Nature.com saytiga tashrif buyurganingiz uchun tashakkur. Siz foydalanayotgan brauzer versiyasida CSS qo'llab-quvvatlashi cheklangan. Eng yaxshi tajriba uchun sizga yangilangan brauzerdan foydalanishingizni tavsiya qilamiz (yoki Internet Explorer-da moslik rejimini o'chirib qo'ying). Shu bilan birga, uzluksiz qo'llab-quvvatlashni ta'minlash uchun biz saytni uslublar va JavaScriptsiz renderlaymiz.
Dori vositalarini tekshirish uchun yurakning fiziologik muhitini aniq qayta tiklay oladigan ishonchli in vitro tizimga ehtiyoj mavjud. Inson yurak to'qimasini kulturalash tizimlarining cheklanganligi yurak dori ta'sirini noto'g'ri talqin qilishga olib keldi. Bu yerda biz yurak bo'laklarini elektromexanik ravishda rag'batlantiradigan va yurak siklining sistolik va diastolik fazalarida fiziologik cho'zilishdan o'tadigan yurak to'qimasini kulturalash modelini (CTCM) ishlab chiqdik. 12 kunlik kulturadan so'ng, bu yondashuv yurak bo'laklarining hayotiyligini qisman yaxshiladi, ammo ularning strukturaviy yaxlitligini to'liq saqlamadi. Shuning uchun, kichik molekula skriningidan so'ng, biz muhitimizga 100 nM triiodotironin (T3) va 1 μM deksametazon (Dex) qo'shilishi bo'laklarning mikrotuzilmasini 12 kun davomida saqlab turishini aniqladik. T3/Dex bilan birgalikda CTCM tizimi transkripsiya profillarini, hayotiyligini, metabolik faolligini va strukturaviy yaxlitligini 12 kun davomida yangi yurak to'qimasi bilan bir xil darajada saqlab qoldi. Bundan tashqari, yurak to'qimalarining madaniyatda haddan tashqari cho'zilishi gipertrofik yurak signalizatsiyasini keltirib chiqaradi, bu esa CTCM ning yurak cho'zilishi natijasida yuzaga keladigan gipertrofik holatlarni taqlid qilish qobiliyatiga dalil beradi. Xulosa qilib aytganda, CTCM uzoq vaqt davomida madaniyatda yurak fiziologiyasi va patofiziologiyasini modellashtirishi mumkin, bu esa ishonchli dori skriningini ta'minlaydi.
Klinik tadqiqotlardan oldin, inson qalbining fiziologik muhitini aniq qayta tiklay oladigan ishonchli in vitro tizimlar zarur. Bunday tizimlar o'zgargan mexanik cho'zilish, yurak urish tezligi va elektrofiziologik xususiyatlarni taqlid qilishi kerak. Hayvon modellari odatda yurak fiziologiyasi uchun skrining platformasi sifatida ishlatiladi, inson qalbida dorilarning ta'sirini aks ettirishda ishonchliligi cheklangan1,2. Oxir-oqibat, ideal yurak to'qimalari madaniyati eksperimental modeli (CTCM) turli terapevtik va farmakologik aralashuvlar uchun juda sezgir va o'ziga xos bo'lgan model bo'lib, inson qalbining fiziologiyasi va patofiziologiyasini aniq qayta tiklaydi3. Bunday tizimning yo'qligi yurak yetishmovchiligini davolashning yangi usullarini kashf etishni cheklaydi4,5 va bozordan chiqishning asosiy sababi sifatida dori kardiotoksikligiga olib keldi6.
So'nggi o'n yillikda sakkizta yurak-qon tomir bo'lmagan dorilar klinik qo'llanilishdan olib tashlandi, chunki ular QT oralig'ining uzayishiga olib keladi, bu esa qorincha aritmiyalari va to'satdan o'limga olib keladi7. Shunday qilib, yurak-qon tomir samaradorligi va toksikligini baholash uchun ishonchli klinikgacha skrining strategiyalariga ehtiyoj ortib bormoqda. Yaqinda odamlar tomonidan qo'zg'atilgan pluripotent ildiz hujayralaridan olingan kardiomiositlarning (hiPS-CM) dori skriningi va toksiklikni tekshirishda qo'llanilishi bu muammoga qisman yechim beradi. Biroq, hiPS-CMlarning yetilmagan tabiati va yurak to'qimalarining ko'p hujayrali murakkabligining yo'qligi bu usulning asosiy cheklovlari hisoblanadi. Yaqinda o'tkazilgan tadqiqotlar shuni ko'rsatdiki, bu cheklovni o'z-o'zidan qisqarishlar boshlanganidan ko'p o'tmay yurak to'qimasi gidrogellarini hosil qilish uchun erta hiPS-CM dan foydalanish va vaqt o'tishi bilan elektr stimulyatsiyasini asta-sekin oshirish orqali qisman bartaraf etish mumkin. Biroq, bu hiPS-CM mikroto'qimalarida kattalar miokardining yetuk elektrofiziologik va qisqarish xususiyatlari yo'q. Bundan tashqari, inson yurak to'qimasi yanada murakkab tuzilishga ega bo'lib, u turli xil hujayra turlarining, jumladan, endotelial hujayralar, neyronlar va stromal fibroblastlarning heterojen aralashmasidan iborat bo'lib, ular hujayradan tashqari matritsa oqsillarining ma'lum to'plamlari bilan o'zaro bog'langan. Voyaga yetgan sutemizuvchilar yuragida kardiomiosit bo'lmagan populyatsiyalarning11,12,13 bu heterojenligi individual hujayra turlaridan foydalangan holda yurak to'qimasini modellashtirishda asosiy to'siq hisoblanadi. Ushbu asosiy cheklovlar fiziologik va patologik sharoitlarda butun miokard to'qimasini kultivatsiya qilish usullarini ishlab chiqish muhimligini ta'kidlaydi.
Inson yuragining yupqa (300 µm) kesimlari butun inson miokardining istiqbolli modeli ekanligi isbotlangan. Bu usul inson yurak to'qimalariga o'xshash to'liq 3D ko'p hujayrali tizimga kirish imkonini beradi. Biroq, 2019-yilgacha kultivatsiya qilingan yurak kesimlaridan foydalanish qisqa (24 soat) kultivatsiyaning saqlanib qolishi bilan cheklangan edi. Bu bir qator omillar, jumladan, fizik-mexanik cho'zilishning yo'qligi, havo-suyuqlik interfeysi va yurak to'qimalarining ehtiyojlarini qo'llab-quvvatlamaydigan oddiy muhitlardan foydalanish bilan bog'liq. 2019-yilda bir nechta tadqiqot guruhlari yurak to'qimalarining kultivatsiya tizimlariga mexanik omillarni kiritish kultivatsiya umrini uzaytirishi, yurak ifodasini yaxshilashi va yurak patologiyasini taqlid qilishi mumkinligini ko'rsatdilar. Ikkita nafis tadqiqot 17 va 18 shuni ko'rsatadiki, bir o'qli mexanik yuklash kultivatsiya paytida yurak fenotipiga ijobiy ta'sir ko'rsatadi. Biroq, bu tadqiqotlar yurak siklining dinamik uch o'lchovli fizik-mexanik yuklanishidan foydalanmadi, chunki yurak kesimlari izometrik kuchlanish kuchlari 17 yoki chiziqli auksotonik yuklama 18 bilan yuklangan edi. To'qimalarni cho'zishning bu usullari ko'plab yurak genlarining bostirilishiga yoki g'ayritabiiy cho'zilish reaksiyalari bilan bog'liq genlarning haddan tashqari ifodalanishiga olib keldi. Shunisi e'tiborga loyiqki, Pitoulis va boshqalar 19 kuch o'tkazgich teskari aloqasi va kuchlanish drayverlaridan foydalangan holda yurak siklini qayta tiklash uchun dinamik yurak bo'laklarini kulturalash vannasini ishlab chiqdilar. Ushbu tizim in vitro yurak siklini aniqroq modellashtirish imkonini bersa-da, usulning murakkabligi va past o'tkazuvchanligi ushbu tizimni qo'llashni cheklaydi. Yaqinda bizning laboratoriyamiz cho'chqa va inson yurak to'qimalarining bo'laklarining hayotiyligini 6 kungacha saqlab turish uchun elektr stimulyatsiyasi va optimallashtirilgan muhitdan foydalangan holda soddalashtirilgan kulturalash tizimini ishlab chiqdi20,21.
Ushbu qo'lyozmada biz yurak sikli davomida uch o'lchovli yurak fiziologiyasi va patofiziologik kengayishni takrorlaydigan gumoral belgilarni o'z ichiga olgan cho'chqa yuragining qismlaridan foydalangan holda yurak to'qimasi madaniyati modelini (CTCM) tasvirlaymiz. Ushbu CTCM klinikadan oldingi dori sinovlari uchun sutemizuvchilar yuragining fiziologiyasi/patofiziologiyasini taqlid qiluvchi tejamkor, o'rtacha o'tkazuvchanlikdagi yurak tizimini taqdim etish orqali klinikadan oldingi dori bashoratining aniqligini ilgari hech qachon erishilmagan darajaga oshirishi mumkin.
Gemodinamik mexanik signallar in vitro 22,23,24 da kardiomiositlar funktsiyasini saqlab qolishda muhim rol o'ynaydi. Ushbu qo'lyozmada biz fiziologik chastotalarda (1,2 Gts, daqiqada 72 urish) ham elektr, ham mexanik stimulyatsiyani keltirib chiqarish orqali kattalar yurak muhitini taqlid qila oladigan CTCM (1a-rasm) ishlab chiqdik. Diastol paytida to'qimalarning haddan tashqari cho'zilishini oldini olish uchun to'qima hajmini 25% ga oshirish uchun 3D bosib chiqarish moslamasi ishlatilgan (1b-rasm). C-PACE tizimi tomonidan qo'zg'atilgan elektr stimulyatori yurak siklini to'liq takrorlash uchun ma'lumotlarni yig'ish tizimidan foydalanib, sistoldan 100 ms oldin boshlash uchun vaqt belgilandi. To'qima madaniyati tizimi yuqori kameradagi yurak bo'laklarining kengayishiga olib keladigan moslashuvchan silikon membranani tsiklik ravishda kengaytirish uchun dasturlashtiriladigan pnevmatik aktuatordan (LB Engineering, Germaniya) foydalanadi. Tizim bosim o'tkazgich orqali tashqi havo liniyasiga ulangan, bu esa bosimni (± 1 mmHg) va vaqtni (± 1 ms) aniq sozlash imkonini berdi (1c-rasm).
a To'qima qismini qurilmaning kultivatsiya kamerasi ichidagi ko'k rangda ko'rsatilgan 7 mm tayanch halqasiga ulang. Kultivatsiya kamerasi havo kamerasidan yupqa egiluvchan silikon membrana bilan ajratilgan. Oqimlarning oldini olish uchun har bir kamera orasiga qistirma qo'ying. Qurilma qopqog'ida elektr stimulyatsiyasini ta'minlaydigan grafit elektrodlari mavjud. b Katta to'qima qurilmasi, yo'naltiruvchi halqa va tayanch halqasining sxematik ko'rinishi. To'qima bo'laklari (jigarrang) katta o'lchamli qurilmaga joylashtiriladi, yo'naltiruvchi halqa esa qurilmaning tashqi chetidagi yivga joylashtiriladi. Yo'naltiruvchidan foydalanib, to'qima akril yopishtiruvchi bilan qoplangan tayanch halqasini yurak to'qimasi kesimi ustiga ehtiyotkorlik bilan joylashtiring. c Dasturlashtiriladigan pnevmatik aktuator (PPD) tomonidan boshqariladigan havo kamerasi bosimining funktsiyasi sifatida elektr stimulyatsiyasi vaqtini ko'rsatuvchi grafit. Bosim sensorlari yordamida elektr stimulyatsiyasini sinxronlashtirish uchun ma'lumotlarni yig'ish moslamasi ishlatilgan. Kultivatsiya kamerasidagi bosim belgilangan chegaraga yetganda, elektr stimulyatsiyasini ishga tushirish uchun C-PACE-EM ga impuls signali yuboriladi. d Inkubator tokchasiga joylashtirilgan to'rtta CTCM tasviri. Pnevmatik sxema orqali bitta PPDga to'rtta qurilma ulangan va pnevmatik sxemadagi bosimni kuzatish uchun gemostatik klapanga bosim sensorlari kiritilgan. Har bir qurilma oltita to'qima bo'limidan iborat.
Bitta pnevmatik aktuator yordamida biz har biri 6 ta to'qima bo'limini sig'dira oladigan 4 ta CTCM moslamasini boshqarishga muvaffaq bo'ldik (1d-rasm). CTCMda havo kamerasidagi havo bosimi suyuqlik kamerasidagi sinxron bosimga aylanadi va yurak bo'lagining fiziologik kengayishini keltirib chiqaradi (2a-rasm va 1-qo'shimcha film). 80 mm simob ustunida to'qima cho'zilishini baholash. San'at. to'qima bo'limlarining 25% ga cho'zilganligini ko'rsatdi (2b-rasm). Bu foiz cho'zilishi normal yurak bo'limi qisqarishi uchun 2,2-2,3 µm fiziologik sarkomer uzunligiga mos kelishi ko'rsatilgan17,19,25. To'qima harakati maxsus kamera sozlamalari yordamida baholandi (1-qo'shimcha rasm). To'qima harakatining amplitudasi va tezligi (2c, d-rasm) yurak sikli davomidagi cho'zilish va sistol va diastol vaqtidagi vaqtga mos keldi (2b-rasm). Yurak to'qimasining qisqarish va relaksatsiya paytida cho'zilishi va tezligi kulturada 12 kun davomida o'zgarmas bo'lib qoldi (2f-rasm). Elektr stimulyatsiyasining kultivatsiya paytida qisqarishga ta'sirini baholash uchun biz soyalash algoritmi yordamida faol deformatsiyani aniqlash usulini ishlab chiqdik (2a, b-qo'shimcha rasm) va elektr stimulyatsiyasi bilan va elektr stimulyatsiyasisiz deformatsiyalarni ajrata oldik. Yurakning xuddi shu qismi (2f-rasm). Kesilgan joyning harakatlanuvchi qismida (R6-9) elektr stimulyatsiyasi paytida kuchlanish elektr stimulyatsiyasi bo'lmagan holatga qaraganda 20% yuqori edi, bu elektr stimulyatsiyasining qisqarish funktsiyasiga qo'shgan hissasini ko'rsatadi.
Havo kamerasi bosimi, suyuqlik kamerasi bosimi va to'qima harakati o'lchovlarining vakillik izlari kamera bosimi suyuqlik kamerasi bosimini o'zgartirishini va to'qima bo'lagining mos keladigan harakatini keltirib chiqarishini tasdiqlaydi. b To'qima bo'laklarining foiz cho'zilishining vakillik izlari (ko'k) foiz cho'zilishi (to'q sariq). c Yurak bo'lagining o'lchangan harakati o'lchangan harakat tezligiga mos keladi. (d) Yurak bo'lagida tsiklik harakat (ko'k chiziq) va tezlikning (to'q sariq nuqta chiziq) vakillik traektoriyalari. e Tsikl vaqtini (har bir guruhda n = 19 bo'lak, turli cho'chqalardan), qisqarish vaqtini (har bir guruhda n = 19 bo'lak, turli cho'chqalardan), relaksatsiya vaqtini (har bir guruhda n = 19 bo'lak, turli cho'chqalardan), to'qima harakatini (n = 25) turli cho'chqalardan), cho'qqi sistolik tezlikni (n = 24(D0), 25(D12) bo'lak/guruh turli cho'chqalardan) va cho'qqi relaksatsiya tezligini (n=24(D0), 25(D12) bo'lak/guruh turli cho'chqalardan). Ikki dumli Student t-testi hech qanday parametrda sezilarli farq ko'rsatmadi. f (qizil) va (ko'k) elektr stimulyatsiyasisiz to'qima kesimlarining vakillik kuchlanish tahlili izlari, bir xil kesimdan olingan to'qima kesimlarining o'nta mintaqaviy maydoni. Pastki panellarda turli kesimlardan olingan o'nta sohada elektr stimulyatsiyasi bilan va elektr stimulyatsiyasisiz to'qima kesimlaridagi kuchlanishdagi foiz farqining miqdoriy ko'rsatkichi ko'rsatilgan. (n = turli cho'chqalardan 8 ta bo'lak/guruh, Ikki dumli Student t-testi bajariladi; ****p < 0.0001, **p < 0.01, *p < 0.05). (n = turli cho'chqalardan 8 ta bo'lak/guruh, Ikki dumli Student t-testi bajariladi; ****p < 0.0001, **p < 0.01, *p < 0.05). (n = 8 srezov/gruppu ot raznyx sviney, provoditsya dvustoronniy t-kriteriy Styudenta; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05). (n = turli cho'chqalardan olingan 8 ta bo'lim/guruh, ikki dumli Student t-testi; ****p<0.0001, **p<0.01, *p<0.05). （n = 8 dín/lín，mēngčičičičičičiičičičičiičičičiičičiičičiiičiičiiiičnīnīn ；****p <0.0001，**p <0.01，**p <0.01，*5. （n = 8 dín/lín，mēngčičičičičičiičičičičiičičičiičičiičičiiičiičiiiičnīnīn ；****p <0.0001，**p <0.01，**p <0.01，*5. (n = 8 srezov/gruppu, ot raznyx sviney, dvustoronniy mezon Styudenta; ****p <0,0001, **p <0,01, *p <0,05). (n = 8 ta bo'lim/guruh, turli cho'chqalardan, ikki dumli Student t-testi; ****p<0.0001, **p<0.01, *p<0.05).Xato satrlari o'rtacha ± standart og'ishni ifodalaydi.
Oldingi statik biomimetik yurak bo'laklarini kulturalash tizimimizda [20, 21] biz elektr stimulyatsiyasini qo'llash va muhit tarkibini optimallashtirish orqali 6 kun davomida yurak bo'laklarining hayotiyligini, funktsiyasini va strukturaviy yaxlitligini saqlab qoldik. Biroq, 10 kundan keyin bu ko'rsatkichlar keskin pasayib ketdi. Biz avvalgi statik biomimetik kulturalash tizimimiz 20, 21 nazorat sharoitlarida (Ctrl) kulturalangan bo'laklarga murojaat qilamiz va biz ilgari optimallashtirilgan muhitimizni MC sharoitlari va bir vaqtning o'zida mexanik va elektr stimulyatsiyasi (CTCM) ostida kultura sifatida ishlatamiz. Birinchidan, biz elektr stimulyatsiyasisiz mexanik stimulyatsiya 6 kun davomida to'qima hayotiyligini saqlab qolish uchun yetarli emasligini aniqladik (Qo'shimcha 3a, b-rasm). Qizig'i shundaki, STCM yordamida fizio-mexanik va elektr stimulyatsiyasining kiritilishi bilan 12 kunlik yurak bo'laklarining hayotiyligi MS sharoitida yangi yurak bo'laklaridagi kabi bir xil bo'lib qoldi, lekin MTT tahlilida ko'rsatilganidek, Ctrl sharoitida emas (1-rasm). Bu shuni ko'rsatadiki, yurak siklini mexanik stimulyatsiya qilish va simulyatsiya qilish to'qima bo'laklarini avvalgi statik kulturalash tizimimizda xabar qilinganidan ikki baravar ko'proq vaqt davomida hayotiyligini saqlab qolishi mumkin. Biroq, yurak troponini T va konneksin 43 ni immunoetikalash orqali to'qima bo'limlarining strukturaviy yaxlitligini baholash shuni ko'rsatdiki, 12-kuni MC to'qimalarida konneksin 43 ifodasi o'sha kuni nazorat guruhidagilarga qaraganda sezilarli darajada yuqori bo'lgan. Biroq, konneksin 43 ning bir xil ifodasi va Z-disk shakllanishi to'liq saqlanib qolmadi (3b-rasm). Biz to'qima strukturaviy yaxlitligini aniqlash uchun sun'iy intellekt (AI) tizimidan foydalanamiz26, troponin-T va konneksinni bo'yashga asoslangan tasvirga asoslangan chuqur o'rganish quvur liniyasi43 yordamida yurak bo'laklarining strukturaviy yaxlitligi va floresansini lokalizatsiya kuchi nuqtai nazaridan avtomatik ravishda aniqlash mumkin. Ushbu usul ma'lumotnomada tasvirlanganidek, yurak to'qimasining strukturaviy yaxlitligini avtomatlashtirilgan va xolis tarzda ishonchli tarzda aniqlash uchun Konvolyutsion Neyron Tarmog'i (CNN) va chuqur o'rganish tizimidan foydalanadi. 26. MC to'qimasi statik nazorat bo'limlariga nisbatan 0-kunga nisbatan strukturaviy o'xshashlikning yaxshilanganligini ko'rsatdi. Bundan tashqari, Massonning trixrom bo'yashida 12-kunlik madaniyatdagi nazorat sharoitlariga nisbatan MS sharoitida fibrozning sezilarli darajada past foizi aniqlandi (3c-rasm). CTCM 12-kuni yurak to'qimasi kesimlarining hayotiyligini yangi yurak to'qimasidagiga o'xshash darajaga oshirgan bo'lsa-da, yurak kesimlarining strukturaviy yaxlitligini sezilarli darajada yaxshilamadi.
Ustunli grafikda yangi yurak bo'laklarining (D0) yoki yurak bo'laklarining MTT hayotiyligini 12 kun davomida statik madaniyatda (D12 Ctrl) yoki CTCMda (D12 MC) ko'rsatilgan (turli cho'chqalardan olingan n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) bo'lak/guruh, bir tomonlama ANOVA testi o'tkaziladi; ####p < 0.0001 D0 ga nisbatan va **p < 0.01 D12 Ctrl ga nisbatan). Ustunli grafikda yangi yurak bo'laklarining (D0) yoki yurak bo'laklarining MTT yashovchanligining miqdoriy ko'rsatkichi 12 kun davomida statik kulturada (D12 Ctrl) yoki CTCMda (D12 MC) ko'rsatilgan (turli cho'chqalardan olingan n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) bo'lak/guruh, bir tomonlama ANOVA testi o'tkaziladi; ####p < 0.0001 D0 ga nisbatan va **p < 0.01 D12 Ctrl ga nisbatan).Gistogrammada turli cho'chqalardan olingan MTT yangi yurak kesmalarining (D0) yoki yurak kesmalarining 12 kun davomida statik kulturada (D12 nazorat) yoki CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 nazorat). ), 12 (D12 MC) kesma/guruhda yashovchanligi miqdoriy jihatdan ko'rsatilgan, bir tomonlama ANOVA testi o'tkaziladi;####p < 0,0001 po sravneniyu s D0 va **p < 0,01 po sravneniyu s D12 Ctrl). ####p < D0 ga nisbatan 0.0001 va **p < D12 Ctrl ga nisbatan 0.01). a língíngíngíngíníngínínín (D12 Ctrl) líCTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) yíngíngín (D0) 或心脏切片培养12 天的MTT 活力的量化)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA mēngčičiD0 dēngči，####p < 0,0001， d12 Ctrl yēi，**p < 0,01)。 a língíngíngíngíníngínínín (D12 Ctrl) líCTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) yíngíngín (D0) ，mēngčičiči12 (D12 MC) dēngči/lín，lēngčičičANOVA língčičiči D0 língínčii, ####p CI 211D ， ywí，**p。)Yangi yurak kesmalarida (D0) yoki statik kulturada (D12 nazorat) yoki CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 nazorat)), turli cho'chqalardan olingan 12 (D12 MC) kesma/guruhda 12 kun davomida kulturalangan yurak kesmalarida MTT ning yashovchanligini miqdoriy aniqlashni ko'rsatuvchi gistogramma, bir tomonlama ANOVA testi;####p < 0,0001 po sravneniyu s D0, **p < 0,01 po sravneniyu s D12 Ctrl). ####p < D0 ga nisbatan 0.0001, **p < D12 ga nisbatan 0.01 Ctrl).b Troponin-T (yashil), connexin 43 (qizil) va DAPI (ko'k) yangi ajratilgan yurak kesimlarida (D0) yoki yurak kesimlarida statik sharoitlarda (Ctrl) yoki CTCM sharoitida (MC) 12 kun davomida yetishtirilgan) vakillik immunofloresans tasvirlarida (bo'sh shkala = 100 µm). Yurak to'qimasining strukturaviy yaxlitligini sun'iy intellekt yordamida aniqlash (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) har xil cho'chqadan olingan bo'laklar/guruhlar, bir tomonlama ANOVA testi o'tkaziladi; ####p < 0.0001 D0 ga nisbatan va ****p < 0.0001 D12 Ctrl ga nisbatan). Yurak to'qimasining strukturaviy yaxlitligini sun'iy intellekt orqali aniqlash (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) turli cho'chqalardan olingan bo'laklar/guruhlar, bir tomonlama ANOVA testi o'tkaziladi; ####p < 0.0001 D0 ga nisbatan va ****p < 0.0001 D12 Ctrl ga nisbatan). Kolichestvennaya otsenka strukturnoy selostnosti serdechnoy tkani iskusstvennym intellektom (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) srezov/grupp ot raznyx sviney, provoditsya odnofaktornyy test ANOVA provoditsya odnofaktornyy test ANOVA < s#0#0; ##0#0 ****p < 0,0001 po sravneniyu s D12 Ctrl). Yurak to'qimalarining strukturaviy yaxlitligini sun'iy intellekt yordamida aniqlash (turli cho'chqalardan olingan n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) bo'limlar/guruhlar, bir tomonlama ANOVA testi o'tkazildi; ####p < 0.0001 va D0 va ****p < 0.0001 bilan D12 Ctrl bilan solishtirganda).n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) boʻlaklari/guruhlari har xil choʻchqalar, bir tomonlama ANOVA testi #0#0; líí，****p < 0,0001 d12 Ctrl líní）。n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) boʻlaklari/guruhlari har xil choʻchqalar, bir tomonlama ANOVA testi #0#0;#0. yD0jíí，****p < 0,0001 yD12 Ctrl míní）。 Iskusstvennyy intellekt uchun kolichestvennoy otsenki strukturnoy celostnosti serdechnoy tkani (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) srezov/gruppu kajdoy iz raznyx sviney, odnostorniy test ANOVA va boshqalar D##0#01; ##0#01 < 0,0001 po sravneniyu s D12 Ctrl). Yurak to'qimalarining strukturaviy yaxlitligini aniqlash uchun sun'iy intellekt (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) turli cho'chqalarning bo'limlari/guruhlari, bir tomonlama ANOVA testi; ####p<0.0001 va .D0 Taqqoslash uchun ****p < 0.0001 D12 Ctrl bilan solishtirganda). c Masson trixrom bo'yog'i bilan bo'yalgan yurak bo'laklari uchun vakillik tasvirlari (chapda) va miqdoriy ko'rsatkichlar (o'ngda) (turli cho'chqalardan olingan n = 10 bo'lak/guruh, bir tomonlama ANOVA testi o'tkaziladi; ####p < 0.0001 D0 ga nisbatan va ***p < 0.001 D12 Ctrl ga nisbatan). c Masson trixrom bo'yog'i bilan bo'yalgan yurak bo'laklari uchun vakillik tasvirlari (chapda) va miqdoriy ko'rsatkichlar (o'ngda) (turli cho'chqalardan olingan n = 10 bo'lak/guruh, bir tomonlama ANOVA testi o'tkaziladi; #### p < 0.0001 D0 ga nisbatan va ***p < 0.001 D12 Ctrl ga nisbatan). c Reprezentativnye izbrajeniya (sleva) va kolichestvennaya otsenka (sprava) srezov serdtsa, okrashennyx trixromnym krasitelem Massona (mashtab bez pokrytiya = 500 mkm) (n = 10 srezov/gruppu ot raznyx sviney, vypolniy test <#VA#; 0,0001 po sravneniyu s D0 i ***p < 0,001 po sravneniyu s D12 Ctrl). c Masson trixrom bo'yog'i bilan bo'yalgan yurak kesimlarining vakillik tasvirlari (chapda) va miqdoriy ko'rsatkichlari (o'ngda) (turli cho'chqalardan olingan n = 10 kesim/guruh, bir tomonlama ANOVA testi o'tkazildi; #### D0 ga nisbatan p < 0.0001 va D12 Ctrl ga nisbatan ***p < 0.001). c ljjjnjīngīngīngīngīngīngīngīngīngīngīngīngīngīngīngīngīngīngīngīngīngīn（n（n（n（n（n（n（n（n（n（0µn 10 yjín/yín，míčičičičičičiičičičičičičiičičiičiičičičičičičang ANOVA yēngčii；#### p < 0,0001 yjnjjín 0.0001 yīd0 （0.01 djī*p Ctrl mímí）. C i masson y i l i l i l i l i l i l i 裸尺度 = 500 µm） （n = 10 个 切片 组 每 组 来自 不同 猪 ， 进行 单向 单向 Anova 测试；#### p < 0,0001 yD0 míi，***p < 0,001 d12 Ctrl míi）. c Reprezentativnye izobrajeniya (sleva) va kolichestvennyy analiz (sprava) srezov serdtsa, okrashennyx trixromnym krasitelem Massona (chistaya shkala = 500 mkm) (n = 10 srezov/gruppa, kajdir ot drugoy srezov/gruppa, proteschno srezov, protessochno proteschno) analiza ;### #p < 0,0001 po sravneniyu s D0, ***p < 0,001 po sravneniyu s D12 Ctrl). c Masson trixrom bo'yog'i bilan bo'yalgan yurak kesimlarining vakillik tasvirlari (chapda) va miqdoriy ko'rsatkichlari (o'ngda) (bo'sh = 500 µm) (n = 10 ta kesim/guruh, har biri turli cho'chqadan olingan, bir tomonlama dispersiya tahlili bilan sinovdan o'tkazilgan;### # p < 0.0001 D0 ga nisbatan, ***p < 0.001 D12 Ctrl ga nisbatan).Xato satrlari o'rtacha ± standart og'ishni ifodalaydi.
Biz madaniyat muhitiga kichik molekulalar qo'shish orqali CTCM madaniyati paytida kardiomiositlarning yaxlitligini yaxshilash va fibroz rivojlanishini kamaytirish mumkin degan gipotezani ilgari surdik. Shuning uchun biz chalkashtiruvchi omillar soni kam bo'lgani uchun statik nazorat madaniyatlarimizdan foydalanib kichik molekulalarni skrining qildik20,21. Ushbu skrining uchun deksametazon (Dex), triiodotironin (T3) va SB431542 (SB) tanlandi. Ushbu kichik molekulalar ilgari hiPSC-CM madaniyatlarida sarkomer uzunligini, T-naychalarini va o'tkazuvchanlik tezligini oshirish orqali kardiomiositlarning yetilishini rag'batlantirish uchun ishlatilgan. Bundan tashqari, Dex (glyukokortikoid) ham, SB ham yallig'lanishni bostirishi ma'lum29,30. Shuning uchun biz ushbu kichik molekulalardan birini yoki ularning kombinatsiyasini qo'shish yurak bo'limlarining strukturaviy yaxlitligini yaxshilaydimi yoki yo'qligini tekshirdik. Dastlabki skrining uchun har bir birikmaning dozasi hujayra madaniyati modellarida keng qo'llaniladigan konsentratsiyalar (1 μM Dex27, 100 nM T327 va 2,5 μM SB31) asosida tanlandi. 12 kunlik madaniyatdan so'ng, T3 va Dex kombinatsiyasi optimal kardiomiotsit strukturaviy yaxlitligiga va minimal tolali remodelatsiyaga olib keldi (4 va 5-qo'shimcha rasmlar). Bundan tashqari, T3 va Dexning bu konsentratsiyalarini ikki yoki ikki baravar oshirish normal konsentratsiyalarga nisbatan zararli ta'sir ko'rsatdi (6a, b-qo'shimcha rasmlar).
Dastlabki skriningdan so'ng, biz 4 ta madaniyat sharoitini yuzma-yuz taqqosladik (4a-rasm): Ctrl: optimallashtirilgan muhit yordamida ilgari tasvirlangan statik madaniyatimizda yetishtirilgan yurak bo'laklari; 20.21 TD: Chorshanba kuni T3 va Ctrl qo'shilgan Dex; MC: oldindan optimallashtirilgan muhit yordamida CTCMda yetishtirilgan yurak bo'laklari; va MT: muhitga T3 va Dex qo'shilgan CTCM. 12 kunlik yetishtirishdan so'ng, MS va MT to'qimalarining hayotiyligi MTT tahlili bilan baholangan yangi to'qimalardagi kabi saqlanib qoldi (4b-rasm). Qizig'i shundaki, transvell madaniyatlariga (TD) T3 va Dex qo'shilishi Ctrl sharoitlariga nisbatan hayotiylikning sezilarli darajada yaxshilanishiga olib kelmadi, bu esa yurak bo'laklarining hayotiyligini saqlashda mexanik stimulyatsiyaning muhim rolini ko'rsatadi.
Mexanik stimulyatsiya va T3/Dex qo'shimchasining 12 kun davomida muhitga ta'sirini baholash uchun ishlatiladigan to'rtta madaniyat sharoitini tasvirlaydigan eksperimental dizayn diagrammasi. b Ustunli grafikda barcha 4 ta ekish sharoitida (Ctrl, TD, MC va MT) yangi yurak bo'laklari (D0) bilan taqqoslaganda 12 kunlik yashovchanlikning miqdoriy ko'rsatkichi ko'rsatilgan (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD va D12 MT), 12 (D12 MC) turli cho'chqalardan olingan bo'lak/guruh, bir tomonlama ANOVA testi o'tkaziladi; ####p < 0.0001, ###p < D0 ga nisbatan 0.001 va **p < 0.01 D12 Ctrl ga nisbatan). b Ustunli grafikda barcha 4 ta ekish sharoitida (Ctrl, TD, MC va MT) yangi yurak bo'laklari (D0) bilan taqqoslaganda 12 kunlik yashovchanlikning miqdoriy ko'rsatkichi ko'rsatilgan (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD va D12 MT), 12 (D12 MC) turli cho'chqalardan olingan bo'lak/guruh, bir tomonlama ANOVA testi o'tkaziladi; ####p < 0.0001, ###p < D0 ga nisbatan 0.001 va **p < 0.01 D12 ctrl ga nisbatan). b Gistogramma pokazyvaet kolichestvennuyu otsenku jiznesposobnosti cherez 12 dney posle kultivirovaniya vo vseh 4 usloviyax madaniyati (nazorat, TD, MC i MT) po sravneniyu so svejimi srezami serdtsa (D0) (n = 18) (D0, D12), TD i D12 MT), 12 (D12 MC) srezov/gruppu ot raznyx sviney, provoditsya odnostorniy test ANOVA; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 po sravneniyu s D0 i **p sravneyul po < 0,01 str2). b Ustunli grafikda barcha 4 ta ekish sharoitida (nazorat, TD, MC va MT) yangi yurak kesmalari (D0) bilan taqqoslaganda 12 kunlik yashovchanlikning miqdoriy ko'rsatkichi ko'rsatilgan (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD va D12 MT), 12 (D12 MC) turli cho'chqalardan olingan kesmalar/guruh, bir tomonlama ANOVA testi; ####p < 0.0001, ###p < 0.001 va D0 va **p < 0.01 va D12 Ctrl bilan taqqoslaganda). b língjíngíngíní4 língíngínín（Ctrl、TD、MC MT） mēngjīngī(D0) (n = 18 (n = 18 (D12 Dl) 12Dl) TD d12 MT), mēngčičiči12 (D12 MC) yēngči/lín, lēngčičang ANOVA mínjčičijčijčičaNOVA；####p < 0.0001；####p < 0.0001（#0#0.0. líí，**p < 0,01 d12mínjín）。b 4 12 (D12 MC) b Gistogramma, pokazyvayushchaya vse 4 usloviya kultivirovaniya (kontrol, TD, MC i MT) po sravneniyu so svejimi srezami serdtsa (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD va D12 MT), ot raz12 vin srezy/gruppa, odnostorniy test ANOVA ####p <0,0001, ###p <0,001 po sravneniyu s D0, **p <0,01 po sravneniyu s kontrolem D12). b Gistogramma barcha 4 ta madaniyat sharoitlarini (nazorat, TD, MC va MT) yangi yurak kesimlari (D0) bilan taqqoslaydi (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD va D12 MT), turli cho'chqalardan olingan 12 ta (D12 MC) kesim/guruh, bir tomonlama ANOVA testi; ####p<0.0001, ###p<0.001 va D0, **p<0.01 va nazorat D12). c Ustunli grafigida barcha 4 ta ekish sharoitida (Ctrl, TD, MC va MT) yangi yurak bo'laklari (D0) bilan taqqoslaganda glyukoza oqimining miqdoriy ko'rsatkichi ko'rsatilgan (turli cho'chqalardan olingan n = 6 bo'lak/guruh, bir tomonlama ANOVA testi o'tkaziladi; ###p < 0,001, D0 bilan taqqoslaganda va ***p < 0,001 D12 Ctrl bilan taqqoslaganda). c Ustunli grafigida barcha 4 ta ekish sharoitida (Ctrl, TD, MC va MT) yangi yurak bo'laklari (D0) bilan taqqoslaganda glyukoza oqimining miqdoriy ko'rsatkichi ko'rsatilgan (turli cho'chqalardan olingan n = 6 bo'lak/guruh, bir tomonlama ANOVA testi o'tkaziladi; ###p < 0,001, D0 bilan taqqoslaganda va ***p < 0,001 D12 Ctrl bilan taqqoslaganda). c Gistogramma pokazyvaet kolichestvennuyu otsenku potoka glyukozy cherez 12 dney posle kultivirovaniya vo vsex 4 usloviyax kultivirovaniya (nazorat, TD, MC i MT) po sravneniyu so svejimi srezami serdtsa (D0) (n = 6 sm) Vypolnyaetsya test ANOVA; ###p < 0,001 po sravneniyu s D0 va ***p < 0,001 po sravneniyu s D12 Ctrl). c Gistogrammada barcha 4 ta ekish sharoitida (nazorat, TD, MC va MT) yangi yurak kesmalari (D0) bilan taqqoslaganda glyukoza oqimining miqdoriy ko'rsatkichi ko'rsatilgan (turli cho'chqalardan olingan n = 6 kesma/guruh, bir tomonlama ANOVA testi o'tkazildi; ###p < D0 ga nisbatan 0,001 va ***p < D12 Ctrl ga nisbatan 0,001). c língíngíngíníní4 língíngínín (Ctrl、TD、MC mín MT） díngíngíngín (D0) língíngín 2dín 天的葡萄糖通量定量（n = 6 片/组，来自不同猪，单向执行ANOVA 测试；###p < 0.001，与D0 míí，***p < 0.001 d12 D12 Ctrl mínì）。 C língčičiči 4 yēngčiči （（ctrl 、 td mc mt） mcēngčičn ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， chànjàníàí ANOVA yàngínín；###p < 0.001， d00 yín，***p < 0.001 díD12 Ctrl língín）。 c Gistogramma, pokazyvayushchaya kolichestvennuyu osenku potoka glyukozy cherez 12 dney posle kultivirovaniya dlya vseh 4 usloviy madaniyati (kontrol, TD, MC i MT) po sravneniyu so svejimi srezami serdtsa (D0) (n =) odnostoroniy Byli provedeny testy ANOVA ###p < 0,001 po sravneniyu s D0, ***p < 0,001 po sravneniyu s D12 (kontrol). c Gistogrammada barcha 4 ta ekish sharoitida (nazorat, TD, MC va MT) yangi yurak kesmalari (D0) bilan taqqoslaganda glyukoza oqimining miqdoriy ko'rsatkichi ko'rsatilgan (n = 6 kesma/guruh, turli cho'chqalardan, bir tomonlama). ANOVA testlari o'tkazildi, ###p < 0,001 D0 ga nisbatan, ***p < 0,001 D12 ga nisbatan (nazorat).d O'nta mintaqaviy to'qima kesish nuqtalarida yangi (ko'k), 12-kunlik MC (yashil) va 12-kunlik MT (qizil) to'qimalarning shtamm tahlili grafiklari (n = 4 bo'lak/guruh, bir tomonlama ANOVA testi; guruhlar o'rtasida sezilarli farq yo'q edi). e Vulqon grafigi yangi yurak kesimlarida (D0) 10-12 kun davomida statik sharoitlarda (Ctrl) yoki MT sharoitida (MT) o'stirilgan yurak kesimlari bilan solishtirganda differentsial ifodalangan genlarni ko'rsatadi. f Har bir o'stirish sharoitida o'stirilgan yurak kesimlari uchun sarkomer genlarining issiqlik xaritasi. Xato satrlari o'rtacha ± standart og'ishni ifodalaydi.
Yog 'kislotasi oksidlanishidan glikolizga o'tishga metabolik bog'liqlik kardiomiositlarning dedifferentsiatsiyasining o'ziga xos belgisidir. Yetuk bo'lmagan kardiomiositlar asosan ATP ishlab chiqarish uchun glyukozadan foydalanadilar va oz miqdordagi kristallar bilan gipoplastik mitoxondriyalarga ega5,32. Glyukozadan foydalanish tahlillari shuni ko'rsatdiki, MC va MT sharoitida glyukozadan foydalanish 0-kunlik to'qimalardagiga o'xshash edi (4c-rasm). Biroq, Ctrl namunalarida yangi to'qimalarga nisbatan glyukozadan foydalanish sezilarli darajada oshdi. Bu shuni ko'rsatadiki, CTCM va T3/Dex kombinatsiyasi to'qimalarning hayotiyligini oshiradi va 12 kunlik kultivatsiya qilingan yurak kesimlarining metabolik fenotipini saqlaydi. Bundan tashqari, shtamm tahlili shuni ko'rsatdiki, shtamm darajasi MT va MS sharoitida 12 kun davomida yangi yurak to'qimasidagi kabi saqlanib qoldi (4d-rasm).
CTCM va T3/Dex ning yurak bo'laklari to'qimalarining global transkripsiya landshaftiga umumiy ta'sirini tahlil qilish uchun biz to'rt xil madaniyat sharoitidan yurak bo'laklarida RNAseq o'tkazdik (Qo'shimcha ma'lumotlar 1). Qizig'i shundaki, MT bo'laklari yangi yurak to'qimalariga yuqori transkripsiya o'xshashligini ko'rsatdi, 13 642 gendan atigi 16 tasi differentsial ravishda ifodalangan. Biroq, avvalroq ko'rsatganimizdek, Ctrl bo'laklari madaniyatda 10-12 kundan keyin 1229 ta differentsial ravishda ifodalangan genlarni ko'rsatdi (4e-rasm). Bu ma'lumotlar yurak va fibroblast genlarining qRT-PCR bilan tasdiqlandi (Qo'shimcha 7a-c-rasm). Qizig'i shundaki, Ctrl bo'laklari yurak va hujayra sikli genlarining pasayishini va yallig'lanish genlari dasturlarining faollashishini ko'rsatdi. Bu ma'lumotlar odatda uzoq muddatli madaniyatdan keyin sodir bo'ladigan dedifferentsiatsiya MT sharoitida butunlay susayganligini ko'rsatadi (Qo'shimcha 8a, b-rasm). Sarkomer genlarini sinchkovlik bilan o'rganish shuni ko'rsatdiki, faqat MT sharoitida sarkomerni (4f-rasm) va ion kanalini (qo'shimcha 9-rasm) kodlovchi genlar saqlanib qoladi, bu ularni Ctrl, TD va MC sharoitlarida bostirishdan himoya qiladi. Ushbu ma'lumotlar mexanik va gumoral stimulyatsiya (T3/Dex) kombinatsiyasi bilan yurak bo'lagi transkriptomasi 12 kunlik madaniyatda saqlangandan keyin yangi yurak bo'laklariga o'xshash bo'lib qolishi mumkinligini ko'rsatadi.
Ushbu transkripsiya topilmalari yurak kesimlaridagi kardiomiotsitlarning strukturaviy yaxlitligi MT sharoitida 12 kun davomida eng yaxshi saqlanib qolishi bilan tasdiqlanadi, bu esa butun va lokalizatsiyalangan konneksin 43 bilan ko'rsatilgan (5a-rasm). Bundan tashqari, MT sharoitida yurak kesimlarida fibroz Ctrl bilan solishtirganda sezilarli darajada kamaydi va yangi yurak kesimlariga o'xshash (5b-rasm). Ushbu ma'lumotlar mexanik stimulyatsiya va T3/Dex bilan davolashning kombinatsiyasi madaniyatda yurak kesimlarida yurak tuzilishini samarali ravishda saqlab qolishini ko'rsatadi.
a Yangi ajratilgan yurak kesimlarida (D0) yoki to'rtta yurak kesimi madaniyat sharoitida 12 kun davomida kultivatsiya qilingan troponin-T (yashil), connexin 43 (qizil) va DAPI (ko'k) ning vakillik immunofloresans tasvirlari (masshtab chizig'i = 100 µm). Yurak to'qimasining strukturaviy yaxlitligini sun'iy intellekt yordamida aniqlash (n = 7 (D0 va D12 Ctrl), turli cho'chqalardan olingan 5 ta (D12 TD, D12 MC va D12 MT) bo'lak/guruh, bir tomonlama ANOVA testi o'tkaziladi; ####p < 0.0001 D0 va *p < 0.05 ga nisbatan yoki ****p < 0.0001 D12 Ctrl ga nisbatan). Yurak to'qimasining strukturaviy yaxlitligini sun'iy intellekt yordamida aniqlash (n = 7 (D0 va D12 Ctrl), turli cho'chqalardan olingan 5 ta (D12 TD, D12 MC va D12 MT) bo'lak/guruh, bir tomonlama ANOVA testi o'tkazildi; #### D0 va *p < 0.05 ga nisbatan p < 0.0001 yoki D12 Ctrl ga nisbatan ****p < 0.0001). Kolichestvennaya otsenka strukturnoy celostnosti tkani serdtsa s pomoshchyu iskusstvennogo intellekta (n = 7 (D0 va D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC va D12 MT) srezov/gruppu ot fakultet sviney, proveden A# # # testi; 0,0001 po sravneniyu s D0 i *p < 0,05 yoki ****p < 0,0001 po sravneniyu s D12 Ctrl). Sun'iy intellekt yordamida yurak to'qimalarining strukturaviy yaxlitligini miqdoriy aniqlash (n = 7 (D0 va D12 Ctrl), turli cho'chqalardan olingan 5 ta (D12 TD, D12 MC va D12 MT) bo'lim/guruh, bir tomonlama ANOVA testi o'tkazildi; #### D0 ga nisbatan p < 0.0001 va *p < 0.05 yoki D12 Ctrl ga nisbatan ****p < 0.0001).díngíngííííííníínínínín = 7（D0（D12 Ctrl））,5（D12 TD, D12 MC d12 MT）jēngči/līngčičičičičičičičnīnīnčičičnčičanoVA līngčičiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiangANOVA #### p < 0.0001 yn D0 ​​línglínjín 0****p <0. 0.0001 d12 Ctrl míní）。y y y y y y y y y y y y y y y n （n = 7 （d0 （ d12 ctrl） （5 （d12 td 、 d12 mc ） 12 mc míngíííííí ííííílíníníííííníínínínínínínínínínínjíníní ； ######### p < 0,0001 yn D0 ​​lílí*p < 0,05p 0.0001 d12 Ctrl míní）。Turli cho'chqalarda (n = 7 (D0 va D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC va D12 MT) bo'limlar/guruh) bir tomonlama ANOVA testi yordamida sun'iy intellekt yordamida yurak to'qimalarining strukturaviy yaxlitligini miqdoriy aniqlash;#### p < 0,0001 po sravneniyu s D0 i *p < 0,05 yoki ****p < 0,0001 po sravneniyu s D12 Ctrl). #### D0 ga nisbatan p < 0.0001 va *p < 0.05 yoki D12 Ctrl ga nisbatan ****p < 0.0001). b Masson trixrom bo'yog'i bilan bo'yalgan yurak bo'laklari uchun vakillik tasvirlari va miqdoriy ko'rsatkichlar (masshtab chizig'i = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD va D12 MC), turli cho'chqalardan olingan 9 (D12 MT) bo'lak/guruh, bir tomonlama ANOVA testi o'tkaziladi; ####p < 0.0001 D0 va ***p < 0.001 ga nisbatan, yoki ****p < 0.0001 D12 Ctrl ga nisbatan). b Masson trixrom bo'yog'i bilan bo'yalgan yurak bo'laklari uchun vakillik tasvirlari va miqdoriy ko'rsatkichlar (masshtab chizig'i = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD va D12 MC), turli cho'chqalardan olingan 9 (D12 MT) bo'lak/guruh, bir tomonlama ANOVA testi o'tkaziladi; ####p < 0.0001 D0 va ***p < 0.001 ga nisbatan, yoki ****p < 0.0001 D12 Ctrl ga nisbatan). b Reprezentativnye izbrajeniya va kolichestvennaya otsenka srezov serdtsa, okrashennyx trixromnym krasitelem Massona (mashtabnaya lineyka = 500 mkm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD va D12 MTrazpu2 MC), 9 (srupxny) sviney, vypolnyaetsya odnostorniy test ANOVA ####p < 0,0001 po sravneniyu s D0 va ***p < 0,001 yoki ****p < 0,0001 po sravneniyu s D12 Ctrl). b Masson trixrom bo'yog'i bilan bo'yalgan yurak kesimlarining vakillik tasvirlari va miqdoriy ko'rsatkichlari (masshtab chizig'i = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD va D12 MC), turli cho'chqalardan olingan 9 (D12 MT) kesim/guruh, bir tomonlama ANOVA bajarildi; ####p < 0.0001 va D0 va ***p < 0.001 yoki ****p < 0.0001 va D12 Ctrl). b yjjjnjīngīngīngīngīngīngīngīngčičičičičičičičičičičičičičnčižnčičnčičnčižnčižnčičn = 500 µm）1（D1（D1） Ctrl、D12 TD d12 MC）， mēngčičnčičičn9 yī（ (D12 MT） mēngči/lín， lēngčičičnf#0#0#0. yD0 líí，***p < 0.001，mí****p < 0.0001 d12 Ctrl míi）。 b 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 和 量化 （比例 尺 尺 尺 = 500 µm） （n = 10 （d0 、 d12 ctrl 、 d12 td td d12 mc） mēngčičiči 9 d12 mt d12 mt chēngčičn chíngín chínín chínín chngjčičičičiči/ičičičičičičičičičiičičičnčičnīngīngčiii；####p < 0.0001 yīD0 língíči，**p <0.0001 yīD0 línín，**p <0.**p 0.0001 d12 Ctrl míní）。 b Reprezentativnye izbrajeniya i kolichestvennaya otsenka srezov serdtsa, okrashennyh trixromom Massona (masshtabnaya lineyka = 500 mkm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD va D12 MC), 9 (D12 otsenka srezov serdtsa), 9 (D12 otsenka srezov) srazyx, sposob ANOVA; ####p < 0,0001 po sravneniyu s D0, ***p < 0,001 yoki ****p < 0,0001 po sravneniyu s D12 Ctrl). b Masson trixromi (masshtab chizig'i = 500 µm) bilan bo'yalgan yurak kesimlarining vakillik tasvirlari va miqdoriy ko'rsatkichlari (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD va D12 MC), turli cho'chqalar/guruhlardan olingan 9 (D12 MT) kesimlar, bitta ANOVA usuli; ####p < 0.0001 D0 ga nisbatan, ***p < 0.001 yoki ****p < 0.0001 D12 Ctrl ga nisbatan).Xato satrlari o'rtacha ± standart og'ishni ifodalaydi.
Nihoyat, CTCM ning yurak gipertrofiyasini taqlid qilish qobiliyati yurak to'qimalarining cho'zilishini oshirish orqali baholandi. CTCM da havo kamerasining eng yuqori bosimi 80 mm sim. ust. dan 80 mm sim. ust. gacha (normal cho'zilish) 140 mm sim. ust. gacha ko'tarildi (6a-rasm). Bu cho'zilishning 32% ga oshishiga mos keladi (6b-rasm), bu ilgari gipertrofiyada kuzatilgan sarkomer uzunligiga erishish uchun yurak kesimlari uchun zarur bo'lgan mos keladigan foiz cho'zilish sifatida ko'rsatilgan edi. Olti kunlik madaniyat davomida qisqarish va relaksatsiya paytida yurak to'qimalarining cho'zilishi va tezligi doimiy bo'lib qoldi (6c-rasm). MT sharoitidan olingan yurak to'qimasi olti kun davomida normal cho'zilish (MT (Normal)) yoki haddan tashqari cho'zilish sharoitlariga (MT (OS)) duchor qilindi. To'rt kunlik madaniyatdan so'ng, gipertrofik biomarker NT-ProBNP MT (OS) sharoitida muhitda MT (normal) sharoitlarga nisbatan sezilarli darajada oshdi (7a-rasm). Bundan tashqari, olti kunlik kultivatsiyadan so'ng, MT (OS) dagi hujayra hajmi (7b-rasm) MT yurak qismlariga (normal) nisbatan sezilarli darajada oshdi. Bundan tashqari, NFATC4 yadro translokatsiyasi haddan tashqari cho'zilgan to'qimalarda sezilarli darajada oshdi (7c-rasm). Bu natijalar gipercho'zilishdan keyin patologik qayta qurishning progressiv rivojlanishini ko'rsatadi va CTCM qurilmasi cho'zilish natijasida yurak gipertrofiyasi signalizatsiyasini o'rganish uchun platforma sifatida ishlatilishi mumkin degan kontseptsiyani qo'llab-quvvatlaydi.
Havo kamerasi bosimi, suyuqlik kamerasi bosimi va to'qima harakati o'lchovlarining vakillik izlari kamera bosimi suyuqlik kamerasi bosimini o'zgartirishini va to'qima bo'lagining mos keladigan harakatini keltirib chiqarishini tasdiqlaydi. b Normal cho'zilgan (to'q sariq) va haddan tashqari cho'zilgan (ko'k) to'qima bo'laklari uchun vakillik cho'zilish foizi va cho'zilish tezligi egri chiziqlari. c Sikl vaqtini (har bir guruh uchun n = 19 bo'lak, turli cho'chqalardan), qisqarish vaqtini (har bir guruh uchun n = 18-19 bo'lak, turli cho'chqalardan), relaksatsiya vaqtini (har bir guruh uchun n = 19 bo'lak, turli cho'chqalardan), to'qima harakatining amplitudasini (har bir guruh uchun n = 14 bo'lak/guruh, turli cho'chqalardan), cho'qqi sistolik tezlikni (har bir guruh uchun n = 14 bo'lak/guruh, turli cho'chqalardan) va cho'qqi relaksatsiya tezligini (har bir cho'chqadan n = 14 (D0), 15 (D6)) turli cho'chqalardan) ko'rsatuvchi ustunli grafik, ikki dumli Student t-testi hech qanday parametrda sezilarli farq ko'rsatmadi, bu parametrlar haddan tashqari kuchlanish bilan 6 kunlik madaniyat davomida o'zgarmas qolganligini ko'rsatadi. Xato chiziqlari o'rtacha ± standart og'ishni ifodalaydi.
a) Turli cho'chqalardan olingan MT normal cho'zilish (Norm) yoki haddan tashqari cho'zilish (OS) sharoitlarida (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm va D4 MTOS) bo'laklar/guruhlarda yetishtirilgan yurak bo'laklaridan olingan madaniy muhitda NT-ProBNP konsentratsiyasining ustunli grafik miqdoriy ko'rsatkichi, Ikki tomonlama ANOVA amalga oshiriladi; **normal cho'zilish bilan solishtirganda p < 0.01). Turli cho'chqalardan olingan MT normal cho'zilish (Norm) yoki haddan tashqari cho'zilish (OS) sharoitlarida (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm va D4 MTOS) bo'laklar/guruhlarda yetishtirilgan yurak bo'laklaridan olingan madaniy muhitda NT-ProBNP konsentratsiyasining ustunli grafik miqdoriy ko'rsatkichi, Ikki tomonlama ANOVA amalga oshiriladi; **normal cho'zilish bilan solishtirganda p < 0.01).Turli cho'chqalardan olingan yurak bo'laklaridan olingan normal MT cho'zilishi (normal) yoki haddan tashqari cho'zilish (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm va D4).MTOS) bo'laklari/guruhi sharoitida yetishtirilgan muhitdagi NT-ProBNP konsentratsiyasining miqdoriy gistogrammasi, ikki faktorli dispersiya tahlili o'tkazildi;**p < 0,01 po sravneniyu s normalnym rastyajeniem). **normal cho'zilish bilan solishtirganda p < 0.01). a MT língíngínín (Norm) língíngíngín (OS) língíngíníngíníngíngíngíngíngíngíngíngíngínglínglínglínglínglínglínglínglíng NT-ProBNP n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm d4) MTOS）lēngčičičičičičičičičičičičičičičičičičnėngėngėngėngčičii；**ičičičiči, p < 0.01 a MT normal cho'zilgan (norma) yoki haddan tashqari cho'zilgan (OS) sharoitida (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm d4 MTOS) har xil holatlarda yetishtirilgan yurak bo'laklarida NT-ProBNP kontsentratsiyasining miqdori. línjínjín/línjínjínínínín **oddiy choʻzish bilan solishtirganda, p < 0.01).gistogramma Turli cho'chqalardan olingan normal MT cho'zilishi (normal) yoki haddan tashqari cho'zilish (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm) va D4 MTOS) bo'laklari/guruhlari sharoitida yetishtirilgan yurak bo'laklarida NT-ProBNP konsentratsiyasini miqdoriy aniqlash, dispersiyaning ikki tomonlama tahlili;**p < 0,01 po sravneniyu s normalnym rastyajeniem). **normal cho'zilish bilan solishtirganda p < 0.01). b Troponin-T va WGA bilan bo'yalgan yurak bo'laklari uchun vakillik tasvirlari (chapda) va hujayra hajmini aniqlash (o'ngda) (turli cho'chqalardan olingan 10 xil bo'lakdan olingan n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) hujayra/guruh, Ikki dumli Student t-testi o'tkaziladi; normal cho'zilish bilan solishtirganda ****p < 0.0001). b Troponin-T va WGA bilan bo'yalgan yurak bo'laklari uchun vakillik tasvirlari (chapda) va hujayra hajmini aniqlash (o'ngda) (turli cho'chqalardan olingan 10 xil bo'lakdan olingan n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) hujayra/guruh, Ikki dumli Student t-testi o'tkaziladi; normal cho'zilish bilan solishtirganda ****p < 0.0001). b Reprezentativnye izobrajeniya srezov serdtsa, okrashennyx troponnom-T i AZP (sleva) va kolichestvennogo opredeleniya razmera kletok (sprava) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) kletok/grupovny izlash dva- provoditsya xvostovoy t-kriteriy Styudenta ****p < 0,0001 po sravneniyu s normalnym rastyajeniem). b Troponin-T va AZP bilan bo'yalgan yurak kesimlarining vakillik tasvirlari (chapda) va hujayra hajmini aniqlash (o'ngda) (n = 330 (D6 MTOS), turli cho'chqalarning 10 xil kesimidan 369 (D6 MTNorm) hujayra/guruh, ikki dumli Student t-testi o'tkazildi; normal shtammga nisbatan ****p < 0.0001). b língíngín-T yíwga (WGA（yēngīngāngīngāngīngīngīngīngīngīngīngīngīngīngīngīngīngīn）mīngīngīngīn（n（n（nnnn（3（nn（3） MTOS）， mēngčičičičičičičičičičičičičičičičičičičičičičičičičičičičičičičičičičićičičičičići 369（D6 MTNorm）lăng/lín，shīngīngīngēng língíngíngíníníní,****p <0,0001）。 b Kaltserin-T va WGA bilan bo'yalgan yurak bo'laklarining vakillik tasvirlari (chapda) va hujayra o'lchami (o'ngda) (n = 330 (D6 MTOS), 10 xil bo'lakdan 369 (D6 MTNorm)) Hujayralar/Normal cho'zilish bilan solishtirganda, ****p < 0.0001). b Reprezentativnye izbrajeniya srezov serdtsa, okrashennyx troponnom-T i AZP (sleva) va kolichestvennaya otsenka razmera kletok (sprava) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) 10 srezovnyx, srezovnyx izi/ dvustoronnie parametr Styudenta; b Troponin-T va AZP bilan bo'yalgan yurak kesimlarining vakillik tasvirlari (chapda) va hujayra hajmining miqdoriy ko'rsatkichi (turli cho'chqalardan olingan 10 xil kesimdan olingan n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm)) Hujayralar/guruh, ikki dumli mezon Studentning t; ****p < 0.0001 normal zo'riqishga nisbatan). c Troponin-T va NFATC4 uchun immunologik yorliqlangan MTOS yurak bo'laklarining 0 va 6-kunlari uchun vakillik tasvirlari va NFATC4 ning CM yadrolariga translokatsiyasini miqdoriy aniqlash (n = 4 (D0), turli cho'chqalardan olingan 3 (D6 MTOS) bo'lak/guruh, Ikki dumli Student t-testi o'tkaziladi; *p <0.05). c Troponin-T va NFATC4 uchun immunologik yorliqlangan MTOS yurak bo'laklarining 0 va 6-kunlari uchun vakillik tasvirlari va NFATC4 ning CM yadrolariga translokatsiyasini miqdoriy aniqlash (n = 4 (D0), turli cho'chqalardan olingan 3 (D6 MTOS) bo'lak/guruh, Ikki dumli Student t-testi o'tkaziladi; *p <0.05). c Reprezentativnye izbrajeniyalar uchun srezov serdtsa 0 va 6 dney MTOS, troponina-T va NFATC4 uchun immunomechenyx, va kolichestvennaya otsenka translokatsii NFATC4 va yadra kavernoznyx kletok (n = 4 (D0), 3 (D0) srezovnix srezpulg6) , vypolnyaetsya dvustoronniy t-kriteriy Styudenta *p < 0,05); c 0 va 6 kunlik MTOS da yurak kesimlari uchun vakillik tasvirlari, troponin-T va NFATC4 uchun immunologik belgilangan va kavernöz hujayralar yadrosida NFATC4 translokatsiyasining miqdoriy bahosi (n = 4 (D0), turli cho'chqalardan olingan 3 (D6 MTOS) bo'lak/guruh) ikki dumli Student t-testi bilan bajarilgan; *p <0.05). c língíngínín-T nNFATC4 líníínííní0 mínínínín6 mínínínín6 MTOS NFATC4 yngyjnjēngčičnčičnčičnčičnčičičičnčičnčičičičn NFATC4 mēngčičičičičičičičičičičičičičičičičičičičiči (MT4Dn) (OS 3D) 6 = chín/yín, língíngíngíngyínjínjínjín*p < 0.05)。 c Kalkanin-T va NFATC4 immunobelingi 0 m 6 MTOS yurak bo‘laklarining va NFATC4 ning turli NFATC4 chíngēng CM hujayra yadrosidan olingan tasvirlar n = 4 (D0), 3 MT (MT6/D) língjàngyíčet yàngín*p < 0,05). c Reprezentativnye izobrajeniya srezov serdtsa MTOS na 0 va 6 den uchun immunomarkirovki troponnom-T va NFATC4 va kolichestvennaya otsenka translokatsii NFATC4 va yadra CM ot raznyx sviney (n = 4 (D0), 3 (D6/MTVosty) t-kriteriy Styudenta; *p < 0,05). c Turli cho'chqalardan olingan CM yadrosida troponin-T va NFATC4 immunobelgilash va NFATC4 translokatsiyasini miqdoriy aniqlash uchun 0 va 6-kunlardagi MTOS yurak bo'laklarining vakillik tasvirlari (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) bo'lak/guruh, ikki dumli t-mezon Studentnikidir; *p <0.05).Xato satrlari o'rtacha ± standart og'ishni bildiradi.
Translyatsion yurak-qon tomir tadqiqotlari yurak muhitini aniq qayta tiklaydigan hujayra modellarini talab qiladi. Ushbu tadqiqotda yurakning ultra yupqa qismlarini rag'batlantirishi mumkin bo'lgan CTCM qurilmasi ishlab chiqildi va tavsiflandi. CTCM tizimi fiziologik jihatdan sinxronlashtirilgan elektromexanik stimulyatsiya va T3 va Dex suyuqligini boyitishni o'z ichiga oladi. Cho'chqa yurak qismlari ushbu omillarga duchor bo'lganda, ularning hayotiyligi, strukturaviy yaxlitligi, metabolik faolligi va transkripsiya ifodasi 12 kunlik madaniyatdan keyin yangi yurak to'qimasidagi kabi saqlanib qoldi. Bundan tashqari, yurak to'qimasining haddan tashqari cho'zilishi giperekstenziya tufayli yurak gipertrofiyasiga olib kelishi mumkin. Umuman olganda, bu natijalar fiziologik madaniyat sharoitlarining normal yurak fenotipini saqlashdagi muhim rolini qo'llab-quvvatlaydi va dori vositalarini skrining qilish uchun platforma yaratadi.
Kardiomiotsitlarning ishlashi va omon qolishi uchun optimal muhitni yaratishga ko'plab omillar hissa qo'shadi. Bu omillarning eng yaqqollari (1) hujayralararo o'zaro ta'sirlar, (2) elektromexanik stimulyatsiya, (3) gumoral omillar va (4) metabolik substratlar bilan bog'liq. Fiziologik hujayralararo o'zaro ta'sirlar hujayradan tashqari matritsa bilan qo'llab-quvvatlanadigan bir nechta hujayra turlarining murakkab uch o'lchovli tarmoqlarini talab qiladi. Bunday murakkab hujayrali o'zaro ta'sirlarni alohida hujayra turlarini birgalikda kulturalash orqali in vitro sharoitida qayta tiklash qiyin, ammo yurak bo'limlarining organotipik tabiati yordamida osongina erishish mumkin.
Kardiomiotsitlarning mexanik cho'zilishi va elektr stimulyatsiyasi yurak fenotipini saqlab qolish uchun juda muhimdir33,34,35. Mexanik stimulyatsiya hiPSC-CM konditsionerlash va yetilish uchun keng qo'llanilgan bo'lsa-da, yaqinda bir nechta oqlangan tadqiqotlarda bir o'qli yuklama yordamida madaniyatda yurak bo'laklarini mexanik stimulyatsiya qilishga urinib ko'rildi. Ushbu tadqiqotlar shuni ko'rsatadiki, 2D bir o'qli mexanik yuklama madaniyat paytida yurak fenotipiga ijobiy ta'sir ko'rsatadi. Ushbu tadqiqotlarda yurakning bo'limlari izometrik cho'zilish kuchlari17, chiziqli auksotonik yuklama18 bilan yuklangan yoki yurak sikli kuch o'tkazgich teskari aloqasi va kuchlanish drayverlari yordamida qayta yaratilgan. Biroq, bu usullar atrof-muhitni optimallashtirmasdan bir o'qli to'qima cho'zilishidan foydalanadi, bu esa ko'plab yurak genlarining bostirilishiga yoki g'ayritabiiy cho'zilish reaksiyalari bilan bog'liq genlarning haddan tashqari ifodalanishiga olib keladi. Bu yerda tasvirlangan CTCM sikl vaqti va fiziologik cho'zilish nuqtai nazaridan tabiiy yurak siklini taqlid qiluvchi 3D elektromexanik stimulyatsiyani taqdim etadi (25% cho'zilish, 40% sistol, 60% diastol va daqiqada 72 urish). Ushbu uch o'lchovli mexanik stimulyatsiyaning o'zi to'qima yaxlitligini saqlab qolish uchun yetarli bo'lmasa-da, to'qima hayotiyligini, funktsiyasini va yaxlitligini yetarli darajada saqlab qolish uchun T3/Dex yordamida gumoral va mexanik stimulyatsiyaning kombinatsiyasi talab qilinadi.
Gumoral omillar kattalar yurak fenotipini modulyatsiya qilishda muhim rol o'ynaydi. Bu HiPS-CM tadqiqotlarida ta'kidlangan bo'lib, ularda hujayralarning yetilishini tezlashtirish uchun T3 va Dex madaniyat muhitiga qo'shilgan. T3 aminokislotalar, shakar va kaltsiyning hujayra membranalari orqali tashilishiga ta'sir qilishi mumkin36. Bundan tashqari, T3 MHC-α ifodasini va MHC-β ning pastga regulyatsiyasini kuchaytiradi, bu esa homila CM dagi sekin tortiladigan miofibrillarga nisbatan yetuk kardiyomiyotsitlarda tez tortiladigan miofibrillarning shakllanishiga yordam beradi. Gipotiroid bemorlarda T3 yetishmovchiligi miofibrillar polosalarining yo'qolishiga va tonus rivojlanish tezligining pasayishiga olib keladi37. Dex glyukokortikoid retseptorlariga ta'sir qiladi va izolyatsiya qilingan perfuzlangan yuraklarda miokard qisqarishini oshirishi ko'rsatilgan;38 bu yaxshilanish kaltsiy konlariga asoslangan kirishga (SOCE) ta'siri bilan bog'liq deb hisoblanadi39,40. Bundan tashqari, Dex o'z retseptorlariga bog'lanib, immun funktsiyasi va yallig'lanishni bostiradigan keng hujayra ichidagi javobni keltirib chiqaradi30.
Bizning natijalarimiz shuni ko'rsatadiki, fizik-mexanik stimulyatsiya (MS) Ctrl ga nisbatan umumiy madaniyat samaradorligini yaxshilagan, ammo madaniyatda 12 kun davomida hayotiylikni, strukturaviy yaxlitlikni va yurak ifodasini saqlab qola olmagan. Ctrl ga nisbatan, CTCM (MT) madaniyatlariga T3 va Dex qo'shilishi hayotiylikni yaxshilagan va 12 kun davomida yangi yurak to'qimasi bilan o'xshash transkripsiya profillarini, strukturaviy yaxlitlikni va metabolik faollikni saqlab qolgan. Bundan tashqari, to'qima cho'zilish darajasini nazorat qilish orqali STCM yordamida giperekstenziya natijasida kelib chiqqan yurak gipertrofiyasi modeli yaratilgan bo'lib, bu STCM tizimining ko'p qirrali ekanligini ko'rsatadi. Shuni ta'kidlash kerakki, yurakni qayta qurish va fibroz odatda qon aylanish hujayralari tegishli sitokinlarni, shuningdek, fagotsitoz va boshqa qayta qurish omillarini ta'minlay oladigan butun organlarni o'z ichiga olsa-da, yurakning bo'limlari stress va travmaga javoban fibrotik jarayonni taqlid qilishi mumkin. miofibroblastlarga. Bu ilgari ushbu yurak bo'lagi modelida baholangan. Shuni ta'kidlash kerakki, CTCM parametrlari taxikardiya, bradikardiya va mexanik qon aylanishini qo'llab-quvvatlash (mexanik yuklanmagan yurak) kabi ko'plab holatlarni simulyatsiya qilish uchun bosim/elektr amplitudasi va chastotasini o'zgartirish orqali modulyatsiya qilinishi mumkin. Bu tizimni dori vositalarini sinovdan o'tkazish uchun o'rtacha o'tkazuvchanlikka aylantiradi. CTCM ning ortiqcha zo'riqish natijasida kelib chiqadigan yurak gipertrofiyasini modellashtirish qobiliyati ushbu tizimni shaxsiylashtirilgan terapiya uchun sinovdan o'tkazish yo'lini ochadi. Xulosa qilib aytganda, ushbu tadqiqot mexanik cho'zish va gumoral stimulyatsiya yurak to'qimalari kesimlarining madaniyatini saqlab qolish uchun juda muhimligini ko'rsatadi.
Bu yerda keltirilgan ma'lumotlar CTCM butun miokardni modellashtirish uchun juda istiqbolli platforma ekanligini ko'rsatsa-da, bu madaniyat usuli ba'zi cheklovlarga ega. CTCM madaniyatining asosiy cheklovi shundaki, u kesmalarga doimiy dinamik mexanik kuchlanishlarni keltirib chiqaradi, bu esa har bir sikl davomida yurak kesmalarining qisqarishlarini faol ravishda kuzatib borish imkoniyatini istisno qiladi. Bundan tashqari, yurak kesmalarining kichik o'lchami (7 mm) tufayli an'anaviy kuch sensorlari yordamida madaniyat tizimlaridan tashqarida sistolik funktsiyani baholash imkoniyati cheklangan. Ushbu qo'lyozmada biz optik kuchlanishni qisqarish funktsiyasining ko'rsatkichi sifatida baholash orqali bu cheklovni qisman yengib o'tamiz. Biroq, bu cheklov qo'shimcha ishlarni talab qiladi va kelajakda madaniyatda yurak kesmalarining funktsiyasini optik monitoring qilish usullarini, masalan, kaltsiy va kuchlanishga sezgir bo'yoqlardan foydalangan holda optik xaritalashni joriy etish orqali hal qilinishi mumkin. CTCMning yana bir cheklovi shundaki, ishchi model fiziologik stressni (oldindan yuklanish va keyingi yuklanish) boshqarmaydi. CTCMda juda katta to'qimalarda diastol (to'liq cho'zilish) va sistolada (elektr stimulyatsiyasi paytida qisqarish uzunligi) 25% fiziologik cho'zilish hosil qilish uchun bosim qarama-qarshi yo'nalishlarda induktsiya qilindi. Kelajakdagi CTCM dizaynlarida bu cheklovni yurak to'qimalariga ikki tomondan yetarli bosim o'tkazish va yurak kameralarida yuzaga keladigan aniq bosim-hajm munosabatlarini qo'llash orqali olib tashlash kerak.
Ushbu qo'lyozmada keltirilgan haddan tashqari cho'zilish natijasida yuzaga kelgan qayta qurish gipertrofik gipercho'zilish signallarini taqlid qilish bilan cheklangan. Shunday qilib, ushbu model gumoral yoki neyron omillariga (bu tizimda mavjud bo'lmagan) ehtiyoj sezmasdan cho'zilish natijasida yuzaga kelgan gipertrofik signalizatsiyani o'rganishga yordam berishi mumkin. CTCM ning ko'pligini oshirish uchun qo'shimcha tadqiqotlar talab etiladi, masalan, immun hujayralari, aylanib yuruvchi plazma gumoral omillari va neyron hujayralari bilan birgalikda kulturalashda innervatsiya CTCM bilan kasalliklarni modellashtirish imkoniyatlarini yaxshilaydi.
Ushbu tadqiqotda o'n uchta cho'chqa ishlatilgan. Barcha hayvonlar bilan o'tkazilgan protseduralar institutsional ko'rsatmalarga muvofiq amalga oshirildi va Luisvill universitetining Institutsional hayvonlarni parvarish qilish va ulardan foydalanish qo'mitasi tomonidan tasdiqlandi. Aorta yoyi qisqich bilan mahkamlandi va yurakka 1 litr steril kardioplegiya (110 mM NaCl, 1,2 mM CaCl2, 16 mM KCl, 16 mM MgCl2, 10 mM NaHCO3, 5 U/ml geparin, pH 7,4 gacha) bilan perfuziya qilindi; Yuraklar muzdek kardioplegik eritmada laboratoriyaga muz ustida, odatda <10 daqiqa davomida olib kelinmaguncha saqlangan. Yuraklar muzdek kardioplegik eritmada laboratoriyaga muz ustida, odatda <10 daqiqa davomida olib kelinmaguncha saqlangan. serdtsa hranili v ledyanom kardioplegicheskom rastvore do transportirovki v laboratoriyayu na ldu, chto obychno zanimaet <10 min. Yuraklar muzdek kardioplegik eritmada saqlangan, ular odatda 10 daqiqadan kamroq vaqtni oladi va laboratoriyaga muz ustida olib kelingan.língíngíngíngíngíngíngíníngínííníníníníníníníngíníníníngíníníngíngíníngíníníníníngíngíngíngíngíngíngíngíngíngíngíng<10dínlíngíngíngíngíngíngíngíníngínííníníníníníníníngíníníníngíníníngíngíníngíníníníníngíngíngíngíngíngíngíngíngíngíngíng<10dín Derjite serdtsa v ledyanoy kardioplegii do transportirovki v laboratoriyayu na ldu, obychno <10 min. Kardioplegiya holatlarida yuraklarni muz ustida laboratoriyaga olib borilgunga qadar, odatda 10 daqiqadan kam vaqt davomida muz ustida saqlang.
CTCM qurilmasi SolidWorks kompyuter yordamida loyihalash (CAD) dasturida ishlab chiqilgan. Kultura kameralari, bo'linmalar va havo kameralari CNC shaffof akril plastmassadan tayyorlangan. 7 mm diametrli zaxira halqasi markazda yuqori zichlikdagi polietilendan (HDPE) tayyorlangan va ostidagi muhitni muhrlash uchun ishlatiladigan silikon O-halqasini joylashtirish uchun O-halqali yivga ega. Yupqa kremniy membranasi kultura kamerasini ajratish plastinkasidan ajratib turadi. Silikon membrana 0,02 dyuym qalinlikdagi silikon varaqdan lazer bilan kesilgan va 35A qattiqlikka ega. Pastki va yuqori silikon qistirmalari 1/16 dyuym qalinlikdagi silikon varaqdan lazer bilan kesilgan va 50A qattiqlikka ega. Blokni mahkamlash va havo o'tkazmaydigan muhr yaratish uchun 316L zanglamaydigan po'latdan yasalgan vintlar va qanotli gaykalar ishlatiladi.
Maxsus bosilgan elektron plata (PCB) C-PACE-EM tizimi bilan integratsiyalash uchun mo'ljallangan. PCBdagi shveytsariya mashinasi ulagichlari grafit elektrodlariga kumush bilan qoplangan mis simlar va elektrodlarga vidalanadigan bronza 0-60 vintlar yordamida ulangan. Bosilgan elektron plata 3D printerning qopqog'iga joylashtirilgan.
CTCM qurilmasi yurak sikliga o'xshash boshqariladigan qon aylanish bosimini yaratadigan dasturlashtiriladigan pnevmatik aktuator (PPD) tomonidan boshqariladi. Havo kamerasi ichidagi bosim oshgani sayin, egiluvchan silikon membrana yuqoriga kengayadi va muhitni to'qima joyi ostiga majbur qiladi. Keyin to'qima maydoni suyuqlikning bu chiqarilishi bilan cho'zilib, diastol paytida yurakning fiziologik kengayishini taqlid qiladi. Relaksatsiya cho'qqisida grafit elektrodlari orqali elektr stimulyatsiyasi qo'llanildi, bu havo kamerasidagi bosimni pasaytirdi va to'qima qismlarining qisqarishiga olib keldi. Quvur ichida havo tizimidagi bosimni aniqlash uchun bosim sensori bo'lgan gemostatik klapan mavjud. Bosim sensori tomonidan aniqlangan bosim noutbukga ulangan ma'lumotlar yig'uvchiga qo'llaniladi. Bu gaz kamerasi ichidagi bosimni doimiy ravishda kuzatib borish imkonini beradi. Maksimal kamera bosimiga (standart 80 mmHg, 140 mmHg OS) erishilganda, ma'lumotlarni yig'ish moslamasiga C-PACE-EM tizimiga 2 ms davomida 4 V ga o'rnatilgan ikki fazali kuchlanish signalini yaratish uchun signal yuborish buyurildi.
Yurak kesimlari olindi va 6 ta quduqda kultivatsiya sharoitlari quyidagicha amalga oshirildi: Yig'ib olingan yuraklarni o'tkazish idishidan sovuq (4° C) kardioplegiya solingan patnisga o'tkazing. Chap qorincha steril pichoq bilan ajratib olindi va 1-2 sm3 bo'laklarga kesildi. Bu to'qima bloklari to'qima tayanchlariga to'qima yopishtiruvchi bilan biriktirildi va Tyrode eritmasi solingan tebranuvchi mikrotom to'qima vannasiga joylashtirildi va doimiy ravishda kislorod bilan to'ldirildi (3 g/L 2,3-butandion monooksim (BDM), 140 mM NaCl (8.18 g), 6 mM KCl (0.447 g), 10 mM D-glyukoza (1.86 g), 10 mM HEPES (2.38 g), 1 mM MgCl2 (1 ml 1 M eritma), 1.8 mM CaCl2 (1.8 ml 1 M eritma), 1 L ddH2O gacha). Vibratsiyali mikrotom 80 Gts chastotada, 2 mm gorizontal tebranish amplitudasida va 0,03 mm/s oldinga siljish tezligida 300 µm qalinlikdagi bo'laklarni kesish uchun o'rnatildi. Eritmani salqin saqlash uchun to'qima vannasi muz bilan o'ralgan va harorat 4°C da saqlangan. Mikrotom vannasidan to'qima bo'laklarini bitta madaniyat plastinkasi uchun yetarli bo'laklar olinmaguncha muz ustida doimiy ravishda kislorodlangan Tyrode eritmasini o'z ichiga olgan inkubatsiya vannasiga o'tkazing. Transvell madaniyatlari uchun to'qima bo'laklari steril 6 mm kenglikdagi poliuretan tayanchlariga biriktirildi va 6 ml optimallashtirilgan muhitga (199 muhit, 1x ITS qo'shimchasi, 10% FBS, 5 ng/ml VEGF, 10 ng/ml FGF-ishqoriy va 2X antibiotik-zamburug'larga qarshi) joylashtirildi. C-Pace orqali to'qima bo'laklariga elektr stimulyatsiyasi (10 V, chastotasi 1,2 Gts) qo'llanildi. TD sharoitlari uchun har bir muhit almashinuvida yangi T3 va Dex 100 nM va 1 μM da qo'shildi. Muhit kuniga 3 marta almashtirishdan oldin kislorod bilan to'yingan. To'qima bo'laklari 37°C va 5% CO2 da inkubatorda o'stirildi.
CTCM kulturalari uchun to'qima bo'laklari modifikatsiyalangan Tyrode eritmasi solingan Petri idishidagi maxsus tayyorlangan 3D printerga joylashtirildi. Qurilma yurak bo'lagi hajmini tayanch halqasi maydonining 25% ga oshirish uchun mo'ljallangan. Bu Tyrode eritmasidan muhitga o'tkazilgandan keyin va diastol paytida yurak bo'laklari cho'zilmasligi uchun amalga oshiriladi. Gistoakril yelim yordamida 300 µm qalinlikdagi bo'laklar diametri 7 mm bo'lgan tayanch halqasiga mahkamlandi. To'qima bo'laklarini tayanch halqasiga biriktirgandan so'ng, ortiqcha to'qima bo'laklarini kesib oling va biriktirilgan to'qima bo'laklarini bitta qurilma uchun yetarli bo'laklar tayyorlanmaguncha muz ustida (4°C) Tyrode eritmasi bilan vannaga qaytaring. Barcha qurilmalar uchun umumiy ishlov berish vaqti 2 soatdan oshmasligi kerak. 6 ta to'qima bo'lagi tayanch halqalariga biriktirilgandan so'ng, CTCM qurilmasi yig'ildi. CTCM kultura kamerasi 21 ml oldindan kislorodlangan muhit bilan oldindan to'ldirilgan. To'qima bo'laklarini kultura kamerasiga o'tkazing va har qanday havo pufakchalarini pipetka bilan ehtiyotkorlik bilan olib tashlang. Keyin to'qima qismi teshikka yo'naltiriladi va joyiga muloyimlik bilan bosiladi. Nihoyat, elektrod qopqog'ini qurilmaga qo'ying va qurilmani inkubatorga o'tkazing. Keyin CTCM ni havo trubkasiga va C-PACE-EM tizimiga ulang. Pnevmatik aktuator ochiladi va havo klapani CTCM ni ochadi. C-PACE-EM tizimi ikki fazali ritmlash paytida 2 ms davomida 1,2 Gts chastotada 4 V ni yetkazib berish uchun sozlangan. Elektrodlarda grafit to'planishining oldini olish uchun muhit kuniga ikki marta va elektrodlar kuniga bir marta almashtirildi. Agar kerak bo'lsa, ularning ostiga tushib qolgan har qanday havo pufakchalarini chiqarib yuborish uchun to'qima qismlarini ularning madaniyat quduqlaridan olib tashlash mumkin. MT bilan ishlov berish sharoitlari uchun har bir muhit almashinuvi bilan T3/Dex 100 nM T3 va 1 μM Dex bilan yangi qo'shildi. CTCM qurilmalari 37°C va 5% CO2 da inkubatorda kultivatsiya qilindi.
Yurak bo'laklarining cho'zilgan traektoriyalarini olish uchun maxsus kamera tizimi ishlab chiqildi. Navitar Zoom 7000 18-108mm makro linzali (Navitar, San-Fransisko, Kaliforniya) SLR kamerasi (Canon Rebel T7i, Canon, Tokio, Yaponiya) ishlatilgan. Vizualizatsiya muhitni yangi muhit bilan almashtirgandan so'ng xona haroratida amalga oshirildi. Kamera 51° burchak ostida joylashtirilgan va video sekundiga 30 kadr tezlikda yozib olinadi. Birinchidan, yurak bo'laklarining harakatini aniqlash uchun Image-J yordamida ochiq kodli dasturiy ta'minot (MUSCLEMOTION43) ishlatilgan. Niqob shovqindan qochish uchun yurak bo'laklarini urish uchun qiziqish sohalarini aniqlash maqsadida MATLAB (MathWorks, Natick, MA, AQSh) yordamida yaratilgan. Qo'lda segmentlangan niqoblar barcha tasvirlarga kadr ketma-ketligida qo'llaniladi va keyin MUSCLEMOTION plaginiga uzatiladi. Muscle Motion har bir kadrdagi piksellarning o'rtacha intensivligidan foydalanib, uning mos yozuvlar kadriga nisbatan harakatini aniqlaydi. Ma'lumotlar yozib olindi, filtrlandi va sikl vaqtini aniqlash va yurak sikli davomida to'qima cho'zilishini baholash uchun ishlatildi. Yozib olingan video birinchi darajali nol fazali raqamli filtr yordamida qayta ishlandi. To'qima cho'zilishini (cho'qqidan cho'qqiga) aniqlash uchun yozib olingan signaldagi cho'qqilar va pasayishlarni farqlash uchun cho'qqidan cho'qqiga tahlil o'tkazildi. Bundan tashqari, signal siljishini bartaraf etish uchun 6-darajali polinom yordamida detrendlash amalga oshiriladi. Global to'qima harakatini, sikl vaqtini, relaksatsiya vaqtini va qisqarish vaqtini aniqlash uchun MATLABda dastur kodi ishlab chiqildi (Qo'shimcha dastur kodi 44).
Deformatsiya tahlili uchun, mexanik cho'zilish baholash uchun yaratilgan bir xil videolardan foydalanib, biz avval MUSCLEMOTION dasturiga muvofiq harakat cho'qqilarini (eng yuqori (yuqori) va eng past (pastki) harakat nuqtalari) ifodalovchi ikkita tasvirni kuzatdik. Keyin biz to'qima mintaqalarini segmentladik va segmentlangan to'qimaga soyalash algoritmining bir shaklini qo'lladik (qo'shimcha 2a-rasm). Keyin segmentlangan to'qima o'nta substratga bo'lindi va har bir sirtdagi kuchlanish quyidagi tenglama yordamida hisoblandi: Deformatsiya = (Sup-Sdown)/Sdown, bu yerda Sup va Sdown mos ravishda matoning yuqori va pastki soyalaridan shaklning masofalari (qo'shimcha 2b-rasm).
Yurak kesimlari 4% paraformaldegidda 48 soat davomida fiksatsiya qilindi. Fiksatsiyalangan to'qimalar 1 soat davomida 10% va 20% saxarozada, so'ngra 30% saxarozada bir kechada suvsizlantirildi. Keyin kesimlar optimal kesish harorati birikmasiga (OCT birikmasi) joylashtirildi va izopentan/quruq muzli vannada asta-sekin muzlatildi. OCT joylashtirish bloklarini ajratilgunga qadar -80 °C da saqlang. Slaydlar qalinligi 8 mkm bo'lgan kesimlar sifatida tayyorlandi.
Yurak kesimlaridan OCTni olib tashlash uchun slaydlarni isitish blokida 95 °C da 5 daqiqa davomida qizdiring. Har bir slaydga 1 ml PBS qo'shing va xona haroratida 30 daqiqa davomida inkubatsiya qiling, so'ngra xona haroratida 15 daqiqa davomida PBSda 0,1% Triton-X qo'yib, kesimlarni singdiring. Nospesifik antikorlarning namunaga bog'lanishiga yo'l qo'ymaslik uchun slaydlarga 1 ml 3% BSA eritmasini qo'shing va xona haroratida 1 soat davomida inkubatsiya qiling. Keyin BSA olib tashlandi va slaydlar PBS bilan yuvildi. Har bir namunani qalam bilan belgilang. Birlamchi antikorlar (1% BSA da 1:200 suyultirilgan) (connexin 43 (Abcam; #AB11370), NFATC4 (Abcam; #AB99431) va troponin-T (Thermo Scientific; #MA5-12960) 90 daqiqa davomida qo'shildi, so'ngra sichqoncha Alexa Fluor 488 (Thermo Scientific; #A16079) ga qarshi ikkilamchi antikorlar (1% BSA da 1:200 suyultirilgan), quyon Alexa Fluor 594 (Thermo Scientific; #T6391) ga qarshi qo'shimcha 90 daqiqa davomida qo'shildi. PBS bilan 3 marta yuvildi. Nishon bo'yashini fondan ajratish uchun biz faqat ikkilamchi antikorni nazorat sifatida ishlatdik. Nihoyat, DAPI yadro bo'yog'i qo'shildi va slaydlar vectashield (Vector Laboratories) ga joylashtirildi va tirnoq lakasi bilan muhrlandi. -x kattalashtirish) va 40x kattalashtirish bilan Keyence mikroskopi.
WGA bo'yash uchun PBSda 5 mkg/ml da WGA-Alexa Fluor 555 (Thermo Scientific; #W32464) ishlatildi va xona haroratida 30 daqiqa davomida qattiq kesimlarga surtildi. Keyin slaydlar PBS bilan yuvildi va har bir slaydga Sudan qora rangi qo'shildi va 30 daqiqa davomida inkubatsiya qilindi. Keyin slaydlar PBS bilan yuvildi va vectashield joylashtirish muhiti qo'shildi. Slaydlar Keyence mikroskopida 40 marta kattalashtirishda ko'rsatildi.
Yuqorida tavsiflanganidek, namunalardan OCT olib tashlandi. OCT olib tashlangandan so'ng, slaydlarni Buin eritmasiga bir kechada botiring. Keyin slaydlar 1 soat davomida distillangan suv bilan yuvildi va keyin 10 daqiqa davomida Bibrich aloe kislotasi fuchsin eritmasiga joylashtirildi. Keyin slaydlar distillangan suv bilan yuvildi va 10 daqiqa davomida 5% fosfomolibden/5% fosfovolg'stik kislota eritmasiga joylashtirildi. Yuvmasdan, slaydlarni to'g'ridan-to'g'ri anilin ko'k eritmasiga 15 daqiqa davomida o'tkazing. Keyin slaydlar distillangan suv bilan yuvildi va 2 daqiqa davomida 1% sirka kislotasi eritmasiga joylashtirildi. Slaydlar 200 N etanolda quritildi va ksilolga o'tkazildi. Bo'yalgan slaydlar 10x obyektivli Keyence mikroskopi yordamida ko'rsatildi. Fibroz maydoni foizi Keyence Analyzer dasturi yordamida aniqlandi.
CyQUANT™ MTT hujayra hayotiyligini tahlil qilish (Invitrogen, Carlsbad, CA), katalog raqami V13154, ishlab chiqaruvchi protokoliga muvofiq, ba'zi o'zgartirishlar bilan. Xususan, MTT tahlili paytida to'qima hajmining bir xilligini ta'minlash uchun diametri 6 mm bo'lgan jarrohlik shtamp ishlatilgan. To'qimalar ishlab chiqaruvchi protokoliga muvofiq MTT substratini o'z ichiga olgan 12 quduqli plastinkaning quduqlariga alohida joylashtirildi. Kesimlar 37°C da 3 soat davomida inkubatsiya qilinadi va tirik to'qima MTT substratini binafsha formazan birikmasini hosil qilish uchun metabolizmga keltiradi. MTT eritmasini 1 ml DMSO bilan almashtiring va yurak kesimlaridan binafsha formazanni ajratib olish uchun 37°C da 15 daqiqa davomida inkubatsiya qiling. Namunalar 96 quduqli shaffof pastki plastinkalarda DMSOda 1:10 nisbatda suyultirildi va binafsha rang intensivligi 570 nm da Cytation plastinka o'quvchi (BioTek) yordamida o'lchandi. Ko'rsatkichlar yurakning har bir bo'lagining og'irligiga qarab normallashtirildi.
Yurak kesilgan muhit avval tasvirlanganidek, glyukoza utilizatsiyasini tahlil qilish uchun 1 μCi/ml [5-3H]-glyukoza (Moravek Biochemicals, Brea, CA, AQSh) saqlovchi muhit bilan almashtirildi. 4 soatlik inkubatsiyadan so'ng, 100 μl 0,2 N HCl saqlovchi ochiq mikrosantrifuga naychasiga 100 μl muhit qo'shing. Keyin naycha 37°C da 72 soat davomida [3H]2O ni bug'latish uchun 500 μl dH2O saqlovchi sintillyatsiya naychasiga joylashtirildi. Keyin mikrosantrifuga naychasini sintillyatsiya naychasidan chiqarib oling va 10 ml sintillyatsiya suyuqligi qo'shing. Sintillyatsiya hisoblari Tri-Carb 2900TR suyuqlik sintillyatsiya analizatori (Packard Bioscience Company, Meriden, CT, AQSh) yordamida amalga oshirildi. Keyin glyukozadan foydalanish [5-3H]-glyukozaga xos faollik, to'liq bo'lmagan muvozanat va fon, [5-3H]-ning yorliqlanmagan glyukozaga suyultirilishi va sintillyatsiyaga qarshi vosita samaradorligi hisobga olingan holda hisoblab chiqildi. Ma'lumotlar yurak bo'limlari massasiga normallashtirildi.
Trizolda to'qimalarni gomogenizatsiya qilgandan so'ng, ishlab chiqaruvchining protokoliga muvofiq Qiagen miRNeasy Micro Kit #210874 yordamida yurak kesimlaridan RNK ajratildi. RNK kutubxonasini tayyorlash, ketma-ketlashtirish va ma'lumotlarni tahlil qilish quyidagicha amalga oshirildi:
Har bir namunada 1 mkg RNK RNK kutubxonasini tayyorlash uchun boshlang'ich material sifatida ishlatilgan. Ketma-ketlik kutubxonalari ishlab chiqaruvchining tavsiyalariga muvofiq NEBNext UltraTM RNK kutubxonasini tayyorlash to'plami (NEB, AQSh) yordamida Illumina uchun yaratilgan va har bir namuna uchun atribut ketma-ketliklariga indeks kodlari qo'shilgan. Qisqacha aytganda, mRNK poli-T oligonukleotidlar bilan biriktirilgan magnit boncuklar yordamida umumiy RNKdan tozalangan. Parchalanish NEBNext birinchi zanjir sintezi reaksiya buferida (5X) yuqori haroratda ikki valentli kationlar yordamida amalga oshiriladi. Birinchi zanjir kDNK tasodifiy geksamer primerlari va M-MuLV teskari transkriptaza (RNase H-) yordamida sintez qilingan. Keyin ikkinchi zanjir kDNK DNK polimeraza I va RNase H yordamida sintez qilinadi. Qolgan o'simtalar eksonukleaza/polimeraza faolligi orqali to'mtoq uchlarga aylantiriladi. DNK fragmentining 3' uchi adenilatsiyalangandan so'ng, uni gibridizatsiyaga tayyorlash uchun unga soch tolali halqali tuzilishga ega NEBNext adapteri biriktirilgan. Afzal uzunlikdagi 150-200 bp. kDNK fragmentlarini tanlash uchun kutubxona fragmentlari AMPure XP tizimi (Beckman Coulter, Beverly, AQSh) yordamida tozalandi. Keyin, PCRdan oldin, o'lchami tanlangan kDNK bilan adapter bilan bog'langan 3 μl USER fermenti (NEB, AQSh) 37°C da 15 daqiqa, keyin esa 95°C da 5 daqiqa davomida ishlatildi. Keyin PCR Phusion High-Fidelity DNK polimeraza, universal PCR primerlari va Index (X) primerlari yordamida amalga oshirildi. Nihoyat, PCR mahsulotlari tozalandi (AMPure XP tizimi) va kutubxona sifati Agilent Bioanalyzer 2100 tizimida baholandi. Keyin kDNK kutubxonasi Novaseq sekvenseri yordamida sekvensiya qilindi. Illumina'dan olingan xom tasvir fayllari CASAVA Base Calling yordamida xom o'qishlarga aylantirildi. Xom ma'lumotlar o'qish ketma-ketliklari va mos keladigan asosiy sifatlarni o'z ichiga olgan FASTQ(fq) formatidagi fayllarda saqlanadi. Filtrlangan ketma-ketlik o'qishlarini Sscrofa11.1 mos yozuvlar genomiga moslashtirish uchun HISAT2 ni tanlang. Umuman olganda, HISAT2 4 milliard bazadan katta genomlarni o'z ichiga olgan har qanday o'lchamdagi genomlarni qo'llab-quvvatlaydi va ko'pgina parametrlar uchun standart qiymatlar o'rnatiladi. RNK Seq ma'lumotlaridan biriktirilgan o'qishlarni hozirda mavjud bo'lgan eng tezkor tizim bo'lgan HISAT2 yordamida boshqa har qanday usulga qaraganda bir xil yoki undan yuqori aniqlikda samarali ravishda moslashtirish mumkin.
Transkriptlarning ko'pligi gen ekspressiyasi darajasini bevosita aks ettiradi. Gen ekspressiyasi darajalari genom yoki ekzonlar bilan bog'liq transkriptlarning ko'pligi (ketma-ketlik soni) bilan baholanadi. O'qishlar soni gen ekspressiyasi darajalari, gen uzunligi va ketma-ketlik chuqurligiga mutanosibdir. FPKM (million baza juftligiga ketma-ketlikdagi transkriptning ming baza juftligiga fragmentlar) hisoblab chiqildi va differentsial ekspressiyaning P-qiymatlari DESeq2 paketi yordamida aniqlandi. Keyin biz har bir P qiymati uchun Benjamini-Hochberg usuli9 yordamida o'rnatilgan "p.adjust" R-funksiyasiga asoslangan holda noto'g'ri kashfiyot tezligini (FDR) hisobladik.
Yurak kesimlaridan ajratilgan RNK Thermo (Thermo, cat. no. 11756050) dan SuperScript IV Vilo Master aralashmasi yordamida 200 ng/mkl konsentratsiyada kDNKga aylantirildi. Miqdoriy RT-PCR Applied Biosystems Endura Plate Microamp 384-quduqli shaffof reaksiya plastinkasi (Thermo, cat. no. 4483319) va mikroamp optik yopishtiruvchi (Thermo, cat. no. 4311971) yordamida amalga oshirildi. Reaksiya aralashmasi 5 µl Taqman Fast Advanced Master aralashmasidan (Thermo, cat. # 4444557), 0,5 µl Taqman Primer va har bir quduq uchun 3,5 µl H2O aralashmasidan iborat edi. Standart qPCR sikllari bajarildi va KT qiymatlari Applied Biosystems Quantstudio 5 real vaqt rejimidagi PCR asbobi (384-quduqli modul; mahsulot # A28135) yordamida o'lchandi. Taqman primerlari Thermo (GAPDH (Ss03375629_u1), PARP12 (Ss06908795_m1), PKDCC (Ss06903874_m1), CYGB (Ss06900188_m1), RGL1 (Ss06868890_m1), ACTN1 (Ss01009508_mH), GATA4 (Ss03383805_u1), GJA1 (Ss03374839_u1), COL1A2 (Ss03375009_u1), COL3A1 (Ss04323794_m1), ACTA2 (Ss04245588_m1) dan sotib olindi. Barcha namunalarning KT qiymatlari GAPDH uy xo'jaligi geniga normallashtirildi.
NT-ProBNP ning ommaviy axborot vositalarida chiqarilishi ishlab chiqaruvchining protokoliga muvofiq NT-ProBNP to'plami (cho'chqa) (kat. № MBS2086979, MyBioSource) yordamida baholandi. Qisqacha aytganda, har bir quduqqa har bir namunadan va standartdan 250 µl ikki nusxada qo'shildi. Namuna qo'shilgandan so'ng darhol har bir quduqqa 50 µl A tahlil reagentini qo'shing. Plastinkani muloyimlik bilan silkiting va germetik bilan yoping. Keyin tabletkalar 37°C da 1 soat davomida inkubatsiya qilindi. Keyin eritmani so'rib oling va quduqlarni 350 µl 1X yuvish eritmasi bilan 4 marta yuving, har safar yuvish eritmasini 1-2 daqiqa davomida inkubatsiya qiling. Keyin har bir quduqqa 100 µl B tahlil reagentini qo'shing va plastinka germetik bilan yoping. Tabletka muloyimlik bilan silkitildi va 37°C da 30 daqiqa davomida inkubatsiya qilindi. Eritmani so'rib oling va quduqlarni 350 µl 1X yuvish eritmasi bilan 5 marta yuving. Har bir quduqqa 90 µl substrat eritmasi qo'shing va plastinkani yoping. Plastinkani 37°C da 10-20 daqiqa davomida inkubatsiya qiling. Har bir quduqqa 50 µl Stop eritmasi qo'shing. Plastinka darhol 450 nm ga o'rnatilgan Cytation (BioTek) plastinka o'quvchi yordamida o'lchandi.
Parametrdagi 10% mutlaq o'zgarishni aniqlash uchun >80% quvvatni ta'minlaydigan guruh o'lchamlarini tanlash uchun quvvat tahlillari o'tkazildi, bu esa 5% I turdagi xato darajasi bilan parametrdagi 10% mutlaq o'zgarishni aniqlash imkonini beradi. Parametrdagi 10% mutlaq o'zgarishni aniqlash uchun >80% quvvatni ta'minlaydigan guruh o'lchamlarini tanlash uchun quvvat tahlillari o'tkazildi, bu esa 5% I turdagi xato darajasi bilan parametrdagi 10% mutlaq o'zgarishni aniqlash imkonini beradi. Analiz moschnosti by vypolnen uchun vybora razmerov guruhi, kotorye obespechat >80% moschnosti uchun obnarujeniya 10% absolyutnogo izmeniya parametra s 5% chastotoy oshibok tipi I. Quvvat tahlili 5% I turdagi xato darajasi bilan 10% mutlaq parametr o'zgarishini aniqlash uchun >80% quvvatni ta'minlaydigan guruh o'lchamlarini tanlash uchun o'tkazildi.língíngǎngǎngíngíngíngíngíngínjínjínínjínjínjínjínjínjínjínjínjínjínjínjínjínjínjínjínjínjínjínjínjínjínjínjínjínjínjínjínjíníi> 80fjnjngyngyjínjínjín 10％línjínjínjínė5％Ijíngíngíngíngíngíngínjín.língíngǎngǎngíngíngíngíngíngínjínjínínjínjínjínjínjínjínjínjínjínjínjínjínjínjínjínjínjínjínjínjínjínjínjínjínjínjínjínjínjíníi> 80fjnjngyngyjínjínjín 10％línjínjínjínė5％Ijíngíngíngíngíngíngínjín. Byl proveden analiz moschnosti dlya vybora razmera gruppy, kotoryy obespechil by > 80% moschnosti uchun obnarujeniya 10% absolyutnogo izmeniya parametrov va 5% chastoty oshibok tipi I. 10% mutlaq parametr o'zgarishini va 5% I turdagi xato darajasini aniqlash uchun >80% quvvatni ta'minlaydigan guruh hajmini tanlash uchun quvvat tahlili o'tkazildi.Tajribadan oldin to'qima kesimlari tasodifiy tanlandi. Barcha tahlillar shartli ravishda o'tkazildi va namunalar faqat barcha ma'lumotlar tahlil qilingandan so'ng dekodlandi. Barcha statistik tahlillarni o'tkazish uchun GraphPad Prism dasturi (San-Diego, Kaliforniya) ishlatilgan. Barcha statistika uchun p-qiymatlari <0.05 qiymatlarida ahamiyatli deb hisoblangan. Barcha statistika uchun p-qiymatlari <0,05 qiymatlarda ahamiyatli deb hisoblangan. Dlya vsey statistiki p-znacheniya schitalis znachimymi pri znacheniyax <0,05. Barcha statistika uchun p-qiymatlari <0,05 qiymatlarda ahamiyatli deb hisoblangan.língíííííííí, p chíngíní<0.05 língíngíngíngíngíngíngíngíngíníng.língíííííííí, p chíngíní<0.05 língíngíngíngíngíngíngíngíngíníng. Dlya vsey statistiki p-znacheniya schitalis znachimymi pri znacheniyax <0,05. Barcha statistika uchun p-qiymatlari <0,05 qiymatlarda ahamiyatli deb hisoblangan.Ikki tomonlama Student t-testi ma'lumotlar bo'yicha faqat 2 ta taqqoslash bilan o'tkazildi. Bir yoki ikki tomonlama ANOVA bir nechta guruhlar orasidagi ahamiyatni aniqlash uchun ishlatilgan. Post-hoc testlarini o'tkazishda bir nechta taqqoslashlarni hisobga olish uchun Tukey tuzatishi qo'llanildi. RNAsec ma'lumotlari FDR va p.adjust ni hisoblashda "Usullar" bo'limida tasvirlanganidek, maxsus statistik mulohazalarga ega.
Tadqiqot dizayni haqida qo'shimcha ma'lumot olish uchun ushbu maqolaga havola qilingan Nature Research Report referatiga qarang.