Merci fir Äre Besuch op Nature.com. D'Browserversioun, déi Dir benotzt, huet limitéiert CSS-Ënnerstëtzung. Fir déi bescht Erfahrung empfeelen mir Iech, en aktualiséierte Browser ze benotzen (oder de Kompatibilitéitsmodus am Internet Explorer auszeschalten). An der Zwëschenzäit, fir weider Ënnerstëtzung ze garantéieren, wäerte mir d'Websäit ouni Stiler a JavaScript duerstellen.
Et gëtt e Besoin fir e verlässlecht In-vitro-System, dat d'physiologesch Ëmwelt vum Häerz fir Drogentest präzis reproduzéiere kann. Déi limitéiert Disponibilitéit vu mënschlechen Häerzgewebekultursystemer huet zu ongenaue Interpretatioune vun den Auswierkunge vun den Häerzdrogen gefouert. Hei hu mir e Häerzgewebekulturmodell (CTCM) entwéckelt, dat elektromechanesch Häerzscheiwen stimuléiert a physiologesch Streckung während de systoleschen an diastoleschen Phasen vum Häerzzyklus mécht. No 12 Deeg Kultur huet dësen Usaz d'Viabilitéit vun den Häerzsektiounen deelweis verbessert, awer hir strukturell Integritéit net vollstänneg erhalen. Dofir hu mir no engem Screening vu klenge Molekülen festgestallt, datt d'Zousätzlech vun 100 nM Triiodothyronin (T3) an 1 μM Dexamethason (Dex) zu eisem Medium d'Mikrostruktur vun de Schnëtter fir 12 Deeg erhalen huet. A Kombinatioun mat der T3/Dex-Behandlung huet den CTCM-System Transkriptiounsprofiler, Viabilitéit, metabolesch Aktivitéit a strukturell Integritéit fir 12 Deeg um selwechten Niveau wéi frësch Häerzgewebe erhalen. Zousätzlech induzéiert exzessiv Strecken vum Häerzgewebe an der Kultur hypertrophesch Herzsignalgebung, wat Beweiser fir d'Fäegkeet vum CTCM liwwert, hypertrophesch Zoustänn ze imitéieren, déi duerch Herzstreckung induzéiert ginn. Zesummefaassend kann de CTCM d'Physiologie a Pathophysiologie vum Häerz an der Kultur iwwer laang Zäitperioden modelléieren, wat e verlässlecht Medikamentenscreening erméiglecht.
Virun der klinescher Fuerschung gi verlässlech In-vitro-Systemer gebraucht, déi dat physiologescht Ëmfeld vum mënschlechen Häerz genee reproduzéiere kënnen. Sou Systemer sollten déi verännert mechanesch Streckung, d'Häerzfrequenz an d'elektrophysiologesch Eegeschafte imitéieren. Déiermodeller gi meeschtens als Screeningplattform fir d'Häerzphysiologie benotzt, mat limitéierter Zouverlässegkeet fir d'Effekter vu Medikamenter am mënschlechen Häerz ze reflektéieren1,2. Schlussendlech ass den Ideal Cardiac Tissue Culture Experimental Model (CTCM) e Modell, dat héich sensibel a spezifesch fir verschidden therapeutesch an pharmakologesch Interventiounen ass a genee d'Physiologie a Pathophysiologie vum mënschlechen Häerz3 reproduzéiert. D'Feele vun engem sou engem System limitéiert d'Entdeckung vun neien Behandlungen fir Häerzversoen4,5 an huet dozou gefouert, datt d'Karditoxizitéit vu Medikamenter en Haaptgrond fir de Maartvertrag6 ass.
An de leschten zéng Joer goufen aacht net-kardiovaskulär Medikamenter aus dem klineschen Asaz zréckgezunn, well se d'QT-Intervallverlängerung verursaachen, wat zu ventrikuläre Rhythmusstéierungen a plëtzlechen Doud féiert7. Dofir gëtt et e wuessende Besoin fir zouverléisseg präklinesch Screeningstrategien fir d'kardiovaskulär Effizienz an d'Toxizitéit ze bewäerten. Déi rezent Notzung vu mënschlecht induzéierte pluripotenten Stammzellen-ofgeleete Kardiomyozyten (hiPS-CM) beim Medikamentenscreening an Toxizitéitstester bitt eng deelweis Léisung fir dëst Problem. Wéi och ëmmer, den onreife Charakter vun hiPS-CM an de Manktem u multizellulärer Komplexitéit vum Häerzgewebe sinn grouss Aschränkungen vun dëser Method. Rezent Studien hunn gewisen, datt dës Aschränkung deelweis iwwerwonne ka ginn, andeems fréi hiPS-CM benotzt gëtt fir Häerzgewebe-Hydrogele kuerz nom Ufank vu spontanen Kontraktiounen ze bilden an d'elektresch Stimulatioun mat der Zäit graduell eropgeet. Wéi och ëmmer, feelen dësen hiPS-CM Mikrogewebe déi reif elektrophysiologesch an kontraktil Eegeschafte vum Erwuessenen-Myokard. Zousätzlech huet mënschlecht Häerzgewebe eng méi komplex Struktur, déi aus enger heterogener Mëschung aus verschiddenen Zelltypen besteet, dorënner Endothelzellen, Neuronen a stromal Fibroblasten, déi duerch spezifesch Sätz vun extrazelluläre Matrixproteinen matenee verbonne sinn. Dës Heterogenitéit vun net-kardiomyozyten-Populatiounen11,12,13 am Häerz vun engem erwuessene Säugetier ass e grousst Hindernis fir d'Modeléierung vum Häerzgewebe mat Hëllef vun eenzelnen Zelltypen. Dës grouss Aschränkungen ënnersträichen d'Wichtegkeet vun der Entwécklung vu Methoden fir d'Kultivatioun vun intaktem Myokardgewebe ënner physiologeschen a pathologesche Konditiounen.
Dënn kultivéiert (300 µm) Schnëtter vum mënschlechen Häerz hunn sech als e villverspriechend Modell vum intakte mënschleche Myokard erwisen. Dës Method bitt Zougang zu engem komplette 3D-multizeluläre System ähnlech wéi mënschlecht Häerzgewebe. Bis 2019 war d'Benotzung vu kultivéierten Häerzschnëtter awer duerch déi kuerz (24 Stonnen) Kulturiwwerliewensdauer limitéiert. Dëst ass op eng Rei vu Faktoren zeréckzeféieren, dorënner de Manktem u physikalesch-mechanescher Streckung, d'Loft-Flëssegkeetsgrenzfläche an d'Benotzung vu einfache Medien, déi d'Bedierfnesser vum Häerzgewebe net ënnerstëtzen. Am Joer 2019 hunn e puer Fuerschungsgruppen demonstréiert, datt d'Integratioun vu mechanesche Faktoren an Häerzgewebekultursystemer d'Liewensdauer vun der Kultur verlängere kann, d'Häerzexpression verbesseren an d'Häerzpathologie imitéiere kann. Zwee elegant Studien 17 an 18 weisen datt uniaxial mechanesch Belaaschtung e positiven Effekt op den Häerzphenotyp während der Kultur huet. Dës Studien hunn awer net déi dynamesch dräidimensional physikalesch-mechanesch Belaaschtung vum Häerzzyklus benotzt, well Häerzschnëtter entweder mat isometreschen Zuchkräften 17 oder linearer auxotonescher Belaaschtung 18 belaascht goufen. Dës Methode vum Tissuedehnen hunn zu der Ënnerdréckung vu ville kardialen Genen oder der Iwwerexpressioun vu Genen gefouert, déi mat anormalen Dehnungsreaktiounen assoziéiert sinn. Besonnesch de Pitoulis et al.19 huet e dynamescht Häerzscheiwenkulturbad fir d'Häerzzyklusrekonstruktioun mat Hëllef vu Kraaftwandler-Feedback a Spannungsuntrieben entwéckelt. Obwuel dëst System eng méi genee in vitro Häerzzyklusmodelléierung erméiglecht, limitéieren d'Komplexitéit an den niddrege Duerchgank vun der Method d'Uwendung vun dësem System. Eist Laboratoire huet viru kuerzem e vereinfacht Kultursystem entwéckelt, dat elektresch Stimulatioun an engem optiméierte Medium benotzt, fir d'Viabilitéit vu Sektioune vu Schwäin- a mënschlechem Häerzgewebe fir bis zu 6 Deeg z'erhalen20,21.
Am aktuelle Manuskript beschreiwe mir e kardialt Gewëbekulturmodell (CTCM) mat Schnëtter vum Schwäinhäerz, dat humoral Signaler enthält, fir déi dräidimensional kardial Physiologie an pathophysiologesch Distensioun während dem Häerzzyklus ze rekapituléieren. Dësen CTCM kann d'Genauegkeet vun der präklinescher Medikamentenprognose op en Niveau erhéijen, deen nach ni virdru erreecht gouf, andeems en e käschtegënschtegt Häerzsystem mat mëttlerer Duerchgangsquote ubitt, dat d'Physiologie/Pathophysiologie vum Säugetierhäerz fir präklinesch Medikamententester imitéiert.
Hämodynamesch mechanesch Signaler spille eng entscheedend Roll fir d'Kardiomyozytenfunktioun in vitro z'erhalen 22,23,24. Am aktuelle Manuskript hu mir en CTCM (Figur 1a) entwéckelt, deen d'Häerzëmfeld vun Erwuessenen imitéiere kann, andeems en souwuel elektresch wéi och mechanesch Stimulatioun bei physiologesche Frequenzen (1,2 Hz, 72 Schléi pro Minutt) induzéiert. Fir exzessiv Tissuedehnung während der Diastol ze vermeiden, gouf en 3D-Drécker benotzt fir d'Gewëssgréisst ëm 25% ze erhéijen (Fig. 1b). Elektrescht Pacing, dat vum C-PACE System induzéiert gouf, gouf getimed fir 100 ms virun der Systole unzefänken, andeems en e Datenerfassungssystem benotzt huet, fir den Häerzzyklus vollstänneg ze reproduzéieren. De Tissuekultursystem benotzt en programméierbaren pneumateschen Aktuator (LB Engineering, Däitschland), fir eng flexibel Silikonmembran zyklisch ze expandéieren, fir d'Expansioun vun den Häerzscheiwen an der ieweschter Häerzkammer ze verursaachen. De System war iwwer en Drockwandler mat enger externer Loftleitung verbonnen, wat et erméiglecht huet, den Drock (± 1 mmHg) an d'Zäit (± 1 ms) präzis unzepassen (Fig. 1c).
a Befestegt d'Gewebesektioun un de 7 mm Stützring, deen a blo gewisen ass, an der Kulturkammer vum Apparat. D'Kulturkammer ass vun der Loftkammer duerch eng dënn, flexibel Silikonmembran getrennt. Leet eng Dichtung tëscht all Kammer fir Leckage ze vermeiden. Den Deckel vum Apparat enthält Graphitelektroden, déi elektresch Stimulatioun ubidden. b Schematesch Duerstellung vum grousse Gewebsapparat, dem Führungsrank an dem Stützring. D'Gewebesektiounen (brong) ginn op den iwwerdimensionéierten Apparat placéiert, mam Führungsrank an der Nut um äusseren Rand vum Apparat. Leet mat Hëllef vun der Führung de mat Gewebsacrylklebstoff beschichtete Stützring virsiichteg iwwer d'Sektioun Häerzgewebe. c Grafik, déi d'Zäit vun der elektrescher Stimulatioun als Funktioun vum Loftkammerdrock weist, deen vun engem programméierbare pneumateschen Aktuator (PPD) kontrolléiert gëtt. En Datenerfassungsapparat gouf benotzt fir d'elektresch Stimulatioun mat Drocksensoren ze synchroniséieren. Wann den Drock an der Kulturkammer de festgeluechte Schwellwäert erreecht, gëtt en Impulssignal un de C-PACE-EM geschéckt fir d'elektresch Stimulatioun auszeléisen. d Bild vu véier CTCMen, déi op engem Inkubatorregal placéiert sinn. Véier Apparater sinn iwwer e pneumatesche Circuit mat engem PPD verbonnen, an Drocksensore ginn an de hemostatesche Ventil agefouert fir den Drock am pneumatesche Circuit ze iwwerwaachen. All Apparat enthält sechs Gewebesektiounen.
Mat engem eenzegen pneumateschen Aktuator konnten mir 4 CTCM-Geräter steieren, déi all 6 Gewebeschnëtter kéinte halen (Fig. 1d). Am CTCM gëtt den Loftdrock an der Loftkammer an e synchronen Drock an der Flëssegkeetskammer ëmgewandelt an induzéiert eng physiologesch Expansioun vun der Häerzscheif (Figur 2a an Ergänzungsfilm 1). D'Evaluatioun vun der Gewebedehnung bei 80 mm Hg. Art. huet eng Dehnung vun de Gewebeschnëtter ëm 25% gewisen (Fig. 2b). Dëse Prozentsaz vun der Dehnung entsprécht enger physiologescher Sarkomerlängt vun 2,2–2,3 µm fir eng normal Kontraktilitéit vun der Häerzsektioun17,19,25. D'Gewebebewegung gouf mat personaliséierten Kameraastellungen bewäert (Ergänzungsfigur 1). D'Amplitude an d'Geschwindegkeet vun der Gewebebewegung (Fig. 2c, d) entspriechen der Dehnung während dem Häerzzyklus an der Zäit während der Systole an Diastole (Fig. 2b). D'Dehnung an d'Geschwindegkeet vum Häerzgewebe während der Kontraktioun an der Relaxatioun sinn 12 Deeg an der Kultur konstant bliwwen (Fig. 2f). Fir den Effekt vun der elektrescher Stimulatioun op d'Kontraktilitéit während der Kultur ze evaluéieren, hu mir eng Method entwéckelt fir déi aktiv Deformitéit mat Hëllef vun engem Schattéierungsalgorithmus ze bestëmmen (Ergänzungsfigur 2a,b) a konnten tëscht Deformatiounen mat an ouni elektresch Stimulatioun ënnerscheeden. Dee selwechten Häerzschnëtt (figur 2f). Am beweegleche Beräich vum Schnëtt (R6-9) war d'Spannung während der elektrescher Stimulatioun 20% méi héich wéi ouni elektresch Stimulatioun, wat op de Bäitrag vun der elektrescher Stimulatioun zur kontraktiler Funktioun hiweist.
Representativ Spuere vum Loftkammerdrock, Flëssegkeetskammerdrock a Gewebebewegungmessunge bestätegen, datt den Drock an der Kammer den Drock an der Flëssegkeetskammer ännert, wat zu enger entspriechender Bewegung vun der Gewebescheif féiert. b Representativ Spuere vum Prozentsaz vun der Streckung (blo) vu Gewebeschechten, déi dem Prozentsaz vun der Streckung (orange) entspriechen. c Déi gemoossen Bewegung vun der Häerzscheif entsprécht der gemoossener Bewegungsgeschwindegkeet. (d) Representativ Trajektorien vun der zyklischer Bewegung (blo Linn) a Geschwindegkeet (orange gepunktete Linn) an enger Scheif vum Häerz. e Quantifizéierung vun der Zykluszäit (n = 19 Scheiwen pro Grupp, vu verschiddene Schwäin), Kontraktiounszäit (n = 19 Scheiwen pro Grupp), Relaxatiounszäit (n = 19 Scheiwen pro Grupp, vu verschiddene Schwäin), Gewebebewegung (n = 25 Scheiwen)/Grupp vu verschiddene Schwäin), Peak systolesch Geschwindegkeet (n = 24(D0), 25(D12) Scheiwen/Grupp vu verschiddene Schwäin) a Peak Relaxatiounsquote (n=24(D0), 25(D12) Scheiwen/Grupp vu verschiddene Schwäin). Den zweesäitege Student's t-Test huet keen signifikanten Ënnerscheed an iergendengem Parameter gewisen. f Representativ Dehnungsanalyse-Spuere vu Gewebeschnëtter mat (rout) an ouni (blo) elektresch Stimulatioun, zéng regional Beräicher vu Gewebeschnëtter aus dem selwechte Schnëtt. Déi ënnescht Paneele weisen d'Quantifizéierung vum prozentualen Ënnerscheed an der Dehnung a Gewebeschnëtter mat an ouni elektresch Stimulatioun an zéng Beräicher aus verschiddene Schnëtter. (n = 8 Scheiwen/Grupp vu verschiddene Schwäin, zweesäitege Student t-Test gëtt duerchgefouert; ****p < 0,0001, **p < 0,01, *p < 0,05). (n = 8 Scheiwen/Grupp vu verschiddene Schwäin, zweesäitege Student t-Test gëtt duerchgefouert; ****p < 0,0001, **p < 0,01, *p < 0,05). (n = 8 срезов/группу от разных свиней, проводится двусторонний t-критерий Стьюдента; ****p<0,0001, ***p<0,01,01,01. (n = 8 Sektiounen/Grupp vu verschiddene Schwäin, zweesäitege Student's t-Test; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05). （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p < 0.0001，**p < 0.01＀0.5） （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p < 0.0001，**p < 0.01＀0.5） (n = 8 срезов/группу, от разных свиней, двусторонний критерий Стьюдента; ****p <0,0001, **p <0,01, *p <0,05). (n = 8 Sektiounen/Grupp, vu verschiddene Schwäin, zweesäitege Student's t-Test; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05).Fehlerbalken representéieren de Mëttelwäert ± Standardofwäichung.
An eisem fréiere statesche biomimetesche Kultursystem fir Häerzscheiwen [20, 21] hu mir d'Viabilitéit, d'Funktioun an d'strukturell Integritéit vun den Häerzscheiwen 6 Deeg laang erhalen, andeems mir elektresch Stimulatioun ugewannt an d'Zesummesetzung vum Medium optimiséiert hunn. No 10 Deeg sinn dës Zuelen awer staark gefall. Mir wäerten eis op d'Schnëtter bezéien, déi an eisem fréiere statesche biomimetesche Kultursystem 20, 21 Kontrollbedingungen (Ctrl) kultivéiert goufen, a mir wäerten eist virdrun optimiséiert Medium als MC-Konditiounen a Kultur ënner simultaner mechanescher an elektrescher Stimulatioun (CTCM) benotzen. genannt . Als éischt hu mir festgestallt, datt mechanesch Stimulatioun ouni elektresch Stimulatioun net ausreechend war, fir d'Gewebsvitabilitéit fir 6 Deeg ze erhalen (Ergänzungsfigur 3a, b). Interessanterweis ass mat der Aféierung vu physio-mechanescher an elektrescher Stimulatioun mat STCM d'Viabilitéit vun 12-Deeg Häerzscheiwen d'selwecht bliwwen wéi a frësche Häerzscheiwen ënner MS-Konditiounen, awer net ënner Ctrl-Konditiounen, wéi duerch d'MTT-Analyse gewisen (Figur 1). 3a). Dëst weist drop hin, datt mechanesch Stimulatioun a Simulatioun vum Häerzzyklus d'Gewebsscheiwen duebel sou laang viabel hale kënnen, wéi an eisem fréiere statesche Kultursystem gemellt gouf. Wéi och ëmmer, d'Bewäertung vun der struktureller Integritéit vu Gewebeschnëtter duerch Immunmarkéierung vum kardialen Troponin T a Connexin 43 huet gewisen, datt d'Connexin 43 Expressioun a MC-Gewëss um Dag 12 signifikant méi héich war wéi a Kontrollen um selwechten Dag. Wéi och ëmmer, d'uniform Connexin 43 Expressioun an d'Z-Diskbildung goufen net vollstänneg erhale gelooss (Fig. 3b). Mir benotzen e Framework fir künstlech Intelligenz (KI) fir d'strukturell Integritéit vum Gewebe ze quantifizéieren26, eng bildbaséiert Deep Learning Pipeline baséiert op Troponin-T a Connexin Färbung43 fir automatesch d'strukturell Integritéit a Fluoreszenz vun Häerzscheiwen a punkto Stäerkt vun der Lokalisatioun ze quantifizéieren. Dës Method benotzt e Convolutional Neuronal Network (CNN) an e Framework fir d'strukturell Integritéit vum Häerzgewebe zouverlässeg op eng automatiséiert an onparteiesch Manéier ze quantifizéieren, wéi an der Referenz beschriwwen.26. MC-Gewëbe huet eng verbessert strukturell Ähnlechkeet zum Dag 0 am Verglach mat statesche Kontrollschnëtter gewisen. Zousätzlech huet d'Masson-Trichrom-Färbung e signifikant méi niddrege Prozentsaz vu Fibrose ënner MS-Konditiounen am Verglach mat Kontrollbedingungen um Dag 12 vun der Kultur gewisen (Fig. 3c). Wärend CTCM d'Viabilitéit vun Häerzgewebeschnëtter um 12. Dag op en Niveau erhéicht huet, dee ähnlech wéi dee vu frëschem Häerzgewebe ass, huet et d'strukturell Integritéit vun den Häerzsektiounen net signifikant verbessert.
E Balkendiagramm weist d'Quantifizéierung vun der MTT-Viabilitéit vu frësche Häerzscheiwen (D0) oder Häerzscheiwenkultur fir 12 Deeg entweder an der statescher Kultur (D12 Ctrl) oder an der CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) Scheiwen/Grupp vu verschiddene Schwäin, een-Wee-ANOVA-Test gëtt duerchgefouert; ####p < 0,0001 am Verglach zu D0 an **p < 0,01 am Verglach zu D12 Ctrl). E Balkendiagramm weist d'Quantifizéierung vun der MTT-Viabilitéit vu frësche Häerzscheiwen (D0) oder Häerzscheiwenkultur fir 12 Deeg entweder an der statescher Kultur (D12 Ctrl) oder an der CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) Scheiwen/Grupp vu verschiddene Schwäin, een-Wee-ANOVA-Test gëtt duerchgefouert; ####p < 0,0001 am Verglach zu D0 an **p < 0,01 am Verglach zu D12 Ctrl).Den Histogramm weist d'Quantifizéierung vun der Viabilitéit vu frësche MTT-Häerzschnëtter (D0) oder Kultur vun Häerzschnëtter fir 12 Deeg entweder an statescher Kultur (D12 Kontroll) oder CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Kontroll). ) ), 12 (D12 MC) Sektiounen/Grupp vu verschiddene Schwäin, en One-Way-ANOVA-Test gëtt duerchgefouert;####p < 0,0001 bei D0 an **p < 0,01 mat D12 Ctrl). ####p < 0,0001 am Verglach zu D0 an **p < 0,01 am Verglach zu D12 Ctrl). a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切片(D0)或心脏切片培养12 天的MTT 活力的量化)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/绑卌 切片/绡卌卌测试；与D0 相比，####p < 0.0001，与D12 Ctrl 相比，**p < 0,01). a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切片(D0) ，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；与D0 相比，##与D，Ctrl1D，Ctrl1D相比,**p.)Histogramm, deen d'Quantifizéierung vun der MTT-Viabilitéit a frësche Häerzschnëtter (D0) oder Häerzschnëtter, déi 12 Deeg laang an enger statescher Kultur (D12 Kontroll) oder CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Kontroll)), 12 (D12 MC) Sektiounen/Grupp vu verschiddene Schwäin weist, One-Way ANOVA-Test;####p < 0,0001 bei D0, **p < 0,01 mat D12 Ctrl). ####p < 0,0001 am Verglach zu D0, **p < 0,01 am Verglach zu D12 Ctrl).b Troponin-T (gréng), Connexin 43 (rout) an DAPI (blo) a frësch isoléierten Häerzschnëtter (D0) oder Häerzschnëtter, déi ënner statesche Konditiounen (Ctrl) oder CTCM-Konditiounen (MC) fir 12 Deeg kultivéiert goufen) vu representativen Immunofluoreszenzbiller (Blankskala = 100 µm). Quantifizéierung vun der struktureller Integritéit vum Häerzgewebe duerch kënschtlech Intelligenz (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) Scheiwen/Grupp vun all verschiddene Schwäin, en One-Way ANOVA-Test gëtt duerchgefouert; ####p < 0,0001 am Verglach zu D0 an ****p < 0,0001 am Verglach zu D12 Ctrl). Quantifizéierung vun der struktureller Integritéit vum Häerzgewebe duerch kënschtlech Intelligenz (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) Scheiwen/Grupp vun all verschiddene Schwäin, en One-Way-ANOVA-Test gëtt duerchgefouert; ####p < 0,0001 am Verglach zu D0 an ****p < 0,0001 am Verglach zu D12 Ctrl). Количественная оценка структурной целостности сердечной ткани искусственным интеллектом (n = 7 (D0), 7 (D12 сD 12), 7 (D12 сD 12) от разных свиней, проводится однофакторный тест ANOVA ; Quantifizéierung vun der struktureller Integritéit vum Häerzgewebe duerch künstlech Intelligenz (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) Sektiounen/Gruppen aus verschiddene Schwäin, One-Way ANOVA Test duerchgefouert; ####p < 0,0001 vs. mat D0 an ****p < 0,0001 am Verglach mat D12 Ctrl).人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) Scheiwen/Grupp jeweils verschidde Schwäin, een-Wee ANOVA Test <10#0;##;相比，****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）.人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) Scheiwen / gruppéiere jidderee vu verschiddene Schwäin, een-Wee ANOVA Test <0##0p <0#;与D0相比，****p < 0.0001 与D12 Ctrl 相比）. Искусственный интеллект для количественной оценки структурной целостности сердечной ткани (n = 7 (D0), 7 (D512 Ctrl), MC (D512) срезов/группу каждой из разных свиней, односторонний тест ANOVA ####p <0,0001 vs. Ctrl). Kënschtlech Intelligenz fir d'strukturell Integritéit vum Häerzgewebe ze quantifizéieren (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) Sektiounen/Grupp vun all verschiddene Schwäin, One-Way ANOVA Test; ####p<0.0001 vs .D0 Zum Verglach ****p < 0.0001 am Verglach mat D12 Ctrl). c Representativ Biller (lénks) a Quantifizéierung (riets) fir Häerzscheiwen, déi mat der Masson-Trichrom-Faarf gefierft goufen (Skala bare = 500 µm) (n = 10 Scheiwen/Grupp vun all verschiddene Schwäin, en One-Way-ANOVA-Test gëtt duerchgefouert; ####p < 0,0001 am Verglach zu D0 an ***p < 0,001 am Verglach zu D12 Ctrl). c Representativ Biller (lénks) a Quantifizéierung (riets) fir Häerzscheiwen, déi mat der Masson-Trichrom-Faarf gefierft goufen (Skala bare = 500 µm) (n = 10 Scheiwen/Grupp vun all verschiddene Schwäin, en One-Way-ANOVA-Test gëtt duerchgefouert; #### p < 0,0001 am Verglach zu D0 an ***p < 0,001 am Verglach zu D12 Ctrl). c Репрезентативные изображения (слева) a количественная оценка (справа) срезов сердца, окрашенных тримихром (Mass ouni Bezuelung = 500 MKM) (n = 10 Schnéi/Grupp vun der Verëffentlechung, ufänkt bis zu 500 Mm) сравнению с D0 и ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Representativ Biller (lénks) a Quantifizéierung (riets) vun Häerzschnëtter, déi mat Masson-Trichrom-Faarf gefierft goufen (onbeschichtete Skala = 500 µm) (n = 10 Schnëtter/Grupp vu verschiddene Schwäin, One-Way-ANOVA-Test duerchgefouert; #### p < 0,0001 am Verglach zu D0 an ***p < 0,001 am Verglach zu D12 Ctrl). c 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像（左）和量化（右）（裸=尺）（裸=尺） 10 个切片/组，每组来自不同的猪，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0.0001 与D0 ． 0.01p <0.001p. Ctrl 相比）. C 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 （左 左） 量化 （右） 裸壸庣庰 裸壸庣 庰裸尺度 = 500 µm） （n = 10 个 切片 组 每 组 来自 不同 猪 ， 进行 单向 单 向 单向##nova 0.0001 Ze D0 相比，***p < 0.001 与D12 Ctrl 相比）. c Репрезентативные изображения (слева) a количественный анализ (справа) срезов сердца, окрашенных тримихром (чистая шкала = 500 mkm) (n = 10 срезов/группа, каждый от другой свиньи, протестировано с помощогруппа дисперсионного анализа ;### #p < 0,0001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Representativ Biller (lénks) a Quantifizéierung (riets) vun Häerzschnëtter, déi mat Masson-Trichrom-Faarf gefierft goufen (Blank = 500 µm) (n = 10 Schnëtter/Grupp, all vun engem anere Schwäin, getest duerch One-Way-Varianzanalyse; ### # p < 0,0001 am Verglach zu D0, ***p < 0,001 am Verglach zu D12 Ctrl).Fehlerbalken representéieren de Mëttelwäert ± Standardofwäichung.
Mir hunn d'Hypothes opgestallt, datt duerch d'Zousätz vu klenge Molekülen zum Kulturmedium d'Integritéit vun de Kardiomyozyten verbessert an d'Fibroseentwécklung während der CTCM-Kultur reduzéiert kéint ginn. Mir hunn dofir mat eise statesche Kontrollkulturen20,21 op kleng Molekülen gescreent, well et wéineg Stéierungsfaktoren gëtt. Dexamethason (Dex), Triiodothyronin (T3) an SB431542 (SB) goufen fir dëse Screening ausgewielt. Dës kleng Moleküle goufen virdru schonn an hiPSC-CM-Kulturen benotzt, fir d'Reifung vu Kardiomyozyten ze induzéieren, andeems d'Sarkomerlängt, d'T-Tubuli an d'Leitungsgeschwindegkeet erhéicht goufen. Zousätzlech si souwuel Dex (e Glukokortikoid) wéi och SB bekannt dofir, Entzündungen z'ënnerdrécken29,30. Dofir hu mir getest, ob d'Inklusioun vun engem oder enger Kombinatioun vun dëse klenge Molekülen d'strukturell Integritéit vun Häerzsektiounen verbessere géif. Fir den initialen Screening gouf d'Dosis vun all Verbindung op Basis vun de Konzentratioune gewielt, déi allgemeng a Zellkulturmodeller benotzt ginn (1 μM Dex27, 100 nM T327 an 2,5 μM SB31). No 12 Deeg Kultur huet d'Kombinatioun vun T3 an Dex zu enger optimaler struktureller Integritéit vun de Kardiomyozyten an engem minimale faseresche Remodeling gefouert (Ergänzungsfiguren 4 an 5). Zousätzlech huet d'Benotzung vun duebeler oder duebel sou héijer Konzentratioun vun T3 an Dex am Verglach mat normale Konzentratioune schiedlech Effekter verursaacht (Ergänzungsfigur 6a,b).
Nom initialen Screening hu mir e Kapp-zu-Kapp-Vergläich vu 4 Kulturbedingungen duerchgefouert (Figur 4a): Ctrl: Häerzschnitten, déi an eiser virdru beschriwwener statescher Kultur mat eisem optimiséierte Medium kultivéiert goufen; 20.21 TD: T3 an Ctrl hunn Dex e Mëttwoch bäigefüügt; MC: Häerzschnitten, déi am CTCM mat eisem virdru optimiséierte Medium kultivéiert goufen; an MT: CTCM mat T3 an Dex, dat dem Medium bäigefüügt gouf. No 12 Deeg Kultivatioun ass d'Viabilitéit vun MS- an MT-Gewëss d'selwecht bliwwen wéi a frësche Gewëss, déi mam MTT-Assay bewäert goufen (Fig. 4b). Interessanterweis huet d'Zousätz vun T3 an Dex zu Transwell-Kulturen (TD) net zu enger bedeitender Verbesserung vun der Viabilitéit am Verglach mat de Ctrl-Konditioune gefouert, wat op eng wichteg Roll vun der mechanescher Stimulatioun bei der Erhalen vun der Viabilitéit vun Häerzschnitten hiweist.
En experimentellt Designdiagramm, dat déi véier Kulturbedingungen duerstellt, déi benotzt gi fir d'Effekter vun der mechanescher Stimulatioun an der T3/Dex-Supplementatioun op Medium fir 12 Deeg ze evaluéieren. b Balkendiagramm weist d'Quantifizéierung vun der Viabilitéit 12 Deeg no der Kultur an alle 4 Kulturbedingungen (Ctrl, TD, MC an MT) am Verglach mat frësche Häerzscheiwen (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD an D12 MT), 12 (D12 MC) Scheiwen/Grupp vu verschiddene Schwäin, en One-Way ANOVA-Test gëtt duerchgefouert; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 am Verglach zu D0 an **p < 0,01 am Verglach zu D12 Ctrl). b Balkendiagramm weist d'Quantifizéierung vun der Viabilitéit 12 Deeg no der Kultur an alle 4 Kulturbedingungen (Ctrl, TD, MC an MT) am Verglach mat frësche Häerzscheiwen (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD an D12 MT), 12 (D12 MC) Scheiwen/Grupp vu verschiddene Schwäin, en One-Way ANOVA-Test gëtt duerchgefouert; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 am Verglach zu D0 an **p < 0,01 am Verglach zu D12 ctrl). b Гистограмма показывает количественную оценку жизнеспособности через 12 дней после культивированис вох культивирования (контроль, TD, MC a MT) fir сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 TD), MC 12 TD, D12) an D12) срезов/группу от разных свиней, проводится односторонний тест ANOVA ####p < 0,0001, ###p < 0,001 по сравнени; с D0 и **p < 0,01 bei D12 Ctrl). b De Balkendiagramm weist d'Quantifizéierung vun der Viabilitéit 12 Deeg no der Kultur an alle 4 Kulturbedingungen (Kontroll, TD, MC an MT) am Verglach mat frësche Häerzschnitter (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD an D12 MT), 12 (D12 MC) Sektiounen/Grupp vu verschiddene Schwäin, One-Way ANOVA Test; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 vs. D0 an **p < 0,01 am Verglach mat D12 Ctrl). b 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) (n = 18 150 、 TD (D 、 TD (D)、 12 150)和D12 MT)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；####p < 0.0001，0##p < 0.0001，##相比，**p < 0.01 与D12控制）.b 4 12 (D12 MC) b Гистограмма, показывающая все 4 условия культивирования (контроль, TD, MC an MT) fir сравнению со свежезими (D) = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD an D12 MT), vun разных свиней 12 (D12 MC) срезы/группа, односторонний тест ANOVA <0,#00#0p, ##00#0; сравнению с D0, **p <0,01 по сравнению с контролем D12). b Histogramm deen all 4 Kulturbedingungen (Kontroll, TD, MC an MT) am Verglach mat frësche Häerzschnëtter (D0) weist (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD an D12 MT), vu verschiddene Schwäin 12 (D12 MC) Sektiounen/Grupp, One-Way ANOVA Test; ####p<0.0001, ###p<0.001 vs. D0, **p<0.01 vs. Kontroll D12). c Balkendiagramm weist d'Quantifizéierung vum Glukosflux 12 Deeg no der Kultur an alle 4 Kulturbedingungen (Ctrl, TD, MC an MT) am Verglach mat frësche Häerzscheiwen (D0) (n = 6 Scheiwen/Grupp vu verschiddene Schwäin, One-Way ANOVA-Test gëtt duerchgefouert; ###p < 0,001, am Verglach mat D0 an ***p < 0,001 am Verglach mat D12 Ctrl). c Balkendiagramm weist d'Quantifizéierung vum Glukosflux 12 Deeg no der Kultur an alle 4 Kulturbedingungen (Ctrl, TD, MC an MT) am Verglach mat frësche Häerzscheiwen (D0) (n = 6 Scheiwen/Grupp vu verschiddene Schwäin, One-Way ANOVA-Test gëtt duerchgefouert; ###p < 0,001, am Verglach mat D0 an ***p < 0,001 am Verglach mat D12 Ctrl). c Гистограмма показывает количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после культивированис во 4висов культивирования (контроль, TD, MC an MT) fir сравнению совежими срезами сердца (D0) (n = 6 срезов/групзионных, односторонний Выполняется тест ANOVA; c Histogramm weist d'Quantifizéierung vum Glukosflux 12 Deeg no der Kultur ënner alle 4 Kulturbedingungen (Kontroll, TD, MC an MT) am Verglach mat frësche Häerzschnëtter (D0) (n = 6 Sektiounen/Grupp vu verschiddene Schwäin, One-Way ANOVA Test duerchgefouert; ###p < 0,001 am Verglach zu D0 an ***p < 0,001 am Verglach zu D12 Ctrl). c 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) 相毹兔弌吐天的葡萄糖通量定量（n = 6 片/组，来自不同猪，单向执行ANOVA 测试；#0，D < 0.相比，***p < 0.001 与D12 Ctrl 相比）. C 条形图 显示 所有 4 种 条件 （（ctrl 、 td 、 mc 和 mt） 新鲜 心脏 切 缉 切 片 切 片 切培养 后 后 12 天 的 通量 定量 （n = 6 片/组 ， 来自 猪 ， ， ， ， ， ， ， ，猪单向执行ANOVA 测试；###p < 0.001，与D0 相比，***p < 0.001 与D12 Ctrl 相比）. c Гистограмма, показывающая количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после культивированис 4 культивирования (контроль, TD, MC a MT) fir сравнению свежими срезами сердца (D0) (n = 6 срезов/групрапа, срезов, односторонний Были проведены тесты ANOVA ###p < 0,001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению с D12 (контроль). c Histogramm weist d'Quantifizéierung vum Glukosflux 12 Deeg no der Kultur fir all 4 Kulturbedingungen (Kontroll, TD, MC an MT) am Verglach mat frësche Häerzschnëtter (D0) (n = 6 Sektiounen/Grupp, vu verschiddene Schwäin, unilateral wou ANOVA-Tester duerchgefouert goufen, ###p < 0,001 am Verglach zu D0, ***p < 0,001 am Verglach zu D12 (Kontroll).d Strain-Analyse-Plots vu frëschem (blo), vum 12. Dag MC (gréng) an vum 12. Dag MT (rout) Gewëss op zéng regionale Gewëssschnëttpunkten (n = 4 Scheiwen/Grupp, One-Way ANOVA-Test; et gouf keen signifikanten Ënnerscheed tëscht de Gruppen festgestallt). e Vulkandiagramm, deen ënnerschiddlech expriméiert Genen a frësche Häerzschnëtter (D0) am Verglach mat Häerzschnëtter weist, déi ënner statesche Konditiounen (Ctrl) oder ënner MT-Konditiounen (MT) fir 10-12 Deeg kultivéiert goufen. f Hëtzekaart vu Sarkomergenen fir Häerzschnëtter, déi ënner all de Kulturbedingungen kultivéiert goufen. Fehlerbalken representéieren de Mittelwert ± Standardofwäichung.
Metabolesch Ofhängegkeet vum Wiessel vun der Fettsäureoxidatioun op d'Glykolyse ass e Kennzeechen vun der Dedifferenziéierung vu Kardiomyozyten. Onreif Kardiomyozyten benotzen haaptsächlech Glukos fir d'ATP-Produktioun a weisen hypoplastesch Mitochondrien mat wéinege Cristae5,32. Glukosverbrauchsanalysen hunn gewisen, datt d'Glukosverbrauch ënner MC- an MT-Konditiounen ähnlech war wéi an den Tissue vum Dag 0 (Figur 4c). Ctrl-Prouwen hunn awer eng bedeitend Erhéijung vun der Glukosverbrauch am Verglach mat frëschem Tissu gewisen. Dëst weist drop hin, datt d'Kombinatioun vu CTCM an T3/Dex d'Gewebevitabilitéit verbessert an de metabolesche Phänotyp vun 12-Deeg kultivéierten Häerzsektiounen erhalen. Zousätzlech huet d'Dehnungsanalyse gewisen, datt d'Dehnungsniveauen 12 Deeg laang ënner MT- an MS-Konditiounen d'selwecht bliwwe sinn wéi a frëschem Häerzgewebe (Fig. 4d).
Fir den allgemengen Impakt vu CTCM an T3/Dex op déi global Transkriptiounslandschaft vum Häerzscheiwengewebe z'analyséieren, hu mir RNAseq op Häerzscheiwen aus alle véier verschiddene Kulturbedingungen duerchgefouert (Ergänzungsdaten 1). Interessanterweis hunn MT-Schnëtter eng héich Transkriptiounsähnlechkeet mat frëschem Häerzgewebe gewisen, mat nëmmen 16 vun 13.642 Genen, déi differenziell expriméiert goufen. Wéi mir awer virdru gewisen hunn, hunn Ctrl-Schnëtter no 10-12 Deeg an der Kultur 1229 differenziell expriméiert Genen gewisen (Fig. 4e). Dës Donnéeë goufen duerch qRT-PCR vun Häerz- a Fibroblastengenen bestätegt (Ergänzungsfigur 7a-c). Interessanterweis hunn d'Ctrl-Schnëtter eng Downreguléierung vun Häerz- a Zellzyklusgenen an eng Aktivéierung vun entzündleche Genprogrammer gewisen. Dës Donnéeë suggeréieren, datt d'Dedifferenziéierung, déi normalerweis no enger laangfristeger Kultivatioun geschitt, ënner MT-Konditioune komplett ofgeschwächt ass (Ergänzungsfigur 8a,b). Eng grëndlech Studie vu Sarkomergenen huet gewisen, datt nëmmen ënner MT-Konditioune d'Genen, déi de Sarkomer (Fig. 4f) an den Ionenkanal (Ergänzungsfig. 9) kodéieren, erhale bleiwen, wat se virun Ënnerdréckung ënner Ctrl-, TD- a MC-Konditioune schützt. Dës Donnéeë weisen, datt mat enger Kombinatioun vu mechanescher a humoraler Stimulatioun (T3/Dex) den Häerzscheiwen-Transkriptom no 12 Deeg an der Kultur ähnlech wéi frësch Häerzscheiwen bleiwe kann.
Dës Transkriptiounsresultater gi vun der Tatsaach ënnerstëtzt, datt d'strukturell Integritéit vu Kardiomyozyten an Häerzschnëtter ënner MT-Konditioune fir 12 Deeg am beschten erhale bleift, wéi duerch intakt a lokaliséiert Connexin 43 gewisen gëtt (Fig. 5a). Zousätzlech war d'Fibrose an Häerzschnëtter ënner MT-Konditioune signifikant reduzéiert am Verglach mat Ctrl a ähnlech wéi mat frëschen Häerzschnëtter (Fig. 5b). Dës Donnéeë weisen datt d'Kombinatioun vu mechanescher Stimulatioun an T3/Dex-Behandlung d'Häerzstruktur an Häerzschnëtter an der Kultur effektiv erhale léisst.
Representativ Immunofluoreszenzbiller vun Troponin-T (gréng), Connexin 43 (rout) an DAPI (blo) a frësch isoléierten Häerzschnëtter (D0) oder kultivéiert fir 12 Deeg ënner alle véier Kulturbedingungen vun Häerzschnëtter (Skalabalk = 100 µm). Quantifizéierung vun der struktureller Integritéit vum Häerzgewebe duerch kënschtlech Intelligenz (n = 7 (D0 an D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC an D12 MT) Scheiwen/Grupp vu verschiddene Schwäin, en One-Way ANOVA-Test gëtt duerchgefouert; ####p < 0,0001 am Verglach zu D0 an *p < 0,05, oder ****p < 0,0001 am Verglach zu D12 Ctrl). Quantifizéierung vun der struktureller Integritéit vum Häerzgewebe duerch kënschtlech Intelligenz (n = 7 (D0 an D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC an D12 MT) Scheiwen/Grupp vu verschiddene Schwäin, en One-Way ANOVA-Test gëtt duerchgefouert; #### p < 0,0001 am Verglach zu D0 an *p < 0,05, oder ****p < 0,0001 am Verglach zu D12 Ctrl). (D12 Ctrl, D = 7 (D12, TD), n = 7 (D12, TD) MC et D12 MT) срезов/группу от разных свиней, проведен однофакторный тест ANOVA #### p < 0,0001 по сравнению по сравнению <****p0p 0,0p 0,5 0,0001 op D12 Ctrl). Quantifizéierung vun der struktureller Integritéit vum Häerzgewebe mat Hëllef vun kënschtlecher Intelligenz (n = 7 (D0 an D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC an D12 MT) Sektiounen/Grupp vu verschiddene Schwäin, One-Way ANOVA-Test duerchgefouert; #### p < 0,0001 am Verglach zu D0 an *p < 0,05 oder ****p < 0,0001 am Verglach zu D12 Ctrl).对不同猪的心脏组织结构完整性（n = 7（D0 和D12 Ctrl）、5（D12 TD, D12 MC 和D12 MT）切片/组）进行人工智能量化，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0.0001 与D0 帒0*p <0.0*p <0.0*p <0.0*p 0.0001 与D12 Ctrl 相比）.对 不同 猪 的 心脏 结构 完整性 （n = 7 （d0 和 d12 ctrl） (5 （d12 td 、 t ， d12 m ） d12 mc 廒人工 智能量 化 进行 单向 单向 单向 测试 ； ########## p < 0.0001 与D0 和*p ；戌****p < 0.05 0.0001 与D12 Ctrl 相比).Quantifizéierung vun der struktureller Integritéit vum Häerzgewebe mat Hëllef vun kënschtlecher Intelligenz bei verschiddene Schwäin (n = 7 (D0 an D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC an D12 MT) Sektiounen/Grupp) mat engem One-Way ANOVA-Test;#### p < 0,0001 bei D0 an *p < 0,05 oder ****p < 0,0001 mat D12 Ctrl). #### p < 0,0001 am Verglach zu D0 an *p < 0,05 oder ****p < 0,0001 am Verglach zu D12 Ctrl). b Representativ Biller a Quantifizéierung fir Häerzscheiwen, déi mat Masson-Trichrom-Faarf gefierft goufen (Skalabalke = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD an D12 MC), 9 (D12 MT) Scheiwen/Grupp vu verschiddene Schwäin, en One-Way-ANOVA-Test gëtt duerchgefouert; ####p < 0,0001 am Verglach zu D0 an ***p < 0,001, oder ****p < 0,0001 am Verglach zu D12 Ctrl). b Representativ Biller a Quantifizéierung fir Häerzscheiwen, déi mat Masson-Trichrom-Faarf gefierft goufen (Skalabalke = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD an D12 MC), 9 (D12 MT) Scheiwen/Grupp vu verschiddene Schwäin, en One-Way-ANOVA-Test gëtt duerchgefouert; ####p < 0,0001 am Verglach zu D0 an ***p < 0,001, oder ****p < 0,0001 am Verglach zu D12 Ctrl). b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромным красиамасная ( линейка = 500 mkm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD an D12 MC), 9 (D12 MT) срезов/группу от разных свиней, выполня ANOVA; ####p < 0,0001 bei D0 an ***p < 0,001 oder ****p < 0,0001 op D12 Ctrl). b Representativ Biller a Quantifizéierung vun Häerzschnëtter, déi mat Masson-Trichrom-Faarf gefierft goufen (Skalabalk = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD an D12 MC), 9 (D12 MT) Schnëtter/Grupp vu verschiddene Schwäin, duerchgefouert One-Way-ANOVA; ####p < 0,0001 vs. D0 an ***p < 0,001 oder ****p < 0,0001 vs. D12 Ctrl). b 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像和量化（比例尺= 500 µm（0）㼈n（10（n Ctrl、D12 TD 和D12 MC），来自不同猪的9 个（D12 MT）切片/组，进行单因素方垕因素方垮弆#0.0与D0 相比，***p < 0.001，或****p < 0.0001 与D12 Ctrl 相比）. b 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 和 量化 （比例 尺 尺 尺 = 500 µn = 0（n（n（n 、 d12 ctrl 、 d12 td 和 d12 mc） 来自 不同 的 9 个 d12 mt 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片/组，进行单因素方差分渎；10#0##D相比，***p < 0.001，或****p < 0.0001 与D12 Ctrl 相比）. b Reguléierungsausbildung a Gestiounsaustausch vun der Gesellschaft, an der Mëtt vum Mee 05000000000 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD an D12 MC), 9 (D12 MT) срезов от разных свиней / группы, один-способ ANOVA; #п##000 с D0, ***p < 0,001 oder ****p < 0,0001 mat D12 Ctrl). b Representativ Biller a Quantifizéierung vun Häerzschnëtter, déi mat Masson-Trichrom gefierft goufen (Skalabalke = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD an D12 MC), 9 (D12 MT) Schnëtter vu verschiddene Schwäin/Grupp, eng ANOVA-Method; ####p < 0,0001 am Verglach zu D0, ***p < 0,001 oder ****p < 0,0001 am Verglach zu D12 Ctrl).Fehlerbalken representéieren de Mëttelwäert ± Standardofwäichung.
Schlussendlech gouf d'Fäegkeet vum CTCM, fir d'Häerzhypertrophie ze imitéieren, duerch d'Erhéijung vum Strecken vum Häerzgewebe bewäert. Am CTCM ass den Drock an der maximaler Loftkammer vun 80 mmHg op 80 mmHg Art. (normal Streck) bis zu 140 mmHg Art. (Fig. 6a) geklommen. Dëst entsprécht enger Erhéijung vun 32% vum Strecken (Fig. 6b), wat virdru als déi entspriechend Prozentsaz vun der Streck gewisen gouf, déi fir Häerzsektiounen erfuerderlech ass, fir eng Sarkomerlängt z'erreechen, déi ähnlech wéi déi bei Hypertrophie ass. D'Strecken an d'Geschwindegkeet vum Häerzgewebe während der Kontraktioun an der Relaxatioun si sechs Deeg Kultur konstant bliwwen (Fig. 6c). Häerzgewebe aus MT-Konditioune gouf sechs Deeg laang normale Strecken (MT (Normal)) oder Iwwerstreckungen (MT (OS)) ausgesat. Scho no véier Deeg Kultur war de hypertrophe Biomarker NT-ProBNP am Medium ënner MT (OS)-Konditiounen am Verglach zu MT (normalen) Konditiounen signifikant erhéicht (Fig. 7a). Zousätzlech ass d'Zellgréisst an der MT (OS) (Fig. 7b) no sechs Deeg Kultivatioun am Verglach mat Schnëtter vum MT-Häerz (normal) däitlech eropgaang. Zousätzlech war d'NFATC4-Nukleartranslokatioun an iwwergestreckten Tissue däitlech eropgaang (Fig. 7c). Dës Resultater weisen déi progressiv Entwécklung vum pathologesche Remodeling no Hyperdistensioun a ënnerstëtzen d'Konzept, datt den CTCM-Apparat als Plattform fir d'Streck-induzéiert Herzhypertrophiesignalgebung ka benotzt ginn.
Representativ Spuere vum Loftkammerdrock, Flëssegkeetskammerdrock a Miessunge vun der Gewëbebewegung bestätegen, datt den Drock an der Kammer den Drock an der Flëssegkeetskammer ännert, wat zu enger entspriechender Bewegung vun der Gewëbescheif féiert. b Representativ Streckprozentsaz- a Streckratekurven fir normalerweis gestreckt (orange) an iwwergestreckt (blo) Gewëbescheiwen. c Balkendiagramm, dat d'Zykluszäit (n = 19 Scheiwen pro Grupp, vu verschiddene Schwäin), d'Kontraktiounszäit (n = 18-19 Scheiwen pro Grupp, vu verschiddene Schwäin), d'Relaxatiounszäit (n = 19 Scheiwen pro Grupp, vu verschiddene Schwäin)), d'Amplitude vun der Gewëbebewegung (n = 14 Scheiwen/Grupp, vu verschiddene Schwäin), d'systolesch Héchstgeschwindegkeet (n = 14 Scheiwen/Grupp, vu verschiddene Schwäin) an d'Relaxatiounsquote (n = 14 (D0), 15 (D6)) Sektiounen/Gruppen) vu verschiddene Schwäin weist, den zweesäitege Student's t-Test huet keen signifikanten Ënnerscheed an iergendengem Parameter gewisen, wat drop hiweist, datt dës Parameter während 6 Deeg Kultur mat Iwwerspannung konstant bliwwe sinn. Fehlerbalken representéieren de Mëttelwäert ± Standardofwäichung.
eng Balkendiagrammquantifizéierung vun der NT-ProBNP-Konzentratioun a Kulturmedien aus Häerzscheiwen, déi ënner MT-normaler Streckbedingungen (Norm) oder Iwwerstreckbedingungen (OS) kultivéiert goufen (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm an D4 MTOS) Scheiwen/Grupp vu verschiddene Schwäin, eng Two-Wee-ANOVA gëtt duerchgefouert; **p < 0,01 am Verglach zum normale Streck). eng Balkendiagrammquantifizéierung vun der NT-ProBNP-Konzentratioun a Kulturmedien aus Häerzscheiwen, déi ënner MT-normaler Streckbedingungen (Norm) oder Iwwerstreckbedingungen (OS) kultivéiert goufen (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm an D4 MTOS) Scheiwen/Grupp vu verschiddene Schwäin, eng Two-Wee-ANOVA gëtt duerchgefouert; **p < 0,01 am Verglach zum normale Streck).Quantitativt Histogramm vun der NT-ProBNP Konzentratioun am Kulturmedium aus Häerzscheiwen, déi ënner Bedingunge vun normaler MT-Streck (Norm) oder Iwwerstreck (OS) kultivéiert goufen (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm an D4).MTOS) Scheiwen /Grupp vu verschiddene Schwäin, Zwei-Faktor-Varianzanalyse gëtt duerchgefouert;**p < 0,01 fir сравнению нормальным растяжением). **p < 0,01 am Verglach mat normaler Dehnung). a 在MT 正常拉伸(Norm) 或过度拉伸(OS) 条件下培养的心脏切片培养基中NT-ProBNP浓度的条形图量化（n = 4 (D2 MTNorm)、3（D2 MTOS, D4 MTNorm 和D4 MTOS）来自不同猪的切片/组，进行双向方差分析；**与正常拉伸相比，p < 0,01) eng Quantifikatioun vun NT-ProBNP Konzentratioun an Häerz Scheiwen kultivéiert ënner MT normal Stretch (Norm) oder Overstretch (OS) Konditiounen (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm 和 D4 MTOS) vu verschiddene猪的切片/组，可以双向方方发发动 **vergläicht mat normale Stretching, p <0.01).Histogramm Quantifizéierung vun den NT-ProBNP-Konzentratiounen an Häerzscheiwen, déi ënner Bedingunge vun normaler MT-Streck (Norm) oder Iwwerstreck (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm) an D4 MTOS) Scheiwen/Grupp vu verschiddene Schwäin kultivéiert goufen, Zweiwege-Varianzanalyse;**p < 0,01 fir сравнению нормальным растяжением). **p < 0,01 am Verglach mat normaler Dehnung). b Representativ Biller fir Häerzscheiwen, déi mat Troponin-T a WGA gefierft goufen (lénks) a Quantifizéierung vun der Zellgréisst (riets) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) Zellen/Grupp aus 10 verschiddene Scheiwen aus verschiddene Schwäin, en zweesäitege Student t-Test gëtt duerchgefouert; ****p < 0,0001 am Verglach mat normaler Streck). b Representativ Biller fir Häerzscheiwen, déi mat Troponin-T a WGA gefierft goufen (lénks) a Quantifizéierung vun der Zellgréisst (riets) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) Zellen/Grupp aus 10 verschiddene Scheiwen aus verschiddene Schwäin, en zweesäitege Student t-Test gëtt duerchgefouert; ****p < 0,0001 am Verglach mat normaler Streck). b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т an АЗП (слева) a количествениногого клеток (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) клеток/группу из 10 разных срезов vun разных свиней, двх-из t-критерий Стьюдента; ****p < 0,0001 по сравнению с нормальным растяжением). b Representativ Biller vun Häerzschnëtter, déi mat Troponin-T an AZP gefierft goufen (lénks) an der Zellgréisstquantifizéierung (riets) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) Zellen/Grupp aus 10 verschiddene Schnëtter vu verschiddene Schwäin, en zweesäitege Student's t-Test gouf duerchgefouert; ****p < 0,0001 am Verglach zum normale Stamm). b 用肌钙蛋白-T 和WGA（左）和细胞大小量化（右）染色的心脏切片的仆胏MTOS），来自不同猪的10 个不同切片的369（D6 MTNorm）细胞/组，两进行有尾学甌检验；与正常拉伸相比，****p < 0,0001）. b Representativ Biller vun Häerzscheiwen, déi mat Calcarein-T a WGA gefierft goufen (lénks) a Zellgréisst (riets) (n = 330 (D6 MTOS), 369 aus 10 verschiddene Scheiwen (D6 MTNorm)) Zellen/Blutt, den Nierentumor-T-T-T-T-Test; am Verglach mat normaler Dehnung, ****p < 0,0001). b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т an АЗП (слева) a количественная околичественная (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) из 10 различных срезов vun разных свиней Клетки/группа, справа, справа; ****p < 0,0001 op сравнению нормальным растяжением). b Representativ Biller vun Häerzschnëtter, déi mat Troponin-T an AZP gefierft goufen (lénks) a Quantifizéierung vun der Zellgréisst (riets) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) aus 10 verschiddene Schnëtter vu verschiddene Schwäin) Zellen/Grupp, zweesäitegt Kriterium Student's t; ****p < 0,0001 am Verglach mat normaler Belaaschtung). c Representativ Biller fir Häerzscheiwen vun MTOS um Dag 0 an um Dag 6, immunolabeléiert fir Troponin-T an NFATC4, an d'Quantifizéierung vun der Translokatioun vun NFATC4 an d'Käre vun de CMs (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) Scheiwen/Grupp vu verschiddene Schwäin, en zweesäitege Student t-Test gëtt duerchgefouert; *p < 0,05). c Representativ Biller fir Häerzscheiwen vun MTOS um Dag 0 an Dag 6, immunolabeléiert fir Troponin-T an NFATC4, an Quantifizéierung vun der Translokatioun vun NFATC4 an d'Käre vun de CMs (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) Scheiwen/Grupp vu verschiddene Schwäin, en zweesäitege Student t-Test gëtt duerchgefouert; *p < 0,05). c Репрезентативные изображения fir срезов сердца 0 a 6 дней MTOS, иммуномеченых fir тропонина-Т an NFATC4, a ковлениче транслокации NFATC4 в ядра кавернозных клеток (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срезов/группу от разных свиняней , видусян t-критерий Стьюдента; *p < 0,05). c Representativ Biller fir Häerzschnëtter bei 0 an 6 Deeg MTOS, immunolabeléiert fir Troponin-T an NFATC4, a Quantifizéierung vun der NFATC4-Translokatioun am Zellkär vu kavernöse Zellen (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) Scheiwen/Grupp vu verschiddene Schwäin) duerchgefouert mat engem zweesäitege Student's t-Test; *p < 0,05). c 用于肌钙蛋白-T 和NFATC4 免疫标记的第0 天和第6 天MTOS心脏切片的代表性图像，以及来自不同猪的NFATC4 易位至CM 细胞核的量匀1（n) =、3D (D)切片/组, 进行双尾学生t 检验；*p < 0.05). c Representativ Biller vu Calcanin-T an NFATC4 Immunolabeling 第0天和第6天MTOS Häerzscheiwen, an NFATC4 vu verschiddenen NFATC4 易位至CM Zellkärenquantitéit 化 (n = 4 (D0), 缇 焇, 缇 , 缇 , 焇 , 焇 , 焇 , 焇 , 缇 , 缇 , 缇 , 缇 , 缇 , 缇 , 缇 , 缇 , CM时间双尾学生et 电影；*p < 0,05). c Репрезентативные изображения срезов сердца MTOS op 0 a 6 день fir иммуномаркировки тропонинином-Т an NFATC4 a коцичи транслокации NFATC4 в ядра CM от разных свиней (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срез/группа, два- хвостатый t-критер, 0); c Representativ Biller vun MTOS-Häerzscheiwen um Dag 0 an 6 fir Troponin-T an NFATC4-Immunolabeling a Quantifizéierung vun der NFATC4-Translokatioun am Zellkär vu CM vu verschiddene Schwäin (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) Scheiwen/Grupp, zweesäitegt t-Kriterium Student's; *p < 0,05).Fehlerbalken representéieren d'Moyenne ± Standardofwäichung.
Translational kardiovaskulär Fuerschung erfuerdert Zellmodeller, déi d'Häerzëmfeld präzis reproduzéieren. An dëser Studie gouf en CTCM-Apparat entwéckelt a charakteriséiert, deen ultradënn Häerzsektiounen stimuléiere kann. Den CTCM-System enthält physiologesch synchroniséiert elektromechanesch Stimulatioun an T3- an Dex-Flëssegkeetsanreicherung. Wann Schwäinhäerzsektiounen dëse Faktoren ausgesat waren, sinn hir Viabilitéit, strukturell Integritéit, metabolesch Aktivitéit an transkriptionell Expressioun no 12 Deeg Kultur d'selwecht bliwwen wéi a frëschem Häerzgewebe. Zousätzlech kann exzessiv Strecken vum Häerzgewebe eng Hypertrophie vum Häerz verursaachen, déi duerch Hyperextensioun verursaacht gëtt. Am Allgemengen ënnerstëtzen dës Resultater déi kritesch Roll vun de physiologesche Kulturbedingungen bei der Erhalen vun engem normale kardialen Phänotyp a bidden eng Plattform fir Medikamentenscreening.
Vill Faktoren droen dozou bäi, en optimalt Ëmfeld fir d'Funktioun an d'Iwwerliewe vu Kardiomyozyten ze schafen. Déi offensichtlechst vun dëse Faktoren hänken mat (1) interzellulären Interaktiounen, (2) elektromechanescher Stimulatioun, (3) humoralen Faktoren an (4) metabolesche Substrater zesummen. Physiologesch Zell-zu-Zell-Interaktiounen erfuerderen komplex dräidimensional Netzwierker vu verschiddene Zelltypen, déi vun enger extrazellulärer Matrix ënnerstëtzt ginn. Sou komplex zellulär Interaktioune si schwéier in vitro duerch Kokultur vun eenzelnen Zelltypen ze rekonstruéieren, kënnen awer einfach mat Hëllef vun der organotypescher Natur vun Häerzsektiounen erreecht ginn.
Mechanesch Streckung an elektresch Stimulatioun vu Kardiomyozyten si kritesch fir de kardialen Phänotyp z'erhalen33,34,35. Wärend mechanesch Stimulatioun wäit verbreet fir hiPSC-CM Konditionéierung a Reifung benotzt gouf, hunn e puer elegant Studien viru kuerzem probéiert, Häerzscheiwen an der Kultur mat uniaxialer Belaaschtung mechanesch Stimulatioun ze maachen. Dës Studien weisen datt 2D uniaxial mechanesch Belaaschtung e positiven Effekt op de Phänotyp vum Häerz während der Kultur huet. An dëse Studien goufen Häerzsektiounen entweder mat isometreschen Zuchkräften17, linearer auxotonescher Belaaschtung18 belaascht, oder den Häerzzyklus gouf mat Kraaftwandler-Feedback a Spannungsuntrieben nei erstallt. Dës Methoden benotzen awer uniaxial Gewiefsstreckung ouni Ëmweltoptimiséierung, wat zu der Ënnerdréckung vu ville Häerzgenen oder Iwwerexpressioun vu Genen féiert, déi mat anormalen Streckreaktiounen assoziéiert sinn. Den CTCM, deen hei beschriwwe gëtt, liwwert en 3D elektromechanesche Stimulus, deen den natierleche Häerzzyklus a punkto Zykluszäit a physiologescher Streckung imitéiert (25% Streckung, 40% Systole, 60% Diastole a 72 Schléi pro Minutt). Obwuel dës dräidimensional mechanesch Stimulatioun eleng net duer geet, fir d'Integritéit vum Gewëss z'erhalen, ass eng Kombinatioun vun humoraler a mechanescher Stimulatioun mat T3/Dex noutwendeg, fir d'Viabilitéit, d'Funktioun an d'Integritéit vum Gewëss adäquat z'erhalen.
Humoral Faktoren spillen eng wichteg Roll bei der Modulatioun vum Häerzphenotyp bei Erwuessenen. Dëst gouf an HiPS-CM Studien ervirgehuewen, an deenen T3 an Dex zu Kulturmedien bäigefüügt goufen, fir d'Zellreifung ze beschleunegen. T3 kéint den Transport vun Aminosäuren, Zocker a Kalzium iwwer Zellmembranen beaflossen36. Zousätzlech fördert T3 d'MHC-α Expressioun an d'MHC-β Downregulatioun, wouduerch d'Bildung vu séieren Twitch-Myofibrillen a reife Kardiomyozyten am Verglach zu luesen Twitch-Myofibrillen a fetalem CM gefördert gëtt. T3-Mangel bei Hypothyroidpatienten féiert zum Verloscht vu Myofibrilläre Bänner an enger reduzéierter Rate vun der Tonusentwécklung37. Dex wierkt op Glukokortikoidrezeptoren a gouf gewisen, datt et d'Myokardkontraktilitéit an isoléierten perfundéierten Häerzer erhéicht;38 gëtt ugeholl, datt dës Verbesserung mam Effekt op de Kalziumdepot-gedriwwenen Entrée (SOCE)39,40 zesummenhänkt. Zousätzlech bindt Dex sech un seng Rezeptoren, wouduerch eng breet intrazellulär Äntwert verursaacht gëtt, déi d'Immunfunktioun an d'Entzündung30 ënnerdréckt.
Eis Resultater weisen datt kierperlech mechanesch Stimulatioun (MS) d'Gesamtleistung vun der Kultur am Verglach mat Ctrl verbessert huet, awer net fäerdeg bruecht huet, d'Viabilitéit, d'strukturell Integritéit an d'Häerzexpressioun iwwer 12 Deeg an der Kultur z'erhalen. Am Verglach mat Ctrl huet d'Zousätzlech vun T3 an Dex zu CTCM (MT) Kulturen d'Viabilitéit verbessert an ähnlech Transkriptiounsprofiler, strukturell Integritéit a metabolesch Aktivitéit mat frëschem Häerzgewebe fir 12 Deeg erhalen. Zousätzlech gouf duerch d'Kontroll vum Grad vun der Gewëbedehnung e Hyperextensioun-induzéiert Häerzhypertrophiemodell mat STCM erstallt, wat d'Villsäitegkeet vum STCM-System illustréiert. Et sollt bemierkt ginn, datt obwuel Häerzremodelléierung a Fibrose normalerweis intakt Organer involvéieren, deenen hir zirkulierend Zellen déi entspriechend Zytokine souwéi Phagozytose an aner Remodelléierungsfaktoren liwwere kënnen, Sektiounen vum Häerz ëmmer nach de fibrotesche Prozess als Reaktioun op Stress an Trauma a Myofibroblasten imitéiere kënnen. Dëst gouf virdru schonn an dësem Häerzscheifmodell evaluéiert. Et sollt bemierkt ginn, datt CTCM-Parameteren duerch Ännerung vum Drock/der elektrescher Amplitude a Frequenz moduléiert kënne ginn, fir vill Konditiounen wéi Tachykardie, Bradykardie a mechanesch Zirkulatiounsënnerstëtzung (mechanescht entlaascht Häerz) ze simuléieren. Dëst mécht de System zu engem mëttleren Duerchgank fir Drogentests. D'Fäegkeet vum CTCM fir Iwwerbelaaschtungsinduzéiert Herzhypertrophie ze modelléieren, mécht de Wee fräi fir dëse System fir eng personaliséiert Therapie ze testen. Zesummefaassend weist déi aktuell Studie datt mechanesch Stretching a humoral Stimulatioun entscheedend sinn fir d'Kultur vu Häerzgewebeschnëtter z'erhalen.
Obwuel d'Donnéeën, déi hei presentéiert ginn, drop hiweisen, datt CTCM eng ganz villverspriechend Plattform fir d'Modeléierung vun intaktem Myokard ass, huet dës Kulturmethod e puer Aschränkungen. Déi Haaptbeschränkung vun der CTCM-Kultur ass, datt se kontinuéierlech dynamesch mechanesch Belaaschtungen op d'Scheiwen ausübt, wat d'Méiglechkeet verhënnert, d'Kontraktioune vun den Häerzscheiwen während all Zyklus aktiv ze iwwerwaachen. Zousätzlech ass wéinst der klenger Gréisst vun den Häerzscheiwen (7 mm) d'Fäegkeet, d'systolesch Funktioun ausserhalb vu Kultursystemer mat traditionelle Kraaftsensoren ze evaluéieren, limitéiert. Am aktuelle Manuskript iwwerwannen mir dës Beschränkung deelweis andeems mir d'optesch Spannung als Indikator fir d'kontraktil Funktioun evaluéieren. Dës Beschränkung erfuerdert awer weider Aarbecht a kéint an Zukunft adresséiert ginn andeems Methode fir d'optesch Iwwerwaachung vun der Funktioun vun Häerzscheiwen an der Kultur agefouert ginn, wéi z. B. optesch Mapping mat Kalzium a spannungsempfindleche Faarfstoffer. Eng aner Beschränkung vun der CTCM ass, datt den Aarbechtsmodell kee physiologesche Stress (Virbelaaschtung an Nobelaaschtung) manipuléiert. Am CTCM gouf Drock a géigeniwwerléiende Richtungen induzéiert fir 25% physiologesch Streckung an der Diastol (voll Streckung) a Systol (Längt vun der Kontraktioun während der elektrescher Stimulatioun) a ganz grousse Gewëss ze reproduzéieren. Dës Aschränkung sollt a zukünftegen CTCM-Designen duerch adäquaten Drock op d'Häerzgewebe vu béide Säiten an duerch d'Uwendung vun de genauen Drock-Volumen-Bezéiungen, déi an de Kummere vum Häerz optrieden, eliminéiert ginn.
Déi duerch Iwwerdehnung induzéiert Remodeling, déi an dësem Manuskript beschriwwe gëtt, beschränkt sech op d'Imitatioun vun hypertrophen Hyperdehnungssignaler. Dofir kann dëst Modell bei der Studie vun der duerch Dehnung induzéierter hypertropherescher Signalgebung hëllefen, ouni datt humoral oder neuronal Faktoren néideg sinn (déi an dësem System net existéieren). Weider Studien sinn néideg fir d'Multiplizitéit vun CTCM ze erhéijen, zum Beispill wäert d'Kokultivatioun mat Immunzellen, zirkulierende Plasma-humoral Faktoren an Innervatioun, wann d'Kokultivatioun mat neuronalen Zellen d'Méiglechkeeten vun der Krankheetsmodelléierung mat CTCM verbesseren.
Dräizéng Schwäin goufen an dëser Studie benotzt. All Déierprozedure goufen am Aklang mat den institutionellen Richtlinne duerchgefouert a goufe vum Institutional Animal Care and Use Committee vun der University of Louisville guttgeheescht. Den Aortabou gouf ofgeklemmt an d'Häerz gouf mat 1 L steriler Kardioplegie perfuséiert (110 mM NaCl, 1,2 mM CaCl2, 16 mM KCl, 16 mM MgCl2, 10 mM NaHCO3, 5 U/mL Heparin, pH bis zu 7,4); D'Häerzer goufen an äiskaler kardioplegescher Léisung konservéiert, bis se op Äis an de Laboratoire transportéiert goufen, wat normalerweis <10 Minutte dauert. D'Häerzer goufen an äiskaler kardioplegescher Léisung konservéiert, bis se op Äis an de Laboratoire transportéiert goufen, wat normalerweis <10 Minutte dauert. сердца хранили в ледяном кардиоплегическом растворе fir транспортировки an лабораторию zu льду, что обанично <10m. D'Häerzer goufen an enger äiskaler kardioplegescher Léisung gelagert, bis se op Äis an de Laboratoire transportéiert goufen, wat normalerweis <10 Minutte dauert.将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常8<10。将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常8<10。 Держите сердца в ледяной кардиоплегии до транспортировки в лабораторию zu льду, обычно <10 min. Halt d'Häerzer op Äis bei Kardioplegie bis zum Transport an de Laboratoire op Äis, normalerweis <10 Minutten.
Den CTCM-Apparat gouf an der SolidWorks Computer-aided Design (CAD) Software entwéckelt. D'Kulturkammeren, d'Trennwänn an d'Loftkammere si aus CNC-kloerem Acrylplastik gemaach. De 7 mm Duerchmiesser Réckring ass an der Mëtt aus Héichdichtpolyethylen (HDPE) gemaach an huet eng O-Ringnut fir den Silikon-O-Ring z'ënnerbréngen, deen benotzt gëtt fir d'Medien drënner ofzedichten. Eng dënn Siliziumdioxidmembran trennt d'Kulturkammer vun der Trennplack. D'Silikonmembran ass aus enger 0,02 Zoll décker Silikonplack lasergeschnidden an huet eng Häert vun 35A. Déi ënnescht an iewescht Silikondichtung sinn aus enger 1/16 Zoll décker Silikonplack lasergeschnidden an hunn eng Häert vun 50A. 316L Edelstahlschrauwen a Flillekmutteren gi benotzt fir de Block ze befestigen an eng loftdicht Dichtung ze kreéieren.
Eng speziell gedréckte Leiterplatte (PCB) ass entwéckelt fir mam C-PACE-EM System integréiert ze ginn. D'Schwäizer Maschinnstecker op der PCB sinn duerch versëlberte Kupferdrot a Bronze 0-60 Schrauwen, déi an d'Elektroden geschrauft sinn, mat Graphitelektroden verbonnen. D'gedréckte Leiterplatte ass an der Ofdeckung vum 3D-Drécker placéiert.
Den CTCM-Apparat gëtt vun engem programméierbare pneumateschen Aktuator (PPD) gesteiert, deen en kontrolléierten Zirkulatiounsdrock erstellt, ähnlech wéi e Häerzzyklus. Wann den Drock an der Loftkammer eropgeet, dehnt sech déi flexibel Silikonmembran no uewen aus, wouduerch de Medium ënner d'Gewebeplaz gedréckt gëtt. D'Gewebefläch gëtt dann duerch dës Ausdréckung vun der Flëssegkeet gestreckt, wat d'physiologesch Expansioun vum Häerz während der Diastol imitéiert. Um Héichpunkt vun der Relaxatioun gouf elektresch Stimulatioun duerch Graphitelektroden ugewannt, wat den Drock an der Loftkammer reduzéiert an d'Kontraktioun vun de Gewebesektiounen verursaacht huet. Am Rouer ass e hemostatescht Ventil mat engem Drocksensor fir den Drock am Loftsystem ze detektéieren. Den Drock, deen vum Drocksensor gemooss gëtt, gëtt op en Datensammler ugewannt, deen mam Laptop verbonnen ass. Dëst erlaabt eng kontinuéierlech Iwwerwaachung vum Drock an der Gaskammer. Wann den maximalen Drock an der Kammer erreecht gouf (Standard 80 mmHg, 140 mmHg OS), gouf den Datenerfassungsapparat uginn, e Signal un de C-PACE-EM System ze schécken, fir e biphasescht Spannungssignal fir 2 ms ze generéieren, agestallt op 4 V.
Häerzschnëtter goufen geholl an d'Kulturbedingungen a 6 Lächer goufen wéi follegt duerchgefouert: Déi geerntet Häerzer goufen aus dem Transferbehälter an en Tablett mat kaler (4°C) Kardioplegie transferéiert. De lénkse Ventrikel gouf mat enger steriler Klingen isoléiert a Stécker vun 1-2 cm3 geschnidden. Dës Gewëbeblöcke goufen un Gewëbeträger mat Gewëbeklebstoff befestegt an an e vibréierend Mikrotom-Gewëbebad mat Tyrode-Léisung geluecht an kontinuéierlech mat Sauerstoff bedeckt (3 g/L 2,3-Butandionmonooxim (BDM), 140 mM NaCl (8,18 g), 6 mM KCl (0,447 g), 10 mM D-Glukos (1,86 g), 10 mM HEPES (2,38 g), 1 mM MgCl2 (1 ml 1 M Léisung), 1,8 mM CaCl2 (1,8 ml 1 M Léisung), bis zu 1 L ddH2O). De vibréierende Mikrotom gouf agestallt fir 300 µm déck Scheiwen mat enger Frequenz vun 80 Hz, enger horizontaler Schwingungsamplitude vun 2 mm an enger Fortschrëttsgeschwindegkeet vun 0,03 mm/s ze schneiden. D'Gewebebad war vun Äis ëmginn fir d'Léisung kill ze halen an d'Temperatur gouf op 4°C gehalen. Gewebsschnëtter goufen aus dem Mikrotomebad an en Inkubatiounsbad mat kontinuéierlech sauerstofféierter Tyrode-Léisung op Äis transferéiert, bis genuch Schnëtter fir eng Kulturplack kritt goufen. Fir Transwell-Kulturen goufen d'Gewebsschnëtter un steril 6 mm breet Polyurethan-Ënnerstëtzer befestegt an a 6 ml optiméiertem Medium (199 Medium, 1x ITS-Ergänzung, 10% FBS, 5 ng/ml VEGF, 10 ng/ml FGF-alkalesch an 2X Antibiotikum-Antifungsmëttel) placéiert. Elektresch Stimulatioun (10 V, Frequenz 1,2 Hz) gouf op d'Gewebsschnëtter iwwer de C-Pace ugewannt. Fir TD-Konditioune goufen frësch T3 an Dex mat 100 nM an 1 μM bei all Mediumwiessel bäigefüügt. D'Medium gëtt 3 Mol am Dag mat Sauerstoff gesättigt, ier et ersat gëtt. D'Gewebeschnitte goufen an engem Inkubator bei 37°C a 5% CO2 kultivéiert.
Fir CTCM-Kulturen goufen Tissueschnitten op engem speziell gebauten 3D-Drucker an enger Petrischüssel mat modifizéierter Tyrode-Léisung placéiert. Den Apparat ass entwéckelt fir d'Gréisst vun der Häerzscheif ëm 25% vun der Fläch vum Stützring ze erhéijen. Dëst gëtt gemaach, fir datt d'Häerzschnitten sech net dehnen nodeems se vun der Tyrode-Léisung an d'Medium an während der Diastole transferéiert goufen. Mat Histoacrylklebstoff goufen 300 µm déck Schnitten op engem Stützring mat engem Duerchmiesser vu 7 mm fixéiert. Nodeems d'Tissueschnitten um Stützring befestegt goufen, goufen déi iwwerschësseg Tissueschnitten ofgeschnidden an déi befestegt Tissueschnitten zeréck an d'Bad mat der Tyrode-Léisung op Äis (4°C) geluecht, bis genuch Schnitten fir een Apparat virbereet goufen. Déi total Veraarbechtungszäit fir all Apparater däerf net méi wéi 2 Stonnen daueren. Nodeems 6 Tissueschnitten un hir Stützréng befestegt waren, gouf den CTCM-Apparat zesummegebaut. D'CTCM-Kulturkammer gëtt mat 21 ml vir-sauerstoffräichem Medium virgefëllt. D'Tissueschnitten an d'Kulturkammer transferéieren an all Loftblosen virsiichteg mat enger Pipett ewechhuelen. D'Gewebesektioun gëtt dann an d'Lach gefouert a virsiichteg festgedréckt. Schlussendlech gëtt d'Elektrodenkapp um Apparat gesat an den Apparat an den Inkubator bruecht. Dann gëtt den CTCM mat der Loftschlauch an dem C-PACE-EM System verbonnen. Den pneumateschen Aktuator geet op an d'Loftventil mécht den CTCM op. De C-PACE-EM System gouf konfiguréiert fir 4 V bei 1,2 Hz während biphasescher Pacing fir 2 ms ze liwweren. De Medium gouf zweemol am Dag gewiesselt an d'Elektroden eemol am Dag gewiesselt fir d'Akkumulatioun vu Graphit op den Elektroden ze vermeiden. Wann néideg kënnen d'Gewebesektiounen aus hire Kulturbühnen erausgeholl ginn fir all Loftblosen ze verdreiwen, déi eventuell ënner si gefall sinn. Fir MT-Behandlungsbedingungen gouf T3/Dex mat all Mediumwiessel frësch mat 100 nM T3 an 1 μM Dex bäigefüügt. D'CTCM-Apparater goufen an engem Inkubator bei 37°C a 5% CO2 kultivéiert.
Fir gestreckte Trajektorien vun Häerzscheiwen ze kréien, gouf e speziellt Kamerasystem entwéckelt. Eng SLR Kamera (Canon Rebel T7i, Canon, Tokyo, Japan) gouf mat engem Navitar Zoom 7000 18-108mm Makroobjektiv (Navitar, San Francisco, CA) benotzt. D'Visualiséierung gouf bei Raumtemperatur duerchgefouert, nodeems de Medium duerch e frësche Medium ersat gouf. D'Kamera gëtt an engem Wénkel vu 51° positionéiert a Video gëtt mat 30 Biller pro Sekonn opgeholl. Als éischt gouf Open-Source Software (MUSCLEMOTION43) mat Image-J benotzt fir d'Bewegung vun den Häerzscheiwen ze quantifizéieren. D'Mask gouf mat MATLAB (MathWorks, Natick, MA, USA) erstallt fir Regiounen vun Interesse fir schloend Häerzscheiwen ze definéieren fir Rauschen ze vermeiden. Manuell segmentéiert Masken ginn op all Biller an enger Bildsequenz ugewannt an dann un de MUSCLEMOTION Plug-in weiderginn. Muscle Motion benotzt déi duerchschnëttlech Intensitéit vun de Pixelen an all Bild fir seng Bewegung relativ zum Referenzbild ze quantifizéieren. D'Donnéeë goufen opgeholl, gefiltert a benotzt fir d'Zykluszäit ze quantifizéieren an d'Gewebestreckung während dem Häerzzyklus ze bewäerten. Déi opgeholl Video gouf mat engem Nullphasen-Digitalfilter vun der éischter Uerdnung noveraarbecht. Fir d'Gewebestreckung (Peak-to-Peak) ze quantifizéieren, gouf eng Peak-to-Peak-Analyse duerchgefouert, fir tëscht Peaks an Dalles am opgehollene Signal z'ënnerscheeden. Zousätzlech gëtt en Detrending mat engem Polynom vun der 6. Uerdnung duerchgefouert, fir d'Signaldrift ze eliminéieren. De Programmcode gouf am MATLAB entwéckelt, fir déi global Gewebsbewegung, d'Zykluszäit, d'Relaxatiounszäit an d'Kontraktiounszäit ze bestëmmen (Supplementary Program Code 44).
Fir d'Deformatiounsanalyse hu mir mat deene selwechte Videoen, déi fir d'Bewäertung vun der mechanescher Dehnung erstallt goufen, fir d'éischt zwou Biller gezeechent, déi Bewegungspeaken (déi héchst (iewescht) an déi niddregst (ënnescht) Bewegungspunkten) no der MUSCLEMOTION Software duerstellen. Duerno hu mir d'Geweberegiounen segmentéiert an eng Form vu Schattéierungsalgorithmus op dat segmentéiert Gewief ugewannt (Ergänzungsfigur 2a). Dat segmentéiert Gewief gouf dann an zéng Ënnerflächen opgedeelt, an d'Spannung op all Uewerfläch gouf mat der folgender Equatioun berechent: Deformatioun = (Sup-Sdown)/Sdown, wou Sup an Sdown d'Distanze vun der Form vun den ieweschten respektiv den ënneschte Schied vum Stoff sinn (Ergänzungsfigur .2b).
Häerzschnëtter goufen 48 Stonnen a 4% Paraformaldehyd fixéiert. Fixéiert Gewëss goufen 1 Stonn a 10% an 20% Saccharose dehydréiert an duerno iwwer Nuecht a 30% Saccharose. D'Schnëtter goufen dann an eng Verbindung mat optimaler Schnëtttemperatur (OCT-Verbindung) agebett a lues a lues an engem Isopentan/Dréchenäisbad agefruer. OCT-Abetterblöcke ginn bei -80 °C bis zur Trennung gelagert. D'Präparater goufen als Schnëtter mat enger Déckt vun 8 μm virbereet.
Fir OCT aus Häerzschnëtter ze entfernen, erhëtzt d'Präparater 5 Minutten op engem Heizblock bei 95 °C. Füügt 1 ml PBS op all Präparat bäi a loosst et 30 Minutten bei Raumtemperatur inkubéieren, dann permeéiert d'Schnëtter andeems Dir 0,1% Triton-X 15 Minutten bei Raumtemperatur a PBS setzt. Fir ze verhënneren datt net spezifesch Antikörper un d'Prouf binden, füügt 1 ml vun enger 3% BSA-Léisung op d'Präparater bäi a loosst et 1 Stonn bei Raumtemperatur inkubéieren. D'BSA gouf dann erausgeholl an d'Präparater goufe mat PBS gewäsch. Markéiert all Prouf mat engem Bläistëft. Primär Antikörper (verdënnt 1:200 an 1% BSA) (Connexin 43 (Abcam; #AB11370), NFATC4 (Abcam; #AB99431) an Troponin-T (Thermo Scientific; #MA5-12960) goufen iwwer 90 Minutten bäigefüügt, duerno sekundär Antikörper (verdënnt 1:200 an 1% BSA) géint Maus Alexa Fluor 488 (Thermo Scientific; #A16079), géint Kanéngchen Alexa Fluor 594 (Thermo Scientific; #T6391) fir weider 90 Minutten. 3-mol mat PBS gewäsch. Fir d'Zilfärbung vum Hannergrond z'ënnerscheeden, hu mir nëmmen den sekundären Antikörper als Kontroll benotzt. Schlussendlech gouf DAPI-Nuklearfärbung bäigefüügt an d'Präparater goufen an e Vectashield (Vector Laboratories) geluecht a mat Nagellack versiegelt. (-x Vergréisserung) an e Keyence-Mikroskop mat 40-fach Vergréisserung.
WGA-Alexa Fluor 555 (Thermo Scientific; #W32464) mat 5 μg/ml a PBS gouf fir d'WGA-Färbung benotzt an 30 Minutte bei Raumtemperatur op fixéiert Sektiounen applizéiert. D'Präparater goufen duerno mat PBS gewäsch an Sudan-Schwaarz gouf op all Präparat bäigefüügt an 30 Minutte laang inkubéiert. D'Präparater goufen duerno mat PBS gewäsch an de Vectashield-Abbettmedium gouf bäigefüügt. D'Präparater goufen op engem Keyence-Mikroskop mat 40-facher Vergréisserung visualiséiert.
OCT gouf wéi uewe beschriwwen aus de Prouwe ewechgeholl. Nodeems den OCT ewechgeholl gouf, goufen d'Glieser iwwer Nuecht an d'Bouin-Léisung getippt. D'Glieser goufen dann 1 Stonn mat destilléiertem Waasser gespullt an duerno 10 Minutten an eng Bibrich-Aloe-Säure-Fuchsin-Léisung geluecht. Duerno goufen d'Glieser mat destilléiertem Waasser gewäsch an 10 Minutten an eng Léisung vu 5% Phosphomolybdän/5% Phosphowolframsäure geluecht. Ouni ze spullen, goufen d'Glieser direkt fir 15 Minutten an d'Anilinblo-Léisung transferéiert. Duerno goufen d'Glieser mat destilléiertem Waasser gewäsch an 2 Minutten an eng 1% Essigsäure-Léisung geluecht. D'Glieser goufen an 200 N Ethanol gedréchent an op Xylol transferéiert. Gefierft Glieser goufen mat engem Keyence-Mikroskop mat engem 10x Objektiv visualiséiert. De Prozentsaz vun der Fibrosefläch gouf mat der Keyence Analyzer-Software quantifizéiert.
CyQUANT™ MTT Zellviabilitéitsassay (Invitrogen, Carlsbad, CA), Katalognummer V13154, laut dem Protokoll vum Hiersteller mat e puer Modifikatiounen. Besonnesch gouf e chirurgesche Stanz mat engem Duerchmiesser vu 6 mm benotzt fir eng eenheetlech Gewiefsgréisst während der MTT-Analyse ze garantéieren. Gewief goufen eenzel an d'Lächer vun enger 12-Lächer-Plack mat MTT-Substrat ausgeplatt, laut dem Protokoll vum Hiersteller. D'Schnëtter ginn 3 Stonnen bei 37°C inkubéiert an dat liewegt Gewief metaboliséiert den MTT-Substrat fir eng violett Formazanverbindung ze bilden. Ersetzt d'MTT-Léisung duerch 1 ml DMSO an inkubéiert 15 Minutten bei 37°C fir violett Formazan aus Häerzsektiounen ze extrahéieren. D'Prouwen goufen 1:10 an DMSO a 96-Lächer-Platten mat klorem Buedem verdënnt an d'violette Faarfintensitéit gouf bei 570 nm mat engem Cytation-Plattelieser (BioTek) gemooss. D'Miessunge goufen op d'Gewiicht vun all Häerzscheif normaliséiert.
Häerzscheiwenmedium gouf duerch Medium ersat, dat 1 μCi/ml [5-3H]-Glukos (Moravek Biochemicals, Brea, CA, USA) enthält, fir de Glukosverbrauchsassay wéi virdru beschriwwen. No 4 Stonnen Inkubatioun ginn 100 µl Medium an en oppent Mikrozentrifugenröhrchen mat 100 µl 0,2 N HCl bäigefüügt. Duerno gouf d'Röhrchen an en Szintillatiounsröhrchen mat 500 μl dH2O geluecht, fir [3H]2O fir 72 Stonnen bei 37°C ze verdampfen. Dann gëtt d'Mikrozentrifugenröhrchen aus dem Szintillatiounsröhrchen erausgeholl an 10 ml Szintillatiounsflëssegkeet bäigefüügt. D'Szintillatiounszielungen goufen mat engem Tri-Carb 2900TR Flëssegkeetsszintillatiounsanalysator (Packard Bioscience Company, Meriden, CT, USA) duerchgefouert. D'Glukosverbrauch gouf dann berechent andeems d'[5-3H]-Glukos-spezifesch Aktivitéit, den onkomplette Gläichgewiicht an den Hannergrond, d'Verdënnung vun [5-3H]- op onmarkéiert Glukos an d'Effizienz vum Szintillatiounszieler berécksiichtegt goufen. D'Donnéeë sinn op d'Mass vun den Häerzsektiounen normaliséiert.
Nom Homogeniséierung vun der Tissu an Trizol gouf d'RNA aus Häerzschnëtter mat dem Qiagen miRNeasy Micro Kit #210874 no dem Protokoll vum Hiersteller isoléiert. D'Virbereedung, d'Sequenzéierung an d'Datenanalyse vun der RNAsec-Bibliothéik goufen wéi follegt duerchgefouert:
1 μg RNA pro Prouf gouf als Ausgangsmaterial fir d'Virbereedung vun der RNA-Bibliothéik benotzt. Sequenzéierungsbibliothéike goufe mat dem NEBNext UltraTM RNA Library Preparation Kit fir Illumina (NEB, USA) generéiert, no den Empfehlungen vum Hiersteller, an Indexcoden goufen zu den Attributsequenze fir all Prouf bäigefüügt. Kuerz gesot, mRNA gouf aus der gesamter RNA gereinegt mat Magnéitperlen, déi mat Poly-T-Oligonukleotiden befestegt waren. D'Fragmentéierung gëtt mat divalente Kationen bei héijer Temperatur am NEBNext First Strand Synthesis Reaction Buffer (5X) duerchgefouert. Éischtstrang cDNA gouf mat zoufällegen Hexamerprimer an M-MuLV Reverse Transkriptase (RNase H-) synthetiséiert. Déi zweetstrang cDNA gëtt dann mat DNA Polymerase I an RNase H synthetiséiert. Déi verbleiwen Iwwerhäng ginn duerch Exonuklease/Polymerase-Aktivitéit a stumpf Enden ëmgewandelt. No der Adenyléierung vum 3'-Enn vum DNA-Fragment gëtt en NEBNext Adapter mat enger Hoernaal-Loop-Struktur befestegt, fir en op d'Hybridiséierung virzebereeden. Fir d'Auswiel vun cDNA-Fragmenter mat enger bevorzugter Längt vun 150-200 bp. Bibliothéiksfragmenter goufen mam AMPure XP System (Beckman Coulter, Beverly, USA) gereinegt. Duerno gouf 3 μl USER Enzyme (NEB, USA) mat Gréisst-selektéierter cDNA, déi mat engem Adapter ligéiert war, fir 15 Minutten bei 37°C an duerno fir 5 Minutten bei 95°C virun der PCR benotzt. D'PCR gouf dann mat Phusion High-Fidelity DNA Polymerase, universelle PCR Primeren an Index (X) Primeren duerchgefouert. Schlussendlech goufen d'PCR Produkter gereinegt (AMPure XP System) an d'Bibliothéiksqualitéit op engem Agilent Bioanalyzer 2100 System bewäert. D'cDNA Bibliothéik gouf dann mat engem Novaseq Sequencer sequenzéiert. Réi Bilddateien vun Illumina goufen a Réi Liesungen mat CASAVA Base Calling ëmgewandelt. Réi Daten ginn a FASTQ(fq) Format Dateien gespäichert, déi Liessequenzen an entspriechend Basisqualitéiten enthalen. Wielt HISAT2 fir gefiltert Sequenzéierungsliesungen mam Sscrofa11.1 Referenzgenom ofzestëmmen. Am Allgemengen ënnerstëtzt HISAT2 Genomer vun all Gréisst, dorënner Genomer méi grouss wéi 4 Milliarde Basen, an et gi Standardwäerter fir déi meescht Parameter festgeluecht. Splicing-Liesungen aus RNA-Seq-Daten kënnen effizient mat HISAT2, dem schnellsten System deen de Moment verfügbar ass, mat der selwechter oder besserer Genauegkeet wéi all aner Method ausgeriicht ginn.
D'Heefegkeet vun den Transkripten reflektéiert direkt den Niveau vun der Genexpression. D'Genexpressionsniveauen ginn duerch d'Heefegkeet vun den Transkripten (Sequenzéierungszuel) bewäert, déi mam Genom oder den Exonen assoziéiert sinn. D'Zuel vun de Liesungen ass proportional zu den Genexpressionsniveauen, der Genlängt an der Sequenzéierungsdéift. FPKM (Fragmenter pro dausend Basenpaar vum sequenzéierten Transkript pro Millioun Basenpaar) goufen berechent an d'P-Wäerter vun der differentieller Expression goufen mat dem DESeq2-Package bestëmmt. Mir hunn dann d'Falsch-Entdeckungsquote (FDR) fir all P-Wäert mat der Benjamini-Hochberg-Method9 baséiert op der agebauter R-Funktioun "p.adjust" berechent.
RNA, déi aus Häerzschnëtter isoléiert gouf, gouf mat enger Konzentratioun vun 200 ng/μl mat dem SuperScript IV Vilo Master Mix vun Thermo (Thermo, Kat. Nr. 11756050) an cDNA ëmgewandelt. Quantitativ RT-PCR gouf mat enger Applied Biosystems Endura Plate Microamp 384-Well transparenter Reaktiounsplack (Thermo, Kat. Nr. 4483319) an engem Microamp opteschen Adhibtiv (Thermo, Kat. Nr. 4311971) duerchgefouert. D'Reaktiounsmëschung bestoung aus 5 µl Taqman Fast Advanced Master Mix (Thermo, Kat. Nr. 4444557), 0,5 µl Taqman Primer an 3,5 µl H2O pro Well gemëscht. Standard qPCR-Zyklen goufen duerchgefouert an d'CT-Wäerter goufen mat engem Applied Biosystems Quantstudio 5 Echtzäit-PCR-Instrument (384-Well-Modul; Produkt Nr. A28135) gemooss. Taqman-Primer goufe vun Thermo kaaft (GAPDH (Ss03375629_u1), PARP12 (Ss06908795_m1), PKDCC (Ss06903874_m1), CYGB (Ss06900188_m1), RGL1 (Ss06868890_m1), ACTN1 (Ss01009508_mH), GATA4 (Ss03383805_u1), GJA1 (Ss03374839_u1), COL1A2 (Ss03375009_u1), COL3A1 (Ss04323794_m1), ACTA2 (Ss04245588_m1). D'CT-Wäerter vun alle Prouwe goufen op den Housekeeping-Gen GAPDH normaliséiert.
D'Medienfräisetzung vun NT-ProBNP gouf mat dem NT-ProBNP Kit (Schwäin) (Kat. Nr. MBS2086979, MyBioSource) geméiss dem Protokoll vum Hiersteller bewäert. Kuerz gesot, goufen 250 µl vun all Prouf a Standard am Duplikat an all Lach bäigefüügt. Direkt nom Bäisetzen vun der Prouf goufen 50 µl Assayreagens A an all Lach bäigefüügt. D'Plack virsiichteg schëdden a mat Dichtstoff zoumaachen. Duerno goufen d'Tabletten 1 Stonn bei 37°C inkubéiert. Dann d'Léisung ofsaugt an d'Lach 4-mol mat 350 µl 1X Wäschléisung gewäscht, andeems d'Wäschléisung all Kéier 1-2 Minutten inkubéiert gouf. Dann 100 µl Assayreagens B pro Lach bäigefüügt a mat Plackendichtstoff zougemaach. D'Tablett gouf virsiichteg geschëddelt an 30 Minutten bei 37°C inkubéiert. D'Léisung ofsaugt a d'Lach 5-mol mat 350 µl 1X Wäschléisung gewäscht. Gitt 90 µl Substratléisung an all Lach a versiegelt d'Plack. Inkubéiert d'Plack bei 37°C fir 10-20 Minutten. Gitt 50 µl Stopléisung an all Lach. D'Plack gouf direkt mat engem Cytation (BioTek) Plackelieser gemooss, deen op 450 nm agestallt war.
Et goufen Poweranalysen duerchgefouert fir déi Gruppgréissten ze wielen, déi eng Power vun >80% liwweren, fir eng absolut Ännerung vum Parameter vun 10% mat enger Typ I Feelerquote vun 5% ze detektéieren. Poweranalysen goufen duerchgefouert fir déi Gruppgréissten ze wielen, déi eng Power vun >80% liwweren, fir eng absolut Ännerung vum Parameter vun 10% mat enger Typ I Feelerquote vun 5% ze detektéieren. Анализ мощности был выполнен для выбора размеров групп, которые обеспечат > 80% мощности fir обаружения 10% параметра с 5% частотой ошибок типа I. Eng Poweranalyse gouf duerchgefouert fir Gruppegréissten ze wielen, déi >80% Power ubidden, fir eng absolut Parameterännerung vun 10% mat enger Typ I Feelerquote vun 5% ze detektéieren.进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％I型错误率的组大小。进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％I型错误率的组大小。 Был проведен анализ мощности fir выбора размера группы, который обеспечил zu > 80% мощности fir обнаружения изменения параметров и 5% частоты ошибок типа I. Eng Poweranalyse gouf duerchgefouert fir eng Gruppgréisst ze wielen, déi >80% Power géif liwweren, fir eng absolut Parameterännerung vun 10% an eng Typ I Feelerquote vun 5% ze detektéieren.Gewebeschnëtter goufen virum Experiment zoufälleg ausgewielt. All Analysen goufen konditionsblind ausgewielt an d'Prouwe goufen eréischt decodéiert nodeems all Donnéeën analyséiert waren. D'GraphPad Prism Software (San Diego, CA) gouf benotzt fir all statistesch Analysen duerchzeféieren. Fir all Statistiken goufen p-Wäerter als signifikant bei Wäerter < 0,05 ugesinn. Fir all Statistike goufen p-Wäerter als signifikant bei Wäerter < 0,05 ugesinn. Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. Fir all Statistike goufen p-Wäerter als signifikant bei Wäerter < 0,05 ugesinn.对于所有统计数据，p 值在值<0.05 时被认为是显着的。对于所有统计数据，p 值在值<0.05 时被认为是显着的。 Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. Fir all Statistike goufen p-Wäerter als signifikant bei Wäerter < 0,05 ugesinn.En zweesäitege Student's t-Test gouf op den Donnéeën mat nëmmen 2 Vergläicher duerchgefouert. Eng een- oder zwee-Weeër ANOVA gouf benotzt fir d'Signifikanz tëscht verschiddene Gruppen ze bestëmmen. Bei der Duerchféierung vu Post-hoc-Tester gouf d'Tukey-Korrektur ugewannt fir verschidde Vergläicher ze berücksichtegen. RNAsec-Donnéeë hunn speziell statistesch Iwwerleeungen bei der Berechnung vun FDR a p.adjust, wéi an der Methodesektioun beschriwwen.
Fir méi Informatiounen iwwer den Design vun der Studie, kuckt den Zesummefassung vum Nature Research Report, deen op dësen Artikel verlinkt ass.