Köszönjük, hogy felkereste a Nature.com weboldalt. Az Ön által használt böngészőverzió korlátozott CSS-támogatással rendelkezik. A legjobb élmény érdekében javasoljuk, hogy egy frissített böngészőt használjon (vagy tiltsa le a kompatibilitási módot az Internet Explorerben). Időközben a folyamatos támogatás biztosítása érdekében stílusok és JavaScript nélkül jelenítjük meg az oldalt.
Szükség van egy megbízható in vitro rendszerre, amely pontosan képes reprodukálni a szív fiziológiai környezetét a gyógyszerteszteléshez. Az emberi szívszövet-tenyésztő rendszerek korlátozott elérhetősége a szívre ható gyógyszerhatások pontatlan értelmezéséhez vezetett. Jelen munkánk során egy olyan szívszövet-tenyésztő modellt (CTCM) fejlesztettünk ki, amely elektromechanikusan stimulálja a szívszeleteket, és fiziológiás nyújtáson megy keresztül a szívciklus szisztolés és diasztolés fázisaiban. 12 napos tenyésztés után ez a megközelítés részben javította a szívmetszetek életképességét, de nem őrizte meg teljesen szerkezeti integritásukat. Ezért kis molekulájú szűrés után azt tapasztaltuk, hogy 100 nM trijód-tironin (T3) és 1 μM dexametazon (Dex) hozzáadása a táptalajunkhoz 12 napig fenntartotta a metszetek mikroszerkezetét. A T3/Dex kezeléssel kombinálva a CTCM rendszer a transzkripciós profilokat, az életképességet, a metabolikus aktivitást és a szerkezeti integritást 12 napig a friss szívszövet szintjén tartotta fenn. Ezenkívül a szívszövet túlzott nyújtása a tenyészetben hipertrófiás szívjelátvitelt indukál, ami bizonyítékot szolgáltat a CTCM azon képességére, hogy utánozza a szívnyújtás által kiváltott hipertrófiás állapotokat. Összefoglalva, a CTCM hosszú időn keresztül képes modellezni a szív fiziológiáját és patofiziológiáját tenyészetben, lehetővé téve a megbízható gyógyszerszűrést.
A klinikai kutatások megkezdése előtt megbízható in vitro rendszerekre van szükség, amelyek képesek pontosan reprodukálni az emberi szív fiziológiai környezetét. Az ilyen rendszereknek utánozniuk kell a megváltozott mechanikai megnyúlást, a pulzusszámot és az elektrofiziológiai tulajdonságokat. Az állatmodelleket gyakran használják a szívfiziológia szűrőplatformjaként, korlátozott megbízhatósággal a gyógyszerek emberi szívre gyakorolt ​​hatásainak tükrözésében1,2. Végső soron az ideális szívszövet-kultúra kísérleti modell (CTCM) egy olyan modell, amely rendkívül érzékeny és specifikus a különféle terápiás és farmakológiai beavatkozásokra, pontosan reprodukálva az emberi szív fiziológiáját és patofiziológiáját3. Egy ilyen rendszer hiánya korlátozza a szívelégtelenség új kezeléseinek felfedezését4,5, és a gyógyszerek kardiotoxicitásához vezetett, mint a piacról való kivonulás egyik fő okához6.
Az elmúlt évtizedben nyolc nem kardiovaszkuláris gyógyszert vontak ki a klinikai használatból, mivel QT-intervallum megnyúlást okoznak, ami kamrai aritmiákhoz és hirtelen halálhoz vezet7. Ezért egyre nagyobb az igény a megbízható preklinikai szűrőstratégiákra a kardiovaszkuláris hatékonyság és toxicitás felmérésére. Az emberben indukált pluripotens őssejtekből származó kardiomiociták (hiPS-CM) közelmúltbeli alkalmazása a gyógyszerszűrésben és a toxicitási vizsgálatokban részleges megoldást kínál erre a problémára. A hiPS-CM-ek éretlen jellege és a szívizomszövet többsejtű komplexitásának hiánya azonban ennek a módszernek a fő korlátja. A legújabb tanulmányok kimutatták, hogy ez a korlátozás részben leküzdhető, ha a korai hiPS-CM-et a spontán összehúzódások kezdete után röviddel szívizomszövet-hidrogélek képzésére használják, és az elektromos stimulációt fokozatosan növelik az idő múlásával. Ezek a hiPS-CM mikroszövetek azonban nem rendelkeznek a felnőtt szívizom érett elektrofiziológiai és összehúzódási tulajdonságaival. Ezenkívül az emberi szívizomszövet összetettebb szerkezetű, különböző sejttípusok heterogén keverékéből áll, beleértve az endotélsejteket, neuronokat és stromális fibroblasztokat, amelyeket specifikus extracelluláris mátrixfehérjék kötnek össze. A felnőtt emlősök szívében található nem szívizomsejt-populációk heterogenitása11,12,13 jelentős akadályt jelent a szívizomszövet egyedi sejttípusokon alapuló modellezésében. Ezek a főbb korlátok kiemelik az ép szívizomszövet fiziológiás és patológiás körülmények közötti tenyésztésére szolgáló módszerek fejlesztésének fontosságát.
Az emberi szív vékony (300 µm-es) tenyésztett metszetei ígéretes modellnek bizonyultak az ép emberi szívizom számára. Ez a módszer hozzáférést biztosít egy teljes 3D-s többsejtű rendszerhez, amely hasonló az emberi szívszövethez. 2019-ig azonban a tenyésztett szívmetszetek használatát korlátozta a rövid (24 órás) tenyészettúlélés. Ez számos tényezőnek tudható be, beleértve a fizikai-mechanikai nyújtás hiányát, a levegő-folyadék határfelületet és az egyszerű táptalajok használatát, amelyek nem elégítik ki a szívszövet igényeit. 2019-ben számos kutatócsoport kimutatta, hogy a mechanikai tényezők beépítése a szívizomszövet-tenyésztő rendszerekbe meghosszabbíthatja a tenyészet élettartamát, javíthatja a szív expresszióját és utánozhatja a szívpatológiát. Két elegáns tanulmány, 17 és 18, kimutatja, hogy az egytengelyű mechanikai terhelés pozitív hatással van a szív fenotípusára a tenyésztés során. Ezek a tanulmányok azonban nem alkalmazták a szívciklus dinamikus háromdimenziós fizikai-mechanikai terhelését, mivel a szívmetszeteket vagy izometrikus húzóerőkkel 17, vagy lineáris auxotonikus terheléssel 18 terhelték. Ezek a szövetnyújtási módszerek számos szívgén elnyomását vagy az abnormális nyújtási válaszokkal kapcsolatos gének túltermelését eredményezték. Pitoulis és munkatársai19 kifejlesztettek egy dinamikus szívszelet-tenyésztő fürdőt a szívciklus rekonstrukciójához erőátalakító visszacsatolás és feszültséghajtások segítségével. Bár ez a rendszer pontosabb in vitro szívciklus-modellezést tesz lehetővé, a módszer összetettsége és alacsony áteresztőképessége korlátozza a rendszer alkalmazását. Laboratóriumunk nemrégiben kifejlesztett egy egyszerűsített tenyésztőrendszert, amely elektromos stimulációt és optimalizált táptalajt használ a sertés- és emberi szívszövet-metszetek életképességének fenntartására akár 6 napig20,21.
Jelen kéziratban egy olyan szívszövet-kultúra-modellt (CTCM) írunk le, amely sertésszív metszeteit használja fel, és humorális jeleket tartalmaz a szívciklus alatti háromdimenziós szívfiziológia és patofiziológiai feszülés felidézésére. Ez a CTCM a preklinikai gyógyszervizsgálatokhoz korábban soha nem látott szintre növelheti a preklinikai gyógyszerelőrejelzés pontosságát azáltal, hogy egy költséghatékony, közepes áteresztőképességű szívrendszert biztosít, amely utánozza az emlősök szívének fiziológiáját/patológiáját a preklinikai gyógyszerteszteléshez.
A hemodinamikai mechanikai jelek kritikus szerepet játszanak a szívizomsejtek működésének fenntartásában in vitro [22,23,24]. A jelenlegi kéziratban egy olyan CTCM-et fejlesztettünk ki (1a. ábra), amely képes utánozni a felnőtt szív környezetét azáltal, hogy fiziológiás frekvenciákon (1,2 Hz, 72 ütés percenként) elektromos és mechanikai stimulációt indukál. A diasztolé alatti túlzott szöveti nyúlás elkerülése érdekében egy 3D nyomtató eszközt használtunk a szövetméret 25%-os növelésére (1b. ábra). A C-PACE rendszer által indukált elektromos pacemakert úgy időzítettük, hogy a szisztolé előtt 100 ms-mal kezdődjön egy adatgyűjtő rendszer segítségével, hogy teljes mértékben reprodukálja a szívciklust. A szövettenyésztő rendszer egy programozható pneumatikus aktuátort (LB Engineering, Németország) használ egy rugalmas szilikon membrán ciklikus tágítására, ami a szívszeletek tágítását okozza a felső kamrában. A rendszert egy nyomásátalakítón keresztül egy külső levegővezetékhez csatlakoztattuk, ami lehetővé tette a nyomás (± 1 Hgmm) és az idő (± 1 ms) pontos beállítását (1c. ábra).
a Csatlakoztassa a szövetmetszetet a készülék tenyésztőkamrájában található 7 mm-es tartógyűrűhöz (kékkel jelölve). A tenyésztőkamrát egy vékony, rugalmas szilikonmembrán választja el a légkamrától. Helyezzen egy tömítést az egyes kamrák közé a szivárgások megakadályozása érdekében. Az eszköz fedele grafitelektródákat tartalmaz, amelyek elektromos stimulációt biztosítanak. b A nagyméretű szöveteszköz, a vezetőgyűrű és a tartógyűrű sematikus ábrázolása. A szövetmetszeteket (barna) a túlméretezett eszközre helyezzük, a vezetőgyűrűt pedig a készülék külső szélén található horonyba helyezzük. A vezető segítségével óvatosan helyezzük a szöveti akril ragasztóval bevont tartógyűrűt a szívszövet-darabra. c Grafikon, amely az elektromos stimuláció idejét mutatja a légkamra nyomásának függvényében, amelyet egy programozható pneumatikus aktuátor (PPD) vezérel. Egy adatgyűjtő eszközt használtunk az elektromos stimuláció szinkronizálására nyomásérzékelők segítségével. Amikor a tenyésztőkamrában a nyomás eléri a beállított küszöbértéket, impulzusjelet küldünk a C-PACE-EM-nek az elektromos stimuláció kiváltásához. d Négy CTCM képe egy inkubátorpolcon. Négy eszköz egy pneumatikus áramkörön keresztül csatlakozik egy PPD-hez, és nyomásérzékelőket helyezünk a hemosztatikus szelepbe a pneumatikus körben lévő nyomás monitorozására. Minden eszköz hat szövetmetszetet tartalmaz.
Egyetlen pneumatikus aktuátorral 4 CTCM eszközt tudtunk vezérelni, amelyek mindegyike 6 szövetmetszetet tudott tárolni (1d. ábra). A CTCM során a légkamrában lévő légnyomás szinkronnyomássá alakul a folyadékkamrában, és a szívszelet fiziológiás tágulást idéz elő (2a. ábra és 1. kiegészítő film). A szövetnyújtás értékelése 80 mm Hg nyomáson. Az Art. a szövetmetszetek 25%-os megnyúlását mutatta (2b. ábra). Kimutatták, hogy ez a százalékos nyújtás 2,2–2,3 µm fiziológiás szarkomerhossznak felel meg a normál szívmetszet-kontraktilitás esetén17,19,25. A szövetmozgást egyedi kamerabeállításokkal értékeltük (1. kiegészítő ábra). A szövetmozgás amplitúdója és sebessége (2c., d. ábra) megfelelt a szívciklus alatti nyújtásnak, valamint a szisztolé és a diasztolé alatti időnek (2b. ábra). A szívszövet nyújtása és sebessége az összehúzódás és a relaxáció során 12 napig állandó maradt a tenyészetben (2f. ábra). Az elektromos stimuláció kontraktilitásra gyakorolt ​​hatásának értékeléséhez a tenyésztés során kidolgoztunk egy módszert az aktív deformitás meghatározására egy árnyékoló algoritmus segítségével (2a.,b. kiegészítő ábra), és képesek voltunk különbséget tenni az elektromos stimulációval és anélkül létrejövő deformitások között. A szív ugyanazon metszete (2f. ábra). A bemetszés mozgatható régiójában (R6-9) az elektromos stimuláció során a feszültség 20%-kal magasabb volt, mint elektromos stimuláció hiányában, ami az elektromos stimuláció hozzájárulását jelzi a kontraktilis funkcióhoz.
A légkamra nyomásának, a folyadékkamra nyomásának és a szövetmozgás méréseinek reprezentatív görbéi megerősítik, hogy a kamra nyomása megváltoztatja a folyadékkamra nyomását, ami a szövetszelet megfelelő mozgását okozza. b A szövetmetszetek százalékos nyúlásának (kék) reprezentatív görbéi a százalékos nyúlásnak (narancssárga) megfelelően. c A szívszelet mért mozgása összhangban van a mért mozgási sebességgel. (d) A ciklikus mozgás (kék vonal) és sebesség (narancssárga szaggatott vonal) reprezentatív pályái a szív egy szeletében. e A ciklusidő (n = 19 szelet csoportonként, különböző sertésekből), az összehúzódási idő (n = 19 szelet csoportonként), a relaxációs idő (n = 19 szelet csoportonként, különböző sertésekből), a szövetmozgás (n = 25 szelet)/csoport különböző sertésekből), a csúcs szisztolés sebesség (n = 24(D0), 25(D12) szelet/csoport különböző sertésekből) és a csúcs relaxációs sebesség (n = 24(D0), 25(D12) szelet/csoport különböző sertésekből) számszerűsítése. A kétoldalú Student-féle t-próba nem mutatott szignifikáns különbséget egyetlen paraméterben sem. f Reprezentatív törzsvizsgálati görbék szövetmetszetekből elektromos stimulációval (piros) és anélkül (kék), tíz regionális terület ugyanazon metszetből származó szövetmetszetekből. Az alsó panelek a törzs százalékos különbségének számszerűsítését mutatják elektromos stimulációval és anélküli szövetmetszetekben tíz különböző metszetből származó területen. (n = 8 szelet/csoport különböző sertésekből, kétoldalú Student t-próbát végeztünk; ****p < 0,0001, **p < 0,01, *p < 0,05). (n = 8 szelet/csoport különböző sertésekből, kétoldalú Student t-próbát végeztünk; ****p < 0,0001, **p < 0,01, *p < 0,05). (n = 8 срезов/группу от разных свиней, проводится двусторонний t-критерий Стьюдента; ****p<0,0001, **p<0,01,5). (n = 8 metszet/csoport különböző sertésekből, kétoldalú Student-féle t-próba; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05). （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p < 0,0001，**p < 0,01，*p < 0,01，*p （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p < 0,0001，**p < 0,01，*p < 0,01，*p (n = 8 срезов/группу, от разных свиней, двусторонний критерий Стьюдента; ****p <0,0001, **p <0,01, *p <0,05). (n = 8 metszet/csoport, különböző sertésekből, kétoldalú Student-féle t-próba; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05).A hibasávok az átlag ± szórást jelölik.
Korábbi statikus biomimetikus szívszelet-tenyésztő rendszerünkben [20, 21] 6 napig fenntartottuk a szívszeletek életképességét, működését és szerkezeti integritását elektromos stimuláció alkalmazásával és a táptalaj összetételének optimalizálásával. 10 nap elteltével azonban ezek az adatok meredeken csökkentek. A korábbi statikus biomimetikus táptalajrendszerünkben [20, 21] kontroll körülmények között (Ctrl) tenyésztett metszetekre fogunk hivatkozni, és a korábban optimalizált táptalajunkat fogjuk használni MC körülmények között és egyidejű mechanikai és elektromos stimuláció (CTCM) alatti tenyésztésként. Először megállapítottuk, hogy az elektromos stimuláció nélküli mechanikai stimuláció nem volt elegendő a szövetek életképességének 6 napig tartó fenntartásához (3a.,b. kiegészítő ábra). Érdekes módon, az STCM alkalmazásával végzett fizikomechanikai és elektromos stimuláció bevezetésével a 12 napos szívmetszetek életképessége megegyezett a friss szívmetszetekkel MS körülmények között, de nem Ctrl körülmények között, amint azt az MTT analízis is mutatja (1. ábra). 3a). Ez arra utal, hogy a mechanikai stimuláció és a szívciklus szimulációja kétszer olyan sokáig képes életképesnek tartani a szövetmetszeteket, mint a korábbi statikus táptalajrendszerünkben jelentették. A szövetmetszetek szerkezeti integritásának a szívizom troponin T és connexin 43 immunjelölésével történő értékelése azonban azt mutatta, hogy a connexin 43 expressziója szignifikánsan magasabb volt az MC szövetekben a 12. napon, mint a kontrollokban ugyanazon a napon. Az egyenletes connexin 43 expresszió és a Z-korong képződés azonban nem maradt teljes mértékben fenn (3b. ábra). Mesterséges intelligencia (MI) keretrendszert használunk a szövetek szerkezeti integritásának számszerűsítésére26, egy troponin-T és connexin festésen alapuló képalapú mélytanulási folyamatot43 a szívszeletek szerkezeti integritásának és fluoreszcenciájának automatikus számszerűsítésére a lokalizáció erőssége alapján. Ez a módszer konvolúciós neurális hálózatot (CNN) és egy mélytanulási keretrendszert használ a szívszövet szerkezeti integritásának megbízható számszerűsítésére automatizált és elfogulatlan módon, a hivatkozásban leírtak szerint26. Az MC szövet a 0. naphoz képest jobb szerkezeti hasonlóságot mutatott a statikus kontrollmetszetekhez képest. Ezenkívül a Masson-féle trikróm festés szignifikánsan alacsonyabb fibrózis százalékos arányát mutatta ki MS körülmények között a kontroll körülményekhez képest a tenyésztés 12. napján (3c. ábra). Míg a CTCM a szívszövet-metszetek életképességét a 12. napon a friss szívszövetéhez hasonló szintre növelte, a szívmetszetek szerkezeti integritását nem javította szignifikánsan.
Az oszlopdiagram a friss szívszeletek (D0) vagy a szívszelet-tenyészet 12 napig tartó életképességének számszerűsítését mutatja statikus tenyészetben (D12 Ctrl) vagy CTCM-ben (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) szelet/csoport különböző sertésekből, egyutas ANOVA tesztet végeztek; ####p < 0,0001 a D0-hoz képest és **p < 0,01 a D12 Ctrl-hez képest). Egy oszlopdiagram a friss szívszeletek (D0) vagy a szívszelet-tenyészet 12 napig tartó MTT életképességének számszerűsítését mutatja statikus tenyészetben (D12 Ctrl) vagy CTCM-ben (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) szelet/csoport különböző sertésekből, egyutas ANOVA tesztet végeztek; ####p < 0,0001 a D0-hoz képest és **p < 0,01 a D12 Ctrl-hez képest).A hisztogram az MTT friss szívmetszetek (D0) vagy a szívmetszetek 12 napig tartó statikus tenyészetben (D12 kontroll) vagy CTCM-ben (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 kontroll). ) , 12 (D12 MC) metszet/csoport különböző sertésekből, egyutas ANOVA tesztet végeztek;####p < 0,0001 по сравнению с D0 и **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p < 0,0001 a D0-hoz képest és **p < 0,01 a D12-höz képest (Ctrl). a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切片(D0)或心脏切片培养12 天的 活力的量化)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组葐，ANO进测试；与D0 相比，####p < 0,0001，与D12 Ctrl 相比，**p < 0,01). a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切片(D0) ，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；与D0 相比，####p < 与 1，####p < 0.0001D相比，**p.)hisztogram, amely az MTT életképességének mennyiségi meghatározását mutatja friss szívmetszetekben (D0) vagy 12 napig statikus tenyészetben (D12 kontroll) vagy CTCM-ben (D12 MC) tenyésztett szívmetszetekben (n = 18 (D0), 15 (D12 kontroll)), 12 (D12 MC) metszet/csoport különböző sertésekből, egyutas ANOVA teszt;####p < 0,0001 по сравнению с D0, **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p < 0,0001 a D0-hoz képest, **p < 0,01 a D12-höz képest (Ctrl).b Troponin-T (zöld), connexin 43 (piros) és DAPI (kék) frissen izolált szívmetszetekben (D0) vagy statikus körülmények között (Ctrl) vagy CTCM körülmények között (MC) 12 napig tenyésztett szívmetszetekben, reprezentatív immunfluoreszcens képeken (üres skála = 100 µm). A szívszövet szerkezeti integritásának mesterséges intelligencia általi kvantifikálása (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) szelet/csoport, mindegyik különböző sertésből, egyutas ANOVA tesztet végeztek; ####p < 0,0001 a D0-hoz képest és ****p < 0,0001 a D12 Ctrl-hez képest). A szívszövet szerkezeti integritásának mesterséges intelligencia általi kvantifikálása (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) szelet/csoport, mindegyik különböző sertésből, egyutas ANOVA tesztet végeztek; ####p < 0,0001 a D0-hoz képest és ****p < 0,0001 a D12 Ctrl-hez képest). Количественная оценка структурной целостности сердечной ткани искусственным интеллектом (n = 7 (D0), 7), (D12) D12 срезов/групп от разных свиней, проводится однофакторный тест ANOVA; D12 Ctrl). A szívizomszövet szerkezeti integritásának mennyiségi meghatározása mesterséges intelligenciával (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) metszet/csoport különböző sertésekből, egyutas ANOVA tesztet végeztünk; ####p < 0,0001 vs. D0 és ****p < 0,0001 a D12 Ctrl-hez képest).人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) szelet/csoport, mindegyik különböző sertésből, egyirányú ANOVA teszt <0###0p10;#.相比，****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）.人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) szelet/csoport különböző sertésekből, egyirányú ANOVA teszt 1#0###0p0;与D0相比，****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）. Искусственный интеллект для количественной оценки структурной целостности сердечной ткани (n = 7 (D0), 7 (D1) MC срезов/группу каждой из разных свиней, односторонний тест ANOVA. Mesterséges intelligencia a szívizomszövet szerkezeti integritásának számszerűsítésére (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) metszet/csoport különböző sertésekből, egyutas ANOVA teszt; ####p<0,0001 vs .D0 Összehasonlításképpen ****p < 0,0001 a D12 Ctrl-hez képest). c Reprezentatív képek (balra) és kvantifikáció (jobbra) Masson-féle trikróm festékkel festett szívszeletekhez (skálaköz = 500 µm) (n = 10 szelet/csoport, mindegyik különböző sertésből, egyutas ANOVA tesztet végeztek; ####p < 0,0001 a D0-hoz képest és ***p < 0,001 a D12 Ctrl-hez képest). c Reprezentatív képek (balra) és kvantifikáció (jobbra) Masson-féle trikróm festékkel festett szívszeletekhez (skálaköz = 500 µm) (n = 10 szelet/csoport, mindegyik különböző sertésből, egyutas ANOVA tesztet végeztek; #### p < 0,0001 a D0-hoz képest és ***p < 0,001 a D12 Ctrl-hez képest). c Репрезентативные изображения (слева) и количественная оценка (справа) срезов сердца, окрашенных трихром (масштаб без покрытия = 500 мкм) (n = 10 срезов/группу от разных свиней, выполняется односторонний ### p#VA; 0,0001 по сравнению с D0 и ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Reprezentatív képek (balra) és kvantifikáció (jobbra) a Masson-féle trikróm festékkel festett szívmetszetekről (bevonat nélküli pikkely = 500 µm) (n = 10 metszet/csoport különböző sertésekből, egyutas ANOVA tesztet végeztünk; #### p < 0,0001 a D0-hoz képest és ***p < 0,001 a D12 Ctrl-hez képest). c 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像（左）和量化（右）（裸尺0）（裸尺0） 10 个切片/组，每组来自不同的猪，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0,0001 与D0 似 与D0 相比 0.00相比）. C 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 （左 左） 量化 （右） 尸尦躸 尸尺度裸尺度 = 500 µm） （n = 10 个 切片 组 每 组 来自 不同 猪 ， 进行 单向 单向 单向 单 拑 单 拑 单向0,0001 与D0 相比，***p < 0,001 与D12 Ctrl 相比）. c Репрезентативные изображения (слева) и количественный анализ (справа) срезов сердца, окрашенных трихром (чистая шкала = 500 мкм) (n = 10 срезов/группа, каждый от другой свиньи, протестировано с помощью однофо дисперсионного анализа ;### #p < 0,0001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c A Masson-féle trikróm festékkel festett szívmetszetek reprezentatív képei (balra) és mennyiségi meghatározása (jobbra) (üres = 500 µm) (n = 10 metszet/csoport, mindegyik különböző sertésből, egyutas varianciaanalízissel tesztelve;### # p < 0,0001 a D0-hoz képest, ***p < 0,001 a D12 Ctrl-hez képest).A hibasávok az átlag ± szórást jelölik.
Azt feltételeztük, hogy kis molekulák hozzáadásával a tenyésztőközeghez javítható a szívizomsejtek integritása és csökkenthető a fibrózis kialakulása a CTCM tenyészet során. Ezért statikus kontrollkultúráinkkal20,21 szűrtük a kis molekulákat a zavaró tényezők kis száma miatt. A szűréshez dexametazont (Dex), trijód-tironint (T3) és SB431542-t (SB) választottuk. Ezeket a kis molekulákat korábban már alkalmazták hiPSC-CM tenyészetekben a szívizomsejtek érésének indukálására a szarkomer hosszának, a T-tubulusoknak és a vezetési sebességnek a növelésével. Ezenkívül mind a Dex (egy glükokortikoid), mind az SB ismerten gátolja a gyulladást29,30. Ezért teszteltük, hogy ezen kis molekulák egyikének vagy kombinációjának beépítése javítja-e a szívmetszetek szerkezeti integritását. A kezdeti szűréshez az egyes vegyületek dózisát a sejtkultúra-modellekben általánosan használt koncentrációk alapján választottuk ki (1 μM Dex27, 100 nM T327 és 2,5 μM SB31). 12 napos tenyésztés után a T3 és a Dex kombinációja optimális kardiomiocita szerkezeti integritást és minimális rostos átépülést eredményezett (4. és 5. kiegészítő ábra). Ezenkívül a T3 és a Dex ezen koncentrációinak kétszeresének vagy duplájának alkalmazása káros hatásokat okozott a normál koncentrációkhoz képest (6a. és b. kiegészítő ábra).
A kezdeti szűrés után 4 tenyésztési körülmény összehasonlítását végeztük el (4a. ábra): Ctrl: szívmetszetek, amelyeket korábban leírt statikus tenyészetünkben tenyésztettünk optimalizált táptalajon; 20.21 TD: T3 és Ctrl s, szerdán Dex-szel kiegészítve; MC: szívmetszetek, amelyeket CTCM-ben tenyésztettünk korábban optimalizált táptalajon; és MT: CTCM, amelyhez T3-at és Dex-et adtunk. 12 napos tenyésztés után az MS és MT szövetek életképessége megegyezett a friss szövetekével, amelyeket MTT vizsgálattal értékeltünk (4b. ábra). Érdekes módon a T3 és Dex hozzáadása a transzwell tenyészetekhez (TD) nem eredményezett szignifikáns javulást az életképességben a Ctrl körülményekhez képest, ami a mechanikai stimuláció fontos szerepét jelzi a szívmetszetek életképességének fenntartásában.
Kísérleti tervdiagram, amely a négy tenyésztési körülményt ábrázolja, amelyeket a mechanikai stimuláció és a T3/Dex kiegészítés 12 napig tartó táptalajon kifejtett hatásainak értékelésére használtak. b Az oszlopdiagram a tenyésztés utáni 12. napon az életképesség mennyiségi meghatározását mutatja mind a 4 tenyésztési körülmény (kontroll, TD, MC és MT) mellett a friss szívszeletekhez (D0) képest (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD és D12 MT), 12 (D12 MC) szelet/csoport különböző sertésekből, egyutas ANOVA tesztet végeztek; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 a D0-hoz képest és **p < 0,01 a D12 Ctrl-hez képest). b Az oszlopdiagram a tenyésztés utáni 12. napon mért életképesség mennyiségi meghatározását mutatja mind a 4 tenyésztési körülmény (kontroll, TD, MC és MT) mellett, friss szívszeletekhez (D0) képest (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD és D12 MT), 12 (D12 MC) szelet/csoport különböző sertésekből, egyutas ANOVA tesztet végeztek; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 a D0-hoz képest és **p < 0,01 a D12 kontrollhoz képest). b Гистограмма показывает количественную оценку жизнеспособности через 12 дней после культивирования во4 культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TDMT1), D12 TDMT срезов/группу от разных свиней, проводится односторонний тест ANOVA; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 по сравнению с D0 и **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). b Az oszlopdiagram a tenyésztés utáni 12. napon az életképesség számszerűsítését mutatja mind a 4 tenyésztési körülmény között (kontroll, TD, MC és MT) a friss szívmetszetekhez (D0) képest (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD és D12 MT), 12 (D12 MC) metszet/csoport különböző sertésekből, egyutas ANOVA teszt; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 vs. D0 és **p < 0,01 a D12 Ctrl-hez képest). b 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片、、』切片、ぁD12D12D10)和D12 MT)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；####p < 0.0001，##00p1 < 0.##00p1相比，**p < 0,01 与D12控制）.b 4 12 (D12 MC) b Гистограмма, показывающая все 4 условия культивирования (контроль, TD, MC és MT) по сравнению со свежими со свежими срез0 срезадща 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD és D12 MT), от разных свиней 12 (D12 MC) срезы/группа, односторонний тест ANOVA, ####p <0, ####p <0, о сравнению с D0, **p <0,01 по сравнению с контролем D12). b Hisztogram, amely mind a 4 tenyésztési körülményt (kontroll, TD, MC és MT) mutatja friss szívmetszetekhez (D0) képest (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD és D12 MT), különböző sertésekből, 12 (D12 MC) metszet/csoport, egyutas ANOVA teszt; ####p<0,0001, ###p<0,001 vs. D0, **p<0,01 vs. kontroll D12). c Az oszlopdiagram a glükózfluxus mennyiségi meghatározását mutatja a tenyésztés után 12 nappal mind a 4 tenyésztési körülmény között (Control, TD, MC és MT) a friss szívszeletekhez (D0) képest (n = 6 szelet/csoport különböző sertésekből, egyutas ANOVA tesztet végeztek; ###p < 0,001, a D0-hoz képest és ***p < 0,001 a D12 Ctrl-hez képest). c Az oszlopdiagram a glükózfluxus mennyiségi meghatározását mutatja a tenyésztés után 12 nappal mind a 4 tenyésztési körülmény között (Control, TD, MC és MT) a friss szívszeletekhez (D0) képest (n = 6 szelet/csoport különböző sertésekből, egyutas ANOVA tesztet végeztek; ###p < 0,001, a D0-hoz képest és ***p < 0,001 a D12 Ctrl-hez képest). c Гистограмма показывает количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после культивирования во 4 всухло культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 6 срезов/группу от развиных от разнению односторонний Выполняется тест ANOVA; ###p < 0,001 по сравнению с D0 и ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c A hisztogram a glükózfluxus mennyiségi meghatározását mutatja a tenyésztés után 12 nappal mind a 4 tenyésztési körülmény között (kontroll, TD, MC és MT) a friss szívmetszetekhez (D0) képest (n = 6 metszet/csoport különböző sertésekből, egyutas ANOVA tesztet végeztek; ###p < 0,001 a D0-hoz képest és ***p < 0,001 a D12 Ctrl-hez képest). c 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) 相掐12，天的葡萄糖通量定量（n = 6 片/组，来自不同猪，单向执行ANOVA 测试；###p <0.0丸D <0.相比，***p < 0,001 与D12 Ctrl 相比）. C 条形图 显示 所有 4 种 条件 （（ctrl 、 td 、 mc 和 mt） 新鲜 心脏 切片 切片 切片 切片培养 后 后 12 天 的 通量 定量 （n = 6 片/组 ， 来自 猪 , ， 的 , ， ， ，猪单向执行ANOVA 测试；###p < 0,001，与D0 相比，***p < 0,001 与D12 Ctrl 相比）. c Гистограмма, показывающая количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после кулививирования культивирования (контроль, TD, MC és MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 6 срезов/группа, от раз свиней, односторонний Были проведены тесты ANOVA; ###p < 0,001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению с D12 (контроль). c Hisztogram, amely a glükózfluxus mennyiségi meghatározását mutatja a tenyésztés utáni 12. napon mind a 4 tenyésztési körülmény (kontroll, TD, MC és MT) esetén a friss szívmetszetekhez (D0) képest (n = 6 metszet/csoport, különböző sertésekből, egyoldali). WRE ANOVA teszteket végeztek, ###p < 0,001 a D0-hoz képest, ***p < 0,001 a D12-höz képest (kontroll).d Friss (kék), 12. napos MC (zöld) és 12. napos MT (piros) szövetek törzsanalízis diagramjai tíz regionális szövetmetszeti ponton (n = 4 szelet/csoport, egyutas ANOVA teszt; nem volt szignifikáns különbség a csoportok között). e Vulkán diagram, amely a friss szívmetszetekben (D0) eltérően expresszált géneket mutatja a statikus körülmények között (Ctrl) vagy MT körülmények között (MT) 10-12 napig tenyésztett szívmetszetekhez képest. f Az egyes tenyésztési körülmények között tenyésztett szívmetszetek szarkomer génjeinek hőtérképe. A hibasávok az átlagot ± szórást jelölik.
A zsírsav-oxidációról a glikolízisre való átállástól való metabolikus függőség a szívizomsejtek dedifferenciálódásának egyik jellemzője. Az éretlen szívizomsejtek elsősorban glükózt használnak ATP-termeléshez, és hipoplasztikus mitokondriumokkal rendelkeznek, kevés crista-val5,32. A glükóz-hasznosítási elemzések azt mutatták, hogy MC és MT körülmények között a glükóz-hasznosítás hasonló volt a 0. napi szövetekben tapasztaltakhoz (4c. ábra). A Ctrl minták azonban szignifikánsan megnövekedett glükóz-hasznosítást mutattak a friss szövethez képest. Ez azt jelzi, hogy a CTCM és a T3/Dex kombinációja fokozza a szövetek életképességét és megőrzi a 12 napos tenyésztett szívmetszetek metabolikus fenotípusát. Ezenkívül a törzselemzés kimutatta, hogy a törzsszintek 12 napig ugyanazok maradtak, mint a friss szívszövetben MT és MS körülmények között (4d. ábra).
A CTCM és a T3/Dex szívizomszövet globális transzkripciós tájképére gyakorolt ​​teljes hatásának elemzéséhez RNS-szekvenálást végeztünk mind a négy különböző tenyésztési körülményből származó szívizomszeleteken (1. kiegészítő adat). Érdekes módon az MT-szekciók magas transzkripciós hasonlóságot mutattak a friss szívszövettel, a 13 642 génből csak 16 expresszálódott eltérően. Azonban, ahogy korábban bemutattuk, a Ctrl-szeletek 10-12 napos tenyészet után 1229 eltérően expresszált gént mutattak (4e. ábra). Ezeket az adatokat a szív- és fibroblasztgének qRT-PCR-je megerősítette (7a-c. kiegészítő ábra). Érdekes módon a Ctrl-szekciók a szív- és sejtciklusgének szabályozásának csökkenését és a gyulladásos génprogramok aktiválódását mutatták. Ezek az adatok arra utalnak, hogy a dedifferenciálódás, amely általában hosszú távú tenyésztés után következik be, MT-körülmények között teljesen csökken (8a.,b. kiegészítő ábra). A szarkomer gének gondos vizsgálata kimutatta, hogy csak MT körülmények között konzerválódnak a szarkomert (4f. ábra) és az ioncsatornát (9. kiegészítő ábra) kódoló gének, megvédve őket a Ctrl, TD és MC körülmények között bekövetkező elnyomástól. Ezek az adatok azt mutatják, hogy mechanikai és humorális stimuláció (T3/Dex) kombinációjával a szívszelet transzkriptomja 12 napos tenyészet után is hasonló maradhat a friss szívszeletekhez.
Ezeket a transzkripciós eredményeket alátámasztja az a tény, hogy a szívmetszetekben a kardiomiociták szerkezeti integritása MT körülmények között őrződik meg legjobban 12 napig, amint azt az ép és lokalizált connexin 43 is mutatja (5a. ábra). Ezenkívül a szívmetszetekben MT körülmények között a fibrózis szignifikánsan csökkent a Ctrl-hez képest, és hasonló volt a friss szívmetszetekhez (5b. ábra). Ezek az adatok azt mutatják, hogy a mechanikai stimuláció és a T3/Dex kezelés kombinációja hatékonyan megőrzi a szív szerkezetét a tenyészetben lévő szívmetszetekben.
a A troponin-T (zöld), a connexin 43 (piros) és a DAPI (kék) reprezentatív immunfluoreszcens képei frissen izolált szívmetszetekben (D0) vagy 12 napig mind a négy szívmetszet-tenyésztési körülmény között tenyésztve (skála = 100 µm). ). A szívszövet szerkezeti integritásának mesterséges intelligencia általi kvantifikálása (n = 7 (D0 és D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC és D12 MT) szelet/csoport különböző sertésekből, egyutas ANOVA tesztet végeztek; ####p < 0,0001 a D0-hoz képest és *p < 0,05, vagy ****p < 0,0001 a D12 Ctrl-hez képest). A szívszövet szerkezeti integritásának mesterséges intelligencia általi kvantifikálása (n = 7 (D0 és D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC és D12 MT) szelet/csoport különböző sertésekből, egyutas ANOVA tesztet végeztek; #### p < 0,0001 a D0-hoz képest és *p < 0,05, vagy ****p < 0,0001 a D12 Ctrl-hez képest). Количественная оценка структурной целостности ткани сердца с помощью искусственного интеллекта (n = 71,2D10), D12 MC és D12 MT) срезов/группу от разных свиней, проведен однофакторный тест ANOVA #### p < 0,0001 по сравне, инию сравне; ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). A szívszövet szerkezeti integritásának számszerűsítése mesterséges intelligencia segítségével (n = 7 (D0 és D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC és D12 MT) metszet/csoport különböző sertésekből, egyutas ANOVA tesztet végeztek; #### p < 0,0001 a D0-hoz képest és *p < 0,05 vagy ****p < 0,0001 a D12 Ctrl-hez képest).对不同猪的心脏组织结构完整性（n = 7（D0 和D12 Ctrl）、5（D12 TD、D12 MC 和D12 MT）切片/组）进行人工智能量化，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0,0001 与D0 和*盌渎済0*pp. 0,0001 与D12 Ctrl 相比）.对 不同 猪 的 心脏 结构 完整性 (n = 7 （d0 和 d12 ctrl） （5 （d12 td 、 d12（d12 mc人工 智能量 化 进行 单向 单向 单向 测试 ； ########## p < 0,0001 与D0 和*p < 0,05 0,0001 与D12 Ctrl 相比）.A szívizomszövet szerkezeti integritásának mennyiségi meghatározása mesterséges intelligencia segítségével különböző sertésekben (n = 7 (0. és 12. nap Ctrl), 5 (12. nap TD, 12. nap MC és 12. nap MT) szekció/csoport) egyutas ANOVA teszttel;#### p < 0,0001 по сравнению с D0 и *p < 0,05 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). #### p < 0,0001 a D0-hoz képest és *p < 0,05 vagy ****p < 0,0001 a D12-höz képest (Ctrl). b Reprezentatív képek és kvantifikáció Masson-féle trikróm festékkel festett szívszeletekhez (lépték = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD és D12 MC), 9 (D12 MT) szelet/csoport különböző sertésekből, egyutas ANOVA tesztet végeztek; ####p < 0,0001 a D0-hoz képest és ***p < 0,001, vagy ****p < 0,0001 a D12 Ctrl-hez képest). b Reprezentatív képek és kvantifikáció Masson-féle trikróm festékkel festett szívszeletekhez (lépték = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD és D12 MC), 9 (D12 MT) szelet/csoport különböző sertésekből, egyutas ANOVA tesztet végeztek; ####p < 0,0001 a D0-hoz képest és ***p < 0,001, vagy ****p < 0,0001 a D12 Ctrl-hez képest). b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромным красителеным красителенная линейка = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD és D12 MC), 9 (D12 MT) срезов/группу от разных свиней, выпоялннияйсностостояннияетс; ####p < 0,0001 по сравнению с D0 и ***p < 0,001 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). b Masson-féle trikróm festékkel festett szívmetszetek reprezentatív képei és mennyiségi meghatározása (skála = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD és D12 MC), 9 (D12 MT) metszet/csoport különböző sertésekből, egyutas ANOVA-t végeztünk; ####p < 0,0001 vs. D0 és ***p < 0,001 vagy ****p < 0,0001 vs. D12 Ctrl). b 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像和量化（比例尺= 500 µm（D01（n Ctrl、D12 TD 和D12 MC），来自不同猪的9 个（D12 MT）切片/组，进行单因素方囌单因素方差10#0###p与D0 相比，***p < 0,001，或****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）. b 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 和 量化 （比例 尺 尺 尺 = 500 µ0 n（0 、 d12 ctrl 、 d12 td 和 d12 mc） 来自 不同 的 9 个 d12 mt 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 组，进行单因素方差分析；###.相比，***p <0,001，或****p <0,0001 与D12 Ctrl 相比）. b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромом = Масссона (тил500ромом Масссона мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD és D12 MC), 9 (D12 MT) срезов от разных свиней / группы, один- способ ANOVA <енес, 0#0p01 с D0, ***p < 0,001 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). b Masson-féle trikrómmal festett szívmetszetek reprezentatív képei és kvantifikációja (skála = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD és D12 MC), 9 (D12 MT) metszet különböző sertésekből/csoportból, egy ANOVA módszer; ####p < 0,0001 a D0-hoz képest, ***p < 0,001 vagy ****p < 0,0001 a D12 Ctrl-hez képest).A hibasávok az átlag ± szórást jelölik.
Végül a CTCM szívizom-hypertrófia utánzó képességét a szívizomszövet nyújtásának növelésével értékelték. CTCM-ben a légkamra csúcsnyomása 80 Hgmm-ről 80 Hgmm-re emelkedett. Art. (normál nyújtás) 140 Hgmm-ig Art. (6a. ábra). Ez a nyújtás 32%-os növekedésének felel meg (6b. ábra), amelyet korábban a hipertrófia esetén megfigyelthez hasonló szarkomerhossz eléréséhez szükséges százalékos nyújtásként mutattak ki. A szívizomszövet nyújtása és sebessége az összehúzódás és relaxáció során állandó maradt a tenyésztés hat napja alatt (6c. ábra). Az MT körülmények között kapott szívszövetet normál nyújtásnak (MT (normál)) vagy túlzott nyújtásnak (MT (OS)) vetették alá hat napig. Már négy nap tenyésztés után a hipertrófiás NT-ProBNP biomarker szignifikánsan emelkedett volt a táptalajban MT (OS) körülmények között az MT (normál) körülményekhez képest (7a. ábra). Ezenkívül hat nap tenyésztés után az MT (OS) sejtek mérete (7b. ábra) szignifikánsan megnőtt az MT szívmetszetekhez (normál) képest. Ezenkívül az NFATC4 nukleáris transzlokációja szignifikánsan megnövekedett a túlnyújtott szövetekben (7c. ábra). Ezek az eredmények a hiperdisztenzió utáni patológiás átrendeződés progresszív fejlődését mutatják, és alátámasztják azt az elképzelést, hogy a CTCM eszköz platformként használható a nyújtás által kiváltott szívizom-megnagyobbodás jelátvitelének vizsgálatára.
A légkamra nyomásának, a folyadékkamra nyomásának és a szövetmozgás méréseinek reprezentatív görbéi megerősítik, hogy a kamra nyomása megváltoztatja a folyadékkamra nyomását, ami a szövetszelet megfelelő mozgását okozza. b Reprezentatív nyújtási százalékos és nyújtási sebesség görbék a normálisan nyújtott (narancssárga) és túlnyújtott (kék) szövetmetszetekhez. c Oszlopdiagram, amely a ciklusidőt (n = 19 szelet csoportonként, különböző sertésekből), az összehúzódási időt (n = 18-19 szelet csoportonként, különböző sertésekből), a relaxációs időt (n = 19 szelet csoportonként, különböző sertésekből)), a szövetmozgás amplitúdóját (n = 14 szelet/csoport, különböző sertésekből), a csúcs szisztolés sebességet (n = 14 szelet/csoport, különböző sertésekből) és a csúcs relaxációs sebességet (n = 14 (D0), 15 (D6)) metszetek/csoportok) különböző sertésekből mutatja. A kétoldali Student-féle t-próba nem mutatott szignifikáns különbséget egyetlen paraméterben sem, ami azt jelzi, hogy ezek a paraméterek állandóak maradtak a túlfeszültséggel végzett tenyésztés 6 napja alatt. A hibasávok az átlagot ± szórást jelölik.
Az NT-ProBNP koncentrációjának oszlopdiagramos kvantifikációja MT normál nyújtással (Norm) vagy túlnyújtással (OS) tenyésztett szívszeletek táptalajában (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm és D4 MTOS) szelet/csoport különböző sertésekből, kétutas ANOVA-t végeztünk; **p < 0,01 a normál nyújtáshoz képest). Az NT-ProBNP koncentrációjának oszlopdiagramos kvantifikációja MT normál nyújtással (Norm) vagy túlnyújtással (OS) tenyésztett szívszeletek táptalajában (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm és D4 MTOS) szelet/csoport különböző sertésekből, kétutas ANOVA-t végeztünk; **p < 0,01 a normál nyújtáshoz képest).Az NT-ProBNP koncentrációjának kvantitatív hisztogramja normál MT-nyújtás (normális) vagy túlnyújtás (OS) körülményei között tenyésztett szívszeletek táptalajában (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm és D4).MTOS) szelet/csoport különböző sertésekből, kétfaktoros varianciaanalízist végeztek;**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p < 0,01 a normál nyújtáshoz képest). a 在MT 正常拉伸(Norm) 或过度拉伸(OS) 条件下培养的心脏切片培养基中NT-ProBNP浓度的条形图量化（n = 4 (D2 MTNorm)、3（D2 MTOS、D4 MTNorm 和D4 MTOS）来自不同猪的切片/组，进行双向方差分析；**与正常拉伸相比，p < 0,01). az NT-ProBNP koncentrációjának mennyiségi meghatározása MT normál nyújtás (Norm) vagy overstretch (OS) körülmények között tenyésztett szívszeletekben (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm和D4 MTOS) különböző猪的切片/组，可以双向方方发发动 **összehasonlítva a normál nyújtással, p < 0,01).hisztogram Az NT-ProBNP koncentrációk mennyiségi meghatározása normál MT-nyújtás (norm) vagy túlnyújtás (OS) körülményei között tenyésztett szívszeletekben (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm) és D4 MTOS) szelet/csoport különböző sertésekből, kétutas varianciaanalízis;**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p < 0,01 a normál nyújtáshoz képest). b Reprezentatív képek troponin-T-vel és WGA-val festett szívszeletekről (balra), valamint sejtméret-kvantifikációról (jobbra) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) sejt/csoport 10 különböző szeletből, különböző sertésekből, kétoldalú Student t-próbát végeztek; ****p < 0,0001 a normál nyújtáshoz képest). b Reprezentatív képek troponin-T-vel és WGA-val festett szívszeletekről (balra), valamint sejtméret-kvantifikációról (jobbra) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) sejt/csoport 10 különböző szeletből, különböző sertésekből, kétoldalú Student t-próbát végeztek; ****p < 0,0001 a normál nyújtáshoz képest). b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слева) и количественипенного клеток (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) клеток/группу из 10 разных срезов от разных свиней, два- тсровоя хвостовой t-критерий Стьюдента; ****p < 0,0001 по сравнению с нормальным растяжением). b Troponin-T-vel és AZP-vel festett szívmetszetek (balra), valamint sejtméret-kvantifikáció (jobbra) reprezentatív képei (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) sejt/csoport 10 különböző metszetből, különböző sertésekből, kétoldalú Student-féle t-próbát végeztek; ****p < 0,0001 a normál törzshöz képest). b 用肌钙蛋白-T 和WGA（左）和细胞大小量化（右）染色的心脏切片的代脏切片的代表揃330DL MTOS），来自不同猪的10 个不同切片的369（D6 MTNorm）细胞/组，两进行有尾t学甦 检验；与正常拉伸相比，****p < 0,0001）. b A calcarein-T-vel és WGA-val festett szívszeletek reprezentatív képei (balra), valamint a sejtméret (jobbra) (n = 330 (D6 MTOS), 369 10 különböző szeletből (D6 MTNorm)) Sejtek/sejtszám, t teszt; normál nyújtással összehasonlítva, ****p < 0,0001). b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слева) и колкичестверанкая (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) из 10 различных срезов от разных свиней Клетки/группа, двутрийстороней Стьюдента; ****p < 0,0001 по сравнению с нормальным растяжением). b Troponin-T-vel és AZP-vel festett szívmetszetek reprezentatív képei (balra), valamint a sejtek méretének kvantifikálása (jobbra) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) 10 különböző metszetből különböző sertésekből) Sejtek/csoport, kétoldalú kritérium Student-féle t; ****p < 0,0001 a normál törzshöz képest). c Reprezentatív képek a 0. és 6. napi troponin-T-re és NFATC4-re immunjelölt MTOS szívszeletekről, valamint az NFATC4 CM-ek magjaiba történő transzlokációjának mennyiségi meghatározása (n = 4 (0. nap), 3 (6. nap MTOS) szelet/csoport különböző sertésekből, kétoldalú Student t-tesztet végeztek; *p < 0,05). c Reprezentatív képek a 0. és 6. napi troponin-T-re és NFATC4-re immunjelölt MTOS szívszeletekről, valamint az NFATC4 CM-ek magjaiba történő transzlokációjának mennyiségi meghatározása (n = 4 (0. nap), 3 (6. nap MTOS) szelet/csoport különböző sertésekből, kétoldali Student t-tesztet végeztünk; *p < 0,05). c Репрезентативные изображения для срезов сердца 0 и 6 дней MTOS, иммуномеченых для тропонина-Т и NFATC4, чяекола оценка транслокации NFATC4 в ядра кавернозных клеток (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срезов/группу от разных свинетпля , , двусторонний t-критерий Стьюдента; *p < 0,05). c Reprezentatív képek a szívmetszetekről a 0. és 6. napon, troponin-T-re és NFATC4-re immunjelöltként, valamint az NFATC4 transzlokációjának kvantifikálása a kavernózus sejtek magjában (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) szelet/csoport különböző sertésekből) kétoldalú Student-féle t-próbával; *p < 0,05). c 用于肌钙蛋白-T 和NFATC4 免疫标记的第0 天和第6 天MTOS心脏切片的代表性图像，以及来自不同猪的NFATC4 易位至CM 细マ核的量化 MT 4（0Dn)切片/组, 进行双尾学生t 检验；*p < 0,05). c Reprezentatív képek a calcanin-T és az NFATC4 immunjelölő 第0天和第6天MTOS szívszeletekről, valamint az NFATC4 különböző NFATC4 易位至CM sejtmagból的quantity化 (n = 4 (D0), 焤6, 焤 3, D时间双尾学生et 电影；*p < 0,05). c Репрезентативные изображения срезов сердца MTOS на 0 и 6 день для иммуномаркировки тропоницом-Т és NFATC4 транслокации NFATC4 в ядра CM от разных свиней (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срез/группа, два- хвостатый t-критьюй * Свиней; 0,05). c MTOS szívszeletek reprezentatív képei a 0. és 6. napon troponin-T és NFATC4 immunjelöléshez, valamint az NFATC4 transzlokációjának kvantifikálásához különböző sertésekből származó CM magjában (n = 4 (0. nap), 3 (6. nap MTOS) szelet/csoport, kétoldalú t-kritérium Student-féle; *p < 0,05).A hibasávok az átlag ± szórást jelentik.
A transzlációs kardiovaszkuláris kutatásokhoz olyan sejtmodellekre van szükség, amelyek pontosan reprodukálják a szív környezetét. Ebben a tanulmányban egy CTCM eszközt fejlesztettek ki és jellemeztek, amely képes stimulálni a szív ultravékony metszeteit. A CTCM rendszer fiziológiásan szinkronizált elektromechanikus stimulációt, valamint T3 és Dex folyadékdúsítást tartalmaz. Amikor a sertésszívmetszeteket ezeknek a faktoroknak tették ki, életképességük, szerkezeti integritásuk, metabolikus aktivitásuk és transzkripciós expressziójuk 12 napos tenyésztés után is változatlan maradt, mint a friss szívszövetben. Ezenkívül a szívszövet túlzott nyújtása a hiperextenzió okozta szívhipertrófiát okozhat. Összességében ezek az eredmények alátámasztják a fiziológiás tenyésztési körülmények kritikus szerepét a normális szívfenotípus fenntartásában, és platformot biztosítanak a gyógyszerszűréshez.
Számos tényező járul hozzá a szívizomsejtek működéséhez és túléléséhez optimális környezet megteremtéséhez. Ezek közül a legnyilvánvalóbbak az (1) intercelluláris interakciókhoz, (2) elektromechanikai stimulációhoz, (3) humorális faktorokhoz és (4) metabolikus szubsztrátokhoz kapcsolódnak. A fiziológiai sejt-sejt interakciókhoz több sejttípus komplex, háromdimenziós hálózataira van szükség, amelyeket egy extracelluláris mátrix támogat. Az ilyen komplex sejtes interakciókat nehéz in vitro rekonstruálni az egyes sejttípusok együttes tenyésztésével, de a szívmetszetek organotípusos jellegének felhasználásával könnyen elérhetők.
A szívizomsejtek mechanikai nyújtása és elektromos stimulációja kritikus fontosságú a szív fenotípusának fenntartásához33,34,35. Míg a mechanikai stimulációt széles körben alkalmazzák a hiPSC-CM kondicionálására és érlelésére, számos elegáns tanulmány kísérelte meg a szívszeletek mechanikai stimulálását tenyészetben egytengelyű terheléssel. Ezek a tanulmányok azt mutatják, hogy a 2D egytengelyű mechanikai terhelés pozitív hatással van a szív fenotípusára a tenyésztés során. Ezekben a vizsgálatokban a szív metszeteit vagy izometrikus húzóerőkkel17,18 lineáris auxotóniás terheléssel terhelték, vagy a szívciklust erőátalakító visszacsatolással és feszültséghajtásokkal rekonstruálták. Ezek a módszerek azonban egytengelyű szövetnyújtást alkalmaznak környezeti optimalizálás nélkül, ami számos szívgén elnyomásához vagy a rendellenes nyújtási válaszokkal összefüggő gének túltermeléséhez vezet. Az itt leírt CTCM egy 3D elektromechanikus ingert biztosít, amely a ciklusidő és a fiziológiai nyújtás tekintetében utánozza a természetes szívciklust (25% nyújtás, 40% szisztolé, 60% diasztolé és 72 ütés percenként). Bár ez a háromdimenziós mechanikai stimuláció önmagában nem elegendő a szövetek integritásának fenntartásához, a humorális és mechanikai stimuláció kombinációja T3/Dex alkalmazásával szükséges a szövetek életképességének, működésének és integritásának megfelelő fenntartásához.
A humorális faktorok fontos szerepet játszanak a felnőtt szív fenotípusának modulálásában. Ezt kiemelték a HiPS-CM vizsgálatok, amelyekben T3-at és Dex-et adtak a táptalajhoz a sejtek érésének felgyorsítása érdekében. A T3 befolyásolhatja az aminosavak, cukrok és kalcium transzportját a sejtmembránokon keresztül36. Ezenkívül a T3 elősegíti az MHC-α expresszióját és az MHC-β szabályozásának csökkenését, elősegítve a gyors összehúzódású miofibrillák kialakulását az érett szívizomsejtekben a lassú összehúzódású miofibrillákhoz képest a magzati CM-ben. A T3-hiány a hipotireózisban szenvedő betegeknél a miofibrilláris sávok elvesztését és a tónusfejlődés csökkenését eredményezi37. A Dex a glükokortikoid receptorokra hat, és kimutatták, hogy növeli a szívizom összehúzódási képességét izolált, perfundált szívekben;38 ezt a javulást a kalciumlerakódás által vezérelt bejutásra (SOCE) gyakorolt ​​hatásnak39,40 tulajdonítják. Ezenkívül a Dex kötődik receptoraihoz, széles intracelluláris választ okozva, amely elnyomja az immunfunkciót és a gyulladást30.
Eredményeink azt mutatják, hogy a fizikai mechanikai stimuláció (MS) javította az általános tenyészet teljesítményét a Ctrl-hez képest, de nem tudta fenntartani az életképességet, a szerkezeti integritást és a szívizom expresszióját 12 napos tenyészetben. A Ctrl-hez képest a T3 és a Dex hozzáadása a CTCM (MT) tenyészetekhez javította az életképességet, és hasonló transzkripciós profilokat, szerkezeti integritást és metabolikus aktivitást tartott fenn friss szívszövettel 12 napig. Ezenkívül a szövetnyújtás mértékének szabályozásával egy hiperextenzió által kiváltott szívizom-hipertrófia modellt hoztak létre STCM segítségével, amely az STCM rendszer sokoldalúságát illusztrálja. Meg kell jegyezni, hogy bár a szívizom átalakulása és a fibrózis általában ép szerveket érint, amelyek keringő sejtjei biztosítják a megfelelő citokineket, valamint a fagocitózist és más átalakulási faktorokat, a szív egyes szakaszai továbbra is képesek utánozni a fibrotikus folyamatot stresszre és traumára adott válaszként. Ezt korábban már értékelték ebben a szívszelet-modellben. Meg kell jegyezni, hogy a CTCM paraméterei modulálhatók a nyomás/elektromos amplitúdó és frekvencia változtatásával, hogy számos állapotot szimuláljanak, például tachycardiát, bradycardiát és mechanikus keringéstámogatást (mechanikusan terheletlen szív). Ez közepes áteresztőképességűvé teszi a rendszert a gyógyszerteszteléshez. A CTCM túlterhelés által kiváltott szívizom-megnagyobbodás modellezésére való képessége utat nyit a rendszer személyre szabott terápiában való tesztelése előtt. Összefoglalva, a jelen tanulmány azt bizonyítja, hogy a mechanikai nyújtás és a humorális stimuláció kritikus fontosságú a szívizomszövet-metszetek kultúrájának fenntartásához.
Bár az itt bemutatott adatok arra utalnak, hogy a CTCM egy nagyon ígéretes platform az ép szívizom modellezésére, ennek a tenyésztési módszernek vannak korlátai. A CTCM tenyésztés fő korlátja, hogy folyamatos dinamikus mechanikai feszültséget gyakorol a szeletekre, ami kizárja a szívizom-összehúzódások aktív monitorozásának lehetőségét minden ciklus során. Ezenkívül a szívmetszetek kis mérete (7 mm) miatt a szisztolés funkció értékelésének lehetősége a tenyésztőrendszereken kívül, hagyományos erőérzékelőkkel, korlátozott. A jelenlegi kéziratban ezt a korlátozást részben leküzdjük az optikai feszültség, mint a kontraktilis funkció indikátorának értékelésével. Ez a korlátozás azonban további munkát igényel, és a jövőben megoldható a szívizom-szeletek funkciójának optikai monitorozására szolgáló módszerek bevezetésével tenyészetben, például optikai térképezéssel kalcium- és feszültségérzékeny festékek használatával. A CTCM további korlátja, hogy a működő modell nem manipulálja a fiziológiai stresszt (elő- és utóterhelés). A CTCM-ben ellentétes irányú nyomást indukáltak, hogy a diasztoléban (teljes nyújtás) és szisztoléban (az összehúzódás hossza elektromos stimuláció alatt) 25%-os fiziológiai nyújtást reprodukáljanak nagyon nagy szövetekben. Ezt a korlátozást a jövőbeli CTCM-tervekben mindkét oldalról a szívszövetre gyakorolt ​​megfelelő nyomással, valamint a szív üregeiben előforduló pontos nyomás-térfogat összefüggések alkalmazásával kell megszüntetni.
A kéziratban ismertetett túlnyújtás által kiváltott átrendeződés a hipertrófiai hipernyújtási jelek utánzására korlátozódik. Így ez a modell segíthet a nyújtás által kiváltott hipertrófiai jelátvitel tanulmányozásában humorális vagy neurális faktorok szükségessége nélkül (amelyek ebben a rendszerben nem léteznek). További vizsgálatokra van szükség a CTCM multiplicitásának növelése érdekében, például az immunsejtekkel, a keringő plazma humorális faktorokkal és az idegsejtekkel való együttes tenyésztés során az beidegzéssel javítva a CTCM-mel történő betegségmodellezés lehetőségeit.
Tizenhárom sertést használtak fel ebben a vizsgálatban. Minden állatkísérletet az intézményi irányelveknek megfelelően végeztek, és azokat a Louisville-i Egyetem Intézményi Állatgondozási és Felhasználási Bizottsága hagyta jóvá. Az aortaívet leszorították, és a szívet 1 liter steril kardioplegiával (110 mM NaCl, 1,2 mM CaCl2, 16 mM KCl, 16 mM MgCl2, 10 mM NaHCO3, 5 U/ml heparin, pH-érték legfeljebb 7,4) perfundálták; A szíveket jéghideg kardioplegikus oldatban tárolták, amíg jégen nem szállították a laboratóriumba, ami általában <10 percig tart. A szíveket jéghideg kardioplegikus oldatban tárolták, amíg jégen nem szállították a laboratóriumba, ami általában <10 percig tart. сердца хранили в ледяном кардиоплегическом растворе до транспортировки в лабораторию на льду, что обынично
A szíveket jéghideg kardioplegikus oldatban tároltuk a laboratóriumba szállításig jégen, ami általában <10 percet vesz igénybe.将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钟将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钟 Держите сердца в ледяной кардиоплегии до транспортировки в лабораторию на льду, обычно <10 мин. A szíveket jégen kell tartani kardioplégia esetén a laboratóriumba szállításig, általában <10 percig.
A CTCM eszközt SolidWorks számítógéppel segített tervező (CAD) szoftverben fejlesztették ki. A tenyésztőkamrák, elválasztók és légkamrák CNC-vel megmunkált átlátszó akril műanyagból készültek. A 7 mm átmérőjű támasztógyűrű közepén nagy sűrűségű polietilénből (HDPE) készült, és egy o-gyűrű horonnyal rendelkezik, amelybe a táptalaj tömítésére használt szilikon o-gyűrű illeszkedik. Egy vékony szilícium-dioxid membrán választja el a tenyésztőkamrát az elválasztó lemeztől. A szilikon membrán 0,02 hüvelyk vastag szilikonlemezből lézervágott, keménysége 35A. Az alsó és felső szilikon tömítések 1/16 hüvelyk vastag szilikonlemezből lézervágott, keménységük 50A. A blokk rögzítésére és a légmentes tömítés létrehozására 316L rozsdamentes acél csavarokat és szárnyas anyákat használnak.
Egy dedikált nyomtatott áramköri lapot (NYÁK) terveztek a C-PACE-EM rendszer integrálására. A NYÁK-on található svájci gép csatlakozóaljzatok ezüstözött rézhuzalokkal és az elektródákba csavarozott 0-60-as bronzcsavarokkal csatlakoznak a grafitelektródákhoz. A nyomtatott áramköri lapot a 3D nyomtató burkolatában helyezik el.
A CTCM készüléket egy programozható pneumatikus aktuátor (PPD) vezérli, amely a szívciklushoz hasonló szabályozott keringési nyomást hoz létre. Ahogy a légkamrán belüli nyomás növekszik, a rugalmas szilikon membrán felfelé tágul, a közeget a szövet alá kényszerítve. A szövet területe ezután megnyúlik a folyadék kilökődése miatt, utánozva a szív fiziológiai tágulását diasztolé alatt. A relaxáció csúcspontján grafitelektródákon keresztül elektromos stimulációt alkalmaztak, ami csökkentette a légkamrában lévő nyomást, és a szövetmetszetek összehúzódását okozta. A cső belsejében egy hemosztatikus szelep található, amely nyomásérzékelővel van felszerelve, hogy érzékelje a légrendszerben lévő nyomást. A nyomásérzékelő által érzékelt nyomást egy laptophoz csatlakoztatott adatgyűjtőre vezetik. Ez lehetővé teszi a gázkamrán belüli nyomás folyamatos monitorozását. Amikor a kamra maximális nyomását elérték (standard 80 Hgmm, 140 Hgmm OS), az adatgyűjtő eszközt arra utasították, hogy küldjön jelet a C-PACE-EM rendszernek, amely egy kétfázisú feszültségjelet generál 2 ms-on keresztül, 4 V-ra állítva.
Szívmetszeteket készítettünk, és a tenyésztési körülményeket 6 lyukban a következőképpen alakítottuk ki: A kigyűjtött szíveket az átvivőedényből hideg (4°C) kardioplégiát tartalmazó tálcára helyeztük át. A bal kamrát steril pengével izoláltuk, és 1-2 cm3-es darabokra vágtuk. Ezeket a szövetblokkokat szövetragasztóval szövettartókhoz rögzítettük, és egy rezgő mikrotómos szövetfürdőbe helyeztük, amely Tyrode-oldatot tartalmazott, és folyamatosan oxigénnel telítettük (3 g/l 2,3-butándion-monooxim (BDM), 140 mM NaCl (8,18 g), 6 mM KCl (0,447 g), 10 mM D-glükóz (1,86 g), 10 mM HEPES (2,38 g), 1 mM MgCl2 (1 ml 1 M oldat), 1,8 mM CaCl2 (1,8 ml 1 M oldat), legfeljebb 1 L ddH2O). A rezgő mikrotómot 300 µm vastag szeletek vágására állítottuk be 80 Hz frekvencián, 2 mm vízszintes rezgési amplitúdóval és 0,03 mm/s előtolási sebességgel. A szövetfürdőt jéggel vettük körül, hogy az oldat hűvös maradjon, és a hőmérsékletet 4°C-on tartottuk. A szövetmetszeteket a mikrotómfürdőből egy folyamatosan oxigénnel telített Tyrode-oldatot tartalmazó inkubációs fürdőbe helyeztük jégen, amíg elegendő metszetet nem kaptunk egy tenyésztőlemezhez. Transzwell tenyészetekhez a szövetmetszeteket steril, 6 mm széles poliuretán hordozókhoz rögzítettük, és 6 ml optimalizált táptalajba (199 táptalaj, 1x ITS kiegészítés, 10% FBS, 5 ng/ml VEGF, 10 ng/ml FGF-lúgos és 2X antibiotikum-gombaellenes szer) helyeztük. Elektromos stimulációt (10 V, frekvencia 1,2 Hz) alkalmaztunk a szövetmetszetekre a C-Pace-en keresztül. TD körülmények között friss T3-at és Dex-et adtunk hozzá 100 nM és 1 μM koncentrációban minden táptalajcserénél. A táptalajt oxigénnel telítjük, mielőtt naponta háromszor visszahelyezzük. A szövetmetszeteket 37°C-on, 5% CO2-atmoszférában inkubátorban tenyésztettük.
A CTCM-kultúrákhoz a szövetmetszeteket egy egyedi gyártású 3D-nyomtatóra helyezték egy módosított Tyrode-oldatot tartalmazó Petri-csészébe. Az eszköz úgy van kialakítva, hogy a szívszelet méretét a tartógyűrű területének 25%-ával növelje. Ezt úgy teszik, hogy a szívmetszetek ne nyúljanak meg a Tyrode-oldatból a közegbe való átvitel és a diasztolé alatt. Hisztoakril ragasztóval 300 µm vastag metszeteket rögzítettek egy 7 mm átmérőjű tartógyűrűre. Miután a szövetmetszeteket a tartógyűrűhöz rögzítették, levágták a felesleges szövetmetszeteket, és a rögzített szövetmetszeteket visszahelyezték a jégen (4°C) lévő Tyrode-oldatos fürdőbe, amíg elegendő metszetet nem készítettek elő egy eszközhöz. Az összes eszköz teljes feldolgozási ideje nem haladhatja meg a 2 órát. Miután 6 szövetmetszetet rögzítettek a tartógyűrűikhez, összeállították a CTCM-eszközt. A CTCM-tenyésztőkamrát 21 ml előoxigénezett közeggel töltötték fel. Vigyék át a szövetmetszeteket a tenyésztőkamrába, és pipettával óvatosan távolítsák el a légbuborékokat. A szövetmetszetet ezután a lyukba vezetik, és óvatosan a helyére nyomják. Végül helyezzék az elektróda kupakot az eszközre, és helyezzék át az eszközt az inkubátorba. Ezután csatlakoztassák a CTCM-et a levegőcsőhöz és a C-PACE-EM rendszerhez. A pneumatikus működtető kinyílik, és a levegőszelep kinyitja a CTCM-et. A C-PACE-EM rendszert úgy konfigurálták, hogy 4 V feszültséget adjon le 1,2 Hz frekvencián bifázisos ingerlés közben 2 ms-on keresztül. A táptalajt naponta kétszer, az elektródákat pedig naponta egyszer cserélték, hogy elkerüljék a grafit felhalmozódását az elektródákon. Szükség esetén a szövetmetszeteket ki lehet venni a tenyésztő kutakból, hogy eltávolítsák az esetlegesen alájuk került légbuborékokat. MT kezelési körülmények között minden táptalajcserénél friss T3/Dex-et adtak hozzá 100 nM T3-mal és 1 μM Dex-szel. A CTCM eszközöket 37°C-on és 5% CO2-t tartalmazó inkubátorban tenyésztették.
A szívszeletek nyújtott pályáinak meghatározásához egy speciális kamerarendszert fejlesztettek ki. Egy SLR kamerát (Canon Rebel T7i, Canon, Tokió, Japán) használtak egy Navitar Zoom 7000 18-108 mm-es makró objektívvel (Navitar, San Francisco, Kalifornia). A vizualizációt szobahőmérsékleten végezték, miután a közeget friss közeggel cserélték. A kamerát 51°-os szögben helyezték el, és a videót másodpercenként 30 képkocka sebességgel rögzítették. Először nyílt forráskódú szoftvert (MUSCLEMOTION43) használtak az Image-J programmal a szívszeletek mozgásának számszerűsítésére. A maszkot MATLAB (MathWorks, Natick, MA, USA) segítségével készítették, hogy meghatározzák a dobogó szív szeletek szempontjából érdekes régiókat a zaj elkerülése érdekében. Manuálisan szegmentált maszkokat alkalmaztak egy képkockasorozat összes képére, majd továbbították a MUSCLEMOTION pluginnek. A Muscle Motion az egyes képkockákban lévő pixelek átlagos intenzitását használja a referencia képkockához viszonyított mozgásának számszerűsítésére. Az adatokat rögzítették, szűrték és a ciklusidő számszerűsítésére, valamint a szövetek nyújtásának felmérésére használták a szívciklus során. A rögzített videót egy elsőrendű nulla fázisú digitális szűrővel utómunkálták. A szöveti nyújtódás (csúcstól csúcsig) számszerűsítéséhez csúcstól csúcsig analízist végeztek a rögzített jel csúcsainak és mélypontjainak megkülönböztetésére. Ezenkívül a trendmentesítést hatodrendű polinom segítségével végezték a jel eltolódásának kiküszöbölésére. A globális szöveti mozgás, a ciklusidő, a relaxációs idő és az összehúzódási idő meghatározásához MATLAB-ban fejlesztettek ki programkódot (44. kiegészítő programkód).
A feszültségelemzéshez, ugyanazokat a videókat használva, amelyeket a mechanikai nyújtóképesség vizsgálatához készítettünk, először két képet rajzoltunk ki, amelyek a mozgáscsúcsokat (a mozgás legmagasabb (felső) és legalacsonyabb (alsó) pontjait) ábrázolják a MUSCLEMOTION szoftver szerint. Ezután szegmentáltuk a szöveti régiókat, és egyfajta árnyékolási algoritmust alkalmaztunk a szegmentált szövetre (2a. kiegészítő ábra). A szegmentált szövetet ezután tíz alfelületre osztottuk, és az egyes felületekre ható feszültséget a következő egyenlettel számítottuk ki: Stressz = (Tenger-Slej)/Slej, ahol a Tenger és Slej az alakzat távolsága a szövet felső, illetve alsó árnyékától (2b. kiegészítő ábra).
A szívmetszeteket 4%-os paraformaldehidben fixáltuk 48 órán át. A fixált szöveteket 10% és 20% szacharózban dehidratáltuk 1 órán át, majd 30% szacharózban egy éjszakán át. A metszeteket ezután optimális vágási hőmérsékletű vegyületbe (OCT vegyület) ágyaztuk, és fokozatosan lefagyasztottuk izopentán/szárazjég fürdőben. Az OCT beágyazó blokkokat -80 °C-on tároltuk a szétválasztásig. A tárgylemezeket 8 μm vastagságú metszetekként készítettük el.
Az OCT szívmetszetekből történő eltávolításához melegítse a tárgylemezeket egy fűtőblokkon 95 °C-on 5 percig. Adjon 1 ml PBS-t minden tárgylemezhez, és inkubálja 30 percig szobahőmérsékleten, majd permeálja a metszeteket 0,1%-os Triton-X PBS-ben történő oldatával 15 percig szobahőmérsékleten. A nem specifikus antitestek mintához való kötődésének megakadályozása érdekében adjon 1 ml 3%-os BSA-oldatot a tárgylemezekhez, és inkubálja 1 órán át szobahőmérsékleten. Ezután a BSA-t eltávolította, és a tárgylemezeket PBS-sel mosta. Jelölje meg mindegyik mintát ceruzával. 90 perc alatt primer antitesteket (1:200 arányban hígítva 1% BSA-ban) (connexin 43 (Abcam; #AB11370), NFATC4 (Abcam; #AB99431) és troponin-T (Thermo Scientific; #MA5-12960) adtunk hozzá, majd további 90 percig szekunder antitesteket (1:200 arányban hígítva 1% BSA-ban) egér Alexa Fluor 488 (Thermo Scientific; #A16079) és nyúl Alexa Fluor 594 (Thermo Scientific; #T6391) ellen. Háromszor mostuk PBS-sel. A célfesték és a háttér megkülönböztetése érdekében kontrollként csak a szekunder antitestet használtuk. Végül DAPI magfestéket adtunk hozzá, és a tárgylemezeket egy Vectashield (Vector Laboratories) mikroszkópba (-x nagyítás) és 40x nagyítású Keyence mikroszkópba helyeztük, és körömlakkal lezártuk.
A WGA festéshez 5 μg/ml koncentrációjú, PBS-ben oldott WGA-Alexa Fluor 555 (Thermo Scientific; #W32464) festéket használtunk, majd fixált metszetekre vittük fel 30 percre szobahőmérsékleten. A tárgylemezeket ezután PBS-sel mostuk, majd szudánfeketét adtunk mindegyikhez, és 30 percig inkubáltuk. A tárgylemezeket ezután PBS-sel mostuk, és vectashield beágyazó közeget adtunk hozzá. A tárgylemezeket Keyence mikroszkópon 40x-es nagyításban vizualizáltuk.
Az OCT-t a fent leírtak szerint távolítottuk el a mintákból. Az OCT eltávolítása után a tárgylemezeket egy éjszakára Bouin-oldatba merítettük. A tárgylemezeket ezután 1 órán át desztillált vízzel öblítettük, majd 10 percre Bibrich aloe vera-fukszin oldatba helyeztük. Ezután a tárgylemezeket desztillált vízzel mostuk, és 10 percre 5%-os foszfor-molibdén/5%-os foszfor-volfrámsav oldatba helyeztük. Öblítés nélkül a tárgylemezeket közvetlenül az anilinkék oldatba helyeztük 15 percre. Ezután a tárgylemezeket desztillált vízzel mostuk, és 2 percre 1%-os ecetsav oldatba helyeztük. A tárgylemezeket 200 N etanolban szárítottuk, majd xilolba helyeztük. A festett tárgylemezeket 10x-es objektívvel ellátott Keyence mikroszkóppal vizualizáltuk. A fibrózis területének százalékos arányát a Keyence Analyzer szoftverrel számszerűsítettük.
CyQUANT™ MTT sejtéletképességi vizsgálat (Invitrogen, Carlsbad, CA), katalógusszám: V13154, a gyártó protokollja szerint, némi módosítással. Az MTT-analízis során egy 6 mm átmérőjű sebészeti lyukasztót használtak az egyenletes szövetméret biztosítására. A szöveteket egyenként szélesztették egy 12 lyukú, MTT-szubsztrátot tartalmazó lemez lyukaiba a gyártó protokollja szerint. A metszeteket 37°C-on 3 órán át inkubálták, és az élő szövet metabolizálta az MTT-szubsztrátot, lila formazán vegyületté alakulva. Az MTT-oldatot 1 ml DMSO-val helyettesítették, és 15 percig 37°C-on inkubálták, hogy a lila formazánt kivonják a szívmetszetekből. A mintákat 1:10 arányban hígították DMSO-ban 96 lyukú, átlátszó aljú lemezeken, és a lila szín intenzitását 570 nm-en mérték Cytation lemezleolvasóval (BioTek). A leolvasott értékeket a szív egyes szeleteinek súlyához normalizálták.
A glükózhasznosítási vizsgálathoz a szívszelet táptalajt 1 μCi/ml [5-3H]-glükózt (Moravek Biochemicals, Brea, CA, USA) tartalmazó táptalajra cseréltük a korábban leírtak szerint. 4 órás inkubáció után 100 µl táptalajt adtunk egy nyitott mikrocentrifuga csőbe, amely 100 µl 0,2 N HCl-t tartalmazott. Ezután a csövet egy 500 μl dH2O-t tartalmazó szcintillációs csőbe helyeztük, hogy a [3H]2O-t 72 órán át 37°C-on elpárologtassuk. Ezután kivettük a mikrocentrifuga csövet a szcintillációs csőből, és adtunk hozzá 10 ml szcintillációs folyadékot. A szcintillációs számlálást Tri-Carb 2900TR folyadékszcintillációs analizátorral (Packard Bioscience Company, Meriden, CT, USA) végeztük. A glükózfelhasználást ezután az [5-3H]-glükóz specifikus aktivitásának, a hiányos egyensúlynak és a háttérnek, az [5-3H]-jelölés nélküli glükózra való hígításának, valamint a szcintillációs számláló hatékonyságának figyelembevételével számították ki. Az adatokat a szívmetszetek tömegére normalizálták.
Trizolban történő szövethomogenizálás után az RNS-t a szívmetszetekből izoláltuk a Qiagen miRNeasy Micro Kit #210874 segítségével a gyártó protokollja szerint. Az RNSsec könyvtár előkészítését, szekvenálását és adatelemzését a következőképpen végeztük:
Az RNS-könyvtár elkészítéséhez mintánként 1 μg RNS-t használtunk kiindulási anyagként. A szekvenáló könyvtárakat az Illumina (NEB, USA) NEBNext UltraTM RNA Library Preparation Kit segítségével állítottuk elő a gyártó ajánlásainak megfelelően, és minden egyes minta attribútumszekvenciáihoz indexkódokat adtunk. Röviden, az mRNS-t teljes RNS-ből tisztítottuk poli-T oligonukleotidokkal rögzített mágneses gyöngyök segítségével. A fragmentációt kétértékű kationokkal, magas hőmérsékleten, NEBNext First Strand Synthesis Reaction Bufferben (5X) végeztük. Az első szálú cDNS-t véletlenszerű hexamer primerek és M-MuLV reverz transzkriptáz (RNase H-) segítségével szintetizáltuk. A második szálú cDNS-t ezután DNS-polimeráz I és RNase H segítségével szintetizáltuk. A fennmaradó túlnyúló részeket exonukleáz/polimeráz aktivitással tompa végekké alakítottuk. A DNS-fragmentum 3'-végének adenilezése után egy hajtűhurok-szerkezetű NEBNext adaptert kapcsoltunk hozzá a hibridizáció előkészítéséhez. A 150-200 bp hosszúságú cDNS-fragmensek kiválasztásához. A könyvtárfragmenseket az AMPure XP rendszerrel (Beckman Coulter, Beverly, USA) tisztították. Ezután 3 μl USER enzimet (NEB, USA) használtak méret szerint szelektált cDNS-sel adapterrel ligálva 15 percig 37°C-on, majd 5 percig 95°C-on a PCR előtt. A PCR-t Phusion High-Fidelity DNS polimeráz, univerzális PCR primerekkel és Index (X) primerekkel végezték. Végül a PCR-termékeket tisztították (AMPure XP rendszer), és a könyvtár minőségét Agilent Bioanalyzer 2100 rendszeren értékelték. A cDNS könyvtárat ezután Novaseq szekvenátorral szekvenálták. Az Illumina nyers képfájljait nyers leolvasásokká konvertálták CASAVA Base Calling segítségével. A nyers adatokat FASTQ(fq) formátumú fájlokban tárolják, amelyek tartalmazzák az olvasott szekvenciákat és a megfelelő bázisminőségeket. Válassza ki a HISAT2 lehetőséget a szűrt szekvenálási leolvasások Sscrofa11.1 referencia genomhoz való illesztéséhez. Általánosságban elmondható, hogy a HISAT2 bármilyen méretű genomot támogat, beleértve a 4 milliárd bázisnál nagyobb genomokat is, és a legtöbb paraméterhez alapértelmezett értékek vannak beállítva. Az RNS-szekvenciaadatokból származó splicing-leolvasások hatékonyan illeszthetők a HISAT2 segítségével, amely a jelenleg elérhető leggyorsabb rendszer, ugyanolyan vagy jobb pontossággal, mint bármely más módszer.
A transzkriptumok mennyisége közvetlenül tükrözi a génexpresszió szintjét. A génexpressziós szinteket a genomhoz vagy exonokhoz kapcsolódó transzkriptumok mennyisége (szekvenálási szám) alapján értékelik. A leolvasások száma arányos a génexpressziós szintekkel, a génhosszal és a szekvenálási mélységgel. Az FPKM-et (fragmentek száma ezer bázispáronként, szekvenált transzkriptum millió bázispáronként) kiszámítottuk, és a differenciális expresszió P-értékeit a DESeq2 csomag segítségével határoztuk meg. Ezután a beépített „p.adjust” R-függvény alapján a Benjamini-Hochberg módszerrel9 kiszámítottuk a téves felfedezési arányt (FDR) minden P-értékhez.
A szívmetszetekből izolált RNS-t 200 ng/μl koncentrációban cDNS-sé alakítottuk a Thermo SuperScript IV Vilo Master mixével (Thermo, katalógusszám: 11756050). A kvantitatív RT-PCR-t Applied Biosystems Endura Plate Microamp 384-lyukú átlátszó reakciólemezzel (Thermo, katalógusszám: 4483319) és microamp optikai ragasztóval (Thermo, katalógusszám: 4311971) végeztük. A reakcióelegy 5 µl Taqman Fast Advanced Master mixet (Thermo, katalógusszám: 4444557), 0,5 µl Taqman Primert és 3,5 µl H2O-t tartalmazott lyukanként összekeverve. Standard qPCR ciklusokat futtattunk, és a CT-értékeket Applied Biosystems Quantstudio 5 valós idejű PCR készülékkel (384-lyukú modul; termékszám: A28135) mértük. A Taqman primereket a Thermo-tól vásároltuk (GAPDH (Ss03375629_u1), PARP12 (Ss06908795_m1), PKDCC (Ss06903874_m1), CYGB (Ss06900188_m1), RGL1 (Ss06868890_m1), ACTN1 (Ss01009508_mH), GATA4 (Ss03383805_u1), GJA1 (Ss03374839_u1), COL1A2 (Ss03375009_u1), COL3A1 (Ss04323794_m1), ACTA2 (Ss04245588_m1). Az összes minta CT-értékeit a GAPDH háztartási génre normalizáltuk.
Az NT-ProBNP táptalajfelszabadulását az NT-ProBNP készlet (sertés) (katalógusszám: MBS2086979, MyBioSource) segítségével értékeltük a gyártó protokollja szerint. Röviden, minden mintából és standardból 250 µl-t adtunk duplikátumban minden egyes kúthoz. A minta hozzáadása után azonnal adjunk 50 µl A vizsgálati reagenst minden kúthoz. Óvatosan rázzuk fel a lemezt, és zárjuk le tömítőanyaggal. A tablettákat ezután 37°C-on 1 órán át inkubáltuk. Ezután szívjuk le az oldatot, és mossuk a kútokat 4-szer 350 µl 1X mosóoldattal, a mosóoldatot minden alkalommal 1-2 percig inkubálva. Ezután adjunk 100 µl B vizsgálati reagenst minden kúthoz, és zárjuk le lemeztömítőanyaggal. A tablettát óvatosan rázzuk fel, és inkubáljuk 37°C-on 30 percig. Szívjuk le az oldatot, és mossuk a kútokat 5-ször 350 µl 1X mosóoldattal. Adjunk 90 µl szubsztrátoldatot minden egyes kútba, és zárjuk le a lemezt. Inkubáljuk a lemezt 37°C-on 10-20 percig. Adjunk 50 µl Stop oldatot minden kútba. A lemezt azonnal megmérjük egy Cytation (BioTek) lemezleolvasóval, 450 nm-en beállítva.
Teljesítményelemzéseket végeztek annak érdekében, hogy kiválasszák azokat a csoportméreteket, amelyek >80%-os teljesítményt biztosítanak a paraméter 10%-os abszolút változásának kimutatására 5%-os I. típusú hibaarány mellett. Teljesítményelemzéseket végeztek azon csoportméretek kiválasztására, amelyek >80%-os teljesítményt biztosítanak a paraméter 10%-os abszolút változásának kimutatására 5%-os I. típusú hibaaránnyal. Анализ мощности был выполнен для выбора размеров групп, которые обеспечат >80% мощности для обнаружения для обнаружения изменения параметра с 5% частотой ошибок типа I. Teljesítményelemzést végeztünk olyan csoportméretek kiválasztására, amelyek >80%-os teljesítményt biztosítanak a 10%-os abszolút paraméterváltozás kimutatására 5%-os I. típusú hibaszázalék mellett.进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％I型错误率的组大小.进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％I型错误率的组大小. Был проведен анализ мощности для выбора размера группы, который обеспечил бы > 80% мощности для обеспечил для обеспечолоѶ% изменения параметров и 5% частоты ошибок типа I. Teljesítményelemzést végeztek egy olyan csoportméret kiválasztására, amely >80%-os teljesítményt biztosít a 10%-os abszolút paraméterváltozás és az 5%-os I. típusú hibaarány kimutatására.A szövetmetszeteket véletlenszerűen választottuk ki a kísérlet előtt. Minden elemzés feltételes vakmódszerrel történt, és a mintákat csak az összes adat elemzése után dekódoltuk. Az összes statisztikai elemzést a GraphPad Prism szoftverrel (San Diego, CA) végeztük. Minden statisztikánál a p-értékeket <0,05 értékeknél tekintettük szignifikánsnak. Minden statisztikánál a p-értékeket <0,05 értékeknél tekintettük szignifikánsnak. Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. Minden statisztikánál a p-értékeket <0,05 értékeknél tekintettük szignifikánsnak.对于所有统计数据，p 值在值<0,05 时被认为是显着的.对于所有统计数据，p 值在值<0,05 时被认为是显着的. Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. Minden statisztikánál a p-értékeket <0,05 értékeknél tekintettük szignifikánsnak.Kétoldali Student-féle t-próbát végeztünk az adatokon, mindössze 2 összehasonlítást végeztünk. Egyutas vagy kétutas ANOVA-t alkalmaztunk a több csoport közötti szignifikancia meghatározásához. Post hoc tesztek elvégzésekor Tukey-korrekciót alkalmaztunk a többszörös összehasonlítások figyelembevételére. Az RNAsec adatok esetében speciális statisztikai szempontokat kell figyelembe venni az FDR és a p.adjust kiszámításakor, a Módszerek részben leírtak szerint.
A tanulmány felépítésével kapcsolatos további információkért lásd a cikkhez kapcsolódó Nature Research Report absztraktot.