Nature.com ला भेट दिल्याबद्दल धन्यवाद. तुम्ही वापरत असलेल्या ब्राउझर आवृत्तीला मर्यादित CSS सपोर्ट आहे. सर्वोत्तम अनुभवासाठी, आम्ही शिफारस करतो की तुम्ही अपडेटेड ब्राउझर वापरा (किंवा इंटरनेट एक्सप्लोररमध्ये कंपॅटिबिलिटी मोड अक्षम करा). दरम्यान, सतत सपोर्ट सुनिश्चित करण्यासाठी, आम्ही साइटला स्टाईल आणि जावास्क्रिप्टशिवाय रेंडर करू.
औषध चाचणीसाठी हृदयाच्या शारीरिक वातावरणाचे अचूक पुनरुत्पादन करू शकेल अशा विश्वासार्ह इन विट्रो प्रणालीची आवश्यकता आहे. मानवी हृदयाच्या ऊती संस्कृती प्रणालींच्या मर्यादित उपलब्धतेमुळे हृदयाच्या औषधांच्या परिणामांचे चुकीचे अर्थ लावले गेले आहेत. येथे, आम्ही एक कार्डियाक टिशू संस्कृती मॉडेल (CTCM) विकसित केले आहे जे इलेक्ट्रोमेकॅनिकली हृदयाच्या तुकड्यांना उत्तेजित करते आणि हृदय चक्राच्या सिस्टोलिक आणि डायस्टोलिक टप्प्यांदरम्यान शारीरिक ताण घेते. १२ दिवसांच्या संस्कृतीनंतर, या दृष्टिकोनामुळे हृदयाच्या विभागांची व्यवहार्यता अंशतः सुधारली, परंतु त्यांची संरचनात्मक अखंडता पूर्णपणे जपली गेली नाही. म्हणून, लहान रेणू तपासणीनंतर, आम्हाला आढळले की आमच्या माध्यमात १०० nM ट्रायओडोथायरोनिन (T3) आणि १ μM डेक्सामेथासोन (Dex) जोडल्याने १२ दिवसांसाठी विभागांची सूक्ष्म रचना राखली गेली. T3/Dex उपचारांसह, CTCM प्रणालीने १२ दिवसांसाठी ताज्या हृदयाच्या ऊतींच्या समान पातळीवर ट्रान्सक्रिप्शनल प्रोफाइल, व्यवहार्यता, चयापचय क्रियाकलाप आणि संरचनात्मक अखंडता राखली. याव्यतिरिक्त, कल्चरमध्ये हृदयाच्या ऊतींचे जास्त ताणणे हायपरट्रॉफिक कार्डियाक सिग्नलिंगला प्रेरित करते, ज्यामुळे हृदयाच्या ताणामुळे होणाऱ्या हायपरट्रॉफिक परिस्थितीची नक्कल करण्याची CTCM ची क्षमता सिद्ध होते. शेवटी, CTCM दीर्घ कालावधीत कल्चरमध्ये हृदयाच्या शरीरक्रियाविज्ञान आणि पॅथोफिजियोलॉजीचे मॉडेल बनवू शकते, ज्यामुळे विश्वसनीय औषध तपासणी शक्य होते.
क्लिनिकल संशोधनापूर्वी, मानवी हृदयाच्या शारीरिक वातावरणाचे अचूक पुनरुत्पादन करू शकणार्‍या विश्वासार्ह इन विट्रो प्रणालींची आवश्यकता असते. अशा प्रणालींनी बदललेल्या यांत्रिक ताण, हृदय गती आणि इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल गुणधर्मांची नक्कल करावी. मानवी हृदयात औषधांचे परिणाम प्रतिबिंबित करण्यात मर्यादित विश्वासार्हतेसह हृदय शरीरक्रियाविज्ञानासाठी स्क्रीनिंग प्लॅटफॉर्म म्हणून प्राण्यांचे मॉडेल सामान्यतः वापरले जातात1,2. शेवटी, आदर्श कार्डियाक टिश्यू कल्चर एक्सपेरिमेंटल मॉडेल (CTCM) हे एक मॉडेल आहे जे विविध उपचारात्मक आणि औषधीय हस्तक्षेपांसाठी अत्यंत संवेदनशील आणि विशिष्ट आहे, मानवी हृदयाच्या शरीरक्रियाविज्ञान आणि पॅथोफिजियोलॉजीचे अचूक पुनरुत्पादन करते3. अशा प्रणालीच्या अनुपस्थितीमुळे हृदय अपयशासाठी नवीन उपचारांचा शोध मर्यादित होतो4,5 आणि बाजारातून बाहेर पडण्याचे प्रमुख कारण म्हणून औषध कार्डियोटॉक्सिसिटीला कारणीभूत ठरले आहे6.
गेल्या दशकात, आठ नॉन-हृदय व रक्तवाहिन्यासंबंधी औषधे क्लिनिकल वापरातून काढून टाकण्यात आली आहेत कारण ती QT मध्यांतर वाढवतात ज्यामुळे वेंट्रिक्युलर एरिथमिया आणि अचानक मृत्यू होतो. अशाप्रकारे, हृदय व रक्तवाहिन्यासंबंधी कार्यक्षमता आणि विषाक्तता मूल्यांकन करण्यासाठी विश्वसनीय प्रीक्लिनिकल स्क्रीनिंग धोरणांची वाढती आवश्यकता आहे. औषध तपासणी आणि विषाक्तता चाचणीमध्ये मानवी-प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल-व्युत्पन्न कार्डिओमायोसाइट्स (hiPS-CM) चा अलिकडचा वापर या समस्येचे अंशतः निराकरण प्रदान करतो. तथापि, hiPS-CM चे अपरिपक्व स्वरूप आणि हृदयाच्या ऊतींचे बहुपेशीय जटिलतेचा अभाव या पद्धतीच्या प्रमुख मर्यादा आहेत. अलिकडच्या अभ्यासातून असे दिसून आले आहे की उत्स्फूर्त आकुंचन सुरू झाल्यानंतर लगेचच कार्डियाक टिशू हायड्रोजेल तयार करण्यासाठी सुरुवातीच्या hiPS-CM वापरून आणि कालांतराने हळूहळू विद्युत उत्तेजन वाढवून ही मर्यादा अंशतः दूर केली जाऊ शकते. तथापि, या hiPS-CM सूक्ष्म ऊतींमध्ये प्रौढ मायोकार्डियमचे परिपक्व इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल आणि आकुंचनशील गुणधर्म नसतात. याव्यतिरिक्त, मानवी हृदयाच्या ऊतींची रचना अधिक जटिल असते, ज्यामध्ये एंडोथेलियल पेशी, न्यूरॉन्स आणि स्ट्रोमल फायब्रोब्लास्ट्ससह विविध पेशी प्रकारांचे विषम मिश्रण असते, जे बाह्य पेशीय मॅट्रिक्स प्रथिनांच्या विशिष्ट संचांद्वारे एकमेकांशी जोडलेले असतात. प्रौढ सस्तन प्राण्यांच्या हृदयात कार्डिओमायोसाइट नसलेल्या लोकसंख्येची ही विषमता 11,12,13 वैयक्तिक पेशी प्रकारांचा वापर करून हृदयाच्या ऊतींचे मॉडेलिंग करण्यासाठी एक प्रमुख अडथळा आहे. या प्रमुख मर्यादा शारीरिक आणि पॅथॉलॉजिकल परिस्थितीत अखंड मायोकार्डियल ऊतींचे संवर्धन करण्यासाठी पद्धती विकसित करण्याच्या महत्त्वावर भर देतात.
मानवी हृदयाचे कल्चर्ड पातळ (३०० µm) विभाग अखंड मानवी मायोकार्डियमचे एक आशादायक मॉडेल असल्याचे सिद्ध झाले आहे. ही पद्धत मानवी हृदयाच्या ऊतींसारख्या संपूर्ण ३D बहुपेशीय प्रणालीमध्ये प्रवेश प्रदान करते. तथापि, २०१९ पर्यंत, कल्चर्ड हृदय विभागांचा वापर लहान (२४ तास) कल्चर जगण्यामुळे मर्यादित होता. हे भौतिक-यांत्रिक ताणाचा अभाव, हवा-द्रव इंटरफेस आणि हृदयाच्या ऊतींच्या गरजा पूर्ण न करणाऱ्या साध्या माध्यमांचा वापर यासह अनेक घटकांमुळे आहे. २०१९ मध्ये, अनेक संशोधन गटांनी असे दाखवून दिले की कार्डियाक टिश्यू कल्चर सिस्टममध्ये यांत्रिक घटकांचा समावेश केल्याने कल्चरचे आयुष्य वाढू शकते, हृदयाची अभिव्यक्ती सुधारू शकते आणि हृदयाच्या पॅथॉलॉजीची नक्कल करता येते. १७ आणि १८ या दोन सुंदर अभ्यासातून असे दिसून आले आहे की कल्चर दरम्यान एकअक्षीय यांत्रिक लोडिंगचा कार्डियाक फेनोटाइपवर सकारात्मक परिणाम होतो. तथापि, या अभ्यासांमध्ये कार्डियाक सायकलच्या गतिमान त्रिमितीय भौतिक-यांत्रिक लोडिंगचा वापर केला गेला नाही, कारण हृदयाचे विभाग आयसोमेट्रिक टेन्सिल फोर्स १७ किंवा रेषीय ऑक्सोटोनिक लोडिंग १८ ने लोड केले गेले होते. ऊती ताणण्याच्या या पद्धतींमुळे अनेक कार्डियाक जीन्स दडपल्या गेल्या किंवा असामान्य स्ट्रेच प्रतिसादांशी संबंधित जीन्सचे अतिप्रदर्शन झाले. उल्लेखनीय म्हणजे, पिटौलिस एट अल. १९ ने फोर्स ट्रान्सड्यूसर फीडबॅक आणि टेन्शन ड्राइव्ह वापरून कार्डियाक सायकल पुनर्बांधणीसाठी डायनॅमिक हार्ट स्लाइस कल्चर बाथ विकसित केला. जरी ही प्रणाली अधिक अचूक इन विट्रो कार्डियाक सायकल मॉडेलिंगला अनुमती देते, तरी पद्धतीची जटिलता आणि कमी थ्रूपुट या प्रणालीच्या वापरावर मर्यादा घालते. आमच्या प्रयोगशाळेने अलीकडेच इलेक्ट्रिकल उत्तेजना आणि पोर्सिन आणि मानवी हृदयाच्या ऊतींच्या विभागांची व्यवहार्यता 6 दिवसांपर्यंत राखण्यासाठी एक ऑप्टिमाइझ केलेले माध्यम वापरून एक सरलीकृत कल्चर सिस्टम विकसित केली आहे. २०,२१.
सध्याच्या हस्तलिखितात, आम्ही पोर्सिन हार्टच्या विभागांचा वापर करून कार्डियाक टिश्यू कल्चर मॉडेल (CTCM) चे वर्णन करतो ज्यामध्ये हृदय चक्रादरम्यान त्रिमितीय कार्डियाक फिजियोलॉजी आणि पॅथोफिजियोलॉजिकल डिस्टेंशनची पुनरावृत्ती करण्यासाठी ह्युमरल संकेत समाविष्ट केले जातात. हे CTCM प्री-क्लिनिकल ड्रग टेस्टिंगसाठी सस्तन प्राण्यांच्या हृदयाच्या फिजियोलॉजी/पॅथोफिजियोलॉजीची नक्कल करणारी किफायतशीर, मध्यम-थ्रूपुट कार्डियाक सिस्टम प्रदान करून प्री-क्लिनिकल ड्रग प्रेडिक्शनची अचूकता कधीही न मिळवलेल्या पातळीवर वाढवू शकते.
हेमोडायनामिक मेकॅनिकल सिग्नल्स इन विट्रो २२,२३,२४ कार्डिओमायोसाइट फंक्शन राखण्यात महत्त्वाची भूमिका बजावतात. सध्याच्या हस्तलिखितात, आम्ही एक CTCM (आकृती १अ) विकसित केले आहे जे शारीरिक फ्रिक्वेन्सीजवर (१.२ हर्ट्झ, ७२ बीट्स प्रति मिनिट) विद्युत आणि यांत्रिक उत्तेजन दोन्ही प्रेरित करून प्रौढ हृदयाच्या वातावरणाची नक्कल करू शकते. डायस्टोल दरम्यान जास्त ऊतींचा ताण टाळण्यासाठी, ऊतींचा आकार २५% ने वाढवण्यासाठी ३D प्रिंटिंग डिव्हाइस वापरण्यात आले (आकृती १ब). कार्डियाक सायकल पूर्णपणे पुनरुत्पादित करण्यासाठी डेटा अधिग्रहण प्रणाली वापरून सिस्टोलच्या १०० मिलीसेकंद आधी सुरू करण्यासाठी C-PACE प्रणालीद्वारे प्रेरित इलेक्ट्रिकल पेसिंगची वेळ निश्चित करण्यात आली. ऊती संस्कृती प्रणाली वरच्या चेंबरमध्ये हृदयाच्या तुकड्यांचा विस्तार करण्यासाठी लवचिक सिलिकॉन पडदा चक्रीयपणे विस्तृत करण्यासाठी प्रोग्रामेबल न्यूमॅटिक अ‍ॅक्ट्युएटर (LB अभियांत्रिकी, जर्मनी) वापरते. प्रेशर ट्रान्सड्यूसरद्वारे सिस्टम बाह्य एअर लाईनशी जोडलेली होती, ज्यामुळे दाब (± १ मिमीएचजी) आणि वेळ (± १ मिलीसेकंद) अचूकपणे समायोजित करणे शक्य झाले (आकृती १क).
a उपकरणाच्या कल्चर चेंबरमध्ये निळ्या रंगात दाखवलेल्या ७ मिमी सपोर्ट रिंगला टिश्यू सेक्शन जोडा. कल्चर चेंबर एअर चेंबरपासून पातळ लवचिक सिलिकॉन मेम्ब्रेनने वेगळे केले आहे. गळती रोखण्यासाठी प्रत्येक चेंबरमध्ये गॅस्केट ठेवा. उपकरणाच्या झाकणात ग्रेफाइट इलेक्ट्रोड असतात जे विद्युत उत्तेजना प्रदान करतात. b मोठ्या टिश्यू डिव्हाइस, मार्गदर्शक रिंग आणि समर्थन रिंगचे योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व. उपकरणाच्या बाहेरील काठावर असलेल्या खोबणीत मार्गदर्शक रिंगसह मोठ्या आकाराच्या डिव्हाइसवर टिश्यू सेक्शन (तपकिरी) ठेवलेले आहेत. मार्गदर्शक वापरून, कार्डियाक टिश्यूच्या सेक्शनवर टिश्यू अॅक्रेलिक अॅडहेसिव्हने लेपित सपोर्ट रिंग काळजीपूर्वक ठेवा. c प्रोग्रामेबल न्यूमॅटिक अ‍ॅक्च्युएटर (PPD) द्वारे नियंत्रित एअर चेंबर प्रेशरचे कार्य म्हणून विद्युत उत्तेजनाचा वेळ दर्शविणारा आलेख. प्रेशर सेन्सर्स वापरून विद्युत उत्तेजन समक्रमित करण्यासाठी डेटा अधिग्रहण डिव्हाइस वापरण्यात आले. जेव्हा कल्चर चेंबरमधील दाब सेट थ्रेशोल्डवर पोहोचतो, तेव्हा विद्युत उत्तेजन ट्रिगर करण्यासाठी C-PACE-EM ला एक पल्स सिग्नल पाठवला जातो. d इनक्यूबेटर शेल्फवर ठेवलेल्या चार CTCM ची प्रतिमा. एका पीपीडीला चार उपकरणे एका न्यूमॅटिक सर्किटद्वारे जोडली जातात आणि न्यूमॅटिक सर्किटमधील दाबाचे निरीक्षण करण्यासाठी हेमोस्टॅटिक व्हॉल्व्हमध्ये प्रेशर सेन्सर घातले जातात. प्रत्येक उपकरणात सहा टिशू सेक्शन असतात.
एकाच वायवीय अ‍ॅक्च्युएटरचा वापर करून, आम्ही ४ CTCM उपकरणे नियंत्रित करू शकलो, ज्यापैकी प्रत्येकी ६ ऊतींचे विभाग धरू शकतात (आकृती १d). CTCM मध्ये, हवेच्या चेंबरमधील हवेचा दाब द्रव चेंबरमध्ये समकालिक दाबात रूपांतरित होतो आणि हृदयाच्या तुकड्याच्या शारीरिक विस्तारास प्रेरित करतो (आकृती २a आणि पूरक चित्रपट १). ८० मिमी Hg वर ऊतींच्या ताणाचे मूल्यांकन. कलाकृतीमध्ये ऊतींच्या विभागांचे २५% ने ताण दिसून आले (आकृती २b). सामान्य हृदयाच्या विभागाच्या आकुंचनासाठी हा टक्केवारीचा ताण २.२-२.३ µm च्या शारीरिक सारकोमेर लांबीशी संबंधित असल्याचे दिसून आले आहे १७,१९,२५. कस्टम कॅमेरा सेटिंग्ज वापरून ऊतींच्या हालचालीचे मूल्यांकन केले गेले (पूरक आकृती १). ऊतींच्या हालचालीचे मोठेपणा आणि वेग (आकृती २c, d) हृदयाच्या चक्रादरम्यान आणि सिस्टोल आणि डायस्टोल दरम्यानच्या वेळेशी संबंधित होते (आकृती २b). आकुंचन आणि विश्रांती दरम्यान हृदयाच्या ऊतींचे ताण आणि वेग १२ दिवसांपर्यंत संस्कृतीत स्थिर राहिले (आकृती २f). कल्चर दरम्यान विद्युत उत्तेजनाचा आकुंचनशीलतेवर होणाऱ्या परिणामाचे मूल्यांकन करण्यासाठी, आम्ही शेडिंग अल्गोरिदम वापरून सक्रिय विकृती निश्चित करण्यासाठी एक पद्धत विकसित केली (पूरक आकृती 2a,b) आणि विद्युत उत्तेजनासह आणि त्याशिवाय विकृतींमध्ये फरक करण्यास सक्षम झालो. हृदयाचा समान भाग (आकृती 2f). कटच्या गतिमान प्रदेशात (R6-9), विद्युत उत्तेजनाच्या अनुपस्थितीपेक्षा विद्युत उत्तेजनादरम्यान व्होल्टेज 20% जास्त होता, जो आकुंचनशील कार्यात विद्युत उत्तेजनाचे योगदान दर्शवितो.
हवेच्या चेंबर प्रेशरचे प्रतिनिधी ट्रेस, फ्लुइड चेंबर प्रेशर आणि टिशू हालचाल मोजमाप हे पुष्टी करतात की चेंबर प्रेशर फ्लुइड चेंबर प्रेशरमध्ये बदल करते, ज्यामुळे टिशू स्लाइसची संबंधित हालचाल होते. b टक्के स्ट्रेच (नारिंगी) शी संबंधित टिशू सेक्शनच्या टक्के स्ट्रेच (निळ्या) चे प्रतिनिधी ट्रेस. c कार्डियाक स्लाइसची मोजलेली गती गतीच्या मोजलेल्या गतीशी सुसंगत आहे. (d) हृदयाच्या स्लाइसमध्ये चक्रीय गती (निळी रेषा) आणि वेग (नारिंगी ठिपकेदार रेषा) चे प्रतिनिधी ट्रॅजेक्टोरीज. e सायकल वेळेचे परिमाण (n = वेगवेगळ्या डुकरांमधून प्रति गट 19 स्लाइस), आकुंचन वेळ (n = 19 स्लाइस प्रति गट), विश्रांती वेळ (n = वेगवेगळ्या डुकरांमधून प्रति गट 19 स्लाइस), वेगवेगळ्या डुकरांमधून ऊती हालचाल (n = 25) स्लाइस)/गट), पीक सिस्टोलिक वेग (n = 24(D0), 25(D12) स्लाइस/गट वेगवेगळ्या डुकरांमधून) आणि पीक विश्रांती दर (n=24(D0), 25(D12) स्लाइस/गट वेगवेगळ्या डुकरांमधून). दोन-पुच्छ असलेल्या विद्यार्थ्याच्या टी-चाचणीने कोणत्याही पॅरामीटरमध्ये कोणताही महत्त्वपूर्ण फरक दर्शविला नाही. f प्रतिनिधी स्ट्रेन विश्लेषण (लाल) आणि (निळा) विद्युत उत्तेजन नसलेल्या ऊती विभागांचे ट्रेस, त्याच विभागातील ऊती विभागांचे दहा प्रादेशिक क्षेत्र. तळाशी असलेले पॅनेल वेगवेगळ्या विभागांमधील दहा क्षेत्रांमध्ये विद्युत उत्तेजनासह आणि त्याशिवाय ऊती विभागांमधील ताणातील टक्केवारीतील फरकाचे प्रमाण दर्शवितात. (n = वेगवेगळ्या डुकरांचे 8 तुकडे/गट, दोन-पुच्छ विद्यार्थी टी-चाचणी केली जाते; ****p < 0.0001, **p < 0.01, *p < 0.05). (n = वेगवेगळ्या डुकरांचे 8 तुकडे/गट, दोन-पुच्छ विद्यार्थी टी-चाचणी केली जाते; ****p < 0.0001, **p < 0.01, *p < 0.05). (n = 8 срезов/группу от разных свиней, проводится двусторонний t-критерий Стьюдента; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,00, *p<0,001). (n = वेगवेगळ्या डुकरांमधून 8 विभाग/गट, दोन-पुच्छ विद्यार्थ्यांची टी-टेस्ट; ****p<0.0001, **p<0.01, *p<0.05). （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；**p <0.0001，**p < 0.01,*p < 0.05）. （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；**p <0.0001，**p < 0.01,*p < 0.05）. (n = 8 срезов/группу, от разных свиней, двусторонний критерий Стьюдента; ****p <0,0001, **p <0,01, *p <0,05). (n = 8 विभाग/गट, वेगवेगळ्या डुकरांपासून, दोन-पुच्छ विद्यार्थ्यांची टी-टेस्ट; ****p<0.0001, **p<0.01, *p<0.05).त्रुटी बार सरासरी ± मानक विचलन दर्शवतात.
आमच्या मागील स्टॅटिक बायोमिमेटिक हार्ट स्लाइस कल्चर सिस्टम [20, 21] मध्ये, आम्ही विद्युत उत्तेजना लागू करून आणि माध्यम रचना ऑप्टिमाइझ करून हृदयाच्या स्लाइसची व्यवहार्यता, कार्य आणि संरचनात्मक अखंडता 6 दिवसांसाठी राखली. तथापि, 10 दिवसांनंतर, हे आकडे झपाट्याने कमी झाले. आम्ही आमच्या मागील स्टॅटिक बायोमिमेटिक कल्चर सिस्टम 20, 21 नियंत्रण परिस्थिती (Ctrl) मध्ये कल्चर केलेल्या विभागांचा संदर्भ घेऊ आणि आम्ही आमच्या पूर्वी ऑप्टिमाइझ केलेल्या माध्यमाचा वापर एकाच वेळी यांत्रिक आणि विद्युत उत्तेजना (CTCM) अंतर्गत MC परिस्थिती आणि संस्कृती म्हणून करू. म्हणतात. प्रथम, आम्ही निर्धारित केले की विद्युत उत्तेजनाशिवाय यांत्रिक उत्तेजना 6 दिवसांसाठी ऊतींची व्यवहार्यता राखण्यासाठी अपुरी होती (पूरक आकृती 3a,b). मनोरंजकपणे, STCM वापरून फिजिओ-मेकॅनिकल आणि विद्युत उत्तेजनाच्या परिचयासह, 12-दिवसांच्या हृदय विभागांची व्यवहार्यता MS परिस्थितीत ताज्या हृदय विभागांसारखीच राहिली, परंतु Ctrl परिस्थितीत नाही, जसे MTT विश्लेषणाने दर्शविले आहे (आकृती 1). 3a). यावरून असे सूचित होते की कार्डियाक सायकलचे यांत्रिक उत्तेजन आणि सिम्युलेशन आपल्या मागील स्टॅटिक कल्चर सिस्टममध्ये नोंदवलेल्यापेक्षा दुप्पट काळासाठी ऊती विभागांना व्यवहार्य ठेवू शकते. तथापि, कार्डियाक ट्रोपोनिन टी आणि कॉनेक्सिन ४३ च्या इम्युनोलेबलिंगद्वारे ऊती विभागांच्या संरचनात्मक अखंडतेचे मूल्यांकन केल्याने असे दिसून आले की त्याच दिवशी नियंत्रणांपेक्षा १२ व्या दिवशी एमसी ऊतींमध्ये कॉनेक्सिन ४३ अभिव्यक्ती लक्षणीयरीत्या जास्त होती. तथापि, एकसमान कॉनेक्सिन ४३ अभिव्यक्ती आणि झेड-डिस्क निर्मिती पूर्णपणे राखली गेली नाही (आकृती ३ब). आम्ही ऊती संरचनात्मक अखंडतेचे प्रमाण मोजण्यासाठी कृत्रिम बुद्धिमत्ता (एआय) फ्रेमवर्क वापरतो२६, ट्रोपोनिन-टी आणि कॉनेक्सिन स्टेनिंग४३ वर आधारित प्रतिमा-आधारित डीप लर्निंग पाइपलाइन स्थानिकीकरणाच्या ताकदीच्या बाबतीत हृदयाच्या तुकड्यांची स्ट्रक्चरल अखंडता आणि प्रतिदीप्तता स्वयंचलितपणे मोजण्यासाठी. संदर्भामध्ये वर्णन केल्याप्रमाणे, ही पद्धत स्वयंचलित आणि निष्पक्ष पद्धतीने कार्डियाक टिशूची स्ट्रक्चरल अखंडता विश्वसनीयरित्या मोजण्यासाठी कन्व्होल्यूशनल न्यूरल नेटवर्क (सीएनएन) आणि डीप लर्निंग फ्रेमवर्क वापरते. २६. एमसी टिशूने स्थिर नियंत्रण विभागांच्या तुलनेत दिवस ० शी सुधारित स्ट्रक्चरल समानता दर्शविली. याव्यतिरिक्त, मॅसनच्या ट्रायक्रोम स्टेनिंगने कल्चरच्या १२ व्या दिवशी नियंत्रण परिस्थितीच्या तुलनेत एमएस परिस्थितीत फायब्रोसिसचे प्रमाण लक्षणीयरीत्या कमी असल्याचे दिसून आले (आकृती ३ क). सीटीसीएमने १२ व्या दिवशी हृदयाच्या ऊतींच्या विभागांची व्यवहार्यता ताज्या हृदयाच्या ऊतींच्या पातळीइतकी वाढवली असली तरी, त्यामुळे हृदयाच्या विभागांची संरचनात्मक अखंडता लक्षणीयरीत्या सुधारली नाही.
बार ग्राफमध्ये १२ दिवसांसाठी ताज्या हृदयाच्या स्लाइस (D0) किंवा हृदयाच्या स्लाइस कल्चरच्या MTT व्यवहार्यतेचे प्रमाण दाखवले आहे, एकतर स्थिर कल्चरमध्ये (D12 Ctrl) किंवा CTCM (D12 MC) (n = १८ (D0), १५ (D12 Ctrl), १२ (D12 MC) वेगवेगळ्या डुकरांमधून काप/गटात, एकतर्फी ANOVA चाचणी केली जाते; ####p < 0.0001 च्या तुलनेत D0 आणि **p < 0.01 च्या तुलनेत D12 Ctrl). बार ग्राफमध्ये १२ दिवसांसाठी ताज्या हृदयाच्या स्लाइस (D0) किंवा हृदयाच्या स्लाइस कल्चरच्या MTT व्यवहार्यतेचे प्रमाण दाखवले जाते, एकतर स्थिर कल्चरमध्ये (D12 Ctrl) किंवा CTCM (D12 MC) (n = १८ (D0), १५ (D12 Ctrl), १२ (D12 MC) वेगवेगळ्या डुकरांमधून काप/गटात, एकतर्फी ANOVA चाचणी केली जाते; ####p < 0.0001 च्या तुलनेत D0 आणि **p < 0.01 च्या तुलनेत D12 Ctrl).हिस्टोग्राम वेगवेगळ्या डुकरांमधील स्थिर कल्चर (D12 नियंत्रण) किंवा CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 नियंत्रण)), 12 (D12 MC) विभाग/गटात 12 दिवसांसाठी MTT ताज्या हृदय विभाग (D0) किंवा हृदय विभागांच्या कल्चरच्या व्यवहार्यतेचे प्रमाण दर्शवितो, एकतर्फी ANOVA चाचणी केली जाते;####p < 0,0001 по сравнению с D0 и **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####d0 च्या तुलनेत p < 0.0001 आणि D12 च्या तुलनेत **p < 0.01 Ctrl). a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切)片हे相比，####p < 0.0001，与D12 Ctrl 相比，**p <0.01). a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切)片，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；与D0 相比，###p < 0.0001，CtrlD12，与p.वेगवेगळ्या डुकरांमधील ताज्या हृदय विभागांमध्ये (D0) किंवा स्थिर संस्कृती (D12 नियंत्रण) किंवा CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 नियंत्रण)) मध्ये 12 दिवसांसाठी कल्चर केलेल्या हृदय विभागांमध्ये MTT व्यवहार्यतेचे प्रमाण दर्शविणारा हिस्टोग्राम, एकतर्फी ANOVA चाचणी;####p < 0,0001 по сравнению с D0, **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p < ०.०००१ D० च्या तुलनेत, **p < ०.०१ D१२ च्या तुलनेत Ctrl).b ट्रोपोनिन-टी (हिरवा), कोनेक्सिन ४३ (लाल) आणि DAPI (निळा) ताज्या वेगळ्या हृदय विभागांमध्ये (D0) किंवा स्थिर परिस्थितीत (Ctrl) किंवा CTCM परिस्थितीत (MC) १२ दिवसांसाठी कल्चर केलेल्या हृदय विभागांमध्ये) प्रतिनिधी इम्युनोफ्लोरेसेन्स प्रतिमा (रिक्त स्केल = १०० µm). हृदयाच्या ऊतींच्या संरचनात्मक अखंडतेचे कृत्रिम बुद्धिमत्ता परिमाणीकरण (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) वेगवेगळ्या डुकरांमधून प्रत्येकी स्लाइस/गट, एकतर्फी ANOVA चाचणी केली जाते; ####p < 0.0001 च्या तुलनेत D0 आणि ****p < 0.0001 च्या तुलनेत D12 Ctrl). हृदयाच्या ऊतींच्या संरचनात्मक अखंडतेचे कृत्रिम बुद्धिमत्ता परिमाणीकरण (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) वेगवेगळ्या डुकरांमधून प्रत्येकी काप/गट, एकतर्फी ANOVA चाचणी केली जाते; ####p < 0.0001 च्या तुलनेत D0 आणि ****p < 0.0001 च्या तुलनेत D12 Ctrl). Количественная оценка структурной целостности селостности сердечной ткани искусственным интеллектом (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5/12/MC разных свиней, проводится однофакторный тест ANOVA; ####p < 0,0001 по сравнению с D0 и ****p < 0,0001 по сравнению). कृत्रिम बुद्धिमत्तेद्वारे हृदयाच्या ऊतींच्या संरचनात्मक अखंडतेचे परिमाण (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) वेगवेगळ्या डुकरांमधील विभाग/गट, एकतर्फी ANOVA चाचणी केली गेली; ####p < 0.0001 विरुद्ध D0 आणि ****p < 0.0001 च्या तुलनेत D12 Ctrl).人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) स्लाइस/गट प्रत्येक भिन्न डुक्कर, वन-वे ANOVA चाचणी. ###0p0;相比,****p < 0.0001 与D12 Ctrl 相比）.人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) स्लाइस/गट प्रत्येक वेगवेगळ्या डुकरांना, वन-वे ANOVA test.##0p.与D0相比，****p <0.0001 与D12 Ctrl 相比）. Искусственный интеллект для количественной оценки структурной целостности сердечной ткани (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl/D05), каждой из разных свиней, односторонний тест ANOVA; ####p <0,0001 वि. हृदयाच्या ऊतींच्या संरचनात्मक अखंडतेचे प्रमाण मोजण्यासाठी कृत्रिम बुद्धिमत्ता (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) वेगवेगळ्या डुकरांचे प्रत्येकी विभाग/गट, एकतर्फी ANOVA चाचणी; ####p<0.0001 विरुद्ध .D0 तुलनेसाठी ****p < 0.0001 D12 Ctrl च्या तुलनेत). c मॅसनच्या ट्रायक्रोम डागाने रंगलेल्या हृदयाच्या तुकड्यांसाठी प्रातिनिधिक प्रतिमा (डावीकडे) आणि परिमाणीकरण (उजवीकडे) (स्केल बेअर = 500 µm) (n = वेगवेगळ्या डुक्करातून प्रत्येकी 10 तुकडे/गट, एक-मार्गी ANOVA चाचणी केली जाते; ####p < 0.0001 च्या तुलनेत D0 आणि ***p < 0.001 च्या तुलनेत D12 Ctrl). c मॅसनच्या ट्रायक्रोम डागाने रंगलेल्या हृदयाच्या तुकड्यांसाठी प्रातिनिधिक प्रतिमा (डावीकडे) आणि परिमाण (उजवीकडे) (स्केल बेअर = 500 µm) (n = वेगवेगळ्या डुकरांमधून प्रत्येकी 10 तुकडे/गट, एक-मार्गी ANOVA चाचणी केली जाते; #### p < 0.0001 च्या तुलनेत D0 आणि ***p < 0.001 च्या तुलनेत D12 Ctrl). c Репрезентативные изображения (слева) и количественная оценка (справа) срезов сердца, окрашенных трихромным красибаслева покрытия = 500 мкм) (n = 10 срезов/группу от разных свиней, выполняется односторонний тест ANOVA; #### p < 0,0001 *** D < 0,0001 0,001 पो сравнению с D12 Ctrl). c मॅसनच्या ट्रायक्रोम डागाने रंगलेल्या हृदयाच्या भागांच्या प्रातिनिधिक प्रतिमा (डावीकडे) आणि परिमाण (उजवीकडे) (अनकोटेड स्केल = 500 µm) (n = वेगवेगळ्या डुकरांमधून 10 विभाग/गट, एकतर्फी ANOVA चाचणी केली गेली; #### p < 0 .0001 D0 च्या तुलनेत आणि ***p < 0.001 D12 च्या तुलनेत Ctrl). c 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像（左）和量化（右）（裸尺剓（0¼n0µm0µ=个切片/组，每组来自不同的猪，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0.0001 与D0 相比，*** 0.0001 पी <0.0.相比). सी 用 मासन 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 （左 左） 量化 （右） 裸尺度 度度尸度裸尺度 = 500 µm） （n = 10 个 切片 组 每 组 来自 不同 猪 ， 进行 单向 单勛 单向 <# 单勐 单向 单向 ## 0.0001 与D0 相比,***p <0.001 与D12 Ctrl 相比）. c Репрезентативные изображения (слева) и количественный анализ (справа) срезов сердца, окрашенных трихромным (слева) 500 мкм) (n = 10 срезов/группа, каждый от другой свиньи, протестировано с помощью однофакторного дисперсиов/группа; ##### 0,0001 पो сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c मॅसनच्या ट्रायक्रोम डागाने रंगलेल्या हृदयाच्या भागांच्या प्रातिनिधिक प्रतिमा (डावीकडे) आणि परिमाण (उजवीकडे) (रिक्त = 500 µm) (n = 10 विभाग/गट, प्रत्येक वेगळ्या डुक्करातून, भिन्नतेच्या एकतर्फी विश्लेषणाद्वारे चाचणी केलेले;### # p < 0.0001 च्या तुलनेत D0, ***p < 0.001 च्या तुलनेत D12 Ctrl).त्रुटी बार सरासरी ± मानक विचलन दर्शवतात.
आम्ही असा अंदाज लावला की कल्चर माध्यमात लहान रेणू जोडल्याने, कार्डिओमायोसाइट अखंडता सुधारली जाऊ शकते आणि CTCM कल्चर दरम्यान फायब्रोसिस विकास कमी केला जाऊ शकतो. म्हणून आम्ही आमच्या स्थिर नियंत्रण कल्चर वापरून लहान रेणूंसाठी तपासणी केली20,21 कारण कमी संख्येने गोंधळात टाकणारे घटक होते. या स्क्रीनसाठी डेक्सामेथासोन (डेक्स), ट्रायओडोथायरोनिन (T3) आणि SB431542 (SB) निवडले गेले. या लहान रेणूंचा वापर पूर्वी hiPSC-CM कल्चरमध्ये सारकोमेर लांबी, टी-ट्यूब्यूल्स आणि वहन वेग वाढवून कार्डिओमायोसाइट्सची परिपक्वता प्रेरित करण्यासाठी केला गेला आहे. याव्यतिरिक्त, डेक्स (एक ग्लुकोकोर्टिकॉइड) आणि SB दोन्ही जळजळ दाबण्यासाठी ओळखले जातात29,30. म्हणून, आम्ही चाचणी केली की या लहान रेणूंचा एक किंवा संयोजन समाविष्ट केल्याने हृदयाच्या विभागांची संरचनात्मक अखंडता सुधारेल का. सुरुवातीच्या तपासणीसाठी, प्रत्येक कंपाऊंडचा डोस सेल कल्चर मॉडेल्समध्ये सामान्यतः वापरल्या जाणाऱ्या सांद्रतेवर आधारित निवडला गेला (1 μM Dex27, 100 nM T327, आणि 2.5 μM SB31). १२ दिवसांच्या कल्चरनंतर, T3 आणि Dex च्या संयोजनामुळे इष्टतम कार्डिओमायोसाइट स्ट्रक्चरल अखंडता आणि किमान तंतुमय पुनर्बांधणी झाली (पूरक आकृती 4 आणि 5). याव्यतिरिक्त, T3 आणि Dex च्या या सांद्रतेच्या दुप्पट किंवा दुप्पट वापरामुळे सामान्य सांद्रतेच्या तुलनेत हानिकारक परिणाम निर्माण झाले (पूरक आकृती 6a,b).
सुरुवातीच्या तपासणीनंतर, आम्ही ४ कल्चर परिस्थितींची प्रत्यक्ष तुलना केली (आकृती ४अ): Ctrl: आमच्या ऑप्टिमाइज्ड माध्यमाचा वापर करून पूर्वी वर्णन केलेल्या स्थिर संस्कृतीमध्ये हृदयाचे विभाग कल्चर केले; २०.२१ TD: T3 आणि Ctrl बुधवारी Dex जोडले; MC: आमच्या पूर्वी ऑप्टिमाइज्ड माध्यमाचा वापर करून CTCM मध्ये हृदयाचे विभाग कल्चर केले; आणि MT: T3 आणि Dex सह CTCM माध्यमात जोडले. १२ दिवसांच्या लागवडीनंतर, MS आणि MT ऊतींची व्यवहार्यता MTT परख (आकृती ४ब) द्वारे मूल्यांकन केलेल्या ताज्या ऊतींप्रमाणेच राहिली. मनोरंजक गोष्ट म्हणजे, ट्रान्सवेल कल्चर (TD) मध्ये T3 आणि Dex जोडल्याने Ctrl परिस्थितीच्या तुलनेत व्यवहार्यतेमध्ये लक्षणीय सुधारणा झाली नाही, जी हृदयाच्या विभागांची व्यवहार्यता राखण्यात यांत्रिक उत्तेजनाची महत्त्वाची भूमिका दर्शवते.
१२ दिवसांसाठी माध्यमावर यांत्रिक उत्तेजना आणि T3/Dex पूरकतेचे परिणाम मूल्यांकन करण्यासाठी वापरल्या जाणाऱ्या चार कल्चर परिस्थितींचे चित्रण करणारा एक प्रायोगिक डिझाइन आकृती. b बार आलेख सर्व ४ कल्चर परिस्थितीत (Ctrl, TD, MC, आणि MT) १२ दिवसांच्या व्यवहार्यतेचे प्रमाण दर्शवितो, ताज्या हृदयाच्या तुकड्यांच्या (D0) (n = १८ (D0), १५ (D12 Ctrl, D12 TD आणि D12 MT), १२ (D12 MC) वेगवेगळ्या डुकरांच्या तुकड्या/गटाच्या तुलनेत, एकतर्फी ANOVA चाचणी केली जाते; ####p < 0.0001, ###p < 0.001 D0 च्या तुलनेत आणि **p < 0.01 D12 Ctrl च्या तुलनेत). b बार आलेख सर्व ४ कल्चर परिस्थितीत (Ctrl, TD, MC, आणि MT) १२ दिवसांच्या व्यवहार्यतेचे प्रमाण दर्शवितो, ताज्या हृदयाच्या तुकड्यांच्या (D0) (n = १८ (D0), १५ (D12 Ctrl, D12 TD आणि D12 MT), १२ (D12 MC) वेगवेगळ्या डुकरांच्या तुकड्या/गटाच्या तुलनेत, एकतर्फी ANOVA चाचणी केली जाते; ####p < 0.0001, ###p < 0.001 D0 च्या तुलनेत आणि **p < 0.01 D12 ctrl च्या तुलनेत). b Гистограмма показывает количественную оценку жизнеспособности через 12 дней после культивирования во всех 4 усеховирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD आणि D12 MT), 12 (12) разных свиней, проводится односторонний тест ANOVA; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 по сравнению с D0 и **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). b बार ग्राफमध्ये सर्व ४ कल्चर परिस्थितीत (नियंत्रण, TD, MC, आणि MT) १२ दिवसांनी कल्चरनंतर व्यवहार्यतेचे प्रमाण दर्शविले आहे, जे वेगवेगळ्या डुकरांमधील ताज्या हृदय विभाग (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD, आणि D12 MT), 12 (D12 MC) विभाग/गटाच्या तुलनेत, एकतर्फी ANOVA चाचणी; ####p < 0.0001, ###p < 0.001 विरुद्ध D0 आणि **p < 0.01 D12 Ctrl च्या तुलनेत). b 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片、D0) (n = 18 (D1r1D0) (D0) TD 和D12 MT)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；####p < 0.0001，###p <0p <0.0** ०.०१ 与D12控制).बी ४ १२ (डी१२ एमसी) b Гистограмма, показывающая все 4 условия культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами (серзами) (серзами =10Dn) 15 (D12 Ctrl, D12 TD आणि D12 MT), от разных свиней 12 (D12 MC) срезы/группа, односторонний тест ANOVA; ####p <0,0001,0001, D0, **p <0,01 по сравнению (कंट्रोलेम D12 सह). b वेगवेगळ्या डुकरांच्या १२ (D12 MC) विभाग/गटातील ताज्या हृदय विभागांच्या (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD आणि D12 MT) तुलनेत सर्व ४ कल्चर स्थिती (नियंत्रण, TD, MC आणि MT) दर्शविणारा हिस्टोग्राम, एकतर्फी ANOVA चाचणी; ####p<0.0001, ###p<0.001 विरुद्ध D0, **p<0.01 विरुद्ध नियंत्रण D12). c बार आलेख सर्व ४ कल्चर परिस्थितीत (Ctrl, TD, MC, आणि MT) १२ दिवसांनी कल्चरनंतर ग्लुकोज फ्लक्सचे प्रमाण ताज्या हृदयाच्या तुकड्यांच्या (D0) तुलनेत दर्शवितो (n = वेगवेगळ्या डुकरांमधील ६ काप/गट, एकतर्फी ANOVA चाचणी केली जाते; ###p < 0.001, D0 च्या तुलनेत आणि ***p < 0.001 D12 च्या तुलनेत Ctrl). c बार आलेख सर्व ४ कल्चर परिस्थितीत (Ctrl, TD, MC, आणि MT) १२ दिवसांनी कल्चरनंतर ग्लुकोज फ्लक्सचे प्रमाण ताज्या हृदयाच्या तुकड्यांच्या (D0) तुलनेत दर्शवितो (n = वेगवेगळ्या डुकरांमधील ६ काप/गट, एकतर्फी ANOVA चाचणी केली जाते; ###p < 0.001, D0 च्या तुलनेत आणि ***p < 0.001 D12 च्या तुलनेत Ctrl). c Гистограмма показывает количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после культивирования во всех 4 усех усех 4 усенку (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 6 срезов/группу от Вот разных свиней, одноялный свиней, одноястов/группу) ANOVA; ###p < 0,001 по сравнению с D0 आणि ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c हिस्टोग्राममध्ये सर्व ४ कल्चर परिस्थितीत (नियंत्रण, TD, MC आणि MT) १२ दिवसांनी ग्लुकोज फ्लक्सचे प्रमाण ताज्या हृदय विभागांच्या (D0) तुलनेत दाखवले जाते (n = वेगवेगळ्या डुकरांमधील ६ विभाग/गट, एकतर्फी ANOVA चाचणी केली गेली; ###p < 0.001 च्या तुलनेत D0 आणि ***p < 0.001 च्या तुलनेत D12 Ctrl). c 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) 相比养切片(D0)天的葡萄糖通量定量（n = 6 片/组，来自不同猪，单向执行ANOVA 测试；###p <0.001，.0p <0.*0p <0.与D12 Ctrl 相比）. C 条形图 显示 所有 4 种 条件 （（ctrl 、 td 、 mc 和 mt） 新鲜 心脏 切片 切片戇片培养 后 12 天 的 通量 定量 （n = 6 片/组 ， 来自 猪 ， ， ， ， ， ， A NO VA 猪单吡测试；###p < ०.००१，与D0 相比,***p <0.001 与D12 Ctrl 相比）. c Гистограмма, показывающая количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после культивирования для всеховирования для всех 4 (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 6 срезов/группа, от разных свиней, одроных свиней, одновежими сердца) тесты ANOVA; ###p < 0,001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению с D12 (контроль). c हिस्टोग्राम, जो सर्व ४ कल्चर परिस्थितींसाठी (नियंत्रण, टीडी, एमसी आणि एमटी) १२ दिवसांच्या पोस्ट-कल्चरवर ग्लुकोज फ्लक्सचे प्रमाण दर्शवितो, ताज्या हृदय विभागांच्या (डी०) तुलनेत (एन = ६ विभाग/गट, वेगवेगळ्या डुकरांमधून, एकतर्फी ANOVA चाचण्या केल्या गेल्या, ###p < ०.००१ च्या तुलनेत D०, ***p < ०.००१ च्या तुलनेत D१२ (नियंत्रण).d दहा प्रादेशिक ऊती विभाग बिंदूंवर ताज्या (निळ्या), दिवसाच्या १२ MC (हिरव्या) आणि दिवसाच्या १२ MT (लाल) ऊतींचे स्ट्रेन विश्लेषण प्लॉट (n = ४ स्लाइस/गट, एकतर्फी ANOVA चाचणी; गटांमध्ये कोणताही महत्त्वपूर्ण फरक नव्हता). e ज्वालामुखी प्लॉट १०-१२ दिवसांसाठी स्थिर परिस्थितीत (Ctrl) किंवा MT परिस्थितीत (MT) कल्चर केलेल्या हृदय विभागांच्या तुलनेत ताज्या हृदय विभागांमध्ये (D0) भिन्नपणे व्यक्त केलेले जीन्स दर्शवित आहे. f प्रत्येक कल्चर परिस्थितीत (Ctrl) कल्चर केलेल्या हृदय विभागांसाठी सारकोमेर जीन्सचा हीटमॅप. एरर बार सरासरी ± मानक विचलन दर्शवतात.
फॅटी अ‍ॅसिड ऑक्सिडेशनपासून ग्लायकोलिसिसकडे स्विच करण्यावर मेटाबॉलिक अवलंबित्व हे कार्डिओमायोसाइट डिडिफरेंशिएशनचे एक वैशिष्ट्य आहे. अपरिपक्व कार्डिओमायोसाइट्स प्रामुख्याने एटीपी उत्पादनासाठी ग्लुकोज वापरतात आणि त्यांच्यात हायपोप्लास्टिक मायटोकॉन्ड्रिया असते ज्यामध्ये काही क्रिस्टी असतात5,32. ग्लुकोज वापर विश्लेषणातून असे दिसून आले की एमसी आणि एमटी परिस्थितीत, ग्लुकोज वापर दिवस 0 ऊतींप्रमाणेच होता (आकृती 4c). तथापि, Ctrl नमुन्यांमध्ये ताज्या ऊतींच्या तुलनेत ग्लुकोज वापरात लक्षणीय वाढ दिसून आली. हे सूचित करते की CTCM आणि T3/Dex चे संयोजन ऊतींची व्यवहार्यता वाढवते आणि 12-दिवसांच्या संवर्धित हृदय विभागांचे चयापचय फेनोटाइप जतन करते. याव्यतिरिक्त, स्ट्रेन विश्लेषणातून असे दिसून आले की एमटी आणि एमएस परिस्थितीत 12 दिवसांसाठी स्ट्रेन पातळी ताज्या हृदयाच्या ऊतींप्रमाणेच राहिली (आकृती 4d).
कार्डियाक स्लाईस टिश्यूच्या जागतिक ट्रान्सक्रिप्शनल लँडस्केपवर CTCM आणि T3/Dex च्या एकूण प्रभावाचे विश्लेषण करण्यासाठी, आम्ही चारही वेगवेगळ्या कल्चर स्थितींमधील कार्डियाक स्लाईसवर RNAseq केले (पूरक डेटा 1). मनोरंजकपणे, MT विभागांनी ताज्या हृदयाच्या ऊतींशी उच्च ट्रान्सक्रिप्शनल समानता दर्शविली, 13,642 जनुकांपैकी फक्त 16 जनुकांमध्ये भिन्नता व्यक्त केली गेली. तथापि, आम्ही आधी दाखवल्याप्रमाणे, Ctrl स्लाईसने 10-12 दिवसांच्या कल्चरनंतर 1229 भिन्नता व्यक्त जीन्स प्रदर्शित केले (आकृती 4e). हृदय आणि फायब्रोब्लास्ट जनुकांच्या qRT-PCR द्वारे या डेटाची पुष्टी केली गेली (पूरक आकृती 7a-c). मनोरंजकपणे, Ctrl विभागांनी कार्डियाक आणि सेल सायकल जनुकांचे डाउनरेग्युलेशन आणि दाहक जनुक कार्यक्रमांचे सक्रियकरण दर्शविले. हे डेटा सूचित करतात की दीर्घकालीन कल्चरिंगनंतर होणारे डिडिफरेंशिएशन, MT परिस्थितीत पूर्णपणे कमी होते (पूरक आकृती 8a,b). सारकोमेरे जनुकांच्या काळजीपूर्वक अभ्यासातून असे दिसून आले की केवळ MT परिस्थितीत सारकोमेरे (आकृती 4f) आणि आयन चॅनेल (पूरक आकृती 9) एन्कोड करणारे जीन्स जतन केले जातात, ज्यामुळे त्यांना Ctrl, TD आणि MC परिस्थितीत दडपशाहीपासून संरक्षण मिळते. हे डेटा दर्शविते की यांत्रिक आणि ह्युमरल उत्तेजना (T3/Dex) च्या संयोजनासह, हृदयाचे स्लाइस ट्रान्सक्रिप्टोम 12 दिवसांच्या संस्कृतीत राहिल्यानंतर ताज्या हृदयाच्या स्लाइससारखेच राहू शकते.
हे ट्रान्सक्रिप्शनल निष्कर्ष या वस्तुस्थितीद्वारे समर्थित आहेत की हृदयाच्या विभागांमध्ये कार्डिओमायोसाइट्सची संरचनात्मक अखंडता MT परिस्थितीत 12 दिवसांसाठी सर्वोत्तम प्रकारे जतन केली जाते, जसे की अखंड आणि स्थानिकीकृत connexin 43 (आकृती 5a) द्वारे दर्शविले गेले आहे. याव्यतिरिक्त, MT परिस्थितीत हृदयाच्या विभागांमध्ये फायब्रोसिस Ctrl च्या तुलनेत लक्षणीयरीत्या कमी झाला आणि ताज्या हृदयाच्या विभागांसारखाच होता (आकृती 5b). हे डेटा दर्शविते की यांत्रिक उत्तेजना आणि T3/Dex उपचारांचे संयोजन कल्चरमध्ये हृदयाच्या विभागांमध्ये हृदयाची रचना प्रभावीपणे जतन करते.
a ट्रोपोनिन-टी (हिरवा), कोनेक्सिन ४३ (लाल) आणि डीएपीआय (निळा) च्या प्रतिनिधी इम्युनोफ्लोरेसेन्स प्रतिमा ताज्या वेगळ्या हृदय विभागांमध्ये (डी०) किंवा चारही हृदय विभाग कल्चर परिस्थितीत १२ दिवसांसाठी कल्चर केलेल्या (स्केल बार = १०० µm). हृदयाच्या ऊतींच्या संरचनात्मक अखंडतेचे कृत्रिम बुद्धिमत्ता प्रमाणीकरण (n = 7 (D0 आणि D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC आणि D12 MT) वेगवेगळ्या डुकरांमधून काप/गट, एकतर्फी ANOVA चाचणी केली जाते; ####p < 0.0001 च्या तुलनेत D0 आणि *p < 0.05, किंवा ****p < 0.0001 च्या तुलनेत D12 Ctrl). हृदयाच्या ऊतींच्या संरचनात्मक अखंडतेचे कृत्रिम बुद्धिमत्ता प्रमाणीकरण (n = 7 (D0 आणि D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC आणि D12 MT) वेगवेगळ्या डुकरांमधून काप/गट, एकतर्फी ANOVA चाचणी केली जाते; #### p < 0.0001 च्या तुलनेत D0 आणि *p < 0.05, किंवा ****p < 0.0001 च्या तुलनेत D12 Ctrl). Количественная оценка структурной целостности ткани сердца с помощью искусственного интеллекта (n = 7 (D0 आणि D12 Ctrl12), DMCTD12, DMCTD12 म сравнению с D12 Ctrl). वेगवेगळ्या डुकरांमधील कृत्रिम बुद्धिमत्ता (n = 7 (D0 आणि D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC आणि D12 MT) विभाग/गट वापरून हृदयाच्या ऊतींच्या संरचनात्मक अखंडतेचे परिमाण, एकतर्फी ANOVA चाचणी केली गेली; #### p < 0.0001 D0 च्या तुलनेत आणि *p < 0.05 किंवा ****p < 0.0001 D12 Ctrl च्या तुलनेत).对不同猪的心脏组织结构完整性（n = 7（D0 和D12 Ctrl）、5（D12 TD、D12 MC 和D12 MT）切片/组）进行人工智能量化，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0.0001 与D0 和*p <0.0001 0.0001 与D12 Ctrl 相比）.对 不同 猪 的 心脏 结构 完整性 （n = 7 （d0 和 d12 ctrl） （5 （d12 td 、 d12 mc人工 智能量 化 进行 单向 单向 单向 测试 ； ######### p < 0.0001 与D0 和*p < 0.0001 与D0 和*p <0.05 0.0001 与D12 Ctrl 相比）.एकतर्फी ANOVA चाचणीसह वेगवेगळ्या डुकरांमध्ये (n = 7 (D0 आणि D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC आणि D12 MT) विभाग/गट) कृत्रिम बुद्धिमत्ता वापरून हृदयाच्या ऊतींच्या संरचनात्मक अखंडतेचे प्रमाणीकरण;#### p < 0,0001 по сравнению с D0 и *p < 0,05 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). #### D0 च्या तुलनेत p < 0.0001 आणि D12 च्या तुलनेत *p < 0.05 किंवा ****p < 0.0001 Ctrl). b मॅसनच्या ट्रायक्रोम डागाने रंगलेल्या हृदयाच्या तुकड्यांसाठी प्रातिनिधिक प्रतिमा आणि परिमाणीकरण (स्केल बार = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD, आणि D12 MC), वेगवेगळ्या डुकरांमधून 9 (D12 MT) काप/गट, एकतर्फी ANOVA चाचणी केली जाते; ####p < 0.0001 च्या तुलनेत D0 आणि ***p < 0.001, किंवा ****p < 0.0001 च्या तुलनेत D12 Ctrl). b मॅसनच्या ट्रायक्रोम डागाने रंगलेल्या हृदयाच्या तुकड्यांसाठी प्रातिनिधिक प्रतिमा आणि परिमाणीकरण (स्केल बार = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD, आणि D12 MC), वेगवेगळ्या डुकरांमधून 9 (D12 MT) काप/गट, एकतर्फी ANOVA चाचणी केली जाते; ####p < 0.0001 च्या तुलनेत D0 आणि ***p < 0.001, किंवा ****p < 0.0001 च्या तुलनेत D12 Ctrl). b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромным красителем Массона (= мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD и D12 MC), 9 (D12 MT) срезов/группу от разных свиней, выполняется односторон, выполняется односторон; по сравнению с D0 आणि ***p < 0,001 किंवा ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). b मॅसनच्या ट्रायक्रोम डागाने रंगलेल्या हृदयाच्या भागांचे प्रातिनिधिक प्रतिमा आणि परिमाण (स्केल बार = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD आणि D12 MC), वेगवेगळ्या डुकरांमधून 9 (D12 MT) विभाग/गट, एकतर्फी ANOVA केले; ####p < 0.0001 विरुद्ध D0 आणि ***p < 0.001 किंवा ****p < 0.0001 विरुद्ध D12 Ctrl). b 用मेसन 三色染料染色的心脏切片的代表性图像和量化（比例尺= 500 µm）（n = 10D Ctrl、D12 TD 和D12 MC），来自不同猪的9 个（D12 MT）切片/组，进行单因素方差分曠素方差分曠00##D0p0##）相比，***p < ०.००१，或****p < 0.0001 与D12 Ctrl 相比）. b 用 मासन 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 和 量化 （比例 尺 尺 尺 = 500 µm） = 0 d0m） d12 ctrl 、 d12 td 和 d12 mc） 来自 不同 的 9 个 d12 mt 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片/组，进行单因素方差分析；####p < 0.0001D* 0.001，或****p < 0.0001 与D12 Ctrl 相比）. b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромом Массона (масштабная =0макенка =50менка) (D0, D12 Ctrl, D12 TD и D12 MC), 9 (D12 MT) срезов от разных свиней / группы, один- способ ANOVA ####p < 0,0001 , 0,0001 0,001 किंवा ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). b मॅसनच्या ट्रायक्रोमने रंगवलेल्या हृदयाच्या भागांचे प्रातिनिधिक प्रतिमा आणि परिमाण (स्केल बार = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD आणि D12 MC), वेगवेगळ्या डुकरांच्या/गटातील 9 (D12 MT) विभाग, एक ANOVA पद्धत; ####p < 0.0001 च्या तुलनेत D0, ***p < 0.001 किंवा ****p < 0.0001 च्या तुलनेत D12 Ctrl).त्रुटी बार सरासरी ± मानक विचलन दर्शवतात.
शेवटी, कार्डियाक टिश्यू स्ट्रेच वाढवून कार्डियाक हायपरट्रॉफीची नक्कल करण्याची CTCM ची क्षमता मूल्यांकन करण्यात आली. CTCM मध्ये, पीक एअर चेंबर प्रेशर 80 mmHg वरून 80 mmHg पर्यंत वाढला. आर्. (सामान्य स्ट्रेच) 140 mmHg पर्यंत आर्. (आकृती 6a). हे स्ट्रेचमध्ये 32% वाढ (आकृती 6b) शी संबंधित आहे, जे पूर्वी हायपरट्रॉफीमध्ये दिसणाऱ्या सारकोमेर लांबी प्राप्त करण्यासाठी हृदयाच्या विभागांना आवश्यक असलेल्या संबंधित टक्केवारी स्ट्रेच म्हणून दर्शविले गेले होते. सहा दिवसांच्या कल्चरमध्ये (आकृती 6c) आकुंचन आणि विश्रांती दरम्यान कार्डियाक टिशूचा स्ट्रेच आणि वेग स्थिर राहिला. MT स्थितीतून कार्डियाक टिशू सहा दिवसांसाठी सामान्य स्ट्रेच (MT (सामान्य)) किंवा ओव्हरस्ट्रेच स्थिती (MT (OS)) च्या अधीन होते. आधीच चार दिवसांच्या कल्चरनंतर, हायपरट्रॉफिक बायोमार्कर NT-ProBNP MT (सामान्य) परिस्थिती (आकृती 7a) च्या तुलनेत MT (OS) परिस्थितीत माध्यमात लक्षणीयरीत्या वाढला होता. याव्यतिरिक्त, सहा दिवसांच्या कल्चरिंगनंतर, MT (OS) (आकृती 7b) मधील पेशींचा आकार MT हृदयाच्या (सामान्य) विभागांच्या तुलनेत लक्षणीयरीत्या वाढला. याव्यतिरिक्त, जास्त ताणलेल्या ऊतींमध्ये NFATC4 न्यूक्लियर ट्रान्सलोकेशन लक्षणीयरीत्या वाढले (आकृती 7c). हे निकाल हायपरडिस्टेन्शन नंतर पॅथॉलॉजिकल रीमॉडेलिंगचा प्रगतीशील विकास दर्शवितात आणि स्ट्रेच-प्रेरित कार्डियाक हायपरट्रॉफी सिग्नलिंगचा अभ्यास करण्यासाठी CTCM डिव्हाइसचा वापर एक व्यासपीठ म्हणून केला जाऊ शकतो या संकल्पनेला समर्थन देतात.
हवेच्या चेंबर प्रेशरचे प्रतिनिधी ट्रेस, फ्लुइड चेंबर प्रेशर आणि टिशू हालचाल मोजमाप पुष्टी करतात की चेंबर प्रेशर फ्लुइड चेंबर प्रेशरमध्ये बदल करते, ज्यामुळे टिशू स्लाइसची संबंधित हालचाल होते. b सामान्यतः ताणलेल्या (नारिंगी) आणि जास्त ताणलेल्या (निळ्या) टिशू सेक्शनसाठी प्रतिनिधी स्ट्रेच टक्केवारी आणि स्ट्रेच रेट वक्र. c बार ग्राफ सायकल वेळ दर्शवितो (n = वेगवेगळ्या डुकरांमधून प्रति गट 19 स्लाइस), आकुंचन वेळ (n = वेगवेगळ्या डुकरांमधून प्रति गट 18-19 स्लाइस), विश्रांती वेळ (n = वेगवेगळ्या डुकरांमधून प्रति गट 19 स्लाइस), ऊतींच्या हालचालीचे मोठेपणा (n = वेगवेगळ्या डुकरांमधून 14 स्लाइस/गट), पीक सिस्टोलिक वेग (n = वेगवेगळ्या डुकरांमधून 14 स्लाइस/गट) आणि पीक रिलॅक्सेशन रेट (n = 14 (D0), 15 (D6) ) वेगवेगळ्या डुकरांमधून विभाग/गट), दोन-पुच्छ असलेल्या विद्यार्थ्यांच्या टी-टेस्टने कोणत्याही पॅरामीटरमध्ये कोणताही महत्त्वपूर्ण फरक दर्शविला नाही, हे दर्शविते की ओव्हरव्होल्टेजसह कल्चरच्या 6 दिवसांमध्ये हे पॅरामीटर्स स्थिर राहिले. एरर बार सरासरी ± मानक विचलन दर्शवितात.
वेगवेगळ्या डुकरांमधून MT सामान्य स्ट्रेच (नॉर्म) किंवा ओव्हरस्ट्रेचिंग (OS) परिस्थितीत (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, आणि D4 MTOS) स्लाइस/ग्रुपमधून कल्चर मीडियामध्ये NT-ProBNP एकाग्रतेचे बार ग्राफ परिमाणीकरण, टू-वे ANOVA केले जाते; **p < सामान्य स्ट्रेचच्या तुलनेत 0.01). वेगवेगळ्या डुकरांमधून MT सामान्य स्ट्रेच (नॉर्म) किंवा ओव्हरस्ट्रेचिंग (OS) परिस्थितीत (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, आणि D4 MTOS) स्लाइस/ग्रुपमधून कल्चर मीडियामध्ये NT-ProBNP एकाग्रतेचे बार ग्राफ परिमाणीकरण, टू-वे ANOVA केले जाते; **p < सामान्य स्ट्रेचच्या तुलनेत 0.01).सामान्य MT स्ट्रेच (नॉर्म) किंवा ओव्हरस्ट्रेच (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, आणि D4).MTOS) वेगवेगळ्या डुकरांमधून कापलेल्या हृदयाच्या तुकड्या/गटातून कल्चर माध्यमात NT-ProBNP एकाग्रतेचा परिमाणात्मक हिस्टोग्राम, भिन्नतेचे द्वि-घटक विश्लेषण केले जाते;**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **सामान्य स्ट्रेचच्या तुलनेत p < ०.०१). a 在MT 正常拉伸(नॉर्म) 或过度拉伸(OS) 条件下培养的心脏切片培养基中NT-ProBNP 浓度離坡庢4 (D2 MTNorm) 、3（D2 MTOS、D4 MTNorm 和D4 MTOS）来自不同猪的切片/组，进行双向方差分析；**与正常拉伸相比, p < ०.०१). एमटी नॉर्मल स्ट्रेच (नॉर्म) किंवा ओव्हरस्ट्रेच (ओएस) परिस्थितीत (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm猪的切片/组，可以双向方方发发动; **सामान्य स्ट्रेचिंगच्या तुलनेत, p <0.01).वेगवेगळ्या डुकरांमधून सामान्य MT स्ट्रेच (नॉर्म) किंवा ओव्हरस्ट्रेच (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm) आणि D4 MTOS) स्लाइस/ग्रुपच्या परिस्थितीत कल्चर केलेल्या हृदयाच्या स्लाइसमध्ये NT-ProBNP सांद्रतेचे परिमाण, भिन्नतेचे द्वि-मार्गी विश्लेषण;**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **सामान्य स्ट्रेचच्या तुलनेत p < ०.०१). b ट्रोपोनिन-टी आणि WGA (डावीकडे) ने रंगवलेल्या हृदयाच्या तुकड्यांच्या आणि पेशी आकाराचे प्रमाण (उजवीकडे) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) वेगवेगळ्या डुकरांच्या 10 वेगवेगळ्या तुकड्यांमधून पेशी/समूहासाठी प्रातिनिधिक प्रतिमा, दोन-पुच्छ विद्यार्थी टी-चाचणी केली जाते; ****p < सामान्य ताणाच्या तुलनेत 0.0001). b ट्रोपोनिन-टी आणि WGA (डावीकडे) ने रंगवलेल्या हृदयाच्या तुकड्यांच्या आणि पेशी आकाराचे प्रमाण (उजवीकडे) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) वेगवेगळ्या डुकरांच्या 10 वेगवेगळ्या तुकड्यांमधून पेशी/गटाच्या प्रातिनिधिक प्रतिमा, दोन-पुच्छ विद्यार्थी टी-चाचणी केली जाते; ****p < सामान्य ताणाच्या तुलनेत 0.0001). b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слева) и количественного определения (разовенного определения) 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) клеток/группу из 10 разных срезов от разных свиней, два- проводится хвостовой;***Свостовой t- 0,0001 по сравнению с нормальным растяжением). b ट्रोपोनिन-टी आणि एझेडपी (डावीकडे) आणि पेशी आकार परिमाण (उजवीकडे) ने रंगवलेल्या हृदयाच्या विभागांच्या प्रातिनिधिक प्रतिमा (n = 330 (D6 MTOS), वेगवेगळ्या डुकरांच्या 10 वेगवेगळ्या विभागांमधून 369 (D6 MTNorm) पेशी/समूह, दोन-पुच्छ असलेल्या विद्यार्थ्यांची टी-चाचणी करण्यात आली; सामान्य स्ट्रेनच्या तुलनेत ****p < 0.0001). b 用肌钙蛋白-T 和WGA（左）和细胞大小量化（右）染色的心脏切片的心脏切片的代表性图n3） MTOS），来自不同猪的10 个不同切片的369（D6 MTNorm）细胞/组，两进行有尾学生t检验；与正常拉伸相比,****p <0.0001）. b कॅल्केरिन-टी आणि डब्ल्यूजीए (डावीकडे) आणि पेशी आकार (उजवीकडे) ने रंगवलेल्या हृदयाच्या तुकड्यांच्या प्रातिनिधिक प्रतिमा (n = 330 (D6 MTOS), 10 वेगवेगळ्या कापांमधून 369 (D6 MTNorm)) पेशी/विशिष्टता, सामान्य स्ट्रेचिंगच्या तुलनेत, ****p < 0.0001). b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слева) и количественная оценка размева (36) MTOS), 369 (D6 MTNorm) из 10 различных срезов от разных свиней Клетки/группа, двусторонние критерий Стьюдента, ***0p0*p01; нормальным (रास्तीकरण). b ट्रोपोनिन-टी आणि एझेडपी (डावीकडे) ने रंगवलेल्या हृदयाच्या विभागांच्या प्रातिनिधिक प्रतिमा आणि पेशींच्या आकाराचे प्रमाण (उजवीकडे) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) वेगवेगळ्या डुकरांच्या 10 वेगवेगळ्या विभागांमधून) पेशी/गट, दोन-पुच्छ निकष विद्यार्थ्यांचा t; ****p < सामान्य स्ट्रेनच्या तुलनेत 0.0001). c दिवस ० आणि दिवस ६ च्या MTOS हृदयाच्या तुकड्यांच्या प्रातिनिधिक प्रतिमा, ज्या ट्रोपोनिन-टी आणि NFATC4 साठी इम्युनोलेबल केलेल्या आहेत आणि वेगवेगळ्या डुकरांमधून CMs (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) काप/गटाच्या केंद्रकात NFATC4 च्या स्थानांतरणाचे प्रमाणीकरण, दोन-पुच्छ विद्यार्थी टी-चाचणी केली जाते; *p < 0.05). c दिवस ० आणि दिवस ६ च्या MTOS हृदयाच्या तुकड्यांच्या प्रातिनिधिक प्रतिमा, ज्या ट्रोपोनिन-टी आणि NFATC4 साठी इम्युनोलेबल केलेल्या आहेत आणि वेगवेगळ्या डुकरांमधून CMs च्या केंद्रकात NFATC4 च्या स्थानांतरणाचे प्रमाणीकरण (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) काप/गट, दोन-पुच्छ विद्यार्थी टी-चाचणी केली जाते; *p < 0.05). c Репрезентативные изображения для срезов сердца 0 и 6 дней MTOS, иммуномеченых для тропонина-Т и NFATC4, инкоянкастена транслокации NFATC4 в ядра кавернозных клеток (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срезов/груптпу от разных свиней , выполняветрийское свиней Стьюдента; *p < ०,०५). c ० आणि ६ दिवसांच्या MTOS वर हृदयाच्या विभागांसाठी प्रातिनिधिक प्रतिमा, ट्रोपोनिन-टी आणि NFATC4 साठी इम्युनोलेबल केलेले, आणि कॅव्हर्नस पेशींच्या केंद्रकात NFATC4 स्थानांतरणाचे प्रमाणीकरण (n = ४ (D०), वेगवेगळ्या डुकरांमधून ३ (D६ MTOS) काप/गट) दोन-पुच्छ असलेल्या विद्यार्थ्यांची टी-चाचणी केली; *p < ०.०५). c 用于肌钙蛋白-T 和NFATC4 免疫标记的第0 天和第6 天MTOS心脏切片的代表性图像，以及来自不同猪的NFATC4 易位至CM 细胞核的量化（n = 4 (D0) , 3 (D0)进行双尾学生t 检验；*p <0.05). c calcanin-T आणि NFATC4 इम्युनोलाबेलिंग 第0天和第6天MTOS हृदयाचे तुकडे, आणि वेगवेगळ्या NFATC4 मधून NFATC4 易位至CM सेल न्यूक्लियस 的 प्रमाण 化 (n = 4 (D0) 化 (n = 4 (D0) 化 化 (n = 4 (D0) 廤 / 燤 3 ) च्या प्रतिनिधी प्रतिमा时间双尾学生et 电影；*p < ०.०५). c Репрезентативные изображения срезов сердца MTOS на 0 и 6 तारखेपर्यंत транслокации NFATC4 в ядра CM от разных свиней (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срез/группа, два- хвостатый t-критерий Сть;0pюдей. c वेगवेगळ्या डुकरांमधून CM च्या केंद्रकात ट्रोपोनिन-T आणि NFATC4 इम्युनोलेबलिंग आणि NFATC4 ट्रान्सलोकेशनचे प्रमाणीकरण करण्यासाठी 0 आणि 6 व्या दिवशी MTOS हृदयाच्या तुकड्यांच्या प्रातिनिधिक प्रतिमा (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) काप/गट, दोन-पुच्छ t-निकष विद्यार्थ्यांचे; *p < 0.05).त्रुटी बार सरासरी ± मानक विचलन दर्शवतात.
ट्रान्सलेशनल कार्डिओव्हस्कुलर रिसर्चसाठी अशा सेल्युलर मॉडेल्सची आवश्यकता असते जे हृदयाच्या वातावरणाचे अचूक पुनरुत्पादन करतात. या अभ्यासात, एक CTCM डिव्हाइस विकसित केले गेले आणि त्याचे वैशिष्ट्यीकृत केले गेले जे हृदयाच्या अतिपातळ भागांना उत्तेजित करू शकते. CTCM प्रणालीमध्ये शारीरिकदृष्ट्या समक्रमित इलेक्ट्रोमेकॅनिकल उत्तेजना आणि T3 आणि Dex द्रव समृद्धी समाविष्ट आहे. जेव्हा डुकराच्या हृदयाचे भाग या घटकांच्या संपर्कात आले तेव्हा त्यांची व्यवहार्यता, संरचनात्मक अखंडता, चयापचय क्रियाकलाप आणि ट्रान्सक्रिप्शनल अभिव्यक्ती 12 दिवसांच्या कल्चरनंतर ताज्या हृदयाच्या ऊतींप्रमाणेच राहिली. याव्यतिरिक्त, हृदयाच्या ऊतींचे जास्त ताणणे हायपरएक्सटेंशनमुळे हृदयाचे हायपरट्रॉफी होऊ शकते. एकूणच, हे निकाल सामान्य हृदयाच्या फेनोटाइप राखण्यात शारीरिक संस्कृती परिस्थितीच्या महत्त्वपूर्ण भूमिकेचे समर्थन करतात आणि औषध तपासणीसाठी एक व्यासपीठ प्रदान करतात.
कार्डिओमायोसाइट्सच्या कार्यासाठी आणि जगण्यासाठी इष्टतम वातावरण तयार करण्यात अनेक घटक योगदान देतात. यातील सर्वात स्पष्ट घटक (१) इंटरसेल्युलर इंटरॅक्शन्स, (२) इलेक्ट्रोमेकॅनिकल स्टिम्युलेशन, (३) ह्युमरल फॅक्टर आणि (४) मेटाबॉलिक सब्सट्रेट्सशी संबंधित आहेत. शारीरिक पेशी-ते-पेशी परस्परसंवादासाठी बाह्य पेशी मॅट्रिक्सद्वारे समर्थित अनेक पेशी प्रकारांचे जटिल त्रिमितीय नेटवर्क आवश्यक असतात. अशा जटिल पेशी परस्परसंवादांना वैयक्तिक पेशी प्रकारांच्या सह-संस्कृतीद्वारे इन विट्रोमध्ये पुनर्बांधणी करणे कठीण असते, परंतु हृदयाच्या विभागांच्या ऑर्गेनोटाइपिक स्वरूपाचा वापर करून ते सहजपणे साध्य करता येते.
कार्डियाक फेनोटाइप राखण्यासाठी कार्डिओमायोसाइट्सचे यांत्रिक स्ट्रेचिंग आणि इलेक्ट्रिकल स्टिम्युलेशन महत्वाचे आहे33,34,35. hiPSC-CM कंडिशनिंग आणि मॅच्युरेशनसाठी यांत्रिक उत्तेजनाचा मोठ्या प्रमाणावर वापर केला जात असला तरी, अलीकडेच अनेक सुंदर अभ्यासांनी एक-अक्षीय लोडिंग वापरून कल्चरमध्ये हृदयाच्या स्लाइसचे यांत्रिक उत्तेजन देण्याचा प्रयत्न केला आहे. या अभ्यासातून असे दिसून आले आहे की 2D एक-अक्षीय यांत्रिक लोडिंगचा कल्चर दरम्यान हृदयाच्या फेनोटाइपवर सकारात्मक परिणाम होतो. या अभ्यासांमध्ये, हृदयाचे विभाग एकतर आयसोमेट्रिक टेन्सिल फोर्स17, रेषीय ऑक्सोटोनिक लोडिंग18 ने लोड केले गेले होते किंवा फोर्स ट्रान्सड्यूसर फीडबॅक आणि टेन्शन ड्राइव्ह वापरून कार्डियाक सायकल पुन्हा तयार केली गेली होती. तथापि, या पद्धती पर्यावरणीय ऑप्टिमायझेशनशिवाय एक-अक्षीय ऊतींचे स्ट्रेच वापरतात, परिणामी अनेक कार्डियाक जीन्स दडपल्या जातात किंवा असामान्य स्ट्रेच प्रतिसादांशी संबंधित जीन्सचे जास्त अभिव्यक्ती होते. येथे वर्णन केलेले CTCM एक 3D इलेक्ट्रोमेकॅनिकल उत्तेजना प्रदान करते जे सायकल वेळ आणि शारीरिक स्ट्रेच (25% स्ट्रेच, 40% सिस्टोल, 60% डायस्टोल आणि 72 बीट्स प्रति मिनिट) च्या बाबतीत नैसर्गिक हृदय चक्राची नक्कल करते. जरी हे त्रिमितीय यांत्रिक उत्तेजन केवळ ऊतींची अखंडता राखण्यासाठी पुरेसे नसले तरी, ऊतींची व्यवहार्यता, कार्य आणि अखंडता पुरेशा प्रमाणात राखण्यासाठी T3/Dex वापरून ह्युमरल आणि यांत्रिक उत्तेजनाचे संयोजन आवश्यक आहे.
प्रौढांच्या हृदयाच्या फेनोटाइपचे नियमन करण्यात विनोदी घटक महत्त्वाची भूमिका बजावतात. हे HiPS-CM अभ्यासात अधोरेखित करण्यात आले आहे ज्यामध्ये पेशी परिपक्वता वाढविण्यासाठी कल्चर मीडियामध्ये T3 आणि Dex जोडले गेले होते. T3 पेशी पडद्यामध्ये अमीनो आम्ल, साखर आणि कॅल्शियमच्या वाहतुकीवर परिणाम करू शकते36. याव्यतिरिक्त, T3 MHC-α अभिव्यक्ती आणि MHC-β डाउनरेग्युलेशनला प्रोत्साहन देते, गर्भाच्या CM मध्ये स्लो ट्विच मायोफिब्रिल्सच्या तुलनेत प्रौढ कार्डिओमायोसाइट्समध्ये जलद ट्विच मायोफिब्रिल्सच्या निर्मितीला प्रोत्साहन देते. हायपोथायरॉइड रुग्णांमध्ये T3 च्या कमतरतेमुळे मायोफिब्रिलर बँडचे नुकसान होते आणि टोन विकासाचा दर कमी होतो37. डेक्स ग्लुकोकोर्टिकोइड रिसेप्टर्सवर कार्य करते आणि वेगळ्या परफ्यूज केलेल्या हृदयांमध्ये मायोकार्डियल आकुंचन वाढवते असे दिसून आले आहे; 38 ही सुधारणा कॅल्शियम डिपॉझिट-चालित एंट्री (SOCE) 39,40 वरील परिणामाशी संबंधित असल्याचे मानले जाते. याव्यतिरिक्त, डेक्स त्याच्या रिसेप्टर्सशी बांधला जातो, ज्यामुळे एक व्यापक इंट्रासेल्युलर प्रतिसाद निर्माण होतो जो रोगप्रतिकारक कार्य आणि जळजळ दाबतो30.
आमचे निकाल असे दर्शवितात की शारीरिक यांत्रिक उत्तेजनाने (MS) Ctrl च्या तुलनेत एकूण कल्चर कामगिरी सुधारली, परंतु कल्चरमध्ये 12 दिवसांपर्यंत व्यवहार्यता, संरचनात्मक अखंडता आणि हृदय अभिव्यक्ती राखण्यात अयशस्वी झाले. Ctrl च्या तुलनेत, CTCM (MT) कल्चरमध्ये T3 आणि Dex जोडल्याने व्यवहार्यता सुधारली आणि 12 दिवसांसाठी ताज्या हृदयाच्या ऊतींसह समान ट्रान्सक्रिप्शन प्रोफाइल, संरचनात्मक अखंडता आणि चयापचय क्रियाकलाप राखला. याव्यतिरिक्त, ऊतींच्या ताणाची डिग्री नियंत्रित करून, STCM वापरून हायपरएक्सटेंशन-प्रेरित कार्डियाक हायपरट्रॉफी मॉडेल तयार केले गेले, जे STCM प्रणालीची बहुमुखी प्रतिभा दर्शवते. हे लक्षात घेतले पाहिजे की जरी कार्डियाक रीमॉडेलिंग आणि फायब्रोसिसमध्ये सामान्यतः अखंड अवयव असतात ज्यांचे रक्ताभिसरण पेशी योग्य सायटोकिन्स तसेच फॅगोसाइटोसिस आणि इतर रीमॉडेलिंग घटक प्रदान करू शकतात, तरीही हृदयाचे विभाग ताण आणि आघाताच्या प्रतिसादात फायब्रोटिक प्रक्रियेची नक्कल करू शकतात. मायोफायब्रोब्लास्टमध्ये. या कार्डियाक स्लाईस मॉडेलमध्ये यापूर्वी मूल्यांकन केले गेले आहे. हे लक्षात घेतले पाहिजे की टाकीकार्डिया, ब्रॅडीकार्डिया आणि यांत्रिक रक्ताभिसरण समर्थन (यांत्रिक अनलोड केलेले हृदय) सारख्या अनेक परिस्थितींचे अनुकरण करण्यासाठी दबाव/विद्युतीय मोठेपणा आणि वारंवारता बदलून CTCM पॅरामीटर्स मॉड्युलेट केले जाऊ शकतात. यामुळे ही प्रणाली औषध चाचणीसाठी एक मध्यम थ्रूपुट बनते. अति श्रम-प्रेरित कार्डियाक हायपरट्रॉफीचे मॉडेलिंग करण्याची CTCM ची क्षमता वैयक्तिकृत थेरपीसाठी या प्रणालीची चाचणी करण्याचा मार्ग मोकळा करते. शेवटी, सध्याच्या अभ्यासातून असे दिसून येते की कार्डियाक टिशू सेक्शन्सचे कल्चर राखण्यासाठी यांत्रिक स्ट्रेचिंग आणि ह्युमरल स्टिम्युलेशन महत्वाचे आहेत.
जरी येथे सादर केलेल्या डेटावरून असे दिसून येते की CTCM हे अखंड मायोकार्डियम मॉडेलिंगसाठी एक अतिशय आशादायक व्यासपीठ आहे, परंतु या कल्चर पद्धतीला काही मर्यादा आहेत. CTCM कल्चरची मुख्य मर्यादा म्हणजे ती स्लाइसवर सतत गतिमान यांत्रिक ताण लादते, ज्यामुळे प्रत्येक चक्रादरम्यान कार्डियाक स्लाइस आकुंचन सक्रियपणे निरीक्षण करण्याची क्षमता कमी होते. याव्यतिरिक्त, कार्डियाक सेक्शनच्या लहान आकारामुळे (७ मिमी), पारंपारिक फोर्स सेन्सर वापरून कल्चर सिस्टमच्या बाहेर सिस्टोलिक फंक्शनचे मूल्यांकन करण्याची क्षमता मर्यादित आहे. सध्याच्या हस्तलिखितात, आम्ही कॉन्ट्रॅक्टाइल फंक्शनचे सूचक म्हणून ऑप्टिकल व्होल्टेजचे मूल्यांकन करून या मर्यादेवर अंशतः मात केली आहे. तथापि, या मर्यादेसाठी पुढील काम करावे लागेल आणि भविष्यात कॅल्शियम आणि व्होल्टेज-संवेदनशील रंगांचा वापर करून ऑप्टिकल मॅपिंगसारख्या कल्चरमध्ये हृदयाच्या स्लाइसच्या कार्याचे ऑप्टिकल मॉनिटरिंग करण्यासाठी पद्धती सादर करून त्यावर उपाय केला जाऊ शकतो. CTCM ची आणखी एक मर्यादा अशी आहे की कार्यरत मॉडेल शारीरिक ताण (प्रीलोड आणि आफ्टरलोड) हाताळत नाही. CTCM मध्ये, मोठ्या ऊतींमध्ये डायस्टोल (पूर्ण स्ट्रेच) आणि सिस्टोल (विद्युत उत्तेजनादरम्यान आकुंचनाची लांबी) मध्ये २५% शारीरिक ताण पुनरुत्पादित करण्यासाठी विरुद्ध दिशेने दबाव आणला गेला. भविष्यातील CTCM डिझाइनमध्ये दोन्ही बाजूंनी हृदयाच्या ऊतींवर पुरेसा दाब देऊन आणि हृदयाच्या कक्षांमध्ये होणारे अचूक दाब-आवाज संबंध लागू करून ही मर्यादा दूर केली पाहिजे.
या हस्तलिखितात नोंदवलेले ओव्हरस्ट्रेच-प्रेरित रीमॉडेलिंग हायपरट्रॉफिक हायपरस्ट्रेच सिग्नल्सची नक्कल करण्यापुरते मर्यादित आहे. अशाप्रकारे, हे मॉडेल ह्युमरल किंवा न्यूरल घटकांची आवश्यकता न ठेवता स्ट्रेच-प्रेरित हायपरट्रॉफिक सिग्नलिंगच्या अभ्यासात मदत करू शकते (जे या प्रणालीमध्ये अस्तित्वात नाहीत). CTCM ची बहुलता वाढवण्यासाठी पुढील अभ्यास आवश्यक आहेत, उदाहरणार्थ, रोगप्रतिकारक पेशींसह सह-संवर्धन, रक्ताभिसरण प्लाझ्मा ह्युमरल घटक आणि न्यूरोनल पेशींसह सह-संवर्धन करताना इनर्व्हेशन CTCM सह रोग मॉडेलिंगच्या शक्यता सुधारेल.
या अभ्यासात तेरा डुकरांचा वापर करण्यात आला. सर्व प्राण्यांच्या प्रक्रिया संस्थात्मक मार्गदर्शक तत्त्वांनुसार केल्या गेल्या आणि त्यांना लुईव्हिल विद्यापीठाच्या संस्थात्मक प्राणी काळजी आणि वापर समितीने मान्यता दिली. महाधमनी कमान क्लॅम्प करण्यात आली आणि हृदयाला १ लिटर निर्जंतुकीकरण कार्डिओप्लेजिया (११० एमएम NaCl, १.२ एमएम CaCl2, १६ एमएम KCl, १६ एमएम MgCl2, १० एमएम NaHCO3, ५ यू/एमएल हेपरिन, ७.४ पर्यंत पीएच) सह परफ्यूज करण्यात आले; हृदये बर्फावर प्रयोगशाळेत नेईपर्यंत बर्फाच्या थंड कार्डिओप्लेजिक द्रावणात जतन केली गेली, जी सहसा <10 मिनिटे असते. हृदये बर्फावर प्रयोगशाळेत नेईपर्यंत बर्फाच्या थंड कार्डिओप्लेजिक द्रावणात जतन केली गेली, जी सहसा <10 मिनिटे असते. сердца хранили в ледяном кардиоплегическом растворе до транспортировки в лабораторию на льду, что обычно занимает <10 мин. हृदये बर्फावर प्रयोगशाळेत नेईपर्यंत बर्फाच्या थंड कार्डिओप्लेजिक द्रावणात साठवली जात होती, ज्याला सहसा <10 मिनिटे लागतात.将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中,直到冰上运送到实验室,通常<10分钟.将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中,直到冰上运送到实验室,通常<10分钟. Держите сердца в ледяной кардиоплегии до транспортировки в лабораторию на льду, обычно <10 min. प्रयोगशाळेत बर्फावर नेईपर्यंत हृदय बर्फाच्या कार्डिओप्लेजियावर ठेवा, सहसा <10 मिनिटे.
CTCM डिव्हाइस सॉलिडवर्क्स कॉम्प्युटर-एडेड डिझाइन (CAD) सॉफ्टवेअरमध्ये विकसित केले गेले आहे. कल्चर चेंबर्स, डिव्हायडर आणि एअर चेंबर्स CNC क्लिअर अॅक्रेलिक प्लास्टिकपासून बनलेले आहेत. ७ मिमी व्यासाचा बॅक-अप रिंग मध्यभागी हाय डेन्सिटी पॉलीथिलीन (HDPE) पासून बनलेला आहे आणि त्याच्या खाली मीडिया सील करण्यासाठी वापरल्या जाणाऱ्या सिलिकॉन ओ-रिंगला सामावून घेण्यासाठी ओ-रिंग ग्रूव्ह आहे. एक पातळ सिलिका मेम्ब्रेन कल्चर चेंबरला सेपरेशन प्लेटपासून वेगळे करतो. सिलिकॉन मेम्ब्रेन ०.०२ इंच जाडीच्या सिलिकॉन शीटपासून लेसर कट केला जातो आणि त्याची कडकपणा ३५A आहे. खालच्या आणि वरच्या सिलिकॉन गॅस्केट १/१६ इंच जाडीच्या सिलिकॉन शीटपासून लेसर कट केल्या जातात आणि त्यांची कडकपणा ५०A आहे. ब्लॉक बांधण्यासाठी आणि हवाबंद सील तयार करण्यासाठी ३१६L स्टेनलेस स्टील स्क्रू आणि विंग नट्स वापरले जातात.
C-PACE-EM प्रणालीशी एकत्रित करण्यासाठी एक समर्पित प्रिंटेड सर्किट बोर्ड (PCB) डिझाइन केला आहे. PCB वरील स्विस मशीन कनेक्टर सॉकेट्स सिल्व्हर-प्लेटेड कॉपर वायर्स आणि कांस्य 0-60 स्क्रू इलेक्ट्रोड्समध्ये स्क्रू करून ग्रेफाइट इलेक्ट्रोड्सशी जोडलेले आहेत. प्रिंटेड सर्किट बोर्ड 3D प्रिंटरच्या कव्हरमध्ये ठेवलेला आहे.
CTCM डिव्हाइस प्रोग्रामेबल न्यूमॅटिक अ‍ॅक्च्युएटर (PPD) द्वारे नियंत्रित केले जाते जे कार्डियाक सायकल प्रमाणेच नियंत्रित रक्ताभिसरण दाब तयार करते. एअर चेंबरमधील दाब वाढल्याने, लवचिक सिलिकॉन पडदा वरच्या दिशेने विस्तारतो, ज्यामुळे टिश्यू साइटखालील माध्यमाला भाग पाडले जाते. नंतर द्रवपदार्थाच्या या निष्कासनामुळे ऊतींचे क्षेत्र ताणले जाईल, जे डायस्टोल दरम्यान हृदयाच्या शारीरिक विस्ताराचे अनुकरण करेल. विश्रांतीच्या शिखरावर, ग्रेफाइट इलेक्ट्रोडद्वारे विद्युत उत्तेजना लागू केली गेली, ज्यामुळे एअर चेंबरमधील दाब कमी झाला आणि टिश्यू विभागांचे आकुंचन झाले. पाईपच्या आत हवेच्या प्रणालीतील दाब शोधण्यासाठी प्रेशर सेन्सरसह एक हेमोस्टॅटिक व्हॉल्व्ह आहे. प्रेशर सेन्सरद्वारे जाणवलेला दाब लॅपटॉपशी जोडलेल्या डेटा कलेक्टरवर लागू केला जातो. हे गॅस चेंबरमधील दाबाचे सतत निरीक्षण करण्यास अनुमती देते. जेव्हा कमाल चेंबर प्रेशर (मानक 80 mmHg, 140 mmHg OS) गाठला जातो, तेव्हा डेटा अधिग्रहण डिव्हाइसला C-PACE-EM सिस्टमला 2 ms साठी बायफेसिक व्होल्टेज सिग्नल निर्माण करण्यासाठी सिग्नल पाठविण्याचा आदेश देण्यात आला होता, जो 4 V वर सेट केला जातो.
हृदयाचे विभाग मिळवण्यात आले आणि 6 विहिरींमध्ये कल्चरची स्थिती खालीलप्रमाणे करण्यात आली: कापलेले हृदय ट्रान्सफर वेसलमधून थंड (4° सेल्सिअस) कार्डिओप्लेजिया असलेल्या ट्रेमध्ये स्थानांतरित करा. डाव्या वेंट्रिकलला निर्जंतुक ब्लेडने वेगळे केले गेले आणि 1-2 सेमी3 च्या तुकड्यांमध्ये कापले गेले. हे टिश्यू ब्लॉक्स टिश्यू अॅडेसिव्हसह टिश्यू सपोर्टशी जोडले गेले आणि टायरोडचे द्रावण असलेल्या कंपन करणाऱ्या मायक्रोटोम टिश्यू बाथमध्ये ठेवले गेले आणि सतत ऑक्सिजनयुक्त (3 g/L 2,3-ब्यूटेनेडिओन मोनोऑक्साईम (BDM), 140 mM NaCl (8.18 g). ), 6 mM KCl (0.447 g), 10 mM D-ग्लूकोज (1.86 g), 10 mM HEPES (2.38 g), 1 mM MgCl2 (1 ml 1 M द्रावण), 1.8 mM CaCl2 (1.8 ml 1 M द्रावण), 1 L ddH2O पर्यंत. व्हायब्रेटिंग मायक्रोटोम ८० हर्ट्झच्या वारंवारतेने, २ मिमीच्या क्षैतिज कंपन मोठेपणाने आणि ०.०३ मिमी/सेकंदच्या आगाऊ दराने ३०० µm जाडीचे तुकडे कापण्यासाठी सेट केले होते. द्रावण थंड ठेवण्यासाठी टिश्यू बाथ बर्फाने वेढलेले होते आणि तापमान ४°C वर राखले गेले होते. मायक्रोटोम बाथमधून टिश्यू सेक्शन बर्फावर सतत ऑक्सिजनयुक्त टायरोड सोल्यूशन असलेल्या इनक्यूबेशन बाथमध्ये स्थानांतरित करा जोपर्यंत एका कल्चर प्लेटसाठी पुरेसे सेक्शन मिळत नाहीत. ट्रान्सवेल कल्चरसाठी, टिश्यू सेक्शन्स निर्जंतुक ६ मिमी रुंद पॉलीयुरेथेन सपोर्टशी जोडले गेले होते आणि ६ मिली ऑप्टिमाइज्ड माध्यमात (१९९ मध्यम, १x आयटीएस सप्लिमेंट, १०% एफबीएस, ५ एनजी/मिली व्हीईजीएफ, १० एनजी/मिली एफजीएफ-अल्कलाइन आणि २X अँटीबायोटिक-अँटीफंगल) ठेवले गेले. सी-पेसद्वारे टिश्यू सेक्शन्सवर इलेक्ट्रिकल स्टिम्युलेशन (१० व्ही, फ्रिक्वेन्सी १.२ हर्ट्झ) लागू केले गेले. टीडीच्या परिस्थितीसाठी, प्रत्येक माध्यम बदलताना १०० एनएम आणि १ μM वर ताजे टी३ आणि डेक्स जोडले गेले. दिवसातून ३ वेळा बदलण्यापूर्वी माध्यम ऑक्सिजनने भरलेले असते. ऊतींचे भाग ३७°C आणि ५% CO2 वर इनक्यूबेटरमध्ये कल्चर केले गेले.
CTCM कल्चरसाठी, टिश्यू सेक्शन्स एका कस्टम-मेड 3D प्रिंटरवर एका पेट्री डिशमध्ये ठेवण्यात आले होते ज्यामध्ये सुधारित टायरोडचे द्रावण होते. हे उपकरण हृदयाच्या स्लाइसचा आकार सपोर्ट रिंगच्या क्षेत्रफळाच्या 25% ने वाढवण्यासाठी डिझाइन केलेले आहे. टायरोडच्या द्रावणातून माध्यमात स्थानांतरित केल्यानंतर आणि डायस्टोल दरम्यान हृदयाचे विभाग ताणले जाऊ नयेत म्हणून हे केले जाते. हिस्टोअॅक्रेलिक ग्लू वापरून, 300 µm जाडीचे विभाग 7 मिमी व्यासाच्या सपोर्ट रिंगवर निश्चित केले गेले. टिश्यू सेक्शन्स सपोर्ट रिंगला जोडल्यानंतर, जास्त टिश्यू सेक्शन्स कापून टाका आणि जोडलेले टिश्यू सेक्शन्स पुन्हा बर्फावर (4°C) टायरोड सोल्यूशनच्या बाथमध्ये ठेवा जोपर्यंत एका डिव्हाइससाठी पुरेसे सेक्शन तयार होत नाहीत. सर्व उपकरणांसाठी एकूण प्रक्रिया वेळ 2 तासांपेक्षा जास्त नसावा. 6 टिश्यू सेक्शन्स त्यांच्या सपोर्ट रिंग्जशी जोडल्यानंतर, CTCM डिव्हाइस असेंबल केले गेले. CTCM कल्चर चेंबर 21 मिली प्री-ऑक्सिजनयुक्त माध्यमाने पूर्व-भरलेले आहे. टिश्यू सेक्शन्स कल्चर चेंबरमध्ये स्थानांतरित करा आणि पिपेटने कोणतेही हवेचे बुडबुडे काळजीपूर्वक काढून टाका. त्यानंतर टिश्यू सेक्शनला छिद्रात नेले जाते आणि हळूवारपणे जागी दाबले जाते. शेवटी, उपकरणावर इलेक्ट्रोड कॅप ठेवा आणि उपकरण इनक्यूबेटरमध्ये स्थानांतरित करा. नंतर CTCM ला एअर ट्यूब आणि C-PACE-EM सिस्टीमशी जोडा. न्यूमॅटिक अ‍ॅक्च्युएटर उघडतो आणि एअर व्हॉल्व्ह CTCM उघडतो. C-PACE-EM सिस्टीम 2 ms साठी बायफेसिक पेसिंग दरम्यान 1.2 Hz वर 4 V वितरित करण्यासाठी कॉन्फिगर केली गेली होती. दिवसातून दोनदा माध्यम बदलले गेले आणि इलेक्ट्रोडवर ग्रेफाइट जमा होऊ नये म्हणून दिवसातून एकदा इलेक्ट्रोड बदलले गेले. आवश्यक असल्यास, त्यांच्या कल्चर विहिरींमधून टिश्यू सेक्शन काढून टाकता येतात जेणेकरून त्यांच्याखाली पडलेले कोणतेही हवेचे बुडबुडे बाहेर पडतील. MT उपचार परिस्थितीसाठी, T3/Dex प्रत्येक माध्यम बदलासह 100 nM T3 आणि 1 μM Dex सह ताजे जोडले गेले. CTCM डिव्हाइसेसना 37°C आणि 5% CO2 वर इनक्यूबेटरमध्ये कल्चर केले गेले.
हृदयाच्या तुकड्यांचे ताणलेले मार्ग मिळविण्यासाठी, एक विशेष कॅमेरा प्रणाली विकसित करण्यात आली. Navitar Zoom 7000 18-108mm मॅक्रो लेन्स (Navitar, San Francisco, CA) सह SLR कॅमेरा (Canon Rebel T7i, Canon, Tokyo, Japan) वापरण्यात आला. माध्यमाला ताज्या माध्यमाने बदलल्यानंतर खोलीच्या तपमानावर व्हिज्युअलायझेशन केले गेले. कॅमेरा 51° कोनात ठेवला जातो आणि व्हिडिओ प्रति सेकंद 30 फ्रेम्स रेकॉर्ड केला जातो. प्रथम, हृदयाच्या तुकड्यांच्या गतीचे प्रमाण मोजण्यासाठी इमेज-जे सह ओपन सोर्स सॉफ्टवेअर (MUSCLEMOTION43) वापरण्यात आले. आवाज टाळण्यासाठी हृदयाच्या तुकड्यांच्या धडधडण्यासाठी स्वारस्य असलेले क्षेत्र परिभाषित करण्यासाठी MATLAB (MathWorks, Natick, MA, USA) वापरून मास्क तयार करण्यात आला. फ्रेम अनुक्रमात सर्व प्रतिमांवर मॅन्युअली सेगमेंट केलेले मास्क लागू केले जातात आणि नंतर MUSCLEMOTION प्लग-इनवर पाठवले जातात. स्नायूंची हालचाल संदर्भ फ्रेमच्या सापेक्ष प्रत्येक फ्रेममधील पिक्सेलची सरासरी तीव्रता वापरते. डेटा रेकॉर्ड केला गेला, फिल्टर केला गेला आणि हृदयाच्या चक्रादरम्यान सायकल वेळेचे प्रमाण मोजण्यासाठी आणि ऊतींच्या ताणाचे मूल्यांकन करण्यासाठी वापरला गेला. रेकॉर्ड केलेला व्हिडिओ फर्स्ट-ऑर्डर झिरो-फेज डिजिटल फिल्टर वापरून पोस्ट-प्रोसेस करण्यात आला. ऊतींच्या ताणाचे प्रमाण मोजण्यासाठी (पीक-टू-पीक), रेकॉर्ड केलेल्या सिग्नलमधील शिखर आणि ट्रफमध्ये फरक करण्यासाठी पीक-टू-पीक विश्लेषण केले गेले. याव्यतिरिक्त, सिग्नल ड्रिफ्ट दूर करण्यासाठी 6 व्या ऑर्डर बहुपदीचा वापर करून डिट्रेंडिंग केले जाते. जागतिक ऊतींची गती, सायकल वेळ, विश्रांती वेळ आणि आकुंचन वेळ निश्चित करण्यासाठी MATLAB मध्ये प्रोग्राम कोड विकसित करण्यात आला (पूरक प्रोग्राम कोड 44).
स्ट्रेन विश्लेषणासाठी, मेकॅनिकल स्ट्रेच असेसमेंटसाठी तयार केलेल्या त्याच व्हिडिओंचा वापर करून, आम्ही प्रथम MUSCLEMOTION सॉफ्टवेअरनुसार गती शिखरांचे (सर्वोच्च (वरचे) आणि सर्वात कमी (खालचे) बिंदू) प्रतिनिधित्व करणाऱ्या दोन प्रतिमा ट्रेस केल्या. त्यानंतर आम्ही ऊतींचे क्षेत्र विभागले आणि विभागलेल्या ऊतींवर शेडिंग अल्गोरिथमचा एक प्रकार लागू केला (पूरक आकृती 2a). त्यानंतर विभागलेल्या ऊतींचे दहा उपपृष्ठभागांमध्ये विभाजन केले गेले आणि प्रत्येक पृष्ठभागावरील ताण खालील समीकरण वापरून मोजला गेला: स्ट्रेन = (सुप-एसडाउन)/एसडाउन, जिथे सुप आणि एसडाउन हे अनुक्रमे फॅब्रिकच्या वरच्या आणि खालच्या सावलीपासून आकाराचे अंतर आहेत (पूरक आकृती 2b).
हृदयाचे भाग ४% पॅराफॉर्मल्डिहाइडमध्ये ४८ तासांसाठी निश्चित केले गेले. स्थिर ऊतींना १०% आणि २०% सुक्रोजमध्ये १ तासासाठी, नंतर ३०% सुक्रोजमध्ये रात्रभर निर्जलीकरण केले गेले. नंतर हे भाग इष्टतम कटिंग तापमान कंपाऊंड (OCT कंपाऊंड) मध्ये एम्बेड केले गेले आणि हळूहळू आयसोपेंटेन/ड्राय आइस बाथमध्ये गोठवले गेले. वेगळे होईपर्यंत OCT एम्बेडिंग ब्लॉक्स -८० °C वर साठवा. ८ μm जाडी असलेल्या विभागांमध्ये स्लाईड तयार केल्या गेल्या.
हृदयाच्या भागांमधून OCT काढून टाकण्यासाठी, स्लाईड्सना ९५°C वर हीटिंग ब्लॉकवर ५ मिनिटांसाठी गरम करा. प्रत्येक स्लाईडमध्ये १ मिली PBS घाला आणि खोलीच्या तपमानावर ३० मिनिटे इनक्युबेट करा, नंतर खोलीच्या तपमानावर १५ मिनिटे PBS मध्ये ०.१% ट्रायटन-X सेट करून त्या भागांमध्ये झिरपा. विशिष्ट नसलेल्या अँटीबॉडीजना नमुन्याशी जोडण्यापासून रोखण्यासाठी, स्लाईड्समध्ये १ मिली ३% BSA द्रावण घाला आणि खोलीच्या तपमानावर १ तास इनक्युबेट करा. त्यानंतर BSA काढून टाकण्यात आला आणि स्लाईड्स PBS ने धुतल्या गेल्या. प्रत्येक नमुना पेन्सिलने चिन्हांकित करा. प्राथमिक अँटीबॉडीज (१% BSA मध्ये १:२०० पातळ केलेले) (कनेक्सिन ४३ (अ‍ॅबकॅम; #AB११३७०), NFATC४ (अ‍ॅबकॅम; #AB९९४३१) आणि ट्रोपोनिन-टी (थर्मो सायंटिफिक; #MA५-१२९६०) ९० मिनिटांत जोडले गेले, त्यानंतर दुय्यम अँटीबॉडीज (१% BSA मध्ये १:२०० पातळ केलेले) उंदराच्या अलेक्सा फ्लोर ४८८ (थर्मो सायंटिफिक; #A१६०७९), सशाच्या अलेक्सा फ्लोर ५९४ (थर्मो सायंटिफिक; #T६३९१) विरुद्ध अतिरिक्त ९० मिनिटांसाठी PBS ने ३ वेळा धुतले गेले. पार्श्वभूमीपासून लक्ष्य स्टेनिंग वेगळे करण्यासाठी, आम्ही नियंत्रण म्हणून फक्त दुय्यम अँटीबॉडी वापरली. शेवटी, DAPI न्यूक्लियर स्टेन जोडण्यात आले आणि स्लाइड्स एका वेक्टाशिल्ड (व्हेक्टर लॅबोरेटरीज) मध्ये ठेवल्या गेल्या आणि नेल पॉलिशने सील केल्या गेल्या. -x मॅग्निफिकेशन) आणि ४०x मॅग्निफिकेशनसह कीन्स मायक्रोस्कोप.
WGA-Alexa Fluor 555 (थर्मो सायंटिफिक; #W32464) 5 μg/ml PBS मध्ये WGA स्टेनिंगसाठी वापरण्यात आले आणि खोलीच्या तपमानावर 30 मिनिटांसाठी स्थिर भागांवर लावण्यात आले. नंतर स्लाईड्स PBS ने धुतल्या गेल्या आणि प्रत्येक स्लाईडमध्ये सुदान ब्लॅक जोडला गेला आणि 30 मिनिटांसाठी इनक्युबेट केला गेला. नंतर स्लाईड्स PBS ने धुतल्या गेल्या आणि व्हेक्टाशिल्ड एम्बेडिंग माध्यम जोडले गेले. स्लाईड्स 40x मॅग्निफिकेशनवर कीन्स मायक्रोस्कोपवर व्हिज्युअलायझ केल्या गेल्या.
वर वर्णन केल्याप्रमाणे नमुन्यांमधून OCT काढून टाकण्यात आले. OCT काढून टाकल्यानंतर, स्लाईड्स रात्रभर बोइनच्या द्रावणात बुडवा. नंतर स्लाईड्स १ तास डिस्टिल्ड पाण्याने धुवल्या गेल्या आणि नंतर बिब्रिच अ‍ॅलो अ‍ॅसिड फ्यूसिन द्रावणात १० मिनिटे ठेवल्या गेल्या. नंतर स्लाईड्स डिस्टिल्ड पाण्याने धुतल्या गेल्या आणि ५% फॉस्फोमोलिब्डेनम/५% फॉस्फोटंगस्टिक अ‍ॅसिडच्या द्रावणात १० मिनिटे ठेवल्या गेल्या. न धुता, स्लाईड्स थेट अ‍ॅनिलिन ब्लू द्रावणात १५ मिनिटे स्थानांतरित करा. नंतर स्लाईड्स डिस्टिल्ड पाण्याने धुतल्या गेल्या आणि १% एसिटिक अ‍ॅसिडच्या द्रावणात २ मिनिटे ठेवल्या गेल्या. स्लाईड्स २०० एन इथेनॉलमध्ये वाळवल्या गेल्या आणि झायलीनमध्ये हस्तांतरित केल्या गेल्या. १०x ऑब्जेक्टिव्ह असलेल्या कीन्स मायक्रोस्कोपचा वापर करून रंगवलेल्या स्लाईड्सचे दृश्यमानीकरण करण्यात आले. कीन्स अॅनालायझर सॉफ्टवेअर वापरून फायब्रोसिस क्षेत्राची टक्केवारी मोजण्यात आली.
उत्पादकाच्या प्रोटोकॉलनुसार, काही बदलांसह, CyQUANT™ MTT सेल व्हायबिलिटी अॅसे (इन्व्हिट्रोजन, कार्ल्सबॅड, CA), कॅटलॉग क्रमांक V13154. विशेषतः, MTT विश्लेषणादरम्यान एकसमान ऊतींचा आकार सुनिश्चित करण्यासाठी 6 मिमी व्यासाचा सर्जिकल पंच वापरण्यात आला. उत्पादकाच्या प्रोटोकॉलनुसार, MTT सब्सट्रेट असलेल्या 12-वेल प्लेटच्या विहिरींमध्ये ऊतींना वैयक्तिकरित्या प्लेट केले गेले. हे विभाग 37° सेल्सिअस तापमानात 3 तासांसाठी इनक्यूबेट केले जातात आणि जिवंत ऊती MTT सब्सट्रेटचे चयापचय करून जांभळा फॉर्माझन कंपाऊंड तयार करतात. हृदयाच्या विभागांमधून जांभळा फॉर्माझन काढण्यासाठी MTT द्रावण 1 मिली DMSO ने बदला आणि 15 मिनिटांसाठी 37°C वर इनक्यूबेट करा. नमुने 96-वेल स्वच्छ तळाच्या प्लेट्समध्ये DMSO मध्ये 1:10 पातळ केले गेले आणि सायटेशन प्लेट रीडर (बायोटेक) वापरून जांभळ्या रंगाची तीव्रता 570 nm मोजली गेली. हृदयाच्या प्रत्येक स्लाइसच्या वजनानुसार वाचन सामान्य केले गेले.
आधी वर्णन केल्याप्रमाणे ग्लुकोज वापर तपासणीसाठी हार्ट स्लाइस मीडिया 1 μCi/ml [5-3H]-ग्लुकोज असलेल्या मीडियाने बदलण्यात आला (मोरावेक बायोकेमिकल्स, ब्रेआ, सीए, यूएसए). 4 तासांच्या उष्मायनानंतर, 100 μl 0.2 N HCl असलेल्या ओपन मायक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबमध्ये 100 μl माध्यम घाला. नंतर ट्यूब 500 μl dH2O असलेल्या सिंटिलेशन ट्यूबमध्ये ठेवण्यात आली जेणेकरून 37°C वर 72 तासांसाठी [3H]2O बाष्पीभवन होईल. नंतर सिंटिलेशन ट्यूबमधून मायक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब काढा आणि 10 मिली सिंटिलेशन फ्लुइड घाला. ट्राय-कार्ब 2900TR लिक्विड सिंटिलेशन अॅनालायझर (पॅकार्ड बायोसायन्स कंपनी, मेरिडेन, सीटी, यूएसए) वापरून सिंटिलेशन काउंट केले गेले. त्यानंतर ग्लुकोजच्या वापराची गणना [5-3H]-ग्लुकोज विशिष्ट क्रियाकलाप, अपूर्ण समतोल आणि पार्श्वभूमी, [5-3H]-चे लेबल नसलेल्या ग्लुकोजमध्ये विरघळणे आणि सिंटिलेशन काउंटर कार्यक्षमता लक्षात घेऊन केली गेली. हृदयाच्या विभागांच्या वस्तुमानानुसार डेटा सामान्यीकृत केला जातो.
ट्रायझोलमध्ये ऊतींचे एकरूपीकरण झाल्यानंतर, उत्पादकाच्या प्रोटोकॉलनुसार कियाजेन miRNeasy मायक्रो किट #210874 वापरून हृदयाच्या विभागांमधून RNA वेगळे केले गेले. RNAsec लायब्ररीची तयारी, अनुक्रम आणि डेटा विश्लेषण खालीलप्रमाणे केले गेले:
आरएनए लायब्ररी तयार करण्यासाठी सुरुवातीच्या साहित्य म्हणून प्रति नमुना १ μg आरएनए वापरण्यात आला. उत्पादकाच्या शिफारशींनुसार इल्युमिना (NEB, USA) साठी NEBNext UltraTM RNA लायब्ररी प्रीपरेशन किट वापरून सिक्वेन्सिंग लायब्ररी तयार करण्यात आल्या आणि प्रत्येक नमुन्यासाठी गुणधर्म अनुक्रमांमध्ये इंडेक्स कोड जोडले गेले. थोडक्यात, पॉली-टी ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्ससह जोडलेल्या चुंबकीय मण्यांचा वापर करून एकूण आरएनएपासून mRNA शुद्ध केले गेले. NEBNext फर्स्ट स्ट्रँड सिंथेसिस रिएक्शन बफर (5X) मध्ये उच्च तापमानावर डायव्हॅलेंट कॅशन्स वापरून फ्रॅगमेंटेशन केले जाते. पहिला स्ट्रँड cDNA रँडम हेक्सामर प्राइमर्स आणि M-MuLV रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्टेस (RNase H-) वापरून संश्लेषित केला गेला. नंतर दुसरा स्ट्रँड cDNA DNA पॉलिमरेज I आणि RNase H वापरून संश्लेषित केला जातो. उर्वरित ओव्हरहँग एक्सोन्यूक्लीज/पॉलिमरेज क्रियाकलापाद्वारे ब्लंट एंड्समध्ये रूपांतरित केले जातात. DNA फ्रॅगमेंटच्या ३′ टोकाच्या अॅडेनायलेशननंतर, हायब्रिडायझेशनसाठी तयार करण्यासाठी हेअरपिन लूप स्ट्रक्चरसह NEBNext अॅडॉप्टर त्याच्याशी जोडले जाते. पसंतीच्या १५०-२०० bp लांबीच्या cDNA तुकड्यांच्या निवडीसाठी. AMPure XP प्रणाली (बेकमन कुल्टर, बेव्हरली, यूएसए) वापरून लायब्ररी तुकड्यांना शुद्ध करण्यात आले. त्यानंतर, आकार-निवडलेल्या cDNA सह ३ μl USER एन्झाइम (NEB, यूएसए) अॅडॉप्टरसह बांधलेले १५ मिनिटे ३७°C वर आणि नंतर PCR करण्यापूर्वी ९५°C वर ५ मिनिटे वापरले गेले. त्यानंतर PCR फ्यूजन हाय-फिडेलिटी DNA पॉलिमरेज, युनिव्हर्सल PCR प्राइमर्स आणि इंडेक्स (X) प्राइमर्स वापरून केले गेले. शेवटी, PCR उत्पादने शुद्ध करण्यात आली (AMPure XP सिस्टीम) आणि लायब्ररी गुणवत्तेचे मूल्यांकन Agilent Bioanalyzer 2100 सिस्टीमवर केले गेले. त्यानंतर CDNA लायब्ररी नोव्हासेक सिक्वेन्सर वापरून सीक्वेन्स करण्यात आली. इल्युमिनाच्या रॉ इमेज फाइल्स CASAVA बेस कॉलिंग वापरून रॉ रीडमध्ये रूपांतरित केल्या गेल्या. रॉ डेटा FASTQ(fq) फॉरमॅट फाइल्समध्ये संग्रहित केला जातो ज्यामध्ये रीड सीक्वेन्स आणि संबंधित बेस गुण असतात. फिल्टर केलेले सीक्वेन्सिंग रीड Sscrofa11.1 संदर्भ जीनोमशी जुळवण्यासाठी HISAT2 निवडा. सर्वसाधारणपणे, HISAT2 कोणत्याही आकाराच्या जीनोमला समर्थन देते, ज्यामध्ये 4 अब्ज बेसपेक्षा मोठे जीनोम समाविष्ट आहेत आणि बहुतेक पॅरामीटर्ससाठी डीफॉल्ट मूल्ये सेट केली जातात. RNA Seq डेटामधून स्प्लिसिंग रीड HISAT2 वापरून कार्यक्षमतेने संरेखित केले जाऊ शकते, जी सध्या उपलब्ध असलेली सर्वात वेगवान प्रणाली आहे, इतर कोणत्याही पद्धतीपेक्षा समान किंवा चांगल्या अचूकतेसह.
ट्रान्सक्रिप्ट्सची विपुलता थेट जनुक अभिव्यक्तीची पातळी प्रतिबिंबित करते. जनुक अभिव्यक्ती पातळी जीनोम किंवा एक्सॉन्सशी संबंधित ट्रान्सक्रिप्ट्सच्या विपुलतेद्वारे (अनुक्रमांक संख्या) मूल्यांकन केली जाते. वाचनांची संख्या जनुक अभिव्यक्ती पातळी, जनुक लांबी आणि अनुक्रम खोलीच्या प्रमाणात असते. FPKM (प्रति दशलक्ष बेस जोड्यांमधील ट्रान्सक्रिप्ट अनुक्रमित हजार बेस जोड्यांमधील तुकड्या) मोजल्या गेल्या आणि DESeq2 पॅकेज वापरून विभेदक अभिव्यक्तीचे P-मूल्ये निश्चित केले गेले. त्यानंतर आम्ही बिल्ट-इन R-फंक्शन “p.adjust” वर आधारित बेंजामिनी-होचबर्ग पद्धत9 वापरून प्रत्येक P मूल्यासाठी खोटे शोध दर (FDR) मोजला.
हृदयाच्या भागांपासून वेगळे केलेले आरएनए थर्मो (थर्मो, कॅट. क्र. ११७५६०५०) मधील सुपरस्क्रिप्ट IV व्हिलो मास्टर मिक्स वापरून २०० एनजी/μl च्या एकाग्रतेने सीडीएनएमध्ये रूपांतरित केले गेले. क्वांटिटेटिव्ह आरटी-पीसीआर अप्लाइड बायोसिस्टम्स एंडुरा प्लेट मायक्रोअँप ३८४-वेल ट्रान्सपरंट रिअॅक्शन प्लेट (थर्मो, कॅट. क्र. ४४८३३१९) आणि मायक्रोअँप ऑप्टिकल अॅडहेसिव्ह (थर्मो, कॅट. क्र. ४३११९७१) वापरून केले गेले. प्रतिक्रियेच्या मिश्रणात ५ μl टॅकमन फास्ट अॅडव्हान्स्ड मास्टर मिक्स (थर्मो, कॅट # ४४४४५५७), ०.५ μl टॅकमन प्राइमर आणि ३.५ μl एच२ओ प्रति विहिरी मिसळलेले होते. मानक क्यूपीसीआर सायकल चालवल्या गेल्या आणि अप्लाइड बायोसिस्टम्स क्वांटस्टुडिओ ५ रिअल-टाइम पीसीआर इन्स्ट्रुमेंट (३८४-वेल मॉड्यूल; उत्पादन # ए२८१३५) वापरून सीटी मूल्ये मोजली गेली. टॅकमन प्रायमर थर्मो (GAPDH (Ss03375629_u1), PARP12 (Ss06908795_m1), PKDCC (Ss06903874_m1), CYGB (Ss06900188_m1), RGL1 (Ss0686890_m1), ACTN1 (Ss01009508_mH), GATA4 (Ss03383805_u1), GJA1 (Ss03374839_u1), COL1A2 (Ss03375009_u1), COL3A1 (Ss04323794_m1), ACTA2 (Ss04245588_m1) कडून खरेदी केले गेले. सर्व नमुन्यांचे CT मूल्ये हाऊसकीपिंग जीन GAPDH मध्ये सामान्यीकृत केली गेली.
उत्पादकाच्या प्रोटोकॉलनुसार NT-ProBNP किट (डुक्कर) (मांजर क्रमांक MBS2086979, MyBioSource) वापरून NT-ProBNP च्या मीडिया रिलीजचे मूल्यांकन करण्यात आले. थोडक्यात, प्रत्येक विहिरीत प्रत्येक नमुना आणि मानकाचे 250 μl डुप्लिकेटमध्ये जोडले गेले. नमुना जोडल्यानंतर लगेच, प्रत्येक विहिरीत 50 μl असे अभिकर्मक A घाला. प्लेट हलक्या हाताने हलवा आणि सीलंटने सील करा. नंतर गोळ्या 37°C वर 1 तासासाठी उबवल्या गेल्या. नंतर द्रावणाचे एस्पिरेट करा आणि 350 μl 1X वॉश सोल्यूशनने विहिरी 4 वेळा धुवा, प्रत्येक वेळी 1-2 मिनिटे वॉश सोल्यूशन उबवा. नंतर प्रत्येक विहिरीत 100 μl असे अभिकर्मक B घाला आणि प्लेट सीलंटने सील करा. टॅब्लेट हलक्या हाताने हलवा आणि 37°C वर 30 मिनिटांसाठी उबवला गेला. द्रावण अ‍ॅस्पिरेट करा आणि विहिरी ५ वेळा ३५० µl १X वॉश सोल्यूशनने धुवा. प्रत्येक विहिरीत ९० µl सब्सट्रेट सोल्यूशन घाला आणि प्लेट सील करा. प्लेट ३७°C वर १०-२० मिनिटे उबवा. प्रत्येक विहिरीत ५० µl स्टॉप सोल्यूशन घाला. ४५० nm वर सेट केलेल्या सायटेशन (बायोटेक) प्लेट रीडरचा वापर करून प्लेटचे त्वरित मोजमाप केले गेले.
५% प्रकार I त्रुटी दरासह पॅरामीटरमध्ये १०% परिपूर्ण बदल शोधण्यासाठी ८०% पेक्षा जास्त शक्ती प्रदान करणारे गट आकार निवडण्यासाठी पॉवर विश्लेषणे केली गेली. ५% प्रकार I त्रुटी दरासह पॅरामीटरमध्ये १०% परिपूर्ण बदल शोधण्यासाठी ८०% पेक्षा जास्त शक्ती प्रदान करणारे गट आकार निवडण्यासाठी पॉवर विश्लेषणे केली गेली. अनालिझ мощности был выполнен для выбора размеров групп, которые обеспечат >80% мощности для обнаружемения 10% абнаружения параметра с 5% частотой ошибок типа I. ५% प्रकार I त्रुटी दरासह १०% परिपूर्ण पॅरामीटर बदल शोधण्यासाठी ८०% पेक्षा जास्त शक्ती प्रदान करणारे गट आकार निवडण्यासाठी पॉवर विश्लेषण केले गेले.进行功效分析以选择将提供>80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％I将揘变化和5％I将提供.进行功效分析以选择将提供>80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％I将揘变化和5％I将提供. Был проведен анализ мощности для выбора размера группы, который обеспечил бы > ८०% мощности для обнаружения 10% параметров и 5% частоты ошибок типа I. १०% परिपूर्ण पॅरामीटर बदल आणि ५% प्रकार I त्रुटी दर शोधण्यासाठी ८०% पेक्षा जास्त शक्ती प्रदान करणारा गट आकार निवडण्यासाठी पॉवर विश्लेषण केले गेले.प्रयोगापूर्वी ऊतींचे विभाग यादृच्छिकपणे निवडले गेले. सर्व विश्लेषणे कंडिशन ब्लाइंड होती आणि सर्व डेटाचे विश्लेषण केल्यानंतरच नमुने डीकोड केले गेले. सर्व सांख्यिकीय विश्लेषण करण्यासाठी ग्राफपॅड प्रिझम सॉफ्टवेअर (सॅन दिएगो, सीए) वापरण्यात आले. सर्व आकडेवारीसाठी, <0.05 मूल्यांवर p-मूल्ये महत्त्वपूर्ण मानली गेली. सर्व आकडेवारीसाठी, p-मूल्ये <0.05 मूल्यांवर महत्त्वपूर्ण मानली गेली. Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. सर्व आकडेवारीसाठी, p-मूल्ये <0.05 मूल्यांवर महत्त्वपूर्ण मानली गेली.对于所有统计数据,p 值在值<0.05 时被认为是显着的.对于所有统计数据,p 值在值<0.05 时被认为是显着的. Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. सर्व आकडेवारीसाठी, p-मूल्ये <0.05 मूल्यांवर महत्त्वपूर्ण मानली गेली.दोन-पुच्छ असलेल्या विद्यार्थ्यांची टी-चाचणी डेटावर फक्त २ तुलनेसह करण्यात आली. एक-मार्गी किंवा दोन-मार्गी ANOVA चा वापर अनेक गटांमधील महत्त्व निश्चित करण्यासाठी करण्यात आला. पोस्ट हॉक चाचण्या करताना, अनेक तुलनांसाठी तुकीची सुधारणा लागू केली गेली. पद्धती विभागात वर्णन केल्याप्रमाणे FDR आणि p.adjust ची गणना करताना RNAsec डेटामध्ये विशेष सांख्यिकीय विचार असतात.
अभ्यास डिझाइनबद्दल अधिक माहितीसाठी, या लेखाशी जोडलेला निसर्ग संशोधन अहवाल सारांश पहा.