Nature.com தளத்திற்கு வருகை தந்ததற்கு நன்றி. நீங்கள் பயன்படுத்தும் உலாவியில் CSS ஆதரவு குறைவாக உள்ளது. சிறந்த அனுபவத்தைப் பெற, மேம்படுத்தப்பட்ட உலாவியைப் பயன்படுத்துமாறு (அல்லது இன்டர்நெட் எக்ஸ்ப்ளோரரில் இணக்கப் பயன்முறையை முடக்குமாறு) பரிந்துரைக்கிறோம். இதற்கிடையில், தொடர்ச்சியான ஆதரவை உறுதிசெய்யும் வகையில், நாங்கள் இந்தத் தளத்தை ஸ்டைல்கள் மற்றும் ஜாவாஸ்கிரிப்ட் இல்லாமல் வழங்குவோம்.
மருந்து சோதனைகளுக்காக இதயத்தின் உடலியல் சூழலைத் துல்லியமாக மீண்டும் உருவாக்கக்கூடிய, நம்பகமான ஒரு இன் விட்ரோ அமைப்பு தேவைப்படுகிறது. மனித இதய திசு வளர்ப்பு அமைப்புகளின் வரையறுக்கப்பட்ட கிடைப்புத்தன்மை, இதய மருந்துகளின் விளைவுகள் குறித்த தவறான விளக்கங்களுக்கு வழிவகுத்துள்ளது. இங்கே, நாங்கள் ஒரு இதய திசு வளர்ப்பு மாதிரியை (CTCM) உருவாக்கியுள்ளோம். இது இதய சுழற்சியின் சிஸ்டாலிக் மற்றும் டயஸ்டாலிக் கட்டங்களின் போது, ​​இதயத் துண்டுகளை மின்னியந்திரவியல் ரீதியாகத் தூண்டி, உடலியல் நீட்சிக்கு உள்ளாக்குகிறது. 12 நாட்கள் வளர்ப்பிற்குப் பிறகு, இந்த அணுகுமுறை இதயப் பகுதிகளின் உயிர்வாழும் தன்மையை ஓரளவு மேம்படுத்தியது, ஆனால் அவற்றின் கட்டமைப்பு ஒருமைப்பாட்டை முழுமையாகப் பாதுகாக்கவில்லை. எனவே, சிறிய மூலக்கூறு பரிசோதனைக்குப் பிறகு, எங்கள் ஊடகத்தில் 100 nM டிரையோடோதைரோனைன் (T3) மற்றும் 1 μM டெக்ஸாமெதாசோன் (Dex) ஆகியவற்றைச் சேர்ப்பது, அந்தப் பகுதிகளின் நுண் கட்டமைப்பை 12 நாட்களுக்குப் பராமரித்தது என்பதைக் கண்டறிந்தோம். T3/Dex சிகிச்சையுடன் இணைந்து, CTCM அமைப்பானது படியெடுத்தல் விவரங்கள், உயிர்வாழும் தன்மை, வளர்சிதை மாற்றச் செயல்பாடு மற்றும் கட்டமைப்பு ஒருமைப்பாடு ஆகியவற்றை 12 நாட்களுக்குப் புதிய இதயத் திசுவின் அதே மட்டத்தில் பராமரித்தது. மேலும், வளர்ப்பில் உள்ள இதயத் திசுவின் அதிகப்படியான நீட்சி, மிகை வளர்ச்சி இதய சமிக்ஞையைத் தூண்டுகிறது. இது, இதய நீட்சியால் தூண்டப்படும் மிகை வளர்ச்சி நிலைகளைப் பிரதிபலிக்கும் CTCM-இன் திறனுக்குச் சான்றளிக்கிறது. முடிவாக, CTCM ஆனது வளர்ப்பில் உள்ள இதயத்தின் உடலியல் மற்றும் நோயியலை நீண்ட காலத்திற்கு மாதிரியாகக் காட்ட முடியும், இது நம்பகமான மருந்துச் சோதனையைச் சாத்தியமாக்குகிறது.
மருத்துவ ஆராய்ச்சிக்கு முன்னர், மனித இதயத்தின் உடலியல் சூழலைத் துல்லியமாக மீண்டும் உருவாக்கக்கூடிய நம்பகமான இன் விட்ரோ அமைப்புகள் தேவைப்படுகின்றன. அத்தகைய அமைப்புகள் மாற்றப்பட்ட இயந்திர நீட்சி, இதயத் துடிப்பு மற்றும் மின் உடலியல் பண்புகளைப் பிரதிபலிக்க வேண்டும். விலங்கு மாதிரிகள் பொதுவாக இதய உடலியலுக்கான ஒரு பரிசோதனைத் தளமாகப் பயன்படுத்தப்படுகின்றன, ஆனால் அவை மனித இதயத்தில் மருந்துகளின் விளைவுகளைப் பிரதிபலிப்பதில் குறைந்த நம்பகத்தன்மையையே கொண்டுள்ளன¹,². இறுதியாக, சிறந்த இதயத் திசு வளர்ப்பு சோதனை மாதிரி (CTCM) என்பது பல்வேறு சிகிச்சை மற்றும் மருந்தியல் தலையீடுகளுக்கு மிகவும் உணர்திறன் மற்றும் குறிப்பிட்ட தன்மையைக் கொண்ட ஒரு மாதிரியாகும், இது மனித இதயத்தின் உடலியல் மற்றும் நோயியல் உடலியலைத் துல்லியமாக மீண்டும் உருவாக்குகிறது³. அத்தகைய ஒரு அமைப்பின் இல்லாமை, இதய செயலிழப்புக்கான புதிய சிகிச்சைகளைக் கண்டுபிடிப்பதைக் கட்டுப்படுத்துகிறது⁴,⁵ மற்றும் மருந்து இதய நச்சுத்தன்மையை சந்தையிலிருந்து வெளியேறுவதற்கான ஒரு முக்கிய காரணமாக மாற்றியுள்ளது⁶.
கடந்த பத்தாண்டுகளில், எட்டு இருதய சம்பந்தமில்லாத மருந்துகள் மருத்துவப் பயன்பாட்டிலிருந்து திரும்பப் பெறப்பட்டுள்ளன, ஏனெனில் அவை QT இடைவெளியை நீட்டித்து, வென்ட்ரிகுலர் அரித்மியாக்கள் மற்றும் திடீர் மரணத்திற்கு வழிவகுக்கின்றன7. எனவே, இருதய செயல்திறன் மற்றும் நச்சுத்தன்மையை மதிப்பிடுவதற்கு நம்பகமான மருத்துவத்திற்கு முந்தைய பரிசோதனை உத்திகளுக்கான தேவை அதிகரித்து வருகிறது. மருந்துப் பரிசோதனை மற்றும் நச்சுத்தன்மை சோதனையில் மனித தூண்டப்பட்ட பன்மைத்திறன் கொண்ட ஸ்டெம் செல்களிலிருந்து பெறப்பட்ட கார்டியோமையோசைட்டுகளின் (hiPS-CM) சமீபத்திய பயன்பாடு இந்தப் பிரச்சனைக்கு ஒரு பகுதி தீர்வை வழங்குகிறது. இருப்பினும், hiPS-CM-களின் முதிர்ச்சியற்ற தன்மை மற்றும் இதயத் திசுக்களின் பலசெல் சிக்கலான தன்மை இல்லாமை ஆகியவை இந்த முறையின் முக்கிய வரம்புகளாகும். தன்னிச்சையான சுருக்கங்கள் தொடங்கிய சிறிது நேரத்திலேயே இதயத் திசு ஹைட்ரோஜெல்களை உருவாக்க ஆரம்பகால hiPS-CM-களைப் பயன்படுத்துவதன் மூலமும், காலப்போக்கில் மின் தூண்டுதலை படிப்படியாக அதிகரிப்பதன் மூலமும் இந்த வரம்பை ஓரளவு சமாளிக்க முடியும் என்று சமீபத்திய ஆய்வுகள் காட்டுகின்றன. இருப்பினும், இந்த hiPS-CM நுண்திசுக்களில், வயதுவந்த இதயத் தசையின் முதிர்ந்த மின் உடலியல் மற்றும் சுருங்கும் பண்புகள் இல்லை. மேலும், மனித இதயத் திசுவானது, எண்டோதெலியல் செல்கள், நியூரான்கள் மற்றும் ஸ்ட்ரோமல் ஃபைப்ரோபிளாஸ்ட்கள் உள்ளிட்ட பல்வேறு செல் வகைகளின் ஒருபடித்தற்ற கலவையைக் கொண்ட மிகவும் சிக்கலான அமைப்பைக் கொண்டுள்ளது; இவை குறிப்பிட்ட வகையான புற-செல் மேட்ரிக்ஸ் புரதங்களால் ஒன்றோடொன்று இணைக்கப்பட்டுள்ளன. வளர்ந்த பாலூட்டிகளின் இதயத்தில் உள்ள கார்டியோமயோசைட் அல்லாத செல் தொகுதிகளின் இந்த பன்முகத்தன்மை¹¹,¹²,¹³, தனிப்பட்ட செல் வகைகளைப் பயன்படுத்தி இதயத் திசுவை மாதிரியாக்குவதற்கு ஒரு பெரிய தடையாக உள்ளது. இந்த முக்கிய வரம்புகள், உடலியல் மற்றும் நோயியல் நிலைகளின் கீழ் சிதைவடையாத இதயத் திசுவை வளர்ப்பதற்கான முறைகளை உருவாக்குவதன் முக்கியத்துவத்தை வலியுறுத்துகின்றன.
வளர்க்கப்பட்ட மனித இதயத்தின் மெல்லிய (300 µm) பகுதிகள், சிதைவடையாத மனித இதயத்தசையின் ஒரு நம்பிக்கைக்குரிய மாதிரியாக நிரூபிக்கப்பட்டுள்ளன. இந்த முறை, மனித இதயத் திசுவைப் போன்ற ஒரு முழுமையான 3D பலசெல் அமைப்பை அணுகுவதற்கான வாய்ப்பை வழங்குகிறது. இருப்பினும், 2019 வரை, வளர்க்கப்பட்ட இதயப் பகுதிகளின் பயன்பாடு, குறுகிய (24 மணிநேர) வளர்ப்பு உயிர்வாழ்வால் மட்டுப்படுத்தப்பட்டிருந்தது. இதற்கு, இயற்பியல்-இயந்திர நீட்சி இல்லாமை, காற்று-திரவ இடைமுகம், மற்றும் இதயத் திசுவின் தேவைகளை ஆதரிக்காத எளிய ஊடகங்களின் பயன்பாடு உள்ளிட்ட பல காரணிகள் உள்ளன. 2019-ல், பல ஆய்வுக் குழுக்கள், இதயத் திசு வளர்ப்பு அமைப்புகளில் இயந்திரக் காரணிகளை இணைப்பது வளர்ப்பு ஆயுளை நீட்டிக்கவும், இதய வெளிப்பாட்டை மேம்படுத்தவும், மற்றும் இதய நோயியலைப் பிரதிபலிக்கவும் முடியும் என்று நிரூபித்தன. இரண்டு நேர்த்தியான ஆய்வுகள் 17 மற்றும் 18, வளர்ப்பின் போது ஒரு-அச்சு இயந்திர சுமையேற்றம் இதயப் புறத்தோற்றத்தில் ஒரு நேர்மறையான விளைவைக் கொண்டிருப்பதைக் காட்டுகின்றன. இருப்பினும், இந்த ஆய்வுகள் இதயச் சுழற்சியின் மாறும் முப்பரிமாண இயற்பியல்-இயந்திர சுமையேற்றத்தைப் பயன்படுத்தவில்லை, ஏனெனில் இதயப் பகுதிகள் சமஅளவு இழுவிசை விசைகள் 17 அல்லது நேரியல் ஆக்ஸோடோனிக் சுமையேற்றம் 18 ஆகியவற்றால் ஏற்றப்பட்டன. திசுக்களை நீட்டும் இந்த முறைகள், பல இதய மரபணுக்களை அடக்குவதற்கோ அல்லது அசாதாரண நீட்சி எதிர்வினைகளுடன் தொடர்புடைய மரபணுக்களை மிகையாக வெளிப்படுத்துவதற்கோ வழிவகுத்தன. குறிப்பாக, பிட்டோலிஸ் மற்றும் குழுவினர் 19, விசை மாற்றி பின்னூட்டம் மற்றும் இழுவிசை இயக்கிகளைப் பயன்படுத்தி இதயச் சுழற்சியை மறுகட்டமைப்பதற்காக ஒரு மாறும் இதயத் துண்டு வளர்ப்புத் தொட்டியை உருவாக்கினர். இந்த அமைப்பு, ஆய்வகத்தில் மிகவும் துல்லியமான இதயச் சுழற்சி மாதிரியாக்கத்தை அனுமதித்தாலும், இந்த முறையின் சிக்கலான தன்மையும் குறைந்த செயல் திறனும் இதன் பயன்பாட்டைக் கட்டுப்படுத்துகின்றன. எங்கள் ஆய்வகம் சமீபத்தில், பன்றி மற்றும் மனித இதயத் திசுக்களின் பிரிவுகளின் உயிர்வாழும் தன்மையை 6 நாட்கள் வரை பராமரிப்பதற்காக, மின் தூண்டுதல் மற்றும் மேம்படுத்தப்பட்ட ஊடகத்தைப் பயன்படுத்தி ஒரு எளிமையான வளர்ப்பு முறையை உருவாக்கியுள்ளது20,21.
தற்போதைய கையெழுத்துப் பிரதியில், இதயச் சுழற்சியின் போது ஏற்படும் முப்பரிமாண இதய உடலியல் மற்றும் நோயியல் சார்ந்த விரிவடைதலை மீண்டும் உருவாக்குவதற்காக, ஹார்மோன் சமிக்ஞைகளை உள்ளடக்கிய பன்றியின் இதயப் பகுதிகளைப் பயன்படுத்தும் ஒரு இதயத் திசு வளர்ப்பு மாதிரியை (CTCM) நாங்கள் விவரிக்கிறோம். இந்த CTCM, மருத்துவத்திற்கு முந்தைய மருந்துச் சோதனைகளுக்காக, பாலூட்டிகளின் இதயத்தின் உடலியல்/நோயியலைப் பிரதிபலிக்கும் ஒரு செலவு குறைந்த, நடுத்தர-செயல்பாட்டு இதய அமைப்பை வழங்குவதன் மூலம், மருத்துவத்திற்கு முந்தைய மருந்து முன்கணிப்பின் துல்லியத்தை இதுவரை அடையப்படாத ஒரு நிலைக்கு உயர்த்த முடியும்.
இன் விட்ரோவில் கார்டியோமயோசைட் செயல்பாட்டைப் பராமரிப்பதில் ஹீமோடைனமிக் இயந்திர சமிக்ஞைகள் ஒரு முக்கியப் பங்கு வகிக்கின்றன 22,23,24. தற்போதைய ஆய்வுக் கட்டுரையில், உடலியல் அதிர்வெண்களில் (1.2 ஹெர்ட்ஸ், நிமிடத்திற்கு 72 துடிப்புகள்) மின் மற்றும் இயந்திர தூண்டுதல் இரண்டையும் தூண்டுவதன் மூலம் வயது வந்தோரின் இதயச் சூழலைப் பிரதிபலிக்கக்கூடிய ஒரு CTCM-ஐ (படம் 1a) நாங்கள் உருவாக்கியுள்ளோம். டயஸ்டோலின் போது அதிகப்படியான திசு நீட்சியைத் தவிர்க்க, திசுவின் அளவை 25% அதிகரிக்க ஒரு 3D அச்சிடும் சாதனம் பயன்படுத்தப்பட்டது (படம் 1b). இதயச் சுழற்சியை முழுமையாக மீண்டும் உருவாக்க, ஒரு தரவு கையகப்படுத்தும் அமைப்பைப் பயன்படுத்தி, சிஸ்டோலுக்கு 100 மில்லி விநாடிகளுக்கு முன்பு C-PACE அமைப்பால் தூண்டப்பட்ட மின் பேஸிங் தொடங்குமாறு நேரம் நிர்ணயிக்கப்பட்டது. இந்த திசு வளர்ப்பு அமைப்பு, மேல் அறையில் உள்ள இதயத் துண்டுகளின் விரிவாக்கத்தை ஏற்படுத்துவதற்காக, ஒரு நெகிழ்வான சிலிக்கான் சவ்வை சுழற்சி முறையில் விரிவுபடுத்த ஒரு நிரல்படுத்தக்கூடிய நியூமேடிக் ஆக்சுவேட்டரைப் (LB இன்ஜினியரிங், ஜெர்மனி) பயன்படுத்துகிறது. இந்த அமைப்பு ஒரு அழுத்த மாற்றி மூலம் வெளிப்புறக் காற்றுக் குழாயுடன் இணைக்கப்பட்டது, இது அழுத்தத்தையும் (± 1 mmHg) நேரத்தையும் (± 1 ms) துல்லியமாகச் சரிசெய்ய வழிவகுத்தது (படம் 1c).
a சாதனத்தின் வளர்ப்பு அறைக்குள், நீல நிறத்தில் காட்டப்பட்டுள்ள 7 மிமீ ஆதரவு வளையத்தில் திசுப் பகுதியை இணைக்கவும். வளர்ப்பு அறையானது, ஒரு மெல்லிய நெகிழ்வான சிலிக்கான் சவ்வினால் காற்று அறையிலிருந்து பிரிக்கப்பட்டுள்ளது. கசிவுகளைத் தடுக்க ஒவ்வொரு அறைக்கும் இடையில் ஒரு கேஸ்கெட்டை வைக்கவும். சாதனத்தின் மூடியில் மின் தூண்டுதலை வழங்கும் கிராஃபைட் மின்முனைகள் உள்ளன. b பெரிய திசு சாதனம், வழிகாட்டி வளையம் மற்றும் ஆதரவு வளையத்தின் திட்ட வரைபடம். திசுப் பகுதிகள் (பழுப்பு நிறம்) பெரிதாக்கப்பட்ட சாதனத்தில் வைக்கப்படுகின்றன, மேலும் வழிகாட்டி வளையம் சாதனத்தின் வெளிப்புற விளிம்பில் உள்ள பள்ளத்தில் வைக்கப்படுகிறது. வழிகாட்டியைப் பயன்படுத்தி, திசு அக்ரிலிக் பசையால் பூசப்பட்ட ஆதரவு வளையத்தை இதயத் திசுப் பகுதியின் மீது கவனமாக வைக்கவும். c நிரல்படுத்தக்கூடிய நியூமேட்டிக் ஆக்சுவேட்டரால் (PPD) கட்டுப்படுத்தப்படும் காற்று அறை அழுத்தத்தின் சார்பாக மின் தூண்டுதலின் நேரத்தைக் காட்டும் வரைபடம். அழுத்த உணரிகளைப் பயன்படுத்தி மின் தூண்டுதலை ஒத்திசைக்க ஒரு தரவு சேகரிப்பு சாதனம் பயன்படுத்தப்பட்டது. வளர்ப்பு அறையில் உள்ள அழுத்தம் நிர்ணயிக்கப்பட்ட வரம்பை அடையும்போது, ​​மின் தூண்டுதலைத் தூண்டுவதற்காக C-PACE-EM-க்கு ஒரு துடிப்பு சமிக்ஞை அனுப்பப்படுகிறது. d ஒரு இன்குபேட்டர் அலமாரியில் வைக்கப்பட்டுள்ள நான்கு CTCM-களின் படம். ஒரு காற்றழுத்தச் சுற்று வழியாக நான்கு சாதனங்கள் ஒரே PPD உடன் இணைக்கப்பட்டுள்ளன, மேலும் காற்றழுத்தச் சுற்றில் உள்ள அழுத்தத்தைக் கண்காணிக்க, இரத்தப்போக்கை நிறுத்தும் வால்வில் அழுத்த உணர்விகள் செருகப்பட்டுள்ளன. ஒவ்வொரு சாதனத்திலும் ஆறு திசுப் பிரிவுகள் உள்ளன.
ஒற்றை நியூமேட்டிக் ஆக்சுவேட்டரைப் பயன்படுத்தி, எங்களால் 4 CTCM கருவிகளைக் கட்டுப்படுத்த முடிந்தது, அவற்றில் ஒவ்வொன்றும் 6 திசுப் பிரிவுகளைத் தாங்கக்கூடியதாக இருந்தது (படம் 1d). CTCM-ல், காற்று அறையில் உள்ள காற்று அழுத்தம், திரவ அறையில் ஒத்திசைவான அழுத்தமாக மாற்றப்பட்டு, இதயத் துண்டின் உடலியல் ரீதியான விரிவாக்கத்தைத் தூண்டுகிறது (படம் 2a மற்றும் துணை காணொளி 1). 80 மிமீ Hg அழுத்தத்தில் திசு நீட்சியை மதிப்பிட்டபோது, ​​திசுப் பிரிவுகள் 25% நீட்சியடைந்தது தெரியவந்தது (படம் 2b). இந்த சதவீத நீட்சியானது, சாதாரண இதயப் பிரிவு சுருங்குதிறனுக்கான 2.2–2.3 µm உடலியல் சார்கோமியர் நீளத்திற்கு ஒத்திருப்பதாகக் காட்டப்பட்டுள்ளது¹⁷,¹⁹,²⁵. பிரத்யேக கேமரா அமைப்புகளைப் பயன்படுத்தி திசு இயக்கம் மதிப்பிடப்பட்டது (துணைப் படம் 1). திசு இயக்கத்தின் வீச்சும் வேகமும் (படம் 2c, d), இதயச் சுழற்சியின் போது ஏற்படும் நீட்சி மற்றும் சிஸ்டோல், டயஸ்டோல் நேரங்களில் ஏற்படும் நீட்சிக்கு (படம் 2b) ஒத்திருந்தது. சுருக்கம் மற்றும் தளர்வின் போது இதயத் திசுவின் நீட்சியும் வேகமும் வளர்ப்பில் 12 நாட்களுக்கு நிலையானதாக இருந்தது (படம் 2f). வளர்ப்பின் போது சுருங்கும் தன்மையின் மீது மின் தூண்டலின் விளைவை மதிப்பிடுவதற்காக, நிழலிடல் வழிமுறையைப் பயன்படுத்தி (துணைப் படம் 2a,b) செயல்படும் உருக்குலைவைக் கண்டறியும் ஒரு முறையை நாங்கள் உருவாக்கினோம், மேலும் மின் தூண்டலுடன் மற்றும் மின் தூண்டல் இல்லாமல் ஏற்படும் உருக்குலைவுகளை வேறுபடுத்தி அறிய முடிந்தது. இதயத்தின் அதே பகுதி (படம் 2f). வெட்டப்பட்ட பகுதியின் அசையும் பகுதியில் (R6-9), மின் தூண்டலின் போது மின்னழுத்தம், மின் தூண்டல் இல்லாத நிலையைக் காட்டிலும் 20% அதிகமாக இருந்தது, இது சுருங்கும் செயல்பாட்டிற்கு மின் தூண்டலின் பங்களிப்பைக் குறிக்கிறது.
காற்று அறை அழுத்தம், திரவ அறை அழுத்தம் மற்றும் திசு இயக்க அளவீடுகளின் பிரதிநிதித்துவத் தடங்கள், அறை அழுத்தம் திரவ அறை அழுத்தத்தை மாற்றுவதை உறுதிப்படுத்துகின்றன, இது திசுத் துண்டின் அதற்கேற்ற இயக்கத்தை ஏற்படுத்துகிறது. b திசுப் பிரிவுகளின் சதவீத நீட்சிக்கு (நீலம்) ஒத்த பிரதிநிதித்துவத் தடங்கள் (ஆரஞ்சு). c இதயத் துண்டின் அளவிடப்பட்ட இயக்கம், அளவிடப்பட்ட இயக்க வேகத்துடன் ஒத்துப்போகிறது. (d) இதயத்தின் ஒரு துண்டில் சுழற்சி இயக்கம் (நீலக் கோடு) மற்றும் திசைவேகம் (ஆரஞ்சு புள்ளிக் கோடு) ஆகியவற்றின் பிரதிநிதித்துவப் பாதைகள். e சுழற்சி நேரம் (வெவ்வேறு பன்றிகளிலிருந்து, ஒரு குழுவிற்கு n = 19 துண்டுகள்), சுருங்கும் நேரம் (ஒரு குழுவிற்கு n = 19 துண்டுகள்), தளர்வு நேரம் (வெவ்வேறு பன்றிகளிலிருந்து, ஒரு குழுவிற்கு n = 19 துண்டுகள்), திசு இயக்கம் (வெவ்வேறு பன்றிகளிலிருந்து, ஒரு குழுவிற்கு n = 25 துண்டுகள்), உச்ச சிஸ்டாலிக் திசைவேகம் (வெவ்வேறு பன்றிகளிலிருந்து, ஒரு குழுவிற்கு n = 24(D0), 25(D12) துண்டுகள்) மற்றும் உச்ச தளர்வு விகிதம் (வெவ்வேறு பன்றிகளிலிருந்து, ஒரு குழுவிற்கு n = 24(D0), 25(D12) துண்டுகள்) ஆகியவற்றின் அளவு நிர்ணயம். இருமுனை மாணவர் t-சோதனை எந்தவொரு அளவுருவிலும் குறிப்பிடத்தக்க வேறுபாடு இல்லை என்பதைக் காட்டியது. f மின் தூண்டுதலுடன் (சிவப்பு) மற்றும் மின் தூண்டுதல் இல்லாமல் (நீலம்) உள்ள திசுப் பிரிவுகளின் பிரதிநிதித்துவ திரிபு பகுப்பாய்வு தடங்கள், ஒரே பிரிவிலிருந்து திசுப் பிரிவுகளின் பத்து பிராந்தியப் பகுதிகள். கீழ் பேனல்கள் வெவ்வேறு பிரிவுகளிலிருந்து பத்து பகுதிகளில் மின் தூண்டுதலுடன் மற்றும் மின் தூண்டுதல் இல்லாமல் உள்ள திசுப் பிரிவுகளில் திரிபில் உள்ள சதவீத வேறுபாட்டின் அளவீட்டைக் காட்டுகின்றன. (வெவ்வேறு பன்றிகளிலிருந்து ஒவ்வொரு குழுவிற்கும் 8 துண்டுகள், இருமுனை ஸ்டூடண்ட் t-சோதனை மேற்கொள்ளப்பட்டது; ****p < 0.0001, **p < 0.01, *p < 0.05). (வெவ்வேறு பன்றிகளிலிருந்து ஒவ்வொரு குழுவிற்கும் 8 துண்டுகள், இருமுனை ஸ்டூடண்ட் t-சோதனை மேற்கொள்ளப்பட்டது; ****p < 0.0001, **p < 0.01, *p < 0.05). (n = 8 срезов/группу от разных свиней, проводится двусторонний t-критерий Стьюдента; **p<0,0001, **p<001, **,<00). (வெவ்வேறு பன்றிகளிலிருந்து ஒவ்வொரு குழுவிற்கும் n = 8, இருமுனை ஸ்டூடண்ட்ஸ் t-சோதனை; ****p<0.0001, **p<0.01, *p<0.05). n = 8 片/组,来自不同的猪,进行双尾学生t 检验；****p <0.0001,**p <0.01,*p <0.05） n = 8 片/组,来自不同的猪,进行双尾学生t 检验；****p <0.0001,**p <0.01,*p <0.05） (n = 8 срезов/группу, от разных свиней, двусторонний критерий Стьюдента; ****p <0,0001, **p <0,01, *p <0,05). (n = 8 பிரிவுகள்/குழு, வெவ்வேறு பன்றிகளிலிருந்து, இருமுனை ஸ்டூடண்ட்ஸ் t-சோதனை; ****p<0.0001, **p<0.01, *p<0.05).பிழைப் பட்டைகள் சராசரி ± திட்ட விலகலைக் குறிக்கின்றன.
எங்களின் முந்தைய நிலையான பயோமிமெடிக் இதயத் துண்டு வளர்ப்பு அமைப்பில் [20, 21], மின் தூண்டுதலைப் பயன்படுத்துவதன் மூலமும் ஊடகக் கலவையை மேம்படுத்துவதன் மூலமும் இதயத் துண்டுகளின் உயிர்வாழும் தன்மை, செயல்பாடு மற்றும் கட்டமைப்பு ஒருமைப்பாட்டை 6 நாட்களுக்குப் பராமரித்தோம். இருப்பினும், 10 நாட்களுக்குப் பிறகு, இந்த புள்ளிவிவரங்கள் கடுமையாகக் குறைந்தன. எங்களின் முந்தைய நிலையான பயோமிமெடிக் வளர்ப்பு அமைப்பில் [20, 21] வளர்க்கப்பட்ட பிரிவுகளைக் கட்டுப்பாட்டு நிலைமைகள் (Ctrl) என்றும், எங்களின் முன்பு மேம்படுத்தப்பட்ட ஊடகத்தை MC நிலைமைகள் மற்றும் ஒரே நேரத்தில் இயந்திர மற்றும் மின் தூண்டுதலின் கீழ் வளர்ப்பு (CTCM) என்றும் குறிப்பிடுவோம். முதலில், மின் தூண்டுதல் இல்லாத இயந்திரத் தூண்டுதல் 6 நாட்களுக்கு திசுவின் உயிர்வாழும் தன்மையைப் பராமரிக்கப் போதுமானதாக இல்லை என்பதை நாங்கள் தீர்மானித்தோம் (துணைப் படம் 3a,b). சுவாரஸ்யமாக, STCM ஐப் பயன்படுத்தி உடலியல்-இயந்திர மற்றும் மின் தூண்டுதலை அறிமுகப்படுத்தியவுடன், 12-நாள் இதயப் பிரிவுகளின் உயிர்வாழும் தன்மை MS நிலைமைகளின் கீழ் புதிய இதயப் பிரிவுகளில் இருந்ததைப் போலவே இருந்தது, ஆனால் Ctrl நிலைமைகளின் கீழ் இல்லை, இது MTT பகுப்பாய்வு மூலம் காட்டப்பட்டுள்ளது (படம் 1). இது, இயந்திரத் தூண்டுதல் மற்றும் இதயச் சுழற்சியின் உருவகப்படுத்துதல் ஆகியவை, நமது முந்தைய நிலையான வளர்ப்பு முறையில் தெரிவிக்கப்பட்டதை விட இரண்டு மடங்கு அதிக காலத்திற்கு திசுப் பகுதிகளை உயிருடன் வைத்திருக்க முடியும் என்பதைக் காட்டுகிறது. இருப்பினும், கார்டியாக் ட்ரோபோனின் T மற்றும் கனெக்சின் 43 ஆகியவற்றின் இம்யூனோலேபிளிங் மூலம் திசுப் பகுதிகளின் கட்டமைப்பு ஒருமைப்பாட்டை மதிப்பிட்டதில், 12 ஆம் நாளில் MC திசுக்களில் கனெக்சின் 43 வெளிப்பாடு, அதே நாளில் கட்டுப்பாட்டு திசுக்களுடன் ஒப்பிடும்போது கணிசமாக அதிகமாக இருந்தது தெரியவந்தது. இருப்பினும், சீரான கனெக்சின் 43 வெளிப்பாடு மற்றும் Z-வட்டு உருவாக்கம் முழுமையாகப் பராமரிக்கப்படவில்லை (படம் 3b). திசுவின் கட்டமைப்பு ஒருமைப்பாட்டை அளவிட, நாங்கள் ஒரு செயற்கை நுண்ணறிவு (AI) கட்டமைப்பைப் பயன்படுத்துகிறோம்²⁶; ட்ரோபோனின்-T மற்றும் கனெக்சின் சாயமேற்றலை⁴³ அடிப்படையாகக் கொண்ட ஒரு பட அடிப்படையிலான டீப் லேர்னிங் பைப்லைனைப் பயன்படுத்தி, இதயத் துண்டுகளின் கட்டமைப்பு ஒருமைப்பாடு மற்றும் ஒளிர்தலை, இருப்பிட வலிமையின் அடிப்படையில் தானாகவே அளவிடுகிறோம். இந்த முறையானது, மேற்கோள் ²⁶-இல் விவரிக்கப்பட்டுள்ளபடி, இதயத் திசுவின் கட்டமைப்பு ஒருமைப்பாட்டை தானியங்கி மற்றும் பாரபட்சமற்ற முறையில் நம்பகத்தன்மையுடன் அளவிட, ஒரு கன்வல்யூஷனல் நியூரல் நெட்வொர்க் (CNN) மற்றும் ஒரு டீப் லேர்னிங் கட்டமைப்பைப் பயன்படுத்துகிறது. நிலையான கட்டுப்பாட்டுப் பகுதிகளுடன் ஒப்பிடும்போது, ​​MC திசு 0 ஆம் நாளுடன் மேம்பட்ட கட்டமைப்பு ஒற்றுமையைக் காட்டியது. மேலும், வளர்ப்பின் 12 ஆம் நாளில், கட்டுப்பாட்டு நிலைமைகளுடன் ஒப்பிடும்போது MS நிலைமைகளின் கீழ் ஃபைப்ரோசிஸின் சதவீதம் கணிசமாகக் குறைவாக இருப்பதை மாசனின் டிரைகுரோம் சாயமேற்றல் வெளிப்படுத்தியது (படம் 3c). CTCM ஆனது 12 ஆம் நாளில் இதயத் திசுப் பிரிவுகளின் உயிர்வாழும் தன்மையை புதிய இதயத் திசுவின் அளவிற்கு அதிகரித்தபோதிலும், அது இதயப் பிரிவுகளின் கட்டமைப்பு ஒருமைப்பாட்டை குறிப்பிடத்தக்க அளவில் மேம்படுத்தவில்லை.
ஒரு பட்டை வரைபடம், புதிய இதயத் துண்டுகளின் (D0) அல்லது நிலையான வளர்ப்பில் (D12 Ctrl) அல்லது CTCM-இல் (D12 MC) 12 நாட்கள் வளர்க்கப்பட்ட இதயத் துண்டுகளின் MTT உயிர்வாழும் திறனின் அளவீட்டைக் காட்டுகிறது (வெவ்வேறு பன்றிகளிடமிருந்து பெறப்பட்ட ஒவ்வொரு குழுவிற்கும் n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) துண்டுகள்; ஒரு வழி ANOVA சோதனை செய்யப்பட்டது; D0 உடன் ஒப்பிடும்போது ####p < 0.0001 மற்றும் D12 Ctrl உடன் ஒப்பிடும்போது **p < 0.01). ஒரு பட்டை வரைபடம், புதிய இதயத் துண்டுகளின் (D0) அல்லது நிலையான வளர்ப்பில் (D12 Ctrl) அல்லது CTCM-இல் (D12 MC) 12 நாட்கள் வளர்க்கப்பட்ட இதயத் துண்டுகளின் MTT உயிர்வாழும் திறனின் அளவீட்டைக் காட்டுகிறது (வெவ்வேறு பன்றிகளிடமிருந்து பெறப்பட்ட ஒவ்வொரு குழுவிற்கும் n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) துண்டுகள்; ஒரு வழி ANOVA சோதனை செய்யப்பட்டது; D0 உடன் ஒப்பிடும்போது ####p < 0.0001 மற்றும் D12 Ctrl உடன் ஒப்பிடும்போது **p < 0.01).இந்த வரைபடம், MTT மூலம் புதிதாக வளர்க்கப்பட்ட இதயத் துண்டுகளின் (D0) அல்லது நிலையான வளர்ப்பில் (D12 கட்டுப்பாடு) அல்லது CTCM-இல் (D12 MC) 12 நாட்களுக்கு வளர்க்கப்பட்ட இதயத் துண்டுகளின் உயிர்வாழும் தன்மையின் அளவீட்டைக் காட்டுகிறது (n = 18 (D0), 15 (D12 கட்டுப்பாடு)). வெவ்வேறு பன்றிகளிடமிருந்து பெறப்பட்ட ஒவ்வொரு குழுவிற்கும் 12 (D12 MC) துண்டுகள் எடுத்துக்கொள்ளப்பட்டு, ஒருவழி ANOVA சோதனை செய்யப்படுகிறது;####p <0,0001 по сравнению с D0 и **p <0,01 по сравнению с D12 Ctrl). D0 உடன் ஒப்பிடும்போது p < 0.0001 மற்றும் D12 Ctrl உடன் ஒப்பிடும்போது p < 0.01). a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏(形心脏)或心脏切片培养12 天的MTT 活力的量化),来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行测试；与D0 相比,####p < 0.0001,与D12 Ctrl 相比,**p <0.01)。 a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏(形心脏) ，来自不同猪的12 (D12 MC)புதிய இதயத் துண்டுகளில் (D0) அல்லது நிலையான வளர்ப்பில் (D12 கட்டுப்பாடு) அல்லது CTCM-ல் (D12 MC) 12 நாட்கள் வளர்க்கப்பட்ட இதயத் துண்டுகளில் MTT உயிர்வாழும் திறனின் அளவீட்டைக் காட்டும் வரைபடம் (n = 18 (D0), 15 (D12 கட்டுப்பாடு)), வெவ்வேறு பன்றிகளிலிருந்து ஒவ்வொரு குழுவிற்கும் 12 (D12 MC) துண்டுகள், ஒருவழி ANOVA சோதனை;####p <0,0001 по сравнению с D0, **p <0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####D0 உடன் ஒப்பிடும்போது p < 0.0001, **D12 Ctrl உடன் ஒப்பிடும்போது p < 0.01).b புதிதாகப் பிரித்தெடுக்கப்பட்ட இதயத் துண்டுகள் (D0) அல்லது 12 நாட்களுக்கு நிலையான நிலைமைகளின் கீழ் (Ctrl) அல்லது CTCM நிலைமைகளின் கீழ் (MC) வளர்க்கப்பட்ட இதயத் துண்டுகளில் உள்ள ட்ரோபோனின்-டி (பச்சை), கனெக்சின் 43 (சிவப்பு) மற்றும் DAPI (நீலம்) ஆகியவற்றின் பிரதிநிதித்துவ இம்யூனோஃப்ளோரசன்ஸ் படங்கள் (வெற்று அளவு = 100 µm). இதயத் திசுவின் கட்டமைப்பு ஒருமைப்பாட்டை செயற்கை நுண்ணறிவு மூலம் அளவிடுதல் (வெவ்வேறு பன்றிகளிலிருந்து எடுக்கப்பட்ட, ஒவ்வொரு குழுவிற்கும் n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) துண்டுகள்; ஒருவழி ANOVA சோதனை செய்யப்பட்டது; D0 உடன் ஒப்பிடும்போது ####p < 0.0001 மற்றும் D12 Ctrl உடன் ஒப்பிடும்போது ****p < 0.0001). இதயத் திசுவின் கட்டமைப்பு ஒருமைப்பாட்டை செயற்கை நுண்ணறிவு மூலம் அளவிடுதல் (வெவ்வேறு பன்றிகளிடமிருந்து பெறப்பட்ட, ஒவ்வொரு குழுவிற்கும் 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) துண்டுகள்; ஒருவழி ANOVA சோதனை மேற்கொள்ளப்பட்டது; D0 உடன் ஒப்பிடும்போது ####p < 0.0001 மற்றும் D12 Ctrl உடன் ஒப்பிடும்போது ****p < 0.0001). கோலிசெஸ்ட்வென்னாயா ஓசென்கா ஸ்ட்ரக்டர்னோய் செலோஸ்ட்னோஸ்டி சர்டெச்னோய் டிகானி இஸ்கஸ்ட்வென்னிம் இன்டெலக்டோம் (n = 7D10), (n = 7D10), எம்.சி.) அனோவா ####p <0,0001 по сравнению с D0 и ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). செயற்கை நுண்ணறிவு மூலம் இதயத் திசுவின் கட்டமைப்பு ஒருமைப்பாட்டை அளவிடுதல் (வெவ்வேறு பன்றிகளிலிருந்து பெறப்பட்ட 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) பிரிவுகள்/குழுக்கள், ஒருவழி ANOVA சோதனை செய்யப்பட்டது; D0 உடன் ஒப்பிடும்போது ####p < 0.0001 மற்றும் D12 Ctrl உடன் ஒப்பிடும்போது ****p < 0.0001).人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) ஸ்லைஸ்கள்/குரூப் ஒவ்வொன்றும் வெவ்வேறு பன்றிகள், ஒரு-வழி ANOVA சோதனை <#0#.相比,****p <0.0001 与D12 Ctrl 相比）。人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) ஸ்லைஸ்கள்/குரூப் ஒவ்வொன்றும் வெவ்வேறு பன்றிகள், <##.#000 சோதனை;与D0相比,**p <0.0001 与D12 Ctrl 相比）。 Искусственный INTELLEKT для COLICHESTVENNOY OS STRUCTURNOY SELOSTNOSTI SERDECHNOY TKANI (120l) (n =7lD), (D12 MC) ராஸ்னிஷ் ஸ்வினி, ஒட்னோஸ்டோரோனி டெஸ்ட் அனோவா; ####p <0,0001 vs. D0. இதயத் திசுவின் கட்டமைப்பு ஒருமைப்பாட்டை அளவிடுவதற்கான செயற்கை நுண்ணறிவு (வெவ்வேறு பன்றிகளின் ஒவ்வொரு குழுவிலிருந்தும் n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) பிரிவுகள், ஒருவழி ANOVA சோதனை; D0 உடன் ஒப்பிடுகையில் ####p<0.0001; D12 Ctrl உடன் ஒப்பிடுகையில் ****p < 0.0001). c மாசனின் டிரைகுரோம் சாயத்தால் சாயமிடப்பட்ட இதயத் துண்டுகளுக்கான பிரதிநிதித்துவப் படங்கள் (இடது) மற்றும் அளவீடு (வலது) (வெவ்வேறு பன்றிகளிலிருந்து ஒவ்வொரு குழுவிற்கும் n = 10 துண்டுகள், ஒருவழி ANOVA சோதனை செய்யப்பட்டது; D0 உடன் ஒப்பிடும்போது ####p < 0.0001 மற்றும் D12 Ctrl உடன் ஒப்பிடும்போது ***p < 0.001). c மாசனின் டிரைகுரோம் சாயத்தால் சாயமிடப்பட்ட இதயத் துண்டுகளுக்கான பிரதிநிதித்துவப் படங்கள் (இடது) மற்றும் அளவீடு (வலது) (வெவ்வேறு பன்றிகளிலிருந்து ஒவ்வொரு குழுவிற்கும் n = 10 துண்டுகள், ஒருவழி ANOVA சோதனை செய்யப்பட்டது; D0 உடன் ஒப்பிடும்போது #### p < 0.0001 மற்றும் D12 Ctrl உடன் ஒப்பிடும்போது ***p < 0.001). c. krasitelem Массона (மாசிட்டப் без покрытия = 500 எம்.கே.எம்.) (n = 10 ஸ்ரேசோவ்/க்ருப்பு அவுட் ராஸ்னிஷ் ஸ்வினி, வைபோல்னியட்சிய ஒட்னோஸ்டோரஸ் <# செய்தி; 0,0001 по сравнению с D0 и ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c மாசனின் டிரைகுரோம் சாயத்தால் சாயமிடப்பட்ட இதயப் பகுதிகளின் பிரதிநிதித்துவப் படங்கள் (இடது) மற்றும் அளவீடு (வலது) (பூச்சு இல்லாத அளவு = 500 µm) (வெவ்வேறு பன்றிகளிலிருந்து ஒவ்வொரு குழுவிற்கும் n = 10 பகுதிகள், ஒருவழி ANOVA சோதனை செய்யப்பட்டது; D0 உடன் ஒப்பிடும்போது #### p < 0.0001 மற்றும் D12 Ctrl உடன் ஒப்பிடும்போது ***p < 0.001). c 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像（左）和量化（剳）（裸=5 10 个切片/组，每组来自不同的猪，进行单向ANOVA 测试；### p <0.0001 与D0 相比, 10.00相比). C 用 மாஸன் 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 （左 左） 量化 （右裸尺度 = 500 மைமீ 0.0001 与D0 相比,***p <0.001 与D12 Ctrl 相比）。 c. கிரசிடெலம் மசோனா (சிஸ்டயா ஷகல = 500 எம்.கே.எம்) (n = 10 ஸ்ரேசோவ்/க்ருப்பா, ட்ருகோய் ஸ்வினியில் இருந்து கஜிடி, புரோட்டஸ்ட்டிரோவனோ ஸ் போமோஷ்யூவ் ஆக்டோனோஸ் дисперсионного анализа ;### #p <0,0001 по сравнению с D0, ***p <0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c மாசனின் டிரைகுரோம் சாயத்தால் சாயமிடப்பட்ட இதயப் பகுதிகளின் பிரதிநிதித்துவப் படங்கள் (இடது) மற்றும் அளவீடு (வலது) (வெற்று = 500 µm) (n = 10 பகுதிகள்/குழு, ஒவ்வொன்றும் வெவ்வேறு பன்றியிலிருந்து எடுக்கப்பட்டது, ஒருவழி மாறுபாட்டுப் பகுப்பாய்வு மூலம் சோதிக்கப்பட்டது; D0 உடன் ஒப்பிடும்போது # p < 0.0001, D12 Ctrl உடன் ஒப்பிடும்போது ***p < 0.001).பிழைப் பட்டைகள் சராசரி ± திட்ட விலகலைக் குறிக்கின்றன.
வளர்ப்பு ஊடகத்தில் சிறிய மூலக்கூறுகளைச் சேர்ப்பதன் மூலம், CTCM வளர்ப்பின் போது கார்டியோமையோசைட் ஒருமைப்பாட்டை மேம்படுத்தவும், ஃபைப்ரோஸிஸ் வளர்ச்சியை குறைக்கவும் முடியும் என்று நாங்கள் கருதுகோள் செய்தோம். எனவே, குழப்பமான காரணிகளின் எண்ணிக்கை குறைவாக இருந்ததால், எங்களின் நிலையான கட்டுப்பாட்டு வளர்ப்புகளைப் பயன்படுத்தி சிறிய மூலக்கூறுகளை நாங்கள் ஆய்வு செய்தோம். இந்த ஆய்விற்காக டெக்ஸாமெதாசோன் (டெக்ஸ்), ட்ரையோடோதைரோனின் (டி3) மற்றும் SB431542 (SB) ஆகியவை தேர்ந்தெடுக்கப்பட்டன. இந்த சிறிய மூலக்கூறுகள், சார்கோமியர் நீளம், டி-குழாய்கள் மற்றும் கடத்தும் வேகத்தை அதிகரிப்பதன் மூலம் கார்டியோமையோசைட்டுகளின் முதிர்ச்சியைத் தூண்டுவதற்காக, hiPSC-CM வளர்ப்புகளில் முன்பு பயன்படுத்தப்பட்டுள்ளன. கூடுதலாக, டெக்ஸ் (ஒரு குளுக்கோகார்டிகாய்டு) மற்றும் SB ஆகிய இரண்டும் அழற்சியை அடக்குவதாக அறியப்படுகின்றன. எனவே, இந்த சிறிய மூலக்கூறுகளில் ஒன்றை அல்லது இவற்றின் கலவையைச் சேர்ப்பது இதயப் பகுதிகளின் கட்டமைப்பு ஒருமைப்பாட்டை மேம்படுத்துமா என்பதை நாங்கள் சோதித்தோம். ஆரம்பகட்ட பரிசோதனைக்காக, ஒவ்வொரு சேர்மத்தின் அளவும் செல் வளர்ப்பு மாதிரிகளில் பொதுவாகப் பயன்படுத்தப்படும் செறிவுகளின் (1 μM Dex27, 100 nM T327, மற்றும் 2.5 μM SB31) அடிப்படையில் தேர்ந்தெடுக்கப்பட்டது. 12 நாட்கள் வளர்ப்பிற்குப் பிறகு, T3 மற்றும் Dex ஆகியவற்றின் கலவையானது, உகந்த கார்டியோமையோசைட் கட்டமைப்பு ஒருமைப்பாட்டையும் குறைந்தபட்ச ஃபைப்ரஸ் மறுவடிவமைப்பையும் ஏற்படுத்தியது (துணைப் படங்கள் 4 மற்றும் 5). மேலும், T3 மற்றும் Dex ஆகியவற்றின் இந்தச் செறிவுகளை விட இரண்டு மடங்கு அல்லது இருமடங்கு செறிவுகளைப் பயன்படுத்தியபோது, ​​சாதாரண செறிவுகளுடன் ஒப்பிடும்போது தீங்கு விளைவிக்கும் விளைவுகள் ஏற்பட்டன (துணைப் படம் 6a,b).
ஆரம்பகட்ட ஆய்வுக்குப் பிறகு, நாங்கள் 4 வளர்ப்பு நிலைகளை நேருக்கு நேர் ஒப்பிட்டுப் பார்த்தோம் (படம் 4a): கட்டுப்பாடு (Ctrl): நாங்கள் முன்பு விவரித்த நிலையான வளர்ப்பில், எங்களின் மேம்படுத்தப்பட்ட ஊடகத்தைப் பயன்படுத்தி வளர்க்கப்பட்ட இதயத் துண்டுகள்; 20.21 TD: T3 மற்றும் புதன்கிழமை அன்று கட்டுப்பாட்டுடன் டெக்ஸ் சேர்க்கப்பட்டது; MC: CTCM-ல், எங்களின் முன்பு மேம்படுத்தப்பட்ட ஊடகத்தைப் பயன்படுத்தி வளர்க்கப்பட்ட இதயத் துண்டுகள்; மற்றும் MT: CTCM ஊடகத்தில் T3 மற்றும் டெக்ஸ் சேர்க்கப்பட்டது. 12 நாட்கள் வளர்ப்பிற்குப் பிறகு, MS மற்றும் MT திசுக்களின் உயிர்வாழும் தன்மை, MTT மதிப்பீட்டின் மூலம் மதிப்பிடப்பட்ட புதிய திசுக்களைப் போலவே இருந்தது (படம் 4b). சுவாரஸ்யமாக, டிரான்ஸ்வெல் வளர்ப்புகளில் (TD) T3 மற்றும் டெக்ஸ் சேர்ப்பது, கட்டுப்பாட்டு நிலைகளுடன் ஒப்பிடும்போது உயிர்வாழும் தன்மையில் குறிப்பிடத்தக்க முன்னேற்றத்தை ஏற்படுத்தவில்லை. இது இதயத் துண்டுகளின் உயிர்வாழும் தன்மையைப் பராமரிப்பதில் இயந்திரத் தூண்டுதலின் முக்கியப் பங்கைக் குறிக்கிறது.
12 நாட்களுக்கு ஊடகத்தின் மீது இயந்திரத் தூண்டுதல் மற்றும் T3/Dex சேர்ப்பின் விளைவுகளை மதிப்பிடுவதற்குப் பயன்படுத்தப்பட்ட நான்கு வளர்ப்பு நிலைமைகளைச் சித்தரிக்கும் ஒரு சோதனை வடிவமைப்பு வரைபடம். b பட்டை வரைபடம், புதிய இதயத் துண்டுகளுடன் (D0) ஒப்பிடும்போது, ​​அனைத்து 4 வளர்ப்பு நிலைகளிலும் (Ctrl, TD, MC, மற்றும் MT) வளர்ப்பிற்குப் பிறகு 12 நாட்களில் உயிர்வாழும் திறனின் அளவீட்டைக் காட்டுகிறது (வெவ்வேறு பன்றிகளிலிருந்து பெறப்பட்ட ஒவ்வொரு குழுவிற்கும் n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD மற்றும் D12 MT), 12 (D12 MC) துண்டுகள்; ஒருவழி ANOVA சோதனை செய்யப்பட்டது; D0 உடன் ஒப்பிடும்போது ####p < 0.0001, ###p < 0.001 மற்றும் D12 Ctrl உடன் ஒப்பிடும்போது **p < 0.01). b பட்டை வரைபடம், புதிய இதயத் துண்டுகளுடன் (D0) ஒப்பிடும்போது, ​​அனைத்து 4 வளர்ப்பு நிலைகளிலும் (Ctrl, TD, MC, மற்றும் MT) வளர்ப்பிற்குப் பிறகு 12 நாட்களில் உயிர்வாழும் திறனின் அளவீட்டைக் காட்டுகிறது (வெவ்வேறு பன்றிகளிலிருந்து பெறப்பட்ட ஒவ்வொரு குழுவிற்கும் n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD மற்றும் D12 MT), 12 (D12 MC) துண்டுகள்; ஒருவழி ANOVA சோதனை செய்யப்பட்டது; D0 உடன் ஒப்பிடும்போது ####p < 0.0001, ###p < 0.001 மற்றும் D12 ctrl உடன் ஒப்பிடும்போது **p < 0.01). b ஜிஸ்டோகிராம்மா போகாஸிவாட் கோலிசெஸ்ட்வென்னுயூ ஒஷெங்கு ஜிஸ்னெஸ்போசோப்னோஸ்டி செரஸ் 12 நாள் போஸ்லே குல்டிவிங்4 условиях குல்டிவிரோவனியா (கான்ட்ரோல், டிடி, எம்சி மற்றும் எம்டி) ஸ்ராவ்னேனியூ மூலம் ஸ்வீஜிமி ஸ்ரேஜாமி செர்டா (டி0) (என் = 18 (டி12 சிடிடி), 125 (டிஎல்டி), 12 12 (D12 MC) ஸ்ரேசோவ்/கிருப்பு ஆஃப் ராஸ்னிஷ் ஸ்வினி, அனோவா ####p <0,0001, ###p <0,001 по сравнению с D0 и **p <0,01 по сравнению с D12 Ctrl). b இந்தப் பட்டை வரைபடம், புதிய இதயத் துண்டுகளுடன் (D0) ஒப்பிடும்போது, ​​அனைத்து 4 வளர்ப்பு நிலைகளிலும் (கட்டுப்பாடு, TD, MC, மற்றும் MT) வளர்ப்பிற்குப் பிந்தைய 12 நாட்களில் உயிர்வாழும் திறனின் அளவீட்டைக் காட்டுகிறது (வெவ்வேறு பன்றிகளிலிருந்து பெறப்பட்ட ஒவ்வொரு குழுவிற்கும் n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD, மற்றும் D12 MT), 12 (D12 MC) துண்டுகள், ஒருவழி ANOVA சோதனை; ####p < 0.0001, ###p < 0.001 D0 உடன் ஒப்பிடும்போது மற்றும் **p < 0.01 D12 Ctrl உடன் ஒப்பிடும்போது). b. Ctrl、D12 TD 和D12 MT), 来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；####p <0.相比，**p <0.01 与D12控制).b 4 12 (D12 MC) b ஜிஸ்டோகிராம்மா, போகாஸிவாயுஸ் 4 யூஸ்லோவிய குல்டிவிரோவானியா (கோன்ட்ரோல், டிடி, எம்சி மற்றும் எம்டி) மூலம் உருவாக்கம் сердца (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD மற்றும் D12 MT), ராஸ்னிஷ் ஸ்வினி 12 (டி12 எம்சி) ஸ்ரேஸி/க்ருப்பா, ஒட்னோஸ்டோரோனி டெஸ்ட் அனோவா; ####p <0,0001, ###p <0,001 по сравнению с D0, **p <0,01 по сравнению с контролем D12). b. புதிய இதயத் துண்டுகளுடன் (D0) ஒப்பிடும்போது, ​​அனைத்து 4 வளர்ப்பு நிலைகளையும் (கட்டுப்பாடு, TD, MC மற்றும் MT) காட்டும் வரைபடம் (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD மற்றும் D12 MT), வெவ்வேறு பன்றிகளிலிருந்து எடுக்கப்பட்ட 12 (D12 MC) துண்டுகள்/குழு, ஒருவழி ANOVA சோதனை; ####p<0.0001, ###p<0.001 vs. D0, **p<0.01 vs. கட்டுப்பாடு D12). c பட்டை வரைபடம், புதிய இதயத் துண்டுகளுடன் (D0) ஒப்பிடுகையில், வளர்ப்புக்குப் பிந்தைய 12 நாட்களில் அனைத்து 4 வளர்ப்பு நிலைகளிலும் (Ctrl, TD, MC, மற்றும் MT) குளுக்கோஸ் ஓட்டத்தின் அளவீட்டைக் காட்டுகிறது (வெவ்வேறு பன்றிகளிலிருந்து ஒவ்வொரு குழுவிற்கும் n = 6 துண்டுகள், ஒருவழி ANOVA சோதனை செய்யப்பட்டுள்ளது; D0 உடன் ஒப்பிடும்போது ###p < 0.001 மற்றும் D12 Ctrl உடன் ஒப்பிடும்போது ***p < 0.001). c பட்டை வரைபடம், புதிய இதயத் துண்டுகளுடன் (D0) ஒப்பிடுகையில், வளர்ப்புக்குப் பிந்தைய 12 நாட்களில் அனைத்து 4 வளர்ப்பு நிலைகளிலும் (Ctrl, TD, MC, மற்றும் MT) குளுக்கோஸ் ஓட்டத்தின் அளவீட்டைக் காட்டுகிறது (வெவ்வேறு பன்றிகளிலிருந்து ஒவ்வொரு குழுவிற்கும் n = 6 துண்டுகள், ஒருவழி ANOVA சோதனை செய்யப்பட்டுள்ளது; D0 உடன் ஒப்பிடும்போது ###p < 0.001 மற்றும் D12 Ctrl உடன் ஒப்பிடும்போது ***p < 0.001). c கிஸ்டோகிராம்மா போகாஸிவாட் கோலிசெஸ்ட்வென்னுயூ ஒஷெங்கு போடோகா கிளுகோஸி செரஸ் 12 நாள் போஸ்லே குல்டிவிரோவ்4 условиях культивирования (கண்ட்ரோல், டிடி, எம்சி மற்றும் எம்டி) ஸ்வேஜிமி ஸ்ரேஜாமி செர்டிசா (டி0) (n = 6 ஸ்ரேஸோவ்/கிருப்பு, ரஸீன், கிராண்ட்ஸ் மூலம் Выpolnyaetся тест ANOVA <0,001 PO сравнению с D0 и ***p <0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c ஹிஸ்டோகிராம், புதிய இதயத் துண்டுகளுடன் (D0) ஒப்பிடும்போது, ​​வளர்ப்புக்குப் பிந்தைய 12 நாட்களில் அனைத்து 4 வளர்ப்பு நிலைகளிலும் (கட்டுப்பாடு, TD, MC மற்றும் MT) குளுக்கோஸ் ஓட்டத்தின் அளவீட்டைக் காட்டுகிறது (வெவ்வேறு பன்றிகளிலிருந்து ஒவ்வொரு குழுவிற்கும் n = 6 துண்டுகள், ஒருவழி ANOVA சோதனை செய்யப்பட்டது; D0 உடன் ஒப்பிடும்போது ###p < 0.001 மற்றும் D12 Ctrl உடன் ஒப்பிடும்போது ***p < 0.001). c.天的葡萄糖通量定量（n = 6 片/组，来自不同猪，单向执行ANOVA 测试0.001 与D12 Ctrl 相比). C 条形图 显示 所有 4 种 条件 （ctrl 、 td 、 mc 和 mt） 新鲜 心脏 切片 切 示 切 片மேலும் 测试；###p <0.001,与D0 相比，***p <0.001 与D12 Ctrl 相比）。 கேட்ச் கிஸ்டோகிராம்மா, போகாஸிவாயுஸ்யா கோலிசெஸ்ட்வென்னுயு ஓசென்கு போடோகா கிளுகோஸி செரஸ் 12 டிநேவ் போஸ்லே குல்டு4 условий குல்டிவிரோவனியா (கான்ட்ரோல், டிடி, எம்சி மற்றும் எம்டி) ஸ்ராவ்னேனியூ மூலம் ஸ்வேஜிமி ஸ்ரேஜாமி சேர்ட்சா (டி0) (n = 6 வரிசைகள்/கிராம்கள் ஸ்வினி, ஒட்னோஸ்டோரோன்னி பைலி அனோவாவை மேம்படுத்துதல்; ###p <0,001 по сравнению с D0, ***p <0,001 по сравнению с D12 (контроль). c புதிய இதயத் துண்டுகளுடன் (D0) ஒப்பிடும்போது, ​​அனைத்து 4 வளர்ப்பு நிலைகளிலும் (கட்டுப்பாடு, TD, MC, மற்றும் MT) வளர்ப்புக்குப் பிந்தைய 12 நாட்களில் குளுக்கோஸ் ஓட்டத்தின் அளவீட்டைக் காட்டும் வரைபடம் (n = 6 துண்டுகள்/குழு, வெவ்வேறு பன்றிகளிலிருந்து, ஒருபக்க). ANOVA சோதனைகள் செய்யப்பட்டன, D0 உடன் ஒப்பிடும்போது ###p < 0.001, D12 (கட்டுப்பாடு) உடன் ஒப்பிடும்போது ***p < 0.001.d புதிய (நீலம்), 12-ஆம் நாள் MC (பச்சை), மற்றும் 12-ஆம் நாள் MT (சிவப்பு) திசுக்களின் பத்து பிராந்திய திசுப் பிரிவுப் புள்ளிகளில் உள்ள திரிபுப் பகுப்பாய்வு வரைபடங்கள் (n = 4 துண்டுகள்/குழு, ஒருவழி ANOVA சோதனை; குழுக்களுக்கு இடையே குறிப்பிடத்தக்க வேறுபாடு இல்லை). e 10-12 நாட்களுக்கு நிலையான நிலைமைகளின் கீழ் (Ctrl) அல்லது MT நிலைமைகளின் கீழ் (MT) வளர்க்கப்பட்ட இதயப் பிரிவுகளுடன் ஒப்பிடும்போது, ​​புதிய இதயப் பிரிவுகளில் (D0) வேறுபட்ட முறையில் வெளிப்படுத்தப்பட்ட மரபணுக்களைக் காட்டும் எரிமலை வரைபடம். f ஒவ்வொரு வளர்ப்பு நிலைமைகளின் கீழும் வளர்க்கப்பட்ட இதயப் பிரிவுகளுக்கான சார்க்கோமியர் மரபணுக்களின் வெப்ப வரைபடம். பிழைப் பட்டைகள் சராசரி ± திட்ட விலகலைக் குறிக்கின்றன.
கொழுப்பு அமில ஆக்சிஜனேற்றத்திலிருந்து கிளைகோலிசிஸிற்கு மாறும் வளர்சிதை மாற்றச் சார்பு, கார்டியோமையோசைட் வேறுபாடழிதலின் ஒரு முக்கிய அடையாளமாகும். முதிர்ச்சியடையாத கார்டியோமையோசைட்டுகள் முதன்மையாக ATP உற்பத்திக்கு குளுக்கோஸைப் பயன்படுத்துகின்றன மற்றும் குறைவான கிரிஸ்டேக்களைக் கொண்ட ஹைப்போபிளாஸ்டிக் மைட்டோகாண்ட்ரியாவைக் கொண்டுள்ளன5,32. குளுக்கோஸ் பயன்பாட்டுப் பகுப்பாய்வுகள், MC மற்றும் MT நிலைமைகளின் கீழ், குளுக்கோஸ் பயன்பாடு நாள் 0 திசுக்களில் இருந்ததைப் போலவே இருந்தது என்பதைக் காட்டியது (படம் 4c). இருப்பினும், புதிய திசுக்களுடன் ஒப்பிடும்போது Ctrl மாதிரிகள் குளுக்கோஸ் பயன்பாட்டில் குறிப்பிடத்தக்க அதிகரிப்பைக் காட்டின. இது CTCM மற்றும் T3/Dex ஆகியவற்றின் கலவையானது திசுவின் உயிர்வாழ்திறனை மேம்படுத்துகிறது மற்றும் 12-நாள் வளர்க்கப்பட்ட இதயப் பிரிவுகளின் வளர்சிதை மாற்றப் பண்பைப் பாதுகாக்கிறது என்பதைக் குறிக்கிறது. கூடுதலாக, திரிபுப் பகுப்பாய்வு, MT மற்றும் MS நிலைமைகளின் கீழ் 12 நாட்களுக்கு திரிபு நிலைகள் புதிய இதயத் திசுக்களில் இருந்ததைப் போலவே இருந்தன என்பதைக் காட்டியது (படம் 4d).
இதயத் துண்டு திசுவின் உலகளாவிய படியெடுத்தல் நிலப்பரப்பில் CTCM மற்றும் T3/Dex ஆகியவற்றின் ஒட்டுமொத்த தாக்கத்தை பகுப்பாய்வு செய்ய, நான்கு வெவ்வேறு வளர்ப்பு நிலைகளில் இருந்தும் பெறப்பட்ட இதயத் துண்டுகளில் நாங்கள் RNAseq செய்தோம் (துணைத் தரவு 1). சுவாரஸ்யமாக, MT பிரிவுகள் புதிய இதயத் திசுவுடன் அதிக படியெடுத்தல் ஒற்றுமையைக் காட்டின, 13,642 மரபணுக்களில் 16 மட்டுமே வேறுபட்ட வெளிப்பாட்டைக் கொண்டிருந்தன. இருப்பினும், நாங்கள் முன்பு காட்டியது போல, வளர்ப்பில் 10-12 நாட்களுக்குப் பிறகு Ctrl துண்டுகள் 1229 வேறுபட்ட வெளிப்பாட்டு மரபணுக்களைக் காட்டின (படம் 4e). இந்தத் தரவுகள் இதயம் மற்றும் ஃபைப்ரோபிளாஸ்ட் மரபணுக்களின் qRT-PCR மூலம் உறுதிப்படுத்தப்பட்டன (துணைப் படம் 7a-c). சுவாரஸ்யமாக, Ctrl பிரிவுகள் இதய மற்றும் செல் சுழற்சி மரபணுக்களின் குறைவான வெளிப்பாட்டையும், அழற்சி மரபணு திட்டங்களின் செயல்பாட்டையும் காட்டின. நீண்ட கால வளர்ப்பிற்குப் பிறகு சாதாரணமாக நிகழும் வேறுபாடற்ற நிலை, MT நிலைகளில் முற்றிலும் தணிக்கப்படுகிறது என்பதை இந்தத் தரவுகள் தெரிவிக்கின்றன (துணைப் படம் 8a,b). சார்கோமியர் மரபணுக்களைக் கவனமாக ஆய்வு செய்ததில், MT நிலைமைகளின் கீழ் மட்டுமே சார்கோமியர் (படம் 4f) மற்றும் அயன் சேனலை (துணைப் படம் 9) குறியீடு செய்யும் மரபணுக்கள் பாதுகாக்கப்பட்டு, Ctrl, TD மற்றும் MC நிலைமைகளின் கீழ் அவை ஒடுக்கப்படுவதிலிருந்து பாதுகாக்கப்படுகின்றன என்பது தெரியவந்தது. இயந்திரவியல் மற்றும் ஹார்மோன் தூண்டுதல்களின் (T3/Dex) கலவையுடன், இதயத் துண்டின் டிரான்ஸ்கிரிப்டோம், வளர்ப்பில் 12 நாட்களுக்குப் பிறகும் புதிய இதயத் துண்டுகளைப் போலவே இருக்க முடியும் என்பதை இந்தத் தரவுகள் நிரூபிக்கின்றன.
இந்த மரபணுப் படியெடுத்தல் கண்டுபிடிப்புகள், இதயப் பிரிவுகளில் உள்ள கார்டியோமையோசைட்டுகளின் கட்டமைப்பு ஒருமைப்பாடு, 12 நாட்களுக்கு MT நிலைமைகளின் கீழ் சிறப்பாகப் பாதுகாக்கப்படுகிறது என்ற உண்மையால் ஆதரிக்கப்படுகின்றன; இதை சிதைவடையாத மற்றும் குறிப்பிட்ட இடத்தில் உள்ள கனெக்சின் 43 காட்டுகிறது (படம் 5a). மேலும், MT நிலைமைகளின் கீழ் இதயப் பிரிவுகளில் ஏற்பட்ட நார்ப்பெருக்கம், Ctrl உடன் ஒப்பிடும்போது கணிசமாகக் குறைந்து, புதிய இதயப் பிரிவுகளைப் போலவே இருந்தது (படம் 5b). இயந்திரத் தூண்டுதல் மற்றும் T3/Dex சிகிச்சையின் கலவையானது, வளர்ப்பில் உள்ள இதயப் பிரிவுகளில் இதயக் கட்டமைப்பைத் திறம்படப் பாதுகாக்கிறது என்பதை இந்தத் தரவுகள் நிரூபிக்கின்றன.
புதிதாகப் பிரித்தெடுக்கப்பட்ட இதயத் துண்டுகளில் (D0) அல்லது நான்கு இதயத் துண்டு வளர்ப்பு நிலைகளிலும் 12 நாட்கள் வளர்க்கப்பட்டவற்றில், ட்ரோபோனின்-டி (பச்சை), கனெக்சின் 43 (சிவப்பு) மற்றும் DAPI (நீலம்) ஆகியவற்றின் பிரதிநிதித்துவ இம்யூனோஃப்ளூரசன்ஸ் படங்கள் (அளவுகோல் = 100 µm). இதயத் திசுவின் கட்டமைப்பு ஒருமைப்பாட்டின் செயற்கை நுண்ணறிவு அளவீடு (வெவ்வேறு பன்றிகளிடமிருந்து பெறப்பட்ட, ஒவ்வொரு குழுவிற்கும் n = 7 (D0 மற்றும் D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC மற்றும் D12 MT) துண்டுகள்; ஒருவழி ANOVA சோதனை மேற்கொள்ளப்பட்டது; D0 உடன் ஒப்பிடும்போது ####p < 0.0001 மற்றும் D12 Ctrl உடன் ஒப்பிடும்போது *p < 0.05, அல்லது ****p < 0.0001). இதயத் திசுவின் கட்டமைப்பு ஒருமைப்பாட்டின் செயற்கை நுண்ணறிவு அளவீடு (வெவ்வேறு பன்றிகளிடமிருந்து பெறப்பட்ட, ஒவ்வொரு குழுவிற்கும் n = 7 (D0 மற்றும் D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC மற்றும் D12 MT) துண்டுகள்; ஒருவழி ANOVA சோதனை மேற்கொள்ளப்பட்டது; D0 உடன் ஒப்பிடும்போது #### p < 0.0001 மற்றும் D12 Ctrl உடன் ஒப்பிடும்போது *p < 0.05, அல்லது ****p < 0.0001). கோலிசெஸ்ட்வென்னாயா ஓசென்கா ஸ்ட்ரக்டர்னோய் செலோஸ்ட்னோஸ்டி ட்கானி செர்டிசா ஸ் போமோஷ்யு இஸ்குஸ்ட்வென்னோகோ (2000 டி.டி.எல். Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC மற்றும் D12 MT) срезов/группу அனோவாவில் இருந்து, ப்ரோவேடன் ஒட்னோஃபாக்டார்னி டெஸ்ட் அனோவா; #### p <0,0001 по сравнению с D0 и *p < 0,05 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). செயற்கை நுண்ணறிவைப் பயன்படுத்தி இதயத் திசுவின் கட்டமைப்பு ஒருமைப்பாட்டை அளவிடுதல் (வெவ்வேறு பன்றிகளிலிருந்து பெறப்பட்ட ஒவ்வொரு குழுவிலிருந்தும் n = 7 (D0 மற்றும் D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC மற்றும் D12 MT) பிரிவுகள்; ஒருவழி ANOVA சோதனை செய்யப்பட்டது; D0 உடன் ஒப்பிடும்போது #### p < 0.0001 மற்றும் D12 Ctrl உடன் ஒப்பிடும்போது *p < 0.05 அல்லது ****p < 0.0001).对不同猪的心脏组织结构完整性（n = 7（D0 和D12 Ctrl）、5（D12 TD,D12 MC 和D12 எம்டி 0.0001 与D12 Ctrl 相比）。மேலும்人工 智能量 化 进行 单向 单向 单向 测试 ； ########## p <0.0001 与D0 和*p, <0.001 与D0 和*p, <0.0.0 0.0001 与D12 Ctrl 相比).ஒருவழி ANOVA சோதனையின் மூலம், வெவ்வேறு பன்றிகளில் (n = 7 (D0 மற்றும் D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC மற்றும் D12 MT) பிரிவுகள்/குழு) செயற்கை நுண்ணறிவைப் பயன்படுத்தி இதயத் திசுவின் கட்டமைப்பு ஒருமைப்பாட்டின் அளவீடு;#### p <0,0001 по сравнению с D0 и *p < 0,05 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). #### D0 உடன் ஒப்பிடும்போது p < 0.0001 மற்றும் *p < 0.05 அல்லது ****D12 Ctrl உடன் ஒப்பிடும்போது p < 0.0001). b மாசனின் டிரைகுரோம் சாயத்தால் சாயமிடப்பட்ட இதயத் துண்டுகளுக்கான பிரதிநிதித்துவப் படங்கள் மற்றும் அளவீடு (அளவுகோல் = 500 µm) (வெவ்வேறு பன்றிகளிடமிருந்து பெறப்பட்ட ஒவ்வொரு குழுவிற்கும் n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD, மற்றும் D12 MC), 9 (D12 MT) துண்டுகள்; ஒருவழி ANOVA சோதனை செய்யப்படுகிறது; D0 உடன் ஒப்பிடும்போது ####p < 0.0001 மற்றும் D12 Ctrl உடன் ஒப்பிடும்போது ***p < 0.001, அல்லது ****p < 0.0001). b மாசனின் டிரைகுரோம் சாயத்தால் சாயமிடப்பட்ட இதயத் துண்டுகளுக்கான பிரதிநிதித்துவப் படங்கள் மற்றும் அளவீடு (அளவுகோல் = 500 µm) (வெவ்வேறு பன்றிகளிடமிருந்து பெறப்பட்ட ஒவ்வொரு குழுவிற்கும் n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD, மற்றும் D12 MC), 9 (D12 MT) துண்டுகள்; ஒருவழி ANOVA சோதனை செய்யப்படுகிறது; D0 உடன் ஒப்பிடும்போது ####p < 0.0001 மற்றும் D12 Ctrl உடன் ஒப்பிடும்போது ***p < 0.001, அல்லது ****p < 0.0001). b ரெப்ரெசென்டடிவ்ன்ய் இசோபிராஜெனியா மற்றும் கோலிசெஸ்ட்வென்னாயா ஓசென்கா ஸ்ரேசோவ் செர்டிசா, ஒக்ரசென்னிக் ட்ரைக்ரோம்ஸ்னாஸ் (மாஸ்ஷிடாப்னாய லினேக்கா = 500 மிக்மீ) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD மற்றும் D12 MC) ####p < 0,0001 по сравнению с D0 и ***p < 0,001 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). b மாசனின் டிரைகுரோம் சாயத்தால் சாயமிடப்பட்ட இதயப் பகுதிகளின் பிரதிநிதித்துவப் படங்கள் மற்றும் அளவீடு (அளவுகோல் = 500 µm) (வெவ்வேறு பன்றிகளிலிருந்து பெறப்பட்ட ஒவ்வொரு குழுவிலிருந்தும் n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD மற்றும் D12 MC), 9 (D12 MT) பகுதிகள்; ஒருவழி ANOVA செய்யப்பட்டது; D0-க்கு எதிராக ####p < 0.0001 மற்றும் D12 Ctrl-க்கு எதிராக ***p < 0.001 அல்லது ****p < 0.0001). b 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像和量化（比和量化（比例尺= 500m（n =201（n Ctrl.与D0 相比，***p < 0.001,或****p <0.0001 与D12 Ctrl 相比）。 b 用 மாஸன் 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代 表性 和 量化 （比 尺 尺 尺 = 500 µn = 1m 、 d12 ctrl.切片 切片 切片 மேலும்相比,***p <0.001,或****p <0.0001 与D12 Ctrl 相比）。 b ரெப்ரெசென்டடிவ்னி இசோபிராஜெனியா மற்றும் கோலிசெஸ்ட்வென்னயா ஓசென்கா ஸ்ரேசோவ் செர்ட்சா, ஆக்ரசென்னிஹ் ட்ரைக்ரோமோஸ்ம் линейка = 500 எம்கேஎம்) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD, D12 MC), 9 (D12 MT) ####p <0,0001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). b மாசனின் டிரைகுரோம் கொண்டு சாயமேற்றப்பட்ட இதயப் பகுதிகளின் பிரதிநிதித்துவப் படங்கள் மற்றும் அளவீடு (அளவுகோல் = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD மற்றும் D12 MC), ஒவ்வொரு குழுவிலிருந்தும் வெவ்வேறு பன்றிகளின் 9 (D12 MT) பகுதிகள், ஒரு ANOVA முறை; D0 உடன் ஒப்பிடும்போது ####p < 0.0001, D12 Ctrl உடன் ஒப்பிடும்போது ***p < 0.001 அல்லது ****p < 0.0001).பிழைப் பட்டைகள் சராசரி ± திட்ட விலகலைக் குறிக்கின்றன.
இறுதியாக, இதயத் திசுவின் நீட்சியை அதிகரிப்பதன் மூலம், இதய மிகைவளர்ச்சியைப் பிரதிபலிக்கும் CTCM-இன் திறன் மதிப்பிடப்பட்டது. CTCM-இல், உச்சபட்ச காற்று அறை அழுத்தம் 80 mmHg-இலிருந்து 80 mmHg Art. (இயல்பான நீட்சி) வரை அதிகரித்து 140 mmHg Art. ஆனது (படம் 6a). இது நீட்சியில் 32% அதிகரிப்புக்கு ஒத்திருக்கிறது (படம் 6b). இது முன்னர், மிகைவளர்ச்சியில் காணப்படும் சார்க்கோமியர் நீளத்தைப் போன்ற நீளத்தை இதயப் பகுதிகள் அடைவதற்குத் தேவையான நீட்சியின் சதவீத அளவாக காட்டப்பட்டது. சுருக்கம் மற்றும் தளர்வின் போது இதயத் திசுவின் நீட்சியும் வேகமும் ஆறு நாட்கள் வளர்ப்பின் போது நிலையானதாக இருந்தன (படம் 6c). MT நிலைமைகளிலிருந்து பெறப்பட்ட இதயத் திசு, ஆறு நாட்களுக்கு இயல்பான நீட்சி (MT (இயல்பான)) அல்லது மிகைநீட்சி நிலைமைகளுக்கு (MT (OS)) உட்படுத்தப்பட்டது. வளர்ப்பில் நான்கு நாட்களுக்குப் பிறகே, MT (இயல்பான) நிலைமைகளுடன் ஒப்பிடும்போது MT (OS) நிலைமைகளின் கீழ் ஊடகத்தில் மிகைவளர்ச்சி உயிரிக்குறியீடான NT-ProBNP குறிப்பிடத்தக்க அளவில் உயர்ந்திருந்தது (படம் 7a). மேலும், ஆறு நாட்கள் வளர்ப்பிற்குப் பிறகு, MT (OS) (படம் 7b)-இல் உள்ள செல்களின் அளவு, MT இதயத்தின் (இயல்பான) பிரிவுகளுடன் ஒப்பிடும்போது குறிப்பிடத்தக்க அளவில் அதிகரித்தது. கூடுதலாக, அதிகப்படியாக நீட்டப்பட்ட திசுக்களில் NFATC4 உட்கரு இடமாற்றம் குறிப்பிடத்தக்க அளவில் அதிகரித்தது (படம் 7c). இந்த முடிவுகள், அதிகப்படியான விரிவடைதலுக்குப் பிறகு நோயியல் மறுவடிவமைப்பின் படிப்படியான வளர்ச்சியைக் காட்டுகின்றன, மேலும் நீட்சியால் தூண்டப்பட்ட இதய மிகைவளர்ச்சி சமிக்ஞையை ஆய்வு செய்வதற்கான ஒரு தளமாக CTCM கருவியைப் பயன்படுத்தலாம் என்ற கருத்தை ஆதரிக்கின்றன.
காற்று அறை அழுத்தம், திரவ அறை அழுத்தம் மற்றும் திசு இயக்க அளவீடுகளின் பிரதிநிதித்துவத் தடங்கள், அறை அழுத்தம் திரவ அறை அழுத்தத்தை மாற்றுவதை உறுதிப்படுத்துகின்றன, இது திசுத் துண்டின் அதற்கேற்ற இயக்கத்தை ஏற்படுத்துகிறது. b சாதாரணமாக நீட்டப்பட்ட (ஆரஞ்சு) மற்றும் மிகையாக நீட்டப்பட்ட (நீலம்) திசுப் பிரிவுகளுக்கான பிரதிநிதித்துவ நீட்சி சதவீதம் மற்றும் நீட்சி விகித வளைவுகள். c சுழற்சி நேரம் (வெவ்வேறு பன்றிகளிலிருந்து, ஒரு குழுவிற்கு n = 19 துண்டுகள்), சுருங்கும் நேரம் (வெவ்வேறு பன்றிகளிலிருந்து, ஒரு குழுவிற்கு n = 18-19 துண்டுகள்), தளர்வு நேரம் (வெவ்வேறு பன்றிகளிலிருந்து, ஒரு குழுவிற்கு n = 19 துண்டுகள்), திசு இயக்கத்தின் வீச்சு (வெவ்வேறு பன்றிகளிலிருந்து, ஒரு குழுவிற்கு n = 14 துண்டுகள்), உச்ச சிஸ்டாலிக் வேகம் (வெவ்வேறு பன்றிகளிலிருந்து, ஒரு குழுவிற்கு n = 14 துண்டுகள்) மற்றும் உச்ச தளர்வு விகிதம் (வெவ்வேறு பன்றிகளிலிருந்து, ஒரு குழுவிற்கு n = 14 (D0), 15 (D6) பிரிவுகள்) ஆகியவற்றைக் காட்டும் பட்டை வரைபடம். இருமுனை ஸ்டூடண்ட்ஸ் t-சோதனை எந்த அளவுருவிலும் குறிப்பிடத்தக்க வேறுபாடு இல்லை என்பதைக் காட்டியது, இது அதிக மின்னழுத்தத்துடன் 6 நாட்கள் வளர்ப்பின் போது இந்த அளவுருக்கள் நிலையானதாக இருந்தன என்பதைக் குறிக்கிறது. பிழைப் பட்டைகள் சராசரி ± திட்ட விலகலைக் குறிக்கின்றன.
MT இயல்பான நீட்சி (Norm) அல்லது அதீத நீட்சி (OS) நிலைகளின் கீழ் வளர்க்கப்பட்ட இதயத் துண்டுகளிலிருந்து பெறப்பட்ட வளர்ப்பு ஊடகத்தில் உள்ள NT-ProBNP செறிவின் பட்டை வரைபட அளவீடு (வெவ்வேறு பன்றிகளிலிருந்து பெறப்பட்ட ஒவ்வொரு குழுவிற்கும் n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, மற்றும் D4 MTOS) துண்டுகள், இருவழி ANOVA மேற்கொள்ளப்பட்டது; **இயல்பான நீட்சியுடன் ஒப்பிடும்போது p < 0.01). MT இயல்பான நீட்சி (Norm) அல்லது அதீத நீட்சி (OS) நிலைகளின் கீழ் வளர்க்கப்பட்ட இதயத் துண்டுகளிலிருந்து பெறப்பட்ட வளர்ப்பு ஊடகத்தில் உள்ள NT-ProBNP செறிவின் பட்டை வரைபட அளவீடு (வெவ்வேறு பன்றிகளிலிருந்து பெறப்பட்ட ஒவ்வொரு குழுவிற்கும் n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, மற்றும் D4 MTOS) துண்டுகள், இருவழி ANOVA மேற்கொள்ளப்பட்டது; **இயல்பான நீட்சியுடன் ஒப்பிடும்போது p < 0.01).சாதாரண MT நீட்சி (norm) அல்லது அதீத நீட்சி (OS) நிலைமைகளின் கீழ் வளர்க்கப்பட்ட இதயத் துண்டுகளிலிருந்து பெறப்பட்ட வளர்ப்பு ஊடகத்தில் உள்ள NT-ProBNP செறிவின் அளவுசார் வரைபடம் (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, மற்றும் D4).MTOS) வெவ்வேறு பன்றிகளிலிருந்து பெறப்பட்ட ஒவ்வொரு குழுவிற்கும்; இதற்காக இரு காரணி மாறுபாட்டுப் பகுப்பாய்வு (two-factor analysis of variance) செய்யப்படுகிறது.**p <0,01 по сравнению с нормальным растяжением). (சாதாரண நீட்சியுடன் ஒப்பிடும்போது p < 0.01). எ浓度的条形图量化（n = 4 (D2 MTNorm)、3（D2 MTOS,D4 MTNorm 和D4 MTOS）来自不同猪的切片/组，进行双向方差分析；**与正常拉伸相比,p <0.01） MT நார்மல் ஸ்ட்ரெச் (Norm) அல்லது overstretch (OS) நிலைகளில் (n= 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm和D4 MTOS) ஆகியவற்றின் கீழ் வளர்க்கப்பட்ட இதயத் துண்டுகளில் NT-ProBNP செறிவின் அளவு猪的切片/组，可以双向方方发发动, சாதாரண நீட்சியுடன் ஒப்பிடும்போது, ​​ப <0.01).வெவ்வேறு பன்றிகளிடமிருந்து பெறப்பட்ட, இயல்பான MT நீட்சி (norm) அல்லது அதீத நீட்சி (OS) நிலைகளின் கீழ் வளர்க்கப்பட்ட இதயத் துண்டுகளில் உள்ள NT-ProBNP செறிவுகளின் ஹிஸ்டோகிராம் அளவீடு (ஒரு குழுவிற்கு n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm) மற்றும் D4 MTOS) மற்றும் இருவழி மாறுபாட்டுப் பகுப்பாய்வு;**p <0,01 по сравнению с нормальным растяжением). (சாதாரண நீட்சியுடன் ஒப்பிடும்போது p < 0.01). b ட்ரோபோனின்-T மற்றும் WGA கொண்டு சாயமேற்றப்பட்ட இதயத் துண்டுகளுக்கான பிரதிநிதித்துவப் படங்கள் (இடதுபுறம்) மற்றும் செல் அளவு அளவீடு (வலதுபுறம்) (வெவ்வேறு பன்றிகளிலிருந்து எடுக்கப்பட்ட 10 வெவ்வேறு துண்டுகளிலிருந்து, ஒரு குழுவிற்கு n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) செல்கள்; இருமுனை ஸ்டூடண்ட் t-சோதனை செய்யப்பட்டுள்ளது; சாதாரண நீட்சியுடன் ஒப்பிடும்போது ****p < 0.0001). b ட்ரோபோனின்-T மற்றும் WGA கொண்டு சாயமேற்றப்பட்ட இதயத் துண்டுகளுக்கான பிரதிநிதித்துவப் படங்கள் (இடதுபுறம்) மற்றும் செல் அளவு அளவீடு (வலதுபுறம்) (வெவ்வேறு பன்றிகளிலிருந்து எடுக்கப்பட்ட 10 வெவ்வேறு துண்டுகளிலிருந்து, ஒரு குழுவிற்கு n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) செல்கள்; இருமுனை ஸ்டூடண்ட் t-சோதனை செய்யப்பட்டுள்ளது; சாதாரண நீட்சியுடன் ஒப்பிடும்போது ****p < 0.0001). b ரெப்ரெசென்டடிவ்னி இஸோப்ராஜெனியா ஸ்ரேசோவ் செர்டா, ஒக்ரசென்னிக் ட்ரோபோனிம்-டி மற்றும் அன்ஜிட் (ஸ்லேவா) மற்றும் கோஸ்டோல் ஆப்ரேடெலினிய ராஸ்மேரா கிளெடோக் (பிரதி) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) க்ளெடோக்/குருப்பு அல்லது 10 ராசனிஸ் ஸ்ரேசோவிலிருந்து ராஜ்ஜிய சுவாசம், தேதி-பிரதிமுறை t-критерий Стьюдента ****p <0,0001 по; ஸ்ராவ்னேனியூஸ் நார்மல்னிம் ரஸ்த்யஜெனிம்). b ட்ரோபோனின்-T மற்றும் AZP கொண்டு சாயமேற்றப்பட்ட இதயப் பிரிவுகளின் பிரதிநிதித்துவப் படங்கள் (இடதுபுறம்) மற்றும் செல் அளவு அளவீடு (வலதுபுறம்) (வெவ்வேறு பன்றிகளிலிருந்து எடுக்கப்பட்ட 10 வெவ்வேறு பிரிவுகளிலிருந்து, ஒரு குழுவிற்கு n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) செல்கள்; இருமுனை ஸ்டூடண்ட்ஸ் t-சோதனை செய்யப்பட்டது; சாதாரண இனத்துடன் ஒப்பிடும்போது ****p < 0.0001). ப MTOS, 来自不同猪的10 个不同切片的369（D6 MTNorm）细胞/组,两进行有尾学生t 检验；与正常拉伸相比,****p <0.0001）。 b கால்கேரின்-டி மற்றும் WGA கொண்டு சாயமேற்றப்பட்ட இதயத் துண்டுகளின் பிரதிநிதித்துவப் படங்கள் (இடதுபுறம்) மற்றும் செல் அளவு (வலதுபுறம்) (n = 330 (D6 MTOS), 10 வெவ்வேறு துண்டுகளிலிருந்து 369 (D6 MTNorm)) செல்கள்/குழு, இரண்டு முறைகளிலும் செல் அளவு உள்ளது t சோதனை; சாதாரண நீட்சியுடன் ஒப்பிடும்போது, ​​****p < 0.0001). b ரெப்ரெசென்டடிவ்னி இஸோப்ராஜெனிய ஸ்ரேசோவ் செர்டிசா, ஒக்ரசென்னிக் ட்ரோபோனிம்-டி மற்றும் அன்காட் (ஸ்லேவா) மற்றும் கோஸ்டோல் ராஸ்மேரா கிளெடோக் (ஸ்ப்ரவா) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) из 10 ரஸ்லிச் ஸ்ரேஸோவ் ஆஃப் ரஸ்னிக் ஸ்வினி கிளெட்கி/க்ருப்பா, டியூஸ்டரோனி க்ரைட்; ****p <0,0001 по сравнению с нормальным растяжением). b ட்ரோபோனின்-T மற்றும் AZP கொண்டு சாயமேற்றப்பட்ட இதயப் பிரிவுகளின் பிரதிநிதித்துவப் படங்கள் (இடதுபுறம்) மற்றும் செல் அளவின் அளவுமதிப்பீடு (வலதுபுறம்) (வெவ்வேறு பன்றிகளிலிருந்து எடுக்கப்பட்ட 10 வெவ்வேறு பிரிவுகளிலிருந்து n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) செல்கள்/குழு, இருமுனை அளவுகோல் ஸ்டூடண்ட்ஸ் t; ****சாதாரண இனத்துடன் ஒப்பிடும்போது p < 0.0001). c ட்ரோபோனின்-T மற்றும் NFATC4-க்காக இம்யூனோலேபிள் செய்யப்பட்ட நாள் 0 மற்றும் நாள் 6 MTOS இதயத் துண்டுகளுக்கான பிரதிநிதித்துவப் படங்கள் மற்றும் CM-களின் உட்கருக்களுக்கு NFATC4-இன் இடமாற்றத்தின் அளவு நிர்ணயம் (வெவ்வேறு பன்றிகளிலிருந்து பெறப்பட்ட ஒவ்வொரு குழுவிற்கும் n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) துண்டுகள், இருமுனை ஸ்டூடண்ட் t-சோதனை செய்யப்பட்டது; *p < 0.05). c ட்ரோபோனின்-T மற்றும் NFATC4-க்காக இம்யூனோலேபிள் செய்யப்பட்ட நாள் 0 மற்றும் நாள் 6 MTOS இதயத் துண்டுகளுக்கான பிரதிநிதித்துவப் படங்கள் மற்றும் CM-களின் உட்கருக்களுக்கு NFATC4-இன் இடமாற்றத்தின் அளவு நிர்ணயம் (வெவ்வேறு பன்றிகளிலிருந்து பெறப்பட்ட ஒவ்வொரு குழுவிற்கும் n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) துண்டுகள், இருமுனை ஸ்டூடண்ட் t-சோதனை செய்யப்பட்டது; *p < 0.05). c ரெப்ரெசென்டடிவ்னி இசோபிராஜெனியா ஸ்ரேசோவ் செர்டிசா 0 மற்றும் 6 நாள் MTOS, இம்முனோமெசென்டிவ் டிலையா ட்ரோபோனினா-டிசிடி, கோலிசெஸ்ட்வென்னாயா ஒசென்கா டிரான்ஸ்லோகாசிஸ் NFATC4 வ யத்ரா காவெர்னோசிக் கிளெடோக் (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) ஸ்ரேஸோவ்/க்ருப்பு அவுட் ராஸ்னிஷ் ஸ்வினி , வைபோன்சியட் டுவூட் Стьюдента; ப <0,05). c. MTOS-இன் 0 மற்றும் 6 நாட்களில் உள்ள இதயப் பகுதிகளுக்கான பிரதிநிதித்துவப் படங்கள், ட்ரோபோனின்-T மற்றும் NFATC4-க்காக இம்யூனோலேபிள் செய்யப்பட்டு, குகைச் செல்களின் உட்கருவில் NFATC4 இடமாற்றத்தின் அளவு நிர்ணயம் செய்யப்பட்டது (வெவ்வேறு பன்றிகளிலிருந்து எடுக்கப்பட்ட ஒவ்வொரு குழுவிற்கும் n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) துண்டுகள்). இருமுனை ஸ்டூடண்ட்ஸ் t-சோதனை செய்யப்பட்டது; *p < 0.05). c 用于肌钙蛋白-T 和NFATC4心脏切片的代表性图像，以及来自不同猪的NFATC4 易位至CM 细胞核的量化切片/组, 进行双尾学生t 检验；*p <0.05)。 c calcanin-T மற்றும் NFATC4 இம்யூனோலேபிளிங் 第0天和第6天MTOS இதயத் துண்டுகள் மற்றும் NFATC4 ஆகியவற்றின் வெவ்வேறு NFATC4 易位至CM செல் நியூக்ளியஸ் 的quantity化 (n = 4 (D0TO)) ஆகியவற்றின் பிரதிநிதி படங்கள்切礼/组, 时间双尾学生et 电影；*p <0.05). கேட்ச் 0 மற்றும் 6 தேதிகளில் இம்முனோமார்கிரோவ்கி டிராபோனிம்-4. கோலிசெஸ்ட்வென்னாயா ஒசென்கா டிரான்ஸ்லோகாசிகள் NFATC4 ல் யத்ரா சிஎம் முதல் ரஸ்னிஷ் ஸ்வினி (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) ஸ்ரேஸ்/க்ருப்பா, dva- хвостатый t-kript; 0,05). c வெவ்வேறு பன்றிகளின் CM உட்கருவில் ட்ரோபோனின்-T மற்றும் NFATC4 இம்யூனோலேபிளிங் மற்றும் NFATC4 இடமாற்றத்தின் அளவீட்டிற்காக, 0 மற்றும் 6 ஆம் நாட்களில் எடுக்கப்பட்ட MTOS இதயத் துண்டுகளின் பிரதிநிதித்துவப் படங்கள் (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) துண்டுகள்/குழு, இருமுனை t-அளவுகோல் ஸ்டூடண்ட்ஸ்; *p < 0.05).பிழைப் பட்டைகள் சராசரி ± திட்ட விலகலைக் குறிக்கின்றன.
மொழிபெயர்ப்பு இருதயவியல் ஆராய்ச்சிக்கு, இதயச் சூழலைத் துல்லியமாக மீண்டும் உருவாக்கும் உயிரணு மாதிரிகள் தேவைப்படுகின்றன. இந்த ஆய்வில், இதயத்தின் மிக மெல்லிய பகுதிகளைத் தூண்டக்கூடிய ஒரு CTCM சாதனம் உருவாக்கப்பட்டு, அதன் பண்புகள் ஆராயப்பட்டன. இந்த CTCM அமைப்பில், உடலியல் ரீதியாக ஒத்திசைக்கப்பட்ட மின்னியந்திரத் தூண்டுதல் மற்றும் T3, Dex திரவச் செறிவூட்டல் ஆகியவை அடங்கும். பன்றியின் இதயப் பகுதிகள் இந்தக் காரணிகளுக்கு உட்படுத்தப்பட்டபோது, ​​12 நாட்கள் வளர்ப்பிற்குப் பிறகும் அவற்றின் உயிர்வாழும் தன்மை, கட்டமைப்பு ஒருமைப்பாடு, வளர்சிதை மாற்றச் செயல்பாடு மற்றும் படியெடுத்தல் வெளிப்பாடு ஆகியவை புதிய இதயத் திசுக்களில் இருந்ததைப் போலவே இருந்தன. மேலும், இதயத் திசுக்களை அதிகப்படியாக நீட்டுவது, மிகை நீட்சியால் ஏற்படும் இதயத்தின் மிகை வளர்ச்சியை ஏற்படுத்தக்கூடும். ஒட்டுமொத்தமாக, இந்த முடிவுகள் ஒரு இயல்பான இதயப் பண்பைப் பராமரிப்பதில் உடலியல் வளர்ப்புச் சூழல்களின் முக்கியப் பங்கை ஆதரிக்கின்றன, மேலும் மருந்துச் சோதனைகளுக்கு ஒரு தளத்தையும் வழங்குகின்றன.
கார்டியோமையோசைட்டுகளின் செயல்பாடு மற்றும் உயிர்வாழ்விற்கான உகந்த சூழலை உருவாக்குவதற்குப் பல காரணிகள் பங்களிக்கின்றன. இந்தக் காரணிகளில் மிகவும் வெளிப்படையானவை (1) செல்களுக்கு இடையேயான தொடர்புகள், (2) மின்னியந்திரத் தூண்டுதல், (3) ஹார்மோன் காரணிகள் மற்றும் (4) வளர்சிதை மாற்ற மூலப்பொருட்கள் ஆகியவற்றுடன் தொடர்புடையவை. உடலியல் ரீதியான செல்களுக்கு இடையேயான தொடர்புகளுக்கு, ஒரு புற-செல் மேட்ரிக்ஸால் ஆதரிக்கப்படும் பல செல் வகைகளின் சிக்கலான முப்பரிமாண வலைப்பின்னல்கள் தேவைப்படுகின்றன. இத்தகைய சிக்கலான செல் தொடர்புகளை, தனிப்பட்ட செல் வகைகளை இணை-வளர்ப்பு செய்வதன் மூலம் ஆய்வகத்தில் மீண்டும் உருவாக்குவது கடினம், ஆனால் இதயப் பகுதிகளின் உறுப்பு சார்ந்த தன்மையைப் பயன்படுத்தி இதை எளிதாக அடைய முடியும்.
கார்டியோமையோசைட்டுகளின் இயந்திர நீட்சி மற்றும் மின் தூண்டுதல் ஆகியவை இதயத்தின் புறத்தோற்றத்தைப் பராமரிப்பதற்கு முக்கியமானவை33,34,35. இயந்திரத் தூண்டுதல் hiPSC-CM சீரமைப்பு மற்றும் முதிர்ச்சிக்கு பரவலாகப் பயன்படுத்தப்பட்டாலும், சமீபத்தில் பல நேர்த்தியான ஆய்வுகள், வளர்ப்பில் உள்ள இதயத் துண்டுகளுக்கு ஒரு-அச்சு சுமையேற்றத்தைப் பயன்படுத்தி இயந்திரத் தூண்டுதலை அளிக்க முயன்றுள்ளன. இந்த ஆய்வுகள், வளர்ப்பின் போது 2D ஒரு-அச்சு இயந்திர சுமையேற்றம் இதயத்தின் புறத்தோற்றத்தில் ஒரு நேர்மறையான விளைவைக் கொண்டிருப்பதைக் காட்டுகின்றன. இந்த ஆய்வுகளில், இதயத்தின் பகுதிகள் சமஅளவு இழுவிசை விசைகள்17, நேரியல் ஆக்ஸோடோனிக் சுமையேற்றம்18 ஆகியவற்றால் ஏற்றப்பட்டன, அல்லது விசை மாற்றி பின்னூட்டம் மற்றும் இழுவிசை இயக்கிகளைப் பயன்படுத்தி இதயச் சுழற்சி மீண்டும் உருவாக்கப்பட்டது. இருப்பினும், இந்த முறைகள் சுற்றுச்சூழல் உகப்பாக்கம் இல்லாமல் ஒரு-அச்சு திசு நீட்சியைப் பயன்படுத்துகின்றன, இதன் விளைவாக பல இதய மரபணுக்கள் அடக்கப்படுகின்றன அல்லது அசாதாரண நீட்சி பதில்களுடன் தொடர்புடைய மரபணுக்கள் மிகையாக வெளிப்படுத்தப்படுகின்றன. இங்கு விவரிக்கப்பட்டுள்ள CTCM, சுழற்சி நேரம் மற்றும் உடலியல் நீட்சி (25% நீட்சி, 40% சிஸ்டோல், 60% டயஸ்டோல் மற்றும் நிமிடத்திற்கு 72 துடிப்புகள்) ஆகியவற்றின் அடிப்படையில் இயற்கையான இதயச் சுழற்சியைப் பிரதிபலிக்கும் ஒரு 3D மின்-இயந்திரத் தூண்டுதலை வழங்குகிறது. இந்த முப்பரிமாண இயந்திரத் தூண்டுதல் மட்டும் திசுவின் ஒருமைப்பாட்டைப் பராமரிக்கப் போதுமானதாக இல்லை என்றாலும், திசுவின் உயிர்வாழ்தல், செயல்பாடு மற்றும் ஒருமைப்பாட்டைப் போதுமான அளவு பராமரிக்க, T3/Dex-ஐப் பயன்படுத்தி மேற்கொள்ளப்படும் திரவ மற்றும் இயந்திரத் தூண்டுதல்களின் கலவை தேவைப்படுகிறது.
முதிர்ந்த இதயத்தின் புறத்தோற்றத்தை நெறிப்படுத்துவதில் திரவக் காரணிகள் ஒரு முக்கியப் பங்கு வகிக்கின்றன. செல் முதிர்ச்சியை விரைவுபடுத்துவதற்காக வளர்ப்பு ஊடகத்தில் T3 மற்றும் Dex சேர்க்கப்பட்ட HiPS-CM ஆய்வுகளில் இது எடுத்துக்காட்டப்பட்டது. T3, செல் சவ்வுகள் வழியாக அமினோ அமிலங்கள், சர்க்கரைகள் மற்றும் கால்சியம் ஆகியவற்றின் போக்குவரத்தைப் பாதிக்கக்கூடும்³⁶. கூடுதலாக, T3, MHC-α வெளிப்பாட்டையும் MHC-β குறைப்பையும் ஊக்குவிக்கிறது. இது, கரு CM-இல் உள்ள மெதுவாகச் சுருங்கும் தசைநாண்களுடன் ஒப்பிடும்போது, ​​முதிர்ந்த இதயத்தசை செல்களில் வேகமாகச் சுருங்கும் தசைநாண்கள் உருவாவதை ஊக்குவிக்கிறது. தைராய்டு சுரப்புக் குறைபாடு உள்ள நோயாளிகளிடம் ஏற்படும் T3 குறைபாடு, தசைநாண் பட்டைகளின் இழப்புக்கும் மற்றும் தசை இறுக்கம் உருவாகும் விகிதம் குறைவதற்கும் வழிவகுக்கிறது³⁷. Dex, குளுக்கோகார்டிகாய்டு ஏற்பிகளில் செயல்படுகிறது மற்றும் தனிமைப்படுத்தப்பட்ட, திரவம் செலுத்தப்பட்ட இதயங்களில் இதயத்தசை சுருங்கும் தன்மையை அதிகரிப்பதாகக் காட்டப்பட்டுள்ளது;³⁸ இந்த முன்னேற்றம், கால்சியம் படிவுகளால் இயக்கப்படும் நுழைவின் (SOCE) மீதான விளைவுடன் தொடர்புடையதாகக் கருதப்படுகிறது³⁹,⁴⁰. கூடுதலாக, Dex அதன் ஏற்பிகளுடன் பிணைந்து, நோயெதிர்ப்புச் செயல்பாடு மற்றும் அழற்சியை அடக்கும் ஒரு பரந்த செல் உள் எதிர்வினையை ஏற்படுத்துகிறது³⁰.
எங்கள் முடிவுகள், கட்டுப்பாட்டுக் குழுவுடன் (Ctrl) ஒப்பிடும்போது, ​​இயற்பியல் இயந்திரத் தூண்டுதல் (MS) ஒட்டுமொத்த வளர்ப்புச் செயல்திறனை மேம்படுத்தியது, ஆனால் வளர்ப்பில் 12 நாட்களுக்கு உயிர்வாழ்திறன், கட்டமைப்பு ஒருமைப்பாடு மற்றும் இதய வெளிப்பாட்டைப் பராமரிக்கத் தவறியது என்பதைக் காட்டுகின்றன. கட்டுப்பாட்டுக் குழுவுடன் ஒப்பிடும்போது, ​​CTCM (MT) வளர்ப்புகளில் T3 மற்றும் Dex-ஐச் சேர்ப்பது உயிர்வாழ்திறனை மேம்படுத்தியது மற்றும் புதிய இதயத் திசுவுடன் 12 நாட்களுக்கு ஒத்த படியெடுத்தல் சுயவிவரங்கள், கட்டமைப்பு ஒருமைப்பாடு மற்றும் வளர்சிதை மாற்றச் செயல்பாட்டைப் பராமரித்தது. கூடுதலாக, திசு நீட்சியின் அளவைக் கட்டுப்படுத்துவதன் மூலம், STCM-ஐப் பயன்படுத்தி ஒரு மிகைநீட்சியால் தூண்டப்பட்ட இதய மிகைவளர்ச்சி மாதிரி உருவாக்கப்பட்டது, இது STCM அமைப்பின் பன்முகத்தன்மையை விளக்குகிறது. இதய மறுவடிவமைப்பு மற்றும் நார்ப்பெருக்கம் பொதுவாகச் சிதைவுறாத உறுப்புகளை உள்ளடக்கியிருந்தாலும், அவற்றின் சுழற்சி செல்கள் பொருத்தமான சைட்டோகைன்கள், விழுங்குதல் மற்றும் பிற மறுவடிவமைப்புக் காரணிகளை வழங்க முடியும் என்றாலும், இதயத்தின் பகுதிகள் மன அழுத்தம் மற்றும் அதிர்ச்சிக்கு பதிலளிக்கும் விதமாக நார்ப்பெருக்கச் செயல்முறையைப் பிரதிபலிக்க முடியும் என்பது குறிப்பிடத்தக்கது. இது முன்னர் இந்த இதயத் துண்டு மாதிரியில் மதிப்பிடப்பட்டுள்ளது. டாக்கிகார்டியா, பிராடிகார்டியா மற்றும் இயந்திர சுற்றோட்ட ஆதரவு (இயந்திர சுமையற்ற இதயம்) போன்ற பல நிலைகளை உருவகப்படுத்த, அழுத்தம்/மின் வீச்சு மற்றும் அதிர்வெண்ணை மாற்றுவதன் மூலம் CTCM அளவுருக்களை மாற்றி அமைக்க முடியும் என்பது குறிப்பிடத்தக்கது. இது இந்த அமைப்பை மருந்து சோதனைக்கு ஒரு நடுத்தர செயல்திறன் கொண்டதாக ஆக்குகிறது. அதிகப்படியான உழைப்பினால் தூண்டப்படும் இதய மிகை வளர்ச்சியை மாதிரியாகக் காட்டும் CTCM-இன் திறன், தனிப்பயனாக்கப்பட்ட சிகிச்சைக்காக இந்த அமைப்பைச் சோதிப்பதற்கு வழிவகுக்கிறது. முடிவாக, இதயத் திசுப் பிரிவுகளின் வளர்ப்பைப் பராமரிப்பதற்கு இயந்திர நீட்சியும் ஹார்மோன் தூண்டுதலும் முக்கியமானவை என்பதை இந்த ஆய்வு நிரூபிக்கிறது.
இங்கு வழங்கப்பட்ட தரவுகள், முழுமையான இதயத் தசையை மாதிரியாக்குவதற்கு CTCM ஒரு மிகவும் நம்பிக்கைக்குரிய தளம் என்று குறிப்பிட்டாலும், இந்த வளர்ப்பு முறையில் சில வரம்புகள் உள்ளன. CTCM வளர்ப்பின் முக்கிய வரம்பு என்னவென்றால், அது இதயத் துண்டுகளின் மீது தொடர்ச்சியான இயக்க இயந்திர அழுத்தங்களைச் செலுத்துகிறது, இது ஒவ்வொரு சுழற்சியின் போதும் இதயத் துண்டுகளின் சுருக்கங்களைச் சுறுசுறுப்பாகக் கண்காணிக்கும் திறனைத் தடுக்கிறது. மேலும், இதயப் பிரிவுகளின் சிறிய அளவு (7 மிமீ) காரணமாக, வளர்ப்பு அமைப்புகளுக்கு வெளியே பாரம்பரிய விசை உணரிகளைப் பயன்படுத்தி சிஸ்டாலிக் செயல்பாட்டை மதிப்பிடும் திறன் குறைவாக உள்ளது. தற்போதைய ஆய்வுக் கட்டுரையில், சுருங்கும் செயல்பாட்டின் ஒரு குறிகாட்டியாக ஒளியியல் மின்னழுத்தத்தை மதிப்பிடுவதன் மூலம் இந்த வரம்பை நாங்கள் ஓரளவு சமாளிக்கிறோம். இருப்பினும், இந்த வரம்பிற்கு மேலும் பணிகள் தேவைப்படும், மேலும் எதிர்காலத்தில் கால்சியம் மற்றும் மின்னழுத்த-உணர்திறன் சாயங்களைப் பயன்படுத்தி ஒளியியல் வரைபடமாக்கல் போன்ற, வளர்ப்பில் உள்ள இதயத் துண்டுகளின் செயல்பாட்டை ஒளியியல் ரீதியாகக் கண்காணிக்கும் முறைகளை அறிமுகப்படுத்துவதன் மூலம் இது சரிசெய்யப்படலாம். CTCM-இன் மற்றொரு வரம்பு என்னவென்றால், செயல்படும் மாதிரியானது உடலியல் அழுத்தத்தை (முன்சுமை மற்றும் பின்சுமை) கையாளாது. CTCM-இல், மிகப் பெரிய திசுக்களில் டயஸ்டோல் (முழு நீட்சி) மற்றும் சிஸ்டோல் (மின் தூண்டலின் போது ஏற்படும் சுருக்கத்தின் நீளம்) ஆகியவற்றில் 25% உடலியல் நீட்சியை மீண்டும் உருவாக்க, அழுத்தம் எதிர் திசைகளில் தூண்டப்பட்டது. எதிர்கால CTCM வடிவமைப்புகளில், இதயத் திசுக்களின் மீது இருபுறமிருந்தும் போதுமான அழுத்தத்தை அளிப்பதன் மூலமும், இதயத்தின் அறைகளில் ஏற்படும் துல்லியமான அழுத்தம்-பருமன் உறவுகளைப் பயன்படுத்துவதன் மூலமும் இந்தக் குறைபாடு நீக்கப்பட வேண்டும்.
இந்தக் கட்டுரையில் விவரிக்கப்பட்டுள்ள அதீத நீட்சியால் தூண்டப்பட்ட மறுசீரமைப்பு, மிகை வளர்ச்சி சார்ந்த நீட்சி சமிக்ஞைகளைப் பிரதிபலிப்பதற்கு மட்டுமே வரையறுக்கப்பட்டுள்ளது. எனவே, இந்த மாதிரியானது திரவ அல்லது நரம்பியல் காரணிகளின் தேவையின்றி (அவை இந்த அமைப்பில் இல்லை) நீட்சியால் தூண்டப்பட்ட மிகை வளர்ச்சி சமிக்ஞைகளைப் பற்றிய ஆய்வுக்கு உதவக்கூடும். CTCM-இன் பன்முகத்தன்மையை அதிகரிக்க மேலும் ஆய்வுகள் தேவைப்படுகின்றன; எடுத்துக்காட்டாக, நோயெதிர்ப்பு செல்களுடன் இணை வளர்ப்பு, சுழற்சியில் உள்ள பிளாஸ்மா திரவக் காரணிகள், மற்றும் நரம்பியல் செல்களுடன் இணை வளர்ப்பு செய்யும்போது ஏற்படும் நரம்பூட்டம் ஆகியவை CTCM-ஐக் கொண்டு நோய் மாதிரியாக்கம் செய்வதற்கான சாத்தியங்களை மேம்படுத்தும்.
இந்த ஆய்வில் பதின்மூன்று பன்றிகள் பயன்படுத்தப்பட்டன. அனைத்து விலங்கு நடைமுறைகளும் நிறுவன வழிகாட்டுதல்களின்படி செய்யப்பட்டன, மேலும் அவை லூயிஸ்வில் பல்கலைக்கழகத்தின் நிறுவன விலங்கு பராமரிப்பு மற்றும் பயன்பாட்டுக் குழுவால் அங்கீகரிக்கப்பட்டன. பெருந்தமனி வளைவு இறுக்கப்பட்டு, 1 லிட்டர் கிருமியழிக்கப்பட்ட கார்டியோப்ளீஜியா (110 mM NaCl, 1.2 mM CaCl2, 16 mM KCl, 16 mM MgCl2, 10 mM NaHCO3, 5 U/mL ஹெப்பரின், pH 7.4 வரை) கொண்டு இதயம் ஊடுருவப்பட்டது; இதயங்கள், பனிக்கட்டியில் வைத்து ஆய்வகத்திற்குக் கொண்டு செல்லப்படும் வரை, மிகவும் குளிர்ந்த கார்டியோப்ளெஜிக் கரைசலில் பாதுகாக்கப்பட்டன; இந்த செயல்முறைக்கு வழக்கமாக 10 நிமிடங்களுக்கும் குறைவாகவே ஆகும். இதயங்கள், பனிக்கட்டியில் வைத்து ஆய்வகத்திற்குக் கொண்டு செல்லப்படும் வரை, மிகவும் குளிர்ந்த கார்டியோப்ளெஜிக் கரைசலில் பாதுகாக்கப்பட்டன; இந்த செயல்முறைக்கு வழக்கமாக 10 நிமிடங்களுக்கும் குறைவாகவே ஆகும். செர்டிசா க்ரானிலி மற்றும் லெடியனோம் கார்டியோபிளேகிசெஸ்கோம் ராஸ்ட்வோரே டூ டிரான்ஸ்போர்டிரோவ்கி வ லாபோரடோரிசு ந லோடு, <10 நிமிடம். ஆய்வகத்திற்குப் பனிக்கட்டியில் வைத்து எடுத்துச் செல்லும் வரை, இதயங்கள் மிகவும் குளிர்ந்த கார்டியோப்ளெஜிக் கரைசலில் சேமித்து வைக்கப்பட்டன; இந்த செயல்முறைக்கு வழக்கமாக 10 நிமிடங்களுக்கும் குறைவாகவே ஆகும்.将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钟。将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钟。 டெர்சைட் செர்டிசா மற்றும் லெடியனோய் கார்டியோபிளேகி டோ டிரான்ஸ்போர்டிரோவ்கி வ லாபோரடோரியூ நா ல்டு, ஓபிசினோ <10 மணி. ஆய்வகத்திற்கு எடுத்துச் செல்லும் வரை, இதயங்களை கார்டியோப்ளீஜியாவுடன் பனிக்கட்டியில் வைக்கவும் (பொதுவாக 10 நிமிடங்களுக்கும் குறைவான நேரம்).
CTCM சாதனம், சாலிட்வொர்க்ஸ் கணினி உதவி வடிவமைப்பு (CAD) மென்பொருளில் உருவாக்கப்பட்டது. வளர்ப்பு அறைகள், பிரிப்பான்கள் மற்றும் காற்று அறைகள் ஆகியவை CNC தெளிவான அக்ரிலிக் பிளாஸ்டிக்கால் செய்யப்பட்டுள்ளன. 7 மிமீ விட்டம் கொண்ட பேக்-அப் வளையத்தின் மையப்பகுதி, உயர் அடர்த்தி பாலிஎதிலீனால் (HDPE) ஆனது. மேலும், அதன் அடியில் உள்ள ஊடகத்தை அடைக்கப் பயன்படுத்தப்படும் சிலிக்கான் ஓ-ரிங்கைப் பொருத்துவதற்காக, அதில் ஒரு ஓ-ரிங் பள்ளம் உள்ளது. ஒரு மெல்லிய சிலிக்கா சவ்வு, வளர்ப்பு அறையைப் பிரிப்புத் தட்டிலிருந்து பிரிக்கிறது. இந்த சிலிக்கான் சவ்வு, 0.02 அங்குல தடிமன் கொண்ட சிலிக்கான் தாளிலிருந்து லேசர் மூலம் வெட்டப்பட்டுள்ளது மற்றும் 35A கடினத்தன்மையைக் கொண்டுள்ளது. கீழ் மற்றும் மேல் சிலிக்கான் கேஸ்கெட்டுகள், 1/16 அங்குல தடிமன் கொண்ட சிலிக்கான் தாளிலிருந்து லேசர் மூலம் வெட்டப்பட்டுள்ளன மற்றும் 50A கடினத்தன்மையைக் கொண்டுள்ளன. இந்தத் தொகுதியைப் பொருத்துவதற்கும், காற்று புகாத அடைப்பை உருவாக்குவதற்கும் 316L துருப்பிடிக்காத எஃகு திருகுகள் மற்றும் விங் நட்டுகள் பயன்படுத்தப்படுகின்றன.
C-PACE-EM அமைப்புடன் ஒருங்கிணைக்கப்படும் வகையில் ஒரு பிரத்யேக அச்சிடப்பட்ட மின்சுற்றுப் பலகை (PCB) வடிவமைக்கப்பட்டுள்ளது. PCB-யில் உள்ள சுவிஸ் இயந்திர இணைப்பான் துளைகள், வெள்ளி பூசப்பட்ட செப்புக் கம்பிகள் மற்றும் மின்முனைகளில் திருகப்பட்ட வெண்கல 0-60 திருகுகள் மூலம் கிராஃபைட் மின்முனைகளுடன் இணைக்கப்பட்டுள்ளன. அந்த அச்சிடப்பட்ட மின்சுற்றுப் பலகை, 3D அச்சுப்பொறியின் மூடியில் வைக்கப்படுகிறது.
CTCM சாதனம், ஒரு இதயச் சுழற்சியைப் போன்ற கட்டுப்படுத்தப்பட்ட சுற்றோட்ட அழுத்தத்தை உருவாக்கும் ஒரு நிரல்படுத்தக்கூடிய காற்றழுத்த இயக்கி (PPD) மூலம் கட்டுப்படுத்தப்படுகிறது. காற்று அறைக்குள் அழுத்தம் அதிகரிக்கும்போது, ​​நெகிழ்வான சிலிக்கான் சவ்வு மேல்நோக்கி விரிவடைந்து, திசுப் பகுதிக்குக் கீழே உள்ள ஊடகத்தை அழுத்துகிறது. இந்தத் திரவ வெளியேற்றத்தால் திசுப் பகுதி நீட்டப்பட்டு, டயஸ்டோலின் போது இதயத்தின் உடலியல் விரிவாக்கத்தைப் போலச் செயல்படுகிறது. தளர்வின் உச்சத்தில், கிராஃபைட் மின்முனைகள் வழியாக மின் தூண்டுதல் அளிக்கப்பட்டது. இது காற்று அறையில் உள்ள அழுத்தத்தைக் குறைத்து, திசுப் பிரிவுகளில் சுருக்கத்தை ஏற்படுத்தியது. குழாயின் உள்ளே, காற்று அமைப்பில் உள்ள அழுத்தத்தைக் கண்டறிய ஒரு அழுத்த உணரியுடன் கூடிய இரத்தப்போக்கைக் கட்டுப்படுத்தும் வால்வு உள்ளது. அழுத்த உணரியால் உணரப்படும் அழுத்தம், மடிக்கணினியுடன் இணைக்கப்பட்ட ஒரு தரவு சேகரிப்பானுக்கு அனுப்பப்படுகிறது. இது வாயு அறைக்குள் உள்ள அழுத்தத்தைத் தொடர்ச்சியாகக் கண்காணிக்க உதவுகிறது. அதிகபட்ச அறை அழுத்தம் (நிலையான அளவு 80 mmHg, OS அளவு 140 mmHg) எட்டப்பட்டபோது, ​​தரவு சேகரிப்பு சாதனம், 2 மில்லி விநாடிகளுக்கு 4 V ஆக அமைக்கப்பட்ட ஒரு இருமுனை மின்னழுத்த சமிக்ஞையை உருவாக்குவதற்காக, C-PACE-EM அமைப்புக்கு ஒரு சமிக்ஞையை அனுப்புமாறு கட்டளையிடப்பட்டது.
இதயத்தின் பகுதிகள் பெறப்பட்டு, 6 கிணறுகளில் வளர்ப்பு நிலைமைகள் பின்வருமாறு மேற்கொள்ளப்பட்டன: அறுவடை செய்யப்பட்ட இதயங்களை, பரிமாற்றக் கலனிலிருந்து குளிர்ச்சியான (4° C) கார்டியோப்ளீஜியா உள்ள ஒரு தட்டுக்கு மாற்றவும். இடது வென்ட்ரிக்கிள் ஒரு கிருமியழிக்கப்பட்ட கத்தியால் தனிமைப்படுத்தப்பட்டு, 1-2 செ.மீ³ துண்டுகளாக வெட்டப்பட்டது. இந்த திசுத் தொகுதிகள், திசுப் பசை கொண்டு திசுத் தாங்கிகளில் இணைக்கப்பட்டு, டைரோட் கரைசல் மற்றும் தொடர்ச்சியாக ஆக்ஸிஜனேற்றம் செய்யப்பட்ட (3 கி/லி 2,3-பியூட்டேன்டையோன் மோனோஆக்சைம் (BDM), 140 mM NaCl (8.18 கி), 6 mM KCl (0.447 கி), 10 mM D-குளுக்கோஸ் (1.86 கி), 10 mM HEPES (2.38 கி), 1 mM MgCl₂ (1 மிலி 1 M கரைசல்), 1.8 mM CaCl₂ (1.8 மிலி 1 M கரைசல்), 1 லிட்டர் வரை ddH₂O) ஆகியவற்றைக் கொண்ட ஒரு அதிர்வுறும் மைக்ரோடோம் திசுத் தொட்டியில் வைக்கப்பட்டன. அதிர்வுறும் மைக்ரோடோம், 300 µm தடிமன் கொண்ட துண்டுகளை 80 Hz அதிர்வெண், 2 mm கிடைமட்ட அதிர்வு வீச்சு மற்றும் 0.03 mm/s முன்னேற்ற விகிதத்தில் வெட்டுமாறு அமைக்கப்பட்டது. கரைசலைக் குளிர்ச்சியாக வைத்திருக்க, திசுத் தொட்டியைச் சுற்றி பனிக்கட்டி வைக்கப்பட்டது மற்றும் வெப்பநிலை 4°C இல் பராமரிக்கப்பட்டது. ஒரு வளர்ப்புத் தட்டுக்குத் தேவையான துண்டுகள் கிடைக்கும் வரை, திசுத் துண்டுகளை மைக்ரோடோம் தொட்டியிலிருந்து, பனிக்கட்டியின் மீது தொடர்ச்சியாக ஆக்ஸிஜனேற்றப்பட்ட டைரோட் கரைசல் உள்ள ஒரு அடைகாப்புத் தொட்டிக்கு மாற்றவும். டிரான்ஸ்வெல் வளர்ப்புகளுக்கு, திசுத் துண்டுகள் கிருமியழிக்கப்பட்ட 6 mm அகலமுள்ள பாலியூரிதேன் தாங்கிகளில் இணைக்கப்பட்டு, 6 ml உகந்த ஊடகத்தில் (199 ஊடகம், 1x ITS துணைப்பொருள், 10% FBS, 5 ng/ml VEGF, 10 ng/ml FGF-காரத்தன்மை மற்றும் 2X நுண்ணுயிர் எதிர்ப்பி-பூஞ்சை எதிர்ப்பு) வைக்கப்பட்டன. C-Pace வழியாக திசுத் துண்டுகளுக்கு மின் தூண்டுதல் (10 V, அதிர்வெண் 1.2 Hz) அளிக்கப்பட்டது. TD நிலைமைகளுக்காக, ஒவ்வொரு ஊடக மாற்றத்தின்போதும் புதிய T3 மற்றும் Dex ஆகியவை முறையே 100 nM மற்றும் 1 μM அளவில் சேர்க்கப்பட்டன. ஒரு நாளைக்கு 3 முறை ஊடகத்தை மாற்றுவதற்கு முன்பு, அது ஆக்ஸிஜனால் செறிவூட்டப்படுகிறது. திசுத் துண்டுகள் 37°C வெப்பநிலையிலும் 5% CO2 சூழலிலும் ஒரு இன்குபேட்டரில் வளர்க்கப்பட்டன.
CTCM வளர்ப்புகளுக்காக, திசுத் துண்டுகள், மாற்றியமைக்கப்பட்ட டைரோட் கரைசல் கொண்ட ஒரு பெட்ரி தட்டில், பிரத்யேகமாக உருவாக்கப்பட்ட 3D பிரிண்டரில் வைக்கப்பட்டன. இந்தக் கருவியானது, இதயத் துண்டின் அளவை ஆதரவு வளையத்தின் பரப்பளவில் 25% அளவுக்கு அதிகரிக்க வடிவமைக்கப்பட்டுள்ளது. டைரோட் கரைசலில் இருந்து ஊடகத்திற்கு மாற்றப்பட்ட பிறகும், டயஸ்டோலின் போதும் இதயத் துண்டுகள் நீளாமல் இருப்பதற்காக இது செய்யப்படுகிறது. ஹிஸ்டோஅக்ரிலிக் பசையைப் பயன்படுத்தி, 300 µm தடிமன் கொண்ட துண்டுகள், 7 மிமீ விட்டம் கொண்ட ஆதரவு வளையத்தில் பொருத்தப்பட்டன. திசுத் துண்டுகளை ஆதரவு வளையத்தில் பொருத்திய பிறகு, அதிகப்படியான திசுத் துண்டுகளை வெட்டிவிட்டு, ஒரு கருவிக்குத் தேவையான துண்டுகள் தயாராகும் வரை, பொருத்தப்பட்ட திசுத் துண்டுகளை மீண்டும் பனிக்கட்டியில் (4°C) உள்ள டைரோட் கரைசல் தொட்டியில் வைக்கவும். அனைத்து கருவிகளுக்குமான மொத்த செயலாக்க நேரம் 2 மணி நேரத்திற்கு மிகாமல் இருக்க வேண்டும். 6 திசுத் துண்டுகள் அவற்றின் ஆதரவு வளையங்களில் பொருத்தப்பட்ட பிறகு, CTCM கருவி ஒன்றுசேர்க்கப்பட்டது. CTCM வளர்ப்பு அறையானது, 21 மிலி முன்-ஆக்ஸிஜனேற்றப்பட்ட ஊடகத்தால் முன்பே நிரப்பப்பட்டுள்ளது. திசுத் துண்டுகளை வளர்ப்பு அறைக்கு மாற்றி, ஒரு பிப்பெட்டைப் பயன்படுத்தி ஏதேனும் காற்று குமிழ்கள் இருந்தால் கவனமாக அகற்றவும். பின்னர் திசுத் துண்டு துளைக்குள் செலுத்தப்பட்டு மெதுவாக அதன் இடத்தில் அழுத்தப்படுகிறது. இறுதியாக, சாதனத்தின் மீது மின்முனை மூடியை வைத்து, சாதனத்தை இன்குபேட்டருக்கு மாற்றவும். பிறகு CTCM-ஐ காற்று குழாய் மற்றும் C-PACE-EM அமைப்புடன் இணைக்கவும். நியூமேட்டிக் ஆக்சுவேட்டர் திறக்கிறது மற்றும் காற்று வால்வு CTCM-ஐத் திறக்கிறது. C-PACE-EM அமைப்பு, 2 மில்லி விநாடிகளுக்கு இருகட்ட பேசிங்கின் போது 1.2 ஹெர்ட்ஸில் 4 V-ஐ வழங்குமாறு கட்டமைக்கப்பட்டது. மின்முனைகளில் கிராஃபைட் படிவதைத் தவிர்க்க, ஊடகம் ஒரு நாளைக்கு இருமுறையும், மின்முனைகள் ஒரு நாளைக்கு ஒருமுறையும் மாற்றப்பட்டன. தேவைப்பட்டால், திசுத் துண்டுகளுக்கு அடியில் விழுந்திருக்கக்கூடிய காற்று குமிழ்களை வெளியேற்றுவதற்காக, அவற்றை அவற்றின் வளர்ப்பு கிணறுகளிலிருந்து அகற்றலாம். MT சிகிச்சை நிலைமைகளுக்கு, ஒவ்வொரு ஊடக மாற்றத்தின் போதும் 100 nM T3 மற்றும் 1 μM Dex உடன் T3/Dex புதிதாகச் சேர்க்கப்பட்டது. CTCM சாதனங்கள் 37°C வெப்பநிலையிலும் 5% CO2 சூழலிலும் ஒரு இன்குபேட்டரில் வளர்க்கப்பட்டன.
இதயத் துண்டுகளின் நீட்டப்பட்ட பாதைகளைப் பெறுவதற்காக, ஒரு சிறப்பு கேமரா அமைப்பு உருவாக்கப்பட்டது. ஒரு SLR கேமரா (Canon Rebel T7i, Canon, Tokyo, Japan) உடன் Navitar Zoom 7000 18-108mm மேக்ரோ லென்ஸ் (Navitar, San Francisco, CA) பயன்படுத்தப்பட்டது. ஊடகத்தை புதிய ஊடகத்தால் மாற்றிய பிறகு, அறை வெப்பநிலையில் காட்சிப்படுத்தல் செய்யப்பட்டது. கேமரா 51° கோணத்தில் நிலைநிறுத்தப்பட்டு, வினாடிக்கு 30 பிரேம்கள் என்ற விகிதத்தில் வீடியோ பதிவு செய்யப்பட்டது. முதலில், இதயத் துண்டுகளின் இயக்கத்தை அளவிட, Image-J உடன் திறந்த மூல மென்பொருள் (MUSCLEMOTION43) பயன்படுத்தப்பட்டது. இரைச்சலைத் தவிர்ப்பதற்காக, துடிக்கும் இதயத் துண்டுகளுக்கான ஆர்வப் பகுதிகளை வரையறுக்க, MATLAB (MathWorks, Natick, MA, USA) பயன்படுத்தி முகமூடி உருவாக்கப்பட்டது. கைமுறையாகப் பிரிக்கப்பட்ட முகமூடிகள் ஒரு பிரேம் வரிசையில் உள்ள அனைத்துப் படங்களுக்கும் பயன்படுத்தப்பட்டு, பின்னர் MUSCLEMOTION செருகுநிரலுக்கு அனுப்பப்படுகின்றன. Muscle Motion, குறிப்பு பிரேமுடன் ஒப்பிட்டு அதன் இயக்கத்தை அளவிட, ஒவ்வொரு பிரேமிலும் உள்ள பிக்சல்களின் சராசரி அடர்த்தியைப் பயன்படுத்துகிறது. தரவுகள் பதிவு செய்யப்பட்டு, வடிகட்டப்பட்டு, இதயச் சுழற்சியின் போது சுழற்சி நேரத்தை அளவிடவும் திசு நீட்சியை மதிப்பிடவும் பயன்படுத்தப்பட்டன. பதிவு செய்யப்பட்ட காணொளி, முதல்-வரிசை பூஜ்ஜிய-கட்ட டிஜிட்டல் வடிகட்டியைப் பயன்படுத்தி பிந்தைய செயலாக்கம் செய்யப்பட்டது. திசு நீட்சியை (உச்சத்திலிருந்து உச்சம் வரை) அளவிட, பதிவு செய்யப்பட்ட சமிக்ஞையில் உள்ள உச்சங்கள் மற்றும் பள்ளங்களுக்கு இடையில் வேறுபடுத்துவதற்காக உச்சத்திலிருந்து உச்சம் வரையிலான பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டது. கூடுதலாக, சமிக்ஞை நகர்வை நீக்குவதற்காக 6-ஆம் வரிசை பல்லுறுப்புக் கோவையைப் பயன்படுத்தி போக்குநீக்கம் செய்யப்படுகிறது. ஒட்டுமொத்த திசு இயக்கம், சுழற்சி நேரம், தளர்வு நேரம் மற்றும் சுருக்க நேரம் ஆகியவற்றைக் கண்டறிய MATLAB-இல் நிரல் குறியீடு உருவாக்கப்பட்டது (துணை நிரல் குறியீடு 44).
திரிபுப் பகுப்பாய்விற்காக, இயந்திர நீட்சி மதிப்பீட்டிற்காக உருவாக்கப்பட்ட அதே காணொளிகளைப் பயன்படுத்தி, மஸில்மோஷன் மென்பொருளின்படி இயக்க உச்சங்களைக் (இயக்கத்தின் மிக உயர்ந்த (மேல்) மற்றும் மிகக் குறைந்த (கீழ்) புள்ளிகள்) குறிக்கும் இரண்டு படங்களை நாங்கள் முதலில் வரைந்தோம். பின்னர், திசுப் பகுதிகளைப் பிரித்து, பிரிக்கப்பட்ட திசுவிற்கு ஒரு வகையான நிழலிடல் நெறிமுறையைப் பயன்படுத்தினோம் (துணைப் படம் 2a). பிரிக்கப்பட்ட திசு பின்னர் பத்து உட்பரப்புகளாகப் பிரிக்கப்பட்டது, மேலும் ஒவ்வொரு பரப்பின் மீதான தகைவு பின்வரும் சமன்பாட்டைப் பயன்படுத்தி கணக்கிடப்பட்டது: திரிபு = (மேல்-கீழ்)/கீழ், இங்கு மேல் மற்றும் கீழ் என்பவை முறையே துணியின் மேல் மற்றும் கீழ் நிழல்களிலிருந்து வடிவத்தின் தூரங்கள் ஆகும் (துணைப் படம் 2b).
இதயத் துண்டுகள் 4% பாராஃபார்மால்டிஹைடில் 48 மணி நேரம் நிலைப்படுத்தப்பட்டன. நிலைப்படுத்தப்பட்ட திசுக்கள் 10% மற்றும் 20% சுக்ரோஸில் 1 மணி நேரத்திற்கும், பின்னர் 30% சுக்ரோஸில் இரவு முழுவதும் நீர் நீக்கம் செய்யப்பட்டன. பின்னர் அந்தத் துண்டுகள் உகந்த வெட்டு வெப்பநிலை கலவையில் (OCT கலவை) பதிக்கப்பட்டு, ஐசோபென்டேன்/உலர் பனிக்கட்டி குளியலில் படிப்படியாக உறையவைக்கப்பட்டன. பிரித்தெடுக்கும் வரை OCT பதிக்கும் கட்டிகளை -80 °C வெப்பநிலையில் சேமிக்கவும். ஸ்லைடுகள் 8 μm தடிமன் கொண்ட துண்டுகளாகத் தயாரிக்கப்பட்டன.
இதயப் பிரிவுகளிலிருந்து OCT-ஐ அகற்ற, ஸ்லைடுகளை ஒரு வெப்பமூட்டும் தொகுதியில் 95 °C வெப்பநிலையில் 5 நிமிடங்களுக்குச் சூடாக்கவும். ஒவ்வொரு ஸ்லைடிலும் 1 மிலி PBS-ஐச் சேர்த்து, அறை வெப்பநிலையில் 30 நிமிடங்களுக்கு அடைகாக்கவும். பின்னர், PBS-இல் உள்ள 0.1% டிரைட்டான்-X-ஐ அறை வெப்பநிலையில் 15 நிமிடங்களுக்கு நிலைநிறுத்துவதன் மூலம் அந்தப் பிரிவுகளில் ஊடுருவச் செய்யவும். குறிப்பிட்டல்லாத ஆன்டிபாடிகள் மாதிரியுடன் பிணைவதைத் தடுக்க, ஸ்லைடுகளில் 1 மிலி 3% BSA கரைசலைச் சேர்த்து, அறை வெப்பநிலையில் 1 மணி நேரம் அடைகாக்கவும். பின்னர் BSA அகற்றப்பட்டு, ஸ்லைடுகள் PBS-ஆல் கழுவப்பட்டன. ஒவ்வொரு மாதிரியையும் பென்சிலால் குறிக்கவும். முதன்மை ஆன்டிபாடிகள் (1% BSA-இல் 1:200 என்ற விகிதத்தில் நீர்த்தவை) (கனெக்சின் 43 (Abcam; #AB11370), NFATC4 (Abcam; #AB99431) மற்றும் ட்ரோபோனின்-T (Thermo Scientific; #MA5-12960)) 90 நிமிடங்களுக்கு மேல் சேர்க்கப்பட்டன, பின்னர் இரண்டாம் நிலை ஆன்டிபாடிகள் (1% BSA-இல் 1:200 என்ற விகிதத்தில் நீர்த்தவை) எலி அலெக்ஸா ஃப்ளூர் 488 (Thermo Scientific; #A16079) மற்றும் முயல் அலெக்ஸா ஃப்ளூர் 594 (Thermo Scientific; #T6391) ஆகியவற்றுக்கு எதிராக மேலும் 90 நிமிடங்களுக்குச் சேர்க்கப்பட்டன. PBS கொண்டு 3 முறை கழுவப்பட்டது. பின்னணியிலிருந்து இலக்குக் கறையை வேறுபடுத்த, நாங்கள் இரண்டாம் நிலை ஆன்டிபாடியை மட்டும் ஒரு கட்டுப்பாடாகப் பயன்படுத்தினோம். இறுதியாக, DAPI உட்கருக் கறை சேர்க்கப்பட்டு, ஸ்லைடுகள் ஒரு வெக்டார்ஷீல்டில் (Vector Laboratories) வைக்கப்பட்டு, நெயில் பாலிஷ் கொண்டு சீல் செய்யப்பட்டன. -x உருப்பெருக்கம்) மற்றும் 40x உருப்பெருக்கம் கொண்ட கீயன்ஸ் மைக்ரோஸ்கோப்.
WGA சாயமேற்றலுக்காக, PBS-இல் 5 μg/ml செறிவில் உள்ள WGA-அலெக்ஸா ஃப்ளூர் 555 (தெர்மோ சயின்டிஃபிக்; #W32464) பயன்படுத்தப்பட்டது. இது அறை வெப்பநிலையில் 30 நிமிடங்களுக்கு நிலைப்படுத்தப்பட்ட பிரிவுகளில் பூசப்பட்டது. பின்னர், ஸ்லைடுகள் PBS-ஆல் கழுவப்பட்டு, ஒவ்வொரு ஸ்லைடிலும் சூடான் பிளாக் சேர்க்கப்பட்டு 30 நிமிடங்களுக்கு அடைகாக்கப்பட்டது. அதன் பிறகு, ஸ்லைடுகள் PBS-ஆல் கழுவப்பட்டு, வெக்டாஷீல்டு உட்பொதிப்பு ஊடகம் சேர்க்கப்பட்டது. ஸ்லைடுகள் கீயன்ஸ் நுண்ணோக்கியில் 40x உருப்பெருக்கத்தில் பார்க்கப்பட்டன.
மேலே விவரிக்கப்பட்டபடி மாதிரிகளிலிருந்து OCT அகற்றப்பட்டது. OCT-ஐ அகற்றிய பிறகு, ஸ்லைடுகளை இரவு முழுவதும் பௌயின் கரைசலில் மூழ்க வைக்கவும். பின்னர் ஸ்லைடுகள் 1 மணி நேரம் காய்ச்சி வடிகட்டிய நீரால் அலசப்பட்டு, பிறகு 10 நிமிடங்களுக்கு பிப்ரிச் கற்றாழை அமில ஃபூச்சின் கரைசலில் வைக்கப்பட்டன. பிறகு ஸ்லைடுகள் காய்ச்சி வடிகட்டிய நீரால் கழுவப்பட்டு, 10 நிமிடங்களுக்கு 5% பாஸ்போமோலிப்டினம்/5% பாஸ்போடாங்ஸ்டிக் அமிலக் கரைசலில் வைக்கப்பட்டன. அலசாமல், ஸ்லைடுகளை நேரடியாக 15 நிமிடங்களுக்கு அனிலின் நீலக் கரைசலுக்கு மாற்றவும். பின்னர் ஸ்லைடுகள் காய்ச்சி வடிகட்டிய நீரால் கழுவப்பட்டு, 2 நிமிடங்களுக்கு 1% அசிட்டிக் அமிலக் கரைசலில் வைக்கப்பட்டன. ஸ்லைடுகள் 200 N எத்தனாலில் உலர்த்தப்பட்டு, சைலினுக்கு மாற்றப்பட்டன. சாயம் பூசப்பட்ட ஸ்லைடுகள் 10x அப்ஜெக்டிவ் கொண்ட கீயன்ஸ் நுண்ணோக்கியைப் பயன்படுத்திப் பார்க்கப்பட்டன. ஃபைப்ரோசிஸ் பகுதியின் சதவீதம் கீயன்ஸ் அனலைசர் மென்பொருளைப் பயன்படுத்தி அளவிடப்பட்டது.
சைக்வாண்ட்™ எம்டிடி செல் உயிர்வாழ்திறன் சோதனை (இன்விட்ரோஜென், கார்ல்ஸ்பேட், சிஏ), பட்டியல் எண் V13154, உற்பத்தியாளரின் நெறிமுறையின்படி சில மாற்றங்களுடன் பயன்படுத்தப்பட்டது. குறிப்பாக, எம்டிடி பகுப்பாய்வின் போது திசுவின் சீரான அளவை உறுதி செய்வதற்காக 6 மிமீ விட்டம் கொண்ட ஒரு அறுவை சிகிச்சை பஞ்ச் பயன்படுத்தப்பட்டது. உற்பத்தியாளரின் நெறிமுறையின்படி, எம்டிடி அடி மூலக்கூறு கொண்ட 12-குழித் தட்டின் குழிகளில் திசுக்கள் தனித்தனியாக இடப்பட்டன. அந்தத் துண்டுகள் 37° C வெப்பநிலையில் 3 மணி நேரம் அடைகாக்கப்பட்டன, மேலும் உயிருள்ள திசு எம்டிடி அடி மூலக்கூறை வளர்சிதை மாற்றம் செய்து ஒரு ஊதா நிற ஃபார்மசான் சேர்மத்தை உருவாக்குகிறது. எம்டிடி கரைசலுக்குப் பதிலாக 1 மிலி டிஎம்எஸ்ஓ-வை இட்டு, இதயத் துண்டுகளிலிருந்து ஊதா நிற ஃபார்மசானைப் பிரித்தெடுக்க 37 °C வெப்பநிலையில் 15 நிமிடங்கள் அடைகாக்கப்பட்டன. மாதிரிகள் 96-குழித் தெளிவான அடிப்பகுதித் தட்டுகளில் டிஎம்எஸ்ஓ-வில் 1:10 என்ற விகிதத்தில் நீர்க்கப்பட்டு, சைடேஷன் பிளேட் ரீடர் (பயோடெக்) பயன்படுத்தி 570 நானோமீட்டரில் ஊதா நிறத்தின் அடர்த்தி அளவிடப்பட்டது. அளவீடுகள் இதயத்தின் ஒவ்வொரு துண்டின் எடைக்கு ஏற்ப இயல்பாக்கப்பட்டன.
முன்னர் விவரிக்கப்பட்டபடி குளுக்கோஸ் பயன்பாட்டு மதிப்பீட்டிற்காக, இதயத் துண்டு ஊடகம் 1 μCi/ml [5-3H]-குளுக்கோஸ் (மொராவெக் பயோகெமிக்கல்ஸ், ப்ரியா, CA, USA) கொண்ட ஊடகத்தால் மாற்றப்பட்டது. 4 மணிநேர அடைகாத்தலுக்குப் பிறகு, 100 µl 0.2 N HCl கொண்ட ஒரு திறந்த மைக்ரோசென்ட்ரிஃபியூஜ் குழாயில் 100 µl ஊடகத்தைச் சேர்க்கவும். பின்னர் அந்தக் குழாய், 37°C வெப்பநிலையில் 72 மணிநேரம் [3H]2O-ஐ ஆவியாக்குவதற்காக, 500 μl dH2O கொண்ட ஒரு ஸ்கின்டிலேஷன் குழாயில் வைக்கப்பட்டது. பின்னர் ஸ்கின்டிலேஷன் குழாயிலிருந்து மைக்ரோசென்ட்ரிஃபியூஜ் குழாயை அகற்றி, 10 ml ஸ்கின்டிலேஷன் திரவத்தைச் சேர்க்கவும். ஸ்கின்டிலேஷன் எண்ணிக்கைகள், ஒரு ட்ரை-கார்ப் 2900TR திரவ ஸ்கின்டிலேஷன் பகுப்பாய்வியைப் (பேக்கார்ட் பயோசயின்ஸ் கம்பெனி, மெரிடன், CT, USA) பயன்படுத்திச் செய்யப்பட்டன. பின்னர், [5-3H]-குளுக்கோஸின் குறிப்பிட்ட செயல்பாடு, முழுமையற்ற சமநிலை மற்றும் பின்னணி, குறியிடப்படாத குளுக்கோஸாக [5-3H]-இன் நீர்த்தல், மற்றும் ஒளிர்வு எண்ணியின் செயல்திறன் ஆகியவற்றைக் கணக்கில் கொண்டு குளுக்கோஸ் பயன்பாடு கணக்கிடப்பட்டது. இந்தத் தரவுகள் இதயத்தின் பிரிவுகளின் நிறைக்கு ஏற்ப இயல்பாக்கப்பட்டுள்ளன.
டிரைசோலில் திசுக்களை ஒருபடித்தாக்கிய பிறகு, உற்பத்தியாளரின் நெறிமுறையின்படி கியாகன் miRNeasy மைக்ரோ கிட் #210874-ஐப் பயன்படுத்தி இதயப் பிரிவுகளிலிருந்து ஆர்.என்.ஏ பிரித்தெடுக்கப்பட்டது. ஆர்.என்.ஏ.செக் லைப்ரரி தயாரிப்பு, வரிசைப்படுத்துதல் மற்றும் தரவு பகுப்பாய்வு ஆகியவை பின்வருமாறு செய்யப்பட்டன:
ஆர்.என்.ஏ லைப்ரரியைத் தயாரிப்பதற்கான தொடக்கப் பொருளாக, ஒவ்வொரு மாதிரியிலிருந்தும் 1 μg ஆர்.என்.ஏ பயன்படுத்தப்பட்டது. உற்பத்தியாளரின் பரிந்துரைகளைப் பின்பற்றி, இல்லுமினாவிற்கான NEBNext UltraTM ஆர்.என்.ஏ லைப்ரரி தயாரிப்புக் கருவியைப் (NEB, USA) பயன்படுத்தி வரிசைப்படுத்தல் லைப்ரரிகள் உருவாக்கப்பட்டன, மேலும் ஒவ்வொரு மாதிரியின் பண்புக்கூறு வரிசைகளிலும் குறியீட்டு எண்கள் சேர்க்கப்பட்டன. சுருக்கமாக, பாலி-T ஒலிகோநியூக்ளியோடைடுகளுடன் இணைக்கப்பட்ட காந்த மணிகளைப் பயன்படுத்தி மொத்த ஆர்.என்.ஏ-விலிருந்து எம்.ஆர்.என்.ஏ தூய்மைப்படுத்தப்பட்டது. NEBNext முதல் இழை தொகுப்பு வினை இடையகத்தில் (5X) உயர் வெப்பநிலையில் இரு இணைதிறன் கொண்ட நேர்மின் அயனிகளைப் பயன்படுத்தி துண்டாக்கம் மேற்கொள்ளப்பட்டது. ரேண்டம் ஹெக்ஸாமர் பிரைமர்கள் மற்றும் M-MuLV ரிவர்ஸ் டிரான்ஸ்கிரிப்டேஸ் (RNase H-) ஆகியவற்றைப் பயன்படுத்தி முதல் இழை சி.டி.என்.ஏ தொகுக்கப்பட்டது. பின்னர், டி.என்.ஏ பாலிமரேஸ் I மற்றும் RNase H ஆகியவற்றைப் பயன்படுத்தி இரண்டாவது இழை சி.டி.என்.ஏ தொகுக்கப்பட்டது. மீதமுள்ள தொங்குமுனைகள் எக்ஸோநியூக்ளியேஸ்/பாலிமரேஸ் செயல்பாட்டின் மூலம் மழுங்கிய முனைகளாக மாற்றப்பட்டன. டிஎன்ஏ துண்டின் 3′ முனையில் அடினைலேஷன் செய்யப்பட்ட பிறகு, ஹைபிரிடைசேஷனுக்குத் தயார்படுத்துவதற்காக, ஹேர்பின் லூப் அமைப்புடன் கூடிய ஒரு NEBNext அடாப்டர் அதனுடன் இணைக்கப்படுகிறது. விரும்பத்தக்க 150-200 bp நீளமுள்ள சிடிஎன்ஏ துண்டுகளைத் தேர்ந்தெடுப்பதற்காக, லைப்ரரி துண்டுகள் AMPure XP சிஸ்டம் (பெக்மேன் கோல்டர், பெவர்லி, அமெரிக்கா) பயன்படுத்தி சுத்திகரிக்கப்பட்டன. பின்னர், அளவு தேர்ந்தெடுக்கப்பட்ட சிடிஎன்ஏ ஒரு அடாப்டருடன் இணைக்கப்பட்ட 3 μl USER என்சைம் (NEB, அமெரிக்கா) 37°C-ல் 15 நிமிடங்களுக்கும், பின்னர் பிசிஆருக்கு முன்பு 95°C-ல் 5 நிமிடங்களுக்கும் பயன்படுத்தப்பட்டது. பின்னர், ஃபியூஷன் ஹை-ஃபிடிலிட்டி டிஎன்ஏ பாலிமரேஸ், யுனிவர்சல் பிசிஆர் பிரைமர்கள் மற்றும் இன்டெக்ஸ் (X) பிரைமர்களைப் பயன்படுத்தி பிசிஆர் செய்யப்பட்டது. இறுதியாக, பிசிஆர் தயாரிப்புகள் (AMPure XP சிஸ்டம்) சுத்திகரிக்கப்பட்டு, லைப்ரரியின் தரம் Agilent Bioanalyzer 2100 சிஸ்டத்தில் மதிப்பிடப்பட்டது. பின்னர், சிடிஎன்ஏ லைப்ரரி ஒரு Novaseq சீக்வென்சரைப் பயன்படுத்தி வரிசைப்படுத்தப்பட்டது. இலுமினாவிலிருந்து பெறப்பட்ட மூலப் படக் கோப்புகள், CASAVA பேஸ் காலிங் முறையைப் பயன்படுத்தி மூல ரீடுகளாக மாற்றப்பட்டன. மூலத் தரவுகள், ரீட் வரிசைகளையும் அதற்கேற்ற பேஸ் தரங்களையும் கொண்ட FASTQ(fq) வடிவக் கோப்புகளில் சேமிக்கப்படுகின்றன. வடிகட்டப்பட்ட வரிசைமுறை ரீடுகளை Sscrofa11.1 குறிப்பு மரபணுத்தொகுதியுடன் பொருத்துவதற்கு HISAT2-ஐத் தேர்ந்தெடுக்கவும். பொதுவாக, HISAT2 4 பில்லியன் பேஸ்களுக்கும் அதிகமான மரபணுத்தொகுதிகள் உட்பட, எந்த அளவிலான மரபணுத்தொகுதிகளையும் ஆதரிக்கிறது, மேலும் பெரும்பாலான அளவுருக்களுக்கு இயல்புநிலை மதிப்புகள் அமைக்கப்பட்டுள்ளன. தற்போது கிடைக்கக்கூடிய வேகமான அமைப்பான HISAT2-ஐப் பயன்படுத்தி, RNA Seq தரவுகளிலிருந்து பெறப்படும் ஸ்ப்ளைசிங் ரீடுகளை, வேறு எந்த முறையையும் விட அதே அல்லது சிறந்த துல்லியத்துடன் திறமையாக சீரமைக்க முடியும்.
டிரான்ஸ்கிரிப்டுகளின் மிகுதியானது மரபணு வெளிப்பாட்டின் அளவை நேரடியாகப் பிரதிபலிக்கிறது. மரபணு வெளிப்பாட்டு நிலைகள், மரபணுத்தொகுதி அல்லது எக்ஸான்களுடன் தொடர்புடைய டிரான்ஸ்கிரிப்டுகளின் மிகுதியைக் (வரிசைப்படுத்தல் எண்ணிக்கை) கொண்டு மதிப்பிடப்படுகின்றன. ரீட்களின் எண்ணிக்கை, மரபணு வெளிப்பாட்டு நிலைகள், மரபணு நீளம் மற்றும் வரிசைப்படுத்தல் ஆழம் ஆகியவற்றுக்கு விகிதாசாரமாக உள்ளது. FPKM (ஒரு மில்லியன் பேஸ் ஜோடிகளுக்கு வரிசைப்படுத்தப்பட்ட டிரான்ஸ்கிரிப்டின் ஆயிரம் பேஸ் ஜோடிகளுக்குரிய துண்டுகள்) கணக்கிடப்பட்டு, வேறுபட்ட வெளிப்பாட்டின் P-மதிப்புகள் DESeq2 தொகுப்பைப் பயன்படுத்தித் தீர்மானிக்கப்பட்டன. பின்னர், உள்ளமைக்கப்பட்ட R-செயல்பாடான “p.adjust”-ஐ அடிப்படையாகக் கொண்ட பெஞ்சமினி-ஹோச்பெர்க் முறை9-ஐப் பயன்படுத்தி, ஒவ்வொரு P-மதிப்பிற்கும் தவறான கண்டுபிடிப்பு விகிதத்தை (FDR) நாங்கள் கணக்கிட்டோம்.
இதயப் பிரிவுகளிலிருந்து பிரித்தெடுக்கப்பட்ட ஆர்.என்.ஏ, தெர்மோவின் சூப்பர்ஸ்கிரிப்ட் IV வைலோ மாஸ்டர் மிக்ஸைப் (தெர்மோ, பட்டியல் எண். 11756050) பயன்படுத்தி 200 ng/μl செறிவில் சி.டி.என்.ஏ-வாக மாற்றப்பட்டது. அப்ளைடு பயோசிஸ்டம்ஸின் எண்டுரா பிளேட் மைக்ரோஆம்ப் 384-குழி ஒளிபுகும் வினைத்தட்டு (தெர்மோ, பட்டியல் எண். 4483319) மற்றும் மைக்ரோஆம்ப் ஒளியியல் ஒட்டுப்பசையைப் (தெர்மோ, பட்டியல் எண். 4311971) பயன்படுத்தி அளவுசார் ஆர்.டி-பி.சி.ஆர் செய்யப்பட்டது. வினைக்கலவையானது, ஒவ்வொரு குழிக்கும் 5 µl டாக்மேன் ஃபாஸ்ட் அட்வான்ஸ்டு மாஸ்டர் மிக்ஸ் (தெர்மோ, பட்டியல் எண். 4444557), 0.5 µl டாக்மேன் பிரைமர் மற்றும் 3.5 µl H2O ஆகியவற்றைக் கொண்டிருந்தது. அப்ளைடு பயோசிஸ்டம்ஸின் குவாண்ட்ஸ்டுடியோ 5 நிகழ்நேர பி.சி.ஆர் கருவியைப் (384-குழி தொகுதி; தயாரிப்பு எண். A28135) பயன்படுத்தி நிலையான qPCR சுழற்சிகள் இயக்கப்பட்டு, CT மதிப்புகள் அளவிடப்பட்டன. டாக்மேன் பிரைமர்கள் தெர்மோ நிறுவனத்திடமிருந்து வாங்கப்பட்டன (GAPDH (Ss03375629_u1), PARP12 (Ss06908795_m1), PKDCC (Ss06903874_m1), CYGB (Ss06900188_m1), RGL1 (Ss06868890_m1), ACTN1 (Ss01009508_mH), GATA4 (Ss03383805_u1), GJA1 (Ss03374839_u1), COL1A2 (Ss03375009_u1), COL3A1 (Ss04323794_m1), ACTA2 (Ss04245588_m1)). அனைத்து மாதிரிகளின் CT மதிப்புகளும் ஹவுஸ்கீப்பிங் மரபணுவான GAPDH-க்கு இயல்பாக்கப்பட்டன.
உற்பத்தியாளரின் நெறிமுறையின்படி, NT-ProBNP கிட் (பன்றி) (பட்டியல் எண். MBS2086979, MyBioSource) ஐப் பயன்படுத்தி NT-ProBNP இன் ஊடக வெளியீடு மதிப்பிடப்பட்டது. சுருக்கமாக, ஒவ்வொரு மாதிரி மற்றும் தரநிலையிலிருந்தும் 250 µl வீதம், ஒவ்வொரு கிணற்றிலும் இருமுறை சேர்க்கப்பட்டது. மாதிரியைச் சேர்த்த உடனேயே, ஒவ்வொரு கிணற்றிலும் 50 µl மதிப்பீட்டு வினைப்பொருள் A ஐச் சேர்க்கவும். தட்டை மெதுவாக அசைத்து, சீலண்ட் கொண்டு மூடவும். பின்னர் மாத்திரைகள் 37°C வெப்பநிலையில் 1 மணி நேரம் அடைகாக்கப்பட்டன. பிறகு கரைசலை உறிஞ்சி எடுத்துவிட்டு, 350 µl 1X கழுவும் கரைசலைக் கொண்டு கிணறுகளை 4 முறை கழுவவும், ஒவ்வொரு முறையும் கழுவும் கரைசலை 1-2 நிமிடங்கள் அடைகாக்கவும். பின்னர் ஒவ்வொரு கிணற்றிலும் 100 µl மதிப்பீட்டு வினைப்பொருள் B ஐச் சேர்த்து, தட்டு சீலண்ட் கொண்டு மூடவும். மாத்திரை மெதுவாக அசைக்கப்பட்டு 37°C வெப்பநிலையில் 30 நிமிடங்கள் அடைகாக்கப்பட்டது. கரைசலை உறிஞ்சி எடுத்துவிட்டு, 350 µl 1X கழுவும் கரைசலைக் கொண்டு கிணறுகளை 5 முறை கழுவவும். ஒவ்வொரு கிணற்றிலும் 90 µl அடி மூலக்கூறு கரைசலைச் சேர்த்து தட்டை மூடி சீல் செய்யவும். தட்டை 37°C வெப்பநிலையில் 10-20 நிமிடங்கள் அடைகாக்கவும். ஒவ்வொரு கிணற்றிலும் 50 µl நிறுத்தும் கரைசலைச் சேர்க்கவும். 450 nm-ல் அமைக்கப்பட்ட சைடேஷன் (பயோடெக்) தட்டு அளவியைப் பயன்படுத்தி தட்டு உடனடியாக அளவிடப்பட்டது.
5% வகை I பிழை விகிதத்துடன், அளவுருவில் ஏற்படும் 10% முழுமையான மாற்றத்தைக் கண்டறிய 80%-க்கும் அதிகமான ஆற்றலை வழங்கும் குழு அளவுகளைத் தேர்ந்தெடுப்பதற்காக, ஆற்றல் பகுப்பாய்வுகள் மேற்கொள்ளப்பட்டன. 5% வகை I பிழை விகிதத்துடன், அளவுருவில் ஏற்படும் 10% முழுமையான மாற்றத்தைக் கண்டறிய 80%-க்கும் அதிகமான ஆற்றலை வழங்கும் குழு அளவுகளைத் தேர்ந்தெடுப்பதற்காக, ஆற்றல் பகுப்பாய்வுகள் மேற்கொள்ளப்பட்டன. அனாலிஸ் மோஸ்னோஸ்டி பைல் வைபோல்னென் டிலை வைபோரா ராஸ்மெரோவ் க்ரூப், கோட்டரி ஓபெஸ்பெச்சட் >80% மாஸ்னோஸ்டி டுலியா 10% பயன்பாடு பராமெட்ரா மற்றும் 5% ஓஷிபோக் டிப்பா I. 5% வகை I பிழை விகிதத்துடன், 10% முழுமையான அளவுரு மாற்றத்தைக் கண்டறிய 80%-க்கும் அதிகமான ஆற்றலை வழங்கும் குழு அளவுகளைத் தேர்ந்தெடுப்பதற்காக ஆற்றல் பகுப்பாய்வு மேற்கொள்ளப்பட்டது.进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝变化和5％I型错误率的组大小。进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝变化和5％I型错误率的组大小。 பைல் ப்ரோவேடன் அனாலிஸ் மோஸ்னோஸ்டி டிலியா வைபோரா ரஸ்மேரா க்ரூப்பி, கோடோரி ஆஸ்பெக்டில் பிய் > 80% மாஸ்டோஸ்டி %000 பயன்பாடு பராமெட்ரோவ் மற்றும் 5% ஆசிப் டிப்பா I. 10% முழுமையான அளவுரு மாற்றம் மற்றும் 5% வகை I பிழை விகிதத்தைக் கண்டறிய, 80%-க்கும் அதிகமான ஆற்றலை வழங்கும் குழு அளவைத் தேர்ந்தெடுப்பதற்காக ஒரு ஆற்றல் பகுப்பாய்வு மேற்கொள்ளப்பட்டது.பரிசோதனைக்கு முன்பு திசுப் பகுதிகள் சமவாய்ப்பு முறையில் தேர்ந்தெடுக்கப்பட்டன. அனைத்துப் பகுப்பாய்வுகளும் நிலை அறியாதவாறு செய்யப்பட்டன, மேலும் அனைத்துத் தரவுகளும் பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்ட பின்னரே மாதிரிகள் குறியீடு நீக்கம் செய்யப்பட்டன. அனைத்துப் புள்ளிவிவரப் பகுப்பாய்வுகளையும் செய்வதற்கு கிராஃப்பேட் பிரிசம் மென்பொருள் (சான் டியாகோ, கலிபோர்னியா) பயன்படுத்தப்பட்டது. அனைத்து புள்ளிவிவரங்களுக்கும், p-மதிப்புகள் 0.05-க்கும் குறைவாக இருக்கும்போது குறிப்பிடத்தக்கவையாகக் கருதப்பட்டன. அனைத்து புள்ளிவிவரங்களுக்கும், p-மதிப்புகள் 0.05-க்கும் குறைவாக இருக்கும்போது குறிப்பிடத்தக்கதாகக் கருதப்பட்டன. Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. அனைத்து புள்ளிவிவரங்களுக்கும், p-மதிப்புகள் 0.05-க்கும் குறைவாக இருக்கும்போது குறிப்பிடத்தக்கதாகக் கருதப்பட்டன.对于所有统计数据，p 值在值<0.05 时被认为是显着的。对于所有统计数据，p 值在值<0.05 时被认为是显着的。 Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. அனைத்து புள்ளிவிவரங்களுக்கும், p-மதிப்புகள் 0.05-க்கும் குறைவாக இருக்கும்போது குறிப்பிடத்தக்கதாகக் கருதப்பட்டன.இரண்டு ஒப்பீடுகளை மட்டுமே கொண்ட தரவுகளில் இருமுனை மாணவர் t-சோதனை நிகழ்த்தப்பட்டது. பல குழுக்களுக்கு இடையேயான முக்கியத்துவத்தைத் தீர்மானிக்க ஒருவழி அல்லது இருவழி ANOVA பயன்படுத்தப்பட்டது. பிந்தைய சோதனைகளை நிகழ்த்தும்போது, ​​பல ஒப்பீடுகளைக் கணக்கில் கொள்ள டக்கியின் திருத்தம் பயன்படுத்தப்பட்டது. முறைகள் பிரிவில் விவரிக்கப்பட்டுள்ளபடி, FDR மற்றும் p.adjust ஆகியவற்றைக் கணக்கிடும்போது RNAsec தரவுகளுக்குச் சிறப்புப் புள்ளிவிவரக் கருத்தாய்வுகள் உள்ளன.
ஆய்வு வடிவமைப்பு குறித்த கூடுதல் தகவல்களுக்கு, இந்தக் கட்டுரையுடன் இணைக்கப்பட்டுள்ள நேச்சர் ரிசர்ச் ரிப்போர்ட் சுருக்கத்தைப் பார்க்கவும்.