Nature.comను సందర్శించినందుకు ధన్యవాదాలు. మీరు ఉపయోగిస్తున్న బ్రౌజర్ వెర్షన్‌లో CSS మద్దతు పరిమితంగా ఉంది. ఉత్తమ అనుభవం కోసం, మీరు అప్‌డేట్ చేయబడిన బ్రౌజర్‌ను ఉపయోగించాలని (లేదా ఇంటర్నెట్ ఎక్స్‌ప్లోరర్‌లో కంపాటిబిలిటీ మోడ్‌ను నిలిపివేయాలని) మేము సిఫార్సు చేస్తున్నాము. ఈలోగా, మద్దతు కొనసాగేలా చూసేందుకు, మేము స్టైల్స్ మరియు జావాస్క్రిప్ట్ లేకుండా సైట్‌ను రెండర్ చేస్తాము.
ఔషధ పరీక్షల కోసం గుండె యొక్క శారీరక వాతావరణాన్ని ఖచ్చితంగా పునరుత్పత్తి చేయగల ఒక నమ్మకమైన ఇన్ విట్రో వ్యవస్థ అవసరం ఉంది. మానవ గుండె కణజాల కల్చర్ వ్యవస్థల పరిమిత లభ్యత, గుండెపై ఔషధాల ప్రభావాలను తప్పుగా అంచనా వేయడానికి దారితీసింది. ఇక్కడ, మేము ఒక కార్డియాక్ టిష్యూ కల్చర్ మోడల్ (CTCM)ను అభివృద్ధి చేశాము. ఇది గుండె ముక్కలను ఎలక్ట్రోమెకానికల్‌గా ఉత్తేజపరుస్తుంది మరియు గుండె చక్రం యొక్క సిస్టోలిక్ మరియు డయాస్టోలిక్ దశలలో శారీరక సాగుదలకు గురవుతుంది. 12 రోజుల కల్చర్ తర్వాత, ఈ విధానం గుండె భాగాల జీవశక్తిని పాక్షికంగా మెరుగుపరిచింది, కానీ వాటి నిర్మాణ సమగ్రతను పూర్తిగా కాపాడలేదు. అందువల్ల, చిన్న అణువుల స్క్రీనింగ్ తర్వాత, మా మీడియమ్‌కు 100 nM ట్రైఅయోడోథైరోనిన్ (T3) మరియు 1 μM డెక్సామెథాసోన్ (Dex) జోడించడం వల్ల ఆ భాగాల సూక్ష్మ నిర్మాణం 12 రోజుల పాటు నిలబెట్టబడిందని మేము కనుగొన్నాము. T3/Dex చికిత్సతో కలిపి, CTCM వ్యవస్థ ట్రాన్స్క్రిప్షనల్ ప్రొఫైల్స్, జీవశక్తి, జీవక్రియ కార్యకలాపాలు మరియు నిర్మాణ సమగ్రతను 12 రోజుల పాటు తాజా గుండె కణజాలంతో సమాన స్థాయిలో నిలబెట్టింది. దీనికి అదనంగా, కల్చర్‌లో గుండె కణజాలాన్ని అధికంగా సాగదీయడం హైపర్‌ట్రోఫిక్ కార్డియాక్ సిగ్నలింగ్‌ను ప్రేరేపిస్తుంది, ఇది గుండెను సాగదీయడం వల్ల కలిగే హైపర్‌ట్రోఫిక్ పరిస్థితులను అనుకరించగల CTCM సామర్థ్యానికి సాక్ష్యాన్ని అందిస్తుంది. ముగింపుగా, CTCM దీర్ఘకాలం పాటు కల్చర్‌లో గుండె యొక్క శరీరధర్మశాస్త్రం మరియు వ్యాధి శరీరధర్మశాస్త్రాన్ని నమూనాగా రూపొందించగలదు, ఇది విశ్వసనీయమైన ఔషధ స్క్రీనింగ్‌ను సాధ్యం చేస్తుంది.
క్లినికల్ పరిశోధనకు ముందు, మానవ గుండె యొక్క శారీరక వాతావరణాన్ని ఖచ్చితంగా పునరుత్పత్తి చేయగల విశ్వసనీయమైన ఇన్ విట్రో వ్యవస్థలు అవసరం. అటువంటి వ్యవస్థలు మార్పు చెందిన యాంత్రిక సాగుదల, హృదయ స్పందన రేటు మరియు ఎలక్ట్రోఫిజియోలాజికల్ లక్షణాలను అనుకరించాలి. కార్డియాక్ ఫిజియాలజీ కోసం జంతు నమూనాలను సాధారణంగా స్క్రీనింగ్ ప్లాట్‌ఫారమ్‌గా ఉపయోగిస్తారు, కానీ మానవ గుండెలో మందుల ప్రభావాలను ప్రతిబింబించడంలో వాటి విశ్వసనీయత పరిమితంగా ఉంటుంది¹,². అంతిమంగా, ఆదర్శ కార్డియాక్ టిష్యూ కల్చర్ ప్రయోగాత్మక నమూనా (CTCM) అనేది వివిధ చికిత్సా మరియు ఔషధ జోక్యాల కోసం అత్యంత సున్నితమైన మరియు నిర్దిష్టమైన ఒక నమూనా, ఇది మానవ గుండె యొక్క ఫిజియాలజీ మరియు పాథోఫిజియాలజీని ఖచ్చితంగా పునరుత్పత్తి చేస్తుంది³. అటువంటి వ్యవస్థ లేకపోవడం గుండె వైఫల్యానికి కొత్త చికిత్సల ఆవిష్కరణను పరిమితం చేస్తుంది⁴,⁵ మరియు ఔషధ కార్డియోటాక్సిసిటీని మార్కెట్ నుండి నిష్క్రమించడానికి ఒక ప్రధాన కారణంగా మార్చింది⁶.
గత దశాబ్దంలో, ఎనిమిది హృదయసంబంధం కాని మందులను వైద్యపరమైన వాడకం నుండి ఉపసంహరించుకున్నారు, ఎందుకంటే అవి QT విరామాన్ని పొడిగించి, జఠరిక అరిథ్మియాలు మరియు ఆకస్మిక మరణానికి దారితీస్తాయి7. అందువల్ల, హృదయసంబంధ ప్రభావశీలత మరియు విషప్రభావాలను అంచనా వేయడానికి విశ్వసనీయమైన ప్రీ-క్లినికల్ స్క్రీనింగ్ వ్యూహాల అవసరం పెరుగుతోంది. ఔషధ స్క్రీనింగ్ మరియు విషప్రభావ పరీక్షలో మానవ-ప్రేరిత ప్లూరిపోటెంట్ స్టెమ్ సెల్-ఉత్పన్న కార్డియోమయోసైట్‌ల (hiPS-CM) ఇటీవలి వాడకం ఈ సమస్యకు పాక్షిక పరిష్కారాన్ని అందిస్తుంది. అయితే, hiPS-CMల అపరిపక్వ స్వభావం మరియు గుండె కణజాలంలో ఉండే బహుకణ సంక్లిష్టత లేకపోవడం ఈ పద్ధతికి ప్రధాన పరిమితులు. స్వచ్ఛంద సంకోచాలు ప్రారంభమైన వెంటనే గుండె కణజాల హైడ్రోజెల్‌లను ఏర్పరచడానికి ప్రారంభ hiPS-CMలను ఉపయోగించడం మరియు కాలక్రమేణా విద్యుత్ ప్రేరణను క్రమంగా పెంచడం ద్వారా ఈ పరిమితిని పాక్షికంగా అధిగమించవచ్చని ఇటీవలి అధ్యయనాలు చూపించాయి. అయితే, ఈ hiPS-CM మైక్రోటిష్యూలలో వయోజన మయోకార్డియం యొక్క పరిపక్వ ఎలక్ట్రోఫిజియోలాజికల్ మరియు సంకోచ లక్షణాలు ఉండవు. దీనికి అదనంగా, మానవ గుండె కణజాలం మరింత సంక్లిష్టమైన నిర్మాణాన్ని కలిగి ఉంటుంది, ఇందులో ఎండోథెలియల్ కణాలు, న్యూరాన్లు మరియు స్ట్రోమల్ ఫైబ్రోబ్లాస్ట్‌లతో సహా వివిధ రకాల కణాల సజాతీయ మిశ్రమం ఉంటుంది, ఇవి నిర్దిష్టమైన ఎక్స్‌ట్రాసెల్యులార్ మ్యాట్రిక్స్ ప్రోటీన్ల సముదాయాల ద్వారా ఒకదానికొకటి అనుసంధానించబడి ఉంటాయి. వయోజన క్షీరదాల గుండెలో కార్డియోమయోసైట్ కాని కణ సమూహాల యొక్క ఈ సజాతీయత లేకపోవడం, వ్యక్తిగత కణ రకాలను ఉపయోగించి గుండె కణజాలాన్ని నమూనాగా రూపొందించడానికి ఒక ప్రధాన అడ్డంకిగా ఉంది. ఈ ప్రధాన పరిమితులు, శారీరక మరియు వ్యాధి సంబంధిత పరిస్థితులలో చెక్కుచెదరని మయోకార్డియల్ కణజాలాన్ని పెంచే పద్ధతులను అభివృద్ధి చేయవలసిన ప్రాముఖ్యతను నొక్కి చెబుతున్నాయి.
మానవ గుండె యొక్క కల్చర్ చేయబడిన పలుచని (300 µm) విభాగాలు, చెక్కుచెదరని మానవ మయోకార్డియమ్‌కు ఒక ఆశాజనకమైన నమూనాగా నిరూపించబడ్డాయి. ఈ పద్ధతి మానవ గుండె కణజాలాన్ని పోలిన పూర్తి 3D బహుకణ వ్యవస్థకు ప్రాప్యతను అందిస్తుంది. అయితే, 2019 వరకు, కల్చర్ చేయబడిన గుండె విభాగాల వాడకం వాటి తక్కువ (24 గంటల) కల్చర్ మనుగడ కారణంగా పరిమితంగా ఉండేది. భౌతిక-యాంత్రిక సాగుదల లేకపోవడం, గాలి-ద్రవ ఇంటర్‌ఫేస్, మరియు గుండె కణజాల అవసరాలకు మద్దతు ఇవ్వని సాధారణ మీడియా వాడకం వంటి అనేక కారణాల వల్ల ఇది జరిగింది. 2019లో, గుండె కణజాల కల్చర్ వ్యవస్థలలో యాంత్రిక కారకాలను చేర్చడం వల్ల కల్చర్ జీవితాన్ని పొడిగించవచ్చని, కార్డియాక్ ఎక్స్‌ప్రెషన్‌ను మెరుగుపరచవచ్చని, మరియు కార్డియాక్ పాథాలజీని అనుకరించవచ్చని అనేక పరిశోధన బృందాలు నిరూపించాయి. రెండు చక్కటి అధ్యయనాలు 17 మరియు 18, కల్చర్ సమయంలో ఏక-అక్ష యాంత్రిక లోడింగ్ కార్డియాక్ ఫినోటైప్‌పై సానుకూల ప్రభావాన్ని చూపుతుందని చూపిస్తున్నాయి. అయితే, ఈ అధ్యయనాలు కార్డియాక్ సైకిల్ యొక్క డైనమిక్ త్రిమితీయ భౌతిక-యాంత్రిక లోడింగ్‌ను ఉపయోగించలేదు, ఎందుకంటే గుండె విభాగాలను ఐసోమెట్రిక్ తన్యత బలాలతో 17 లేదా లీనియర్ ఆక్సోటోనిక్ లోడింగ్‌తో 18 లోడ్ చేశారు. ఈ కణజాల సాగదీత పద్ధతులు అనేక కార్డియాక్ జన్యువుల అణచివేతకు లేదా అసాధారణ సాగదీత ప్రతిస్పందనలతో సంబంధం ఉన్న జన్యువుల అతివ్యక్తీకరణకు దారితీశాయి. ముఖ్యంగా, పిటౌలిస్ మరియు ఇతరులు 19 ఫోర్స్ ట్రాన్స్‌డ్యూసర్ ఫీడ్‌బ్యాక్ మరియు టెన్షన్ డ్రైవ్‌లను ఉపయోగించి కార్డియాక్ సైకిల్ పునర్నిర్మాణం కోసం ఒక డైనమిక్ హార్ట్ స్లైస్ కల్చర్ బాత్‌ను అభివృద్ధి చేశారు. ఈ వ్యవస్థ మరింత కచ్చితమైన ఇన్ విట్రో కార్డియాక్ సైకిల్ మోడలింగ్‌కు అనుమతించినప్పటికీ, ఈ పద్ధతి యొక్క సంక్లిష్టత మరియు తక్కువ థ్రూపుట్ ఈ వ్యవస్థ యొక్క అనువర్తనాన్ని పరిమితం చేస్తాయి. మా ప్రయోగశాల ఇటీవల పంది మరియు మానవ గుండె కణజాల విభాగాల జీవశక్తిని 6 రోజుల వరకు నిర్వహించడానికి విద్యుత్ ఉద్దీపన మరియు ఆప్టిమైజ్ చేసిన మాధ్యమాన్ని ఉపయోగించి ఒక సరళీకృత కల్చర్ వ్యవస్థను అభివృద్ధి చేసింది20,21.
ప్రస్తుత మాన్యుస్క్రిప్ట్‌లో, హృదయ చక్రం సమయంలో త్రిమితీయ హృదయ శరీరధర్మశాస్త్రం మరియు పాథోఫిజియోలాజికల్ డిస్టెన్షన్‌ను పునఃసృష్టించడానికి హ్యూమోరల్ క్యూస్‌ను పొందుపరిచే పంది గుండె భాగాలను ఉపయోగించి ఒక కార్డియాక్ టిష్యూ కల్చర్ మోడల్ (CTCM)ను మేము వివరిస్తున్నాము. ప్రీ-క్లినికల్ డ్రగ్ టెస్టింగ్ కోసం క్షీరదాల గుండె యొక్క శరీరధర్మశాస్త్రం/పాథోఫిజియాలజీని అనుకరించే, తక్కువ ఖర్చుతో కూడిన, మిడ్-త్రూపుట్ కార్డియాక్ సిస్టమ్‌ను అందించడం ద్వారా, ఈ CTCM ప్రీ-క్లినికల్ డ్రగ్ ప్రిడిక్షన్ యొక్క కచ్చితత్వాన్ని మునుపెన్నడూ సాధించని స్థాయికి పెంచగలదు.
ఇన్ విట్రో 22,23,24 కార్డియోమయోసైట్ పనితీరును నిర్వహించడంలో హెమోడైనమిక్ మెకానికల్ సిగ్నల్స్ కీలక పాత్ర పోషిస్తాయి. ప్రస్తుత మాన్యుస్క్రిప్ట్‌లో, మేము ఒక CTCM (చిత్రం 1a)ను అభివృద్ధి చేశాము, ఇది శారీరక పౌనఃపున్యాల వద్ద (1.2 Hz, నిమిషానికి 72 బీట్స్) విద్యుత్ మరియు యాంత్రిక ఉద్దీపన రెండింటినీ ప్రేరేపించడం ద్వారా వయోజన హృదయ వాతావరణాన్ని అనుకరించగలదు. డయాస్టోల్ సమయంలో కణజాలం అధికంగా సాగడాన్ని నివారించడానికి, కణజాల పరిమాణాన్ని 25% పెంచడానికి 3D ప్రింటింగ్ పరికరాన్ని ఉపయోగించారు (చిత్రం 1b). హృదయ చక్రాన్ని పూర్తిగా పునరుత్పత్తి చేయడానికి, డేటా అక్విజిషన్ సిస్టమ్‌ను ఉపయోగించి, సిస్టోల్‌కు 100 ms ముందు ప్రారంభమయ్యేలా C-PACE సిస్టమ్ ద్వారా ప్రేరేపించబడిన ఎలక్ట్రికల్ పేసింగ్‌ను సమయబద్ధం చేశారు. ఈ టిష్యూ కల్చర్ సిస్టమ్, ఎగువ గదిలోని గుండె ముక్కల విస్తరణకు కారణమయ్యేలా, ఒక ఫ్లెక్సిబుల్ సిలికాన్ పొరను చక్రీయంగా విస్తరించడానికి ప్రోగ్రామబుల్ న్యూమాటిక్ యాక్యుయేటర్‌ను (LB ఇంజనీరింగ్, జర్మనీ) ఉపయోగిస్తుంది. ఈ వ్యవస్థను ఒక ప్రెషర్ ట్రాన్స్‌డ్యూసర్ ద్వారా బాహ్య గాలి మార్గానికి అనుసంధానించారు, దీనివల్ల పీడనాన్ని (± 1 mmHg) మరియు సమయాన్ని (± 1 ms) ఖచ్చితంగా సర్దుబాటు చేయడం సాధ్యమైంది (పటం 1c).
a పరికరం యొక్క కల్చర్ ఛాంబర్ లోపల, నీలం రంగులో చూపిన 7 మి.మీ. సపోర్ట్ రింగ్‌కు కణజాల విభాగాన్ని జత చేయండి. కల్చర్ ఛాంబర్, ఎయిర్ ఛాంబర్ నుండి ఒక పలుచని, సాగే గుణం గల సిలికాన్ పొర ద్వారా వేరు చేయబడి ఉంటుంది. లీక్‌లను నివారించడానికి ప్రతి ఛాంబర్ మధ్య ఒక గాస్కెట్‌ను ఉంచండి. పరికరం యొక్క మూతలో విద్యుత్ ప్రేరణను అందించే గ్రాఫైట్ ఎలక్ట్రోడ్‌లు ఉంటాయి. b పెద్ద కణజాల పరికరం, గైడ్ రింగ్ మరియు సపోర్ట్ రింగ్ యొక్క రేఖాచిత్ర ప్రాతినిధ్యం. కణజాల విభాగాలు (గోధుమ రంగు) పెద్ద పరికరంపై ఉంచబడతాయి, గైడ్ రింగ్ పరికరం యొక్క బయటి అంచున ఉన్న గాడిలో ఉంచబడుతుంది. గైడ్‌ను ఉపయోగించి, టిష్యూ యాక్రిలిక్ అంటుకునే పదార్థంతో పూసిన సపోర్ట్ రింగ్‌ను గుండె కణజాల విభాగంపై జాగ్రత్తగా ఉంచండి. c ప్రోగ్రామబుల్ న్యూమాటిక్ యాక్యుయేటర్ (PPD) ద్వారా నియంత్రించబడే ఎయిర్ ఛాంబర్ పీడనం యొక్క ఫంక్షన్‌గా విద్యుత్ ప్రేరణ సమయాన్ని చూపే గ్రాఫ్. పీడన సెన్సార్లను ఉపయోగించి విద్యుత్ ప్రేరణను సమకాలీకరించడానికి ఒక డేటా సేకరణ పరికరం ఉపయోగించబడింది. కల్చర్ ఛాంబర్‌లోని పీడనం సెట్ చేసిన థ్రెషోల్డ్‌కు చేరుకున్నప్పుడు, విద్యుత్ ప్రేరణను ప్రేరేపించడానికి C-PACE-EMకు ఒక పల్స్ సిగ్నల్ పంపబడుతుంది. d ఇంక్యుబేటర్ షెల్ఫ్‌పై ఉంచిన నాలుగు CTCMల చిత్రం. నాలుగు పరికరాలు ఒక PPDకి వాయు ప్రసరణ వలయం ద్వారా అనుసంధానించబడి ఉంటాయి, మరియు వాయు ప్రసరణ వలయంలోని పీడనాన్ని పర్యవేక్షించడానికి రక్తస్రావ నివారణ కవాటంలోకి పీడన సెన్సార్లు చొప్పించబడి ఉంటాయి. ప్రతి పరికరంలో ఆరు కణజాల విభాగాలు ఉంటాయి.
ఒకే న్యూమాటిక్ యాక్యుయేటర్‌ను ఉపయోగించి, మేము 4 CTCM పరికరాలను నియంత్రించగలిగాము, వీటిలో ప్రతి ఒక్కటి 6 కణజాల విభాగాలను కలిగి ఉండగలదు (పటం 1డి). CTCMలో, గాలి గదిలోని గాలి పీడనం ద్రవ గదిలో సమకాలిక పీడనంగా మార్చబడుతుంది మరియు గుండె ముక్క యొక్క శారీరక విస్తరణను ప్రేరేపిస్తుంది (పటం 2ఎ మరియు అనుబంధ చలనచిత్రం 1). 80 mm Hg వద్ద కణజాల సాగుదల మూల్యాంకనం కణజాల విభాగాలలో 25% సాగుదలను చూపించింది (పటం 2బి). ఈ శాతం సాగుదల సాధారణ కార్డియాక్ సెక్షన్ సంకోచశక్తికి 2.2–2.3 µm శారీరక సార్కోమెర్ పొడవుకు అనుగుణంగా ఉంటుందని చూపబడింది¹⁷,¹⁹,²⁵. కస్టమ్ కెమెరా సెట్టింగ్‌లను ఉపయోగించి కణజాల కదలిక అంచనా వేయబడింది (అనుబంధ పటం 1). కణజాల కదలిక యొక్క వ్యాప్తి మరియు వేగం (పటం 2సి, డి) కార్డియాక్ సైకిల్ సమయంలో సాగుదలకు మరియు సిస్టోల్ మరియు డయాస్టోల్ సమయంలోని సమయానికి అనుగుణంగా ఉన్నాయి (పటం 2బి). కల్చర్‌లో 12 రోజుల పాటు సంకోచం మరియు సడలింపు సమయంలో గుండె కణజాలం యొక్క సాగుదల మరియు వేగం స్థిరంగా ఉన్నాయి (పటం 2f). కల్చర్ సమయంలో సంకోచశక్తిపై విద్యుత్ ఉద్దీపన ప్రభావాన్ని అంచనా వేయడానికి, మేము షేడింగ్ అల్గారిథమ్‌ను ఉపయోగించి క్రియాశీల వైకల్యాన్ని నిర్ధారించే పద్ధతిని అభివృద్ధి చేశాము (అనుబంధ పటం 2a,b) మరియు విద్యుత్ ఉద్దీపనతో మరియు లేకుండా ఉన్న వైకల్యాల మధ్య తేడాను గుర్తించగలిగాము. గుండె యొక్క అదే భాగం (పటం 2f). కోత యొక్క కదిలే ప్రాంతంలో (R6-9), విద్యుత్ ఉద్దీపన సమయంలో వోల్టేజ్, విద్యుత్ ఉద్దీపన లేని సమయం కంటే 20% ఎక్కువగా ఉంది, ఇది సంకోచ పనితీరుకు విద్యుత్ ఉద్దీపన యొక్క దోహదాన్ని సూచిస్తుంది.
గాలి గది పీడనం, ద్రవ గది పీడనం మరియు కణజాల కదలిక కొలతల యొక్క ప్రాతినిధ్య జాడలు, గది పీడనం ద్రవ గది పీడనాన్ని మారుస్తుందని, తద్వారా కణజాల ముక్క యొక్క సంబంధిత కదలికకు కారణమవుతుందని నిర్ధారిస్తున్నాయి. బి) శాతం సాగుదల (నారింజ)కు అనుగుణంగా ఉండే కణజాల విభాగాల శాతం సాగుదల (నీలం) యొక్క ప్రాతినిధ్య జాడలు. సి) గుండె ముక్క యొక్క కొలవబడిన కదలిక, కొలవబడిన కదలిక వేగంతో స్థిరంగా ఉంది. (డి) గుండె ముక్కలో చక్రీయ కదలిక (నీలం గీత) మరియు వేగం (నారింజ చుక్కల గీత) యొక్క ప్రాతినిధ్య పథాలు. ఇ) చక్రీయ సమయం (n = ప్రతి సమూహానికి 19 ముక్కలు, వేర్వేరు పందుల నుండి), సంకోచ సమయం (n = ప్రతి సమూహానికి 19 ముక్కలు), సడలింపు సమయం (n = ప్రతి సమూహానికి 19 ముక్కలు, వేర్వేరు పందుల నుండి), కణజాల కదలిక (n = 25 ముక్కలు/సమూహం వేర్వేరు పందుల నుండి), గరిష్ట సిస్టోలిక్ వేగం (n = 24(D0), 25(D12) ముక్కలు/సమూహం వేర్వేరు పందుల నుండి) మరియు గరిష్ట సడలింపు రేటు (n=24(D0), 25(D12) ముక్కలు/సమూహం వేర్వేరు పందుల నుండి) యొక్క పరిమాణీకరణ. రెండు-తోకల స్టూడెంట్స్ t-పరీక్ష ఏ పరామితిలోనూ గణనీయమైన వ్యత్యాసాన్ని చూపలేదు. f విద్యుత్ ప్రేరణతో (ఎరుపు) మరియు లేకుండా (నీలం) ఉన్న కణజాల విభాగాల యొక్క ప్రతినిధి స్ట్రెయిన్ విశ్లేషణ ట్రేస్‌లు, ఒకే విభాగం నుండి పది ప్రాంతీయ కణజాల ప్రాంతాలు. దిగువ ప్యానెల్‌లు వేర్వేరు విభాగాల నుండి పది ప్రాంతాలలో విద్యుత్ ప్రేరణతో మరియు లేకుండా ఉన్న కణజాల విభాగాలలో స్ట్రెయిన్‌లోని శాతం వ్యత్యాసం యొక్క పరిమాణీకరణను చూపుతాయి. (వివిధ పందుల నుండి ఒక్కో సమూహానికి n = 8 ముక్కలు, టూ-టెయిల్డ్ స్టూడెంట్ t-టెస్ట్ నిర్వహించబడింది; ****p < 0.0001, **p < 0.01, *p < 0.05). (వివిధ పందుల నుండి ఒక్కో సమూహానికి n = 8 ముక్కలు, టూ-టెయిల్డ్ స్టూడెంట్ t-టెస్ట్ నిర్వహించబడింది; ****p < 0.0001, **p < 0.01, *p < 0.05). (n = 8 срезов/группу от разных свиней, проводится двусторонний t-критерий Стьюдента; **p<0,0001, **p<001, **p<001, **,<00). (వివిధ పందుల నుండి ఒక్కో సమూహానికి n = 8 విభాగాలు, రెండు-వైపుల స్టూడెంట్స్ t-పరీక్ష; ****p<0.0001, **p<0.01, *p<0.05). n = 8 片/组,来自不同的猪,进行双尾学生t 检验；****p <0.0001,**p <0.01,*p <0.05） n = 8 片/组,来自不同的猪,进行双尾学生t 检验；****p <0.0001,**p <0.01,*p <0.05） (n = 8 срезов/группу, от разных свиней, двусторонний критерий Стьюдента; ****p <0,0001, **p <0,01, *p <0,05). (n = 8 విభాగాలు/సమూహం, వేర్వేరు పందుల నుండి, రెండు-వైపుల స్టూడెంట్స్ t-పరీక్ష; ****p<0.0001, **p<0.01, *p<0.05).ఎర్రర్ బార్‌లు సగటు ± ప్రామాణిక విచలనాన్ని సూచిస్తాయి.
మా మునుపటి స్టాటిక్ బయోమిమెటిక్ హార్ట్ స్లైస్ కల్చర్ సిస్టమ్‌లో [20, 21], మేము విద్యుత్ ఉద్దీపనను వర్తింపజేయడం మరియు మాధ్యమం కూర్పును ఆప్టిమైజ్ చేయడం ద్వారా 6 రోజుల పాటు గుండె స్లైస్‌ల యొక్క జీవశక్తి, పనితీరు మరియు నిర్మాణ సమగ్రతను నిర్వహించాము. అయితే, 10 రోజుల తర్వాత, ఈ గణాంకాలు తీవ్రంగా పడిపోయాయి. మేము మా మునుపటి స్టాటిక్ బయోమిమెటిక్ కల్చర్ సిస్టమ్ 20, 21లో కల్చర్ చేసిన విభాగాలను నియంత్రణ పరిస్థితులు (Ctrl)గా సూచిస్తాము మరియు మేము మా గతంలో ఆప్టిమైజ్ చేసిన మాధ్యమాన్ని MC పరిస్థితులుగా మరియు ఏకకాల యాంత్రిక మరియు విద్యుత్ ఉద్దీపన (CTCM) కింద కల్చర్‌గా ఉపయోగిస్తాము. మొదట, విద్యుత్ ఉద్దీపన లేకుండా యాంత్రిక ఉద్దీపన 6 రోజుల పాటు కణజాల జీవశక్తిని నిర్వహించడానికి సరిపోదని మేము నిర్ధారించాము (సప్లిమెంటరీ ఫిగర్ 3a,b). ఆసక్తికరంగా, STCM ఉపయోగించి భౌతిక-యాంత్రిక మరియు విద్యుత్ ఉద్దీపనను ప్రవేశపెట్టడంతో, 12-రోజుల గుండె విభాగాల జీవశక్తి MS పరిస్థితులలో తాజా గుండె విభాగాలలో ఉన్నట్లే ఉంది, కానీ Ctrl పరిస్థితులలో అలా లేదు, ఇది MTT విశ్లేషణ ద్వారా చూపబడింది (ఫిగర్ 1). 3a). యాంత్రిక ప్రేరణ మరియు హృదయ చక్రం యొక్క అనుకరణ, మా మునుపటి స్టాటిక్ కల్చర్ సిస్టమ్‌లో నివేదించిన దాని కంటే రెండు రెట్లు ఎక్కువ కాలం పాటు కణజాల విభాగాలను సజీవంగా ఉంచగలవని ఇది సూచిస్తుంది. అయితే, కార్డియాక్ ట్రోపోనిన్ T మరియు కనెక్సిన్ 43 యొక్క ఇమ్యునోలేబలింగ్ ద్వారా కణజాల విభాగాల నిర్మాణ సమగ్రతను అంచనా వేయగా, అదే రోజున ఉన్న నియంత్రణలతో పోలిస్తే 12వ రోజున MC కణజాలాలలో కనెక్సిన్ 43 వ్యక్తీకరణ గణనీయంగా ఎక్కువగా ఉందని తేలింది. అయినప్పటికీ, ఏకరీతి కనెక్సిన్ 43 వ్యక్తీకరణ మరియు Z-డిస్క్ నిర్మాణం పూర్తిగా కొనసాగలేదు (Fig. 3b). మేము కణజాల నిర్మాణ సమగ్రతను పరిమాణీకరించడానికి ఒక కృత్రిమ మేధస్సు (AI) ఫ్రేమ్‌వర్క్‌ను ఉపయోగిస్తాము26, ఇది ట్రోపోనిన్-T మరియు కనెక్సిన్ స్టెయినింగ్43 ఆధారంగా రూపొందించబడిన ఒక ఇమేజ్-ఆధారిత డీప్ లెర్నింగ్ పైప్‌లైన్. ఇది హృదయ స్లైస్‌ల నిర్మాణ సమగ్రతను మరియు ఫ్లోరోసెన్స్‌ను స్థానికీకరణ బలం పరంగా స్వయంచాలకంగా పరిమాణీకరిస్తుంది. ఈ పద్ధతి, రిఫరెన్స్ 26లో వివరించినట్లుగా, హృదయ కణజాలం యొక్క నిర్మాణ సమగ్రతను స్వయంచాలకంగా మరియు నిష్పాక్షిక పద్ధతిలో విశ్వసనీయంగా పరిమాణీకరించడానికి ఒక కన్వల్యూషనల్ న్యూరల్ నెట్‌వర్క్ (CNN) మరియు ఒక డీప్ లెర్నింగ్ ఫ్రేమ్‌వర్క్‌ను ఉపయోగిస్తుంది. స్టాటిక్ కంట్రోల్ విభాగాలతో పోలిస్తే MC కణజాలం 0వ రోజుతో మెరుగైన నిర్మాణ సారూప్యతను చూపించింది. అదనంగా, మాసన్ ట్రైక్రోమ్ స్టెయినింగ్ ద్వారా కల్చర్ యొక్క 12వ రోజున కంట్రోల్ పరిస్థితులతో పోలిస్తే MS పరిస్థితులలో ఫైబ్రోసిస్ శాతం గణనీయంగా తక్కువగా ఉన్నట్లు వెల్లడైంది (Fig. 3c). CTCM 12వ రోజున గుండె కణజాల విభాగాల జీవశక్తిని తాజా గుండె కణజాలం స్థాయికి సమానంగా పెంచినప్పటికీ, అది గుండె విభాగాల నిర్మాణ సమగ్రతను గణనీయంగా మెరుగుపరచలేదు.
బార్ గ్రాఫ్ తాజా గుండె ముక్కల (D0) లేదా స్టాటిక్ కల్చర్ (D12 Ctrl) లేదా CTCM (D12 MC) లో 12 రోజుల పాటు కల్చర్ చేసిన గుండె ముక్కల యొక్క MTT వయబిలిటీ పరిమాణీకరణను చూపుతుంది (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) ముక్కలు/సమూహం వేర్వేరు పందుల నుండి, వన్ వే ANOVA పరీక్ష నిర్వహించబడింది; ####p < 0.0001 D0 తో పోలిస్తే మరియు **p < 0.01 D12 Ctrl తో పోలిస్తే). బార్ గ్రాఫ్ తాజా గుండె ముక్కల (D0) లేదా స్టాటిక్ కల్చర్ (D12 Ctrl) లేదా CTCM (D12 MC) లో 12 రోజుల పాటు కల్చర్ చేసిన గుండె ముక్కల యొక్క MTT వయబిలిటీ పరిమాణీకరణను చూపుతుంది (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) ముక్కలు/సమూహం వేర్వేరు పందుల నుండి, వన్ వే ANOVA పరీక్ష నిర్వహించబడింది; ####p < 0.0001 D0 తో పోలిస్తే మరియు **p < 0.01 D12 Ctrl తో పోలిస్తే).హిస్టోగ్రామ్ వివిధ పందుల నుండి తీసుకున్న MTT తాజా గుండె భాగాల (D0) లేదా స్టాటిక్ కల్చర్ (D12 కంట్రోల్) లేదా CTCM (D12 MC) లలో 12 రోజుల పాటు కల్చర్ చేసిన గుండె భాగాల యొక్క జీవసామర్థ్యం యొక్క పరిమాణీకరణను చూపుతుంది (n = 18 (D0), 15 (D12 కంట్రోల్). ), ప్రతి సమూహానికి 12 (D12 MC) భాగాలు, ఒక-మార్గం ANOVA పరీక్ష నిర్వహించబడింది;####p <0,0001 по сравнению с D0 и **p <0,01 по сравнению с D12 Ctrl). D0 తో పోల్చినప్పుడు ####p < 0.0001 మరియు D12 Ctrl తో పోల్చినప్పుడు **p < 0.01). a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏(形心脏)或心脏切片培养12 天的MTT 活力的量化),来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组,进行测试；与D0 相比,####p < 0.0001,与D12 Ctrl 相比,**p <0.01)。 a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏(形心脏) ，来自不同猪的12 (D12 MC)తాజా గుండె భాగాలలో (D0) లేదా స్టాటిక్ కల్చర్‌లో 12 రోజులు పెంచిన గుండె భాగాలలో (D12 కంట్రోల్) లేదా CTCM (D12 MC) లలో MTT వయబిలిటీ యొక్క పరిమాణీకరణను చూపించే హిస్టోగ్రామ్ (n = 18 (D0), 15 (D12 కంట్రోల్)), వేర్వేరు పందుల నుండి ఒక్కో సమూహానికి 12 (D12 MC) భాగాలు, వన్-వే ANOVA పరీక్ష;####p <0,0001 по сравнению с D0, **p <0,01 по сравнению с D12 Ctrl). D0 తో పోలిస్తే p < 0.0001, D12 Ctrl తో పోలిస్తే p < 0.01.తాజాగా వేరుచేసిన గుండె భాగాలలో (D0) లేదా 12 రోజుల పాటు స్టాటిక్ పరిస్థితులలో (Ctrl) లేదా CTCM పరిస్థితులలో (MC) కల్చర్ చేయబడిన గుండె భాగాలలో (ట్రోపోనిన్-టి (ఆకుపచ్చ), కనెక్సిన్ 43 (ఎరుపు) మరియు DAPI (నీలం)) ప్రాతినిధ్య ఇమ్యునోఫ్లోరోసెన్స్ చిత్రాలు (బ్లాంక్ స్కేల్ = 100 µm). గుండె కణజాలం యొక్క నిర్మాణ సమగ్రతను కృత్రిమ మేధస్సు ద్వారా పరిమాణీకరించడం (వివిధ పందుల నుండి ఒక్కో సమూహం నుండి n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) స్లైస్‌లు, వన్-వే ANOVA పరీక్ష నిర్వహించబడింది; D0 తో పోలిస్తే ####p < 0.0001 మరియు D12 Ctrl తో పోలిస్తే ****p < 0.0001). గుండె కణజాలం యొక్క నిర్మాణ సమగ్రతను కృత్రిమ మేధస్సు ద్వారా పరిమాణీకరించడం (వివిధ పందుల నుండి ప్రతి సమూహం నుండి n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) స్లైస్‌లు, వన్-వే ANOVA పరీక్ష నిర్వహించబడింది; D0 తో పోలిస్తే ####p < 0.0001 మరియు D12 Ctrl తో పోలిస్తే ****p < 0.0001). కోలిచెస్ట్‌వెన్నాయ ఆసెంకా స్ట్రక్చర్ స్ట్రక్చర్ సర్డెచ్నొస్టి సెర్డెచ్నోయి ట్కాని ఐస్కూస్ట్‌వెనిమ్ ఇంటెలెక్టోమ్ (n = 71Dl), (n = 71Dl), MC) срезов/groupp от разных స్వినీ, ప్రోవోడిట్సియా ఓడ్నోఫ్యాక్టోర్నియస్ టేస్ట్ ANOVA; ####p <0,0001 по сравнению с D0 మరియు ****p <0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). కృత్రిమ మేధస్సు ద్వారా గుండె కణజాలం యొక్క నిర్మాణ సమగ్రతను పరిమాణీకరించడం (వివిధ పందుల నుండి n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) విభాగాలు/సమూహాలు, వన్-వే ANOVA పరీక్ష నిర్వహించబడింది; ####p < 0.0001 vs. D0 మరియు ****p < 0.0001 D12 Ctrl తో పోల్చితే).人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) స్లైసులు/వివిధ పంది ప్రతి ఒక్కటి, ఒక-మార్గం 与 1#000 పరీక్ష;相比,****p <0.0001 与D12 Ctrl 相比）。人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) స్లైస్‌లు/వివిధ పందుల ప్రతి సమూహం, వన్-వే 1#00 పరీక్ష;与D0相比,**p <0.0001 与D12 Ctrl 相比）。 కోలిచెస్ట్‌వెన్నోయ్ ఒషెంకి స్ట్రక్చర్నోస్టి సెర్డెచ్నోయి ట్కాని (120l) (n =7l) (D12 MC) అనోవా ####p <0,0001 vs. D0. గుండె కణజాలం యొక్క నిర్మాణ సమగ్రతను లెక్కించడానికి కృత్రిమ మేధస్సు (వివిధ పందుల నుండి ఒక్కో సమూహానికి n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) విభాగాలు, వన్-వే ANOVA పరీక్ష; ####పోలిక కోసం D0 తో పోలిస్తే p<0.0001 ****D12 Ctrl తో పోలిస్తే p < 0.0001). c మాసన్ ట్రైక్రోమ్ స్టెయిన్‌తో రంగు వేసిన గుండె ముక్కల ప్రతినిధి చిత్రాలు (ఎడమ) మరియు పరిమాణీకరణ (కుడి) (బేస్ స్కేల్ = 500 µm) (n = వేర్వేరు పందుల నుండి ఒక్కో సమూహానికి 10 ముక్కలు, వన్-వే ANOVA పరీక్ష నిర్వహించబడింది; ####D0 తో పోలిస్తే p < 0.0001 మరియు ***D12 Ctrl తో పోలిస్తే p < 0.001). c మాసన్ ట్రైక్రోమ్ స్టెయిన్‌తో రంగు వేసిన గుండె ముక్కల ప్రతినిధి చిత్రాలు (ఎడమ) మరియు పరిమాణీకరణ (కుడి) (బేస్ స్కేల్ = 500 µm) (వివిధ పందుల నుండి ఒక్కో సమూహానికి n = 10 ముక్కలు, వన్-వే ANOVA పరీక్ష నిర్వహించబడింది; #### D0 తో పోలిస్తే p < 0.0001 మరియు ***D12 Ctrl తో పోలిస్తే p < 0.001). c ప్రెజెంటేషన్ ఐసోబ్రాజేనియా (స్లేవా) మరియు కోలిచెస్ట్‌వెన్న ఒసెన్కా (స్ప్రవా) స్రెజోవ్ సెర్డ్సా, ఓక్రాస్సెన్స్ krasitelem మస్సోనా (మౌఖికంగా జవాబు చెప్పు = 500 mkm) (n = 10 శ్రేణులు/గ్రుప్పు నుండి రాజనీతి స్వినీ, వైపోల్నియాత్స్ ఓడినస్టొర్న్ <# వార్తలు; 0,0001 по сравнению с D0 и ***p < 0,001 по с D12 Ctrl). c మాసన్ ట్రైక్రోమ్ స్టెయిన్‌తో రంగు వేయబడిన గుండె భాగాల ప్రతినిధి చిత్రాలు (ఎడమ) మరియు పరిమాణీకరణ (కుడి) (పూత లేని స్కేల్ = 500 µm) (వివిధ పందుల నుండి ఒక్కో సమూహానికి n = 10 విభాగాలు, వన్-వే ANOVA పరీక్ష నిర్వహించబడింది; #### D0 తో పోలిస్తే p < 0.0001 మరియు ***D12 Ctrl తో పోలిస్తే p < 0.001). c 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像（左）和量化（右）（裦=55 10 个切片/组，每组来自不同的猪，进行单向ANOVA 测试；#### p <0.0001 与D0 相比, 0.0001相比). C 用 మాసన్ 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代 表性 （左 左） 量化 （右裸尺度 = 500 µm） （n = 10 个 切片 组 每 组 来自 不同 猪 , 进行 单向 单（ 单向0.0001 与D0 相比，***p <0.001 与D12 Ctrl 相比）。 c ప్రెజెంటేషన్ ఐసోబ్రాజేనియా (స్లేవా) మరియు కోలిచెస్ట్‌వెన్ని అనాలైజ్ (స్ప్రవా) స్రెజోవ్ సెర్ద్సా, ఓక్రాషెన్‌మెన్ క్రాసిటెలెమ్ మస్సోనా (చిస్తయా స్కాల = 500 ఎమ్‌కెఎమ్) (n = 10 స్రెజోవ్/గ్రుప్ప, డ్రూగోయ్ స్వినీ నుండి కడ్డీ, ప్రోటెస్టిరోవానో స్ పోమోషూక్స్ дисперсионного анализа ;### #p <0,0001 по сравнению с D0, ***p <0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c మాసన్ ట్రైక్రోమ్ స్టెయిన్‌తో రంగు వేయబడిన గుండె భాగాల ప్రతినిధి చిత్రాలు (ఎడమ) మరియు పరిమాణీకరణ (కుడి) (బ్లాంక్ = 500 µm) (n = 10 విభాగాలు/సమూహం, ప్రతి ఒక్కటి వేరొక పంది నుండి, వన్-వే అనాలిసిస్ ఆఫ్ వేరియెన్స్ ద్వారా పరీక్షించబడింది;### # D0 తో పోలిస్తే p < 0.0001, ***D12 Ctrl తో పోలిస్తే p < 0.001).ఎర్రర్ బార్‌లు సగటు ± ప్రామాణిక విచలనాన్ని సూచిస్తాయి.
కల్చర్ మీడియమ్‌కు చిన్న అణువులను జోడించడం ద్వారా, CTCM కల్చర్ సమయంలో కార్డియోమయోసైట్ సమగ్రతను మెరుగుపరచవచ్చని మరియు ఫైబ్రోసిస్ అభివృద్ధిని తగ్గించవచ్చని మేము ఊహించాము. అందువల్ల, గందరగోళ కారకాలు తక్కువగా ఉన్నందున, మేము మా స్టాటిక్ కంట్రోల్ కల్చర్‌లను20,21 ఉపయోగించి చిన్న అణువుల కోసం స్క్రీనింగ్ చేశాము. ఈ స్క్రీనింగ్ కోసం డెక్సామెథాసోన్ (డెక్స్), ట్రైఅయోడోథైరోనిన్ (T3), మరియు SB431542 (SB) లను ఎంచుకున్నాము. ఈ చిన్న అణువులను గతంలో hiPSC-CM కల్చర్‌లలో సార్కోమెర్ పొడవు, T-ట్యూబ్యూల్స్, మరియు ప్రసరణ వేగాన్ని పెంచడం ద్వారా కార్డియోమయోసైట్‌ల పరిపక్వతను ప్రేరేపించడానికి ఉపయోగించారు. అదనంగా, డెక్స్ (ఒక గ్లూకోకార్టికాయిడ్) మరియు SB రెండూ వాపును అణిచివేస్తాయని తెలుసు29,30. అందువల్ల, ఈ చిన్న అణువులలో ఒకటి లేదా వాటి కలయికను చేర్చడం వల్ల గుండె భాగాల నిర్మాణ సమగ్రత మెరుగుపడుతుందో లేదో మేము పరీక్షించాము. ప్రాథమిక స్క్రీనింగ్ కోసం, సెల్ కల్చర్ నమూనాలలో సాధారణంగా ఉపయోగించే గాఢతల ఆధారంగా ప్రతి సమ్మేళనం యొక్క మోతాదును ఎంపిక చేశారు (1 μM Dex27, 100 nM T327, మరియు 2.5 μM SB31). 12 రోజుల కల్చర్ తర్వాత, T3 మరియు Dexల కలయిక ఉత్తమమైన కార్డియోమయోసైట్ నిర్మాణ సమగ్రతకు మరియు కనిష్ట ఫైబ్రస్ పునర్నిర్మాణానికి దారితీసింది (అనుబంధ చిత్రాలు 4 మరియు 5). అదనంగా, సాధారణ గాఢతలతో పోలిస్తే T3 మరియు Dexల యొక్క ఈ గాఢతలకు రెట్టింపు లేదా అంతకంటే ఎక్కువ వాడకం హానికరమైన ప్రభావాలను కలిగించింది (అనుబంధ చిత్రం 6a,b).
ప్రాథమిక స్క్రీనింగ్ తర్వాత, మేము 4 కల్చర్ పరిస్థితులను (పటం 4ఎ) తల-నుండి-తల పోలిక చేసాము: Ctrl: మేము ముందుగా వివరించిన స్టాటిక్ కల్చర్‌లో, మా ఆప్టిమైజ్డ్ మీడియంను ఉపయోగించి పెంచిన గుండె భాగాలు; 20.21 TD: బుధవారం నాడు T3 మరియు Ctrl లకు డెక్స్ జోడించబడింది; MC: మేము ముందుగా ఆప్టిమైజ్ చేసిన మీడియంను ఉపయోగించి CTCMలో పెంచిన గుండె భాగాలు; మరియు MT: CTCM మీడియమ్‌కు T3 మరియు డెక్స్ జోడించబడింది. 12 రోజుల పెంపకం తర్వాత, MTT అస్సే ద్వారా అంచనా వేయగా, MS మరియు MT కణజాలాల జీవశక్తి తాజా కణజాలాలలో ఉన్నట్లే ఉంది (పటం 4బి). ఆసక్తికరంగా, ట్రాన్స్‌వెల్ కల్చర్‌లకు (TD) T3 మరియు డెక్స్ జోడించడం వల్ల Ctrl పరిస్థితులతో పోలిస్తే జీవశక్తిలో గణనీయమైన మెరుగుదల కనిపించలేదు, ఇది గుండె భాగాల జీవశక్తిని కాపాడుకోవడంలో యాంత్రిక ప్రేరణ యొక్క ముఖ్యమైన పాత్రను సూచిస్తుంది.
12 రోజుల పాటు మాధ్యమంపై యాంత్రిక ప్రేరణ మరియు T3/Dex అనుబంధం యొక్క ప్రభావాలను మూల్యాంకనం చేయడానికి ఉపయోగించిన నాలుగు కల్చర్ పరిస్థితులను వర్ణించే ప్రయోగాత్మక రూపకల్పన రేఖాచిత్రం. బి. తాజా గుండె ముక్కలతో (D0) పోల్చి చూసినప్పుడు, 4 కల్చర్ పరిస్థితులలో (Ctrl, TD, MC, మరియు MT) కల్చర్ చేసిన 12 రోజుల తర్వాత జీవశక్తి యొక్క పరిమాణీకరణను బార్ గ్రాఫ్ చూపిస్తుంది (వివిధ పందుల నుండి ఒక్కో సమూహానికి n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD మరియు D12 MT), 12 (D12 MC) ముక్కలు, వన్-వే ANOVA పరీక్ష నిర్వహించబడింది; D0 తో పోల్చినప్పుడు ####p < 0.0001, ###p < 0.001 మరియు D12 Ctrl తో పోల్చినప్పుడు **p < 0.01). బి. తాజా గుండె ముక్కలతో (D0) పోల్చి చూసినప్పుడు, 4 కల్చర్ పరిస్థితులలో (Ctrl, TD, MC, మరియు MT) కల్చర్ చేసిన 12 రోజుల తర్వాత జీవశక్తి యొక్క పరిమాణీకరణను బార్ గ్రాఫ్ చూపిస్తుంది (వివిధ పందుల నుండి ఒక్కో సమూహానికి n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD మరియు D12 MT), 12 (D12 MC) ముక్కలు, వన్-వే ANOVA పరీక్ష నిర్వహించబడింది; D0 తో పోల్చినప్పుడు ####p < 0.0001, ###p < 0.001 మరియు D12 ctrl తో పోల్చినప్పుడు **p < 0.01). b జిస్టోగ్రమ్మా పోకజ్‌వైట్ కోలిచెస్ట్‌వెన్నుయు ఒషెంకు జిజ్నెస్పోసోబ్నోస్టి చెర్జ్ 12 డేస్ పోస్లే కల్తీవింగ్ 4 условиях కల్తీవిరోవానియ (కాంట్రోల్, TD, MC మరియు MT) పో స్రావ్నెనియు ద్వారా స్వేజీమి శ్రేణి సెర్డాస్ (D0) (n = 18 (D0, D12 CtrT), 12 (D15) 12 (D12 MC) శ్రేణి/గ్రుప్పు నుండి రాజనీతి, అనోవా ####p <0,0001, ###p <0,001 по сравнению с D0 и **p <0,01 по сравнению с D12 Ctrl). బి. తాజా గుండె భాగాలతో (D0) పోల్చినప్పుడు, 4 కల్చర్ పరిస్థితులలో (కంట్రోల్, TD, MC, మరియు MT) కల్చర్ చేసిన 12 రోజుల తర్వాత జీవశక్తి యొక్క పరిమాణీకరణను బార్ గ్రాఫ్ చూపిస్తుంది (వివిధ పందుల నుండి ఒక్కో సమూహానికి n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD, మరియు D12 MT), 12 (D12 MC) భాగాలు, వన్-వే ANOVA పరీక్ష; ####p < 0.0001, ###p < 0.001 vs. D0 మరియు **p < 0.01 D12 Ctrl తో పోల్చినప్పుడు). b 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) (150) 18 (150) Ctrl、D12 TD 和D12 MT), 来自不同猪的12 (D12 MC)相比，**p <0.01 与D12控制).బి 4 12 (డి12 ఎంసి) b గీస్టోగ్రమ్మ, పోకజీవాయుష్యా నుండి 4 యూస్లోవియస్ కల్తీవిరోవానియ (కాంట్రోల్, TD, MC మరియు MT) క్రియేషన్స్ ద్వారా сердца (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD మరియు D12 MT), రాత్రి స్వినీ 12 (D12 MC) నుండి ####p <0,0001, ###p <0,001 по сравнению с D0, **p <0,01 по сравнению с контролем D12). బి. తాజా గుండె భాగాలతో (D0) పోల్చినప్పుడు 4 కల్చర్ పరిస్థితులను (కంట్రోల్, TD, MC మరియు MT) చూపించే హిస్టోగ్రామ్ (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD మరియు D12 MT), వేర్వేరు పందుల నుండి 12 (D12 MC) భాగాలు/సమూహం, వన్-వే ANOVA పరీక్ష; ####p<0.0001, ###p<0.001 vs. D0, **p<0.01 vs. కంట్రోల్ D12). c బార్ గ్రాఫ్, తాజా గుండె ముక్కలతో (D0) పోల్చినప్పుడు, 4 కల్చర్ పరిస్థితులలో (Ctrl, TD, MC, మరియు MT) కల్చర్ చేసిన 12 రోజుల తర్వాత గ్లూకోజ్ ఫ్లక్స్ యొక్క పరిమాణాన్ని చూపుతుంది (వివిధ పందుల నుండి ఒక్కో సమూహానికి n = 6 ముక్కలు, వన్-వే ANOVA పరీక్ష నిర్వహించబడింది; ###p < 0.001, D0 తో పోల్చినప్పుడు మరియు ***p < 0.001 D12 Ctrl తో పోల్చినప్పుడు). c బార్ గ్రాఫ్, తాజా గుండె ముక్కలతో (D0) పోల్చినప్పుడు, 4 కల్చర్ పరిస్థితులలో (Ctrl, TD, MC, మరియు MT) కల్చర్ చేసిన 12 రోజుల తర్వాత గ్లూకోజ్ ఫ్లక్స్ యొక్క పరిమాణాన్ని చూపుతుంది (వివిధ పందుల నుండి ఒక్కో సమూహానికి n = 6 ముక్కలు, వన్-వే ANOVA పరీక్ష నిర్వహించబడింది; ###p < 0.001, D0 తో పోల్చినప్పుడు మరియు ***p < 0.001 D12 Ctrl తో పోల్చినప్పుడు). c గిస్టోగ్రమ్మా పోకజ్వాయెట్ కోలిచెస్ట్వెన్నుయు ఒషెంకు పోటోకా గ్లికోజీ చెర్జ్ 12 రోజుల పోస్ట్ క్యూల్టైవ్4 условиях культивирования (కాంట్రోల్, TD, MC మరియు MT) శోధించడం ద్వారా స్వేఛిమి సెర్జామి సెర్డిసా (D0) (n = 6 శ్రేణులు/గ్రంధులు, శ్రేణులు Выpolnyaetся тест ANOVA <0,001 по; сравнению с D0 и ***p <0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c హిస్టోగ్రామ్, తాజా గుండె భాగాలతో (D0) పోల్చినప్పుడు, 4 కల్చర్ పరిస్థితులలో (కంట్రోల్, TD, MC మరియు MT) కల్చర్ చేసిన 12 రోజుల తర్వాత గ్లూకోజ్ ఫ్లక్స్ యొక్క పరిమాణాన్ని చూపుతుంది (వివిధ పందుల నుండి ఒక్కో సమూహానికి n = 6 భాగాలు, వన్-వే ANOVA పరీక్ష నిర్వహించబడింది; D0 తో పోల్చినప్పుడు ###p < 0.001 మరియు D12 Ctrl తో పోల్చినప్పుడు ***p < 0.001). సి天的葡萄糖通量定量（n = 6 片/组，来自不同猪，单向执行ANOVA 测试；###p <与 001, 0.001 与D12 Ctrl 相比). సి.培养 后 后 12 天 的 通量 定量 n = 6 片/组 , 来自 猪 ， ， ， , , , , , 猪 猪 挪 捕 测试；###p <0.001,与D0 相比,***p <0.001 与D12 Ctrl 相比）。 c గీస్టోగ్రమ్మ, పోకజీవాయుష్య కోలిచెస్ట్వెన్నుయు ఒషెంకు పోటోకా గ్లుకోజీ చెరెజ్ 12 డేవిడ్ పోస్ట్ 4 условий కల్తీవిరోవానియ (కాంట్రోల్, TD, MC మరియు MT) పో స్రావనీయు ద్వారా స్వేఛిమి శ్రేణి సెర్డాస్ (D0) (n = 6 శ్రేణి, పదాలు స్వినీ, ఒడ్నోస్టోరోనియ్ బ్యూలీ ANOVA ప్రోవెడెన్స్ టేస్ట్స్; ###p <0,001 по сравнению с D0, ***p <0,001 по сравнению с D12 (контроль). తాజా గుండె భాగాలతో (D0) పోల్చినప్పుడు, 4 కల్చర్ పరిస్థితులలో (కంట్రోల్, TD, MC, మరియు MT) కల్చర్ తర్వాత 12 రోజులకు గ్లూకోజ్ ఫ్లక్స్ పరిమాణాన్ని చూపించే హిస్టోగ్రామ్ (n = 6 భాగాలు/సమూహం, వేర్వేరు పందుల నుండి, ఏకపక్షం). ANOVA పరీక్షలు నిర్వహించబడ్డాయి, ###p < 0.001 D0 తో పోల్చినప్పుడు, ***p < 0.001 D12 (కంట్రోల్) తో పోల్చినప్పుడు.d పది ప్రాంతీయ కణజాల విభాగ పాయింట్ల వద్ద తాజా (నీలం), 12వ రోజు MC (ఆకుపచ్చ), మరియు 12వ రోజు MT (ఎరుపు) కణజాలాల స్ట్రెయిన్ విశ్లేషణ ప్లాట్లు (n = 4 స్లైస్‌లు/సమూహం, వన్-వే ANOVA పరీక్ష; సమూహాల మధ్య గణనీయమైన తేడా లేదు). e 10-12 రోజుల పాటు స్థిర పరిస్థితులలో (Ctrl) లేదా MT పరిస్థితులలో (MT) కల్చర్ చేయబడిన గుండె విభాగాలతో పోలిస్తే, తాజా గుండె విభాగాలలో (D0) భిన్నంగా వ్యక్తమయ్యే జన్యువులను చూపే వోల్కానో ప్లాట్. f ప్రతి కల్చర్ పరిస్థితి కింద కల్చర్ చేయబడిన గుండె విభాగాల కోసం సార్కోమెర్ జన్యువుల హీట్‌మ్యాప్. ఎర్రర్ బార్‌లు సగటు ± ప్రామాణిక విచలనాన్ని సూచిస్తాయి.
కొవ్వు ఆమ్ల ఆక్సీకరణ నుండి గ్లైకోలిసిస్‌కు మారడంపై జీవక్రియ ఆధారపడటం అనేది కార్డియోమయోసైట్ డీడిఫరెన్సియేషన్ యొక్క ఒక ముఖ్య లక్షణం. అపరిపక్వ కార్డియోమయోసైట్లు ప్రాథమికంగా ATP ఉత్పత్తి కోసం గ్లూకోజ్‌ను ఉపయోగిస్తాయి మరియు కొన్ని క్రిస్టేలతో హైపోప్లాస్టిక్ మైటోకాండ్రియాను కలిగి ఉంటాయి5,32. గ్లూకోజ్ వినియోగ విశ్లేషణలు MC మరియు MT పరిస్థితులలో, గ్లూకోజ్ వినియోగం 0వ రోజు కణజాలాలలో ఉన్నదానితో సమానంగా ఉందని చూపించాయి (చిత్రం 4c). అయితే, తాజా కణజాలంతో పోలిస్తే Ctrl నమూనాలు గ్లూకోజ్ వినియోగంలో గణనీయమైన పెరుగుదలను చూపించాయి. ఇది CTCM మరియు T3/Dexల కలయిక కణజాల జీవశక్తిని పెంచుతుందని మరియు 12-రోజుల పాటు కల్చర్ చేసిన గుండె భాగాల జీవక్రియ ఫినోటైప్‌ను కాపాడుతుందని సూచిస్తుంది. అదనంగా, స్ట్రెయిన్ విశ్లేషణ MT మరియు MS పరిస్థితులలో 12 రోజుల పాటు స్ట్రెయిన్ స్థాయిలు తాజా గుండె కణజాలంలో ఉన్నట్లే ఉన్నాయని చూపించింది (చిత్రం 4d).
కార్డియాక్ స్లైస్ కణజాలం యొక్క మొత్తం ట్రాన్స్క్రిప్షనల్ ల్యాండ్‌స్కేప్‌పై CTCM మరియు T3/Dex యొక్క ప్రభావాన్ని విశ్లేషించడానికి, మేము నాలుగు వేర్వేరు కల్చర్ పరిస్థితుల నుండి కార్డియాక్ స్లైస్‌లపై RNAseqను నిర్వహించాము (సప్లిమెంటరీ డేటా 1). ఆసక్తికరంగా, MT సెక్షన్‌లు తాజా గుండె కణజాలంతో అధిక ట్రాన్స్క్రిప్షనల్ సారూప్యతను చూపించాయి, 13,642 జన్యువులలో కేవలం 16 మాత్రమే విభిన్నంగా వ్యక్తమయ్యాయి. అయితే, మేము ఇంతకు ముందు చూపినట్లుగా, కల్చర్‌లో 10–12 రోజుల తర్వాత Ctrl స్లైస్‌లు 1229 విభిన్నంగా వ్యక్తమయ్యే జన్యువులను ప్రదర్శించాయి (Fig. 4e). ఈ డేటా గుండె మరియు ఫైబ్రోబ్లాస్ట్ జన్యువుల qRT-PCR ద్వారా నిర్ధారించబడింది (సప్లిమెంటరీ Fig. 7a-c). ఆసక్తికరంగా, Ctrl సెక్షన్‌లు కార్డియాక్ మరియు సెల్ సైకిల్ జన్యువుల డౌన్‌రెగ్యులేషన్ మరియు ఇన్ఫ్లమేటరీ జన్యు ప్రోగ్రామ్‌ల యాక్టివేషన్‌ను చూపించాయి. ఈ డేటా సాధారణంగా దీర్ఘకాలిక కల్చరింగ్ తర్వాత సంభవించే డీడిఫరెన్సియేషన్, MT పరిస్థితులలో పూర్తిగా బలహీనపడిందని సూచిస్తుంది (సప్లిమెంటరీ Fig. 8a,b). సార్కోమియర్ జన్యువులను జాగ్రత్తగా అధ్యయనం చేయగా, MT పరిస్థితులలో మాత్రమే సార్కోమియర్ (Fig. 4f) మరియు అయాన్ ఛానెల్ (సప్లిమెంటరీ Fig. 9) లను ఎన్‌కోడ్ చేసే జన్యువులు సంరక్షించబడతాయని, తద్వారా Ctrl, TD, మరియు MC పరిస్థితులలో అవి అణచివేతకు గురికాకుండా రక్షించబడతాయని తేలింది. ఈ డేటా ఏమి చూపిస్తుందంటే, మెకానికల్ మరియు హ్యూమోరల్ స్టిమ్యులేషన్ (T3/Dex) కలయికతో, కల్చర్‌లో 12 రోజుల తర్వాత కూడా హార్ట్ స్లైస్ ట్రాన్స్‌క్రిప్టోమ్ తాజా హార్ట్ స్లైస్‌ల మాదిరిగానే ఉండగలదు.
ఈ ట్రాన్స్క్రిప్షనల్ ఫలితాలకు మద్దతుగా, గుండె భాగాలలో కార్డియోమయోసైట్ల నిర్మాణ సమగ్రత 12 రోజుల పాటు MT పరిస్థితులలో ఉత్తమంగా సంరక్షించబడుతుంది, ఇది చెక్కుచెదరని మరియు స్థానికీకరించబడిన కనెక్సిన్ 43 ద్వారా చూపబడింది (Fig. 5a). అదనంగా, Ctrl తో పోలిస్తే MT పరిస్థితులలో గుండె భాగాలలో ఫైబ్రోసిస్ గణనీయంగా తగ్గింది మరియు తాజా గుండె భాగాలకు సమానంగా ఉంది (Fig. 5b). ఈ డేటా యాంత్రిక ప్రేరణ మరియు T3/Dex చికిత్సల కలయిక కల్చర్‌లోని గుండె భాగాలలో గుండె నిర్మాణాన్ని సమర్థవంతంగా సంరక్షిస్తుందని నిరూపిస్తుంది.
తాజాగా వేరుచేసిన గుండె భాగాలలో (D0) లేదా నాలుగు గుండె భాగాల కల్చర్ పరిస్థితులలో 12 రోజుల పాటు కల్చర్ చేసిన వాటిలో ట్రోపోనిన్-టి (ఆకుపచ్చ), కనెక్సిన్ 43 (ఎరుపు), మరియు DAPI (నీలం) యొక్క ప్రాతినిధ్య ఇమ్యునోఫ్లోరోసెన్స్ చిత్రాలు (స్కేల్ బార్ = 100 µm). గుండె కణజాలం యొక్క నిర్మాణ సమగ్రతను కృత్రిమ మేధస్సు ద్వారా పరిమాణీకరించడం (వివిధ పందుల నుండి ప్రతి సమూహానికి n = 7 (D0 మరియు D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC మరియు D12 MT) స్లైస్‌లు, వన్-వే ANOVA పరీక్ష నిర్వహించబడింది; D0 తో పోల్చినప్పుడు ####p < 0.0001 మరియు D12 Ctrl తో పోల్చినప్పుడు *p < 0.05, లేదా ****p < 0.0001). గుండె కణజాలం యొక్క నిర్మాణ సమగ్రతను కృత్రిమ మేధస్సు ద్వారా పరిమాణీకరించడం (వివిధ పందుల నుండి ప్రతి సమూహానికి n = 7 (D0 మరియు D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC మరియు D12 MT) స్లైస్‌లు, వన్-వే ANOVA పరీక్ష నిర్వహించబడింది; #### D0 తో పోలిస్తే p < 0.0001 మరియు *d12 Ctrl తో పోలిస్తే p < 0.05, లేదా ****p < 0.0001). కొలిచెస్ట్‌వెన్నాయ ఒషెంకా స్ట్రక్చర్‌నోయి థెలాస్ట్నోస్టి టకాని సెర్డాస్ స్ పోమోష్యూ ఇస్కుస్ట్‌వెన్నోగో (2000 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC మరియు D12 MT) срезов/группу అనోవా నుండి అద్భుతమైన స్వినే #### p <0,0001 по сравнению с D0 и *p < 0,05 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). కృత్రిమ మేధస్సును ఉపయోగించి గుండె కణజాలం యొక్క నిర్మాణ సమగ్రతను పరిమాణీకరించడం (వివిధ పందుల నుండి ప్రతి సమూహం నుండి n = 7 (D0 మరియు D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC మరియు D12 MT) విభాగాలు, వన్-వే ANOVA పరీక్ష నిర్వహించబడింది; D0 తో పోలిస్తే #### p < 0.0001 మరియు D12 Ctrl తో పోలిస్తే *p < 0.05 లేదా ****p < 0.0001).对不同猪的心脏组织结构完整性（n = 7（D0 和D12 Ctrl）、5（D12 TD,D12 MC 和D12 ఎమ్‌టి 0.0001 与D12 Ctrl 相比）。对 不同 猪 దాదాపు人工 智能量 化 进行 单向 单向 单向 测试 ； ########## p < 0.0001 与D0 和*p <0.001 与D0 和*p <0.0.0 0.0001 与D12 Ctrl 相比).ఒక-మార్గం ANOVA పరీక్షతో వివిధ పందులలో (n = 7 (D0 మరియు D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC మరియు D12 MT) విభాగాలు/సమూహం) కృత్రిమ మేధస్సును ఉపయోగించి గుండె కణజాలం యొక్క నిర్మాణ సమగ్రత యొక్క పరిమాణీకరణ;#### p <0,0001 по сравнению с D0 и *p < 0,05 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). D0 తో పోల్చినప్పుడు p < 0.0001 మరియు D12 Ctrl తో పోల్చినప్పుడు p < 0.05 లేదా p < 0.0001. బి. మాసన్ ట్రైక్రోమ్ స్టెయిన్‌తో రంగు వేయబడిన గుండె ముక్కల ప్రతినిధి చిత్రాలు మరియు పరిమాణీకరణ (స్కేల్ బార్ = 500 µm) (వివిధ పందుల నుండి ఒక్కో సమూహానికి n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD, మరియు D12 MC), 9 (D12 MT) ముక్కలు, వన్-వే ANOVA పరీక్ష నిర్వహించబడింది; D0 తో పోలిస్తే ####p < 0.0001 మరియు D12 Ctrl తో పోలిస్తే ***p < 0.001, లేదా ****p < 0.0001). బి. మాసన్ ట్రైక్రోమ్ స్టెయిన్‌తో రంగు వేయబడిన గుండె ముక్కల ప్రతినిధి చిత్రాలు మరియు పరిమాణీకరణ (స్కేల్ బార్ = 500 µm) (వివిధ పందుల నుండి ఒక్కో సమూహానికి n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD, మరియు D12 MC), 9 (D12 MT) ముక్కలు, వన్-వే ANOVA పరీక్ష నిర్వహించబడింది; D0 తో పోలిస్తే ####p < 0.0001 మరియు D12 Ctrl తో పోలిస్తే ***p < 0.001, లేదా ****p < 0.0001). b ప్రెజెంటేషన్ ఇజోబ్రాజెనియా మరియు కోలిచెస్ట్‌వెన్న ఒషెంకా స్రెజోవ్ సెర్డిసా, ఓక్రాసెన్స్ ట్రిమ్‌నాస్మ్ (మాసితబ్నాయ లినెయికా = 500 ఎమ్‌కెఎమ్) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD మరియు D12 MC), 9 (D12 MT) శ్రేణి/గ్రుప్పు నుండి ర్యాజినిక్స్ స్వినీ, వైపోల్న్యాస్ట్ ప్రకటన; ####p <0,0001 по сравнению с D0 и ***p < 0,001 или ****p < 0,0001 по с D12 Ctrl). బి. మాసన్ ట్రైక్రోమ్ స్టెయిన్‌తో రంగు వేయబడిన గుండె భాగాల ప్రతినిధి చిత్రాలు మరియు పరిమాణీకరణ (స్కేల్ బార్ = 500 µm) (వివిధ పందుల నుండి ఒక్కో సమూహానికి n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD మరియు D12 MC), 9 (D12 MT) భాగాలు, వన్-వే ANOVA నిర్వహించబడింది; ####p < 0.0001 vs. D0 మరియు ***p < 0.001 లేదా ****p < 0.0001 vs. D12 Ctrl). b 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像和量化（比 ఉదాహరణలు 尺= 500 µm（d =20）n Ctrl.与D0 相比，***p < 0.001,或****p <0.0001 与D12 Ctrl 相比）。 b 用 మాసన్ 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 和 量化 （比 ఉదాహరణలు 尺 尺 剼 = 500 µn 、 d12 ctrl , d12 td 和 d12 mc） 来自 不同 的 9 个 d12 mt 切片 切片 切片 切片切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片/组，进行单因素方差分析；##00d相比,***p <0.001，或****p <0.0001 与D12 Ctrl 相比）。 b ప్రెజెంటేషన్ ఇజోబ్రాజెనియా మరియు కోలిచెస్ట్‌వెన్న ఒషెంకా స్రెజోవ్ సెర్డిసా, ఓక్రాషెన్యస్ ట్రిమ్సోమ్ линейка = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD మరియు D12 MC), 9 (D12 MT) సాధారణ స్వినీ / గ్రూప్పీ, ఓడిన్-స్పోసోబ్ ANOVA; ####p <0,0001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). బి. మాసన్ ట్రైక్రోమ్‌తో రంగు వేయబడిన గుండె భాగాల ప్రతినిధి చిత్రాలు మరియు పరిమాణీకరణ (స్కేల్ బార్ = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD మరియు D12 MC), 9 (D12 MT) ప్రతి సమూహం నుండి వేర్వేరు పందుల విభాగాలు, ఒక ANOVA పద్ధతి; ####p < 0.0001 D0 తో పోల్చగా, ***p < 0.001 లేదా ****p < 0.0001 D12 Ctrl తో పోల్చగా).ఎర్రర్ బార్‌లు సగటు ± ప్రామాణిక విచలనాన్ని సూచిస్తాయి.
చివరగా, గుండె కణజాలం సాగడాన్ని పెంచడం ద్వారా కార్డియాక్ హైపర్‌ట్రోఫీని అనుకరించే CTCM సామర్థ్యాన్ని అంచనా వేశారు. CTCMలో, గరిష్ట గాలి గది పీడనం 80 mmHg నుండి 80 mmHg వరకు పెరిగింది. ఆర్ట్. (సాధారణ సాగడం) 140 mmHg వరకు పెరిగింది (పటం 6a). ఇది సాగడంలో 32% పెరుగుదలకు అనుగుణంగా ఉంటుంది (పటం 6b), ఇది హైపర్‌ట్రోఫీలో కనిపించే సార్కోమెర్ పొడవును సాధించడానికి గుండె భాగాలకు అవసరమైన సంబంధిత శాతం సాగడంగా గతంలో చూపబడింది. ఆరు రోజుల కల్చర్ సమయంలో సంకోచం మరియు సడలింపు సమయంలో గుండె కణజాలం యొక్క సాగడం మరియు వేగం స్థిరంగా ఉన్నాయి (పటం 6c). MT పరిస్థితుల నుండి వచ్చిన గుండె కణజాలాన్ని ఆరు రోజుల పాటు సాధారణ సాగడం (MT (సాధారణ)) లేదా అధిక సాగడం పరిస్థితులకు (MT (OS)) గురిచేశారు. కల్చర్‌లో కేవలం నాలుగు రోజుల తర్వాత, MT (సాధారణ) పరిస్థితులతో పోలిస్తే MT (OS) పరిస్థితులలోని మాధ్యమంలో హైపర్‌ట్రోఫిక్ బయోమార్కర్ NT-ProBNP గణనీయంగా పెరిగింది (పటం 7a). అదనంగా, ఆరు రోజుల కల్చరింగ్ తర్వాత, MT (OS) (Fig. 7b) లోని కణ పరిమాణం, MT గుండె (సాధారణ) భాగాలతో పోలిస్తే గణనీయంగా పెరిగింది. అంతేకాకుండా, అతిగా సాగదీసిన కణజాలాలలో NFATC4 న్యూక్లియర్ ట్రాన్స్‌లోకేషన్ గణనీయంగా పెరిగింది (Fig. 7c). ఈ ఫలితాలు హైపర్‌డిస్టెన్షన్ తర్వాత పాథలాజికల్ రీమోడలింగ్ క్రమంగా అభివృద్ధి చెందడాన్ని చూపుతాయి మరియు సాగదీయడం వల్ల ప్రేరేపించబడిన కార్డియాక్ హైపర్‌ట్రోఫీ సిగ్నలింగ్‌ను అధ్యయనం చేయడానికి CTCM పరికరాన్ని ఒక వేదికగా ఉపయోగించవచ్చనే భావనకు మద్దతు ఇస్తాయి.
గాలి గది పీడనం, ద్రవ గది పీడనం మరియు కణజాల కదలిక కొలతల యొక్క ప్రాతినిధ్య జాడలు, గది పీడనం ద్రవ గది పీడనాన్ని మారుస్తుందని, తద్వారా కణజాల ముక్క యొక్క సంబంధిత కదలికకు కారణమవుతుందని నిర్ధారిస్తున్నాయి. బి. సాధారణంగా సాగదీయబడిన (నారింజ రంగు) మరియు అధికంగా సాగదీయబడిన (నీలం రంగు) కణజాల విభాగాల కోసం ప్రాతినిధ్య సాగుదల శాతం మరియు సాగుదల రేటు వక్రతలు. సి. చక్ర సమయం (ప్రతి సమూహానికి n = 19 ముక్కలు, వేర్వేరు పందుల నుండి), సంకోచ సమయం (ప్రతి సమూహానికి n = 18-19 ముక్కలు, వేర్వేరు పందుల నుండి), సడలింపు సమయం (ప్రతి సమూహానికి n = 19 ముక్కలు, వేర్వేరు పందుల నుండి), కణజాల కదలిక యొక్క వ్యాప్తి (ప్రతి సమూహానికి n = 14 ముక్కలు, వేర్వేరు పందుల నుండి), గరిష్ట సిస్టోలిక్ వేగం (ప్రతి సమూహానికి n = 14 ముక్కలు, వేర్వేరు పందుల నుండి) మరియు గరిష్ట సడలింపు రేటు (n = 14 (D0), 15 (D6) విభాగాలు/సమూహాలు) లను చూపించే బార్ గ్రాఫ్. టూ-టెయిల్డ్ స్టూడెంట్స్ టి-టెస్ట్ ఏ పరామితిలోనూ గణనీయమైన వ్యత్యాసాన్ని చూపలేదు, ఇది అధిక వోల్టేజ్‌తో 6 రోజుల కల్చర్ సమయంలో ఈ పరామితులు స్థిరంగా ఉన్నాయని సూచిస్తుంది. ఎర్రర్ బార్‌లు సగటు ± ప్రామాణిక విచలనాన్ని సూచిస్తాయి.
MT సాధారణ సాగతీత (Norm) లేదా అధిక సాగతీత (OS) పరిస్థితులలో కల్చర్ చేయబడిన గుండె ముక్కల నుండి కల్చర్ మీడియాలో NT-ProBNP గాఢత యొక్క బార్ గ్రాఫ్ పరిమాణీకరణ (వివిధ పందుల నుండి ఒక్కో సమూహానికి n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, మరియు D4 MTOS) ముక్కలు, టూ-వే ANOVA నిర్వహించబడింది; **సాధారణ సాగతీతతో పోలిస్తే p < 0.01). MT సాధారణ సాగతీత (Norm) లేదా అధిక సాగతీత (OS) పరిస్థితులలో కల్చర్ చేయబడిన గుండె స్లైస్‌ల నుండి కల్చర్ మీడియాలో NT-ProBNP గాఢత యొక్క బార్ గ్రాఫ్ పరిమాణీకరణ (వివిధ పందుల నుండి ఒక్కో సమూహానికి n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, మరియు D4 MTOS) స్లైస్‌లు, టూ-వే ANOVA నిర్వహించబడింది; **సాధారణ సాగతీతతో పోలిస్తే p < 0.01).వివిధ పందుల నుండి సాధారణ MT సాగతీత (norm) లేదా అధిక సాగతీత (OS) పరిస్థితులలో కల్చర్ చేయబడిన గుండె ముక్కల నుండి కల్చర్ మాధ్యమంలోని NT-ProBNP గాఢత యొక్క పరిమాణాత్మక హిస్టోగ్రామ్ (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, మరియు D4).MTOS) ముక్కలు / సమూహం, రెండు-కారకాల విశ్లేషణ వైవిధ్యం నిర్వహించబడింది;**p <0,01 по сравнению с нормальным растяжением). సాధారణ సాగతీతతో పోల్చినప్పుడు p < 0.01). ఒక 在MT 正常拉伸(నార్మ్) 或过度拉伸(OS) 条件下培养的心脏切片培养基中NT-ProBNP浓度的条形图量化（n = 4 (D2 MTNorm)、3（D2 MTOS,D4 MTనార్మ్ 和D4 MTOS MT సాధారణ స్ట్రెచ్ (నార్మ్) లేదా ఓవర్‌స్ట్రెచ్ (OS) పరిస్థితులలో (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm和D4 MTOS) కల్చర్ చేయబడిన గుండె ముక్కలలో NT-ProBNP గాఢత యొక్క పరిమాణీకరణ猪的切片/组，可以双向方方发发动; సాధారణ సాగతీతతో పోలిస్తే, p <0.01).వివిధ పందుల నుండి సాధారణ MT సాగతీత (norm) లేదా అధిక సాగతీత (OS) పరిస్థితులలో కల్చర్ చేయబడిన గుండె ముక్కలలో NT-ProBNP సాంద్రతల హిస్టోగ్రామ్ పరిమాణీకరణ (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm) మరియు D4 MTOS) ముక్కలు/సమూహం, రెండు-మార్గాల విశ్లేషణ;**p <0,01 по сравнению с нормальным растяжением). సాధారణ సాగతీతతో పోల్చినప్పుడు p < 0.01). బి. ట్రోపోనిన్-టి మరియు డబ్ల్యుజిఎ (ఎడమ) తో రంగు వేయబడిన గుండె ముక్కల ప్రతినిధి చిత్రాలు మరియు కణ పరిమాణ గణన (కుడి) (వివిధ పందుల నుండి 10 వేర్వేరు ముక్కల నుండి ఒక్కో సమూహానికి n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) కణాలు, టూ-టెయిల్డ్ స్టూడెంట్ టి-టెస్ట్ నిర్వహించబడింది; ****సాధారణ సాగతీతతో పోలిస్తే p < 0.0001). బి. ట్రోపోనిన్-టి మరియు డబ్ల్యుజిఎ (ఎడమ) తో రంగు వేయబడిన గుండె ముక్కల ప్రతినిధి చిత్రాలు మరియు కణ పరిమాణ గణన (కుడి) (వివిధ పందుల నుండి 10 వేర్వేరు ముక్కల నుండి ఒక్కో సమూహానికి n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) కణాలు, ద్విముఖ స్టూడెంట్ టి-పరీక్ష నిర్వహించబడింది; ****సాధారణ సాగుదలతో పోలిస్తే p < 0.0001). b ప్రెజెంటేషన్ ఇజోబ్రాజెనియ స్రెజోవ్ సెర్డాస్, ఓక్రాసెన్నిహ్ ట్రోపోనినమ్-టీ మరియు అగ్జిట్ (స్లేవా) మరియు గోస్టోల్ ఒప్రెడెలెనియా రజ్మేరా క్లేటోక్ (ప్రవచనం) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) క్లేటోక్/గ్రుప్పు లేదా 10 ర్యాంకులు క్రమానుగతంగా రాజధాని స్విణి, ప్రకటన-ప్రక్రియ t-критерий Стьюдента ****p <0,0001 по; స్రావ్నేనియు స్ నార్మల్ రస్టేజెనియం). బి. ట్రోపోనిన్-టి మరియు AZP తో రంగు వేయబడిన గుండె భాగాల ప్రతినిధి చిత్రాలు (ఎడమ) మరియు కణ పరిమాణ గణన (కుడి) (వివిధ పందుల నుండి 10 వేర్వేరు భాగాల నుండి ఒక్కో సమూహానికి n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) కణాలు, రెండు-వైపుల స్టూడెంట్స్ t-పరీక్ష నిర్వహించబడింది; ****సాధారణ జాతితో పోలిస్తే p < 0.0001). b 用肌钙蛋白-T 和WGA（左）和细胞大小量化（右）染色的心脏切片的代30） MTOS）,来自不同猪的10 个不同切片的369（D6 MTNorm）细胞/组,两进行有尾学生t 检验；与正常拉伸相比,****p <0.0001）。 బి. కాల్కేరిన్-టి మరియు డబ్ల్యుజిఎ (ఎడమ) తో రంగు వేయబడిన గుండె ముక్కల ప్రతినిధి చిత్రాలు మరియు కణ పరిమాణం (కుడి) (n = 330 (D6 MTOS), 10 వేర్వేరు ముక్కల నుండి 369 (D6 MTNorm)) కణాలు/సమూహం, రెండు పద్ధతులు విద్యార్థి t పరీక్ష; సాధారణ సాగదీయడంతో పోల్చితే, ****p < 0.0001). b ప్రెజెంటేషన్ ఇజోబ్రాజెనియ స్రెజోవ్ సెర్డాస్, ఓక్రాషెన్ ట్రోపోనినమ్-టా మరియు ఎగ్జ్ (స్లేవా) మరియు కోలాన్ రజ్మేరా క్లేటోక్ (స్ప్రవా) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) из 10 రజనియస్ స్వినీ క్లాట్‌కి/గ్రుప్పా, డ్వుస్టోరోనియర్ క్రైట్‌లు; ****p <0,0001 по сравнению с нормальным растяжением). బి. ట్రోపోనిన్-టి మరియు AZP తో రంగు వేయబడిన గుండె భాగాల ప్రతినిధి చిత్రాలు (ఎడమ) మరియు కణ పరిమాణం యొక్క పరిమాణీకరణ (కుడి) (వివిధ పందుల నుండి 10 వేర్వేరు భాగాల నుండి n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm)). కణాలు/సమూహం, రెండు-వైపుల ప్రమాణం స్టూడెంట్స్ t; ****p < 0.0001 సాధారణ జాతితో పోల్చినప్పుడు). c. ట్రోపోనిన్-టి మరియు NFATC4 కోసం ఇమ్యునోలేబుల్ చేయబడిన 0వ రోజు మరియు 6వ రోజు MTOS గుండె స్లైస్‌ల ప్రతినిధి చిత్రాలు మరియు CMల కేంద్రకాలకు NFATC4 యొక్క స్థానభ్రంశం యొక్క పరిమాణీకరణ (వివిధ పందుల నుండి ఒక్కో సమూహానికి n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) స్లైస్‌లు, టూ-టెయిల్డ్ స్టూడెంట్ t-టెస్ట్ నిర్వహించబడింది; *p < 0.05). c ట్రోపోనిన్-T మరియు NFATC4 కోసం ఇమ్యునోలేబుల్ చేయబడిన 0వ రోజు మరియు 6వ రోజు MTOS గుండె స్లైస్‌ల ప్రతినిధి చిత్రాలు మరియు CMల కేంద్రకాలకు NFATC4 యొక్క స్థానభ్రంశం యొక్క పరిమాణీకరణ (వివిధ పందుల నుండి ఒక్కో సమూహానికి n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) స్లైస్‌లు, టూ-టెయిల్డ్ స్టూడెంట్ t-టెస్ట్ నిర్వహించబడింది; *p < 0.05). c ప్రెజెంటేషన్ ఐజోబ్రాజేనియా స్రెజోవ్ సెర్డిసా 0 మరియు 6 రోజుల MTOS, ఇమ్మ్యునోమెచనిక్స్ డ్లియా ట్రోపోనినా-TCT4, కోలిచెస్ట్వెన్న ఒషెంకా ట్రాన్స్లోకాసియి NFATC4 వయాడ్రా కావెర్నోజ్నిక్స్ క్లేటాక్ (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) స్రెజోవ్/గ్రుప్పు నుండి రాజనీతి స్వినీ , వర్ణన-వ్యవహారం Стьюдента;p <0,05). c 0 మరియు 6 రోజుల MTOS వద్ద గుండె భాగాల ప్రతినిధి చిత్రాలు, ట్రోపోనిన్-T మరియు NFATC4 కోసం ఇమ్యునోలేబుల్ చేయబడ్డాయి, మరియు కావెర్నస్ కణాల కేంద్రకంలో NFATC4 స్థానభ్రంశం యొక్క పరిమాణీకరణ (వివిధ పందుల నుండి ప్రతి సమూహానికి n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) ముక్కలు) రెండు-వైపుల స్టూడెంట్స్ t-పరీక్షను నిర్వహించాయి; *p < 0.05). c 用于肌钙蛋白-T 和NFATC4 మీరు切片/组, 进行双尾学生t 检验；*p <0.05)。 c కాల్కానిన్-T మరియు NFATC4 ఇమ్యునోలేబిలింగ్ 第0天和第6天MTOS గుండె ముక్కలు, మరియు NFATC4 వివిధ NFATC4 易位至CM సెల్ న్యూక్లియస్ 的quantity化 (n = 4 (D0TO) నుండి ప్రాతినిధ్య చిత్రాలు切礼/组, 时间双尾学生et 电影；*p <0.05). c 0 మరియు 6 రోజులలో ఇమ్మ్యూనోమార్కిరోవ్కీ ట్రోపోనియోమ్-4 కోలిచెస్ట్వెన్నాయ ఒషెంకా ట్రాన్సులోకాష్‌లు NFATC4 నుండి yadra CM నుండి రాజ్‌నియస్ స్వినై (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) శ్రేణి/గ్రుప్పా, два- хвостатый t-kript; 0,05). c వివిధ పందుల నుండి తీసుకున్న CM కేంద్రకంలో ట్రోపోనిన్-T మరియు NFATC4 ఇమ్యునోలేబలింగ్ మరియు NFATC4 స్థానభ్రంశం యొక్క పరిమాణీకరణ కొరకు 0 మరియు 6వ రోజు నాటి MTOS గుండె ముక్కల ప్రతినిధి చిత్రాలు (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) ముక్కలు/సమూహం, రెండు-వైపుల t -మానదండం స్టూడెంట్స్; *p < 0.05).ఎర్రర్ బార్‌లు సగటు ± ప్రామాణిక విచలనాన్ని సూచిస్తాయి.
అనువాద హృదయ సంబంధ పరిశోధనకు, గుండె వాతావరణాన్ని ఖచ్చితంగా పునరుత్పత్తి చేసే కణ నమూనాలు అవసరం. ఈ అధ్యయనంలో, గుండె యొక్క అతి సన్నని భాగాలను ఉత్తేజపరచగల ఒక CTCM పరికరం అభివృద్ధి చేయబడి, దాని లక్షణాలు నిర్ధారించబడ్డాయి. ఈ CTCM వ్యవస్థలో శారీరకంగా సమకాలీకరించబడిన ఎలక్ట్రోమెకానికల్ ఉత్తేజం మరియు T3, Dex ద్రవాల సమృద్ధి ఉంటాయి. పంది గుండె భాగాలను ఈ కారకాలకు గురిచేసినప్పుడు, 12 రోజుల కల్చర్ తర్వాత కూడా వాటి జీవశక్తి, నిర్మాణ సమగ్రత, జీవక్రియ కార్యకలాపం మరియు ట్రాన్స్క్రిప్షనల్ వ్యక్తీకరణ తాజా గుండె కణజాలంలో ఉన్నట్లే ఉన్నాయి. అదనంగా, గుండె కణజాలాన్ని అధికంగా సాగదీయడం వలన హైపర్‌ఎక్స్‌టెన్షన్ కారణంగా గుండె హైపర్‌ట్రోఫీకి దారితీయవచ్చు. మొత్తంమీద, ఈ ఫలితాలు సాధారణ గుండె ఫినోటైప్‌ను నిర్వహించడంలో శారీరక కల్చర్ పరిస్థితుల కీలక పాత్రకు మద్దతు ఇస్తాయి మరియు ఔషధ స్క్రీనింగ్ కోసం ఒక వేదికను అందిస్తాయి.
కార్డియోమయోసైట్‌ల పనితీరు మరియు మనుగడకు అనువైన వాతావరణాన్ని సృష్టించడానికి అనేక కారకాలు దోహదపడతాయి. ఈ కారకాలలో అత్యంత స్పష్టమైనవి (1) కణాల మధ్య పరస్పర చర్యలు, (2) ఎలక్ట్రోమెకానికల్ స్టిమ్యులేషన్, (3) హ్యూమోరల్ కారకాలు, మరియు (4) మెటబాలిక్ సబ్‌స్ట్రేట్‌లకు సంబంధించినవి. శారీరక కణాల మధ్య పరస్పర చర్యలకు, ఎక్స్‌ట్రాసెల్యులార్ మ్యాట్రిక్స్ మద్దతుతో బహుళ కణ రకాల సంక్లిష్టమైన త్రిమితీయ నెట్‌వర్క్‌లు అవసరం. ఇటువంటి సంక్లిష్టమైన సెల్యులార్ పరస్పర చర్యలను వేర్వేరు కణ రకాలను కలిపి పెంచడం ద్వారా ఇన్ విట్రోలో పునర్నిర్మించడం కష్టం, కానీ గుండె భాగాల ఆర్గానోటైపిక్ స్వభావాన్ని ఉపయోగించి దీనిని సులభంగా సాధించవచ్చు.
హృదయ ఫినోటైప్‌ను నిర్వహించడానికి కార్డియోమయోసైట్‌ల యాంత్రిక సాగతీత మరియు విద్యుత్ ఉద్దీపన చాలా కీలకమైనవి33,34,35. hiPSC-CM కండిషనింగ్ మరియు పరిపక్వత కోసం యాంత్రిక ఉద్దీపనను విస్తృతంగా ఉపయోగిస్తున్నప్పటికీ, ఇటీవల అనేక చక్కటి అధ్యయనాలు ఏకదిశాత్మక లోడింగ్‌ను ఉపయోగించి కల్చర్‌లో ఉన్న గుండె ముక్కల యాంత్రిక ఉద్దీపనను ప్రయత్నించాయి. ఈ అధ్యయనాలు 2D ఏకదిశాత్మక యాంత్రిక లోడింగ్ కల్చర్ సమయంలో గుండె ఫినోటైప్‌పై సానుకూల ప్రభావాన్ని చూపుతుందని తెలియజేస్తున్నాయి. ఈ అధ్యయనాలలో, గుండె భాగాలను ఐసోమెట్రిక్ తన్యత బలాలతో17, లీనియర్ ఆక్సోటోనిక్ లోడింగ్‌తో18 లోడ్ చేశారు, లేదా ఫోర్స్ ట్రాన్స్‌డ్యూసర్ ఫీడ్‌బ్యాక్ మరియు టెన్షన్ డ్రైవ్‌లను ఉపయోగించి కార్డియాక్ సైకిల్‌ను పునఃసృష్టించారు. అయితే, ఈ పద్ధతులు పర్యావరణ ఆప్టిమైజేషన్ లేకుండా ఏకదిశాత్మక కణజాల సాగతీతను ఉపయోగిస్తాయి, దీని ఫలితంగా అనేక కార్డియాక్ జన్యువులు అణచివేయబడతాయి లేదా అసాధారణ సాగతీత ప్రతిస్పందనలతో సంబంధం ఉన్న జన్యువులు అతిగా వ్యక్తీకరించబడతాయి. ఇక్కడ వివరించిన CTCM, సైకిల్ సమయం మరియు శారీరక సాగతీత (25% సాగతీత, 40% సిస్టోల్, 60% డయాస్టోల్, మరియు నిమిషానికి 72 బీట్స్) పరంగా సహజ కార్డియాక్ సైకిల్‌ను అనుకరించే 3D ఎలక్ట్రోమెకానికల్ ఉద్దీపనను అందిస్తుంది. కణజాల సమగ్రతను కాపాడుకోవడానికి ఈ త్రిమితీయ యాంత్రిక ప్రేరణ ఒక్కటే సరిపోనప్పటికీ, కణజాల జీవశక్తి, పనితీరు మరియు సమగ్రతను తగినంతగా నిర్వహించడానికి T3/Dex ఉపయోగించి ద్రవ మరియు యాంత్రిక ప్రేరణల కలయిక అవసరం.
వయోజన గుండె ఫినోటైప్‌ను మాడ్యులేట్ చేయడంలో హ్యూమోరల్ కారకాలు ముఖ్యమైన పాత్ర పోషిస్తాయి. కణ పరిపక్వతను వేగవంతం చేయడానికి కల్చర్ మీడియాకు T3 మరియు Dex జోడించిన HiPS-CM అధ్యయనాలలో ఇది స్పష్టమైంది. T3 కణ త్వచాల గుండా అమైనో ఆమ్లాలు, చక్కెరలు మరియు కాల్షియం రవాణాను ప్రభావితం చేయవచ్చు36. అదనంగా, T3, MHC-α వ్యక్తీకరణను మరియు MHC-β డౌన్‌రెగ్యులేషన్‌ను ప్రోత్సహిస్తుంది, ఇది పిండ CMలోని స్లో ట్విచ్ మయోఫైబ్రిల్స్‌తో పోలిస్తే పరిపక్వ కార్డియోమయోసైట్‌లలో ఫాస్ట్ ట్విచ్ మయోఫైబ్రిల్స్ ఏర్పడటాన్ని ప్రోత్సహిస్తుంది. హైపోథైరాయిడ్ రోగులలో T3 లోపం మయోఫైబ్రిలార్ బ్యాండ్‌ల నష్టానికి మరియు టోన్ అభివృద్ధి రేటు తగ్గడానికి దారితీస్తుంది37. Dex గ్లూకోకార్టికాయిడ్ రిసెప్టర్‌లపై పనిచేస్తుంది మరియు ఐసోలేటెడ్ పెర్ఫ్యూజ్డ్ గుండెలలో మయోకార్డియల్ సంకోచశక్తిని పెంచుతుందని చూపబడింది;38 ఈ మెరుగుదల కాల్షియం డిపాజిట్-డ్రైవెన్ ఎంట్రీ (SOCE)పై ప్రభావానికి సంబంధించినదని భావిస్తున్నారు39,40. అదనంగా, Dex దాని రిసెప్టర్‌లకు బంధించబడి, రోగనిరోధక పనితీరు మరియు వాపును అణచివేసే విస్తృత ఇంట్రాసెల్యులార్ ప్రతిస్పందనను కలిగిస్తుంది30.
మా ఫలితాలు సూచించేదేమిటంటే, కంట్రోల్ (Ctrl) తో పోలిస్తే భౌతిక యాంత్రిక ప్రేరణ (MS) మొత్తం కల్చర్ పనితీరును మెరుగుపరిచింది, కానీ కల్చర్‌లో 12 రోజుల పాటు జీవశక్తి, నిర్మాణ సమగ్రత మరియు కార్డియాక్ ఎక్స్‌ప్రెషన్‌ను నిలబెట్టడంలో విఫలమైంది. కంట్రోల్‌తో పోలిస్తే, CTCM (MT) కల్చర్‌లకు T3 మరియు Dex లను జోడించడం వల్ల జీవశక్తి మెరుగుపడింది మరియు 12 రోజుల పాటు తాజా గుండె కణజాలంతో సమానమైన ట్రాన్స్‌క్రిప్షన్ ప్రొఫైల్స్, నిర్మాణ సమగ్రత మరియు జీవక్రియ కార్యకలాపాలను కొనసాగించింది. అదనంగా, కణజాల సాగుదల స్థాయిని నియంత్రించడం ద్వారా, STCM ను ఉపయోగించి హైపర్‌ఎక్స్‌టెన్షన్-ప్రేరిత కార్డియాక్ హైపర్‌ట్రోఫీ నమూనాను సృష్టించడం జరిగింది, ఇది STCM వ్యవస్థ యొక్క బహుముఖ ప్రజ్ఞను వివరిస్తుంది. గమనించవలసిన విషయం ఏమిటంటే, కార్డియాక్ రీమోడలింగ్ మరియు ఫైబ్రోసిస్ సాధారణంగా చెక్కుచెదరని అవయవాలలో జరుగుతాయి, వాటి ప్రసరించే కణాలు తగిన సైటోకిన్‌లతో పాటు ఫాగోసైటోసిస్ మరియు ఇతర రీమోడలింగ్ కారకాలను అందించగలవు, అయినప్పటికీ ఒత్తిడి మరియు గాయానికి ప్రతిస్పందనగా గుండెలోని భాగాలు ఫైబ్రోటిక్ ప్రక్రియను అనుకరించగలవు. మైయోఫైబ్రోబ్లాస్ట్‌లుగా. ఇది గతంలో ఈ కార్డియాక్ స్లైస్ నమూనాలో మూల్యాంకనం చేయబడింది. టాకీకార్డియా, బ్రాడీకార్డియా మరియు మెకానికల్ సర్క్యులేటరీ సపోర్ట్ (మెకానికల్ అన్‌లోడెడ్ హార్ట్) వంటి అనేక పరిస్థితులను అనుకరించడానికి, పీడనం/విద్యుత్ వ్యాప్తి మరియు పౌనఃపున్యాన్ని మార్చడం ద్వారా CTCM పారామితులను మాడ్యులేట్ చేయవచ్చని గమనించాలి. ఇది ఔషధ పరీక్షల కోసం ఈ వ్యవస్థను ఒక మధ్యస్థ థ్రూపుట్‌గా చేస్తుంది. అధిక శ్రమ వలన కలిగే కార్డియాక్ హైపర్‌ట్రోఫీని మోడల్ చేయగల CTCM యొక్క సామర్థ్యం, ​​వ్యక్తిగతీకరించిన చికిత్స కోసం ఈ వ్యవస్థను పరీక్షించడానికి మార్గం సుగమం చేస్తుంది. ముగింపుగా, కార్డియాక్ కణజాల విభాగాల కల్చర్‌ను నిర్వహించడానికి మెకానికల్ స్ట్రెచ్ మరియు హ్యూమోరల్ స్టిమ్యులేషన్ చాలా కీలకమైనవని ప్రస్తుత అధ్యయనం నిరూపిస్తుంది.
ఇక్కడ సమర్పించిన డేటా, చెక్కుచెదరని మయోకార్డియంను నమూనాగా రూపొందించడానికి CTCM చాలా ఆశాజనకమైన వేదిక అని సూచిస్తున్నప్పటికీ, ఈ కల్చర్ పద్ధతికి కొన్ని పరిమితులు ఉన్నాయి. CTCM కల్చర్ యొక్క ప్రధాన పరిమితి ఏమిటంటే, ఇది స్లైస్‌లపై నిరంతర డైనమిక్ యాంత్రిక ఒత్తిళ్లను ప్రయోగిస్తుంది, ఇది ప్రతి చక్రంలో కార్డియాక్ స్లైస్ సంకోచాలను చురుకుగా పర్యవేక్షించే సామర్థ్యాన్ని నిరోధిస్తుంది. అదనంగా, కార్డియాక్ సెక్షన్ల చిన్న పరిమాణం (7 మిమీ) కారణంగా, సాంప్రదాయ ఫోర్స్ సెన్సార్లను ఉపయోగించి కల్చర్ సిస్టమ్‌ల వెలుపల సిస్టోలిక్ పనితీరును అంచనా వేసే సామర్థ్యం పరిమితంగా ఉంటుంది. ప్రస్తుత మాన్యుస్క్రిప్ట్‌లో, సంకోచ పనితీరుకు సూచికగా ఆప్టికల్ వోల్టేజ్‌ను అంచనా వేయడం ద్వారా మేము ఈ పరిమితిని పాక్షికంగా అధిగమించాము. అయినప్పటికీ, ఈ పరిమితికి మరింత కృషి అవసరం మరియు కాల్షియం మరియు వోల్టేజ్-సెన్సిటివ్ డైలను ఉపయోగించి ఆప్టికల్ మ్యాపింగ్ వంటి, కల్చర్‌లో గుండె స్లైస్‌ల పనితీరును ఆప్టికల్‌గా పర్యవేక్షించే పద్ధతులను ప్రవేశపెట్టడం ద్వారా భవిష్యత్తులో దీనిని పరిష్కరించవచ్చు. CTCM యొక్క మరొక పరిమితి ఏమిటంటే, వర్కింగ్ మోడల్ శారీరక ఒత్తిడిని (ప్రీలోడ్ మరియు ఆఫ్టర్‌లోడ్) మార్పుచేయదు. CTCMలో, చాలా పెద్ద కణజాలాలలో డయాస్టోల్ (పూర్తి సాగుదల) మరియు సిస్టోల్ (విద్యుత్ ప్రేరణ సమయంలో సంకోచం యొక్క పొడవు)లో 25% శారీరక సాగుదలను పునరుత్పత్తి చేయడానికి వ్యతిరేక దిశలలో పీడనం ప్రేరేపించబడింది. భవిష్యత్ CTCM డిజైన్‌లలో, గుండె కణజాలంపై ఇరువైపుల నుండి తగినంత ఒత్తిడిని కలిగించడం ద్వారా మరియు గుండె గదులలో ఏర్పడే ఖచ్చితమైన పీడన-పరిమాణ సంబంధాలను వర్తింపజేయడం ద్వారా ఈ పరిమితిని తొలగించాలి.
ఈ పత్రంలో నివేదించబడిన, అతిగా సాగదీయడం వల్ల ప్రేరేపించబడిన పునర్నిర్మాణం అనేది హైపర్ట్రోఫిక్ హైపర్‌స్ట్రెచ్ సంకేతాలను అనుకరించడానికి మాత్రమే పరిమితం. అందువల్ల, ఈ నమూనా హ్యూమరల్ లేదా న్యూరల్ కారకాల అవసరం లేకుండా (ఈ వ్యవస్థలో అవి లేవు) సాగదీయడం వల్ల ప్రేరేపించబడిన హైపర్ట్రోఫిక్ సిగ్నలింగ్ అధ్యయనంలో సహాయపడుతుంది. CTCM యొక్క బహుళత్వాన్ని పెంచడానికి మరిన్ని అధ్యయనాలు అవసరం. ఉదాహరణకు, రోగనిరోధక కణాలతో సహ-సాగు చేయడం, ప్రసరించే ప్లాస్మా హ్యూమరల్ కారకాలు, మరియు న్యూరోనల్ కణాలతో సహ-సాగు చేసేటప్పుడు ఇన్నర్వేషన్ వంటివి CTCMతో వ్యాధి నమూనా యొక్క అవకాశాలను మెరుగుపరుస్తాయి.
ఈ అధ్యయనంలో పదమూడు పందులను ఉపయోగించారు. అన్ని జంతు ప్రక్రియలు సంస్థాగత మార్గదర్శకాలకు అనుగుణంగా నిర్వహించబడ్డాయి మరియు లూయిస్‌విల్లే విశ్వవిద్యాలయం యొక్క సంస్థాగత జంతు సంరక్షణ మరియు వినియోగ కమిటీచే ఆమోదించబడ్డాయి. అయోర్టిక్ ఆర్చ్‌ను క్లాంప్ చేసి, గుండెను 1 లీటరు స్టెరైల్ కార్డియోప్లేజియాతో (110 mM NaCl, 1.2 mM CaCl2, 16 mM KCl, 16 mM MgCl2, 10 mM NaHCO3, 5 U/mL హెపారిన్, pH 7.4 వరకు) పెర్ఫ్యూజ్ చేశారు; గుండెలను ల్యాబ్‌కు మంచు మీద రవాణా చేసే వరకు, అంటే సాధారణంగా 10 నిమిషాల కంటే తక్కువ సమయం వరకు, అతి శీతల కార్డియోప్లెజిక్ ద్రావణంలో భద్రపరిచారు. గుండెలను ల్యాబ్‌కు మంచు మీద రవాణా చేసే వరకు, అంటే సాధారణంగా 10 నిమిషాల కంటే తక్కువ సమయం వరకు, అతి శీతల కార్డియోప్లెజిక్ ద్రావణంలో భద్రపరిచారు. ట్రాన్స్‌పోర్టిరోవ్‌కి ల్యాబోరటోరీస్‌లో సెర్డా హ్రానిలీ కార్డియోప్లెగిచెస్కోమ్ రాస్ట్‌వోరే <10 నిమిషాలు. గుండెలను ప్రయోగశాలకు మంచులో రవాణా చేసే వరకు, అతి శీతల కార్డియోప్లెజిక్ ద్రావణంలో నిల్వ ఉంచారు, ఈ రవాణాకు సాధారణంగా 10 నిమిషాల కంటే తక్కువ సమయం పడుతుంది.将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钟。将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钟。 డెర్జైట్ సెర్డా వ్ లెడియానోయ్ కార్డియోప్లెగిస్ డో ట్రాన్స్‌పోర్టిరోవ్‌కి వి లాబోరటోరియూ న ల్డుదు, ఒబిచ్నో <10 నిమిషాలు. గుండెలను ప్రయోగశాలకు తరలించే వరకు, సాధారణంగా 10 నిమిషాల కంటే తక్కువ సమయం పాటు, ఐస్ కార్డియోప్లేజియా మీద ఉంచండి.
CTCM పరికరాన్ని సాలిడ్‌వర్క్స్ కంప్యూటర్-ఎయిడెడ్ డిజైన్ (CAD) సాఫ్ట్‌వేర్‌లో అభివృద్ధి చేశారు. కల్చర్ ఛాంబర్‌లు, డివైడర్‌లు మరియు ఎయిర్ ఛాంబర్‌లు CNC క్లియర్ యాక్రిలిక్ ప్లాస్టిక్‌తో తయారు చేయబడ్డాయి. 7mm వ్యాసం గల బ్యాక్-అప్ రింగ్ మధ్యలో హై డెన్సిటీ పాలిథిలిన్ (HDPE)తో తయారు చేయబడింది మరియు దాని కింద మీడియాను సీల్ చేయడానికి ఉపయోగించే సిలికాన్ ఓ-రింగ్‌ను అమర్చడానికి ఒక ఓ-రింగ్ గ్రూవ్‌ను కలిగి ఉంటుంది. ఒక పలుచని సిలికా పొర కల్చర్ ఛాంబర్‌ను సెపరేషన్ ప్లేట్ నుండి వేరు చేస్తుంది. ఈ సిలికాన్ పొరను 0.02″ మందపాటి సిలికాన్ షీట్ నుండి లేజర్‌తో కట్ చేశారు మరియు ఇది 35A కాఠిన్యాన్ని కలిగి ఉంటుంది. దిగువ మరియు పైభాగపు సిలికాన్ గాస్కెట్‌లను 1/16″ మందపాటి సిలికాన్ షీట్ నుండి లేజర్‌తో కట్ చేశారు మరియు ఇవి 50A కాఠిన్యాన్ని కలిగి ఉంటాయి. బ్లాక్‌ను బిగించడానికి మరియు గాలి చొరబడని సీల్‌ను సృష్టించడానికి 316L స్టెయిన్‌లెస్ స్టీల్ స్క్రూలు మరియు వింగ్ నట్‌లను ఉపయోగిస్తారు.
C-PACE-EM సిస్టమ్‌తో అనుసంధానించడానికి ఒక ప్రత్యేక ప్రింటెడ్ సర్క్యూట్ బోర్డ్ (PCB) రూపొందించబడింది. PCB పై ఉన్న స్విస్ మెషిన్ కనెక్టర్ సాకెట్లు, వెండి పూత పూసిన రాగి తీగలు మరియు ఎలక్ట్రోడ్‌లలోకి బిగించిన కాంస్య 0-60 స్క్రూల ద్వారా గ్రాఫైట్ ఎలక్ట్రోడ్‌లకు అనుసంధానించబడతాయి. ఈ ప్రింటెడ్ సర్క్యూట్ బోర్డ్‌ను 3D ప్రింటర్ కవర్‌లో ఉంచుతారు.
CTCM పరికరం ఒక ప్రోగ్రామబుల్ న్యూమాటిక్ యాక్యుయేటర్ (PPD) ద్వారా నియంత్రించబడుతుంది, ఇది హృదయ స్పందన చక్రం వలె నియంత్రిత ప్రసరణ పీడనాన్ని సృష్టిస్తుంది. గాలి గది లోపల పీడనం పెరిగేకొద్దీ, సాగే గుణం గల సిలికాన్ పొర పైకి వ్యాకోచించి, కణజాల ప్రదేశం కింద ఉన్న మాధ్యమాన్ని నెడుతుంది. ఈ ద్రవ బహిష్కరణ ద్వారా కణజాల ప్రాంతం సాగదీయబడుతుంది, ఇది డయాస్టోల్ సమయంలో గుండె యొక్క శారీరక వ్యాకోచాన్ని అనుకరిస్తుంది. విశ్రాంతి గరిష్ట స్థాయిలో ఉన్నప్పుడు, గ్రాఫైట్ ఎలక్ట్రోడ్‌ల ద్వారా విద్యుత్ ప్రేరణను ప్రయోగించారు, ఇది గాలి గదిలో పీడనాన్ని తగ్గించి, కణజాల భాగాల సంకోచానికి కారణమైంది. పైపు లోపల, గాలి వ్యవస్థలోని పీడనాన్ని గుర్తించడానికి ఒక పీడన సెన్సార్‌తో కూడిన హెమోస్టాటిక్ వాల్వ్ ఉంటుంది. పీడన సెన్సార్ ద్వారా గ్రహించిన పీడనం, ల్యాప్‌టాప్‌కు అనుసంధానించబడిన డేటా కలెక్టర్‌కు పంపబడుతుంది. ఇది గ్యాస్ ఛాంబర్ లోపల పీడనాన్ని నిరంతరం పర్యవేక్షించడానికి అనుమతిస్తుంది. ఛాంబర్ గరిష్ట పీడనం (ప్రామాణికంగా 80 mmHg, OS 140 mmHg) చేరినప్పుడు, 2 ms పాటు 4 V కు సెట్ చేయబడిన బైఫేసిక్ వోల్టేజ్ సిగ్నల్‌ను ఉత్పత్తి చేయడానికి, డేటా అక్విజిషన్ పరికరం C-PACE-EM సిస్టమ్‌కు ఒక సిగ్నల్‌ను పంపమని ఆదేశించబడింది.
గుండె భాగాలను సేకరించి, 6 వెల్స్‌లో కల్చర్ పరిస్థితులను ఈ క్రింది విధంగా నిర్వహించారు: సేకరించిన గుండెలను ట్రాన్స్‌ఫర్ వెసెల్ నుండి చల్లని (4° C.) కార్డియోప్లేజియా ఉన్న ట్రేలోకి బదిలీ చేయండి. ఎడమ జఠరికను స్టెరైల్ బ్లేడ్‌తో వేరుచేసి, 1-2 cm³ ముక్కలుగా కత్తిరించారు. ఈ కణజాలపు ముక్కలను టిష్యూ అడెసివ్‌తో టిష్యూ సపోర్ట్‌లకు అంటించి, టైరోడ్ ద్రావణం ఉన్న మరియు నిరంతరం ఆక్సిజన్ అందించబడే వైబ్రేటింగ్ మైక్రోటోమ్ టిష్యూ బాత్‌లో ఉంచారు (3 గ్రా/లీ 2,3-బ్యూటానెడియోన్ మోనోఆక్సిమ్ (BDM), 140 mM NaCl (8.18 గ్రా), 6 mM KCl (0.447 గ్రా), 10 mM D-గ్లూకోజ్ (1.86 గ్రా), 10 mM HEPES (2.38 గ్రా), 1 mM MgCl₂ (1 ml 1 M ద్రావణం), 1.8 mM CaCl₂ (1.8 ml 1 M ద్రావణం), 1 లీటరు వరకు ddH₂O). వైబ్రేటింగ్ మైక్రోటోమ్‌ను 80 Hz పౌనఃపున్యం, 2 mm క్షితిజ సమాంతర కంపన వ్యాప్తి మరియు 0.03 mm/s పురోగమన రేటు వద్ద 300 µm మందం గల ముక్కలను కత్తిరించడానికి సెట్ చేయబడింది. ద్రావణాన్ని చల్లగా ఉంచడానికి టిష్యూ బాత్ చుట్టూ మంచు ఉంచబడింది మరియు ఉష్ణోగ్రత 4°C వద్ద నిర్వహించబడింది. ఒక కల్చర్ ప్లేట్‌కు సరిపడా సెక్షన్‌లు లభించే వరకు, మైక్రోటోమ్ బాత్ నుండి టిష్యూ సెక్షన్‌లను, నిరంతరం ఆక్సిజన్‌ను అందించే టైరోడ్ ద్రావణం ఉన్న ఇంక్యుబేషన్ బాత్‌లోకి మంచు మీదకు బదిలీ చేయండి. ట్రాన్స్‌వెల్ కల్చర్‌ల కోసం, టిష్యూ సెక్షన్‌లను స్టెరైల్ 6 mm వెడల్పు గల పాలియురేథేన్ సపోర్ట్‌లకు అటాచ్ చేసి, 6 ml ఆప్టిమైజ్డ్ మీడియంలో (199 మీడియం, 1x ITS సప్లిమెంట్, 10% FBS, 5 ng/ml VEGF, 10 ng/ml FGF-ఆల్కలైన్ మరియు 2X యాంటీబయాటిక్-యాంటీఫంగల్) ఉంచారు. C-Pace ద్వారా టిష్యూ సెక్షన్‌లకు ఎలక్ట్రికల్ స్టిమ్యులేషన్ (10 V, పౌనఃపున్యం 1.2 Hz) వర్తింపజేయబడింది. TD పరిస్థితుల కోసం, ప్రతి మీడియం మార్పు వద్ద 100 nM మరియు 1 μM మోతాదులో తాజా T3 మరియు Dex జోడించబడ్డాయి. రోజుకు 3 సార్లు మీడియంను మార్చే ముందు ఆక్సిజన్‌తో సంతృప్తపరచబడింది. కణజాల విభాగాలను 37°C మరియు 5% CO2 వద్ద ఇంక్యుబేటర్‌లో కల్చర్ చేశారు.
CTCM కల్చర్‌ల కోసం, సవరించిన టైరోడ్ ద్రావణం ఉన్న పెట్రీ డిష్‌లో కణజాల విభాగాలను ప్రత్యేకంగా తయారు చేసిన 3D ప్రింటర్‌పై ఉంచారు. ఈ పరికరం, సపోర్ట్ రింగ్ వైశాల్యంలో 25% మేర గుండె ముక్క పరిమాణాన్ని పెంచేలా రూపొందించబడింది. ఇలా చేయడం వల్ల, గుండె విభాగాలు టైరోడ్ ద్రావణం నుండి మాధ్యమంలోకి మార్చిన తర్వాత మరియు డయాస్టోల్ సమయంలో సాగకుండా ఉంటాయి. హిస్టోఅక్రిలిక్ జిగురును ఉపయోగించి, 300 µm మందం ఉన్న విభాగాలను 7 mm వ్యాసం ఉన్న సపోర్ట్ రింగ్‌పై స్థిరపరిచారు. కణజాల విభాగాలను సపోర్ట్ రింగ్‌కు అంటించిన తర్వాత, అదనపు కణజాల విభాగాలను కత్తిరించి, ఒక పరికరానికి సరిపడా విభాగాలు సిద్ధమయ్యే వరకు అంటించిన కణజాల విభాగాలను తిరిగి మంచు (4°C) వద్ద ఉన్న టైరోడ్ ద్రావణపు తొట్టిలో ఉంచాలి. అన్ని పరికరాల మొత్తం ప్రాసెసింగ్ సమయం 2 గంటలకు మించకూడదు. 6 కణజాల విభాగాలను వాటి సపోర్ట్ రింగ్‌లకు అంటించిన తర్వాత, CTCM పరికరాన్ని అమర్చారు. CTCM కల్చర్ చాంబర్‌ను 21 ml ముందుగా ఆక్సిజన్‌తో నింపిన మాధ్యమంతో ముందుగానే నింపుతారు. కణజాల భాగాలను కల్చర్ ఛాంబర్‌లోకి మార్చి, పైపెట్‌తో గాలి బుడగలను జాగ్రత్తగా తొలగించండి. ఆ తర్వాత కణజాల భాగాన్ని రంధ్రంలోకి మార్గనిర్దేశం చేసి, నెమ్మదిగా దాని స్థానంలోకి నొక్కి ఉంచాలి. చివరగా, పరికరంపై ఎలక్ట్రోడ్ క్యాప్‌ను ఉంచి, పరికరాన్ని ఇంక్యుబేటర్‌కు మార్చండి. అప్పుడు CTCMను ఎయిర్ ట్యూబ్ మరియు C-PACE-EM సిస్టమ్‌కు కనెక్ట్ చేయండి. న్యూమాటిక్ యాక్యుయేటర్ తెరుచుకుంటుంది మరియు ఎయిర్ వాల్వ్ CTCMను తెరుస్తుంది. 2 ms పాటు బైఫేసిక్ పేసింగ్ సమయంలో 1.2 Hz వద్ద 4 V అందించడానికి C-PACE-EM సిస్టమ్ కాన్ఫిగర్ చేయబడింది. ఎలక్ట్రోడ్‌లపై గ్రాఫైట్ పేరుకుపోకుండా ఉండటానికి, మీడియంను రోజుకు రెండుసార్లు మరియు ఎలక్ట్రోడ్‌లను రోజుకు ఒకసారి మార్చారు. అవసరమైతే, కణజాల భాగాల కింద పడి ఉండగల గాలి బుడగలను బయటకు పంపడానికి వాటిని కల్చర్ వెల్స్ నుండి తీసివేయవచ్చు. MT చికిత్స పరిస్థితుల కోసం, ప్రతి మీడియం మార్పుతో 100 nM T3 మరియు 1 μM Dexతో T3/Dexను తాజాగా జోడించారు. CTCM పరికరాలను 37°C మరియు 5% CO2 వద్ద ఇంక్యుబేటర్‌లో ఉంచి కల్చర్ చేశారు.
గుండె ముక్కల సాగిన గమన పథాలను పొందడానికి, ఒక ప్రత్యేక కెమెరా వ్యవస్థను అభివృద్ధి చేశారు. ఒక SLR కెమెరాను (కానన్ రెబెల్ T7i, కానన్, టోక్యో, జపాన్) నవితార్ జూమ్ 7000 18-108mm మాక్రో లెన్స్‌తో (నవితార్, శాన్ ఫ్రాన్సిస్కో, CA) ఉపయోగించారు. పాత మాధ్యమాన్ని తాజా మాధ్యమంతో మార్చిన తర్వాత, గది ఉష్ణోగ్రత వద్ద దృశ్యీకరణను నిర్వహించారు. కెమెరాను 51° కోణంలో ఉంచి, సెకనుకు 30 ఫ్రేమ్‌ల చొప్పున వీడియోను రికార్డ్ చేశారు. మొదట, గుండె ముక్కల కదలికను లెక్కించడానికి ఇమేజ్-జె (Image-J) తో పాటు ఓపెన్ సోర్స్ సాఫ్ట్‌వేర్‌ను (MUSCLEMOTION43) ఉపయోగించారు. శబ్దాన్ని (noise) నివారించడానికి, కొట్టుకుంటున్న గుండె ముక్కలలోని ఆసక్తి గల ప్రాంతాలను (regions of interest) నిర్వచించడానికి మ్యాట్‌ల్యాబ్ (MATLAB) (మాత్‌వర్క్స్, నాటిక్, MA, USA) ఉపయోగించి మాస్క్‌ను సృష్టించారు. చేతితో విభజించిన మాస్క్‌లను ఒక ఫ్రేమ్ క్రమంలోని అన్ని చిత్రాలకు వర్తింపజేసి, ఆపై వాటిని మజిల్ మోషన్ (MUSCLEMOTION) ప్లగ్-ఇన్‌కు పంపారు. మజిల్ మోషన్, రిఫరెన్స్ ఫ్రేమ్‌తో పోలిస్తే ప్రతి ఫ్రేమ్‌లోని పిక్సెల్‌ల కదలికను లెక్కించడానికి వాటి సగటు తీవ్రతను ఉపయోగిస్తుంది. హృదయ చక్రం సమయంలో చక్ర సమయాన్ని లెక్కించడానికి మరియు కణజాల సాగుదలను అంచనా వేయడానికి డేటాను రికార్డ్ చేసి, ఫిల్టర్ చేసి ఉపయోగించారు. రికార్డ్ చేసిన వీడియోను ఫస్ట్-ఆర్డర్ జీరో-ఫేజ్ డిజిటల్ ఫిల్టర్‌ను ఉపయోగించి పోస్ట్-ప్రాసెస్ చేశారు. కణజాల సాగుదలను (పీక్-టు-పీక్) లెక్కించడానికి, రికార్డ్ చేసిన సిగ్నల్‌లోని శిఖరాలు మరియు లోయల మధ్య తేడాను గుర్తించడానికి పీక్-టు-పీక్ విశ్లేషణను నిర్వహించారు. అదనంగా, సిగ్నల్ డ్రిఫ్ట్‌ను తొలగించడానికి 6వ ఆర్డర్ పాలినోమియల్‌ను ఉపయోగించి డిట్రెండింగ్ నిర్వహించబడింది. మొత్తం కణజాల చలనం, చక్ర సమయం, సడలింపు సమయం మరియు సంకోచ సమయాన్ని నిర్ధారించడానికి MATLABలో ప్రోగ్రామ్ కోడ్ అభివృద్ధి చేయబడింది (సప్లిమెంటరీ ప్రోగ్రామ్ కోడ్ 44).
స్ట్రెయిన్ విశ్లేషణ కోసం, యాంత్రిక సాగుదల అంచనా కొరకు సృష్టించిన అవే వీడియోలను ఉపయోగించి, మేము మొదటగా MUSCLEMOTION సాఫ్ట్‌వేర్ ప్రకారం చలన శిఖరాలను (చలనం యొక్క అత్యధిక (పై) మరియు అత్యల్ప (కింది) బిందువులు) సూచించే రెండు చిత్రాలను ట్రేస్ చేసాము. ఆ తర్వాత మేము కణజాల ప్రాంతాలను విభజించి, విభజించబడిన కణజాలానికి ఒక రకమైన షేడింగ్ అల్గారిథమ్‌ను వర్తింపజేసాము (అనుబంధ చిత్రం 2a). విభజించబడిన కణజాలాన్ని పది ఉప-ఉపరితలాలుగా విభజించి, ప్రతి ఉపరితలంపై ఒత్తిడిని ఈ క్రింది సమీకరణాన్ని ఉపయోగించి లెక్కించాము: స్ట్రెయిన్ = (Sup-Sdown)/Sdown, ఇక్కడ Sup మరియు Sdown అనేవి వరుసగా ఫాబ్రిక్ యొక్క పై మరియు కింది నీడల నుండి ఆకారం యొక్క దూరాలు (అనుబంధ చిత్రం 2b).
గుండె భాగాలను 4% పారాఫార్మాల్డిహైడ్‌లో 48 గంటల పాటు స్థిరీకరించారు. స్థిరీకరించిన కణజాలాలను 10% మరియు 20% సుక్రోజ్‌లో 1 గంట పాటు, ఆపై 30% సుక్రోజ్‌లో రాత్రంతా నిర్జలీకరణం చేశారు. ఆ తర్వాత ఆ భాగాలను ఆప్టిమమ్ కటింగ్ టెంపరేచర్ కాంపౌండ్ (OCT కాంపౌండ్)లో పొదిగి, ఐసోపెంటేన్/డ్రై ఐస్ బాత్‌లో క్రమంగా గడ్డకట్టించారు. వేరుచేసే వరకు OCT ఎంబెడింగ్ బ్లాక్‌లను -80 °C వద్ద నిల్వ చేయండి. 8 μm మందం గల భాగాలుగా స్లైడ్‌లను తయారు చేశారు.
గుండె భాగాల నుండి OCTని తొలగించడానికి, స్లైడ్‌లను హీటింగ్ బ్లాక్‌పై 95 °C వద్ద 5 నిమిషాల పాటు వేడి చేయండి. ప్రతి స్లైడ్‌కు 1 ml PBS జోడించి, గది ఉష్ణోగ్రత వద్ద 30 నిమిషాల పాటు ఇంక్యుబేట్ చేయండి, ఆ తర్వాత గది ఉష్ణోగ్రత వద్ద 15 నిమిషాల పాటు PBSలో 0.1% ట్రైటాన్-Xను ఉంచి భాగాలను పెర్మియేట్ చేయండి. నాన్-స్పెసిఫిక్ యాంటీబాడీలు నమూనాకు బంధించబడకుండా నిరోధించడానికి, స్లైడ్‌లకు 1 ml 3% BSA ద్రావణాన్ని జోడించి, గది ఉష్ణోగ్రత వద్ద 1 గంట పాటు ఇంక్యుబేట్ చేయండి. ఆ తర్వాత BSAను తొలగించి, స్లైడ్‌లను PBSతో కడగాలి. ప్రతి నమూనాను పెన్సిల్‌తో గుర్తించండి. ప్రాథమిక యాంటీబాడీలను (1% BSAలో 1:200 నిష్పత్తిలో పలుచబరిచినవి) (కనెక్సిన్ 43 (అబ్‌క్యామ్; #AB11370), NFATC4 (అబ్‌క్యామ్; #AB99431) మరియు ట్రోపోనిన్-T (థర్మో సైంటిఫిక్; #MA5-12960)) 90 నిమిషాల పాటు జోడించారు, ఆ తర్వాత మౌస్ అలెక్సా ఫ్లోర్ 488 (థర్మో సైంటిఫిక్; #A16079), రాబిట్ అలెక్సా ఫ్లోర్ 594 (థర్మో సైంటిఫిక్; #T6391) లకు వ్యతిరేకంగా ద్వితీయ యాంటీబాడీలను (1% BSAలో 1:200 నిష్పత్తిలో పలుచబరిచినవి) అదనంగా 90 నిమిషాల పాటు జోడించారు. PBSతో 3 సార్లు కడిగారు. బ్యాక్‌గ్రౌండ్ నుండి టార్గెట్ స్టెయినింగ్‌ను వేరు చేయడానికి, మేము కేవలం ద్వితీయ యాంటీబాడీని మాత్రమే కంట్రోల్‌గా ఉపయోగించాము. చివరగా, DAPI న్యూక్లియర్ స్టెయిన్‌ను జోడించి, స్లైడ్‌లను వెక్టాషీల్డ్ (వెక్టర్ లాబొరేటరీస్)లో ఉంచి, నెయిల్ పాలిష్‌తో సీల్ చేశారు. -x మాగ్నిఫికేషన్) మరియు 40x మాగ్నిఫికేషన్‌తో కీన్స్ మైక్రోస్కోప్.
WGA స్టెయినింగ్ కోసం PBSలో 5 μg/ml వద్ద ఉన్న WGA-అలెక్సా ఫ్లోర్ 555 (థర్మో సైంటిఫిక్; #W32464)ను ఉపయోగించి, గది ఉష్ణోగ్రత వద్ద 30 నిమిషాల పాటు ఫిక్స్ చేసిన సెక్షన్లకు పూయడం జరిగింది. ఆ తర్వాత స్లైడ్‌లను PBSతో కడిగి, ప్రతి స్లైడ్‌కు సుడాన్ బ్లాక్ జోడించి 30 నిమిషాల పాటు ఇంక్యుబేట్ చేశారు. అనంతరం స్లైడ్‌లను PBSతో కడిగి, వెక్టాషీల్డ్ ఎంబెడింగ్ మీడియంను జోడించారు. స్లైడ్‌లను కీన్స్ మైక్రోస్కోప్‌లో 40x మాగ్నిఫికేషన్ వద్ద వీక్షించారు.
పైన వివరించిన విధంగా నమూనాల నుండి OCTని తొలగించారు. OCTని తొలగించిన తర్వాత, స్లైడ్‌లను రాత్రంతా బౌయిన్ ద్రావణంలో ముంచి ఉంచండి. ఆ తర్వాత స్లైడ్‌లను 1 గంట పాటు స్వేదన జలంతో కడిగి, 10 నిమిషాల పాటు బిబ్రిచ్ అలో యాసిడ్ ఫుక్సిన్ ద్రావణంలో ఉంచారు. తర్వాత స్లైడ్‌లను స్వేదన జలంతో కడిగి, 10 నిమిషాల పాటు 5% ఫాస్ఫోమోలిబ్డినం/5% ఫాస్ఫోటంగ్‌స్టిక్ యాసిడ్ ద్రావణంలో ఉంచారు. కడగకుండా, స్లైడ్‌లను నేరుగా 15 నిమిషాల పాటు అనైలిన్ బ్లూ ద్రావణంలోకి మార్చారు. తర్వాత స్లైడ్‌లను స్వేదన జలంతో కడిగి, 2 నిమిషాల పాటు 1% ఎసిటిక్ యాసిడ్ ద్రావణంలో ఉంచారు. స్లైడ్‌లను 200 N ఇథనాల్‌లో ఆరబెట్టి, జైలీన్‌లోకి మార్చారు. రంగు వేసిన స్లైడ్‌లను 10x ఆబ్జెక్టివ్‌తో కీన్స్ మైక్రోస్కోప్‌ను ఉపయోగించి వీక్షించారు. కీన్స్ అనలైజర్ సాఫ్ట్‌వేర్‌ను ఉపయోగించి ఫైబ్రోసిస్ ప్రాంత శాతాన్ని లెక్కించారు.
CyQUANT™ MTT కణ జీవసామర్థ్య పరీక్ష (ఇన్విట్రోజెన్, కార్ల్స్‌బాడ్, CA), కేటలాగ్ నంబర్ V13154, తయారీదారు ప్రోటోకాల్ ప్రకారం కొన్ని మార్పులతో నిర్వహించబడింది. ముఖ్యంగా, MTT విశ్లేషణ సమయంలో కణజాల పరిమాణం ఏకరీతిగా ఉండేలా చూసుకోవడానికి 6 మిమీ వ్యాసం గల సర్జికల్ పంచ్‌ను ఉపయోగించారు. తయారీదారు ప్రోటోకాల్ ప్రకారం, MTT సబ్‌స్ట్రేట్ ఉన్న 12-వెల్ ప్లేట్‌లోని వెల్స్‌లో కణజాలాలను ఒక్కొక్కటిగా ప్లేట్ చేశారు. ఈ సెక్షన్‌లను 37° C వద్ద 3 గంటల పాటు ఇంక్యుబేట్ చేయగా, జీవించి ఉన్న కణజాలం MTT సబ్‌స్ట్రేట్‌ను జీవక్రియ చేసి ఊదా రంగు ఫోర్మాజాన్ సమ్మేళనాన్ని ఏర్పరుస్తుంది. గుండె సెక్షన్‌ల నుండి ఊదా రంగు ఫోర్మాజాన్‌ను సంగ్రహించడానికి, MTT ద్రావణాన్ని 1 మి.లీ DMSOతో భర్తీ చేసి, 37 °C వద్ద 15 నిమిషాల పాటు ఇంక్యుబేట్ చేశారు. నమూనాలను 96-వెల్ క్లియర్ బాటమ్ ప్లేట్లలో DMSOలో 1:10 నిష్పత్తిలో పలుచగా చేసి, సైటేషన్ ప్లేట్ రీడర్ (బయోటెక్) ఉపయోగించి 570 nm వద్ద ఊదా రంగు తీవ్రతను కొలిచారు. రీడింగ్‌లను గుండె యొక్క ప్రతి స్లైస్ బరువుకు అనుగుణంగా సాధారణీకరించారు.
ముందుగా వివరించిన విధంగా గ్లూకోజ్ వినియోగ పరీక్ష కోసం హార్ట్ స్లైస్ మీడియా స్థానంలో 1 μCi/ml [5-3H]-గ్లూకోజ్ (మొరావెక్ బయోకెమికల్స్, బ్రీయా, CA, USA) కలిగిన మీడియాను ఉంచారు. 4 గంటల ఇంక్యుబేషన్ తర్వాత, 100 µl 0.2 N HCl ఉన్న ఒక ఓపెన్ మైక్రోసెంట్రిఫ్యూజ్ ట్యూబ్‌లోకి 100 µl మీడియాను కలపండి. ఆ తర్వాత, 37°C వద్ద 72 గంటల పాటు [3H]2O ను ఆవిరి చేయడానికి, ఆ ట్యూబ్‌ను 500 μl dH2O ఉన్న ఒక స్కింటిలేషన్ ట్యూబ్‌లో ఉంచారు. ఆ తర్వాత, స్కింటిలేషన్ ట్యూబ్ నుండి మైక్రోసెంట్రిఫ్యూజ్ ట్యూబ్‌ను తీసివేసి, 10 ml స్కింటిలేషన్ ఫ్లూయిడ్‌ను కలపండి. ట్రై-కార్బ్ 2900TR లిక్విడ్ స్కింటిలేషన్ ఎనలైజర్ (ప్యాకార్డ్ బయోసైన్స్ కంపెనీ, మెరిడెన్, CT, USA) ఉపయోగించి స్కింటిలేషన్ కౌంట్స్ నిర్వహించారు. ఆ తర్వాత [5-3H]-గ్లూకోజ్ విశిష్ట క్రియాశీలత, అసంపూర్ణ సమతౌల్యం మరియు నేపథ్యం, ​​[5-3H]-ను లేబుల్ చేయని గ్లూకోజ్‌తో విలీనం చేయడం, మరియు స్కింటిలేషన్ కౌంటర్ సామర్థ్యాన్ని పరిగణనలోకి తీసుకుని గ్లూకోజ్ వినియోగాన్ని లెక్కించారు. ఈ డేటాను గుండె భాగాల ద్రవ్యరాశికి అనుగుణంగా సాధారణీకరించారు.
ట్రైజోల్‌లో కణజాల హోమోజెనైజేషన్ తర్వాత, తయారీదారు ప్రోటోకాల్ ప్రకారం క్వైజెన్ miRNeasy మైక్రో కిట్ #210874 ఉపయోగించి గుండె భాగాల నుండి RNA వేరుచేయబడింది. RNAsec లైబ్రరీ తయారీ, సీక్వెన్సింగ్ మరియు డేటా విశ్లేషణ ఈ క్రింది విధంగా నిర్వహించబడ్డాయి:
RNA లైబ్రరీ తయారీకి ప్రారంభ పదార్థంగా ప్రతి నమూనాకు 1 μg RNA ఉపయోగించబడింది. తయారీదారు సిఫార్సులను అనుసరించి, ఇల్యూమినా కోసం NEBNext UltraTM RNA లైబ్రరీ ప్రిపరేషన్ కిట్ (NEB, USA) ఉపయోగించి సీక్వెన్సింగ్ లైబ్రరీలు రూపొందించబడ్డాయి మరియు ప్రతి నమూనా యొక్క అట్రిబ్యూట్ సీక్వెన్సులకు ఇండెక్స్ కోడ్‌లు జోడించబడ్డాయి. క్లుప్తంగా, పాలి-T ఒలిగోన్యూక్లియోటైడ్‌లతో జతచేయబడిన మాగ్నెటిక్ బీడ్స్‌ను ఉపయోగించి మొత్తం RNA నుండి mRNA శుద్ధి చేయబడింది. NEBNext ఫస్ట్ స్ట్రాండ్ సింథసిస్ రియాక్షన్ బఫర్ (5X)లో అధిక ఉష్ణోగ్రత వద్ద ద్విసంయోజక కాటయాన్‌లను ఉపయోగించి ఫ్రాగ్మెంటేషన్ నిర్వహించబడుతుంది. రాండమ్ హెక్సామర్ ప్రైమర్‌లు మరియు M-MuLV రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్టేజ్ (RNase H-) ఉపయోగించి ఫస్ట్ స్ట్రాండ్ cDNA సంశ్లేషణ చేయబడింది. ఆ తర్వాత, DNA పాలిమరేస్ I మరియు RNase H ఉపయోగించి సెకండ్ స్ట్రాండ్ cDNA సంశ్లేషణ చేయబడుతుంది. మిగిలిన ఓవర్‌హాంగ్‌లు ఎక్సోన్యూక్లియేస్/పాలిమరేస్ చర్య ద్వారా బ్లంట్ ఎండ్స్‌గా మార్చబడతాయి. DNA ఖండం యొక్క 3′ చివర అడెనిలేషన్ చేసిన తర్వాత, హైబ్రిడైజేషన్ కోసం దానిని సిద్ధం చేయడానికి హెయిర్‌పిన్ లూప్ నిర్మాణంతో కూడిన NEBNext అడాప్టర్‌ను దానికి జతచేస్తారు. 150-200 bp ప్రాధాన్య పొడవు గల cDNA ఖండాలను ఎంపిక చేయడానికి, లైబ్రరీ ఖండాలను AMPure XP సిస్టమ్ (బెక్మాన్ కౌల్టర్, బెవర్లీ, USA) ఉపయోగించి శుద్ధి చేశారు. ఆ తర్వాత, అడాప్టర్‌తో లైగేట్ చేయబడిన, పరిమాణం ఆధారంగా ఎంపిక చేసిన cDNAతో కూడిన 3 μl యూజర్ ఎంజైమ్ (NEB, USA)ను PCRకు ముందు 37°C వద్ద 15 నిమిషాలు, ఆపై 95°C వద్ద 5 నిమిషాలు ఉపయోగించారు. అనంతరం, ఫ్యూషన్ హై-ఫిడిలిటీ DNA పాలిమరేస్, యూనివర్సల్ PCR ప్రైమర్‌లు, మరియు ఇండెక్స్ (X) ప్రైమర్‌లను ఉపయోగించి PCR నిర్వహించారు. చివరగా, PCR ఉత్పత్తులను (AMPure XP సిస్టమ్) శుద్ధి చేసి, అజిలెంట్ బయోఅనలైజర్ 2100 సిస్టమ్‌పై లైబ్రరీ నాణ్యతను అంచనా వేశారు. ఆ తర్వాత, cDNA లైబ్రరీని నోవాసెక్ సీక్వెన్సర్ ఉపయోగించి సీక్వెన్స్ చేశారు. ఇల్యూమినా నుండి వచ్చిన రా ఇమేజ్ ఫైల్స్‌ను కాసావా బేస్ కాలింగ్ ఉపయోగించి రా రీడ్స్‌గా మార్చారు. రీడ్ సీక్వెన్సులు మరియు వాటికి సంబంధించిన బేస్ క్వాలిటీలను కలిగి ఉన్న FASTQ(fq) ఫార్మాట్ ఫైల్స్‌లో రా డేటాను నిల్వ చేస్తారు. ఫిల్టర్ చేసిన సీక్వెన్సింగ్ రీడ్స్‌ను Sscrofa11.1 రిఫరెన్స్ జీనోమ్‌తో సరిపోల్చడానికి HISAT2ను ఎంచుకోండి. సాధారణంగా, HISAT2 4 బిలియన్ బేస్‌ల కంటే పెద్ద జీనోమ్‌లతో సహా, ఏ పరిమాణంలోనైనా ఉన్న జీనోమ్‌లకు మద్దతు ఇస్తుంది మరియు చాలా పారామీటర్లకు డిఫాల్ట్ విలువలు సెట్ చేయబడి ఉంటాయి. ప్రస్తుతం అందుబాటులో ఉన్న అత్యంత వేగవంతమైన సిస్టమ్ అయిన HISAT2ను ఉపయోగించి, RNA Seq డేటా నుండి స్ప్లైసింగ్ రీడ్స్‌ను ఇతర ఏ పద్ధతితో పోల్చినా సమానమైన లేదా అంతకంటే మెరుగైన కచ్చితత్వంతో సమర్థవంతంగా అలైన్ చేయవచ్చు.
ట్రాన్స్క్రిప్ట్‌ల సమృద్ధి జన్యు వ్యక్తీకరణ స్థాయిని నేరుగా ప్రతిబింబిస్తుంది. జన్యు వ్యక్తీకరణ స్థాయిలను జీనోమ్ లేదా ఎక్సాన్‌లతో అనుబంధించబడిన ట్రాన్స్క్రిప్ట్‌ల సమృద్ధి (సీక్వెన్సింగ్ కౌంట్) ద్వారా అంచనా వేస్తారు. రీడ్‌ల సంఖ్య జన్యు వ్యక్తీకరణ స్థాయిలు, జన్యు పొడవు మరియు సీక్వెన్సింగ్ డెప్త్‌కు అనులోమానుపాతంలో ఉంటుంది. DESeq2 ప్యాకేజీని ఉపయోగించి FPKM (ప్రతి మిలియన్ బేస్ పెయిర్‌లకు సీక్వెన్స్ చేయబడిన ప్రతి వెయ్యి బేస్ పెయిర్‌ల ట్రాన్స్క్రిప్ట్‌కు ఫ్రాగ్మెంట్‌లు) లెక్కించబడ్డాయి మరియు డిఫరెన్షియల్ ఎక్స్‌ప్రెషన్ యొక్క P-విలువలు నిర్ణయించబడ్డాయి. ఆ తర్వాత, అంతర్నిర్మిత R-ఫంక్షన్ “p.adjust” ఆధారంగా బెంజమిని-హోచ్‌బర్గ్ పద్ధతి9ని ఉపయోగించి ప్రతి P-విలువకు ఫాల్స్ డిస్కవరీ రేట్ (FDR)ని లెక్కించాము.
గుండె భాగాల నుండి వేరు చేసిన RNAను, థర్మో వారి సూపర్ స్క్రిప్ట్ IV విలో మాస్టర్ మిక్స్ (థర్మో, క్యాట్. నం. 11756050) ఉపయోగించి 200 ng/μl గాఢత వద్ద cDNAగా మార్చబడింది. అప్లైడ్ బయోసిస్టమ్స్ ఎండ్యూరా ప్లేట్ మైక్రోయాంప్ 384-వెల్ పారదర్శక రియాక్షన్ ప్లేట్ (థర్మో, క్యాట్. నం. 4483319) మరియు మైక్రోయాంప్ ఆప్టికల్ అడెసివ్ (థర్మో, క్యాట్. నం. 4311971) ఉపయోగించి క్వాంటిటేటివ్ RT-PCR నిర్వహించబడింది. ప్రతి వెల్‌లో 5 µl టాక్‌మాన్ ఫాస్ట్ అడ్వాన్స్‌డ్ మాస్టర్ మిక్స్ (థర్మో, క్యాట్ # 4444557), 0.5 µl టాక్‌మాన్ ప్రైమర్ మరియు 3.5 µl H2O కలిపి రియాక్షన్ మిశ్రమం తయారు చేయబడింది. అప్లైడ్ బయోసిస్టమ్స్ క్వాన్‌స్టూడియో 5 రియల్-టైమ్ PCR పరికరం (384-వెల్ మాడ్యూల్; ఉత్పత్తి సంఖ్య A28135) ఉపయోగించి ప్రామాణిక qPCR సైకిల్స్ నడపబడ్డాయి మరియు CT విలువలు కొలవబడ్డాయి. టాక్‌మాన్ ప్రైమర్‌లను థర్మో నుండి కొనుగోలు చేశారు (GAPDH (Ss03375629_u1), PARP12 (Ss06908795_m1), PKDCC (Ss06903874_m1), CYGB (Ss06900188_m1), RGL1 (Ss06868890_m1), ACTN1 (Ss01009508_mH), GATA4 (Ss03383805_u1), GJA1 (Ss03374839_u1), COL1A2 (Ss03375009_u1 ), COL3A1 (Ss04323794_m1), ACTA2 (Ss04245588_m1)). అన్ని నమూనాల CT విలువలను హౌస్‌కీపింగ్ జీన్ GAPDHకు సాధారణీకరించారు.
తయారీదారు ప్రోటోకాల్ ప్రకారం, NT-ProBNP కిట్ (పంది) (క్యాట్. నం. MBS2086979, మైబయోసోర్స్) ఉపయోగించి NT-ProBNP యొక్క మీడియా విడుదల అంచనా వేయబడింది. క్లుప్తంగా, ప్రతి వెల్‌కు 250 µl చొప్పున ప్రతి నమూనా మరియు ప్రమాణాన్ని రెండుసార్లు జోడించారు. నమూనాను జోడించిన వెంటనే, ప్రతి వెల్‌కు 50 µl అస్సే రిఏజెంట్ A ను జోడించండి. ప్లేట్‌ను మెల్లగా కదిలించి, సీలెంట్‌తో మూసివేయండి. ఆ తర్వాత టాబ్లెట్‌లను 37°C వద్ద 1 గంట పాటు ఇంక్యుబేట్ చేశారు. తర్వాత ద్రావణాన్ని ఆస్పిరేట్ చేసి, 350 µl 1X వాష్ ద్రావణంతో వెల్స్‌ను 4 సార్లు కడగాలి, ప్రతిసారి వాష్ ద్రావణాన్ని 1-2 నిమిషాల పాటు ఇంక్యుబేట్ చేయాలి. ఆ తర్వాత ప్రతి వెల్‌కు 100 µl అస్సే రిఏజెంట్ B ను జోడించి, ప్లేట్ సీలెంట్‌తో మూసివేయండి. టాబ్లెట్‌ను మెల్లగా కదిలించి, 37°C వద్ద 30 నిమిషాల పాటు ఇంక్యుబేట్ చేశారు. ద్రావణాన్ని ఆస్పిరేట్ చేసి, 350 µl 1X వాష్ ద్రావణంతో వెల్స్‌ను 5 సార్లు కడగండి. ప్రతి వెల్‌కు 90 µl సబ్‌స్ట్రేట్ ద్రావణాన్ని జోడించి, ప్లేట్‌ను సీల్ చేయండి. ప్లేట్‌ను 37°C వద్ద 10-20 నిమిషాల పాటు ఇంక్యుబేట్ చేయండి. ప్రతి వెల్‌కు 50 µl స్టాప్ సొల్యూషన్‌ను జోడించండి. 450 nm వద్ద సెట్ చేయబడిన సైటేషన్ (బయోటెక్) ప్లేట్ రీడర్‌ను ఉపయోగించి ప్లేట్‌ను వెంటనే కొలిచారు.
5% టైప్ I దోష రేటుతో పారామీటర్‌లో 10% సంపూర్ణ మార్పును గుర్తించడానికి >80% శక్తిని అందించే సమూహ పరిమాణాలను ఎంచుకోవడానికి శక్తి విశ్లేషణలు నిర్వహించబడ్డాయి. 5% టైప్ I దోష రేటుతో పారామీటర్‌లో 10% సంపూర్ణ మార్పును గుర్తించడానికి >80% శక్తిని అందించే సమూహ పరిమాణాలను ఎంచుకోవడానికి శక్తి విశ్లేషణలు నిర్వహించబడ్డాయి. అనాలిస్ మోష్నోస్టి బైల్ వైపోల్నెన్ టు వైబోరా రాజ్మెరోవ్ గ్రూప్, కోటోరీ ఒబెస్పెచాట్ >80% మాస్నోస్టి డ్లీయా 10% అబ్సోల్యుట్నోగో ఇజ్మెనేనియా పరామితి 5% ఛాస్టొయ్ ఓషిబాక్ టిపా I. 5% టైప్ I దోష రేటుతో 10% సంపూర్ణ పారామీటర్ మార్పును గుర్తించడానికి >80% శక్తిని అందించే సమూహ పరిమాణాలను ఎంచుకోవడానికి శక్తి విశ్లేషణ నిర్వహించబడింది.进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％I型错误率的组大小。进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％I型错误率的组大小。 బైల్ ప్రొవెడెన్ అనాలిజ్ మోష్నోస్టి డిలియా వైబోరా రజ్మేరా గ్రూప్పీ, కోటోరియ్ ఒబెస్పెచిల్ బి > 80% మాస్నోస్టి%% అబ్సోల్యుట్నోగో ఇజ్మెనేనియా పారామెట్రోవ్ మరియు 5% ఛాస్టోట్ ఓషిబాక్ టిపా I. 10% సంపూర్ణ పారామీటర్ మార్పును మరియు 5% టైప్ I దోష రేటును గుర్తించడానికి >80% శక్తిని అందించే సమూహ పరిమాణాన్ని ఎంచుకోవడానికి శక్తి విశ్లేషణ నిర్వహించబడింది.ప్రయోగానికి ముందు కణజాల విభాగాలు యాదృచ్ఛికంగా ఎంపిక చేయబడ్డాయి. అన్ని విశ్లేషణలు కండిషన్ బ్లైండ్‌గా జరిగాయి మరియు మొత్తం డేటా విశ్లేషించబడిన తర్వాత మాత్రమే నమూనాలు డీకోడ్ చేయబడ్డాయి. అన్ని గణాంక విశ్లేషణలను నిర్వహించడానికి గ్రాఫ్‌ప్యాడ్ ప్రిజం సాఫ్ట్‌వేర్ (శాన్ డియాగో, CA) ఉపయోగించబడింది. అన్ని గణాంకాలకు, p-విలువలు <0.05 వద్ద గణనీయమైనవిగా పరిగణించబడ్డాయి. అన్ని గణాంకాలకు, p-విలువలు <0.05 వద్ద గణనీయమైనవిగా పరిగణించబడ్డాయి. Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. అన్ని గణాంకాలకు, p-విలువలు <0.05 వద్ద గణనీయమైనవిగా పరిగణించబడ్డాయి.对于所有统计数据，p 值在值<0.05 时被认为是显着的。对于所有统计数据，p 值在值<0.05 时被认为是显着的。 Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. అన్ని గణాంకాలకు, p-విలువలు <0.05 వద్ద గణనీయమైనవిగా పరిగణించబడ్డాయి.కేవలం 2 పోలికలతో డేటాపై టూ-టెయిల్డ్ స్టూడెంట్స్ టి-టెస్ట్ నిర్వహించబడింది. బహుళ సమూహాల మధ్య ప్రాముఖ్యతను నిర్ధారించడానికి వన్-వే లేదా టూ-వే ANOVA ఉపయోగించబడింది. పోస్ట్ హాక్ పరీక్షలను నిర్వహిస్తున్నప్పుడు, బహుళ పోలికలను పరిగణనలోకి తీసుకోవడానికి ట్యూకీ సవరణ వర్తింపజేయబడింది. పద్ధతుల విభాగంలో వివరించినట్లుగా, FDR మరియు p.adjust లను గణిస్తున్నప్పుడు RNAsec డేటాకు ప్రత్యేక గణాంక పరిగణనలు ఉంటాయి.
అధ్యయన రూపకల్పనపై మరింత సమాచారం కోసం, ఈ వ్యాసానికి లింక్ చేయబడిన నేచర్ రీసెర్చ్ రిపోర్ట్ సారాంశాన్ని చూడండి.