistemi për terapi të personalizuar.Si përfundim, studimi aktual tregon se shtrirja mekanike dhe stimulimi humoral janë kritike për ruajtjen e kulturës së seksioneve të indit kardiak.
Megjithëse të dhënat e paraqitura këtu sugjerojnë se CTCM është një platformë shumë premtuese për modelimin e miokardit të paprekur, kjo metodë e kulturës ka disa kufizime.Kufizimi kryesor i kulturës CTCM është se ajo imponon strese të vazhdueshme mekanike dinamike në feta, gjë që përjashton aftësinë për të monitoruar në mënyrë aktive kontraktimet e fetës kardiake gjatë çdo cikli.Përveç kësaj, për shkak të madhësisë së vogël të seksioneve kardiake (7 mm), aftësia për të vlerësuar funksionin sistolik jashtë sistemeve të kulturës duke përdorur sensorë tradicionalë të forcës është i kufizuar.Në dorëshkrimin aktual, ne e kapërcejmë pjesërisht këtë kufizim duke vlerësuar tensionin optik si një tregues të funksionit kontraktues.Megjithatë, ky kufizim do të kërkojë punë të mëtejshme dhe mund të adresohet në të ardhmen duke futur metoda për monitorimin optik të funksionit të fetave të zemrës në kulturë, të tilla si harta optike duke përdorur kalcium dhe ngjyra të ndjeshme ndaj tensionit.Një kufizim tjetër i CTCM është se modeli i punës nuk manipulon stresin fiziologjik (prengarkesë dhe pas ngarkesës).Në CTCM, presioni u nxit në drejtime të kundërta për të riprodhuar shtrirje fiziologjike 25% në diastole (shtrirje e plotë) dhe sistole (gjatësia e tkurrjes gjatë stimulimit elektrik) në inde shumë të mëdha.Ky kufizim duhet të hiqet në modelet e ardhshme të CTCM me presion adekuat në indin kardiak nga të dyja anët dhe duke aplikuar marrëdhëniet e sakta presion-vëllim që ndodhin në dhomat e zemrës.
Rimodelimi i shkaktuar nga mbishtrirja e raportuar në këtë dorëshkrim është i kufizuar në imitimin e sinjaleve hiperstretch hipertrofike.Kështu, ky model mund të ndihmojë në studimin e sinjalizimit hipertrofik të induktuar nga shtrirja pa pasur nevojë për faktorë humoralë ose nervorë (të cilët nuk ekzistojnë në këtë sistem).Studime të mëtejshme nevojiten për të rritur shumëllojshmërinë e CTCM, për shembull, bashkëkulturimi me qelizat imune, faktorët humoralë të plazmës qarkulluese dhe inervimi kur bashkëkulturimi me qelizat neuronale do të përmirësojë mundësitë e modelimit të sëmundjes me CTCM.
Në këtë studim u përdorën 13 derra.Të gjitha procedurat e kafshëve u kryen në përputhje me udhëzimet institucionale dhe u miratuan nga Komiteti i Kujdesit dhe Përdorimit Institucional të Kafshëve të Universitetit të Louisville.Harku i aortës u mbërthye dhe zemra u perfuzua me 1 L kardioplegji sterile (110 mM NaCl, 1.2 mM CaCl2, 16 mM KCl, 16 mM MgCl2, 10 mM NaHCO3, 5 U/mL heparinë, pH deri në 7); zemrat u ruajtën në tretësirë ​​kardioplegjike të ftohtë në akull derisa të transportoheshin në laborator në akull që zakonisht është <10 min. zemrat u ruajtën në tretësirë ​​kardioplegjike të ftohtë në akull derisa të transportoheshin në laborator në akull që zakonisht është <10 min. Serdca хранили në ледяном кардиоплегическом shpërndahet deri në transportirov në laboratorët e lumit, që nuk kërkon <10 min. zemrat u ruajtën në tretësirë ​​kardioplegjike të ftohtë në akull deri në transportin në laborator në akull, i cili zakonisht zgjat <10 min.将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钞将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钞 Держите сердца во ледяной кардиоплегии до transportirovki në laboratorët e lьdu, обычно <10 мин. Mbani zemrat në kardioplegji akulli deri në transportin në laborator në akull, zakonisht <10 min.
Pajisja CTCM u zhvillua në softuerin SolidWorks të dizajnit me ndihmën e kompjuterit (CAD).Dhomat e kulturës, ndarësit dhe dhomat e ajrit janë bërë nga plastika akrilike e pastër CNC.Unaza mbështetëse me diametër 7 mm është bërë nga polietileni me densitet të lartë (HDPE) në qendër dhe ka një brazdë unaze o për të akomoduar unazën o silikoni që përdoret për të vulosur median poshtë.Një membranë e hollë silicë ndan dhomën e kulturës nga pllaka ndarëse.Membrana e silikonit është e prerë me lazer nga fletë silikoni 0,02 inç të trashë dhe ka një fortësi prej 35A.Guarnicionet e poshtme dhe të sipërme silikoni janë të prera me lazer nga fletë silikoni 1/16 inç të trashë dhe kanë një fortësi prej 50A.Vida prej çeliku inox 316L dhe dadot e krahëve përdoren për fiksimin e bllokut dhe krijimin e një mbyllëse hermetike.
Një tabelë e dedikuar e qarkut të printuar (PCB) është projektuar për t'u integruar me sistemin C-PACE-EM.Prizat e lidhësit të makinës zvicerane në PCB janë të lidhura me elektroda grafiti me tela bakri të veshur me argjend dhe vida bronzi 0-60 të vidhosura në elektroda.Pllaka e qarkut të printuar vendoset në kapakun e printerit 3D.
Pajisja CTCM kontrollohet nga një aktivizues pneumatik i programueshëm (PPD) që krijon një presion të kontrolluar qarkullues të ngjashëm me një cikël kardiak.Ndërsa presioni brenda dhomës së ajrit rritet, membrana fleksibël silikoni zgjerohet lart, duke e detyruar mediumin nën zonën e indeve.Zona e indit më pas do të shtrihet nga ky dëbim i lëngjeve, duke imituar zgjerimin fiziologjik të zemrës gjatë diastolës.Në kulmin e relaksimit, stimulimi elektrik u aplikua nëpërmjet elektrodave grafit, të cilat reduktuan presionin në dhomën e ajrit dhe shkaktuan tkurrje të seksioneve të indeve.Brenda tubit është një valvul hemostatike me një sensor presioni për të zbuluar presionin në sistemin e ajrit.Presioni i ndjerë nga sensori i presionit aplikohet në një koleksionist të dhënash të lidhur me laptopin.Kjo lejon monitorimin e vazhdueshëm të presionit brenda dhomës së gazit.Kur u arrit presioni maksimal i dhomës (standard 80 mmHg, 140 mmHg OS), pajisja e marrjes së të dhënave u urdhërua të dërgonte një sinjal në sistemin C-PACE-EM për të gjeneruar një sinjal të tensionit bifazik për 2 ms, i vendosur në 4 V.
U morën seksione zemre dhe u kryen kushtet e kultivimit në 6 puse si më poshtë: Transferoni zemrat e grumbulluara nga ena e transferimit në një tabaka që përmban kardioplegji të ftohtë (4°C).Barkusha e majtë është izoluar me një teh steril dhe është prerë në copa 1-2 cm3.Këto blloqe indore u ngjitën në mbështetëset e indeve me ngjitës indi dhe u vendosën në një banjë indi mikrotomike vibruese që përmban tretësirën e Tyrode dhe oksigjenuar vazhdimisht (3 g/L 2,3-butanedion monooksime (BDM), 140 mM NaCl (8,18 g) . mM HEPES (2,38 g), 1 mM MgCl2 (1 ml tretësirë ​​1 M), 1,8 mM CaCl2 (1,8 ml tretësirë ​​1 M), deri në 1 L ddH2O).Mikrotomi vibrues u vendos për të prerë feta të trasha 300 μm në një frekuencë prej 80 Hz, një amplitudë vibrimi horizontal prej 2 mm dhe një shpejtësi avancimi prej 0.03 mm/s.Banja e indeve ishte e rrethuar me akull për ta mbajtur tretësirën të ftohtë dhe temperatura u mbajt në 4°C.Transferoni seksionet e indeve nga banja me mikrotomë në një banjë inkubacioni që përmban tretësirë ​​të vazhdueshme të oksigjenuar të Tyrode në akull derisa të përftohen seksione të mjaftueshme për një pjatë kultivimi.Për kulturat transpuse, seksionet e indeve u ngjitën në mbështetëse poliuretani sterile me gjerësi 6 mm dhe u vendosën në 6 ml medium të optimizuar (199 medium, 1x suplement ITS, 10% FBS, 5 ng/ml VEGF, 10 ng/ml FGF-alkaline dhe 2X antibiotik-antifungal).Stimulimi elektrik (10 V, frekuenca 1.2 Hz) u aplikua në seksionet e indeve përmes C-Pace.Për kushtet TD, T3 dhe Dex të freskëta u shtuan në 100 nM dhe 1 μM në çdo ndryshim të mediumit.Mediumi është i ngopur me oksigjen para zëvendësimit 3 herë në ditë.Seksionet e indeve u kultivuan në një inkubator në 37°C dhe 5% CO2.
Për kulturat CTCM, seksionet e indeve u vendosën në një printer 3D të bërë me porosi në një pjatë Petri që përmban tretësirën e modifikuar Tyrode.Pajisja është krijuar për të rritur madhësinë e fetës së zemrës me 25% të zonës së unazës mbështetëse.Kjo bëhet në mënyrë që pjesët e zemrës të mos shtrihen pasi të transferohen nga tretësira e Tyrode në medium dhe gjatë diastolës.Duke përdorur ngjitësin histoakrilik, seksionet me trashësi 300 µm u fiksuan në një unazë mbështetëse me diametër 7 mm.Pas bashkimit të seksioneve të indeve në unazën mbështetëse, preni seksionet e indeve të tepërta dhe vendosini pjesët e indeve të ngjitura përsëri në banjën e tretësirës Tyrode në akull (4°C) derisa të përgatiten pjesë të mjaftueshme për një pajisje.Koha totale e përpunimit për të gjitha pajisjet nuk duhet të kalojë 2 orë.Pasi 6 seksione indi u ngjitën në unazat e tyre mbështetëse, pajisja CTCM u montua.Dhoma e kulturës CTCM është e mbushur paraprakisht me 21 ml mjedis të paraoksigjenuar.Transferoni pjesët e indeve në dhomën e kulturës dhe hiqni me kujdes çdo flluskë ajri me një pipetë.Seksioni i indit më pas drejtohet në vrimë dhe shtypet butësisht në vend.Së fundi, vendosni kapakun e elektrodës në pajisje dhe transferojeni pajisjen në inkubator.Më pas lidhni CTCM me tubin e ajrit dhe sistemin C-PACE-EM.Aktivizuesi pneumatik hapet dhe valvula e ajrit hap CTCM.Sistemi C-PACE-EM u konfigurua për të dhënë 4 V në 1,2 Hz gjatë ritmit dyfazor për 2 ms.Mediumi ndërrohej dy herë në ditë dhe elektrodat ndërroheshin një herë në ditë për të shmangur akumulimin e grafitit në elektroda.Nëse është e nevojshme, seksionet e indeve mund të hiqen nga pusetat e tyre të kulturës për të nxjerrë çdo flluskë ajri që mund të ketë rënë nën to.Për kushtet e trajtimit MT, T3/Dex u shtua i freskët me çdo ndryshim mesatar me 100 nM T3 dhe 1 μM Dex.Pajisjet CTCM u kultivuan në një inkubator në 37°C dhe 5% CO2.
Për të marrë trajektoret e shtrirë të fetave të zemrës, u zhvillua një sistem i veçantë kamerash.Një aparat fotografik SLR (Canon Rebel T7i, Canon, Tokio, Japoni) u përdor me një lente makro Navitar Zoom 7000 18-108 mm (Navitar, San Francisco, CA).Vizualizimi u krye në temperaturën e dhomës pas zëvendësimit të mediumit me medium të freskët.Kamera është e pozicionuar në një kënd 51° dhe video regjistrohet me 30 korniza për sekondë.Së pari, softueri me burim të hapur (MUSCLEMOTION43) u përdor me Image-J për të përcaktuar sasinë e lëvizjes së fetave të zemrës.Maska u krijua duke përdorur MATLAB (MathWorks, Natick, MA, SHBA) për të përcaktuar rajonet me interes për rrahjet e zemrës për të shmangur zhurmën.Maskat e segmentuara manualisht aplikohen në të gjitha imazhet në një sekuencë kornizash dhe më pas kalohen në shtojcën MUSCLEMOTION.Muscle Motion përdor intensitetin mesatar të pikselëve në çdo kornizë për të përcaktuar sasinë e lëvizjes së tij në lidhje me kornizën e referencës.Të dhënat u regjistruan, u filtruan dhe u përdorën për të përcaktuar kohën e ciklit dhe për të vlerësuar shtrirjen e indeve gjatë ciklit kardiak.Videoja e regjistruar u përpunua pas duke përdorur një filtër dixhital me fazë zero të rendit të parë.Për të përcaktuar sasinë e shtrirjes së indeve (maja në majë), u krye analiza nga maja në majë për të dalluar midis majave dhe kufijve në sinjalin e regjistruar.Përveç kësaj, detrendimi kryhet duke përdorur një polinom të rendit të 6-të për të eliminuar zhvendosjen e sinjalit.Kodi i programit u zhvillua në MATLAB për të përcaktuar lëvizjen globale të indeve, kohën e ciklit, kohën e relaksimit dhe kohën e tkurrjes (Kodi i Programit Suplementar 44).
Për analizën e tendosjes, duke përdorur të njëjtat video të krijuara për vlerësimin mekanik të shtrirjes, fillimisht gjurmuam dy imazhe që përfaqësojnë majat e lëvizjes (pikat më të larta (të sipërme) dhe më të ulëta (të poshtme) të lëvizjes) sipas softuerit MUSCLEMOTION.Më pas ne segmentuam rajonet e indeve dhe aplikuam një formë algoritmi hijezues në indin e segmentuar (Figura plotësuese 2a).Më pas indi i segmentuar u nda në dhjetë nënsipërfaqe dhe sforcimi në secilën sipërfaqe u llogarit duke përdorur ekuacionin e mëposhtëm: Strain = (Sup-Sdown)/Sdown, ku Sup dhe Sdown janë distancat e formës nga hijet e sipërme dhe të poshtme të pëlhurës, respektivisht (Fig. Suplementare .2b).
Seksionet e zemrës u fiksuan në 4% paraformaldehid për 48 orë.Indet e fiksuara u dehidratuan në 10% dhe 20% saharozë për 1 orë, pastaj në 30% saharozë gjatë natës.Seksionet më pas u futën në përbërjen e temperaturës optimale të prerjes (përbërja OCT) dhe u ngrinë gradualisht në një banjë izopentani/akulli të thatë.Ruani blloqet e futjes OCT në -80 °C deri në ndarje.Slides u përgatitën si seksione me trashësi 8 μm.
Për të hequr OCT nga seksionet e zemrës, ngrohni rrëshqitjet në një bllok ngrohje në 95 °C për 5 minuta.Shtoni 1 ml PBS në secilën rrëshqitje dhe inkuboni për 30 minuta në temperaturën e dhomës, më pas përshkoni seksionet duke vendosur 0,1% Triton-X në PBS për 15 minuta në temperaturën e dhomës.Për të parandaluar lidhjen e antitrupave jospecifik me kampionin, shtoni 1 ml tretësirë ​​3% BSA në rrëshqitëse dhe inkuboni për 1 orë në temperaturën e dhomës.BSA u hoq më pas dhe rrëshqitjet u lanë me PBS.Shënoni çdo mostër me një laps.Antitrupat parësorë (të holluar 1:200 në 1% BSA) (koneksina 43 (Abcam; #AB11370), NFATC4 (Abcam; #AB99431) dhe troponin-T (Thermo Scientific; #MA5-12960) u shtuan gjatë 90 minutave, pastaj u shtuan antitrupat sekondarë të 01% (Alex 1%): 488 (Thermo Scientific; #A16079), kundër lepurit Alexa Fluor 594 (Thermo Scientific; #T6391) për 90 minuta të tjera Larë 3 herë me PBS Për të dalluar ngjyrosjen e synuar nga sfondi, ne përdorëm vetëm antitrupin dytësor si kontroll. Më në fund, u shtua njolla DAPI dhe u vendosën njolla bërthamore (në sliardues nail. -x zmadhimi) dhe mikroskopi Keyence me zmadhim 40x.
WGA-Alexa Fluor 555 (Thermo Scientific; #W32464) në 5 μg/ml në PBS u përdor për ngjyrosjen WGA dhe u aplikua në seksione fikse për 30 minuta në temperaturën e dhomës.Sllajdat u lanë më pas me PBS dhe në secilën rrëshqitje u shtua e zeza Sudan dhe u inkubuan për 30 minuta.Më pas, rrëshqitjet u lanë me PBS dhe u shtua medium për ngulitje vectashield.Slides u vizualizuan në një mikroskop Keyence me zmadhim 40x.
OCT u hoq nga mostrat siç përshkruhet më sipër.Pasi të keni hequr OCT, zhytni rrëshqitjet në tretësirën e Bouin gjatë natës.Më pas, rrëshqitjet u lanë me ujë të distiluar për 1 orë dhe më pas u vendosën në një tretësirë ​​fuksine të acidit aloe Bibrich për 10 minuta.Më pas rrëshqitjet u lanë me ujë të distiluar dhe u vendosën në një tretësirë ​​prej 5% fosfomolibden/5% acid fosfotungstik për 10 minuta.Pa shpëlarje, transferojini rrëshqitjet direkt në tretësirën blu të anilinës për 15 minuta.Më pas rrëshqitjet u lanë me ujë të distiluar dhe u vendosën në një tretësirë ​​të acidit acetik 1% për 2 minuta.Slides u thanë në 200 N etanol dhe u transferuan në ksilen.Slides me njolla u vizualizuan duke përdorur një mikroskop Keyence me një objektiv 10x.Përqindja e sipërfaqes së fibrozës u mat duke përdorur softuerin Keyence Analyzer.
Testi i qëndrueshmërisë së qelizave CyQUANT™ MTT (Invitrogen, Carlsbad, CA), numër katalogu V13154, sipas protokollit të prodhuesit me disa modifikime.Në veçanti, një grusht kirurgjik me diametër 6 mm është përdorur për të siguruar madhësi uniforme të indit gjatë analizës MTT.Indet u vendosën individualisht në pusetat e një pllake me 12 puse që përmban substrate MTT sipas protokollit të prodhuesit.Seksionet inkubohen në 37°C për 3 orë dhe indi i gjallë metabolizon substratin MTT për të formuar një përbërje të purpurt formazan.Zëvendësoni tretësirën MTT me 1 ml DMSO dhe inkuboni në 37 °C për 15 minuta për të nxjerrë formazan ngjyrë vjollce nga seksionet e zemrës.Mostrat u holluan 1:10 në DMSO në pllaka fundore të qarta me 96 pus dhe intensiteti i ngjyrës vjollcë u matur në 570 nm duke përdorur një lexues të pllakës Cytation (BioTek).Leximet u normalizuan në peshën e çdo fete të zemrës.
Media e fetës së zemrës u zëvendësua me media që përmban 1 μCi/ml [5-3H]-glukozë (Moravek Biochemicals, Brea, CA, USA) për analizën e përdorimit të glukozës siç përshkruhet më parë.Pas 4 orësh inkubimi, shtoni 100 µl medium në një tub mikrocentrifuge të hapur që përmban 100 µl HCl 0,2 N.Më pas tubi u vendos në një tub scintilacioni që përmban 500 μl dH2O për të avulluar [3H]2O për 72 orë në 37°C.Më pas hiqeni tubin e mikrocentrifugës nga tubi i scintilacionit dhe shtoni 10 ml lëng scintilation.Numërimi i scintilacionit u krye duke përdorur një analizues të lëngshëm shintilimi Tri-Carb 2900TR (Packard Bioscience Company, Meriden, CT, USA).Përdorimi i glukozës u llogarit më pas duke marrë parasysh aktivitetin specifik të [5-3H]-glukozës, ekuilibrin dhe sfondin jo të plotë, hollimin e [5-3H]-në glukozë të paetiketuar dhe efikasitetin kundër shkëndijës.Të dhënat normalizohen në masën e seksioneve të zemrës.
Pas homogjenizimit të indeve në Trizol, ARN u izolua nga seksionet e zemrës duke përdorur Qiagen miRNeasy Micro Kit #210874 sipas protokollit të prodhuesit.Përgatitja, renditja dhe analiza e të dhënave të bibliotekës RNAsec u krye si më poshtë:
1 μg ARN për mostër u përdor si material fillestar për përgatitjen e bibliotekës së ARN-së.Bibliotekat e renditjes u krijuan duke përdorur Kompletin e Përgatitjes së Bibliotekës NEBNext UltraTM RNA për Illumina (NEB, USA) pas rekomandimeve të prodhuesit dhe kodet e indeksit u shtuan në sekuencat e atributeve për çdo mostër.Shkurtimisht, mRNA u pastrua nga ARN totale duke përdorur rruaza magnetike të bashkangjitura me oligonukleotide poli-T.Fragmentimi kryhet duke përdorur katione dyvalente në temperaturë të lartë në NEBNext First Strand Synthesis Reaction Buffer (5X).cDNA e vargut të parë u sintetizua duke përdorur primerë heksamer të rastësishëm dhe transkriptazë të kundërt M-MuLV (RNaza H-).Më pas, cDNA e vargut të dytë sintetizohet duke përdorur ADN polimerazën I dhe RNazën H. Mbingarkesat e mbetura shndërrohen në skaje të hapura nga aktiviteti ekzonukleazë/polimerazë.Pas adenilimit të skajit 3' të fragmentit të ADN-së, atij i ngjitet një përshtatës NEBNext me strukturë lakore për ta përgatitur atë për hibridizim.Për përzgjedhjen e fragmenteve të cADN-së me gjatësi të preferuar 150-200 bp.fragmentet e bibliotekës u pastruan duke përdorur sistemin AMPure XP (Beckman Coulter, Beverly, SHBA).Më pas, 3 μl USER Enzime (NEB, USA) me cDNA të zgjedhur nga madhësia e lidhur me një përshtatës u përdor për 15 minuta në 37°C dhe më pas për 5 minuta në 95°C përpara PCR.PCR u krye më pas duke përdorur polimerazën e ADN-së me besueshmëri të lartë Phusion, primerët universalë PCR dhe primerët e Indeksit (X).Më në fund, produktet PCR u pastruan (sistemi AMPure XP) dhe cilësia e bibliotekës u vlerësua në një sistem Agilent Bioanalyzer 2100.Biblioteka cDNA u rendit më pas duke përdorur një sekuencues Novaseq.Skedarët e imazheve të papërpunuara nga Illumina u konvertuan në lexime të papërpunuara duke përdorur CASAVA Base Calling.Të dhënat e papërpunuara ruhen në skedarë të formatit FASTQ(fq) që përmbajnë sekuenca leximi dhe cilësitë bazë përkatëse.Zgjidhni HISAT2 për të përputhur leximet e sekuencës së filtruar me gjenomin e referencës Sscrofa11.1.Në përgjithësi, HISAT2 mbështet gjenomet e çdo madhësie, duke përfshirë gjenomet më të mëdha se 4 miliardë baza, dhe vlerat e paracaktuara janë vendosur për shumicën e parametrave.Lidhja e leximeve nga të dhënat e ARN Seq mund të përafrohet në mënyrë efikase duke përdorur HISAT2, sistemi më i shpejtë i disponueshëm aktualisht, me të njëjtën saktësi ose më të mirë se çdo metodë tjetër.
Bollëku i transkripteve pasqyron drejtpërdrejt nivelin e shprehjes së gjeneve.Nivelet e shprehjes së gjeneve vlerësohen nga bollëku i transkripteve (numërimi i sekuencave) të lidhura me gjenomin ose ekzonet.Numri i leximeve është proporcional me nivelet e shprehjes së gjeneve, gjatësinë e gjenit dhe thellësinë e renditjes.FPKM (fragmente për një mijë çifte bazë të transkriptit të renditura për milion çifte bazë) u llogaritën dhe u përcaktuan vlerat P të shprehjes diferenciale duke përdorur paketën DESeq2.Më pas kemi llogaritur shkallën e zbulimit të rremë (FDR) për secilën vlerë P duke përdorur metodën Benjamini-Hochberg9 bazuar në funksionin R të integruar "p.adjust".
ARN-ja e izoluar nga seksionet e zemrës u konvertua në cDNA në një përqendrim prej 200 ng/μl duke përdorur përzierjen SuperScript IV Vilo Master nga Thermo (Thermo, kat. nr. 11756050).RT-PCR sasiore u krye duke përdorur një pllakë reaksioni transparent të Applied Biosystems Endura Plate Microamp 384 pusi (Thermo, nr. cat. 4483319) dhe ngjitës optik mikroamp (Thermo, nr. cat. 4311971).Përzierja e reaksionit përbëhej nga 5 µl Taqman Fast Advanced Master përzierje (Thermo, cat # 4444557), 0,5 µl Taqman Primer dhe 3,5 µl H2O të përziera për pus.U ekzekutuan ciklet standarde qPCR dhe vlerat e CT u matën duke përdorur një instrument PCR në kohë reale të Applied Biosystems Quantstudio 5 (moduli 384 pusi; produkti # A28135).Abetaret Taqman u blenë nga Thermo (GAPDH (Ss03375629_u1), PARP12 (Ss06908795_m1), PKDCC (Ss06903874_m1), CYGB (Ss06900188_m1), RGL8m1 (Ss0800S) 8_mH), GATA4 (Ss03383805_u1), GJA1 (Ss03374839_u1), COL1A2 (Ss03375009_u1 ), COL3A1 (Ss04323794_m1), ACTA2 (Ss08_245 të gjitha vlerat e CT janë normalizuar në shtëpi) GAPDH.
Lëshimi mediatik i NT-ProBNP u vlerësua duke përdorur kompletin NT-ProBNP (derr) (Nr. Kat. MBS2086979, MyBioSource) sipas protokollit të prodhuesit.Shkurtimisht, 250 µl të çdo kampioni dhe standardi u shtuan në dublikatë në çdo pus.Menjëherë pas shtimit të kampionit, shtoni 50 µl Reagent A të analizës në çdo pus.Shkundni butësisht pjatën dhe mbylleni me izolues.Më pas tabletat u inkubuan në 37°C për 1 orë.Më pas aspironi tretësirën dhe lani pusetat 4 herë me 350 µl tretësirë ​​larës 1X, duke inkubuar tretësirën e larjes për 1-2 minuta çdo herë.Më pas shtoni 100 µl Reagent B të analizës për pus dhe mbylleni me ngjitës pllake.Tableta u tund lehtë dhe u inkubua në 37°C për 30 minuta.Aspironi tretësirën dhe lani pusetat 5 herë me 350 µl tretësirë ​​larës 1X.Shtoni 90 µl tretësirë ​​të nënshtresës në çdo pus dhe mbylleni pjatën.Inkuboni pjatën në 37°C për 10-20 minuta.Shtoni 50 µl tretësirë ​​ndaluese në çdo pus.Pllaka u mat menjëherë duke përdorur një lexues të pllakave Cytation (BioTek) të vendosur në 450 nm.
Analizat e fuqisë u kryen për të zgjedhur madhësitë e grupit të cilat do të sigurojnë >80% fuqi për të zbuluar një ndryshim absolut prej 10% në parametër me një shkallë gabimi të tipit I 5%. Analizat e fuqisë u kryen për të zgjedhur madhësitë e grupit të cilat do të sigurojnë >80% fuqi për të zbuluar një ndryshim absolut prej 10% në parametër me një shkallë gabimi të tipit I 5%. Analiza e mundësisë был vыplot для выбора размеров групп, которые обеспечаток >80% domosdoshmëri për zbardhjen 10% absolutisht absolutisht edimeneniya parametra me 5% частотой ошибок lloji I. Analiza e fuqisë u krye për të zgjedhur madhësitë e grupeve që do të siguronin >80% fuqi për të zbuluar 10% ndryshim të parametrit absolut me një shkallë gabimi të tipit I 5%.进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％褧型进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％褧型 Bыl proveden analiz moщnosty dlя vыбора размера gruppы, kotorыy opespechil bы > 80% domosdoshmëri për shfrytezimin 10% absolutisht të ndryshueshme të parametrave dhe 5% orë të tipit I. U krye një analizë e fuqisë për të zgjedhur një madhësi grupi që do të siguronte >80% fuqi për të zbuluar 10% ndryshim të parametrit absolut dhe 5% shkallë gabimi të tipit I.Seksionet e indeve u zgjodhën rastësisht përpara eksperimentit.Të gjitha analizat ishin të verbëra dhe mostrat u dekoduan vetëm pasi të ishin analizuar të gjitha të dhënat.Softueri GraphPad Prism (San Diego, CA) është përdorur për të kryer të gjitha analizat statistikore. Për të gjitha statistikat, vlerat p u konsideruan të rëndësishme në vlerat <0.05. Për të gjitha statistikat, vlerat p u konsideruan të rëndësishme në vlerat <0,05. Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. Për të gjitha statistikat, vlerat p u konsideruan të rëndësishme në vlerat <0,05.对于所有统计数据，p 值在值<0,05 时被认为是显着的。对于所有统计数据，p 值在值<0,05 时被认为是显着的。 Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. Për të gjitha statistikat, vlerat p u konsideruan të rëndësishme në vlerat <0,05.T-testi Student me dy bishta u krye mbi të dhënat me vetëm 2 krahasime.ANOVA njëkahëshe ose e dyanshme u përdor për të përcaktuar rëndësinë midis grupeve të shumta.Gjatë kryerjes së testeve post hoc, korrigjimi i Tukey u aplikua për të llogaritur krahasime të shumta.Të dhënat e RNAsec kanë konsiderata të veçanta statistikore gjatë llogaritjes së FDR dhe p.rregullimit siç përshkruhet në seksionin Metodat.
Për më shumë informacion mbi hartimin e studimit, shihni abstraktin e Raportit të Kërkimit të Natyrës të lidhur me këtë artikull.