Nature.com ला भेट दिल्याबद्दल धन्यवाद. तुम्ही वापरत असलेल्या ब्राउझरच्या आवृत्तीमध्ये CSS साठी मर्यादित समर्थन आहे. सर्वोत्तम अनुभवासाठी, आम्ही शिफारस करतो की तुम्ही अद्ययावत ब्राउझर वापरा (किंवा इंटरनेट एक्सप्लोररमध्ये कॉम्पॅटिबिलिटी मोड अक्षम करा). यादरम्यान, सतत समर्थन सुनिश्चित करण्यासाठी, आम्ही ही साइट स्टाईल्स आणि जावास्क्रिप्टशिवाय प्रस्तुत करू.
औषध चाचणीसाठी हृदयाच्या शारीरिक वातावरणाचे अचूकपणे पुनरुत्पादन करू शकणाऱ्या एका विश्वसनीय इन विट्रो प्रणालीची गरज आहे. मानवी हृदय ऊतक संवर्धन प्रणालींच्या मर्यादित उपलब्धतेमुळे हृदयावरील औषधांच्या परिणामांचे चुकीचे अर्थ लावले गेले आहेत. येथे, आम्ही एक हृदय ऊतक संवर्धन मॉडेल (CTCM) विकसित केले आहे, जे हृदयाच्या चक्राच्या सिस्टोलिक आणि डायस्टोलिक टप्प्यांदरम्यान हृदयाच्या स्लाइसला इलेक्ट्रोमेकॅनिकल पद्धतीने उत्तेजित करते आणि शारीरिक ताणाला सामोरे जाते. १२ दिवसांच्या संवर्धनानंतर, या पद्धतीमुळे हृदयाच्या भागांची व्यवहार्यता अंशतः सुधारली, परंतु त्यांची संरचनात्मक अखंडता पूर्णपणे टिकून राहिली नाही. म्हणून, लहान रेणूंच्या चाचणीनंतर, आम्हाला आढळले की आमच्या माध्यमात १०० nM ट्रायओडोथायरोनिन (T3) आणि १ μM डेक्सामेथासोन (Dex) मिसळल्याने भागांची सूक्ष्म-संरचना १२ दिवसांपर्यंत टिकून राहिली. T3/Dex उपचारांच्या संयोगाने, CTCM प्रणालीने १२ दिवसांपर्यंत ट्रान्सक्रिप्शनल प्रोफाइल, व्यवहार्यता, चयापचय क्रिया आणि संरचनात्मक अखंडता ताज्या हृदय ऊतकांच्या पातळीवरच टिकवून ठेवली. याव्यतिरिक्त, कल्चरमधील हृदय ऊतींचे अत्यधिक ताणले जाणे हायपरट्रॉफिक कार्डियाक सिग्नलिंगला प्रेरित करते, जे हृदयाच्या ताणामुळे निर्माण होणाऱ्या हायपरट्रॉफिक परिस्थितीचे अनुकरण करण्याच्या CTCM च्या क्षमतेचा पुरावा देते. निष्कर्षतः, CTCM दीर्घ कालावधीसाठी कल्चरमध्ये हृदयाच्या शरीरक्रियाविज्ञान आणि विकृतिविज्ञानाचे मॉडेल तयार करू शकते, ज्यामुळे विश्वसनीय औषध चाचणी शक्य होते.
नैदानिक संशोधनापूर्वी, मानवी हृदयाच्या शारीरिक वातावरणाचे अचूकपणे पुनरुत्पादन करू शकणाऱ्या विश्वसनीय इन विट्रो प्रणालींची आवश्यकता असते. अशा प्रणालींनी बदललेला यांत्रिक ताण, हृदयाची गती आणि इलेक्ट्रोफिजिओलॉजिकल गुणधर्मांचे अनुकरण केले पाहिजे. हृदयाच्या शरीरविज्ञानासाठी स्क्रीनिंग प्लॅटफॉर्म म्हणून सामान्यतः प्राणी मॉडेल्सचा वापर केला जातो, परंतु मानवी हृदयावरील औषधांचे परिणाम दर्शविण्यात त्यांची विश्वसनीयता मर्यादित असते¹,². सरतेशेवटी, आदर्श हृदय ऊतक संवर्धन प्रायोगिक मॉडेल (CTCM) हे एक असे मॉडेल आहे जे विविध उपचारात्मक आणि औषधशास्त्रीय हस्तक्षेपांसाठी अत्यंत संवेदनशील आणि विशिष्ट असून, मानवी हृदयाच्या शरीरविज्ञान आणि विकृतिविज्ञानाचे अचूकपणे पुनरुत्पादन करते³. अशा प्रणालीच्या अभावामुळे हृदय निकामी होण्यावरील नवीन उपचारांचा शोध मर्यादित होतो⁴,⁵ आणि औषधांची कार्डिओटॉक्सिसिटी हे बाजारातून बाहेर पडण्याचे एक प्रमुख कारण बनले आहे⁶.
गेल्या दशकात, हृदयाशी संबंधित नसलेली आठ औषधे वैद्यकीय वापरातून मागे घेण्यात आली आहेत, कारण त्यांच्यामुळे क्यूटी इंटरव्हल (QT interval) वाढतो, ज्यामुळे व्हेंट्रिक्युलर ॲरिथमिया (ventricular arrhythmias) आणि अचानक मृत्यू होतो⁷. त्यामुळे, हृदय व रक्तवाहिन्यांसंबंधी परिणामकारकता आणि विषारीपणाचे मूल्यांकन करण्यासाठी विश्वसनीय प्रीक्लिनिकल स्क्रीनिंग धोरणांची वाढती गरज आहे. औषध स्क्रीनिंग आणि विषारीपणा चाचणीमध्ये मानवी प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल-व्युत्पन्न कार्डिओमायोसाइट्सचा (hiPS-CM) अलीकडील वापर या समस्येवर अंशतः उपाय प्रदान करतो. तथापि, hiPS-CM चे अपरिपक्व स्वरूप आणि हृदयाच्या ऊतींमधील बहुपेशीय जटिलतेचा अभाव या पद्धतीच्या प्रमुख मर्यादा आहेत. अलीकडील अभ्यासातून असे दिसून आले आहे की, नैसर्गिक आकुंचन सुरू झाल्यानंतर लगेचच हृदयाच्या ऊतींचे हायड्रोजेल (hydrogels) तयार करण्यासाठी सुरुवातीच्या hiPS-CM चा वापर करून आणि कालांतराने विद्युत उत्तेजना हळूहळू वाढवून या मर्यादेवर अंशतः मात केली जाऊ शकते. तथापि, या hiPS-CM सूक्ष्म-ऊतींमध्ये प्रौढ मायोकार्डियमचे (myocardium) परिपक्व इलेक्ट्रोफिजिओलॉजिकल (electrophysiological) आणि आकुंचनशील गुणधर्म नसतात. याव्यतिरिक्त, मानवी हृदयाच्या ऊतींची रचना अधिक गुंतागुंतीची असते, ज्यात एंडोथेलियल पेशी, न्यूरॉन्स आणि स्ट्रोमल फायब्रोब्लास्ट्स यांसारख्या विविध प्रकारच्या पेशींचे विषम मिश्रण असते, जे विशिष्ट प्रकारच्या एक्स्ट्रासेल्युलर मॅट्रिक्स प्रथिनांद्वारे एकमेकांशी जोडलेले असतात. प्रौढ सस्तन प्राण्यांच्या हृदयातील नॉन-कार्डिओमायोसाइट पेशींच्या समूहांमधील ही विषमता¹¹,¹²,¹³ ही, स्वतंत्र पेशी प्रकारांचा वापर करून हृदयाच्या ऊतींचे मॉडेलिंग करण्यामधील एक प्रमुख अडथळा आहे. या प्रमुख मर्यादा, शारीरिक आणि रोगविषयक परिस्थितींमध्ये अखंड मायोकार्डियल ऊतींचे संवर्धन करण्याच्या पद्धती विकसित करण्याचे महत्त्व अधोरेखित करतात.
मानवी हृदयाचे संवर्धित पातळ (३०० µm) छेद हे अखंड मानवी मायोकार्डियमचे एक आशादायक मॉडेल असल्याचे सिद्ध झाले आहे. ही पद्धत मानवी हृदयाच्या ऊतींसारख्या संपूर्ण ३डी बहुपेशीय प्रणालीमध्ये प्रवेश मिळवून देते. तथापि, २०१९ पर्यंत, संवर्धित हृदयाच्या छेदांचा वापर त्यांच्या अल्प (२४ तास) संवर्धन टिकण्याच्या कालावधीमुळे मर्यादित होता. यामागे अनेक घटक कारणीभूत आहेत, ज्यात भौतिक-यांत्रिक ताणाचा अभाव, हवा-द्रव आंतरपृष्ठ आणि हृदयाच्या ऊतींच्या गरजा पूर्ण न करणाऱ्या साध्या माध्यमांचा वापर यांचा समावेश आहे. २०१९ मध्ये, अनेक संशोधन गटांनी दाखवून दिले की हृदयाच्या ऊती संवर्धन प्रणालींमध्ये यांत्रिक घटकांचा समावेश केल्याने संवर्धनाचा कालावधी वाढू शकतो, हृदयाची अभिव्यक्ती सुधारू शकते आणि हृदयाच्या विकृतीचे अनुकरण करता येते. दोन उत्कृष्ट अभ्यास १७ आणि १८ दर्शवतात की संवर्धनादरम्यान एकअक्षीय यांत्रिक भाराचा हृदयाच्या फेनोटाइपवर सकारात्मक परिणाम होतो. तथापि, या अभ्यासांमध्ये हृदयचक्राच्या गतिशील त्रि-आयामी भौतिक-यांत्रिक भाराचा वापर केला गेला नाही, कारण हृदयाच्या छेदांवर एकतर आयसोमेट्रिक ताण शक्ती १७ किंवा रेखीय ऑक्सोटॉनिक भार १८ लावला गेला होता. ऊती ताणण्याच्या या पद्धतींमुळे अनेक हृदयीय जनुकांचे दमन झाले किंवा असामान्य ताण प्रतिसादांशी संबंधित जनुकांचे अतिअभिव्यक्ती झाली. विशेष म्हणजे, पिटौलिस आणि सहकाऱ्यांनी (१९) फोर्स ट्रान्सड्यूसर फीडबॅक आणि टेन्शन ड्राइव्ह्स वापरून हृदय चक्राच्या पुनर्रचनेसाठी एक डायनॅमिक हार्ट स्लाइस कल्चर बाथ विकसित केला. जरी ही प्रणाली अधिक अचूक इन विट्रो हृदय चक्र मॉडेलिंगसाठी परवानगी देत असली तरी, पद्धतीची गुंतागुंत आणि कमी थ्रुपुट या प्रणालीच्या वापराला मर्यादित करते. आमच्या प्रयोगशाळेने अलीकडेच डुक्कर आणि मानवी हृदय ऊतींच्या विभागांची व्यवहार्यता ६ दिवसांपर्यंत टिकवून ठेवण्यासाठी विद्युत उत्तेजना आणि अनुकूलित माध्यमाचा वापर करून एक सरलीकृत कल्चर प्रणाली विकसित केली आहे (२०,२१).
प्रस्तुत हस्तलिखितामध्ये, आम्ही डुकराच्या हृदयाच्या भागांचा वापर करून तयार केलेल्या एका हृदय ऊतक संवर्धन मॉडेलचे (CTCM) वर्णन केले आहे. हे मॉडेल हृदयचक्रादरम्यान त्रिमितीय हृदय शरीरक्रियाविज्ञान आणि विकृतिजन्य प्रसरणाची पुनरावृत्ती करण्यासाठी शारीरिक संकेतांचा समावेश करते. हे CTCM, औषध पूर्व-चिकित्सा चाचणीसाठी सस्तन प्राण्यांच्या हृदयाच्या शरीरक्रियाविज्ञान/विकृतिविज्ञानाचे अनुकरण करणारी एक किफायतशीर, मध्यम-उत्पादनक्षम हृदय प्रणाली प्रदान करून, औषध पूर्व-चिकित्सा अंदाजाची अचूकता पूर्वी कधीही न गाठलेल्या पातळीपर्यंत वाढवू शकते.
इन विट्रोमध्ये कार्डिओमायोसाइटचे कार्य टिकवून ठेवण्यात हेमोडायनामिक मेकॅनिकल सिग्नल महत्त्वपूर्ण भूमिका बजावतात 22,23,24. प्रस्तुत हस्तलिखितामध्ये, आम्ही एक CTCM (आकृती 1a) विकसित केले आहे जे शारीरिक वारंवारतेवर (1.2 Hz, 72 ठोके प्रति मिनिट) विद्युत आणि यांत्रिक दोन्ही उत्तेजना देऊन प्रौढ हृदयाच्या वातावरणाची नक्कल करू शकते. डायस्टोल दरम्यान ऊतींचा अत्यधिक ताण टाळण्यासाठी, ऊतींचा आकार 25% ने वाढवण्यासाठी 3D प्रिंटिंग उपकरणाचा वापर करण्यात आला (आकृती 1b). हृदयाच्या चक्राची पूर्णपणे पुनरावृत्ती करण्यासाठी, C-PACE प्रणालीद्वारे प्रेरित विद्युत पेसिंग सिस्टोलच्या 100 ms आधी सुरू होण्यासाठी डेटा संपादन प्रणालीचा वापर करून वेळ निश्चित करण्यात आली. ही ऊती संवर्धन प्रणाली वरच्या कप्प्यातील हृदयाच्या स्लाइसचा विस्तार घडवून आणण्यासाठी लवचिक सिलिकॉन पडद्याला चक्रीयपणे विस्तारित करण्याकरिता प्रोग्राम करण्यायोग्य न्यूमॅटिक ॲक्ट्युएटरचा (LB इंजिनिअरिंग, जर्मनी) वापर करते. ही प्रणाली एका प्रेशर ट्रान्सड्यूसरद्वारे बाह्य एअर लाइनला जोडली होती, ज्यामुळे दाब (± 1 mmHg) आणि वेळ (± 1 ms) अचूकपणे समायोजित करणे शक्य झाले (आकृती 1c).
a डिव्हाइसच्या कल्चर चेंबरमधील, निळ्या रंगात दाखवलेल्या ७ मिमी सपोर्ट रिंगला ऊतीचा तुकडा जोडा. कल्चर चेंबर एका पातळ लवचिक सिलिकॉन पडद्याने एअर चेंबरपासून वेगळे केलेले असते. गळती टाळण्यासाठी प्रत्येक चेंबरमध्ये एक गॅस्केट ठेवा. डिव्हाइसच्या झाकणामध्ये ग्राफाइट इलेक्ट्रोड असतात जे विद्युत उत्तेजना देतात. b मोठ्या ऊती डिव्हाइस, गाइड रिंग आणि सपोर्ट रिंगचे योजनाबद्ध सादरीकरण. ऊतीचे तुकडे (तपकिरी) मोठ्या आकाराच्या डिव्हाइसवर ठेवले जातात, ज्यात गाइड रिंग डिव्हाइसच्या बाहेरील कडेवरील खाचेत ठेवली जाते. गाइडचा वापर करून, ऊती ॲक्रेलिक चिकट पदार्थाने लेपित केलेली सपोर्ट रिंग हृदयाच्या ऊतीच्या तुकड्यावर काळजीपूर्वक ठेवा. c प्रोग्रामेबल न्यूमॅटिक ॲक्ट्युएटर (PPD) द्वारे नियंत्रित एअर चेंबरच्या दाबानुसार विद्युत उत्तेजनेची वेळ दर्शवणारा आलेख. दाब सेन्सर वापरून विद्युत उत्तेजना समक्रमित करण्यासाठी डेटा संपादन डिव्हाइसचा वापर केला गेला. जेव्हा कल्चर चेंबरमधील दाब निर्धारित मर्यादेपर्यंत पोहोचतो, तेव्हा विद्युत उत्तेजना सुरू करण्यासाठी C-PACE-EM ला एक पल्स सिग्नल पाठवला जातो. d इनक्यूबेटरच्या शेल्फवर ठेवलेल्या चार CTCM ची प्रतिमा. चार उपकरणे एका PPD ला न्यूमॅटिक सर्किटद्वारे जोडलेली असतात आणि न्यूमॅटिक सर्किटमधील दाबाचे निरीक्षण करण्यासाठी हेमोस्टॅटिक व्हॉल्व्हमध्ये दाब संवेदक बसवलेले असतात. प्रत्येक उपकरणामध्ये ऊतींचे सहा तुकडे असतात.
एकाच न्यूमॅटिक ॲक्ट्युएटरचा वापर करून, आम्ही ४ CTCM उपकरणांवर नियंत्रण ठेवू शकलो, ज्यापैकी प्रत्येक उपकरणामध्ये ऊतींचे ६ तुकडे ठेवता येत होते (आकृती १d). CTCM मध्ये, एअर चेंबरमधील हवेचा दाब फ्लुइड चेंबरमधील समकालिक दाबामध्ये रूपांतरित केला जातो आणि हृदयाच्या स्लाइसमध्ये शारीरिक प्रसरण घडवून आणतो (आकृती २a आणि पूरक चित्रपट १). ८० mm Hg दाबावर ऊतींच्या ताणाचे मूल्यांकन केल्यावर ऊतींचे तुकडे २५% ने ताणले गेल्याचे दिसून आले (आकृती २b). सामान्य हृदयाच्या तुकड्यांच्या आकुंचनक्षमतेसाठी ही टक्केवारी २.२–२.३ µm च्या शारीरिक सार्कोमियर लांबीशी जुळते असे दर्शविले गेले आहे¹⁷,¹⁹,²⁵. ऊतींच्या हालचालीचे मूल्यांकन कस्टम कॅमेरा सेटिंग्ज वापरून केले गेले (पूरक आकृती १). ऊतींच्या हालचालीची तीव्रता आणि वेग (आकृती २c, d) हे हृदयाच्या चक्रादरम्यानचा ताण आणि सिस्टोल व डायस्टोल दरम्यानचा वेळ यांच्याशी जुळत होते (आकृती २b). आकुंचन आणि शिथिलीकरणादरम्यान हृदयाच्या ऊतींचा ताण आणि वेग कल्चरमध्ये १२ दिवसांपर्यंत स्थिर राहिला (आकृती २f). कल्चर दरम्यान आकुंचनक्षमतेवर विद्युत उत्तेजनाचा होणारा परिणाम तपासण्यासाठी, आम्ही शेडिंग अल्गोरिदम वापरून सक्रिय विकृती निश्चित करण्याची एक पद्धत विकसित केली (पूरक आकृती २अ,ब) आणि विद्युत उत्तेजनासह व त्याशिवाय असलेल्या विकृतींमध्ये फरक करू शकलो. हृदयाचा तोच भाग (आकृती २फ). कापलेल्या भागाच्या हलणाऱ्या प्रदेशात (R6-9), विद्युत उत्तेजनादरम्यानचा व्होल्टेज, विद्युत उत्तेजनाच्या अनुपस्थितीपेक्षा २०% जास्त होता, जे आकुंचन कार्यामध्ये विद्युत उत्तेजनेचे योगदान दर्शवते.
एअर चेंबर प्रेशर, फ्लुइड चेंबर प्रेशर आणि टिश्यू मूव्हमेंट मोजमापांचे प्रातिनिधिक आलेख हे पुष्टी करतात की चेंबर प्रेशरमुळे फ्लुइड चेंबर प्रेशरमध्ये बदल होतो, ज्यामुळे टिश्यू स्लाइसची त्यानुसार हालचाल होते. b टिश्यू सेक्शनच्या टक्केवारी ताणाचे (नारंगी) प्रातिनिधिक आलेख. c कार्डियाक स्लाइसची मोजलेली हालचाल ही मोजलेल्या गतीच्या वेगाशी सुसंगत आहे. (d) हृदयाच्या स्लाइसमधील चक्रीय गतीचे (निळी रेषा) आणि वेगाचे (नारंगी तुटक रेषा) प्रातिनिधिक मार्ग. e सायकल टाइम (प्रत्येक गटात n = 19 स्लाइस, वेगवेगळ्या डुकरांपासून), आकुंचन वेळ (प्रत्येक गटात n = 19 स्लाइस), शिथिलता वेळ (प्रत्येक गटात n = 19 स्लाइस, वेगवेगळ्या डुकरांपासून), टिश्यू मूव्हमेंट (प्रत्येक गटात n = 25 स्लाइस, वेगवेगळ्या डुकरांपासून), पीक सिस्टोलिक वेलॉसिटी (प्रत्येक गटात n = 24(D0), 25(D12) स्लाइस, वेगवेगळ्या डुकरांपासून) आणि पीक रिलॅक्सेशन रेट (प्रत्येक गटात n = 24(D0), 25(D12) स्लाइस, वेगवेगळ्या डुकरांपासून) यांचे परिमाणीकरण. द्विपक्षीय स्टुडंटच्या टी-चाचणीने कोणत्याही पॅरामीटरमध्ये लक्षणीय फरक आढळला नाही. f विद्युत उत्तेजनासह (लाल) आणि त्याशिवाय (निळा) घेतलेल्या ऊतींच्या छेदांच्या प्रातिनिधिक स्ट्रेन विश्लेषण ट्रेस, एकाच छेदातील ऊतींच्या छेदांची दहा प्रादेशिक क्षेत्रे. खालचे पॅनेल वेगवेगळ्या छेदांमधील दहा क्षेत्रांमध्ये, विद्युत उत्तेजनासह आणि त्याशिवाय घेतलेल्या ऊतींच्या छेदांमधील स्ट्रेनमधील टक्केवारी फरकाचे परिमाणीकरण दर्शवतात. (वेगवेगळ्या डुकरांपासून घेतलेल्या प्रत्येक गटात ८ तुकडे, द्विपक्षीय स्टुडंट टी-चाचणी केली आहे; ****p < 0.0001, **p < 0.01, *p < 0.05). (वेगवेगळ्या डुकरांपासून घेतलेल्या प्रत्येक गटात ८ तुकडे, द्विपक्षीय स्टुडंट टी-चाचणी केली आहे; ****p < 0.0001, **p < 0.01, *p < 0.05). (n = 8 срезов/группу от разных свиней, проводится двусторонний t-критерий Стьюдента; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,00, *p<0,001). (वेगवेगळ्या डुकरांकडून घेतलेले 8 भाग/गट, द्विपक्षीय स्टुडंट्स टी-टेस्ट; ****p<0.0001, **p<0.01, *p<0.05). （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；**p <0.0001，**p < 0.01,*p < 0.05）. （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；**p <0.0001，**p < 0.01,*p < 0.05）. (n = 8 срезов/группу, от разных свиней, двусторонний критерий Стьюдента; ****p <0,0001, **p <0,01, *p <0,05). (n = 8 विभाग/गट, वेगवेगळ्या डुकरांपासून, द्विपक्षीय स्टुडंटचा टी-टेस्ट; ****p<0.0001, **p<0.01, *p<0.05).त्रुटी पट्ट्या सरासरी ± मानक विचलन दर्शवतात.
आमच्या पूर्वीच्या स्टॅटिक बायोमिमेटिक हार्ट स्लाईस कल्चर सिस्टीममध्ये [20, 21], आम्ही विद्युत उत्तेजना देऊन आणि माध्यमाची रचना अनुकूल करून हृदयाच्या स्लाईसची व्यवहार्यता, कार्य आणि संरचनात्मक अखंडता 6 दिवसांपर्यंत टिकवून ठेवली. तथापि, 10 दिवसांनंतर, हे आकडे झपाट्याने कमी झाले. आम्ही आमच्या पूर्वीच्या स्टॅटिक बायोमिमेटिक कल्चर सिस्टीम 20, 21 मध्ये कल्चर केलेल्या सेक्शन्सना कंट्रोल कंडिशन्स (Ctrl) म्हणून संबोधू आणि आम्ही आमचे पूर्वी अनुकूलित केलेले माध्यम MC कंडिशन्स म्हणून वापरू आणि एकाच वेळी यांत्रिक आणि विद्युत उत्तेजनाखाली (CTCM) कल्चर करू. प्रथम, आम्ही हे निश्चित केले की विद्युत उत्तेजनेशिवाय यांत्रिक उत्तेजना 6 दिवसांपर्यंत ऊतींची व्यवहार्यता टिकवून ठेवण्यासाठी अपुरी होती (पूरक आकृती 3a,b). विशेष म्हणजे, STCM वापरून भौतिक-यांत्रिक आणि विद्युत उत्तेजना सुरू केल्यावर, 12-दिवसांच्या हृदयाच्या सेक्शन्सची व्यवहार्यता MS कंडिशन्स अंतर्गत ताज्या हृदयाच्या सेक्शन्ससारखीच राहिली, परंतु Ctrl कंडिशन्स अंतर्गत नाही, जसे MTT विश्लेषणाने दर्शविले आहे (आकृती 1.3a). यावरून असे सूचित होते की, यांत्रिक उत्तेजना आणि हृदयचक्राचे अनुकरण केल्यास ऊतींचे भाग आमच्या पूर्वीच्या स्थिर संवर्धन प्रणालीमध्ये नोंदवलेल्या वेळेपेक्षा दुप्पट काळ जिवंत राहू शकतात. तथापि, कार्डियाक ट्रोपोनिन टी आणि कॉनेक्सिन ४३ च्या इम्युनोलेबेलिंगद्वारे ऊतींच्या भागांच्या संरचनात्मक अखंडतेचे मूल्यांकन केल्यावर असे दिसून आले की, १२ व्या दिवशी एमसी ऊतींमध्ये कॉनेक्सिन ४३ ची अभिव्यक्ती त्याच दिवसाच्या नियंत्रणांपेक्षा लक्षणीयरीत्या जास्त होती. तथापि, एकसमान कॉनेक्सिन ४३ अभिव्यक्ती आणि झेड-डिस्क निर्मिती पूर्णपणे टिकून राहिली नाही (आकृती ३ब). आम्ही ऊतींच्या संरचनात्मक अखंडतेचे प्रमाण निश्चित करण्यासाठी कृत्रिम बुद्धिमत्ता (AI) फ्रेमवर्क २६ वापरतो, तसेच स्थानिकीकरणाच्या तीव्रतेच्या संदर्भात हृदयाच्या स्लाइसची संरचनात्मक अखंडता आणि प्रतिदीप्ती स्वयंचलितपणे मोजण्यासाठी ट्रोपोनिन-टी आणि कॉनेक्सिन स्टेनिंगवर आधारित एक प्रतिमा-आधारित डीप लर्निंग पाइपलाइन ४३ वापरतो. ही पद्धत संदर्भ २६ मध्ये वर्णन केल्याप्रमाणे, हृदयाच्या ऊतींच्या संरचनात्मक अखंडतेचे स्वयंचलित आणि निःपक्षपातीपणे विश्वसनीयपणे प्रमाण निश्चित करण्यासाठी कॉन्व्होल्यूशनल न्यूरल नेटवर्क (CNN) आणि डीप लर्निंग फ्रेमवर्क वापरते. स्थिर नियंत्रण भागांच्या तुलनेत एमसी ऊतींनी शून्य दिवसाच्या तुलनेत सुधारित संरचनात्मक समानता दर्शविली. याव्यतिरिक्त, मॅसनच्या ट्रायक्रोम स्टेनिंगने कल्चरच्या १२ व्या दिवशी कंट्रोल कंडिशन्सच्या तुलनेत एमएस कंडिशन्समध्ये फायब्रोसिसची टक्केवारी लक्षणीयरीत्या कमी असल्याचे उघड केले (आकृती ३क). जरी सीटीसीएमने १२ व्या दिवशी हृदयाच्या ऊतींच्या सेक्शन्सची व्यवहार्यता ताज्या हृदयाच्या ऊतींच्या पातळीपर्यंत वाढवली असली तरी, त्याने हृदयाच्या सेक्शन्सच्या स्ट्रक्चरल इंटिग्रिटीमध्ये लक्षणीय सुधारणा केली नाही.
बार ग्राफमध्ये ताज्या हृदयाच्या स्लाइसच्या (D0) किंवा 12 दिवसांसाठी स्टॅटिक कल्चरमध्ये (D12 Ctrl) किंवा CTCM मध्ये (D12 MC) कल्चर केलेल्या हृदयाच्या स्लाइसच्या MTT व्यवहार्यतेचे परिमाणीकरण दर्शविले आहे (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) स्लाइस/गट, वेगवेगळ्या डुकरांपासून घेतलेले; वन-वे ॲनोव्हा चाचणी केली आहे; D0 च्या तुलनेत ####p < 0.0001 आणि D12 Ctrl च्या तुलनेत **p < 0.01). बार ग्राफमध्ये ताज्या हृदयाच्या स्लाइसच्या (D0) किंवा 12 दिवसांसाठी स्टॅटिक कल्चरमध्ये (D12 Ctrl) किंवा CTCM मध्ये (D12 MC) कल्चर केलेल्या हृदयाच्या स्लाइसच्या MTT व्यवहार्यतेचे परिमाणीकरण दर्शविले आहे (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) स्लाइस/गट वेगवेगळ्या डुकरांकडून, वन-वे ANOVA चाचणी केली आहे; D0 च्या तुलनेत ####p < 0.0001 आणि D12 Ctrl च्या तुलनेत **p < 0.01).हिस्टोग्राममध्ये MTT ताज्या हृदयाच्या भागांची (D0) किंवा स्थिर संवर्धनात (D12 नियंत्रण) किंवा CTCM (D12 MC) मध्ये 12 दिवसांसाठी संवर्धन केलेल्या हृदयाच्या भागांच्या व्यवहार्यतेचे परिमाणीकरण दर्शविले आहे (n = 18 (D0), 15 (D12 नियंत्रण)), वेगवेगळ्या डुकरांकडून घेतलेल्या 12 (D12 MC) भागांसह/गटावर, एक-मार्गी ANOVA चाचणी केली जाते;####p < 0,0001 по сравнению с D0 и **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). D0 च्या तुलनेत p < 0.0001 आणि D12 Ctrl च्या तुलनेत p < 0.01. a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切)片हे相比，####p < 0.0001，与D12 Ctrl 相比，**p <0.01). a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切)片，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；与D0 相比，###p < 0.0001，CtrlD12，与p.ताज्या हृदयाच्या भागांमध्ये (D0) किंवा स्थिर कल्चरमध्ये 12 दिवस कल्चर केलेल्या हृदयाच्या भागांमध्ये (D12 कंट्रोल) किंवा CTCM मध्ये (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 कंट्रोल)), वेगवेगळ्या डुकरांकडून 12 (D12 MC) भाग/गट, MTT व्यवहार्यतेचे प्रमाण दर्शवणारा हिस्टोग्राम, एक-मार्गी ANOVA चाचणी;####p < 0,0001 по сравнению с D0, **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). D0 च्या तुलनेत p < 0.0001, D12 Ctrl च्या तुलनेत p < 0.01.b ताजे वेगळे केलेले हृदय विभाग (D0) किंवा स्थिर परिस्थितीत (Ctrl) किंवा CTCM परिस्थितीत (MC) 12 दिवसांसाठी संवर्धित केलेले हृदय विभाग) मधील ट्रोपोनिन-टी (हिरवा), कॉनेक्सिन 43 (लाल) आणि DAPI (निळा) प्रातिनिधिक इम्युनोफ्लोरेसन्स प्रतिमांमध्ये (रिक्त स्केल = 100 µm). हृदय ऊतींच्या संरचनात्मक अखंडतेचे कृत्रिम बुद्धिमत्तेद्वारे परिमाणीकरण (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) स्लाइस/गट, प्रत्येक वेगवेगळ्या डुकरांकडून, एक-मार्गी ANOVA चाचणी केली आहे; D0 च्या तुलनेत ####p < 0.0001 आणि D12 Ctrl च्या तुलनेत ****p < 0.0001). हृदय ऊतींच्या संरचनात्मक अखंडतेचे कृत्रिम बुद्धिमत्तेद्वारे परिमाणीकरण (वेगवेगळ्या डुकरांकडून प्रत्येकी n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) स्लाइस/गट, एक-मार्गी ANOVA चाचणी केली आहे; D0 च्या तुलनेत ####p < 0.0001 आणि D12 Ctrl च्या तुलनेत ****p < 0.0001). Количественная оценка структурной целостности селостности сердечной ткани искусственным интеллектом (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5/12/MC разных свиней, проводится однофакторный тест ANOVA; ####p < 0,0001 по сравнению с D0 и ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). कृत्रिम बुद्धिमत्तेद्वारे हृदय ऊतींच्या संरचनात्मक अखंडतेचे परिमाणीकरण (वेगवेगळ्या डुकरांकडून घेतलेले n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) विभाग/गट, एक-मार्गी ANOVA चाचणी केली; D0 च्या तुलनेत ####p < 0.0001 आणि D12 Ctrl च्या तुलनेत ****p < 0.0001).人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) स्लाइस/गट प्रत्येक भिन्न डुक्कर, वन-वे ANOVA चाचणी. ###0p0;相比,****p < 0.0001 与D12 Ctrl 相比）.人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) स्लाइस/गट प्रत्येक वेगवेगळ्या डुकरांना, वन-वे ANOVA test.##0p.与D0相比，****p <0.0001 与D12 Ctrl 相比）. Искусственный интеллект для количественной оценки структурной целостности сердечной ткани (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl/D05), каждой из разных свиней, односторонний тест ANOVA; ####p <0,0001 वि. D0 Для сравнения ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). हृदय ऊतींच्या संरचनात्मक अखंडतेचे परिमाणीकरण करण्यासाठी कृत्रिम बुद्धिमत्ता (वेगवेगळ्या डुकरांचे प्रत्येकी 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) छेद/गट, एक-मार्गी ANOVA चाचणी; ####p<0.0001 विरुद्ध D0. तुलनेसाठी ****p < 0.0001 D12 Ctrl च्या तुलनेत). c मॅसनच्या ट्रायक्रोम स्टेनने रंगवलेल्या हृदयाच्या स्लाइससाठी प्रातिनिधिक प्रतिमा (डावीकडे) आणि परिमाणीकरण (उजवीकडे) (मूळ स्केल = 500 µm) (n = 10 स्लाइस/गट, प्रत्येक वेगवेगळ्या डुकरांकडून, एक-मार्गी ANOVA चाचणी केली आहे; D0 च्या तुलनेत ####p < 0.0001 आणि D12 Ctrl च्या तुलनेत ***p < 0.001). c मॅसनच्या ट्रायक्रोम स्टेनने रंगवलेल्या हृदयाच्या स्लाइससाठी प्रातिनिधिक प्रतिमा (डावीकडे) आणि परिमाणीकरण (उजवीकडे) (स्केल बेअर = 500 µm) (n = 10 स्लाइस/गट, प्रत्येक वेगवेगळ्या डुकरांकडून, वन-वे ॲनोव्हा चाचणी केली आहे; #### p < 0.0001 D0 च्या तुलनेत आणि ***p < 0.001 D12 Ctrl च्या तुलनेत). c Репрезентативные изображения (слева) и количественная оценка (справа) срезов сердца, окрашенных трихромным краситеслева (масштаб без покрытия = 500 мкм) (n = 10 срезов/группу от разных свиней, выполняется односторонний тест ANOVA; #0##01; сравнению с D0 आणि ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c मॅसनच्या ट्रायक्रोम स्टेनने रंगवलेल्या हृदयाच्या छेदांच्या प्रातिनिधिक प्रतिमा (डावीकडे) आणि परिमाणीकरण (उजवीकडे) (अनकोटेड स्केल = 500 µm) (n = वेगवेगळ्या डुकरांकडून प्रत्येक गटात 10 छेद, वन-वे ॲनोव्हा चाचणी केली; #### p < 0.0001 D0 च्या तुलनेत आणि ***p < 0.001 D12 Ctrl च्या तुलनेत). c 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像（左）和量化（右）（裸尺剓（0¼n0µm0µ=个切片/组，每组来自不同的猪，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0.0001 与D0 相比，*** 0.0001 पी <0.0.相比). सी 用 मासन 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 （左 左） 量化 （右） 裸尺度 度度尸度裸尺度 = 500 µm） （n = 10 个 切片 组 每 组 来自 不同 猪 ， 进行 单向 单勛 单向 <# 单勐 单向 单向 ## 0.0001 与D0 相比,***p <0.001 与D12 Ctrl 相比）. c Репрезентативные изображения (слева) и количественный анализ (справа) срезов сердца, окрашенных трихромным краситиаслева шкала = 500 мкм) (n = 10 срезов/группа, каждый от другой свиньи, протестировано с помощью однофакторного однофакторного диспозов##; < ०,०००१ पो сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c मॅसनच्या ट्रायक्रोम स्टेनने रंगवलेल्या हृदयाच्या छेदांच्या प्रातिनिधिक प्रतिमा (डावीकडे) आणि संख्यात्मक विश्लेषण (उजवीकडे) (रिक्त = ५०० µm) (n = १० छेद/गट, प्रत्येक वेगळ्या डुकराकडून, एक-मार्गी विचलन विश्लेषणाद्वारे तपासलेले; ### # D0 च्या तुलनेत p < ०.०००१, ***D12 Ctrl च्या तुलनेत p < ०.००१).त्रुटी पट्ट्या सरासरी ± मानक विचलन दर्शवतात.
आम्ही असा अंदाज लावला होता की कल्चर माध्यमात लहान रेणू टाकल्याने, CTCM कल्चर दरम्यान कार्डिओमायोसाइटची अखंडता सुधारली जाऊ शकते आणि फायब्रोसिसचा विकास कमी होऊ शकतो. त्यामुळे, गोंधळ निर्माण करणाऱ्या घटकांची संख्या कमी असल्यामुळे, आम्ही आमच्या स्थिर नियंत्रण कल्चरचा वापर करून लहान रेणूंसाठी चाचणी केली. या चाचणीसाठी डेक्सामेथासोन (डेक्स), ट्रायओडोथायरोनिन (टी३), आणि एसबी४३१५४२ (एसबी) यांची निवड करण्यात आली. हे लहान रेणू पूर्वी hiPSC-CM कल्चरमध्ये सार्कोमियरची लांबी, टी-ट्यूब्यूल्स आणि वहन गती वाढवून कार्डिओमायोसाइट्सचे परिपक्वन घडवून आणण्यासाठी वापरले गेले आहेत. याव्यतिरिक्त, डेक्स (एक ग्लुकोकॉर्टिकॉइड) आणि एसबी दोन्ही दाह कमी करण्यासाठी ओळखले जातात. म्हणून, आम्ही तपासले की यापैकी एक किंवा या लहान रेणूंच्या मिश्रणाचा समावेश केल्याने हृदयाच्या भागांची संरचनात्मक अखंडता सुधारेल का. प्राथमिक चाचणीसाठी, प्रत्येक संयुगाची मात्रा पेशी संवर्धन मॉडेलमध्ये सामान्यतः वापरल्या जाणाऱ्या सांद्रतेच्या आधारावर निवडण्यात आली (१ μM Dex27, १०० nM T327, आणि २.५ μM SB31). १२ दिवसांच्या संवर्धनानंतर, T3 आणि Dex च्या संयोजनामुळे हृदपेशींची इष्टतम संरचनात्मक अखंडता आणि किमान तंतुमय पुनर्रचना दिसून आली (पूरक आकृत्या ४ आणि ५). याव्यतिरिक्त, सामान्य सांद्रतेच्या तुलनेत T3 आणि Dex च्या या सांद्रतेच्या दुप्पट किंवा त्याहून अधिक सांद्रतेच्या वापरामुळे हानिकारक परिणाम दिसून आले (पूरक आकृती ६अ,ब).
प्राथमिक तपासणीनंतर, आम्ही ४ संवर्धन परिस्थितींची थेट तुलना केली (आकृती ४अ): Ctrl: आमच्या पूर्वी वर्णन केलेल्या स्थिर संवर्धनामध्ये आमच्या अनुकूलित माध्यमाचा वापर करून संवर्धित केलेले हृदयाचे भाग; २०.२१ TD: T3 आणि Ctrl मध्ये बुधवारी डेक्स मिसळले; MC: आमच्या पूर्वी अनुकूलित केलेल्या माध्यमाचा वापर करून CTCM मध्ये संवर्धित केलेले हृदयाचे भाग; आणि MT: CTCM मध्ये माध्यमात T3 आणि डेक्स मिसळले. १२ दिवसांच्या संवर्धनानंतर, MTT चाचणीद्वारे मूल्यांकन केल्यानुसार MS आणि MT ऊतींची जीवनक्षमता ताज्या ऊतींप्रमाणेच राहिली (आकृती ४ब). विशेष म्हणजे, Ctrl परिस्थितींच्या तुलनेत ट्रान्सवेल संवर्धनामध्ये (TD) T3 आणि डेक्स मिसळल्याने जीवनक्षमतेत लक्षणीय सुधारणा झाली नाही, जे हृदयाच्या भागांची जीवनक्षमता टिकवून ठेवण्यात यांत्रिक उत्तेजनाची महत्त्वाची भूमिका दर्शवते.
१२ दिवसांसाठी माध्यमावर यांत्रिक उत्तेजना आणि T3/Dex पूरकतेच्या परिणामांचे मूल्यांकन करण्यासाठी वापरलेल्या चार संवर्धन परिस्थिती दर्शवणारी प्रायोगिक रचना आकृती. b बार ग्राफमध्ये ताज्या हृदयाच्या स्लाइसच्या (D0) तुलनेत सर्व ४ कल्चर कंडिशन्समध्ये (Ctrl, TD, MC, आणि MT) कल्चरनंतर १२ दिवसांनी व्यवहार्यतेचे परिमाणीकरण दाखवले आहे (n = १८ (D0), १५ (D12 Ctrl, D12 TD आणि D12 MT), १२ (D12 MC) स्लाइस/गट वेगवेगळ्या डुकरांकडून, वन-वे ॲनोव्हा चाचणी केली आहे; ####p < 0.0001, ###p < 0.001 D0 च्या तुलनेत आणि **p < 0.01 D12 Ctrl च्या तुलनेत). b बार ग्राफमध्ये ताज्या हृदयाच्या स्लाइसच्या (D0) तुलनेत सर्व ४ कल्चर कंडिशन्समध्ये (Ctrl, TD, MC, आणि MT) कल्चरनंतर १२ दिवसांनी व्यवहार्यतेचे परिमाणीकरण दाखवले आहे (n = १८ (D0), १५ (D12 Ctrl, D12 TD आणि D12 MT), १२ (D12 MC) स्लाइस/गट वेगवेगळ्या डुकरांकडून, वन-वे ॲनोव्हा चाचणी केली आहे; ####p < 0.0001, ###p < 0.001 D0 च्या तुलनेत आणि **p < 0.01 D12 ctrl च्या तुलनेत). b Гистограмма показывает количественную оценку жизнеспособности через 12 дней после культивирования во всех 4 усех культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12)D12MCTD (D12MT) срезов/группу от разных свиней, проводится односторонний тест ANOVA; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 по сравнению с D0 и **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). b बार ग्राफमध्ये ताज्या हृदयाच्या तुकड्यांच्या (D0) तुलनेत, सर्व ४ कल्चर कंडिशन्समध्ये (कंट्रोल, TD, MC, आणि MT) कल्चरनंतर १२ दिवसांनी असलेल्या जिवंतपणाचे प्रमाण दाखवले आहे (n = १८ (D0), १५ (D12 Ctrl, D12 TD, आणि D12 MT), १२ (D12 MC) तुकडे/गट वेगवेगळ्या डुकरांकडून, वन-वे ॲनोव्हा चाचणी; ####p < 0.0001, ###p < 0.001 D0 च्या तुलनेत आणि **p < 0.01 D12 Ctrl च्या तुलनेत). b 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片、D0) (n = 18 (D1r1D0) (D0) TD 和D12 MT)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；####p < 0.0001，###p <0p <0.0** ०.०१ 与D12控制).b 4 12 (D12 MC) b Гистограмма, показывающая все 4 условия культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами (серзами) (серзами =10Dn) 15 (D12 Ctrl, D12 TD आणि D12 MT), от разных свиней 12 (D12 MC) срезы/группа, односторонний тест ANOVA; ####p <0,0001, ###p <0,001 по сравнению с D0, **p <0,01 по сравнению с контролем D12). b) ताज्या हृदयाच्या भागांच्या (D0) तुलनेत सर्व ४ संवर्धन स्थिती (नियंत्रण, TD, MC आणि MT) दर्शवणारा हिस्टोग्राम (n = १८ (D0), १५ (D12 Ctrl, D12 TD आणि D12 MT), वेगवेगळ्या डुकरांकडून १२ (D12 MC) भाग/गट, एक-मार्गी ANOVA चाचणी; ####p<0.0001, ###p<0.001 विरुद्ध D0, **p<0.01 विरुद्ध नियंत्रण D12). c बार ग्राफमध्ये ताज्या हृदयाच्या स्लाइसच्या (D0) तुलनेत सर्व ४ कल्चर कंडिशन्समध्ये (Ctrl, TD, MC, आणि MT) कल्चरनंतर १२ दिवसांनी ग्लुकोज फ्लक्सचे प्रमाण दाखवले आहे (n = वेगवेगळ्या डुकरांकडून प्रत्येक गटात ६ स्लाइस, वन-वे ॲनोव्हा चाचणी केली आहे; ###p < 0.001, D0 च्या तुलनेत आणि ***p < 0.001, D12 Ctrl च्या तुलनेत). c बार ग्राफमध्ये ताज्या हृदयाच्या स्लाइसच्या (D0) तुलनेत सर्व ४ कल्चर कंडिशन्समध्ये (Ctrl, TD, MC, आणि MT) कल्चरनंतर १२ दिवसांनी ग्लुकोज फ्लक्सचे प्रमाण दाखवले आहे (n = वेगवेगळ्या डुकरांकडून प्रत्येक गटात ६ स्लाइस, वन-वे ॲनोव्हा चाचणी केली आहे; ###p < 0.001, D0 च्या तुलनेत आणि ***p < 0.001, D12 Ctrl च्या तुलनेत). c Гистограмма показывает количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после культивирования во всех 4 усех усех 4 усенку (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 6 срезов/группу от разных свиней, одоноляный свиней, одноя свежими) тест ANOVA; ###p < 0,001 по сравнению с D0 आणि ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c हिस्टोग्राममध्ये ताज्या हृदयाच्या भागांच्या (D0) तुलनेत सर्व ४ कल्चर परिस्थितींमध्ये (कंट्रोल, TD, MC आणि MT) कल्चरनंतर १२ दिवसांनी ग्लुकोज फ्लक्सचे प्रमाण दाखवले आहे (n = वेगवेगळ्या डुकरांकडून प्रत्येक गटात ६ भाग, वन-वे ॲनोव्हा चाचणी केली; D0 च्या तुलनेत ###p < 0.001 आणि D12 Ctrl च्या तुलनेत ***p < 0.001). c 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) 相比养切片(D0)天的葡萄糖通量定量（n = 6 片/组，来自不同猪，单向执行ANOVA 测试；###p <0.001，.0p <0.*0p <0.与D12 Ctrl 相比). C 条形图 显示 所有 4 种 条件 （（ctrl 、 td 、 mc 和 mt） 新鲜 心脏 切片 切片戇片培养 后 12 天 的 通量 定量 （n = 6 片/组 ， 来自 猪 ， ， ， ， ， ， A NO VA 猪单吡 测试；###p <0.001，与D0 相比，***p <0.001 与D12 Ctrl 相比）. c Гистограмма, показывающая количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после культивирования для всех 4 культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 6 срезов/группа, от разновный срезов/группа, от , Были проведены тесты ANOVA; ###p < 0,001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению с D12 (контроль). c ताजे हृदय विभाग (D0) च्या तुलनेत सर्व 4 संवर्धन परिस्थितींसाठी (नियंत्रण, TD, MC, आणि MT) संवर्धनानंतर 12 दिवसांनी ग्लुकोज प्रवाहाचे परिमाणीकरण दर्शवणारा हिस्टोग्राम (n = 6 विभाग/गट, वेगवेगळ्या डुकरांपासून, एकतर्फी). ANOVA चाचण्या केल्या गेल्या, ###p < 0.001 D0 च्या तुलनेत, ***p < 0.001 D12 (नियंत्रण) च्या तुलनेत.d दहा प्रादेशिक ऊतक छेद बिंदूंवरील ताज्या (निळा), १२ व्या दिवसाच्या MC (हिरवा), आणि १२ व्या दिवसाच्या MT (लाल) ऊतकांचे स्ट्रेन विश्लेषण आलेख (n = ४ स्लाइस/गट, एक-मार्गी ANOVA चाचणी; गटांमध्ये कोणताही लक्षणीय फरक नव्हता). e १०-१२ दिवसांसाठी स्थिर परिस्थितीत (Ctrl) किंवा MT परिस्थितीत (MT) संवर्धित केलेल्या हृदय छेदांच्या तुलनेत ताज्या हृदय छेदांमध्ये (D0) भिन्नपणे व्यक्त होणारी जनुके दर्शवणारा व्होल्कॅनो आलेख. f प्रत्येक संवर्धन परिस्थितीत संवर्धित केलेल्या हृदय छेदांमधील सार्कोमियर जनुकांचा हीटमॅप. त्रुटी पट्ट्या सरासरी ± मानक विचलन दर्शवतात.
फॅटी ऍसिड ऑक्सिडेशनपासून ग्लायकोलिसिसकडे होणाऱ्या बदलावरील चयापचय अवलंबित्व हे कार्डिओमायोसाइट डीडिफरन्सिएशनचे एक प्रमुख वैशिष्ट्य आहे. अपरिपक्व कार्डिओमायोसाइट्स प्रामुख्याने एटीपी उत्पादनासाठी ग्लुकोजचा वापर करतात आणि त्यांच्यामध्ये हायपोप्लास्टिक मायटोकॉन्ड्रिया असतात ज्यात क्रिस्टी कमी असतात5,32. ग्लुकोज वापराच्या विश्लेषणातून असे दिसून आले की एमसी आणि एमटी परिस्थितीत, ग्लुकोजचा वापर डे 0 टिश्यूजमधील वापरासारखाच होता (आकृती 4c). तथापि, Ctrl नमुन्यांमध्ये ताज्या टिश्यूजच्या तुलनेत ग्लुकोजच्या वापरात लक्षणीय वाढ दिसून आली. हे सूचित करते की CTCM आणि T3/Dex यांचे मिश्रण टिश्यूजची व्यवहार्यता वाढवते आणि 12-दिवस कल्चर केलेल्या हृदयाच्या भागांचा मेटाबोलिक फेनोटाइप जतन करते. याव्यतिरिक्त, स्ट्रेन विश्लेषणातून असे दिसून आले की एमटी आणि एमएस परिस्थितीत 12 दिवसांपर्यंत स्ट्रेनची पातळी ताज्या हृदयाच्या टिश्यूजप्रमाणेच राहिली (आकृती 4d).
हृदयाच्या स्लाइस ऊतींच्या जागतिक ट्रान्सक्रिप्शनल लँडस्केपवर CTCM आणि T3/Dex च्या एकूण परिणामाचे विश्लेषण करण्यासाठी, आम्ही चारही वेगवेगळ्या कल्चर कंडिशन्समधील हृदयाच्या स्लाइसवर RNAseq केले (पूरक डेटा १). विशेष म्हणजे, MT सेक्शन्सनी ताज्या हृदयाच्या ऊतींशी उच्च ट्रान्सक्रिप्शनल समानता दर्शविली, ज्यात १३,६४२ जीन्समधून केवळ १६ जीन्स भिन्नपणे व्यक्त झाले होते. तथापि, जसे आम्ही आधी दाखवले आहे, Ctrl स्लाइसमध्ये कल्चरमध्ये १०-१२ दिवसांनंतर १२२९ भिन्नपणे व्यक्त झालेले जीन्स दिसून आले (आकृती ४e). या डेटाची पुष्टी हृदय आणि फायब्रोब्लास्ट जीन्सच्या qRT-PCR द्वारे करण्यात आली (पूरक आकृती ७a-c). विशेष म्हणजे, Ctrl सेक्शन्समध्ये हृदय आणि पेशी चक्र जीन्सचे डाउनरेग्युलेशन आणि दाहक जीन प्रोग्राम्सचे सक्रियकरण दिसून आले. हा डेटा सूचित करतो की डीडिफरेंशिएशन, जे सामान्यतः दीर्घकालीन कल्चरिंगनंतर होते, ते MT कंडिशन्समध्ये पूर्णपणे कमी होते (पूरक आकृती ८a,b). सार्कोमियर जनुकांच्या काळजीपूर्वक केलेल्या अभ्यासातून असे दिसून आले की, केवळ MT परिस्थितीतच सार्कोमियर (आकृती ४फ) आणि आयन चॅनल (पूरक आकृती ९) यांना एन्कोड करणारी जनुके जतन केली जातात, ज्यामुळे Ctrl, TD आणि MC परिस्थितीत होणाऱ्या दडपशाहीपासून त्यांचे संरक्षण होते. ही माहिती दर्शवते की, यांत्रिक आणि ह्युमरल उत्तेजनाच्या (T3/Dex) संयोजनाने, हृदयाच्या स्लाइसचे ट्रान्सक्रिप्टोम कल्चरमध्ये १२ दिवसांनंतरही ताज्या हृदयाच्या स्लाइससारखेच राहू शकते.
हे ट्रान्सक्रिप्शनल निष्कर्ष या वस्तुस्थितीमुळे समर्थित आहेत की, हृदयाच्या सेक्शनमधील कार्डिओमायोसाइट्सची संरचनात्मक अखंडता MT परिस्थितीत १२ दिवसांसाठी सर्वोत्तम प्रकारे जतन केली जाते, जसे की अखंड आणि स्थानिक कॉनेक्सिन ४३ (आकृती ५अ) द्वारे दिसून येते. याव्यतिरिक्त, Ctrl च्या तुलनेत आणि ताज्या हृदयाच्या सेक्शनप्रमाणेच, MT परिस्थितीत हृदयाच्या सेक्शनमधील फायब्रोसिस लक्षणीयरीत्या कमी झाला होता (आकृती ५ब). ही माहिती दर्शवते की यांत्रिक उत्तेजना आणि T3/Dex उपचारांचे संयोजन कल्चरमधील हृदयाच्या सेक्शनमध्ये हृदयाची रचना प्रभावीपणे जतन करते.
अ) नुकत्याच वेगळ्या केलेल्या हृदयाच्या छेदांमधील (D0) किंवा हृदयाच्या छेदांच्या चारही संवर्धन पद्धतींमध्ये १२ दिवस संवर्धित केलेल्या छेदांमधील ट्रोपोनिन-टी (हिरवा), कॉनेक्सिन ४३ (लाल) आणि DAPI (निळा) यांच्या इम्युनोफ्लोरेसन्स प्रतिमा (स्केल बार = १०० µm). हृदय ऊतींच्या संरचनात्मक अखंडतेचे कृत्रिम बुद्धिमत्तेद्वारे परिमाणीकरण (n = 7 (D0 आणि D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC आणि D12 MT) स्लाइस/गट वेगवेगळ्या डुकरांकडून, एक-मार्गी ANOVA चाचणी केली आहे; ####p < 0.0001 D0 च्या तुलनेत आणि *p < 0.05, किंवा ****p < 0.0001 D12 Ctrl च्या तुलनेत). हृदय ऊतींच्या संरचनात्मक अखंडतेचे कृत्रिम बुद्धिमत्तेद्वारे परिमाणीकरण (n = 7 (D0 आणि D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC आणि D12 MT) स्लाइस/गट वेगवेगळ्या डुकरांकडून, एक-मार्गी ANOVA चाचणी केली आहे; #### p < 0.0001 D0 च्या तुलनेत आणि *p < 0.05, किंवा ****p < 0.0001 D12 Ctrl च्या तुलनेत). Количественная оценка структурной целостности ткани сердца с помощью искусственного интеллекта (n = 7 (D0 आणि D12 Ctrl12), DMCTD12, DMCTD12 MT) срезов/группу от разных свиней, проведен однофакторный тест ANOVA; #### p < 0,0001 по сравнению с D0 и *p < 0,05 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). कृत्रिम बुद्धिमत्तेचा वापर करून हृदय ऊतींच्या संरचनात्मक अखंडतेचे परिमाणीकरण (n = 7 (D0 आणि D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC आणि D12 MT) वेगवेगळ्या डुकरांचे प्रत्येक गटातील छेद, एक-मार्गी ANOVA चाचणी केली; #### p < 0.0001 D0 च्या तुलनेत आणि *p < 0.05 किंवा ****p < 0.0001 D12 Ctrl च्या तुलनेत).对不同猪的心脏组织结构完整性（n = 7（D0 和D12 Ctrl）、5（D12 TD、D12 MC 和D12 MT）切片/组）进行人工智能量化，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0.0001 与D0 和*p <0.0001 0.0001 与D12 Ctrl 相比）.对 不同 猪 的 心脏 结构 完整性 （n = 7 （d0 和 d12 ctrl） （5 （d12 td 、 d12 mc人工 智能量 化 进行 单向 单向 单向 测试 ； ######### p < 0.0001 与D0 和*p < 0.0001 与D0 和*p <0.05 0.0001 与D12 Ctrl 相比).वेगवेगळ्या डुकरांमध्ये कृत्रिम बुद्धिमत्तेचा वापर करून हृदयाच्या ऊतींच्या संरचनात्मक अखंडतेचे परिमाणीकरण (n = 7 (D0 आणि D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC आणि D12 MT) विभाग/गट) एक-मार्गी ANOVA चाचणीसह;#### p < 0,0001 по сравнению с D0 и *p < 0,05 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). D0 च्या तुलनेत #### p < 0.0001 आणि D12 Ctrl च्या तुलनेत *p < 0.05 किंवा ****p < 0.0001). b मॅसनच्या ट्रायक्रोम स्टेनने रंगवलेल्या हृदयाच्या स्लाइसच्या प्रातिनिधिक प्रतिमा आणि परिमाणीकरण (स्केल बार = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD, आणि D12 MC), 9 (D12 MT) स्लाइस/गट वेगवेगळ्या डुकरांकडून, एक-मार्गी ANOVA चाचणी केली आहे; D0 च्या तुलनेत ####p < 0.0001 आणि D12 Ctrl च्या तुलनेत ***p < 0.001, किंवा ****p < 0.0001). b मॅसनच्या ट्रायक्रोम स्टेनने रंगवलेल्या हृदयाच्या स्लाइसच्या प्रातिनिधिक प्रतिमा आणि परिमाणीकरण (स्केल बार = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD, आणि D12 MC), 9 (D12 MT) स्लाइस/गट वेगवेगळ्या डुकरांकडून, एक-मार्गी ANOVA चाचणी केली आहे; D0 च्या तुलनेत ####p < 0.0001 आणि D12 Ctrl च्या तुलनेत ***p < 0.001, किंवा ****p < 0.0001). b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромным красителем Массона (= 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD и D12 MC), 9 (D12 MT) срезов/группу от разных свиней, выполняется одность #NOстой; 0,0001 по сравнению с D0 आणि ***p < 0,001 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). b मॅसनच्या ट्रायक्रोम स्टेनने रंगवलेल्या हृदयाच्या छेदांच्या प्रातिनिधिक प्रतिमा आणि परिमाणीकरण (स्केल बार = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD आणि D12 MC), 9 (D12 MT) छेद/गट वेगवेगळ्या डुकरांकडून, वन-वे ॲनोव्हा केले; ####p < 0.0001 विरुद्ध D0 आणि ***p < 0.001 किंवा ****p < 0.0001 विरुद्ध D12 Ctrl). b 用मेसन 三色染料染色的心脏切片的代表性图像和量化（比例尺= 500 µm）（n = 10D Ctrl、D12 TD 和D12 MC），来自不同猪的9 个（D12 MT）切片/组，进行单因素方差分曠素方差分曠00##D0p0##）相比，***p < 0.001，或****p < 0.0001 与D12 Ctrl 相比）. b 用 मासन 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 和 量化 （比例 尺 尺 尺 = 500 µm） = 0 d0m） d12 ctrl 、 d12 td 和 d12 mc） 来自 不同 的 9 个 d12 mt 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片/组，进行单因素方差分析；####00.01
शेवटी, हृदयाच्या ऊतींचा ताण वाढवून CTCM ची हृदयाच्या अतिवृद्धीचे (कार्डियाक हायपरट्रॉफीचे) अनुकरण करण्याची क्षमता तपासण्यात आली. CTCM मध्ये, हवेच्या कक्षातील कमाल दाब ८० mmHg पासून (सामान्य ताण) ते १४० mmHg पर्यंत वाढवण्यात आला (आकृती ६अ). हे ताणामध्ये ३२% वाढीशी संबंधित आहे (आकृती ६ब), जे पूर्वी हृदयाच्या भागांना अतिवृद्धीमध्ये दिसणाऱ्या सार्कोमियरच्या लांबीसारखी लांबी प्राप्त करण्यासाठी आवश्यक असलेल्या संबंधित टक्केवारीच्या ताणाच्या रूपात दाखवले गेले होते. सहा दिवसांच्या कल्चर दरम्यान हृदयाच्या ऊतींचा आकुंचन आणि शिथिलतेमधील ताण आणि वेग स्थिर राहिला (आकृती ६क). MT परिस्थितीतून घेतलेल्या हृदयाच्या ऊतींना सहा दिवसांसाठी सामान्य ताण (MT (Normal)) किंवा अतिताण (MT (OS)) परिस्थितीत ठेवण्यात आले. कल्चरमध्ये केवळ चार दिवसांनंतरच, MT (normal) परिस्थितीच्या तुलनेत MT (OS) परिस्थितीत माध्यमामध्ये अतिवृद्धीचा बायोमार्कर NT-ProBNP लक्षणीयरीत्या वाढलेला आढळला (आकृती ७अ). याव्यतिरिक्त, सहा दिवसांच्या कल्चरिंगनंतर, MT हृदयाच्या (सामान्य) भागांच्या तुलनेत MT (OS) मधील पेशींचा आकार लक्षणीयरीत्या वाढला (आकृती 7b). तसेच, अतिताणलेल्या ऊतींमध्ये NFATC4 चे केंद्रकीय स्थानांतरण लक्षणीयरीत्या वाढले होते (आकृती 7c). हे परिणाम हायपरडिस्टेन्शननंतर होणाऱ्या पॅथॉलॉजिकल रिमॉडेलिंगचा प्रगतीशील विकास दर्शवतात आणि या संकल्पनेला समर्थन देतात की CTCM उपकरणाचा उपयोग ताणामुळे होणाऱ्या कार्डियाक हायपरट्रॉफी सिग्नलिंगचा अभ्यास करण्यासाठी एक व्यासपीठ म्हणून केला जाऊ शकतो.
एअर चेंबर प्रेशर, फ्लुइड चेंबर प्रेशर आणि टिश्यू मूव्हमेंट मोजमापांचे प्रातिनिधिक आलेख हे पुष्टी करतात की चेंबर प्रेशरमुळे फ्लुइड चेंबर प्रेशरमध्ये बदल होतो, ज्यामुळे टिश्यू स्लाइसची त्यानुसार हालचाल होते. b सामान्यपणे ताणलेल्या (नारंगी) आणि जास्त ताणलेल्या (निळ्या) टिश्यू सेक्शनसाठी प्रातिनिधिक स्ट्रेच पर्सेंटेज आणि स्ट्रेच रेट वक्र. c बार ग्राफ जो सायकल टाइम (प्रत्येक गटात n = 19 स्लाइस, वेगवेगळ्या डुकरांपासून), कॉन्ट्रॅक्शन टाइम (प्रत्येक गटात n = 18-19 स्लाइस, वेगवेगळ्या डुकरांपासून), रिलॅक्सेशन टाइम (प्रत्येक गटात n = 19 स्लाइस, वेगवेगळ्या डुकरांपासून), टिश्यू मूव्हमेंटची अॅम्प्लिट्यूड (प्रत्येक गटात n = 14 स्लाइस, वेगवेगळ्या डुकरांपासून), पीक सिस्टोलिक व्हेलॉसिटी (प्रत्येक गटात n = 14 स्लाइस, वेगवेगळ्या डुकरांपासून) आणि पीक रिलॅक्सेशन रेट (प्रत्येक गटात n = 14 (D0), 15 (D6) स्लाइस, वेगवेगळ्या डुकरांपासून) दर्शवतो. टू-टेल्ड स्टुडंट्स टी-टेस्टने कोणत्याही पॅरामीटरमध्ये लक्षणीय फरक नसल्याचे दाखवले, जे सूचित करते की ओव्हरव्होल्टेजसह 6 दिवसांच्या कल्चर दरम्यान हे पॅरामीटर्स स्थिर राहिले. त्रुटी पट्ट्या सरासरी ± मानक विचलन दर्शवतात.
एमटी नॉर्मल स्ट्रेच (नॉर्म) किंवा ओव्हरस्ट्रेचिंग (ओएस) परिस्थितीत कल्चर केलेल्या हृदयाच्या स्लाइसमधील कल्चर मीडियामधील एनटी-प्रोबीएनपी (NT-ProBNP) एकाग्रतेचे बार ग्राफद्वारे केलेले संख्यात्मक मापन (n = ४ (डी२ एमटीनॉर्म), ३ (डी२ एमटीओएस, डी४ एमटीनॉर्म, आणि डी४ एमटीओएस) स्लाइस/गट, वेगवेगळ्या डुकरांपासून घेतलेले, टू-वे ॲनोव्हा (ANOVA) केले आहे; **सामान्य स्ट्रेचच्या तुलनेत p < ०.०१). एमटी नॉर्मल स्ट्रेच (नॉर्म) किंवा ओव्हरस्ट्रेचिंग (ओएस) परिस्थितीत कल्चर केलेल्या हृदयाच्या स्लाइसमधील कल्चर मीडियामधील एनटी-प्रोबीएनपी (NT-ProBNP) एकाग्रतेचे बार ग्राफद्वारे केलेले संख्यात्मक मापन (n = ४ (डी२ एमटीनॉर्म), ३ (डी२ एमटीओएस, डी४ एमटीनॉर्म, आणि डी४ एमटीओएस) स्लाइस/गट, वेगवेगळ्या डुकरांकडून; टू-वे ॲनोव्हा (ANOVA) केले आहे; **सामान्य स्ट्रेचच्या तुलनेत p < ०.०१).सामान्य MT स्ट्रेच (नॉर्म) किंवा ओव्हरस्ट्रेच (ओएस) च्या परिस्थितीत कल्चर केलेल्या हृदयाच्या स्लाइसमधील कल्चर माध्यमातील NT-ProBNP एकाग्रतेचा संख्यात्मक हिस्टोग्राम (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, आणि D4 MTOS) स्लाइस /गट वेगवेगळ्या डुकरांकडून, दोन-घटक विचलन विश्लेषण केले जाते;**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). सामान्य ताणाच्या तुलनेत p < 0.01). a 在MT 正常拉伸(नॉर्म) 或过度拉伸(OS) 条件下培养的心脏切片培养基中NT-ProBNP 浓度離坡庢4 (D2 MTNorm) 、3（D2 MTOS、D4 MTNorm 和D4 MTOS）来自不同猪的切片/组，进行双向方差分析；**与正常拉伸相比, p < 0.01）. एमटी नॉर्मल स्ट्रेच (नॉर्म) किंवा ओव्हरस्ट्रेच (ओएस) परिस्थितीत (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm猪的切片/组，可以双向方方发发动; **सामान्य स्ट्रेचिंगच्या तुलनेत, p <0.01).सामान्य MT ताण (norm) किंवा अतिताण (OS) च्या परिस्थितीत संवर्धित केलेल्या हृदयाच्या स्लाइसमधील NT-ProBNP सांद्रतेचे हिस्टोग्राम परिमाणीकरण (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm) आणि D4 MTOS) स्लाइस/गट वेगवेगळ्या डुकरांकडून, द्विमार्गी विचलन विश्लेषण;**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). सामान्य ताणाच्या तुलनेत p < 0.01). b ट्रोपोनिन-टी आणि डब्ल्यूजीएने रंगवलेल्या हृदयाच्या स्लाइसच्या प्रातिनिधिक प्रतिमा (डावीकडे) आणि पेशींच्या आकाराचे परिमाणीकरण (उजवीकडे) (n = ३३० (डी६ एमटीओएस), ३६९ (डी६ एमटीनॉर्म) पेशी/गट, वेगवेगळ्या डुकरांच्या १० वेगवेगळ्या स्लाइसमधून, द्विपक्षीय स्टुडंट टी-चाचणी केली आहे; ****पी < ०.०००१ सामान्य ताणाच्या तुलनेत). b ट्रोपोनिन-टी आणि डब्ल्यूजीएने रंगवलेल्या हृदयाच्या स्लाइसच्या प्रातिनिधिक प्रतिमा (डावीकडे) आणि पेशींच्या आकाराचे परिमाणीकरण (उजवीकडे) (n = ३३० (डी६ एमटीओएस), ३६९ (डी६ एमटीनॉर्म) पेशी/गट, वेगवेगळ्या डुकरांच्या १० वेगवेगळ्या स्लाइसमधून, द्विपक्षीय स्टुडंट टी-चाचणी केली आहे; ****पी < ०.०००१ सामान्य ताणाच्या तुलनेत). b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слева) и количественного определения разовения (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) клеток/группу из 10 разных срезов от разных свиней, два- проводится tористи-проводится t Стьюдента; ****p < 0,0001 по сравнению с нормальным растяжением). b ट्रोपोनिन-टी आणि एझेडपीने रंगवलेल्या हृदयाच्या छेदांच्या प्रातिनिधिक प्रतिमा (डावीकडे) आणि पेशींच्या आकाराचे परिमाणीकरण (उजवीकडे) (n = ३३० (डी६ एमटीओएस), ३६९ (डी६ एमटीनॉर्म) पेशी/गट, वेगवेगळ्या डुकरांच्या १० वेगवेगळ्या छेदांमधून, द्विपक्षीय स्टुडंट्स टी-चाचणी करण्यात आली; ****पी < ०.०००१ सामान्य प्रजातीच्या तुलनेत). b 用肌钙蛋白-T 和WGA（左）和细胞大小量化（右）染色的心脏切片的心脏切片的代表性图n3） MTOS），来自不同猪的10 个不同切片的369（D6 MTNorm）细胞/组，两进行有尾学生t 检验；与正常拉伸相比,****p <0.0001）. b कॅल्केरीन-टी आणि डब्ल्यूजीएने रंगवलेल्या हृदयाच्या स्लाइसच्या प्रातिनिधिक प्रतिमा (डावीकडे) आणि पेशींचा आकार (उजवीकडे) (n = 330 (डी6 एमटीओएस), 10 वेगवेगळ्या स्लाइसमधून 369 (डी6 एमटीनॉर्म)) पेशी/समूह, दोन पद्धतींमध्ये लहान पेशींचा समावेश आहे टी चाचणी; सामान्य ताणण्याशी तुलना केली असता,****पी < 0.0001). b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слева) и количественная оценка (размеракто) =30 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) из 10 различных срезов от разных свиней Клетки/группа, двусторонние критерий Стьюдента; ****p < 0,0001 по сравнению с нормальным растяжением). b ट्रोपोनिन-टी आणि एझेडपीने रंगवलेल्या हृदयाच्या छेदांच्या प्रातिनिधिक प्रतिमा (डावीकडे) आणि पेशींच्या आकाराचे परिमाणीकरण (उजवीकडे) (n = ३३० (डी६ एमटीओएस), ३६९ (डी६ एमटीनॉर्म) वेगवेगळ्या डुकरांच्या १० वेगवेगळ्या छेदांमधून) पेशी/गट, द्विपक्षीय निकष स्टुडंटचा टी; ****पी < ०.०००१ सामान्य प्रजातीच्या तुलनेत). c ट्रोपोनिन-टी आणि NFATC4 साठी इम्युनोलॅबेल केलेल्या दिवस 0 आणि दिवस 6 MTOS हृदय स्लाइसच्या प्रातिनिधिक प्रतिमा आणि CM च्या केंद्रकांमध्ये NFATC4 च्या स्थलांतराचे प्रमाणीकरण (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) स्लाइस/गट वेगवेगळ्या डुकरांकडून, द्विपक्षीय स्टुडंट टी-चाचणी केली आहे; *p < 0.05). c ट्रोपोनिन-टी आणि NFATC4 साठी इम्युनोलॅबेल केलेल्या दिवस 0 आणि दिवस 6 MTOS हृदय स्लाइसच्या प्रातिनिधिक प्रतिमा आणि CM च्या केंद्रकांमध्ये NFATC4 च्या स्थलांतराचे प्रमाणीकरण (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) स्लाइस/गट वेगवेगळ्या डुकरांकडून, द्विपक्षीय स्टुडंट टी-चाचणी केली आहे; *p < 0.05). c Репрезентативные изображения для срезов сердца 0 и 6 дней MTOS, иммуномеченых для тропонина-Т и NFATC4, инкоянкастена ट्रॅन्सलोकासी NFATC4 в ядра кавернозных клеток (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срезов/группу от разных свиней , выполняется двусторонный свиней; 0,05). c) ट्रोपोनिन-टी आणि NFATC4 साठी इम्युनोलॅबेल केलेल्या, MTOS च्या 0 आणि 6 दिवसांच्या हृदयाच्या छेदांच्या प्रातिनिधिक प्रतिमा, आणि केव्हर्नस पेशींच्या केंद्रकातील NFATC4 च्या स्थानांतरणाचे परिमाणीकरण (वेगवेगळ्या डुकरांकडून प्रत्येक गटात n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) स्लाइस) द्विपक्षीय स्टुडंट्स टी-चाचणी केली; *p < 0.05). c 用于肌钙蛋白-T 和NFATC4 免疫标记的第0 天和第6 天MTOS心脏切片的代表性图像，以及来自不同猪的NFATC4 易位至CM 细胞核的量化（n = 4 (D0) , 3 (D0)进行双尾学生t 检验；*p <0.05). c calcanin-T आणि NFATC4 इम्युनोलाबेलिंग 第0天和第6天MTOS हृदयाचे तुकडे, आणि वेगवेगळ्या NFATC4 मधून NFATC4 易位至CM सेल न्यूक्लियस 的 प्रमाण 化 (n = 4 (D0) 化 (n = 4 (D0) 化 化 (n = 4 (D0) 廤 / 燤 3 ) च्या प्रतिनिधी प्रतिमा时间双尾学生et 电影；*p < ०.०५). c Репрезентативные изображения срезов сердца MTOS на 0 и 6 तारखेपर्यंत транслокации NFATC4 в ядра CM от разных свиней (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срез/группа, два- хвостатый t-критерий Сть;0pюдей. c वेगवेगळ्या डुकरांच्या CM च्या केंद्रकात ट्रोपोनिन-टी आणि NFATC4 इम्युनोलेबेलिंग आणि NFATC4 ट्रान्सलोकेशनच्या प्रमाणीकरणासाठी दिवस 0 आणि 6 वरील MTOS हृदय स्लाइसच्या प्रातिनिधिक प्रतिमा (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) स्लाइस/गट, दोन-पुच्छीय t-निकष स्टुडंटचा; *p < 0.05).त्रुटी पट्ट्या सरासरी ± मानक विचलन दर्शवतात.
अनुप्रयुक्त हृदयरोग संशोधनासाठी अशा पेशीय मॉडेल्सची आवश्यकता असते, जे हृदयाच्या वातावरणाची अचूक प्रतिकृती तयार करतात. या अभ्यासात, हृदयाच्या अतिसूक्ष्म छेदांना उत्तेजित करू शकणारे एक CTCM उपकरण विकसित करून त्याचे वैशिष्ट्यीकरण करण्यात आले. या CTCM प्रणालीमध्ये शारीरिकदृष्ट्या समकालिक विद्युत-यांत्रिक उत्तेजन आणि T3 व Dex द्रव संवर्धनाचा समावेश आहे. जेव्हा डुकराच्या हृदयाचे छेद या घटकांच्या संपर्कात आणले गेले, तेव्हा १२ दिवसांच्या संवर्धनानंतर त्यांची जीवनक्षमता, संरचनात्मक अखंडता, चयापचय क्रिया आणि प्रतिलेखन अभिव्यक्ती ताज्या हृदय ऊतींप्रमाणेच राहिली. याव्यतिरिक्त, हृदय ऊतींच्या अत्यधिक ताणामुळे अतिप्रसरणाद्वारे हृदयाची अतिवृद्धी (हायपरट्रॉफी) होऊ शकते. एकूणच, हे परिणाम सामान्य हृदयीय स्वरूप (फिनोटाइप) टिकवून ठेवण्यासाठी शारीरिक संवर्धन परिस्थितीच्या महत्त्वपूर्ण भूमिकेला समर्थन देतात आणि औषध चाचणीसाठी एक व्यासपीठ प्रदान करतात.
कार्डिओमायोसाइट्सच्या कार्यासाठी आणि जगण्यासाठी एक इष्टतम वातावरण तयार करण्यास अनेक घटक हातभार लावतात. या घटकांपैकी सर्वात स्पष्ट घटक (१) आंतरपेशीय आंतरक्रिया, (२) इलेक्ट्रोमेकॅनिकल उद्दीपन, (३) ह्युमरल घटक आणि (४) मेटाबोलिक सबस्ट्रेट्स यांच्याशी संबंधित आहेत. शारीरिक पेशी-पेशींमधील आंतरक्रियांसाठी एक्स्ट्रासेल्युलर मॅट्रिक्सद्वारे आधारलेल्या अनेक प्रकारच्या पेशींच्या जटिल त्रिमितीय जाळ्यांची आवश्यकता असते. अशा जटिल पेशीय आंतरक्रिया इन विट्रोमध्ये वैयक्तिक पेशी प्रकारांच्या सह-संवर्धनाद्वारे पुनर्निर्मित करणे कठीण आहे, परंतु हृदयाच्या भागांच्या अवयव-सदृश स्वरूपाचा वापर करून ते सहजपणे साध्य केले जाऊ शकते.
हृदयस्नायू पेशींना (cardiomyocytes) यांत्रिक ताण देणे आणि विद्युत उत्तेजना देणे हे हृदयाचा फिनोटाइप (phenotype) टिकवून ठेवण्यासाठी महत्त्वपूर्ण आहे33,34,35. जरी hiPSC-CM कंडिशनिंग आणि मॅचुरेशनसाठी यांत्रिक उत्तेजनाचा मोठ्या प्रमाणावर वापर केला गेला असला तरी, अलीकडेच अनेक उत्कृष्ट अभ्यासांमध्ये युनिअॅक्सियल लोडिंगचा (uniaxial loading) वापर करून कल्चरमधील हृदयाच्या स्लाइसना यांत्रिक उत्तेजना देण्याचा प्रयत्न केला गेला आहे. हे अभ्यास दर्शवतात की कल्चर दरम्यान हृदयाच्या फिनोटाइपवर २डी युनिअॅक्सियल यांत्रिक लोडिंगचा सकारात्मक परिणाम होतो. या अभ्यासांमध्ये, हृदयाच्या भागांवर एकतर आयसोमेट्रिक टेन्साइल फोर्सेस (isometric tensile forces)17, लिनियर ऑक्सोटॉनिक लोडिंग (linear auxotonic loading)18 दिले गेले, किंवा फोर्स ट्रान्सड्यूसर फीडबॅक (force transducer feedback) आणि टेन्शन ड्राइव्ह्स (tension drives) वापरून हृदयचक्र (cardiac cycle) पुन्हा तयार केले गेले. तथापि, या पद्धतींमध्ये पर्यावरणीय ऑप्टिमायझेशनशिवाय (environmental optimization) युनिअॅक्सियल टिश्यू स्ट्रेचचा (uniaxial tissue stretch) वापर केला जातो, ज्यामुळे अनेक कार्डियाक जीन्सचे दमन (suppression) होते किंवा असामान्य स्ट्रेच रिस्पॉन्सशी (abnormal stretch responses) संबंधित जीन्सचे ओव्हरएक्सप्रेशन (overexpression) होते. येथे वर्णन केलेले CTCM एक ३डी इलेक्ट्रोमेकॅनिकल स्टिम्युलस (3D electromechanical stimulus) प्रदान करते जे सायकल टाइम (cycle time) आणि फिजिओलॉजिकल स्ट्रेचच्या (physiological stretch) बाबतीत नैसर्गिक हृदयचक्राची नक्कल करते (२५% स्ट्रेच, ४०% सिस्टोल, ६०% डायस्टोल आणि ७२ बीट्स प्रति मिनिट). जरी केवळ ही त्रिमितीय यांत्रिक उत्तेजना ऊतींची अखंडता टिकवण्यासाठी पुरेशी नसली तरी, ऊतींची जीवनक्षमता, कार्य आणि अखंडता पुरेशा प्रमाणात टिकवण्यासाठी T3/Dex वापरून शारीरिक आणि यांत्रिक उत्तेजनेचे संयोजन आवश्यक आहे.
प्रौढ हृदयाच्या फेनोटाइपचे नियमन करण्यात ह्युमोरल घटक महत्त्वाची भूमिका बजावतात. HiPS-CM अभ्यासांमध्ये यावर प्रकाश टाकण्यात आला, ज्यात पेशींच्या परिपक्वतेला गती देण्यासाठी कल्चर मीडियामध्ये T3 आणि डेक्स (Dex) टाकण्यात आले होते. T3 पेशींच्या पडद्यांमधून अमिनो ॲसिड, शर्करा आणि कॅल्शियमच्या वहनावर प्रभाव टाकू शकते36. याव्यतिरिक्त, T3 हे MHC-α अभिव्यक्तीला प्रोत्साहन देते आणि MHC-β चे डाउनरेग्युलेशन करते, ज्यामुळे गर्भाच्या CM मधील स्लो ट्विच मायोफायब्रिल्सच्या तुलनेत प्रौढ कार्डिओमायोसाइट्समध्ये फास्ट ट्विच मायोफायब्रिल्सच्या निर्मितीस चालना मिळते. हायपोथायरॉईड रुग्णांमध्ये T3 च्या कमतरतेमुळे मायोफायब्रिलर बँड्स नष्ट होतात आणि टोन विकासाचा दर कमी होतो37. डेक्स (Dex) ग्लुकोकॉर्टिकॉइड रिसेप्टर्सवर कार्य करते आणि आयसोलेटेड परफ्यूज्ड हृदयांमध्ये मायोकार्डियल कॉन्ट्रॅक्टिलिटी वाढवते असे दिसून आले आहे;38 ही सुधारणा कॅल्शियम डिपॉझिट-ड्रिव्हन एंट्री (SOCE) वरील परिणामाशी संबंधित असल्याचे मानले जाते39,40. याव्यतिरिक्त, डेक्स (Dex) त्याच्या रिसेप्टर्सशी बांधले जाते, ज्यामुळे एक व्यापक इंट्रासेल्युलर प्रतिसाद निर्माण होतो जो रोगप्रतिकारक कार्य आणि दाह कमी करतो30.
आमच्या निष्कर्षांवरून असे दिसून येते की, कंट्रोलच्या (Ctrl) तुलनेत भौतिक यांत्रिक उत्तेजनामुळे (MS) एकूण कल्चरची कामगिरी सुधारली, परंतु कल्चरमध्ये १२ दिवसांपर्यंत व्यवहार्यता, संरचनात्मक अखंडता आणि कार्डियाक एक्सप्रेशन टिकवून ठेवण्यात ती अयशस्वी ठरली. कंट्रोलच्या तुलनेत, CTCM (MT) कल्चरमध्ये T3 आणि Dex मिसळल्याने व्यवहार्यता सुधारली आणि १२ दिवसांपर्यंत ताज्या हृदय ऊतींप्रमाणेच ट्रान्सक्रिप्शन प्रोफाइल, संरचनात्मक अखंडता आणि चयापचय क्रिया टिकून राहिली. याव्यतिरिक्त, ऊतींच्या ताणण्याच्या प्रमाणावर नियंत्रण ठेवून, STCM वापरून हायपरएक्स्टेंशन-प्रेरित कार्डियाक हायपरट्रॉफी मॉडेल तयार केले गेले, जे STCM प्रणालीची बहुउपयोगिता दर्शवते. हे लक्षात घेतले पाहिजे की, जरी कार्डियाक रिमॉडेलिंग आणि फायब्रोसिसमध्ये सामान्यतः अखंड अवयवांचा समावेश असतो, ज्यांच्या रक्ताभिसरणातील पेशी योग्य सायटोकाइन्स तसेच फॅगोसायटोसिस आणि इतर रिमॉडेलिंग घटक पुरवू शकतात, तरीही हृदयाचे भाग ताण आणि आघाताच्या प्रतिसादात फायब्रोटिक प्रक्रियेची नक्कल करू शकतात. मायोफायब्रोब्लास्ट्समध्ये. याचे मूल्यांकन यापूर्वी या कार्डियाक स्लाइस मॉडेलमध्ये केले गेले आहे. हे लक्षात घ्यावे की, दाब/विद्युत आयाम आणि वारंवारता बदलून CTCM पॅरामीटर्स नियंत्रित केले जाऊ शकतात, ज्यामुळे टॅकीकार्डिया, ब्रॅडीकार्डिया आणि यांत्रिक रक्ताभिसरण आधार (यांत्रिक भाररहित हृदय) यांसारख्या अनेक परिस्थितींचे अनुकरण करता येते. यामुळे ही प्रणाली औषध चाचणीसाठी मध्यम क्षमतेची ठरते. अतिश्रमामुळे होणाऱ्या हृदयाच्या अतिवृद्धीचे (कार्डियाक हायपरट्रॉफी) मॉडेलिंग करण्याची CTCM ची क्षमता, वैयक्तिकृत उपचारांसाठी या प्रणालीच्या चाचणीचा मार्ग मोकळा करते. निष्कर्षतः, प्रस्तुत अभ्यास दर्शवितो की हृदयाच्या ऊतींच्या भागांचे संवर्धन टिकवून ठेवण्यासाठी यांत्रिक ताण आणि ह्युमरल उत्तेजना महत्त्वपूर्ण आहेत.
जरी येथे सादर केलेला डेटा असे सूचित करतो की अखंड मायोकार्डियमचे मॉडेलिंग करण्यासाठी CTCM हे एक अतिशय आश्वासक व्यासपीठ आहे, तरीही या कल्चर पद्धतीला काही मर्यादा आहेत. CTCM कल्चरची मुख्य मर्यादा ही आहे की ते स्लाइसवर सतत गतिशील यांत्रिक ताण लादते, ज्यामुळे प्रत्येक चक्रात हृदयाच्या स्लाइसच्या आकुंचनांचे सक्रियपणे निरीक्षण करण्याची क्षमता मर्यादित होते. याव्यतिरिक्त, हृदयाच्या भागांच्या लहान आकारामुळे (७ मिमी), पारंपरिक फोर्स सेन्सर्स वापरून कल्चर सिस्टीमच्या बाहेर सिस्टोलिक कार्याचे मूल्यांकन करण्याची क्षमता मर्यादित आहे. सध्याच्या हस्तलिखितामध्ये, आम्ही आकुंचन कार्याचे सूचक म्हणून ऑप्टिकल व्होल्टेजचे मूल्यांकन करून ही मर्यादा अंशतः दूर केली आहे. तथापि, या मर्यादेवर अधिक काम करणे आवश्यक आहे आणि भविष्यात कल्चरमधील हृदयाच्या स्लाइसच्या कार्याचे ऑप्टिकल निरीक्षण करण्याच्या पद्धती सादर करून, जसे की कॅल्शियम आणि व्होल्टेज-संवेदनशील रंगांचा वापर करून ऑप्टिकल मॅपिंग, यावर उपाय केला जाऊ शकतो. CTCM ची आणखी एक मर्यादा ही आहे की कार्यरत मॉडेल शारीरिक ताण (प्रीलोड आणि आफ्टरलोड) हाताळत नाही. CTCM मध्ये, अतिशय मोठ्या ऊतींमध्ये डायस्टोल (पूर्ण ताण) आणि सिस्टोल (विद्युत उत्तेजनादरम्यान आकुंचनाची लांबी) मध्ये २५% शारीरिक ताण पुनरुत्पादित करण्यासाठी विरुद्ध दिशेने दाब दिला गेला. भविष्यातील CTCM डिझाइनमध्ये, हृदयाच्या ऊतींवर दोन्ही बाजूंनी पुरेसा दाब देऊन आणि हृदयाच्या कप्प्यांमध्ये आढळणारे अचूक दाब-आकारमान संबंध लागू करून ही मर्यादा दूर केली पाहिजे.
या हस्तलिखितामध्ये नोंदवलेले अतिताणामुळे होणारे पुनर्रचनात्मक बदल हे केवळ हायपरट्रॉफिक हायपरस्ट्रेच संकेतांचे अनुकरण करण्यापुरते मर्यादित आहेत. त्यामुळे, हे मॉडेल ह्युमरल किंवा न्यूरल घटकांच्या (जे या प्रणालीमध्ये अस्तित्वात नाहीत) गरजेशिवाय ताणामुळे होणाऱ्या हायपरट्रॉफिक सिग्नलिंगच्या अभ्यासात मदत करू शकते. CTCM ची बहुविधता वाढवण्यासाठी पुढील अभ्यासांची आवश्यकता आहे, उदाहरणार्थ, रोगप्रतिकारक पेशींसोबत सह-संवर्धन करणे, रक्ताभिसरणातील प्लाझ्मा ह्युमरल घटक आणि न्यूरॉनल पेशींसोबत सह-संवर्धन करताना चेतासंबंधन, यामुळे CTCM द्वारे रोग मॉडेलिंगच्या शक्यता सुधारतील.
या अभ्यासात तेरा डुकरांचा वापर करण्यात आला. प्राण्यांवरील सर्व प्रक्रिया संस्थात्मक मार्गदर्शक तत्त्वांनुसार पार पाडण्यात आल्या आणि त्यांना युनिव्हर्सिटी ऑफ लुईव्हिल इन्स्टिट्यूशनल ॲनिमल केअर अँड यूज कमिटीने मान्यता दिली होती. एओर्टिक आर्चला क्लॅम्प लावून हृदयात १ लिटर निर्जंतुक कार्डिओप्लेजिया (११० mM NaCl, १.२ mM CaCl2, १६ mM KCl, १६ mM MgCl2, १० mM NaHCO3, ५ U/mL हेपॅरिन, pH ७.४ पर्यंत) प्रवाहित करण्यात आले; हृदये प्रयोगशाळेत बर्फावर ठेवून नेईपर्यंत बर्फासारख्या थंड कार्डिओप्लेजिक द्रावणात जतन करून ठेवली होती, ज्यासाठी साधारणपणे <10 मिनिटे लागतात. हृदये प्रयोगशाळेत बर्फावर ठेवून नेईपर्यंत बर्फासारख्या थंड कार्डिओप्लेजिक द्रावणात जतन करून ठेवली होती, ज्यासाठी साधारणपणे <10 मिनिटे लागतात. сердца хранили в ледяном кардиоплегическом растворе до транспортировки в лабораторию на льду, что обычно занимает <10 мин. प्रयोगशाळेत बर्फावर ठेवून नेईपर्यंत हृदये बर्फासारख्या थंड कार्डिओप्लेजिक द्रावणात साठवून ठेवली होती, ज्यास साधारणपणे १० मिनिटांपेक्षा कमी वेळ लागतो.将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中,直到冰上运送到实验室,通常<10分钟.将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中,直到冰上运送到实验室,通常<10分钟. Держите сердца в ледяной кардиоплегии до транспортировки в лабораторию на льду, обычно <10 min. प्रयोगशाळेत नेईपर्यंत हृदय बर्फावर ठेवा (कार्डिओप्लेजिया), साधारणपणे १० मिनिटांपेक्षा कमी वेळ लागतो.
CTCM उपकरण सॉलिडवर्क्स कॉम्प्युटर-एडेड डिझाइन (CAD) सॉफ्टवेअरमध्ये विकसित केले गेले. कल्चर चेंबर्स, डिव्हायडर्स आणि एअर चेंबर्स सीएनसी क्लियर ऍक्रेलिक प्लॅस्टिकचे बनलेले आहेत. ७ मिमी व्यासाची बॅक-अप रिंग मध्यभागी हाय डेन्सिटी पॉलीथिलीन (HDPE) पासून बनलेली आहे आणि तिच्यामध्ये एक ओ-रिंग ग्रूव्ह आहे, ज्यात खालील मीडिया सील करण्यासाठी वापरली जाणारी सिलिकॉन ओ-रिंग बसते. एक पातळ सिलिका मेम्ब्रेन कल्चर चेंबरला सेपरेशन प्लेटपासून वेगळे करते. सिलिकॉन मेम्ब्रेन ०.०२ इंच जाडीच्या सिलिकॉन शीटमधून लेझरने कापलेला असून त्याची कठीणता ३५A आहे. खालचे आणि वरचे सिलिकॉन गॅस्केट १/१६ इंच जाडीच्या सिलिकॉन शीटमधून लेझरने कापलेले असून त्यांची कठीणता ५०A आहे. ब्लॉक घट्ट करण्यासाठी आणि हवाबंद सील तयार करण्यासाठी ३१६L स्टेनलेस स्टीलचे स्क्रू आणि विंग नट्स वापरले जातात.
सी-पेस-ईएम प्रणालीमध्ये समाकलित करण्यासाठी एक विशेष प्रिंटेड सर्किट बोर्ड (पीसीबी) तयार करण्यात आला आहे. पीसीबीवरील स्विस मशीन कनेक्टर सॉकेट्स, ग्रॅफाइट इलेक्ट्रोड्समध्ये बसवलेल्या चांदीचा मुलामा दिलेल्या तांब्याच्या तारा आणि ब्राँझ ०-६० स्क्रूंच्या साहाय्याने जोडलेले असतात. हा प्रिंटेड सर्किट बोर्ड ३डी प्रिंटरच्या कव्हरमध्ये ठेवला जातो.
सीटीसीएम (CTCM) उपकरण एका प्रोग्रामेबल न्यूमॅटिक ॲक्ट्युएटरद्वारे (PPD) नियंत्रित केले जाते, जे हृदयाच्या चक्राप्रमाणे नियंत्रित रक्ताभिसरण दाब निर्माण करते. जसा एअर चेंबरमधील दाब वाढतो, तसा लवचिक सिलिकॉन पडदा वरच्या दिशेने विस्तारतो, ज्यामुळे ऊतींच्या जागेखालील माध्यम ढकलले जाते. या द्रवाच्या बाहेर पडण्यामुळे ऊतींचा भाग ताणला जातो, ज्यामुळे डायस्टोल दरम्यान हृदयाच्या शारीरिक विस्ताराची नक्कल होते. शिथिलतेच्या सर्वोच्च टप्प्यावर, ग्राफाइट इलेक्ट्रोडद्वारे विद्युत उत्तेजना दिली गेली, ज्यामुळे एअर चेंबरमधील दाब कमी झाला आणि ऊतींच्या भागांमध्ये आकुंचन झाले. पाईपच्या आत एक हेमोस्टॅटिक व्हॉल्व्ह आहे, ज्यामध्ये एअर सिस्टीममधील दाब ओळखण्यासाठी एक प्रेशर सेन्सर आहे. प्रेशर सेन्सरद्वारे जाणवलेला दाब लॅपटॉपला जोडलेल्या डेटा कलेक्टरला दिला जातो. यामुळे गॅस चेंबरमधील दाबाचे सतत निरीक्षण करणे शक्य होते. जेव्हा कमाल चेंबर दाब गाठला गेला (मानक 80 mmHg, 140 mmHg OS), तेव्हा डेटा संपादन उपकरणाला C-PACE-EM प्रणालीला 4 V वर सेट केलेला 2 ms साठी बायफेसिक व्होल्टेज सिग्नल तयार करण्यासाठी सिग्नल पाठवण्याचा आदेश देण्यात आला.
हृदयाचे भाग मिळवण्यात आले आणि ६ विहिरींमध्ये (wells) संवर्धनाची परिस्थिती खालीलप्रमाणे ठेवण्यात आली: काढलेली हृदये हस्तांतरण पात्रातून थंड (४° से.) कार्डिओप्लेजिया असलेल्या ट्रेमध्ये स्थानांतरित करा. डावे निलय (left ventricle) निर्जंतुक ब्लेडने वेगळे करून त्याचे १-२ घन सेमीचे तुकडे करण्यात आले. हे ऊतींचे ठोकळे (tissue blocks) ऊती चिकटवणाऱ्या पदार्थाने (tissue adhesive) ऊतींच्या आधारांना (tissue supports) जोडण्यात आले आणि टायरोडचे द्रावण (Tyrode's solution) असलेल्या आणि सतत ऑक्सिजन पुरवठा होणाऱ्या कंपन करणाऱ्या मायक्रोटोम ऊती बाथमध्ये (vibrating microtome tissue bath) ठेवण्यात आले (३ ग्रॅम/लिटर २,३-ब्युटेनडायोन मोनोऑक्झाइम (BDM), १४० mM NaCl (८.१८ ग्रॅम), ६ mM KCl (०.४४७ ग्रॅम), १० mM डी-ग्लुकोज (१.८६ ग्रॅम), १० mM HEPES (२.३८ ग्रॅम), १ mM MgCl2 (१ मिली १ M द्रावण), १.८ mM CaCl2 (१.८ मिली १ M द्रावण), १ लिटर ddH2O पर्यंत). कंपनशील मायक्रोटोम 80 Hz च्या वारंवारतेवर, 2 mm च्या क्षैतिज कंपन आयामावर आणि 0.03 mm/s च्या प्रगती दराने 300 µm जाडीचे काप कापण्यासाठी सेट केले होते. द्रावण थंड ठेवण्यासाठी टिश्यू बाथच्या सभोवती बर्फ ठेवला होता आणि तापमान 4°C वर राखले होते. एका कल्चर प्लेटसाठी पुरेसे तुकडे मिळेपर्यंत टिश्यू सेक्शन्स मायक्रोटोम बाथमधून बर्फावर ठेवलेल्या, सतत ऑक्सिजनयुक्त टायरोड द्रावण असलेल्या इनक्युबेशन बाथमध्ये स्थानांतरित करा. ट्रान्सवेल कल्चरसाठी, टिश्यू सेक्शन्स निर्जंतुक 6 mm रुंद पॉलीयुरेथेन सपोर्टवर जोडले गेले आणि 6 ml ऑप्टिमाइझ्ड माध्यमात (199 माध्यम, 1x ITS सप्लिमेंट, 10% FBS, 5 ng/ml VEGF, 10 ng/ml FGF-अल्कलाइन आणि 2X अँटीबायोटिक-अँटीफंगल) ठेवले गेले. C-Pace द्वारे टिश्यू सेक्शन्सना विद्युत उत्तेजना (10 V, वारंवारता 1.2 Hz) दिली गेली. TD परिस्थितीसाठी, प्रत्येक माध्यम बदलताना 100 nM आणि 1 μM सांद्रतेवर ताजे T3 आणि Dex टाकण्यात आले. दिवसातून ३ वेळा माध्यम बदलण्यापूर्वी ते ऑक्सिजनने संपृक्त केले जाते. ऊतींचे तुकडे ३७°C आणि ५% CO2 असलेल्या इनक्यूबेटरमध्ये संवर्धित करण्यात आले.
CTCM कल्चरसाठी, ऊतींचे तुकडे एका खास बनवलेल्या 3D प्रिंटरवर, सुधारित टायरोड द्रावण असलेल्या पेट्री डिशमध्ये ठेवण्यात आले. हे उपकरण सपोर्ट रिंगच्या क्षेत्रफळाच्या २५% ने हृदयाच्या तुकड्याचा आकार वाढवण्यासाठी डिझाइन केलेले आहे. हे यासाठी केले जाते जेणेकरून टायरोड द्रावणातून माध्यमात स्थानांतरित केल्यानंतर आणि डायस्टोल दरम्यान हृदयाचे तुकडे ताणले जाणार नाहीत. हिस्टोॲक्रिलिक गोंद वापरून, ३०० µm जाडीचे तुकडे ७ मिमी व्यासाच्या सपोर्ट रिंगवर निश्चित केले गेले. ऊतींचे तुकडे सपोर्ट रिंगला जोडल्यानंतर, अतिरिक्त तुकडे कापून टाका आणि जोडलेले तुकडे एका उपकरणासाठी पुरेसे तुकडे तयार होईपर्यंत बर्फावर (४°C) ठेवलेल्या टायरोड द्रावणाच्या बाथमध्ये परत ठेवा. सर्व उपकरणांसाठी एकूण प्रक्रिया वेळ २ तासांपेक्षा जास्त नसावा. ६ ऊतींचे तुकडे त्यांच्या सपोर्ट रिंगला जोडल्यानंतर, CTCM उपकरण एकत्र जोडले गेले. CTCM कल्चर चेंबरमध्ये २१ मिली पूर्व-ऑक्सिजनयुक्त माध्यम आधीच भरलेले असते. ऊतींचे तुकडे कल्चर चेंबरमध्ये स्थानांतरित करा आणि पिपेटने त्यातील हवेचे बुडबुडे काळजीपूर्वक काढून टाका. त्यानंतर ऊतींचा तुकडा छिद्रामध्ये घालून हळुवारपणे जागेवर दाबून बसवा. शेवटी, डिव्हाइसवर इलेक्ट्रोड कॅप लावा आणि डिव्हाइस इनक्यूबेटरमध्ये स्थानांतरित करा. त्यानंतर CTCM ला एअर ट्यूब आणि C-PACE-EM प्रणालीशी जोडा. न्यूमॅटिक ॲक्ट्युएटर उघडतो आणि एअर व्हॉल्व्ह CTCM उघडतो. C-PACE-EM प्रणाली २ मिलिसेकंदांसाठी बायफेसिक पेसिंग दरम्यान १.२ हर्ट्झवर ४ व्होल्ट पुरवण्यासाठी कॉन्फिगर केली होती. इलेक्ट्रोड्सवर ग्रॅफाइट जमा होऊ नये म्हणून माध्यम दिवसातून दोनदा आणि इलेक्ट्रोड्स दिवसातून एकदा बदलले जात होते. आवश्यक असल्यास, ऊतींच्या तुकड्यांखाली गेलेले हवेचे बुडबुडे काढण्यासाठी त्यांना त्यांच्या कल्चर वेल्समधून बाहेर काढता येते. MT उपचाराच्या स्थितीसाठी, प्रत्येक माध्यम बदलताना १०० nM T3 आणि १ μM Dex सह T3/Dex ताजे टाकले जात होते. CTCM डिव्हाइसेस ३७°C आणि ५% CO2 असलेल्या इनक्यूबेटरमध्ये कल्चर केले गेले.
हृदयाच्या स्लाइसच्या ताणलेल्या हालचाली मिळवण्यासाठी, एक विशेष कॅमेरा प्रणाली विकसित करण्यात आली. नॅव्हिटार झूम 7000 18-108mm मॅक्रो लेन्स (नॅव्हिटार, सॅन फ्रान्सिस्को, सीए) सोबत एक एसएलआर कॅमेरा (कॅनन रेबेल T7i, कॅनन, टोकियो, जपान) वापरण्यात आला. माध्यम बदलून ताजे माध्यम टाकल्यानंतर खोलीच्या तापमानावर व्हिज्युअलायझेशन करण्यात आले. कॅमेरा 51° कोनात ठेवला जातो आणि प्रति सेकंद 30 फ्रेम्सवर व्हिडिओ रेकॉर्ड केला जातो. सर्वप्रथम, हृदयाच्या स्लाइसच्या हालचालीचे प्रमाण निश्चित करण्यासाठी इमेज-जे (Image-J) सोबत ओपन सोर्स सॉफ्टवेअर (मसलमोशन43) वापरण्यात आले. नॉईज टाळण्यासाठी, स्पंदन करणाऱ्या हृदयाच्या स्लाइससाठी महत्त्वाचे क्षेत्र (regions of interest) निश्चित करण्याकरिता मॅटलॅब (MATLAB) (मॅथवर्क्स, नॅटिक, एमए, यूएसए) वापरून मास्क तयार करण्यात आला. हाताने विभागलेले मास्क फ्रेम सिक्वेन्समधील सर्व इमेजेसवर लागू केले जातात आणि नंतर मसलमोशन प्लग-इनला पाठवले जातात. मसल मोशन प्रत्येक फ्रेममधील पिक्सेलच्या सरासरी तीव्रतेचा वापर करून संदर्भ फ्रेमच्या सापेक्ष हालचालीचे प्रमाण निश्चित करते. हृदयचक्रादरम्यान चक्रवेळ मोजण्यासाठी आणि ऊतींच्या ताणाचे मूल्यांकन करण्यासाठी डेटा रेकॉर्ड केला गेला, फिल्टर केला गेला आणि वापरला गेला. रेकॉर्ड केलेल्या व्हिडिओवर फर्स्ट-ऑर्डर झिरो-फेज डिजिटल फिल्टर वापरून पोस्ट-प्रोसेसिंग केले गेले. ऊतींचा ताण (पीक-टू-पीक) मोजण्यासाठी, रेकॉर्ड केलेल्या सिग्नलमधील शिखरे आणि दऱ्यांमध्ये फरक करण्यासाठी पीक-टू-पीक विश्लेषण केले गेले. याव्यतिरिक्त, सिग्नल ड्रिफ्ट काढून टाकण्यासाठी ६व्या ऑर्डरच्या पॉलीनोमिअलचा वापर करून डिट्रेंडिंग केले जाते. ऊतींची एकूण हालचाल, चक्रवेळ, शिथिलता वेळ आणि आकुंचन वेळ निश्चित करण्यासाठी MATLAB मध्ये प्रोग्राम कोड विकसित केला गेला (पूरक प्रोग्राम कोड ४४).
ताण विश्लेषणासाठी, यांत्रिक ताण मूल्यांकनासाठी तयार केलेले तेच व्हिडिओ वापरून, आम्ही प्रथम MUSCLEMOTION सॉफ्टवेअरनुसार गती शिखरे (गतीचे सर्वोच्च (वरचे) आणि सर्वात खालचे (खालचे) बिंदू) दर्शविणाऱ्या दोन प्रतिमा रेखाटल्या. त्यानंतर आम्ही ऊतींचे भाग विभागले आणि विभागलेल्या ऊतींवर एक प्रकारचा शेडिंग अल्गोरिदम लागू केला (पूरक आकृती २अ). त्यानंतर विभागलेल्या ऊतींना दहा उपपृष्ठभागांमध्ये विभागले गेले आणि प्रत्येक पृष्ठभागावरील ताण खालील समीकरणाचा वापर करून मोजण्यात आला: ताण = (Sup-Sdown)/Sdown, जिथे Sup आणि Sdown हे अनुक्रमे कापडाच्या वरच्या आणि खालच्या सावल्यांपासून आकाराचे अंतर आहे (पूरक आकृती २ब).
हृदयाचे तुकडे ४८ तासांसाठी ४% पॅराफॉर्मल्डिहाइडमध्ये स्थिर करण्यात आले. स्थिर केलेल्या उतींना १ तासासाठी १०% आणि २०% सुक्रोजमध्ये, आणि नंतर रात्रभर ३०% सुक्रोजमध्ये निर्जलित करण्यात आले. त्यानंतर हे तुकडे ऑप्टिमम कटिंग टेम्परेचर कंपाऊंड (OCT कंपाऊंड) मध्ये एम्बेड करून आयसोपेंटेन/ड्राय आईस बाथमध्ये हळूहळू गोठवण्यात आले. OCT एम्बेडिंग ब्लॉक्स वेगळे करेपर्यंत -८० °C तापमानावर साठवा. ८ μm जाडीचे तुकडे वापरून स्लाईड्स तयार करण्यात आल्या.
हृदयाच्या भागांमधून OCT काढण्यासाठी, स्लाईड्सना हीटिंग ब्लॉकवर ९५°C तापमानावर ५ मिनिटे गरम करा. प्रत्येक स्लाईडवर १ मिली पीबीएस (PBS) टाका आणि खोलीच्या तापमानावर ३० मिनिटे ठेवा, त्यानंतर पीबीएसमधील ०.१% ट्रायटन-एक्स (Triton-X) खोलीच्या तापमानावर १५ मिनिटे ठेवून भागांना पारगम्य करा. नमुन्याला अविशिष्ट प्रतिपिंडे (non-specific antibodies) चिकटू नयेत म्हणून, स्लाईड्सवर १ मिली ३% बीएसए (BSA) द्रावण टाका आणि खोलीच्या तापमानावर १ तास ठेवा. त्यानंतर बीएसए काढून टाकण्यात आले आणि स्लाईड्स पीबीएसने धुतल्या गेल्या. प्रत्येक नमुन्यावर पेन्सिलने खूण करा. प्राथमिक अँटीबॉडीज (१% BSA मध्ये १:२०० प्रमाणात विरल केलेल्या) (कनेक्सिन ४३ (Abcam; #AB11370), NFATC4 (Abcam; #AB99431) आणि ट्रोपोनिन-टी (Thermo Scientific; #MA5-12960)) ९० मिनिटांत टाकण्यात आल्या, त्यानंतर माऊस अलेक्सा फ्लोअर ४८८ (Thermo Scientific; #A16079) विरुद्ध आणि रॅबिट अलेक्सा फ्लोअर ५९४ (Thermo Scientific; #T6391) विरुद्ध दुय्यम अँटीबॉडीज (१% BSA मध्ये १:२०० प्रमाणात विरल केलेल्या) आणखी ९० मिनिटांसाठी टाकण्यात आल्या. PBS ने ३ वेळा धुतले. टार्गेट स्टेनिंगला बॅकग्राउंडपासून वेगळे ओळखण्यासाठी, आम्ही फक्त दुय्यम अँटीबॉडीचा कंट्रोल म्हणून वापर केला. शेवटी, DAPI न्यूक्लियर स्टेन टाकण्यात आला आणि स्लाईड्स व्हेक्टाशील्ड (Vector Laboratories) मध्ये ठेवून नेलपॉलिशने सील करण्यात आल्या. -x मॅग्निफिकेशन) आणि ४०x मॅग्निफिकेशन असलेल्या कीएन्स मायक्रोस्कोपद्वारे निरीक्षण करण्यात आले.
डब्ल्यूजीए (WGA) स्टैनिंगसाठी पीबीएस (PBS) मध्ये ५ मायक्रोग्रॅम/मिलिलिटर द्रावणात डब्ल्यूजीए-अलेक्सा फ्लुओर ५५५ (थर्मो सायंटिफिक; #W32464) वापरण्यात आले आणि ते स्थिर केलेल्या सेक्शन्सवर खोलीच्या तापमानावर ३० मिनिटांसाठी लावले गेले. त्यानंतर स्लाईड्स पीबीएसने धुतल्या गेल्या आणि प्रत्येक स्लाईडवर सुदान ब्लॅक टाकून ३० मिनिटांसाठी इनक्युबेट केले गेले. त्यानंतर स्लाईड्स पीबीएसने धुतल्या गेल्या आणि व्हेक्टाशील्ड एम्बेडिंग मीडियम टाकण्यात आले. स्लाईड्स कीएन्स मायक्रोस्कोपवर ४०x मॅग्निफिकेशनवर पाहण्यात आल्या.
वर वर्णन केल्याप्रमाणे नमुन्यांमधून OCT काढण्यात आले. OCT काढल्यानंतर, स्लाईड्स रात्रभर बोइनच्या द्रावणात बुडवून ठेवा. त्यानंतर स्लाईड्स १ तास डिस्टिल्ड वॉटरने धुतल्या आणि नंतर १० मिनिटांसाठी बिब्रिच ॲलो ॲसिड फ्युक्सिन द्रावणात ठेवल्या. त्यानंतर स्लाईड्स डिस्टिल्ड वॉटरने धुतल्या आणि १० मिनिटांसाठी ५% फॉस्फोमोलीब्डेनम/५% फॉस्फोटंगस्टिक ॲसिडच्या द्रावणात ठेवल्या. न धुता, स्लाईड्स थेट १५ मिनिटांसाठी ॲनिलीन ब्लू द्रावणात स्थानांतरित करा. त्यानंतर स्लाईड्स डिस्टिल्ड वॉटरने धुतल्या आणि २ मिनिटांसाठी १% ॲसिटिक ॲसिडच्या द्रावणात ठेवल्या. स्लाईड्स २०० N इथेनॉलमध्ये वाळवल्या आणि झायलिनमध्ये स्थानांतरित केल्या. डाग दिलेल्या स्लाईड्स १०x ऑब्जेक्टिव्ह असलेल्या कीएन्स मायक्रोस्कोपचा वापर करून पाहण्यात आल्या. फायब्रोसिस क्षेत्राची टक्केवारी कीएन्स ॲनालायझर सॉफ्टवेअरचा वापर करून मोजण्यात आली.
सायक्वांट™ एमटीटी सेल व्हायबिलिटी अॅसे (इन्व्हिट्रोजन, कार्ल्सबॅड, सीए), कॅटलॉग क्रमांक V13154, निर्मात्याच्या प्रोटोकॉलनुसार काही सुधारणांसह वापरण्यात आले. विशेषतः, एमटीटी विश्लेषणादरम्यान ऊतींचा आकार एकसमान राहील याची खात्री करण्यासाठी ६ मिमी व्यासाचा सर्जिकल पंच वापरण्यात आला. निर्मात्याच्या प्रोटोकॉलनुसार, एमटीटी सबस्ट्रेट असलेल्या १२-वेल प्लेटच्या विहिरींमध्ये (wells) ऊती स्वतंत्रपणे लावण्यात आल्या. हे सेक्शन्स ३७° से. तापमानावर ३ तासांसाठी इनक्युबेट केले जातात आणि जिवंत ऊती एमटीटी सबस्ट्रेटचे चयापचय करून जांभळ्या रंगाचे फॉर्माझॅन संयुग तयार करतात. हृदयाच्या सेक्शन्समधून जांभळा फॉर्माझॅन काढण्यासाठी एमटीटी द्रावणाच्या जागी १ मिली डीएमएसओ (DMSO) वापरा आणि ३७° से. तापमानावर १५ मिनिटांसाठी इनक्युबेट करा. नमुने ९६-वेल क्लिअर बॉटम प्लेट्समध्ये डीएमएसओमध्ये १:१० प्रमाणात विरल (dilute) करण्यात आले आणि सायटेशन प्लेट रीडर (बायोटेक) वापरून ५७० एनएम (nm) वर जांभळ्या रंगाची तीव्रता मोजण्यात आली. हृदयाच्या प्रत्येक स्लाइसच्या वजनानुसार रीडिंग्ज सामान्यीकृत (normalized) करण्यात आली.
पूर्वी वर्णन केल्याप्रमाणे ग्लुकोज उपयोग चाचणीसाठी, हार्ट स्लाईस मीडिया बदलून त्या जागी १ μCi/ml [5-3H]-ग्लुकोज (मोरावेक बायोकेमिकल्स, ब्रेआ, सीए, यूएसए) असलेले मीडिया वापरण्यात आले. ४ तासांच्या इनक्युबेशननंतर, १०० µl ०.२ N HCl असलेल्या एका उघड्या मायक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबमध्ये १०० µl माध्यम टाका. त्यानंतर, [3H]2O चे ३७°C तापमानावर ७२ तासांसाठी बाष्पीभवन करण्याकरिता, ती ट्यूब ५०० μl dH2O असलेल्या सिंटिलेशन ट्यूबमध्ये ठेवण्यात आली. त्यानंतर, मायक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब सिंटिलेशन ट्यूबमधून काढून त्यात १० ml सिंटिलेशन फ्लुइड टाका. ट्राय-कार्ब २९००टीआर लिक्विड सिंटिलेशन ॲनालायझर (पॅकार्ड बायोसायन्स कंपनी, मेरिडेन, सीटी, यूएसए) वापरून सिंटिलेशन काउंट्स करण्यात आले. त्यानंतर [5-3H]-ग्लुकोजची विशिष्ट क्रियाशीलता, अपूर्ण समतोल आणि पार्श्वभूमी, [5-3H]-ग्लुकोजचे अचिन्हांकित ग्लुकोजमध्ये झालेले विरलीकरण आणि स्केंटिलेशन काउंटरची कार्यक्षमता विचारात घेऊन ग्लुकोजच्या वापराची गणना करण्यात आली. ही माहिती हृदयाच्या भागांच्या वस्तुमानानुसार सामान्यीकृत केली आहे.
ट्रायझोलमध्ये ऊतींचे एकत्रीकरण केल्यानंतर, उत्पादकाच्या प्रोटोकॉलनुसार कियाजेन miRNeasy मायक्रो किट #210874 वापरून हृदयाच्या भागांमधून RNA वेगळा करण्यात आला. RNAsec लायब्ररीची तयारी, सिक्वेन्सिंग आणि डेटा विश्लेषण खालीलप्रमाणे करण्यात आले:
आरएनए लायब्ररी तयार करण्यासाठी सुरुवातीचे साहित्य म्हणून प्रत्येक नमुन्यासाठी १ मायक्रोग्रॅम आरएनए वापरण्यात आला. उत्पादकाच्या शिफारशींनुसार, इल्युमिनासाठी असलेल्या NEBNext UltraTM RNA लायब्ररी प्रिपरेशन किट (NEB, USA) चा वापर करून सिक्वेन्सिंग लायब्ररी तयार करण्यात आल्या आणि प्रत्येक नमुन्याच्या ॲट्रिब्यूट सिक्वेन्समध्ये इंडेक्स कोड जोडण्यात आले. थोडक्यात, पॉली-टी ऑलिगोन्यूक्लिओटाइड्स जोडलेल्या चुंबकीय मण्यांचा वापर करून एकूण आरएनएमधून एमआरएनए शुद्ध करण्यात आला. NEBNext फर्स्ट स्ट्रँड सिंथेसिस रिॲक्शन बफर (5X) मध्ये उच्च तापमानावर द्विसंयुजी कॅटायन्सचा वापर करून फ्रॅगमेंटेशन केले जाते. रँडम हेक्झामर प्रायमर्स आणि M-MuLV रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्टेज (RNase H-) वापरून फर्स्ट स्ट्रँड सीडीएनए संश्लेषित करण्यात आला. त्यानंतर डीएनए पॉलिमरेज I आणि RNase H वापरून सेकंड स्ट्रँड सीडीएनए संश्लेषित केला जातो. उरलेल्या ओव्हरहँग्सचे रूपांतर एक्सोन्यूक्लिएज/पॉलिमरेज क्रियेद्वारे ब्लंट एंड्समध्ये केले जाते. डीएनए फ्रॅगमेंटच्या ३' टोकाचे ॲडेनिलेशन केल्यानंतर, हायब्रिडायझेशनसाठी तयार करण्याकरिता त्याला हेअरपिन लूप संरचनेसह एक NEBNext ॲडॉप्टर जोडला जातो. १५०-२०० bp च्या पसंतीच्या लांबीचे cDNA तुकडे निवडण्यासाठी, लायब्ररीचे तुकडे AMPure XP प्रणाली (बेकमन कोल्टर, बेव्हरली, यूएसए) वापरून शुद्ध केले गेले. त्यानंतर, PCR करण्यापूर्वी, आकारानुसार निवडलेले cDNA एका अडॅप्टरसोबत जोडून, ३ μl USER एन्झाइम (NEB, यूएसए) ३७°C वर १५ मिनिटे आणि नंतर ९५°C वर ५ मिनिटे ठेवण्यात आले. त्यानंतर, Phusion High-Fidelity DNA पॉलिमरेज, युनिव्हर्सल PCR प्रायमर्स आणि इंडेक्स (X) प्रायमर्स वापरून PCR केले गेले. शेवटी, PCR उत्पादने शुद्ध केली गेली (AMPure XP प्रणाली) आणि Agilent Bioanalyzer 2100 प्रणालीवर लायब्ररीच्या गुणवत्तेचे मूल्यांकन केले गेले. त्यानंतर, Novaseq सिक्वेन्सर वापरून cDNA लायब्ररीचे सिक्वेन्सिंग केले गेले. Illumina मधील कच्च्या इमेज फाइल्स CASAVA बेस कॉलिंग वापरून कच्च्या रीड्समध्ये रूपांतरित केल्या गेल्या. कच्चा डेटा FASTQ(fq) फॉरमॅट फाइल्समध्ये संग्रहित केला जातो, ज्यामध्ये रीड सिक्वेन्स आणि संबंधित बेस गुणवत्ता असते. फिल्टर केलेल्या सिक्वेन्सिंग रीड्सना Sscrofa11.1 रेफरन्स जीनोमशी जुळवण्यासाठी HISAT2 निवडा. सर्वसाधारणपणे, HISAT2 कोणत्याही आकाराच्या जीनोमला सपोर्ट करते, ज्यामध्ये ४ अब्ज बेसपेक्षा मोठे जीनोम देखील समाविष्ट आहेत, आणि बहुतेक पॅरामीटर्ससाठी डीफॉल्ट व्हॅल्यूज सेट केलेल्या असतात. सध्या उपलब्ध असलेल्या सर्वात वेगवान प्रणाली, HISAT2 चा वापर करून, RNA Seq डेटामधील स्प्लिसिंग रीड्सना इतर कोणत्याही पद्धतीइतक्याच किंवा त्याहून अधिक अचूकतेने कार्यक्षमतेने अलाइन केले जाऊ शकते.
ट्रान्सक्रिप्ट्सची विपुलता थेट जनुकीय अभिव्यक्तीची पातळी दर्शवते. जनुकीय अभिव्यक्तीची पातळी जीनोम किंवा एक्सॉनशी संबंधित असलेल्या ट्रान्सक्रिप्ट्सच्या विपुलतेवरून (सिक्वेन्सिंग काउंट) मोजली जाते. रीड्सची संख्या जनुकीय अभिव्यक्तीची पातळी, जनुकीय लांबी आणि सिक्वेन्सिंग डेप्थ यांच्या प्रमाणात असते. DESeq2 पॅकेजचा वापर करून FPKM (प्रति दशलक्ष बेस पेअर्स सिक्वेन्स केलेल्या प्रति हजार बेस पेअर्स ट्रान्सक्रिप्टचे फ्रॅगमेंट्स) ची गणना करण्यात आली आणि विभेदक अभिव्यक्तीची P-व्हॅल्यू निश्चित करण्यात आली. त्यानंतर, आम्ही R-मधील अंगभूत फंक्शन “p.adjust” वर आधारित बेन्जामिनी-होचबर्ग पद्धत9 वापरून प्रत्येक P-व्हॅल्यूसाठी फॉल्स डिस्कव्हरी रेट (FDR) ची गणना केली.
हृदयाच्या भागांमधून वेगळे केलेले RNA, थर्मोच्या (Thermo, cat. no. 11756050) सुपरस्क्रिप्ट IV विलो मास्टर मिक्सचा वापर करून 200 ng/μl च्या सांद्रतेवर cDNA मध्ये रूपांतरित करण्यात आले. अप्लाइड बायोसिस्टम्स एंडुरा प्लेट मायक्रोअॅम्प 384-वेल पारदर्शक रिॲक्शन प्लेट (Thermo, cat. no. 4483319) आणि मायक्रोअॅम्प ऑप्टिकल ॲडेसिव्ह (Thermo, cat. no. 4311971) वापरून क्वांटिटेटिव्ह RT-PCR करण्यात आले. रिॲक्शन मिश्रणामध्ये प्रत्येक वेलसाठी 5 µl टॅकमॅन फास्ट ॲडव्हान्स्ड मास्टर मिक्स (Thermo, cat # 4444557), 0.5 µl टॅकमॅन प्रायमर आणि 3.5 µl H2O मिसळलेले होते. अप्लाइड बायोसिस्टम्स क्वांटस्टुडिओ 5 रिअल-टाइम PCR इन्स्ट्रुमेंट (384-वेल मॉड्यूल; उत्पादन # A28135) वापरून मानक qPCR सायकल्स चालवण्यात आल्या आणि CT मूल्ये मोजण्यात आली. टॅकमॅन प्रायमर्स थर्मो कडून खरेदी केले होते (GAPDH (Ss03375629_u1), PARP12 (Ss06908795_m1), PKDCC (Ss06903874_m1), CYGB (Ss06900188_m1), RGL1 (Ss06868890_m1), ACTN1 (Ss01009508_mH), GATA4 (Ss03383805_u1), GJA1 (Ss03374839_u1), COL1A2 (Ss03375009_u1 ), COL3A1 (Ss04323794_m1), ACTA2 (Ss04245588_m1)). सर्व नमुन्यांची CT मूल्ये हाउसकीपिंग जीन GAPDH च्या तुलनेत सामान्यीकृत केली गेली.
उत्पादकाच्या प्रोटोकॉलनुसार, NT-ProBNP किट (डुक्कर) (कॅट. नं. MBS2086979, मायबायोसॉर्स) वापरून NT-ProBNP च्या मीडिया रिलीझचे मूल्यांकन करण्यात आले. थोडक्यात, प्रत्येक वेलमध्ये नमुना आणि स्टँडर्डचे प्रत्येकी २५० µl दुप्पट प्रमाणात टाकण्यात आले. नमुना टाकल्यानंतर लगेचच, प्रत्येक वेलमध्ये ५० µl असे रिएजंट A टाका. प्लेट हळुवारपणे हलवा आणि सीलंटने सील करा. त्यानंतर टॅब्लेट ३७°C तापमानावर १ तासासाठी इनक्युबेट करण्यात आले. नंतर सोल्युशन काढून टाका आणि ३५० µl 1X वॉश सोल्युशनने वेल्स ४ वेळा धुवा, प्रत्येक वेळी वॉश सोल्युशन १-२ मिनिटांसाठी इनक्युबेट करा. त्यानंतर प्रत्येक वेलमध्ये १०० µl असे रिएजंट B टाका आणि प्लेट सीलंटने सील करा. टॅब्लेट हळुवारपणे हलवून ३७°C तापमानावर ३० मिनिटांसाठी इनक्युबेट करण्यात आले. द्रावण शोषून घ्या आणि ३५० µl १X वॉश सोल्युशनने वेल्स ५ वेळा धुवा. प्रत्येक वेलमध्ये ९० µl सबस्ट्रेट सोल्युशन टाका आणि प्लेट सील करा. प्लेट ३७°C तापमानावर १०-२० मिनिटांसाठी इनक्युबेट करा. प्रत्येक वेलमध्ये ५० µl स्टॉप सोल्युशन टाका. प्लेटचे मोजमाप लगेचच ४५० nm वर सेट केलेल्या सायटेशन (बायोटेक) प्लेट रीडरचा वापर करून करण्यात आले.
5% टाईप I त्रुटी दरासह पॅरामीटरमधील 10% निरपेक्ष बदल शोधण्यासाठी >80% पॉवर प्रदान करतील अशा गट आकारांची निवड करण्यासाठी पॉवर विश्लेषणे केली गेली. 5% टाईप I त्रुटी दरासह पॅरामीटरमधील 10% निरपेक्ष बदल शोधण्यासाठी >80% पॉवर प्रदान करतील अशा गट आकारांची निवड करण्यासाठी पॉवर विश्लेषणे केली गेली. अनालिझ мощности был выполнен для выбора размеров групп, которые обеспечат >80% мощности для обнаружемения 10% абнаружения параметра с 5% частотой ошибок типа I. 5% टाईप I त्रुटी दरासह 10% निरपेक्ष पॅरामीटर बदल शोधण्यासाठी >80% पॉवर प्रदान करतील अशा गट आकारांची निवड करण्यासाठी पॉवर विश्लेषण केले गेले.进行功效分析以选择将提供>80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％I将揘变化和5％I将提供.进行功效分析以选择将提供>80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％I将揘变化和5％I将提供. Был проведен анализ мощности для выбора размера группы, который обеспечил бы > ८०% мощности для обнаружения 10% параметров и 5% частоты ошибок типа I. 10% निरपेक्ष पॅरामीटर बदल आणि 5% टाईप I त्रुटी दर शोधण्यासाठी >80% पॉवर प्रदान करेल अशा गटाचा आकार निवडण्यासाठी पॉवर विश्लेषण केले गेले.प्रयोगापूर्वी ऊतींचे नमुने यादृच्छिकपणे निवडले गेले. सर्व विश्लेषणे स्थिती-अंध होती आणि सर्व डेटाचे विश्लेषण झाल्यानंतरच नमुने डीकोड केले गेले. सर्व सांख्यिकीय विश्लेषणे करण्यासाठी ग्राफपॅड प्रिझम सॉफ्टवेअर (सॅन दिएगो, सीए) वापरण्यात आले. सर्व सांख्यिकीसाठी, p-मूल्ये <0.05 असताना ती महत्त्वपूर्ण मानली गेली. सर्व सांख्यिकीसाठी, p-मूल्ये <0.05 असताना महत्त्वपूर्ण मानली गेली. Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. सर्व सांख्यिकीसाठी, p-मूल्ये <0.05 असताना महत्त्वपूर्ण मानली गेली.对于所有统计数据,p 值在值<0.05 时被认为是显着的.对于所有统计数据,p 值在值<0.05 时被认为是显着的. Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. सर्व सांख्यिकीसाठी, p-मूल्ये <0.05 असताना महत्त्वपूर्ण मानली गेली.डेटावर फक्त २ तुलनांसह द्विपक्षीय स्टुडंट्स टी-टेस्ट करण्यात आली. अनेक गटांमधील सार्थकता निश्चित करण्यासाठी एकपक्षीय किंवा द्विपक्षीय ॲनोव्हाचा वापर करण्यात आला. पोस्ट हॉक चाचण्या करताना, अनेक तुलना विचारात घेण्यासाठी टुकीची सुधारणा लागू करण्यात आली. पद्धती विभागात वर्णन केल्यानुसार, एफडीआर आणि पी.ॲडजस्टची गणना करताना आरएनएसेक डेटासाठी विशेष सांख्यिकीय बाबी विचारात घ्याव्या लागतात.
अभ्यासाच्या रचनेबद्दल अधिक माहितीसाठी, या लेखाशी जोडलेला नेचर रिसर्च रिपोर्टचा सारांश पहा.
पोस्ट करण्याची वेळ: २८ सप्टेंबर २०२२
