Dėkojame, kad apsilankėte Nature.com. Jūsų naudojama naršyklės versija turi ribotą CSS palaikymą. Kad galėtumėte naudotis visomis įmanomomis funkcijomis, rekomenduojame naudoti atnaujintą naršyklę (arba išjungti suderinamumo režimą „Internet Explorer“). Tuo tarpu, siekdami užtikrinti nuolatinį palaikymą, svetainę pateiksime be stilių ir „JavaScript“.
Reikia patikimos in vitro sistemos, kuri galėtų tiksliai atkurti širdies fiziologinę aplinką vaistų testavimui. Ribotas žmogaus širdies audinių kultūrų sistemų prieinamumas lėmė netikslias širdies vaistų poveikio interpretacijas. Čia sukūrėme širdies audinių kultūros modelį (CTCM), kuris elektromechaniškai stimuliuoja širdies pjūvius ir fiziologiškai tempiasi širdies ciklo sistolinės ir diastolinės fazių metu. Po 12 dienų kultivavimo šis metodas iš dalies pagerino širdies pjūvių gyvybingumą, tačiau nevisiškai išsaugojo jų struktūrinį vientisumą. Todėl, atlikus mažų molekulių atranką, nustatėme, kad į mūsų terpę įdėjus 100 nM trijodtironino (T3) ir 1 μM deksametazono (Dex), pjūvių mikrostruktūra išliko 12 dienų. Kartu su T3/Dex gydymu CTCM sistema 12 dienų išlaikė transkripcijos profilius, gyvybingumą, metabolinį aktyvumą ir struktūrinį vientisumą tokiame pačiame lygyje kaip ir šviežio širdies audinio. Be to, per didelis širdies audinio tempimas kultūroje sukelia hipertrofinę širdies signalizaciją, o tai rodo CTCM gebėjimą imituoti širdies tempimo sukeltas hipertrofines būkles. Apibendrinant galima teigti, kad CTCM gali modeliuoti širdies fiziologiją ir patofiziologiją kultūroje per ilgą laiką, sudarydamas sąlygas patikimai patikrinti vaistus.
Prieš pradedant klinikinius tyrimus, reikalingos patikimos in vitro sistemos, galinčios tiksliai atkurti žmogaus širdies fiziologinę aplinką. Tokios sistemos turėtų imituoti pakitusį mechaninį tempimą, širdies ritmą ir elektrofiziologines savybes. Gyvūnų modeliai dažniausiai naudojami kaip širdies fiziologijos atrankos platforma, tačiau jų patikimumas atspindi vaistų poveikį žmogaus širdžiai yra ribotas1,2. Galiausiai, idealus širdies audinių kultūros eksperimentinis modelis (CTCM) yra labai jautrus ir specifinis modelis įvairioms terapinėms ir farmakologinėms intervencijoms, tiksliai atkuriantis žmogaus širdies fiziologiją ir patofiziologiją3. Tokios sistemos nebuvimas riboja naujų širdies nepakankamumo gydymo būdų atradimą4,5 ir lėmė, kad vaistų kardiotoksiškumas yra pagrindinė pasitraukimo iš rinkos priežastis6.
Per pastarąjį dešimtmetį aštuoni ne širdies ir kraujagyslių sistemos vaistai buvo pašalinti iš klinikinio vartojimo, nes jie pailgina QT intervalą, o tai sukelia skilvelių aritmijas ir staigią mirtį7. Todėl vis labiau reikia patikimų ikiklinikinių atrankos strategijų, skirtų širdies ir kraujagyslių sistemos veiksmingumui ir toksiškumui įvertinti. Neseniai pradėtas vaistų atrankos ir toksiškumo tyrimuose naudoti iš žmogaus sukeltų pluripotentinių kamieninių ląstelių gautas kardiomiocitas (hiPS-CM) iš dalies išsprendžia šią problemą. Tačiau nesubrendęs hiPS-CM pobūdis ir daugialąsčio širdies audinio sudėtingumo stoka yra pagrindiniai šio metodo apribojimai. Naujausi tyrimai parodė, kad šį apribojimą galima iš dalies įveikti naudojant ankstyvąją hiPS-CM širdies audinių hidrogeliams formuoti netrukus po savaiminių susitraukimų pradžios ir palaipsniui didinant elektrinę stimuliaciją laikui bėgant. Tačiau šiems hiPS-CM mikroaudiniams trūksta brandžių elektrofiziologinių ir susitraukimo savybių, būdingų suaugusiojo miokardui. Be to, žmogaus širdies audinys turi sudėtingesnę struktūrą, susidedančią iš heterogeninio skirtingų ląstelių tipų mišinio, įskaitant endotelio ląsteles, neuronus ir stromos fibroblastus, sujungtus specifiniais tarpląstelinių matricos baltymų rinkiniais. Šis nekardiomiocitų populiacijų heterogeniškumas11,12,13 suaugusio žinduolio širdyje yra pagrindinė kliūtis modeliuoti širdies audinį naudojant individualius ląstelių tipus. Šie pagrindiniai apribojimai pabrėžia, kaip svarbu kurti metodus, skirtus sveiko miokardo audinio kultivavimui fiziologinėmis ir patologinėmis sąlygomis.
Kultūriniai ploni (300 µm) žmogaus širdies pjūviai pasirodė esą perspektyvus sveiko žmogaus miokardo modelis. Šis metodas suteikia prieigą prie pilnos 3D daugialąstės sistemos, panašios į žmogaus širdies audinį. Tačiau iki 2019 m. kultivuotų širdies pjūvių naudojimą ribojo trumpas (24 val.) kultūros išgyvenamumas. Taip yra dėl daugelio veiksnių, įskaitant fizinio-mechaninio tempimo trūkumą, oro ir skysčio sąsają bei paprastų terpių, kurios neatitinka širdies audinio poreikių, naudojimą. 2019 m. kelios tyrimų grupės įrodė, kad mechaninių veiksnių įtraukimas į širdies audinių kultūros sistemas gali pailginti kultūros gyvavimo laiką, pagerinti širdies raišką ir imituoti širdies patologiją. Du elegantiški tyrimai17 ir18 rodo, kad vienaašis mechaninis krūvis teigiamai veikia širdies fenotipą kultūros metu. Tačiau šiuose tyrimuose nebuvo naudojamas dinaminis trimatis fizikinis-mechaninis širdies ciklo krūvis, nes širdies pjūviai buvo apkraunami arba izometrinėmis tempimo jėgomis17, arba linijiniu auksotoniniu krūviu18. Šie audinių tempimo metodai lėmė daugelio širdies genų slopinimą arba genų, susijusių su nenormaliais tempimo atsakais, pernelyg didelę raišką. Pažymėtina, kad Pitoulis ir kt.19 sukūrė dinaminę širdies pjūvio kultūros vonią širdies ciklo rekonstrukcijai, naudodami jėgos keitiklio grįžtamąjį ryšį ir įtampos pavaras. Nors ši sistema leidžia tiksliau modeliuoti širdies ciklą in vitro, metodo sudėtingumas ir mažas našumas riboja jos taikymą. Mūsų laboratorija neseniai sukūrė supaprastintą kultūros sistemą, kurioje naudojama elektrinė stimuliacija ir optimizuota terpė, skirta kiaulių ir žmogaus širdies audinių pjūvių gyvybingumui palaikyti iki 6 dienų20,21.
Šiame rankraštyje aprašome širdies audinių kultūros modelį (CTCM), kuriame naudojami kiaulės širdies pjūviai, įtraukiant humoralinius signalus, siekiant pakartoti trimatę širdies fiziologiją ir patofiziologinį išsiplėtimą širdies ciklo metu. Šis CTCM gali padidinti ikiklinikinių vaistų prognozavimo tikslumą iki niekada anksčiau nepasiekto lygio, suteikiant ekonomišką, vidutinio našumo širdies sistemą, kuri imituoja žinduolių širdies fiziologiją / patofiziologiją ikiklinikiniams vaistų tyrimams.
Hemodinaminiai mechaniniai signalai vaidina labai svarbų vaidmenį palaikant kardiomiocitų funkciją in vitro [22,23,24]. Šiame rankraštyje sukūrėme CTCM (1a pav.), kuri gali imituoti suaugusiojo širdies aplinką, sukeldama tiek elektrinę, tiek mechaninę stimuliaciją fiziologiniais dažniais (1,2 Hz, 72 dūžiai per minutę). Siekiant išvengti per didelio audinių tempimo diastolės metu, buvo naudojamas 3D spausdinimo įrenginys, kuris padidino audinio dydį 25 % (1b pav.). C-PACE sistemos sukelta elektrinė stimuliacija buvo pradėta 100 ms prieš sistolę, naudojant duomenų rinkimo sistemą, kad būtų visiškai atkurtas širdies ciklas. Audinių kultūros sistema naudoja programuojamą pneumatinę pavarą („LB Engineering“, Vokietija), kuri cikliškai išplečia lanksčią silikoninę membraną, kad išsiplėstų širdies pjūviai viršutinėje kameroje. Sistema buvo prijungta prie išorinės oro linijos per slėgio keitiklį, kuris leido tiksliai reguliuoti slėgį (± 1 mmHg) ir laiką (± 1 ms) (1c pav.).
a Pritvirtinkite audinio pjūvį prie 7 mm atraminio žiedo, pavaizduoto mėlyna spalva, prietaiso kultūros kameros viduje. Kultūros kamera nuo oro kameros yra atskirta plona lanksčia silikonine membrana. Tarp kiekvienos kameros įdėkite tarpinę, kad išvengtumėte nuotėkių. Prietaiso dangtelyje yra grafito elektrodai, kurie atlieka elektrinę stimuliaciją. b Didelio audinių prietaiso, kreipiamojo žiedo ir atraminio žiedo schema. Audinių pjūviai (rudi) dedami ant didelio prietaiso, o kreipiamasis žiedas įdedamas į griovelį prietaiso išoriniame krašte. Naudodami kreipiklį, atsargiai uždėkite audinių akriliniais klijais padengtą atraminį žiedą ant širdies audinio pjūvio. c Grafikas, kuriame parodytas elektrinės stimuliacijos laikas kaip oro kameros slėgio, valdomo programuojamo pneumatinio pavaros (PPD), funkcija. Duomenų rinkimo įrenginys buvo naudojamas elektrinei stimuliacijai sinchronizuoti naudojant slėgio jutiklius. Kai slėgis kultūros kameroje pasiekia nustatytą ribą, į C-PACE-EM siunčiamas impulsinis signalas, kad būtų suaktyvinta elektrinė stimuliacija. d Keturių CTCM, padėtų ant inkubatoriaus lentynos, vaizdas. Keturi prietaisai prijungti prie vieno PPD per pneumatinę grandinę, o slėgio jutikliai įstatyti į hemostazinį vožtuvą, kad būtų galima stebėti slėgį pneumatinėje grandinėje. Kiekviename įrenginyje yra šeši audinių pjūviai.
Naudodami vieną pneumatinę pavarą, galėjome valdyti 4 CTCM įrenginius, kurių kiekvienas galėjo laikyti 6 audinių pjūvius (1d pav.). CTCM sistemoje oro slėgis oro kameroje paverčiamas sinchroniniu slėgiu skysčio kameroje ir sukelia fiziologinį širdies pjūvio išsiplėtimą (2a pav. ir 1 papildomas filmas). Audinių tempimo įvertinimas esant 80 mm Hg slėgiui. Art. parodė audinių pjūvių ištempimą 25 % (2b pav.). Nustatyta, kad šis procentinis tempimas atitinka fiziologinį 2,2–2,3 µm sarkomeros ilgį, esant normaliam širdies pjūvio susitraukimui17,19,25. Audinių judėjimas buvo įvertintas naudojant individualius kameros nustatymus (1 papildomas paveikslas). Audinių judėjimo amplitudė ir greitis (2c, d pav.) atitiko tempimą širdies ciklo metu ir laiką sistolės bei diastolės metu (2b pav.). Širdies audinio tempimas ir greitis susitraukimo ir relaksacijos metu išliko pastovūs 12 dienų kultūroje (2f pav.). Norėdami įvertinti elektrinės stimuliacijos poveikį susitraukimui kultivavimo metu, sukūrėme aktyvios deformacijos nustatymo metodą, naudodami šešėliavimo algoritmą (papildomas 2a, b pav.), ir galėjome atskirti deformacijas su elektrine stimuliacija ir be jos. Tas pats širdies pjūvis (2f pav.). Judančioje pjūvio srityje (R6-9) įtampa elektrinės stimuliacijos metu buvo 20 % didesnė nei nesant elektrinės stimuliacijos, o tai rodo elektrinės stimuliacijos indėlį į susitraukimo funkciją.
Reprezentatyvūs oro kameros slėgio, skysčio kameros slėgio ir audinių judėjimo matavimų kreivės patvirtina, kad kameros slėgis keičia skysčio kameros slėgį, sukeldamas atitinkamą audinio pjūvio judėjimą. b Reprezentatyvūs audinių pjūvių procentinio ištempimo (mėlyna) kreivės, atitinkančios procentinį ištempimą (oranžinė). c Išmatuotas širdies pjūvio judėjimas atitinka išmatuotą judėjimo greitį. (d) Reprezentatyvios ciklinio judėjimo (mėlyna linija) ir greičio (oranžinė punktyrinė linija) trajektorijos širdies pjūvyje. e Ciklo laiko (n = 19 pjūvių vienoje grupėje, iš skirtingų kiaulių), susitraukimo laiko (n = 19 pjūvių vienoje grupėje), relaksacijos laiko (n = 19 pjūvių vienoje grupėje, iš skirtingų kiaulių), audinių judėjimo (n = 25). pjūviai) / grupė iš skirtingų kiaulių), didžiausio sistolinio greičio (n = 24 (D0), 25 (D12) pjūviai / grupė iš skirtingų kiaulių) ir didžiausio relaksacijos greičio (n = 24 (D0), 25 (D12) pjūviai / grupė iš skirtingų kiaulių) kiekybinis įvertinimas. Dvipusis Student'o t-testas neparodė reikšmingo skirtumo jokiame parametre. f Reprezentatyvūs audinių pjūvių su (raudona) ir be (mėlyna) elektrinės stimuliacijos deformacijos analizės kreivės, dešimt to paties pjūvio audinių pjūvių regioninių sričių. Apatiniuose skyduose parodytas audinių pjūvių su elektrine stimuliacija ir be jos deformacijos procentinio skirtumo kiekybinis įvertinimas dešimtyje skirtingų pjūvių sričių. (n = 8 griežinėliai/grupė iš skirtingų kiaulių, atliekamas dvipusis Student t testas; ****p < 0,0001, **p < 0,01, *p < 0,05). (n = 8 griežinėliai/grupė iš skirtingų kiaulių, atliekamas dvipusis Student t testas; ****p < 0,0001, **p < 0,01, *p < 0,05). (n = 8 срезов/группу от разных свиней, проводится двусторонний t-критерий Стьюдента; ****p<0,0001, **p<0,01,5). (n = 8 pjūviai/grupė iš skirtingų kiaulių, dvipusis Stjudento t-testas; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05). （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p < 0,0001，**p < 0,01，*p < 0,01，*p （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p < 0,0001，**p < 0,01，*p < 0,01，*p (n = 8 срезов/группу, от разных свиней, двусторонний критерий Стьюдента; ****p <0,0001, **p <0,01, *p <0,05). (n = 8 pjūviai/grupė, iš skirtingų kiaulių, dvipusis Stjudento t testas; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05).Klaidų juostos rodo vidurkį ± standartinį nuokrypį.
Ankstesnėje statinėje biomimetinėje širdies pjūvių kultivavimo sistemoje [20, 21] 6 dienas išlaikėme širdies pjūvių gyvybingumą, funkciją ir struktūrinį vientisumą, taikydami elektrinę stimuliaciją ir optimizuodami terpės sudėtį. Tačiau po 10 dienų šie skaičiai smarkiai sumažėjo. Remsimės pjūviais, kultivuotais ankstesnėje statinėje biomimetinėje kultivavimo sistemoje 20, 21 kontrolinėmis sąlygomis (kontrolė), ir naudosime anksčiau optimizuotą terpę kaip MC sąlygas ir kultivavimą vienu metu taikant mechaninę ir elektrinę stimuliaciją (CTCM). vadinama . Pirmiausia nustatėme, kad mechaninė stimuliacija be elektrinės stimuliacijos buvo nepakankama audinių gyvybingumui palaikyti 6 dienas (papildomas 3a, b pav.). Įdomu tai, kad įdiegus fiziomechaninę ir elektrinę stimuliaciją naudojant STCM, 12 dienų širdies pjūvių gyvybingumas išliko toks pat kaip ir šviežių širdies pjūvių MS sąlygomis, bet ne Ctrl sąlygomis, kaip parodė MTT analizė (1 pav.). Tai rodo, kad mechaninė stimuliacija ir širdies ciklo modeliavimas gali išlaikyti audinių pjūvius gyvybingus dvigubai ilgiau, nei buvo pranešta ankstesnėje mūsų statinėje kultivavimo sistemoje. Vis dėlto, įvertinus audinių pjūvių struktūrinį vientisumą imunologiniu širdies troponino T ir koneksino 43 žymėjimu, paaiškėjo, kad konneksino 43 raiška MC audiniuose 12 dieną buvo žymiai didesnė nei kontrolinėse grupėse tą pačią dieną. Tačiau vienoda konneksino 43 raiška ir Z disko formavimasis nebuvo visiškai išlaikyti (3b pav.). Audinių struktūriniam vientisumui kiekybiškai įvertinti naudojame dirbtinio intelekto (DI) sistemą26, o širdies pjūvių struktūriniam vientisumui ir fluorescencijai pagal lokalizacijos stiprumą automatiškai kiekybiškai įvertinti naudojame vaizduojamą gilaus mokymosi kanalą, pagrįstą troponinu T ir koneksino dažymu43. Šis metodas naudoja konvoliucinį neuroninį tinklą (CNN) ir gilaus mokymosi sistemą, kad būtų galima patikimai kiekybiškai įvertinti širdies audinio struktūrinį vientisumą automatizuotu ir nešališku būdu, kaip aprašyta nuorodoje26. MC audinys, palyginti su statiniais kontroliniais pjūviais, parodė geresnį struktūrinį panašumą su 0 diena. Be to, Massono trichromo dažymas atskleidė žymiai mažesnį fibrozės procentą MS sąlygomis, palyginti su kontrolinėmis sąlygomis 12 kultūros dieną (3c pav.). Nors CTCM padidino širdies audinių pjūvių gyvybingumą 12 dieną iki panašaus lygio, kaip ir šviežio širdies audinio, jis reikšmingai nepagerino širdies pjūvių struktūrinio vientisumo.
Juostinė diagrama rodo šviežių širdies griežinėlių (D0) arba širdies griežinėlių kultūros MTT gyvybingumo kiekybinį įvertinimą 12 dienų statinėje kultūroje (D12 Ctrl) arba CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) griežinėlių/grupė iš skirtingų kiaulių, atliekamas vienfaktorinis ANOVA testas; ####p < 0,0001, palyginti su D0, ir **p < 0,01, palyginti su D12 Ctrl). Juostinė diagrama rodo šviežių širdies griežinėlių (D0) arba širdies griežinėlių kultūros MTT gyvybingumo kiekybinį įvertinimą 12 dienų statinėje kultūroje (D12 Ctrl) arba CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) griežinėlių/grupė iš skirtingų kiaulių, atliekamas vienfaktorinis ANOVA testas; ####p < 0,0001, palyginti su D0, ir **p < 0,01, palyginti su D12 Ctrl).Histogramoje parodytas šviežių MTT širdies pjūvių (D0) arba širdies pjūvių kultūros 12 dienų trukmės kiekybinis įvertinimas statinėje kultūroje (D12 kontrolė) arba CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 kontrolė). ) , 12 (D12 MC) pjūvių/grupės iš skirtingų kiaulių, atliekamas vienfaktorinis ANOVA testas;####p < 0,0001 по сравнению с D0 ir **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p < 0,0001, palyginti su D0 ir **p < 0,01, palyginti su D12 (kontrolinė linija). a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切片(D0)或心脏切片培养12 天的 活力的量化)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组， ANO进测试；与D0 相比，####p < 0,0001，与D12 Ctrl 相比，**p < 0,01). a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切片(D0) ，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；与D0 相比，####p < 0,0001D相比，**p.)Histograma, rodanti MTT gyvybingumo kiekybinį įvertinimą šviežiose širdies pjūviuose (D0) arba širdies pjūviuose, kultivuotuose 12 dienų statinėje kultūroje (D12 kontrolė) arba CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 kontrolė)), 12 (D12 MC) pjūvių/grupės iš skirtingų kiaulių, vienfaktorinis ANOVA testas;####p < 0,0001 по сравнению с D0, **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p < 0,0001, palyginti su D0, **p < 0,01, palyginti su D12 (kontrolinė grupė).b Troponinas-T (žalia), koneksinas 43 (raudona) ir DAPI (mėlyna) šviežiai izoliuotuose širdies pjūviuose (D0) arba širdies pjūviuose, kultivuotuose statinėmis sąlygomis (Ctrl) arba CTCM sąlygomis (MC) 12 dienų) reprezentatyviuose imunofluorescenciniuose vaizduose (tuščia skalė = 100 µm). Dirbtinio intelekto pagalba kiekybiškai įvertintas širdies audinio struktūrinis vientisumas (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) griežinėliai/grupė iš kiekvienos skirtingos kiaulės, atliktas vienfaktorinis ANOVA testas; ####p < 0,0001, palyginti su D0, ir ****p < 0,0001, palyginti su D12 Ctrl). Dirbtinio intelekto pagalba kiekybiškai įvertintas širdies audinio struktūrinis vientisumas (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) griežinėliai/grupė iš skirtingų kiaulių, atliktas vienfaktorinis ANOVA testas; ####p < 0,0001, palyginti su D0, ir ****p < 0,0001, palyginti su D12 Ctrl). Количественная оценка структурной целостности сердечной ткани искусственным интеллектом (n = 7 (D0), 7), (D12) D12 срезов/групп от разных свиней, проводится однофакторный тест ANOVA ####p < 0,0001 по сравнению с D0 и ****ю101 D12 Ctrl). Širdies audinio struktūrinio vientisumo kiekybinis įvertinimas dirbtinio intelekto metodu (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) pjūviai/grupės iš skirtingų kiaulių, atliktas vienfaktorinis ANOVA testas; ####p < 0,0001, palyginti su D0 ir ****p < 0,0001, palyginti su D12 Ctrl).人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) griežinėliai/grupė, kiekviena skirtingų kiaulių, vienpusis ANOVA testas <丸与与与䎎 0p1;#.相比，****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）.人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) griežinėliai/grupė kiekviena skirtingų kiaulių, vienpusis ANOVA testas 1#.###0p0;与D0相比，****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）. Искусственный интеллект для количественной оценки структурной целостности сердечной ткани (n = 7 (D0), 7 (D5) (D12) срезов/группу каждой из разных свиней, односторонний тест ANOVA; ####p <0,0001 vs. D0 Для сравнения ****p < 0,02010. Dirbtinis intelektas širdies audinio struktūriniam vientisumui kiekybiškai įvertinti (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) pjūviai/grupė kiekvienos iš skirtingų kiaulių, vienfaktorinis ANOVA testas; ####p<0,0001 vs .D0. Palyginimui ****p < 0,0001, palyginti su D12 Ctrl). c Reprezentatyvūs vaizdai (kairėje) ir kiekybinis įvertinimas (dešinėje), gauti iš širdies pjūvių, nudažytų Massono trichromo dažais (skalės plotis = 500 µm) (n = 10 pjūvių/grupės iš kiekvienos iš skirtingų kiaulių, atliekamas vienfaktorinis ANOVA testas; ####p < 0,0001, palyginti su D0, ir ***p < 0,001, palyginti su D12 Ctrl). c Reprezentatyvūs vaizdai (kairėje) ir kiekybinis įvertinimas (dešinėje), gauti širdies griežinėliams, nudažytiems Massono trichromo dažais (skalės plotis = 500 µm) (n = 10 griežinėlių/grupės iš kiekvienos iš skirtingų kiaulių, atliekamas vienfaktorinis ANOVA testas; #### p < 0,0001, palyginti su D0, ir ***p < 0,001, palyginti su D12 Ctrl). c Репрезентативные изображения (слева) и количественная оценка (справа) срезов сердца, окрашенных трихром (масштаб без покрытия = 500 мкм) (n = 10 срезов/группу от разных свиней, выполняется односторонний тест# p#VA; 0,0001 по сравнению с D0 ir ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Širdies pjūvių, nudažytų Massono trichromo dažais (nedengta skalė = 500 µm), reprezentatyvūs vaizdai (kairėje) ir kiekybinis įvertinimas (dešinėje) (n = 10 pjūvių/grupė iš skirtingų kiaulių, atliktas vienfaktorinis ANOVA testas; #### p < 0,0001, palyginti su D0 ir ***p < 0,001, palyginti su D12 Ctrl). c 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像（左）和量化（右）（裸尺0）（裸尺0） 10 个切片/组，每组来自不同的猪，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0,0001 与D0 相比 0.0001 与D0 相比相比）. C 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 （左 左） 量化 （右） 尸尦躣裸尺度 = 500 µm） （n = 10 个 切片 组 每 组 来自 不同 猪 ， 进行 单向 单向 单 拑 单 单向0,0001 与D0 相比，***p < 0,001 与D12 Ctrl 相比）. c Репрезентативные изображения (слева) ir количественный анализ (справа) срезов сердца, окрашенных трихром (чистая шкала = 500 мкм) (n = 10 срезов/группа, каждый от другой свиньи, протестировано с помощью однофо дисперсионного анализа ;### #p < 0,0001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Širdies pjūvių, nudažytų Massono trichromo dažais (tuščias = 500 µm), reprezentatyvūs vaizdai (kairėje) ir kiekybinis įvertinimas (dešinėje) (n = 10 pjūvių/grupė, kiekvienas iš skirtingos kiaulės, išbandytas vienfaktorine dispersine analize; ### # p < 0,0001, palyginti su D0, ***p < 0,001, palyginti su D12 Ctrl).Klaidų juostos rodo vidurkį ± standartinį nuokrypį.
Mes iškėlėme hipotezę, kad į kultūros terpę pridedant mažų molekulių, CTCM kultūros metu galima pagerinti kardiomiocitų vientisumą ir sumažinti fibrozės vystymąsi. Todėl, kadangi buvo nedaug painiojančių veiksnių, atlikome mažų molekulių paiešką, naudodami statines kontrolines kultūras20,21. Šiam tyrimui buvo pasirinkti deksametazonas (Dex), trijodtironinas (T3) ir SB431542 (SB). Šios mažos molekulės anksčiau buvo naudojamos hiPSC-CM kultūrose, siekiant paskatinti kardiomiocitų brendimą didinant sarkomerų ilgį, T kanalėlius ir laidumo greitį. Be to, žinoma, kad ir Dex (gliukokortikoidas), ir SB slopina uždegimą29,30. Todėl išbandėme, ar vienos ar kelių šių mažų molekulių įtraukimas pagerintų širdies pjūvių struktūrinį vientisumą. Pradiniam tyrimui kiekvieno junginio dozė buvo parinkta remiantis koncentracijomis, dažniausiai naudojamomis ląstelių kultūros modeliuose (1 μM Dex27, 100 nM T327 ir 2,5 μM SB31). Po 12 kultivavimo dienų T3 ir Dex derinys lėmė optimalų kardiomiocitų struktūros vientisumą ir minimalų skaidulų remodeliavimą (papildomi 4 ir 5 paveikslai). Be to, dvigubos arba dvigubos šių T3 ir Dex koncentracijų naudojimas sukėlė žalingą poveikį, palyginti su įprastomis koncentracijomis (papildomi 6a, b paveikslai).
Po pirminio patikrinimo atlikome 4 kultivavimo sąlygų tiesioginį palyginimą (4a pav.): Ctrl: širdies pjūviai, kultivuojami anksčiau aprašytoje statinėje kultūroje, naudojant optimizuotą terpę; 20.21 TD: T3 ir Ctrl, į kuriuos trečiadienį pridėta Dex; MC: širdies pjūviai, kultivuojami CTCM, naudojant anksčiau optimizuotą terpę; ir MT: CTCM, į kurią pridėta T3 ir Dex. Po 12 kultivavimo dienų MS ir MT audinių gyvybingumas išliko toks pat kaip ir šviežiuose audiniuose, įvertintas MTT tyrimu (4b pav.). Įdomu tai, kad T3 ir Dex pridėjimas prie transšulininių kultūrų (TD) reikšmingai nepagerino gyvybingumo, palyginti su Ctrl sąlygomis, o tai rodo svarbų mechaninės stimuliacijos vaidmenį palaikant širdies pjūvių gyvybingumą.
Eksperimentinio plano diagrama, kurioje vaizduojamos keturios kultūros sąlygos, naudojamos mechaninės stimuliacijos ir T3/Dex papildymo poveikiui terpėje 12 dienų įvertinti. b Juostinė diagrama rodo gyvybingumo kiekybinį įvertinimą praėjus 12 dienų po kultivavimo visomis 4 kultivavimo sąlygomis (kontrolinė, TD, MC ir MT), palyginti su šviežiais širdies griežinėliais (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD ir D12 MT), 12 (D12 MC) griežinėlių/grupė iš skirtingų kiaulių, atliktas vienfaktorinis ANOVA testas; ####p < 0,0001, ###p < 0,001, palyginti su D0, ir **p < 0,01, palyginti su D12 Ctrl). b Juostinė diagrama rodo gyvybingumo kiekybinį įvertinimą praėjus 12 dienų po kultivavimo visomis 4 kultivavimo sąlygomis (kontrolinė, TD, MC ir MT), palyginti su šviežiais širdies griežinėliais (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD ir D12 MT), 12 (D12 MC) griežinėlių/grupė iš skirtingų kiaulių, atliktas vienfaktorinis ANOVA testas; ####p < 0,0001, ###p < 0,001, palyginti su D0, ir **p < 0,01, palyginti su D12 kontroline). b Гистограмма показывает количественную оценку жизнеспособности через 12 дней после культивирования во4 культивирования (контроль, TD, MC ir MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TDD1) срезов/группу от разных свиней, проводится односторонний тест ANOVA; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 по сравнению с D0 ir **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). b Juostinė diagrama rodo gyvybingumo kiekybinį įvertinimą praėjus 12 dienų po kultivavimo visose 4 kultivavimo sąlygose (kontrolinė, TD, MC ir MT), palyginti su šviežiais širdies pjūviais (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD ir D12 MT), 12 (D12 MC) pjūvių/grupė iš skirtingų kiaulių, vienfaktorinis ANOVA testas; ####p < 0,0001, ###p < 0,001, palyginti su D0 ir **p < 0,01, palyginti su D12 Ctrl). b 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片、、』切片、、、D12D12D10)和D12 MT)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；####p < 0.0001，##00p1 < 0##00p1相比，**p < 0,01 与D12控制).b 4 12 (D12 MC) b Гистограмма, показывающая все 4 условия культивирования (контроль, TD, MC ir MT) по сравнению со свежими со свежими срез0 срезадщая 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD ir D12 MT), от разных свиней 12 (D12 MC) срезы/группа, односторонний тест ANOVA, ####p <0, ####p <0, ####p < 0,0 сравнению с D0, **p <0,01 по сравнению с контролем D12). b Histograma, rodanti visas 4 kultivavimo sąlygas (kontrolinė, TD, MC ir MT), palyginti su šviežiais širdies pjūviais (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD ir D12 MT), iš skirtingų kiaulių 12 (D12 MC) pjūvių/grupės, vienfaktorinis ANOVA testas; ####p<0,0001, ###p<0,001 vs. D0, **p<0,01 vs. kontrolinė D12). c Juostinė diagrama rodo gliukozės srauto kiekybinį įvertinimą praėjus 12 dienų po kultivavimo visomis 4 kultivavimo sąlygomis (kontrolinė, TD, MC ir MT), palyginti su šviežių širdies griežinėliais (D0) (n = 6 griežinėliai/grupė iš skirtingų kiaulių, atliktas vienfaktorinis ANOVA testas; ###p < 0,001, palyginti su D0 ir ***p < 0,001, palyginti su D12 Ctrl). c Juostinė diagrama rodo gliukozės srauto kiekybinį įvertinimą praėjus 12 dienų po kultivavimo visomis 4 kultivavimo sąlygomis (kontrolinė, TD, MC ir MT), palyginti su šviežių širdies griežinėliais (D0) (n = 6 griežinėliai/grupė iš skirtingų kiaulių, atliktas vienfaktorinis ANOVA testas; ###p < 0,001, palyginti su D0 ir ***p < 0,001, palyginti su D12 Ctrl). c Гистограмма показывает количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после культивирования во 4 всусехло культивирования (контроль, TD, MC ir MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 6 срезов/группу от развиных от разнению односторонний Выполняется тест ANOVA; ###p < 0,001 по сравнению с D0 ir ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Histogramoje parodytas gliukozės srauto kiekybinis įvertinimas praėjus 12 dienų po kultivavimo visomis 4 kultivavimo sąlygomis (kontrolinė, TD, MC ir MT), palyginti su šviežiais širdies pjūviais (D0) (n = 6 pjūviai/grupė iš skirtingų kiaulių, atliktas vienfaktorinis ANOVA testas; ###p < 0,001, palyginti su D0 ir ***p < 0,001, palyginti su D12 Ctrl). c 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) 相掐兔2，天的葡萄糖通量定量（n = 6 片/组，来自不同猪，单向执行ANOVA 测试；###p < 0.0丸D相比，***p < 0,001 与D12 Ctrl 相比）. C 条形图 显示 所有 4 种 条件 （（ctrl 、 td 、 mc 和 mt） 新鲜 心脏 切片 切片 切片 切片培养 后 后 12 天 的 通量 定量 （n = 6 片/组 ， 来自 猪 , ， 的 ， ， ，，猪单向执行ANOVA 测试；###p < 0,001，与D0 相比，***p < 0,001 与D12 Ctrl 相比）. c Гистограмма, показывающая количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после кулов4вирования культивирования (контроль, TD, MC ir MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 6 срезов/группа, от раз свиней, односторонний Были проведены тесты ANOVA; ###p < 0,001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению с D12 (контроль). c Histograma, rodanti gliukozės srauto kiekybinį įvertinimą praėjus 12 dienų po kultivavimo visomis 4 kultivavimo sąlygomis (kontrolinė, TD, MC ir MT), palyginti su šviežiais širdies pjūviais (D0) (n = 6 pjūviai/grupė, iš skirtingų kiaulių, vienpusiai). Buvo atlikti ANOVA testai, ###p < 0,001, palyginti su D0, ***p < 0,001, palyginti su D12 (kontrolinė).d Šviežių (mėlyna), 12 dienos MC (žalia) ir 12 dienos MT (raudona) audinių deformacijų analizės grafikai dešimtyje regioninių audinių pjūvių taškų (n = 4 pjūviai/grupė, vienfaktorinis ANOVA testas; reikšmingo skirtumo tarp grupių nebuvo). e Vulkano grafikas, rodantis skirtingai ekspresuojamus genus šviežiuose širdies pjūviuose (D0), palyginti su širdies pjūviais, kultivuotais statinėmis sąlygomis (Ctrl) arba MT sąlygomis (MT) 10–12 dienų. f Sarkomerų genų šilumos žemėlapis širdies pjūviams, kultivuotiems kiekvienomis kultivavimo sąlygomis. Paklaidų juostos rodo vidurkį ± standartinį nuokrypį.
Metabolizmo priklausomybė nuo perėjimo nuo riebalų rūgščių oksidacijos prie glikolizės yra būdingas kardiomiocitų dediferenciacijos požymis. Nesubrendę kardiomiocitai ATP gamybai daugiausia naudoja gliukozę ir turi hipoplastines mitochondrijas su nedaugeliu kristų5,32. Gliukozės panaudojimo analizė parodė, kad MC ir MT sąlygomis gliukozės panaudojimas buvo panašus į 0 dienos audiniuose (4c pav.). Tačiau Ctrl mėginiai parodė reikšmingą gliukozės panaudojimo padidėjimą, palyginti su šviežiu audiniu. Tai rodo, kad CTCM ir T3/Dex derinys padidina audinių gyvybingumą ir išsaugo 12 dienų kultivuotų širdies pjūvių metabolinį fenotipą. Be to, deformacijos analizė parodė, kad deformacijos lygis 12 dienų MT ir MS sąlygomis išliko toks pat kaip ir šviežiame širdies audinyje (4d pav.).
Norėdami išanalizuoti bendrą CTCM ir T3/Dex poveikį pasauliniam širdies pjūvio audinio transkripcijos kraštovaizdžiui, atlikome RNR sekvenavimą širdies pjūviuose, gautuose iš visų keturių skirtingų kultivavimo sąlygų (1 papildomi duomenys). Įdomu tai, kad MT pjūviai parodė didelį transkripcijos panašumą į šviežią širdies audinį, tik 16 iš 13 642 genų buvo skirtingai ekspresuoti. Tačiau, kaip parodėme anksčiau, Ctrl pjūviai po 10–12 dienų kultivavimo parodė 1229 skirtingai ekspresuotus genus (4e pav.). Šie duomenys buvo patvirtinti širdies ir fibroblastų genų qRT-PGR (papildomas 7a–c pav.). Įdomu tai, kad Ctrl pjūviai parodė širdies ir ląstelių ciklo genų reguliacijos sumažėjimą ir uždegiminių genų programų aktyvaciją. Šie duomenys rodo, kad dediferenciacija, kuri paprastai įvyksta po ilgalaikio kultivavimo, MT sąlygomis yra visiškai susilpnėjusi (papildomas 8a, b pav.). Kruopštus sarkomerų genų tyrimas parodė, kad tik MT sąlygomis išsaugomi sarkomerą (4f pav.) ir jonų kanalą (papildomas 9 pav.) koduojantys genai, apsaugantys juos nuo slopinimo Ctrl, TD ir MC sąlygomis. Šie duomenys rodo, kad derinant mechaninę ir humoralinę stimuliaciją (T3/Dex), širdies pjūvio transkriptomas gali išlikti panašus į šviežius širdies pjūvius po 12 dienų kultūroje.
Šiuos transkripcijos duomenis patvirtina faktas, kad širdies pjūvių kardiomiocitų struktūrinis vientisumas geriausiai išsilaiko MT sąlygomis 12 dienų, kaip rodo nepažeistas ir lokalizuotas koneksinas 43 (5a pav.). Be to, fibrozė širdies pjūviuose MT sąlygomis buvo žymiai sumažėjusi, palyginti su Ctrl, ir panaši į šviežių širdies pjūvių (5b pav.). Šie duomenys rodo, kad mechaninės stimuliacijos ir T3/Dex gydymo derinys efektyviai išsaugo širdies struktūrą širdies pjūviuose kultūroje.
a Tipiniai troponino T (žalia), koneksino 43 (raudona) ir DAPI (mėlyna) imunofluorescenciniai vaizdai šviežiai izoliuotuose širdies pjūviuose (D0) arba kultivuotuose 12 dienų visose keturiose širdies pjūvių kultivavimo sąlygose (mastelio juosta = 100 µm). ). Dirbtinio intelekto pagalba kiekybiškai įvertintas širdies audinio struktūrinis vientisumas (n = 7 (D0 ir D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC ir D12 MT) griežinėliai/grupė iš skirtingų kiaulių, atliktas vienfaktorinis ANOVA testas; ####p < 0,0001, palyginti su D0, ir *p < 0,05, arba ****p < 0,0001, palyginti su D12 Ctrl). Dirbtinio intelekto pagalba kiekybiškai įvertintas širdies audinio struktūrinis vientisumas (n = 7 (D0 ir D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC ir D12 MT) griežinėliai/grupė iš skirtingų kiaulių, atliktas vienfaktorinis ANOVA testas; #### p < 0,0001, palyginti su D0, ir *p < 0,05, arba ****p < 0,0001, palyginti su D12 Ctrl). Количественная оценка структурной целостности ткани сердца с помощью искусственного интеллекта (n = 71,2D10) D12 MC ir D12 MT) срезов/группу от разных свиней, проведен однофакторный тест ANOVA #### p < 0,0001 по сравне, 0001 по сравне; ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). Širdies audinio struktūrinio vientisumo kiekybinis įvertinimas naudojant dirbtinį intelektą (n = 7 (D0 ir D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC ir D12 MT) pjūviai/grupė iš skirtingų kiaulių, atliktas vienfaktorinis ANOVA testas; #### p < 0,0001, palyginti su D0, ir *p < 0,05 arba ****p < 0,0001, palyginti su D12 Ctrl).对不同猪的心脏组织结构完整性（n = 7（D0 和D12 Ctrl）、5（D12 TD、D12 MC 和D12 MT）切片/组）进行人工智能量化，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0,0001 与D0 和*盌渖戌*p. 0.0001 与D12 Ctrl 相比）.对 不同 猪 的 心脏 结构 完整性 (n = 7 （d0 和 d12 ctrl） （5 （d12 td 、 d12 mc12 mc人工 智能量 化 进行 单向 单向 单向 测试 ； ########## p < 0,0001 与D0 和*p < 0,05 0,0001 与D12 Ctrl 相比）.Širdies audinio struktūrinio vientisumo kiekybinis įvertinimas naudojant dirbtinį intelektą skirtingose ​​kiaulėse (n = 7 (D0 ir D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC ir D12 MT) pjūviai/grupė) vienfaktoriniu ANOVA testu;#### p < 0,0001 по сравнению с D0 ir *p < 0,05 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). #### p < 0,0001, palyginti su D0, ir *p < 0,05 arba ****p < 0,0001, palyginti su D12 (vald.). b Reprezentatyvūs vaizdai ir kiekybinis įvertinimas širdies pjūviams, nudažytiems Massono trichromo dažais (mastelio juosta = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD ir D12 MC), 9 (D12 MT) pjūviai/grupė iš skirtingų kiaulių, atliktas vienfaktorinis ANOVA testas; ####p < 0,0001, palyginti su D0 ir ***p < 0,001 arba ****p < 0,0001, palyginti su D12 Ctrl). b Reprezentatyvūs vaizdai ir kiekybinis įvertinimas širdies pjūviams, nudažytiems Massono trichromo dažais (mastelio juosta = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD ir D12 MC), 9 (D12 MT) pjūviai/grupė iš skirtingų kiaulių, atliktas vienfaktorinis ANOVA testas; ####p < 0,0001, palyginti su D0 ir ***p < 0,001 arba ****p < 0,0001, palyginti su D12 Ctrl). b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромным красителеным красителенная линейка = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD ir D12 MC), 9 (D12 MT) срезов/группу от разных свиней, выпояроннияйностостостояннияетс; ####p < 0,0001 по сравнению с D0 ir ***p < 0,001 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). b Reprezentatyvūs vaizdai ir širdies pjūvių, nudažytų Massono trichromo dažais (mastelio juosta = 500 µm), kiekybinis įvertinimas (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD ir D12 MC), 9 (D12 MT) pjūviai/grupė iš skirtingų kiaulių, atlikta vienfaktorinė ANOVA; ####p < 0,0001 vs. D0 ir ***p < 0,001 arba ****p < 0,0001 vs. D12 Ctrl). b 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像和量化（比例尺= 500 µm）D01（n Ctrl、D12 TD 和D12 MC），来自不同猪的9 个（D12 MT）切片/组，进行单因素方差0.0###p与D0 相比，***p < 0,001，或****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）. b 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 和 量化 （比例 尺 尺 尺 = 500 µ0 n（0 、 d12 ctrl 、 d12 td 和 d12 mc） 来自 不同 的 9 个 d12 mt 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 组，进行单因素方差分析；###00D01相比，***p < 0,001，或****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）. b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромом = Масссона (тил500ромом Масссона мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD ir D12 MC), 9 (D12 MT) срезов от разных свиней / группы, один- способ ANOVA <нера; #0,0#0p01 с D0, ***p < 0,001 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). b Reprezentatyvūs vaizdai ir širdies pjūvių, nudažytų Massono trichromu (mastelio juosta = 500 µm), kiekybinis įvertinimas (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD ir D12 MC), 9 (D12 MT) pjūviai iš skirtingų kiaulių/grupės, vienas ANOVA metodas; ####p < 0,0001, palyginti su D0, ***p < 0,001 arba ****p < 0,0001, palyginti su D12 Ctrl).Klaidų juostos rodo vidurkį ± standartinį nuokrypį.
Galiausiai, CTCM gebėjimas imituoti širdies hipertrofiją buvo įvertintas didinant širdies audinio tempimą. CTCM metu didžiausias oro kameros slėgis padidėjo nuo 80 mmHg iki 80 mmHg. Art. (normalus tempimas) iki 140 mmHg Art. (6a pav.). Tai atitinka 32 % tempimo padidėjimą (6b pav.), kuris anksčiau buvo parodytas kaip atitinkamas tempimo procentas, reikalingas širdies pjūviams, kad būtų pasiektas panašus į hipertrofijos metu matomą sarkomeros ilgį. Širdies audinio tempimas ir greitis susitraukimo ir atsipalaidavimo metu išliko pastovūs per šešias kultivavimo dienas (6c pav.). Širdies audinys iš MT sąlygų šešias dienas buvo tempiamas normaliomis (MT (normalus)) arba pertempimo sąlygomis (MT (OS)). Jau po keturių kultivavimo dienų hipertrofinis biožymuo NT-ProBNP buvo reikšmingai padidėjęs terpėje MT (OS) sąlygomis, palyginti su MT (normaliomis) sąlygomis (7a pav.). Be to, po šešių kultivavimo dienų ląstelių dydis MT (OS) (7b pav.) reikšmingai padidėjo, palyginti su MT širdies pjūviais (normalūs). Be to, pernelyg ištemptuose audiniuose reikšmingai padidėjo NFATC4 branduolio translokacija (7c pav.). Šie rezultatai rodo progresuojantį patologinio remodeliavimosi vystymąsi po hiperdistenzijos ir patvirtina koncepciją, kad CTCM įrenginys gali būti naudojamas kaip platforma tempimo sukeltos širdies hipertrofijos signalizacijos tyrimui.
Tipiniai oro kameros slėgio, skysčio kameros slėgio ir audinių judėjimo matavimų kreivės patvirtina, kad kameros slėgis keičia skysčio kameros slėgį, sukeldamas atitinkamą audinio pjūvio judėjimą. b Tipinės tempimo procentinės ir tempimo greičio kreivės normaliai ištemptiems (oranžiniams) ir pertemptiems (mėlyniems) audinių pjūviams. c Juostinė diagrama, rodanti ciklo laiką (n = 19 pjūvių vienoje grupėje, iš skirtingų kiaulių), susitraukimo laiką (n = 18–19 pjūvių vienoje grupėje, iš skirtingų kiaulių), relaksacijos laiką (n = 19 pjūvių vienoje grupėje, iš skirtingų kiaulių)), audinių judėjimo amplitudę (n = 14 pjūvių/grupėje, iš skirtingų kiaulių), didžiausią sistolinį greitį (n = 14 pjūvių/grupėje, iš skirtingų kiaulių) ir didžiausią relaksacijos greitį (n = 14 (D0), 15 (D6)) pjūvių/grupių) iš skirtingų kiaulių), dvipusis Student'o t-testas neparodė reikšmingo skirtumo jokiame parametre, o tai rodo, kad šie parametrai išliko pastovūs per 6 kultivavimo dienas esant viršįtampiui. Paklaidų juostos rodo vidurkį ± standartinį nuokrypį.
NT-ProBNP koncentracijos kultūros terpėse, gautose esant normaliam MT tempimui (Norm) arba per dideliam tempimui (OS), kiekybinis stulpelio grafikas (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm ir D4 MTOS) griežinėliai/grupė iš skirtingų kiaulių, atlikta dvipusė ANOVA; **p < 0,01, palyginti su normaliu tempimu). NT-ProBNP koncentracijos kultūros terpėse, gautose esant normaliam MT tempimui (Norm) arba per dideliam tempimui (OS), kiekybinis stulpelio grafikas (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm ir D4 MTOS) griežinėliai/grupė iš skirtingų kiaulių, atlikta dvipusė ANOVA; **p < 0,01, palyginti su normaliu tempimu).Kiekybinė NT-ProBNP koncentracijos kultūros terpėje histograma, gauta iš širdies griežinėlių, kultivuotų esant normaliam MT tempimui (norma) arba per dideliam tempimui (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm ir D4).MTOS) griežinėliai/grupė iš skirtingų kiaulių, atliekama dviejų faktorių dispersinė analizė;**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p < 0,01, palyginti su normaliu tempimu). a 在MT 正常拉伸(Norm) 或过度拉伸(OS) 条件下培养的心脏切片培养基中NT-ProBNP浓度的条形图量化（n = 4 (D2 MTNorm)、3（D2 MTOS、D4 MTNorm 和D4 MTOS）来自不同猪的切片/组，进行双向方差分析；**与正常拉伸相比，p < 0,01). NT-ProBNP koncentracijos kiekybinis širdies pjūvių, kultivuotų MT normalaus tempimo (norma) arba pertempimo (OS) sąlygomis (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm 和D4 MTOS), iš skirtingų skirtingų猪的切片/组，可以双向方方发发动 **palyginti su įprastu tempimu, p < 0,01).histograma. NT-ProBNP koncentracijų kiekybinis įvertinimas širdies pjūviuose, kultivuotuose normaliu MT tempimu (norma) arba pertempimu (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm) ir D4 MTOS) pjūviai/grupė iš skirtingų kiaulių, dvifaktorinė dispersinė analizė;**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p < 0,01, palyginti su normaliu tempimu). b Tipiniai širdies pjūvių, nudažytų troponinu T ir WGA (kairėje), ir ląstelių dydžio kiekybinio įvertinimo (dešinėje) vaizdai (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) ląstelės/grupė iš 10 skirtingų pjūvių iš skirtingų kiaulių, atliktas dvipusis Student t testas; ****p < 0,0001, palyginti su normaliu tempimu). b Tipiniai širdies pjūvių, nudažytų troponinu T ir WGA (kairėje), ir ląstelių dydžio kiekybinio įvertinimo (dešinėje) vaizdai (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) ląstelės/grupė iš 10 skirtingų pjūvių iš skirtingų kiaulių, atliktas dvipusis Student t testas; ****p < 0,0001, palyginti su normaliu ištempimu). b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слева) и количествеяперазмолераственного клеток (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) клеток/группу из 10 разных срезов от разных свиней, два- провод хвостовой t-критерий Стьюдента; ****p < 0,0001 по сравнению с нормальным растяжением). b Tipiniai širdies pjūvių, nudažytų troponinu T ir AZP (kairėje), ir ląstelių dydžio kiekybinio įvertinimo (dešinėje) vaizdai (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) ląstelės/grupė iš 10 skirtingų pjūvių iš skirtingų kiaulių, atliktas dvipusis Student'o t testas; ****p < 0,0001, palyginti su normalia paderme). b 用肌钙蛋白-T 和WGA（左）和细胞大小量化（右）染色的心脏切片的代脏切片的代表揃330D MTOS），来自不同猪的10 个不同切片的369（D6 MTNorm）细胞/组，两进行有尾t学甦 检验；与正常拉伸相比，****p < 0,0001）. b Tipiniai širdies pjūvių, nudažytų kalkareinu-T ir WGA (kairėje), ir ląstelių dydžio (dešinėje) vaizdai (n = 330 (D6 MTOS), 369 iš 10 skirtingų pjūvių (D6 MTNorm)). Ląstelės/组，两方法有尾学生t testas；palyginti su normaliu tempimu，****p < 0,0001). b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т ir АЗП (слева) и колкичестверанка (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) из 10 различных срезов от разных свиней Клетки/группа, двустрийстороней Стьюдента; ****p < 0,0001 по сравнению с нормальным растяжением). b Širdies pjūvių, nudažytų troponinu T ir AZP (kairėje), reprezentatyvūs vaizdai ir ląstelių dydžio kiekybinis įvertinimas (dešinėje) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) iš 10 skirtingų pjūvių iš skirtingų kiaulių) Ląstelės/grupė, dvipusis kriterijus Studento t; ****p < 0,0001, palyginti su normalia paderme). c Reprezentatyvūs 0 ir 6 dienų MTOS širdies pjūvių, imunologiškai paženklintų troponinu T ir NFATC4, vaizdai ir NFATC4 perkėlimo į širdies ląstelių branduolius kiekybinis įvertinimas (n = 4 (0 diena), 3 (6 diena MTOS) pjūviai/grupė iš skirtingų kiaulių, atliktas dvipusis Student t testas; *p < 0,05). c Reprezentatyvūs 0 ir 6 dienų MTOS širdies pjūvių, imunologiškai paženklintų troponinu T ir NFATC4, vaizdai ir NFATC4 perkėlimo į širdies ląstelių branduolius kiekybinis įvertinimas (n = 4 (0 diena), 3 (6 diena MTOS) pjūviai/grupė iš skirtingų kiaulių, atliktas dvipusis Student t testas; *p < 0,05). c Репрезентативные изображения для срезов сердца 0 ir 6 дней MTOS, иммуномеченых для тропонина-Т и NFATC4, чентастивные оценка транслокации NFATC4 в ядра кавернозных клеток (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срезов/группу от разных свинетпля , двусторонний t-критерий Стьюдента; *p < 0,05). c Reprezentatyvūs širdies pjūvių vaizdai 0 ir 6 dieną po MTOS, imunologiškai paženklinti troponinu T ir NFATC4, ir NFATC4 translokacijos kiekybinis įvertinimas kaverninių ląstelių branduolyje (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) pjūviai/grupė iš skirtingų kiaulių), atliktas dvipusis Student t-testas; *p < 0,05). c 用于肌钙蛋白-T 和NFATC4 免疫标记的第0 天和第6 天MTOS心脏切片的代表性图像，以及来自不同猪的NFATC4 易位至CM 细マ核的量化6 = MT 4（Dn)切片/组, 进行双尾学生t 检验；*p < 0,05). c Reprezentatyvūs kalkanino-T ir NFATC4 imuninio žymėjimo 第0天和第6天MTOS širdies pjūviai ir NFATC4 iš skirtingų NFATC4 易位至CM ląstelių branduolių 的 kvantitetas化 (n = 4 (D0), 焤 3, 焤 3)时间双尾学生et 电影；*p < 0,05). c Репрезентативные изображения срезов сердца MTOS на 0 ir 6 день для иммуномаркировки тропоницном-Т и NFATC4 изображения срезов сердца и транслокации NFATC4 в ядра CM от разных свиней (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срез/группа, два- хвостатый t-критерий *

0,05). c MTOS širdies pjūvių reprezentatyvūs vaizdai 0 ir 6 dieną, skirti troponino T ir NFATC4 imunologiniam žymėjimui ir NFATC4 translokacijos kiekybiniam įvertinimui CM branduolyje iš skirtingų kiaulių (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) pjūviai/grupė, dvipusis t kriterijus, Studento; *p < 0,05).Klaidų juostos yra vidurkis ± standartinis nuokrypis.
Transliaciniams širdies ir kraujagyslių sistemos tyrimams reikalingi ląstelių modeliai, kurie tiksliai atkuria širdies aplinką. Šiame tyrime buvo sukurtas ir apibūdintas CTCM įrenginys, galintis stimuliuoti itin plonus širdies pjūvius. CTCM sistema apima fiziologiškai sinchronizuotą elektromechaninę stimuliaciją ir T3 bei Dex skysčių praturtinimą. Kai kiaulių širdies pjūviai buvo veikiami šiais veiksniais, jų gyvybingumas, struktūrinis vientisumas, metabolinis aktyvumas ir transkripcijos raiška išliko tokie patys kaip ir šviežiame širdies audinyje po 12 dienų kultivavimo. Be to, per didelis širdies audinio tempimas gali sukelti širdies hipertrofiją, kurią sukelia hiperekstenzija. Apskritai šie rezultatai patvirtina svarbų fiziologinių kultivavimo sąlygų vaidmenį palaikant normalų širdies fenotipą ir suteikia platformą vaistų patikrai.
Daugelis veiksnių prisideda prie optimalios kardiomiocitų funkcionavimo ir išlikimo aplinkos sukūrimo. Akivaizdžiausi iš šių veiksnių yra susiję su (1) tarpląstelinėmis sąveikomis, (2) elektromechanine stimuliacija, (3) humoraliniais veiksniais ir (4) metaboliniais substratais. Fiziologinei ląstelių tarpusavio sąveikai reikalingi sudėtingi trimačiai kelių ląstelių tipų tinklai, kuriuos palaiko tarpląstelinė matrica. Tokias sudėtingas ląstelių sąveikas sunku atkurti in vitro, bendrai kultivuojant atskirus ląstelių tipus, tačiau tai galima lengvai pasiekti naudojant širdies pjūvių organotipinį pobūdį.
Mechaninis kardiomiocitų tempimas ir elektrinė stimuliacija yra labai svarbūs širdies fenotipui palaikyti33,34,35. Nors mechaninė stimuliacija buvo plačiai naudojama hiPSC-CM kondicionavimui ir brendimui, neseniai atlikta keletas elegantiškų tyrimų, kuriuose bandyta mechaniškai stimuliuoti širdies pjūvius kultūroje, naudojant vienaašį krūvį. Šie tyrimai rodo, kad 2D vienaašis mechaninis krūvis kultūros metu daro teigiamą poveikį širdies fenotipui. Šiuose tyrimuose širdies pjūviai buvo apkraunami izometrinėmis tempimo jėgomis17, tiesine auksotonine apkrova18 arba širdies ciklas buvo atkurtas naudojant jėgos keitiklio grįžtamąjį ryšį ir įtempimo pavaras. Tačiau šie metodai naudoja vienaašį audinių tempimą be aplinkos optimizavimo, todėl daugelis širdies genų yra slopinami arba pernelyg išreiškiami genai, susiję su nenormaliais tempimo atsakais. Čia aprašyta CTCM suteikia 3D elektromechaninį stimulą, kuris imituoja natūralų širdies ciklą pagal ciklo laiką ir fiziologinį tempimą (25 % tempimas, 40 % sistolė, 60 % diastolė ir 72 dūžiai per minutę). Nors vien šios trimatės mechaninės stimuliacijos nepakanka audinių vientisumui palaikyti, norint tinkamai palaikyti audinių gyvybingumą, funkciją ir vientisumą, reikalingas humoralinės ir mechaninės stimuliacijos derinys naudojant T3/Dex.
Humoraliniai veiksniai vaidina svarbų vaidmenį moduliuojant suaugusio žmogaus širdies fenotipą. Tai buvo pabrėžta HiPS-CM tyrimuose, kuriuose į kultūros terpę buvo dedama T3 ir Dex, siekiant paspartinti ląstelių brendimą. T3 gali turėti įtakos aminorūgščių, cukrų ir kalcio pernašai per ląstelių membranas36. Be to, T3 skatina MHC-α ekspresiją ir MHC-β reguliacijos sumažėjimą, skatindamas greito susitraukimo miofibrilų susidarymą subrendusiuose kardiomiocituose, palyginti su lėto susitraukimo miofibrilėmis vaisiaus CM. T3 trūkumas pacientams, sergantiems hipotireoze, lemia miofibrilinių juostų praradimą ir sulėtėjusį tonuso vystymosi greitį37. Dex veikia gliukokortikoidų receptorius ir, kaip įrodyta, padidina miokardo susitraukimą izoliuotose perfuzuotose širdyse;38 manoma, kad šis pagerėjimas susijęs su poveikiu kalcio nuosėdų sukeltam patekimui (SOCE)39,40. Be to, Dex prisijungia prie savo receptorių, sukeldamas platų tarpląstelinį atsaką, kuris slopina imuninę funkciją ir uždegimą30.
Mūsų rezultatai rodo, kad fizinė mechaninė stimuliacija (MS) pagerino bendrą kultūros našumą, palyginti su Ctrl, tačiau nepavyko išlaikyti gyvybingumo, struktūrinio vientisumo ir širdies raiškos per 12 dienų kultūroje. Palyginti su Ctrl, T3 ir Dex pridėjimas prie CTCM (MT) kultūrų pagerino gyvybingumą ir 12 dienų išlaikė panašius transkripcijos profilius, struktūrinį vientisumą ir metabolinį aktyvumą su šviežiu širdies audiniu. Be to, kontroliuojant audinių tempimo laipsnį, naudojant STCM buvo sukurtas hiperekstenzijos sukeltos širdies hipertrofijos modelis, iliustruojantis STCM sistemos universalumą. Reikėtų pažymėti, kad nors širdies remodeliavimas ir fibrozė paprastai apima nepažeistus organus, kurių cirkuliuojančios ląstelės gali tiekti tinkamus citokinus, taip pat fagocitozę ir kitus remodeliavimo faktorius, širdies pjūviai vis tiek gali imituoti fibrozinį procesą, reaguodami į stresą ir traumą. Tai jau buvo anksčiau įvertinta šiame širdies pjūvio modelyje. Reikėtų pažymėti, kad CTCM parametrus galima moduliuoti keičiant slėgį / elektrinę amplitudę ir dažnį, kad būtų imituojamos įvairios sąlygos, tokios kaip tachikardija, bradikardija ir mechaninė kraujotakos palaikymas (mechaniškai neapkrauta širdis). Dėl to sistema yra vidutinio našumo vaistų testavimui. CTCM gebėjimas modeliuoti pervargimo sukeltą širdies hipertrofiją atveria kelią šios sistemos testavimui taikant individualizuotą terapiją. Apibendrinant, šis tyrimas parodo, kad mechaninis tempimas ir humoralinė stimuliacija yra labai svarbūs širdies audinių pjūvių kultūros palaikymui.
Nors čia pateikti duomenys rodo, kad CTCM yra labai perspektyvi platforma nepažeisto miokardo modeliavimui, šis kultivavimo metodas turi tam tikrų apribojimų. Pagrindinis CTCM kultivavimo apribojimas yra tas, kad pjūviams taikomas nuolatinis dinaminis mechaninis įtempis, dėl kurio negalima aktyviai stebėti širdies pjūvio susitraukimų kiekvieno ciklo metu. Be to, dėl mažo širdies pjūvių dydžio (7 mm), ribotos galimybės įvertinti sistolinę funkciją už kultivavimo sistemų ribų, naudojant tradicinius jėgos jutiklius. Šiame rankraštyje mes iš dalies įveikiame šį apribojimą, vertindami optinę įtampą kaip susitraukimo funkcijos rodiklį. Tačiau šiam apribojimui reikės tolesnio darbo ir ateityje jis gali būti išspręstas įdiegiant širdies pjūvių funkcijos optinio stebėjimo kultūroje metodus, tokius kaip optinis žemėlapių sudarymas naudojant kalcio ir įtampai jautrius dažus. Kitas CTCM apribojimas yra tas, kad darbinis modelis nemanipuliuoja fiziologiniu stresu (prieškrūviu ir pokrūviu). CTCM atveju slėgis buvo sukeliamas priešingomis kryptimis, kad būtų atkurtas 25 % fiziologinis tempimas diastolėje (pilnas tempimas) ir sistolėje (susitraukimo ilgis elektrinės stimuliacijos metu) labai dideliuose audiniuose. Šis apribojimas turėtų būti pašalintas būsimuose CTCM modeliuose, tinkamai spaudžiant širdies audinius iš abiejų pusių ir taikant tikslius slėgio ir tūrio santykius, kurie atsiranda širdies kamerose.
Šiame rankraštyje aprašytas pertempimo sukeltas remodeliavimas apsiriboja hipertrofinių hipertempimo signalų imitacija. Taigi, šis modelis gali padėti tirti tempimo sukeltą hipertrofinę signalizaciją, nereikalaujant humoralinių ar neuroninių faktorių (kurių šioje sistemoje nėra). Reikalingi tolesni tyrimai, siekiant padidinti CTCM įvairovės, pavyzdžiui, bendras kultivavimas su imuninėmis ląstelėmis, cirkuliuojančiais plazmos humoraliniais faktoriais ir inervacija, kai bendras kultivavimas su neuroninėmis ląstelėmis pagerins ligų modeliavimo naudojant CTCM galimybes.
Šiame tyrime buvo panaudota trylika kiaulių. Visos procedūros su gyvūnais buvo atliekamos laikantis institucijos gairių ir patvirtintos Luisvilio universiteto Institucinio gyvūnų priežiūros ir naudojimo komiteto. Aortos lankas buvo užspaustas, o širdis perfuzuota 1 l sterilaus kardioplegijos tirpalo (110 mM NaCl, 1,2 mM CaCl2, 16 mM KCl, 16 mM MgCl2, 10 mM NaHCO3, 5 U/ml heparino, pH iki 7,4); Širdys buvo laikomos lediniame kardiopleginiame tirpale, kol buvo transportuojamos į laboratoriją ant ledo, kuris paprastai trunka <10 min. Širdys buvo laikomos lediniame kardiopleginiame tirpale, kol buvo transportuojamos į laboratoriją ant ledo, kuris paprastai trunka <10 min. сердца хранили в ледяном кардиоплегическом растворе до транспортировки в лабораторию на льду, что обынично льду. Širdys buvo laikomos lediniame kardiopleginiame tirpale iki transportavimo į laboratoriją ant ledo, kuris paprastai trunka <10 min.将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钟将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钟 Держите сердца в ледяной кардиоплегии до транспортировки в лабораторию на льду, обычно <10 мин. Laikykite širdis ant ledo, atlikdami kardioplegiją, kol jas transportuosite į laboratoriją ant ledo, paprastai <10 min.
CTCM įrenginys buvo sukurtas naudojant „SolidWorks“ kompiuterinio projektavimo (CAD) programinę įrangą. Kultūros kameros, pertvaros ir oro kameros pagamintos iš CNC skaidraus akrilo plastiko. 7 mm skersmens atraminis žiedas centre pagamintas iš didelio tankio polietileno (HDPE) ir turi O formos žiedo griovelį, skirtą silikoniniam O žiedui, naudojamam terpės sandarinimui apačioje. Plona silicio membrana skiria kultūros kamerą nuo atskyrimo plokštės. Silikono membrana yra lazeriu išpjauta iš 0,02 colio storio silikono lakšto, o jos kietumas yra 35A. Apatinės ir viršutinės silikoninės tarpinės yra lazeriu išpjautos iš 1/16 colio storio silikono lakšto, o jų kietumas yra 50A. Blokui pritvirtinti ir hermetiškam sandarinimui sukurti naudojami 316L nerūdijančio plieno varžtai ir sparno veržlės.
Speciali spausdintinė plokštė (PCB) skirta integravimui su C-PACE-EM sistema. Ant plokštės esantys šveicariško tipo jungčių lizdai prie grafito elektrodų prijungti sidabruotais variniais laidais ir į elektrodus įsuktais bronziniais 0-60 varžtais. Spausdintinė plokštė dedama į 3D spausdintuvo dangtelį.
CTCM įrenginį valdo programuojama pneumatinė pavara (PPD), kuri sukuria kontroliuojamą kraujotakos slėgį, panašų į širdies ciklą. Didėjant slėgiui oro kameroje, lanksti silikoninė membrana plečiasi į viršų, priversdama terpę patekti po audiniu. Tuomet audinio plotas ištempiamas dėl šio skysčio išstūmimo, imituojant fiziologinį širdies išsiplėtimą diastolės metu. Relaksacijos piko metu per grafito elektrodus buvo taikoma elektrinė stimuliacija, kuri sumažino slėgį oro kameroje ir sukėlė audinių sekcijų susitraukimą. Vamzdžio viduje yra hemostazinis vožtuvas su slėgio jutikliu, kuris matuoja slėgį oro sistemoje. Slėgio jutiklio užfiksuotas slėgis perduodamas duomenų rinktuvui, prijungtam prie nešiojamojo kompiuterio. Tai leidžia nuolat stebėti slėgį dujų kameroje. Kai pasiekiamas maksimalus kameros slėgis (standartinis 80 mmHg, 140 mmHg OS), duomenų rinkimo įrenginiui buvo nurodyta siųsti signalą į C-PACE-EM sistemą, kad būtų generuojamas dvifazis įtampos signalas 2 ms, nustatytas į 4 V.
Buvo gauti širdies pjūviai ir 6 šulinėlių kultivavimo sąlygos buvo sudarytos taip: paimtos širdelės iš perkėlimo indo buvo perkeltos į dėklą su šalta (4 °C) kardioplegija. Kairysis skilvelis buvo izoliuotas steriliu peiliuku ir supjaustytas 1–2 cm3 gabalėliais. Šie audinių blokai buvo pritvirtinti prie audinių laikiklių audinių klijais ir įdėti į vibruojančią mikrotomo audinių vonią su Tyrode tirpalu ir nuolat deguonimi prisotinta (3 g/l 2,3-butandiono monooksimo (BDM), 140 mM NaCl (8,18 g), 6 mM KCl (0,447 g), 10 mM D-gliukozės (1,86 g), 10 mM HEPES (2,38 g), 1 mM MgCl2 (1 ml 1 M tirpalo), 1,8 mM CaCl2 (1,8 ml 1 M tirpalo), iki 1 l ddH2O). Vibruojantis mikrotomas buvo nustatytas pjauti 300 µm storio riekeles 80 Hz dažniu, 2 mm horizontalios vibracijos amplitude ir 0,03 mm/s judėjimo greičiu. Audinių vonelė buvo apsupta ledo, kad tirpalas būtų vėsus, o temperatūra buvo palaikoma 4 °C. Audinių pjūviai iš mikrotomo vonios buvo perkeliami į inkubacinę vonią su nuolat deguonimi prisotintu Tyrode tirpalu ant ledo, kol bus gauta pakankamai pjūvių vienai kultūros lėkštelei. Transšulininėms kultūroms audinių pjūviai buvo pritvirtinti prie sterilių 6 mm pločio poliuretano laikiklių ir dedami į 6 ml optimizuotos terpės (199 terpė, 1x ITS papildas, 10 % FBS, 5 ng/ml VEGF, 10 ng/ml FGF-šarminis ir 2X antibiotikas-priešgrybelinis preparatas). Audinių pjūviams per C-Pace buvo taikoma elektrinė stimuliacija (10 V, dažnis 1,2 Hz). TD sąlygoms kiekvieną kartą keičiant terpę buvo pridėta šviežio T3 ir Dex, kurių koncentracija buvo 100 nM ir 1 μM. Terpė prisotinama deguonimi prieš pakeičiant ją 3 kartus per dieną. Audinių pjūviai buvo kultivuojami inkubatoriuje 37 °C temperatūroje ir 5 % CO2 atmosferoje.
CTCM kultūroms audinių pjūviai buvo dedami ant specialiai pagaminto 3D spausdintuvo Petri lėkštelėje su modifikuotu Tyrode tirpalu. Įrenginys sukurtas taip, kad širdies pjūvio dydis padidėtų 25 % atraminio žiedo ploto. Tai daroma taip, kad širdies pjūviai neišsitemptų juos perkėlus iš Tyrode tirpalo į terpę ir diastolės metu. Naudojant histoakrilinius klijus, 300 µm storio pjūviai buvo pritvirtinti prie 7 mm skersmens atraminio žiedo. Pritvirtinus audinių pjūvius prie atraminio žiedo, nukirpkite perteklinius audinių pjūvius ir pritvirtintus audinių pjūvius vėl įdėkite į Tyrode tirpalo vonią ant ledo (4 °C), kol bus paruošta pakankamai pjūvių vienam įrenginiui. Bendras visų įrenginių apdorojimo laikas neturėtų viršyti 2 valandų. Pritvirtinus 6 audinių pjūvius prie atraminių žiedų, buvo surinktas CTCM įrenginys. CTCM kultūros kamera iš anksto pripildyta 21 ml iš anksto deguonimi prisotintos terpės. Audinių pjūvius perkelkite į kultūros kamerą ir atsargiai pašalinkite oro burbuliukus pipete. Tada audinio pjūvis įkišamas į angą ir švelniai prispaudžiamas. Galiausiai uždedamas elektrodo dangtelis ant prietaiso ir prietaisas perkeliamas į inkubatorių. Tada prijunkite CTCM prie oro vamzdelio ir C-PACE-EM sistemos. Pneumatinė pavara atsidaro, o oro vožtuvas atidaro CTCM. C-PACE-EM sistema buvo sukonfigūruota tiekti 4 V įtampą 1,2 Hz dažniu dvifazinio stimuliavimo metu 2 ms. Terpė buvo keičiama du kartus per dieną, o elektrodai – kartą per dieną, siekiant išvengti grafito kaupimosi ant elektrodų. Jei reikia, audinių pjūvius galima išimti iš jų kultūros šulinėlių, kad būtų pašalinti visi oro burbuliukai, kurie galėjo patekti po jais. MT apdorojimo sąlygomis T3/Dex buvo įdedamas šviežias su kiekvienu terpės keitimu su 100 nM T3 ir 1 μM Dex. CTCM prietaisai buvo kultivuojami inkubatoriuje 37 °C temperatūroje ir 5 % CO2 atmosferoje.
Norint gauti ištemptas širdies pjūvių trajektorijas, buvo sukurta speciali kamerų sistema. Buvo naudojama veidrodinė kamera („Canon Rebel T7i“, „Canon“, Tokijas, Japonija) su „Navitar Zoom 7000 18–108 mm“ makroobjektyvu („Navitar“, San Franciskas, Kalifornija). Vizualizacija buvo atlikta kambario temperatūroje, pakeitus terpę nauja terpe. Kamera pastatyta 51° kampu, o vaizdo įrašas įrašomas 30 kadrų per sekundę greičiu. Pirmiausia, atvirojo kodo programinė įranga („MUSCLEMOTION43“) su „Image-J“ buvo naudojama širdies pjūvių judėjimui kiekybiškai įvertinti. Kaukė buvo sukurta naudojant MATLAB („MathWorks“, Natikas, Masačusetsas, JAV), siekiant apibrėžti plakančios širdies pjūvių dominančias sritis ir išvengti triukšmo. Rankiniu būdu segmentuotos kaukės taikomos visiems kadrų sekos vaizdams ir perduodamos į „MUSCLEMOTION“ papildinį. „Muscle Motion“ naudoja vidutinį pikselių intensyvumą kiekviename kadre, kad kiekybiškai įvertintų jo judėjimą atskaitos kadro atžvilgiu. Duomenys buvo įrašyti, filtruoti ir naudojami ciklo trukmei kiekybiškai įvertinti ir audinių tempimui širdies ciklo metu įvertinti. Įrašytas vaizdo įrašas buvo apdorotas naudojant pirmos eilės nulinės fazės skaitmeninį filtrą. Norint kiekybiškai įvertinti audinių tempimą (nuo piko iki piko), buvo atlikta piko iki piko analizė, siekiant atskirti įrašyto signalo pikus ir įdubas. Be to, tendencijų šalinimas atliekamas naudojant 6-os eilės polinomą, siekiant pašalinti signalo poslinkį. MATLAB aplinkoje buvo sukurtas programos kodas, skirtas nustatyti bendrą audinių judėjimą, ciklo laiką, relaksacijos laiką ir susitraukimo laiką (papildomas programos kodas 44).
Deformacijos analizei, naudodami tuos pačius vaizdo įrašus, sukurtus mechaninio tempimo vertinimui, pirmiausia pagal MUSCLEMOTION programinę įrangą nubraižėme du vaizdus, ​​vaizduojančius judėjimo pikus (aukščiausią (viršutinį) ir žemiausią (apatinį) judėjimo taškus). Tada segmentavome audinių sritis ir segmentuotam audiniui pritaikėme šešėliavimo algoritmą (papildomas 2a pav.). Segmentuotas audinys buvo padalintas į dešimt popaviršių, o įtempis kiekviename paviršiuje buvo apskaičiuotas pagal šią lygtį: Deformacija = (Į viršų - Žemyn) / Žemyn, kur Į viršų ir Žemyn yra formos atstumai nuo viršutinio ir apatinio audinio šešėlių (papildomas 2b pav.).
Širdies pjūviai 48 valandas buvo fiksuoti 4 % paraformaldehido tirpale. Fiksuoti audiniai 1 valandą buvo dehidratuoti 10 % ir 20 % sacharozės tirpale, o po to per naktį – 30 % sacharozės tirpale. Tuomet pjūviai buvo įterpti į optimalios pjovimo temperatūros junginį (OCT junginį) ir palaipsniui užšaldyti izopentano/sauso ledo vonelėje. OCT įterpimo blokelius laikyti -80 °C temperatūroje iki atskyrimo. Preparatai buvo paruošti kaip 8 μm storio pjūviai.
Norint pašalinti optinę koherentinę mikroskopiją (OCT) iš širdies pjūvių, stiklelius 5 minutes kaitinkite ant kaitinimo blokelio 95 °C temperatūroje. Į kiekvieną stiklelį įpilkite 1 ml PBS ir inkubuokite 30 minučių kambario temperatūroje, tada 15 minučių kambario temperatūroje permezkite pjūvius, nustatydami 0,1 % Triton-X PBS tirpalą. Kad nespecifiniai antikūnai neprisijungtų prie mėginio, į stiklelius įpilkite 1 ml 3 % BSA tirpalo ir inkubuokite 1 valandą kambario temperatūroje. Tada BSA buvo pašalintas, o stikleliai nuplauti PBS. Kiekvieną mėginį pažymėkite pieštuku. Per 90 minučių buvo pridėti pirminiai antikūnai (praskiesti 1:200 1 % BSA) (koneksinas 43 (Abcam; #AB11370), NFATC4 (Abcam; #AB99431) ir troponinas-T (Thermo Scientific; #MA5-12960), po to dar 90 minučių – antriniai antikūnai (praskiesti 1:200 1 % BSA) prieš pelės Alexa Fluor 488 (Thermo Scientific; #A16079) ir triušio Alexa Fluor 594 (Thermo Scientific; #T6391). Tris kartus plauti PBS. Norint atskirti taikinio dažymą nuo fono, kaip kontrolę naudojome tik antrinį antikūną. Galiausiai buvo pridėta DAPI branduolio dažų, o stikleliai buvo dedami į „Vectashield“ (Vector Laboratories) ir užsandarinami nagų laku. (-x didinimas) ir „Keyence“ mikroskopą su 40 kartų didinimu.
WGA dažymui buvo naudojamas WGA-Alexa Fluor 555 (Thermo Scientific; #W32464), kurio koncentracija buvo 5 μg/ml PBS tirpale, ir užpiltas ant fiksuotų pjūvių 30 minučių kambario temperatūroje. Tada stikleliai buvo plaunami PBS tirpalu, į kiekvieną stiklelį įpilama Sudano juodojo dažiklio ir inkubuojama 30 minučių. Tada stikleliai buvo plaunami PBS tirpalu ir įpilama „Vectashield“ įterpimo terpės. Stikleliai buvo vizualizuojami „Keyence“ mikroskopu 40 kartų didinimu.
OKT buvo pašalintas iš mėginių, kaip aprašyta aukščiau. Nuėmus OKT, preparatai per naktį panardinti į Bouin tirpalą. Tada preparatai 1 valandą buvo skalaujami distiliuotu vandeniu ir 10 minučių dedami į Bibrich alavijo rūgšties fuksino tirpalą. Tada preparatai nuplauti distiliuotu vandeniu ir 10 minučių panardinti į 5 % fosfomolibdeno/5 % fosfovolframo rūgšties tirpalą. Nenuplaunant, preparatai 15 minučių tiesiogiai perkelti į anilino mėlynojo tirpalą. Tada preparatai nuplauti distiliuotu vandeniu ir 2 minutėms panardinti į 1 % acto rūgšties tirpalą. Preparatai džiovinti 200 N etanolyje ir perkelti į ksileną. Nudažyti preparatai vizualizuoti naudojant Keyence mikroskopą su 10x objektyvu. Fibrozės ploto procentinė dalis buvo kiekybiškai įvertinta naudojant Keyence Analyzer programinę įrangą.
„CyQUANT™ MTT“ ląstelių gyvybingumo tyrimas (Invitrogen, Carlsbad, CA), katalogo numeris V13154, pagal gamintojo protokolą su tam tikrais pakeitimais. Visų pirma, MTT analizės metu buvo naudojamas 6 mm skersmens chirurginis perforatorius, siekiant užtikrinti vienodą audinio dydį. Audiniai buvo atskirai dedami į 12 šulinėlių plokštelės, kurioje buvo MTT substratas, šulinėlius pagal gamintojo protokolą. Pjūviai inkubuojami 37 °C temperatūroje 3 valandas, o gyvas audinys metabolizuoja MTT substratą ir sudaro purpurinį formazano junginį. MTT tirpalą pakeičiame 1 ml DMSO ir inkubuojame 37 °C temperatūroje 15 minučių, kad iš širdies pjūvių būtų išskirtas purpurinis formazanas. Mėginiai buvo praskiesti DMSO santykiu 1:10 96 šulinėlių skaidrių dugnų plokštelėse, o purpurinės spalvos intensyvumas matuojamas esant 570 nm bangos ilgiui naudojant „Cytation“ plokštelių skaitytuvą („BioTek“). Rodmenys buvo normalizuoti pagal kiekvieno širdies pjūvio svorį.
Širdies pjūvio terpė buvo pakeista terpe, kurioje yra 1 μCi/ml [5-3H]-gliukozės („Moravek Biochemicals“, Brea, Kalifornija, JAV), gliukozės panaudojimo tyrimui, kaip aprašyta anksčiau. Po 4 valandų inkubacijos į atvirą mikrocentrifūgos mėgintuvėlį, kuriame yra 100 µl 0,2 N HCl, įpilama 100 µl terpės. Tada mėgintuvėlis buvo įdėtas į scintiliacinį mėgintuvėlį, kuriame yra 500 μl dH2O, kad [3H]2O būtų garinamas 72 valandas 37 °C temperatūroje. Tada mikrocentrifūgos mėgintuvėlis išimamas iš scintiliacinio mėgintuvėlio ir įpilama 10 ml scintiliacinio skysčio. Scintiliaciniai skaičiavimai atlikti naudojant „Tri-Carb 2900TR“ skysčio scintiliacinį analizatorių („Packard Bioscience Company“, Meridenas, Konektikutas, JAV). Gliukozės panaudojimas buvo apskaičiuotas atsižvelgiant į [5-3H]-gliukozės specifinį aktyvumą, nepilną pusiausvyrą ir foną, [5-3H]- praskiedimą nežymėta gliukoze ir scintiliacinio skaitiklio efektyvumą. Duomenys normalizuoti pagal širdies pjūvių masę.
Po audinių homogenizavimo „Trizol“ tirpale, RNR buvo išskirta iš širdies pjūvių naudojant „Qiagen miRNeasy Micro Kit #210874“ pagal gamintojo protokolą. RNRsec bibliotekos paruošimas, sekvenavimas ir duomenų analizė buvo atlikti taip:
1 μg RNR vienam mėginiui buvo naudojama kaip pradinė medžiaga RNR bibliotekai paruošti. Sekvenavimo bibliotekos buvo sugeneruotos naudojant „NEBNext UltraTM“ RNR bibliotekos paruošimo rinkinį, skirtą „Illumina“ (NEB, JAV), laikantis gamintojo rekomendacijų, o kiekvieno mėginio atributų sekoms buvo pridėti indekso kodai. Trumpai tariant, mRNR buvo išgryninta iš bendros RNR naudojant magnetinius karoliukus, pritvirtintus poli-T oligonukleotidais. Fragmentacija atliekama naudojant dvivalenčius katijonus aukštoje temperatūroje NEBNext pirmosios grandinės sintezės reakcijos buferyje (5X). Pirmosios grandinės kDNR buvo susintetinta naudojant atsitiktinius heksamerinius pradmenis ir M-MuLV atvirkštinę transkriptazę (RNazė H-). Antrosios grandinės kDNR tada susintetinama naudojant DNR polimerazę I ir RNazę H. Likę išsikišę galai paverčiami bukais galais eksonukleazės/polimerazės aktyvumo būdu. Po DNR fragmento 3′ galo adenilinimo prie jo pritvirtinamas NEBNext adapteris su plaukų segtuko kilpos struktūra, kad būtų paruoštas hibridizacijai. Norint atrinkti pageidaujamo ilgio 150–200 bp kDNR fragmentus. Bibliotekos fragmentai buvo išgryninti naudojant AMPure XP sistemą (Beckman Coulter, Beverly, JAV). Tada 3 μl USER fermento (NEB, JAV) su pagal dydį atrinkta kDNR, liguota adapteriu, buvo naudojamas 15 minučių 37 °C temperatūroje, o po to 5 minutes 95 °C temperatūroje prieš PGR. PGR buvo atlikta naudojant „Phusion High-Fidelity“ DNR polimerazę, universalius PGR pradmenis ir Index (X) pradmenis. Galiausiai PGR produktai buvo išgryninti („AMPure XP“ sistema), o bibliotekos kokybė įvertinta naudojant „Agilent Bioanalyzer 2100“ sistemą. Tada kDNR biblioteka buvo sekvenuojama naudojant „Novaseq“ sekvenatorių. Neapdoroti vaizdo failai iš „Illumina“ buvo konvertuoti į neapdorotus nuskaitymus naudojant CASAVA bazių skambinimą. Neapdoroti duomenys saugomi FASTQ(fq) formato failuose, kuriuose yra nuskaitytos sekos ir atitinkamos bazinės savybės. Pasirinkite HISAT2, kad filtruoti sekvenavimo nuskaitymai atitiktų Sscrofa11.1 etaloninį genomą. Apskritai HISAT2 palaiko bet kokio dydžio genomus, įskaitant genomus, didesnius nei 4 milijardai bazių, o daugumai parametrų nustatytos numatytosios vertės. RNR sekos duomenų sujungimo nuskaitymai gali būti efektyviai suderinti naudojant HISAT2, greičiausią šiuo metu prieinamą sistemą, tokiu pat arba geresniu tikslumu nei bet kuris kitas metodas.
Transkriptų gausa tiesiogiai atspindi genų raiškos lygį. Genų raiškos lygis įvertinamas pagal su genomu arba egzonais susijusių transkriptų gausą (sekvenavimo skaičių). Nuskaitymų skaičius yra proporcingas genų raiškos lygiams, geno ilgiui ir sekvenavimo gyliui. FPKM (fragmentų skaičius tūkstančiame sekvenuotų transkriptų bazinių porų milijonui bazių porų) buvo apskaičiuotas ir diferencinės raiškos P reikšmės nustatytos naudojant DESeq2 paketą. Tada kiekvienai P reikšmei apskaičiavome klaidingų atradimų dažnį (FDR), naudodami Benjamini-Hochberg metodą9, pagrįstą integruota R funkcija „p.adjust“.
Iš širdies pjūvių išskirta RNR buvo paversta į 200 ng/μl koncentracijos kDNR, naudojant „Thermo“ „SuperScript IV Vilo Master“ mišinį („Thermo“, kat. nr. 11756050). Kiekybinė RT-PGR buvo atlikta naudojant „Applied Biosystems Endura Plate Microamp“ 384 šulinėlių skaidrią reakcijos plokštelę („Thermo“, kat. nr. 4483319) ir „Microamp“ optinius klijus („Thermo“, kat. nr. 4311971). Reakcijos mišinį sudarė 5 µl „Taqman Fast Advanced Master“ mišinio („Thermo“, kat. nr. 4444557), 0,5 µl „Taqman Primer“ ir 3,5 µl vandens, sumaišytų kiekviename šulinėlyje. Buvo atlikti standartiniai qPCR ciklai, o CT vertės buvo matuojamos naudojant „Applied Biosystems Quantstudio 5“ realaus laiko PGR prietaisą (384 šulinėlių modulis; produkto nr. A28135). „Taqman“ pradmenys buvo įsigyti iš „Thermo“ (GAPDH (Ss03375629_u1), PARP12 (Ss06908795_m1), PKDCC (Ss06903874_m1), CYGB (Ss06900188_m1), RGL1 (Ss06868890_m1), ACTN1 (Ss01009508_mH), GATA4 (Ss03383805_u1), GJA1 (Ss03374839_u1), COL1A2 (Ss03375009_u1), COL3A1 (Ss04323794_m1), ACTA2 (Ss04245588_m1). Visų mėginių CT reikšmės buvo normalizuotos pagal „namų ūkio“ geną GAPDH.
NT-ProBNP išsiskyrimas terpėje buvo įvertintas naudojant NT-ProBNP rinkinį (kiaulės) (kat. Nr. MBS2086979, „MyBioSource“) pagal gamintojo protokolą. Trumpai tariant, į kiekvieną šulinėlį du kartus buvo įpilta po 250 µl kiekvieno mėginio ir standarto. Iškart po mėginio įpylimo į kiekvieną šulinėlį įpilama 50 µl tyrimo reagento A. Plokštelę švelniai suplakite ir užsandarinkite sandarikliu. Tada tabletės buvo inkubuojamos 37 °C temperatūroje 1 valandą. Tada tirpalas išsiurbiamas ir šulinėlius 4 kartus plaunate 350 µl 1X plovimo tirpalo, kiekvieną kartą inkubuojant ploviklį 1–2 minutes. Tada į kiekvieną šulinėlį įpilama 100 µl tyrimo reagento B ir užsandarinama plokštelės sandarikliu. Tabletė buvo švelniai suplakama ir inkubuojama 37 °C temperatūroje 30 minučių. Tirpalas išsiurbiamas ir šulinėlius 5 kartus plaunate 350 µl 1X plovimo tirpalo. Į kiekvieną šulinėlį įpilkite 90 µl substrato tirpalo ir užsandarinkite plokštelę. Inkubuokite plokštelę 37 °C temperatūroje 10–20 minučių. Į kiekvieną šulinėlį įpilkite 50 µl stabdymo tirpalo. Plokštelė buvo nedelsiant išmatuota naudojant „Cytation“ (BioTek) plokštelių skaitytuvą, nustatytą ties 450 nm.
Buvo atlikta galios analizė, siekiant pasirinkti grupių dydžius, kurie užtikrins >80 % galią aptikti 10 % absoliutų parametro pokytį su 5 % I tipo paklaidos lygiu. Buvo atlikta galios analizė, siekiant pasirinkti grupių dydžius, kurie užtikrins >80 % galią aptikti 10 % absoliutų parametro pokytį su 5 % I tipo paklaidos lygiu. Анализ мощности был выполнен для выбора размеров групп, которые обеспечат >80% мощности для обнаружения для обнаружения изменения параметра с 5% частотой ошибок типа I. Buvo atlikta galios analizė, siekiant parinkti grupių dydžius, kurie užtikrintų >80 % galią aptikti 10 % absoliutų parametrų pokytį su 5 % I tipo paklaidų dažniu.进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％I型错误率的组大小.进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％I型错误率的组大小. Был проведен анализ мощности для выбора размера группы, который обеспечил бы > 80% мощности для обеспечил 10% изменения параметров и 5% частоты ошибок типа I. Buvo atlikta galios analizė, siekiant parinkti grupės dydį, kuris užtikrintų >80 % galią aptikti 10 % absoliutų parametrų pokytį ir 5 % I tipo klaidų dažnį.Audinių pjūviai buvo atsitiktinai parinkti prieš eksperimentą. Visos analizės buvo atliktos be išankstinio patvirtinimo, o mėginiai buvo dekoduoti tik išanalizavus visus duomenis. Visoms statistinėms analizėms atlikti buvo naudojama „GraphPad Prism“ programinė įranga (San Diegas, Kalifornija). Visiems statistiniams duomenims p reikšmės buvo laikomos reikšmingomis, kai reikšmės buvo <0,05. Visiems statistiniams duomenims p reikšmės buvo laikomos reikšmingomis, kai reikšmės buvo <0,05. Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. Visiems statistiniams duomenims p reikšmės buvo laikomos reikšmingomis, kai reikšmės buvo <0,05.对于所有统计数据，p 值在值<0,05 时被认为是显着的.对于所有统计数据，p 值在值<0,05 时被认为是显着的. Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. Visiems statistiniams duomenims p reikšmės buvo laikomos reikšmingomis, kai reikšmės buvo <0,05.Dvipusis Student'o t-testas buvo atliktas su duomenimis, atliekant tik 2 palyginimus. Vienfaktorinė arba dvifaktorinė ANOVA buvo naudojama reikšmingumui tarp kelių grupių nustatyti. Atliekant post hoc testus, siekiant atsižvelgti į kelis palyginimus, buvo taikoma Tukey korekcija. Skaičiuojant FDR ir p.adjust, RNAsec duomenys turi specialių statistinių aspektų, kaip aprašyta skyriuje „Metodai“.
Daugiau informacijos apie tyrimo dizainą rasite su šiuo straipsniu susietoje „Nature Research Report“ santraukoje.