Nature.com сайтына кергәнегез өчен рәхмәт.Сез кулланган браузер версиясенең CSS ярдәме чикләнгән.Иң яхшы тәҗрибә өчен без яңартылган браузерны кулланырга киңәш итәбез (яки Internet Explorer'та туры килү режимын сүндерегез).Шул ук вакытта, дәвамлы ярдәмне тәэмин итү өчен, без сайтны стильләр һәм JavaScriptсыз күрсәтәчәкбез.
Наркотиклар сынау өчен йөрәкнең физиологик мохитен төгәл кабатлый алырлык ышанычлы витро системасы кирәк.Кеше йөрәк тукымасы культурасы системасының чикләнгән булуы йөрәк наркоманиясе эффектларын дөрес аңлатуга китерде.Монда без йөрәк тукымаларының культурасы моделен (CTCM) эшләдек, ул электромеханик йөрәк кисәкләрен стимуллаштыра һәм йөрәк циклының систолик һәм диастолик этапларында физиологик сузылу кичерә.12 көн культурадан соң, бу алым йөрәк бүлекләренең яшәешен өлешчә яхшыртты, ләкин аларның структур бөтенлеген тулысынча сакламады.Шуңа күрә, кечкенә молекуланы тикшергәннән соң, без үзебезнең уртага 100 nM триодотиронин (T3) һәм 1 μM дексеметазон (Декс) кушылуы 12 көн бүлекләрнең микроструктурасын саклаганнарын ачыкладык.T3 / Dex дәвалау белән берлектә, CTCM системасы транскрипция профильләрен, яшәешен, метаболик активлыгын, структур бөтенлеген 12 көн дәвамында яңа йөрәк тукымасы белән бер дәрәҗәдә саклады.Моннан тыш, культурада йөрәк тукымаларының артык сузылуы гипертофик йөрәк сигнализациясен китерә, CTCM-ның йөрәк сузуы китергән гипертофик шартларны охшату мөмкинлеген раслый.Ахырда, CTCM йөрәк физиологиясен һәм патофизиологиясен озак вакыт культурада модельләштерә ала, ышанычлы наркотиклар тикшерергә мөмкинлек бирә.
Клиник тикшеренүләр башланганчы, кеше йөрәгенең физиологик мохитен төгәл чагылдыра алырлык ышанычлы витро системалар кирәк.Мондый системалар үзгәртелгән механик сузуны, йөрәк тибешен, электрофизиологик үзлекләрне охшатырга тиеш.Хайван модельләре гадәттә йөрәк физиологиясен тикшерү мәйданы буларак кулланыла, кеше йөрәгендә наркотикларның тәэсирен чагылдыруда ышанычлылыгы чикләнгән1,2.Ахырда, Идеаль йөрәк тукымасы культурасы эксперименталь моделе (CTCM) - бик сизгер һәм төрле терапевтик һәм фармакологик интервенцияләр өчен, кеше йөрәгенең физиологиясен һәм патофизиологиясен төгәл чагылдырган модель3.Мондый системаның булмавы йөрәк җитешсезлеге өчен яңа дәвалау ысулларын табуны чикли4,5 һәм базардан чыгу өчен төп сәбәп буларак наркотик кардиотоксиклыгына китерде6.
Соңгы ун ел эчендә йөрәк-кан тамырлары булмаган сигез препарат клиник кулланудан алынды, чөнки алар QT интервалын озайтуга китерә, карын аритмиясенә һәм кинәт үлемгә китерә7.Шулай итеп, йөрәк-кан тамырларының эффективлыгын һәм токсиклылыгын бәяләү өчен ышанычлы преклиник тикшерү стратегияләренә ихтыяҗ арта.Күптән түгел наркотиклар тикшерүдә һәм токсиклылыкны тикшерүдә кеше китергән плюрипотент тамыр күзәнәкләреннән алынган кардиомиоцитларны (hiPS-CM) куллану бу проблеманы өлешчә чишүне тәэмин итә.Ләкин, hiPS-CMларның җитмәгән табигате һәм йөрәк тукымасының күп күзәнәкле катлаулылыгы булмау - бу ысулның төп чикләүләре.Соңгы тикшеренүләр күрсәткәнчә, бу чикләү өлешчә hiPS-CM кулланып, йөрәк тукымасы гидрогелларын формалаштырып, үз-үзеннән кысылу башланганнан соң һәм вакыт узу белән әкренләп электр стимуляциясен арттырып була.Ләкин, бу hiPS-CM микротиссларында өлкән миокардның җитлеккән электрофизиологик һәм контракт үзлекләре юк.Моннан тыш, кеше йөрәк тукымасы катлаулырак структурага ия, төрле күзәнәк типларының гетероген катнашмасыннан тора, шул исәптән эндотелия күзәнәкләре, нейроннар һәм стромаль фибробластлар, күзәнәктән тыш матрица белгечләре белән бәйләнгән.Бу кардиомиоцит булмаган популяцияләрнең гетерогенлыгы 11,12,13 олы имезүчеләр йөрәгендә йөрәк тукымаларын аерым күзәнәк төрләрен кулланып модельләштерү өчен төп киртә булып тора.Бу төп чикләүләр физиологик һәм патологик шартларда тотрыклы миокард тукымасын үстерү ысулларын эшләүнең мөһимлеген ассызыклый.
Кеше йөрәгенең культуралы нечкә (300 мм) бүлекләре кеше миокардының перспективалы моделе булуын исбатладылар.Бу ысул кеше йөрәк тукымасына охшаган тулы 3D күп күзәнәкле системага керү мөмкинлеген бирә.Ләкин, 2019 елга кадәр, культуралы йөрәк бүлекләрен куллану кыска (24 с) культураның яшәве белән чикләнде.Бу физик-механик сузылуның булмавы, һава-сыек интерфейс, йөрәк тукымасы ихтыяҗларын хупламаган гади медиа куллану кебек берничә фактор белән бәйле.2019 елда берничә тикшеренү төркеме механик факторларны йөрәк тукымасы культурасы системасына кертү культураның гомерен озайтырга, йөрәк экспрессиясен яхшыртырга һәм йөрәк патологиясен охшатырга мөмкинлеген күрсәттеләр.17 һәм 18 ике зәвыклы тикшеренүләр шуны күрсәтә: униаксиаль механик йөкләү культура вакытында йөрәк фенотибына уңай йогынты ясый.Ләкин, бу тикшеренүләр йөрәк циклының динамик өч үлчәмле физик-механик йөкләнешен кулланмады, чөнки йөрәк бүлекләре изометрик киеренке көчләр 17 яки сызыклы аксотоник йөкләү 18 белән йөкләнгән.Бу тукымаларны сузуның бу ысуллары күп йөрәк геннарын кысуга яки аномаль сузылу реакцияләре белән бәйле геннарның чиктән тыш кысылуына китерде.Искиткеч, Питулис һ.б.19 йөрәк кондиционеры реконструкциясе өчен динамик йөрәк кисәкләре культурасы мунчасы эшләнде.Бу система витро йөрәк циклын модельләштерүдә төгәлрәк мөмкинлек бирсә дә, методның катлаулылыгы һәм аз үткәрелүе бу системаны куллануны чикли.Күптән түгел безнең лаборатория электр стимуляциясе һәм оптимизацияләнгән медиа ярдәмендә гадиләштерелгән культура системасын эшләде, дуңгыз һәм кеше йөрәк тукымаларының бүлекчәләренең яшәешен 6 көнгә кадәр 20,21 көнгә кадәр.
Хәзерге кулъязмада без йөрәк тукымасы культурасы моделен (CTCM) тасвирлыйбыз, йөрәк циклы вакытында өч үлчәмле йөрәк физиологиясен һәм патофизиологик дистанцияне кабатлау өчен юмористик үзенчәлекләрне үз эченә алган дуңгыз йөрәгенең бүлекләрен кулланып.Бу CTCM клиник алдынгы препаратларның төгәллеген клиник дәрәҗәгә кадәр тикшерү өчен, имезүчеләр йөрәгенең физиологиясен / патофизиологиясен охшаткан, нәтиҗәле, урта үткәргеч йөрәк системасын тәэмин итеп, ирешелгән дәрәҗәгә кадәр арттыра ала.
Гемодинамик механик сигналлар 22,23,24 витрода кардиомиоцит функциясен саклауда мөһим роль уйныйлар.Хәзерге кулъязмада без CTCM (1а рәсем) эшләдек, ул физиологик ешлыкларда электр һәм механик стимуляция кертеп, олыларның йөрәк мохитен охшата ала (минутына 1,2 Гц, 72 тапкыр).Диастол вакытында тукымаларның артык сузылуына юл куймас өчен, 3D басма җайланмасы тукымаларның күләмен 25% ка арттыру өчен кулланылган (1б рәсем).C-PACE системасы белән эшләнгән электр тизлеге систолдан 100 мс башланырга тиеш иде, йөрәк циклын тулысынча кабатлау өчен мәгълүмат туплау системасы ярдәмендә.Токым культурасы системасы программалаштырылган пневматик актуаторны куллана (LB Engineering, Германия), өске палатада йөрәк кисәкләренең киңәюенә китереп, сыгылмалы силикон мембранасын цикллы киңәйтү өчен.Система басым кондукторы аша тышкы һава линиясенә тоташтырылган, бу басымны (± 1 ммХг) һәм вакытны (± 1 мс) төгәл көйләргә мөмкинлек биргән (1с рәсем).
a тукыманың бүлеген җайланманың культура палатасы эчендә зәңгәр төстә күрсәтелгән 7 мм таякка бәйләгез.Мәдәният камерасы һава камерасыннан нечкә сыгылмалы силикон мембранасы белән аерылган.Агып китмәсен өчен, һәр палата арасында савыт урнаштырыгыз.Deviceайланма капкасында электр стимуляциясе бирүче графит электродлары бар.b Зур тукымалар җайланмасының схематик чагылышы, юллама һәм таяк боҗрасы.Тукымалар бүлекчәләре (коңгырт) зурайтылган җайланмага җайланманың тышкы читендәге трюкка урнаштырылган.Белешмәлекне кулланып, акрил ябыштыргыч белән капланган терәк боҗрасын йөрәк тукымасы бүлегенә урнаштырыгыз.в Программалаштырылган пневматик актуатор (PPD) белән идарә итүче һава камерасы басымы функциясе буларак электр стимуллаштыру вакытын күрсәтүче график.Мәгълүмат алу җайланмасы басым сенсорлары ярдәмендә электр стимуляциясен синхронлаштыру өчен кулланылды.Мәдәният палатасындагы басым билгеләнгән бусагага җиткәч, электр стимуляциясен җибәрү өчен C-PACE-EM импульс сигналы җибәрелә.d Инкубатор киштәсенә куелган дүрт CTCM рәсеме.Дүрт җайланма пневматик схема аша бер PPD белән тоташтырылган, һәм пневматик схемадагы басымны күзәтү өчен гемостатик клапанга басым сенсорлары кертелә.Eachәрбер җайланмада алты тукымалар бүлеге бар.
Бер пневматик актуатор кулланып, без 4 CTCM җайланмасын контрольдә тота алдык, аларның һәрберсе 6 тукымалар бүлеген тота ала (1 нче рәсем).CTCMда, һава камерасындагы һава басымы сыеклык камерасында синхрон басымга әверелә һәм йөрәк кисәгенең физиологик киңәюенә китерә (2а рәсем һәм өстәмә кино 1).Тукыманы бәяләү 80 мм Hg.Сәнгать.тукымалар бүлекләренең 25% ка сузылуын күрсәтте (2б рәсем).Бу процент озынлыгы физиологик саркомерның 2,2-2,3 мм озынлыктагы йөрәк бүлегенең контрактлыгы өчен туры килүен күрсәтте17,19,25.Кисем хәрәкәте махсус камера көйләүләре ярдәмендә бәяләнде (өстәмә рәсем 1).Токым хәрәкәтенең амплитудасы һәм тизлеге (2с рәсем, г) йөрәк циклы һәм систол һәм диастол вакытында сузылуга туры килә (2б рәсем).Кысылу һәм ял итү вакытында йөрәк тукымасының сузылуы һәм тизлеге культурада 12 көн дәвамында калды (2 нче рәсем).Электр стимуляциясенең культура вакытында контрактлыкка тәэсирен бәяләү өчен, без күләгәле алгоритм ярдәмендә актив деформацияне билгеләү ысулын эшләдек (өстәмә рәсем 2а, б) һәм деформацияләрне электр стимуляциясе белән һәм аларсыз аера алдык.Йөрәкнең шул ук бүлеге (2ф рәсем).Киселгән күчерелгән төбәктә (R6-9), электр стимуляциясе вакытында көчәнеш электр стимуляциясе булмаганга караганда 20% югарырак иде, бу электр стимулының контракт функциясенә керткән өлешен күрсәтә.
Airава камерасы басымы, сыек камера басымы, тукымалар хәрәкәтенең үлчәү эзләре камера басымы сыек камера басымын үзгәртә, тукыманың кисәгенең тиешле хәрәкәтенә китерә.b тукымалар өлешенең процент сузылуының (зәңгәр) процент эзләренә туры килгән (кызгылт сары).в Йөрәк кисәгенең үлчәнгән хәрәкәте үлчәнгән хәрәкәт тизлегенә туры килә.г) йөрәк хәрәкәтенең цикллы хәрәкәтенең (зәңгәр сызык) һәм тизлекнең (кызгылт сары нокта) вәкиллекле траекторияләре.e цикл вакытын санлаштыру (группага n = 19 кисәк, төрле дуңгызлардан), кысылу вакыты (төркемгә n = 19 кисәк), ял итү вакыты (төркемгә n = 19 кисәк, төрле дуңгызлардан), тукымалар хәрәкәте (n = 25).кисәкләр) / төрле дуңгызлардан төркем), иң югары систолик тизлек (n = 24 (D0), 25 (D12) кисәкләр / төрле дуңгызлардан төркем) һәм иң югары ял итү тизлеге (n = 24 (D0), 25 (D12) кисәкләр / төрле дуңгызлардан төркем).Ике койрыклы Студентның тесты бернинди параметрда да зур аерма күрсәтмәде.f (кызыл) һәм (зәңгәр) электр стимуляциясе булмаган тукымалар бүлекчәләренең вәкиллекле штамм анализы, шул ук бүлектән тукымалар бүлекчәләренең ун региональ өлкәсе.Түбән панельләр тукымалар бүлекчәләрендәге бүленешнең процент аермасының күләмен күрсәтәләр, төрле бүлекләрдән ун өлкәдә электр стимуляциясе булмаган. (n = 8 дуңгыздан 8 кисәк / төркем, Ике койрыклы Студентлар т-тесты үткәрелә; **** p <0.0001, ** p <0.01, * p <0.05). (n = 8 дуңгыздан 8 кисәк / төркем, Ике койрыклы Студентлар т-тесты үткәрелә; **** p <0.0001, ** p <0.01, * p <0.05). . (n = 8 дуңгыздан 8 бүлек / төркем, ике койрыклы Студентның тесты; **** p <0.0001, ** p <0.01, * p <0.05). （N = 8 片 / 组 ， 来自 ** ** ** ** **** p <0.0001 ， ** p <0.01 ， * p <0.05）。 （N = 8 片 / 组 ， 来自 ** ** ** ** **** p <0.0001 ， ** p <0.01 ， * p <0.05）。 . (n = 8 бүлек / төркем, төрле дуңгызлардан, ике койрыклы Студентның тесты; **** p <0.0001, ** p <0.01, * p <0.05).Хата юллары уртача ± стандарт тайпылышны күрсәтә.
Элеккеге статик биомиметик йөрәк кисәкләре культурасы системасында [20, 21], без электр стимуляциясен кулланып һәм урта составны оптимальләштереп 6 көн йөрәк кисәкләренең яшәешен, функциясен, структур бөтенлеген сакладык.Ләкин, 10 көннән соң, бу саннар кискен кимеде.Без элеккеге статик биомиметик культура системасында культуралы бүлекләргә мөрәҗәгать итәрбез, 20, 21 контроль шартлар (Ctrl) һәм без элек оптимальләштерелгән уртачаны бер үк вакытта механик һәм электр стимуляциясе (CTCM) шартларында MC шартлары һәм культурасы итеп кулланачакбыз.дип атала.Беренчедән, без электр стимуляциясе булмаган механик стимуляция тукымаларның яшәешен 6 көн дәвамында саклап калу өчен җитәрлек түгеллеген ачыкладык (өстәмә рәсем 3а, б).Шунысы кызык, STCM ярдәмендә физио-механик һәм электр стимуляциясе кертелгәч, 12 көнлек йөрәк бүлекчәләренең яшәү сәләте яңа йөрәк бүлекчәләрендәге кебек, MS шартларында, ләкин Ctrl шартларында түгел, MTT анализы күрсәткәнчә (1 нче рәсем).3а).Бу шуны күрсәтә: йөрәк циклын механик стимуллаштыру һәм симуляция тукымалар бүлекләрен элеккеге статик культура системасында хәбәр ителгәннән ике тапкыр озаграк саклый ала.Ләкин, тукымалар бүлекләренең структур бөтенлеген бәяләү, йөрәк тропонины һәм 43 коннексин иммунолабеллагы белән бәяләнде, коннексин 43 экспрессиясе 12-нче көнне МК тукымаларында шул ук көндәге контрольгә караганда зуррак булган.Ләкин, бердәм коннексин 43 экспрессия һәм Z-диск формалашуы тулысынча сакланмаган (3б рәсем).Без ясалма интеллект (AI) базасын тукымаларның структур бөтенлеген бәяләү өчен кулланабыз26, локализация көче ягыннан йөрәк кисәкләренең структур бөтенлеген һәм флюоресенциясен автоматик рәвештә бәяләү өчен тропонин-Т һәм коннексин буяу нигезендә сурәткә нигезләнгән тирән өйрәнү үткәргече.Бу ысул белешмәлектә күрсәтелгәнчә, йөрәк тукымасының структур бөтенлеген ышанычлы бәяләү өчен Конволицион Нейр Челтәрен (CNN) һәм тирән өйрәнү базасын куллана.26. МК тукымасы статик контроль бүлекләре белән чагыштырганда 0 көнгә яхшырган структур охшашлык күрсәтте.Моннан тыш, Массонның трихромы буяу культураның 12-нче көнендәге контроль шартлар белән чагыштырганда MS шартларында фиброзның шактый түбән процентын ачыклады (3с рәсем).CTCM 12-нче көнне йөрәк тукымалары бүлекчәләренең яшәешен яңа йөрәк тукымаларына охшаган дәрәҗәгә күтәрсә дә, йөрәк бүлекләренең структур бөтенлеген сизелерлек яхшыртмады.
штрих график яңа йөрәк кисәкләренең (D0) яки йөрәк кисәкләре культурасының MTT яшәешенең күләмен күрсәтә, статик культурада (D12 Ctrl) яки CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) кисәкләре / төркеме төрле дуңгызлар белән чагыштырганда, ANOVA # p <0.01; l). штрих график яңа йөрәк кисәкләренең (D0) яки йөрәк кисәкләре культурасының MTT яшәешенең күләмен күрсәтә, статик культурада (D12 Ctrl) яки CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) кисәкләре / төркеме төрле дуңгызлар белән чагыштырганда, ANOVA # p <0.01; l).гистограмма MTT яңа йөрәк бүлекчәләренең (D0) яки йөрәк бүлекләре культурасының статик культурада (D12 контроль) яки CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 контроль).)), 12 (D12 MC) бүлек / төркем төрле дуңгызлардан, бер яклы ANOVA тесты үткәрелүен күрсәтә;#### p <0,0001 по сравнению с D0 и ** p <0,01 по сравненюю с D12 Ctrl). #### p <0.0001 D0 белән чагыштырганда ** p <0.01 D12 Ctrl белән чагыштырганда). a 条形图 显示 在 D (D12 Ctrl) 或 CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中 新鲜 心脏 D (D0) 或 心脏 培养 天 12 天 的 MT 活力， #### p <0.0001 ， 与 D12 Ctrl 相比 ， ** p <0.01)。 a 条形图 显示 在 静态 (D12 Ctrl) 或 CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中 新鲜 切片 D (D0) ， 来自 不同 的 的 12 (D12 MC) 切片 / 组 ， 进行 单向 OV OV OV ， ** p。)яңа йөрәк бүлекләрендә (D0) яки йөрәк бүлекләрендә статистик культурада (D12 контроль) яки CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 контроль)), 12 (D12 MC) бүлек / төркемдә MTT яшәешенең күләмен күрсәтүче гистограмма, бер дуңгызлы ANOVA тесты;#### p <0,0001 по сравнению с D0, ** p <0,01 по сравненюю с D12 Ctrl). #### p <0.0001 D0 белән чагыштырганда, ** p <0.01 D12 Ctrl белән чагыштырганда).b Тропонин-Т (яшел), коннексин 43 (кызыл) һәм DAPI (зәңгәр) яңа изоляцияләнгән йөрәк бүлекләрендә (D0) яки статик шартларда (Ctrl) яки CTCM шартларында (MC) 12 көн дәвамында культуралы иммунофлюорсент рәсемнәре (буш масштаб = 100 µm). Йөрәк тукымасының структур бөтенлегенең ясалма интеллектуаль күләме (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) кисәкләре / төркемнәре төрле дуңгызлардан, бер яклы ANOVA тесты үткәрелә; #### p <0.0001 D0 һәм **** p <0.0001 D12 Ctrl белән чагыштырганда). Йөрәк тукымасының структур бөтенлеген ясалма интеллект күләме (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) кисәкләре / төркеме төрле дуңгызлардан, бер яклы ANOVA тесты үткәрелә; #### p <0.0001 D0 һәм **** p <0.0001 D12 Ctrl белән чагыштырганда). Кичичественная оценка адинной целостности сердечной ткани кусусственным интеллектом (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) срезов / групп от разных свиней, про пакититя однофакторный с ANOVA с # с # с по сравнению с D12 Ctrl). Ясалма интеллект (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) бүлекләр / төркемнәр, дуңгызларның бер яклы ANOVA тесты белән йөрәк тукымасының структур бөтенлеген санлаштыру; #### p <0.0001 vs. D0 һәм **** p <0.0001 белән D12 Ctrl).人工智能 量化 心脏 组织 结构 （= n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) кисәкләре / төрле дуңгызларның һәрберсе, бер яклы ANOVA тесты; #### p <0.0001 与 D0 相比 ， **** p <0.0001 与 D12 Ctrl 相比）。。人工智能 量化 心脏 组织 完整性 （n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) төрле дуңгызларның һәрберсе / төркеме, бер яклы ANOVA тесты; #### p <0.0001 与 D0 相比 ， **** p <0.0001 与 D12 Ctrl 相比）。 Искусственный интеллектт для количественной оензки адной целостности сердечной ткани (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) срезов / группу каждой из разных свей, одностороны <0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). Йөрәк тукымасының структур бөтенлеген бәяләү өчен ясалма интеллект (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) бүлекләр / төрле дуңгызларның һәрберсе, бер яклы ANOVA тесты; #### p <0.0001 vs .D0 Чагыштыру өчен **** p <0.0001 D12 Ctrl). в Массонның трихром таплары белән буялган йөрәк кисәкләре өчен вәкиллекле рәсемнәр (сулда) һәм санлаштыру (уңда) в Массонның трихром таплары белән буялган йөрәк кисәкләре өчен вәкиллекле рәсемнәр (сулда) һәм санлаштыру (уңда) в Репрезент каныны изображения (слева) һәм количественная оценка (справа) срезов сердца, окрашенных трихромным красителем Массона (чи покрятия = 500 мкм) ### p <0,0001 по сравнению с D0 и *** p <0,001 по сравненюю с D12 Ctrl). в Массонның трихром таплары белән буялган йөрәк бүлекләренең рәсемнәре (сулда) һәм санлашуы (уңда) (капланмаган масштаб = 500 µm) (n = 10 бүлек / төрле дуңгызлардан төркем, бер яклы ANOVA тесты үткәрелде; #### p <0 .0001 D0 һәм *** p <0,001 D12 Ctrl белән чагыштырганда). c 用 Массон 三 色 染料 染色 500 500 500 500 500 = 500 µm） （n = 10 个 切片 / 组 ， 0.00 OV ANOVA 测试 # # # # # # # # # # # ）。 C 用 массон 三 色 染料 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 trl 相比）。 c Репрезент каныны изображения (слева) һәм количественный мат (справа) срезов сердца, окрашенных трихромным красителем Мас адоа (чя шкала = 500 мкм) с кагного мата; ### #p <0,0001 по сравнению с D0, *** p <0,001 по сравнению с D12 Ctrl). в Массонның трихром таплары (буш = 500 µm) белән буялган йөрәк бүлекләренең рәсемнәре (сулда) һәм саны (уңда) (n = 10 бүлек / төркем, һәрберсе төрле дуңгыздан, вариантның бер яклы анализы белән сынап каралган; ### # p <0.0001 D0 белән чагыштырганда, *** p <0,001 D12 Ctrl белән чагыштырганда).Хата юллары уртача ± стандарт тайпылышны күрсәтә.
Без культураны кечкенә молекулалар өстәп, кардиомиоцитларның бөтенлеге яхшырырга һәм CTCM культурасы вакытында фиброз үсеше кимергә мөмкин дип фаразладык.Шуңа күрә без статик контроль культураларыбызны кулланып кечкенә молекулаларны тикшердек20,21, аз санлы факторлар аркасында.Бу экран өчен Дексеметазон (Декс), триодотиронин (T3), һәм SB431542 (SB) сайланды.Бу кечкенә молекулалар моңа кадәр hiPSC-CM культураларында кардиомиоцитларның саркомера озынлыгын, Т-трубкаларын һәм үткәрү тизлеген арттырып куллану өчен кулланылган.Моннан тыш, Декс (глюкокортикоид) һәм SB ялкынсынуны баса беләләр29,30.Шуңа күрә, без бу кечкенә молекулаларның кушылуы йөрәк бүлекләренең структур бөтенлеген яхшыртачакмы-юкмы икәнен сынадык.Башлангыч тикшерү өчен, һәр кушылманың дозасы күзәнәк культурасы модельләрендә еш кулланыла торган концентрацияләргә нигезләнеп сайланды (1 μM Dex27, 100 nM T327, һәм 2,5 μM SB31).12 көн культурадан соң, T3 һәм Dex комбинациясе оптималь кардиомиоцит структур бөтенлегенә һәм минималь җепселле ремонтка китерде (өстәмә рәсемнәр 4 һәм 5).Моннан тыш, T3 һәм Dex бу концентрацияләрен икеләтә яки икеләтә куллану гадәти концентрацияләр белән чагыштырганда зарарлы эффектлар китерде (өстәмә рәсем 6а, б).
Беренче тикшерүдән соң без 4 культуралы шартны чагыштырдык (4а рәсем): Ctrl: оптимизацияләнгән урта кулланып, элек тасвирланган статик культурада йөрәк бүлекләре;20.21 TD: T3 һәм Ctrl s чәршәмбе көнне өстәлде;МК: безнең элеккеге оптимальләштерелгән чараны кулланып CTCMда культуралы йөрәк бүлекләре;һәм MT: T3 һәм Dex белән CTCM уртага кушылды.12 көн эшкәртүдән соң, MS һәм MT тукымаларының яшәешчәнлеге MTT анализы белән бәяләнгән яңа тукымалардагы кебек калды (4б рәсем).Кызык, T3 һәм Dex трансвелл культураларына (TD) кушылу Ctrl шартлары белән чагыштырганда яшәешнең сизелерлек яхшыруына китермәде, бу йөрәк бүлекләренең яшәешен саклауда механик стимулның мөһим ролен күрсәтте.
12 көн эчендә механик стимуллаштыру һәм T3 / Dex өстәмә тәэсирен бәяләү өчен кулланылган дүрт культура шартларын сурәтләгән эксперименталь дизайн схемасы. b График графикасы барлык 4 культура шартларында (Ctrl, TD, MC, MT) 12 көнлек культураның яшәеш күләмен күрсәтә, яңа йөрәк кисәкләре (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD һәм D12 MT), 12 (D12 MC) кисәкләр / төркем төрле дуңгызлар белән чагыштырганда, <# p # 0 # D12 Ctrl). b График графикасы барлык 4 культура шартларында (Ctrl, TD, MC, MT) 12 көнлек культураның яшәеш күләмен күрсәтә, яңа йөрәк кисәкләре (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD һәм D12 MT), 12 (D12 MC) кисәкләр / төркем төрле дуңгызлар белән чагыштырганда, <# p # 0 # D12 ctrl). b Гистограмма показывает количественную оензу жизнеспособности через 12 дней после митингировирование всх 4 условиях адиривированя (арка, TD, MC и MT) по сравнению со свежим срезами среджа (D0) 12 (D) MT), 12 (D12 MC) срезов / группу от разных свиней, про проитится односторонний те ANOVA; b График графикасы 12 көнлек культурада барлык 4 культура шартларында (контроль, TD, MC, MT) яңа йөрәк бүлекләре (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD, һәм D12 MT), 12 (D12 MC) секция / төркем төрле дуңгызлардан, бер яклы ANOVA тесты белән. rl). b 条形图 显示 所有 4 种 培养 t t Ctrl 、 TD 、 MC 和 MT） 与 新鲜 D (D0) (n = 18 (D0) 、 15 (D12 Ctrl 、 D12 TD 和 D12 MT) ， 来自 不同 猪 OV # OV 0,001 与 D0 相比 ， ** p <0.01 与 D12 控制）。b 4 12 (D12 MC) b Гистограммама, показывающая все 4 условия консервированя (кин, TD, MC и MT) по сравнению со свежим срезами сердца (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD һәм D12 MT), от разыч ОВА; # ## b Гистограмма барлык 4 культура шартларын күрсәтә (контроль, TD, MC һәм MT) яңа йөрәк бүлекләре (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD һәм D12 MT), төрле дуңгызлардан 12 (D12 MC) бүлек / төркем, бер яклы ANOVA тесты; #### p <0.0001, ### p <0.001 vs. в График графикасы барлык 4 культура шартларында (Ctrl, TD, MC, MT) глюкоза агымының 12 көнлек культурасын күрсәтә, яңа йөрәк кисәкләре (D0) белән чагыштырганда (n = 6 кисәк / төркем төрле дуңгызлардан, берьяклы ANOVA тесты үткәрелә; ### p <0,001, D0 һәм *** p <0,001 белән чагыштырганда). в График графикасы барлык 4 культура шартларында (Ctrl, TD, MC, MT) глюкоза агымының 12 көнлек культурасын күрсәтә, яңа йөрәк кисәкләре (D0) белән чагыштырганда (n = 6 кисәк / төркем төрле дуңгызлардан, берьяклы ANOVA тесты үткәрелә; ### p <0,001, D0 һәм *** p <0,001 белән чагыштырганда). c Гистограмма показывает количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после митингировирование всх 4 условиях адиривированя (арка, TD, MC һәм MT) по сравнению со свежим срезами с оронний Выполняется тост ANOVA; ### p <0,001 по сравнению с D0 и *** p <0,001 по сравнению с D12 Ctrl). в Гистограмма глюкоза агымының 12 көнлек культура шартларында (контроль, TD, MC һәм MT) яңа йөрәк бүлекләре (D0) белән чагыштырганда күрсәтелә (n = 6 бүлек / төрле дуңгызлардан төркем, бер яклы ANOVA тесты; ### p <0,001 D0 һәм *** p <0,001 D12 Ctrl белән чагыштырганда). c 条形图 显示 所有 4 种 培养 t Ctrl 、 TD 、 MC 和 MT） 与 新鲜 D (D0) 相比 ， 后 12 天 = = （n = 6 片 / 组 ， 来自 不同 OV OV 执行 OV OV OV OV OV OV OV OV OV OV OV OV OV OV l 相比）。 C 条形图 显示 所有 4 种 条件 t ctrl 、 td 、 mc 和 mt） 新鲜 后 后 后 后 后 后 = = = = = = = = 0.00 0.00 0 相比 ， *** p <0,001 与 D12 Ctrl 相比）。 в Гистограммама, показывающая количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после материвированя для всех 4 условий осиловированя (ис, ТД, МК һәм МТ) по сравнению со свеж ср с с с с с с р с , односторонний Былы проведены Тисты АНОВА; в Гистограмма 12 көнлек культура шартларында (контроль, ТД, МК, һәм МТ) глюкоза агымының күләмен күрсәтә, яңа йөрәк бүлекләре (D0) белән чагыштырганда (n = 6 бүлек / төркем, төрле дуңгызлардан, берьяклы ANOVA тестлары үткәрелде, ### p <0,001 D0 белән чагыштырганда, *** p <0,001 D12 (контроль) белән чагыштырганда.d Яңа (зәңгәр), 12 МК (яшел), һәм 12 МТ (кызыл) тукымаларның стресс анализ участоклары ун региональ тукымалар бүлегендә (n = 4 кисәк / төркем, бер яклы ANOVA тесты; төркемнәр арасында зур аерма юк иде).e Вулкан сюжеты 10-12 көн дәвамында статик шартларда (Ctrl) яки MT шартларында культуралы йөрәк бүлекләре белән чагыштырганда, яңа йөрәк бүлекләрендә (D0) дифференциаль рәвештә күрсәтелгән геннарны күрсәтә.f Мәдәният шартларында культуралы йөрәк бүлекләре өчен саркомер геннарның җылылык картасы.Хата юллары уртача ± стандарт тайпылышны күрсәтә.
Май кислотасының оксидлашуыннан гликолизга күчүгә метаболик бәйләнеш кардиомиоцит дифференциациясенең билгесе.Cardитмәгән кардиомиоцитлар, беренче чиратта, глюкозаны ATP җитештерү өчен кулланалар һәм аз криста 5,32 булган гипопластик митохондриягә ия.Глюкозаны куллану анализы күрсәткәнчә, MC һәм MT шартларында глюкозаны куллану 0 тукымалардагы көнгә охшаган (4 нче рәсем).Ләкин, Ctrl үрнәкләре яңа тукымалар белән чагыштырганда глюкозаны куллануның зур үсешен күрсәттеләр.Бу CTCM һәм T3 / Dex комбинациясе тукымаларның яшәешен көчәйтә һәм 12 көнлек культуралы йөрәк бүлекләренең метаболик фенотибын саклый.Моннан тыш, штамм анализы күрсәткәнчә, MT һәм MS шартларында штамм дәрәҗәсе яңа йөрәк тукымасында 12 көн дәвамында калган (4d рәсем).
CTCM һәм T3 / Dex-ның йөрәк кисәк тукымасының глобаль транскрипция пейзажына гомуми йогынтысын анализлау өчен, без дүрт төрле культура шартларыннан йөрәк кисәкләренә RNAseq ясадык (өстәмә мәгълүматлар 1).Кызык, MT бүлекләре яңа йөрәк тукымасына югары транскрипция охшашлыгын күрсәттеләр, 13 642 геннан 16 дифференциаль рәвештә күрсәтелде.Ләкин, алда күрсәткәнчә, Ctrl кисәкләре культурада 10-12 көннән соң 1229 дифференциаль рәвештә күрсәтелгән геннар күрсәттеләр (4e рәсем).Бу мәгълүматлар йөрәк һәм фибробласт геннарның qRT-PCR белән расланды (өстәмә рәсем 7а-с).Кызык, Ctrl бүлекчәләрендә йөрәк һәм күзәнәк циклы геннары регрегуляциясе һәм ялкынсынучан ген программалары активлашуы күрсәтелде.Бу мәгълүматлар шуны күрсәтә: гадәттә озак вакытлы культурадан соң булган дифференциация MT шартларында тулысынча көчәйтелә (өстәмә рәсем 8а, б).Саркомер геннарын җентекләп өйрәнү күрсәткәнчә, MT шартларында гына саркомерны кодлаучы геннар (4ф рәсем) һәм ион каналы (өстәмә рәсем 9) сакланган, аларны Ctrl, TD, MC шартларында басудан саклый.Бу мәгълүматлар шуны күрсәтә: механик һәм юмораль стимуллаштыру (T3 / Dex) кушылмасы белән йөрәк кисәге транскриптомы 12 көн культурада яңа йөрәк кисәкләренә охшаш булып кала ала.
Бу транскрипцияле табышмаклар йөрәк бүлекләрендәге кардиомиоцитларның структур бөтенлеге 12 көн дәвамында MT шартларында иң яхшы сакланганлыгы белән расланган, 43-нче коннексин тотрыклы һәм локальләштерелгән (5а рәсем).Моннан тыш, MT шартларында йөрәк бүлекләрендәге фиброз Ctrl белән чагыштырганда сизелерлек кимеде һәм яңа йөрәк бүлекләренә охшаган (5б рәсем).Бу мәгълүматлар шуны күрсәтә: механик стимуллаштыру һәм T3 / Dex дәвалау комбинациясе йөрәк структураларында культураның йөрәк структурасын эффектив саклый.
тропонин-Т (яшел), коннексин 43 (кызыл), һәм DAPI (зәңгәр) иммунофлуоресцент образлары яңа изоляцияләнгән йөрәк бүлекләрендә (D0) яки йөрәк бүлегенең дүрт культурасы шартларында 12 көн культуралы (масштаблы бар = 100 µm).). Йөрәк тукымасының ясалма интеллект күләме (n = 7 (D0 һәм D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC һәм D12 MT) кисәкләре / төркеме төрле дуңгызлардан, бер яклы ANOVA тесты үткәрелә; #### p <0.0001 D0 һәм * p <0.05, яки **** p <0.0001) D12 Ctrl белән чагыштырганда. Йөрәк тукымасының ясалма интеллект күләме (n = 7 (D0 һәм D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC һәм D12 MT) кисәкләре / төркеме төрле дуңгызлардан, бер яклы ANOVA тесты үткәрелә; #### p <0.0001 D0 һәм * p <0.05, яки **** p <0.0001) D12 Ctrl белән чагыштырганда. Кичичественная оценка адинной целостности ткани сердца с помощуй консюственного интеллекта (n = 7 (D0 и D12 Ctrl)), 5 D0 и * р <0,05 или **** р <0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). Ясалма интеллект (n = 7 (D0 һәм D12 Ctrl)), 5 (D12 TD, D12 MC һәм D12 MT) бүлекләр / төркем кулланып, төрле дуңгызлардан группа, берьяклы ANOVA тесты кулланылган; #### p <0.0001 D0 һәм * p <0.05 яки **** p <0.0001).对 不同 猪 心脏 组织 结构 完整性 n = 7 （D0 和 D12 Ctrl） 、 5 （D12 TD 、 D12 MC 和 D12 MT） 切片 / 组 进行 人工智能 人工智能 OV 单向 ANOVA 测试 # #### p <0.0001 与 D0 和相比）。对 不同 猪 的 心脏 完整性 = = n = 7 （d0 和 d12 ctrl） （5 （d12 td 、 d12 mc 和 d12 mt） 组） 量 # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # Ctrl 相比）。Төрле дуңгызларда ясалма интеллект кулланып, йөрәк тукымасының структур бөтенлеген санлаштыру (n = 7 (D0 һәм D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC һәм D12 MT) секцияләр / төркем) бер яклы ANOVA тесты белән;#### p <0,0001 по сравнению с D0 и * р <0,05 или **** р <0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). #### p <0.0001 D0 һәм * p <0.05 яки **** p <0.0001 D12 Ctrl белән чагыштырганда). B Йөрәк кисәкләре өчен Вефлом станциясе (масштаблы бар = 10 (D0, D12 Ctrl, D10, D12 Ctrl, D0 һәм *** P <0.001, яки D1 ​​**** P <0.0001 белән чагыштырганда, D1 белән чагыштырганда 2 CTRL). B Йөрәк кисәкләре өчен Вефлом станциясе (масштаблы бар = 10 (D0, D12 Ctrl, D10, D12 Ctrl, D0 һәм *** P <0.001, яки D1 ​​**** P <0.0001 белән чагыштырганда, D1 белән чагыштырганда 2 CTRL). b Репрезент елны изображения һәм количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромным красителем Масона (чиная чейейка = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD һәм D12 MC) я односторонний тост ANOVA; #### p <0,0001 по сравнению с D0 и *** p <0,001 или **** p <0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). b Массонның трихром таплары (масштаблы бар = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD һәм D12 MC), төрле дуңгызлардан 9 (D12 MT) секцияләр / төркем, бер яклы ANOVA башкардылар; #### p <0.0001 vs. D0 һәм *** p <0,001 яки ** p b 用 Массон ， *** p <0,001 ， 或 **** p <0.0001 与 D12 Ctrl 相比）。 б 用 массон组 ， 进行 # # # #### p <0.0001 与 D0 相比 ， *** p <0,001 ， 或 **** p <0.0001 与 D12 Ctrl 相比）。 b Репрезент каныны изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромом Масона (чиная чейейка = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD һәм D12 MC), 9 (D12 MT ры) ## p <0,0001 по сравнению с D0, *** p <0,001 или **** p <0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). b Массон трихромы (шкаласы = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD һәм D12 MC), төрле дуңгызлар / төркемнәрдән 9 (D12 MT) бүлекчәләре, бер ANOVA ысулы;Хата юллары уртача ± стандарт тайпылышны күрсәтә.
Ниһаять, CTCMның йөрәк гипертрофиясен охшату сәләте йөрәк тукымаларының сузылуы белән бәяләнде.CTCMда иң югары һава камерасы басымы 80 ммГгтан 80 ммГгга кадәр артты.Сәнгать.(нормаль сузу) 140 ммГг сәнгать.(6а рәсем).Бу сузылуның 32% артуына туры килә (6б рәсем), ул гипертрофиядә күренгән саркомер озынлыгына ирешү өчен йөрәк бүлекләре өчен кирәкле процент сузылуы итеп күрсәтелгән иде.Алты көн культурада кысылу һәм ял итү вакытында йөрәк тукымасының сузылуы һәм тизлеге даими калды (6с рәсем).MT шартларыннан йөрәк тукымасы гадәти сузылуга (MT (Нормаль)) яки чиктән тыш сузылу шартларына (MT (OS)) алты көн дәвамында кагылды.Мәдәнияттә дүрт көн үткәннән соң, гипертрофик биомаркер NT-ProBNP MT (OS) шартларында MT (нормаль) шартлар белән чагыштырганда шактый күтәрелде (7а рәсем).Моннан тыш, алты көн культурадан соң, MT (ОС) күзәнәкләренең зурлыгы (7б рәсем) MT йөрәк бүлекләре белән чагыштырганда сизелерлек артты (нормаль).Моннан тыш, NFATC4 атом транслокациясе артык тукымаларда сизелерлек артты (7с рәсем).Бу нәтиҗәләр гипердистанциядән соң патологик ремонтның прогрессив үсешен күрсәтә һәм CTCM җайланмасы сузылган йөрәк гипертрофиясе сигналын өйрәнү өчен мәйданчык буларак кулланыла ала дигән төшенчәне хуплый.
Airава камерасы басымы, сыек камера басымы, тукымалар хәрәкәтенең үлчәү эзләре камера басымы сыек камера басымын үзгәртә, тукыманың кисәгенең тиешле хәрәкәтенә китерә.b Гадәттә сузылган (кызгылт сары) һәм чиктән тыш (зәңгәр) тукымалар бүлекчәләре өчен сузылган процент һәм сузылу ставкалары.в цикл вакыты (группага n = 19 кисәк, төрле дуңгызлардан), кысылу вакыты (группага n = 18-19 кисәк, төрле дуңгызлардан), ял итү вакыты (группага n = 19 кисәк, төрле дуңгызлардан)), тукымалар хәрәкәтенең амплитудасы (n = 14 кисәк / төркем, төрле дуңгызлардан), иң югары систолик тизлек (n = 14 кисәк) ) бүлекләр / төркемнәр) төрле дуңгызлардан), ике койрыклы Студентларның тесты бернинди параметрда да зур аерма күрсәтмәде, бу параметрларның 6 көн дәвамында культураның артык көчәнеш белән тотрыклы булуын күрсәтә.Хата юллары уртача ± стандарт тайпылышны күрсәтә.
культуралы массакүләм мәгълүмат чараларында NT-ProBNP концентрациясенең график нормасы MT нормаль сузылу (Норм) яки чиктән тыш сузылу (OS) шартларында культуралы (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, һәм D4 MTOS) кисәкләре / төркеме төрле дуңгызлар белән чагыштырганда, ** p <0.01; культуралы массакүләм мәгълүмат чараларында NT-ProBNP концентрациясенең график нормасы MT нормаль сузылу (Норм) яки чиктән тыш сузылу (OS) шартларында культуралы (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, һәм D4 MTOS) кисәкләре / төркеме төрле дуңгызлар белән чагыштырганда, ** p <0.01;Нормаль MT сузу (норма) яки чиктән тыш (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, һәм D4) шартларында культуралы йөрәк кисәкләреннән NT-ProBNP концентрациясенең санлы гистограммасы, төрле дуңгызлардан кисәкләр / төркем, вариантның ике факторлы анализы ясала;** p <0,01 по сравнению с каникным раст аденением). ** р <0.01 гадәти сузу белән чагыштырганда). a 在 MT 正常 Norm (Норм) 或 OS OS (OS) 条件 下 中 中 中 中 中 NT-ProBNP 浓度 的 条形图 （n = 4 (D2 MTNorm) 、 3 （D2 MTOS 、 D4 MTNorm 和 4 4 ； ； ； ； ； ； 切片 ； p <0.01）。 MT нормаль сузылу (Норм) яки чиктән тыш (OS) шартларында культуралы йөрәк кисәкләрендә NT-ProBNP концентрациясе күләме (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm 和 D4 MTOS) төрле 猪 的 切片 / 组 ， 可以 双向 方 方.гистограмма НТ-ПроБНП концентрацияләренең нормаль MT сузу (норма) яки чиктән тыш сузылу (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm) һәм D4 MTOS) шартларында культуралы йөрәк кисәкләрендә концентрацияләнеше, төрле дуңгызлардан ике яклы анализ;** p <0,01 по сравнению с каникным раст аденением). ** р <0.01 гадәти сузу белән чагыштырганда). b Тропонин-Т һәм WGA (сулда) һәм күзәнәк күләменең күләме (уңда) (n = 330 (D6 MTNorm), 369 (D6 MTNorm) күзәнәкләре / төркеме төрле дуңгызларның 10 төрле кисәкләреннән, ике койрыклы Студентлар т-тесты үткәрелә; нормаль сузу белән чагыштырганда **** p <0.0001). b Тропонин-Т һәм WGA (сулда) һәм күзәнәк күләменең күләме (уңда) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) күзәнәкләре / төркеме төрле дуңгызлардан 10 төрле кисәкләрдән, ике койрыклы Студентлар тесты үткәрелә; нормаль сузу белән чагыштырганда **** p <0.0001). b Репрезент елны изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слева) һәм количественного определения размера клеток (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 водится хвостовой т-критерий Стьюдента; **** р <0,0001 по сравнению с чизныным раст адением). b Тропонин-Т һәм AZP (сулда) һәм күзәнәк күләменең күләме (уңда) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) күзәнәкләре / группасы төрле дуңгызларның 10 төрле бүлегеннән, ике койрыклы Студентларның тесты үткәрелде; **** p <0.0001 гадәти штамм белән чагыштырганда). b 用 肌钙蛋白 -T 和 WGA （左） = = = = 330 （D6 MTOS） 来自 来自 9 的 9 9 9 6 6 6 ** p <0.0001）。 b Калькареин-Т һәм WGA (сулда) һәм күзәнәк зурлыгы (уңда) (n = 330 (D6 MTOS), 10 төрле кисәкләрдән 369 (D6 MTNorm)) күзәнәк кисәкләре / 组 ， 方法 test test тест normal нормаль сузу белән чагыштырганда ， **** p <0.0001). b Репрезент каныны изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слева) һәм количественная оценка размера клеток (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) из 10 скичлыч критерий Стьюдента; **** р <0,0001 по сравнению с канныным раст кинением). b Тропонин-Т һәм AZP (сулда) һәм күзәнәк зурлыгының күләме (уңда) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) төрле дуңгызлардан 10 төрле бүлек) Күзәнәкләр / төркем, ике койрыклы критерий Студент т;**** р <0.0001 гадәти штамм белән чагыштырганда). c 0 һәм 6 нчы көн өчен MTOS йөрәк кисәкләре тропонин-Т һәм NFATC4 өчен иммунолабельле һәм NFATC4 CMs ядрәләренә тәрҗемә итү күләме (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) кисәкләре / төркеме төрле дуңгызлардан, Ике койрыклы Студентлар тесты * * p <0.05); c 0 һәм 6 нчы көн өчен MTOS йөрәк кисәкләре тропонин-Т һәм NFATC4 өчен иммунолабельле һәм NFATC4 CMs ядрәләренә тәрҗемә итү күләме (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) кисәкләре / төркеме төрле дуңгызлардан, Ике койрыклы Студентлар тесты * * p <0.05); c Репрезент каныны изображения для срезов сердца 0 и 6 дней MTOS, им исомомеченых для тропонина-Т и NFATC4, и количественная осенка чилоккации NFATC4 в ядра кавернозных клеток (n = 4) выполняется дву зононний т-критерий Стьюдента; * р <0,05). в 0 һәм 6 көн йөрәк бүлекләре өчен рәсемле рәсемнәр, тропонин-Т һәм NFATC4 өчен иммунолабельле, һәм каверноз күзәнәкләре ядросында NFATC4 транслокоциясе күләме (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) кисәкләре / төрле дуңгызлар төркеме) ике койрыклы Студентның тестын үткәрделәр;* р <0.05). c 用于 肌钙蛋白 -T 和 NFATC4 免疫 标记 的 第 0 天和 第 6 天 MTOS 心脏 切片 的 的 的 的 NFATC4 易位 至 CM 细胞核 的 （n = 4 (D0) 、 3 (D6 MTOS) 切片 / 组, 学生 t 0.05 c Кальканин-Т һәм NFATC4 иммунолабелинг рәсемнәре 第 0 天和 第 6 天 MTOS йөрәк кисәкләре, һәм NFATC4 төрле NFATC4 易位 至 CM күзәнәк ядрәсе 的 саны 化 (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) 切 礼 / 组, 时间 双 p p 学生 0.05 c Репрезент каныны изображения срезов сердца MTOS на 0 и 6 день для им исомаркарировки тропонином-Т и NFATC4 и количественная осенка чилококации NFATC4 в ядра CM от разных свиней (n = 4 (Др) ерий Стьюдента; * р <0,05). c Тропонин-Т һәм NFATC4 иммунолабелинг һәм NFATC4 транслокоциясе өчен төрле дуңгызлардан (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) кисәкләре / группасы, ике койрыклы т-критерийлар өчен MTOS йөрәк кисәкләренең рәсемле рәсемнәре; * p <0.05);Хата юллары уртача ± стандарт тайпылышны күрсәтә.
Тәрҗемә ителгән йөрәк-кан тамырлары тикшеренүләре йөрәк мохитен төгәл чагылдырган кәрәзле модельләр таләп итә.Бу тикшеренүдә CTCM җайланмасы эшләнде һәм йөрәкнең ультратин бүлекләрен стимуллаштыра ала.CTCM системасына физиологик синхрон электромеханик стимуллаштыру һәм T3 һәм Dex сыеклыгын баету керә.Чучка йөрәк бүлекләре бу факторларга дучар булганда, аларның яшәешчәнлеге, структур бөтенлеге, метаболик активлыгы, транскрипцияле чагылышы 12 көн культурадан соң яңа йөрәк тукымасында булган кебек калды.Моннан тыш, йөрәк тукымасының артык сузылуы йөрәкнең гипертрофиясенә китерергә мөмкин.Гомумән алганда, бу нәтиҗәләр физиологик культура шартларының гадәти йөрәк фенотибын саклап калуда ярдәм итә һәм наркотиклар тикшерү өчен мәйданчык бирә.
Кардиомиоцитларның эшләве һәм яшәве өчен оптималь мохит булдыруга күп факторлар ярдәм итә.Бу факторларның иң ачыкы (1) күзәнәкара үзара бәйләнеш, 2) электромеханик стимуллаштыру, (3) юмористик факторлар һәм (4) метаболик субстратлар белән бәйле.Физиологик күзәнәк-күзәнәк үзара бәйләнеш, күзәнәктән тыш матрица ярдәмендә күп күзәнәк тибындагы катлаулы өч үлчәмле челтәр таләп итә.Мондый катлаулы кәрәзле үзара бәйләнешне витрода аерым күзәнәк төрләренең культурасы буенча реконструкцияләү кыен, ләкин йөрәк бүлекләренең органотипик табигате ярдәмендә җиңел ирешеп була.
Кардиомиоцитларның механик сузылуы һәм электр стимуляциясе йөрәк фенотибын саклау өчен бик мөһим33,34,35.HiPSC-CM кондиционеры һәм җитлеккәнлеге өчен механик стимул киң кулланылса да, күптән түгел берничә нәфис тикшеренүләр униаксиаль йөкләү ярдәмендә культурада йөрәк кисәкләрен механик стимуллаштырырга тырыштылар.Бу тикшеренүләр шуны күрсәтә: 2D униаксиаль механик йөкләү культураның йөрәк фенотибына уңай йогынты ясый.Бу тикшеренүләрдә йөрәк бүлекләре я изометрик киеренке көчләр белән йөкләнде17, сызыклы аксотоник йөкләү18, яисә йөрәк циклы көч трансдуктеры һәм киеренкелек саклагычлары ярдәмендә яңадан ясалды.Ләкин, бу ысуллар экологик оптимизациясез униаксиаль тукымалар сузуны кулланалар, нәтиҗәдә күп йөрәк геннары кысыла яки аномаль сузылу җаваплары белән бәйле геннарның чиктән тыш кысылуы.Монда тасвирланган CTCM 3D электромеханик стимул бирә, ул табигый йөрәк циклын цикл вакыты һәм физиологик сузу ягыннан охшата (25% сузу, 40% систол, 60% диастол, һәм минутына 72 кыйнау).Бу өч үлчәмле механик стимуляция тукымаларның бөтенлеген саклап калу өчен генә җитмәсә дә, тукымаларның яшәешен, эшләвен, бөтенлеген адекват саклап калу өчен, T3 / Dex ярдәмендә юмораль һәм механик стимуллаштыру комбинациясе кирәк.
Өлкәннәрнең йөрәк фенотибын модульләштерүдә юмористик факторлар мөһим роль уйныйлар.Бу HiPS-CM тикшеренүләрендә күрсәтелде, анда T3 һәм Dex күзәнәк җитлеккәнлеген тизләтү өчен культура медиасына кушылды.T3 аминокислоталар, шикәр һәм кальций күзәнәк мембраналары аша ташуга тәэсир итә ала36.Моннан тыш, T3 MHC-α экспрессиясен һәм MHC-β регрегуляциясен алга этәрә, җитлеккән кардиомиоцитларда тиз бөтерелгән миофибриллар формалашуга ярдәм итә, fetal CMдагы әкрен миофибриллар белән чагыштырганда.Гипотироид пациентларында T3 җитешсезлеге миофибриллар полосаларының югалуына һәм тон үсеш темпының кимүенә китерә37.Декс глюкокортикоид рецепторларында эшли һәм изоляцияләнгән йөрәкләрдә миокард контрактлыгын арттыруны күрсәтте;38 бу камилләштерү кальций депозитлары белән идарә итүгә (SOCE) 39,40 тәэсире белән бәйле дип уйланыла.Моннан тыш, Декс үз рецепторлары белән бәйләнә, иммун функциясен һәм ялкынсынуны баса торган киң күзәнәк реакциясенә китерә30.
Безнең нәтиҗәләр шуны күрсәтә: физик механик стимуллаштыру (MS) Ctrl белән чагыштырганда культураның гомуми күрсәткечләрен яхшыртты, ләкин культурада 12 көн дәвамында яшәешне, структур бөтенлекне, йөрәк экспрессиясен саклап кала алмады.Ctrl белән чагыштырганда, T3 һәм Dex CTCM (MT) культураларына кушылу яшәешне яхшыртты һәм охшаш транскрипция профильләрен, структур бөтенлекне, яңа йөрәк тукымасы белән метаболик активлыкны 12 көн дәвамында саклады.Моннан тыш, тукымаларның сузылу дәрәҗәсен контрольдә тотып, STCM системасының күпкырлы булуын күрсәтеп, STCM ярдәмендә гиперекстенсияле йөрәк гипертрофиясе моделе булдырылды.Әйтергә кирәк, йөрәкне төзекләндерү һәм фиброз гадәттә тотрыксыз органнарны үз эченә ала, аларның әйләнеш күзәнәкләре тиешле цитокиннар, шулай ук ​​фагоцитоз һәм башка төзекләндерү факторлары белән тәэмин итә алалар, йөрәк бүлекләре стресс һәм травмага җавап итеп фибротик процессны охшата алалар.миофибробластларга.Бу моңа кадәр бу йөрәк кисәк моделендә бәяләнде.Әйтергә кирәк, CTCM параметрлары басым / электр амплитудасы һәм ешлыкны үзгәртеп модульләштерелергә мөмкин, такикардия, брадикардия, механик кан әйләнеше ярдәме (механик төшмәгән йөрәк).Бу системаны наркотиклар сынау өчен уртача үткәрү итә.CTCM-ның чиктән тыш йөрәк-гипертрофияне модельләштерү сәләте бу системаны шәхси терапия өчен сынап карау өчен юл ача.Ахырда, хәзерге тикшеренү шуны күрсәтә: йөрәк тукымасы бүлекләре культурасын саклау өчен механик сузу һәм юмораль стимул бик мөһим.
Монда китерелгән мәгълүматлар CTCMның миокардны модельләштерү өчен бик перспектив мәйданчык булуын күрсәтсәләр дә, бу культура ысулының кайбер чикләүләре бар.CTCM культурасының төп чикләнеше - ул кисәкләргә өзлексез динамик механик басым ясый, бу һәр цикл вакытында йөрәк кисәкләренең кысылуларын актив күзәтү мөмкинлеген тыя.Моннан тыш, йөрәк бүлекләренең кечкенә күләме аркасында (7 мм), традицион көч сенсорларын кулланып, культура системаларыннан тыш систолик функцияне бәяләү сәләте чикләнгән.Хәзерге кулъязмада оптик көчәнешне контракт функциясе күрсәткече итеп бәяләп, бу чикләнүне өлешчә җиңәбез.Ләкин, бу чикләү алга таба эшне таләп итәчәк һәм киләчәктә культураның йөрәк кисәкләренең функциясен оптик мониторинглау ысулларын кертеп, кальций һәм көчәнешкә сизгер буяулар кулланып оптик карта ясау ысулларын кертеп чишелергә мөмкин.CTCM-ның тагын бер чикләнеше - эш моделе физиологик стресс белән идарә итми (йөкләү һәм йөкләү).CTCM-да басым бик зур тукымаларда диастолда (тулы сузылу) һәм систолда (электр стимуляциясе кысылу озынлыгы) 25% физиологик сузуны чыгару өчен каршы якка юнәлтелде.Бу чикләү киләчәктә CTCM конструкцияләрендә йөрәк тукымасына ике яктан да басым ясап һәм йөрәк палаталарында булган төгәл басым күләмен кулланып бетерелергә тиеш.
Бу кулъязмада хәбәр ителгән чиктән тыш ремонтлау гипертрофик гиперстретч сигналларын охшату белән чикләнә.Шулай итеп, бу модель юмораль яки нейраль факторлар кирәксез (бу системада юк) сузылган гипертофик сигналны өйрәнүдә булыша ала.Алга таба тикшеренүләр CTCM күплеген арттыру өчен кирәк, мәсәлән, иммун күзәнәкләр белән хезмәттәшлек итү, плазма юмористик факторлар әйләнеше, нейрон күзәнәкләре белән хезмәттәшлек иткәндә CTCM белән авыруларны модельләштерү мөмкинлекләрен яхшыртачак.
Бу тикшеренүдә 13 дуңгыз кулланылган.Барлык хайваннар процедуралары институциональ күрсәтмәләр нигезендә башкарылды һәм Луисвилл Университеты хайваннарны карау һәм куллану комитеты тарафыннан расланды.Аорт аркасы кысылган һәм йөрәк 1 л стериль кардиоплегия белән майланган (110 мм NaCl, 1,2 мм CaCl2, 16 мм KCl, 16 мм MgCl2, 10 мм NaHCO3, 5 U / mL гепарин, pH 7,4 кадәр); йөрәкләр бозлы кардиоплегик эремәдә боз өстендә лабораториягә китерелгәнче сакланганнар, гадәттә <10 мин. йөрәкләр бозлы кардиоплегик эремәдә боз өстендә лабораториягә китерелгәнче сакланганнар, гадәттә <10 мин. сердца хранили в ледяном кардиоп огиическом растворе до сировировки в лабораторию на льду, что обикно занимает <10 мин. йөрәкләр бозлы кардиоплегик эремәдә боз өстендә лабораториягә кадәр сакланганнар, бу гадәттә <10 мин.将 心脏 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10将 心脏 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 Держите сердца в ледяной кардиопгии до зирировки в лаборатораторю на льду, обикно <10 мин. Йөрәкләрне боз кардиоплегиясендә саклагыз, боз өстендә лабораториягә кадәр, гадәттә <10 мин.
CTCM җайланмасы SolidWorks компьютер ярдәмендә дизайн (CAD) программасында эшләнгән.Мәдәният палаталары, бүлүчеләр һәм һава палаталары CNC чиста акрил пластиктан эшләнгән.7 мм диаметрлы резервуар боҗра үзәктә югары тыгызлыктагы полиэтиленнан (HDPE) эшләнгән һәм астындагы медианы мөһерләү өчен кулланылган силикон о-боҗраны урнаштыру өчен о-боҗра бар.Нечкә кремний мембранасы культура камерасын аеру тәлинкәсеннән аера.Силикон мембранасы 0,02 ″ калын силикон таблицасыннан лазер белән киселгән һәм 35A каты.Силиконның аскы һәм өске өлеше 1/16 ″ калын силикон таблицасыннан лазер белән киселгән һәм катылыгы 50A.Блокны беркетү һәм һава үткәрми торган мөһер ясау өчен 316L дат басмас корыч винталар һәм канатлы гайкалар кулланыла.
Махсус басылган схема тактасы (PCB) C-PACE-EM системасы белән интеграцияләнү өчен эшләнгән.PCBдагы свисс машинасын тоташтыручы розеткалар графит электродларына көмеш белән капланган бакыр чыбыклар һәм электродларга винтланган бронза 0-60 винталар белән тоташтырылган.Басылган схема тактасы 3D принтерның тышлыгына урнаштырылган.
CTCM җайланмасы программалаштырыла торган пневматик актуатор (PPD) белән идарә ителә, ул йөрәк циклына охшаган контроль кан әйләнеше басымын тудыра.Airава камерасы эчендәге басым арта барган саен, сыгылмалы силикон мембранасы өскә киңәя, тукымалар урыны астындагы чараны мәҗбүр итә.Аннары тукымалар өлкәсе диастол вакытында йөрәкнең физиологик киңәюен охшатып, сыеклыкның бу куылуы белән сузылачак.Ял итүнең иң югары ноктасында электр стимуляциясе графит электродлары ярдәмендә кулланылды, бу һава камерасындагы басымны киметте һәм тукымалар кисәкләренең кысылуына китерде.Торба эчендә һава системасындагы басымны ачыклау өчен басым сенсоры булган гемостатик клапан бар.Басым сенсоры сизгән басым ноутбукка тоташтырылган мәгълүмат җыючыга кулланыла.Бу газ камерасы эчендәге басымны өзлексез күзәтергә мөмкинлек бирә.Палатаның максималь басымы җиткәч (стандарт 80 ммГг, 140 ммХг ОС), мәгълүмат алу җайланмасы C-PACE-EM системасына сигнал җибәрергә кушылды, 2 мс өчен бифазик көчәнеш сигналын, 4 V итеп.
Йөрәк бүлекләре алынды һәм 6 скважинада культура шартлары түбәндәгечә башкарылды: Урып-җыю йөрәкләрен салкын (4 ° C) кардиоплегия булган лодкага күчерегез.Сул карын стериль пычак белән изоляцияләнде һәм 1-2 см3 кисәкләргә киселде.Бу тукымалар блоклары тукымалар ябыштыргычлары белән тукымалар терәкләренә бәйләнгәннәр һәм тирод эремәсе булган һәм өзлексез кислородланган (3 г / Л 2,3-бутанедион моноксимы (BDM), 140 мм NaCl (8,18 г). mM CaCl2 (1,8 мл 1 М эремәсе), 1 L ddH2O кадәр).Тибрәнүче микротом 300 Гц ешлыгында 300 мм калынлыктагы кисәкләрне, горизонталь тибрәнү амплитудасын һәм 0,03 мм / с тизлекне кисәргә тиеш иде.Токым мунчасы эремә салкын булсын өчен боз белән әйләндереп алынган һәм температура 4 ° C сакланган.Микротом ваннасыннан тукымалар бүлекләрен боз өстендә өзлексез кислородлы Тирод эремәсе булган инкубация мунчасына күчерегез, бер культура тәлинкәсе өчен җитәрлек бүлекләр алынганчы.Трансвелл культуралары өчен тукымалар бүлекчәләре 6 мм киңлектәге полиуретан терәкләренә бәйләнгәннәр һәм 6 мл оптимальләштерелгән уртага урнаштырылганнар (199 урта, 1х ITS өстәмәсе, 10% FBS, 5 ng / ml VEGF, 10 ng / ml FGF-эшкәртү һәм 2X антибиотик-антифунгал).Электр стимуляциясе (10 V, ешлык 1,2 Гц) тукымалар бүлекчәләренә C-Pace аша кулланылды.TD шартлары өчен, яңа T3 һәм Dex һәр урта үзгәрештә 100 nM һәм 1 μM өстәлде.Көнгә 3 тапкыр алыштырганчы, кислород белән туендырылган.Кисем кисәкләре инкубаторда 37 ° C һәм 5% CO2 культурасында эшләнгән.
CTCM культуралары өчен тукымалар бүлекчәләре махсус ясалган 3D принтерга Петри савытында үзгәртелгән Тирод эремәсе урнаштырылган.Deviceайланма йөрәк кисәгенең зурлыгын терәк боҗрасының 25% ка арттыру өчен эшләнгән.Бу Тирод эремәсеннән уртага һәм диастолга күчерелгәннән соң йөрәк бүлекләре сузылмасын өчен эшләнә.Гистоакрилик клей кулланып, 300 мм калынлыктагы бүлекләр 7 мм диаметрлы терәк боҗрасына куелган.Тукым бүлекләрен терәк боҗрасына бәйләгәннән соң, артык тукымалар кисәкләрен кисегез һәм бәйләнгән тукымалар бүлекләрен бер җайланма өчен җитәрлек бүлекләр әзерләнгәнче боз өстендә (4 ° C) Тирод эремәсе мунчасына урнаштырыгыз.Барлык җайланмалар өчен эшкәртү вакыты 2 сәгатьтән артмаска тиеш.Аларның ярдәм боҗраларына 6 тукыма бүлеге бәйләнгәннән соң, CTCM җайланмасы җыелды.CTCM культурасы камерасы алдан 21 мл кислородлы матдә белән тутырылган.Токым бүлекләрен культура палатасына күчерегез һәм пипетка белән һава күбекләрен җентекләп бетерегез.Аннары тукымалар бүлеге тишеккә кертелә һәм урынына әкренләп кысыла.Ниһаять, электрод капкасын җайланмага урнаштырыгыз һәм җайланманы инкубаторга күчерегез.Аннары CTCMны һава торбасына һәм C-PACE-EM системасына тоташтырыгыз.Пневматик актуатор ачыла һәм һава клапаны CTCM ача.C-PACE-EM системасы 2 мс өчен бифазик тизлек вакытында 1,2 Гц 4 V җибәрү өчен конфигурацияләнгән.Көненә ике тапкыр уртача үзгәртелде, электродларда графит тупланмасын өчен электродлар көнгә бер тапкыр үзгәртелде.Кирәк булса, тукымалар бүлекчәләре культурасы скважиналарыннан чыгарылырга мөмкин, алар астына төшкән һава күбекләрен куып чыгарырга.MT дәвалау шартлары өчен, T3 / Dex һәр урта үзгәреш белән 100 nM T3 һәм 1 μM Dex белән яңа кушылды.CTCM җайланмалары 37 ° C һәм 5% CO2 инкубаторында культураланган.
Йөрәк кисәкләренең сузылган траекторияләрен алу өчен махсус камера системасы эшләнде.SLR камерасы (Canon Rebel T7i, Canon, Токио, Япония) Navitar Zoom 7000 18-108 мм макро линза белән кулланылган (Навитар, Сан-Франциско, Калифорния).Визуализация бүлмә температурасында, уртача яңа әйбер белән алыштырылганнан соң башкарылды.Камера 51 ° почмакта урнашкан һәм видео секундына 30 кадрда яздырылган.Беренчедән, йөрәк кисәкләренең хәрәкәтен бәяләү өчен Image-J ярдәмендә ачык чыганак программа тәэминаты (MUSCLEMOTION43) кулланылды.Маска MATLAB (MathWorks, Natick, MA, АКШ) ярдәмендә ясалган, шау-шудан саклану өчен йөрәк кисәкләрен кыйнау өчен кызыклы өлкәләрне билгеләү өчен.Кул белән сегментланган маскалар барлык рәсемнәргә рам эзлеклелегендә кулланыла, аннары MUSCLEMOTION плагинына бирелә.Мускул хәрәкәте һәр рамдагы пиксельләрнең уртача интенсивлыгын куллана, аның хәрәкәтен белешмә рамка белән чагыштырганда.Мәгълүматлар язылган, фильтрланган һәм цикл вакытын бәяләү һәм йөрәк циклы вакытында тукымаларның сузылуын бәяләү өчен кулланылган.Язылган видео беренче заказлы нуль фазалы санлы фильтр ярдәмендә эшкәртелде.Тукыманың сузылуын (пик-пик) санлаштыру өчен, язылган сигналдагы чокырлар белән чокырларны аеру өчен иң югары-иң югары анализ ясалды.Моннан тыш, сигнал дрифтын бетерү өчен 6-нчы тәртип полиномиалы ​​ярдәмендә детрендинг башкарыла.Программа коды MATLABда глобаль тукымаларның хәрәкәтен, цикл вакытын, ял итү вакытын һәм кысылу вакытын билгеләү өчен эшләнде (Өстәмә программа коды 44).
Штурм анализы өчен, механик сузуны бәяләү өчен ясалган шул ук видеоларны кулланып, без MUSCLEMOTION программа тәэминаты нигезендә хәрәкәтнең иң югары (иң югары) һәм иң түбән (түбән) хәрәкәт нокталарын күрсәтүче ике рәсемне эзләдек.Аннары без тукымалар өлкәләрен сегментлаштырдык һәм сегментланган тукымаларга күләгәле алгоритм формасын кулландык (өстәмә рәсем 2а).Аннары сегментланган тукымалар ун җир астына бүленде, һәм һәр өслектәге стресс түбәндәге тигезләмә ярдәмендә исәпләнде: Strain = (Sup-Sdown) / Sdown, монда Sup һәм Sdown форманың тукыманың өске һәм аскы күләгәләреннән ераклыклар (өстәмә рәсем .2б).
Йөрәк бүлекләре 4% параформалдегидта 48 сәгать дәвамында торгызылды.Тикшерелгән тукымалар 1% өчен 10% һәм 20% сакарозада, аннары 30% сакарозада дегидратланган.Аннары бүлекләр оптималь кисү температурасы кушылмасына (ОКТ кушылмасы) кертелде һәм изопентан / коры боз мунчасында әкренләп туңдылар.ОКТ урнаштыру блокларын аерылганчы -80 ° C саклагыз.Слайдлар калынлыгы 8 мм булган бүлекләр итеп әзерләнде.
ОКТны йөрәк бүлекләреннән чыгару өчен, слайдларны 95 ° C җылыту блогында 5 минутка җылыт.Eachәр слайдка 1 мл ПБС кушыгыз һәм бүлмә температурасында 30 минут инкубацияләгез, аннары бүлмә температурасында ПБСта 0,1% Triton-X куеп бүлекләргә керегез.Конкрет булмаган антителалар үрнәккә бәйләнмәсен өчен, слайдларга 1 мл 3% BSA эремәсе кушыгыз һәм бүлмә температурасында 1 сәгать инкубацияләгез.Аннары BSA алынды һәм слайдлар ПБС белән юылды.Eachәрбер үрнәкне карандаш белән билгеләргә.Беренчел антителалар (1% BSAда 1: 200 эретелгән) (43 коннексин (Абкам; # AB11370), NFATC4 (Абкам; # AB99431) һәм тропонин-Т (Термо Фәнни; Өстәмә 90 минут эчендә 594 (Термо Фәнни;
WGA-Alexa Fluor 555 (Термо Фәнни; # W32464) 5 μг / мл ПБСта WGA буяу өчен кулланылды һәм бүлмә температурасында 30 минутка тоташтырылган бүлекләргә кулланылды.Аннары слайдлар ПБС белән юылды һәм һәр слайдка Судан кара кушылды һәм 30 минут инкубацияләнде.Аннары слайдлар ПБС белән юылды һәм векташилд урнаштыру чарасы өстәлде.Слайдлар Keyence микроскопында 40х зурлыкта визуальләштерелгән.
ОКТ югарыда күрсәтелгәнчә үрнәкләрдән алынды.ОКТны бетергәннән соң, слайдларны Буин эремәсенә төнлә чумыгыз.Аннары слайдлар дистилляцияләнгән су белән 1 сәгать чайкап, аннары Бибрих алоэ кислотасы фуксин эремәсенә 10 минутка урнаштырылды.Аннары слайдлар дистилляцияләнгән су белән юылып, 10% фосфомолибден / 5% фосфотунг кислотасы эремәсенә урнаштырылды.Чистартмыйча, слайдларны турыдан-туры анилин зәңгәр эремәсенә 15 минутка күчерегез.Аннары слайдлар дистилляцияләнгән су белән юылып, 2 минутка 1% кислоталы эремәгә урнаштырылды.Слайдлар 200 Н этанолда киптерелгән һәм ксиленга күчерелгән.10х максатлы Keyence микроскопы ярдәмендә тапланган слайдлар визуальләштерелгән.Фиброз өлкәсе проценты Keyence Analyzer программасы ярдәмендә бәяләнде.
CyQUANT ™ MTT күзәнәкләренең яшәешчәнлеген тикшерү (инвитроген, Карлсбад, Калифорния), каталог номеры V13154, кайбер протоколлар белән җитештерүче протоколы буенча.Аерым алганда, MTT анализы вакытында диаметры 6 мм булган хирургик тип кулланылды.Кисемнәр җитештерүче протоколы нигезендә MTT субстратлары булган 12 кое тәлинкә коеларына аерым куелган.Секцияләр 37 ° C температурада 3 сәгать инкубацияләнәләр һәм тере тукымалар MTT субстратын метаболизациялиләр, кызгылт формазан кушылмасы ясыйлар.МТТ эремәсен 1 мл DMSO белән алыштырыгыз һәм йөрәк бүлекләреннән кызгылт формазан чыгару өчен 15 минутка 37 ° C инкубацияләгез.Dрнәкләр 1:10 DMSOда 96 яхшы чиста аскы тәлинкәләрдә һәм Cytation плитасы укучысы (BioTek) ярдәмендә 570 нм белән үлчәнгән кызгылт төс интенсивлыгында эретелде.Укулар йөрәкнең һәр кисәгенең авырлыгына нормальләштерелде.
Йөрәк кисәкчәләре массакүләм мәгълүмат чаралары белән алмаштырылды, алда әйтелгәнчә глюкозаны куллану өчен 1 μCi / мл [5-3H] -клюкоза (Моравек Биохимиклар, Бре, Калифорния, АКШ).4 сәгать инкубациядән соң, 100 µл 0,2 N HCl булган ачык микроцентрифуга торбасына 100 µл уртача кушыгыз.Аннары труба 500 μl dH2O булган скринтиляция трубасына урнаштырылды, [3H] 2O 37 сәг.Аннары микроцентрифуга трубасын ссинтилляция трубасыннан чыгарып, 10 мл ссинтилляция сыеклыгы кушыгыз.Скинтилляция санаулары Tri-Carb 2900TR сыек скинтиллацион анализатор ярдәмендә башкарылды (Packard Bioscience Company, Meriden, CT, АКШ).Аннары глюкозаны куллану [5-3H] - глюкозаның махсус эшчәнлеген, тулы булмаган тигезләнешне һәм фонны, [5-3H] билгесез глюкозаны эретүне һәм скинтилляция счетчик эффективлыгын исәпкә алып исәпләнде.Мәгълүматлар йөрәк бүлекләренең массасына нормальләштерелгән.
Тризолдагы тукымаларның гомогенизациясеннән соң, РНА протокол нигезендә Qiagen miRNeasy Micro Kit # 210874 ярдәмендә йөрәк бүлекләреннән аерылды.RNAsec китапханәсен әзерләү, эзләү һәм мәгълүмат анализы түбәндәгечә башкарылды:
Бер үрнәккә 1 μг РНК РНК китапханәсен әзерләү өчен башлангыч материал буларак кулланылды.Эзләү китапханәләре NEBNext UltraTM RNA китапханәсен Иллумина өчен (NEB, АКШ) җитештерүче тәкъдиме буенча ясалган, һәм һәрбер үрнәк өчен атрибутик эзлеклелектә индекс кодлары өстәлгән.Кыскасы, mRNA поли-Т олигонуклеотидлар белән бәйләнгән магнит мишәрләр ярдәмендә тулы РНКдан чистартылды.Фрагментация NEBNext Беренче катлы синтез реакциясе буферында (5X) югары температурада дивалент катионнар ярдәмендә башкарыла.Беренче полоса cDNA очраклы гексамер праймерлары һәм M-MuLV кире транскриптаз ярдәмендә синтезланган (RNase H-).Икенче полоса cDNA аннары ДНК полимераз I һәм RNase H. ярдәмендә синтезлана. Калган кырлар экзонуклаз / полимераз активлыгы белән тупас очларга әйләнәләр.ДНК фрагментының 3 ′ очын адениляцияләгәннән соң, аны гибридизациягә әзерләү өчен, чәч әйләнәсе структурасы булган NEBNext Адаптер бәйләнә.Сайланган озынлыктагы cDNA фрагментларын сайлау өчен 150-200 б.п.китапханә фрагментлары AMPure XP системасы ярдәмендә чистартылды (Бекман Култер, Беверли, АКШ).Аннары, 3 μл USER ферменты (NEB, АКШ) адаптер белән бәйләнгән зурлыктагы CDNA белән 15 минут 37 ° C, аннары PCR алдыннан 5 минут 95 минутта кулланылды.Аннары PCR Phusion High-Fidelity DNA полимерасы, универсаль PCR праймериз һәм Index (X) праймериз ярдәмендә башкарылды.Ниһаять, PCR продуктлары чистартылды (AMPure XP системасы) һәм Agilent Bioanalyzer 2100 системасында китапханә сыйфаты бәяләнде.CDNA китапханәсе аннары Новасек эзлеклелеге ярдәмендә эзлеклеләнде.Illumina-ның чимал файллары CASAVA Base Calling ярдәмендә чимал укуга әверелде.Чимал FASTQ (fq) формат файлларында саклана, аларда уку эзлеклелеге һәм төп сыйфатлар бар.Sscrofa11.1 сылтама геномына фильтрланган эзлеклелектә туры килү өчен HISAT2 сайлагыз.Гомумән алганда, HISAT2 теләсә нинди зурлыктагы геномнарны хуплый, шул исәптән 4 миллиардтан зуррак геномнар, һәм күпчелек параметрлар өчен килешү кыйммәтләре куелган.RNA Seq мәгълүматларын уку бүленеше HISAT2 ярдәмендә эффектив рәвештә тигезләнергә мөмкин, хәзерге вакытта иң тиз система, башка ысулларга караганда бер үк яки яхшырак төгәллек белән.
Транскрипцияләрнең күплеге ген белдерү дәрәҗәсен турыдан-туры чагылдыра.Ген белдерү дәрәҗәләре геном яки эксон белән бәйле транскрипцияләрнең күплеге белән бәяләнә.Укулар саны ген белдерү дәрәҗәләренә, ген озынлыгына, эзлеклелек тирәнлегенә пропорциональ.FPKM (миллион төп пар өчен транскрипциянең мең төп парына фрагментлар) исәпләнде һәм дифференциаль экспрессның P-кыйммәтләре DESeq2 пакеты ярдәмендә билгеләнде.Аннары без Бенжамини-Хохберг методы ярдәмендә һәр P бәясе өчен ялган ачыш ставкасын (FDR) исәпләдек, урнаштырылган R-функциясенә нигезләнеп "p.adjust".
Йөрәк бүлекләреннән изоляцияләнгән РНК термодан SuperScript IV Vilo Master катнашмасы ярдәмендә 200 ng / μl концентрациясендә CDNAга үзгәртелде (Термо, мәче. 11756050).Санлы RT-PCR кулланылган биосистемалар Эндура тәлинкәсе микроампасы 384 кое-ачык үтә күренмәле реакция тәлинкәсе (Термо, мәче. 4483319) һәм микроамптик оптик ябыштыргыч (Термо, мәче 43 4311971) ярдәмендә башкарылды.Реакция катнашмасы 5 µл Такман Тиз Алга киткән Мастер катнашмасы (Термо, мәче 44 4444557), 0,5 µл Такман Примеры һәм кое өчен 3,5 µл H2O катнашмасы.Стандарт qPCR цикллары эшләнде һәм CT кыйммәтләре кулланылган биосистемалар Quantstudio 5 реаль вакыттагы PCR коралы ярдәмендә үлчәнде (384 кое модуле; продукт # A28135).Такман праймериз Термодан (GAPDH (Ss03375629_u1), PARP12 (Ss06908795_m1), PKDCC (Ss06903874_m1), CYGB (Ss06900188_m1), RGL1 (Ss06868890_M1) 33.
NT-ProBNP медиа-чыгарылышы җитештерүче протоколы нигезендә NT-ProBNP комплекты (дуңгыз) (мәче No. MBS2086979, MyBioSource) ярдәмендә бәяләнде.Кыскасы, һәр коега икеләтә 250 үрнәк һәм стандарт өстәлде.Ampleрнәкне өстәгәннән соң, һәр коега 50 µл Assay Reagent A кушыгыз.Тәлинкәне әкрен генә селкетегез һәм мөһер белән мөһерләгез.Аннары планшетлар 37 ° C температурада 1 сәгать инкубацияләнде.Аннары эремәгә омтылыгыз һәм скважиналарны 4 тапкыр 350 µл 1X юу эремәсе белән юыгыз, юу эремәсен 1-2 минутка инкубацияләгез.Аннары коега 100 µл Assay Reagent B кушыгыз һәм тәлинкә плиткасы белән мөһерләгез.Планшет әкрен генә селкетелде һәм 30 минут эчендә 37 ° C инкубацияләнде.Чишелешкә омтылыгыз һәм скважиналарны 5 тапкыр юыгыз, 1 µ юу эремәсе белән 350 µл.Wellәр скважинага 90 µл субстрат эремәсе кушыгыз һәм тәлинкәне мөһерләгез.Тәлинкәне 37 ° C температурада 10-20 минутка инкубацияләгез.Wellәр коега 50 µl Stop Solution кушыгыз.Тәлинкә шунда ук 450 nm урнашкан Cytation (BioTek) тәлинкә укучы ярдәмендә үлчәнде.
Төркем размерларын сайлау өчен көч анализлары ясалды, алар параметрда 10% абсолют үзгәрешне ачыклау өчен 80% көч бирәчәк, I типтагы хата ставкасы белән. Төркем размерларын сайлау өчен көч анализлары ясалды, алар параметрда 10% абсолют үзгәрешне ачыклау өчен 80% көч бирәчәк, I типтагы хата ставкасы белән. Аназ мощности был выполнен для выборта размеров группасы, кот че обеспечат> 80% мощности для обнаружения 10% абсолтного изменения Параметра с 5% частотой сихибок чипа I. Энергия анализы группа размерларын сайлау өчен башкарылды, алар 5% I типтагы хата ставкасы белән 10% абсолют параметр үзгәрүен ачыклау өчен 80% көч бирәчәк.进行 功效 分析 80 80> 80 ％ 功效 以 中 中 10 ％ 绝对 和 和 5 ％ I 型 错误 率。。进行 功效 分析 80 80> 80 ％ 功效 以 中 中 10 ％ 绝对 和 和 5 ％ I 型 错误 率。。 Был проекты 10% абсолют параметр үзгәрүен һәм 5% I тибындагы хата ставкасын табу өчен> 80% көч бирәчәк төркем күләмен сайлау өчен көч анализы ясалды.Кисем бүлекләре эксперимент алдыннан очраклы рәвештә сайланган.Барлык анализлар да сукыр булган, үрнәкләр барлык мәгълүматлар анализланганнан соң гына декодланган.GraphPad Prism программасы (Сан-Диего, Калифорния) барлык статистик анализлар өчен кулланылды. Барлык статистика өчен p-кыйммәтләр <0.05 кыйммәтләрендә мөһим саналды. Барлык статистика өчен p-кыйммәтләр <0.05 кыйммәтләрендә мөһим саналды. Для всей статя пи-значения считались значимыми при значениях <0,05. Барлык статистика өчен p-кыйммәтләр <0.05 кыйммәтләрендә мөһим саналды.对于 所有 统计 ， ， p 0.05 0.05 <0.05 时 被 认为 是。。。对于 所有 统计 ， ， p 0.05 0.05 <0.05 时 被 认为 是。。。 Для всей статя пи-значения считались значимыми при значениях <0,05. Барлык статистика өчен p-кыйммәтләр <0.05 кыйммәтләрендә мөһим саналды.Ике койрыклы Студентның тесты 2 чагыштыру белән генә башкарылды.Бер төркем яки ике яклы ANOVA берничә төркем арасында әһәмиятне билгеләү өчен кулланылды.Төп тестлар үткәргәндә, Тукайны төзәтү берничә чагыштыру өчен кулланылды.RNAsec мәгълүматлары, методлар бүлегендә күрсәтелгәнчә, FDR һәм p.adjust-ны исәпләгәндә махсус статистик күзаллауларга ия.
Өйрәнү дизайны турында күбрәк мәгълүмат алу өчен, бу мәкалә белән бәйләнгән Табигатьне тикшерү отчетын карагыз.