Nature.com сайтына кергәнегез өчен рәхмәт. Сез куллана торган браузер версиясендә CSS ярдәме чикләнгән. Иң яхшы тәҗрибә өчен, без сезгә яңартылган браузер кулланырга киңәш итәбез (яки Internet Explorer'да туры килүчәнлек режимын сүндерегез). Шуңа кадәр, ярдәмне дәвам итү өчен, без сайтны стильләрсез һәм JavaScriptсыз күрсәтәчәкбез.
Даруларны тикшерү өчен йөрәкнең физиологик мохитен төгәл кабатлый алырлык ышанычлы in vitro системасына ихтыяҗ бар. Кеше йөрәк тукымасын культуралаштыру системаларының чикләнгән булуы йөрәк дарулары йогынтысын дөрес аңлатмауга китерде. Монда без йөрәк кисәкләрен электромеханик рәвештә стимуллаштыра торган һәм йөрәк циклының систолик һәм диастолик фазаларында физиологик сузылуга дучар була торган йөрәк тукымасын культуралаштыру моделен (CTCM) эшләдек. 12 көнлек культурадан соң, бу алым йөрәк кисәкләренең яшәүчәнлеген өлешчә яхшыртты, ләкин аларның структураль бөтенлеген тулысынча сакламады. Шуңа күрә, кечкенә молекулалы скринингтан соң, без мохиткә 100 нМ трийодтиронин (T3) һәм 1 мкМ дексаметазон (Dex) өстәү кисәкләрнең микроструктурасын 12 көн дәвамында саклап калганын ачыкладык. T3/Dex белән дәвалау белән берлектә, CTCM системасы 12 көн дәвамында яңа йөрәк тукымасы белән бер үк дәрәҗәдә транскрипция профильләрен, яшәүчәнлеген, метаболик активлыкны һәм структураль бөтенлекне саклады. Моннан тыш, культурада йөрәк тукымасының артык сузылуы гипертрофик йөрәк сигнализациясен китереп чыгара, бу CTCMның йөрәк сузылуы нәтиҗәсендә барлыкка килгән гипертрофик халәтләрне имитацияләү сәләтен күрсәтә. Нәтиҗә ясап шуны әйтергә мөмкин: CTCM озак вакыт дәвамында культурада йөрәк физиологиясен һәм патофизиологиясен модельләштерә ала, бу исә препаратларны ышанычлы тикшерү мөмкинлеген бирә.
Клиник тикшеренүләр алдыннан кеше йөрәгенең физиологик мохитен төгәл кабатлый алырлык ышанычлы in vitro системалар кирәк. Мондый системалар үзгәртелгән механик сузылуны, йөрәк тибешен һәм электрофизиологик үзенчәлекләрне кабатларга тиеш. Хайван модельләре гадәттә йөрәк физиологиясен тикшерү платформасы буларак кулланыла, кеше йөрәгенә даруларның йогынтысын чагылдыруда ышанычлылыгы чикләнгән1,2. Ниһаять, Идеаль Йөрәк Тукымалары Культурасы Эксперименталь Моделе (CTCM) - төрле терапевтик һәм фармакологик чаралар өчен бик сизгер һәм специфик модель, кеше йөрәгенең физиологиясен һәм патофизиологиясен төгәл кабатлый3. Мондый системаның булмавы йөрәк җитешсезлеген дәвалауның яңа ысулларын ачуны чикли4,5 һәм даруларның кардиотоксик булуына базардан чыгуның төп сәбәбе итеп китерде6.
Соңгы дистә ел эчендә сигез йөрәк-кан тамырлары белән бәйле булмаган препарат клиник кулланудан алынды, чөнки алар QT интервалын озайта, карынчык аритмияләренә һәм кинәт үлемгә китерә7. Шулай итеп, йөрәк-кан тамырлары нәтиҗәлелеген һәм токсиклыгын бәяләү өчен ышанычлы клиникка кадәрге скрининг стратегияләренә ихтыяҗ арта бара. Соңгы вакытта даруларны скрининглауда һәм токсиклыкны тикшерүдә кеше тарафыннан индукцияләнгән плюрипотент күзәнәкләреннән алынган кардиомиоцитларны (hiPS-CM) куллану бу проблемага өлешчә чишелеш бирә. Ләкин, hiPS-CMларның өлгермәгән табигате һәм йөрәк тукымаларының күп күзәнәкле катлаулылыгы булмау бу ысулның төп чикләүләре булып тора. Соңгы тикшеренүләр күрсәткәнчә, бу чикләүне спонтан кыска вакыт эчендә йөрәк тукымалары гидрогельләрен формалаштыру өчен иртә hiPS-CM кулланып һәм вакыт узу белән электр стимуляциясен әкренләп арттырып, өлешчә җиңеп була. Ләкин, бу hiPS-CM микротукымаларында олы миокардның өлгергән электрофизиологик һәм кыскару үзлекләре юк. Моннан тыш, кеше йөрәк тукымасы катлаулырак структурага ия, ул төрле күзәнәк төрләренең, шул исәптән эндотелиаль күзәнәкләрнең, нейроннарның һәм стромаль фибробластларның гетероген катнашмасыннан тора, алар клеткадан тыш матрица аксымнарының махсус җыелмалары белән бәйләнгән. Өлкән имезүчеләр йөрәгендә кардиомиоцит булмаган популяцияләрнең11,12,13 бу гетерогенлыгы йөрәк тукымасын аерым күзәнәк төрләрен кулланып модельләштерүдә төп киртә булып тора. Бу төп чикләүләр физиологик һәм патологик шартларда бөтен миокард тукымасын үстерү ысулларын эшләүнең мөһимлеген ассызыклый.
Кеше йөрәгенең үстерелгән нечкә (300 мкм) кисемтәләре кеше миокардының бөтенлегенең өметле моделе булып чыкты. Бу ысул кеше йөрәк тукымасына охшаш тулы 3D күп күзәнәкле системага керү мөмкинлеген бирә. Ләкин, 2019 елга кадәр үстерелгән йөрәк кисемтәләрен куллану кыска (24 сәгать) культураның яшәү вакыты белән чикләнгән иде. Бу берничә факторга бәйле, шул исәптән физик-механик сузылу булмау, һава-сыеклык интерфейсы һәм йөрәк тукымалары ихтыяҗларын канәгатьләндермәгән гади мохит куллану. 2019 елда берничә тикшеренү төркеме йөрәк тукымалары культурасы системаларына механик факторларны кертү культура гомерен озайта, йөрәк экспрессиясен яхшырта һәм йөрәк патологиясен имитацияли алачагын күрсәтте. Ике нәфис тикшеренү 17 һәм 18 бер күчәрле механик йөкләнешнең культура вакытында йөрәк фенотипына уңай йогынты ясавын күрсәтә. Ләкин, бу тикшеренүләрдә йөрәк циклының динамик өч үлчәмле физик-механик йөкләнеше кулланылмады, чөнки йөрәк кисемтәләре изометрик тарту көчләре 17 яки сызыклы ауксотон йөкләнеш 18 белән йөкләнгән иде. Бу тукымаларны сузылу ысуллары күп йөрәк геннарын бастыруга яки аномаль сузылу реакцияләре белән бәйле геннарның артык экспрессиясенә китерде. Шунысы игътибарга лаек, Питулис һ.б. 19 көч датчигы кире элемтәсен һәм киеренкелек җайланмаларын кулланып йөрәк циклын реконструкцияләү өчен динамик йөрәк кисәге культура ваннасын эшләделәр. Бу система in vitro йөрәк циклын төгәлрәк модельләштерү мөмкинлеген бирсә дә, ысулның катлаулылыгы һәм түбән үткәрүчәнлеге бу системаны куллануны чикли. Безнең лаборатория күптән түгел дуңгыз һәм кеше йөрәк тукымалары кисәкләренең яшәүчәнлеген 6 көнгә кадәр саклап калу өчен электр стимуляциясе һәм оптимальләштерелгән мохит кулланып гадиләштерелгән культура системасын эшләде20,21.
Әлеге кулъязмада без йөрәк циклы вакытында өч үлчәмле йөрәк физиологиясен һәм патофизиологик киңәюне кабатлау өчен гумораль билгеләр кертелгән дуңгыз йөрәге кисәкләрен кулланып йөрәк тукымасы культурасы моделен (ЙТКМ) тасвирлыйбыз. Бу ЙТКМ клиникка кадәрге даруларны фаразлауның төгәллеген элек булмаган дәрәҗәгә күтәрә ала, чөнки ул имезүчеләр йөрәгенең физиологиясен/патофизиологиясен клиникка кадәрге даруларны сынау өчен имезүчеләр йөрәгенең физиологиясен/патофизиологиясен кабатлый торган экономияле, уртача үткәрүчән йөрәк системасын тәэмин итә.
Гемодинамик механик сигналлар in vitro 22,23,24 шартларында кардиомиоцит функциясен саклап калуда мөһим роль уйный. Әлеге кулъязмада без физиологик ешлыкларда (1,2 Гц, минутына 72 тибү) электр һәм механик стимуляцияне китереп, өлкәннәрнең йөрәк мохитен имитацияли алырлык CTCM (1a рәсем) эшләдек. Диастола вакытында тукымаларның артык сузылуын булдырмас өчен, тукымаларның зурлыгын 25% ка арттыру өчен 3D бастыру җайланмасы кулланылды (1b рәсем). C-PACE системасы тарафыннан индукцияләнгән электр ритмы йөрәк циклын тулысынча кабатлау өчен мәгълүмат җыю системасы ярдәмендә систола алдыннан 100 мс башланырлык итеп билгеләнде. Тукымалар культурасы системасы өске камерадагы йөрәк кисәкләренең киңәюенә китерү өчен сыгылмалы силикон мембрананы циклик рәвештә киңәйтү өчен программалаштырыла торган пневматик актуаторны (LB Engineering, Германия) куллана. Система басым датчигы аша тышкы һава линиясенә тоташтырылган, бу басымны (± 1 мм.т.б.) һәм вакытны (± 1 мс) төгәл көйләргә мөмкинлек бирде (1c рәсем).
a Тукыма өлешен җайланманың культура камерасы эчендәге зәңгәр төстә күрсәтелгән 7 мм терәк боҗрасына беркетегез. Культура камерасы һава камерасыннан нечкә сыгылмалы силикон мембрана белән аерылган. Агып чыгуны булдырмас өчен һәр камера арасына прокладка куегыз. Җайланма капкачында электр стимуляциясен тәэмин итүче графит электродлары бар. b Зур тукыма җайланмасының, юнәлеш бирүче боҗраның һәм терәк боҗрасының схематик күренеше. Тукыма бүлекләре (көрән) зур җайланмага урнаштырыла, юнәлеш бирүче боҗра җайланманың тышкы кырыена урнаштырылган. Җитәкләүче ярдәмендә тукыма акрил җилеме белән капланган терәк боҗрасын йөрәк тукымасы кисәге өстенә сак кына куегыз. c Программалаштырыла торган пневматик җайланма (PPD) белән контрольдә тотыла торган һава камерасы басымы функциясе буларак электр стимуляциясе вакытын күрсәтүче график. Басым датчиклары ярдәмендә электр стимуляциясен синхронлаштыру өчен мәгълүмат җыю җайланмасы кулланылды. Культура камерасындагы басым билгеләнгән чиккә җиткәч, электр стимуляциясен эшләтеп җибәрү өчен C-PACE-EM га импульс сигналы җибәрелә. d Инкубатор киштәсе өстенә урнаштырылган дүрт CTCM рәсеме. Пневматик схема аша бер PPDга дүрт җайланма тоташтырылган, һәм пневматик схемадагы басымны күзәтү өчен гемостатик клапанга басым датчиклары урнаштырылган. Һәр җайланмада алты тукыма өлеше бар.
Бер пневматик җайланма ярдәмендә без 4 CTCM җайланмасын контрольдә тота алдык, аларның һәрберсе 6 тукыма кисәген сыйдыра ала иде (1d рәсем). CTCMда һава камерасындагы һава басымы сыеклык камерасындагы синхрон басымга әйләндерелә һәм йөрәк кисәгенең физиологик киңәюенә китерә (2a рәсем һәм 1 нче өстәмә фильм). 80 мм рт.ст. басымда тукыма сузылуын бәяләү. 2b рәсем. тукыма кисәкләренең 25% ка сузылуын күрсәтте (2b рәсем). Бу процент сузылуы нормаль йөрәк кисәге кыскаручанлыгы өчен 2,2–2,3 мкм физиологик саркомер озынлыгына туры килә дип күрсәтелде17,19,25. Тукымалар хәрәкәте махсус камера көйләүләре ярдәмендә бәяләнде (1 нче өстәмә рәсем). Тукымалар хәрәкәтенең амплитудасы һәм тизлеге (2c, d рәсемнәре) йөрәк циклы вакытында сузылуга һәм систола һәм диастола вакытына туры килде (2b рәсем). Кыскару һәм релаксация вакытында йөрәк тукымасының сузылуы һәм тизлеге культурада 12 көн дәвамында даими булып калды (2f рәсем). Культура вакытында электр стимуляциясенең кыскаручанлыкка йогынтысын бәяләү өчен, без күләгәләү алгоритмы ярдәмендә актив деформацияне билгеләү ысулын эшләдек (Өстәмә 2a,b рәсемнәр) һәм электр стимуляциясе булган һәм булмаган деформацияләрне аера алдык. Йөрәкнең шул ук кисемтәсе (2f рәсем). Кисемтәнең хәрәкәтләнүче өлкәсендә (R6-9) электр стимуляциясе вакытында көчәнеш электр стимуляциясе булмагандагыга караганда 20% ка югарырак иде, бу электр стимуляциясенең кыскару функциясенә керткән өлешен күрсәтә.
Һава камерасы басымының, сыеклык камерасы басымының һәм тукыма хәрәкәтен үлчәүләрнең типик эзләре камера басымының сыеклык камерасы басымын үзгәртүен, тукыма кисәгенең тиешле хәрәкәтен китереп чыгаруын раслый. b Тукыма кисәкләренең процент сузылуының (зәңгәр) типик эзләре процент сузылуына (кызгылт сары) туры килә. c Йөрәк кисәгенең үлчәнгән хәрәкәте үлчәнгән хәрәкәт тизлегенә туры килә. (d) Йөрәк кисәгендә циклик хәрәкәтнең (зәңгәр сызык) һәм тизлекнең (кызгылт сары нокталы сызык) типик траекторияләре. e Цикл вакытын (төрле дуңгызлардан төркемдә n = 19 кисәк), кыскару вакытын (төркемдә n = 19 кисәк), релаксация вакытын (төркемдә n = 19 кисәк, төрле дуңгызлардан), тукыма хәрәкәтен (n = 25) төрле дуңгызлардан), пик систолик тизлекне (n = 24(D0), төрле дуңгызлардан 25(D12) кисәк/төркем) һәм пик релаксация тизлеген (n=24(D0), төрле дуңгызлардан 25(D12) кисәк/төркем) санлаштыру. Ике яклы Стьюдент t-тестында бернинди параметрда да әһәмиятле аерма күрсәтелмәде. f Электр стимуляциясе белән (кызыл) һәм (зәңгәр) булган тукыма кисемтәләренең репрезентатив деформация анализы эзләре, бер үк кисемтәдән алынган тукыма кисемтәләренең ун региональ өлкәсе. Аскы панельләрдә төрле кисемтәләрдән алынган ун өлкәдә электр стимуляциясе белән һәм аннан башка тукыма кисемтәләрендә деформациянең процент аермасының саннары күрсәтелгән. (n = төрле дуңгызлардан 8 кисәк/төркем, Ике койрыклы Студент t-тест башкарыла; ****p < 0.0001, **p < 0.01, *p < 0.05). (n = төрле дуңгызлардан 8 кисәк/төркем, Ике койрыклы Студент t-тест башкарыла; ****p < 0.0001, **p < 0.01, *p < 0.05). . (n = төрле дуңгызлардан 8 секция/төркем, ике койрыклы Стьюдент t-тест; ****p<0.0001, **p<0.01, *p<0.05). （N = 8 片 / 组，来自不同的猪，进行双尾学生 t 检验； **** p <0.0001 ， ** p <0.01 ， * p <0.05 ）。 （N = 8 片 / 组，来自不同的猪，进行双尾学生 t 检验； **** p <0.0001 ， ** p <0.01 ， * p <0.05 ）。 . (n = 8 секция/төркем, төрле дуңгызлардан, ике койрыклы Стьюдент t-тест; ****p<0.0001, **p<0.01, *p<0.05).Хата сызыклары уртача ± стандарт тайпылышны күрсәтә.
Безнең алдагы статик биомиметик йөрәк кисәкләрен культуралаштыру системабызда [20, 21], без электр стимуляциясен кулланып һәм мохит составын оптимальләштереп, йөрәк кисәкләренең яшәүчәнлеген, функциясен һәм структура бөтенлеген 6 көн дәвамында сакладык. Ләкин, 10 көннән соң бу күрсәткечләр кискен төште. Без алдагы статик биомиметик культура системасында 20, 21 контроль шартларында (Ctrl) культураланган кисәкләргә мөрәҗәгать итәчәкбез һәм без элек оптимальләштерелгән мохитне MC шартларында һәм бер үк вакытта механик һәм электр стимуляциясе (CTCM) астында культура буларак кулланачакбыз. дип атала. Беренчедән, без электр стимуляциясе булмаган механик стимуляция тукымаларның яшәүчәнлеген 6 көн дәвамында саклап калу өчен җитәрлек түгеллеген ачыкладык (Өстәмә 3a,b рәсем). Кызыклысы шунда ки, STCM кулланып физик-механик һәм электр стимуляциясен кертү белән, 12 көнлек йөрәк кисәкләренең яшәүчәнлеге MS шартларында яңа йөрәк кисәкләрендәге кебек үк калды, ләкин MTT анализы күрсәткәнчә (1 нче рәсем). 3a). Бу йөрәк циклын механик стимуляцияләү һәм симуляцияләү тукыма кисәкләренең яшәүчәнлеген алдагы статик культура системабызда хәбәр ителгәннән ике тапкыр озаграк саклый ала дигәнне аңлата. Шулай да, йөрәк тропонини Т һәм коннексин 43 иммуномаркалаштыру юлы белән тукыма кисемтәләренең структураль бөтенлеген бәяләү 12 нче көнне MC тукымаларында шул ук көнне контроль төркемдәгеләргә караганда күпкә югарырак булуын күрсәтте. Ләкин, коннексин 43нең бердәм экспрессиясе һәм Z-диск формалашуы тулысынча сакланмаган (3б рәсем). Тукыма структураль бөтенлеген санлаштыру өчен без ясалма интеллект (AI) рамкасын кулланабыз26, тропонин-Т һәм коннексин буяуларына нигезләнгән рәсемгә нигезләнгән тирән өйрәнү конвейерын43 кулланып, йөрәк кисемтәләренең структураль бөтенлеген һәм флуоресценциясен локализация көче ягыннан автоматик рәвештә санлаштырабыз. Бу ысул йөрәк тукымасының структураль бөтенлеген автоматик һәм объектив рәвештә ышанычлы санлаштыру өчен Конволюцион Нейрон Челтәрен (CNN) һәм тирән өйрәнү рамкасын куллана, белешмәдә тасвирланганча. 26. MC тукымалары статик контроль кисемтәләре белән чагыштырганда 0 нче көнгә структураль охшашлыкның яхшыруын күрсәтте. Моннан тыш, Массонның трихром буявы культураның 12 нче көнендә контроль шартлар белән чагыштырганда, MS шартларында фиброзның күпкә түбәнрәк процентын күрсәтте (3в рәсем). CTCM йөрәк тукымалары кисәкләренең яшәүчәнлеген 12 нче көнне яңа йөрәк тукымалары белән охшаш дәрәҗәгә күтәрсә дә, йөрәк кисәкләренең структураль бөтенлеген сизелерлек яхшыртмады.
Баганалы графикта яңа йөрәк кисәкләренең (D0) яки йөрәк кисәкләренең MTT яшәүчәнлегенең саннары күрсәтелгән, алар 12 көн дәвамында статик культурада (D12 Ctrl) яки CTCMда (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) төрле дуңгызлардан алынган кисәк/төркем, бер яклы ANOVA тесты башкарыла; ####p < 0.0001 D0 белән чагыштырганда һәм **p < 0.01 D12 Ctrl белән чагыштырганда). Баганалы графикта яңа йөрәк кисәкләренең (D0) яки йөрәк кисәкләренең MTT яшәүчәнлегенең саннары күрсәтелгән, алар 12 көн дәвамында статик культурада (D12 Ctrl) яки CTCMда (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) төрле дуңгызлардан алынган кисәк/төркемдә, бер яклы ANOVA тесты башкарыла; ####p < 0.0001 D0 белән чагыштырганда һәм **p < 0.01 D12 Ctrl белән чагыштырганда).гистограмма төрле дуңгызлардан алынган MTT яңа йөрәк кисемтәләренең (D0) яшәүчәнлеген санлаштыруны яки йөрәк кисемтәләрен 12 көн дәвамында статик культурада (D12 контроль) яки CTCMда (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 контроль). ), 12 (D12 MC) кисемтә/төркемдә культурада күрсәтә, берьяклы ANOVA тесты үткәрелә;#### p <0,0001 по сравнению с D0 и ** p <0,01 по сравненюю с D12 Ctrl). ####p < 0.0001 D0 белән чагыштырганда һәм **p < 0.01 D12 белән чагыштырганда Ctrl). a 条形图显示在静态培养 (D12 Ctrl) 或 CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切片 (D0) 或心脏切片培养 12 天的 MTT 活力的量化) ，来自不同猪的 12 (D12 MC) 切片 / 组，进行单向 ANOVA 测试；与 D0 相比， #### p <0.0001 ，与 D12 ptrl 相比， ** a 条形图显示在静态培养 (D12 Ctrl) 或 CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切片 (D0) ，来自不同猪的 12 (D12 MC) 切片 / 组，进行单向 ANOVA 测试；与 D0 相比， #### p <0.0001 ，与 D12 Ctrl 相比， ** p。)Яңа йөрәк кисемтәләрендә (D0) яки 12 көн дәвамында статик культурада (D12 контроль) яки CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 контроль)), төрле дуңгызлардан алынган 12 (D12 MC) кисемтә/төркемдә үстерелгән йөрәк кисемтәләрендә MTT яшәүчәнлеген санлаштыруны күрсәтүче гистограмма, бер яклы ANOVA тесты;#### p <0,0001 по сравнению с D0, ** p <0,01 по сравненюю с D12 Ctrl). ####p < D0 белән чагыштырганда 0.0001, **p < D12 белән чагыштырганда 0.01 Ctrl).b Тропонин-Т (яшел), коннексин 43 (кызыл) һәм DAPI (зәңгәр) яңа аерылган йөрәк кисемтәләрендә (D0) яки йөрәк кисемтәләрендә статик шартларда (Ctrl) яки CTCM шартларында (MC) 12 көн дәвамында үстерелгән) репрезентатив иммунофлуоресценция рәсемнәре (буш шкала = 100 мкм). Йөрәк тукымасы структурасының бөтенлеген ясалма интеллект ярдәмендә санлаштыру (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), төрле дуңгыздан 5 (D12 MC) кисәк/төркем, берьяклы ANOVA тесты үткәрелә; ####p < 0.0001 D0 белән чагыштырганда һәм ****p < 0.0001 D12 Ctrl белән чагыштырганда). Йөрәк тукымасы структурасының бөтенлеген ясалма интеллект ярдәмендә санлаштыру (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), төрле дуңгызлардан 5 (D12 MC) кисәк/төркем, берьяклы ANOVA тесты үткәрелә; ####p < 0.0001 D0 белән чагыштырганда һәм ****p < 0.0001 D12 Ctrl белән чагыштырганда). Количественная оценка структурной целостности сердечной ткани искусственным интеллектом (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) срезов/групп от разных свиней, проводится однофакторный тест ANOVA; ####p < 0,0001 по сравнению с D0 и **** p <0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). Йөрәк тукымасының структур бөтенлеген ясалма интеллект ярдәмендә санлаштыру (төрле дуңгызлардан n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) кисемтә/төркем, берьяклы ANOVA тесты үткәрелде; ####p < 0.0001 vs. D0 һәм ****p < 0.0001 белән D12 Ctrl белән чагыштырганда).人工智能量化心脏组织结构完整性（ n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) кисәкләре / төрле дуңгызларның һәрберсе, бер яклы ANOVA тесты; #### p <0.0001 与 D0 相比， **** p <0.0001 与 D12 Ctrl 相比）。人工智能量化心脏组织结构完整性（ n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) кисәкләре / төрле дуңгызларның һәрберсе, бер яклы ANOVA тесты; #### p <0.0001 与 D0 相比， **** p <0.0001 与 D12 Ctrl 相比）。 Искусственный интеллектт для количественной оензки адной целостности сердечной ткани (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) срезов / группу каждой из разных свей, односторонный сравнения **** р <0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). Йөрәк тукымасының структураль бөтенлеген санлаштыру өчен ясалма интеллект (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) төрле дуңгызларның һәрберсен кисәкләргә бүлү/төркемләү, берьяклы ANOVA тесты; ####p<0.0001 vs .D0 Чагыштыру өчен ****p < 0.0001 D12 Ctrl белән чагыштырганда). c Массон трихром буявы белән буялган йөрәк кисәкләре өчен репрезентатив рәсемнәр (сулда) һәм саннар (уңда) (төрле дуңгыздан n = 10 кисәк/төркем, берьяклы ANOVA тесты үткәрелә; ####p < 0.0001 D0 белән чагыштырганда һәм ***p < 0.001 D12 Ctrl белән чагыштырганда). c Массон трихром буявы белән буялган йөрәк кисәкләре өчен репрезентатив рәсемнәр (сулда) һәм саннар (уңда) (төрле дуңгызлардан n = 10 кисәк/төркем, берьяклы ANOVA тесты үткәрелә; #### p < 0.0001 D0 белән чагыштырганда һәм ***p < 0.001 D12 Ctrl белән чагыштырганда). c Репрезент каныны изображения (слева) һәм количественная оценка (справа) срезов сердца, окрашенных трихромным красителем Массона (чи покрития = 500 мкм) ANOVA #### p <0,0001 по сравнению с D0 и *** p <0,001 по сравненю с D12 Ctrl) c Массон трихром буявы белән буялган йөрәк кисемтәләренең репрезентатив рәсемнәре (сулда) һәм саннары (уңда) (төрле дуңгызлардан алынган n = 10 кисемтә/төркем, берьяклы ANOVA тесты үткәрелде; #### p < 0.0001 D0 белән чагыштырганда һәм ***p < 0.001 D12 Ctrl белән чагыштырганда). c 用 Массон 三色染料染色的心脏切片的代表性图像（左）和量化（右）（裸尺度 = 500 µm ）（ n = 10 个切片 / 组，每组来自不同的猪，进行单向 ANOVA 测试； #### p <0.0001 与 D0 相比， *** p <0,001 与 D12 Ctrl 相比）。 C 用 массон 三 色 染料 的 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 相比）。 c Репрезент каныны изображения (слева) һәм количественный мат (справа) срезов сердца, окрашенных трихромным красителем Мас адоа (чя шкала = 500 мкм) (n = 10 срезов / группа, кажж с с с с с с с к с с с с с с с с с с. однофакторного ди горинного мата; ### #p <0,0001 по сравнению с D0, *** p <0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Массон трихром буявы белән буялган йөрәк кисемтәләренең репрезентатив рәсемнәре (сулда) һәм саннары (уңда) (буш = 500 мкм) (n = 10 кисемтә/төркем, һәрберсе төрле дуңгыздан, дисперсиянең берьяклы анализы белән тикшерелгән;### # p < 0.0001 D0 белән чагыштырганда, ***p < 0.001 D12 белән чагыштырганда Ctrl).Хата сызыклары уртача ± стандарт тайпылышны күрсәтә.
Без культура мохитенә кечкенә молекулалар өстәү аша CTCM культурасы вакытында кардиомиоцитларның бөтенлеген яхшыртырга һәм фиброз үсешен киметергә мөмкин дип фаразладык. Шуңа күрә без статик контроль культураларыбызны кулланып кечкенә молекулаларны тикшердек20,21, чөнки буталучы факторлар аз. Бу скрининг өчен дексаметазон (Dex), трийодтиронин (T3) һәм SB431542 (SB) сайланды. Бу кечкенә молекулалар элек hiPSC-CM культураларында саркомер озынлыгын, Т-көзәнәкләрен һәм үткәрү тизлеген арттыру юлы белән кардиомиоцитларның өлгерүен стимуллаштыру өчен кулланылган. Моннан тыш, Dex (глюкокортикоид) һәм SB икесенең дә ялкынсынуны бастыруы билгеле29,30. Шуңа күрә без бу кечкенә молекулаларның берсен яки аларның комбинациясен кертү йөрәк кисемтәләренең структура бөтенлеген яхшыртачакмы-юкмы икәнен тикшердек. Башлангыч скрининг өчен һәр кушылманың дозасы күзәнәк культурасы модельләрендә еш кулланыла торган концентрацияләргә нигезләнеп сайланды (1 мкМ Dex27, 100 нМ T327 һәм 2,5 мкМ SB31). 12 көнлек культурадан соң, T3 һәм Dex комбинациясе кардиомиоцитларның оптималь структура бөтенлегенә һәм минималь фиброз ремоделингына китергән (4 һәм 5 өстәмә рәсемнәр). Моннан тыш, T3 һәм Dexның бу концентрацияләрен икеләтә яки икеләтә куллану гадәти концентрацияләр белән чагыштырганда тискәре йогынты ясаган (6a, b өстәмә рәсемнәр).
Башлангыч скринингтан соң, без 4 культура шартларын йөзгә-йөз чагыштырдык (4a рәсем): Ctrl: безнең алдан тасвирланган статик культурада оптимальләштерелгән мохит кулланып үстерелгән йөрәк кисәкләре; 20.21 TD: чәршәмбе көнне T3 һәм Ctrl өстәлгән Dex; MC: безнең алдан оптимальләштерелгән мохит кулланып CTCMда үстерелгән йөрәк кисәкләре; һәм MT: мохиткә T3 һәм Dex өстәлгән CTCM. 12 көн үстергәннән соң, MS һәм MT тукымаларының яшәүчәнлеге MTT анализы белән бәяләнүче яңа тукымаларда булган кебек калды (4b рәсем). Кызыклысы шунда ки, трансвелл культураларына (TD) T3 һәм Dex өстәү Ctrl шартлары белән чагыштырганда яшәүчәнлекнең сизелерлек яхшыруына китермәде, бу йөрәк кисәкләренең яшәүчәнлеген саклап калуда механик стимуляциянең мөһим ролен күрсәтә.
12 көн дәвамында мохиттә механик стимуляция һәм T3/Dex өстәмәсенең йогынтысын бәяләү өчен кулланылган дүрт культура шартларын сурәтләүче эксперименталь дизайн схемасы. b Баганалы графикта барлык 4 культура шартларында да (Ctrl, TD, MC һәм MT) культурадан соң 12 көннән соң яшәүчәнлекнең саннары күрсәтелгән, ул яңа йөрәк кисәкләре (D0) белән чагыштырылган (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD һәм D12 MT), 12 (D12 MC) кисәк/төркем төрле дуңгызлардан алынган, берьяклы ANOVA тесты үткәрелгән; ####p < 0.0001, ###p < D0 белән чагыштырганда 0.001 һәм **p < 0.01 D12 Ctrl белән чагыштырганда). b Баганалы графикта барлык 4 культура шартларында да (Ctrl, TD, MC һәм MT) культурадан соң 12 көннән соң яшәүчәнлекнең саннары күрсәтелгән, ул яңа йөрәк кисәкләре (D0) белән чагыштырылган (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD һәм D12 MT), 12 (D12 MC) кисәк/төркем төрле дуңгызлардан алынган, бер яклы ANOVA тесты үткәрелгән; ####p < 0.0001, ###p < D0 белән чагыштырганда 0.001 һәм **p < 0.01 D12 ctrl белән чагыштырганда). b Гистограмма показывает количественную оценку жизнеспособности через 12 дней после мативерированя всх 4 условиях адиривированя (чи, TD, MC һәм MT) по сравнению со свежим срезами срджа (D0) D12 TD и D12 MT), 12 (D12 MC) срезов / группу от разных свиней, про проитится односторонний тис ANOVA; b Баганалы графикта 4 культура шартларында да (контроль, TD, MC һәм MT) культурадан соң 12 көн эчендә яшәүчәнлекнең сан күрсәткече яңа йөрәк кисемтәләре (D0) белән чагыштырылган (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD һәм D12 MT), 12 (D12 MC) төрле дуңгызлардан алынган кисемтә/төркем, берьяклы ANOVA тесты; ####p < 0.0001, ###p < 0.001 vs. D0 һәм **p < 0.01 vs. D12 Ctrl). b 条形图显示所有 4 t Ctrl 、 TD 、 MC 和 MT ）与新鲜心脏切片 (D0) (n = 18 (D0) 、 15 (D12 Ctrl 、 D12 TD 和 D12 MT) ，来自不同猪的 12 (D12 MC) 切片 / 组，进行单向 ANOVA 测试； #### p <0.0001 ， ### p <0.001 与 D0 相比，b 4 12 (D12 MC) b Гистограммама, показывающая все 4 условия консервированя (кин, TD, MC и MT) по сравнению со свежим срезами сердца (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD һәм D12 MT), от разыч сч. односторонний тест ANOVA #### p <0,0001, ### p <0,001 по сравнению с D0, ** p <0,01 по сравнению с серем D12); b Гистограммада барлык 4 культура шартлары (контроль, TD, MC һәм MT) яңа йөрәк кисемтәләре (D0) белән чагыштырыла (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD һәм D12 MT), төрле дуңгызлардан 12 (D12 MC) кисемтә/төркем, берьяклы ANOVA тесты; ####p<0.0001, ###p<0.001 vs. D0, **p<0.01 vs. контроль D12). c Баганалы графикта 4 культура шартларында да (Ctrl, TD, MC һәм MT) культурадан соң 12 көн үткәч глюкоза агымының санлаштыруы яңа йөрәк кисәкләре (D0) белән чагыштырылган (төрле дуңгызлардан алынган n = 6 кисәк/төркем, берьяклы ANOVA тесты үткәрелә; ###p < 0,001, D0 белән чагыштырганда һәм ***p < 0,001, D12 белән чагыштырганда Ctrl). c Баганалы графикта 4 культура шартларында да (Ctrl, TD, MC һәм MT) культурадан соң 12 көн үткәч глюкоза агымының санлаштыруы яңа йөрәк кисәкләре (D0) белән чагыштырылган (төрле дуңгызлардан алынган n = 6 кисәк/төркем, берьяклы ANOVA тесты үткәрелә; ###p < 0,001, D0 белән чагыштырганда һәм ***p < 0,001, D12 белән чагыштырганда Ctrl). c Гистограмма показывает количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после матингировирование всх 4 условиях адиривированя (арка, TD, MC һәм MT) по сравнению со свежим срезамы с свиней, односторонний Выполняется тос ANOVA ### p <0,001 по сравнению с D0 и *** p <0,001 по сравнению с D12 Ctrl); c Гистограммада 4 культура шартларында да (контроль, TD, MC һәм MT) культурадан соң 12 көн үткәч глюкоза агымының саннары яңа йөрәк кисемтәләре (D0) белән чагыштырыла (n = 6 кисем/төркем төрле дуңгызлардан алынган, берьяклы ANOVA тесты үткәрелде; ###p < 0,001 D0 белән чагыштырганда һәм ***p < 0,001 D12 Ctrl белән чагыштырганда). c 条形图显示所有 4 种培养条件（ Ctrl 、 TD 、 MC 和 MT ）与新鲜心脏切片 (D0) 相比，培养后 12 天的葡萄糖通量定量（ n = 6 片 / 组，来自不同猪，单向执行 ANOVA 测试； ### p <0,001 ，与 D0 相比， *** p <0,001 与 D12 Ctrl 相比）。 C 条形图 显示 所有 4 种 t ctrl 、 td 、 mc 和 mt） 新鲜 后 后 后 后 后 后 = = = n = 6 片 / 组 ， 猪 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 <0,001 与 D12 Ctrl 相比）。 c Гистограмма, показывающая количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после мгитерированя для всех 4 условий митеривированя (ис, ТД, МК һәм МТ) по сравнению со свеж ср сәм разных свиней, односторонний Былы проведены Тисты АНОВА c Гистограммада барлык 4 культура шартларында (контроль, TD, MC һәм MT) яңа йөрәк кисемтәләре (D0) белән чагыштырганда, культурадан соң 12 көн эчендә глюкоза агымының санлаштыруы күрсәтелгән (n = 6 кисем/төркем, төрле дуңгызлардан, бер яклы). ANOVA тестлары үткәрелдеме, ###p < 0,001 D0 белән чагыштырганда, ***p < 0,001 D12 белән чагыштырганда (контроль).d Ун региональ тукыма кисү ноктасында яңа (зәңгәр), 12 нче көнлек MC (яшел) һәм 12 нче көнлек MT (кызыл) тукымаларның штамм анализы графиклары (n = 4 кисәк/төркем, берьяклы ANOVA тесты; төркемнәр арасында әһәмиятле аерма юк иде). ​​e Яңа йөрәк кисемтәләрендә (D0) 10-12 көн дәвамында статик шартларда (Ctrl) яки MT шартларында (MT) үстерелгән йөрәк кисемтәләре белән чагыштырганда төрлечә экспрессияләнгән геннарны күрсәтүче Вулкан графигы. f Һәр культура шартларында үстерелгән йөрәк кисемтәләре өчен саркомер геннарының җылылык картасы. Хата сызыклары уртача ± стандарт тайпылышны күрсәтә.
Май кислотасы оксидлашуыннан гликолизга күчүгә метаболик бәйлелек кардиомиоцитларның дифференциациясенең төп билгесе булып тора. Өлгермәгән кардиомиоцитлар, нигездә, АТФ җитештерү өчен глюкоза кулланалар һәм гипопластик митохондрияләргә ия, кристаллар аз 5,32. Глюкозаны куллану анализлары күрсәткәнчә, MC һәм MT шартларында глюкозаны куллану 0 нче көн тукымаларында булганга охшаш булган (4c рәсем). Ләкин Ctrl үрнәкләрендә яңа тукымаларга караганда глюкозаны куллануның сизелерлек артуы күзәтелгән. Бу CTCM һәм T3/Dex комбинациясе тукымаларның яшәүчәнлеген арттыра һәм 12 көнлек үстерелгән йөрәк кисемтәләренең метаболик фенотипын саклый дигәнне аңлата. Моннан тыш, штамм анализы күрсәткәнчә, штамм дәрәҗәләре MT һәм MS шартларында 12 көн дәвамында яңа йөрәк тукымасындагы кебек үк калган (4d рәсем).
Йөрәк кисәге тукымасының глобаль транскрипция ландшафтына CTCM һәм T3/Dex гомуми йогынтысын анализлау өчен, без дүрт төрле культура шартларыннан да йөрәк кисәкләрендә RNAseq үткәрдек (Өстәмә мәгълүмат 1). Кызыклысы шунда ки, MT кисәкләре яңа йөрәк тукымасына югары транскрипция охшашлыгы күрсәтте, 13,642 генның нибары 16сы гына дифференциаль рәвештә экспрессияләнде. Ләкин, без элегрәк күрсәткәнчә, Ctrl кисәкләре культурада 10-12 көннән соң 1229 дифференциаль рәвештә экспрессияләнгән ген күрсәтте (4e рәсем). Бу мәгълүматлар йөрәк һәм фибробласт геннарының qRT-PCR белән расланды (Өстәмә 7a-c рәсем). Кызыклысы шунда ки, Ctrl кисәкләре йөрәк һәм күзәнәк циклы геннарының түбәнәюен һәм ялкынсыну геннары программаларының активлашуын күрсәтте. Бу мәгълүматлар, гадәттә, озак вакытлы культуралаштырудан соң була торган дедифференциациянең MT шартларында тулысынча кимегәнен күрсәтә (Өстәмә 8a,b рәсем). Саркомер геннарын җентекләп өйрәнү күрсәткәнчә, бары тик MT шартларында гына саркомерны (4f рәсем) һәм ион каналын (9 нчы өстәмә рәсем) кодлаучы геннар саклана, бу аларны Ctrl, TD һәм MC шартларында бастырудан саклый. Бу мәгълүматлар механик һәм гумораль стимуляция (T3/Dex) комбинациясе белән йөрәк кисәгенең транскриптомы 12 көн культурада үстерелгәннән соң яңа йөрәк кисәкләренә охшап кала ала.
Бу транскрипция нәтиҗәләре йөрәк кисемтәләрендә кардиомиоцитларның структураль бөтенлеге MT шартларында 12 көн дәвамында иң яхшы саклануы белән раслана, моны бөтен һәм локализацияләнгән коннексин 43 күрсәтә (5а рәсем). Моннан тыш, MT шартларында йөрәк кисемтәләрендә фиброз Ctrl белән чагыштырганда һәм яңа йөрәк кисемтәләренә охшаш рәвештә сизелерлек кимегән (5б рәсем). Бу мәгълүматлар механик стимуляция һәм T3/Dex белән дәвалау комбинациясе йөрәк структурасын культурада нәтиҗәле саклый икәнен күрсәтә.
a Яңа гына аерып алынган йөрәк кисемтәләрендә (D0) яки йөрәк кисемтәсенең дүрт культура шартларында 12 көн дәвамында үстерелгән тропонин-T (яшел), коннексин 43 (кызыл) һәм DAPI (зәңгәр) типик иммунофлуоресценция рәсемнәре (масштаблы сызык = 100 мкм). Йөрәк тукымасы структурасының бөтенлеген ясалма интеллект ярдәмендә санлаштыру (n = 7 (D0 һәм D12 Ctrl), төрле дуңгызлардан 5 (D12 TD, D12 MC һәм D12 MT) кисәк/төркем, берьяклы ANOVA тесты үткәрелә; ####p < 0.0001 D0 һәм *p < 0.05 белән чагыштырганда, яки ****p < 0.0001 D12 Ctrl белән чагыштырганда). Йөрәк тукымасы структурасының бөтенлеген ясалма интеллект ярдәмендә санлаштыру (n = 7 (D0 һәм D12 Ctrl), төрле дуңгызлардан 5 кисәк/төркем (D12 TD, D12 MC һәм D12 MT), берьяклы ANOVA тесты үткәрелә; #### p < 0.0001 D0 һәм *p < 0.05 белән чагыштырганда, яки ****p < 0.0001 D12 Ctrl белән чагыштырганда). Количественная оценка структурной целостности ткани сердца с помощью искусственного интеллекта (n = 7 (D0 и D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC и D12 MT) срезов/группу от разных свиней, проведен однофакторный тест ANOVA; #### p < 0,0001 по сравнению с D0 и * р <0,05 или **** р <0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). Йөрәк тукымасының структур бөтенлеген ясалма интеллект ярдәмендә санлаштыру (n = 7 (D0 һәм D12 Ctrl), төрле дуңгызлардан 5 (D12 TD, D12 MC һәм D12 MT) кисемтә/төркем, берьяклы ANOVA тесты үткәрелде; #### D0 белән чагыштырганда p < 0.0001 һәм *p < 0.05 яки D12 Ctrl белән чагыштырганда ****p < 0.0001).对不同猪的心脏组织结构完整性（ n = 7 （D0 和 D12 Ctrl ）、 5 （D12 TD 、 D12 MC 和 D12 MT ）切片 / 组）进行人工智能量化，进行单向 ANOVA 测试； #### p <0.0001 与 D0 和 * p <0.05 相比，或 **** p <0.0001 与 D12 Ctrl 相比）。对 不同 猪 的 心脏 完整性 = n = 7 （d0 和 d12 ctrl） （5 （d12 td 、 d12 mc 和 d12 mt） 组） 人工 # # # # # ########## p <0.0001 与 D0 和Ctrl 相比）。Берьяклы ANOVA тесты белән төрле дуңгызларда (n = 7 (D0 һәм D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC һәм D12 MT) секцияләр/төркем) ясалма интеллект ярдәмендә йөрәк тукымасының структур бөтенлеген санлаштыру;#### p <0,0001 по сравнению с D0 и * р <0,05 или **** р <0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). #### p < 0.0001 D0 белән чагыштырганда һәм *p < 0.05 яки ****p < 0.0001 D12 Ctrl белән чагыштырганда). b Массон трихром буявы белән буялган йөрәк кисәкләре өчен репрезентатив рәсемнәр һәм саннар (масштаб сызыгы = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD һәм D12 MC), төрле дуңгызлардан алынган 9 (D12 MT) кисәк/төркем, берьяклы ANOVA тесты үткәрелә; ####p < 0.0001 D0 һәм ***p < 0.001 белән чагыштырганда, яки ****p < 0.0001 D12 Ctrl белән чагыштырганда). b Массон трихром буявы белән буялган йөрәк кисәкләре өчен репрезентатив рәсемнәр һәм саннар (масштаб сызыгы = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD һәм D12 MC), төрле дуңгызлардан алынган 9 (D12 MT) кисәк/төркем, берьяклы ANOVA тесты үткәрелә; ####p < 0.0001 D0 һәм ***p < 0.001 белән чагыштырганда, яки ****p < 0.0001 D12 Ctrl белән чагыштырганда). b Репрезент каныны изображения һәм количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромным красителем Масона (чинная чейейка = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD һәм D12 MC) сц (сц 2012) выполняется односторонний те ANOVA #### p <0,0001 по сравнению с D0 и *** p <0,001 или **** p <0,0001 по сравнению с D12 Ctrl) b Массон трихром буявы белән буялган йөрәк кисемтәләренең репрезентатив рәсемнәре һәм саннары (масштаб сызыгы = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD һәм D12 MC), төрле дуңгызлардан алынган 9 (D12 MT) кисемтә/төркем, берьяклы ANOVA белән башкарылган; ####p < 0.0001 vs. D0 һәм ***p < 0.001 яки ****p < 0.0001 vs. D12 Ctrl). b 用 Массон 三色染料染色的心脏切片的代表性图像和量化（比例尺 = 500 µm ）（ n = 10 （D0 、 D12 Ctrl 、 D12 TD 和 D12 MC ），来自不同猪的 9 个（ D12 MT ）切片 / 组，进行单因素方差分析； #### p <0.0001 与 D0 相比， *** p <0,001 ，或 **** p <0.0001 与 D12 Ctrl 相比）。 б 用 массон 切片 切片 切片 切片 / 组，进行单因素方差分析； #### p <0.0001 与 D0 相比， *** p <0,001 ，或 **** p <0.0001 与 D12 Ctrl 相比）。 b Репрезент каныны изображения һәм количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромом Масона (чинная чейейка = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD һәм D12 MC) счовы ANOVA #### p <0,0001 по сравненю с D0, *** p <0,001 или **** р <0,0001 по сравненю с с D12 Ctrl). b Массон трихромы белән буялган йөрәк кисемтәләренең репрезентатив рәсемнәре һәм саннары (масштаб сызыгы = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD һәм D12 MC), төрле дуңгызлардан/төркемнәрдән 9 (D12 MT) кисемтә, бер ANOVA ысулы; ####p < 0.0001 D0 белән чагыштырганда, ***p < 0.001 яки ****p < 0.0001 D12 Ctrl белән чагыштырганда).Хата сызыклары уртача ± стандарт тайпылышны күрсәтә.
Ниһаять, CTCMның йөрәк гипертрофиясен имитацияләү сәләте йөрәк тукымалары сузылуын арттыру юлы белән бәяләнде. CTCMда һава камерасының иң югары басымы 80 мм.т.б. дан 80 мм.т.б. га кадәр артты. Арт. (нормаль сузылу) Арт. 140 мм.т.б. га кадәр (6а рәсем). Бу сузылуның 32% ка артуына туры килә (6б рәсем), ул элек йөрәк кисемтәләре өчен гипертрофиядә күзәтелгәнгә охшаш саркомер озынлыгына ирешү өчен кирәкле процент сузылуы буларак күрсәтелгән иде. Кыскару һәм релаксация вакытында йөрәк тукымаларының сузылуы һәм тизлеге алты көнлек культура вакытында даими булып калды (6в рәсем). MT шартларында йөрәк тукымалары алты көн дәвамында нормаль сузылуга (MT (Нормаль)) яки артык сузылу шартларында (MT (OS)) үткәрелде. Дүрт көн культурада булганнан соң, гипертрофик биомаркер NT-ProBNP MT (OS) шартларында MT (Нормаль) шартлар белән чагыштырганда мохиттә сизелерлек югарырак иде (7а рәсем). Моннан тыш, алты көнлек культуралаштырудан соң, MT (OS) күзәнәк зурлыгы (7б рәсем) MT йөрәге кисәкләре белән чагыштырганда сизелерлек арткан (нормаль). Моннан тыш, артык сузылган тукымаларда NFATC4 ядро ​​транслокациясе сизелерлек арткан (7в рәсем). Бу нәтиҗәләр гипертаратудан соң патологик ремоделизациянең прогрессив үсешен күрсәтә һәм CTCM җайланмасын сузылу аркасында йөрәк гипертрофиясе сигнализациясен өйрәнү өчен платформа буларак кулланырга мөмкин дигән концепцияне раслый.
Һава камерасы басымының, сыеклык камерасы басымының һәм тукыма хәрәкәтен үлчәүнең типик эзләре камера басымының сыеклык камерасы басымын үзгәртүен, тукыма кисәгенең тиешле хәрәкәтен китереп чыгаруын раслый. b Нормаль рәвештә сузылган (кызгылт сары) һәм артык сузылган (зәңгәр) тукыма кисәкләре өчен типик сузылу проценты һәм сузылу тизлеге кәкреләре. c Цикл вакытын (төрле дуңгызлардан төркемдә n = 19 кисәк), кыскару вакытын (төрле дуңгызлардан төркемдә n = 18-19 кисәк), релаксация вакытын (төрле дуңгызлардан төркемдә n = 19 кисәк), тукыма хәрәкәте амплитудасын (төрле дуңгызлардан n = 14 кисәк/төркем), пик систолик тизлекне (төрле дуңгызлардан n = 14 кисәк/төркем) һәм пик релаксация тизлеген (төрле дуңгызлардан n = 14 (D0), 15 (D6)), ике койрыклы Стьюдентның t-тестында бернинди параметрда да әһәмиятле аерма күрсәтелмәде, бу параметрларның артык көчәнеш белән 6 көнлек культура вакытында даими булып калуын күрсәтә. Хата сызыклары уртача ± стандарт тайпылышны күрсәтә.
a Төрле дуңгызлардан алынган йөрәк кисәкләреннән алынган MT нормаль сузылу (Нормаль) яки артык сузылу (OS) шартларында (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm һәм D4 MTOS) кисәк/төркем культура мохитендә NT-ProBNP концентрациясенең баганалы графиктагы санлаштыруы, Ике яклы ANOVA башкарыла; **p < 0,01 нормаль сузылу белән чагыштырганда). a Төрле дуңгызлардан алынган йөрәк кисәкләреннән алынган MT нормаль сузылу (Нормаль) яки артык сузылу (OS) шартларында (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm һәм D4 MTOS) кисәк/төркем культура мохитендә NT-ProBNP концентрациясенең баганалы график саннары, Ике яклы ANOVA башкарыла; **p < 0,01 нормаль сузылу белән чагыштырганда).Төрле дуңгызлардан алынган гадәти MT сузылу (нормаль) яки артык сузылу (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm һәм D4).MTOS) кисәкләре / төркем шартларында үстерелгән йөрәк кисәкләреннән алынган культура мохитендәге NT-ProBNP концентрациясенең санлы гистограммасы, дисперсиянең ике факторлы анализы башкарылды;** p <0,01 по сравнению с каникным раст аденением). **гадәти сузылу белән чагыштырганда p < 0,01). a 在 MT Norm (Норм) 或过度拉伸 (ОС) 条件下培养的心脏切片培养基中 NT-ProBNP 浓度的条形图量化（ n = 4 (D2 MTNorm) 、 3 （D2 MTOS 、 D4 MTNorm 和 D4 MTOS ）来自不同猪的切片 / 组，进行双向方差分析； ** 与正常拉伸相比， p <0.01 ）。 MT нормаль сузылу (Норм) яки чиктән тыш (OS) шартларында культуралы йөрәк кисәкләрендә NT-ProBNP концентрациясенең күләме (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm 和 D4 MTOS) төрле 猪的切片 / 组，可以双向方方发发动; ** нормаль сузу белән чагыштырганда, p <0.01).гистограмма Төрле дуңгызлардан алынган гадәти MT сузылу (нормаль) яки артык сузылу (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm) һәм D4 MTOS) кисәкләре/төркем шартларында үстерелгән йөрәк кисәкләрендә NT-ProBNP концентрацияләрен санлаштыру, дисперсиянең ике яклы анализы;** p <0,01 по сравнению с каникным раст аденением). **гадәти сузылу белән чагыштырганда p < 0,01). b Тропонин-T һәм WGA белән буялган йөрәк кисәкләре өчен репрезентатив рәсемнәр (сулда) һәм күзәнәк зурлыгын санлаштыру (уңда) (n = 330 (D6 MTOS), төрле дуңгызларның 10 төрле кисәгеннән 369 (D6 MTNorm) күзәнәк/төркем, Ике койрыклы Студент t-тест үткәрелә; нормаль сузылу белән чагыштырганда ****p < 0.0001). b Тропонин-T һәм WGA белән буялган йөрәк кисәкләре өчен репрезентатив рәсемнәр (сулда) һәм күзәнәк зурлыгын санлаштыру (уңда) (n = 330 (D6 MTOS), төрле дуңгызларның 10 төрле кисәгеннән 369 (D6 MTNorm) күзәнәк/төркем, Ике койрыклы Студент t-тест үткәрелә; нормаль сузылу белән чагыштырганда ****p < 0.0001). b Репрезент елны изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слева) һәм количественного определения размера клеток (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm ск рот р) свиней, два- про проитится хвостовой т-критерий Стьюдента **** р <0,0001 по сравнению с чанным раст кинением); b Тропонин-Т һәм AZP белән буялган йөрәк кисемтәләренең репрезентатив рәсемнәре (сулда) һәм күзәнәк зурлыгы саннары (уңда) (n = 330 (D6 MTOS), төрле дуңгызларның 10 төрле кисемтәсеннән 369 (D6 MTNorm) күзәнәк/төркем, ике койрыклы Стьюдент t-тест үткәрелде; ****p < 0,0001 нормаль штамм белән чагыштырганда). b 用肌钙蛋白 -T 和 WGA （左）和细胞大小量化（右）染色的心脏切片的代表性图像（ n = 330 （D6 MTOS ），来自不同猪的 10 个不同切片的 369 （D6 MTNorm ）细胞 / 组，两进行有尾学生 t 检验；与正常拉伸相比， **** p <0.0001 ）。 b Кальцареин-Т һәм WGA белән буялган йөрәк кисәкләренең репрезентатив рәсемнәре (сулда) һәм күзәнәк зурлыгы (уңда) (n = 330 (D6 MTOS), 10 төрле кисәктән 369 (D6 MTNorm)) Күзәнәкләр/Күзәнәкләр, нормаль сузылу белән чагыштырганда, ****p < 0.0001). b Репрезент каныны изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слева) һәм количественная оценка размера клеток (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) из 10 скичлыч дву зононние критерий Стьюдента **** р <0,0001 по сравнению с чанным раст зенением); b Тропонин-Т һәм AZP белән буялган йөрәк кисемтәләренең репрезентатив рәсемнәре (сулда) һәм күзәнәк зурлыгының санлаштыруы (уңда) (төрле дуңгызларның 10 төрле кисемтәсеннән n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm)) Күзәнәкләр/төркем, ике койрыклы критерий Студентның t; ****p < 0.0001 нормаль штамм белән чагыштырганда). c Тропонин-T һәм NFATC4 өчен иммуномаркаланган MTOS йөрәк кисәкләренең 0 һәм 6 көннәр өчен репрезентатив рәсемнәре һәм NFATC4ның CM төшләренә транслокациясен санлаштыру (n = 4 (D0), төрле дуңгызлардан 3 (D6 MTOS) кисәк/төркем, Ике койрыклы Студент t-тест башкарыла; *p < 0.05). c Тропонин-T һәм NFATC4 өчен иммуномаркаланган MTOS йөрәк кисәкләренең 0 һәм 6 көннәр өчен репрезентатив рәсемнәре һәм NFATC4ның CM төшләренә транслокациясен санлаштыру (n = 4 (D0), төрле дуңгызлардан 3 (D6 MTOS) кисәк/төркем, Ике койрыклы Студент t-тест башкарыла; *p < 0.05). c Репрезент каныны изображения для срезов сердца 0 и 6 дней MTOS, им исомомеченых для тропонина-Т и NFATC4, и количественная осенка чилоккации NFATC4 в ядра кавернозных клеток (n = 4) разных свиней, виполняется дву зононний т-критерий Стьюдента * p <0,05); c 0 һәм 6 көнлек MTOS вакытында йөрәк кисемтәләре өчен репрезентатив рәсемнәр, тропонин-T һәм NFATC4 өчен иммуномаркаланган, һәм каверноз күзәнәкләрнең төшендә NFATC4 транслокациясенең саннарын билгеләү (n = 4 (D0), төрле дуңгызлардан 3 (D6 MTOS) кисемтә/төркем) ике койрыклы Стьюдент t-тестында башкарылган; *p < 0.05). c 用于肌钙蛋白 -T 和 NFATC4 免疫标记的第 0 天和第 6 天 MTOS 心脏切片的代表性图像，以及来自不同猪的 NFATC4 易位至 CM 细胞核的量化（ n = 4 (D0) 、 3 (D6 MTOS) 切片 / 组, 进行双尾学生 t 检验； * p <0.05)。 c Кальканин-Т һәм NFATC4 иммунолабелингның образлы рәсемнәре 第 0 天和第 6 天 MTOS йөрәк кисәкләре, һәм NFATC4 төрле NFATC4 易位至 CM күзәнәк ядрәсе 的 саны 化 (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) 切礼 / 组, 时间双尾学生 et 电影； * p <0.05). c Репрезент каныны изображения срезов сердца MTOS на 0 и 6 день для им исомомарировки тропонином-Т и NFATC4 и количественная осенка чилокакасии NFATC4 в ядра CM от разных свиней (n = 4 (D0) хвостатый т-критерий Стьюдента * р <0,05); c Төрле дуңгызлардан алынган CM ядросында тропонин-T һәм NFATC4 иммуномаркалаштыру һәм NFATC4 транслокациясен санлаштыру өчен 0 һәм 6 көннәрдә MTOS йөрәк кисәкләренең репрезентатив рәсемнәре (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) кисәк/төркем, ике койрыклы t-критерие Студентныкы; *p < 0.05).Хата сызыклары уртача ± стандарт тайпылышны күрсәтә.
Трансляцияле йөрәк-кан тамырлары тикшеренүләре йөрәк мохитен төгәл кабатлый торган күзәнәк модельләрен таләп итә. Бу тикшеренүдә йөрәкнең ультра-нечкә кисәкләрен стимуллаштыра алырлык CTCM җайланмасы эшләнгән һәм характеристикаланган. CTCM системасы физиологик яктан синхронлаштырылган электромеханик стимуляцияне һәм T3 һәм Dex сыекчасын баетуды үз эченә ала. Дуңгыз йөрәге кисәкләренә бу факторлар тәэсир иткәндә, аларның яшәүчәнлеге, структураль бөтенлеге, метаболик активлыгы һәм транскрипция экспрессиясе 12 көнлек культурадан соң яңа йөрәк тукымасындагы кебек үк калган. Моннан тыш, йөрәк тукымасының артык сузылуы гиперэкстензия аркасында йөрәкнең гипертрофиясенә китерергә мөмкин. Гомумән алганда, бу нәтиҗәләр физиологик культура шартларының нормаль йөрәк фенотипын саклап калуда мөһим ролен раслый һәм даруларны тикшерү өчен платформа булып тора.
Кардиомиоцитларның эшләве һәм яшәве өчен оптималь мохит булдыруга күп факторлар өлеш кертә. Бу факторларның иң ачыклары (1) күзәнәкара үзара бәйләнешләр, (2) электромеханик стимуляция, (3) гумораль факторлар һәм (4) метаболик субстратлар белән бәйле. Физиологик күзәнәк-күзәнәк үзара бәйләнешләре өчен күзәнәктән тыш матрица белән тәэмин ителгән күп күзәнәк төрләренең катлаулы өч үлчәмле челтәрләре кирәк. Мондый катлаулы күзәнәк үзара бәйләнешләрен in vitro шартларында аерым күзәнәк төрләрен бергәләп үстерү юлы белән торгызу авыр, ләкин йөрәк кисемтәләренең органотипик табигатен кулланып җиңел генә ирешеп була.
Кардиомиоцитларның механик сузылуы һәм электр стимуляциясе йөрәк фенотипын саклап калу өчен бик мөһим33,34,35. Механик стимуляция hiPSC-CM кондицияләү һәм өлгерү өчен киң кулланылса да, күптән түгел берничә нәфис тикшеренүдә йөрәк кисәкләрен культурада бер күчәрле йөкләү кулланып механик стимуляцияләү сынап каралды. Бу тикшеренүләр күрсәткәнчә, 2D бер күчәрле механик йөкләү культура вакытында йөрәк фенотипына уңай йогынты ясый. Бу тикшеренүләрдә йөрәк кисәкләре я изометрик сузылу көчләре17, сызыклы аукотон йөкләү18 белән йөкләнгән, яисә йөрәк циклы көч датчигы кире элемтәсе һәм киеренкелек җайланмалары ярдәмендә яңадан төзелгән. Ләкин бу ысуллар әйләнә-тирә мохитне оптимизацияләмичә бер күчәрле тукыма сузылуын куллана, бу күп йөрәк геннарының бастырылуына яки аномаль сузылу җаваплары белән бәйле геннарның артык экспрессиясенә китерә. Монда тасвирланган CTCM цикл вакыты һәм физиологик сузылу ягыннан табигый йөрәк циклын имитацияләүче 3D электромеханик стимул бирә (25% сузылу, 40% систола, 60% диастола һәм минутына 72 тибеш). Бу өч үлчәмле механик стимуляция генә тукымаларның бөтенлеген саклап калу өчен җитәрлек булмаса да, тукымаларның яшәүчәнлеген, функциясен һәм бөтенлеген тиешенчә саклап калу өчен T3/Dex кулланып гумораль һәм механик стимуляция комбинациясе кирәк.
Гумораль факторлар өлкәннәрнең йөрәк фенотипын модуляцияләүдә мөһим роль уйный. Бу HiPS-CM тикшеренүләрендә ачыкланды, анда күзәнәк өлгерүен тизләтү өчен культура мохитенә T3 һәм Dex өстәлде. T3 аминокислоталарның, шикәрләрнең һәм кальцийның күзәнәк мембраналары аша ташылуына тәэсир итә ала36. Моннан тыш, T3 MHC-α экспрессиясен һәм MHC-β түбәнәюен стимуллаштыра, җитлеккән кардиомиоцитларда тиз тартылучы миофибриллалар формалашуын стимуллаштыра, тумыштан килгән CMдагы әкрен тартылучы миофибриллалар белән чагыштырганда. Гипотиреозлы пациентларда T3 җитмәү миофибрилляр полосаларның югалуына һәм тонус үсеш тизлегенең кимүенә китерә37. Dex глюкокортикоид рецепторларына тәэсир итә һәм аерым перфузияләнгән йөрәкләрдә миокард кыскаручанлыгын арттыра дип күрсәтелгән;38 бу яхшыру кальций утырмаларына (SOCE) йогынты ясау белән бәйле дип санала39,40. Моннан тыш, Dex үзенең рецепторларына бәйләнә, иммун функциясен һәм ялкынсынуны бастыручы киң күзәнәк эчендәге җавап тудыра30.
Нәтиҗәләребез күрсәткәнчә, физик механик стимуляция (MS) Ctrl белән чагыштырганда гомуми культура эшчәнлеген яхшыртты, ләкин культурада 12 көн дәвамында яшәүчәнлекне, структураль бөтенлекне һәм йөрәк экспрессиясен саклап кала алмады. Ctrl белән чагыштырганда, CTCM (MT) культураларына T3 һәм Dex өстәү яшәүчәнлекне яхшыртты һәм 12 көн дәвамында яңа йөрәк тукымалары белән охшаш транскрипция профильләрен, структураль бөтенлекне һәм метаболик активлыкны саклады. Моннан тыш, тукымаларның сузылу дәрәҗәсен контрольдә тотып, STCM кулланып гиперэкстензия аркасында йөрәк гипертрофиясе моделе төзелде, бу STCM системасының күпкырлылыгын күрсәтә. Йөрәкнең ремоделингы һәм фиброз гадәттә кан әйләнеше күзәнәкләре тиешле цитокиннарны, шулай ук ​​фагоцитозны һәм башка ремоделинг факторларын тәэмин итә ала торган бөтен органнарны үз эченә алса да, йөрәк кисәкләре стресс һәм травмага җавап итеп фиброз процессын имитацияли ала. миофибробластларга. Бу элек бу йөрәк кисәге моделендә бәяләнде. CTCM параметрларын басым/электр амплитудасын һәм ешлыгын үзгәртеп, тахикардия, брадикардия һәм механик кан әйләнешен тәэмин итү (механик йөкләнешсез йөрәк) кебек күп кенә хәлләрне симуляцияләү юлы белән модуляцияләргә мөмкин икәнен билгеләп үтәргә кирәк. Бу системаны даруларны сынау өчен уртача үткәрүчәнлеккә әйләндерә. CTCMның артык көчәнеш аркасында йөрәк гипертрофиясен модельләштерү сәләте бу системаны шәхси терапия өчен сынау өчен юл ача. Нәтиҗә ясап шуны әйтергә мөмкин: бу тикшеренү механик сузылу һәм гумораль стимуляция йөрәк тукымалары кисемтәләрен культурада саклап калу өчен бик мөһим икәнен күрсәтә.
Монда китерелгән мәгълүматлар CTCM-ның миокардның бөтенлеген модельләштерү өчен бик өметле платформа булуын күрсәтсә дә, бу культура ысулының кайбер чикләүләре бар. CTCM культурасының төп чикләүе шунда ки, ул кисемтәләргә өзлексез динамик механик көчәнешләр сала, бу һәр цикл вакытында йөрәк кисемтәләренең кыскаруларын актив рәвештә күзәтү мөмкинлеген чикли. Моннан тыш, йөрәк кисемтәләренең кечкенә зурлыгы (7 мм) аркасында, традицион көч сенсорларын кулланып, культура системаларыннан тыш систолик функцияне бәяләү мөмкинлеге чикләнгән. Хәзерге кулъязмада без бу чикләүне оптик көчәнешне кыскару функциясенең индикаторы буларак бәяләп өлешчә җиңәбез. Ләкин бу чикләү өстәмә эш таләп итәчәк һәм киләчәктә культурада йөрәк кисемтәләренең функциясен оптик мониторинглау ысулларын кертү, мәсәлән, кальций һәм көчәнешкә сизгер буягычлар кулланып оптик карталаштыру юлы белән хәл ителергә мөмкин. CTCM-ның тагын бер чикләүе шунда ки, эш моделе физиологик көчәнешне (алдан йөкләү һәм аннан соңгы йөкләнеш) манипуляцияләми. CTCM-да бик зур тукымаларда диастолада (тулы сузылу) һәм систолада (электр стимуляциясе вакытында кыскару озынлыгы) 25% физиологик сузылуны кабатлау өчен басым капма-каршы юнәлешләрдә индукцияләнде. Бу чикләү киләчәк CTCM проектларында йөрәк тукымасына ике яктан да җитәрлек басым ясау һәм йөрәк камераларында барлыкка килә торган басым-күләм мөнәсәбәтләрен төгәл куллану юлы белән бетерелергә тиеш.
Бу кулъязмада хәбәр ителгән артык сузылу аркасында барлыкка килгән үзгәртеп кору гипертрофик гиперсузылу сигналларын имитацияләү белән чикләнә. Шулай итеп, бу модель гумораль яки нейрон факторларына (бу системада юк) мохтаҗлык булмыйча, сузылу аркасында барлыкка килгән гипертрофик сигналлаштыруны өйрәнүдә ярдәм итә ала. CTCM күплеген арттыру өчен алга таба тикшеренүләр кирәк, мәсәлән, иммун күзәнәкләре, әйләнештәге плазма гумораль факторлары белән бергә үстерү һәм нейрон күзәнәкләре белән бергә үстерү вакытында иннервация CTCM белән авыруларны модельләштерү мөмкинлекләрен яхшыртачак.
Бу тикшеренүдә унөч дуңгыз кулланылды. Хайваннар белән барлык процедуралар да учреждение күрсәтмәләренә туры китереп башкарылды һәм Луисвилл университетының Хайваннарны карау һәм куллану буенча учреждение комитеты тарафыннан расланды. Аорта дугасы кысылды һәм йөрәккә 1 л стериль кардиоплегия (110 мМ NaCl, 1,2 мМ CaCl2, 16 мМ KCl, 16 мМ MgCl2, 10 мМ NaHCO3, 5 U/мл гепарин, рН 7,4 кадәр) белән перфузияләнде; йөрәкләр бозлы кардиоплегик эремәдә сакланган, алар лабораториягә бозда күчерелгәнче, гадәттә <10 минут дәвам иткән. йөрәкләр бозлы кардиоплегик эремәдә сакланган, алар лабораториягә бозда күчерелгәнче, гадәттә <10 минут дәвам иткән. сердца хранили в ледяном кардиоп огическом растворе до сировировки в лабораторию на льду, что обикно занимает <10 мин. йөрәкләр бозлы кардиоплегик эремәдә сакланган, аларны лабораториягә бозда күчерү гадәттә 10 минуттан кимрәк вакыт ала.将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常 <10 分钟。将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常 <10 分钟。 Держите сердца в ледяной кардиопгии до зирировки в лаборатораторю на льду, обикно <10 мин. Кардиоплегиядән соң йөрәкләрне бозда лабораториягә бозда күчергәнче, гадәттә 10 минуттан азрак вакытка, бозда тотыгыз.
CTCM җайланмасы SolidWorks компьютер ярдәмендә проектлау (CAD) программасында эшләнгән. Культура камералары, бүлгечләр һәм һава камералары CNC үтә күренмәле акрил пластиктан эшләнгән. 7 мм диаметрлы резерв боҗрасы үзәктә югары тыгызлыклы полиэтиленнан (HDPE) эшләнгән һәм астагы мохитне герметизацияләү өчен кулланыла торган силикон боҗрасын урнаштыру өчен о-ринглы уемга ия. Нечкә кремний мембранасы культура камерасын аеру пластинасыннан аера. Силикон мембрана 0,02 дюйм калынлыктагы силикон биттән лазер белән киселгән һәм 35 А катылыкка ия. Аскы һәм өске силикон прокладкалар 1/16 дюйм калынлыктагы силикон биттән лазер белән киселгән һәм 50 А катылыкка ия. Блокны беркетү һәм һава үткәрми торган герметизация ясау өчен 316L дат басмас корыч винтлар һәм канат гайкалары кулланыла.
C-PACE-EM системасы белән интеграцияләнерлек итеп махсус басма схема платасы (PCB) эшләнгән. PCB'дагы Швейцария машинасы тоташтыргычлары көмеш белән капланган бакыр чыбыклар һәм электродларга борылган бронза 0-60 винтлар ярдәмендә графит электродларына тоташтырылган. Басма схема платасы 3D принтерның тышлыгына урнаштырылган.
CTCM җайланмасы йөрәк циклына охшаш контрольдә тотыла торган кан әйләнеше басымын булдыручы программалаштырыла торган пневматик актуатор (PPD) белән идарә ителә. Һава камерасы эчендәге басым артканда, сыгылмалы силикон мембрана өскә таба киңәя, мохитне тукыма астына мәҗбүр итә. Аннары тукыма өлкәсе бу сыеклыкның чыгарылуы белән сузылачак, диастола вакытында йөрәкнең физиологик киңәюен кабатлый. Релаксациянең иң югары ноктасында графит электродлары аша электр стимуляциясе кулланылды, бу һава камерасындагы басымны киметте һәм тукыма кисәкләренең кыскаруына китерде. Торба эчендә һава системасындагы басымны ачыклау өчен басым сенсоры булган гемостатик клапан урнашкан. Басым сенсоры тарафыннан сизелгән басым ноутбукка тоташтырылган мәгълүмат җыючыга бирелә. Бу газ камерасы эчендәге басымны өзлексез күзәтергә мөмкинлек бирә. Максималь камера басымына җиткәч (стандарт 80 мм.т.б., 140 мм.т.б. OS), мәгълүмат җыю җайланмасына C-PACE-EM системасына сигнал җибәрергә кушылды, ул 4 В итеп 2 мс өчен ике фазалы көчәнеш сигналын булдырырга тиеш иде.
Йөрәк кисемтәләре алынды һәм 6 чокырда культура шартлары түбәндәгечә башкарылды: Җыелган йөрәкләрне күчерү савытыннан салкын (4° C) кардиоплегия салынган табага күчерегез. Сул карынчык стериль пычак белән изоляцияләнде һәм 1-2 см3 кисәкләргә киселде. Бу тукыма блоклары тукыма терәкләренә тукыма ябыштыргычы белән беркетелде һәм Тирод эремәсе булган тибрәнүчән микротом тукыма ваннасына урнаштырылды һәм өзлексез кислород белән тулыландырылды (3 г/л 2,3-бутандион монооксим (BDM), 140 мМ NaCl (8,18 г) ), 6 мМ KCl (0,447 г), 10 мМ D-глюкоза (1,86 г), 10 мМ HEPES (2,38 г), 1 мМ MgCl2 (1 мл 1 М эремә), 1,8 мМ CaCl2 (1,8 мл 1 М эремә), 1 л ddH2O кадәр). Вибрацияле микротом 80 Гц ешлыкта, горизонталь тибрәнү амплитудасы 2 мм һәм алга китү тизлеге 0,03 мм/с булган 300 мкм калынлыктагы кисәкләрне кисәргә көйләнгән. Тукымалар ваннасы эремәне салкын тоту өчен боз белән әйләндереп алынган һәм температура 4°C температурада сакланган. Микротом ваннасыннан тукыма кисәкләрен бер культура пластинасы өчен җитәрлек кисәк алынганчы бозда өзлексез кислородлы Тирод эремәсе булган инкубация ваннасына күчерегез. Трансвелл культуралары өчен тукыма кисәкләре стериль 6 мм киңлектәге полиуретан терәткечләргә беркетелгән һәм 6 мл оптимальләштерелгән мохиткә (199 мохит, 1x ITS өстәмәсе, 10% FBS, 5 нг/мл VEGF, 10 нг/мл FGF-селте һәм 2X антибиотик-гөмбәчеккә каршы) урнаштырылган. C-Pace аша тукыма кисәкләренә электр стимуляциясе (10 В, ешлыгы 1,2 Гц) кулланылган. TD шартларында, һәр мохит алышынганда 100 нМ һәм 1 мкМ тизлектә яңа T3 һәм Dex өстәлде. Мохит көненә 3 тапкыр алыштыру алдыннан кислород белән туендырыла. Тукымалар кисәкләре инкубаторда 37°C температурада һәм 5% CO2 температурада үстерелде.
CTCM культуралары өчен тукыма кисәкләре модификацияләнгән Тирод эремәсе салынган Петри савытындагы махсус ясалган 3D принтерга урнаштырылды. Җайланма йөрәк кисәгенең зурлыгын терәк боҗрасы мәйданының 25% ына арттыру өчен эшләнгән. Бу йөрәк кисәкләре Тирод эремәсеннән мохиткә күчерелгәннән соң һәм диастола вакытында сузылмасын өчен эшләнә. Гистоакрил җилеме кулланып, 300 мкм калынлыктагы кисәкләр диаметры 7 мм булган терәк боҗрасына беркетелгән. Тукыма кисәкләрен терәк боҗрасына беркеткәннән соң, артык тукыма кисәкләрен кисеп алыгыз һәм беркетелгән тукыма кисәкләрен бер җайланма өчен җитәрлек кисәкләр әзерләнгәнче боз өстендәге (4°C) Тирод эремәсе ваннасына кире урнаштырыгыз. Барлык җайланмалар өчен дә гомуми эшкәртү вакыты 2 сәгатьтән артмаска тиеш. 6 тукыма кисәге терәк боҗраларына беркетелгәннән соң, CTCM җайланмасы җыелды. CTCM культура камерасы 21 мл алдан кислородланган мохит белән алдан тутырыла. Тукыма кисәкләрен культура камерасына күчерегез һәм һава күбекләрен пипетка белән сак кына бетерегез. Аннары тукымалар кисәге тишеккә юнәлтелә һәм әкрен генә урынына басыла. Ниһаять, электрод капкачын җайланмага куегыз һәм җайланманы инкубаторга күчерегез. Аннары CTCM һава торбасына һәм C-PACE-EM системасына тоташтырыгыз. Пневматик җайланма ачыла һәм һава клапаны CTCMны ача. C-PACE-EM системасы ике фазалы ритм вакытында 2 мс дәвамында 1,2 Гц ешлыкта 4 В көчәнеш бирү өчен конфигурацияләнгән. Электродларда графит туплануын булдырмас өчен, мохит көненә ике тапкыр, ә электродлар көненә бер тапкыр алыштырылды. Кирәк булса, тукымалар кисәкләрен культура чокырларыннан алып, алар астына төшкән һава күбекләрен чыгарырга мөмкин. MT эшкәртү шартларында, һәр мохит алышынганда T3/Dex 100 нМ T3 һәм 1 мкМ Dex белән яңа өстәлде. CTCM җайланмалары 37°C температурада һәм 5% CO2 инкубаторында культуралаштырылды.
Йөрәк кисәкләренең сузылган траекторияләрен алу өчен махсус камера системасы эшләнде. Navitar Zoom 7000 18-108 мм макро объективлы SLR камера (Canon Rebel T7i, Canon, Токио, Япония) кулланылды (Navitar, Сан-Франциско, Калифорния). Визуализация яңа материал белән алыштырылганнан соң бүлмә температурасында башкарылды. Камера 51° почмакта урнаштырыла һәм видео секундына 30 кадр тизлегендә яздырыла. Башта йөрәк кисәкләренең хәрәкәтен санлаштыру өчен Image-J белән ачык чыганаклы программа тәэминаты (MUSCLEMOTION43) кулланылды. Шау-шуны булдырмас өчен, йөрәк кисәкләренең тибеше өчен кызыксыну өлкәләрен билгеләү өчен битлек MATLAB (MathWorks, Natick, MA, АКШ) ярдәмендә булдырылды. Кадрлар эзлеклелегендәге барлык рәсемнәргә кул белән сегментланган битлекләр куела һәм аннары MUSCLEMOTION плагинына тапшырыла. Muscle Motion һәр кадрдагы пиксельләрнең уртача интенсивлыгын аның эталон кадрга карата хәрәкәтен санлаштыру өчен куллана. Мәгълүматлар язып алынды, фильтрланды һәм цикл вакытын санлаштыру һәм йөрәк циклы вакытында тукымаларның сузылуын бәяләү өчен кулланылды. Яздырылган видео беренче дәрәҗәдәге нуль фазалы цифрлы фильтр ярдәмендә эшкәртелде. Тукымаларның сузылуын (пиктан пикка кадәр) санлаштыру өчен, язылган сигналдагы пикларны һәм түбәнлекләрне аеру өчен пиктан пикка кадәр анализ үткәрелде. Моннан тыш, сигнал дрейфын бетерү өчен 6 нчы дәрәҗәдәге полином ярдәмендә трендны киметү башкарыла. MATLABта глобаль тукыма хәрәкәтен, цикл вакытын, релаксация вакытын һәм кысылу вакытын билгеләү өчен программа коды эшләнде (Өстәмә программа коды 44).
Деформация анализы өчен, механик сузылуны бәяләү өчен ясалган шул ук видеоларны кулланып, без башта MUSCLEMOTION программасы буенча хәрәкәт пикларын (иң югары (өске) һәм иң түбән (түбән) хәрәкәт нокталарын) күрсәтүче ике рәсемне күзәттек. Аннары без тукыма өлкәләрен сегментладык һәм сегментланган тукымага күләгәләү алгоритмы формасын кулландык (Өстәмә 2a рәсем). Сегментланган тукыма аннары ун аскы катламга бүленде, һәм һәр өслеккә көчәнеш түбәндәге тигезләмә ярдәмендә исәпләнде: Деформация = (Өстәү-Төшү)/Төшү, монда Өстәү һәм Төшү - форманың тукыманың өске һәм аскы күләгәләреннән ераклыгы (Өстәмә 2b рәсем).
Йөрәк кисемтәләре 4% параформальдегидта 48 сәгать дәвамында фиксацияләнде. Фиксацияләнгән тукымалар 1 сәгать дәвамында 10% һәм 20% сахарозада сусызландырылды, аннары төнлә 30% сахарозада сусызландырылды. Аннары кисемтәләрне оптималь кисү температурасы катнашмасына (OCT катнашмасы) керттеләр һәм изопентан/коры бозлы ваннада әкренләп туңдырдылар. OCT урнаштыру блокларын -80 °C температурада аерганчы саклагыз. Слайдлар 8 мкм калынлыктагы кисемтә рәвешендә әзерләнде.
Йөрәк кисемтәләреннән OCTны алу өчен, слайдларны җылыту блогында 95 °C температурада 5 минут җылытыгыз. Һәр слайдка 1 мл PBS өстәгез һәм бүлмә температурасында 30 минут инкубацияләгез, аннары 0,1% Triton-Xны PBSта 15 минутка куеп, кисемтәләргә үтеп керегез. Специфик булмаган антитәнчекләрнең үрнәккә бәйләнүенә юл куймас өчен, слайдларга 1 мл 3% BSA эремәсе өстәгез һәм бүлмә температурасында 1 сәгать инкубацияләгез. Аннары BSA алынды һәм слайдлар PBS белән юылды. Һәр үрнәкне карандаш белән билгеләгез. Беренчел антитәнчекләр (1% BSAда 1:200 сыекландырылган) (connexin 43 (Abcam; #AB11370), NFATC4 (Abcam; #AB99431) һәм тропонин-T (Thermo Scientific; #MA5-12960) 90 минут дәвамында өстәлде, аннары тычкан Alexa Fluor 488 (Thermo Scientific; #A16079), куян Alexa Fluor 594 (Thermo Scientific; #T6391) га каршы өстәмә 90 минут дәвамында икенчел антитәнчекләр (1% BSAда 1:200 сыекландырылган) өстәлде. Максатлы буяуны фоннан аеру өчен, без контроль буларак икенчел антитәнчекне генә кулландык. Ниһаять, DAPI ядро ​​буявы өстәлде һәм слайдлар vectashield (Vector Laboratories) эченә урнаштырылды һәм тырнак лагы белән ябыштырылды. -x зурайту) һәм 40x зурайтулы Keyence микроскобы белән ябыштырылды.
WGA буявы өчен PBS'та 5 мкг/мл концентрациясендә WGA-Alexa Fluor 555 (Thermo Scientific; #W32464) кулланылды һәм бүлмә температурасында 30 минут дәвамында билгеләнгән кисәкләргә сөртелде. Аннары слайдлар PBS белән юылды һәм һәр слайдка Судан карасы өстәлде һәм 30 минут инкубацияләнде. Аннары слайдлар PBS белән юылды һәм векташильд урнаштыручы мохит өстәлде. Слайдлар Кейнс микроскобында 40 тапкыр зурайтып күрсәтелде.
OCT югарыда тасвирланганча үрнәкләрдән алынды. OCTны алганнан соң, слайдларны төн буе Буин эремәсенә мандырыгыз. Аннары слайдлар 1 сәгать дәвамында дистилляцияләнгән су белән чайкатылды, аннары 10 минутка Бибрих алоэ кислотасы фуксин эремәсенә салынды. Аннары слайдлар дистилляцияләнгән су белән юылды һәм 10 минутка 5% фосфомолибден/5% фосфовольфрам кислотасы эремәсенә салынды. Чайкамыйча, слайдларны турыдан-туры 15 минутка анилин зәңгәре эремәсенә күчерегез. Аннары слайдлар дистилляцияләнгән су белән юылды һәм 2 минутка 1% сиркә кислотасы эремәсенә салынды. Слайдлар 200 Н этанолда киптерелде һәм ксилолга күчерелде. Буялган слайдлар 10х объективлы Кейнс микроскопы ярдәмендә күрсәтелде. Фиброз мәйданы проценты Кейнс анализаторы программасы ярдәмендә сан белән билгеләнде.
CyQUANT™ MTT күзәнәкләренең яшәүчәнлек анализы (Invitrogen, Карлсбад, Калифорния), каталог номеры V13154, җитештерүче протоколы буенча, кайбер үзгәрешләр белән. Аерым алганда, MTT анализы вакытында тукымаларның бердәм зурлыгын тәэмин итү өчен диаметры 6 мм булган хирургик перфоратор кулланылды. Тукымалар җитештерүче протоколы буенча MTT субстраты булган 12 коелы пластинаның коеларына аерым урнаштырылган. Кисемтәләр 37°C температурада 3 сәгать инкубацияләнә, һәм тере тукыма MTT субстратын шәмәхә формазан кушылмасы барлыкка китереп метаболизлый. MTT эремәсен 1 мл DMSO белән алыштырыгыз һәм йөрәк кисемтәләреннән шәмәхә формазанны алу өчен 37°C температурада 15 минут инкубацияләгез. Үрнәкләр 96 коелы үтә күренмәле төп пластиналарда DMSOда 1:10 нисбәтендә суюлтылды һәм шәмәхә төс интенсивлыгы 570 нм да Cytation пластинасы укучысы (BioTek) ярдәмендә үлчәнде. Күрсәтмәләр йөрәкнең һәр кисемтәсенең авырлыгына нормальләштерелде.
Йөрәк кисемтәләре мохите, элек тасвирланганча, глюкозаны куллану анализы өчен 1 мкКи/мл [5-3Н]-глюкоза (Moravek Biochemicals, Brea, CA, АКШ) булган мохит белән алыштырылды. 4 сәгать инкубациядән соң, 100 мкл 0,2 Н HCl булган ачык микроцентрифуга пробиркасына 100 мкл мохит өстәгез. Аннары пробирка 37°C температурада 72 сәгать дәвамында [3Н]2О парга әйләндерү өчен 500 мкл dH2O булган сцинтилляция пробиркасына урнаштырылды. Аннары микроцентрифуга пробиркасын сцинтилляция пробиркасыннан алыгыз һәм 10 мл сцинтилляция сыекчасы өстәгез. Сцинтилляция исәпләүләре Tri-Carb 2900TR сыек сцинтилляция анализаторы (Packard Bioscience Company, Meriden, CT, АКШ) ярдәмендә башкарылды. Аннары глюкоза куллану [5-3H]-глюкозага хас активлыкны, тулы булмаган тигезлекне һәм фонны, [5-3H]-ны билгесез глюкозага кадәр суюлтуны һәм сцинтилляциягә каршы тору нәтиҗәлелеген исәпкә алып исәпләнде. Мәгълүматлар йөрәк кисемтәләренең массасына нормальләштерелде.
Тризолда тукымаларны гомогенизацияләгәннән соң, җитештерүче протоколы буенча Qiagen miRNeasy Micro Kit #210874 кулланып йөрәк кисемтәләреннән РНК аерып алынды. RNAsec китапханәсен әзерләү, секвенирлау һәм мәгълүматларны анализлау түбәндәгечә башкарылды:
РНК китапханәсен әзерләү өчен башлангыч материал буларак һәр үрнәккә 1 мкг РНК кулланылды. Җитештерүченең тәкъдимнәренә туры китереп, NEBNext UltraTM RNA китапханәсен әзерләү комплекты (NEB, АКШ) ярдәмендә секвенирлау китапханәләре булдырылды, һәм һәр үрнәк өчен атрибут эзлеклелегенә индекс кодлары өстәлде. Кыскасы, мРНК поли-Т олигонуклеотидлары белән беркетелгән магнит мончыклары ярдәмендә гомуми РНКдан чистартылды. Фрагментация NEBNext Беренче Чыбык Синтезы Реакциясе Буферында (5X) югары температурада ике валентлы катионнар ярдәмендә башкарыла. Беренче чылбыр кДНК очраклы гексамер праймерлары һәм M-MuLV кире транскриптаза (RNase H-) ярдәмендә синтезланды. Аннары икенче чылбыр кДНК ДНК полимераза I һәм RNase H кулланып синтезлана. Калган өслекләр экзонуклеаза/полимераза активлыгы ярдәмендә тупас очларга әйләндерелә. ДНК фрагментының 3' очы аденилланганнан соң, гибридизациягә әзерләү өчен аңа чәч бәйләгечле элмәк структурасы булган NEBNext адаптеры беркетелгән. Өстенлекле озынлыгы 150-200 б.п. булган кДНК фрагментларын сайлау өчен китапханә фрагментлары AMPure XP системасы (Beckman Coulter, Beverly, АКШ) ярдәмендә чистартылды. Аннары, адаптер белән бәйләнгән зурлыгы буенча сайланган кДНК белән 3 мкл USER Enzyme (NEB, АКШ) 37°C температурада 15 минут, аннары 95°C температурада 5 минут кулланылды, аннары ПТР үткәрелде. Аннары ПТР Phusion High-Fidelity ДНК полимеразасы, универсаль ПЦР праймерлары һәм Index (X) праймерлары ярдәмендә үткәрелде. Ниһаять, ПЦР продуктлары чистартылды (AMPure XP системасы) һәм китапханә сыйфаты Agilent Bioanalyzer 2100 системасында бәяләнде. Аннары кДНК китапханәсе Novaseq секвенсеры ярдәмендә секвенирланды. Illumina'дан чимал рәсем файллары CASAVA Base Calling ярдәмендә чимал укуларга әйләндерелде. Чимал мәгълүматлар уку эзлеклелекләрен һәм тиешле база сыйфатларын үз эченә алган FASTQ(fq) форматындагы файлларда саклана. Фильтрланган секвенирлау укуларын Sscrofa11.1 белешмә геномы белән туры китерү өчен HISAT2 сайлагыз. Гомумән алганда, HISAT2 теләсә нинди зурлыктагы геномнарны, шул исәптән 4 миллиард базадан зуррак геномнарны да хуплый, һәм күпчелек параметрлар өчен гадәти кыйммәтләр билгеләнә. РНК секвенирлау мәгълүматларыннан сплайсинг укуларын хәзерге вакытта иң тиз система булган HISAT2 ярдәмендә башка теләсә нинди ысулга караганда бер үк яки яхшырак төгәллек белән нәтиҗәле рәвештә тигезләргә мөмкин.
Транскриптларның күплеге ген экспрессиясе дәрәҗәсен турыдан-туры чагылдыра. Ген экспрессиясе дәрәҗәләре геном яки экзоннар белән бәйле транскриптларның күплеге (секвенирлау саны) белән бәяләнә. Укулар саны ген экспрессиясе дәрәҗәләренә, ген озынлыгына һәм секвенирлау тирәнлегенә пропорциональ. FPKM (миллион база парына секвенирланган транскриптның мең база парына фрагментлар) исәпләнде һәм дифференциаль экспрессиянең P-кыйммәтләре DESeq2 пакеты ярдәмендә билгеләнде. Аннары без һәр P кыйммәте өчен ялган ачу тизлеген (FDR) "p.adjust" R-функциясенә нигезләнгән Бенджамини-Хохберг методын9 кулланып исәпләдек.
Йөрәк кисемтәләреннән алынган РНК Thermo (Thermo, кат. № 11756050) компаниясенең SuperScript IV Vilo Master катнашмасы ярдәмендә 200 нг/мкл концентрациясендә кДНКга әйләндерелде. Санлы RT-ПЦР Applied Biosystems Endura Plate Microamp 384-коелы үтә күренмәле реакция пластинасы (Thermo, кат. № 4483319) һәм микроампер оптик ябыштыргыч (Thermo, кат. № 4311971) ярдәмендә башкарылды. Реакция катнашмасы 5 мкл Taqman Fast Advanced Master катнашмасыннан (Thermo, кат. № 4444557), 0,5 мкл Taqman Primer һәм һәр коега 3,5 мкл H2O кушылганнан торды. Стандарт qPCR цикллары эшләнде һәм КТ кыйммәтләре Applied Biosystems Quantstudio 5 реаль вакытлы ПЦР коралы (384-коелы модуль; продукт № A28135) ярдәмендә үлчәнде. Taqman праймерлары Thermo (GAPDH (Ss03375629_u1), PARP12 (Ss06908795_m1), PKDCC (Ss06903874_m1), CYGB (Ss06900188_m1), RGL1 (Ss06868890_m1), ACTN1 (Ss01009508_mH), GATA4 (Ss03383805_u1), GJA1 (Ss03374839_u1), COL1A2 (Ss03375009_u1), COL3A1 (Ss04323794_m1), ACTA2 (Ss04245588_m1) компанияләреннән сатып алынган. Барлык үрнәкләрнең дә КТ кыйммәтләре GAPDH өй хуҗалыгы генына нормальләштерелгән.
NT-ProBNP препаратының медиа чыгарылышы җитештерүче протоколы нигезендә NT-ProBNP комплекты (дуңгыз) (категория № MBS2086979, MyBioSource) ярдәмендә бәяләнде. Кыскасы, һәр коега икеләтә 250 мкл һәр үрнәк һәм стандарт өстәлде. Үрнәкне өстәгәннән соң, һәр коега 50 мкл А анализ реагенты өстәгез. Пластинканы сак кына селкетегез һәм герметик белән ябыгыз. Аннары таблеткалар 37°C температурада 1 сәгать инкубацияләнде. Аннары эремәне суырып алыгыз һәм коеларны 350 мкл 1X юу эремәсе белән 4 тапкыр юыгыз, һәр тапкыр юу эремәсен 1-2 минут инкубацияләгез. Аннары һәр коега 100 мкл В анализ реагенты өстәгез һәм пластина герметик белән ябыгыз. Таблетка сак кына селкетелде һәм 37°C температурада 30 минут инкубацияләнде. Эремәне суырып алыгыз һәм коеларны 350 мкл 1X юу эремәсе белән 5 тапкыр юыгыз. Һәр чокырда 90 мкл субстрат эремәсе өстәгез һәм пластинаны ябыгыз. Пластинаны 37°C температурада 10-20 минут инкубацияләгез. Һәр чокырда 50 мкл Стоп Эритмәсе өстәгез. Пластинаны шунда ук 450 нмга урнаштырылган Cytation (BioTek) пластина укучысы ярдәмендә үлчәделәр.
Параметрдагы 10% абсолют үзгәрешне ачыклау өчен 80% тан артык көч бирәчәк төркем зурлыкларын сайлау өчен көч анализлары үткәрелде, бу 5% I типтагы хата күрсәткече белән иде. Параметрдагы 10% абсолют үзгәрешне ачыклау өчен 80% тан артык көч бирәчәк төркем зурлыкларын сайлау өчен көч анализлары үткәрелде, бу 5% I типтагы хата күрсәткече белән иде. Аназ мощности был выполнен для выборта размеров группасы, кот че обеспечат> 80% мощности для обнаружения 10% абсолтного изменения Параметра с 5% частотой сихибок чипа I. 5% I типтагы хата күрсәткече белән 10% абсолют параметр үзгәрешен ачыклау өчен >80% көч бирә торган төркем зурлыкларын сайлау өчен көч анализы үткәрелде.进行功效分析以选择将提供> 80 ％功效以检测参数中 10 ％绝对变化和 5 ％ I 型错误率的组大小。进行功效分析以选择将提供> 80 ％功效以检测参数中 10 ％绝对变化和 5 ％ I 型错误率的组大小。 Был проекты Абсолют параметр үзгәрешенең 10% һәм I типтагы хата дәрәҗәсенең 5% булуын ачыклау өчен >80% куәт бирә торган төркем зурлыгын сайлау өчен көч анализы үткәрелде.Эксперимент алдыннан тукыма кисемтәләре очраклы рәвештә сайланды. Барлык анализлар да шартлы рәвештә үткәрелде, ә үрнәкләр барлык мәгълүматлар анализланганнан соң гына декодланды. Барлык статистик анализларны башкару өчен GraphPad Prism программасы (Сан-Диего, Калифорния) кулланылды. Барлык статистика өчен дә, p-кыйммәтләре <0,05 кыйммәтләрендә әһәмиятле дип саналды. Барлык статистика өчен дә, p-кыйммәтләре <0,05 кыйммәтләрендә әһәмиятле дип саналды. Для всей статя пи-значения считались значимыми при значениях <0,05. Барлык статистика өчен дә, p-кыйммәтләре <0,05 кыйммәтләрендә әһәмиятле дип саналды.对于所有统计数据， p 值在值 <0.05 时被认为是显着的。对于所有统计数据， p 值在值 <0.05 时被认为是显着的。 Для всей статя пи-значения считались значимыми при значениях <0,05. Барлык статистика өчен дә, p-кыйммәтләре <0,05 кыйммәтләрендә әһәмиятле дип саналды.Ике яклы Стьюдент t-тест мәгълүматлар буенча нибары 2 чагыштыру белән башкарылды. Бер яки ике яклы ANOVA берничә төркем арасындагы әһәмиятне билгеләү өчен кулланылды. Post hoc тестларын үткәргәндә, күп чагыштыруларны исәпкә алу өчен Туки төзәтмәсе кулланылды. Методлар бүлегендә тасвирланганча, FDR һәм p.adjust исәпләгәндә RNAsec мәгълүматлары махсус статистик исәпкә алына.
Тикшеренү дизайны турында тулырак мәгълүмат алу өчен, бу мәкаләгә сылтама белән бирелгән Nature Research Report аннотациясен карагыз.