Paldies, ka apmeklējāt vietni Nature.com. Jūsu izmantotajai pārlūkprogrammas versijai ir ierobežots CSS atbalsts. Lai nodrošinātu vislabāko pieredzi, iesakām izmantot atjauninātu pārlūkprogrammu (vai atspējot saderības režīmu pārlūkprogrammā Internet Explorer). Tikmēr, lai nodrošinātu nepārtrauktu atbalstu, mēs atveidosim vietni bez stiliem un JavaScript.
Ir nepieciešama uzticama in vitro sistēma, kas var precīzi reproducēt sirds fizioloģisko vidi zāļu testēšanai. Ierobežotā cilvēka sirds audu kultūru sistēmu pieejamība ir novedusi pie neprecīzas sirds zāļu iedarbības interpretācijas. Šeit mēs esam izstrādājuši sirds audu kultūras modeli (CTCM), kas elektromehāniski stimulē sirds šķēles un fizioloģiski stiepjas sirds cikla sistoliskajā un diastoliskajā fāzē. Pēc 12 kultivēšanas dienām šī pieeja daļēji uzlaboja sirds sekciju dzīvotspēju, bet pilnībā nesaglabāja to strukturālo integritāti. Tādēļ pēc mazo molekulu skrīninga mēs atklājām, ka 100 nM trijodtironīna (T3) un 1 μM deksametazona (Dex) pievienošana mūsu barotnei saglabāja sekciju mikrostruktūru 12 dienas. Kombinācijā ar T3/Dex apstrādi CTCM sistēma saglabāja transkripcijas profilus, dzīvotspēju, vielmaiņas aktivitāti un strukturālo integritāti tādā pašā līmenī kā svaigiem sirds audiem 12 dienas. Turklāt pārmērīga sirds audu stiepšana kultūrā izraisa hipertrofisku sirds signalizāciju, sniedzot pierādījumus par CTCM spēju atdarināt hipertrofiskus stāvokļus, ko izraisa sirds stiepšanās. Noslēgumā jāsaka, ka CTCM var modelēt sirds fizioloģiju un patofizioloģiju kultūrā ilgā laika periodā, nodrošinot uzticamu zāļu skrīningu.
Pirms klīnisko pētījumu uzsākšanas ir nepieciešamas uzticamas in vitro sistēmas, kas var precīzi reproducēt cilvēka sirds fizioloģisko vidi. Šādām sistēmām vajadzētu imitēt izmainītu mehānisko stiepšanos, sirdsdarbības ātrumu un elektrofizioloģiskās īpašības. Dzīvnieku modeļi parasti tiek izmantoti kā sirds fizioloģijas skrīninga platforma ar ierobežotu ticamību zāļu ietekmes atspoguļošanā cilvēka sirdī1,2. Galu galā ideālais sirds audu kultūras eksperimentālais modelis (CTCM) ir modelis, kas ir ļoti jutīgs un specifisks dažādām terapeitiskām un farmakoloģiskām intervencēm, precīzi reproducējot cilvēka sirds fizioloģiju un patofizioloģiju3. Šādas sistēmas trūkums ierobežo jaunu sirds mazspējas ārstēšanas metožu atklāšanu4,5 un ir novedis pie zāļu kardiotoksicitātes kā galvenā iemesla iziešanai no tirgus6.
Pēdējās desmitgades laikā astoņi nekardiovaskulāri medikamenti ir izņemti no klīniskās lietošanas, jo tie izraisa QT intervāla pagarināšanos, kas noved pie kambaru aritmijām un pēkšņas nāves7. Tādēļ pieaug nepieciešamība pēc uzticamām preklīniskām skrīninga stratēģijām, lai novērtētu kardiovaskulāro efektivitāti un toksicitāti. Nesenā cilvēka inducēto pluripotento cilmes šūnu kardiomiocītu (hiPS-CM) izmantošana zāļu skrīningā un toksicitātes testēšanā sniedz daļēju risinājumu šai problēmai. Tomēr hiPS-CM nenobriedis raksturs un sirds audu daudzšūnu sarežģītības trūkums ir šīs metodes galvenie ierobežojumi. Jaunākie pētījumi liecina, ka šo ierobežojumu var daļēji pārvarēt, izmantojot agrīnus hiPS-CM, lai veidotu sirds audu hidrogēlus neilgi pēc spontāno kontrakciju sākuma un pakāpeniski palielinot elektrisko stimulāciju laika gaitā. Tomēr šiem hiPS-CM mikroaudiem trūkst pieauguša miokarda nobriedušu elektrofizioloģisko un kontraktilo īpašību. Turklāt cilvēka sirds audiem ir sarežģītāka struktūra, kas sastāv no dažādu šūnu tipu heterogēna maisījuma, tostarp endotēlija šūnām, neironiem un stromas fibroblastiem, kas savstarpēji savienoti ar specifiskiem ekstracelulāro matrices proteīnu komplektiem. Šī nekardiomiocītu populāciju heterogenitāte11,12,13 pieauguša zīdītāja sirdī ir galvenais šķērslis sirds audu modelēšanai, izmantojot atsevišķus šūnu tipus. Šie galvenie ierobežojumi uzsver tādu metožu izstrādes nozīmi, kas ļauj kultivēt neskartus miokarda audus fizioloģiskos un patoloģiskos apstākļos.
Kultivētas plānas (300 µm) cilvēka sirds daļas ir izrādījušās daudzsološs vesela cilvēka miokarda modelis. Šī metode nodrošina piekļuvi pilnīgai 3D daudzšūnu sistēmai, kas ir līdzīga cilvēka sirds audiem. Tomēr līdz 2019. gadam kultivētu sirds daļu izmantošanu ierobežoja īsā (24 h) kultūras izdzīvošanas laiks. Tas ir saistīts ar vairākiem faktoriem, tostarp fizikāli mehāniskās stiepes trūkumu, gaisa un šķidruma saskarni un vienkāršu barotņu izmantošanu, kas neatbalsta sirds audu vajadzības. 2019. gadā vairākas pētniecības grupas pierādīja, ka mehānisko faktoru iekļaušana sirds audu kultūru sistēmās var pagarināt kultūras dzīvi, uzlabot sirds ekspresiju un atdarināt sirds patoloģiju. Divi eleganti pētījumi17 un18 liecina, ka vienaksiāla mehāniskā slodze pozitīvi ietekmē sirds fenotipu kultivēšanas laikā. Tomēr šajos pētījumos netika izmantota dinamiskā trīsdimensiju fizikāli mehāniskā slodze sirds ciklam, jo ​​sirds daļas tika noslogotas vai nu ar izometriskiem stiepes spēkiem17, vai ar lineāru auksotonisku slodzi18. Šīs audu stiepšanas metodes izraisīja daudzu sirds gēnu nomākšanu vai ar patoloģiskām stiepšanās reakcijām saistītu gēnu pārekspresiju. Jāatzīmē, ka Pitoulis et al.19 izstrādāja dinamisku sirds šķēles kultūras vannu sirds cikla rekonstrukcijai, izmantojot spēka pārveidotāja atgriezenisko saiti un sprieguma piedziņas. Lai gan šī sistēma ļauj precīzāk modelēt sirds ciklu in vitro, metodes sarežģītība un zemā caurlaidspēja ierobežo šīs sistēmas pielietojumu. Mūsu laboratorija nesen ir izstrādājusi vienkāršotu kultivēšanas sistēmu, izmantojot elektrisko stimulāciju un optimizētu barotni, lai saglabātu cūku un cilvēka sirds audu griezumu dzīvotspēju līdz pat 6 dienām20,21.
Šajā manuskriptā mēs aprakstām sirds audu kultūras modeli (CTCM), izmantojot cūkas sirds griezumus, kas ietver humorālus signālus, lai atkārtotu trīsdimensiju sirds fizioloģiju un patofizioloģisko izplešanos sirds cikla laikā. Šis CTCM var palielināt preklīniskās zāļu prognozēšanas precizitāti līdz vēl nekad iepriekš nesasniegtam līmenim, nodrošinot rentablu, vidējas caurlaidības sirds sistēmu, kas imitē zīdītāju sirds fizioloģiju/patofizioloģiju preklīniskajai zāļu testēšanai.
Hemodinamiskajiem mehāniskajiem signāliem ir izšķiroša nozīme kardiomiocītu funkcijas uzturēšanā in vitro [22,23,24]. Šajā manuskriptā esam izstrādājuši CTCM (1.a attēls), kas var atdarināt pieauguša cilvēka sirds vidi, inducējot gan elektrisko, gan mehānisko stimulāciju fizioloģiskās frekvencēs (1,2 Hz, 72 sitieni minūtē). Lai izvairītos no pārmērīgas audu stiepšanās diastoles laikā, tika izmantota 3D drukas ierīce, lai palielinātu audu izmēru par 25% (1.b attēls). C-PACE sistēmas inducētā elektriskā stimulācija tika iestatīta tā, lai tā sāktos 100 ms pirms sistoles, izmantojot datu ieguves sistēmu, lai pilnībā reproducētu sirds ciklu. Audu kultūras sistēma izmanto programmējamu pneimatisko izpildmehānismu (LB Engineering, Vācija), lai cikliski paplašinātu elastīgu silikona membrānu, tādējādi izraisot sirds šķēļu paplašināšanos augšējā kamerā. Sistēma tika savienota ar ārējo gaisa vadu caur spiediena devēju, kas ļāva precīzi pielāgot spiedienu (± 1 mmHg) un laiku (± 1 ms) (1.c attēls).
a Piestipriniet audu daļu pie 7 mm atbalsta gredzena, kas attēlots zilā krāsā, ierīces kultūras kameras iekšpusē. Kultūras kamera ir atdalīta no gaisa kameras ar plānu, elastīgu silikona membrānu. Lai novērstu noplūdes, starp katru kameru ievietojiet blīvi. Ierīces vāks satur grafīta elektrodus, kas nodrošina elektrisko stimulāciju. b Lielās audu ierīces, vadotnes gredzena un atbalsta gredzena shematisks attēlojums. Audu daļas (brūnas) tiek novietotas uz lielās ierīces, vadotni ievietojot rievā ierīces ārējā malā. Izmantojot vadotni, uzmanīgi novietojiet ar audu akrila līmi pārklāto atbalsta gredzenu virs sirds audu daļas. c Grafiks, kurā parādīts elektriskās stimulācijas laiks kā gaisa kameras spiediena funkcija, ko kontrolē programmējams pneimatiskais izpildmehānisms (PPD). Elektriskās stimulācijas sinhronizēšanai, izmantojot spiediena sensorus, tika izmantota datu ieguves ierīce. Kad spiediens kultūras kamerā sasniedz iestatīto slieksni, uz C-PACE-EM tiek nosūtīts impulsa signāls, lai ierosinātu elektrisko stimulāciju. d Četru CTCM attēls, kas novietotas uz inkubatora plaukta. Četras ierīces ir savienotas ar vienu PPD, izmantojot pneimatisko ķēdi, un spiediena sensori ir ievietoti hemostatiskajā vārstā, lai uzraudzītu spiedienu pneimatiskajā ķēdē. Katrā ierīcē ir sešas audu sekcijas.
Izmantojot vienu pneimatisko izpildmehānismu, mēs varējām kontrolēt 4 CTCM ierīces, no kurām katra varēja saturēt 6 audu sekcijas (1.d att.). CTCM gaisa spiediens gaisa kamerā tiek pārveidots par sinhrono spiedienu šķidruma kamerā un izraisa sirds šķēles fizioloģisku izplešanos (2.a attēls un 1. papildfilma). Audu stiepšanās novērtējums pie 80 mm Hg. Art. parādīja audu sekciju stiepšanos par 25% (2.b att.). Ir pierādīts, ka šis procentuālais stiepšanās atbilst fizioloģiskajam sarkomēra garumam 2,2–2,3 µm normālai sirds sekcijas kontraktilitātei17,19,25. Audu kustība tika novērtēta, izmantojot pielāgotus kameras iestatījumus (1. papildattēls). Audu kustības amplitūda un ātrums (2.c, d att.) atbilda stiepšanās laikam sirds cikla laikā un laikam sistoles un diastoles laikā (2.b att.). Sirds audu stiepšanās un ātrums kontrakcijas un relaksācijas laikā kultūrā saglabājās nemainīgs 12 dienas (2.f att.). Lai novērtētu elektriskās stimulācijas ietekmi uz kontraktilitāti kultivēšanas laikā, mēs izstrādājām metodi aktīvas deformācijas noteikšanai, izmantojot ēnošanas algoritmu (2.a,b papildattēls), un varējām atšķirt deformācijas ar elektrisko stimulāciju un bez tās. Tā pati sirds daļa (2.f att.). Griezuma kustīgajā zonā (R6-9) spriegums elektriskās stimulācijas laikā bija par 20% augstāks nekā bez elektriskās stimulācijas, kas norāda uz elektriskās stimulācijas ieguldījumu kontraktilajā funkcijā.
Reprezentatīvas gaisa kameras spiediena, šķidruma kameras spiediena un audu kustības mērījumu līknes apstiprina, ka kameras spiediens maina šķidruma kameras spiedienu, izraisot atbilstošu audu šķēles kustību. b Reprezentatīvas audu griezumu procentuālās stiepšanās līknes (zilā krāsā), kas atbilst procentuālajai stiepšanās pakāpei (oranža). c Izmērītā sirds šķēles kustība atbilst izmērītajam kustības ātrumam. (d) Reprezentatīvas cikliskās kustības trajektorijas (zilā līnija) un ātruma (oranža punktētā līnija) sirds šķēlē. e Cikla laika (n = 19 šķēles katrā grupā, no dažādām cūkām), kontrakcijas laika (n = 19 šķēles katrā grupā), relaksācijas laika (n = 19 šķēles katrā grupā, no dažādām cūkām), audu kustības (n = 25 šķēles)/grupa no dažādām cūkām), maksimālā sistoliskā ātruma (n = 24(D0), 25(D12) šķēles/grupa no dažādām cūkām) un maksimālā relaksācijas ātruma (n = 24(D0), 25(D12) šķēles/grupa no dažādām cūkām) kvantitatīva noteikšana. Divpusējs Stjudenta t-tests neuzrādīja būtisku atšķirību nevienā parametrā. f Reprezentatīvas deformācijas analīzes līknes audu griezumiem ar (sarkanu) un bez (zilu) elektriskās stimulācijas, desmit reģionāli audu griezumu apgabali no viena un tā paša griezuma. Apakšējie paneļi parāda deformācijas procentuālās atšķirības kvantitatīvo noteikšanu audu griezumos ar un bez elektriskās stimulācijas desmit apgabalos no dažādiem griezumiem. (n = 8 šķēles/grupa no dažādām cūkām, tiek veikts divpusējs Student t-tests; ****p < 0,0001, **p < 0,01, *p < 0,05). (n = 8 šķēles/grupa no dažādām cūkām, tiek veikts divpusējs Student t-tests; ****p < 0,0001, **p < 0,01, *p < 0,05). (n = 8 срезов/группу от разных свиней, проводится двусторонний t-критерий Стьюдента; ****p<0,0001, **p<0,01,5). (n = 8 griezumi/grupa no dažādām cūkām, divpusējs Stjudenta t-tests; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05). （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p < 0,0001，**p < 0,01,0*p < 0,01，*p （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p < 0,0001，**p < 0,01,0*p < 0,01，*p (n = 8 срезов/группу, от разных свиней, двусторонний критерий Стьюдента; ****p <0,0001, **p <0,01, *p <0,05). (n = 8 griezumi/grupa, no dažādām cūkām, divpusējs Stjudenta t-tests; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05).Kļūdu joslas apzīmē vidējo ± standarta novirzi.
Mūsu iepriekšējā statiskajā biomimetiskā sirds šķēlīšu kultivēšanas sistēmā [20, 21] mēs 6 dienas saglabājām sirds šķēļu dzīvotspēju, funkciju un strukturālo integritāti, pielietojot elektrisko stimulāciju un optimizējot barotnes sastāvu. Tomēr pēc 10 dienām šie rādītāji strauji samazinājās. Mēs atsauksimies uz griezumiem, kas kultivēti mūsu iepriekšējās statiskās biomimetiskā kultivēšanas sistēmas 20, 21 kontroles apstākļos (kontrole), un mēs izmantosim mūsu iepriekš optimizēto barotni kā MC apstākļus un kultivēšanu vienlaicīgas mehāniskās un elektriskās stimulācijas (CTCM) apstākļos. saukts par . Vispirms mēs noteicām, ka mehāniskā stimulācija bez elektriskās stimulācijas nebija pietiekama, lai uzturētu audu dzīvotspēju 6 dienas (3.a,b papildattēls). Interesanti, ka, ieviešot fiziomehānisko un elektrisko stimulāciju, izmantojot STCM, 12 dienu sirds griezumu dzīvotspēja saglabājās tāda pati kā svaigiem sirds griezumiem MS apstākļos, bet ne Ctrl apstākļos, kā parādīts MTT analīzē (1. att.). Tas liecina, ka mehāniskā stimulācija un sirds cikla simulācija var saglabāt audu griezumus dzīvotspējīgus divreiz ilgāk, nekā ziņots mūsu iepriekšējā statiskajā kultivēšanas sistēmā. Tomēr audu sekciju strukturālās integritātes novērtējums, imūnmarķējot sirds troponīnu T un koneksīnu 43, parādīja, ka koneksīna 43 ekspresija MC audos 12. dienā bija ievērojami augstāka nekā kontroles grupā tajā pašā dienā. Tomēr vienmērīga koneksīna 43 ekspresija un Z diska veidošanās netika pilnībā saglabāta (3.b att.). Mēs izmantojam mākslīgā intelekta (MI) sistēmu, lai kvantitatīvi noteiktu audu strukturālo integritāti26, uz attēliem balstītu dziļās mācīšanās cauruļvadu, kas balstīts uz troponīnu-T un koneksīna krāsošanu43, lai automātiski kvantitatīvi noteiktu sirds šķēļu strukturālo integritāti un fluorescenci lokalizācijas stipruma ziņā. Šī metode izmanto konvolucionālo neironu tīklu (CNN) un dziļās mācīšanās sistēmu, lai droši kvantitatīvi noteiktu sirds audu strukturālo integritāti automatizētā un objektīvā veidā, kā aprakstīts atsaucē26. MC audiem bija uzlabota strukturālā līdzība ar 0. dienu, salīdzinot ar statiskajām kontroles sekcijām. Turklāt Masona trihroma krāsošana atklāja ievērojami zemāku fibrozes procentuālo daudzumu MS apstākļos, salīdzinot ar kontroles apstākļiem, kultūras 12. dienā (3.c att.). Lai gan CTCM palielināja sirds audu sekciju dzīvotspēju 12. dienā līdz līmenim, kas līdzīgs svaigu sirds audu dzīvotspējai, tas būtiski neuzlaboja sirds sekciju strukturālo integritāti.
Stabiņu diagramma parāda svaigu sirds šķēļu (D0) vai sirds šķēļu kultūras MTT dzīvotspējas kvantitatīvu noteikšanu 12 dienu laikā vai nu statiskā kultūrā (D12 Ctrl), vai CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) šķēles/grupa no dažādām cūkām, tiek veikts vienvirziena ANOVA tests; ####p < 0,0001 salīdzinājumā ar D0 un **p < 0,01 salīdzinājumā ar D12 Ctrl). Stabiņu diagramma parāda svaigu sirds šķēļu (D0) vai sirds šķēļu kultūras MTT dzīvotspējas kvantitatīvu noteikšanu 12 dienu laikā vai nu statiskā kultūrā (D12 Ctrl), vai CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) šķēles/grupa no dažādām cūkām, tiek veikts vienvirziena ANOVA tests; ####p < 0,0001 salīdzinājumā ar D0 un **p < 0,01 salīdzinājumā ar D12 Ctrl).Histogrammā parādīta MTT svaigu sirds griezumu (D0) vai sirds griezumu kultūras dzīvotspējas kvantitatīvā noteikšana 12 dienu laikā vai nu statiskā kultūrā (D12 kontrole), vai CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 kontrole). ) , 12 (D12 MC) griezumi/grupa no dažādām cūkām, tiek veikts vienvirziena ANOVA tests;####p < 0,0001 по сравнению с D0 и **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p < 0,0001 salīdzinājumā ar D0 un **p < 0,01 salīdzinājumā ar D12 (vadīšanas režīmā). a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切片(D0)或心脏切片培养12 天的 活力的量化)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，啛测试；与D0 相比，####p < 0,0001，与D12 Ctrl 相比，**p < 0,01). a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切片(D0) ，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；与D0 相比，####p < 0.0001D相比，**p。)histogramma, kas parāda MTT dzīvotspējas kvantitatīvo noteikšanu svaigās sirds sekcijās (D0) vai sirds sekcijās, kas 12 dienas kultivētas statiskā kultūrā (D12 kontrole) vai CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 kontrole)), 12 (D12 MC) sekcijas/grupa no dažādām cūkām, vienvirziena ANOVA tests;####p < 0,0001 по сравнению с D0, **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p < 0,0001 salīdzinājumā ar D0, **p < 0,01 salīdzinājumā ar D12 (vadīšanas poga).b Troponīns-T (zaļš), koneksīns 43 (sarkans) un DAPI (zils) svaigi izolētās sirds daļās (D0) vai sirds daļās, kas kultivētas statiskos apstākļos (Ctrl) vai CTCM apstākļos (MC) 12 dienas) reprezentatīvos imunofluorescences attēlos (tukša skala = 100 µm). Sirds audu strukturālās integritātes kvantitatīva noteikšana ar mākslīgo intelektu (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) šķēles/grupa katra no dažādām cūkām, tiek veikts vienvirziena ANOVA tests; ####p < 0,0001 salīdzinājumā ar D0 un ****p < 0,0001 salīdzinājumā ar D12 Ctrl). Sirds audu strukturālās integritātes kvantitatīva noteikšana ar mākslīgo intelektu (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) šķēles/grupa katra no dažādām cūkām, tiek veikts vienvirziena ANOVA tests; ####p < 0,0001 salīdzinājumā ar D0 un ****p < 0,0001 salīdzinājumā ar D12 Ctrl). Количественная оценка структурной целостности сердечной ткани искусственным интеллектом (n = 7 (D0), 7, (D12) D12 срезов/групп от разных свиней, проводится однофакторный тест ANOVA; D12 Ctrl). Sirds audu strukturālās integritātes kvantitatīva noteikšana, izmantojot mākslīgo intelektu (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) griezumi/grupas no dažādām cūkām, veikts vienvirziena ANOVA tests; ####p < 0,0001 salīdzinājumā ar D0 un ****p < 0,0001 salīdzinājumā ar D12 Ctrl).人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) šķēles/grupa katra no dažādām cūkām, vienvirziena ANOVA tests <丸与 0#0p1;#.相比，****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）.人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) šķēles/grupa katra no dažādām cūkām, vienvirziena ANOVA tests 1#0###0p0;与D0相比，****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）. Искусственный интеллект для количественной оценки структурной целостности сердечной ткани (n = 7 (D0), 7 (D5) (D0), 7 (D12) срезов/группу каждой из разных свиней, односторонний тест ANOVA; ####p <0,0001 pret D0 Для сравнения ****p < 0,0201) Mākslīgais intelekts sirds audu strukturālās integritātes kvantitatīvai noteikšanai (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) griezumi/grupa no katras dažādām cūkām, vienvirziena ANOVA tests; ####p<0,0001 pret .D0. Salīdzinājumam ****p < 0,0001, salīdzinot ar D12 Ctrl). c Reprezentatīvi attēli (pa kreisi) un kvantifikācija (pa labi) sirds šķēlītēm, kas iekrāsotas ar Masona trihroma krāsvielu (mēroga tukšums = 500 µm) (n = 10 šķēles/grupa katra no dažādām cūkām, tiek veikts vienvirziena ANOVA tests; ####p < 0,0001 salīdzinājumā ar D0 un ***p < 0,001 salīdzinājumā ar D12 Ctrl). c Reprezentatīvi attēli (pa kreisi) un kvantifikācija (pa labi) sirds šķēlītēm, kas iekrāsotas ar Masona trihroma krāsvielu (mēroga tukšums = 500 µm) (n = 10 šķēles/grupa katra no dažādām cūkām, tiek veikts vienvirziena ANOVA tests; #### p < 0,0001 salīdzinājumā ar D0 un ***p < 0,001 salīdzinājumā ar D12 Ctrl). c Репрезентативные изображения (слева) и количественная оценка (справа) срезов сердца, окрашенных трихром (масштаб без покрытия = 500 мкм) (n = 10 срезов/группу от разных свиней, выполняется односторонний ## p#VA; 0,0001 по сравнению с D0 un ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Sirds griezumu, kas iekrāsoti ar Masona trihroma krāsvielu (nepārklāta skala = 500 µm), reprezentatīvi attēli (pa kreisi) un kvantitatīvā noteikšana (pa labi) (n = 10 griezumi/grupa no dažādām cūkām, veikts vienvirziena ANOVA tests; #### p < 0,0001 salīdzinājumā ar D0 un ***p < 0,001 salīdzinājumā ar D12 Ctrl). c 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像（左）和量化（右）（裸尺0）（裸尺0） 10 个切片/组，每组来自不同的猪，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0.0001 与D0 相比1.***1︌0p.相比）. C 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 （左 左） 量化 （右） 尸尦躸 尸尺度裸尺度 = 500 µm） （n = 10 个 切片 组 每 组 来自 不同 猪 ， 进行 单向 单 曑进行 单向 单 单向 ### 0,0001 与D0 相比，***p < 0,001 与D12 Ctrl 相比）. c Репрезентативные изображения (слева) и количественный анализ (справа) срезов сердца, окрашенных трихром (чистая шкала = 500 мкм) (n = 10 срезов/группа, каждый от другой свиньи, протестировано с помощью однофо дисперсионного анализа ;### #p < 0,0001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Sirds griezumu, kas iekrāsoti ar Masona trihroma krāsvielu (tukš = 500 µm), reprezentatīvi attēli (pa kreisi) un kvantitatīva noteikšana (pa labi) (n = 10 griezumi/grupa, katrs no citas cūkas, testēts ar vienvirziena dispersijas analīzi; ### # p < 0,0001 salīdzinājumā ar D0, ***p < 0,001 salīdzinājumā ar D12 Ctrl).Kļūdu joslas apzīmē vidējo ± standarta novirzi.
Mēs izvirzījām hipotēzi, ka, pievienojot barotnei mazas molekulas, CTCM kultūras laikā var uzlabot kardiomiocītu integritāti un samazināt fibrozes attīstību. Tāpēc mēs veicām mazo molekulu skrīningu, izmantojot mūsu statiskās kontroles kultūras20,21, jo ir maz traucējošo faktoru. Šim skrīningam tika izvēlēts deksametazons (Dex), trijodtironīns (T3) un SB431542 (SB). Šīs mazās molekulas iepriekš ir izmantotas hiPSC-CM kultūrās, lai inducētu kardiomiocītu nobriešanu, palielinot sarkomēru garumu, T-kanāliņus un vadīšanas ātrumu. Turklāt ir zināms, ka gan Dex (glikokortikoīds), gan SB nomāc iekaisumu29,30. Tāpēc mēs pārbaudījām, vai vienas vai vairāku šo mazo molekulu kombinācijas iekļaušana uzlabotu sirds sekciju strukturālo integritāti. Sākotnējai skrīningam katra savienojuma deva tika izvēlēta, pamatojoties uz koncentrācijām, ko parasti izmanto šūnu kultūru modeļos (1 μM Dex27, 100 nM T327 un 2,5 μM SB31). Pēc 12 dienu kultivēšanas T3 un Dex kombinācija nodrošināja optimālu kardiomiocītu strukturālo integritāti un minimālu šķiedru remodelāciju (4. un 5. papildattēls). Turklāt divkāršas vai dubultas T3 un Dex koncentrācijas lietošana radīja kaitīgu ietekmi, salīdzinot ar normālām koncentrācijām (6.a,b papildattēls).
Pēc sākotnējās skrīninga mēs veicām 4 kultivēšanas apstākļu tiešu salīdzinājumu (4.a attēls): Ctrl: sirds griezumi, kultivēti mūsu iepriekš aprakstītajā statiskajā kultūrā, izmantojot mūsu optimizēto barotni; 20.21 TD: T3 un Ctrl, kam trešdien pievienots Dex; MC: sirds griezumi, kultivēti CTCM, izmantojot mūsu iepriekš optimizēto barotni; un MT: CTCM, kam barotnei pievienots T3 un Dex. Pēc 12 kultivēšanas dienām MS un MT audu dzīvotspēja saglabājās tāda pati kā svaigos audos, kas novērtēta ar MTT testu (4.b attēls). Interesanti, ka T3 un Dex pievienošana transwell kultūrām (TD) neizraisīja būtisku dzīvotspējas uzlabojumu, salīdzinot ar Ctrl apstākļiem, kas norāda uz mehāniskās stimulācijas svarīgu lomu sirds griezumu dzīvotspējas saglabāšanā.
Eksperimentāla dizaina diagramma, kurā attēloti četri kultivēšanas apstākļi, kas izmantoti, lai novērtētu mehāniskās stimulācijas un T3/Dex piedevas ietekmi uz barotni 12 dienas. b Stabiņu diagramma parāda dzīvotspējas kvantitatīvo noteikšanu 12 dienas pēc kultivēšanas visos 4 kultivēšanas apstākļos (kontrole, TD, MC un MT), salīdzinot ar svaigām sirds šķēlītēm (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD un D12 MT), 12 (D12 MC) šķēles/grupa no dažādām cūkām, tiek veikts vienvirziena ANOVA tests; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 salīdzinājumā ar D0 un **p < 0,01 salīdzinājumā ar D12 Ctrl). b Stabiņu diagramma parāda dzīvotspējas kvantitatīvo noteikšanu 12 dienas pēc kultivēšanas visos 4 kultivēšanas apstākļos (kontrole, TD, MC un MT), salīdzinot ar svaigām sirds šķēlītēm (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD un D12 MT), 12 (D12 MC) šķēles/grupa no dažādām cūkām, tiek veikts vienvirziena ANOVA tests; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 salīdzinājumā ar D0 un **p < 0,01 salīdzinājumā ar D12 ctrl). b Гистограмма показывает количественную оценку жизнеспособности через 12 дней после культивирования во 4вивирования во4 культивирования (контроль, TD, MC un MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TDMT1), D12 срезов/группу от разных свиней, проводится односторонний тест ANOVA; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 по сравнению с D0 и **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). b Stabiņu diagramma parāda dzīvotspējas kvantitatīvo noteikšanu 12 dienas pēc kultivēšanas visos 4 kultivēšanas apstākļos (kontrole, TD, MC un MT), salīdzinot ar svaigām sirds sekcijām (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD un D12 MT), 12 (D12 MC) sekcijas/grupa no dažādām cūkām, vienvirziena ANOVA tests; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 pret D0 un **p < 0,01, salīdzinot ar D12 Ctrl). b 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) (n = 18 (D1215) D1215)和D12 MT)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；####p < 0.0001，###0p1 < 0.0#.相比，**p < 0,01 与D12控制）.b 4 12 (D12 MC) b Гистограмма, показывающая все 4 условия культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими со свежими срез0 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD un D12 MT), от разных свиней 12 (D12 MC) срезы/группа, односторонний тест ANOVA, ##0#p <0, ####p <0, ####p <0, ####p < о сравнению с D0, **p <0,01 по сравнению с контролем D12). b Histogramma, kurā parādīti visi 4 kultivēšanas apstākļi (kontrole, TD, MC un MT), salīdzinot ar svaigām sirds sekcijām (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD un D12 MT), no dažādām cūkām, 12 (D12 MC) sekcijas/grupa, vienvirziena ANOVA tests; ####p<0,0001, ###p<0,001 pret D0, **p<0,01 pret kontroli D12). c Stabiņu diagramma parāda glikozes plūsmas kvantitatīvo noteikšanu 12 dienas pēc kultivēšanas visos 4 kultivēšanas apstākļos (kontrole, TD, MC un MT), salīdzinot ar svaigām sirds šķēlītēm (D0) (n = 6 šķēles/grupa no dažādām cūkām, tiek veikts vienvirziena ANOVA tests; ###p < 0,001, salīdzinot ar D0 un ***p < 0,001, salīdzinot ar D12 Ctrl). c Stabiņu diagramma parāda glikozes plūsmas kvantitatīvo noteikšanu 12 dienas pēc kultivēšanas visos 4 kultivēšanas apstākļos (kontrole, TD, MC un MT), salīdzinot ar svaigām sirds šķēlītēm (D0) (n = 6 šķēles/grupa no dažādām cūkām, tiek veikts vienvirziena ANOVA tests; ###p < 0,001, salīdzinot ar D0 un ***p < 0,001, salīdzinot ar D12 Ctrl). c Гистограмма показывает количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после культивирования во 4 всусехво во всусе культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 6 срезов/группу от разниных развиных от разнению односторонний Выполняется тест ANOVA; ###p < 0,001 по сравнению с D0 и ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Histogrammā parādīta glikozes plūsmas kvantitatīvā noteikšana 12 dienas pēc kultivēšanas visos 4 kultivēšanas apstākļos (kontroles, TD, MC un MT), salīdzinot ar svaigām sirds sekcijām (D0) (n = 6 sekcijas/grupa no dažādām cūkām, veikts vienvirziena ANOVA tests; ###p < 0,001, salīdzinot ar D0, un ***p < 0,001, salīdzinot ar D12 Ctrl). c 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) 相掐12，天的葡萄糖通量定量（n = 6 片/组，来自不同猪，单向执行ANOVA 测试；###p < 0.0与D < 0.0.相比，***p < 0,001 与D12 Ctrl 相比）. C 条形图 显示 所有 4 种 条件 （（ctrl 、 td 、 mc 和 mt） 新鲜 心脏 切片 切片 切片 切片培养 后 后 12 天 的 通量 定量 （n = 6 片/组 ， 来自 猪 , ， 的 , ， ， ，猪单向执行ANOVA 测试；###p < 0,001，与D0 相比，***p < 0,001 与D12 Ctrl 相比）. c Гистограмма, показывающая количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после культивирования куличественную дценку культивирования (контроль, TD, MC un MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 6 срезов/группа, от раз свиней, односторонний Были проведены тесты ANOVA; ###p < 0,001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению с D12 (контроль). c Histogramma, kas parāda glikozes plūsmas kvantitatīvo noteikšanu 12 dienas pēc kultivēšanas visos 4 kultivēšanas apstākļos (kontrole, TD, MC un MT), salīdzinot ar svaigām sirds sekcijām (D0) (n = 6 sekcijas/grupa, no dažādām cūkām, vienpusēji). Tika veikti ANOVA testi, ###p < 0,001, salīdzinot ar D0, ***p < 0,001, salīdzinot ar D12 (kontrole).d Svaigu (zilu), 12. dienas MC (zaļu) un 12. dienas MT (sarkanu) audu celmu analīzes diagrammas desmit reģionālos audu griezumu punktos (n = 4 šķēles/grupa, vienvirziena ANOVA tests; starp grupām nebija būtiskas atšķirības). e Vulkāna diagramma, kurā parādīti atšķirīgi ekspresētie gēni svaigās sirds sekcijās (D0), salīdzinot ar sirds sekcijām, kas kultivētas statiskos apstākļos (Ctrl) vai MT apstākļos (MT) 10–12 dienas. f Sarkomēru gēnu karstuma karte sirds sekcijām, kas kultivētas katros no kultivēšanas apstākļiem. Kļūdu joslas apzīmē vidējo vērtību ± standartnovirzi.
Metabolisma atkarība no pārejas no taukskābju oksidēšanās uz glikolīzi ir kardiomiocītu dediferenciācijas pazīme. Nenobrieduši kardiomiocīti galvenokārt izmanto glikozi ATP ražošanai un tiem ir hipoplastiski mitohondriji ar nelielu kristām5,32. Glikozes izmantošanas analīzes parādīja, ka MC un MT apstākļos glikozes izmantošana bija līdzīga tai, kas tika izmantota 0. dienas audos (4.c attēls). Tomēr Ctrl paraugos bija ievērojams glikozes izmantošanas pieaugums salīdzinājumā ar svaigiem audiem. Tas norāda, ka CTCM un T3/Dex kombinācija uzlabo audu dzīvotspēju un saglabā 12 dienu kultivētu sirds sekciju vielmaiņas fenotipu. Turklāt deformācijas analīze parādīja, ka deformācijas līmenis 12 dienas MT un MS apstākļos saglabājās tāds pats kā svaigos sirds audos (4.d attēls).
Lai analizētu CTCM un T3/Dex kopējo ietekmi uz sirds šķēlīšu audu globālo transkripcijas ainavu, mēs veicām RNS sekvencēšanu sirds šķēlītēs no visiem četriem dažādiem kultivēšanas apstākļiem (1. papilddati). Interesanti, ka MT šķēlēs bija augsta transkripcijas līdzība ar svaigiem sirds audiem, tikai 16 no 13 642 gēniem bija diferencēti ekspresēti. Tomēr, kā jau parādījām iepriekš, Ctrl šķēlēs pēc 10–12 dienām kultūrā bija redzami 1229 diferencēti ekspresēti gēni (4.e att.). Šos datus apstiprināja sirds un fibroblastu gēnu qRT-PCR (7.a–c. papildattēls). Interesanti, ka Ctrl šķēlēs bija redzama sirds un šūnu cikla gēnu samazināta regulācija un iekaisuma gēnu programmu aktivācija. Šie dati liecina, ka dediferenciācija, kas parasti notiek pēc ilgstošas ​​kultivēšanas, MT apstākļos ir pilnībā vājināta (8.a,b. papildattēls). Rūpīga sarkomēru gēnu izpēte parādīja, ka tikai MT apstākļos tiek saglabāti gēni, kas kodē sarkomēru (4.f att.) un jonu kanālu (9. papildattēls), pasargājot tos no nomākšanas Ctrl, TD un MC apstākļos. Šie dati liecina, ka, kombinējot mehānisko un humorālo stimulāciju (T3/Dex), sirds šķēles transkriptoms var saglabāties līdzīgs svaigām sirds šķēlēm pēc 12 dienām kultūrā.
Šos transkripcijas atklājumus apstiprina fakts, ka kardiomiocītu strukturālā integritāte sirds griezumos vislabāk saglabājas MT apstākļos 12 dienas, ko parāda neskarts un lokalizēts koneksīns 43 (5.a att.). Turklāt fibroze sirds griezumos MT apstākļos bija ievērojami samazināta, salīdzinot ar Ctrl, un līdzīga svaigiem sirds griezumiem (5.b att.). Šie dati liecina, ka mehāniskās stimulācijas un T3/Dex apstrādes kombinācija efektīvi saglabā sirds struktūru sirds griezumos kultūrā.
a Troponīna-T (zaļš), konexīna 43 (sarkans) un DAPI (zils) reprezentatīvi imunofluorescences attēli svaigi izolētās sirds daļās (D0) vai kultivētās 12 dienas visos četros sirds daļu kultivēšanas apstākļos (mēroga josla = 100 µm). ). Sirds audu strukturālās integritātes kvantitatīva noteikšana ar mākslīgo intelektu (n = 7 (D0 un D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC un D12 MT) šķēles/grupa no dažādām cūkām, tiek veikts vienvirziena ANOVA tests; ####p < 0,0001 salīdzinājumā ar D0 un *p < 0,05 vai ****p < 0,0001 salīdzinājumā ar D12 Ctrl). Sirds audu strukturālās integritātes kvantitatīva noteikšana ar mākslīgo intelektu (n = 7 (D0 un D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC un D12 MT) šķēles/grupa no dažādām cūkām, tiek veikts vienvirziena ANOVA tests; #### p < 0,0001 salīdzinājumā ar D0 un *p < 0,05 vai ****p < 0,0001 salīdzinājumā ar D12 Ctrl). Количественная оценка структурной целостности ткани сердца с помощью искусственного интеллекта (n = 71,2D10) D12 MC un D12 MT) срезов/группу от разных свиней, проведен однофакторный тест ANOVA #### p < 0,0001 по сравне, 0001 по сравне; ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). Sirds audu strukturālās integritātes kvantitatīva noteikšana, izmantojot mākslīgo intelektu (n = 7 (D0 un D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC un D12 MT) griezumi/grupa no dažādām cūkām, veikts vienvirziena ANOVA tests; #### p < 0,0001 salīdzinājumā ar D0 un *p < 0,05 vai ****p < 0,0001 salīdzinājumā ar D12 Ctrl).对不同猪的心脏组织结构完整性（n = 7（D0 和D12 Ctrl）、、5（D12 TD、D12 MC 和D12 MT）切片/组）进行人工智能量化，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0,0001 与D0 和*盌渖戌*p. 0.0001 与D12 Ctrl 相比）.对 不同 猪 的 心脏 结构 完整性 (n = 7 （d0 和 d12 ctrl） （5 （d12 td 、 d12 mc12 mc人工 智能量 化 进行 单向 单向 单向 测试 ； ########## p < 0,0001 与D0 和*p < 0,05戔0,0001 与D12 Ctrl 相比）.Sirds audu strukturālās integritātes kvantitatīva noteikšana, izmantojot mākslīgo intelektu dažādām cūkām (n = 7 (0. un 12. dienas Ctrl), 5 (12. dienas TD, 12. dienas MC un 12. dienas MT) sekcijas/grupas), izmantojot vienvirziena ANOVA testu;#### p < 0,0001 по сравнению с D0 и *p < 0,05 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). #### p < 0,0001 salīdzinājumā ar D0 un *p < 0,05 vai ****p < 0,0001 salīdzinājumā ar D12 (vadības poga). b Reprezentatīvi attēli un kvantitatīva noteikšana sirds šķēlītēm, kas iekrāsotas ar Masona trihroma krāsvielu (mēroga josla = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD un D12 MC), 9 (D12 MT) šķēles/grupa no dažādām cūkām, tiek veikts vienvirziena ANOVA tests; ####p < 0,0001 salīdzinājumā ar D0 un ***p < 0,001 vai ****p < 0,0001 salīdzinājumā ar D12 Ctrl). b Reprezentatīvi attēli un kvantitatīva noteikšana sirds šķēlītēm, kas iekrāsotas ar Masona trihroma krāsvielu (mēroga josla = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD un D12 MC), 9 (D12 MT) šķēles/grupa no dažādām cūkām, tiek veikts vienvirziena ANOVA tests; ####p < 0,0001 salīdzinājumā ar D0 un ***p < 0,001 vai ****p < 0,0001 salīdzinājumā ar D12 Ctrl). b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромным красителеным красителеным линейка = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD un D12 MC), 9 (D12 MT) срезов/группу от разных свиней, выпояроннияйностостостонодатс; ####p < 0,0001 по сравнению с D0 un ***p < 0,001 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). b Sirds sekciju, kas iekrāsotas ar Masona trihroma krāsvielu (skalas josla = 500 µm), reprezentatīvi attēli un kvantitatīva noteikšana (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD un D12 MC), 9 (D12 MT) sekcijas/grupa no dažādām cūkām, veikta vienvirziena ANOVA; ####p < 0,0001 pret D0 un ***p < 0,001 vai ****p < 0,0001 pret D12 Ctrl). b 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像和量化（比例尺= 500 µm（D01＀（n Ctrl、D12 TD 和D12 MC），来自不同猪的9 个（D12 MT）切片/组，进行单因素方差0.0###p与D0 相比，***p < 0,001，或****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）. b 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 和 量化 （比例 尺 尺 尺 = 500 µ0 n（0 、 d12 ctrl 、 d12 td 和 d12 mc） 来自 不同 的 9 个 d12 mt 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片/组，进行单因素方差分析；##.00D001相比，***p < 0,001，或****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）. b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромом Масссона (тил500ромом Масссона мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD un D12 MC), 9 (D12 MT) срезов от разных свиней / группы, один- способ ANOVA; #0,0#0p01 с D0, ***p < 0,001 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). b Sirds griezumu, kas iekrāsoti ar Masona trihromu (mēroga josla = 500 µm), reprezentatīvi attēli un kvantitatīva noteikšana (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD un D12 MC), 9 (D12 MT) griezumi no dažādām cūkām/grupas, viena ANOVA metode; ####p < 0,0001 salīdzinājumā ar D0, ***p < 0,001 vai ****p < 0,0001 salīdzinājumā ar D12 Ctrl).Kļūdu joslas apzīmē vidējo ± standarta novirzi.
Visbeidzot, CTCM spēja imitēt sirds hipertrofiju tika novērtēta, palielinot sirds audu stiepšanos. CTCM gadījumā maksimālais gaisa kameras spiediens palielinājās no 80 mmHg līdz 80 mmHg. Art. (normāla stiepšanās) līdz 140 mmHg Art. (6.a att.). Tas atbilst 32% stiepšanās palielinājumam (6.b att.), kas iepriekš tika parādīts kā atbilstoša procentuālā stiepšanās, kas nepieciešama sirds sekcijām, lai sasniegtu sarkomēra garumu, kas līdzīgs hipertrofijas gadījumā novērotajam. Sirds audu stiepšanās un ātrums kontrakcijas un relaksācijas laikā sešu dienu kultivēšanas laikā saglabājās nemainīgs (6.c att.). Sirds audi no MT apstākļiem sešas dienas tika pakļauti normālai stiepšanai (MT (Normāls)) vai pārstiepšanai (MT (OS)). Jau pēc četrām dienām kultivēšanā hipertrofiskais biomarķieris NT-ProBNP bija ievērojami paaugstināts vidē MT (OS) apstākļos, salīdzinot ar MT (normāliem) apstākļiem (7.a att.). Turklāt pēc sešu dienu kultivēšanas šūnu izmērs MT (OS) (7.b att.) ievērojami palielinājās, salīdzinot ar MT sirds sekcijām (normālām). Turklāt NFATC4 kodola translokācija bija ievērojami palielināta pārstieptos audos (7.c att.). Šie rezultāti parāda patoloģiskas remodelācijas progresējošu attīstību pēc hiperdistensijas un apstiprina koncepciju, ka CTCM ierīci var izmantot kā platformu stiepšanās izraisītas sirds hipertrofijas signalizācijas pētīšanai.
Gaisa kameras spiediena, šķidruma kameras spiediena un audu kustības mērījumu reprezentatīvas līknes apstiprina, ka kameras spiediens maina šķidruma kameras spiedienu, izraisot atbilstošu audu šķēles kustību. b Reprezentatīvas stiepšanās procentuālās un stiepšanās ātruma līknes normāli izstieptām (oranžām) un pārstieptām (zilām) audu sekcijām. c Stieņu diagramma, kas parāda cikla laiku (n = 19 šķēles katrā grupā, no dažādām cūkām), kontrakcijas laiku (n = 18–19 šķēles katrā grupā, no dažādām cūkām), relaksācijas laiku (n = 19 šķēles katrā grupā, no dažādām cūkām)), audu kustības amplitūdu (n = 14 šķēles/grupa, no dažādām cūkām), maksimālo sistolisko ātrumu (n = 14 šķēles/grupa, no dažādām cūkām) un maksimālo relaksācijas ātrumu (n = 14 (D0), 15 (D6)) sekcijas/grupas) no dažādām cūkām), divpusējs Stjudenta t-tests neuzrādīja būtisku atšķirību nevienā parametrā, norādot, ka šie parametri 6 kultivēšanas dienu laikā ar pārspriegumu saglabājās nemainīgi. Kļūdu joslas apzīmē vidējo vērtību ± standartnovirzi.
NT-ProBNP koncentrācijas joslu diagrammas kvantitatīva noteikšana barotnēs no sirds šķēlītēm, kas kultivētas MT normālas stiepšanās (Norm) vai pārstiepšanās (OS) apstākļos (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm un D4 MTOS) šķēles/grupa no dažādām cūkām, veikta divvirzienu ANOVA; **p < 0,01 salīdzinājumā ar normālu stiepšanos). NT-ProBNP koncentrācijas kvantitatīva noteikšana ar joslu diagrammu barotnēs no sirds šķēlītēm, kas kultivētas MT normālas stiepšanās (Norm) vai pārstiepšanās (OS) apstākļos (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm un D4 MTOS) šķēles/grupa no dažādām cūkām, veikta divvirzienu ANOVA; **p < 0,01 salīdzinājumā ar normālu stiepšanos).NT-ProBNP koncentrācijas kvantitatīva histogramma barotnē no sirds šķēlītēm, kas kultivētas normālas MT stiepšanās (normas) vai pārstiepšanās (OS) apstākļos (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm un D4).MTOS) šķēles/grupa no dažādām cūkām, veikta divfaktoru dispersijas analīze;**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p < 0,01 salīdzinājumā ar normālu stiepšanos). a 在MT 正常拉伸(Norm) 或过度拉伸(OS) 条件下培养的心脏切片培养基中NT-ProBNP浓度的条形图量化（n = 4 (D2 MTNorm)、3（D2 MTOS、D4 MTNorm 和D4 MTOS）来自不同猪的切片/组，进行双向方差分析；**与正常拉伸相比，p < 0,01). a NT-ProBNP koncentrācijas kvantitatīva noteikšana sirds šķēlēs, kas kultivētas MT normālas stiepes (Norm) vai pārmērīgas stiepes (OS) apstākļos (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm和D4 MTOS) no dažādiem猪的切片/组，可以双向方方发发动 **salīdzinot ar parasto stiepšanu, p < 0,01).Histogramma. NT-ProBNP koncentrāciju kvantitatīva noteikšana sirds šķēlītēs, kas kultivētas normālas MT stiepšanās (normas) vai pārstiepšanās (OS) apstākļos (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm) un D4 MTOS) šķēles/grupa no dažādām cūkām, divvirzienu dispersijas analīze;**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p < 0,01 salīdzinājumā ar normālu stiepšanos). b Reprezentatīvi attēli sirds šķēlītēm, kas iekrāsotas ar troponīnu-T un WGA (pa kreisi), un šūnu lieluma kvantitatīvai noteikšanai (pa labi) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) šūnas/grupa no 10 dažādām šķēlītēm no dažādām cūkām, tiek veikts divpusējs Student t-tests; ****p < 0,0001 salīdzinājumā ar normālu stiepšanos). b Reprezentatīvi attēli sirds šķēlītēm, kas iekrāsotas ar troponīnu-T un WGA (pa kreisi), un šūnu lieluma kvantitatīvajai noteikšanai (pa labi) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) šūnas/grupa no 10 dažādām šķēlītēm no dažādām cūkām, tiek veikts divpusējs Student t-tests; ****p < 0,0001 salīdzinājumā ar normālu stiepšanos). b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слева) и количественанного клеток (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) клеток/группу из 10 разных срезов от разных свиней, два- провово хвостовой t-критерий Стьюдента; ****p < 0,0001 по сравнению с нормальным растяжением). b Sirds sekciju reprezentatīvi attēli, kas iekrāsoti ar troponīnu-T un AZP (pa kreisi), un šūnu lieluma kvantitatīvā noteikšana (pa labi) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) šūnas/grupa no 10 dažādām sekcijām no dažādām cūkām, tika veikts divpusējs Stjudenta t-tests; ****p < 0,0001, salīdzinot ar normālo celmu). b 用肌钙蛋白-T 和WGA（左）和细胞大小量化（右）染色的心脏切片的代脏切片的代表揃330D MTOS），来自不同猪的10 个不同切片的369（D6 MTNorm）细胞/组，两进行有尾t学甦 检验；与正常拉伸相比，****p < 0,0001）. b Ar kalkareīnu-T un WGA iekrāsotu sirds šķēļu reprezentatīvi attēli (pa kreisi) un šūnu izmērs (pa labi) (n = 330 (D6 MTOS), 369 no 10 dažādām šķēlītēm (D6 MTNorm)). Šūnas/组，两方法有尾学生t tests；salīdzinājumā ar normālu stiepšanu，****p < 0,0001). b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т un АЗП (слева) un колкичестверанка (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) из 10 различных срезов от разных свиней Клетки/группа, двустрийстороней Стьюдента; ****p < 0,0001 по сравнению с нормальным растяжением). b Sirds sekciju reprezentatīvi attēli, kas iekrāsoti ar troponīnu-T un AZP (pa kreisi), un šūnu lieluma kvantitatīva noteikšana (pa labi) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) no 10 dažādām sekcijām no dažādām cūkām) Šūnas/grupa, divpusējs kritērijs Studenta t; ****p < 0,0001 salīdzinājumā ar normālo celmu). c Reprezentatīvi attēli 0. un 6. dienas MTOS sirds šķēlītēm, kas imūnmarķētas ar troponīnu-T un NFATC4, un NFATC4 translokācijas kvantitatīva noteikšana uz sirds šūnu kodoliem (n = 4 (0. diena), 3 (6. diena MTOS) šķēles/grupa no dažādām cūkām, tiek veikts divpusējs Student t-tests; *p < 0,05). c Reprezentatīvi attēli 0. un 6. dienas MTOS sirds šķēlītēm, kas imūnmarķētas ar troponīnu-T un NFATC4, un NFATC4 translokācijas kvantitatīva noteikšana uz sirds šūnu kodoliem (n = 4 (0. diena), 3 (6. diena MTOS) šķēles/grupa no dažādām cūkām, tiek veikts divpusējs Stjudenta t-tests; *p < 0,05). c Репрезентативные изображения для срезов сердца 0 и 6 дней MTOS, иммуномеченых для тропонина-Т и NFATC4, чяекол оценка транслокации NFATC4 в ядра кавернозных клеток (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срезов/группу от разных свинетпля , , двусторонний t-критерий Стьюдента; *p < 0,05). c Reprezentatīvi attēli sirds griezumiem 0. un 6. dienā pēc MTOS, imūnmarķēti ar troponīnu-T un NFATC4, un NFATC4 translokācijas kvantitatīva noteikšana kavernozo šūnu kodolā (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) šķēles/grupa no dažādām cūkām), veicot divpusēju Stjudenta t-testu; *p < 0,05). c 用于肌钙蛋白-T 和NFATC4 免疫标记的第0 天和第6 天MTOS心脏切片的代表性图像，以及来自不同猪的NFATC4 易位至CM 细マ核的量化 6（D0) = MT切片/组, 进行双尾学生t 检验；*p < 0,05). c Kalkanīna-T un NFATC4 imūnmarķēšanas 第0天和第6天MTOS sirds šķēles un NFATC4 reprezentatīvi attēli no dažādiem NFATC4 易位至CM šūnu kodoliem的quantity化 (n = 4 (D0), 缄 凤 3, D时间双尾学生et 电影；*p < 0,05). c Репрезентативные изображения срезов сердца MTOS на 0 и 6 день для иммуномаркировки тропонином-Т и NFATC4 срезов сердца и MTOS транслокации NFATC4 в ядра CM от разных свиней (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срез/группа, два- хвостатый t-критью *

0,05). c MTOS sirds šķēļu reprezentatīvi attēli 0. un 6. dienā troponīna-T un NFATC4 imūnmarķēšanai un NFATC4 translokācijas kvantitatīvai noteikšanai CM kodolā no dažādām cūkām (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) šķēles/grupa, divpusējs t-kritērijs Student; *p < 0,05).Kļūdu joslas apzīmē vidējo ± standarta novirzi.
Translācijas kardiovaskulārajiem pētījumiem ir nepieciešami šūnu modeļi, kas precīzi reproducē sirds vidi. Šajā pētījumā tika izstrādāta un raksturota CTCM ierīce, kas var stimulēt īpaši plānus sirds griezumus. CTCM sistēma ietver fizioloģiski sinhronizētu elektromehānisko stimulāciju un T3 un Dex šķidruma bagātināšanu. Kad cūku sirds griezumi tika pakļauti šiem faktoriem, to dzīvotspēja, strukturālā integritāte, vielmaiņas aktivitāte un transkripcijas ekspresija saglabājās tāda pati kā svaigos sirds audos pēc 12 dienu kultivēšanas. Turklāt pārmērīga sirds audu stiepšana var izraisīt sirds hipertrofiju, ko izraisa hiperekstensija. Kopumā šie rezultāti apstiprina fizioloģisko kultivēšanas apstākļu kritisko lomu normāla sirds fenotipa uzturēšanā un nodrošina platformu zāļu skrīningam.
Daudzi faktori veicina optimālas vides radīšanu kardiomiocītu funkcionēšanai un izdzīvošanai. Visacīmredzamākie no šiem faktoriem ir saistīti ar (1) starpšūnu mijiedarbību, (2) elektromehānisko stimulāciju, (3) humorālajiem faktoriem un (4) vielmaiņas substrātiem. Fizioloģiskai šūnu mijiedarbībai ir nepieciešami sarežģīti trīsdimensiju tīkli, kas sastāv no vairākiem šūnu tipiem, ko atbalsta ekstracelulārā matrica. Šādas sarežģītas šūnu mijiedarbības ir grūti rekonstruēt in vitro, kopkultivējot atsevišķus šūnu tipus, bet to var viegli panākt, izmantojot sirds sekciju organotipisko raksturu.
Kardiomiocītu mehāniskā stiepšanās un elektriskā stimulācija ir kritiski svarīga sirds fenotipa saglabāšanai33,34,35. Lai gan mehāniskā stimulācija ir plaši izmantota hiPSC-CM kondicionēšanai un nobriešanai, nesen vairākos elegantos pētījumos ir mēģināts mehāniski stimulēt sirds šķēles kultūrā, izmantojot vienpusēju slodzi. Šie pētījumi liecina, ka 2D vienpusējai mehāniskajai slodzei ir pozitīva ietekme uz sirds fenotipu kultūras laikā. Šajos pētījumos sirds sekcijas tika vai nu noslogotas ar izometriskiem stiepes spēkiem17, lineāru auksotonisku slodzi18, vai arī sirds cikls tika atjaunots, izmantojot spēka pārveidotāja atgriezenisko saiti un sprieguma piedziņas. Tomēr šīs metodes izmanto vienpusēju audu stiepšanos bez vides optimizācijas, kā rezultātā tiek nomākti daudzi sirds gēni vai pārekspresēta gēni, kas saistīti ar patoloģiskām stiepšanās reakcijām. Šeit aprakstītā CTCM nodrošina 3D elektromehānisku stimulu, kas atdarina dabisko sirds ciklu cikla laika un fizioloģiskā stiepšanās ziņā (25% stiepšanās, 40% sistole, 60% diastole un 72 sitieni minūtē). Lai gan šī trīsdimensiju mehāniskā stimulācija vien nav pietiekama, lai saglabātu audu integritāti, ir nepieciešama humorālās un mehāniskās stimulācijas kombinācija, izmantojot T3/Dex, lai pienācīgi uzturētu audu dzīvotspēju, funkciju un integritāti.
Humorālajiem faktoriem ir svarīga loma pieaugušo sirds fenotipa modulēšanā. Tas tika uzsvērts HiPS-CM pētījumos, kuros T3 un Dex tika pievienoti kultūras barotnei, lai paātrinātu šūnu nobriešanu. T3 var ietekmēt aminoskābju, cukuru un kalcija transportēšanu caur šūnu membrānām36. Turklāt T3 veicina MHC-α ekspresiju un MHC-β regulācijas samazināšanos, veicinot ātras raustīšanās miofibrilu veidošanos nobriedušos kardiomiocītos, salīdzinot ar lēnas raustīšanās miofibrilām augļa CM. T3 deficīts pacientiem ar hipotireozi izraisa miofibrilāro joslu zudumu un samazinātu tonusa attīstības ātrumu37. Dex iedarbojas uz glikokortikoīdu receptoriem un ir pierādīts, ka tas palielina miokarda kontraktilitāti izolētās perfuzētām sirdīm;38 tiek uzskatīts, ka šis uzlabojums ir saistīts ar ietekmi uz kalcija nogulšņu izraisītu iekļūšanu (SOCE)39,40. Turklāt Dex saistās ar saviem receptoriem, izraisot plašu intracelulāru reakciju, kas nomāc imūnfunkciju un iekaisumu30.
Mūsu rezultāti liecina, ka fizikāli mehāniskā stimulācija (MS) uzlaboja kopējo kultūras sniegumu, salīdzinot ar Ctrl, bet nespēja saglabāt dzīvotspēju, strukturālo integritāti un sirds ekspresiju 12 dienu laikā kultūrā. Salīdzinot ar Ctrl, T3 un Dex pievienošana CTCM (MT) kultūrām uzlaboja dzīvotspēju un saglabāja līdzīgus transkripcijas profilus, strukturālo integritāti un vielmaiņas aktivitāti ar svaigiem sirds audiem 12 dienas. Turklāt, kontrolējot audu stiepšanās pakāpi, izmantojot STCM, tika izveidots hiperekstensijas izraisītas sirds hipertrofijas modelis, kas ilustrē STCM sistēmas daudzpusību. Jāatzīmē, ka, lai gan sirds remodelācijā un fibrozē parasti ir iesaistīti neskarti orgāni, kuru cirkulējošās šūnas var nodrošināt atbilstošus citokīnus, kā arī fagocitozi un citus remodelācijas faktorus, sirds daļas joprojām var atdarināt fibrozes procesu, reaģējot uz stresu un traumu. Tas iepriekš ir novērtēts šajā sirds šķēles modelī. Jāatzīmē, ka CTCM parametrus var modulēt, mainot spiedienu/elektrisko amplitūdu un frekvenci, lai simulētu daudzus stāvokļus, piemēram, tahikardiju, bradikardiju un mehānisku asinsrites atbalstu (mehāniski nenoslogota sirds). Tas padara sistēmu par vidējas caurlaidības zāļu testēšanai. CTCM spēja modelēt pārslodzes izraisītu sirds hipertrofiju paver ceļu šīs sistēmas testēšanai personalizētai terapijai. Noslēgumā jāsaka, ka pašreizējais pētījums parāda, ka mehāniska stiepšanās un humorāla stimulācija ir kritiski svarīgas sirds audu sekciju kultūras uzturēšanai.
Lai gan šeit sniegtie dati liecina, ka CTCM ir ļoti daudzsološa platforma neskarta miokarda modelēšanai, šai kultivēšanas metodei ir daži ierobežojumi. CTCM kultivēšanas galvenais ierobežojums ir nepārtraukta dinamiska mehāniska slodze uz šķēlītēm, kas neļauj aktīvi uzraudzīt sirds šķēlīšu kontrakcijas katra cikla laikā. Turklāt, ņemot vērā sirds griezumu mazo izmēru (7 mm), iespēja novērtēt sistolisko funkciju ārpus kultivēšanas sistēmām, izmantojot tradicionālos spēka sensorus, ir ierobežota. Pašreizējā manuskriptā mēs daļēji pārvaram šo ierobežojumu, novērtējot optisko spriegumu kā kontraktilās funkcijas indikatoru. Tomēr šim ierobežojumam būs nepieciešams turpmāks darbs, un to varētu risināt nākotnē, ieviešot metodes sirds šķēlīšu funkcijas optiskai uzraudzībai kultūrā, piemēram, optisko kartēšanu, izmantojot kalciju un spriegumam jutīgas krāsvielas. Vēl viens CTCM ierobežojums ir tas, ka darba modelis nemanipulē ar fizioloģisko stresu (pirmsslodzi un pēcslodzi). CTCM tika inducēts spiediens pretējos virzienos, lai ļoti lielos audos reproducētu 25% fizioloģisko stiepšanos diastolē (pilnā stiepšanās) un sistolē (kontrakcijas ilgums elektriskās stimulācijas laikā). Šis ierobežojums turpmākajos CTCM dizainos būtu jānovērš, radot atbilstošu spiedienu uz sirds audiem no abām pusēm un piemērojot precīzas spiediena un tilpuma attiecības, kas rodas sirds kambaros.
Šajā manuskriptā aprakstītā pārstiepšanās izraisītā remodelācija aprobežojas ar hipertrofisku hiperstiepšanās signālu atdarināšanu. Tādējādi šis modelis var palīdzēt pētīt stiepšanās izraisītu hipertrofisku signalizāciju bez humorālu vai neironu faktoru nepieciešamības (kas šajā sistēmā nepastāv). Ir nepieciešami turpmāki pētījumi, lai palielinātu CTCM daudzveidību, piemēram, kopkultivēšana ar imūnšūnām, cirkulējošiem plazmas humorāliem faktoriem un inervāciju, kopkultivējot ar neironu šūnām, uzlabos slimību modelēšanas iespējas ar CTCM.
Šajā pētījumā tika izmantotas trīspadsmit cūkas. Visas dzīvnieku procedūras tika veiktas saskaņā ar iestādes vadlīnijām un apstiprinātas Luisvilas Universitātes Dzīvnieku aprūpes un izmantošanas komitejas. Aortas arka tika nostiprināta ar skavām, un sirds tika perfuzēta ar 1 l sterila kardioplēģijas šķīduma (110 mM NaCl, 1,2 mM CaCl2, 16 mM KCl, 16 mM MgCl2, 10 mM NaHCO3, 5 U/ml heparīna, pH līdz 7,4); Sirdis tika uzglabātas ledusaukstā kardioplēģijas šķīdumā līdz transportēšanai uz laboratoriju uz ledus, kas parasti ir <10 minūtes. Sirdis tika uzglabātas ledusaukstā kardioplēģijas šķīdumā līdz transportēšanai uz laboratoriju uz ledus, kas parasti ir <10 minūtes. сердца хранили в ледяном кардиоплегическом растворе до транспортировки в лабораторию на льду, что обынично в лабораторию на льду. Sirdis tika uzglabātas ledusaukstā kardioplēģiskā šķīdumā līdz transportēšanai uz laboratoriju uz ledus, kas parasti aizņem <10 minūtes.将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钟将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钟 Держите сердца в ледяной кардиоплегии до транспортировки в лабораторию на льду, обычно <10 мин. Sirdis jāglabā uz ledus, veicot kardioplēģiju, līdz tās tiek transportētas uz laboratoriju uz ledus, parasti <10 min.
CTCM ierīce tika izstrādāta, izmantojot SolidWorks datorizētās projektēšanas (CAD) programmatūru. Kultūras kameras, dalītāji un gaisa kameras ir izgatavotas no CNC caurspīdīgas akrila plastmasas. 7 mm diametra atbalsta gredzens centrā ir izgatavots no augsta blīvuma polietilēna (HDPE), un tam ir o veida gredzena rieva silikona o veida gredzenam, ko izmanto barotnes blīvēšanai apakšā. Plāna silīcija membrāna atdala kultūras kameru no atdalīšanas plāksnes. Silikona membrāna ir lāzergriezta no 0,02 collas biezas silikona loksnes, un tās cietība ir 35A. Apakšējā un augšējā silikona blīves ir lāzergrieztas no 1/16 collas biezas silikona loksnes, un to cietība ir 50A. Bloka stiprināšanai un hermētiska blīvējuma izveidei tiek izmantotas 316L nerūsējošā tērauda skrūves un spārnuzgriežņi.
Ir paredzēta speciāla iespiedshēmas plate (PCB), kas integrējama ar C-PACE-EM sistēmu. PCB Šveices mašīnu savienotāja ligzdas ir savienotas ar grafīta elektrodiem, izmantojot sudrabotus vara vadus un bronzas 0-60 skrūves, kas ieskrūvētas elektrodos. Iespiedshēmas plate ir ievietota 3D printera vākā.
CTCM ierīci kontrolē programmējams pneimatiskais izpildmehānisms (PPD), kas rada kontrolētu asinsrites spiedienu, kas līdzīgs sirds ciklam. Palielinoties spiedienam gaisa kamerā, elastīgā silikona membrāna izplešas uz augšu, piespiežot vidi zem audu zonas. Pēc tam audu laukums tiks izstiepts, pateicoties šai šķidruma izspiešanai, atdarinot sirds fizioloģisko izplešanos diastoles laikā. Relaksācijas maksimuma brīdī caur grafīta elektrodiem tika pielietota elektriskā stimulācija, kas samazināja spiedienu gaisa kamerā un izraisīja audu sekciju kontrakciju. Caurules iekšpusē ir hemostatisks vārsts ar spiediena sensoru, lai noteiktu spiedienu gaisa sistēmā. Spiediena sensora uztvertais spiediens tiek pievadīts datu savācējam, kas savienots ar klēpjdatoru. Tas ļauj nepārtraukti uzraudzīt spiedienu gāzes kamerā. Kad tika sasniegts maksimālais spiediens kamerā (standarta 80 mmHg, 140 mmHg OS), datu ieguves ierīcei tika dots komandējums nosūtīt signālu uz C-PACE-EM sistēmu, lai ģenerētu divfāzu sprieguma signālu 2 ms garumā, kas iestatīts uz 4 V.
Sirds griezumi tika iegūti un kultivēšanas apstākļi 6 iedobēs tika nodrošināti šādi: iegūtās sirdis no pārneses trauka tika pārvietotas uz paplāti ar aukstu (4°C) kardioplēģijas skarto šūnu (kardioplēģijas) masu. Kreisais kambaris tika izolēts ar sterilu asmeni un sagriezts 1-2 cm3 gabaliņos. Šie audu bloki tika piestiprināti pie audu balstiem ar audu līmi un ievietoti vibrējošā mikrotoma audu vannā, kas saturēja Tirode šķīdumu un nepārtraukti piesātināja ar skābekli (3 g/l 2,3-butāndiona monooksīma (BDM), 140 mM NaCl (8,18 g), 6 mM KCl (0,447 g), 10 mM D-glikozes (1,86 g), 10 mM HEPES (2,38 g), 1 mM MgCl2 (1 ml 1 M šķīduma), 1,8 mM CaCl2 (1,8 ml 1 M šķīduma), līdz 1 l ddH2O). Vibrējošais mikrotoms tika iestatīts, lai grieztu 300 µm biezas šķēles ar 80 Hz frekvenci, horizontālās vibrācijas amplitūdu 2 mm un virzes ātrumu 0,03 mm/s. Audu vannu ieskauj ledus, lai šķīdums būtu vēss, un temperatūra tika uzturēta 4°C. Pārnesiet audu griezumus no mikrotoma vannas uz inkubācijas vannu, kas satur nepārtraukti skābekli piesātinātu Tyrode šķīdumu uz ledus, līdz iegūts pietiekami daudz griezumu vienai kultūras platei. Transwell kultūrām audu griezumi tika piestiprināti pie steriliem 6 mm platiem poliuretāna balstiem un ievietoti 6 ml optimizētas barotnes (199 barotne, 1x ITS piedeva, 10% FBS, 5 ng/ml VEGF, 10 ng/ml FGF-sārmains un 2X antibiotika-pretsēnīšu līdzeklis). Audu griezumiem tika pielietota elektriskā stimulācija (10 V, frekvence 1,2 Hz), izmantojot C-Pace. TD apstākļiem katrā barotnes maiņā tika pievienots svaigs T3 un Dex ar koncentrāciju 100 nM un 1 μM. Vidi piesātina ar skābekli pirms tās nomaiņas 3 reizes dienā. Audu griezumi tika kultivēti inkubatorā 37°C temperatūrā un 5% CO2 atmosfērā.
CTCM kultūrām audu griezumi tika ievietoti uz speciāli izgatavota 3D printera Petri trauciņā, kas satur modificētu Tyrode šķīdumu. Ierīce ir paredzēta, lai palielinātu sirds šķēles izmēru par 25% no atbalsta gredzena laukuma. Tas tiek darīts tā, lai sirds griezumi neizstieptos pēc pārvietošanas no Tyrode šķīduma uz vidi un diastoles laikā. Izmantojot histoakrila līmi, 300 µm biezi griezumi tika piestiprināti pie 7 mm diametra atbalsta gredzena. Pēc audu griezumu piestiprināšanas pie atbalsta gredzena nogrieziet liekos audu griezumus un ievietojiet piestiprinātos audu griezumus atpakaļ Tyrode šķīduma vannā uz ledus (4°C), līdz ir sagatavots pietiekami daudz griezumu vienai ierīcei. Kopējais apstrādes laiks visām ierīcēm nedrīkst pārsniegt 2 stundas. Pēc tam, kad pie atbalsta gredzeniem bija piestiprināti 6 audu griezumi, CTCM ierīce tika salikta. CTCM kultūras kamera ir iepriekš piepildīta ar 21 ml iepriekš piesātinātas vides. Pārnesiet audu griezumus uz kultūras kameru un uzmanīgi izvadiet gaisa burbuļus ar pipeti. Pēc tam audu griezums tiek ievadīts caurumā un viegli piespiests vietā. Visbeidzot, uzlieciet elektroda vāciņu uz ierīces un pārvietojiet ierīci uz inkubatoru. Pēc tam pievienojiet CTCM gaisa caurulei un C-PACE-EM sistēmai. Pneimatiskais izpildmehānisms atveras, un gaisa vārsts atver CTCM. C-PACE-EM sistēma tika konfigurēta tā, lai divfāzu stimulācijas laikā 2 ms laikā piegādātu 4 V ar frekvenci 1,2 Hz. Barotne tika mainīta divas reizes dienā, un elektrodi tika mainīti vienu reizi dienā, lai izvairītos no grafīta uzkrāšanās uz elektrodiem. Ja nepieciešams, audu griezumus var izņemt no to kultivēšanas iedobēm, lai izvadītu visus gaisa burbuļus, kas varētu būt nonākuši zem tiem. MT apstrādes apstākļos T3/Dex tika pievienots svaigs ar katru barotnes maiņu ar 100 nM T3 un 1 μM Dex. CTCM ierīces tika kultivētas inkubatorā 37°C temperatūrā un 5% CO2 atmosfērā.
Lai iegūtu izstieptas sirds šķēļu trajektorijas, tika izstrādāta īpaša kameru sistēma. Tika izmantota spoguļkamera (Canon Rebel T7i, Canon, Tokija, Japāna) ar Navitar Zoom 7000 18-108 mm makro objektīvu (Navitar, Sanfrancisko, Kalifornija). Vizualizācija tika veikta istabas temperatūrā pēc barotnes nomaiņas ar svaigu barotni. Kamera ir novietota 51° leņķī, un video tiek ierakstīts ar ātrumu 30 kadri sekundē. Vispirms tika izmantota atvērtā pirmkoda programmatūra (MUSCLEMOTION43) ar Image-J, lai kvantitatīvi noteiktu sirds šķēļu kustību. Maska tika izveidota, izmantojot MATLAB (MathWorks, Natick, MA, ASV), lai definētu interesējošos reģionus pukstošajai sirds šķēlei un izvairītos no trokšņa. Manuāli segmentētas maskas tiek pielietotas visiem attēliem kadru secībā un pēc tam nodotas MUSCLEMOTION spraudnim. Muscle Motion izmanto pikseļu vidējo intensitāti katrā kadrā, lai kvantitatīvi noteiktu tā kustību attiecībā pret atsauces kadru. Dati tika ierakstīti, filtrēti un izmantoti, lai kvantitatīvi noteiktu cikla laiku un novērtētu audu stiepšanos sirds cikla laikā. Ierakstītais video tika pēcapstrādāts, izmantojot pirmās kārtas nulles fāzes digitālo filtru. Lai kvantitatīvi noteiktu audu stiepšanos (no virsotnes līdz virsotnei), tika veikta virsotnes līdz virsotnei analīze, lai atšķirtu ierakstītā signāla virsotnes un zemākās vērtības. Turklāt, lai novērstu signāla nobīdi, tiek veikta tendences noteikšana, izmantojot sestās kārtas polinomu. MATLAB vidē tika izstrādāts programmas kods, lai noteiktu globālo audu kustību, cikla laiku, relaksācijas laiku un kontrakcijas laiku (Papildu programmas kods 44).
Deformācijas analīzei, izmantojot tos pašus video, kas izveidoti mehāniskās stiepes novērtēšanai, mēs vispirms uzzīmējām divus attēlus, kas attēlo kustības maksimumus (augstāko (augšējo) un zemāko (apakšējo) kustības punktu) saskaņā ar MUSCLEMOTION programmatūru. Pēc tam mēs segmentējām audu reģionus un segmentētajiem audiem piemērojām ēnojuma algoritma veidu (2.a papildattēls). Segmentētie audi pēc tam tika sadalīti desmit apakšvirsmās, un spriegums uz katras virsmas tika aprēķināts, izmantojot šādu vienādojumu: Deformācija = (Sup-Sdown)/Sdown, kur Sup un Sdown ir formas attālumi no auduma augšējās un apakšējās ēnas attiecīgi (2.b papildattēls).
Sirds griezumi tika fiksēti 4% paraformaldehīdā 48 stundas. Fiksētie audi tika dehidrēti 10% un 20% saharozes šķīdumā 1 stundu, pēc tam 30% saharozes šķīdumā uz nakti. Pēc tam griezumi tika iestrādāti optimālas griešanas temperatūras savienojumā (OCT savienojumā) un pakāpeniski sasaldēti izopentāna/sausā ledus vannā. OCT iestrādāšanas blokus uzglabāt -80 °C temperatūrā līdz atdalīšanai. Preparāti tika sagatavoti kā griezumi ar 8 μm biezumu.
Lai noņemtu OCT no sirds griezumiem, preparātus karsē uz karsēšanas bloka 95 °C temperatūrā 5 minūtes. Katram preparātam pievieno 1 ml PBS un inkubē 30 minūtes istabas temperatūrā, pēc tam griezumus caurdur, uz 15 minūtēm istabas temperatūrā ievietojot 0,1% Triton-X PBS. Lai novērstu nespecifisku antivielu saistīšanos ar paraugu, preparātiem pievieno 1 ml 3% BSA šķīduma un inkubē 1 stundu istabas temperatūrā. Pēc tam BSA noņem un preparātus mazgā ar PBS. Katru paraugu atzīmē ar zīmuli. Primārās antivielas (atšķaidītas 1:200 1% BSA) (konexīns 43 (Abcam; #AB11370), NFATC4 (Abcam; #AB99431) un troponīns-T (Thermo Scientific; #MA5-12960) tika pievienotas 90 minūšu laikā, pēc tam sekundārās antivielas (atšķaidītas 1:200 1% BSA) pret peles Alexa Fluor 488 (Thermo Scientific; #A16079), pret truša Alexa Fluor 594 (Thermo Scientific; #T6391) vēl 90 minūtes. Mazgātas 3 reizes ar PBS. Lai atšķirtu mērķa iekrāsojumu no fona, kā kontroli izmantojām tikai sekundāro antivielu. Visbeidzot, tika pievienota DAPI kodolkrāsviela, un preparāti tika ievietoti vectashield (Vector Laboratories) un noblīvēti ar nagu laku. (-x palielinājums) un Keyence mikroskopā ar 40x palielinājumu.
WGA krāsošanai tika izmantots WGA-Alexa Fluor 555 (Thermo Scientific; #W32464) 5 μg/ml koncentrācijā PBS un uzklāts uz fiksētām sekcijām 30 minūtes istabas temperatūrā. Pēc tam preparāti tika mazgāti ar PBS, katram preparātam pievienojot Sudānas melno krāsu un inkubējot 30 minūtes. Pēc tam preparāti tika mazgāti ar PBS un pievienota Vectashield iestrādāšanas vide. Preparāti tika vizualizēti Keyence mikroskopā ar 40x palielinājumu.
OCT tika noņemts no paraugiem, kā aprakstīts iepriekš. Pēc OCT noņemšanas preparātus iegremdēja Buena šķīdumā uz nakti. Pēc tam preparātus 1 stundu skaloja ar destilētu ūdeni un pēc tam uz 10 minūtēm ievietoja Bibrich alvejas skābes fuksīna šķīdumā. Pēc tam preparātus mazgāja ar destilētu ūdeni un uz 10 minūtēm ievietoja 5% fosfomolibdēna/5% fosfotungstīnskābes šķīdumā. Nenoskalojot, preparātus 15 minūtes pārvietoja tieši anilīnzilā šķīdumā. Pēc tam preparātus mazgāja ar destilētu ūdeni un uz 2 minūtēm ievietoja 1% etiķskābes šķīdumā. Preparātus žāvēja 200 N etanolā un pārvietoja uz ksilolu. Iekrāsotos preparātus vizualizēja, izmantojot Keyence mikroskopu ar 10x objektīvu. Fibrozes laukuma procentuālā daļa tika kvantitatīvi noteikta, izmantojot Keyence Analyzer programmatūru.
CyQUANT™ MTT šūnu dzīvotspējas tests (Invitrogen, Carlsbad, CA), kataloga numurs V13154, saskaņā ar ražotāja protokolu ar dažām modifikācijām. Jo īpaši, lai MTT analīzes laikā nodrošinātu vienmērīgu audu izmēru, tika izmantots ķirurģisks perforators ar diametru 6 mm. Audi tika atsevišķi ievietoti 12 iedobju plāksnes iedobēs, kas satur MTT substrātu, saskaņā ar ražotāja protokolu. Sekcijas tiek inkubētas 37°C temperatūrā 3 stundas, un dzīvie audi metabolizē MTT substrātu, veidojot violetu formazāna savienojumu. MTT šķīdumu aizstāj ar 1 ml DMSO un inkubē 37°C temperatūrā 15 minūtes, lai no sirds sekcijām iegūtu violetu formazānu. Paraugi tika atšķaidīti 1:10 DMSO 96 iedobju plāksnēs ar caurspīdīgu dibenu, un violetās krāsas intensitāte tika mērīta pie 570 nm, izmantojot Cytation plākšņu lasītāju (BioTek). Rādījumi tika normalizēti atbilstoši katras sirds šķēles svaram.
Sirds šķēles barotne tika aizstāta ar barotni, kas satur 1 μCi/ml [5-3H]-glikozes (Moravek Biochemicals, Brea, CA, ASV), lai veiktu glikozes izmantošanas testu, kā aprakstīts iepriekš. Pēc 4 stundu inkubācijas pievieno 100 µl barotnes atvērtā mikrocentrifūgas mēģenē, kas satur 100 µl 0,2 N HCl. Pēc tam mēģeni ievieto scintilācijas mēģenē, kas satur 500 μl dH2O, lai iztvaicētu [3H]2O 72 stundas 37°C temperatūrā. Pēc tam mikrocentrifūgas mēģeni izņem no scintilācijas mēģenes un pievieno 10 ml scintilācijas šķidruma. Scintilācijas skaitīšana tika veikta, izmantojot Tri-Carb 2900TR šķidruma scintilācijas analizatoru (Packard Bioscience Company, Meriden, CT, ASV). Pēc tam glikozes izmantošana tika aprēķināta, ņemot vērā [5-3H]-glikozes īpatnējo aktivitāti, nepilnīgo līdzsvaru un fonu, [5-3H]-atšķaidīšanu ar neiezīmētu glikozi un scintilācijas skaitītāja efektivitāti. Dati ir normalizēti attiecībā pret sirds sekciju masu.
Pēc audu homogenizācijas Trizol vidē RNS tika izolēta no sirds griezumiem, izmantojot Qiagen miRNeasy Micro Kit #210874 saskaņā ar ražotāja protokolu. RNSsec bibliotēkas sagatavošana, sekvencēšana un datu analīze tika veikta šādi:
Kā izejmateriāls RNS bibliotēkas sagatavošanai tika izmantots 1 μg RNS uz katru paraugu. Sekvencēšanas bibliotēkas tika ģenerētas, izmantojot NEBNext UltraTM RNS bibliotēkas sagatavošanas komplektu Illumina (NEB, ASV), ievērojot ražotāja ieteikumus, un katra parauga atribūtu sekvencēm tika pievienoti indeksa kodi. Īsumā, mRNS tika attīrīta no kopējās RNS, izmantojot magnētiskās lodītes, kas piestiprinātas ar poli-T oligonukleotīdiem. Fragmentācija tiek veikta, izmantojot divvērtīgus katjonus augstā temperatūrā NEBNext pirmās virknes sintēzes reakcijas buferšķīdumā (5X). Pirmās virknes cDNS tika sintezēta, izmantojot nejaušus heksamēru praimerus un M-MuLV reversās transkriptāzes (RNāze H-) palīdzību. Otrās virknes cDNS pēc tam tiek sintezēta, izmantojot DNS polimerāzi I un RNāzi H. Atlikušie pārkari tiek pārvērsti par neasiem galiem ar eksonukleāzes/polimerāzes aktivitātes palīdzību. Pēc DNS fragmenta 3' gala adenilēšanas tam tiek pievienots NEBNext adapteris ar matadatas cilpas struktūru, lai sagatavotu to hibridizācijai. Lai atlasītu vēlamā garuma cDNS fragmentus 150-200 bp. Bibliotēkas fragmenti tika attīrīti, izmantojot AMPure XP sistēmu (Beckman Coulter, Beverly, ASV). Pēc tam 15 minūtes 37°C temperatūrā un pēc tam 5 minūtes 95°C temperatūrā pirms PCR tika izmantots 3 μl USER enzīms (NEB, ASV) ar pēc izmēra atlasītu kDNS, kas ligēts ar adapteri. Pēc tam PCR tika veikta, izmantojot Phusion High-Fidelity DNS polimerāzi, universālos PCR praimerus un Index (X) praimerus. Visbeidzot, PCR produkti tika attīrīti (AMPure XP sistēma), un bibliotēkas kvalitāte tika novērtēta, izmantojot Agilent Bioanalyzer 2100 sistēmu. Pēc tam kDNS bibliotēka tika sekvencēta, izmantojot Novaseq sekvencētāju. Neapstrādāti attēlu faili no Illumina tika konvertēti uz neapstrādātiem lasījumiem, izmantojot CASAVA Base Calling. Neapstrādāti dati tiek glabāti FASTQ(fq) formāta failos, kas satur nolasīšanas secības un atbilstošās bāzes īpašības. Atlasiet HISAT2, lai saskaņotu filtrētos sekvencēšanas lasījumus ar Sscrofa11.1 atsauces genomu. Kopumā HISAT2 atbalsta jebkura izmēra genomus, tostarp genomus, kas lielāki par 4 miljardiem bāzu, un lielākajai daļai parametru ir iestatītas noklusējuma vērtības. RNS Seq datu splaisēšanas nolasījumus var efektīvi saskaņot, izmantojot HISAT2, kas ir ātrākā pašlaik pieejamā sistēma, ar tādu pašu vai labāku precizitāti nekā jebkura cita metode.
Transkriptu pārpilnība tieši atspoguļo gēnu ekspresijas līmeni. Gēnu ekspresijas līmeņi tiek novērtēti pēc transkriptu pārpilnības (sekvencēšanas skaita), kas saistīti ar genomu vai eksoniem. Nolasījumu skaits ir proporcionāls gēnu ekspresijas līmeņiem, gēna garumam un sekvencēšanas dziļumam. FPKM (fragmenti uz tūkstoš bāzes pāriem sekvencētiem transkriptiem uz miljonu bāzes pāru) tika aprēķināti un diferenciālās ekspresijas P vērtības tika noteiktas, izmantojot DESeq2 pakotni. Pēc tam, izmantojot Benjamini-Hohberga metodi9, kuras pamatā ir iebūvētā R funkcija “p.adjust”, katrai P vērtībai aprēķinājām kļūdaino atklāšanas līmeni (FDR).
No sirds griezumiem izolētā RNS tika pārveidota par kDNS 200 ng/μl koncentrācijā, izmantojot Thermo SuperScript IV Vilo Master maisījumu (Thermo, kat. nr. 11756050). Kvantitatīvā RT-PCR tika veikta, izmantojot Applied Biosystems Endura Plate Microamp 384 iedobju caurspīdīgu reakcijas plāksni (Thermo, kat. nr. 4483319) un microamp optisko līmi (Thermo, kat. nr. 4311971). Reakcijas maisījums sastāvēja no 5 µl Taqman Fast Advanced Master maisījuma (Thermo, kat. nr. 4444557), 0,5 µl Taqman Primer un 3,5 µl H2O, kas sajaukti katrā iedobē. Tika veikti standarta qPCR cikli, un CT vērtības tika mērītas, izmantojot Applied Biosystems Quantstudio 5 reāllaika PCR instrumentu (384 iedobju modulis; produkta nr. A28135). Taqman praimeri tika iegādāti no Thermo (GAPDH (Ss03375629_u1), PARP12 (Ss06908795_m1), PKDCC (Ss06903874_m1), CYGB (Ss06900188_m1), RGL1 (Ss06868890_m1), ACTN1 (Ss01009508_mH), GATA4 (Ss03383805_u1), GJA1 (Ss03374839_u1), COL1A2 (Ss03375009_u1), COL3A1 (Ss04323794_m1), ACTA2 (Ss04245588_m1). Visu paraugu CT vērtības tika normalizētas attiecībā pret saimniekgēnu GAPDH.
NT-ProBNP izdalīšanās vidē tika novērtēta, izmantojot NT-ProBNP komplektu (cūka) (Kat. Nr. MBS2086979, MyBioSource) saskaņā ar ražotāja protokolu. Īsumā, katrā iedobē divos eksemplāros tika pievienoti 250 µl katra parauga un standarta. Tūlīt pēc parauga pievienošanas katrā iedobē pievieno 50 µl Analīzes reaģenta A. Viegli sakratiet plāksni un noslēdziet ar hermētiķi. Pēc tam tabletes inkubēja 37°C temperatūrā 1 stundu. Pēc tam šķīdumu aspirē un iedobes 4 reizes mazgā ar 350 µl 1X mazgāšanas šķīduma, inkubējot mazgāšanas šķīdumu 1-2 minūtes katru reizi. Pēc tam katrā iedobē pievieno 100 µl Analīzes reaģenta B un noslēdz ar plāksnes hermētiķi. Tableti viegli sakrati un inkubēja 37°C temperatūrā 30 minūtes. Šķīdumu aspirē un iedobes 5 reizes mazgā ar 350 µl 1X mazgāšanas šķīduma. Katrā iedobē pievienojiet 90 µl substrāta šķīduma un noslēdziet plāksni. Inkubējiet plāksni 37°C temperatūrā 10–20 minūtes. Katrā iedobē pievienojiet 50 µl Stop šķīduma. Plāksne nekavējoties tika mērīta, izmantojot Cytation (BioTek) plākšņu lasītāju, kas iestatīts uz 450 nm.
Tika veiktas jaudas analīzes, lai izvēlētos grupu lielumus, kas nodrošinās >80% jaudu, lai noteiktu 10% absolūtās izmaiņas parametrā ar 5% I tipa kļūdas līmeni. Lai izvēlētos grupu lielumus, kas nodrošinās >80% jaudu 10% absolūto parametra izmaiņu noteikšanai ar 5% I tipa kļūdas līmeni, tika veiktas jaudas analīzes. Анализ мощности был выполнен для выбора размеров групп, которые обеспечат >80% мощности для обнарусожения изменения параметра с 5% частотой ошибок типа I. Tika veikta jaudas analīze, lai izvēlētos grupu lielumus, kas nodrošinātu >80% jaudu 10% absolūto parametru izmaiņu noteikšanai ar 5% I tipa kļūdas līmeni.进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％I型错误率的组大小.进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％I型错误率的组大小. Был проведен анализ мощности для выбора размера группы, который обеспечил бы > 80% мощности для обеспечил0% изменения параметров и 5% частоты ошибок типа I. Tika veikta jaudas analīze, lai izvēlētos grupas lielumu, kas nodrošinātu >80% jaudu 10% absolūto parametru izmaiņu un 5% I tipa kļūdu līmeņa noteikšanai.Audu griezumi tika nejauši atlasīti pirms eksperimenta. Visas analīzes tika veiktas pēc nosacījumu aklās metodes, un paraugi tika dekodēti tikai pēc visu datu analīzes. Visu statistisko analīžu veikšanai tika izmantota GraphPad Prism programmatūra (San Diego, Kalifornija). Visiem statistikas datiem p-vērtības tika uzskatītas par nozīmīgām, ja vērtības bija <0,05. Visiem statistikas datiem p-vērtības tika uzskatītas par nozīmīgām, ja vērtības bija <0,05. Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. Visiem statistikas datiem p-vērtības tika uzskatītas par nozīmīgām, ja vērtības bija <0,05.对于所有统计数据，p 值在值<0,05 时被认为是显着的.对于所有统计数据，p 值在值<0,05 时被认为是显着的. Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. Visiem statistikas datiem p-vērtības tika uzskatītas par nozīmīgām, ja vērtības bija <0,05.Divpusējs Stjudenta t-tests tika veikts ar datiem, veicot tikai 2 salīdzinājumus. Lai noteiktu nozīmīgumu starp vairākām grupām, tika izmantota vienvirziena vai divvirzienu ANOVA. Veicot post hoc testus, tika piemērota Tukey korekcija, lai ņemtu vērā vairākus salīdzinājumus. RNAsec datiem, aprēķinot FDR un p.adjust, ir jāņem vērā īpaši statistiski apsvērumi, kā aprakstīts sadaļā Metodes.
Lai iegūtu plašāku informāciju par pētījuma dizainu, skatiet šim rakstam pievienoto Dabas pētījumu ziņojuma kopsavilkumu.