Dankie dat jy Nature.com besoek het.Die blaaierweergawe wat jy gebruik het beperkte CSS-ondersteuning.Vir die beste ervaring, beveel ons aan dat jy 'n opgedateerde blaaier gebruik (of versoenbaarheidsmodus in Internet Explorer deaktiveer).In die tussentyd, om volgehoue ​​ondersteuning te verseker, sal ons die webwerf sonder style en JavaScript weergee.
Daar is 'n behoefte aan 'n betroubare in vitro-stelsel wat die fisiologiese omgewing van die hart akkuraat kan weergee vir dwelmtoetsing.Die beperkte beskikbaarheid van menslike hartweefselkultuurstelsels het gelei tot onakkurate interpretasies van kardiale geneesmiddeleffekte.Hier het ons 'n kardiale weefselkultuurmodel (CTCM) ontwikkel wat hartskywe elektromeganies stimuleer en fisiologiese rek ondergaan tydens die sistoliese en diastoliese fases van die hartsiklus.Na 12 dae van kultuur het hierdie benadering die lewensvatbaarheid van hartafdelings gedeeltelik verbeter, maar het nie hul strukturele integriteit ten volle bewaar nie.Daarom, na klein molekule sifting, het ons gevind dat die byvoeging van 100 nM trijodotironien (T3) en 1 μM deksametasoon (Dex) tot ons medium die mikrostruktuur van die snitte vir 12 dae behou het.In kombinasie met T3/Dex-behandeling het die CTCM-stelsel transkripsieprofiele, lewensvatbaarheid, metaboliese aktiwiteit en strukturele integriteit op dieselfde vlak as vars hartweefsel gehandhaaf vir 12 dae.Daarbenewens veroorsaak oormatige strek van hartweefsel in kultuur hipertrofiese hartsein, wat bewys lewer vir die vermoë van CTCM om hipertrofiese toestande wat deur kardiale strek veroorsaak word, na te boots.Ten slotte, CTCM kan die fisiologie en patofisiologie van die hart in kultuur oor lang tydperke modelleer, wat betroubare dwelmsifting moontlik maak.
Voor kliniese navorsing is betroubare in vitro-stelsels nodig wat die fisiologiese omgewing van die menslike hart akkuraat kan weergee.Sulke stelsels moet veranderde meganiese strek, hartklop en elektrofisiologiese eienskappe naboots.Dieremodelle word algemeen gebruik as 'n siftingsplatform vir kardiale fisiologie met beperkte betroubaarheid om die effekte van geneesmiddels in die menslike hart te weerspieël1,2.Uiteindelik is die ideale hartweefselkultuur-eksperimentele model (CTCM) 'n model wat hoogs sensitief en spesifiek is vir verskeie terapeutiese en farmakologiese intervensies, wat die fisiologie en patofisiologie van die menslike hart akkuraat weergee3.Die afwesigheid van so 'n stelsel beperk die ontdekking van nuwe behandelings vir hartversaking4,5 en het gelei tot geneesmiddelkardiotoksisiteit as 'n groot rede om die mark te verlaat6.
Oor die afgelope dekade is agt nie-kardiovaskulêre middels uit kliniese gebruik onttrek omdat hulle QT-interval verlenging veroorsaak wat lei tot ventrikulêre aritmieë en skielike dood7.Daar is dus 'n toenemende behoefte aan betroubare prekliniese siftingstrategieë om kardiovaskulêre doeltreffendheid en toksisiteit te bepaal.Die onlangse gebruik van mens-geïnduseerde pluripotente stamsel-afgeleide kardiomiosiete (hiPS-CM) in dwelmsifting en toksisiteitstoetse bied 'n gedeeltelike oplossing vir hierdie probleem.Die onvolwasse aard van hiPS-CMs en die gebrek aan meersellige kompleksiteit van hartweefsel is egter groot beperkings van hierdie metode.Onlangse studies het getoon dat hierdie beperking gedeeltelik oorkom kan word deur vroeë hiPS-CM te gebruik om kardiale weefsel hidrogels te vorm kort na die aanvang van spontane kontraksies en geleidelik toenemende elektriese stimulasie met verloop van tyd.Hierdie hiPS-CM mikroweefsels het egter nie die volwasse elektrofisiologiese en kontraktiele eienskappe van die volwasse miokardium nie.Daarbenewens het menslike hartweefsel 'n meer komplekse struktuur, wat bestaan ​​uit 'n heterogene mengsel van verskillende seltipes, insluitend endoteelselle, neurone en stromale fibroblaste, onderling verbind deur spesifieke stelle ekstrasellulêre matriksproteïene.Hierdie heterogeniteit van nie-kardiomiosiet populasies11,12,13 in die volwasse soogdierhart is 'n groot hindernis vir die modellering van hartweefsel deur individuele seltipes te gebruik.Hierdie groot beperkings beklemtoon die belangrikheid van die ontwikkeling van metodes vir die kweek van ongeskonde miokardiale weefsel onder fisiologiese en patologiese toestande.
Gekweekte dun (300 µm) dele van die menslike hart het bewys dat dit 'n belowende model van ongeskonde menslike miokardium is.Hierdie metode bied toegang tot 'n volledige 3D meersellige stelsel soortgelyk aan menslike hartweefsel.Tot 2019 was die gebruik van gekweekte hartafdelings egter beperk deur die kort (24 uur) kultuuroorlewing.Dit is as gevolg van 'n aantal faktore, insluitend die gebrek aan fisies-meganiese strek, die lug-vloeistof-koppelvlak en die gebruik van eenvoudige media wat nie die behoeftes van hartweefsel ondersteun nie.In 2019 het verskeie navorsingsgroepe getoon dat die inkorporering van meganiese faktore in kardiale weefselkultuurstelsels kultuurlewe kan verleng, hartuitdrukking kan verbeter en hartpatologie kan naboots.Twee elegante studies 17 en 18 toon dat eenassige meganiese belading 'n positiewe effek op kardiale fenotipe tydens kweek het.Hierdie studies het egter nie die dinamiese driedimensionele fisies-meganiese belading van die kardiale siklus gebruik nie, aangesien hartseksies met óf isometriese trekkragte 17 óf lineêre outotoniese laai 18 gelaai is.Hierdie metodes van weefselstrek het gelei tot die onderdrukking van baie hartgene of die ooruitdrukking van gene wat verband hou met abnormale rekreaksies.Veral Pitoulis et al.19 'n dinamiese hartskyfie-kultuurbad ontwikkel vir hartsiklusrekonstruksie deur gebruik te maak van kragomskakelaarterugvoer en spanningaandrywings.Alhoewel hierdie stelsel meer akkurate in vitro hartsiklusmodellering moontlik maak, beperk die kompleksiteit en lae deurset van die metode die toepassing van hierdie stelsel.Ons laboratorium het onlangs 'n vereenvoudigde kultuurstelsel ontwikkel wat elektriese stimulasie en 'n geoptimaliseerde medium gebruik om die lewensvatbaarheid van dele van vark- en menslike hartweefsel vir tot 6 dae te handhaaf20,21.
In die huidige manuskrip beskryf ons 'n hartweefselkultuurmodel (CTCM) deur gedeeltes van die varkhart te gebruik wat humorale leidrade bevat om driedimensionele kardiale fisiologie en patofisiologiese distensie tydens die hartsiklus te rekapituleer.Hierdie CTCM kan die akkuraatheid van pre-kliniese geneesmiddelvoorspelling verhoog tot 'n vlak wat nog nooit tevore bereik is nie deur 'n koste-effektiewe, middeldeurvloei-hartstelsel te verskaf wat die fisiologie/patofisiologie van die soogdierhart naboots vir pre-kliniese dwelmtoetsing.
Hemodinamiese meganiese seine speel 'n kritieke rol in die handhawing van kardiomiosietfunksie in vitro 22,23,24.In die huidige manuskrip het ons 'n CTCM (Figuur 1a) ontwikkel wat die volwasse hartomgewing kan naboots deur beide elektriese en meganiese stimulasie by fisiologiese frekwensies (1.2 Hz, 72 slae per minuut) te veroorsaak.Om oormatige weefselstrek tydens diastool te vermy, is 'n 3D-druktoestel gebruik om weefselgrootte met 25% te vergroot (Fig. 1b).Elektriese tempo wat deur die C-PACE-stelsel geïnduseer is, is op tyd gestel om 100 ms voor sistool te begin deur 'n data-verkrygingstelsel te gebruik om die hartsiklus ten volle te reproduseer.Die weefselkultuurstelsel gebruik 'n programmeerbare pneumatiese aktuator (LB Engineering, Duitsland) om 'n buigsame silikoonmembraan siklies uit te brei om uitbreiding van die hartskywe in die boonste kamer te veroorsaak.Die stelsel is deur 'n drukomskakelaar aan 'n eksterne luglyn gekoppel, wat dit moontlik gemaak het om die druk (± 1 mmHg) en tyd (± 1 ms) akkuraat aan te pas (Fig. 1c).
a Heg die weefselgedeelte aan die 7 mm-steunring, getoon in blou, binne die kultuurkamer van die toestel.Die kultuurkamer word van die lugkamer geskei deur 'n dun buigsame silikoonmembraan.Plaas 'n pakking tussen elke kamer om lekkasies te voorkom.Die deksel van die toestel bevat grafietelektrodes wat elektriese stimulasie verskaf.b Skematiese voorstelling van die grootweefseltoestel, leiring en steunring.Die weefselseksies (bruin) word op die oormaat toestel geplaas met die gidsring in die groef op die buitenste rand van die toestel geplaas.Gebruik die gids en plaas die steunring wat met weefsel-akriel-kleefmiddel bedek is, versigtig oor die gedeelte van die hartweefsel.c Grafiek wat die tyd van elektriese stimulasie toon as 'n funksie van lugkamerdruk wat deur 'n programmeerbare pneumatiese aktuator (PPD) beheer word.'n Data-verkrygingstoestel is gebruik om elektriese stimulasie te sinchroniseer deur druksensors te gebruik.Wanneer die druk in die kultuurkamer die vasgestelde drempel bereik, word 'n pulssein na die C-PACE-EM gestuur om elektriese stimulasie te aktiveer.d Beeld van vier CTCM's wat op 'n broeikasrak geplaas is.Vier toestelle word via 'n pneumatiese stroombaan aan een PPD gekoppel, en druksensors word in die hemostatiese klep geplaas om die druk in die pneumatiese stroombaan te monitor.Elke toestel bevat ses weefselafdelings.
Deur 'n enkele pneumatiese aktuator te gebruik, was ons in staat om 4 CTCM-toestelle te beheer, wat elkeen 6 weefselafdelings kon hou (Fig. 1d).In CTCM word die lugdruk in die lugkamer omgeskakel na sinchroniese druk in die vloeistofkamer en veroorsaak dit fisiologiese uitbreiding van die hartsny (Figuur 2a en Aanvullende Film 1).Evaluering van weefselrek by 80 mm Hg.Art.strek van weefselseksies met 25% getoon (Fig. 2b).Daar is getoon dat hierdie persentasie strek ooreenstem met 'n fisiologiese sarkomeerlengte van 2.2–2.3 µm vir normale kardiale seksie kontraktiliteit17,19,25.Weefselbeweging is geassesseer deur gebruik te maak van persoonlike kamera-instellings (Aanvullende Figuur 1).Die amplitude en snelheid van weefselbeweging (Fig. 2c, d) het ooreengestem met strek tydens die hartsiklus en tyd tydens sistool en diastool (Fig. 2b).Strek en snelheid van hartweefsel tydens sametrekking en ontspanning het konstant gebly vir 12 dae in kultuur (Fig. 2f).Om die effek van elektriese stimulasie op kontraktiliteit tydens kweek te evalueer, het ons 'n metode ontwikkel vir die bepaling van aktiewe misvorming met behulp van 'n skakeringalgoritme (Aanvullende Fig. 2a,b) en kon onderskei tussen misvormings met en sonder elektriese stimulasie.Dieselfde gedeelte van die hart (Fig. 2f).In die beweegbare area van die snit (R6-9) was die spanning tydens elektriese stimulasie 20% hoër as in die afwesigheid van elektriese stimulasie, wat die bydrae van elektriese stimulasie tot kontraktiele funksie aandui.
Verteenwoordigende spore van lugkamerdruk, vloeistofkamerdruk en weefselbewegingsmetings bevestig dat kamerdruk vloeistofkamerdruk verander, wat 'n ooreenstemmende beweging van die weefselsny veroorsaak.b Verteenwoordigende spore van persentasie strek (blou) van weefselseksies wat ooreenstem met persentasie strek (oranje).c Die gemete beweging van die hartsny stem ooreen met die gemete spoed van beweging.(d) Verteenwoordigende trajekte van sikliese beweging (blou lyn) en snelheid (oranje stippellyn) in 'n deel van die hart.e Kwantifisering van siklustyd (n = 19 snye per groep, van verskillende varke), sametrekkingstyd (n = 19 snye per groep), ontspanningstyd (n = 19 snye per groep, van verskillende varke), weefselbeweging (n = 25 ).snye)/groep van verskillende varke), piek sistoliese snelheid (n = 24(D0), 25(D12) snye/groep van verskillende varke) en piek ontspanningstempo (n=24(D0), 25(D12) snye/groep van verskillende varke).Tweestert Student se t-toets het geen betekenisvolle verskil in enige parameter getoon nie.f Verteenwoordigende stamanalise-spore van weefselsnitte met (rooi) en sonder (blou) elektriese stimulasie, tien streeksareas van weefselsnitte van dieselfde seksie.Die onderste panele toon die kwantifisering van die persentasie verskil in spanning in weefselafdelings met en sonder elektriese stimulasie in tien areas van verskillende afdelings. (n = 8 snye/groep van verskillende varke, Tweestert Student t-toets word uitgevoer; ****p < 0.0001, **p < 0.01, *p < 0.05). (n = 8 snye/groep van verskillende varke, Tweestert Student t-toets word uitgevoer; ****p < 0.0001, **p < 0.01, *p < 0.05). (n = 8 syfers/spele van wedrenne, проводится двусторонний t-критерий Стьюдента; ****p<0,0001, ***p<0,01,01,**p<0,01,01. (n = 8 seksies/groep van verskillende varke, tweestert Student se t-toets; ****p<0.0001, **p<0.01, *p<0.05). （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p < 0.0001，**p < 0.01＀0.5） （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p < 0.0001，**p < 0.01＀0.5） (n = 8 syfers/speel, van разных свиней, двусторонний критерий Стьюдента; ****p <0,0001, **p <0,01, *p <0,05). (n = 8 seksies/groep, van verskillende varke, tweestert Student se t-toets; ****p<0.0001, **p<0.01, *p<0.05).Foutstawe verteenwoordig die gemiddelde ± standaardafwyking.
In ons vorige statiese biomimetiese hartskyfie-kultuurstelsel [20, 21], het ons die lewensvatbaarheid, funksie en strukturele integriteit van hartskywe vir 6 dae gehandhaaf deur elektriese stimulasie toe te pas en die mediumsamestelling te optimaliseer.Na 10 dae het hierdie syfers egter skerp gedaal.Ons sal verwys na afdelings wat gekweek is in ons vorige statiese biomimetiese kultuurstelsel 20, 21 beheertoestande (Ctrl) en ons sal ons voorheen geoptimaliseerde medium as MC toestande en kultuur gebruik onder gelyktydige meganiese en elektriese stimulasie (CTCM).geroep.Eerstens het ons vasgestel dat meganiese stimulasie sonder elektriese stimulasie onvoldoende was om weefsellewensvatbaarheid vir 6 dae te handhaaf (Aanvullende Fig. 3a,b).Interessant genoeg, met die bekendstelling van fisio-meganiese en elektriese stimulasie deur gebruik te maak van STCM, het die lewensvatbaarheid van 12-dae hartafdelings dieselfde gebly as in vars hartafdelings onder MS-toestande, maar nie onder Ctrl-toestande nie, soos getoon deur MTT-analise (Fig. 1).3a).Dit dui daarop dat meganiese stimulasie en simulasie van die hartsiklus weefselafdelings vir twee keer so lank lewensvatbaar kan hou as wat in ons vorige statiese kultuurstelsel gerapporteer is.Assessering van die strukturele integriteit van weefselseksies deur immunolabelering van kardiale troponien T en konneksien 43 het egter getoon dat konneksien 43 uitdrukking aansienlik hoër was in MC weefsels op dag 12 as in kontroles op dieselfde dag.Egter eenvormige connexin 43 uitdrukking en Z-skyf vorming is nie ten volle gehandhaaf (Fig. 3b).Ons gebruik 'n kunsmatige intelligensie (KI) raamwerk om weefsel strukturele integriteit te kwantifiseer26, 'n beeld-gebaseerde diep leer pyplyn gebaseer op troponin-T en connexin kleuring43 om outomaties die strukturele integriteit en fluoressensie van hart skywe te kwantifiseer in terme van sterkte van lokalisering.Hierdie metode gebruik 'n Convolutional Neural Network (CNN) en 'n diep leerraamwerk om die strukturele integriteit van hartweefsel op 'n outomatiese en onbevooroordeelde wyse betroubaar te kwantifiseer, soos beskryf in die verwysing.26. MC-weefsel het verbeterde strukturele ooreenkoms met dag 0 getoon in vergelyking met statiese beheerafdelings.Daarbenewens het Masson se trichroomkleuring 'n aansienlik laer persentasie fibrose onder MS toestande geopenbaar in vergelyking met kontrole toestande op dag 12 van kultuur (Fig. 3c).Terwyl CTCM die lewensvatbaarheid van hartweefselafdelings op dag 12 verhoog het tot 'n vlak soortgelyk aan dié van vars hartweefsel, het dit nie die strukturele integriteit van die hartafdelings aansienlik verbeter nie.
'n Staafgrafiek toon kwantifisering van die MTT-lewensvatbaarheid van vars hartskywe (D0) of hartskywe kultuur vir 12 dae óf in statiese kultuur (D12 Ctrl) of in CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) skywe ANOp s,# is uitgevoer een manier VA vark,# 0 van verskillende snitte / groep. 01 in vergelyking met D0 en **p < 0,01 in vergelyking met D12 Ctrl). 'n Staafgrafiek toon kwantifisering van die MTT-lewensvatbaarheid van vars hartskywe (D0) of hartskywe kultuur vir 12 dae, hetsy in statiese kultuur (D12 Ctrl) of in CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl ), 12 (D12 MC) is uitgevoer een manier verskillende skywe ANO/# vark, #0, verskillende snitte ;# groep; 001 in vergelyking met D0 en **p < 0,01 in vergelyking met D12 Ctrl).die histogram toon die kwantifisering van die lewensvatbaarheid van MTT vars hartseksies (D0) of kultuur van hartseksies vir 12 dae in óf statiese kultuur (D12 kontrole) óf CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 kontrole). ) ), 12 (D12 MC) snitte uit een-VA, 'n vark-toets-afdelings/-groep;####p < 0,0001 met D0 en **p < 0,01 met D12 Ctrl). ####p < 0,0001 in vergelyking met D0 en **p < 0,01 in vergelyking met D12 Ctrl). a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏刃牄切 切版(D2 Ctrl)天的MTT 活力的量化)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测踎D 0； 0； 0 ；#0. ，与D12 Ctrl 相比，**p < 0.01)。 a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心不脏別片 片(D2 脏切片) (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；与D0 相比，####p < 0,0001，与D12 Ctrl 相比，**phistogram wat die kwantifisering van MTT-lewensvatbaarheid toon in varshartseksies (D0) of hartseksies wat vir 12 dae gekweek is in statiese kultuur (D12-kontrole) of CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12-kontrole)), 12 (D12 MC)-afdelings/-groep van verskillende ANOVA-toetse;####p < 0,0001 met D0, **p < 0,01 met D12 Ctrl). ####p < 0,0001 in vergelyking met D0, **p < 0,01 in vergelyking met D12 Ctrl).b Troponien-T (groen), konneksien 43 (rooi) en DAPI (blou) in vars geïsoleerde hartafdelings (D0) of hartafdelings gekweek onder statiese toestande (Ctrl) of CTCM toestande (MC) vir 12 dae) van verteenwoordigende immunofluoressensiebeelde (blanko skaal = 100 µm). Kunsmatige intelligensie kwantifisering van die hartweefsel strukturele integriteit (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) snye/groep elk van verskillende vark, eenrigting ANOVA toets word uitgevoer; ####p < 0,0001 in vergelyking met D0 en D100 p < 1 0. Kunsmatige intelligensie kwantifisering van die hartweefsel strukturele integriteit (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) snye/groep elk van verskillende varke, eenrigting ANOVA toets word uitgevoer; ####p < 0,0001 in vergelyking met D0 en 10****p <10. Количественная оценка структурной целостности сердечной ткани искусственным интеллектом (n = 7 (D0), 7 (D12 с12), 7 (D12 с12), пурег (D12 с12), зных свиней, проводится однофакторный тест ANOVA; ####p < 0,0001 by сравнению с D0 en ****p < 0,0001 by D12ю сравни). Kwantifisering van die strukturele integriteit van hartweefsel deur kunsmatige intelligensie (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) afdelings/groepe van verskillende varke, eenrigting ANOVA-toets uitgevoer; ####p < 0.0001 vs. met D0 en D****01 in vergelyking met D0 en D****01).人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) snye/groepeer elk van verskillende vark, eenrigting ANOVA-toets <1 ，****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）.人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) snye/groepeer elk van verskillende varke, eenrigting .#0#0VA toets <0#0VA toets;#D; ，****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）. Искусственный интеллект для количественной оценки структурной целостности сердечной ткани (n = 7 (D0), 7 (D512 Ctrl) , 7 (D512 Ctrl) аждой из разных свиней, односторонний тест ANOVA; ####p <0,0001 vs. D0 Для сравнения ****p < 0,0001 по сравния). Kunsmatige intelligensie om die strukturele integriteit van kardiale weefsel te kwantifiseer (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) afdelings/groep elk van verskillende varke, eenrigting ANOVA-toets; ####p<0.0001 vs .D0 < 0 Vergelyk .****p 01). c Verteenwoordigende beelde (links) en kwantifisering (regs) vir hartskywe gekleur met Masson se trichroom-vlek (Skaal kaal = 500 µm) (n = 10 snye/groep elk van verskillende vark, eenrigting ANOVA-toets word uitgevoer; ####p < 0.0001 in vergelyking met D0.*** Ctrl in vergelyking met D0 en 100p). c Verteenwoordigende beelde (links) en kwantifisering (regs) vir hartskywe gekleur met Masson se trichroom-vlek (Skaal kaal = 500 µm) (n = 10 snye/groep elk van verskillende varke, eenrigting ANOVA-toets word uitgevoer; #### p < 0.0001 in vergelyking met D0. Ctrl***1 in vergelyking met D0 en DCtrl). c Репрезентативные изображения (слева) en количественная оценка (справа) срезов сердца, окрашенных тримихром штаб без покрытия = 500 мкм) (n = 10 срезов/группу от разных свиней, выполняется одностороюний pounds pt ### ANOVA; D0 en ***p < 0,001 met D12 Ctrl). c Verteenwoordigende beelde (links) en kwantifisering (regs) van hartafdelings wat met Masson se trichroomvlek gekleur is (onbedekte skaal = 500 µm) (n = 10 seksies/groep van verskillende varke, eenrigting ANOVA-toets uitgevoer; #### p < 0 .0001 in vergelyking met D0 en 102p Ctrl). c 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像（左）和量化（右）（裸尺剼（裸=尺媺切片/组，每组来自不同的猪，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0.0001 与D0 相比，1 与D0 相比，01 Ctrl <0，01 . C 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 （左 左） 量化 （右） 裸尺庰 帺尺庰度 = 500 µm） （n = 10 个 切片 组 每 组 来自 不同 猪 ， 进行 单向 单弛上 单向 0 # Anova 浵 0 # # D相比，***p < 0,001 与D12 Ctrl 相比）. c Репрезентативные изображения (слева) en количественный анализ (справа) срезов сердца, окрашенных трихмных я шкала = 500 мкм) (n = 10 срезов/группа, каждый от другой свиньи, протестировано с помощью одинофагного ;### #p < 0,0001 met D0, ***p < 0,001 met D12 Ctrl). c Verteenwoordigende beelde (links) en kwantifisering (regs) van hartafdelings wat met Masson se trichroomvlek gekleur is (leeg = 500 µm) (n = 10 seksies/groep, elk van 'n ander vark, getoets deur eenrigtinganalise van variansie ;### # p < 0.0001 in vergelyking met D0, Ctrl***1 in vergelyking met D0, Ctrl***1).Foutstawe verteenwoordig die gemiddelde ± standaardafwyking.
Ons het veronderstel dat deur klein molekules by die kultuurmedium te voeg, kardiomiosietintegriteit verbeter kan word en fibrose-ontwikkeling verminder kan word tydens CTCM-kultuur.Ons het dus gekeur vir klein molekules met behulp van ons statiese beheerkulture20,21 as gevolg van die klein aantal verwarrende faktore.Deksametasoon (Dex), trijodotironien (T3) en SB431542 (SB) is vir hierdie skerm gekies.Hierdie klein molekules is voorheen in hiPSC-CM-kulture gebruik om rypwording van kardiomiosiete te veroorsaak deur sarkomeerlengte, T-buisies en geleidingsnelheid te verhoog.Daarbenewens is dit bekend dat beide Dex ('n glukokortikoïed) en SB inflammasie onderdruk29,30.Daarom het ons getoets of die insluiting van een of 'n kombinasie van hierdie klein molekules die strukturele integriteit van hartafdelings sou verbeter.Vir aanvanklike sifting is die dosis van elke verbinding gekies op grond van die konsentrasies wat algemeen in selkultuurmodelle gebruik word (1 μM Dex27, 100 nM T327 en 2.5 μM SB31).Na 12 dae van kultuur het die kombinasie van T3 en Dex gelei tot optimale kardiomiosiet strukturele integriteit en minimale veselagtige hermodellering (Aanvullende Figure 4 en 5).Daarbenewens het die gebruik van dubbel of dubbel hierdie konsentrasies van T3 en Dex nadelige effekte in vergelyking met normale konsentrasies (Aanvullende Fig. 6a,b).
Na aanvanklike sifting het ons 'n kop-aan-kop-vergelyking van 4 kultuurtoestande uitgevoer (Figuur 4a): Ctrl: hartafdelings gekweek in ons voorheen beskryfde statiese kultuur met behulp van ons geoptimaliseerde medium;20.21 TD: T3 en Ctrl s Dex bygevoeg op Woensdag;MC: hartafdelings gekweek in CTCM met behulp van ons voorheen geoptimaliseerde medium;en MT: CTCM met T3 en Dex by die medium gevoeg.Na 12 dae van verbouing het die lewensvatbaarheid van MS- en MT-weefsels dieselfde gebly as in vars weefsels wat deur MTT-toets beoordeel is (Fig. 4b).Interessant genoeg het die byvoeging van T3 en Dex tot transwell-kulture (TD) nie 'n beduidende verbetering in lewensvatbaarheid in vergelyking met Ctrl-toestande tot gevolg gehad nie, wat 'n belangrike rol van meganiese stimulasie in die handhawing van die lewensvatbaarheid van hartafdelings aandui.
'n Eksperimentele ontwerpdiagram wat die vier kultuurtoestande uitbeeld wat gebruik word om die effekte van meganiese stimulasie en T3/Dex-aanvulling op medium vir 12 dae te evalueer. b Staafgrafiek toon kwantifisering van lewensvatbaarheid 12 dae na kweek in al 4 kultuurtoestande (Ctrl, TD, MC, en MT) in vergelyking met vars hartskywe (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD en D12 MT), 12 (D12 MC) skywe ANO-0,# is verskillende maniere VA/groep,# toets uitgevoer. 001, ###p < 0,001 in vergelyking met D0 en **p < 0,01 in vergelyking met D12 Ctrl). b Staafgrafiek toon kwantifisering van lewensvatbaarheid 12 dae na kweek in al 4 kultuurtoestande (Ctrl, TD, MC, en MT) in vergelyking met vars hartskywe (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD en D12 MT), 12 (D12 MC) skywe ANO-0,# is verskillende maniere VA/groep,# toets uitgevoer. 001, ###p < 0,001 in vergelyking met D0 en **p < 0,01 in vergelyking met D12 ctrl). b Гистограмма показывает количественную оценку. ования (контроль, TD, MC en MT) vir сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD en D12) сров (D12) сров (D12) сров (D0) т разных свиней, проводится односторонний тест ANOVA; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 by сравнению с D0 en **p < по 0,01). b Die staafgrafiek toon die kwantifisering van lewensvatbaarheid 12 dae na kweek in al 4 kweektoestande (kontrole, TD, MC en MT) in vergelyking met varshartafdelings (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD en D12 MT), 12 (D12 MC) van verskillende afdelings/# vark 0;# vark0; 001, ###p < 0,001 vs. D0 en **p < 0,01 in vergelyking met D12 Ctrl). b. MT)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；####p < 0.0001，，，，，，，，，，，，，，，，，，，，，，，，，，，，，，，，，，，，，，，#**01缌p < 0.0.与D12控制）.b 4 12 (D12 MC) b Гистограмма, показывающая все 4 условия культивирования (контроль, TD, MC en MT) op сравнению со свежезц (D) (1) D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD en D12 MT), van разных свиней 12 (D12 MC) срезы/группа, односторонний тест ANOVA; #с###p <0,#0#p <0,#0#p <0,#0#p с D0, **p <0,01 по сравнению с контролем D12). b Histogram wat al 4 kweektoestande (kontrole, TD, MC en MT) in vergelyking met varshartseksies (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD en D12 MT), van verskillende varke 12 (D12 MC) afdelings/groep, eenrigting ANOVAp1, #0##0, #0###0, #.0##0 , **p<0.01 vs. kontrole D12). c Staafgrafiek toon die kwantifisering van glukosevloei 12 dae na kweek in al 4 kultuurtoestande (Ctrl, TD, MC en MT) in vergelyking met varshartskywe (D0) (n = 6 snye/groep van verskillende varke, eenrigting ANOVA-toets word uitgevoer; ###p < 0.001, in vergelyking met D0 en DCtrl***p < D0 en D0.1***p 1). c Staafgrafiek toon die kwantifisering van glukosevloei 12 dae na kweek in al 4 kultuurtoestande (Ctrl, TD, MC en MT) in vergelyking met varshartskywe (D0) (n = 6 snye/groep van verskillende varke, eenrigting ANOVA-toets word uitgevoer; ###p < 0.001, in vergelyking met D0 en DCtrl***p < D0 en D0.1***p 1). c Гистограмма показывает количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после культивирования во 4висовисов ания (контроль, TD, MC en MT) vir сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 6 срезов/группу от разных сердца, Полных ся тест ANOVA; ###p < 0,001 met D0 en ***p < 0,001 met D12 Ctrl). c Histogram toon kwantifisering van glukosevloei 12 dae na-kweek onder al 4 kultuurtoestande (kontrole, TD, MC en MT) in vergelyking met varshartafdelings (D0) (n = 6 snitte/groep van verskillende varke, eenrigting ANOVA-toets uitgevoer; ###p < 0.001 in vergelyking met D0 en .***p <Ctrl in vergelyking met D0 en .***p <Ctrl). c.通量定量（n = 6 片/组，来自不同猪，单向执行ANOVA 测试；###p < 0.001，与***D0 盌 与***D0 盌 Ctrl相比）. C 条形图 显示 所有 4 种 条件 （（ctrl 、 td 、 mc 和 mt） 新鲜 心脏 条件 切 片 切 片 切 片 切养 后 后 12 天 的 通量 定量 （n = 6 片/组 ， 来自 猪 ， ， ， ， 定量 （n = 6 片/组 ， 来自 猪 ， ， ， ， 定量 （n = 6 片/组 ， 来自 猪 ， ， ， ， 定量 （ 养 后 后测试；###p < 0.001，与D0 相比，***p < 0.001 与D12 Ctrl 相比）. c Гистограмма, показывающая количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после культивированив 4 для культивированив рования (контроль, TD, MC en MT) vir сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 6 срезов/группа, от развиных, развиных роведены тесты ANOVA; ###p < 0,001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению с D12 (контроль). c Histogram wat kwantifisering van glukose-vloed toon op 12 dae na-kweek vir al 4 kultuurtoestande (kontrole, TD, MC en MT) in vergelyking met varshartafdelings (D0) (n = 6 seksies/groep, van verskillende varke, eensydig Was ANOVA-toetse uitgevoer, ###p < 0.001 in vergelyking met D.***0 in vergelyking met D <0,001).d Stamanalise plotte van vars (blou), dag 12 MC (groen) en dag 12 MT (rooi) weefsels by tien streeksweefselseksiepunte (n = 4 snye/groep, eenrigting ANOVA-toets; daar was geen betekenisvolle verskil tussen groepe nie).e Vulkaanplot wat differensieel uitgedrukte gene in vars hartafdelings (D0) toon in vergelyking met hartafdelings wat onder statiese toestande (Ctrl) of onder MT-toestande (MT) vir 10-12 dae gekweek is.f Hittekaart van sarkomeergene vir hartafdelings wat onder elk van die kultuurtoestande gekweek is.Foutstawe verteenwoordig die gemiddelde ± standaardafwyking.
Metaboliese afhanklikheid van die oorskakeling van vetsuuroksidasie na glikolise is 'n kenmerk van kardiomiosiet dedifferensiasie.Onvolwasse kardiomiosiete gebruik hoofsaaklik glukose vir ATP-produksie en het hipoplastiese mitochondria met min cristae5,32.Glukosebenuttingsontledings het getoon dat onder MC- en MT-toestande, glukosebenutting soortgelyk was aan dié in dag 0-weefsels (Figuur 4c).Ctrl-monsters het egter 'n beduidende toename in glukosebenutting in vergelyking met vars weefsel getoon.Dit dui aan dat die kombinasie van CTCM en T3/Dex weefsellewensvatbaarheid verbeter en die metaboliese fenotipe van 12-dae gekweekte hartafdelings bewaar.Daarbenewens het stamanalise getoon dat spanningsvlakke dieselfde gebly het as in vars hartweefsel vir 12 dae onder MT- en MS-toestande (Fig. 4d).
Om die algehele impak van CTCM en T3/Dex op die globale transkripsielandskap van kardiale snyweefsel te ontleed, het ons RNAseq op hartskywe van al vier verskillende kultuurtoestande uitgevoer (Aanvullende Data 1).Interessant genoeg het MT-afdelings hoë transkripsionele ooreenkomste met vars hartweefsel getoon, met slegs 16 differensieel uitgedruk uit 13 642 gene.Soos ons egter vroeër gewys het, het Ctrl-skywe 1229 gene wat differensieel uitgedruk is na 10-12 dae in kultuur vertoon (Fig. 4e).Hierdie data is bevestig deur qRT-PCR van hart- en fibroblastgene (Aanvullende Fig. 7a-c).Interessant genoeg het die Ctrl-afdelings afregulering van hart- en selsiklusgene en aktivering van inflammatoriese geenprogramme getoon.Hierdie data dui daarop dat dedifferensiasie, wat normaalweg na langtermyn verbouing plaasvind, heeltemal verswak is onder MT toestande (Aanvullende Fig. 8a,b).Noukeurige studie van sarkomeergene het getoon dat slegs onder MT-toestande die gene wat vir die sarkomeer (Fig. 4f) en ioonkanaal (Aanvullende Fig. 9) kodeer, bewaar word, wat hulle beskerm teen onderdrukking onder Ctrl-, TD- en MC-toestande.Hierdie data demonstreer dat met 'n kombinasie van meganiese en humorale stimulasie (T3/Dex), die hartskyfie-transkriptoom soortgelyk aan vars hartskywe kan bly na 12 dae in kultuur.
Hierdie transkripsiebevindinge word ondersteun deur die feit dat die strukturele integriteit van kardiomiosiete in hartafdelings die beste bewaar word onder MT toestande vir 12 dae, soos aangetoon deur ongeskonde en gelokaliseerde konneksien 43 (Fig. 5a).Daarbenewens is fibrose in hartafdelings onder MT toestande aansienlik verminder in vergelyking met Ctrl en soortgelyk aan vars hartafdelings (Fig. 5b).Hierdie data demonstreer dat die kombinasie van meganiese stimulasie en T3/Dex-behandeling die hartstruktuur in hartafdelings in kultuur effektief bewaar.
'n Verteenwoordigende immunofluoressensiebeelde van troponien-T (groen), connexin 43 (rooi) en DAPI (blou) in vars geïsoleerde hartafdelings (D0) of gekweek vir 12 dae in al vier hartafdeling-kultuurtoestande (skaalbalk = 100 µm).). Kunsmatige intelligensie-kwantifisering van die hartweefsel strukturele integriteit (n = 7 (D0 en D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC en D12 MT) skywe/groep van verskillende varke, eenrigting ANOVA-toets word uitgevoer; ####p < 0.00001 in vergelyking met D0.0001 en *p < of 0.0001 in vergelyking met D0,0. 12 Ctrl). Kunsmatige intelligensie kwantifisering van die hartweefsel strukturele integriteit (n = 7 (D0 en D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC en D12 MT) skywe/groep van verskillende varke, eenrigting ANOVA-toets word uitgevoer; #### p < 0.00001 in vergelyking met D0.0.0001 in vergelyking met D0.0001 en *p < of 0.0001 in vergelyking met D0. 12 Ctrl). Количественная оценка структурной целостности ткани сердца с помощью искусственного интеллекта (n = 7 (D121 Ctrl), (D = 7 (D121 Ctrl) 2 MT) syfers/speletjies van разных свиней, проведен однофакторный тест ANOVA; #### p < 0,0001 p. met D12 Ctrl). Kwantifisering van die strukturele integriteit van hartweefsel deur gebruik te maak van kunsmatige intelligensie (n = 7 (D0 en D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC en D12 MT) snitte/groep van verskillende varke, eenrigting ANOVA-toets uitgevoer; #### p < 0.0001 in vergelyking met D01 en * 0,0001 of D01 in vergelyking met D02.****0. Ctrl).对不同猪的心脏组织结构完整性（n = 7（D0 和D12 Ctrl）、5（D12 TD、D12 MC 咼艇忇，衉线纻，缌线 MTﺛ工智能量化，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0.0001 与D0 和*p < 0.05 相比，或****p < 0.000 Ctrl ，且****p < 0.000对 不同 猪 的 心脏 结构 完整性 （n = 7 （d0 和 d12 ctrl） （5 （d12 td 、 td ， ， d12 mc 廒 d12 mc 廒智能量 化 进行 单向 单向 单向 测试 ； ########## p < 0.0001 与D0 和*p < 0.05 单向 测试 ； ######### p < 0.0001 与D0 和*p < 0.05 单向相比）.Kwantifisering van die strukturele integriteit van hartweefsel met behulp van kunsmatige intelligensie in verskillende varke (n = 7 (D0 en D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC en D12 MT) afdelings/groep) met 'n eenrigting ANOVA-toets;#### p < 0,0001 met D0 en *p < 0,05 of ****p < 0,0001 met D12 Ctrl). #### p < 0,0001 in vergelyking met D0 en *p < 0,05 of ****p < 0,0001 in vergelyking met D12 Ctrl). b Verteenwoordigende beelde en kwantifisering vir hartskywe gekleur met Masson se trichroom-vlek (Skaalbalk = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD en D12 MC), 9 (D12 MT) skywe/groep van verskillende varke, eenrigting ANO.## toets word uitgevoer <1NO.#0 in vergelyking; p < 0,001, of ****p < 0,0001 in vergelyking met D12 Ctrl). b Verteenwoordigende beelde en kwantifisering vir hartskywe gekleur met Masson se trichroom-vlek (Skaalbalk = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD en D12 MC), 9 (D12 MT) skywe/groep van verskillende varke, eenrigting ANO.## toets word uitgevoer <1NO.#0 in vergelyking; p < 0,001, of ****p < 0,0001 in vergelyking met D12 Ctrl). b Репрезентативные изображения en количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромным краснателем ( = 500 mkm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD en D12 MC), 9 (D12 MT) срезов/группу от разных свиней, выполняется одни0,#0; 1 met D0 en ***p < 0,001 of ****p < 0,0001 met D12 Ctrl). b Verteenwoordigende beelde en kwantifisering van hartafdelings gekleur met Masson se trichroom-vlek (skaalbalk = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD en D12 MC), 9 (D12 MT) snitte/groep van verskillende varke, uitgevoer eenrigting ANOVA <.#0pVA en #***0pVA, #***0pVA en #***0pVA; 01 of ****p < 0,0001 vs. D12 Ctrl). b 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像和量化（比例尺= 500 µm（1D、D（10n和D12 MC），来自不同猪的9 个（D12 MT）切片/组，进行单因素方差分渔；缛；缛##***#p 0,001，或****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）. b 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 和 量化 （比例 尺 尺 尺 = ダ0（n（1（n trl 、 d12 td 和 d12 mc） 来自 不同 的 9 个 d12 mt 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片片 切片 ​​切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片/组，进行单因素方差刼．縌p 0##0＼ ***p < 0,001，或****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）. b Voorwaardes vir die ontwikkeling en die ontwikkeling van 'n tydperk, 5 maande 0 maande (5 maande) n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD en D12 MC), 9 (D12 MT) syfers van разных свиней / speletjies, один-способ ANOVA; ####p < 0,0p < 0,0p < 0,0 001 of ****p < 0,0001 met D12 Ctrl). b Verteenwoordigende beelde en kwantifisering van hartafdelings wat met Masson se trichroom gekleur is (skaalbalk = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD en D12 MC), 9 (D12 MT) afdelings van verskillende varke/groepe, een ANOVA-metode; #0.00,1,00 of D****0.***0.***0. p < 0,0001 in vergelyking met D12 Ctrl).Foutstawe verteenwoordig die gemiddelde ± standaardafwyking.
Laastens is die vermoë van CTCM om harthipertrofie na te boots geassesseer deur verhoging van kardiale weefselrek.In CTCM het piek lugkamerdruk van 80 mmHg tot 80 mmHg toegeneem.Art.(normale rek) tot 140 mmHg Art.(Fig. 6a).Dit stem ooreen met 'n 32% toename in rek (Fig. 6b), wat voorheen getoon is as die ooreenstemmende persentasie strek wat benodig word vir hartafdelings om 'n sarkomeerlengte soortgelyk aan dié wat in hipertrofie gesien word, te bereik.Strek en snelheid van hartweefsel tydens sametrekking en ontspanning het konstant gebly gedurende ses dae van kultuur (Fig. 6c).Kardiale weefsel van MT toestande is vir ses dae aan normale rek (MT (Normaal)) of oorrek toestande (MT (OS)) onderwerp.Reeds na vier dae in kultuur was die hipertrofiese biomerker NT-ProBNP aansienlik verhoog in die medium onder MT (OS) toestande in vergelyking met MT (normale) toestande (Fig. 7a).Daarbenewens, na ses dae van verbouing, het die selgrootte in MT (OS) (Fig. 7b) aansienlik toegeneem in vergelyking met dele van MT-hart (normaal).Daarbenewens is NFATC4-kerntranslokasie aansienlik verhoog in oorgestrekte weefsels (Fig. 7c).Hierdie resultate toon die progressiewe ontwikkeling van patologiese hermodellering na hiperdistensie en ondersteun die konsep dat die CTCM-toestel as 'n platform gebruik kan word om rek-geïnduseerde harthipertrofie-sein te bestudeer.
Verteenwoordigende spore van lugkamerdruk, vloeistofkamerdruk en weefselbewegingsmetings bevestig dat kamerdruk vloeistofkamerdruk verander, wat 'n ooreenstemmende beweging van die weefselsny veroorsaak.b Verteenwoordigende rekpersentasie en rektempo-krommes vir normaal gestrekte (oranje) en oorgestrekte (blou) weefselseksies.c Staafgrafiek wat siklustyd aandui (n = 19 snye per groep, van verskillende varke), sametrekkingstyd (n = 18-19 snye per groep, van verskillende varke), ontspanningstyd (n = 19 snye per groep, van verskillende varke) ), amplitude van weefselbeweging (n = 14 snye/groep snelheid, vanaf verskillende skywe/groep, snelheid, vanaf verskillende skywe/groep, 4 skywe, van verskillende varke, verskillende varke) en piekverslappingstempo (n = 14 (D0), 15 (D6) ) seksies/groepe) van verskillende varke), het tweestert Student se t-toets geen betekenisvolle verskil in enige parameter getoon nie, wat aandui dat hierdie parameters konstant gebly het gedurende 6 dae van kweek met oorspanning.Foutstawe verteenwoordig die gemiddelde ± standaardafwyking.
'n Staafgrafiek-kwantifikasie van NT-ProBNP-konsentrasie in kweekmedia vanaf hartskywe gekweek onder MT normale rek (Norm) of oorstrek (OS) toestande (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, en D4 MTOS) skywe/groep van verskillende varke, is tweerigtingvergelyking, ANOpVA in vergelyking met normaal uitgevoer. 'n Staafgrafiek-kwantifikasie van NT-ProBNP-konsentrasie in kweekmedia vanaf hartskywe gekweek onder MT normale rek (Norm) of oorstrek (OS) toestande (n ​​= 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, en D4 MTOS) snye/groep van verskillende A**NO's, twee-rigting, is vergeleke met rek uitgevoer.Kwantitatiewe histogram van NT-ProBNP konsentrasie in kweekmedium van hartskywe gekweek onder toestande van normale MT strek (norm) of oorrek (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, en D4).MTOS) skywe /groep van verskillende varke, twee-faktor analise van variansie word uitgevoer;**p < 0,01 vir chroniese maatreëls). **p < 0,01 in vergelyking met normale strek). 'n 在MT 正常拉伸(Norm) 或过度拉伸(OS) 条件下培养的心脏切片培养基中NT-ProBNP 絢度n (D2 MTNorm)、3（D2 MTOS、D4 MTNorm 和D4 MTOS）来自不同猪的切片/组，进行双向方与缛**帯方与刣**析，p < 0.01）. 'n Kwantifisering van NT-ProBNP-konsentrasie in hartskywe gekweek onder MT normale strek (Norm) of oorrek (OS) toestande (n ​​= 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm和D4 MTOS) vanaf verskillende 猪的切䉇 幏幏喑喑发弌动; **in vergelyking met normale strek, p < 0,01).histogram Kwantifisering van NT-ProBNP konsentrasies in hartskywe gekweek onder toestande van normale MT rek (norm) of oorrek (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm) en D4 MTOS) skywe/groep van verskillende varke, tweerigting analise van variansie;**p < 0,01 vir chroniese maatreëls). **p < 0,01 in vergelyking met normale strek). b Verteenwoordigende beelde vir hartskywe gekleur met troponien-T en WGA (links) en selgrootte kwantifisering (regs) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) selle/groep van 10 verskillende snye van verskillende varke, Tweestert Student t-toets word vergelyk met normaal 0; ****0 < 1 01). b Verteenwoordigende beelde vir hartskywe gekleur met troponien-T en WGA (links) en selgrootte-kwantifikasie (regs) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) selle/groep van 10 verskillende snye van verskillende varke, Tweestert Student t-toets word met normaal vergelyk 0; ****00 <1). b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т en АЗП (слева) en количестолениногос права) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) клеток/группу из 10 разных срезов от разных свиней, два- провохдит entа; ****p < 0,0001 vir сравнению с нормальным растяжением). b Verteenwoordigende beelde van hartafdelings wat met troponien-T en AZP (links) gekleur is en selgrootte-kwantifikasie (regs) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) selle/groep van 10 verskillende snitte van verskillende varke, tweestert Student se t-toets is uitgevoer met 0; ****0p0 <1 is vergelyk met 0; b 用肌钙蛋白-T 和WGA（左）和细胞大小量化（右）染色的心脏切片的（左）和细胞大小量化（右）染色的心脏切片的（左）和细胞大小量化（右）染色的心脏切片的代表性），来自不同猪的10 个不同切片的369（D6 MTNorm）细胞/组，两进行有鸎与季生有鸎季生比，****p < 0,0001）. b Verteenwoordigende beelde van hartskywe wat met calcarein-T en WGA (links) gekleur is en selgrootte (regs) (n = 330 (D6 MTOS), 369 van 10 verskillende skywe (D6 MTNorm)) Selle/组，两方法有埾学电 ，，两方法有埾学电；par. 1). b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т en АЗП (слева) en количестравенная (количестравеная) n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) of 10 paaiemente van разных свиней Клетки/группа, двустороСние критер,0,0p ****; сравнению с нормальным растяжением). b Verteenwoordigende beelde van hartafdelings wat met troponien-T en AZP (links) gekleur is en kwantifisering van selgrootte (regs) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) van 10 verskillende seksies van verskillende varke) Selle/groep, tweestertmaatstaf Student se t;****p < 0,0001 in vergelyking met normale spanning). c Verteenwoordigende beelde vir dag 0 en dag 6 MTOS-hartskywe immuungemerk vir troponien-T en NFATC4 en kwantifisering van die translokasie van NFATC4 na die kerne van CM's (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) snye/groep van verskillende varke, Tweestert Student 0; 5-p toets word uitgevoer. c Verteenwoordigende beelde vir dag 0 en dag 6 MTOS-hartskywe immuungemerk vir troponien-T en NFATC4 en kwantifisering van die translokasie van NFATC4 na die kerne van CM's (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) snye/groep van verskillende varke , Twee-stert <-toets word uitgevoer;0p-toets is uitgevoer; c Репрезентативные изображения для срезов сердца 0 en 6 дней MTOS, иммуномеченых тропонина-Т en NFATC4, en коколна ции NFATC4 в ядра кавернозных клеток (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срезов/группу от разных свиней , выдуполняется та; *p < 0,05). c Verteenwoordigende beelde vir hartafdelings by 0 en 6 dae MTOS, immuungemerk vir troponien-T en NFATC4, en kwantifisering van NFATC4-translokasie in die kern van kaverneuse selle (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) snye/groep van verskillende varke) het twee-sterttoets uitgevoer Student';*p < 0,05). c 用于肌钙蛋白-T 和NFATC4 免疫标记的第0 天和第6 天MTOS 心脏切片的代表性，第的NFATC4 易位至CM 细胞核的量化（n = 4 (D0)、3 (D6 MTOS) 切片/组, 进行双尾学锟「t 检0) 。；0) c Verteenwoordigende beelde van kalkanien-T- en NFATC4-immunolabelering 第0天和第6天MTOS-hartskywe, en NFATC4 van verskillende NFATC4-易位至CM-selkern-hoeveelheid化 (n = 4 (D0), 化 族族 鈻 , 3 / MTOS, 缇 , 缇 , 刻尾学生et 电影；*p < 0,05). c Репрезентативные изображения срезов сердца MTOS op 0 en 6 dae vir иммуномаркировки тропонином-Т en NFATC4-metodes ции NFATC4 в ядра CM от разных свиней (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срез/группа, два- хвостатый t-критерий t-критерий < Стьюю; 5). c Verteenwoordigende beelde van MTOS-hartskywe op dag 0 en 6 vir troponien-T- en NFATC4-immunolabelering en kwantifisering van NFATC4-translokasie in die kern van CM van verskillende varke (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) snye/groep, tweestert <' -scriterium; *p Student).Foutstawe verteenwoordig gemiddelde ± standaardafwyking.
Translationele kardiovaskulêre navorsing vereis sellulêre modelle wat die kardiale omgewing akkuraat weergee.In hierdie studie is 'n CTCM-toestel ontwikkel en gekarakteriseer wat ultradun dele van die hart kan stimuleer.Die CTCM-stelsel sluit fisiologies gesinchroniseerde elektromeganiese stimulasie en T3- en Dex-vloeistofverryking in.Wanneer varkhartseksies aan hierdie faktore blootgestel is, het hul lewensvatbaarheid, strukturele integriteit, metaboliese aktiwiteit en transkripsionele uitdrukking dieselfde gebly as in vars hartweefsel na 12 dae van kweek.Daarbenewens kan oormatige strek van hartweefsel hipertrofie van die hart veroorsaak wat deur hiperekstensie veroorsaak word.Oor die algemeen ondersteun hierdie resultate die kritieke rol van fisiologiese kultuurtoestande in die handhawing van 'n normale kardiale fenotipe en bied 'n platform vir dwelmsifting.
Baie faktore dra by tot die skep van 'n optimale omgewing vir die funksionering en oorlewing van kardiomiosiete.Die mees ooglopende van hierdie faktore hou verband met (1) intersellulêre interaksies, (2) elektromeganiese stimulasie, (3) humorale faktore en (4) metaboliese substrate.Fisiologiese sel-tot-sel-interaksies vereis komplekse driedimensionele netwerke van veelvuldige seltipes wat deur 'n ekstrasellulêre matriks ondersteun word.Sulke komplekse sellulêre interaksies is moeilik om in vitro te rekonstrueer deur mede-kultuur van individuele seltipes, maar kan maklik bereik word deur die organotipiese aard van hartafdelings te gebruik.
Meganiese strek en elektriese stimulasie van kardiomiosiete is krities vir die handhawing van kardiale fenotipe33,34,35.Terwyl meganiese stimulasie wyd gebruik is vir hiPSC-CM kondisionering en rypwording, het verskeie elegante studies onlangs gepoog om meganiese stimulasie van hartskywe in kultuur met behulp van eenassige laai.Hierdie studies toon dat 2D eenassige meganiese laai 'n positiewe uitwerking op die fenotipe van die hart tydens kweek het.In hierdie studies is dele van die hart óf gelaai met isometriese trekkragte17, lineêre outotoniese laai18, óf die hartsiklus is herskep deur gebruik te maak van kragomskakelaarterugvoer en spanningaandrywings.Hierdie metodes gebruik egter eenassige weefselstrek sonder omgewingsoptimalisering, wat lei tot die onderdrukking van baie kardiale gene of ooruitdrukking van gene wat met abnormale rekreaksies geassosieer word.Die CTCM wat hier beskryf word, verskaf 'n 3D elektromeganiese stimulus wat die natuurlike hartsiklus naboots in terme van siklustyd en fisiologiese strek (25% strek, 40% sistool, 60% diastool en 72 slae per minuut).Alhoewel hierdie driedimensionele meganiese stimulasie alleen nie voldoende is om weefselintegriteit te handhaaf nie, is 'n kombinasie van humorale en meganiese stimulasie met behulp van T3/Dex nodig om weefsellewensvatbaarheid, funksie en integriteit voldoende te handhaaf.
Humorale faktore speel 'n belangrike rol in die modulering van die volwasse hartfenotipe.Dit is uitgelig in HiPS-CM studies waarin T3 en Dex by kultuurmedia gevoeg is om sel rypwording te versnel.T3 kan die vervoer van aminosure, suikers en kalsium oor selmembrane beïnvloed36.Daarbenewens bevorder T3 MHC-α uitdrukking en MHC-β afregulering, wat die vorming van vinnige twitch miofibrille in volwasse kardiomiosiete bevorder in vergelyking met stadige twitch miofibrille in fetale CM.T3-tekort by hipotiroïedpasiënte lei tot die verlies van miofibrillêre bande en 'n verminderde tempo van toonontwikkeling37.Dex werk op glukokortikoïedreseptore en daar is getoon dat dit miokardiale kontraktiliteit in geïsoleerde perfuseerde harte verhoog;38 hierdie verbetering word vermoedelik verwant aan die effek op kalsiumdeposito-gedrewe toetrede (SOCE) 39,40.Daarbenewens bind Dex aan sy reseptore, wat 'n breë intrasellulêre reaksie veroorsaak wat immuunfunksie en inflammasie onderdruk30.
Ons resultate dui daarop dat fisiese meganiese stimulasie (MS) algehele kultuurprestasie verbeter het in vergelyking met Ctrl, maar nie daarin geslaag het om lewensvatbaarheid, strukturele integriteit en hartuitdrukking oor 12 dae in kultuur te handhaaf nie.In vergelyking met Ctrl, het byvoeging van T3 en Dex tot CTCM (MT) kulture lewensvatbaarheid verbeter en soortgelyke transkripsieprofiele, strukturele integriteit en metaboliese aktiwiteit met vars hartweefsel vir 12 dae gehandhaaf.Daarbenewens, deur die graad van weefselstrek te beheer, is 'n hiperekstensie-geïnduseerde kardiale hipertrofie-model geskep met behulp van STCM, wat die veelsydigheid van die STCM-stelsel illustreer.Daar moet kennis geneem word dat alhoewel kardiale hermodellering en fibrose gewoonlik ongeskonde organe behels waarvan die sirkulerende selle die toepaslike sitokiene sowel as fagositose en ander hermodelleringsfaktore kan verskaf, dele van die hart steeds die fibrotiese proses kan naboots in reaksie op stres en trauma.in miofibroblaste.Dit is voorheen in hierdie kardiale snymodel geëvalueer.Daar moet kennis geneem word dat CTCM-parameters gemoduleer kan word deur druk/elektriese amplitude en frekwensie te verander om baie toestande soos tagikardie, bradikardie en meganiese sirkulatoriese ondersteuning (meganiese onbelaaide hart) te simuleer.Dit maak die stelsel 'n medium deurset vir dwelmtoetsing.Die vermoë van CTCM om oorinspanning-geïnduseerde harthipertrofie te modelleer baan die weg vir die toets van hierdie stelsel vir persoonlike terapie.Ten slotte, die huidige studie demonstreer dat meganiese strek en humorale stimulasie van kritieke belang is vir die handhawing van die kultuur van hartweefselafdelings.
Alhoewel die data wat hier aangebied word, daarop dui dat CTCM 'n baie belowende platform is vir die modellering van ongeskonde miokardium, het hierdie kultuurmetode 'n paar beperkings.Die hoofbeperking van CTCM-kultuur is dat dit deurlopende dinamiese meganiese spanning op die skywe plaas, wat die vermoë uitsluit om aktief kardiale snykontraksies tydens elke siklus te monitor.Daarbenewens, as gevolg van die klein grootte van kardiale afdelings (7 mm), is die vermoë om sistoliese funksie buite kultuurstelsels te evalueer met behulp van tradisionele kragsensors beperk.In die huidige manuskrip oorkom ons hierdie beperking gedeeltelik deur optiese spanning as 'n aanduiding van kontraktiele funksie te evalueer.Hierdie beperking sal egter verdere werk verg en kan in die toekoms aangespreek word deur die bekendstelling van metodes vir optiese monitering van die funksie van hartskywe in kultuur, soos optiese kartering met behulp van kalsium en spanningsensitiewe kleurstowwe.Nog 'n beperking van CTCM is dat die werksmodel nie fisiologiese stres (voorlaai en nalading) manipuleer nie.In CTCM is druk in teenoorgestelde rigtings geïnduseer om 25% fisiologiese strek in diastool (volle rek) en sistool (lengte van sametrekking tydens elektriese stimulasie) in baie groot weefsels weer te gee.Hierdie beperking moet in toekomstige CTCM-ontwerpe verwyder word deur voldoende druk op die hartweefsel van beide kante en deur die presiese druk-volume-verhoudings wat in die kamers van die hart voorkom, toe te pas.
Die oorrek-geïnduseerde hermodellering wat in hierdie manuskrip gerapporteer word, is beperk tot die nabootsing van hipertrofiese hiperstrek-seine.Hierdie model kan dus help met die studie van strek-geïnduseerde hipertrofiese sein sonder die behoefte aan humorale of neurale faktore (wat nie in hierdie stelsel bestaan ​​nie).Verdere studies is nodig om die veelheid van CTCM te verhoog, byvoorbeeld, gesamentlike kweek met immuunselle, sirkulerende plasma humorale faktore, en innervering wanneer gesamentlike kweek met neuronale selle sal die moontlikhede van siektemodellering met CTCM verbeter.
Dertien varke is in hierdie studie gebruik.Alle diereprosedures is in ooreenstemming met institusionele riglyne uitgevoer en is deur die Universiteit van Louisville se Institusionele Dieresorg- en Gebruikskomitee goedgekeur.Die aortaboog is vasgeklem en die hart is geperfuseer met 1 L steriele kardioplegie (110 mM NaCl, 1.2 mM CaCl2, 16 mM KCl, 16 mM MgCl2, 10 mM NaHCO3, 5 U/mL heparien, pH tot 7.4); die harte is in yskoue kardioplegiese oplossing bewaar totdat dit na die laboratorium vervoer is op ys wat gewoonlik <10 min. die harte is in yskoue kardioplegiese oplossing bewaar totdat dit na die laboratorium vervoer is op ys wat gewoonlik <10 min. сердца хранили in ледяном кардиоплегическом растворе до транспортировки in лабораторию на льду, что обанично <10m. harte is in yskoue kardioplegiese oplossing gestoor tot vervoer na die laboratorium op ys, wat gewoonlik <10 min.将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10。逛将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10。逛 Держите сердца в ледяной кардиоплегии до транспортировки in лабораторию op льду, teen <10 minute. Hou harte op ys kardioplegie tot vervoer na die laboratorium op ys, gewoonlik <10 min.
Die CTCM-toestel is ontwikkel in SolidWorks rekenaargesteunde ontwerp (CAD) sagteware.Die kultuurkamers, verdelers en lugkamers is gemaak van CNC helder akriel plastiek.Die rugsteunring van 7 mm deursnee is gemaak van hoëdigtheid poliëtileen (HDPE) in die middel en het 'n o-ringgroef om die silikoon-o-ring te akkommodeer wat gebruik word om die media daaronder te seël.'n Dun silikamembraan skei die kultuurkamer van die skeidingsplaat.Die silikoonmembraan is lasergesny van 0.02″ dik silikoonvel en het 'n hardheid van 35A.Die onderste en boonste silikoonpakkies is lasergesny van 1/16″ dik silikoonplaat en het 'n hardheid van 50A.316L vlekvrye staal skroewe en vlerkmoere word gebruik om die blok vas te maak en 'n lugdigte seël te skep.
'n Toegewyde gedrukte stroombaanbord (PCB) is ontwerp om met die C-PACE-EM-stelsel geïntegreer te word.Die Switserse masjienverbindingssokke op die PCB is aan grafietelektrodes verbind deur silwerbedekte koperdrade en brons 0-60 skroewe wat in die elektrodes vasgeskroef is.Die gedrukte stroombaanbord word in die deksel van die 3D-drukker geplaas.
Die CTCM-toestel word beheer deur 'n programmeerbare pneumatiese aktuator (PPD) wat 'n beheerde sirkulasiedruk soortgelyk aan 'n hartsiklus skep.Soos die druk binne die lugkamer toeneem, brei die buigsame silikoonmembraan opwaarts uit, wat die medium onder die weefselplek dwing.Die area van weefsel sal dan gestrek word deur hierdie uitsetting van vloeistof, wat die fisiologiese uitbreiding van die hart tydens diastool naboots.Op die hoogtepunt van ontspanning is elektriese stimulasie deur grafietelektrodes toegepas, wat die druk in die lugkamer verminder en sametrekking van weefselafdelings veroorsaak het.Binne die pyp is 'n hemostatiese klep met 'n druksensor om die druk in die lugstelsel op te spoor.Die druk wat deur die druksensor waargeneem word, word toegepas op 'n dataversamelaar wat aan die skootrekenaar gekoppel is.Dit laat deurlopende monitering van die druk binne die gaskamer toe.Toe die maksimum kamerdruk bereik is (standaard 80 mmHg, 140 mmHg OS), is die data-verkrygingstoestel beveel om 'n sein na die C-PACE-EM-stelsel te stuur om 'n bifasiese spanningsein vir 2 ms, gestel op 4 V, te genereer.
Hartseksies is verkry en kultuurtoestande in 6 putte is soos volg uitgevoer: Dra die geoesde harte van die oordraghouer oor na 'n skinkbord wat koue (4° C.) kardioplegie bevat.Die linkerventrikel is met 'n steriele lem geïsoleer en in stukke van 1-2 cm3 gesny.Hierdie weefselblokke is met weefselkleefmiddel aan weefselstutte geheg en in 'n vibrerende mikrotoomweefselbad geplaas wat Tyrode se oplossing bevat en deurlopend suurstof (3 g/L 2,3-butaandioonmonooksim (BDM), 140 mM NaCl (8.18 g) . , 6 mM KCl (0.447 mM), (0.447 mM) , 810 mM lukose (D) .38 g), 1 mM MgCl2 (1 ml 1 M oplossing), 1.8 mM CaCl2 ( 1.8 ml 1 M oplossing), tot 1 L ddH2O).Die vibrerende mikrotoom is ingestel om 300 µm dik skywe te sny teen 'n frekwensie van 80 Hz, 'n horisontale vibrasie amplitude van 2 mm, en 'n spoed van 0.03 mm/s.Die weefselbad is deur ys omring om die oplossing koel te hou en die temperatuur is op 4°C gehandhaaf.Dra weefselseksies van die mikrotoombad na 'n inkubasiebad wat voortdurend geoksigneerde Tyrode-oplossing op ys bevat totdat genoeg snitte vir een kultuurplaat verkry is.Vir transwell-kulture is weefselseksies aan steriele 6 mm wye poliuretaan-ondersteunings geheg en in 6 ml geoptimaliseerde medium geplaas (199 medium, 1x ITS-aanvulling, 10% FBS, 5 ng/ml VEGF, 10 ng/ml FGF-alkalies en 2X antibiotika-antifungus).Elektriese stimulasie (10 V, frekwensie 1.2 Hz) is toegepas op die weefselseksies deur die C-Pace.Vir TD toestande is vars T3 en Dex bygevoeg by 100 nM en 1 μM by elke medium verandering.Die medium is versadig met suurstof voordat dit 3 keer per dag vervang word.Weefselafdelings is in 'n broeikas gekweek by 37°C en 5% CO2.
Vir CTCM-kulture is weefselsnitte op 'n pasgemaakte 3D-drukker geplaas in 'n Petri-bak wat gemodifiseerde Tyrode se oplossing bevat.Die toestel is ontwerp om die grootte van die sny van die hart met 25% van die oppervlakte van die ondersteuningsring te vergroot.Dit word gedoen sodat die gedeeltes van die hart nie rek nadat dit van Tyrode se oplossing na die medium en tydens diastool oorgedra is nie.Deur histoakrielgom te gebruik, is 300 µm dik dele op 'n steunring van 7 mm in deursnee vasgemaak.Nadat die weefselseksies aan die steunring geheg is, sny die oortollige weefselgedeeltes af en plaas die aangehegte weefselgedeeltes terug in die bad van Tyrode-oplossing op ys (4°C) totdat genoeg snitte vir een toestel voorberei is.Die totale verwerkingstyd vir alle toestelle moet nie 2 uur oorskry nie.Nadat 6 weefselseksies aan hul ondersteuningsringe geheg is, is die CTCM-toestel saamgestel.Die CTCM-kultuurkamer is vooraf gevul met 21 ml vooraf-geoksigeneerde medium.Dra die weefselafdelings oor na die kultuurkamer en verwyder enige lugborrels versigtig met 'n pipet.Die weefselgedeelte word dan in die gat gelei en liggies in plek gedruk.Plaas laastens die elektrodedop op die toestel en dra die toestel oor na die broeikas.Koppel dan die CTCM aan die lugbuis en die C-PACE-EM-stelsel.Die pneumatiese aktuator maak oop en die lugklep maak die CTCM oop.Die C-PACE-EM-stelsel is gekonfigureer om 4 V teen 1.2 Hz te lewer tydens bifasiese tempo vir 2 ms.Die medium is twee keer per dag verander en die elektrodes is een keer per dag verander om ophoping van grafiet op die elektrodes te vermy.Indien nodig, kan weefselseksies uit hul kultuurputte verwyder word om enige lugborrels wat moontlik onder hulle geval het, uit te dryf.Vir MT-behandelingstoestande is T3/Dex vars bygevoeg met elke mediumverandering met 100 nM T3 en 1 μM Dex.Die CTCM-toestelle is in 'n broeikas gekweek by 37°C en 5% CO2.
Om uitgerekte trajekte van hartskywe te verkry, is 'n spesiale kamerastelsel ontwikkel.'n SLR-kamera (Canon Rebel T7i, Canon, Tokio, Japan) is gebruik met 'n Navitar Zoom 7000 18-108mm makrolens (Navitar, San Francisco, CA).Visualisering is by kamertemperatuur uitgevoer nadat die medium met vars medium vervang is.Die kamera is teen 'n hoek van 51° geplaas en video word teen 30 rame per sekonde opgeneem.Eerstens is oopbronsagteware (MUSCLEMOTION43) saam met Image-J gebruik om die beweging van hartskywe te kwantifiseer.Die masker is geskep met MATLAB (MathWorks, Natick, MA, VSA) om streke van belang te definieer vir kloppende hartskywe om geraas te vermy.Handmatig gesegmenteerde maskers word op alle beelde in 'n raamvolgorde toegepas en dan na die MUSCLEMOTION-inprop oorgedra.Spierbeweging gebruik die gemiddelde intensiteit van die pixels in elke raam om sy beweging relatief tot die verwysingsraam te kwantifiseer.Data is aangeteken, gefiltreer en gebruik om siklustyd te kwantifiseer en weefselrek tydens die hartsiklus te assesseer.Die opgeneemde video is na-verwerk met behulp van 'n eerste-orde nul-fase digitale filter.Om weefselrek (piek-tot-piek) te kwantifiseer, is piek-tot-piek analise uitgevoer om te onderskei tussen pieke en daltjies in die aangetekende sein.Daarbenewens word onttrekking uitgevoer met behulp van 'n 6de orde polinoom om seinverdryf uit te skakel.Programkode is in MATLAB ontwikkel om globale weefselbeweging, siklustyd, ontspanningstyd en sametrekkingstyd te bepaal (Aanvullende Programkode 44).
Vir spanningsanalise, met dieselfde video's wat geskep is vir meganiese rekassessering, het ons eers twee beelde opgespoor wat bewegingspieke (die hoogste (boonste) en laagste (onderste) bewegingspunte) volgens die MUSCLEMOTION-sagteware verteenwoordig.Ons het toe die weefselstreke gesegmenteer en 'n vorm van skadu-algoritme op die gesegmenteerde weefsel toegepas (Aanvullende Fig. 2a).Die gesegmenteerde weefsel is dan in tien onderoppervlakke verdeel, en die spanning op elke oppervlak is bereken deur die volgende vergelyking te gebruik: Vervorming = (Sup-Sdown)/Sdown, waar Sup en Sdown onderskeidelik die afstande van die vorm vanaf die boonste en onderste skaduwees van die stof is (Aanvullende Fig. .2b).
Hartafdelings is vir 48 uur in 4% paraformaldehied gefixeer.Vaste weefsels is gedehidreer in 10% en 20% sukrose vir 1 uur, dan in 30% sukrose oornag.Die gedeeltes is dan ingebed in optimum snytemperatuur verbinding (OCT verbinding) en geleidelik in 'n isopentaan/droë ysbad gevries.Berg OKT-inbedblokke by -80 °C tot skeiding.Skyfies is voorberei as snitte met 'n dikte van 8 μm.
Om OCT van hartafdelings te verwyder, verhit die skyfies op 'n verhittingsblok by 95 °C vir 5 min.Voeg 1 ml PBS by elke skyfie en inkubeer vir 30 minute by kamertemperatuur, deurdring dan die afdelings deur 0.1% Triton-X in PBS te stel vir 15 minute by kamertemperatuur.Om te verhoed dat nie-spesifieke teenliggaampies aan die monster bind, voeg 1 ml 3% BSA-oplossing by skyfies en inkubeer vir 1 uur by kamertemperatuur.Die BSA is dan verwyder en die skyfies is met PBS gewas.Merk elke monster met 'n potlood.Primêre teenliggaampies (verdun 1:200 in 1% BSA) (connexin 43 (Abcam; #AB11370), NFATC4 (Abcam; #AB99431) en troponin-T (Thermo Scientific; #MA5-12960) is oor 90 minute bygevoeg (verdunde teen-liggaampies: 200) teen 1% BSA, en dan sekondêr teen 1 mous. of 488 (Thermo Scientific; #A16079), teen konyn Alexa Fluor 594 (Thermo Scientific; #T6391) vir 'n addisionele 90 minute Was 3 keer met PBS Om teikenkleuring van agtergrond te onderskei, het ons slegs die sekondêre teenliggaam as 'n kontrole gebruik. Uiteindelik is DAPI in 'n skuins gewas en 'n shield geplaas. met naellak. -x vergroting) en Keyence mikroskoop met 40x vergroting.
WGA-Alexa Fluor 555 (Thermo Scientific; #W32464) teen 5 μg/ml in PBS is vir WGA-kleuring gebruik en vir 30 minute by kamertemperatuur op vaste afdelings toegedien.Die skyfies is dan met PBS gewas en Soedan swart is by elke skyfie gevoeg en vir 30 minute geïnkubeer.Die skyfies is dan met PBS gewas en vectashield-inbedmedium is bygevoeg.Skyfies is op 'n Keyence-mikroskoop teen 40x vergroting gevisualiseer.
OCT is uit die monsters verwyder soos hierbo beskryf.Nadat die OCT verwyder is, dompel die skyfies oornag in Bouin se oplossing.Die skyfies is dan vir 1 uur met gedistilleerde water afgespoel en dan vir 10 minute in 'n Bibrich-aalwynsuurfuchsin-oplossing geplaas.Daarna is die skyfies met gedistilleerde water gewas en vir 10 minute in 'n oplossing van 5% fosfomolibdeen/5% fosfowolfraamsuur geplaas.Sonder om te spoel, plaas die skyfies direk in die anilienblou oplossing vir 15 minute.Daarna is die skyfies met gedistilleerde water gewas en vir 2 minute in 'n 1% asynsuuroplossing geplaas.Skyfies is in 200 N etanol gedroog en na xileen oorgeplaas.Gekleurde skyfies is gevisualiseer met behulp van 'n Keyence-mikroskoop met 'n 10x-objektief.Fibrose area persentasie is gekwantifiseer met behulp van Keyence Analyzer sagteware.
CyQUANT™ MTT Cell Viability Assay (Invitrogen, Carlsbad, CA), katalogusnommer V13154, volgens die vervaardiger se protokol met enkele wysigings.In die besonder is 'n chirurgiese pons met 'n deursnee van 6 mm gebruik om eenvormige weefselgrootte tydens MTT-analise te verseker.Weefsels is individueel uitgeplaat in die putte van 'n 12-put plaat wat MTT substraat bevat volgens die vervaardiger se protokol.Die snitte word vir 3 uur by 37° C. geïnkubeer en die lewende weefsel metaboliseer die MTT-substraat om 'n pers formazan-verbinding te vorm.Vervang die MTT-oplossing met 1 ml DMSO en inkubeer by 37 °C vir 15 minute om pers formazan uit hartafdelings te onttrek.Monsters is 1:10 verdun in DMSO in 96-putte deursigtige bodemplate en pers kleurintensiteit is gemeet by 570 nm met behulp van 'n Cytation plaatleser (BioTek).Lesings is genormaliseer na die gewig van elke sny van die hart.
Hartskyfiemedia is vervang met media wat 1 μCi/ml [5-3H]-glukose bevat (Moravek Biochemicals, Brea, CA, VSA) vir glukosebenuttingstoets soos voorheen beskryf.Na 4 uur se inkubasie, voeg 100 µl medium by 'n oop mikrosentrifugebuis wat 100 µl 0.2 N HCl bevat.Daarna is die buis in 'n skitterbuis geplaas wat 500 μl dH2O bevat om [3H]2O vir 72 uur by 37°C te verdamp.Verwyder dan die mikrosentrifugebuis uit die skitterbuis en voeg 10 ml skittervloeistof by.Skintillasietellings is uitgevoer met behulp van 'n Tri-Carb 2900TR vloeistofscintillasie-ontleder (Packard Bioscience Company, Meriden, CT, VSA).Glukosebenutting is dan bereken met inagneming van [5-3H]-glukose-spesifieke aktiwiteit, onvolledige ewewig en agtergrond, verdunning van [5-3H]-tot ongemerkte glukose, en die doeltreffendheid van die skitterteller.Die data word genormaliseer na die massa van dele van die hart.
Na weefselhomogenisering in Trizol, is RNA uit hartafdelings geïsoleer deur gebruik te maak van die Qiagen miRNeasy Micro Kit #210874 volgens die vervaardiger se protokol.RNAsec-biblioteekvoorbereiding, volgordebepaling en data-analise is soos volg uitgevoer:
1 μg RNA per monster is as beginmateriaal vir die voorbereiding van die RNA-biblioteek gebruik.Volgordebepalingsbiblioteke is gegenereer met behulp van die NEBNext UltraTM RNA Library Preparation Kit vir Illumina (NEB, VSA) na aanleiding van die vervaardiger se aanbevelings, en indekskodes is by die kenmerkreekse vir elke monster gevoeg.Kortliks, mRNA is gesuiwer van totale RNA met behulp van magnetiese krale wat met poli-T oligonukleotiede geheg is.Fragmentasie word uitgevoer met behulp van tweewaardige katione by hoë temperatuur in NEBNext First Strand Synthesis Reaction Buffer (5X).Eerste string cDNA is gesintetiseer deur gebruik te maak van ewekansige heksamer primers en M-MuLV tru-transkripsie (RNase H-).Die tweede string cDNA word dan gesintetiseer deur gebruik te maak van DNA-polimerase I en RNase H. Die oorblywende oorhange word deur eksonuklease/polimerase-aktiwiteit na stomp punte omgeskakel.Na adenilering van die 3'-punt van die DNA-fragment, word 'n NEBNext Adapter met 'n haarnaaldlusstruktuur daaraan geheg om dit vir hibridisasie voor te berei.Vir seleksie van cDNA-fragmente van voorkeurlengte 150-200 bp.biblioteekfragmente is gesuiwer deur gebruik te maak van die AMPure XP-stelsel (Beckman Coulter, Beverly, VSA).Daarna is 3 μl GEBRUIKER Ensiem (NEB, VSA) met grootte-geselekteerde cDNA gelig met 'n adapter gebruik vir 15 minute by 37°C en dan vir 5 minute by 95°C voor PCR.PCR is dan uitgevoer met behulp van Phusion High-Fidelity DNA polimerase, universele PCR primers en Index (X) primers.Laastens is PCR-produkte gesuiwer (AMPure XP-stelsel) en biblioteekkwaliteit geassesseer op 'n Agilent Bioanalyzer 2100-stelsel.Die cDNA-biblioteek is dan met behulp van 'n Novaseq-volgorder georden.Rou beeldlêers van Illumina is omgeskakel na rou leeswerk met behulp van CASAVA Base Calling.Rou data word gestoor in FASTQ(fq)-formaat lêers wat leesreekse en ooreenstemmende basiskwaliteite bevat.Kies HISAT2 om gefiltreerde volgordebepalinglesings by die Sscrofa11.1-verwysingsgenoom te pas.Oor die algemeen ondersteun HISAT2 genome van enige grootte, insluitend genome groter as 4 miljard basisse, en verstekwaardes word vir die meeste parameters gestel.Splitsingslesings vanaf RNA Seq-data kan doeltreffend in lyn gebring word met behulp van HISAT2, die vinnigste stelsel wat tans beskikbaar is, met dieselfde of beter akkuraatheid as enige ander metode.
Die oorvloed van transkripsies weerspieël direk die vlak van geenuitdrukking.Geenuitdrukkingvlakke word geassesseer deur die oorvloed van transkripsies (volgordetelling) wat met die genoom of eksons geassosieer word.Die aantal lesings is eweredig aan geenuitdrukkingsvlakke, geenlengte en volgordebepalingsdiepte.FPKM (fragmente per duisend basispare van transkripsie georden per miljoen basispare) is bereken en P-waardes van differensiële uitdrukking is bepaal met behulp van die DESeq2-pakket.Ons het toe die vals ontdekkingskoers (FDR) vir elke P-waarde bereken deur gebruik te maak van die Benjamini-Hochberg-metode9 gebaseer op die ingeboude R-funksie "p.adjust".
RNA wat uit hartseksies geïsoleer is, is omgeskakel na cDNA teen 'n konsentrasie van 200 ng/μl met behulp van die SuperScript IV Vilo Master-mengsel van Thermo (Thermo, kat.nr. 11756050).Kwantitatiewe RT-PCR is uitgevoer met behulp van 'n Applied Biosystems Endura Plate Microamp 384-put deursigtige reaksieplaat (Thermo, kat.nr. 4483319) en mikroamp-optiese kleefmiddel (Thermo, kat.nr. 4311971).Die reaksiemengsel het bestaan ​​uit 5 µl Taqman Fast Advanced Master-mengsel (Thermo, kat # 4444557), 0.5 µl Taqman Primer en 3.5 µl H2O gemeng per put.Standaard qPCR-siklusse is uitgevoer en CT-waardes is gemeet met behulp van 'n Applied Biosystems Quantstudio 5-intydse PCR-instrument (384-put module; produk # A28135).Taqman primers is aangekoop by Thermo (GAPDH (Ss03375629_u1), PARP12 (Ss06908795_m1), PKDCC (Ss06903874_m1), CYGB (Ss06900188_m1), RGL1 (Ss8906_05m1), 890608m1 (Ss890608m1) mH), GATA4 (Ss03383805_u1), GJA1 (Ss03374839_u1), COL1A2 (Ss03375009_u1), COL3A1 (Ss04323794_m1), ACTA2 (Ss04245588_m1s) die steekproefwaarde van GDH genormaliseer.
Mediavrystelling van NT-ProBNP is geassesseer met behulp van die NT-ProBNP-stel (vark) (Kat. No. MBS2086979, MyBioSource) volgens die vervaardiger se protokol.Kortliks, 250 µl van elke monster en standaard is in duplikaat by elke put gevoeg.Onmiddellik nadat die monster bygevoeg is, voeg 50 µl Assay Reagens A by elke put.Skud die plaat liggies en verseël met seëlmiddel.Daarna is die tablette vir 1 uur by 37°C geïnkubeer.Aspireer dan die oplossing en was die putte 4 keer met 350 µl 1X wasoplossing, en inkubeer die wasoplossing elke keer vir 1-2 minute.Voeg dan 100 µl Assay Reagens B per put by en verseël met plaatverseëlaar.Die tablet is liggies geskud en vir 30 minute by 37°C geïnkubeer.Aspireer die oplossing en was die putte 5 keer met 350 µl 1X wasoplossing.Voeg 90 µl substraatoplossing by elke put en verseël die plaat.Inkubeer die plaat by 37°C vir 10-20 minute.Voeg 50 µl stopoplossing by elke put.Die plaat is onmiddellik gemeet met behulp van 'n Cytation (BioTek) plaatleser wat op 450 nm gestel is.
Kragontledings is uitgevoer om die groepgroottes te kies wat >80% krag sal verskaf om 'n 10% absolute verandering in die parameter met 'n 5% Tipe I foutkoers op te spoor. Kragontledings is uitgevoer om die groepgroottes te kies wat >80% krag sal verskaf om 'n 10% absolute verandering in die parameter met 'n 5% Tipe I foutkoers op te spoor. Анализ мощности был выполнен для выбора размеров групп, которые обеспечат >80% maandelikse maatreëls vir verligting van 10% тра с 5% частотой ошибок типа I. Kraganalise is uitgevoer om groepgroottes te kies wat >80% krag sal verskaf om 10% absolute parameterverandering op te spoor met 'n 5% Tipe I-foutkoers.进行功效分析以选择将提供> 80%进行功效分析以选择将提供> 80% Был проведен анализ мощности для выбора размера группы, который обеспечил бы 80% мощности для обнаружения параметров и 5% частоты ошибок типа I. 'n Kraganalise is uitgevoer om 'n groepgrootte te kies wat >80% krag sou verskaf om 10% absolute parameterverandering en 5% tipe I foutkoers op te spoor.Weefselafdelings is lukraak gekies voor die eksperiment.Alle ontledings was toestandblind en monsters is eers gedekodeer nadat alle data ontleed is.GraphPad Prism sagteware (San Diego, CA) is gebruik om alle statistiese ontledings uit te voer. Vir alle statistieke is p-waardes as betekenisvol beskou by waardes <0.05. Vir alle statistieke is p-waardes as betekenisvol beskou by waardes <0,05. Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. Vir alle statistieke is p-waardes as betekenisvol beskou by waardes <0,05.对于所有统计数据，p 值在值<0.05 时被认为是显着的。对于所有统计数据，p 值在值<0.05 时被认为是显着的。 Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. Vir alle statistieke is p-waardes as betekenisvol beskou by waardes <0,05.Tweestert Student se t-toets is op die data uitgevoer met slegs 2 vergelykings.Eenrigting of tweerigting ANOVA is gebruik om betekenis tussen veelvuldige groepe te bepaal.Wanneer post hoc toetse uitgevoer is, is Tukey se regstelling toegepas om rekening te hou met veelvuldige vergelykings.RNAsec data het spesiale statistiese oorwegings by die berekening van FDR en p.adjust soos beskryf in die Metodes afdeling.
Vir meer inligting oor studie-ontwerp, sien die Natuurnavorsingsverslag-abstrak wat aan hierdie artikel gekoppel is.