Dankie dat u Nature.com besoek het. Die blaaierweergawe wat u gebruik, het beperkte CSS-ondersteuning. Vir die beste ervaring beveel ons aan dat u 'n opgedateerde blaaier gebruik (of Verenigbaarheidsmodus in Internet Explorer deaktiveer). Intussen, om voortgesette ondersteuning te verseker, sal ons die webwerf sonder style en JavaScript weergee.
Daar is 'n behoefte aan 'n betroubare in vitro-stelsel wat die fisiologiese omgewing van die hart akkuraat kan reproduseer vir dwelmtoetsing. Die beperkte beskikbaarheid van menslike hartweefselkultuurstelsels het gelei tot onakkurate interpretasies van kardiale geneesmiddeleffekte. Hier het ons 'n kardiale weefselkultuurmodel (KVK) ontwikkel wat elektromeganies hartsnitte stimuleer en fisiologiese strek ondergaan tydens die sistoliese en diastoliese fases van die kardiale siklus. Na 12 dae van kultuur het hierdie benadering die lewensvatbaarheid van hartsnitte gedeeltelik verbeter, maar nie hul strukturele integriteit ten volle behou nie. Daarom het ons na klein molekule-sifting gevind dat die byvoeging van 100 nM trijodotironien (T3) en 1 μM deksametasoon (Dex) tot ons medium die mikrostruktuur van die snitte vir 12 dae gehandhaaf het. In kombinasie met T3/Dex-behandeling het die KVK-stelsel transkripsieprofiele, lewensvatbaarheid, metaboliese aktiwiteit en strukturele integriteit vir 12 dae op dieselfde vlak as vars hartweefsel gehandhaaf. Daarbenewens veroorsaak oormatige strekking van hartweefsel in kultuur hipertrofiese hartseintransduksie, wat bewys lewer vir die vermoë van CTCM om hipertrofiese toestande wat deur hartstrekking veroorsaak word, na te boots. Ten slotte kan CTCM die fisiologie en patofisiologie van die hart in kultuur oor lang tydperke modelleer, wat betroubare geneesmiddelsifting moontlik maak.
Voor kliniese navorsing is betroubare in vitro-stelsels nodig wat die fisiologiese omgewing van die menslike hart akkuraat kan reproduseer. Sulke stelsels moet veranderde meganiese strek, hartklop en elektrofisiologiese eienskappe naboots. Diermodelle word algemeen gebruik as 'n siftingsplatform vir kardiale fisiologie met beperkte betroubaarheid in die weerspieëling van die effekte van geneesmiddels in die menslike hart1,2. Uiteindelik is die Ideale Kardiale Weefselkultuur Eksperimentele Model (CTCM) 'n model wat hoogs sensitief en spesifiek is vir verskeie terapeutiese en farmakologiese intervensies, wat die fisiologie en patofisiologie van die menslike hart3 akkuraat reproduseer. Die afwesigheid van so 'n stelsel beperk die ontdekking van nuwe behandelings vir hartversaking4,5 en het gelei tot geneesmiddelkardiotoksisiteit as 'n belangrike rede vir die verlaat van die mark6.
Oor die afgelope dekade is agt nie-kardiovaskulêre middels uit kliniese gebruik onttrek omdat hulle QT-intervalverlenging veroorsaak wat lei tot ventrikulêre aritmieë en skielike dood7. Dus is daar 'n toenemende behoefte aan betroubare prekliniese siftingsstrategieë om kardiovaskulêre doeltreffendheid en toksisiteit te bepaal. Die onlangse gebruik van mensgeïnduseerde pluripotente stamsel-afgeleide kardiomiosiete (hiPS-CM) in geneesmiddelsifting en toksisiteitstoetsing bied 'n gedeeltelike oplossing vir hierdie probleem. Die onvolwasse aard van hiPS-CM's en die gebrek aan multisellulêre kompleksiteit van hartweefsel is egter groot beperkings van hierdie metode. Onlangse studies het getoon dat hierdie beperking gedeeltelik oorkom kan word deur vroeë hiPS-CM te gebruik om hartweefselhidrogele kort na die aanvang van spontane kontraksies te vorm en elektriese stimulasie geleidelik oor tyd te verhoog. Hierdie hiPS-CM-mikroweefsels het egter nie die volwasse elektrofisiologiese en kontraktiele eienskappe van die volwasse miokardium nie. Daarbenewens het menslike hartweefsel 'n meer komplekse struktuur, bestaande uit 'n heterogene mengsel van verskillende seltipes, insluitend endoteelselle, neurone en stromale fibroblaste, wat met mekaar verbind is deur spesifieke stelle ekstrasellulêre matriksproteïene. Hierdie heterogeniteit van nie-kardiomiosietpopulasies11,12,13 in die volwasse soogdierhart is 'n groot hindernis vir die modellering van hartweefsel met behulp van individuele seltipes. Hierdie groot beperkings beklemtoon die belangrikheid van die ontwikkeling van metodes vir die kweek van intakte miokardiale weefsel onder fisiologiese en patologiese toestande.
Gekweekte dun (300 µm) snitte van die menslike hart het bewys dat dit 'n belowende model van intakte menslike miokardium is. Hierdie metode bied toegang tot 'n volledige 3D-multisellulêre stelsel soortgelyk aan menslike hartweefsel. Tot 2019 was die gebruik van gekweekte hartsnitte egter beperk deur die kort (24 uur) kultuuroorlewing. Dit is te wyte aan 'n aantal faktore, insluitend die gebrek aan fisies-meganiese strek, die lug-vloeistof-koppelvlak en die gebruik van eenvoudige media wat nie die behoeftes van hartweefsel ondersteun nie. In 2019 het verskeie navorsingsgroepe gedemonstreer dat die inkorporering van meganiese faktore in hartweefselkultuurstelsels die kultuurlewe kan verleng, hartuitdrukking kan verbeter en hartpatologie kan naboots. Twee elegante studies 17 en 18 toon dat uniaksiale meganiese belasting 'n positiewe effek op die hartfenotipe tydens kultuur het. Hierdie studies het egter nie die dinamiese driedimensionele fisies-meganiese belasting van die hartsiklus gebruik nie, aangesien hartsnitte met óf isometriese trekkragte 17 óf lineêre ouksotoniese belasting 18 gelaai is. Hierdie metodes van weefselstrek het gelei tot die onderdrukking van baie kardiale gene of die ooruitdrukking van gene wat geassosieer word met abnormale strekresponse. Dit is opmerklik dat Pitoulis et al. 19 'n dinamiese hartsny-kultuurbad vir kardiale siklusrekonstruksie ontwikkel het deur gebruik te maak van kragtransduktor-terugvoer en spanningsaandrywers. Alhoewel hierdie stelsel meer akkurate in vitro-kardiale siklusmodellering moontlik maak, beperk die kompleksiteit en lae deurset van die metode die toepassing van hierdie stelsel. Ons laboratorium het onlangs 'n vereenvoudigde kultuurstelsel ontwikkel deur elektriese stimulasie en 'n geoptimaliseerde medium te gebruik om die lewensvatbaarheid van seksies van vark- en menslike hartweefsel vir tot 6 dae te handhaaf 20,21.
In die huidige manuskrip beskryf ons 'n kardiale weefselkultuurmodel (KVK) wat dele van die varkhart gebruik wat humorale leidrade insluit om driedimensionele kardiale fisiologie en patofisiologiese distensie tydens die kardiale siklus te herhaal. Hierdie KVK kan die akkuraatheid van prekliniese geneesmiddelvoorspelling verhoog tot 'n vlak wat nog nooit tevore bereik is nie, deur 'n koste-effektiewe, middeldeurset-kardiale stelsel te verskaf wat die fisiologie/patofisiologie van die soogdierhart naboots vir prekliniese geneesmiddeltoetsing.
Hemodinamiese meganiese seine speel 'n kritieke rol in die handhawing van kardiomiosietfunksie in vitro 22,23,24. In die huidige manuskrip het ons 'n CTCM (Figuur 1a) ontwikkel wat die volwasse kardiale omgewing kan naboots deur beide elektriese en meganiese stimulasie by fisiologiese frekwensies (1.2 Hz, 72 slae per minuut) te veroorsaak. Om oormatige weefselstrekking tydens diastole te vermy, is 'n 3D-drukapparaat gebruik om weefselgrootte met 25% te verhoog (Fig. 1b). Elektriese pacing wat deur die C-PACE-stelsel geïnduseer is, is getime om 100 ms voor sistole te begin met behulp van 'n data-insamelingstelsel om die kardiale siklus volledig te reproduseer. Die weefselkultuurstelsel gebruik 'n programmeerbare pneumatiese aktuator (LB Engineering, Duitsland) om 'n buigsame silikoonmembraan siklies uit te brei om uitbreiding van die hartskyfies in die boonste kamer te veroorsaak. Die stelsel is aan 'n eksterne luglyn gekoppel deur 'n druktransduktor, wat dit moontlik gemaak het om die druk (± 1 mmHg) en tyd (± 1 ms) akkuraat aan te pas (Fig. 1c).
a Heg die weefselseksie aan die 7 mm-ondersteuningsring, in blou getoon, binne die kweekkamer van die toestel. Die kweekkamer word van die lugkamer geskei deur 'n dun, buigsame silikoonmembraan. Plaas 'n pakking tussen elke kamer om lekkasies te voorkom. Die deksel van die toestel bevat grafietelektrodes wat elektriese stimulasie verskaf. b Skematiese voorstelling van die groot weefseltoestel, gidsring en ondersteuningsring. Die weefselseksies (bruin) word op die oorgrootte toestel geplaas met die gidsring in die groef aan die buitenste rand van die toestel. Gebruik die gids om die ondersteuningsring, wat met weefselakrielkleefmiddel bedek is, versigtig oor die hartweefselseksie te plaas. c Grafiek wat die tyd van elektriese stimulasie toon as 'n funksie van lugkamerdruk wat deur 'n programmeerbare pneumatiese aktuator (PPD) beheer word. 'n Data-insamelingstoestel is gebruik om elektriese stimulasie met behulp van druksensors te sinchroniseer. Wanneer die druk in die kweekkamer die ingestelde drempel bereik, word 'n pulssein na die C-PACE-EM gestuur om elektriese stimulasie te aktiveer. d Beeld van vier CTCM's wat op 'n broeikasrak geplaas is. Vier toestelle is via 'n pneumatiese stroombaan aan een PPD gekoppel, en druksensors word in die hemostatiese klep geplaas om die druk in die pneumatiese stroombaan te monitor. Elke toestel bevat ses weefselafdelings.
Deur 'n enkele pneumatiese aktuator te gebruik, kon ons 4 CTCM-toestelle beheer, wat elk 6 weefselsnitte kon hou (Fig. 1d). In CTCM word die lugdruk in die lugkamer omgeskakel na sinchrone druk in die vloeistofkamer en veroorsaak dit fisiologiese uitbreiding van die hartsnit (Figuur 2a en Aanvullende Film 1). Evaluering van weefselstrekking teen 80 mm Hg. Art. het 'n strekking van weefselsnitte met 25% getoon (Fig. 2b). Daar is getoon dat hierdie persentasie strekking ooreenstem met 'n fisiologiese sarkomeerlengte van 2.2–2.3 µm vir normale hartsnitkontraktiliteit17,19,25. Weefselbeweging is geassesseer met behulp van persoonlike kamera-instellings (Aanvullende Figuur 1). Die amplitude en snelheid van weefselbeweging (Fig. 2c, d) het ooreengestem met strekking tydens die hartsiklus en tyd tydens sistole en diastole (Fig. 2b). Strekking en snelheid van hartweefsel tydens sametrekking en ontspanning het konstant gebly vir 12 dae in kultuur (Fig. 2f). Om die effek van elektriese stimulasie op kontraktiliteit tydens kultuur te evalueer, het ons 'n metode ontwikkel om aktiewe misvorming te bepaal met behulp van 'n skadu-algoritme (Aanvullende Fig. 2a,b) en kon ons onderskei tussen misvormings met en sonder elektriese stimulasie. Dieselfde gedeelte van die hart (Fig. 2f). In die beweegbare gebied van die snit (R6-9) was die spanning tydens elektriese stimulasie 20% hoër as in die afwesigheid van elektriese stimulasie, wat die bydrae van elektriese stimulasie tot kontraktiele funksie aandui.
Verteenwoordigende spore van lugkamerdruk, vloeistofkamerdruk en weefselbewegingsmetings bevestig dat kamerdruk vloeistofkamerdruk verander, wat 'n ooreenstemmende beweging van die weefselsnit veroorsaak. b Verteenwoordigende spore van persentasie strek (blou) van weefselsnitte wat ooreenstem met persentasie strek (oranje). c Die gemete beweging van die hartsnit is in ooreenstemming met die gemete bewegingspoed. (d) Verteenwoordigende trajekte van sikliese beweging (blou lyn) en snelheid (oranje stippellyn) in 'n sny van die hart. e Kwantifisering van siklustyd (n = 19 snye per groep, van verskillende varke), sametrekkingstyd (n = 19 snye per groep), ontspanningstyd (n = 19 snye per groep, van verskillende varke), weefselbeweging (n = 25 snye)/groep van verskillende varke), piek sistoliese snelheid (n = 24(D0), 25(D12) snye/groep van verskillende varke) en piek ontspanningstempo (n=24(D0), 25(D12) snye/groep van verskillende varke). Tweesydige Student se t-toets het geen beduidende verskil in enige parameter getoon nie. f Verteenwoordigende spanningsanalisespore van weefselsnitte met (rooi) en sonder (blou) elektriese stimulasie, tien streeksareas van weefselsnitte van dieselfde snit. Die onderste panele toon die kwantifisering van die persentasieverskil in spanning in weefselsnitte met en sonder elektriese stimulasie in tien areas van verskillende snitte. (n = 8 snye/groep van verskillende varke, Tweesydige Student t-toets word uitgevoer; ****p < 0.0001, **p < 0.01, *p < 0.05). (n = 8 snye/groep van verskillende varke, Tweesydige Student t-toets word uitgevoer; ****p < 0.0001, **p < 0.01, *p < 0.05). (n = 8 syfers/spele van wedrenne, проводится двусторонний t-критерий Стьюдента; ****p<0,0001, ***p<0,01,01,**p<0,01,01. (n = 8 seksies/groep van verskillende varke, tweesydige Student se t-toets; ****p<0.0001, **p<0.01, *p<0.05). （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p < 0.0001，**p < 0.01＀0.5） （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p < 0.0001，**p < 0.01＀0.5） (n = 8 syfers/speel, van разных свиней, двусторонний критерий Стьюдента; ****p <0,0001, **p <0,01, *p <0,05). (n = 8 seksies/groep, van verskillende varke, tweesydige Student se t-toets; ****p<0.0001, **p<0.01, *p<0.05).Foutbalke verteenwoordig die gemiddelde ± standaardafwyking.
In ons vorige statiese biomimetiese hartskyfkultuurstelsel [20, 21] het ons die lewensvatbaarheid, funksie en strukturele integriteit van hartskyfies vir 6 dae gehandhaaf deur elektriese stimulasie toe te pas en die mediumsamestelling te optimaliseer. Na 10 dae het hierdie syfers egter skerp gedaal. Ons sal verwys na seksies wat in ons vorige statiese biomimetiese kultuurstelsel 20, 21 beheertoestande (Ctrl) gekweek is en ons sal ons voorheen geoptimaliseerde medium as MC-toestande en kultuur onder gelyktydige meganiese en elektriese stimulasie (CTCM) gebruik. genoem . Eerstens het ons bepaal dat meganiese stimulasie sonder elektriese stimulasie onvoldoende was om weefsellewensvatbaarheid vir 6 dae te handhaaf (Aanvullende Fig. 3a,b). Interessant genoeg, met die bekendstelling van fisio-meganiese en elektriese stimulasie met behulp van STCM, het die lewensvatbaarheid van 12-dae hartseksies dieselfde gebly as in vars hartseksies onder MS-toestande, maar nie onder Ctrl-toestande nie, soos getoon deur MTT-analise (Fig. 1). 3a). Dit dui daarop dat meganiese stimulasie en simulasie van die hartsiklus weefselseksies twee keer so lank lewensvatbaar kan hou as wat in ons vorige statiese kultuurstelsel gerapporteer is. Assessering van die strukturele integriteit van weefselsnitte deur immuno-etikettering van kardiale troponien T en konneksien 43 het egter getoon dat konneksien 43-uitdrukking beduidend hoër was in MC-weefsels op dag 12 as in kontroles op dieselfde dag. Eenvormige konneksien 43-uitdrukking en Z-skyfvorming is egter nie ten volle gehandhaaf nie (Fig. 3b). Ons gebruik 'n kunsmatige intelligensie (KI) raamwerk om weefselstrukturele integriteit26 te kwantifiseer, 'n beeldgebaseerde diep leerpyplyn gebaseer op troponien-T en konneksienkleuring43 om outomaties die strukturele integriteit en fluoresensie van hartsnitte te kwantifiseer in terme van lokaliseringssterkte. Hierdie metode gebruik 'n Konvolusionele Neurale Netwerk (KNN) en 'n diep leerraamwerk om die strukturele integriteit van hartweefsel betroubaar te kwantifiseer op 'n outomatiese en onbevooroordeelde wyse, soos beskryf in die verwysing.26. MC-weefsel het verbeterde strukturele ooreenkoms met dag 0 getoon in vergelyking met statiese kontrolesnitte. Daarbenewens het Masson se trichroomkleuring 'n beduidend laer persentasie fibrose onder MS-toestande getoon in vergelyking met kontroletoestande op dag 12 van kultuur (Fig. 3c). Terwyl CTCM die lewensvatbaarheid van hartweefselseksies op dag 12 verhoog het tot 'n vlak soortgelyk aan dié van vars hartweefsel, het dit nie die strukturele integriteit van die hartseksies beduidend verbeter nie.
'n Staafgrafiek toon kwantifisering van die MTT-lewensvatbaarheid van vars hartsnitte (D0) of hartsnitte-kultuur vir 12 dae, óf in statiese kultuur (D12 Ctrl) óf in CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) snitte/groep van verskillende varke, een manier waarop die ANOVA-toets uitgevoer word; ####p < 0.0001 in vergelyking met D0 en **p < 0.01 in vergelyking met D12 Ctrl). 'n Staafgrafiek toon kwantifisering van die MTT-lewensvatbaarheid van vars hartsnitte (D0) of hartsnitte-kultuur vir 12 dae, óf in statiese kultuur (D12 Ctrl) óf in CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) snitte/groep van verskillende varke, een manier waarop die ANOVA-toets uitgevoer word; ####p < 0.0001 in vergelyking met D0 en **p < 0.01 in vergelyking met D12 Ctrl).Die histogram toon die kwantifisering van die lewensvatbaarheid van MTT vars hartseksies (D0) of kultuur van hartseksies vir 12 dae in óf statiese kultuur (D12-kontrole) óf CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12-kontrole). ) ), 12 (D12 MC) seksies/groep van verskillende varke, 'n eenrigting-ANOVA-toets word uitgevoer;####p < 0,0001 met D0 en **p < 0,01 met D12 Ctrl). ####p < 0.0001 in vergelyking met D0 en **p < 0.01 in vergelyking met D12 Ctrl). a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切片(D0)或心脏切片培养12 天的MTT 活力的量化)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/绐茅AN，进茅测试；与D0 相比，####p < 0,0001，与D12 Ctrl 相比，**p < 0.01). a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切片(D0) ，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；与D0 相比，##与D， Ctrl##p < 0.0001D， Ctrl相比，**p.)histogram wat die kwantifisering van MTT-lewensvatbaarheid in vars hartseksies (D0) of hartseksies wat vir 12 dae in statiese kultuur (D12-kontrole) of CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12-kontrole)), 12 (D12 MC) seksies/groep van verskillende varke, eenrigting-ANOVA-toets, toon;####p < 0,0001 met D0, **p < 0,01 met D12 Ctrl). ####p < 0.0001 in vergelyking met D0, **p < 0.01 in vergelyking met D12 Ctrl).b Troponien-T (groen), konneksien 43 (rooi) en DAPI (blou) in vars geïsoleerde hartsnitte (D0) of hartsnitte gekweek onder statiese toestande (Ctrl) of CTCM-toestande (MC) vir 12 dae) van verteenwoordigende immunofluoresensiebeelde (leë skaal = 100 µm). Kunsmatige intelligensie-kwantifisering van die strukturele integriteit van hartweefsel (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) snye/groep elk van verskillende varke, eenrigting-ANOVA-toets word uitgevoer; ####p < 0.0001 in vergelyking met D0 en ****p < 0.0001 in vergelyking met D12 Ctrl). Kunsmatige intelligensie-kwantifisering van die strukturele integriteit van hartweefsel (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) snye/groep elk van verskillende varke, eenrigting-ANOVA-toets word uitgevoer; ####p < 0.0001 in vergelyking met D0 en ****p < 0.0001 in vergelyking met D12 Ctrl). Количественная оценка структурной целостности сердечной ткани искусственным интеллектом (n = 7 (D0), 7 (D12 с12), 7 (D12 сD), пгов (D12 с12), от разных свиней, проводится однофакторный тест ANOVA ####p < 0,0001 met D0 en ****p < 0,0001 по12 Ctrl). Kwantifisering van die strukturele integriteit van hartweefsel deur kunsmatige intelligensie (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) seksies/groepe van verskillende varke, eenrigting-ANOVA-toets uitgevoer; ####p < 0.0001 vs. met D0 en ****p < 0.0001 in vergelyking met D12 Ctrl).人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) snye/groepeer elk van verskillende vark, eenrigting ANOVA-toets .##0;# 与#0p;#;#相比，****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）.人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) skywe/groepeer elk van verskillende varke, eenrigting ANOVA-toets <0#0p <0#;与D0相比，****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）. Искусственный интеллект для количественной оценки структурной целостности сердечной ткани (n = 7 (D0), 7) (D512 Ctrl), 7 (D512 Ctrl), срезов/группу каждой из разных свиней, односторонний тест ANOVA ####p <0,0001 vs. D0 Для сравнения ****p < 10, 2 Ctrl). Kunsmatige intelligensie om die strukturele integriteit van hartweefsel te kwantifiseer (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) seksies/groep elk van verskillende varke, eenrigting-ANOVA-toets; ####p<0.0001 vs .D0 Vir vergelyking ****p < 0.0001 in vergelyking met D12 Ctrl). c Verteenwoordigende beelde (links) en kwantifisering (regs) vir hartskyfies gekleur met Masson se trichroom-kleuring (Skaal kaal = 500 µm) (n = 10 skyfies/groep elk van verskillende varke, eenrigting-ANOVA-toets word uitgevoer; ####p < 0.0001 in vergelyking met D0 en ***p < 0.001 in vergelyking met D12 Ctrl). c Verteenwoordigende beelde (links) en kwantifisering (regs) vir hartskyfies gekleur met Masson se trichroom-kleuring (Skaal kaal = 500 µm) (n = 10 skyfies/groep elk van verskillende varke, eenrigting-ANOVA-toets word uitgevoer; #### p < 0.0001 in vergelyking met D0 en ***p < 0.001 in vergelyking met D12 Ctrl). c Репрезентативные изображения (слева) en количественная оценка (справа) срезов сердца, окрашенных трихмихром (máсштаб без покрытия = 500 мкм) (n = 10 срезов/группу от разных свиней, выполняется односторон те 0,##NO 0,##; сравнению с D0 и ***p < 0,001 by сравнению с D12 Ctrl). c Verteenwoordigende beelde (links) en kwantifisering (regs) van hartseksies gekleur met Masson se trichroomkleuring (ongelaagde skaal = 500 µm) (n = 10 seksies/groep van verskillende varke, eenrigting-ANOVA-toets uitgevoer; #### p < 0.0001 in vergelyking met D0 en ***p < 0.001 in vergelyking met D12 Ctrl). c 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像（左）和量化（右）（裸=尺剼（裸=尺剼10 个切片/组，每组来自不同的猪，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0,0001 与D0 相***1p <0．***01 Ctrl 相比）. C 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 （左 左） 量化 （右） 裸壸庣 帺壸庣 庰裸尺度 = 500 µm） （n = 10 个 切片 组 每 组 来自 不同 猪 ， 进行 单向 单嵛 单向 p## 0,0001 与D0 相比，***p < 0,001 与D12 Ctrl 相比）. c Репрезентативные изображения (слева) en количественный анализ (справа) срезов сердца, окрашенных трихмихром (чистая шкала = 500 mkm) (n = 10 срезов/группа, каждый от другой свиньи, протестировано с помощогруппа дисперсионного анализа ;### #p < 0,0001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Verteenwoordigende beelde (links) en kwantifisering (regs) van hartseksies gekleur met Masson se trichroom-kleuring (leë = 500 µm) (n = 10 seksies/groep, elk van 'n ander vark, getoets deur eenrigting-variansie-analise; ### # p < 0.0001 in vergelyking met D0, ***p < 0.001 in vergelyking met D12 Ctrl).Foutbalke verteenwoordig die gemiddelde ± standaardafwyking.
Ons het gehipotetiseer dat deur klein molekules by die kultuurmedium te voeg, die integriteit van kardiomiosiete verbeter kan word en die ontwikkeling van fibrose tydens CTCM-kultuur verminder kan word. Ons het dus vir klein molekules gekeur met behulp van ons statiese beheerkulture20,21 as gevolg van die klein aantal verwarrende faktore. Deksametasoon (Dex), triiodotironien (T3) en SB431542 (SB) is vir hierdie sifting gekies. Hierdie klein molekules is voorheen in hiPSC-CM-kulture gebruik om die volwassenheid van kardiomiosiete te veroorsaak deur sarkomeerlengte, T-buisies en geleidingsnelheid te verhoog. Daarbenewens is beide Dex (’n glukokortikoïed) en SB bekend daarvoor dat hulle inflammasie onderdruk29,30. Daarom het ons getoets of die insluiting van een of ’n kombinasie van hierdie klein molekules die strukturele integriteit van hartgedeeltes sou verbeter. Vir aanvanklike sifting is die dosis van elke verbinding gekies op grond van die konsentrasies wat algemeen in selkultuurmodelle gebruik word (1 μM Dex27, 100 nM T327 en 2.5 μM SB31). Na 12 dae van kultuur het die kombinasie van T3 en Dex gelei tot optimale kardiomiosietstrukturele integriteit en minimale veselagtige hermodellering (Aanvullende Figure 4 en 5). Daarbenewens het die gebruik van dubbel of dubbel hierdie konsentrasies van T3 en Dex skadelike effekte veroorsaak in vergelyking met normale konsentrasies (Aanvullende Fig. 6a,b).
Na aanvanklike sifting het ons 'n kop-aan-kop vergelyking van 4 kultuurtoestande uitgevoer (Figuur 4a): Ctrl: hartseksies gekweek in ons voorheen beskryfde statiese kultuur met behulp van ons geoptimaliseerde medium; 20.21 TD: T3 en Ctrl s het Dex op Woensdag bygevoeg; MC: hartseksies gekweek in CTCM met behulp van ons voorheen geoptimaliseerde medium; en MT: CTCM met T3 en Dex by die medium gevoeg. Na 12 dae van kweek het die lewensvatbaarheid van MS- en MT-weefsels dieselfde gebly as in vars weefsels wat deur MTT-toets beoordeel is (Fig. 4b). Interessant genoeg het die byvoeging van T3 en Dex tot transwell-kulture (TD) nie 'n beduidende verbetering in lewensvatbaarheid tot gevolg gehad in vergelyking met Ctrl-toestande nie, wat dui op 'n belangrike rol van meganiese stimulasie in die handhawing van die lewensvatbaarheid van hartseksies.
'n Eksperimentele ontwerpdiagram wat die vier kultuurtoestande uitbeeld wat gebruik is om die effekte van meganiese stimulasie en T3/Dex-aanvulling op medium vir 12 dae te evalueer. b Staafgrafiek toon kwantifisering van lewensvatbaarheid 12 dae na kultuur in al 4 kultuurtoestande (Ctrl, TD, MC en MT) in vergelyking met vars hartsnitte (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD en D12 MT), 12 (D12 MC) snye/groep van verskillende varke, eenrigting-ANOVA-toets word uitgevoer; ####p < 0.0001, ###p < 0.001 in vergelyking met D0 en **p < 0.01 in vergelyking met D12 Ctrl). b Staafgrafiek toon kwantifisering van lewensvatbaarheid 12 dae na kultuur in al 4 kultuurtoestande (Ctrl, TD, MC, en MT) in vergelyking met vars hartsnitte (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD en D12 MT), 12 (D12 MC) snye/groep van verskillende varke, eenrigting-ANOVA-toets word uitgevoer; ####p < 0.0001, ###p < 0.001 in vergelyking met D0 en **p < 0.01 in vergelyking met D12 ctrl). b Гистограмма показывает количественную оценку. культивирования (контроль, TD, MC en MT) vir сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 TD), MC 12 TD, D12) en D12 срезов/группу от разных свиней, проводится односторонний тест ANOVA ####p < 0,0001, ###p < 0,001 по сравни; с D0 и **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). b Die staafgrafiek toon die kwantifisering van lewensvatbaarheid 12 dae na kultuur in al 4 kultuurtoestande (kontrole, TD, MC en MT) in vergelyking met vars hartseksies (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD en D12 MT), 12 (D12 MC) seksies/groep van verskillende varke, eenrigting-ANOVA-toets; ####p < 0.0001, ###p < 0.001 vs. D0 en **p < 0.01 in vergelyking met D12 Ctrl). b.和D12 MT)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；####p < 0.00001，##p <与.0#1，##p相比，**p < 0.01 与D12控制）.b 4 12 (D12 MC) b Гистограмма, показывающая все 4 условия культивирования (контроль, TD, MC en MT) deur сравнению со свежезц (0) = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD en D12 MT), van разных свиней 12 (D12 MC) срезы/группа, односторонний тест ANOVA <0, ##000p, ##00#; сравнению с D0, **p <0,01 по сравнению с контролем D12). b Histogram wat al 4 kultuurtoestande (kontrole, TD, MC en MT) toon in vergelyking met vars hartseksies (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD en D12 MT), van verskillende varke 12 (D12 MC) seksies/groep, eenrigting-ANOVA-toets; ####p<0.0001, ###p<0.001 vs. D0, **p<0.01 vs. kontrole D12). c Staafgrafiek toon die kwantifisering van glukosevluks 12 dae na kultuur in al 4 kultuurtoestande (Ctrl, TD, MC en MT) in vergelyking met vars hartsnitte (D0) (n = 6 snye/groep van verskillende varke, eenrigting-ANOVA-toets word uitgevoer; ###p < 0.001, in vergelyking met D0 en ***p < 0.001 in vergelyking met D12 Ctrl). c Staafgrafiek toon die kwantifisering van glukosevluks 12 dae na kultuur in al 4 kultuurtoestande (Ctrl, TD, MC en MT) in vergelyking met vars hartsnitte (D0) (n = 6 snye/groep van verskillende varke, eenrigting-ANOVA-toets word uitgevoer; ###p < 0.001, in vergelyking met D0 en ***p < 0.001 in vergelyking met D12 Ctrl). c Гистограмма показывает количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после культивирования во 4висовисов культивирования (контроль, TD, MC en MT) vir сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 6 срезов/грезовированию односторонний Выполняется тест ANOVA; ###p < 0,001 по сравнению с D0 и ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Histogram toon kwantifisering van glukosevluks 12 dae na kultuur onder al 4 kultuurtoestande (kontrole, TD, MC en MT) in vergelyking met vars hartseksies (D0) (n = 6 seksies/groep van verskillende varke, eenrigting-ANOVA-toets uitgevoer; ###p < 0.001 in vergelyking met D0 en ***p < 0.001 in vergelyking met D12 Ctrl). c 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) 相掹养吅养吐天的葡萄糖通量定量（n = 6 片/组，来自不同猪，单向执行ANOVA 测试；#0，D < 0.相比，***p < 0,001 与D12 Ctrl 相比）. C 条形图 显示 所有 4 种 条件 （（ctrl 、 td 、 mc 和 mt） 新鲜 心脏 条件 切缉 切 片 切 片 切培养 后 后 12 天 的 通量 定量 （n = 6 片/组 ， 来自 猪 ， ， ， ， ， ， ，猪单向执行ANOVA 测试；###p < 0.001，与D0 相比，***p < 0,001 与D12 Ctrl 相比）. c Гистограмма, показывающая количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после культивирования культивирования (контроль, TD, MC en MT) vir сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 6 срезов/групрапа, срезов, срезов односторонний Были проведены тесты ANOVA ###p < 0,001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению с D12 (контроль). c Histogram wat die kwantifisering van glukosevluks 12 dae na kultuur toon vir al 4 kultuurtoestande (kontrole, TD, MC en MT) in vergelyking met vars hartseksies (D0) (n = 6 seksies/groep, van verskillende varke, eensydig Waar ANOVA-toetse uitgevoer is, ###p < 0.001 in vergelyking met D0, ***p < 0.001 in vergelyking met D12 (kontrole).d Stammingsanaliseplotte van vars (blou), dag 12 MC (groen), en dag 12 MT (rooi) weefsels by tien streeksweefselsnitpunte (n = 4 snitte/groep, eenrigting-ANOVA-toets; daar was geen beduidende verskil tussen groepe nie). e Vulkaanplot wat differensieel uitgedrukte gene in vars hartsnitte (D0) toon in vergelyking met hartsnitte wat onder statiese toestande (Ctrl) of onder MT-toestande (MT) vir 10-12 dae gekweek is. f Hittekaart van sarkomeergene vir hartsnitte wat onder elk van die kultuurtoestande gekweek is. Foutbalke verteenwoordig die gemiddelde ± standaardafwyking.
Metaboliese afhanklikheid van die oorskakeling van vetsuuroksidasie na glikolise is 'n kenmerk van kardiomiosiet-dedifferensiasie. Onvolwasse kardiomiosiete gebruik hoofsaaklik glukose vir ATP-produksie en het hipoplastiese mitochondria met min cristae5,32. Glukosebenuttingsanalises het getoon dat glukosebenutting onder MC- en MT-toestande soortgelyk was aan dié in dag 0-weefsels (Figuur 4c). Ctrl-monsters het egter 'n beduidende toename in glukosebenutting getoon in vergelyking met vars weefsel. Dit dui daarop dat die kombinasie van CTCM en T3/Dex weefsellewensvatbaarheid verbeter en die metaboliese fenotipe van 12-dae gekweekte hartseksies bewaar. Daarbenewens het spanningsanalise getoon dat spanningsvlakke dieselfde gebly het as in vars hartweefsel vir 12 dae onder MT- en MS-toestande (Fig. 4d).
Om die algehele impak van CTCM en T3/Dex op die globale transkripsielandskap van hartsnyweefsel te analiseer, het ons RNAseq op hartsnye van al vier verskillende kultuurtoestande uitgevoer (Aanvullende Data 1). Interessant genoeg het MT-seksies hoë transkripsie-ooreenkoms met vars hartweefsel getoon, met slegs 16 differensieel uitgedruk uit 13 642 gene. Soos ons egter vroeër getoon het, het Ctrl-seksies 1229 differensieel uitgedrukte gene na 10-12 dae in kultuur vertoon (Fig. 4e). Hierdie data is bevestig deur qRT-PCR van hart- en fibroblastgene (Aanvullende Fig. 7a-c). Interessant genoeg het die Ctrl-seksies afregulering van hart- en selsiklusgene en aktivering van inflammatoriese geenprogramme getoon. Hierdie data dui daarop dat dedifferensiasie, wat normaalweg na langtermyn-kweek plaasvind, heeltemal verswak word onder MT-toestande (Aanvullende Fig. 8a,b). 'n Noukeurige studie van sarkomeergene het getoon dat slegs onder MT-toestande die gene wat vir die sarkomeer (Fig. 4f) en ioonkanaal (Aanvullende Fig. 9) kodeer, bewaar word, wat hulle teen onderdrukking onder Ctrl-, TD- en MC-toestande beskerm. Hierdie data toon dat met 'n kombinasie van meganiese en humorale stimulasie (T3/Dex), die hartsny-transkriptoom na 12 dae in kultuur soortgelyk aan vars hartsnye kan bly.
Hierdie transkripsiebevindinge word ondersteun deur die feit dat die strukturele integriteit van kardiomiosiete in hartsnitte die beste bewaar word onder MT-toestande vir 12 dae, soos getoon deur intakte en gelokaliseerde konneksien 43 (Fig. 5a). Daarbenewens was fibrose in hartsnitte onder MT-toestande aansienlik verminder in vergelyking met Ctrl en soortgelyk aan vars hartsnitte (Fig. 5b). Hierdie data toon dat die kombinasie van meganiese stimulasie en T3/Dex-behandeling die hartstruktuur in hartsnitte in kultuur effektief bewaar.
Verteenwoordigende immunofluoresensiebeelde van troponien-T (groen), konneksien 43 (rooi) en DAPI (blou) in vars geïsoleerde hartseksies (D0) of gekweek vir 12 dae in al vier hartseksie-kweektoestande (skaalbalk = 100 µm). Kunsmatige intelligensie-kwantifisering van die strukturele integriteit van hartweefsel (n = 7 (D0 en D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC en D12 MT) snye/groep van verskillende varke, eenrigting-ANOVA-toets word uitgevoer; ####p < 0.0001 in vergelyking met D0 en *p < 0.05, of ****p < 0.0001 in vergelyking met D12 Ctrl). Kunsmatige intelligensie-kwantifisering van die strukturele integriteit van hartweefsel (n = 7 (D0 en D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC en D12 MT) snye/groep van verskillende varke, eenrigting-ANOVA-toets word uitgevoer; #### p < 0.0001 in vergelyking met D0 en *p < 0.05, of ****p < 0.0001 in vergelyking met D12 Ctrl). Количественная оценка структурной целостности ткани сердца с помощью искусственного интеллекта (n = 7 (D12 Ctrl), (D = 7 (D12 Ctrl), (D12 Ctrl) MC en D12 MT) срезов/группу от разных свиней, проведен однофакторный тест ANOVA; 0,0001 met D12 Ctrl). Kwantifisering van die strukturele integriteit van hartweefsel met behulp van kunsmatige intelligensie (n = 7 (D0 en D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC en D12 MT) seksies/groep van verskillende varke, eenrigting-ANOVA-toets uitgevoer; #### p < 0.0001 in vergelyking met D0 en *p < 0.05 of ****p < 0.0001 in vergelyking met D12 Ctrl).对不同猪的心脏组织结构完整性（n = 7（D0 和D12 Ctrl）、5（D12 TD、D12 MC 和D12 MT）切片/组）进行人工智能量化，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0.0001 与D0 希0*p <0.0*p <0.0*p <0. 0,0001 与D12 Ctrl 相比）.对 不同 猪 的 心脏 结构 完整性 （n = 7 （d0 和 d12 ctrl） （5 （d12 td 、t ， ， d12 mc 廒人工 智能量 化 进行 单向 单向 单向 测试 ； ########## p < 0.0001 与D0 和*p < 0.05**** p < 0.05 0,0001 与D12 Ctrl 相比）.Kwantifisering van die strukturele integriteit van hartweefsel met behulp van kunsmatige intelligensie in verskillende varke (n = 7 (D0 en D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC en D12 MT) seksies/groep) met 'n eenrigting-ANOVA-toets;#### p < 0,0001 met D0 en *p < 0,05 of ****p < 0,0001 met D12 Ctrl). #### p < 0.0001 in vergelyking met D0 en *p < 0.05 of ****p < 0.0001 in vergelyking met D12 Ctrl). b Verteenwoordigende beelde en kwantifisering vir hartsnitte gekleur met Masson se trichroom-kleuring (Skaalbalk = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD, en D12 MC), 9 (D12 MT) snye/groep van verskillende varke, eenrigting-ANOVA-toets word uitgevoer; ####p < 0.0001 in vergelyking met D0 en ***p < 0.001, of ****p < 0.0001 in vergelyking met D12 Ctrl). b Verteenwoordigende beelde en kwantifisering vir hartsnitte gekleur met Masson se trichroom-kleuring (Skaalbalk = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD, en D12 MC), 9 (D12 MT) snye/groep van verskillende varke, eenrigting-ANOVA-toets word uitgevoer; ####p < 0.0001 in vergelyking met D0 en ***p < 0.001, of ****p < 0.0001 in vergelyking met D12 Ctrl). b Репрезентативные изображения en количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромным краснамася линейка = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD en D12 MC), 9 (D12 MT) срезов/группу от разных свиней, выдонсолня ANOVA; ####p < 0,0001 met D0 en ***p < 0,001 of ****p < 0,0001 met D12 Ctrl). b Verteenwoordigende beelde en kwantifisering van hartseksies gekleur met Masson se trichroom-kleuring (skaalbalk = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD en D12 MC), 9 (D12 MT) seksies/groep van verskillende varke, uitgevoer eenrigting-ANOVA; ####p < 0.0001 vs. D0 en ***p < 0.001 of ****p < 0.0001 vs. D12 Ctrl). b 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像和量化（比例尺= 500 µm = 01！D Ctrl、D12 TD 和D12 MC），来自不同猪的9 个（D12 MT）切片/组，进行单因素方巐弆方巐##0与D0 相比，***p < 0.001，或****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）. b 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 和 量化 （比例 尺 尺 尺 = 500 µn = 0（n（n 、 d12 ctrl 、 d12 td 和 d12 mc） 来自 不同 的 9 个 d12 mt 切片 切片 切片 切片 切片 切片切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片/组，进行单因素方差分析；00 <10###相比，***p < 0,001，或****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）. b Voorsiening van die siekte en die operasie van die siekte, die afgelope maand, 5 maande (maans0 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD en D12 MC), 9 (D12 MT) срезов от разных свиней / группы, один-способ ANOVA; #0п,0#p с D0, ***p < 0,001 of ****p < 0,0001 met behulp van D12 Ctrl). b Verteenwoordigende beelde en kwantifisering van hartseksies gekleur met Masson se trichroom (skaalbalk = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD en D12 MC), 9 (D12 MT) seksies van verskillende varke/groep, een ANOVA-metode; ####p < 0.0001 in vergelyking met D0, ***p < 0.001 of ****p < 0.0001 in vergelyking met D12 Ctrl).Foutbalke verteenwoordig die gemiddelde ± standaardafwyking.
Laastens is die vermoë van CTCM om kardiale hipertrofie na te boots, beoordeel deur die verhoging van die kardiale weefselstrekking. In CTCM het die pieklugkamerdruk toegeneem van 80 mmHg tot 80 mmHg Art. (normale strek) tot 140 mmHg Art. (Fig. 6a). Dit stem ooreen met 'n 32% toename in strek (Fig. 6b), wat voorheen getoon is as die ooreenstemmende persentasie strek wat benodig word vir hartseksies om 'n sarkomeerlengte soortgelyk aan dié wat in hipertrofie gesien word, te bereik. Die strek en snelheid van hartweefsel tydens sametrekking en ontspanning het konstant gebly gedurende ses dae van kultuur (Fig. 6c). Hartweefsel van MT-toestande is vir ses dae aan normale strek (MT (Normaal)) of oorstrektoestande (MT (OS)) onderwerp. Reeds na vier dae in kultuur was die hipertrofiese biomerker NT-ProBNP beduidend verhoog in die medium onder MT (OS)-toestande in vergelyking met MT (normale) toestande (Fig. 7a). Daarbenewens het die selgrootte in MT (OS) (Fig. 7b) na ses dae van kweek aansienlik toegeneem in vergelyking met gedeeltes van MT-hart (normaal). Daarbenewens was NFATC4-kerntranslokasie aansienlik verhoog in ooruitgerekte weefsels (Fig. 7c). Hierdie resultate toon die progressiewe ontwikkeling van patologiese hermodellering na hiperdistensie en ondersteun die konsep dat die CTCM-toestel as 'n platform gebruik kan word om strek-geïnduseerde kardiale hipertrofie-seintransduksie te bestudeer.
Verteenwoordigende spore van lugkamerdruk, vloeistofkamerdruk en weefselbewegingsmetings bevestig dat kamerdruk vloeistofkamerdruk verander, wat 'n ooreenstemmende beweging van die weefselsnit veroorsaak. b Verteenwoordigende strekpersentasie- en strektempokrommes vir normaal gestrekte (oranje) en oorgerekte (blou) weefselsnitte. c Staafgrafiek wat siklustyd (n = 19 snitte per groep, van verskillende varke), sametrekkingstyd (n = 18-19 snitte per groep, van verskillende varke), ontspanningstyd (n = 19 snitte per groep, van verskillende varke)), amplitude van weefselbeweging (n = 14 snitte/groep, van verskillende varke), piek sistoliese snelheid (n = 14 snitte/groep, van verskillende varke) en piek ontspanningstempo (n = 14 (D0), 15 (D6)) snitte/groepe) van verskillende varke toon, tweesydige Student se t-toets het geen beduidende verskil in enige parameter getoon nie, wat aandui dat hierdie parameters konstant gebly het gedurende 6 dae van kultuur met oorspanning. Foutbalke verteenwoordig die gemiddelde ± standaardafwyking.
'n Staafgrafiekkwantifisering van NT-ProBNP-konsentrasie in kultuurmedia van hartsnitte gekweek onder MT normale strek (Norm) of oorstrek (OS) toestande (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, en D4 MTOS) snitte/groep van verskillende varke, Tweerigting-ANOVA word uitgevoer; **p < 0.01 in vergelyking met normale strek). 'n Staafgrafiekkwantifisering van NT-ProBNP-konsentrasie in kultuurmedia van hartskyfies gekweek onder MT normale strek (Norm) of oorstrek (OS) toestande (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, en D4 MTOS) skyfies/groep van verskillende varke, Tweerigting-ANOVA word uitgevoer; **p < 0.01 in vergelyking met normale strek).Kwantitatiewe histogram van NT-ProBNP-konsentrasie in kultuurmedium van hartsnitte gekweek onder toestande van normale MT-strek (norm) of oorstrek (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, en D4).MTOS) snitte/groep van verskillende varke, tweefaktor-variansie-analise word uitgevoer;**p < 0,01 vir chroniese maatreëls). **p < 0.01 in vergelyking met normale strek). a 在MT 正常拉伸(Norm) 或过度拉伸(OS) 条件下培养的心脏切片培养基中NT-ProBNP浓度的条形图量化（n = 4 (D2 MTNorm)、3（D2 MTOS、D4 MTNorm 和D4 MTOS）来自不同猪的切片/组，进行双向方差分析；**与正常拉伸相比，p < 0.01）. 'n Kwantifisering van NT-ProBNP-konsentrasie in hartskywe gekweek onder MT normale rek (Norm) of oorrek (OS) toestande (n ​​= 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm和D4 MTOS) van verskillende猪的切片/组，可以双向方方发发动 **in vergelyking met normale strek, p <0.01).histogram Kwantifisering van NT-ProBNP-konsentrasies in hartsnitte gekweek onder toestande van normale MT-strek (norm) of oorstrek (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm) en D4 MTOS) snitte/groep van verskillende varke, tweerigting-variansie-analise;**p < 0,01 vir chroniese maatreëls). **p < 0.01 in vergelyking met normale strek). b Verteenwoordigende beelde vir hartsnitte gekleur met troponien-T en WGA (links) en selgrootte-kwantifisering (regs) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) selle/groep van 10 verskillende snitte van verskillende varke, Tweesydige Student t-toets word uitgevoer; ****p < 0.0001 in vergelyking met normale strek). b Verteenwoordigende beelde vir hartsnitte gekleur met troponien-T en WGA (links) en selgrootte-kwantifisering (regs) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) selle/groep van 10 verskillende snitte van verskillende varke, tweesydige Student t-toets word uitgevoer; ****p < 0.0001 in vergelyking met normale strek). b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т en АЗП (слева) en количестолениногого клеток (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) клеток/группу из 10 разных срезов от разных свиней, двх-из t-критерий Стьюдента; ****p < 0,0001 по сравнению с нормальным растяжением). b Verteenwoordigende beelde van hartseksies gekleur met troponien-T en AZP (links) en selgrootte-kwantifisering (regs) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) selle/groep van 10 verskillende seksies van verskillende varke, tweesydige Student se t-toets is uitgevoer; ****p < 0.0001 in vergelyking met normale stam). b 用肌钙蛋白-T 和WGA（左）和细胞大小量化（右）染色的心脏切片的（左）和细胞大小量化（右）染色的心脏切片的代表性 3（n MTOS），来自不同猪的10 个不同切片的369（D6 MTNorm）细胞/组，两进行有尟学甌检验；与正常拉伸相比，****p < 0.0001）. b Verteenwoordigende beelde van hartsnitte gekleur met calcareïn-T en WGA (links) en selgrootte (regs) (n = 330 (D6 MTOS), 369 van 10 verskillende snitte (D6 MTNorm)) Selle/sel, standaardwerkwoorde en standaardwerkwoorde t-toets; in vergelyking met normale strekking, ****p < 0.0001). b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т en АЗП (слева) en количественная околичественная (sправа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) из 10 различных срезов от разных свиней Клетки/групца, дверусторонид; ****p < 0,0001 vir 'n standaard gebruik). b Verteenwoordigende beelde van hartseksies gekleur met troponien-T en AZP (links) en kwantifisering van selgrootte (regs) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) van 10 verskillende seksies van verskillende varke) Selle/groep, tweesydige kriterium Student se t; ****p < 0.0001 in vergelyking met normale spanning). c Verteenwoordigende beelde vir dag 0 en dag 6 MTOS-hartsnitte, immuno-gemerk vir troponien-T en NFATC4, en kwantifisering van die translokasie van NFATC4 na die kerne van CMs (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) snitte/groep van verskillende varke, tweesydige Student t-toets word uitgevoer; *p < 0.05). c Verteenwoordigende beelde vir dag 0 en dag 6 MTOS-hartsnitte, immuno-gemerk vir troponien-T en NFATC4, en kwantifisering van die translokasie van NFATC4 na die kerne van CMs (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) snitte/groep van verskillende varke, tweesydige Student t-toets word uitgevoer; *p < 0.05). c Репрезентативные изображения для срезов сердца 0 en 6 дней MTOS, иммуномеченых тропонина-Т en NFATC4, en ковленич транслокации NFATC4 в ядра кавернозных клеток (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) syfers/speel van разных свиняней , выпус t-критерий Стьюдента; *p < 0,05). c Verteenwoordigende beelde vir hartsnitte by 0 en 6 dae MTOS, immuno-gemerk vir troponien-T en NFATC4, en kwantifisering van NFATC4-translokasie in die kern van kaverneuse selle (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) snitte/groep van verskillende varke) uitgevoer met tweesydige Student se t-toets; *p < 0.05). c 用于肌钙蛋白-T 和NFATC4 免疫标记的第0 天和第6 天MTOS心脏切片的代表性图像，以及来自不同猪的NFATC4 易位至CM 细胞核的量匀MT 匀3D(0n)切片/组, 进行双尾学生t 检验；*p < 0.05). c Verteenwoordigende beelde van kalkanien-T en NFATC4 immunolabeling 第0天和第6天MTOS hartskywe, en NFATC4 van verskillende NFATC4 易位至CM selkern的hoeveelheid化 (n = 4 (D0), 缤 刻 , 缇 , 焇 , 缇 , 焇 , 缇时间双尾学生et 电影；*p < 0.05). c Репрезентативные изображения срезов сердца MTOS op 0 en 6 dae vir иммуномаркировки тропонином-Т en NFATC4 en NFATC4-metodes транслокации NFATC4 в ядра CM от разных свиней (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срез/группа, два- хвостатый t-критер, 0). c Verteenwoordigende beelde van MTOS-hartsnitte op dag 0 en 6 vir troponien-T en NFATC4-immunomerking en kwantifisering van NFATC4-translokasie in die kern van CM van verskillende varke (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) snitte/groep, tweesydige t-kriterium Student se; *p < 0.05).Foutbalke verteenwoordig gemiddelde ± standaardafwyking.
Translasionele kardiovaskulêre navorsing vereis sellulêre modelle wat die kardiale omgewing akkuraat reproduseer. In hierdie studie is 'n CTCM-toestel ontwikkel en gekarakteriseer wat ultradun gedeeltes van die hart kan stimuleer. Die CTCM-stelsel sluit fisiologies gesinchroniseerde elektromeganiese stimulasie en T3- en Dex-vloeistofverryking in. Toe varkhartgedeeltes aan hierdie faktore blootgestel is, het hul lewensvatbaarheid, strukturele integriteit, metaboliese aktiwiteit en transkripsie-uitdrukking dieselfde gebly as in vars hartweefsel na 12 dae van kultuur. Daarbenewens kan oormatige strek van hartweefsel hipertrofie van die hart veroorsaak wat deur hiperekstensie veroorsaak word. Oor die algemeen ondersteun hierdie resultate die kritieke rol van fisiologiese kultuurtoestande in die handhawing van 'n normale kardiale fenotipe en bied 'n platform vir geneesmiddelsifting.
Baie faktore dra by tot die skep van 'n optimale omgewing vir die funksionering en oorlewing van kardiomiosiete. Die mees voor die hand liggende van hierdie faktore hou verband met (1) intersellulêre interaksies, (2) elektromeganiese stimulasie, (3) humorale faktore en (4) metaboliese substrate. Fisiologiese sel-tot-sel-interaksies vereis komplekse driedimensionele netwerke van veelvuldige seltipes wat deur 'n ekstrasellulêre matriks ondersteun word. Sulke komplekse sellulêre interaksies is moeilik om in vitro te rekonstrueer deur ko-kultuur van individuele seltipes, maar kan maklik bereik word deur die organotipiese aard van hartseksies te gebruik.
Meganiese strek en elektriese stimulasie van kardiomiosiete is krities vir die handhawing van kardiale fenotipe33,34,35. Terwyl meganiese stimulasie wyd gebruik is vir hiPSC-CM kondisionering en rypwording, het verskeie elegante studies onlangs gepoog om hartsnitte in kultuur meganies te stimuleer deur uniaksiale lading te gebruik. Hierdie studies toon dat 2D uniaksiale meganiese lading 'n positiewe effek op die fenotipe van die hart tydens kultuur het. In hierdie studies is dele van die hart óf gelaai met isometriese trekkragte17, lineêre ouksotoniese lading18, óf die kardiale siklus is herskep deur gebruik te maak van kragtransduktorterugvoer en spanningsaandrywers. Hierdie metodes gebruik egter uniaksiale weefselstrek sonder omgewingsoptimalisering, wat lei tot die onderdrukking van baie kardiale gene of ooruitdrukking van gene wat verband hou met abnormale strekresponse. Die CTCM wat hier beskryf word, bied 'n 3D elektromeganiese stimulus wat die natuurlike kardiale siklus naboots in terme van siklustyd en fisiologiese strek (25% strek, 40% sistole, 60% diastole en 72 slae per minuut). Alhoewel hierdie driedimensionele meganiese stimulasie alleen nie voldoende is om weefselintegriteit te handhaaf nie, is 'n kombinasie van humorale en meganiese stimulasie met behulp van T3/Dex nodig om weefsellewensvatbaarheid, funksie en integriteit voldoende te handhaaf.
Humorale faktore speel 'n belangrike rol in die modulasie van die volwasse hartfenotipe. Dit is uitgelig in HiPS-CM-studies waarin T3 en Dex by kultuurmedia gevoeg is om selvolwassenheid te versnel. T3 kan die vervoer van aminosure, suikers en kalsium oor selmembrane beïnvloed36. Daarbenewens bevorder T3 MHC-α-uitdrukking en MHC-β-afregulering, wat die vorming van vinnige miofibrille in volwasse kardiomiosiete bevorder in vergelyking met stadige miofibrille in fetale CM. T3-tekort in hipotiroïedpasiënte lei tot die verlies van miofibrillêre bande en 'n verminderde tempo van tonusontwikkeling37. Dex werk in op glukokortikoïedreseptore en het getoon dat dit miokardiale kontraktiliteit in geïsoleerde geperfuseerde harte verhoog;38 hierdie verbetering word vermoedelik verband hou met die effek op kalsiumafsetting-gedrewe toetrede (SOCE)39,40. Daarbenewens bind Dex aan sy reseptore, wat 'n breë intrasellulêre reaksie veroorsaak wat immuunfunksie en inflammasie onderdruk30.
Ons resultate dui daarop dat fisiese meganiese stimulasie (MS) die algehele kultuurprestasie verbeter het in vergelyking met Ctrl, maar nie daarin geslaag het om lewensvatbaarheid, strukturele integriteit en kardiale uitdrukking oor 12 dae in kultuur te handhaaf nie. In vergelyking met Ctrl het die byvoeging van T3 en Dex tot CTCM (MT) kulture die lewensvatbaarheid verbeter en soortgelyke transkripsieprofiele, strukturele integriteit en metaboliese aktiwiteit met vars hartweefsel vir 12 dae gehandhaaf. Daarbenewens is 'n hiperekstensie-geïnduseerde kardiale hipertrofiemodel met behulp van STCM geskep deur die mate van weefselstrek te beheer, wat die veelsydigheid van die STCM-stelsel illustreer. Daar moet op gelet word dat hoewel kardiale hermodellering en fibrose gewoonlik intakte organe behels waarvan die sirkulerende selle die toepaslike sitokiene sowel as fagositose en ander hermodelleringsfaktore kan verskaf, dele van die hart steeds die fibrotiese proses in reaksie op stres en trauma in miofibroblaste kan naboots. Dit is voorheen in hierdie kardiale snymodel geëvalueer. Daar moet op gelet word dat CTCM-parameters gemoduleer kan word deur druk/elektriese amplitude en frekwensie te verander om baie toestande soos tagikardie, bradikardie en meganiese sirkulasieondersteuning (meganiese ongelaaide hart) te simuleer. Dit maak die stelsel 'n medium deurset vir dwelmtoetsing. Die vermoë van CTCM om oorinspanning-geïnduseerde kardiale hipertrofie te modelleer, baan die weg vir die toets van hierdie stelsel vir gepersonaliseerde terapie. Ten slotte toon die huidige studie dat meganiese strek en humorale stimulasie krities is vir die handhawing van die kultuur van kardiale weefselseksies.
Alhoewel die data wat hier aangebied word, daarop dui dat CTCM 'n baie belowende platform is vir die modellering van intakte miokardium, het hierdie kultuurmetode sekere beperkings. Die hoofbeperking van CTCM-kultuur is dat dit deurlopende dinamiese meganiese spanning op die snitte plaas, wat die vermoë om hartsnitte se sametrekkings aktief te monitor tydens elke siklus, uitsluit. Boonop, as gevolg van die klein grootte van hartsnitte (7 mm), is die vermoë om sistoliese funksie buite kultuurstelsels met behulp van tradisionele kragsensors te evalueer, beperk. In die huidige manuskrip oorkom ons hierdie beperking gedeeltelik deur optiese spanning as 'n aanduiding van kontraktiele funksie te evalueer. Hierdie beperking sal egter verdere werk vereis en kan in die toekoms aangespreek word deur metodes vir optiese monitering van die funksie van hartsnitte in kultuur bekend te stel, soos optiese kartering met behulp van kalsium en spanningsensitiewe kleurstowwe. Nog 'n beperking van CTCM is dat die werkmodel nie fisiologiese spanning (voorbelasting en nabelasting) manipuleer nie. In CTCM is druk in teenoorgestelde rigtings geïnduseer om 25% fisiologiese strek in diastole (volle strek) en sistole (lengte van sametrekking tydens elektriese stimulasie) in baie groot weefsels te reproduseer. Hierdie beperking behoort in toekomstige CTCM-ontwerpe verwyder te word deur voldoende druk op die hartweefsel van beide kante af te plaas en deur die presiese druk-volume-verhoudings toe te pas wat in die kamers van die hart voorkom.
Die oorstrek-geïnduseerde hermodellering wat in hierdie manuskrip gerapporteer word, is beperk tot die nabootsing van hipertrofiese hiperstrekseine. Dus kan hierdie model help met die studie van strek-geïnduseerde hipertrofiese seintransduksie sonder die behoefte aan humorale of neurale faktore (wat nie in hierdie stelsel bestaan ​​nie). Verdere studies is nodig om die veelvuldigheid van CTCM te verhoog, byvoorbeeld, saamkultivering met immuunselle, sirkulerende plasma humorale faktore, en innervering wanneer saamkultivering met neuronale selle die moontlikhede van siektemodellering met CTCM sal verbeter.
Dertien varke is in hierdie studie gebruik. Alle dierprosedures is uitgevoer in ooreenstemming met institusionele riglyne en is goedgekeur deur die Universiteit van Louisville se Institusionele Diereversorgings- en Gebruikskomitee. Die aortaboog is vasgeklem en die hart is geperfuseer met 1 L steriele kardioplegie (110 mM NaCl, 1.2 mM CaCl2, 16 mM KCl, 16 mM MgCl2, 10 mM NaHCO3, 5 U/mL heparien, pH tot 7.4); Die harte is in yskoue kardioplegiese oplossing bewaar totdat dit op ys na die laboratorium vervoer is, wat gewoonlik <10 min is. Die harte is in yskoue kardioplegiese oplossing bewaar totdat dit op ys na die laboratorium vervoer is, wat gewoonlik <10 min is. сердца хранили in ледяном кардиоплегическом растворе до транспортировки in лабораторию на льду, что обанично <10m. harte is in yskoue kardioplegiese oplossing gestoor tot vervoer na die laboratorium op ys, wat gewoonlik <10 min neem.将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10。逛将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10。逛 Держите сердца в ледяной кардиоплегии до транспортировки in лабораторию op льду, teen <10 minute. Hou harte op ys kardioplegie tot vervoer na die laboratorium op ys, gewoonlik <10 min.
Die CTCM-toestel is ontwikkel in SolidWorks se rekenaargesteunde ontwerp (CAD) sagteware. Die kultuurkamers, verdelers en lugkamers is gemaak van CNC-deursigtige akrielplastiek. Die rugsteunring met 'n deursnee van 7 mm is gemaak van hoëdigtheid-poliëtileen (HDPE) in die middel en het 'n o-ringgroef om die silikoon-o-ring te akkommodeer wat gebruik word om die media daaronder te verseël. 'n Dun silikamembraan skei die kultuurkamer van die skeidingsplaat. Die silikoonmembraan is lasergesny uit 'n 0,02″ dik silikoonplaat en het 'n hardheid van 35A. Die onderste en boonste silikoonpakkings is lasergesny uit 'n 1/16″ dik silikoonplaat en het 'n hardheid van 50A. 316L vlekvrye staalskroewe en vlerkmoere word gebruik om die blok vas te maak en 'n lugdigte seël te skep.
'n Toegewyde gedrukte stroombaanbord (PCB) is ontwerp om met die C-PACE-EM-stelsel geïntegreer te word. Die Switserse masjien-konnektorsokke op die PCB is aan grafietelektrodes gekoppel deur middel van versilwerde koperdrade en brons 0-60-skroewe wat in die elektrodes ingeskroef is. Die gedrukte stroombaanbord word in die deksel van die 3D-drukker geplaas.
Die CTCM-toestel word beheer deur 'n programmeerbare pneumatiese aktuator (PPD) wat 'n beheerde sirkulasiedruk skep soortgelyk aan 'n hartsiklus. Soos die druk binne die lugkamer toeneem, sit die buigsame silikoonmembraan opwaarts uit, wat die medium onder die weefselplek dwing. Die weefselarea sal dan deur hierdie uitstoot van vloeistof gerek word, wat die fisiologiese uitbreiding van die hart tydens diastole naboots. Op die piek van ontspanning is elektriese stimulasie deur grafietelektrodes toegepas, wat die druk in die lugkamer verminder het en sametrekking van weefselseksies veroorsaak het. Binne die pyp is 'n hemostatiese klep met 'n druksensor om die druk in die lugstelsel op te spoor. Die druk wat deur die druksensor waargeneem word, word toegepas op 'n data-insamelaar wat aan die skootrekenaar gekoppel is. Dit maak deurlopende monitering van die druk binne die gaskamer moontlik. Wanneer die maksimum kamerdruk bereik is (standaard 80 mmHg, 140 mmHg OS), is die data-insamelingstoestel beveel om 'n sein na die C-PACE-EM-stelsel te stuur om 'n tweefasige spanningssein vir 2 ms te genereer, ingestel op 4 V.
Hartseksies is verkry en die kweektoestande in 6 putjies is soos volg uitgevoer: Plaas die geoeste harte van die oordragvat oor na 'n bakkie met koue (4°C) kardioplegie. Die linkerventrikel is met 'n steriele lem geïsoleer en in stukke van 1-2 cm3 gesny. Hierdie weefselblokke is met weefselkleefmiddel aan weefselsteun vasgemaak en in 'n vibrerende mikrotoomweefselbad geplaas wat Tyrode se oplossing bevat en voortdurend geoksigeneer is (3 g/L 2,3-butaandioonmonooksiem (BDM), 140 mM NaCl (8.18 g), 6 mM KCl (0.447 g), 10 mM D-glukose (1.86 g), 10 mM HEPES (2.38 g), 1 mM MgCl2 (1 ml 1 M oplossing), 1.8 mM CaCl2 (1.8 ml 1 M oplossing), tot 1 L ddH2O). Die vibrerende mikrotoom is ingestel om 300 µm dik skywe te sny teen 'n frekwensie van 80 Hz, 'n horisontale vibrasie-amplitude van 2 mm en 'n vooruitgangstempo van 0.03 mm/s. Die weefselbad is deur ys omring om die oplossing koel te hou en die temperatuur is op 4°C gehandhaaf. Oordra weefselsnitte van die mikrotoombad na 'n inkubasiebad wat voortdurend geoksigeneerde Tyrode-oplossing op ys bevat totdat genoeg snitte vir een kultuurplaat verkry is. Vir transwell-kulture is weefselsnitte aan steriele 6 mm wye poliuretaan-ondersteunings geheg en in 6 ml geoptimaliseerde medium (199 medium, 1x ITS-aanvulling, 10% FBS, 5 ng/ml VEGF, 10 ng/ml FGF-alkalies en 2X antibiotika-antifungaal) geplaas. Elektriese stimulasie (10 V, frekwensie 1.2 Hz) is deur die C-Pace op die weefselsnitte toegepas. Vir TD-toestande is vars T3 en Dex bygevoeg teen 100 nM en 1 μM met elke mediumverandering. Die medium word drie keer per dag met suurstof versadig voor vervanging. Weefselsnitte is in 'n inkubeerder by 37°C en 5% CO2 gekweek.
Vir CTCM-kulture is weefselsnitte op 'n pasgemaakte 3D-drukker in 'n Petri-skottel geplaas wat gemodifiseerde Tyrode-oplossing bevat. Die toestel is ontwerp om die grootte van die sny van die hart met 25% van die area van die ondersteuningsring te vergroot. Dit word gedoen sodat die snitte van die hart nie rek nadat dit van Tyrode se oplossing na die medium en tydens diastole oorgedra is nie. Met behulp van histoakrielgom is snitte van 300 µm dik op 'n ondersteuningsring van 7 mm in deursnee vasgemaak. Nadat die weefselsnitte aan die ondersteuningsring vasgemaak is, sny die oortollige weefselsnitte af en plaas die aangehegte weefselsnitte terug in die bad van Tyrode-oplossing op ys (4°C) totdat genoeg snitte vir een toestel voorberei is. Die totale verwerkingstyd vir alle toestelle moet nie 2 uur oorskry nie. Nadat 6 weefselsnitte aan hul ondersteuningsringe vasgemaak is, is die CTCM-toestel saamgestel. Die CTCM-kultuurkamer is vooraf gevul met 21 ml vooraf-gesuurstofde medium. Plaas die weefselsnitte oor na die kultuurkamer en verwyder enige lugborrels versigtig met 'n pipet. Die weefselsnit word dan in die gat gelei en saggies in plek gedruk. Plaas laastens die elektrodekap op die toestel en dra die toestel na die broeikas oor. Koppel dan die CTCM aan die lugbuis en die C-PACE-EM-stelsel. Die pneumatiese aktuator maak oop en die lugklep maak die CTCM oop. Die C-PACE-EM-stelsel is gekonfigureer om 4 V teen 1.2 Hz te lewer tydens tweefasige pacing vir 2 ms. Die medium is twee keer per dag vervang en die elektrodes is een keer per dag vervang om die ophoping van grafiet op die elektrodes te vermy. Indien nodig, kan weefselsnitte uit hul kweekputjies verwyder word om enige lugborrels wat daaronder geval het, te verdryf. Vir MT-behandelingstoestande is T3/Dex vars bygevoeg met elke mediumverandering met 100 nM T3 en 1 μM Dex. Die CTCM-toestelle is in 'n broeikas by 37°C en 5% CO2 gekweek.
Om gestrekte trajekte van hartsnitte te verkry, is 'n spesiale kamerastelsel ontwikkel. 'n SLR-kamera (Canon Rebel T7i, Canon, Tokio, Japan) is gebruik met 'n Navitar Zoom 7000 18-108mm makrolens (Navitar, San Francisco, CA). Visualisering is by kamertemperatuur uitgevoer nadat die medium met vars medium vervang is. Die kamera word teen 'n hoek van 51° geposisioneer en video word teen 30 rame per sekonde opgeneem. Eerstens is oopbronsagteware (MUSCLEMOTION43) met Image-J gebruik om die beweging van hartsnitte te kwantifiseer. Die masker is geskep met behulp van MATLAB (MathWorks, Natick, MA, VSA) om streke van belang vir kloppende hartsnitte te definieer om geraas te vermy. Handmatig gesegmenteerde maskers word op alle beelde in 'n raamvolgorde toegepas en dan na die MUSCLEMOTION-inprop oorgedra. Muscle Motion gebruik die gemiddelde intensiteit van die pixels in elke raam om die beweging daarvan relatief tot die verwysingsraamwerk te kwantifiseer. Data is aangeteken, gefiltreer en gebruik om siklustyd te kwantifiseer en weefselstrek tydens die hartsiklus te bepaal. Die opgeneemde video is naverwerk met behulp van 'n eerste-orde nulfase digitale filter. Om weefselstrekking (piek-tot-piek) te kwantifiseer, is piek-tot-piek-analise uitgevoer om te onderskei tussen pieke en dale in die opgeneemde sein. Daarbenewens word onttrekking uitgevoer met behulp van 'n 6de-orde polinoom om seindrift uit te skakel. Programkode is in MATLAB ontwikkel om globale weefselbeweging, siklustyd, ontspanningstyd en sametrekkingstyd te bepaal (Aanvullende Programkode 44).
Vir spanningsanalise, met behulp van dieselfde video's wat vir meganiese strekassessering geskep is, het ons eers twee beelde nagespoor wat bewegingspieke (die hoogste (boonste) en laagste (onderste) bewegingspunte) volgens die MUSCLEMOTION-sagteware voorstel. Ons het toe die weefselstreke gesegmenteer en 'n vorm van skadu-algoritme op die gesegmenteerde weefsel toegepas (Aanvullende Fig. 2a). Die gesegmenteerde weefsel is toe in tien suboppervlaktes verdeel, en die spanning op elke oppervlak is bereken met behulp van die volgende vergelyking: Vervorming = (Aanvullende-Afvlakke)/Afvlakke, waar Aanvullende en Afvlakke die afstande van die vorm vanaf die boonste en onderste skaduwees van die materiaal is, onderskeidelik (Aanvullende Fig. .2b).
Hartseksies is vir 48 uur in 4% paraformaldehied gefikseer. Gefikseerde weefsels is vir 1 uur in 10% en 20% sukrose gedehidreer, en toe oornag in 30% sukrose. Die seksies is toe in 'n optimale snytemperatuurverbinding (OCT-verbinding) ingebed en geleidelik in 'n isopentaan/droëysbad gevries. Bêre OCT-inbeddingsblokke by -80 °C tot skeiding. Skyfies is as seksies met 'n dikte van 8 μm voorberei.
Om OCT uit hartsnitte te verwyder, verhit die skyfies op 'n verhittingsblok teen 95 °C vir 5 minute. Voeg 1 ml PBS by elke skyfie en inkubeer vir 30 minute by kamertemperatuur, en permeeer dan die snitte deur 0.1% Triton-X in PBS vir 15 minute by kamertemperatuur te plaas. Om te verhoed dat nie-spesifieke teenliggaampies aan die monster bind, voeg 1 ml van 'n 3% BSA-oplossing by die skyfies en inkubeer vir 1 uur by kamertemperatuur. Die BSA is toe verwyder en die skyfies is met PBS gewas. Merk elke monster met 'n potlood. Primêre teenliggaampies (verdun 1:200 in 1% BSA) (connexin 43 (Abcam; #AB11370), NFATC4 (Abcam; #AB99431) en troponien-T (Thermo Scientific; #MA5-12960) is oor 90 minute bygevoeg, dan sekondêre teenliggaampies (verdun 1:200 in 1% BSA) teen muis Alexa Fluor 488 (Thermo Scientific; #A16079), teen konyn Alexa Fluor 594 (Thermo Scientific; #T6391) vir 'n bykomende 90 minute. Drie keer gewas met PBS. Om teikenkleuring van agtergrond te onderskei, het ons slegs die sekondêre teenliggaam as 'n kontrole gebruik. Laastens is DAPI-kernkleuring bygevoeg en die skyfies is in 'n vectashield (Vector Laboratories) geplaas en met naellak verseël. (-x vergroting) en Keyence-mikroskoop met 40x vergroting.
WGA-Alexa Fluor 555 (Thermo Scientific; #W32464) teen 5 μg/ml in PBS is gebruik vir WGA-kleuring en vir 30 minute by kamertemperatuur op vaste snitte toegedien. Die skyfies is toe met PBS gewas en Soedan-swart is by elke skyfie gevoeg en vir 30 minute geïnkubeer. Die skyfies is toe met PBS gewas en Vectashield-inbeddingsmedium is bygevoeg. Skyfies is op 'n Keyence-mikroskoop teen 40x vergroting gevisualiseer.
OCT is soos hierbo beskryf uit die monsters verwyder. Nadat die OCT verwyder is, is die skyfies oornag in Bouin se oplossing gedompel. Die skyfies is toe vir 1 uur met gedistilleerde water afgespoel en toe vir 10 minute in 'n Bibrich-aalwynsuur-fuchsinoplossing geplaas. Daarna is die skyfies met gedistilleerde water gewas en vir 10 minute in 'n oplossing van 5% fosfomolibdeen/5% fosfowolfraamsuur geplaas. Plaas die skyfies direk in die anilienblou-oplossing vir 15 minute sonder om te spoel. Daarna is die skyfies met gedistilleerde water gewas en vir 2 minute in 'n 1% asynsuuroplossing geplaas. Die skyfies is in 200 N etanol gedroog en na xileen oorgedra. Gekleurde skyfies is gevisualiseer met behulp van 'n Keyence-mikroskoop met 'n 10x objektief. Die persentasie fibrose-area is gekwantifiseer met behulp van Keyence Analyzer-sagteware.
CyQUANT™ MTT Sellewensvatbaarheidstoets (Invitrogen, Carlsbad, CA), katalogusnommer V13154, volgens die vervaardiger se protokol met 'n paar wysigings. In die besonder is 'n chirurgiese pons met 'n deursnee van 6 mm gebruik om 'n eenvormige weefselgrootte tydens MTT-analise te verseker. Weefsels is individueel in die putjies van 'n 12-putjieplaat wat MTT-substraat bevat, geplaas volgens die vervaardiger se protokol. Die snitte word vir 3 uur by 37°C geïnkubeer en die lewende weefsel metaboliseer die MTT-substraat om 'n pers formasanverbinding te vorm. Vervang die MTT-oplossing met 1 ml DMSO en inkubeer vir 15 minute by 37°C om pers formasan uit hartsnitte te onttrek. Monsters is 1:10 in DMSO verdun in 96-putjie deursigtige bodemplate en die pers kleurintensiteit is gemeet by 570 nm met behulp van 'n Cytation-plaatleser (BioTek). Lesings is genormaliseer tot die gewig van elke sny van die hart.
Hartsnitmedia is vervang met media wat 1 μCi/ml [5-3H]-glukose (Moravek Biochemicals, Brea, CA, VSA) bevat vir die glukosebenuttingstoets soos voorheen beskryf. Na 4 uur inkubasie, voeg 100 µl medium by 'n oop mikrosentrifugebuis wat 100 µl 0.2 N HCl bevat. Daarna is die buis in 'n sintillasiebuis wat 500 μl dH2O bevat, geplaas om [3H]2O vir 72 uur by 37°C te verdamp. Verwyder dan die mikrosentrifugebuis uit die sintillasiebuis en voeg 10 ml sintillasievloeistof by. Sintillasietellings is uitgevoer met behulp van 'n Tri-Carb 2900TR vloeistofsintillasie-analiseerder (Packard Bioscience Company, Meriden, CT, VSA). Glukosebenutting is toe bereken met inagneming van [5-3H]-glukose-spesifieke aktiwiteit, onvolledige ewewig en agtergrond, verdunning van [5-3H]-tot ongemerkte glukose, en die doeltreffendheid van die sintillasieteller. Die data is genormaliseer na die massa van dele van die hart.
Na weefselhomogenisering in Trizol, is RNA uit hartseksies geïsoleer met behulp van die Qiagen miRNeasy Micro Kit #210874 volgens die vervaardiger se protokol. RNAsec-biblioteekvoorbereiding, volgordebepaling en data-analise is soos volg uitgevoer:
1 μg RNA per monster is as beginmateriaal gebruik vir die voorbereiding van die RNA-biblioteek. Volgordebepalingsbiblioteke is gegenereer met behulp van die NEBNext UltraTM RNA Library Preparation Kit vir Illumina (NEB, VSA) volgens die vervaardiger se aanbevelings, en indekskodes is by die attribuutvolgordes vir elke monster gevoeg. Kortliks, mRNA is gesuiwer uit totale RNA met behulp van magnetiese krale wat met poli-T-oligonukleotiede geheg is. Fragmentasie word uitgevoer met behulp van divalente katione by hoë temperatuur in NEBNext First Strand Synthesis Reaction Buffer (5X). Eerste string cDNA is gesintetiseer met behulp van ewekansige heksameerprimers en M-MuLV omgekeerde transkriptase (RNase H-). Die tweede string cDNA word dan gesintetiseer met behulp van DNA-polimerase I en RNase H. Die oorblywende oorhange word omgeskakel na stomp punte deur eksonuklease/polimerase-aktiwiteit. Na adenilering van die 3'-punt van die DNA-fragment word 'n NEBNext Adapter met 'n haarspeldlusstruktuur daaraan geheg om dit voor te berei vir hibridisering. Vir die seleksie van cDNA-fragmente van voorkeurlengte 150-200 bp. Biblioteekfragmente is gesuiwer met behulp van die AMPure XP-stelsel (Beckman Coulter, Beverly, VSA). Daarna is 3 μl USER Enzyme (NEB, VSA) met grootte-geselekteerde cDNA geligeer met 'n adapter vir 15 minute by 37°C en daarna vir 5 minute by 95°C voor PCR gebruik. PCR is toe uitgevoer met behulp van Phusion High-Fidelity DNA-polimerase, universele PCR-primers en Index (X)-primers. Laastens is PCR-produkte gesuiwer (AMPure XP-stelsel) en die biblioteekkwaliteit is beoordeel op 'n Agilent Bioanalyzer 2100-stelsel. Die cDNA-biblioteek is toe gesekwensieer met behulp van 'n Novaseq-sekwenseerder. Rou beeldlêers van Illumina is omgeskakel na rou lesings met behulp van CASAVA Base Calling. Rou data word gestoor in FASTQ(fq)-formaatlêers wat lessekwensies en ooreenstemmende basiskwaliteite bevat. Kies HISAT2 om gefiltreerde volgordebepalingslesings by die Sscrofa11.1-verwysingsgenoom te pas. Oor die algemeen ondersteun HISAT2 genome van enige grootte, insluitend genome groter as 4 miljard basisse, en standaardwaardes word vir die meeste parameters gestel. Splitsingslesings van RNA Seq-data kan doeltreffend in lyn gebring word met behulp van HISAT2, die vinnigste stelsel wat tans beskikbaar is, met dieselfde of beter akkuraatheid as enige ander metode.
Die oorvloed van transkripsies weerspieël direk die vlak van geenekspressie. Geenekspressievlakke word bepaal deur die oorvloed van transkripsies (volgordebepalingstelling) wat met die genoom of eksons geassosieer word. Die aantal lesings is eweredig aan geenekspressievlakke, geenlengte en volgordebepalingsdiepte. FPKM (fragmente per duisend basispare van transkripsie-gevolgorde per miljoen basispare) is bereken en P-waardes van differensiële ekspressie is bepaal met behulp van die DESeq2-pakket. Ons het toe die vals ontdekkingskoers (FDR) vir elke P-waarde bereken met behulp van die Benjamini-Hochberg-metode9 gebaseer op die ingeboude R-funksie "p.adjust".
RNS wat uit hartseksies geïsoleer is, is omgeskakel na cDNA teen 'n konsentrasie van 200 ng/μl met behulp van die SuperScript IV Vilo Master mix van Thermo (Thermo, kat. nr. 11756050). Kwantitatiewe RT-PCR is uitgevoer met behulp van 'n Applied Biosystems Endura Plate Microamp 384-put deursigtige reaksieplaat (Thermo, kat. nr. 4483319) en mikroamp optiese kleefmiddel (Thermo, kat. nr. 4311971). Die reaksiemengsel het bestaan ​​uit 5 µl Taqman Fast Advanced Master mix (Thermo, kat # 4444557), 0.5 µl Taqman Primer en 3.5 µl H2O gemeng per putjie. Standaard qPCR-siklusse is uitgevoer en CT-waardes is gemeet met behulp van 'n Applied Biosystems Quantstudio 5 intydse PCR-instrument (384-put module; produk # A28135). Taqman-primers is aangekoop van Thermo (GAPDH (Ss03375629_u1), PARP12 (Ss06908795_m1), PKDCC (Ss06903874_m1), CYGB (Ss06900188_m1), RGL1 (Ss06868890_m1), ACTN1 (Ss01009508_mH), GATA4 (Ss03383805_u1), GJA1 (Ss03374839_u1), COL1A2 (Ss03375009_u1), COL3A1 (Ss04323794_m1), ACTA2 (Ss04245588_m1). Die CT-waardes van alle monsters is genormaliseer na die huishoudingsgeen GAPDH.
Mediavrystelling van NT-ProBNP is geassesseer met behulp van die NT-ProBNP-kit (vark) (Kat. Nr. MBS2086979, MyBioSource) volgens die vervaardiger se protokol. Kortliks, 250 µl van elke monster en standaard is in duplikaat by elke putjie gevoeg. Onmiddellik na die byvoeging van die monster, voeg 50 µl Toetsreagens A by elke putjie. Skud die plaat liggies en verseël met seëlmiddel. Daarna is die tablette vir 1 uur by 37°C geïnkubeer. Aspireer dan die oplossing en was die putjies 4 keer met 350 µl 1X wasoplossing, en inkubeer die wasoplossing elke keer vir 1-2 minute. Voeg dan 100 µl Toetsreagens B per putjie by en verseël met plaatseëlmiddel. Die tablet is liggies geskud en vir 30 minute by 37°C geïnkubeer. Aspireer die oplossing en was die putjies 5 keer met 350 µl 1X wasoplossing. Voeg 90 µl substraatoplossing by elke putjie en verseël die plaat. Inkubeer die plaat by 37°C vir 10-20 minute. Voeg 50 µl Stopoplossing by elke putjie. Die plaat is onmiddellik gemeet met behulp van 'n Cytation (BioTek) plaatleser wat op 450 nm gestel is.
Kraganalises is uitgevoer om die groepgroottes te kies wat >80% krag sal verskaf om 'n absolute verandering van 10% in die parameter met 'n tipe I-foutkoers van 5% op te spoor. Kraganalises is uitgevoer om die groepgroottes te kies wat >80% krag sal verskaf om 'n absolute verandering van 10% in die parameter met 'n tipe I-foutkoers van 5% op te spoor. Анализ мощности был выполнен для выбора размеров групп, которые обеспечат > 80% moontlikhede vir verligting van 10% параметра с 5% частотой ошибок типа I. Kraganalise is uitgevoer om groepgroottes te selekteer wat >80% krag sou verskaf om 10% absolute parameterverandering met 'n 5% Tipe I-foutkoers op te spoor.进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％I型错误率的组大小。进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％I型错误率的组大小。 Был проведен анализ мощности для выбора размера группы, который обеспечил бы 80% мощности для обнаружения изменения параметров и 5% частоты ошибок типа I. 'n Kraganalise is uitgevoer om 'n groepgrootte te kies wat >80% krag sou verskaf om 10% absolute parameterverandering en 5% tipe I-foutkoers op te spoor.Weefselseksies is ewekansig gekies voor die eksperiment. Alle ontledings was kondisie-blind en monsters is eers gedekodeer nadat alle data geanaliseer is. GraphPad Prism sagteware (San Diego, CA) is gebruik om alle statistiese ontledings uit te voer. Vir alle statistieke is p-waardes as beduidend beskou by waardes <0.05. Vir alle statistieke is p-waardes as beduidend beskou by waardes <0.05. Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. Vir alle statistieke is p-waardes as beduidend beskou by waardes <0.05.对于所有统计数据，p 值在值<0.05 时被认为是显着的。对于所有统计数据，p 值在值<0.05 时被认为是显着的。 Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. Vir alle statistieke is p-waardes as beduidend beskou by waardes <0.05.Tweesydige Student se t-toets is op die data uitgevoer met slegs 2 vergelykings. Eenrigting- of tweerigting-ANOVA is gebruik om betekenisvolheid tussen verskeie groepe te bepaal. Wanneer post hoc-toetse uitgevoer is, is Tukey se korreksie toegepas om rekening te hou met verskeie vergelykings. RNAsec-data het spesiale statistiese oorwegings wanneer FDR en p.adjust bereken word, soos beskryf in die Metodes-afdeling.
Vir meer inligting oor studie-ontwerp, sien die Nature Research Report-opsomming wat aan hierdie artikel gekoppel is.