Salamat sa pagbisita sa Nature.com. Ang bersyon sa browser nga imong gigamit adunay limitado nga suporta sa CSS. Para sa pinakamaayong kasinatian, among girekomendar nga mogamit ka og updated nga browser (o i-disable ang Compatibility Mode sa Internet Explorer). Samtang, aron masiguro ang padayon nga suporta, among i-render ang site nga walay mga style ug JavaScript.
Kinahanglan ang usa ka kasaligan nga in vitro system nga makahimo sa pagkopya sa pisyolohikal nga palibot sa kasingkasing alang sa drug testing. Ang limitado nga magamit nga mga sistema sa human heart tissue culture misangpot sa dili tukma nga mga interpretasyon sa mga epekto sa tambal sa kasingkasing. Dinhi, nakahimo kami og cardiac tissue culture model (CTCM) nga electromechanically stimulate sa mga hiwa sa kasingkasing ug moagi sa physiological stretch atol sa systolic ug diastolic phases sa cardiac cycle. Human sa 12 ka adlaw nga culture, kini nga pamaagi nakapauswag sa viability sa mga seksyon sa kasingkasing, apan wala hingpit nga napreserbar ang ilang structural integrity. Busa, human sa small molecule screening, among nakita nga ang pagdugang sa 100 nM triiodothyronine (T3) ug 1 μM dexamethasone (Dex) sa among medium nagmintinar sa microstructure sa mga seksyon sulod sa 12 ka adlaw. Inubanan sa T3/Dex treatment, ang CTCM system nagmintinar sa transcriptional profiles, viability, metabolic activity, ug structural integrity sa parehas nga lebel sa presko nga tisyu sa kasingkasing sulod sa 12 ka adlaw. Dugang pa, ang sobra nga pag-inat sa tisyu sa kasingkasing sa kultura nag-induce sa hypertrophic cardiac signaling, nga naghatag ebidensya sa abilidad sa CTCM sa pagsundog sa mga hypertrophic nga kondisyon nga gipahinabo sa cardiac stretch. Sa konklusyon, ang CTCM makamodelo sa pisyolohiya ug patopisyolohiya sa kasingkasing pinaagi sa kultura sa taas nga panahon, nga makapahimo sa kasaligan nga drug screening.
Sa wala pa ang klinikal nga panukiduki, gikinahanglan ang kasaligan nga mga in vitro system nga tukma nga makakopya sa pisyolohikal nga palibot sa kasingkasing sa tawo. Ang ingon nga mga sistema kinahanglan nga mosundog sa giusab nga mekanikal nga pag-inat, rate sa kasingkasing, ug mga kabtangan sa electrophysiological. Ang mga modelo sa hayop kasagarang gigamit isip plataporma sa screening alang sa pisyolohiya sa kasingkasing nga adunay limitado nga kasaligan sa pagpakita sa mga epekto sa mga tambal sa kasingkasing sa tawo1,2. Sa katapusan, ang Ideal Cardiac Tissue Culture Experimental Model (CTCM) usa ka modelo nga sensitibo kaayo ug espesipiko alang sa lainlaing mga therapeutic ug pharmacological nga mga interbensyon, nga tukma nga nagkopya sa pisyolohiya ug pathophysiology sa kasingkasing sa tawo3. Ang pagkawala sa ingon nga sistema naglimite sa pagdiskobre sa mga bag-ong pagtambal alang sa pagkapakyas sa kasingkasing4,5 ug misangpot sa cardiotoxicity sa tambal isip usa ka mayor nga hinungdan sa paggawas sa merkado6.
Sulod sa miaging dekada, walo ka mga tambal nga dili para sa kasingkasing ug ugat ang gihunong na sa klinikal nga paggamit tungod kay kini hinungdan sa paglugway sa QT interval nga mosangpot sa ventricular arrhythmias ug kalit nga kamatayon7. Busa, adunay nagkadako nga panginahanglan alang sa kasaligan nga mga estratehiya sa preclinical screening aron masusi ang cardiovascular efficacy ug toxicity. Ang bag-o nga paggamit sa human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPS-CM) sa drug screening ug toxicity testing naghatag ug partial nga solusyon niini nga problema. Bisan pa, ang dili pa hamtong nga kinaiya sa hiPS-CMs ug ang kakulang sa multicellular complexity sa cardiac tissue mao ang mga nag-unang limitasyon niini nga pamaagi. Gipakita sa bag-o nga mga pagtuon nga kini nga limitasyon mahimong mabuntog pinaagi sa paggamit sa sayo nga hiPS-CM aron maporma ang mga hydrogel sa cardiac tissue wala madugay pagkahuman sa pagsugod sa kusang mga pagkontrata ug hinay-hinay nga pagdugang sa electrical stimulation sa paglabay sa panahon. Bisan pa, kini nga mga hiPS-CM microtissues kulang sa hamtong nga electrophysiological ug contractile nga mga kabtangan sa hamtong nga myocardium. Dugang pa, ang tisyu sa kasingkasing sa tawo adunay mas komplikado nga istruktura, nga gilangkoban sa usa ka heterogeneous nga sagol nga lainlaing mga tipo sa selula, lakip ang mga endothelial cells, neurons, ug stromal fibroblasts, nga konektado sa piho nga mga set sa extracellular matrix proteins. Kining pagkalainlain sa mga populasyon nga dili-cardiomyocyte11,12,13 sa hamtong nga kasingkasing sa mammal usa ka dakong babag sa pagmodelo sa tisyu sa kasingkasing gamit ang indibidwal nga mga tipo sa selula. Kining mga dagkong limitasyon nagpasiugda sa kamahinungdanon sa pagpalambo sa mga pamaagi alang sa pag-kultura sa wala madaot nga tisyu sa myocardial ubos sa mga kondisyon sa pisyolohikal ug patolohiya.
Ang gikultura nga nipis (300 µm) nga mga seksyon sa kasingkasing sa tawo napamatud-an nga usa ka maayong modelo sa hingpit nga myocardium sa tawo. Kini nga pamaagi naghatag og access sa usa ka kompleto nga 3D multicellular system nga susama sa tisyu sa kasingkasing sa tawo. Bisan pa, hangtod sa 2019, ang paggamit sa gikultura nga mga seksyon sa kasingkasing limitado sa mubo (24 oras) nga pagkabuhi sa kultura. Kini tungod sa daghang mga hinungdan lakip ang kakulang sa pisikal-mekanikal nga pag-inat, ang air-liquid interface, ug ang paggamit sa yano nga media nga dili mosuporta sa mga panginahanglanon sa tisyu sa kasingkasing. Niadtong 2019, daghang mga grupo sa panukiduki ang nagpakita nga ang paglakip sa mga mekanikal nga hinungdan sa mga sistema sa kultura sa tisyu sa kasingkasing makapalugway sa kinabuhi sa kultura, makapauswag sa ekspresyon sa kasingkasing, ug makasundog sa patolohiya sa kasingkasing. Duha ka elegante nga mga pagtuon 17 ug 18 nagpakita nga ang uniaxial mechanical loading adunay positibo nga epekto sa cardiac phenotype atol sa kultura. Bisan pa, kini nga mga pagtuon wala mogamit sa dinamikong three-dimensional physico-mechanical loading sa cardiac cycle, tungod kay ang mga seksyon sa kasingkasing gikargahan sa isometric tensile forces 17 o linear auxotonic loading 18. Kining mga pamaagi sa tissue stretching miresulta sa pagpugong sa daghang cardiac genes o sa overexpression sa mga genes nga nalangkit sa abnormal stretch responses. Ilabi na, si Pitoulis et al. 19 nakaugmad og dynamic heart slice culture bath para sa cardiac cycle reconstruction gamit ang force transducer feedback ug tension drives. Bisan tuod kini nga sistema nagtugot sa mas tukma nga in vitro cardiac cycle modeling, ang pagkakomplikado ug ubos nga throughput sa pamaagi naglimite sa paggamit niini nga sistema. Ang among laboratoryo bag-o lang nakaugmad og gipasimple nga culture system gamit ang electrical stimulation ug usa ka optimized medium aron mapadayon ang viability sa mga seksyon sa porcine ug human heart tissue hangtod sa 6 ka adlaw20,21.
Sa kasamtangang manuskrito, among gihulagway ang usa ka cardiac tissue culture model (CTCM) gamit ang mga seksyon sa kasingkasing sa baboy nga naglakip sa humoral cues aron i-recapitulate ang three-dimensional cardiac physiology ug pathophysiological distension atol sa cardiac cycle. Kini nga CTCM makadugang sa katukma sa pre-clinical drug prediction ngadto sa lebel nga wala pa makab-ot kaniadto pinaagi sa paghatag og cost-effective, mid-throughput cardiac system nga nagsundog sa physiology/pathophysiology sa mammalian heart para sa pre-clinical drug testing.
Ang mga hemodynamic mechanical signal adunay kritikal nga papel sa pagmintinar sa function sa cardiomyocyte in vitro 22,23,24. Sa kasamtangang manuskrito, nakahimo kami og CTCM (Figure 1a) nga makasundog sa palibot sa kasingkasing sa mga hamtong pinaagi sa pag-induce sa electrical ug mechanical stimulation sa physiological frequencies (1.2 Hz, 72 beats kada minuto). Aron malikayan ang sobra nga pag-inat sa tisyu atol sa diastole, usa ka 3D printing device ang gigamit aron madugangan ang gidak-on sa tisyu sa 25% (Fig. 1b). Ang electrical pacing nga gipahinabo sa C-PACE system gi-time nga magsugod 100 ms sa dili pa ang systole gamit ang data acquisition system aron hingpit nga makopya ang cardiac cycle. Ang tissue culture system naggamit og programmable pneumatic actuator (LB Engineering, Germany) aron cyclically nga palapdan ang usa ka flexible silicone membrane aron hinungdan sa pagpalapad sa mga hiwa sa kasingkasing sa ibabaw nga chamber. Ang sistema konektado sa usa ka external air line pinaagi sa usa ka pressure transducer, nga naghimo niini nga posible nga tukma nga ma-adjust ang pressure (± 1 mmHg) ug oras (± 1 ms) (Fig. 1c).
a Ikonektar ang seksyon sa tisyu sa 7 mm nga support ring, nga gipakita sa asul, sulod sa culture chamber sa device. Ang culture chamber gibulag gikan sa air chamber pinaagi sa nipis nga flexible silicone membrane. Butangi og gasket taliwala sa matag chamber aron malikayan ang pagtulo. Ang taklob sa device adunay mga graphite electrodes nga naghatag og electrical stimulation. b Eskematikong representasyon sa dako nga tissue device, guide ring ug support ring. Ang mga seksyon sa tisyu (brown) gibutang sa dako nga device diin ang guide ring gibutang sa groove sa gawas nga ngilit sa device. Gamit ang giya, ibutang pag-ayo ang support ring nga giputos sa tissue acrylic adhesive ibabaw sa seksyon sa cardiac tissue. c Graph nga nagpakita sa oras sa electrical stimulation isip function sa pressure sa air chamber nga gikontrol sa usa ka programmable pneumatic actuator (PPD). Usa ka data acquisition device ang gigamit aron i-synchronize ang electrical stimulation gamit ang pressure sensors. Kung ang pressure sa culture chamber makaabot sa gitakdang threshold, usa ka pulse signal ang ipadala sa C-PACE-EM aron ma-trigger ang electrical stimulation. d Hulagway sa upat ka CTCM nga gibutang sa usa ka incubator shelf. Upat ka mga aparato ang konektado sa usa ka PPD pinaagi sa usa ka pneumatic circuit, ug ang mga pressure sensor gisulod sa hemostatic valve aron mabantayan ang presyur sa pneumatic circuit. Ang matag aparato adunay unom ka mga seksyon sa tisyu.
Gamit ang usa ka pneumatic actuator, among nakontrol ang 4 ka CTCM device, nga ang matag usa niini makakupot og 6 ka tissue sections (Fig. 1d). Sa CTCM, ang air pressure sa air chamber gi-convert ngadto sa synchronous pressure sa fluid chamber ug nag-induce sa physiological expansion sa heart slice (Figure 2a ug Supplementary Movie 1). Ang ebalwasyon sa tissue stretch sa 80 mm Hg. Ang Art. nagpakita sa stretching sa tissue sections og 25% (Fig. 2b). Kini nga percentage stretch gipakita nga katumbas sa physiological sarcomere length nga 2.2–2.3 µm para sa normal cardiac section contractility17,19,25. Ang paglihok sa tissue gi-assess gamit ang custom camera settings (Supplementary Figure 1). Ang amplitude ug velocity sa paglihok sa tissue (Fig. 2c, d) katumbas sa stretch atol sa cardiac cycle ug oras atol sa systole ug diastole (Fig. 2b). Ang stretch ug velocity sa cardiac tissue atol sa contraction ug relaxation nagpabilin nga constant sulod sa 12 ka adlaw sa culture (Fig. 2f). Aron masusi ang epekto sa electrical stimulation sa contractility atol sa culture, nakahimo kami og pamaagi para sa pagtino sa active deformity gamit ang shading algorithm (Supplementary Fig. 2a,b) ug nakahimo kami sa pag-ila tali sa mga deformity nga adunay ug walay electrical stimulation. Ang parehas nga seksyon sa kasingkasing (Fig. 2f). Sa movable region sa cut (R6-9), ang boltahe atol sa electrical stimulation 20% nga mas taas kaysa sa wala’y electrical stimulation, nga nagpakita sa kontribusyon sa electrical stimulation sa contractile function.
Ang mga representatibong timailhan sa presyur sa air chamber, presyur sa fluid chamber, ug mga sukod sa paglihok sa tisyu nagpamatuod nga ang presyur sa chamber nag-usab sa presyur sa fluid chamber, nga hinungdan sa katugbang nga paglihok sa tissue slice. b Ang mga representatibong timailhan sa porsyento sa pag-inat (asul) sa mga seksyon sa tisyu nga katumbas sa porsyento sa pag-inat (kahel). c Ang gisukod nga paglihok sa cardiac slice nahiuyon sa gisukod nga katulin sa paglihok. (d) Mga representatibong trajectory sa cyclic motion (asul nga linya) ug velocity (kahel nga tuldok-tuldok nga linya) sa usa ka slice sa kasingkasing. e Pagkwenta sa oras sa siklo (n = 19 ka slice matag grupo, gikan sa lainlaing mga baboy), oras sa pagkontrata (n = 19 ka slice matag grupo), oras sa pagrelaks (n = 19 ka slice matag grupo, gikan sa lainlaing mga baboy), paglihok sa tisyu (n = 25 ). mga slice)/grupo gikan sa lainlaing mga baboy), peak systolic velocity (n = 24(D0), 25(D12) ka slice/grupo gikan sa lainlaing mga baboy) ug peak relaxation rate (n=24(D0), 25(D12) ka slice/grupo gikan sa lainlaing mga baboy). Ang Two-tailed Student's t-test wala magpakita og dakong kalainan sa bisan unsang parameter. f Representative strain analysis traces sa mga seksyon sa tisyu nga adunay (pula) ug walay (asul) nga electrical stimulation, napulo ka rehiyonal nga mga lugar sa mga seksyon sa tisyu gikan sa parehas nga seksyon. Ang mga panel sa ubos nagpakita sa kwantipikasyon sa porsyento nga kalainan sa strain sa mga seksyon sa tisyu nga adunay ug walay electrical stimulation sa napulo ka mga lugar gikan sa lainlaing mga seksyon. (n = 8 ka hiwa/grupo gikan sa lain-laing mga baboy, gihimo ang Two-tailed Student t-test; ****p < 0.0001, **p < 0.01, *p < 0.05). (n = 8 ka hiwa/grupo gikan sa lain-laing mga baboy, gihimo ang Two-tailed Student t-test; ****p < 0.0001, **p < 0.01, *p < 0.05). (n = 8 срезов/группу от разных свиней, проводится двусторонний t-критерий Стьюдента; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05). (n = 8 ka seksyon/grupo gikan sa lain-laing mga baboy, two-tailed Student's t-test; ****p<0.0001, **p<0.01, *p<0.05). （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p < 0.0001，**p < 0.01，*p < 0.05）。 （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p < 0.0001，**p < 0.01，*p < 0.05）。 (n = 8 срезов/группу, gikan sa разных свиней, двусторонний критерий Стьюдента; ****p <0,0001, **p <0,01, *p <0,05). (n = 8 ka seksyon/grupo, gikan sa lain-laing mga baboy, two-tailed Student's t-test; ****p<0.0001, **p<0.01, *p<0.05).Ang mga error bar nagrepresentar sa mean ± standard deviation.
Sa among miaging static biomimetic heart slice culture system [20, 21], among gimentinar ang viability, function, ug structural integrity sa mga heart slices sulod sa 6 ka adlaw pinaagi sa pag-apply og electrical stimulation ug pag-optimize sa medium composition. Apan, human sa 10 ka adlaw, kini nga mga numero miubos pag-ayo. Atong hisgutan ang mga seksyon nga gi-culture sa among miaging static biomimetic culture system 20, 21 control conditions (Ctrl) ug atong gamiton ang among kaniadto gi-optimize nga medium isip MC conditions ug culture ubos sa dungan nga mechanical ug electrical stimulation (CTCM). nga gitawag og . Una, among natino nga ang mechanical stimulation nga walay electrical stimulation dili igo aron mapadayon ang tissue viability sulod sa 6 ka adlaw (Supplementary Fig. 3a,b). Makapainteres, sa pagpaila sa physio-mechanical ug electrical stimulation gamit ang STCM, ang viability sa 12-day heart sections nagpabilin nga parehas sa presko nga heart sections ubos sa MS conditions, apan dili ubos sa Ctrl conditions, sama sa gipakita sa MTT analysis (Fig. 1). 3a). Kini nagsugyot nga ang mechanical stimulation ug simulation sa cardiac cycle makapadayon sa tissue sections nga mabuhi og doble sa gidugayon kay sa gitaho sa among miaging static culture system. Apan, ang pagtimbang-timbang sa structural integrity sa mga tissue section pinaagi sa immunolabeling sa cardiac troponin T ug connexin 43 nagpakita nga ang connexin 43 expression mas taas sa MC tissues sa ika-12 nga adlaw kaysa sa mga kontrol sa samang adlaw. Apan, ang uniporme nga connexin 43 expression ug Z-disc formation wala hingpit nga namintinar (Fig. 3b). Gigamit namo ang artificial intelligence (AI) framework aron masukod ang tissue structural integrity26, usa ka image-based deep learning pipeline nga gibase sa troponin-T ug connexin staining43 aron awtomatikong masukod ang structural integrity ug fluorescence sa mga heart slices sa termino sa kusog sa localization. Kini nga pamaagi naggamit og Convolutional Neural Network (CNN) ug usa ka deep learning framework aron masaligan nga masukod ang structural integrity sa cardiac tissue sa usa ka automated ug unbiased nga paagi, sama sa gihulagway sa reference. 26. Ang MC tissue nagpakita og mas maayong structural similarity sa day 0 kon itandi sa static control sections. Dugang pa, ang Masson's trichrome staining nagpakita og mas ubos nga porsyento sa fibrosis ubos sa MS conditions kon itandi sa control conditions sa ika-12 nga adlaw sa culture (Fig. 3c). Samtang ang CTCM nagdugang sa posibilidad nga mabuhi ang mga seksyon sa tisyu sa kasingkasing sa ika-12 nga adlaw ngadto sa lebel nga susama sa presko nga tisyu sa kasingkasing, wala kini kaayo nakapauswag sa istruktura sa mga seksyon sa kasingkasing.
Usa ka Bar graph ang nagpakita sa kwantipikasyon sa MTT viability sa preskong mga hiwa sa kasingkasing (D0) o heart slices culture sulod sa 12 ka adlaw sa static culture (D12 Ctrl) o sa CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) nga mga hiwa/grupo gikan sa lain-laing mga baboy, gihimo ang one way ANOVA test; ####p < 0.0001 kon itandi sa D0 ug **p < 0.01 kon itandi sa D12 Ctrl). Usa ka Bar graph ang nagpakita sa kwantipikasyon sa MTT viability sa preskong mga hiwa sa kasingkasing (D0) o heart slices culture sulod sa 12 ka adlaw sa static culture (D12 Ctrl) o sa CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) nga mga hiwa/grupo gikan sa lain-laing mga baboy, gihimo ang one way ANOVA test; ####p < 0.0001 kon itandi sa D0 ug **p < 0.01 kon itandi sa D12 Ctrl).Ang histogram nagpakita sa kwantipikasyon sa viability sa MTT fresh heart sections (D0) o culture sa heart sections sulod sa 12 ka adlaw sa static culture (D12 control) o CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 control). ) ), 12 (D12 MC) nga mga seksyon/grupo gikan sa lain-laing mga baboy, usa ka one-way ANOVA test ang gihimo;####p < 0,0001 по сравнению с D0 и **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p < 0.0001 kon itandi sa D0 ug **p < 0.01 kon itandi sa D12 Ctrl). usa ka 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切)片或心脏切片培养12 天的MTT 活力的量化)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单后行单后从相比，####p < 0.0001，与D12 Ctrl 相比，**p < 0.01). usa ka 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切)片，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；与D0 相比，####p < 0.0001，与与用 Ctrl)histogram nga nagpakita sa kwantipikasyon sa MTT viability sa preskong mga seksyon sa kasingkasing (D0) o mga seksyon sa kasingkasing nga gipatubo sulod sa 12 ka adlaw sa static culture (D12 control) o CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 control)), 12 (D12 MC) nga mga seksyon/grupo gikan sa lain-laing mga baboy, one-way ANOVA test;####p < 0,0001 по сравнению с D0, **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p < 0.0001 kon itandi sa D0, **p < 0.01 kon itandi sa D12 Ctrl).b Troponin-T (berde), connexin 43 (pula) ug DAPI (asul) sa bag-ong nahimulag nga mga seksyon sa kasingkasing (D0) o mga seksyon sa kasingkasing nga gikultura ubos sa static nga mga kondisyon (Ctrl) o mga kondisyon sa CTCM (MC) sulod sa 12 ka adlaw) sa representatibong mga imahe sa immunofluorescence (blank scale = 100 µm). Ang pagkwenta sa istruktura sa tisyu sa kasingkasing gamit ang artipisyal nga intelihensiya (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) nga mga hiwa/grupo matag usa gikan sa lainlaing baboy, gihimo ang one-way ANOVA test; ####p < 0.0001 kon itandi sa D0 ug ****p < 0.0001 kon itandi sa D12 Ctrl). Pagkwenta sa istruktura sa tisyu sa kasingkasing gamit ang artipisyal nga intelihensiya (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) nga mga hiwa/grupo matag usa gikan sa lainlaing mga baboy, gihimo ang one-way ANOVA test; ####p < 0.0001 kon itandi sa D0 ug ****p < 0.0001 kon itandi sa D12 Ctrl). Количественная оценка структурной целостности сердечной тпкани искусственным интеллектом (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 7 (D12 Ctrl) gikan sa разных свиней, проводится однофакторный тест ANOVA; Kwantipikasyon sa estruktural nga integridad sa tisyu sa kasingkasing pinaagi sa artificial intelligence (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) nga mga seksyon/grupo gikan sa lain-laing mga baboy, gihimo ang one-way ANOVA test; ####p < 0.0001 vs. nga adunay D0 ug ****p < 0.0001 kon itandi sa D12 Ctrl).人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) mga hiwa/grupo matag usa sa lain-laing baboy, one-way ANOVA test;####p01 ，####p0 ， 0.****p01 ， ####p01 ， ####p0 ， 0.****p < 0.0001 与D12 Ctrl 相比）。人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) mga hiwa/grupo matag usa sa lain-laing mga baboy, one-way ANOVA test;##00 < 0.000000,000. < 0.0001 与D12 Ctrl 相比）。 Искусственный интеллект для количественной оценки структурной целостности сердечной ткани (n = 7 (D0), 7 (D0), Ctrl12 (D12) срезов/группу каждой из разных свиней, односторонний тест ANOVA ####p <0,0001 vs. D0 Для сравнения ****p < 0,0001 по сравнения; Artipisyal nga intelihensiya aron masukod ang integridad sa istruktura sa tisyu sa kasingkasing (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) nga mga seksyon/grupo ang matag usa sa lainlaing mga baboy, one-way ANOVA test; ####p<0.0001 vs .D0 Para sa pagtandi ****p < 0.0001 kon itandi sa D12 Ctrl). c Mga representatibong hulagway (wala) ug kwantipikasyon (tuo) para sa mga hiwa sa kasingkasing nga gitina gamit ang Masson's trichrome stain (Scale bare = 500 µm) (n = 10 ka hiwa/grupo matag usa gikan sa lainlaing baboy, gihimo ang one-way ANOVA test; ####p < 0.0001 kon itandi sa D0 ug ***p < 0.001 kon itandi sa D12 Ctrl). c Mga representatibong hulagway (wala) ug kwantipikasyon (tuo) para sa mga hiwa sa kasingkasing nga gitina gamit ang Masson's trichrome stain (Scale bare = 500 µm) (n = 10 ka hiwa/grupo matag usa gikan sa lain-laing mga baboy, gihimo ang one-way ANOVA test; #### p < 0.0001 kon itandi sa D0 ug ***p < 0.001 kon itandi sa D12 Ctrl). c Репрезентативные изображения (слева) ug количественная оценка (справа) срезов сердца, окрашенных трихромным красимлате без покрытия = 500 мкм) (n = 10 срезов/группу от разных свиней, выполняется односторонний тест ANOVA; #### p < 0,00001 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Mga representatibong hulagway (wala) ug kwantipikasyon (tuo) sa mga seksyon sa kasingkasing nga gitina gamit ang Masson's trichrome stain (uncoated scale = 500 µm) (n = 10 ka seksyon/grupo gikan sa lain-laing mga baboy, gihimo ang one-way ANOVA test; #### p < 0 .0001 kon itandi sa D0 ug ***p < 0.001 kon itandi sa D12 Ctrl). c 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像（左）和量化（右）（裸尺度（裸尺度 = 5个切片/组，每组来自不同的猪，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0.0001 与D0 相比，***p < 0.0012 C 。 C 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 （左 左） 量化 （右） 裸尺度 裸尺度 裸尺度裸尺度 = 500 µm） （n = 10 个 切片 组 每 组 来自 不同 猪 ， 进行 单向 单向 单向 0##0.与D0 相比，***p < 0.001 与D12 Ctrl 相比）. c. = 500 мкм) (n = 10 срезов/группа, каждый от другой свиньи, протестировано с помощью однофакторного доного дисперси <###; 0,0001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Mga representatibong hulagway (wala) ug kwantidad (tuo) sa mga seksyon sa kasingkasing nga gitina gamit ang Masson's trichrome stain (blangko = 500 µm) (n = 10 ka seksyon/grupo, matag usa gikan sa lainlaing baboy, gisulayan pinaagi sa one-way analysis of variance ;### # p < 0.0001 kon itandi sa D0, ***p < 0.001 kon itandi sa D12 Ctrl).Ang mga error bar nagrepresentar sa mean ± standard deviation.
Among gihipotesis nga pinaagi sa pagdugang og gagmay nga mga molekula sa culture medium, ang integridad sa cardiomyocyte mahimong mapaayo ug ang paglambo sa fibrosis mokunhod atol sa CTCM culture. Busa, among gisusi ang gagmay nga mga molekula gamit ang among static control cultures20,21 tungod sa gamay nga gidaghanon sa mga confounding factors. Ang Dexamethasone (Dex), triiodothyronine (T3), ug SB431542 (SB) gipili alang niini nga screening. Kini nga gagmay nga mga molekula gigamit kaniadto sa mga hiPSC-CM culture aron maaghat ang pagkahinog sa mga cardiomyocyte pinaagi sa pagdugang sa gitas-on sa sarcomere, T-tubules, ug conduction velocity. Dugang pa, ang Dex (usa ka glucocorticoid) ug SB nailhan nga makapugong sa panghubag29,30. Busa, among gisulayan kung ang paglakip sa usa o usa ka kombinasyon niining gagmay nga mga molekula makapauswag sa istruktura nga integridad sa mga seksyon sa kasingkasing. Alang sa inisyal nga screening, ang dosis sa matag compound gipili base sa mga konsentrasyon nga kasagarang gigamit sa mga modelo sa cell culture (1 μM Dex27, 100 nM T327, ug 2.5 μM SB31). Human sa 12 ka adlaw nga pag-culture, ang kombinasyon sa T3 ug Dex miresulta sa labing maayong cardiomyocyte structural integrity ug gamay nga fibrous remodeling (Supplementary Figures 4 ug 5). Dugang pa, ang paggamit og doble o doble niining mga konsentrasyon sa T3 ug Dex nakamugna og makadaot nga mga epekto kon itandi sa normal nga konsentrasyon (Supplementary Fig. 6a,b).
Human sa inisyal nga screening, naghimo kami og head-to-head nga pagtandi sa 4 ka kondisyon sa culture (Figure 4a): Ctrl: mga seksyon sa kasingkasing nga gikultura sa among gihulagway kaniadto nga static culture gamit ang among gi-optimize nga medium; 20.21 TD: Gidugang ni T3 ug Ctrl si Dex niadtong Miyerkules; MC: mga seksyon sa kasingkasing nga gikultura sa CTCM gamit ang among gi-optimize kaniadto nga medium; ug MT: Gidugang ang CTCM nga adunay T3 ug Dex sa medium. Human sa 12 ka adlaw nga cultivation, ang viability sa MS ug MT tissues nagpabilin nga parehas sa presko nga mga tisyu nga gi-assess pinaagi sa MTT assay (Fig. 4b). Makapainteres, ang pagdugang sa T3 ug Dex sa transwell cultures (TD) wala moresulta sa usa ka hinungdanon nga pag-uswag sa viability kon itandi sa mga kondisyon sa Ctrl, nga nagpakita sa usa ka importante nga papel sa mechanical stimulation sa pagmintinar sa viability sa mga seksyon sa kasingkasing.
usa ka eksperimental nga disenyo nga diagram nga nagpakita sa upat ka kondisyon sa kultura nga gigamit aron masusi ang mga epekto sa mekanikal nga pagpukaw ug suplemento sa T3/Dex sa medium sulod sa 12 ka adlaw. b Ang bar graph nagpakita sa kwantipikasyon sa viability 12 ka adlaw human sa culture sa tanang 4 ka kondisyon sa culture (Ctrl, TD, MC, ug MT) kon itandi sa presko nga mga hiwa sa kasingkasing (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD ug D12 MT), 12 (D12 MC) nga mga hiwa/grupo gikan sa lain-laing mga baboy, gihimo ang one-way ANOVA test; ####p < 0.0001, ###p < 0.001 kon itandi sa D0 ug **p < 0.01 kon itandi sa D12 Ctrl). b Ang bar graph nagpakita sa kwantipikasyon sa viability 12 ka adlaw human sa culture sa tanang 4 ka kondisyon sa culture (Ctrl, TD, MC, ug MT) kon itandi sa presko nga mga hiwa sa kasingkasing (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD ug D12 MT), 12 (D12 MC) nga mga hiwa/grupo gikan sa lain-laing mga baboy, gihimo ang one-way ANOVA test; ####p < 0.0001, ###p < 0.001 kon itandi sa D0 ug **p < 0.01 kon itandi sa D12 ctrl). b Гистограмма показывает количественную оценку жизнеспособности через 12 дней после культивирования во всельникових 4 (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD и D12 MT), 12)/D12 зоп разных свиней, проводится односторонний тест ANOVA; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 по сравнению с D0 и **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). b Ang bar graph nagpakita sa kwantipikasyon sa viability sa 12 ka adlaw human sa culture sa tanang 4 ka kondisyon sa culture (control, TD, MC, ug MT) kon itandi sa presko nga mga seksyon sa kasingkasing (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD, ug D12 MT), 12 (D12 MC) nga mga seksyon/grupo gikan sa lain-laing mga baboy, one-way ANOVA test; ####p < 0.0001, ###p < 0.001 vs. D0 ug **p < 0.01 kon itandi sa D12 Ctrl). b 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) (n = 18 (Dl5)、 TD0和D12 MT)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；####p < 0.0001，###p < 0.001 ，p < 0.001 ，p<0.001 ，p<0.001 ，p<0.001 ，p**与D12控制）.b 4 12 (D12 MC) b Гистограмма, показывающая все 4 условия культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими (сердими (сердими) 1 15. <0,01 по сравнению с контролем D12). b Histogram nga nagpakita sa tanang 4 ka kondisyon sa kultura (kontrol, TD, MC ug MT) kon itandi sa preskong mga seksyon sa kasingkasing (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD ug D12 MT), gikan sa lain-laing mga baboy 12 (D12 MC) nga mga seksyon/grupo, one-way ANOVA test; ####p<0.0001, ###p<0.001 vs. D0, **p<0.01 vs. kontrol D12). Ang bar graph nagpakita sa kwantipikasyon sa glucose flux 12 ka adlaw human sa culture sa tanang 4 ka kondisyon sa culture (Ctrl, TD, MC, ug MT) kon itandi sa presko nga mga hiwa sa kasingkasing (D0) (n = 6 ka hiwa/grupo gikan sa lain-laing mga baboy, gihimo ang one-way ANOVA test; ###p < 0.001, kon itandi sa D0 ug ***p < 0.001 kon itandi sa D12 Ctrl). Ang bar graph nagpakita sa kwantipikasyon sa glucose flux 12 ka adlaw human sa culture sa tanang 4 ka kondisyon sa culture (Ctrl, TD, MC, ug MT) kon itandi sa presko nga mga hiwa sa kasingkasing (D0) (n = 6 ka hiwa/grupo gikan sa lain-laing mga baboy, gihimo ang one-way ANOVA test; ###p < 0.001, kon itandi sa D0 ug ***p < 0.001 kon itandi sa D12 Ctrl). c Гистограмма показывает количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после культивирования во всенку потока глюкозы через 12 дней после культивирования во всенох 4 лусих (контроль, TD, MC и MT) pinaagi sa сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 6 срезов/группу от разных свиней, роднин стоясти ANOVA; ###p < 0,001 по сравнению с D0 ug ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). Ang c Histogram nagpakita sa kwantipikasyon sa glucose flux 12 ka adlaw human sa culture ubos sa tanang 4 ka kondisyon sa culture (control, TD, MC ug MT) kon itandi sa presko nga mga seksyon sa kasingkasing (D0) (n = 6 ka seksyon/grupo gikan sa lain-laing mga baboy, gihimo ang one-way ANOVA test; ###p < 0.001 kon itandi sa D0 ug ***p < 0.001 kon itandi sa D12 Ctrl). c 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) 相寔，厹天的葡萄糖通量定量（n = 6 片/组，来自不同猪，单向执行ANOVA 测试；###p < 0.001 ，盎有1 ，与与D1与D12 Ctrl 相比）. C 条形图 显示 所有 4 种 条件 （（ctrl 、 td 、 mc 和 mt） 新鲜 心脏 切片 切片 ， 切片培养 后 后 12 天 的 通量 定量 （n = 6 片/组 ， 来自 猪 ， ， ， ， ， ， ， ， ， 猪 猪单同< 0.001，与D0 相比，***p < 0.001 与D12 Ctrl 相比）。 c Гистограмма, показывающая количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после культивирования для всех для всех культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 6 срезов/группа, от разинностой Были проведены тесты ANOVA ###p < 0,001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению с D12 (контроль). c Histogram nga nagpakita sa kwantipikasyon sa glucose flux sa 12 ka adlaw human sa culture para sa tanang 4 ka kondisyon sa culture (control, TD, MC, ug MT) kon itandi sa presko nga mga seksyon sa kasingkasing (D0) (n = 6 ka seksyon/grupo, gikan sa lain-laing mga baboy, unilateral. Sa diin gihimo ang mga ANOVA test, ###p < 0.001 kon itandi sa D0, ***p < 0.001 kon itandi sa D12 (control).d Mga plot sa pag-analisa sa strain sa presko (asul), ika-12 nga adlaw nga MC (berde), ug ika-12 nga adlaw nga MT (pula) nga mga tisyu sa napulo ka rehiyonal nga punto sa seksyon sa tisyu (n = 4 ka hiwa/grupo, one-way ANOVA test; walay dakong kalainan tali sa mga grupo). e Ang plot sa bulkan nga nagpakita sa lain-laing gipahayag nga mga gene sa presko nga mga seksyon sa kasingkasing (D0) kon itandi sa mga seksyon sa kasingkasing nga gikultura ubos sa static nga mga kondisyon (Ctrl) o ubos sa mga kondisyon sa MT (MT) sulod sa 10-12 ka adlaw. f Heatmap sa mga gene sa sarcomere para sa mga seksyon sa kasingkasing nga gikultura ubos sa matag usa sa mga kondisyon sa kultura. Ang mga error bar nagrepresentar sa mean ± standard deviation.
Ang metabolic dependence sa pagbalhin gikan sa fatty acid oxidation ngadto sa glycolysis usa ka timaan sa cardiomyocyte dedifferentiation. Ang mga immature cardiomyocyte panguna nga naggamit og glucose para sa produksiyon sa ATP ug adunay hypoplastic mitochondria nga adunay gamay nga cristae5,32. Ang mga pag-analisa sa paggamit sa glucose nagpakita nga ubos sa mga kondisyon sa MC ug MT, ang paggamit sa glucose parehas sa sa mga tisyu sa adlaw 0 (Figure 4c). Bisan pa, ang mga sample sa Ctrl nagpakita og dakong pagtaas sa paggamit sa glucose kon itandi sa presko nga tisyu. Kini nagpakita nga ang kombinasyon sa CTCM ug T3/Dex nagpalambo sa tissue viability ug nagpreserbar sa metabolic phenotype sa 12-day cultured heart sections. Dugang pa, ang strain analysis nagpakita nga ang lebel sa strain nagpabilin nga parehas sa presko nga tisyu sa kasingkasing sulod sa 12 ka adlaw ubos sa mga kondisyon sa MT ug MS (Fig. 4d).
Aron masusi ang kinatibuk-ang epekto sa CTCM ug T3/Dex sa tibuok kalibutan nga transcriptional landscape sa cardiac slice tissue, among gihimo ang RNAseq sa cardiac slices gikan sa tanang upat ka lain-laing culture conditions (Supplementary Data 1). Makapainteres, ang MT sections nagpakita og taas nga transcriptional similarity sa presko nga heart tissue, nga adunay 16 lang ka differentially expressed gikan sa 13,642 ka genes. Apan, sama sa among gipakita ganina, ang Ctrl slices nagpakita og 1229 ka differentially expressed genes human sa 10-12 ka adlaw sa culture (Fig. 4e). Kini nga datos gikumpirma sa qRT-PCR sa heart ug fibroblast genes (Supplementary Fig. 7a-c). Makapainteres, ang Ctrl sections nagpakita og downregulation sa cardiac ug cell cycle genes ug activation sa inflammatory gene programs. Kini nga datos nagsugyot nga ang dedifferentiation, nga kasagaran mahitabo human sa long-term culturing, hingpit nga mikunhod ubos sa MT conditions (Supplementary Fig. 8a,b). Ang maampingong pagtuon sa mga gene sa sarcomere nagpakita nga ubos lamang sa mga kondisyon sa MT nga ang mga gene nga nag-encode sa sarcomere (Fig. 4f) ug ion channel (Supplementary Fig. 9) mapreserbar, nga manalipod niini gikan sa pagpugong ubos sa mga kondisyon sa Ctrl, TD, ug MC. Kini nga datos nagpakita nga uban sa kombinasyon sa mechanical ug humoral stimulation (T3/Dex), ang heart slice transcriptome mahimong magpabilin nga susama sa presko nga mga hiwa sa kasingkasing human sa 12 ka adlaw sa kultura.
Kini nga mga nakaplagan sa transkripsyon gisuportahan sa kamatuoran nga ang integridad sa istruktura sa mga cardiomyocyte sa mga seksyon sa kasingkasing labing maayo nga mapreserbar ubos sa mga kondisyon sa MT sulod sa 12 ka adlaw, sama sa gipakita sa wala madaot ug lokal nga connexin 43 (Fig. 5a). Dugang pa, ang fibrosis sa mga seksyon sa kasingkasing ubos sa mga kondisyon sa MT mikunhod pag-ayo kon itandi sa Ctrl ug susama sa presko nga mga seksyon sa kasingkasing (Fig. 5b). Kini nga datos nagpakita nga ang kombinasyon sa mekanikal nga pagpukaw ug pagtambal sa T3/Dex epektibo nga nagpreserbar sa istruktura sa kasingkasing sa mga seksyon sa kasingkasing nga gi-kultura.
usa ka Representatibong mga imahe sa immunofluorescence sa troponin-T (berde), connexin 43 (pula), ug DAPI (asul) sa bag-ong nahimulag nga mga seksyon sa kasingkasing (D0) o gikultura sulod sa 12 ka adlaw sa tanang upat ka kondisyon sa pagkultura sa seksyon sa kasingkasing (scale bar = 100 µm). ). Ang pagkwenta sa istruktura sa tisyu sa kasingkasing gamit ang artipisyal nga paniktik (n = 7 (D0 ug D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC ug D12 MT) nga mga hiwa/grupo gikan sa lain-laing mga baboy, gihimo ang one-way ANOVA test; ####p < 0.0001 kon itandi sa D0 ug *p < 0.05, o ****p < 0.0001 kon itandi sa D12 Ctrl). Ang pagkwenta sa istruktura sa tisyu sa kasingkasing gamit ang artipisyal nga paniktik (n = 7 (D0 ug D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC ug D12 MT) nga mga hiwa/grupo gikan sa lain-laing mga baboy, gihimo ang one-way ANOVA test; #### p < 0.0001 kon itandi sa D0 ug *p < 0.05, o ****p < 0.0001 kon itandi sa D12 Ctrl). Количественная оценка структурной целостности ткани сердца с помощью искусственного интеллекта (n = 7 (D0 и TD15), D0 2 MC D12 MT) срезов/группу от разных свиней, проведен однофакторный тест ANOVA #### p < 0,0001 по сравнению с D0 ,**** и5 ли с D0 ,**** и5 ли < 0,**** и по < 0,**** и л сравнению sa D12 Ctrl). Kwantipikasyon sa estruktural nga integridad sa tisyu sa kasingkasing gamit ang artificial intelligence (n = 7 (D0 ug D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC ug D12 MT) nga mga seksyon/grupo gikan sa lain-laing mga baboy, gihimo ang one-way ANOVA test; #### p < 0.0001 kon itandi sa D0 ug *p < 0.05 o ****p < 0.0001 kon itandi sa D12 Ctrl).对不同猪的心脏组织结构完整性（n = 7（D0 和D12 Ctrl）、5（D12 TD、D12 MC 和D12 MT）切片/组）进行人工智能量化，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0.0001 与D0 和*p < 0.05 ，書是 < 0.05 ，書文与D12 Ctrl 相比）.对 不同 猪 的 心脏 结构 完整性 （n = 7 （d0 和 d12 ctrl） （5 （d12 td 、 d12 mc 和 d12智能量 化 进行 单向 单向 单向 测试 ； ########## p < 0.0001 与D0 和*p < 0.05 相月0 ， 戴 0.05 相比 ， 戸 相 0.相比）.Pagkwenta sa estruktural nga integridad sa tisyu sa kasingkasing gamit ang artificial intelligence sa lain-laing mga baboy (n = 7 (D0 ug D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC ug D12 MT) nga mga seksyon/grupo) nga adunay one-way ANOVA test;#### p < 0,0001 по сравнению с D0 и *p < 0,05 o ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). #### p < 0.0001 kon itandi sa D0 ug *p < 0.05 o ****p < 0.0001 kon itandi sa D12 Ctrl). b Mga representatibong hulagway ug kwantipikasyon para sa mga hiwa sa kasingkasing nga gitina gamit ang Masson's trichrome stain (Scale bar = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD, ug D12 MC), 9 (D12 MT) ka hiwa/grupo gikan sa lain-laing mga baboy, gihimo ang one-way ANOVA test; ####p < 0.0001 kon itandi sa D0 ug ***p < 0.001, o ****p < 0.0001 kon itandi sa D12 Ctrl). b Mga representatibong hulagway ug kwantipikasyon para sa mga hiwa sa kasingkasing nga gitina gamit ang Masson's trichrome stain (Scale bar = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD, ug D12 MC), 9 (D12 MT) ka hiwa/grupo gikan sa lain-laing mga baboy, gihimo ang one-way ANOVA test; ####p < 0.0001 kon itandi sa D0 ug ***p < 0.001, o ****p < 0.0001 kon itandi sa D12 Ctrl). b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромным красителем Массона ( мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD и D12 MC), 9 (D12 MT) срезов/группу от разных свиней, выполняется односторонний теля <##0сторонний тел. сравнению с D0 ug ***p < 0,001 o ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). b Mga representatibong hulagway ug kwantipikasyon sa mga seksyon sa kasingkasing nga gitina gamit ang Masson's trichrome stain (scale bar = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD ug D12 MC), 9 (D12 MT) nga mga seksyon/grupo gikan sa lain-laing mga baboy, gihimo ang one-way ANOVA; ####p < 0.0001 vs. D0 ug ***p < 0.001 o ****p < 0.0001 vs. D12 Ctrl). b 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像和量化（比例尺= 500 µm）！n = 10（D10） TD 和D12 MC），来自不同猪的9 个（D12 MT）切片/组，进行单因素方差分析；####p < 0.0001 < 丯有01 0.001，或****p < 0.0001 与D12 Ctrl 相比）. b 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 和 量化 （比例 尺 尺 尺 = 500 µm） = 500 µm） = 500 µm） ctrl 、 d12 td 和 d12 mc） 来自 不同 的 9 个 d12 mt 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片/组，进行单因素方差分析；####p < 0.0001 与D0 相比 ，*0****p <0. 0.0001 与D12 Ctrl 相比）。 b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромом Массона (масштабная = лим50) (D0, D12 Ctrl, D12 TD ug D12 MC), 9 (D12 MT) срезов от разных свиней / группы, один- способ ANOVA ####p < 0,0001 по, ***##p < 0,0001 свиней, один- способ ANOVA; ****p < 0,0001 по сравнению sa D12 Ctrl). b Mga representatibong hulagway ug kwantipikasyon sa mga seksyon sa kasingkasing nga gitina gamit ang Masson's trichrome (scale bar = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD ug D12 MC), 9 (D12 MT) nga mga seksyon gikan sa lain-laing mga baboy/grupo, usa ka pamaagi sa ANOVA; ####p < 0.0001 kon itandi sa D0, ***p < 0.001 o ****p < 0.0001 kon itandi sa D12 Ctrl).Ang mga error bar nagrepresentar sa mean ± standard deviation.
Sa katapusan, ang abilidad sa CTCM sa pagsundog sa cardiac hypertrophy gisusi pinaagi sa pagdugang sa cardiac tissue stretch. Sa CTCM, ang peak air chamber pressure misaka gikan sa 80 mmHg ngadto sa 80 mmHg. Art. (normal stretch) hangtod sa 140 mmHg Art. (Fig. 6a). Kini katumbas sa 32% nga pagtaas sa stretch (Fig. 6b), nga kaniadto gipakita isip katugbang nga porsyento sa stretch nga gikinahanglan para sa mga seksyon sa kasingkasing aron makab-ot ang gitas-on sa sarcomere nga susama sa nakita sa hypertrophy. Ang stretch ug velocity sa cardiac tissue atol sa contraction ug relaxation nagpabilin nga makanunayon sulod sa unom ka adlaw nga culture (Fig. 6c). Ang cardiac tissue gikan sa mga kondisyon sa MT gipailalom sa normal stretch (MT (Normal)) o overstretch nga mga kondisyon (MT (OS)) sulod sa unom ka adlaw. Human sa upat ka adlaw sa culture, ang hypertrophic biomarker NT-ProBNP miusbaw pag-ayo sa medium ubos sa mga kondisyon sa MT (OS) kon itandi sa mga kondisyon sa MT (normal) (Fig. 7a). Dugang pa, human sa unom ka adlaw nga culture, ang gidak-on sa cell sa MT (OS) (Fig. 7b) miusbaw pag-ayo kon itandi sa mga seksyon sa MT heart (normal). Dugang pa, ang NFATC4 nuclear translocation miusbaw pag-ayo sa mga tisyu nga sobra ang pagkaunat (Fig. 7c). Kini nga mga resulta nagpakita sa progresibong pag-uswag sa pathological remodeling pagkahuman sa hyperdistension ug nagsuporta sa konsepto nga ang CTCM device magamit isip plataporma sa pagtuon sa stretch-induced cardiac hypertrophy signaling.
Ang mga representatibong timailhan sa presyur sa air chamber, presyur sa fluid chamber, ug mga sukod sa paglihok sa tisyu nagpamatuod nga ang presyur sa chamber nag-usab sa presyur sa fluid chamber, nga hinungdan sa katugbang nga paglihok sa hiwa sa tisyu. b Representative stretch percentage ug stretch rate curves para sa normally stretched (orange) ug overstretched (blue) nga mga seksyon sa tisyu. c Bar graph nga nagpakita sa oras sa siklo (n = 19 ka hiwa matag grupo, gikan sa lainlaing mga baboy), oras sa pagkontrata (n = 18-19 ka hiwa matag grupo, gikan sa lainlaing mga baboy), oras sa pagrelaks (n = 19 ka hiwa matag grupo, gikan sa lainlaing mga baboy) ), amplitude sa paglihok sa tisyu (n = 14 ka hiwa/grupo, gikan sa lainlaing mga baboy), peak systolic velocity (n = 14 ka hiwa/grupo, gikan sa lainlaing mga baboy) ug peak relaxation rate (n = 14 (D0), 15 (D6) ) mga seksyon/grupo) gikan sa lainlaing mga baboy), two-tailed Student's t-test wala magpakita og dakong kalainan sa bisan unsang parameter, nga nagpakita nga kini nga mga parameter nagpabilin nga makanunayon sulod sa 6 ka adlaw nga pag-culture nga adunay overvoltage. Ang mga error bar nagrepresentar sa mean ± standard deviation.
usa ka Bar graph nga kwantipikasyon sa konsentrasyon sa NT-ProBNP sa culture media gikan sa mga hiwa sa kasingkasing nga gikultura ubos sa MT normal stretch (Norm) o overstretching (OS) nga mga kondisyon (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, ug D4 MTOS) nga mga hiwa/grupo gikan sa lain-laing mga baboy, gihimo ang Two-way ANOVA; **p < 0.01 kon itandi sa normal stretch). usa ka Bar graph nga kwantipikasyon sa konsentrasyon sa NT-ProBNP sa culture media gikan sa mga hiwa sa kasingkasing nga gikultura ubos sa MT normal stretch (Norm) o overstretching (OS) nga mga kondisyon (n ​​= 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, ug D4 MTOS) nga mga hiwa/grupo gikan sa lain-laing mga baboy, Two-way ANOVA ang gihimo; **p < 0.01 kon itandi sa normal stretch).Ang kwantitatibong histogram sa konsentrasyon sa NT-ProBNP sa medium sa kultura gikan sa mga hiwa sa kasingkasing nga gikultura ubos sa mga kondisyon sa normal nga MT stretch (norm) o overstretch (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, ug D4).MTOS) nga mga hiwa /grupo gikan sa lainlaing mga baboy, gihimo ang two-factor analysis of variance;**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p < 0.01 kon itandi sa normal nga pag-inat). a 在MT 正常拉伸(Norm) 或过度拉伸(OS) 条件下培养的心脏切片培养基中NT-ProBNP 浓度的条度的条度4 (D2 MTNorm)、3（D2 MTOS、D4 MTNorm 和D4 MTOS）来自不同猪的切片/组，进行双向方差分析；p中文一中中文中文0.01). a Quantification sa konsentrasyon sa NT-ProBNP sa mga hiwa sa kasingkasing nga gi-culture ubos sa MT normal stretch (Norm) o overstretch (OS) nga kondisyon (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm和D4 MTOS) gikan sa lain-laing ** itandi sa normal nga pag-inat, p <0.01).histogram Kwantipikasyon sa konsentrasyon sa NT-ProBNP sa mga hiwa sa kasingkasing nga gipatubo ubos sa mga kondisyon sa normal nga MT stretch (norm) o overstretch (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm) ug D4 MTOS) nga mga hiwa/grupo gikan sa lain-laing mga baboy, two-way analysis of variance;**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p < 0.01 kon itandi sa normal nga pag-inat). b Mga representatibong hulagway para sa mga hiwa sa kasingkasing nga gitinahan og troponin-T ug WGA (wala) ug kwantipikasyon sa gidak-on sa selula (tuo) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) nga mga selula/grupo gikan sa 10 ka lain-laing mga hiwa gikan sa lain-laing mga baboy, gihimo ang Two-tailed Student t-test; ****p < 0.0001 kon itandi sa normal nga pag-inat). b Mga representatibong hulagway para sa mga hiwa sa kasingkasing nga gitinahan og troponin-T ug WGA (wala) ug kwantipikasyon sa gidak-on sa selula (tuo) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) nga mga selula/grupo gikan sa 10 ka lain-laing mga hiwa gikan sa lain-laing mga baboy, Gihimo ang Two-tailed Student t-test; ****p < 0.0001 kon itandi sa normal nga pag-inat). b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слева) и количественного опеникрадрадца (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) клеток/группу из 10 разных срезов от разных свиней, два- проводится х t-стойстой ****p < 0,0001 по сравнению с нормальным растяжением). b Mga representatibong hulagway sa mga seksyon sa kasingkasing nga gitinahan og troponin-T ug AZP (wala) ug kwantipikasyon sa gidak-on sa selula (tuo) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) nga mga selula/grupo gikan sa 10 ka lain-laing mga seksyon gikan sa lain-laing mga baboy, gihimo ang two-tailed Student's t-test; ****p < 0.0001 kon itandi sa normal nga strain). b 用肌钙蛋白-T 和WGA（左）和细胞大小量化（右）染色的心脏切片的代表性（小量化（右）染色的心脏切片的代表性（图图MTOS），来自不同猪的10 个不同切片的369（D6 MTNorm）细胞/组，两进行有尾学生t检验；与正常拉伸相比，****p < 0.0001）。 b Mga representatibong hulagway sa mga hiwa sa kasingkasing nga gitinahan og calcarein-T ug WGA (wala) ug gidak-on sa selula (tuo) (n = 330 (D6 MTOS), 369 gikan sa 10 ka lain-laing mga hiwa (D6 MTNorm)) Mga Selyula/组，两方法有尾学生t test；itandi sa normal nga pag-inat，****p < 0.0001). b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слева) и количественная оцленка оцленка 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) из 10 различных срезов от разных свиней Клетки/группа, двусторонние критерий Ста;юд0 сравнению с нормальным растяжением). b Mga representatibong hulagway sa mga seksyon sa kasingkasing nga gitinahan og troponin-T ug AZP (wala) ug kwantipikasyon sa gidak-on sa selula (tuo) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) gikan sa 10 ka lain-laing mga seksyon gikan sa lain-laing mga baboy) Mga selula/grupo, duha ka ikog nga sukdanan Student's t; ****p < 0.0001 kon itandi sa normal nga strain). c Mga representatibong hulagway para sa adlaw 0 ug adlaw 6 nga MTOS heart slices nga gi-immunolabel para sa troponin-T ug NFATC4 ug kwantipikasyon sa translocation sa NFATC4 ngadto sa nuclei sa CMs (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) slices/grupo gikan sa lain-laing baboy, gihimo ang Two-tailed Student t-test; *p < 0.05). c Mga representatibong hulagway para sa adlaw 0 ug adlaw 6 nga MTOS heart slices nga gi-immunolabel para sa troponin-T ug NFATC4 ug kwantipikasyon sa translocation sa NFATC4 ngadto sa nuclei sa CMs (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) slices/grupo gikan sa lain-laing baboy, gihimo ang Two-tailed Student t-test; *p < 0.05). c. транслокации NFATC4 в ядра кавернозных клеток (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срезов/группу от разных свиней , вылндяетсрикрикрой Стьюдента; *p < 0,05). c Mga representatibong hulagway para sa mga seksyon sa kasingkasing sa 0 ug 6 ka adlaw nga MTOS, immunolabeled para sa troponin-T ug NFATC4, ug kwantipikasyon sa translocation sa NFATC4 sa nucleus sa mga cavernous cells (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) nga mga hiwa/grupo gikan sa lain-laing mga baboy) nga gihimo gamit ang two-tailed Student's t-test; *p < 0.05). c 用于肌钙蛋白-T 和NFATC4 免疫标记的第0 天和第6 天MTOS心脏切片的代表性图像，以及来自不同猪的NFATC4 易位至CM 细胞核的量化（n = 4 (D0)、 MTOS) (D0)、进行双尾学生t 检验；*p < 0.05). c Representante nga mga hulagway sa calcanin-T ug NFATC4 immunolabeling 第0天和第6天MTOS heart slices, ug NFATC4 gikan sa lain-laing NFATC4 易位至CM cell nucleus的quantity化 (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS)/爇时间双尾学生et 电影；*p < 0.05). c. транслокации NFATC4 sa ядра CM gikan sa разных свиней (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срез/группа, два- хвостатый t-критерий Сюден 0, *0). c Mga representatibong hulagway sa mga hiwa sa kasingkasing sa MTOS sa adlaw 0 ug 6 para sa troponin-T ug NFATC4 immunolabeling ug kwantipikasyon sa NFATC4 translocation sa nucleus sa CM gikan sa lain-laing mga baboy (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) nga mga hiwa/grupo, duha ka ikog nga t-criterion Student's; *p < 0.05).Ang mga error bar nagrepresentar sa mean ± standard deviation.
Ang Translational Cardiovascular Research nanginahanglan og mga cellular model nga tukma nga mosundog sa palibot sa kasingkasing. Niini nga pagtuon, usa ka CTCM device ang naugmad ug gihulagway nga makapukaw sa nipis kaayo nga mga seksyon sa kasingkasing. Ang CTCM system naglakip sa physiologically synchronized electromechanical stimulation ug T3 ug Dex fluid enrichment. Sa dihang ang mga seksyon sa kasingkasing sa baboy naladlad niining mga butanga, ang ilang viability, structural integrity, metabolic activity, ug transcriptional expression nagpabilin nga parehas sa presko nga tisyu sa kasingkasing human sa 12 ka adlaw nga culture. Dugang pa, ang sobra nga pag-inat sa tisyu sa kasingkasing mahimong hinungdan sa hypertrophy sa kasingkasing nga gipahinabo sa hyperextension. Sa kinatibuk-an, kini nga mga resulta nagsuporta sa kritikal nga papel sa mga kondisyon sa physiological culture sa pagmintinar sa normal nga cardiac phenotype ug naghatag og plataporma alang sa drug screening.
Daghang mga butang ang nakatampo sa pagmugna og usa ka labing maayo nga palibot alang sa pag-obra ug pagkabuhi sa mga cardiomyocyte. Ang labing klaro niini nga mga butang may kalabutan sa (1) interaksyon sa intercellular, (2) electromechanical stimulation, (3) humoral factors, ug (4) metabolic substrates. Ang physiological cell-to-cell interactions nanginahanglan og komplikado nga three-dimensional networks sa daghang mga tipo sa cell nga gisuportahan sa usa ka extracellular matrix. Ang ingon nga komplikado nga mga interaksyon sa cellular lisud nga tukuron pag-usab in vitro pinaagi sa co-culture sa indibidwal nga mga tipo sa cell, apan dali nga makab-ot gamit ang organotypic nga kinaiya sa mga seksyon sa kasingkasing.
Ang mekanikal nga pag-inat ug elektrikal nga pag-stimulate sa mga cardiomyocyte kritikal alang sa pagmintinar sa cardiac phenotype33,34,35. Samtang ang mekanikal nga pag-stimulate kaylap nga gigamit alang sa hiPSC-CM conditioning ug maturation, daghang elegante nga mga pagtuon ang bag-o lang misulay sa mekanikal nga pag-stimulate sa mga hiwa sa kasingkasing sa kultura gamit ang uniaxial loading. Kini nga mga pagtuon nagpakita nga ang 2D uniaxial mechanical loading adunay positibo nga epekto sa phenotype sa kasingkasing atol sa kultura. Niini nga mga pagtuon, ang mga seksyon sa kasingkasing gi-load sa isometric tensile forces17, linear auxotonic loading18, o ang cardiac cycle gihimo pag-usab gamit ang force transducer feedback ug tension drives. Bisan pa, kini nga mga pamaagi naggamit sa uniaxial tissue stretch nga wala’y pag-optimize sa kalikopan, nga miresulta sa pagpugong sa daghang mga cardiac gene o sobra nga ekspresyon sa mga gene nga nalangkit sa dili normal nga mga tubag sa pag-inat. Ang CTCM nga gihulagway dinhi naghatag usa ka 3D electromechanical stimulus nga nagsundog sa natural nga cardiac cycle sa mga termino sa oras sa siklo ug physiological stretch (25% stretch, 40% systole, 60% diastole, ug 72 ka beats kada minuto). Bisan tuod kining tulo-ka-dimensyon nga mekanikal nga pagpukaw lamang dili igo aron mapadayon ang integridad sa tisyu, ang kombinasyon sa humoral ug mekanikal nga pagpukaw gamit ang T3/Dex gikinahanglan aron igong mapadayon ang pagkabuhi, pag-obra, ug integridad sa tisyu.
Ang mga humoral factor adunay importanteng papel sa pag-modulate sa phenotype sa kasingkasing sa mga hamtong. Kini gipasiugda sa mga pagtuon sa HiPS-CM diin ang T3 ug Dex gidugang sa culture media aron mapadali ang pagkahinog sa selula. Ang T3 mahimong makaimpluwensya sa pagdala sa mga amino acid, asukal, ug calcium tabok sa mga lamad sa selula36. Dugang pa, ang T3 nagpasiugda sa ekspresyon sa MHC-α ug pag-ubos sa MHC-β, nga nagpasiugda sa pagporma sa paspas nga pagkurog sa myofibrils sa hamtong nga cardiomyocytes kon itandi sa hinay nga pagkurog sa myofibrils sa fetal CM. Ang kakulangan sa T3 sa mga pasyente nga adunay hypothyroid moresulta sa pagkawala sa mga myofibrillar band ug pagkunhod sa rate sa paglambo sa tono37. Ang Dex molihok sa mga glucocorticoid receptor ug gipakita nga nagdugang sa myocardial contractility sa nahimulag nga perfused hearts; 38 kini nga pag-uswag gituohan nga may kalabutan sa epekto sa calcium deposit-driven entry (SOCE) 39,40. Dugang pa, ang Dex mogapos sa mga receptor niini, nga hinungdan sa usa ka halapad nga intracellular nga tubag nga nagpugong sa immune function ug panghubag30.
Ang among mga resulta nagpakita nga ang pisikal nga mekanikal nga pag-stimulate (MS) nakapauswag sa kinatibuk-ang performance sa kultura kon itandi sa Ctrl, apan napakyas sa pagmintinar sa viability, structural integrity, ug cardiac expression sulod sa 12 ka adlaw sa kultura. Kon itandi sa Ctrl, ang pagdugang sa T3 ug Dex sa CTCM (MT) nga mga kultura nakapauswag sa viability ug nagmintinar sa susamang transcription profiles, structural integrity, ug metabolic activity nga adunay presko nga tisyu sa kasingkasing sulod sa 12 ka adlaw. Dugang pa, pinaagi sa pagkontrol sa degree sa tissue stretch, usa ka hyperextension-induced cardiac hypertrophy model ang gihimo gamit ang STCM, nga nagpakita sa versatility sa STCM system. Kinahanglan nga matikdan nga bisan kung ang cardiac remodeling ug fibrosis kasagaran naglambigit sa mga intact nga organ kansang circulating cells makahatag sa angay nga cytokines ingon man phagocytosis ug uban pang remodeling factors, ang mga seksyon sa kasingkasing mahimo gihapon nga mosundog sa fibrotic process agig tubag sa stress ug trauma ngadto sa myofibroblasts. Kini gisusi na kaniadto niining cardiac slice model. Kinahanglan nga matikdan nga ang mga parameter sa CTCM mahimong ma-modulate pinaagi sa pag-usab sa pressure/electrical amplitude ug frequency aron ma-simulate ang daghang mga kondisyon sama sa tachycardia, bradycardia, ug mechanical circulatory support (mechanical unloaded heart). Kini naghimo sa sistema nga usa ka medium throughput para sa drug testing. Ang abilidad sa CTCM sa pag-modelo sa overexertion-induced cardiac hypertrophy nagbukas sa dalan para sa pagsulay niini nga sistema para sa personalized nga therapy. Sa konklusyon, kini nga pagtuon nagpakita nga ang mechanical stretch ug humoral stimulation importante para sa pagmintinar sa kultura sa mga cardiac tissue section.
Bisan tuod ang datos nga gipresentar dinhi nagsugyot nga ang CTCM usa ka maayong plataporma alang sa pagmodelo sa intact myocardium, kini nga pamaagi sa kultura adunay pipila ka mga limitasyon. Ang pangunang limitasyon sa kultura sa CTCM mao nga kini nagpahamtang sa padayon nga dinamikong mekanikal nga mga stress sa mga hiwa, nga nagpugong sa abilidad sa aktibong pagmonitor sa mga pagkontrata sa cardiac slice sa matag siklo. Dugang pa, tungod sa gamay nga gidak-on sa mga seksyon sa kasingkasing (7 mm), ang abilidad sa pagtimbang-timbang sa systolic function gawas sa mga sistema sa kultura gamit ang tradisyonal nga mga sensor sa puwersa limitado. Sa kasamtangang manuskrito, among nabuntog kini nga limitasyon pinaagi sa pagtimbang-timbang sa optical voltage isip usa ka timailhan sa contractile function. Bisan pa, kini nga limitasyon magkinahanglan og dugang nga trabaho ug mahimong matubag sa umaabot pinaagi sa pagpaila sa mga pamaagi alang sa optical monitoring sa function sa mga hiwa sa kasingkasing sa kultura, sama sa optical mapping gamit ang calcium ug voltage-sensitive dyes. Laing limitasyon sa CTCM mao nga ang nagtrabaho nga modelo wala magmaniobra sa physiological stress (preload ug afterload). Sa CTCM, ang presyur gipahinabo sa magkaatbang nga direksyon aron masubli ang 25% nga physiological stretch sa diastole (full stretch) ug systole (gitas-on sa pagkontrata atol sa electrical stimulation) sa dagkong mga tisyu. Kini nga limitasyon kinahanglan nga tangtangon sa umaabot nga mga disenyo sa CTCM pinaagi sa igong presyur sa tisyu sa kasingkasing gikan sa duha ka kilid ug pinaagi sa pagpadapat sa eksaktong relasyon sa presyur-volume nga mahitabo sa mga lawak sa kasingkasing.
Ang overstretch-induced remodeling nga gitaho niini nga manuskrito limitado lamang sa pagsundog sa mga hypertrophic hyperstretch signal. Busa, kini nga modelo makatabang sa pagtuon sa stretch-induced hypertrophic signaling nga dili kinahanglan ang humoral o neural factors (nga wala niini nga sistema). Gikinahanglan ang dugang nga mga pagtuon aron madugangan ang pagkadaghan sa CTCM, pananglitan, ang co-culturing sa mga immune cells, circulating plasma humoral factors, ug innervation kung ang co-culturing sa mga neuronal cells makapauswag sa mga posibilidad sa disease modeling gamit ang CTCM.
Trese ka baboy ang gigamit niini nga pagtuon. Ang tanang pamaagi sa hayop gihimo subay sa mga giya sa institusyon ug giaprobahan sa University of Louisville Institutional Animal Care and Use Committee. Ang aortic arch gi-clamp ug ang kasingkasing giperfuse gamit ang 1 L nga sterile cardioplegia (110 mM NaCl, 1.2 mM CaCl2, 16 mM KCl, 16 mM MgCl2, 10 mM NaHCO3, 5 U/mL heparin, pH hangtod sa 7.4); ang mga kasingkasing gipreserbar sa bugnaw kaayong cardioplegic solution hangtod nga gidala sa laboratoryo ibabaw sa yelo nga kasagaran <10 minutos. ang mga kasingkasing gipreserbar sa bugnaw kaayong cardioplegic solution hangtod nga gidala sa laboratoryo ibabaw sa yelo nga kasagaran <10 minutos. сердца хранили в ледяном кардиоплегическом растворе до транспортировки в лабораторию на льду, что обычно занимает <10нимает. Ang mga kasingkasing gitipigan sa bugnaw kaayong cardioplegic solution hangtod nga madala sa laboratoryo sakay sa yelo, nga kasagaran molungtad og <10 minutos.将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钟。将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钟。 Держите сердца в ледяной кардиоплегии до транспортировки в лабораторию на льду, обычно <10 мин. Ipadayon nga naa sa yelo ang kasingkasing ug adunay cardioplegia hangtod nga madala sa laboratoryo nga naa sa yelo, kasagaran <10 minutos.
Ang CTCM device gihimo gamit ang SolidWorks computer-aided design (CAD) software. Ang mga culture chamber, divider, ug air chamber hinimo sa CNC clear acrylic plastic. Ang 7mm diameter nga back-up ring hinimo sa high density polyethylene (HDPE) sa tunga ug adunay o-ring groove aron ma-accommodate ang silicone o-ring nga gigamit sa pagsilyo sa media sa ilalom. Usa ka nipis nga silica membrane ang nagbulag sa culture chamber gikan sa separation plate. Ang silicone membrane giputol gamit ang laser gikan sa 0.02″ nga gibag-on nga silicone sheet ug adunay katig-a nga 35A. Ang ubos ug ibabaw nga silicone gasket giputol gamit ang laser gikan sa 1/16″ nga gibag-on nga silicone sheet ug adunay katig-a nga 50A. Ang 316L stainless steel screws ug wing nuts gigamit sa pag-fasten sa block ug paghimo og airtight seal.
Usa ka dedikado nga printed circuit board (PCB) ang gidisenyo aron i-integrate sa C-PACE-EM system. Ang mga swiss machine connector sockets sa PCB konektado sa mga graphite electrodes pinaagi sa mga silver-plated copper wires ug bronze 0-60 screws nga gi-screw sa mga electrodes. Ang printed circuit board gibutang sa hapin sa 3D printer.
Ang CTCM device gikontrolar sa usa ka programmable pneumatic actuator (PPD) nga nagmugna og kontroladong circulatory pressure nga susama sa cardiac cycle. Samtang motaas ang pressure sulod sa air chamber, ang flexible silicone membrane molapad pataas, nga mopugos sa medium nga moilalom sa tissue site. Ang tissue area unya moinat pinaagi niining pagpagawas sa pluwido, nga mosundog sa physiological expansion sa kasingkasing atol sa diastole. Sa kinapungkayan sa relaxation, ang electrical stimulation gi-apply pinaagi sa graphite electrodes, nga mikunhod sa pressure sa air chamber ug hinungdan sa pagkontrata sa mga tissue section. Sulod sa tubo adunay hemostatic valve nga adunay pressure sensor aron makamatikod sa pressure sa air system. Ang pressure nga na-sense sa pressure sensor gi-apply sa data collector nga konektado sa laptop. Kini nagtugot sa padayon nga pagmonitor sa pressure sulod sa gas chamber. Sa dihang naabot na ang maximum chamber pressure (standard 80 mmHg, 140 mmHg OS), ang data acquisition device gimandoan nga magpadala og signal sa C-PACE-EM system aron makamugna og biphasic voltage signal sulod sa 2 ms, nga gibutang sa 4 V.
Ang mga seksyon sa kasingkasing gikuha ug ang mga kondisyon sa kultura sa 6 ka atabay gihimo sama sa mosunod: Ibalhin ang nakuha nga mga kasingkasing gikan sa transfer vessel ngadto sa usa ka tray nga adunay bugnaw (4° C.) nga cardioplegia. Ang wala nga ventricle gi-isolate gamit ang sterile blade ug gihiwa-hiwa sa mga piraso nga 1-2 cm3. Kini nga mga bloke sa tisyu gilakip sa mga suporta sa tisyu gamit ang tissue adhesive ug gibutang sa usa ka nag-vibrate nga microtome tissue bath nga adunay solusyon sa Tyrode ug padayon nga gi-oxygenate (3 g/L 2,3-butanedione monooxime (BDM), 140 mM NaCl (8.18 g) . ), 6 mM KCl (0.447 g), 10 mM D-glucose (1.86 g), 10 mM HEPES (2.38 g), 1 mM MgCl2 (1 ml 1 M nga solusyon), 1.8 mM CaCl2 (1.8 ml 1 M nga solusyon), hangtod sa 1 L ddH2O). Ang nag-vibrate nga microtome gitakda aron putlon ang 300 µm nga gibag-on nga mga hiwa sa frequency nga 80 Hz, usa ka horizontal vibration amplitude nga 2 mm, ug usa ka advance rate nga 0.03 mm/s. Ang tissue bath gilibutan sa yelo aron magpabiling bugnaw ang solusyon ug ang temperatura gipadayon sa 4°C. Ibalhin ang mga seksyon sa tisyu gikan sa microtome bath ngadto sa usa ka incubation bath nga adunay padayon nga oxygenated nga Tyrode solution sa yelo hangtod nga makakuha og igo nga mga seksyon para sa usa ka culture plate. Para sa mga transwell culture, ang mga seksyon sa tisyu gilakip sa sterile nga 6 mm ang gilapdon nga polyurethane supports ug gibutang sa 6 ml nga optimized medium (199 medium, 1x ITS supplement, 10% FBS, 5 ng/ml VEGF, 10 ng/ml FGF-alkaline ug 2X antibiotic-antifungal). Ang electrical stimulation (10 V, frequency 1.2 Hz) gigamit sa mga seksyon sa tisyu pinaagi sa C-Pace. Para sa mga kondisyon sa TD, ang preskong T3 ug Dex gidugang sa 100 nM ug 1 μM sa matag pag-ilis sa medium. Ang medium gibasa sa oksiheno sa dili pa ilisan 3 ka beses sa usa ka adlaw. Ang mga seksyon sa tisyu gipatubo sa usa ka incubator sa 37°C ug 5% CO2.
Para sa mga CTCM culture, ang mga tissue section gibutang sa usa ka custom-made nga 3D printer sa usa ka Petri dish nga adunay giusab nga Tyrode's solution. Ang device gidisenyo aron madugangan ang gidak-on sa hiwa sa kasingkasing og 25% sa gilapdon sa support ring. Gihimo kini aron ang mga seksyon sa kasingkasing dili moinat human ibalhin gikan sa Tyrode's solution ngadto sa medium ug atol sa diastole. Gamit ang histoacrylic glue, ang mga seksyon nga 300 µm ang gibag-on giayo sa usa ka support ring nga 7 mm ang diyametro. Human ikabit ang mga seksyon sa tisyu sa support ring, putla ang sobra nga mga seksyon sa tisyu ug ibutang ang gilakip nga mga seksyon sa tisyu balik sa bath sa Tyrode solution sa yelo (4°C) hangtod nga igo na ang mga seksyon nga giandam para sa usa ka device. Ang kinatibuk-ang oras sa pagproseso para sa tanang device dili molapas sa 2 ka oras. Human ikabit ang 6 ka seksyon sa tisyu sa ilang mga support ring, gi-assemble ang CTCM device. Ang CTCM culture chamber gipuno na daan og 21 ml nga pre-oxygenated medium. Ibalhin ang mga seksyon sa tisyu ngadto sa culture chamber ug hinayhinay nga kuhaa ang bisan unsang mga bula sa hangin gamit ang pipette. Ang seksyon sa tisyu giyahan dayon ngadto sa lungag ug hinayhinay nga gipilit sa lugar niini. Sa katapusan, ibutang ang taklob sa electrode sa device ug ibalhin ang device ngadto sa incubator. Dayon ikonektar ang CTCM sa air tube ug sa C-PACE-EM system. Ang pneumatic actuator moabli ug ang air valve moabli sa CTCM. Ang C-PACE-EM system gi-configure aron maghatag og 4 V sa 1.2 Hz atol sa biphasic pacing sulod sa 2 ms. Ang medium giilisan kaduha sa usa ka adlaw ug ang mga electrodes giilisan kausa sa usa ka adlaw aron malikayan ang pagtapok sa graphite sa mga electrodes. Kung kinahanglan, ang mga seksyon sa tisyu mahimong tangtangon gikan sa ilang mga culture well aron mapagawas ang bisan unsang mga bula sa hangin nga mahimong nahulog sa ilawom niini. Alang sa mga kondisyon sa pagtambal sa MT, ang T3/Dex gidugang nga presko sa matag pag-ilis sa medium nga adunay 100 nM T3 ug 1 μM Dex. Ang mga CTCM device gipatubo sa usa ka incubator sa 37°C ug 5% CO2.
Aron makuha ang mga giinat nga trajectory sa mga hiwa sa kasingkasing, usa ka espesyal nga sistema sa kamera ang gihimo. Usa ka SLR camera (Canon Rebel T7i, Canon, Tokyo, Japan) ang gigamit gamit ang Navitar Zoom 7000 18-108mm macro lens (Navitar, San Francisco, CA). Gihimo ang visualization sa temperatura sa kwarto human ilisan ang medium og bag-ong medium. Ang kamera gibutang sa 51° nga anggulo ug ang video girekord sa 30 ka frame kada segundo. Una, gigamit ang open source software (MUSCLEMOTION43) uban sa Image-J aron masukod ang paglihok sa mga hiwa sa kasingkasing. Ang maskara gihimo gamit ang MATLAB (MathWorks, Natick, MA, USA) aron ipasabot ang mga rehiyon nga interesado alang sa pagpitik sa mga hiwa sa kasingkasing aron malikayan ang kasaba. Ang mano-mano nga gi-segment nga mga maskara gigamit sa tanang mga imahe sa usa ka frame sequence ug dayon gipasa sa MUSCLEMOTION plug-in. Gigamit sa Muscle Motion ang average intensity sa mga pixel sa matag frame aron masukod ang paglihok niini kalabot sa reference frame. Ang datos girekord, gisala ug gigamit aron masukod ang oras sa siklo ug masusi ang pag-inat sa tisyu atol sa cardiac cycle. Ang narekord nga video gi-post-process gamit ang first-order zero-phase digital filter. Aron masukod ang tissue stretch (peak-to-peak), gihimo ang peak-to-peak analysis aron mailhan ang mga peak ug trough sa narekord nga signal. Dugang pa, gihimo ang detrending gamit ang 6th order polynomial aron mawagtang ang signal drift. Ang program code gihimo sa MATLAB aron mahibal-an ang global tissue motion, cycle time, relaxation time, ug contraction time (Supplementary Program Code 44).
Para sa strain analysis, gamit ang parehas nga mga video nga gihimo para sa mechanical stretch assessment, una namong gisubay ang duha ka mga imahe nga nagrepresentar sa mga motion peak (ang pinakataas (ibabaw) ug pinakaubos (ubos) nga mga punto sa paglihok) sumala sa MUSCLEMOTION software. Dayon among gi-segment ang mga rehiyon sa tisyu ug gigamit ang usa ka porma sa shading algorithm sa segmented tissue (Supplementary Fig. 2a). Ang segmented tissue gibahin dayon ngadto sa napulo ka subsurfaces, ug ang stress sa matag nawong gikalkulo gamit ang mosunod nga equation: Strain = (Sup-Sdown)/Sdown, diin ang Sup ug Sdown mao ang mga distansya sa porma gikan sa ibabaw ug ubos nga mga anino sa panapton, matag usa (Supplementary Fig. .2b).
Ang mga seksyon sa kasingkasing gi-fix sa 4% paraformaldehyde sulod sa 48 ka oras. Ang mga tisyu nga gi-fix gi-dehydrate sa 10% ug 20% ​​sucrose sulod sa 1 ka oras, dayon sa 30% sucrose sa tibuok gabii. Ang mga seksyon gi-embed dayon sa optimum cutting temperature compound (OCT compound) ug hinayhinay nga gi-freeze sa isopentane/dry ice bath. Tipigi ang mga OCT embedding block sa -80 °C hangtod mabulag. Ang mga slide giandam isip mga seksyon nga adunay gibag-on nga 8 μm.
Aron makuha ang OCT gikan sa mga seksyon sa kasingkasing, ipainit ang mga slide sa usa ka heating block sa 95 °C sulod sa 5 ka minuto. Idugang ang 1 ml PBS sa matag slide ug i-incubate sulod sa 30 minutos sa temperatura sa kwarto, dayon i-permeate ang mga seksyon pinaagi sa pagbutang og 0.1% Triton-X sa PBS sulod sa 15 minutos sa temperatura sa kwarto. Aron malikayan ang mga non-specific antibodies nga motapot sa sample, idugang ang 1 ml nga 3% BSA solution sa mga slide ug i-incubate sulod sa 1 ka oras sa temperatura sa kwarto. Ang BSA gikuha dayon ug ang mga slide gihugasan gamit ang PBS. Markahi ang matag sample gamit ang lapis. Ang mga primary antibodies (gi-dilute 1:200 sa 1% BSA) (connexin 43 (Abcam; #AB11370), NFATC4 (Abcam; #AB99431) ug troponin-T (Thermo Scientific; #MA5-12960) gidugang sulod sa 90 ka minuto, dayon ang mga secondary antibodies (gi-dilute 1:200 sa 1% BSA) batok sa ilaga nga Alexa Fluor 488 (Thermo Scientific; #A16079), batok sa koneho nga Alexa Fluor 594 (Thermo Scientific; #T6391) sulod sa dugang nga 90 ka minuto. Gihugasan 3 ka beses gamit ang PBS aron mailhan ang target staining gikan sa background, gigamit lang namo ang secondary antibody isip control. Sa katapusan, gidugang ang DAPI nuclear stain ug ang mga slide gibutang sa usa ka vectashield (Vector Laboratories) ug giselyohan og nail polish (-x magnification) ug Keyence microscope nga adunay 40x magnification.
Ang WGA-Alexa Fluor 555 (Thermo Scientific; #W32464) sa 5 μg/ml sa PBS gigamit para sa WGA staining ug gibutang sa fixed sections sulod sa 30 minutos sa temperatura sa kwarto. Ang mga slide gihugasan dayon gamit ang PBS ug gidugangan og Sudan black ang matag slide ug gi-incubate sulod sa 30 minutos. Ang mga slide gihugasan dayon gamit ang PBS ug gidugangan og vectashield embedding medium. Ang mga slide gi-visualize sa usa ka Keyence microscope sa 40x magnification.
Ang OCT gikuha gikan sa mga sample sama sa gihulagway sa ibabaw. Human makuha ang OCT, ituslob ang mga slide sa Bouin's solution sa tibuok gabii. Ang mga slide gihugasan dayon gamit ang distilled water sulod sa 1 ka oras ug dayon gibutang sa Bibrich aloe acid fuchsin solution sulod sa 10 ka minuto. Dayon ang mga slide gihugasan gamit ang distilled water ug gibutang sa solusyon nga 5% phosphomolybdenum/5% phosphotungstic acid sulod sa 10 ka minuto. Nga dili kinahanglan hugasan, ibalhin ang mga slide direkta ngadto sa aniline blue solution sulod sa 15 ka minuto. Dayon ang mga slide gihugasan gamit ang distilled water ug gibutang sa 1% acetic acid solution sulod sa 2 ka minuto. Ang mga slide gipauga sa 200 N ethanol ug gibalhin sa xylene. Ang mga stained slide gi-visualize gamit ang Keyence microscope nga adunay 10x objective. Ang Fibrosis area percentage gi-quantify gamit ang Keyence Analyzer software.
CyQUANT™ MTT Cell Viability Assay (Invitrogen, Carlsbad, CA), numero sa katalogo nga V13154, sumala sa protocol sa tiggama nga adunay pipila ka mga pagbag-o. Sa partikular, usa ka surgical punch nga adunay diametro nga 6 mm ang gigamit aron masiguro ang parehas nga gidak-on sa tisyu atol sa pag-analisa sa MTT. Ang mga tisyu gi-plate sa tagsa-tagsa ngadto sa mga lungag sa usa ka 12-well plate nga adunay MTT substrate sumala sa protocol sa tiggama. Ang mga seksyon gi-incubate sa 37° C sulod sa 3 ka oras ug ang buhing tisyu nag-metabolize sa MTT substrate aron maporma ang usa ka purple formazan compound. Ilisi ang solusyon sa MTT og 1 ml DMSO ug i-incubate sa 37 °C sulod sa 15 ka minuto aron makuha ang purple formazan gikan sa mga seksyon sa kasingkasing. Ang mga sample gi-dilute og 1:10 sa DMSO sa 96-well clear bottom plates ug gisukod ang purple color intensity sa 570 nm gamit ang Cytation plate reader (BioTek). Ang mga pagbasa gi-normalize sa gibug-aton sa matag hiwa sa kasingkasing.
Ang heart slice media gipulihan og media nga adunay 1 μCi/ml [5-3H]-glucose (Moravek Biochemicals, Brea, CA, USA) para sa glucose utilization assay sama sa gihulagway kaniadto. Human sa 4 ka oras nga incubation, idugang ang 100 µl nga medium ngadto sa usa ka bukas nga microcentrifuge tube nga adunay 100 µl nga 0.2 N HCl. Dayon ang tubo gibutang sa usa ka scintillation tube nga adunay 500 μl nga dH2O aron moalisngaw ang [3H]2O sulod sa 72 ka oras sa 37°C. Dayon kuhaa ang microcentrifuge tube gikan sa scintillation tube ug idugang ang 10 ml nga scintillation fluid. Ang scintillation counts gihimo gamit ang Tri-Carb 2900TR liquid scintillation analyzer (Packard Bioscience Company, Meriden, CT, USA). Ang paggamit sa glucose gikalkulo dayon nga gikonsiderar ang [5-3H]-glucose specific activity, dili kompleto nga equilibrium ug background, dilution sa [5-3H]-ngadto sa unlabeled glucose, ug scintillation counter efficiency. Ang datos gi-normalize sa masa sa mga seksyon sa kasingkasing.
Human sa tissue homogenization sa Trizol, ang RNA gi-isolate gikan sa mga seksyon sa kasingkasing gamit ang Qiagen miRNeasy Micro Kit #210874 sumala sa protocol sa tiggama. Ang pag-andam sa RNAsec library, sequencing ug data analysis gihimo sama sa mosunod:
1 μg nga RNA kada sample ang gigamit isip sinugdanang materyal para sa pag-andam sa RNA library. Ang mga sequencing libraries gihimo gamit ang NEBNext UltraTM RNA Library Preparation Kit para sa Illumina (NEB, USA) subay sa mga rekomendasyon sa tiggama, ug ang mga index code gidugang sa mga attribute sequence para sa matag sample. Sa laktod nga pagkasulti, ang mRNA giputli gikan sa total RNA gamit ang magnetic beads nga gilakip sa poly-T oligonucleotides. Ang fragmentation gihimo gamit ang divalent cations sa taas nga temperatura sa NEBNext First Strand Synthesis Reaction Buffer (5X). Ang unang strand cDNA gi-synthesize gamit ang random hexamer primers ug M-MuLV reverse transcriptase (RNase H-). Ang ikaduhang strand cDNA gi-synthesize dayon gamit ang DNA polymerase I ug RNase H. Ang nahibiling mga overhang gi-convert ngadto sa blunt ends pinaagi sa exonuclease/polymerase activity. Human sa adenylation sa 3′ end sa DNA fragment, usa ka NEBNext Adapter nga adunay hairpin loop structure ang gilakip niini aron maandam kini para sa hybridization. Para sa pagpili sa mga cDNA fragment nga adunay gusto nga gitas-on nga 150-200 bp. Ang mga tipik sa librarya giputli gamit ang AMPure XP system (Beckman Coulter, Beverly, USA). Dayon, ang 3 μl USER Enzyme (NEB, USA) nga adunay size-selected cDNA nga gi-ligate gamit ang adapter gigamit sulod sa 15 minutos sa 37°C ug dayon sulod sa 5 minutos sa 95°C sa dili pa ang PCR. Ang PCR gihimo dayon gamit ang Phusion High-Fidelity DNA polymerase, universal PCR primers, ug Index (X) primers. Sa katapusan, ang mga produkto sa PCR giputli (AMPure XP system) ug ang kalidad sa librarya gisusi sa usa ka Agilent Bioanalyzer 2100 system. Ang cDNA library gi-sequence dayon gamit ang Novaseq sequencer. Ang mga raw image file gikan sa Illumina gi-convert ngadto sa raw reads gamit ang CASAVA Base Calling. Ang raw data gitipigan sa FASTQ(fq) format files nga adunay mga read sequences ug katugbang nga base qualities. Pilia ang HISAT2 aron ipares ang filtered sequencing reads sa Sscrofa11.1 reference genome. Sa kinatibuk-an, ang HISAT2 nagsuporta sa mga genome sa bisan unsang gidak-on, lakip ang mga genome nga mas dako sa 4 bilyon nga mga base, ug ang mga default nga kantidad gitakda alang sa kadaghanan sa mga parameter. Ang mga pagbasa sa splicing gikan sa datos sa RNA Seq mahimong episyente nga ma-align gamit ang HISAT2, ang labing paspas nga sistema nga magamit karon, nga adunay parehas o mas maayo nga katukma kaysa sa bisan unsang ubang pamaagi.
Ang kadaghan sa mga transcript direktang nagpakita sa lebel sa gene expression. Ang lebel sa gene expression gisusi pinaagi sa kadaghan sa mga transcript (sequencing count) nga nalangkit sa genome o exons. Ang gidaghanon sa mga nabasa proporsyonal sa lebel sa gene expression, gitas-on sa gene, ug giladmon sa sequencing. Ang FPKM (mga fragment kada libo nga base pairs sa transcript sequenced kada milyon nga base pairs) gikalkulo ug ang mga P-values ​​​​sa differential expression gitino gamit ang DESeq2 package. Dayon among gikalkulo ang false discovery rate (FDR) alang sa matag P value gamit ang Benjamini-Hochberg method9 base sa built-in nga R-function nga "p.adjust".
Ang RNA nga gi-isolate gikan sa mga seksyon sa kasingkasing gi-convert ngadto sa cDNA sa konsentrasyon nga 200 ng/μl gamit ang SuperScript IV Vilo Master mix gikan sa Thermo (Thermo, cat. no. 11756050). Ang quantitative RT-PCR gihimo gamit ang Applied Biosystems Endura Plate Microamp 384-well transparent reaction plate (Thermo, cat. no. 4483319) ug microamp optical adhesive (Thermo, cat. no. 4311971). Ang reaction mixture gilangkoban sa 5 µl Taqman Fast Advanced Master mix (Thermo, cat # 4444557), 0.5 µl Taqman Primer ug 3.5 µl H2O nga gisagol kada well. Ang standard qPCR cycles gipadagan ug ang CT values ​​gisukod gamit ang Applied Biosystems Quantstudio 5 real-time PCR instrument (384-well module; product # A28135). Ang mga Taqman primer gipalit gikan sa Thermo (GAPDH (Ss03375629_u1), PARP12 (Ss06908795_m1), PKDCC (Ss06903874_m1), CYGB (Ss06900188_m1), RGL1 (Ss06868890_m1), ACTN1 (Ss01009508_mH), GATA4 (Ss03383805_u1), GJA1 (Ss03374839_u1), COL1A2 (Ss03375009_u1), COL3A1 (Ss04323794_m1), ACTA2 (Ss04245588_m1). Ang mga CT value sa tanang sample gi-normalize sa housekeeping gene nga GAPDH.
Ang pagpagawas sa NT-ProBNP pinaagi sa media gisusi gamit ang NT-ProBNP kit (pig) (Cat. No. MBS2086979, MyBioSource) sumala sa protocol sa tiggama. Sa laktod nga pagkasulti, 250 µl sa matag sample ug standard ang gidugang nga doble sa matag well. Human dayon idugang ang sample, idugang ang 50 µl sa Assay Reagent A sa matag well. Hinayhinay nga uyoga ang plato ug isira gamit ang sealant. Dayon ang mga tablet gi-incubate sa 37°C sulod sa 1 ka oras. Dayon i-aspirate ang solusyon ug hugasi ang mga well sa 4 ka beses gamit ang 350 µl sa 1X wash solution, i-incubate ang wash solution sulod sa 1-2 ka minuto matag higayon. Dayon idugang ang 100 µl sa Assay Reagent B matag well ug isira gamit ang plate sealant. Ang tablet hinayhinay nga uyoga ug gi-incubate sa 37°C sulod sa 30 ka minuto. I-aspirate ang solusyon ug hugasi ang mga well sa 5 ka beses gamit ang 350 µl sa 1X wash solution. Idugang ang 90 µl nga substrate solution sa matag atabay ug isira ang plato. I-incubate ang plato sa 37°C sulod sa 10-20 ka minuto. Idugang ang 50 µl nga Stop Solution sa matag atabay. Ang plato gisukod dayon gamit ang Cytation (BioTek) plate reader nga gibutang sa 450 nm.
Gihimo ang mga power analyses aron mapili ang gidak-on sa grupo nga makahatag og >80% nga gahum aron makamatikod og 10% nga hingpit nga pagbag-o sa parameter nga adunay 5% Type I error rate. Gihimo ang mga power analyses aron mapili ang gidak-on sa grupo nga makahatag og >80% nga gahum aron makamatikod og 10% nga hingpit nga pagbag-o sa parameter nga adunay 5% Type I error rate. Анализ мощности был выполнен для выбора размеров групп, которые обеспечат >80% мощности для обнаружения 10% изменения параметра с 5% частотой ошибок типа I. Gihimo ang pag-analisa sa gahum aron mapili ang mga gidak-on sa grupo nga makahatag og >80% nga gahum aron makamatikod sa 10% nga hingpit nga pagbag-o sa parameter nga adunay 5% nga Type I error rate.进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％I功效以检测参数中10％绝对变化和5％I变化和5％I型用。进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％I功效以检测参数中10％绝对变化和5％I变化和5％I型用。 Был проведен анализ мощности для выбора размера группы, который обеспечил бы > 80% мощности для обнаругожлотябня изменения параметров и 5% частоты ошибок типа I. Usa ka pag-analisa sa gahum ang gihimo aron mapili ang gidak-on sa grupo nga makahatag og >80% nga gahum aron makamatikod sa 10% nga hingpit nga pagbag-o sa parameter ug 5% nga type I error rate.Ang mga seksyon sa tisyu gipili nga random sa wala pa ang eksperimento. Ang tanang pag-analisar kay condition blind ug ang mga sample gi-decode lamang human ma-analisar ang tanang datos. Ang GraphPad Prism software (San Diego, CA) gigamit sa paghimo sa tanang statistical analysis. Alang sa tanang estadistika, ang mga p-value giisip nga hinungdanon sa mga kantidad nga <0.05. Alang sa tanang estadistika, ang mga p-value giisip nga hinungdanon sa mga kantidad nga <0.05. Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. Alang sa tanang estadistika, ang mga p-value giisip nga hinungdanon sa mga kantidad nga <0.05.对于所有统计数据，p 值在会<0.05 时被认为是显着的。对于所有统计数据，p 值在会<0.05 时被认为是显着的。 Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. Alang sa tanang estadistika, ang mga p-value giisip nga hinungdanon sa mga kantidad nga <0.05.Ang two-tailed Student's t-test gihimo sa datos nga adunay 2 lang ka pagtandi. Gigamit ang one-way o two-way ANOVA aron mahibal-an ang kamahinungdanon tali sa daghang grupo. Sa paghimo og post hoc tests, gigamit ang Tukey's correction aron ma-account ang daghang pagtandi. Ang datos sa RNAsec adunay espesyal nga mga konsiderasyon sa estadistika sa pagkalkulo sa FDR ug p.adjust sama sa gihulagway sa seksyon sa Methods.
Alang sa dugang nga impormasyon bahin sa disenyo sa pagtuon, tan-awa ang abstrak sa Nature Research Report nga nalambigit niini nga artikulo.