Takk for at du besøker Nature.com. Nettleserversjonen du bruker har begrenset CSS-støtte. For best mulig opplevelse anbefaler vi at du bruker en oppdatert nettleser (eller deaktiverer kompatibilitetsmodus i Internet Explorer). I mellomtiden, for å sikre fortsatt støtte, vil vi gjengi nettstedet uten stiler og JavaScript.
Det er behov for et pålitelig in vitro-system som nøyaktig kan reprodusere hjertets fysiologiske miljø for medikamenttesting. Den begrensede tilgjengeligheten av humane hjertevevskultursystemer har ført til unøyaktige tolkninger av hjertemedisiners effekter. Her har vi utviklet en hjertevevskulturmodell (CTCM) som elektromekanisk stimulerer hjerteskiver og gjennomgår fysiologisk strekk i løpet av de systoliske og diastoliske fasene av hjertesyklusen. Etter 12 dager med dyrking forbedret denne tilnærmingen delvis levedyktigheten til hjerteseksjonene, men bevarte ikke deres strukturelle integritet fullt ut. Derfor fant vi etter screening av små molekyler at tilsetning av 100 nM trijodtyronin (T3) og 1 μM deksametason (Dex) til mediet vårt opprettholdt mikrostrukturen til seksjonene i 12 dager. I kombinasjon med T3/Dex-behandling opprettholdt CTCM-systemet transkripsjonsprofiler, levedyktighet, metabolsk aktivitet og strukturell integritet på samme nivå som ferskt hjertevev i 12 dager. I tillegg induserer overdreven strekking av hjertevev i kultur hypertrofisk hjertesignalering, noe som gir bevis for CTCMs evne til å etterligne hypertrofiske tilstander indusert av hjertestrekking. Avslutningsvis kan CTCM modellere hjertets fysiologi og patofysiologi i kultur over lange perioder, noe som muliggjør pålitelig medikamentscreening.
Før klinisk forskning er det behov for pålitelige in vitro-systemer som nøyaktig kan reprodusere det fysiologiske miljøet i menneskehjertet. Slike systemer bør etterligne endret mekanisk strekk, hjertefrekvens og elektrofysiologiske egenskaper. Dyremodeller brukes ofte som en screeningsplattform for hjertefysiologi med begrenset pålitelighet når det gjelder å reflektere effekten av legemidler i menneskehjertet1,2. Til syvende og sist er den ideelle eksperimentelle modellen for hjertevevskultur (CTCM) en modell som er svært sensitiv og spesifikk for ulike terapeutiske og farmakologiske intervensjoner, og nøyaktig reproduserer fysiologien og patofysiologien til menneskehjertet3. Fraværet av et slikt system begrenser oppdagelsen av nye behandlinger for hjertesvikt4,5 og har ført til at legemiddelkardiotoksisitet er en viktig årsak til å forlate markedet6.
I løpet av det siste tiåret har åtte ikke-kardiovaskulære legemidler blitt trukket tilbake fra klinisk bruk fordi de forårsaker forlengelse av QT-intervallet, noe som fører til ventrikulære arytmier og plutselig død7. Det er derfor et økende behov for pålitelige prekliniske screeningsstrategier for å vurdere kardiovaskulær effekt og toksisitet. Den nylige bruken av humaninduserte pluripotente stamcelle-avledede kardiomyocytter (hiPS-CM) i legemiddelscreening og toksisitetstesting gir en delvis løsning på dette problemet. Imidlertid er den umodne naturen til hiPS-CM og mangelen på flercellulær kompleksitet i hjertevevet store begrensninger ved denne metoden. Nyere studier har vist at denne begrensningen delvis kan overvinnes ved å bruke tidlig hiPS-CM til å danne hjertevevshydrogeler kort tid etter starten av spontane sammentrekninger og gradvis øke elektrisk stimulering over tid. Imidlertid mangler disse hiPS-CM-mikrovevene de modne elektrofysiologiske og kontraktile egenskapene til det voksne myokardiet. I tillegg har menneskelig hjertevev en mer kompleks struktur, bestående av en heterogen blanding av forskjellige celletyper, inkludert endotelceller, nevroner og stromale fibroblaster, sammenkoblet av spesifikke sett med ekstracellulære matriksproteiner. Denne heterogeniteten av ikke-kardiomyocyttpopulasjoner11,12,13 i det voksne pattedyrhjertet er en stor barriere for modellering av hjertevev ved bruk av individuelle celletyper. Disse store begrensningene understreker viktigheten av å utvikle metoder for dyrking av intakt hjertemuskelvev under fysiologiske og patologiske forhold.
Dyrkede tynne (300 µm) snitt av menneskehjertet har vist seg å være en lovende modell for intakt menneskelig myokard. Denne metoden gir tilgang til et komplett 3D flercellet system som ligner på menneskelig hjertevev. Frem til 2019 var imidlertid bruken av dyrkede hjertesnitt begrenset av den korte (24 timer) kulturoverlevelsen. Dette skyldes en rekke faktorer, inkludert mangel på fysisk-mekanisk strekk, luft-væske-grensesnittet og bruk av enkle medier som ikke støtter behovene til hjertevev. I 2019 demonstrerte flere forskningsgrupper at det å innlemme mekaniske faktorer i hjertevevskultursystemer kan forlenge kulturens levetid, forbedre hjerteuttrykk og etterligne hjertepatologi. To elegante studier 17 og 18 viser at enaksial mekanisk belastning har en positiv effekt på hjertefenotypen under dyrking. Disse studiene brukte imidlertid ikke den dynamiske tredimensjonale fysisk-mekaniske belastningen av hjertesyklusen, siden hjertesnittene ble belastet med enten isometriske strekkkrefter 17 eller lineær auxotonisk belastning 18. Disse metodene for vevsstrekking resulterte i undertrykkelse av mange hjertegener eller overekspresjon av gener assosiert med unormale strekkresponser. Det er verdt å merke seg at Pitoulis et al. 19 utviklet et dynamisk hjerteskivekulturbad for rekonstruksjon av hjertesyklusen ved hjelp av krafttransdusertilbakemeldinger og spenningsdrivere. Selv om dette systemet muliggjør mer nøyaktig in vitro-hjertesyklusmodellering, begrenser metodens kompleksitet og lave gjennomstrømning anvendelsen av dette systemet. Vårt laboratorium har nylig utviklet et forenklet kultursystem ved hjelp av elektrisk stimulering og et optimalisert medium for å opprettholde levedyktigheten til seksjoner av svine- og menneskehjertevev i opptil 6 dager 20,21.
I dette manuskriptet beskriver vi en hjertevevskulturmodell (CTCM) som bruker seksjoner av grisehjertet som inkorporerer humorale signaler for å gjenskape tredimensjonal hjertefysiologi og patofysiologisk distensjon under hjertesyklusen. Denne CTCM-en kan øke nøyaktigheten av preklinisk legemiddelprediksjon til et nivå som aldri før er oppnådd ved å tilby et kostnadseffektivt hjertesystem med middels gjennomstrømning som etterligner fysiologien/patofysiologien til pattedyrhjertet for preklinisk legemiddeltesting.
Hemodynamiske mekaniske signaler spiller en kritisk rolle i å opprettholde kardiomyocyttfunksjonen in vitro 22,23,24. I dette manuskriptet har vi utviklet en CTCM (figur 1a) som kan etterligne det voksne hjertemiljøet ved å indusere både elektrisk og mekanisk stimulering ved fysiologiske frekvenser (1,2 Hz, 72 slag per minutt). For å unngå overdreven vevsstrekking under diastole ble en 3D-printer brukt til å øke vevsstørrelsen med 25 % (figur 1b). Elektrisk pacing indusert av C-PACE-systemet ble tidsbestemt til å starte 100 ms før systole ved hjelp av et datainnsamlingssystem for å gjengi hjertesyklusen fullt ut. Vevskultursystemet bruker en programmerbar pneumatisk aktuator (LB Engineering, Tyskland) for å syklisk utvide en fleksibel silikonmembran for å forårsake utvidelse av hjerteskivene i det øvre kammeret. Systemet ble koblet til en ekstern luftledning gjennom en trykktransduser, noe som gjorde det mulig å justere trykket (± 1 mmHg) og tiden (± 1 ms) nøyaktig (figur 1c).
a Fest vevsseksjonen til den 7 mm store støtteringen, vist i blått, inne i kulturkammeret på enheten. Kulturkammeret er atskilt fra luftkammeret med en tynn, fleksibel silikonmembran. Plasser en pakning mellom hvert kammer for å forhindre lekkasjer. Lokket på enheten inneholder grafittelektroder som gir elektrisk stimulering. b Skjematisk fremstilling av den store vevsenheten, føringsringen og støtteringen. Vevsseksjonene (brune) plasseres på den overdimensjonerte enheten med føringsringen plassert i sporet på den ytre kanten av enheten. Bruk føringen til å forsiktig plassere støtteringen belagt med vevsakryllim over seksjonen med hjertevev. c Graf som viser tiden for elektrisk stimulering som en funksjon av luftkammertrykket kontrollert av en programmerbar pneumatisk aktuator (PPD). En datainnsamlingsenhet ble brukt til å synkronisere elektrisk stimulering ved hjelp av trykksensorer. Når trykket i kulturkammeret når den innstilte terskelen, sendes et pulssignal til C-PACE-EM for å utløse elektrisk stimulering. d Bilde av fire CTCM-er plassert på en inkubatorhylle. Fire enheter er koblet til én PPD via en pneumatisk krets, og trykksensorer settes inn i hemostaseventilen for å overvåke trykket i den pneumatiske kretsen. Hver enhet inneholder seks vevsseksjoner.
Ved hjelp av en enkelt pneumatisk aktuator kunne vi kontrollere fire CTCM-enheter, som hver kunne holde seks vevssnitt (fig. 1d). I CTCM konverteres lufttrykket i luftkammeret til synkront trykk i væskekammeret og induserer fysiologisk ekspansjon av hjerteskiven (figur 2a og tilleggsfilm 1). Evaluering av vevsstrekking ved 80 mm Hg. Art. viste strekking av vevssnitt med 25 % (fig. 2b). Denne prosentvise strekkingen har vist seg å tilsvare en fysiologisk sarkomerlengde på 2,2–2,3 µm for normal hjerteseksjonskontraktilitet17,19,25. Vevsbevegelse ble vurdert ved hjelp av tilpassede kamerainnstillinger (tilleggsfigur 1). Amplituden og hastigheten til vevsbevegelsen (fig. 2c, d) tilsvarte strekking under hjertesyklusen og tiden under systole og diastole (fig. 2b). Strekking og hastighet av hjertevev under kontraksjon og avslapning forble konstant i 12 dager i kultur (fig. 2f). For å evaluere effekten av elektrisk stimulering på kontraktilitet under dyrking, utviklet vi en metode for å bestemme aktiv deformitet ved hjelp av en skyggeleggingsalgoritme (tilleggsfigur 2a, b) og var i stand til å skille mellom deformiteter med og uten elektrisk stimulering. Samme seksjon av hjertet (figur 2f). I det bevegelige området av kuttet (R6-9) var spenningen under elektrisk stimulering 20 % høyere enn i fravær av elektrisk stimulering, noe som indikerer bidraget fra elektrisk stimulering til kontraktil funksjon.
Representative spor av luftkammertrykk, væskekammertrykk og målinger av vevsbevegelse bekrefter at kammertrykket endrer væskekammertrykket, noe som forårsaker en tilsvarende bevegelse av vevsskiven. b Representative spor av prosentvis strekk (blå) av vevsseksjoner som tilsvarer prosentvis strekk (oransje). c Den målte bevegelsen til hjerteskiven er i samsvar med den målte bevegelseshastigheten. (d) Representative baner for syklisk bevegelse (blå linje) og hastighet (oransje stiplet linje) i en hjerteskive. e Kvantifisering av syklustid (n = 19 skiver per gruppe, fra forskjellige griser), kontraksjonstid (n = 19 skiver per gruppe), relaksasjonstid (n = 19 skiver per gruppe, fra forskjellige griser), vevsbevegelse (n = 25 skiver)/gruppe fra forskjellige griser), topp systolisk hastighet (n = 24(D0), 25(D12) skiver/gruppe fra forskjellige griser) og topp relaksasjonsrate (n=24(D0), 25(D12) skiver/gruppe fra forskjellige griser). Tosidig Student's t-test viste ingen signifikant forskjell i noen parameter. f Representative tøyningsanalysespor av vevssnitt med (rød) og uten (blå) elektrisk stimulering, ti regionale områder av vevssnitt fra samme snitt. De nederste panelene viser kvantifiseringen av den prosentvise forskjellen i tøyning i vevssnitt med og uten elektrisk stimulering i ti områder fra forskjellige snitt. (n = 8 skiver/gruppe fra forskjellige griser, tosidig Student t-test er utført; ****p < 0,0001, **p < 0,01, *p < 0,05). (n = 8 skiver/gruppe fra forskjellige griser, tosidig Student t-test er utført; ****p < 0,0001, **p < 0,01, *p < 0,05). (n = 8 срезов/группу от разных свиней, проводится двусторонний t-критерий Стьюдента; ****p<0,0001, ***p<0,01,01,5p<0,01,01. (n = 8 seksjoner/gruppe fra forskjellige griser, tosidig Student's t-test; ****p < 0,0001, **p < 0,01, *p < 0,05). （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p < 0,0001，**p < 0,01「0,5） （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p < 0,0001，**p < 0,01「0,5） (n = 8 срезов/группу, от разных свиней, двусторонний критерий Стьюдента; ****p <0,0001, **p <0,01, *p <0,05). (n = 8 seksjoner/gruppe, fra forskjellige griser, tosidig Student's t-test; ****p < 0,0001, **p < 0,01, *p < 0,05).Feilfelt representerer gjennomsnittet ± standardavviket.
I vårt tidligere statiske biomimetiske hjerteskivekultursystem [20, 21] opprettholdt vi levedyktigheten, funksjonen og den strukturelle integriteten til hjerteskivene i 6 dager ved å bruke elektrisk stimulering og optimalisere mediets sammensetning. Etter 10 dager falt imidlertid disse tallene kraftig. Vi vil referere til snitt dyrket i vårt tidligere statiske biomimetiske kultursystem 20, 21 kontrollbetingelser (Ctrl), og vi vil bruke vårt tidligere optimaliserte medium som MC-betingelser og kultur under samtidig mekanisk og elektrisk stimulering (CTCM). kalt . Først bestemte vi at mekanisk stimulering uten elektrisk stimulering var utilstrekkelig til å opprettholde vevslevedyktighet i 6 dager (tilleggsfigur 3a, b). Interessant nok, med introduksjonen av fysiomekanisk og elektrisk stimulering ved bruk av STCM, forble levedyktigheten til 12-dagers hjertesnitt den samme som i ferske hjertesnitt under MS-betingelser, men ikke under Ctrl-betingelser, som vist ved MTT-analyse (figur 1). 3a). Dette antyder at mekanisk stimulering og simulering av hjertesyklusen kan holde vevssnitt levedyktige dobbelt så lenge som rapportert i vårt tidligere statiske kultursystem. Vurdering av den strukturelle integriteten til vevssnitt ved immunmerking av kardial troponin T og connexin 43 viste imidlertid at connexin 43-ekspresjon var betydelig høyere i MC-vev på dag 12 enn i kontrollene samme dag. Imidlertid ble ikke ensartet connexin 43-ekspresjon og Z-skivedannelse fullstendig opprettholdt (fig. 3b). Vi bruker et rammeverk for kunstig intelligens (AI) for å kvantifisere vevets strukturelle integritet26, en bildebasert dyp læringspipeline basert på troponin-T og connexin-farging43 for automatisk å kvantifisere den strukturelle integriteten og fluorescensen til hjerteskiver med tanke på lokaliseringsstyrke. Denne metoden bruker et konvolusjonelt nevralt nettverk (CNN) og et dyp læringsrammeverk for å pålitelig kvantifisere den strukturelle integriteten til hjertevev på en automatisert og objektiv måte, som beskrevet i referansen.26. MC-vev viste forbedret strukturell likhet til dag 0 sammenlignet med statiske kontrollsnitt. I tillegg avslørte Massons trikromfarging en betydelig lavere prosentandel av fibrose under MS-forhold sammenlignet med kontrollforhold på dag 12 av kulturen (fig. 3c). Selv om CTCM økte levedyktigheten til hjertevevsseksjoner på dag 12 til et nivå som ligner på ferskt hjertevev, forbedret det ikke den strukturelle integriteten til hjerteseksjonene signifikant.
Et søylediagram viser kvantifisering av MTT-levedyktigheten til ferske hjerteskiver (D0) eller hjerteskiverkultur i 12 dager enten i statisk kultur (D12 Ctrl) eller i CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) skiver/gruppe fra forskjellige griser, énveis ANOVA-test utføres; ####p < 0,0001 sammenlignet med D0 og **p < 0,01 sammenlignet med D12 Ctrl). Et søylediagram viser kvantifisering av MTT-levedyktigheten til ferske hjerteskiver (D0) eller hjerteskiverkultur i 12 dager enten i statisk kultur (D12 Ctrl) eller i CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) skiver/gruppe fra forskjellige griser, énveis ANOVA-test utføres; ####p < 0,0001 sammenlignet med D0 og **p < 0,01 sammenlignet med D12 Ctrl).Histogrammet viser kvantifiseringen av levedyktigheten til ferske MTT-hjerteseksjoner (D0) eller kultur av hjerteseksjoner i 12 dager i enten statisk kultur (D12-kontroll) eller CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12-kontroll). ) ), 12 (D12 MC) seksjoner/gruppe fra forskjellige griser, en enveis ANOVA-test utføres;####p < 0,0001 по сравнению с D0 и **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p < 0,0001 sammenlignet med D0 og **p < 0,01 sammenlignet med D12 Ctrl). a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切片(D0)或心脏切片培养12 天的MTT 活力的量化)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/绐卌AN,OVA测试；与D0 相比，####p < 0,0001，与D12 Ctrl 相比，**p < 0,01). a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切片(D0) ，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；与D0 相比，##与D， Ctrl1D， Ctrl1D，相比，**p.)histogram som viser kvantifiseringen av MTT-levedyktighet i ferske hjerteseksjoner (D0) eller hjerteseksjoner dyrket i 12 dager i statisk kultur (D12-kontroll) eller CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12-kontroll)), 12 (D12 MC) seksjoner/gruppe fra forskjellige griser, enveis ANOVA-test;####p < 0,0001 по сравнению с D0, **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p < 0,0001 sammenlignet med D0, **p < 0,01 sammenlignet med D12 Ctrl).b Troponin-T (grønn), connexin 43 (rød) og DAPI (blå) i nylig isolerte hjerteseksjoner (D0) eller hjerteseksjoner dyrket under statiske forhold (Ctrl) eller CTCM-forhold (MC) i 12 dager) av representative immunofluorescensbilder (blank skala = 100 µm). Kvantifisering av hjertevevets strukturelle integritet med kunstig intelligens (n ​​= 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) skiver/gruppe hver fra forskjellige griser, enveis ANOVA-test utføres; ####p < 0,0001 sammenlignet med D0 og ****p < 0,0001 sammenlignet med D12 Ctrl). Kvantifisering av hjertevevets strukturelle integritet ved hjelp av kunstig intelligens (n ​​= 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) skiver/gruppe hver fra forskjellige griser, enveis ANOVA-test utføres; ####p < 0,0001 sammenlignet med D0 og ****p < 0,0001 sammenlignet med D12 Ctrl). Количественная оценка структурной целостности сердечной ткани искусственным интеллектом (n = 7 (D0), 7 (D12 сов), 7 (D12 сов), пгов (D12 с 12), av разных свиней, проводится однофакторный тест ANOVA; Kvantifisering av den strukturelle integriteten til hjertevev ved hjelp av kunstig intelligens (n ​​= 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) seksjoner/grupper fra forskjellige griser, enveis ANOVA-test utført; ####p < 0,0001 vs. med D0 og ****p < 0,0001 sammenlignet med D12 Ctrl).人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) skiver/grupper hver av forskjellige griser, enveis ANO#0p .0#0p .0## .相比，****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）.人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) skiver/grupper hver av forskjellige griser, enveis ANO#0#0p <0#0p;与D0相比，****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）. Искусственный интеллект для количественной оценки структурной целостности сердечной ткани (n = 7 (D0), 7 (D512 Ctrl), 7 (D512 Ctrl) срезов/группу каждой из разных свиней, односторонний тест ANOVA ####p <0,0001 vs. Ctrl). Kunstig intelligens for å kvantifisere den strukturelle integriteten til hjertevev (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) seksjoner/gruppe hver av forskjellige griser, enveis ANOVA-test; ####p < 0,0001 vs .D0 For sammenligning ****p < 0,0001 sammenlignet med D12 Ctrl). c Representative bilder (venstre) og kvantifisering (høyre) for hjerteskiver farget med Massons trikromfarging (skala bare = 500 µm) (n = 10 skiver/gruppe hver fra forskjellige griser, enveis ANOVA-test utføres; ####p < 0,0001 sammenlignet med D0 og ***p < 0,001 sammenlignet med D12 Ctrl). c Representative bilder (venstre) og kvantifisering (høyre) for hjerteskiver farget med Massons trikromfarging (skala bare = 500 µm) (n = 10 skiver/gruppe hver fra forskjellige griser, enveis ANOVA-test utføres; #### p < 0,0001 sammenlignet med D0 og ***p < 0,001 sammenlignet med D12 Ctrl). c Репрезентативные изображения (слева) и количественная оценка (справа) срезов сердца, окрашенных трилехром (масштаб без покрытия = 500 мкм) (n = 10 срезов/группу от разных свиней, выполняется односторон мкм) сравнению с D0 и ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Representative bilder (venstre) og kvantifisering (høyre) av hjerteseksjoner farget med Massons trikromfarging (ubelagt skala = 500 µm) (n = 10 seksjoner/gruppe fra forskjellige griser, enveis ANOVA-test utført; #### p < 0,0001 sammenlignet med D0 og ***p < 0,001 sammenlignet med D12 Ctrl). c 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像（左）和量化（右）（裸=尺0）（裸=尺0）（裸=尺0） 10 个切片/组，每组来自不同的猪，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0,0001 与D0 缎***02D < 0***02D Ctrl 相比）. C 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 （左 左） 量化 （右） 裸壸庣 帺壸庣裸尺度 = 500 µm） （n = 10 个 切片 组 每 组 来自 不同 猪 ， 进行 单向 单ﵛ 单 向 A#nova 0,0001 与D0 相比，***p < 0,001 与D12 Ctrl 相比）. c Репрезентативные изображения (слева) и количественный анализ (справа) срезов сердца, окрашенных трилихром (чистая шкала = 500 mkm) (n = 10 срезов/группа, каждый от другой свиньи, протестировано с помощогруппа дисперсионного анализа ;### #p < 0,0001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Representative bilder (venstre) og kvantifisering (høyre) av hjerteseksjoner farget med Massons trikromfarging (blank = 500 µm) (n = 10 seksjoner/gruppe, hver fra en annen gris, testet ved enveis variansanalyse; ### # p < 0,0001 sammenlignet med D0, ***p < 0,001 sammenlignet med D12 Ctrl).Feilfelt representerer gjennomsnittet ± standardavviket.
Vi antok at ved å tilsette små molekyler til kulturmediet, kunne kardiomyocytters integritet forbedres og fibroseutvikling reduseres under CTCM-kultur. Vi screenet derfor for små molekyler ved hjelp av våre statiske kontrollkulturer20,21 på grunn av det lille antallet forstyrrende faktorer. Deksametason (Dex), trijodtyronin (T3) og SB431542 (SB) ble valgt for denne screeningen. Disse små molekylene har tidligere blitt brukt i hiPSC-CM-kulturer for å indusere modning av kardiomyocytter ved å øke sarkomerlengde, T-tubuli og ledningshastighet. I tillegg er både Dex (et glukokortikoid) og SB kjent for å undertrykke betennelse29,30. Derfor testet vi om inkludering av ett eller en kombinasjon av disse små molekylene ville forbedre den strukturelle integriteten til hjerteseksjoner. For innledende screening ble dosen av hver forbindelse valgt basert på konsentrasjonene som vanligvis brukes i cellekulturmodeller (1 μM Dex27, 100 nM T327 og 2,5 μM SB31). Etter 12 dager med dyrking resulterte kombinasjonen av T3 og Dex i optimal strukturell integritet av kardiomyocyttene og minimal fibrøs ombygging (tilleggsfigur 4 og 5). I tillegg ga bruk av doble eller dobbelt så høye konsentrasjoner av T3 og Dex skadelige effekter sammenlignet med normale konsentrasjoner (tilleggsfigur 6a, b).
Etter innledende screening utførte vi en direkte sammenligning av fire kulturbetingelser (figur 4a): Ctrl: hjerteseksjoner dyrket i vår tidligere beskrevne statiske kultur ved bruk av vårt optimaliserte medium; 20.21 TD: T3 og Ctrl tilsatte Dex på onsdag; MC: hjerteseksjoner dyrket i CTCM ved bruk av vårt tidligere optimaliserte medium; og MT: CTCM med T3 og Dex tilsatt mediet. Etter 12 dager med dyrking forble levedyktigheten til MS- og MT-vev den samme som i ferskt vev vurdert ved MTT-analyse (fig. 4b). Interessant nok resulterte ikke tilsetning av T3 og Dex til transwell-kulturer (TD) i en signifikant forbedring i levedyktighet sammenlignet med Ctrl-betingelser, noe som indikerer en viktig rolle for mekanisk stimulering i å opprettholde levedyktigheten til hjerteseksjonene.
Et eksperimentelt designdiagram som viser de fire kulturbetingelsene som ble brukt til å evaluere effektene av mekanisk stimulering og T3/Dex-tilskudd på medium i 12 dager. b Stolpediagrammet viser kvantifisering av levedyktighet 12 dager etter dyrking under alle 4 dyrkningsforhold (Ctrl, TD, MC og MT) sammenlignet med ferske hjerteskiver (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD og D12 MT), 12 (D12 MC) skiver/gruppe fra forskjellige griser, enveis ANOVA-test utføres; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 sammenlignet med D0 og **p < 0,01 sammenlignet med D12 Ctrl). b Stolpediagrammet viser kvantifisering av levedyktighet 12 dager etter dyrking under alle 4 dyrkningsforhold (Ctrl, TD, MC og MT) sammenlignet med ferske hjerteskiver (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD og D12 MT), 12 (D12 MC) skiver/gruppe fra forskjellige griser, enveis ANOVA-test utføres; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 sammenlignet med D0 og **p < 0,01 sammenlignet med D12 ctrl). b Гистограмма показывает количественную оценку. культивирования (контроль, TD, MC og MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 TD), og D12 TD, MC 12) срезов/группу от разных свиней, проводится односторонний тест ANOVA ####p < 0,0001, ###p < 0,001 по сравни; с D0 и **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). b Stolpediagrammet viser kvantifiseringen av levedyktighet 12 dager etter dyrking under alle 4 kulturforhold (kontroll, TD, MC og MT) sammenlignet med ferske hjerteseksjoner (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD og D12 MT), 12 (D12 MC) seksjoner/gruppe fra forskjellige griser, enveis ANOVA-test; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 vs. D0 og **p < 0,01 sammenlignet med D12 Ctrl). b.和D12 MT)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；####p < 0.0001， 0##p < 0.00#1， 0##相比，**p < 0,01 与D12控制）.b 4 12 (D12 MC) b Гистограмма, показывающая все 4 условия культивирования (контроль, TD, MC og MT) på сравнению со свежезц (0) = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD og D12 MT), av разных свиней 12 (D12 MC) срезы/группа, односторонний тест ANOVA <0 ##00п сравнению с D0, **p <0,01 по сравнению с контролем D12). b Histogram som viser alle 4 kulturbetingelsene (kontroll, TD, MC og MT) sammenlignet med ferske hjerteseksjoner (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD og D12 MT), fra forskjellige griser 12 (D12 MC) seksjoner/gruppe, enveis ANOVA-test; ####p<0,0001, ###p<0,001 vs. D0, **p<0,01 vs. kontroll D12). c Stolpediagrammet viser kvantifiseringen av glukosefluks 12 dager etter dyrking under alle 4 dyrkningsforhold (Ctrl, TD, MC og MT) sammenlignet med ferske hjerteskiver (D0) (n = 6 skiver/gruppe fra forskjellige griser, enveis ANOVA-test utføres; ###p < 0,001, sammenlignet med D0 og ***p < 0,001 sammenlignet med D12 Ctrl). c Stolpediagrammet viser kvantifiseringen av glukosefluks 12 dager etter dyrking under alle 4 dyrkningsforhold (Ctrl, TD, MC og MT) sammenlignet med ferske hjerteskiver (D0) (n = 6 skiver/gruppe fra forskjellige griser, enveis ANOVA-test utføres; ###p < 0,001, sammenlignet med D0 og ***p < 0,001 sammenlignet med D12 Ctrl). c Гистограмма показывает количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после культивированис во 4висованис культивирования (контроль, TD, MC og MT) for сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 6 срезов/грезовировних, односторонний Выполняется тест ANOVA; ###p < 0,001 по сравнению с D0 и ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Histogrammet viser kvantifisering av glukosefluks 12 dager etter dyrking under alle 4 dyrkningsbetingelser (kontroll, TD, MC og MT) sammenlignet med ferske hjerteseksjoner (D0) (n = 6 seksjoner/gruppe fra forskjellige griser, enveis ANOVA-test utført; ###p < 0,001 sammenlignet med D0 og ***p < 0,001 sammenlignet med D12 Ctrl). c 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) 相毹养吐12，吐天的葡萄糖通量定量（n = 6 片/组，来自不同猪，单向执行ANOVA 测试；#0，D < 0.相比，***p < 0,001 与D12 Ctrl 相比）. C 条形图 显示 所有 4 种 条件 （（ctrl 、 td 、 mc 和 mt） 新鲜 心脏 切 缉 切 片 切 片 切培养 后 后 12 天 的 通量 定量 （n = 6 片/组 ， 来自 猪 ， ， ， ， ， ， ， .猪单向执行ANOVA 测试；###p < 0,001，与D0 相比，***p < 0,001 与D12 Ctrl 相比）. c Гистограмма, показывающая количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после культивирования культивирования (контроль, TD, MC og MT) for сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 6 срезов/групрапа, срезов односторонний Были проведены тесты ANOVA; ###p < 0,001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению с D12 (контроль). c Histogram som viser kvantifisering av glukosefluks 12 dager etter dyrking for alle 4 dyrkningsbetingelsene (kontroll, TD, MC og MT) sammenlignet med ferske hjerteseksjoner (D0) (n = 6 seksjoner/gruppe, fra forskjellige griser, unilaterale der ANOVA-tester ble utført, ###p < 0,001 sammenlignet med D0, ***p < 0,001 sammenlignet med D12 (kontroll).d Tøyningsanalyseplott av ferskt (blått), dag 12 MC (grønt) og dag 12 MT (rødt) vev ved ti regionale vevssnittpunkter (n = 4 snitt/gruppe, enveis ANOVA-test; det var ingen signifikant forskjell mellom gruppene). e Vulkanplott som viser differensielt uttrykte gener i ferske hjertesnitt (D0) sammenlignet med hjertesnitt dyrket under statiske forhold (Ctrl) eller under MT-forhold (MT) i 10–12 dager. f Varmekart over sarkomergener for hjertesnitt dyrket under hver av kulturbetingelsene. Feilfelt representerer gjennomsnitt ± standardavvik.
Metabolsk avhengighet av overgangen fra fettsyreoksidasjon til glykolyse er et kjennetegn på kardiomyocytt-dedifferensiering. Umodne kardiomyocytter bruker primært glukose til ATP-produksjon og har hypoplastiske mitokondrier med få cristae5,32. Analyser av glukoseutnyttelse viste at glukoseutnyttelsen under MC- og MT-forhold var lik den i vev på dag 0 (figur 4c). Ctrl-prøver viste imidlertid en betydelig økning i glukoseutnyttelse sammenlignet med ferskt vev. Dette indikerer at kombinasjonen av CTCM og T3/Dex forbedrer vevslevedyktighet og bevarer den metabolske fenotypen til 12-dagers dyrkede hjerteseksjoner. I tillegg viste tøyningsanalyse at tøyningsnivåene forble de samme som i ferskt hjertevev i 12 dager under MT- og MS-forhold (fig. 4d).
For å analysere den samlede effekten av CTCM og T3/Dex på det globale transkripsjonslandskapet av hjertevev, utførte vi RNAseq på hjerteskiver fra alle fire forskjellige kulturbetingelser (Tilleggsdata 1). Interessant nok viste MT-seksjoner høy transkripsjonell likhet med ferskt hjertevev, med bare 16 differensielt uttrykt av 13 642 gener. Men som vi viste tidligere, viste Ctrl-seksjonene 1229 differensielt uttrykte gener etter 10–12 dager i kultur (fig. 4e). Disse dataene ble bekreftet av qRT-PCR av hjerte- og fibroblastgener (Tilleggsfig. 7a-c). Interessant nok viste Ctrl-seksjonene nedregulering av hjerte- og cellesyklusgener og aktivering av inflammatoriske genprogrammer. Disse dataene antyder at dedifferensiering, som normalt oppstår etter langvarig dyrking, er fullstendig dempet under MT-betingelser (Tilleggsfig. 8a,b). Nøye studier av sarkomergener viste at kun under MT-forhold er genene som koder for sarkomeret (fig. 4f) og ionekanalen (tilleggsfig. 9) bevart, noe som beskytter dem mot undertrykkelse under Ctrl-, TD- og MC-forhold. Disse dataene viser at med en kombinasjon av mekanisk og humoral stimulering (T3/Dex) kan hjerteskivetranskriptomet forbli likt ferske hjerteskiver etter 12 dager i kultur.
Disse transkripsjonelle funnene støttes av det faktum at den strukturelle integriteten til kardiomyocytter i hjerteseksjoner er best bevart under MT-forhold i 12 dager, som vist av intakt og lokalisert connexin 43 (fig. 5a). I tillegg var fibrose i hjerteseksjoner under MT-forhold betydelig redusert sammenlignet med Ctrl og liknende som i ferske hjerteseksjoner (fig. 5b). Disse dataene viser at kombinasjonen av mekanisk stimulering og T3/Dex-behandling effektivt bevarer hjertestrukturen i hjerteseksjoner i kultur.
Representative immunofluorescensbilder av troponin-T (grønn), connexin 43 (rød) og DAPI (blå) i nylig isolerte hjerteseksjoner (D0) eller dyrket i 12 dager under alle fire hjerteseksjonskulturbetingelser (skalabar = 100 µm). Kvantifisering av hjertevevets strukturelle integritet ved hjelp av kunstig intelligens (n ​​= 7 (D0 og D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC og D12 MT) skiver/gruppe fra forskjellige griser, enveis ANOVA-test utføres; ####p < 0,0001 sammenlignet med D0 og *p < 0,05, eller ****p < 0,0001 sammenlignet med D12 Ctrl). Kvantifisering av hjertevevets strukturelle integritet ved hjelp av kunstig intelligens (n ​​= 7 (D0 og D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC og D12 MT) skiver/gruppe fra forskjellige griser, enveis ANOVA-test utføres; #### p < 0,0001 sammenlignet med D0 og *p < 0,05, eller ****p < 0,0001 sammenlignet med D12 Ctrl). Количественная оценка структурной целостности ткани сердца с помощью искусственного интеллекта (n = 7 (D12 TD), (D12TD), (D = 7 (D12, Ctrl), MC og D12 MT) срезов/группу от разных свиней, проведен однофакторный тест ANOVA #### p < 0,0001 p. 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). Kvantifisering av den strukturelle integriteten til hjertevev ved bruk av kunstig intelligens (n ​​= 7 (D0 og D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC og D12 MT) seksjoner/gruppe fra forskjellige griser, enveis ANOVA-test utført; #### p < 0,0001 sammenlignet med D0 og *p < 0,05 eller ****p < 0,0001 sammenlignet med D12 Ctrl).对不同猪的心脏组织结构完整性（n = 7（D0 和D12 Ctrl）、5（D12 TD、D12 MC 和D12 MT）切片/组）进行人工智能量化，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0,0001 与D0 帒*p <0.0*p <0.0*p < 0,0*p <0. 0,0001 与D12 Ctrl 相比）.对 不同 猪 的 心脏 结构 完整性 （n = 7 （d0 和 d12 ctrl） （5 （d12 td 、t ， ， d12 mc 廒人工 智能量 化 进行 单向 单向 单向 测试 ； ########## p < 0,0001 与D0 和*p ****p < 0,05 0,0001 与D12 Ctrl 相比).Kvantifisering av den strukturelle integriteten til hjertevev ved bruk av kunstig intelligens hos forskjellige griser (n = 7 (D0 og D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC og D12 MT) seksjoner/gruppe) med en enveis ANOVA-test;#### p < 0,0001 по сравнению с D0 и *p < 0,05 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). #### p < 0,0001 sammenlignet med D0 og *p < 0,05 eller ****p < 0,0001 sammenlignet med D12 Ctrl). b Representative bilder og kvantifisering for hjerteskiver farget med Massons trikromfarging (skalabar = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD og D12 MC), 9 (D12 MT) skiver/gruppe fra forskjellige griser, enveis ANOVA-test utføres; ####p < 0,0001 sammenlignet med D0 og ***p < 0,001, eller ****p < 0,0001 sammenlignet med D12 Ctrl). b Representative bilder og kvantifisering for hjerteskiver farget med Massons trikromfarging (skalabar = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD og D12 MC), 9 (D12 MT) skiver/gruppe fra forskjellige griser, enveis ANOVA-test utføres; ####p < 0,0001 sammenlignet med D0 og ***p < 0,001, eller ****p < 0,0001 sammenlignet med D12 Ctrl). b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромным краснамасная ( линейка = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD og D12 MC), 9 (D12 MT) срезов/группу от разных свиней, ведонсолня ANOVA; ####p < 0,0001 по сравнению с D0 и ***p < 0,001 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). b Representative bilder og kvantifisering av hjerteseksjoner farget med Massons trikromfarging (skalabar = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD og D12 MC), 9 (D12 MT) seksjoner/gruppe fra forskjellige griser, utført enveis ANOVA; ####p < 0,0001 vs. D0 og ***p < 0,001 eller ****p < 0,0001 vs. D12 Ctrl). b 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像和量化（比例尺= 500 µm = 010nD = 010n Ctrl、D12 TD 和D12 MC），来自不同猪的9 个（D12 MT）切片/组，进行单因素方垕因素方垞#0＆#0分#1与D0 相比，***p < 0,001，或****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）. b 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 和 量化 （比例 尺 尺 尺 = 500 µn = 0（n （n 、 d12 ctrl 、 d12 td 和 d12 mc） 来自 不同 的 9 个 d12 mt 切片 切片 切片 切片 切片 切片切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片/组，进行单因素方差分析； 0.00D <10###相比，***p < 0,001，或****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）. b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромом Маснашения (маснашали) мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD og D12 MC), 9 (D12 MT) срезов от разных свиней / группы, один-способ ANOVA; #0пос000 с D0, ***p < 0,001 eller ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). b Representative bilder og kvantifisering av hjerteseksjoner farget med Massons trikrom (skalabar = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD og D12 MC), 9 (D12 MT) seksjoner fra forskjellige griser/gruppe, én ANOVA-metode; ####p < 0,0001 sammenlignet med D0, ***p < 0,001 eller ****p < 0,0001 sammenlignet med D12 Ctrl).Feilfelt representerer gjennomsnittet ± standardavviket.
Til slutt ble CTCMs evne til å etterligne hjertehypertrofi vurdert ved å øke strekningen av hjertevevet. I CTCM økte maksimalt luftkammertrykk fra 80 mmHg til 80 mmHg Art. (normal strekk) opp til 140 mmHg Art. (fig. 6a). Dette tilsvarer en økning på 32 % i strekk (fig. 6b), som tidligere ble vist som den tilsvarende prosentvise strekk som kreves for at hjerteseksjoner skal oppnå en sarkomerlengde som ligner den som sees ved hypertrofi. Strekk og hastighet av hjertevev under kontraksjon og avslapning forble konstant i løpet av seks dager med dyrking (fig. 6c). Hjertevev fra MT-forhold ble utsatt for normal strekk (MT (Normal)) eller overstrekkforhold (MT (OS)) i seks dager. Allerede etter fire dager i dyrking var den hypertrofiske biomarkøren NT-ProBNP signifikant forhøyet i mediet under MT (OS)-forhold sammenlignet med MT (normale) forhold (fig. 7a). I tillegg økte cellestørrelsen i MT (OS) (fig. 7b) betydelig etter seks dager med dyrking sammenlignet med seksjoner av MT-hjerte (normalt). I tillegg økte NFATC4-nukleær translokasjon betydelig i overstrakte vev (fig. 7c). Disse resultatene viser den progressive utviklingen av patologisk ombygging etter hyperdistensjon og støtter konseptet om at CTCM-enheten kan brukes som en plattform for å studere strekkindusert hjertehypertrofisignalering.
Representative spor av målinger av luftkammertrykk, væskekammertrykk og vevsbevegelse bekrefter at kammertrykket endrer væskekammertrykket, noe som forårsaker en tilsvarende bevegelse av vevssnittet. b Representative strekkprosent- og strekkhastighetskurver for normalt strukkede (oransje) og overstrukkede (blå) vevssnitt. c Stolpediagram som viser syklustid (n = 19 skiver per gruppe, fra forskjellige griser), kontraksjonstid (n = 18–19 skiver per gruppe, fra forskjellige griser), relaksasjonstid (n = 19 skiver per gruppe, fra forskjellige griser)), amplitude av vevsbevegelse (n = 14 skiver/gruppe, fra forskjellige griser), topp systolisk hastighet (n = 14 skiver/gruppe, fra forskjellige griser) og topp relaksasjonsrate (n = 14 (D0), 15 (D6)) snitt/grupper) fra forskjellige griser), tosidig Student's t-test viste ingen signifikant forskjell i noen parameter, noe som indikerer at disse parameterne forble konstante i løpet av 6 dager med dyrking med overspenning. Feilfelt representerer gjennomsnitt ± standardavvik.
en søylediagramkvantifisering av NT-ProBNP-konsentrasjon i kulturmedier fra hjerteskiver dyrket under MT normal strekk (Norm) eller overstrekk (OS) forhold (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm og D4 MTOS) skiver/gruppe fra forskjellige griser. Toveis ANOVA utføres; **p < 0,01 sammenlignet med normal strekk). en søylediagramkvantifisering av NT-ProBNP-konsentrasjon i kulturmedier fra hjerteskiver dyrket under MT normal strekk (Norm) eller overstrekk (OS) forhold (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm og D4 MTOS) skiver/gruppe fra forskjellige griser. Toveis ANOVA er utført; **p < 0,01 sammenlignet med normal strekk).Kvantitativt histogram av NT-ProBNP-konsentrasjon i kulturmedium fra hjerteskiver dyrket under forhold med normal MT-strekk (norm) eller overstrekk (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm og D4).MTOS) skiver/gruppe fra forskjellige griser, tofaktorvariansanalyse utføres;**p < 0,01 for сравнению с нормальным растяжением). **p < 0,01 sammenlignet med normal strekk). a 在MT 正常拉伸(Norm) 或过度拉伸(OS) 条件下培养的心脏切片培养基中NT-ProBNP浓度的条形图量化（n = 4 (D2 MTNorm)、3（D2 MTOS、D4 MTNorm 和D4 MTOS）来自不同猪的切片/组，进行双向方差分析；**与正常拉伸相比，p < 0,01）. a Kvantifisering av NT-ProBNP-konsentrasjon i hjerteskiver dyrket under MT normal stretch (Norm) eller overstretch (OS) forhold (n​= 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm和D4 MTOS) fra forskjellige猪的切片/组，可以双向方方发发动 **sammenlignet med normal strekking, p < 0,01).histogram Kvantifisering av NT-ProBNP-konsentrasjoner i hjerteskiver dyrket under forhold med normal MT-strekk (norm) eller overstrekk (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm) og D4 MTOS) skiver/gruppe fra forskjellige griser, toveis variansanalyse;**p < 0,01 for сравнению с нормальным растяжением). **p < 0,01 sammenlignet med normal strekk). b Representative bilder for hjerteskiver farget med troponin-T og WGA (venstre) og kvantifisering av cellestørrelse (høyre) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) celler/gruppe fra 10 forskjellige skiver fra forskjellige griser, tosidig Student t-test er utført; ****p < 0,0001 sammenlignet med normal strekk). b Representative bilder for hjerteskiver farget med troponin-T og WGA (venstre) og kvantifisering av cellestørrelse (høyre) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) celler/gruppe fra 10 forskjellige skiver fra forskjellige griser, tosidig Student t-test er utført; ****p < 0,0001 sammenlignet med normal strekk). b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слева) og количестолениногого клеток (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) клеток/группу из 10 разных срезов от разных свиней, двх-из t-критерий Стьюдента; ****p < 0,0001 по сравнению с нормальным растяжением). b Representative bilder av hjerteseksjoner farget med troponin-T og AZP (venstre) og kvantifisering av cellestørrelse (høyre) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) celler/gruppe fra 10 forskjellige seksjoner fra forskjellige griser, tosidig Student's t-test ble utført; ****p < 0,0001 sammenlignet med normal belastning). b 用肌钙蛋白-T 和WGA（左）和细胞大小量化（右）染色的心脏切片的代表性 3（n MTOS），来自不同猪的10 个不同切片的369（D6 MTNorm）细胞/组，两进行有尟学甌检验；与正常拉伸相比，****p < 0,0001）. b Representative bilder av hjerteskiver farget med calcarein-T og WGA (venstre) og cellestørrelse (høyre) (n = 330 (D6 MTOS), 369 fra 10 forskjellige skiver (D6 MTNorm)) Celler/celle, standardisert modifikasjonstest t-test; sammenlignet med normal strekking, ****p < 0,0001). b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слева) и количественная ошенных (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) из 10 различных срезов от разных свиней Клетки/групца, Справа, Справа; ****p < 0,0001 for сравнению с нормальным растяжением). b Representative bilder av hjerteseksjoner farget med troponin-T og AZP (venstre) og kvantifisering av cellestørrelse (høyre) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) fra 10 forskjellige seksjoner fra forskjellige griser) Celler/gruppe, tosidig kriterium Student's t; ****p < 0,0001 sammenlignet med normal belastning). c Representative bilder for dag 0 og dag 6 MTOS-hjerteskiver immunmerket for troponin-T og NFATC4 og kvantifisering av translokasjonen av NFATC4 til kjernene i CM-er (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) skiver/gruppe fra forskjellige griser, tosidig Student t-test utføres; *p < 0,05). c Representative bilder for dag 0 og dag 6 MTOS-hjerteskiver immunmerket for troponin-T og NFATC4 og kvantifisering av translokasjonen av NFATC4 til kjernene i CM-er (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) skiver/gruppe fra forskjellige griser, tosidig Student t-test er utført; *p < 0,05). c Репрезентативные изображения для срезов сердца 0 og 6 дней MTOS, иммуномеченых for тропонина-Т и NFATC4, og ковленич транслокации NFATC4 в ядра кавернозных клеток (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срезов/группу от разных свиняней , выпус t-критерий Стьюдента; *p < 0,05). c Representative bilder for hjertesnitt ved 0 og 6 dager MTOS, immunmerket for troponin-T og NFATC4, og kvantifisering av NFATC4-translokasjon i kjernen av kavernøse celler (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) snitt/gruppe fra forskjellige griser) utført tosidig Student's t-test; *p < 0,05). c 用于肌钙蛋白-T 和NFATC4 免疫标记的第0 天和第6 天MTOS心脏切片的代表性图像，以及来自不同猪的NFATC4 易位至CM 细胞核的量匀MT 匀4（n)切片/组, 进行双尾学生t 检验；*p < 0,05). c Representative bilder av calcanin-T- og NFATC4-immunmerking 第0天和第6天MTOS-hjerteskiver, og NFATC4 fra forskjellige NFATC4-易位至CM-cellekjernemengde化 (n = 4 (D0), 缤 刻 , 焇 , 焇 , 焇 , 焇 , 焇 ,时间双尾学生et 电影；*p < 0,05). c Репрезентативные изображения срезов сердца MTOS на 0 og 6 день for иммуномаркировки тропониностином-Т и NFATC4 и коцичи транслокации NFATC4 в ядра CM от разных свиней (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срез/группа, два- хвостатый t-критер, 0). c Representative bilder av MTOS-hjerteskiver på dag 0 og 6 for troponin-T- og NFATC4-immunmerking og kvantifisering av NFATC4-translokasjon i kjernen til CM fra forskjellige griser (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) skiver/gruppe, tosidig t-kriterium Student's; *p < 0,05).Feilfelt representerer gjennomsnitt ± standardavvik.
Translasjonell kardiovaskulær forskning krever cellulære modeller som nøyaktig gjengir hjertemiljøet. I denne studien ble en CTCM-enhet utviklet og karakterisert som kan stimulere ultratynne seksjoner av hjertet. CTCM-systemet inkluderer fysiologisk synkronisert elektromekanisk stimulering og T3- og Dex-væskeanrikning. Når svinehjerteseksjoner ble eksponert for disse faktorene, forble deres levedyktighet, strukturelle integritet, metabolske aktivitet og transkripsjonsuttrykk den samme som i ferskt hjertevev etter 12 dager med dyrking. I tillegg kan overdreven strekking av hjertevev forårsake hypertrofi av hjertet forårsaket av hyperekstensjon. Samlet sett støtter disse resultatene den kritiske rollen til fysiologiske kulturforhold i å opprettholde en normal hjertefenotype og gir en plattform for medikamentscreening.
Mange faktorer bidrar til å skape et optimalt miljø for funksjon og overlevelse av kardiomyocytter. De mest åpenbare av disse faktorene er knyttet til (1) intercellulære interaksjoner, (2) elektromekanisk stimulering, (3) humorale faktorer og (4) metabolske substrater. Fysiologiske celle-til-celle-interaksjoner krever komplekse tredimensjonale nettverk av flere celletyper støttet av en ekstracellulær matrise. Slike komplekse cellulære interaksjoner er vanskelige å rekonstruere in vitro ved samkultur av individuelle celletyper, men kan enkelt oppnås ved hjelp av den organotypiske naturen til hjerteseksjoner.
Mekanisk strekking og elektrisk stimulering av kardiomyocytter er kritisk for å opprettholde hjertefenotypen33,34,35. Selv om mekanisk stimulering har blitt mye brukt for hiPSC-CM-kondisjonering og modning, har flere elegante studier nylig forsøkt mekanisk stimulering av hjerteskiver i kultur ved bruk av uniaksial belastning. Disse studiene viser at 2D uniaksial mekanisk belastning har en positiv effekt på hjertets fenotype under dyrking. I disse studiene ble seksjoner av hjertet enten belastet med isometriske strekkrefter17, lineær auxotonisk belastning18, eller hjertesyklusen ble gjenskapt ved bruk av krafttransduser-tilbakemeldinger og spenningsdrivere. Imidlertid bruker disse metodene uniaksial vev-strekking uten miljøoptimalisering, noe som resulterer i undertrykkelse av mange hjertegener eller overekspresjon av gener assosiert med unormale strekkresponser. CTCM beskrevet her gir en 3D elektromekanisk stimulus som etterligner den naturlige hjertesyklusen når det gjelder syklustid og fysiologisk strekking (25 % strekking, 40 % systole, 60 % diastole og 72 slag per minutt). Selv om denne tredimensjonale mekaniske stimuleringen alene ikke er tilstrekkelig til å opprettholde vevets integritet, er en kombinasjon av humoral og mekanisk stimulering ved bruk av T3/Dex nødvendig for å opprettholde vevets levedyktighet, funksjon og integritet på en tilstrekkelig måte.
Humorale faktorer spiller en viktig rolle i å modulere fenotypen til et voksent hjerte. Dette ble fremhevet i HiPS-CM-studier der T3 og Dex ble tilsatt kulturmedier for å akselerere cellemodning. T3 kan påvirke transporten av aminosyrer, sukker og kalsium over cellemembraner36. I tillegg fremmer T3 MHC-α-ekspresjon og MHC-β-nedregulering, og fremmer dannelsen av raske myofibriller i modne kardiomyocytter sammenlignet med langsomme myofibriller i føtalt CM. T3-mangel hos pasienter med hypotyreose resulterer i tap av myofibrillære bånd og en redusert hastighet på tonusutvikling37. Dex virker på glukokortikoidreseptorer og har vist seg å øke myokardkontraktiliteten i isolerte perfuserte hjerter;38 denne forbedringen antas å være relatert til effekten på kalsiumavsetningsdrevet entry (SOCE)39,40. I tillegg binder Dex seg til reseptorene sine, noe som forårsaker en bred intracellulær respons som undertrykker immunfunksjon og betennelse30.
Resultatene våre indikerer at fysisk mekanisk stimulering (MS) forbedret den generelle kulturytelsen sammenlignet med Ctrl, men klarte ikke å opprettholde levedyktighet, strukturell integritet og hjerteekspresjon over 12 dager i kultur. Sammenlignet med Ctrl forbedret tilsetning av T3 og Dex til CTCM (MT)-kulturer levedyktigheten og opprettholdt lignende transkripsjonsprofiler, strukturell integritet og metabolsk aktivitet med ferskt hjertevev i 12 dager. I tillegg, ved å kontrollere graden av vevsstrekk, ble en hyperekstensjonsindusert hjertehypertrofimodell laget ved hjelp av STCM, noe som illustrerer allsidigheten til STCM-systemet. Det bør bemerkes at selv om hjerteombygging og fibrose vanligvis involverer intakte organer hvis sirkulerende celler kan gi passende cytokiner samt fagocytose og andre ombyggingsfaktorer, kan deler av hjertet fortsatt etterligne den fibrotiske prosessen som respons på stress og traumer inn i myofibroblaster. Dette har tidligere blitt evaluert i denne hjertesnittmodellen. Det bør bemerkes at CTCM-parametere kan moduleres ved å endre trykk/elektrisk amplitude og frekvens for å simulere mange tilstander som takykardi, bradykardi og mekanisk sirkulasjonsstøtte (mekanisk ubelastet hjerte). Dette gjør systemet til et system med middels gjennomstrømning for legemiddeltesting. CTCMs evne til å modellere overanstrengelsesindusert hjertehypertrofi baner vei for testing av dette systemet for personlig tilpasset behandling. Avslutningsvis viser denne studien at mekanisk tøyning og humoral stimulering er avgjørende for å opprettholde kulturen av hjertevevssnitt.
Selv om dataene som presenteres her antyder at CTCM er en svært lovende plattform for modellering av intakt myokard, har denne kulturmetoden noen begrensninger. Hovedbegrensningen ved CTCM-kultur er at den påfører kontinuerlig dynamisk mekanisk stress på skivene, noe som utelukker muligheten til aktivt å overvåke hjerteskivens sammentrekninger i løpet av hver syklus. I tillegg, på grunn av den lille størrelsen på hjerteseksjonene (7 mm), er muligheten til å evaluere systolisk funksjon utenfor kultursystemer ved hjelp av tradisjonelle kraftsensorer begrenset. I dette manuskriptet har vi delvis overvunnet denne begrensningen ved å evaluere optisk spenning som en indikator på kontraktil funksjon. Denne begrensningen vil imidlertid kreve ytterligere arbeid og kan løses i fremtiden ved å introdusere metoder for optisk overvåking av funksjonen til hjerteskiver i kultur, for eksempel optisk kartlegging ved bruk av kalsium og spenningsfølsomme fargestoffer. En annen begrensning ved CTCM er at arbeidsmodellen ikke manipulerer fysiologisk stress (forbelastning og etterbelastning). I CTCM ble trykk indusert i motsatte retninger for å reprodusere 25 % fysiologisk strekk i diastole (full strekk) og systole (lengde på sammentrekning under elektrisk stimulering) i svært store vev. Denne begrensningen bør fjernes i fremtidige CTCM-design ved tilstrekkelig trykk på hjertevevet fra begge sider og ved å anvende nøyaktig de samme trykk-volum-forholdene som oppstår i hjertets kamre.
Den overstrekkinduserte ombyggingen som rapporteres i dette manuskriptet er begrenset til å etterligne hypertrofiske hyperstrekksignaler. Dermed kan denne modellen hjelpe i studiet av strekkindusert hypertrofisk signalering uten behov for humorale eller nevrale faktorer (som ikke finnes i dette systemet). Ytterligere studier er nødvendige for å øke multiplisiteten av CTCM, for eksempel vil samdyrking med immunceller, humorale faktorer i sirkulerende plasma og innervering når samdyrking med nevronceller vil forbedre mulighetene for sykdomsmodellering med CTCM.
Tretten griser ble brukt i denne studien. Alle dyreforsøk ble utført i samsvar med institusjonens retningslinjer og ble godkjent av University of Louisville Institutional Animal Care and Use Committee. Aortabuen ble avklemt og hjertet ble perfusert med 1 liter steril kardioplegi (110 mM NaCl, 1,2 mM CaCl2, 16 mM KCl, 16 mM MgCl2, 10 mM NaHCO3, 5 U/ml heparin, pH opptil 7,4); Hjertene ble bevart i iskald kardioplegisk løsning inntil de ble transportert til laboratoriet på is, noe som vanligvis er <10 minutter. Hjertene ble bevart i iskald kardioplegisk løsning inntil de ble transportert til laboratoriet på is, noe som vanligvis er <10 minutter. сердца хранили в ледяном кардиоплегическом растворе до транспортировки в лабораторию на льду, что обанично <10мно. Hjertene ble oppbevart i iskald kardioplegisk løsning inntil transport til laboratoriet på is, noe som vanligvis tar <10 minutter.将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10。逛将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10。逛 Держите сердца в ледяной кардиоплегии до транспортировки в лабораторию на льду, обычно <10 min. Hold hjertene på is ved kardioplegi inntil transport til laboratoriet på is, vanligvis <10 min.
CTCM-enheten ble utviklet i SolidWorks dataassistert design (CAD)-programvare. Kulturkamrene, skilleveggene og luftkamrene er laget av CNC-bearbeidet klar akrylplast. Støtteringen med en diameter på 7 mm er laget av høydensitetspolyetylen (HDPE) i midten og har et o-ringspor for å gi plass til silikon-o-ringen som brukes til å forsegle mediet under. En tynn silikamembran skiller kulturkammeret fra separasjonsplaten. Silikonmembranen er laserskåret fra 0,02 tommer tykk silikonplate og har en hardhet på 35A. De nederste og øverste silikonpakningene er laserskåret fra 1/16 tommer tykk silikonplate og har en hardhet på 50A. Skruer og vingemuttere i rustfritt stål av typen 316L brukes til å feste blokken og skape en lufttett forsegling.
Et dedikert kretskort (PCB) er designet for å integreres med C-PACE-EM-systemet. Kontaktsoklene for sveitsermaskinen på kretskortet er koblet til grafittelektroder med forsølvede kobbertråder og bronseskruer (0-60) som er skrudd inn i elektrodene. Kretskortet er plassert i dekselet på 3D-skriveren.
CTCM-enheten styres av en programmerbar pneumatisk aktuator (PPD) som skaper et kontrollert sirkulasjonstrykk som ligner på en hjertesyklus. Når trykket inne i luftkammeret øker, ekspanderer den fleksible silikonmembranen oppover, noe som tvinger mediet under vevsområdet. Vevsområdet vil deretter bli strukket av denne utstøtingen av væske, noe som etterligner den fysiologiske utvidelsen av hjertet under diastolen. Ved toppen av avslapningen ble elektrisk stimulering påført gjennom grafittelektroder, noe som reduserte trykket i luftkammeret og forårsaket sammentrekning av vevsseksjonene. Inne i røret er det en hemostatisk ventil med en trykksensor for å detektere trykket i luftsystemet. Trykket som registreres av trykksensoren påføres en datainnsamler koblet til den bærbare datamaskinen. Dette muliggjør kontinuerlig overvåking av trykket inne i gasskammeret. Når det maksimale kammertrykket ble nådd (standard 80 mmHg, 140 mmHg over-the-top), ble datainnsamlingsenheten beordret til å sende et signal til C-PACE-EM-systemet for å generere et tofaset spenningssignal i 2 ms, satt til 4 V.
Hjertesnitt ble tatt, og dyrkningsforholdene i 6 brønner ble utført som følger: Overfør de høstede hjertene fra overføringsbeholderen til et brett som inneholdt kald (4 °C) kardioplegi. Venstre ventrikkel ble isolert med et sterilt blad og kuttet i biter på 1–2 cm³. Disse vevsblokkene ble festet til vevsstøtter med vevslim og plassert i et vibrerende mikrotomvevsbad som inneholdt Tyrodes løsning og kontinuerlig oksygenert (3 g/L 2,3-butandionmonooksim (BDM), 140 mM NaCl (8,18 g), 6 mM KCl (0,447 g), 10 mM D-glukose (1,86 g), 10 mM HEPES (2,38 g), 1 mM MgCl2 (1 ml 1 M løsning), 1,8 mM CaCl2 (1,8 ml 1 M løsning), opptil 1 L ddH2O). Den vibrerende mikrotomen ble satt til å skjære 300 µm tykke skiver med en frekvens på 80 Hz, en horisontal vibrasjonsamplitude på 2 mm og en fremføringshastighet på 0,03 mm/s. Vevsbadet ble omgitt av is for å holde løsningen kjølig, og temperaturen ble holdt på 4 °C. Overfør vevssnittene fra mikrotombadet til et inkubasjonsbad som inneholdt kontinuerlig oksygenert Tyrode-løsning på is inntil nok snitt var oppnådd til én kulturplate. For transwell-kulturer ble vevssnittene festet til sterile 6 mm brede polyuretanstøtter og plassert i 6 ml optimalisert medium (199 medium, 1x ITS-tilskudd, 10 % FBS, 5 ng/ml VEGF, 10 ng/ml FGF-alkalisk og 2X antibiotika-soppdrepende middel). Elektrisk stimulering (10 V, frekvens 1,2 Hz) ble påført vevssnittene gjennom C-Pace. For TD-forhold ble fersk T3 og Dex tilsatt ved 100 nM og 1 μM ved hvert mediumbytte. Mediet mettes med oksygen før utskifting 3 ganger daglig. Vevsseksjonene ble dyrket i en inkubator ved 37 °C og 5 % CO2.
For CTCM-kulturer ble vevssnitt plassert på en spesiallaget 3D-printer i en petriskål som inneholdt modifisert Tyrodes løsning. Enheten er designet for å øke størrelsen på hjertesnittet med 25 % av støtteringens areal. Dette gjøres slik at hjertesnittene ikke strekker seg etter overføring fra Tyrodes løsning til mediet og under diastolen. Ved hjelp av histoakryllim ble snitt med en tykkelse på 300 µm festet på en støttering med en diameter på 7 mm. Etter at vevssnittene var festet til støtteringen, kuttes de overflødige vevssnittene av og de festede vevssnittene plasseres tilbake i badet med Tyrode-løsning på is (4 °C) til nok snitt er forberedt for én enhet. Den totale behandlingstiden for alle enhetene bør ikke overstige 2 timer. Etter at 6 vevssnitt var festet til støtteringene, ble CTCM-enheten montert. CTCM-kulturkammeret er forhåndsfylt med 21 ml preoksygenert medium. Overfør vevssnittene til kulturkammeret og fjern forsiktig eventuelle luftbobler med en pipette. Vevsseksjonen føres deretter inn i hullet og presses forsiktig på plass. Til slutt plasseres elektrodehetten på enheten og enheten overføres til inkubatoren. Koble deretter CTCM-en til luftslangen og C-PACE-EM-systemet. Den pneumatiske aktuatoren åpnes, og luftventilen åpner CTCM-en. C-PACE-EM-systemet ble konfigurert til å levere 4 V ved 1,2 Hz under bifasisk pacing i 2 ms. Mediet ble byttet to ganger om dagen, og elektrodene ble byttet én gang om dagen for å unngå opphopning av grafitt på elektrodene. Om nødvendig kan vevsseksjonene fjernes fra kulturbrønnene for å fjerne eventuelle luftbobler som kan ha falt under dem. For MT-behandlingsforhold ble T3/Dex tilsatt friskt ved hvert mediumbytte med 100 nM T3 og 1 μM Dex. CTCM-enhetene ble dyrket i en inkubator ved 37 °C og 5 % CO2.
For å oppnå strukket bane av hjerteskiver ble det utviklet et spesielt kamerasystem. Et speilreflekskamera (Canon Rebel T7i, Canon, Tokyo, Japan) ble brukt med et Navitar Zoom 7000 18-108mm makroobjektiv (Navitar, San Francisco, CA). Visualisering ble utført ved romtemperatur etter at mediet ble erstattet med nytt medium. Kameraet er plassert i en vinkel på 51°, og video tas opp med 30 bilder per sekund. Først ble åpen kildekode-programvare (MUSCLEMOTION43) brukt med Image-J for å kvantifisere bevegelsen til hjerteskivene. Masken ble laget ved hjelp av MATLAB (MathWorks, Natick, MA, USA) for å definere interesseområder for bankende hjerteskiver for å unngå støy. Manuelt segmenterte masker brukes på alle bilder i en bildesekvens og sendes deretter til MUSCLEMOTION-plugin-modulen. Muscle Motion bruker den gjennomsnittlige intensiteten til pikslene i hvert bilde for å kvantifisere bevegelsen i forhold til referansebildet. Data ble registrert, filtrert og brukt til å kvantifisere syklustid og vurdere vevsstrekking under hjertesyklusen. Den innspilte videoen ble etterbehandlet ved hjelp av et førsteordens nullfase digitalt filter. For å kvantifisere vevsstrekk (topp-til-topp) ble det utført topp-til-topp-analyse for å skille mellom topper og bunner i det innspilte signalet. I tillegg utføres trenddegradering ved hjelp av et 6. ordens polynom for å eliminere signaldrift. Programkode ble utviklet i MATLAB for å bestemme global vevsbevegelse, syklustid, relaksasjonstid og kontraksjonstid (Supplerende programkode 44).
For tøyningsanalyse, ved å bruke de samme videoene som ble laget for mekanisk strekkvurdering, tegnet vi først to bilder som representerte bevegelsestopper (de høyeste (øvre) og laveste (nedre) bevegelsespunktene) i henhold til MUSCLEMOTION-programvaren. Deretter segmenterte vi vevsregionene og anvendte en form for skyggeleggingsalgoritme på det segmenterte vevet (tilleggsfigur 2a). Det segmenterte vevet ble deretter delt inn i ti underflater, og spenningen på hver overflate ble beregnet ved hjelp av følgende ligning: Tøyning = (Sup-Sdown)/Sdown, hvor Sup og Sdown er avstandene fra formen til henholdsvis stoffets øvre og nedre skygger (tilleggsfigur 2b).
Hjerteseksjoner ble fiksert i 4 % paraformaldehyd i 48 timer. Fikserte vev ble dehydrert i 10 % og 20 % sukrose i 1 time, deretter i 30 % sukrose over natten. Seksjonene ble deretter innstøpt i OCT-forbindelse (optimal cutting temperature compound) og gradvis frosset i et isopentan/tørrisbad. Oppbevar OCT-innstøpningsblokkene ved -80 °C inntil separasjon. Objektglassene ble fremstilt som seksjoner med en tykkelse på 8 μm.
For å fjerne OCT fra hjerteseksjoner, varm opp objektglassene på en varmeblokk ved 95 °C i 5 minutter. Tilsett 1 ml PBS til hvert objektglass og inkuber i 30 minutter ved romtemperatur, og permeer deretter snittene ved å sette 0,1 % Triton-X i PBS i 15 minutter ved romtemperatur. For å forhindre at uspesifikke antistoffer binder seg til prøven, tilsett 1 ml 3 % BSA-løsning til objektglassene og inkuber i 1 time ved romtemperatur. BSA ble deretter fjernet, og objektglassene ble vasket med PBS. Merk hver prøve med en blyant. Primære antistoffer (fortynnet 1:200 i 1 % BSA) (connexin 43 (Abcam; #AB11370), NFATC4 (Abcam; #AB99431) og troponin-T (Thermo Scientific; #MA5-12960) ble tilsatt over 90 minutter, deretter sekundære antistoffer (fortynnet 1:200 i 1 % BSA) mot mus Alexa Fluor 488 (Thermo Scientific; #A16079), mot kanin Alexa Fluor 594 (Thermo Scientific; #T6391) i ytterligere 90 minutter. Vasket 3 ganger med PBS. For å skille målfarging fra bakgrunn brukte vi kun det sekundære antistoffet som kontroll. Til slutt ble DAPI-kjernefarging tilsatt, og objektglassene ble plassert i et Vectashield (Vector Laboratories) og forseglet med neglelakk. (-x forstørrelse) og Keyence-mikroskop med 40x forstørrelse.
WGA-Alexa Fluor 555 (Thermo Scientific; #W32464) ved 5 μg/ml i PBS ble brukt til WGA-farging og påført fikserte snitt i 30 minutter ved romtemperatur. Objektglassene ble deretter vasket med PBS, og Sudansvart ble tilsatt hvert objektglass og inkubert i 30 minutter. Objektglassene ble deretter vasket med PBS, og Vectashield-innstøpningsmedium ble tilsatt. Objektglassene ble visualisert på et Keyence-mikroskop ved 40x forstørrelse.
OCT ble fjernet fra prøvene som beskrevet ovenfor. Etter at OCT-en var fjernet, ble objektglassene lagt i Bouins løsning over natten. Objektglassene ble deretter skylt med destillert vann i 1 time og deretter plassert i en Bibrich-aloe vera-syre-fuksinløsning i 10 minutter. Deretter ble objektglassene vasket med destillert vann og plassert i en løsning av 5 % fosfomolybden/5 % fosfowolframsyre i 10 minutter. Overfør objektglassene direkte til anilinblåttløsningen i 15 minutter uten å skylle. Deretter ble objektglassene vasket med destillert vann og plassert i en 1 % eddiksyreløsning i 2 minutter. Objektglassene ble tørket i 200 N etanol og overført til xylen. Fargede objektglass ble visualisert ved hjelp av et Keyence-mikroskop med 10x objektiv. Fibrosearealprosent ble kvantifisert ved hjelp av Keyence Analyzer-programvaren.
CyQUANT™ MTT Cell Viability Assay (Invitrogen, Carlsbad, CA), katalognummer V13154, i henhold til produsentens protokoll med noen modifikasjoner. Spesielt ble en kirurgisk stempel med en diameter på 6 mm brukt for å sikre jevn vevsstørrelse under MTT-analysen. Vev ble individuelt platet ut i brønnene på en 12-brønns plate som inneholdt MTT-substrat i henhold til produsentens protokoll. Snittene inkuberes ved 37 °C i 3 timer, og det levende vevet metaboliserer MTT-substratet for å danne en lilla formazanforbindelse. Erstatt MTT-løsningen med 1 ml DMSO og inkuber ved 37 °C i 15 minutter for å ekstrahere lilla formazan fra hjerteseksjoner. Prøvene ble fortynnet 1:10 i DMSO i 96-brønns klare bunnplater, og lilla fargeintensitet ble målt ved 570 nm ved hjelp av en Cytation-plateleser (BioTek). Avlesningene ble normalisert til vekten av hver skive av hjertet.
Hjerteskivemedium ble erstattet med medium som inneholdt 1 μCi/ml [5-3H]-glukose (Moravek Biochemicals, Brea, CA, USA) for glukoseutnyttelsesanalyse som tidligere beskrevet. Etter 4 timers inkubasjon, tilsett 100 µl medium til et åpent mikrosentrifugerør som inneholdt 100 µl 0,2 N HCl. Deretter ble røret plassert i et scintillasjonsrør som inneholdt 500 μl dH₂O for å fordampe [3H]₂O i 72 timer ved 37 °C. Fjern deretter mikrosentrifugerøret fra scintillasjonsrøret og tilsett 10 ml scintillasjonsvæske. Scintillasjonstellinger ble utført ved hjelp av en Tri-Carb 2900TR væskescintillasjonsanalysator (Packard Bioscience Company, Meriden, CT, USA). Glukoseutnyttelsen ble deretter beregnet under hensyntagen til [5-3H]-glukosespesifikk aktivitet, ufullstendig likevekt og bakgrunn, fortynning av [5-3H]-til umerket glukose og scintillasjonstellerens effektivitet. Dataene er normalisert til massen av hjerteseksjonene.
Etter vevs-homogenisering i Trizol ble RNA isolert fra hjerteseksjoner ved bruk av Qiagen miRNeasy Micro Kit #210874 i henhold til produsentens protokoll. RNAsec-bibliotekforberedelse, sekvensering og dataanalyse ble utført som følger:
1 μg RNA per prøve ble brukt som utgangsmateriale for fremstilling av RNA-biblioteket. Sekvenseringsbiblioteker ble generert ved hjelp av NEBNext UltraTM RNA Library Preparation Kit for Illumina (NEB, USA) i henhold til produsentens anbefalinger, og indekskoder ble lagt til attributtsekvensene for hver prøve. Kort fortalt ble mRNA renset fra totalt RNA ved hjelp av magnetiske kuler festet med poly-T-oligonukleotider. Fragmentering utføres ved hjelp av divalente kationer ved høy temperatur i NEBNext First Strand Synthesis Reaction Buffer (5X). Første-tråds cDNA ble syntetisert ved hjelp av tilfeldige heksamerprimere og M-MuLV revers transkriptase (RNase H-). Andre-tråds cDNA syntetiseres deretter ved hjelp av DNA-polymerase I og RNase H. De gjenværende overhengene omdannes til butte ender ved eksonuklease/polymeraseaktivitet. Etter adenylering av 3'-enden av DNA-fragmentet festes en NEBNext Adapter med en hårnålsløyfestruktur til den for å forberede den for hybridisering. For valg av cDNA-fragmenter med foretrukket lengde 150-200 bp. Bibliotekfragmenter ble renset ved hjelp av AMPure XP-systemet (Beckman Coulter, Beverly, USA). Deretter ble 3 μl USER Enzyme (NEB, USA) med størrelsesselektert cDNA ligert med en adapter brukt i 15 minutter ved 37 °C og deretter i 5 minutter ved 95 °C før PCR. PCR ble deretter utført ved hjelp av Phusion High-Fidelity DNA-polymerase, universelle PCR-primere og Index (X)-primere. Til slutt ble PCR-produktene renset (AMPure XP-system) og bibliotekkvaliteten vurdert på et Agilent Bioanalyzer 2100-system. cDNA-biblioteket ble deretter sekvensert ved hjelp av en Novaseq-sekvenserer. Rå bildefiler fra Illumina ble konvertert til råavlesninger ved hjelp av CASAVA Base Calling. Rådata lagres i FASTQ(fq)-formatfiler som inneholder avlesningssekvenser og tilsvarende basekvaliteter. Velg HISAT2 for å matche filtrerte sekvenseringsavlesninger med Sscrofa11.1-referansegenomet. Generelt støtter HISAT2 genomer av alle størrelser, inkludert genomer større enn 4 milliarder baser, og standardverdier er satt for de fleste parametere. Skjøting av avlesninger fra RNA-sekvensdata kan effektivt justeres ved hjelp av HISAT2, det raskeste systemet som er tilgjengelig for øyeblikket, med samme eller bedre nøyaktighet enn noen annen metode.
Forekomsten av transkripter reflekterer direkte nivået av genuttrykk. Genuttrykksnivåer vurderes ut fra forekomsten av transkripter (sekvenseringsantall) assosiert med genomet eller eksonene. Antall avlesninger er proporsjonalt med genuttrykksnivåer, genlengde og sekvenseringsdybde. FPKM (fragmenter per tusen basepar av sekvensert transkript per million basepar) ble beregnet, og P-verdier for differensiell uttrykk ble bestemt ved hjelp av DESeq2-pakken. Vi beregnet deretter falsk oppdagelsesrate (FDR) for hver P-verdi ved hjelp av Benjamini-Hochberg-metoden9 basert på den innebygde R-funksjonen «p.adjust».
RNA isolert fra hjerteseksjoner ble omdannet til cDNA ved en konsentrasjon på 200 ng/μl ved bruk av SuperScript IV Vilo Master mix fra Thermo (Thermo, kat.nr. 11756050). Kvantitativ RT-PCR ble utført ved bruk av en Applied Biosystems Endura Plate Microamp 384-brønns transparent reaksjonsplate (Thermo, kat.nr. 4483319) og microamp optisk lim (Thermo, kat.nr. 4311971). Reaksjonsblandingen besto av 5 µl Taqman Fast Advanced Master mix (Thermo, kat.nr. 4444557), 0,5 µl Taqman Primer og 3,5 µl H2O blandet per brønn. Standard qPCR-sykluser ble kjørt og CT-verdier ble målt ved bruk av et Applied Biosystems Quantstudio 5 sanntids-PCR-instrument (384-brønnsmodul; produktnr. A28135). Taqman-primere ble kjøpt fra Thermo (GAPDH (Ss03375629_u1), PARP12 (Ss06908795_m1), PKDCC (Ss06903874_m1), CYGB (Ss06900188_m1), RGL1 (Ss06868890_m1), ACTN1 (Ss01009508_mH), GATA4 (Ss03383805_u1), GJA1 (Ss03374839_u1), COL1A2 (Ss03375009_u1), COL3A1 (Ss04323794_m1), ACTA2 (Ss04245588_m1). CT-verdiene for alle prøvene ble normalisert til housekeeping-genet GAPDH.
Medieutgivelse av NT-ProBNP ble vurdert ved bruk av NT-ProBNP-settet (pig) (katalognr. MBS2086979, MyBioSource) i henhold til produsentens protokoll. Kort fortalt ble 250 µl av hver prøve og standard tilsatt i duplikat til hver brønn. Umiddelbart etter tilsetning av prøven, tilsettes 50 µl analysereagens A til hver brønn. Rist platen forsiktig og forsegl den med tetningsmiddel. Deretter ble tablettene inkubert ved 37 °C i 1 time. Aspirer deretter løsningen og vask brønnene 4 ganger med 350 µl 1X vaskeløsning, og inkuber vaskeløsningen i 1–2 minutter hver gang. Tilsett deretter 100 µl analysereagens B per brønn og forsegl med platetetningsmiddel. Tabletten ble forsiktig ristet og inkubert ved 37 °C i 30 minutter. Aspirer løsningen og vask brønnene 5 ganger med 350 µl 1X vaskeløsning. Tilsett 90 µl substratløsning til hver brønn og forsegl platen. Inkuber platen ved 37 °C i 10–20 minutter. Tilsett 50 µl stoppløsning til hver brønn. Platen ble umiddelbart målt med en Cytation (BioTek) plateleser innstilt på 450 nm.
Power-analyser ble utført for å velge gruppestørrelser som vil gi >80 % effekt for å oppdage en absolutt endring i parameteren på 10 % med en type I-feilrate på 5 %. Power-analyser ble utført for å velge gruppestørrelser som vil gi >80 % effekt for å oppdage en absolutt endring i parameteren på 10 % med en type I-feilrate på 5 %. Анализ мощности был выполнен for выбора размеров групп, которые обеспечат >80% мощности for обнаружения 10% параметра с 5% частотой ошибок типа I. Poweranalyse ble utført for å velge gruppestørrelser som ville gi >80 % effekt for å oppdage 10 % absolutt parameterendring med en type I-feilrate på 5 %.进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％I型错误率的组大小。进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％I型错误率的组大小。 Был проведен анализ мощности for выбора размера группы, который обеспечил бы 80% мощности for обнаружения изменения параметров и 5% частоты ошибок типа I. En styrkeanalyse ble utført for å velge en gruppestørrelse som ville gi >80 % styrke for å oppdage 10 % absolutt parameterendring og 5 % type I-feilrate.Vevssnitt ble tilfeldig valgt før eksperimentet. Alle analyser var kondisjonsblinde, og prøvene ble dekodet først etter at alle data var analysert. GraphPad Prism-programvaren (San Diego, CA) ble brukt til å utføre alle statistiske analyser. For all statistikk ble p-verdier ansett som signifikante ved verdier <0,05. For all statistikk ble p-verdier ansett som signifikante ved verdier <0,05. Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. For all statistikk ble p-verdier ansett som signifikante ved verdier <0,05.对于所有统计数据，p 值在值<0.05 时被认为是显着的。对于所有统计数据，p 值在值<0.05 时被认为是显着的。 Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. For all statistikk ble p-verdier ansett som signifikante ved verdier <0,05.Tosidig Student's t-test ble utført på dataene med kun to sammenligninger. Enveis eller toveis ANOVA ble brukt til å bestemme signifikans mellom flere grupper. Ved utførelse av post hoc-tester ble Tukeys korreksjon brukt for å ta hensyn til flere sammenligninger. RNAsec-data har spesielle statistiske hensyn ved beregning av FDR og p.adjust som beskrevet i metodedelen.
For mer informasjon om studiedesign, se sammendraget fra Nature Research Report som er lenket til denne artikkelen.