Дзякуй за наведванне сайта Nature.com. Версія браўзера, якой вы карыстаецеся, мае абмежаваную падтрымку CSS. Для найлепшага карыстання рэкамендуем выкарыстоўваць абноўлены браўзер (або адключыць рэжым сумяшчальнасці ў Internet Explorer). Тым часам, каб забяспечыць бесперапынную падтрымку, мы будзем адлюстроўваць сайт без стыляў і JavaScript.
Існуе патрэба ў надзейнай сістэме in vitro, якая можа дакладна ўзнавіць фізіялагічнае асяроддзе сэрца для тэставання на лекі. Абмежаваная даступнасць сістэм культывавання тканін сэрца чалавека прывяла да недакладных інтэрпрэтацый эфектаў лекаў на сэрца. Тут мы распрацавалі мадэль культывавання тканін сэрца (КТКМ), якая электрамеханічна стымулюе зрэзы сэрца і падвяргаецца фізіялагічнаму расцяжэнню падчас сісталічнай і дыясталічнай фаз сардэчнага цыклу. Пасля 12 дзён культывавання гэты падыход часткова палепшыў жыццяздольнасць зрэзаў сэрца, але не цалкам захаваў іх структурную цэласнасць. Такім чынам, пасля скрынінга малых малекул мы выявілі, што даданне 100 нМ трыёдтыраніну (Т3) і 1 мкМ дэксаметазону (Дэкс) у наша асяроддзе падтрымлівала мікраструктуру зрэзаў на працягу 12 дзён. У спалучэнні з апрацоўкай Т3/Дэкс сістэма КТКМ падтрымлівала транскрыпцыйныя профілі, жыццяздольнасць, метабалічную актыўнасць і структурную цэласнасць на тым жа ўзроўні, што і свежая тканіна сэрца на працягу 12 дзён. Акрамя таго, празмернае расцяжэнне сардэчнай тканіны ў культуры выклікае гіпертрафічную сардэчную сігналізацыю, што сведчыць аб здольнасці КТКМ імітаваць гіпертрафічныя станы, выкліканыя расцяжэннем сэрца. У заключэнне, КТКМ можа мадэляваць фізіялогію і патафізіялогію сэрца ў культуры на працягу працяглых перыядаў часу, што дазваляе надзейна праводзіць скрынінг лекаў.
Перад клінічнымі даследаваннямі неабходныя надзейныя сістэмы in vitro, якія могуць дакладна ўзнавіць фізіялагічнае асяроддзе сэрца чалавека. Такія сістэмы павінны імітаваць змененыя механічнае расцяжэнне, частату сардэчных скарачэнняў і электрафізіялагічныя ўласцівасці. Мадэлі на жывёлах звычайна выкарыстоўваюцца ў якасці скрынінгавай платформы для фізіялогіі сэрца з абмежаванай надзейнасцю ў адлюстраванні ўздзеяння лекаў на сэрца чалавека1,2. У рэшце рэшт, ідэальная эксперыментальная мадэль культуры сардэчнай тканіны (CTCM) - гэта мадэль, якая з'яўляецца вельмі адчувальнай і спецыфічнай для розных тэрапеўтычных і фармакалагічных умяшанняў, дакладна ўзнаўляе фізіялогію і патафізіялогію сэрца чалавека3. Адсутнасць такой сістэмы абмяжоўвае адкрыццё новых метадаў лячэння сардэчнай недастатковасці4,5 і прывяла да кардыятаксічнасці лекаў як асноўнай прычыны сыходу з рынку6.
За апошняе дзесяцігоддзе восем несардэчна-сасудзістых прэпаратаў былі выведзены з клінічнага прымянення, паколькі яны выклікаюць падаўжэнне інтэрвалу QT, што прыводзіць да жалудачкавых арытмій і раптоўнай смерці7. Такім чынам, існуе ўсё большая патрэба ў надзейных даклінічных стратэгіях скрынінгу для ацэнкі эфектыўнасці і таксічнасці сардэчна-сасудзістых прэпаратаў. Нядаўняе выкарыстанне кардыяміяцытаў, атрыманых з плюрыпатэнтных ствалавых клетак чалавека (hiPS-CM), у скрынінгу лекаў і тэставанні на таксічнасць забяспечвае частковае рашэнне гэтай праблемы. Аднак няспелая прырода hiPS-CM і адсутнасць шматклеткавай складанасці сардэчнай тканіны з'яўляюцца асноўнымі абмежаваннямі гэтага метаду. Нядаўнія даследаванні паказалі, што гэта абмежаванне можна часткова пераадолець, выкарыстоўваючы раннія hiPS-CM для фарміравання гідрагеляў сардэчнай тканіны неўзабаве пасля пачатку спантанных скарачэнняў і паступова павялічваючы электрычную стымуляцыю з цягам часу. Аднак гэтым мікратканам hiPS-CM не хапае сталых электрафізіялагічных і скарачальных уласцівасцей дарослага міякарда. Акрамя таго, сардэчная тканіна чалавека мае больш складаную структуру, якая складаецца з гетэрагеннай сумесі розных тыпаў клетак, уключаючы эндатэліяльныя клеткі, нейроны і стромальныя фібрабласты, злучаныя паміж сабой спецыфічнымі наборамі бялкоў пазаклеткавага матрыкса. Гэтая неаднароднасць папуляцый некардыяміяцытаў11,12,13 у сэрцы дарослых млекакормячых з'яўляецца асноўнай перашкодай для мадэлявання сардэчнай тканіны з выкарыстаннем асобных тыпаў клетак. Гэтыя асноўныя абмежаванні падкрэсліваюць важнасць распрацоўкі метадаў культывавання непашкоджанай міякардыяльнай тканіны ў фізіялагічных і паталагічных умовах.
Культываваныя тонкія (300 мкм) зрэзы чалавечага сэрца аказаліся перспектыўнай мадэллю цэлага міякарда чалавека. Гэты метад забяспечвае доступ да поўнай трохмернай шматклеткавай сістэмы, падобнай да тканіны сэрца чалавека. Аднак да 2019 года выкарыстанне культываваных зрэзаў сэрца было абмежавана кароткім (24 гадзіны) тэрмінам выжывання культуры. Гэта звязана з шэрагам фактараў, у тым ліку з адсутнасцю фізіка-механічнага расцяжэння, паверхняй падзелу паветра-вадкасць і выкарыстаннем простых асяроддзяў, якія не задавальняюць патрэбы сардэчнай тканіны. У 2019 годзе некалькі даследчых груп паказалі, што ўключэнне механічных фактараў у сістэмы культывавання сардэчнай тканіны можа падоўжыць тэрмін службы культуры, палепшыць экспрэсію сардэчнай функцыі і імітаваць паталогію сардэчнай функцыі. Два элегантныя даследаванні 17 і 18 паказваюць, што аднавосевая механічная нагрузка станоўча ўплывае на фенатып сэрца падчас культывавання. Аднак у гэтых даследаваннях не выкарыстоўвалася дынамічная трохмерная фізіка-механічная нагрузка сардэчнага цыклу, паколькі зрэзы сэрца нагружаліся альбо ізаметрычнымі сіламі расцяжэння 17, альбо лінейнай аўксатоннай нагрузкай 18. Гэтыя метады расцяжэння тканін прывялі да падаўлення многіх сардэчных генаў або празмернай экспрэсіі генаў, звязаных з анамальнымі рэакцыямі расцяжэння. Варта адзначыць, што Пітуліс і інш.19 распрацавалі дынамічную ванну для культывавання зрэзаў сэрца для рэканструкцыі сардэчнага цыклу з выкарыстаннем зваротнай сувязі па сілавых датчыках і прывадаў нацяжэння. Нягледзячы на ​​тое, што гэтая сістэма дазваляе больш дакладна мадэляваць сардэчны цыкл in vitro, складанасць і нізкая прапускная здольнасць метаду абмяжоўваюць яго прымяненне. Наша лабараторыя нядаўна распрацавала спрошчаную сістэму культывавання з выкарыстаннем электрычнай стымуляцыі і аптымізаванага асяроддзя для падтрымання жыццяздольнасці зрэзаў сардэчнай тканіны свінні і чалавека да 6 дзён20,21.
У гэтым рукапісе мы апісваем мадэль культуры сардэчнай тканіны (КТКМ) з выкарыстаннем зрэзаў свінога сэрца, якая ўключае гумаральныя сігналы для трохмернага адлюстравання фізіялогіі сэрца і патафізіялагічнага расцяжэння падчас сардэчнага цыклу. Гэтая КТКМ можа павысіць дакладнасць даклінічнага прагназавання лекаў да ўзроўню, які раней ніколі не дасягаўся, забяспечваючы эканамічна эфектыўную сардэчную сістэму сярэдняй прадукцыйнасці, якая імітуе фізіялогію/патафізіялогію сэрца млекакормячых для даклінічных выпрабаванняў лекаў.
Гемадынамічныя механічныя сігналы адыгрываюць важную ролю ў падтрыманні функцыі кардыяміяцытаў in vitro 22,23,24. У гэтым рукапісе мы распрацавалі CTCM (малюнак 1a), які можа імітаваць сардэчнае асяроддзе дарослага чалавека, выклікаючы як электрычную, так і механічную стымуляцыю на фізіялагічных частотах (1,2 Гц, 72 удары ў хвіліну). Каб пазбегнуць празмернага расцяжэння тканіны падчас дыясталы, для павелічэння памеру тканіны на 25% была выкарыстана прылада 3D-друку (мал. 1b). Электрычная стымуляцыя, выкліканая сістэмай C-PACE, была зададзена так, каб пачынацца за 100 мс да сістолы з выкарыстаннем сістэмы збору дадзеных для поўнага ўзнаўлення сардэчнага цыклу. Сістэма культывавання тканін выкарыстоўвае праграмуемы пнеўматычны прывад (LB Engineering, Германія) для цыклічнага пашырэння гнуткай сіліконавай мембраны, каб выклікаць пашырэнне зрэзаў сэрца ў верхняй камеры. Сістэма была падключана да знешняй паветранай лініі праз датчык ціску, што дазволіла дакладна рэгуляваць ціск (± 1 мм рт.сл.) і час (± 1 мс) (мал. 1c).
а) Прымацуйце зрэз тканіны да 7-міліметровага апорнага кольца, паказанага сінім колерам, унутры камеры для культывавання прылады. Камера для культывавання аддзелена ад паветранай камеры тонкай гнуткай сіліконавай мембранай. Змесціце пракладку паміж кожнай камерай, каб прадухіліць уцечкі. Вечка прылады змяшчае графітавыя электроды, якія забяспечваюць электрычную стымуляцыю. b) Схематычнае адлюстраванне прылады для вялікіх тканін, накіроўвальнага кольца і апорнага кольца. Зрэзы тканіны (карычневага колеру) размяшчаюцца на павялічанай прыладзе, прычым накіроўвальнае кольца змяшчаюцца ў пазу на вонкавым краі прылады. Выкарыстоўваючы накіроўвальную, асцярожна размясціце апорнае кольца, пакрытае тканінным акрылавым клеем, на зрэз сардэчнай тканіны. c) Графік, які паказвае час электрычнай стымуляцыі ў залежнасці ад ціску ў паветранай камеры, якім кіруе праграмуемы пнеўматычны прывад (PPD). Для сінхранізацыі электрычнай стымуляцыі з дапамогай датчыкаў ціску выкарыстоўвалася прылада збору дадзеных. Калі ціск у камеры для культывавання дасягае зададзенага парога, імпульсны сігнал пасылаецца на C-PACE-EM для запуску электрычнай стымуляцыі. d) Выява чатырох CTCM, размешчаных на паліцы інкубатара. Чатыры прылады падключаны да аднаго PPD праз пнеўматычны ланцуг, а датчыкі ціску ўстаўлены ў гемастатычны клапан для кантролю ціску ў пнеўматычным ланцугу. Кожная прылада змяшчае шэсць зрэзаў тканіны.
Выкарыстоўваючы адзін пнеўматычны прывад, мы змаглі кіраваць 4 прыладамі CTCM, кожная з якіх магла змясціць 6 зрэзаў тканіны (мал. 1d). У CTCM ціск паветра ў паветранай камеры пераўтвараецца ў сінхронны ціск у камеры вадкасці і выклікае фізіялагічнае пашырэнне зрэзу сэрца (мал. 2a і дадатковы фільм 1). Ацэнка расцяжэння тканіны пры ціску 80 мм рт.сл. паказала расцяжэнне зрэзаў тканіны на 25% (мал. 2b). Было паказана, што гэтае працэнтнае расцяжэнне адпавядае фізіялагічнай даўжыні саркамера 2,2–2,3 мкм для нармальнай скарачальнасці зрэзу сэрца17,19,25. Рух тканіны ацэньваўся з дапамогай карыстальніцкіх налад камеры (дадатковы малюнак 1). Амплітуда і хуткасць руху тканіны (мал. 2c, d) адпавядалі расцяжэнню падчас сардэчнага цыклу і часу падчас сістолы і дыясталы (мал. 2b). Расцяжэнне і хуткасць сардэчнай тканіны падчас скарачэння і расслаблення заставаліся пастаяннымі на працягу 12 дзён у культуры (мал. 2f). Каб ацаніць уплыў электрычнай стымуляцыі на скарачальнасць падчас культывавання, мы распрацавалі метад вызначэння актыўнай дэфармацыі з выкарыстаннем алгарытму зацянення (дадатковы мал. 2a,b) і змаглі адрозніць дэфармацыі з электрычнай стымуляцыяй і без яе. Той жа зрэз сэрца (мал. 2f). У рухомай вобласці разрэзу (R6-9) напружанне падчас электрычнай стымуляцыі было на 20% вышэй, чым пры адсутнасці электрычнай стымуляцыі, што сведчыць пра ўклад электрычнай стымуляцыі ў скарачальную функцыю.
Тыповыя траекторыі вымярэнняў ціску ў паветранай камеры, ціску ў вадкаснай камеры і руху тканін пацвярджаюць, што ціск у камеры змяняе ціск у вадкаснай камеры, выклікаючы адпаведны рух зрэзу тканіны. b Тыповыя траекторыі працэнтнага расцяжэння (сіні колер) зрэзаў тканіны, якія адпавядаюць працэнтнаму расцяжэнню (аранжавы колер). c Вымераны рух сардэчнага зрэзу адпавядае вымеранай хуткасці руху. (d) Тыповыя траекторыі цыклічнага руху (сіняя лінія) і хуткасці (аранжавая пункцірная лінія) у зрэзе сэрца. e Колькасная ацэнка часу цыклу (n = 19 зрэзаў у групе, ад розных свіней), часу скарачэння (n = 19 зрэзаў у групе), часу рэлаксацыі (n = 19 зрэзаў у групе, ад розных свіней), руху тканіны (n = 25 зрэзаў)/група ад розных свіней), пікавай сісталічнай хуткасці (n = 24(D0), 25(D12) зрэзаў/група ад розных свіней) і пікавай хуткасці рэлаксацыі (n = 24(D0), 25(D12) зрэзаў/група ад розных свіней). Двухбаковы t-крытэрый Стьюдэнта не паказаў істотнай розніцы ні ў адным з параметраў. Тыповыя сляды аналізу дэфармацыі зрэзаў тканін з (чырвоны) і без (сіні) электрычнай стымуляцыі, дзесяць рэгіянальных участкаў зрэзаў тканін з аднаго і таго ж зрэзу. Ніжнія панэлі паказваюць колькасную ацэнку працэнтнай розніцы ў дэфармацыі ў зрэзах тканін з электрычнай стымуляцыяй і без яе ў дзесяці ўчастках з розных зрэзаў. (n = 8 зрэзаў/група ад розных свіней, праведзены двухбаковы t-крытэрый Стьюдэнта; ****p < 0,0001, **p < 0,01, *p < 0,05). (n = 8 зрэзаў/група ад розных свіней, праведзены двухбаковы t-крытэрый Стьюдэнта; ****p < 0,0001, **p < 0,01, *p < 0,05). (n = 8 зрэзаў/групу ад розных свіней, праводзіцца двухбаковы t-крытэрый Сцюдэнта; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05). (n = 8 зрэзаў/група ад розных свіней, двухбаковы t-крытэрый Стьюдэнта; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05). （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p <0,0001，**p<0,01，*p<0,05）. （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p <0,0001，**p<0,01，*p<0,05）. (n = 8 срэзаў/групу, ад розных свіней, двухбаковы крытэрый Сцюдэнта; ****p <0,0001, **p <0,01, *p <0,05). (n = 8 зрэзаў/група, ад розных свіней, двухбаковы t-крытэрый Стьюдэнта; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05).Палоскі памылак прадстаўляюць сярэдняе значэнне ± стандартнае адхіленне.
У нашай папярэдняй статычнай біяміметычнай сістэме культывавання зрэзаў сэрца [20, 21] мы падтрымлівалі жыццяздольнасць, функцыянальнасць і структурную цэласнасць зрэзаў сэрца на працягу 6 дзён, ужываючы электрычную стымуляцыю і аптымізуючы склад асяроддзя. Аднак праз 10 дзён гэтыя паказчыкі рэзка знізіліся. Мы будзем спасылацца на зрэзы, культываваныя ў нашай папярэдняй статычнай біяміметычнай сістэме культывавання 20, 21 у кантрольных умовах (Ctrl), і мы будзем выкарыстоўваць наша раней аптымізаванае асяроддзе ў якасці ўмоў MC і культывавання пры адначасовай механічнай і электрычнай стымуляцыі (CTCM). Спачатку мы вызначылі, што механічная стымуляцыя без электрычнай стымуляцыі была недастатковай для падтрымання жыццяздольнасці тканіны на працягу 6 дзён (Дадатковы мал. 3a,b). Цікава, што з увядзеннем фізія-механічнай і электрычнай стымуляцыі з выкарыстаннем STCM жыццяздольнасць 12-дзённых зрэзаў сэрца заставалася такой жа, як і ў свежых зрэзах сэрца ва ўмовах MS, але не ва ўмовах Ctrl, як паказаў MTT-аналіз (мал. 1). 3a). Гэта сведчыць аб тым, што механічная стымуляцыя і мадэляванне сардэчнага цыклу могуць падтрымліваць жыццяздольнасць зрэзаў тканіны ўдвая даўжэй, чым паведамлялася ў нашай папярэдняй статычнай сістэме культывавання. Аднак ацэнка структурнай цэласнасці зрэзаў тканін шляхам імунамалявання сардэчнага трапаніну Т і канексіну 43 паказала, што экспрэсія канексіну 43 была значна вышэйшай у тканінах сардэчнага тракта на 12-ы дзень, чым у кантрольнай групе ў той жа дзень. Аднак аднастайная экспрэсія канексіну 43 і ўтварэнне Z-дыскаў не былі цалкам захаваны (мал. 3b). Мы выкарыстоўваем сістэму штучнага інтэлекту (ШІ) для колькаснай ацэнкі структурнай цэласнасці тканін26, канвеер глыбокага навучання на аснове малюнкаў, заснаваны на афарбоўванні трапаніну-Т і канексіну43, для аўтаматычнай колькаснай ацэнкі структурнай цэласнасці і флуарэсцэнцыі зрэзаў сэрца з пункту гледжання сілы лакалізацыі. Гэты метад выкарыстоўвае згортачную нейронную сетку (CNN) і сістэму глыбокага навучання для надзейнай колькаснай ацэнкі структурнай цэласнасці сардэчнай тканіны аўтаматызаваным і непрадузятым чынам, як апісана ў спасылцы26. Тканка сардэчнага тракта прадэманстравала палепшанае структурнае падабенства да 0-га дня ў параўнанні са статычнымі кантрольнымі зрэзамі. Акрамя таго, трыхромнае афарбоўванне па Масану выявіла значна меншы працэнт фіброзу ва ўмовах МС у параўнанні з кантрольнымі ўмовамі на 12-ы дзень культывавання (мал. 3c). Нягледзячы на ​​тое, што CTCM павялічыў жыццяздольнасць зрэзаў сардэчнай тканкі на 12-ы дзень да ўзроўню, падобнага да ўзроўню свежай сардэчнай тканкі, ён не прывёў да істотнага паляпшэння структурнай цэласнасці зрэзаў сэрца.
Слупковая дыяграма паказвае колькасную ацэнку жыццяздольнасці MTT свежых зрэзаў сэрца (D0) або культуры зрэзаў сэрца на працягу 12 дзён альбо ў статычнай культуры (D12 Ctrl), альбо ў CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) зрэзаў/група ад розных свіней, праведзены аднабаковы ANOVA-тэст; ####p < 0,0001 у параўнанні з D0 і **p < 0,01 у параўнанні з D12 Ctrl). Слупковая дыяграма паказвае колькасную ацэнку жыццяздольнасці MTT свежых зрэзаў сэрца (D0) або культуры зрэзаў сэрца на працягу 12 дзён альбо ў статычнай культуры (D12 Ctrl), альбо ў CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) зрэзаў/група ад розных свіней, праведзены аднабаковы дысперсійны аналіз; ####p < 0,0001 у параўнанні з D0 і **p < 0,01 у параўнанні з D12 Ctrl).Гістаграма паказвае колькасную ацэнку жыццяздольнасці свежых зрэзаў сэрца, атрыманых метадам MTT (D0), або культуры зрэзаў сэрца на працягу 12 дзён у статычнай культуры (кантроль D12) або CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (кантроль D12).) ), 12 (D12 MC) зрэзаў/групы ад розных свіней, праводзіцца аднафактарны тэст ANOVA;####p < 0,0001 у параўнанні з D0 і **p < 0,01 у параўнанні з D12 Ctrl). ####p < 0,0001 у параўнанні з D0 і **p < 0,01 у параўнанні з D12 (Ctrl). a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切片(D0)或心脏切片培养12 天的MTT 活力的量化)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA测试；与D0 相比，####p < 0,0001，与D12 Ctrl 相比，**p <0,01)。 a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切片(D0) ，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向 ANOVA 测试；与D0 相比，####p < 0,0001，与D12 Ctrl相比，**p。)гістаграма, якая паказвае колькасную ацэнку жыццяздольнасці MTT у свежых зрэзах сэрца (D0) або зрэзах сэрца, культываваных на працягу 12 дзён у статычнай культуры (D12 кантроль) або CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 кантроль)), 12 (D12 MC) зрэзаў/групы ад розных свіней, аднафактарны тэст ANOVA;####p < 0,0001 у параўнанні з D0, **p < 0,01 у параўнанні з D12 Ctrl). ####p < 0,0001 у параўнанні з D0, **p < 0,01 у параўнанні з D12 (Ctrl).b Трапанін-T (зялёны), канексін 43 (чырвоны) і DAPI (сіні) у свежавылучаных зрэзах сэрца (D0) або зрэзах сэрца, культываваных у статычных умовах (Ctrl) або ўмовах CTCM (MC) на працягу 12 дзён) рэпрэзентатыўных імунафлуарэсцэнтных малюнкаў (шкала пустога прабору = 100 мкм). Колькасная ацэнка структурнай цэласнасці сардэчнай тканіны з дапамогай штучнага інтэлекту (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) зрэзаў/групы ад розных свіней, праведзены аднафактарны дысперсійны аналіз; ####p < 0,0001 у параўнанні з D0 і ****p < 0,0001 у параўнанні з D12 Ctrl). Колькасная ацэнка структурнай цэласнасці сардэчнай тканіны з дапамогай штучнага інтэлекту (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) зрэзаў/групы ад розных свіней, праведзены аднафактарны дысперсійны аналіз; ####p < 0,0001 у параўнанні з D0 і ****p < 0,0001 у параўнанні з D12 Ctrl). Количественная ацэнка структурнай цэласнасці сардэчнай тканіны штучным інтэлектам (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) зрэзаў/груп ад розных свіней, праводзіцца аднафактарны тэст ANOVA; ####p < 0,0001 у параўнанні з D0 і ****p < 0,0001 у параўнанні з D12 Ctrl). Колькасная ацэнка структурнай цэласнасці сардэчнай тканіны з дапамогай штучнага інтэлекту (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) зрэзаў/груп ад розных свіней, праведзены аднафактарны дысперсійны аналіз; ####p < 0,0001 у параўнанні з D0 і ****p < 0,0001 у параўнанні з D12 Ctrl).人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) зрэзаў/група кожнай з розных свіней, аднабаковы тэст ANOVA;####p < 0,0001 与D0相比，****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）。人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) зрэзаў/груп кожны з розных свіней, аднабаковы тэст ANOVA;####p < 0,0001与D0相比，****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）。 Искусственный інтэлект для колькаснай ацэнкі структурнай цэласнасці сардэчнай тканіны (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) срэзаў/групу кожнай з розных свіней, аднабаковы тэст ANOVA; ####p <0,0001 супраць D0 Для параўнання ****p <0,0001 у параўнанні з D12 Ctrl). Штучны інтэлект для колькаснай ацэнкі структурнай цэласнасці сардэчнай тканіны (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) зрэзаў/групы кожнай з розных свіней, аднафактарны тэст ANOVA; ####p<0,0001 супраць .D0 Для параўнання ****p < 0,0001 у параўнанні з D12 Ctrl). c Тыповыя выявы (злева) і колькасная ацэнка (справа) для зрэзаў сэрца, афарбаваных трыхромным фарбавальнікам Масона (Scale hole = 500 мкм) (n = 10 зрэзаў/група, кожны з якіх ад розных свіней, праведзены аднафактарны дысперсійны аналіз; ####p < 0,0001 у параўнанні з D0 і ***p < 0,001 у параўнанні з D12 Ctrl). c Тыповыя выявы (злева) і колькасная ацэнка (справа) для зрэзаў сэрца, афарбаваных трыхромным фарбавальнікам Масона (Scale hole = 500 мкм) (n = 10 зрэзаў/група ад розных свіней, праведзены аднафактарны дысперсійны аналіз; #### p < 0,0001 у параўнанні з D0 і ***p < 0,001 у параўнанні з D12 Ctrl). c Рэпрэзентатыўныя выявы (слева) і колькасная ацэнка (справа) зрэзаў сэрца, афарбаваных троххромным красіцелем Массона (масштаб без пакрыцця = 500 мкм) (n = 10 срэзаў/групу ад розных свіней, выконваецца аднабаковы тэст ANOVA; #### p < 0,0001 у параўнанні з D0 і ***p < 0,001 у параўнанні з D12 Ctrl). c Тыповыя выявы (злева) і колькасная ацэнка (справа) зрэзаў сэрца, афарбаваных трыхромным фарбавальнікам Масона (непакрытая шкала = 500 мкм) (n = 10 зрэзаў/група ад розных свіней, праведзены аднафактарны дысперсійны аналіз; #### p < 0,0001 у параўнанні з D0 і ***p < 0,001 у параўнанні з D12 Ctrl). c 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像（左）和量化（右）（裸尺度= 500 мкм）（n = 10 个切片/组，每组来自不同的猪，进行单向 ANOVA 测试；#### p < 0,0001 与D0 相比，***p < 0,001 与D12 Ctrl相比）. C 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 （左 左） 量化 （右） 裸尺度 裸尺度 裸尺度裸尺度 = 500 мкм） （n = 10 个 切片 组 每 组 来自 不同 猪 ， 进行 单向 单向 Anova 测试；#### p < 0,0001 与D0 相比，***p < 0,001 与D12 Ctrl 相比）。 c Рэпрэзентатыўныя выявы (слева) і колькасны аналіз (справа) зрэзаў сэрца, афарбаваных троххромным красіцелем Массона (чыстая шкала = 500 мкм) (n = 10 срэзаў/група, кожная ад іншай свіні, пратэставана з дапамогай аднафактарнага дысперсійнага аналізу ;### #p < 0,0001 у параўнанні з D0, ***p < 0,001 у параўнанні з D12 Ctrl). c Тыповыя выявы (злева) і колькасная ацэнка (справа) зрэзаў сэрца, афарбаваных трыхромным фарбавальнікам Масона (пусты проба = 500 мкм) (n = 10 зрэзаў/група, кожны з розных свіней, правераны аднабаковым дысперсійным аналізам;### # p < 0,0001 у параўнанні з D0, ***p < 0,001 у параўнанні з D12 Ctrl).Палоскі памылак прадстаўляюць сярэдняе значэнне ± стандартнае адхіленне.
Мы выказалі гіпотэзу, што даданне малых малекул у культуральнае асяроддзе можа палепшыць цэласнасць кардыяміяцытаў і знізіць развіццё фіброзу падчас культывавання CTCM. Таму мы правялі скрынінг малых малекул з выкарыстаннем нашых статычных кантрольных культур20,21 з-за невялікай колькасці змешваючых фактараў. Для гэтага скрынінга былі абраныя дэксаметазон (Dex), трыёдтыранін (T3) і SB431542 (SB). Гэтыя малыя малекулы раней выкарыстоўваліся ў культурах hiPSC-CM для індукцыі паспявання кардыяміяцытаў шляхам павелічэння даўжыні саркамера, Т-канальчыкаў і хуткасці праводнасці. Акрамя таго, вядома, што як Dex (глюкакартыкоід), так і SB падаўляюць запаленне29,30. Таму мы праверылі, ці палепшыць уключэнне адной або камбінацыі гэтых малых малекул структурную цэласнасць зрэзаў сэрца. Для першапачатковага скрынінга доза кожнага злучэння была выбрана на аснове канцэнтрацый, якія звычайна выкарыстоўваюцца ў мадэлях клетачных культур (1 мкМ Dex27, 100 нМ T327 і 2,5 мкМ SB31). Пасля 12 дзён культывавання камбінацыя Т3 і дэксаметазону прывяла да аптымальнай структурнай цэласнасці кардыяміяцытаў і мінімальнай фібрознай перабудовы (дадатковыя малюнкі 4 і 5). Акрамя таго, выкарыстанне падвойных або ўдвая большых канцэнтрацый Т3 і дэксаметазону аказала шкодныя наступствы ў параўнанні з нармальнымі канцэнтрацыямі (дадатковыя малюнкі 6a,b).
Пасля першапачатковага скрынінга мы правялі параўнанне 4 умоў культывавання (малюнак 4a): Ctrl: зрэзы сэрца, культываваныя ў раней апісанай намі статычнай культуры з выкарыстаннем аптымізаванага асяроддзя; 20.21 TD: T3 і Ctrl з даданнем дэксаметазону ў сераду; MC: зрэзы сэрца, культываваныя ў CTCM з выкарыстаннем раней аптымізаванага асяроддзя; і MT: CTCM з даданнем T3 і дэксаметазону ў асяроддзе. Пасля 12 дзён культывавання жыццяздольнасць тканін MS і MT заставалася такой жа, як і ў свежых тканінах, ацэненых з дапамогай MTT-аналізу (мал. 4b). Цікава, што даданне T3 і дэксаметазону да транслункавых культур (TD) не прывяло да значнага паляпшэння жыццяздольнасці ў параўнанні з умовамі Ctrl, што сведчыць аб важнай ролі механічнай стымуляцыі ў падтрыманні жыццяздольнасці зрэзаў сэрца.
Дыяграма эксперыментальнага плана, якая адлюстроўвае чатыры ўмовы культывавання, якія выкарыстоўваліся для ацэнкі эфектаў механічнай стымуляцыі і дадання T3/Dex на асяроддзе на працягу 12 дзён. b Слупковая дыяграма паказвае колькасную ацэнку жыццяздольнасці праз 12 дзён пасля культывавання ва ўсіх 4 умовах культывавання (Ctrl, TD, MC і MT) у параўнанні са свежымі зрэзамі сэрца (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD і D12 MT), 12 (D12 MC) зрэзаў/групы ад розных свіней, праведзены аднафактарны дысперсійны аналіз; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 у параўнанні з D0 і **p < 0,01 у параўнанні з D12 Ctrl). b Слупковая дыяграма паказвае колькасную ацэнку жыццяздольнасці праз 12 дзён пасля культывавання ва ўсіх 4 умовах культывавання (Ctrl, TD, MC і MT) у параўнанні са свежымі зрэзамі сэрца (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD і D12 MT), 12 (D12 MC) зрэзаў/групы ад розных свіней, праведзены аднафактарны дысперсійны аналіз; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 у параўнанні з D0 і **p < 0,01 у параўнанні з D12 ctrl). b Гістаграма паказвае дастатковую ацэнку працаздольнасці праз 12 дзён пасля культывавання ва ўсіх 4 умовах культывавання (кантроль, TD, MC і MT) у параўнанні са свежымі зрэзамі сэрца (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD і D12 MT), 12 (D12 MC) срэзаў/групу ад розных свіней, вырабляецца аднабаковы тэст ANOVA; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 у параўнанні з D0 і **p < 0,01 у параўнанні з D12 Ctrl). b Слупковая дыяграма паказвае колькасную ацэнку жыццяздольнасці праз 12 дзён пасля культывавання ва ўсіх 4 умовах культывавання (кантроль, TD, MC і MT) у параўнанні са свежымі зрэзамі сэрца (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD і D12 MT), 12 (D12 MC) зрэзаў/група ад розных свіней, аднафактарны тэст ANOVA; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 у параўнанні з D0 і **p < 0,01 у параўнанні з D12 Ctrl). b 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) (n = 18 (D0)、15 (D12 Ctrl、D12 TD和D12 MT), 来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向 ANOVA 测试；####p < 0,0001，###p < 0,001 与D0相比，**p <0,01 与D12控制）.b 4 12 (D12 MC) b Гістаграма, якая паказвае ўсе 4 умовы культывавання (кантроль, TD, MC і MT) у параўнанні са свежымі зрэзамі сэрца (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD і D12 MT), ад розных свіней 12 (D12 MC) срэзы/група, аднабаковы тэст ANOVA; ####p <0,0001, ###p <0,001 у параўнанні з D0, **p <0,01 у параўнанні з кантролем D12). b Гістаграма, якая паказвае ўсе 4 умовы культывавання (кантроль, TD, MC і MT) у параўнанні са свежымі зрэзамі сэрца (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD і D12 MT), ад розных свіней 12 (D12 MC) зрэзаў/група, аднабаковы тэст ANOVA; ####p<0,0001, ###p<0,001 у параўнанні з D0, **p<0,01 у параўнанні з кантролем D12). c Слупковая дыяграма паказвае колькасную ацэнку патоку глюкозы праз 12 дзён пасля культывавання ва ўсіх 4 умовах культывавання (Ctrl, TD, MC і MT) у параўнанні са свежымі зрэзамі сэрца (D0) (n = 6 зрэзаў/група ад розных свіней, праведзены аднафактарны ANOVA-тэст; ###p < 0,001 у параўнанні з D0 і ***p < 0,001 у параўнанні з D12 Ctrl). c Слупковая дыяграма паказвае колькасную ацэнку патоку глюкозы праз 12 дзён пасля культывавання ва ўсіх 4 умовах культывавання (Ctrl, TD, MC і MT) у параўнанні са свежымі зрэзамі сэрца (D0) (n = 6 зрэзаў/група ад розных свіней, праведзены аднафактарны ANOVA-тэст; ###p < 0,001 у параўнанні з D0 і ***p < 0,001 у параўнанні з D12 Ctrl). c Гістограмма паказвае колькасную ацэнку патоку глюкозы праз 12 дзён пасля культывавання ва ўсіх 4 умовах культывавання (кантроль, TD, MC і MT) у параўнанні са свежымі зрэзамі сэрца (D0) (n = 6 зрэзаў/групу ад розных свіней, аднабаковы Выконваецца тэст ANOVA; ###p < 0,001 у параўнанні з D0 і ***p < 0,001 у параўнанні з D12 Ctrl). Гістаграма паказвае колькасную ацэнку патоку глюкозы праз 12 дзён пасля культывавання ва ўсіх 4 умовах культывавання (кантроль, TD, MC і MT) у параўнанні са свежымі зрэзамі сэрца (D0) (n = 6 зрэзаў/група ад розных свіней, праведзены аднафактарны дысперсійны аналіз; ###p < 0,001 у параўнанні з D0 і ***p < 0,001 у параўнанні з D12 Ctrl). c 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) 相比，培养后12天的葡萄糖通量定量（n = 6 片/组，来自不同猪，单向执行 ANOVA 测试；###p < 0,001，与D0相比，***p < 0,001 与D12 Ctrl 相比）. C 条形图 显示 所有 4 种 条件 （（ctrl 、 td 、 mc 和 mt） 新鲜 心脏 切片 切片 切片 相比 ，培养 后 后 12 天 的 通量 定量 （n = 6 片/组 ， 来自 猪 ， ， ， ， ， ， ， ， 猪猪单向执行ANOVA 测试；###p < 0,001，与D0 相比，***p < 0,001 与D12 Ctrl 相比）。 c Гістограмма, якая паказвае колькасную ацэнку патоку глюкозы праз 12 дзён пасля культывавання для ўсіх 4 умоў культывавання (кантроль, TD, MC і MT) у параўнанні са свежымі зрэзамі сэрца (D0) (n = 6 зрэзаў/група, ад розных свіней, аднабаковы Былі праведзены аналізы ANOVA; ###p < 0,001 у параўнанні з D0, ***p < 0,001 у параўнанні з D12 (кантроль). Гістаграма, якая паказвае колькасную ацэнку патоку глюкозы праз 12 дзён пасля культывавання для ўсіх 4 умоў культывавання (кантроль, TD, MC і MT) у параўнанні са свежымі зрэзамі сэрца (D0) (n = 6 зрэзаў/група, ад розных свіней, аднабаковы аналіз). Ці праводзіліся тэсты ANOVA, ###p < 0,001 у параўнанні з D0, ***p < 0,001 у параўнанні з D12 (кантроль).d Дыяграмы аналізу штамаў свежых (сіні), тканін сярэдняй таўшчыні (зялёны) на 12-ы дзень і тканін сярэдняй таўшчыні (чырвоны) на 12-ы дзень у дзесяці рэгіянальных кропках зрэзаў тканіны (n = 4 зрэзы/група, аднабаковы дысперсійны аналіз; істотнай розніцы паміж групамі не было). e Дыяграма вулкана, якая паказвае дыферэнцыяльна экспрэсаваныя гены ў свежых зрэзах сэрца (D0) у параўнанні са зрэзамі сэрца, культываванымі ў статычных умовах (Ctrl) або ва ўмовах сярэдняй таўшчыні (MT) на працягу 10-12 дзён. f Цеплавая карта генаў саркамера для зрэзаў сэрца, культываваных у кожным з умоў культывавання. Палоскі памылак прадстаўляюць сярэдняе значэнне ± стандартнае адхіленне.
Метабалічная залежнасць ад пераключэння ад акіслення тоўстых кіслот да гліколізу з'яўляецца адметнай рысай дэдыферэнцыяцыі кардыяміяцытаў. Няспелыя кардыяміяцыты ў асноўным выкарыстоўваюць глюкозу для вытворчасці АТФ і маюць гіпапластычныя мітахондрыі з невялікай колькасцю крыст5,32. Аналіз выкарыстання глюкозы паказаў, што ва ўмовах MC і MT выкарыстанне глюкозы было падобным да такога ж у тканінах 0-га дня (малюнак 4c). Аднак узоры Ctrl паказалі значнае павелічэнне выкарыстання глюкозы ў параўнанні са свежай тканінай. Гэта сведчыць аб тым, што спалучэнне CTCM і T3/Dex паляпшае жыццяздольнасць тканін і захоўвае метабалічны фенатып 12-дзённых культываваных зрэзаў сэрца. Акрамя таго, аналіз штамаў паказаў, што ўзровень штамаў заставаўся такім жа, як і ў свежай тканіны сэрца на працягу 12 дзён ва ўмовах MT і MS (мал. 4d).
Каб прааналізаваць агульны ўплыў CTCM і T3/Dex на глабальны транскрыпцыйны ландшафт тканіны сардэчных зрэзаў, мы правялі RNA-секвенаванне на сардэчных зрэзах з усіх чатырох розных умоў культывавання (Дадатковыя дадзеныя 1). Цікава, што МТ-зрэзы прадэманстравалі высокую транскрыпцыйную падабенства са свежай сардэчнай тканінай, прычым толькі 16 дыферэнцыяльна экспрэсаваліся з 13 642 генаў. Аднак, як мы паказалі раней, Ctrl-зрэзы прадэманстравалі 1229 дыферэнцыяльна экспрэсаваных генаў праз 10-12 дзён культывавання (Малюнак 4e). Гэтыя дадзеныя былі пацверджаны кПЛР у рэжыме рэальнага часу (qRT-PCR) генаў сэрца і фібрабластаў (Дадатковыя малюнкі 7a-c). Цікава, што Ctrl-зрэзы прадэманстравалі паніжэнне рэгуляцыі сардэчных і клеткавых генаў і актывацыю запаленчых генных праграм. Гэтыя дадзеныя сведчаць аб тым, што дэдыферэнцыяцыя, якая звычайна адбываецца пасля працяглага культывавання, цалкам аслабляецца ва ўмовах МТ (Дадатковыя малюнкі 8a,b). Дбайнае вывучэнне генаў саркамера паказала, што толькі ва ўмовах МТ захоўваюцца гены, якія кадуюць саркамер (мал. 4f) і іённы канал (дадатковы мал. 9), што абараняе іх ад падаўлення ва ўмовах Ctrl, TD і MC. Гэтыя дадзеныя паказваюць, што пры спалучэнні механічнай і гумаральнай стымуляцыі (T3/Dex) транскрыптом зрэзу сэрца можа заставацца падобным да свежых зрэзаў сэрца пасля 12 дзён культывавання.
Гэтыя транскрыпцыйныя вынікі пацвярджаюцца тым фактам, што структурная цэласнасць кардыяміяцытаў у зрэзах сэрца найлепш захоўваецца ва ўмовах МТ на працягу 12 дзён, што паказана наяўнасцю інтактнага і лакалізаванага канексіну 43 (мал. 5a). Акрамя таго, фіброз у зрэзах сэрца ва ўмовах МТ быў значна зніжаны ў параўнанні з Ctrl і падобны да свежых зрэзаў сэрца (мал. 5b). Гэтыя дадзеныя паказваюць, што спалучэнне механічнай стымуляцыі і апрацоўкі T3/Dex эфектыўна захоўвае структуру сэрца ў зрэзах сэрца ў культуры.
Тыповыя імунафлуарэсцэнтныя выявы трапаніну-Т (зялёны), канексіну 43 (чырвоны) і DAPI (сіні) у свежавылучаных зрэзах сэрца (D0) або культываваных на працягу 12 дзён ва ўсіх чатырох умовах культывавання зрэзаў сэрца (маштабная шкала = 100 мкм). Колькасная ацэнка структурнай цэласнасці тканіны сэрца з дапамогай штучнага інтэлекту (n = 7 (D0 і D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC і D12 MT) зрэзаў/групы ад розных свіней, праведзены аднафактарны дысперсійны аналіз; ####p < 0,0001 у параўнанні з D0 і *p < 0,05, або ****p < 0,0001 у параўнанні з D12 Ctrl). Колькасная ацэнка структурнай цэласнасці сардэчнай тканіны з дапамогай штучнага інтэлекту (n = 7 (D0 і D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC і D12 MT) зрэзаў/групы ад розных свіней, праведзены аднафактарны дысперсійны аналіз; #### p < 0,0001 у параўнанні з D0 і *p < 0,05, або ****p < 0,0001 у параўнанні з D12 Ctrl). Сумесная адзнака структурнай цэласнасці тканіны сэрца з дапамогай штучнага інтэлекту (n = 7 (D0 і D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC і D12 MT) зрэзаў/групы ад розных свіней, праведзена аднафактарным тэстам ANOVA; #### p < 0,0001 у параўнанні з D0 і *p < 0,05 або ****p < 0,0001 у параўнанні з D12 Ctrl). Колькасная ацэнка структурнай цэласнасці тканіны сэрца з выкарыстаннем штучнага інтэлекту (n = 7 (D0 і D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC і D12 MT) зрэзаў/групы ад розных свіней, праведзены аднафактарны ANOVA-тэст; #### p < 0,0001 у параўнанні з D0 і *p < 0,05 або ****p < 0,0001 у параўнанні з D12 Ctrl).对不同猪的心脏组织结构完整性（n = 7（D0 和D12 Ctrl）、5（D12 TD、D12 MC 和D12 MT）切片/组）进行人工智能量化，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0,0001 与D0 和*p < 0,05 相比，或****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比).对 不同 猪 的 心脏 结构 完整性 （n = 7 （d0 和 d12 ctrl） （5 （d12 td 、 d12 mc 和 d12 mt） 组）人工 智能量 化 进行 单向 单向 单向 测试 ； ########### p < 0,0001 与D0 和*p < 0,05 相比，或****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）.Колькасная ацэнка структурнай цэласнасці сардэчнай тканіны з выкарыстаннем штучнага інтэлекту ў розных свіней (n = 7 (D0 і D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC і D12 MT) зрэзаў/групы) з дапамогай аднафактарнага тэсту ANOVA;#### p < 0,0001 у параўнанні з D0 і *p < 0,05 або ****p < 0,0001 у параўнанні з D12 Ctrl). #### p < 0,0001 у параўнанні з D0 і *p < 0,05 або ****p < 0,0001 у параўнанні з D12 (Ctrl). b Тыповыя выявы і колькасная ацэнка зрэзаў сэрца, афарбаваных трыхромным фарбавальнікам Масона (маштабная шкала = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD і D12 MC), 9 (D12 MT) зрэзаў/група ад розных свіней, праведзены аднафактарны дысперсійны аналіз; ####p < 0,0001 у параўнанні з D0 і ***p < 0,001, або ****p < 0,0001 у параўнанні з D12 Ctrl). b Тыповыя выявы і колькасная ацэнка зрэзаў сэрца, афарбаваных трыхромным фарбавальнікам Масона (маштабная шкала = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD і D12 MC), 9 (D12 MT) зрэзаў/група ад розных свіней, праведзены аднафактарны дысперсійны аналіз; ####p < 0,0001 у параўнанні з D0 і ***p < 0,001, або ****p < 0,0001 у параўнанні з D12 Ctrl). b Рэпрэзентатыўныя выявы і колькасная ацэнка зрэзаў сэрца, упрыгожаных троххромным красіцелем Массона (масштабная лінія = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD і D12 MC), 9 (D12 MT) зрэзаў/групы ад розных свіней, выконваецца аднабаковы тэст ANOVA; ####p < 0,0001 у параўнанні з D0 і ***p < 0,001 або ****p < 0,0001 у параўнанні з D12 Ctrl). b Тыповыя выявы і колькасная ацэнка зрэзаў сэрца, афарбаваных трыхромным фарбавальнікам Масона (маштабная шкала = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD і D12 MC), 9 (D12 MT) зрэзаў/група ад розных свіней, праведзены аднафактарны ANOVA; ####p < 0,0001 супраць D0 і ***p < 0,001 або ****p < 0,0001 супраць D12 Ctrl). b 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像和量化（比例尺= 500 мкм）（n = 10（D0、D12 Ctrl、D12 TD 和D12 MC，，来自不同猪的9 个（D12 MT）切片/组，进行单因素方差分析；####p < 0,0001与D0 相比，***p < 0,001，或****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）。 b 用 mason 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 和 量化 （比例 尺 尺 尺 = 500 мкм） （n = 10 （d0 、 d12 ctrl 、 d12 td 和 d12 mc） 来自 不同 的 9 个 d12 mt 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片/组，进行单因素方差分析；####p < 0,0001与D0 相比，***p < 0,001，或****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）。 b Рэпрэзентатыўныя выявы і колькасная ацэнка зрэзаў сэрца, упрыгожаных трыхромам Массона (масштабная лінія = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD і D12 MC), 9 (D12 MT) зрэзаў ад розных свіней / групы, адзін спосаб ANOVA; ####p < 0,0001 у параўнанні з D0, ***p < 0,001 або ****p < 0,0001 у параўнанні з D12 Ctrl). b Тыповыя выявы і колькасная ацэнка зрэзаў сэрца, афарбаваных трыхромам Масона (маштабная шкала = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD і D12 MC), 9 (D12 MT) зрэзаў ад розных свіней/групы, адзін метад ANOVA; ####p < 0,0001 у параўнанні з D0, ***p < 0,001 або ****p < 0,0001 у параўнанні з D12 Ctrl).Палоскі памылак прадстаўляюць сярэдняе значэнне ± стандартнае адхіленне.
Нарэшце, здольнасць CTCM імітаваць гіпертрафію сэрца ацэньвалася па павелічэнні расцяжэння сардэчнай тканіны. Пры CTCM пікавы ціск у паветранай камеры павялічыўся з 80 мм рт.сл. да 80 мм рт.сл. (нармальнае расцяжэнне) і да 140 мм рт.сл. (мал. 6a). Гэта адпавядае павелічэнню расцяжэння на 32% (мал. 6b), якое раней было паказана як адпаведнае працэнтнае расцяжэнне, неабходнае для дасягнення зрэзамі сэрца даўжыні саркамера, падобнай да той, што назіраецца пры гіпертрафіі. Расцяжэнне і хуткасць сардэчнай тканіны падчас скарачэння і расслаблення заставаліся нязменнымі на працягу шасці дзён культывавання (мал. 6c). Сардэчная тканіна з умоў MT падвяргалася нармальнаму расцяжэнню (MT (нармальная)) або перарасцяжэнню (MT (перарасцяжэнне)) на працягу шасці дзён. Ужо пасля чатырох дзён культывавання ўзровень гіпертрафнага біямаркера NT-ProBNP быў значна павышаны ў асяроддзі ва ўмовах MT (перарасцяжэнне) у параўнанні з MT (нармальнымі) (мал. 7a). Акрамя таго, праз шэсць дзён культывавання памер клетак у МТ (АС) (мал. 7b) значна павялічыўся ў параўнанні са зрэзамі сэрца МТ (нармальны стан). Акрамя таго, ядзерная транслакацыя NFATC4 была значна павялічана ў перарасцягнутых тканінах (мал. 7c). Гэтыя вынікі паказваюць прагрэсіўнае развіццё паталагічнай рэмадэляцыі пасля гіпердыстэзіі і пацвярджаюць канцэпцыю таго, што прылада CTCM можа быць выкарыстана ў якасці платформы для вывучэння сігналізацыі сардэчнай гіпертрафіі, выкліканай расцяжэннем.
Тыповыя крывыя вымярэнняў ціску ў паветранай камеры, ціску ў вадкаснай камеры і руху тканіны пацвярджаюць, што ціск у камеры змяняе ціск у вадкаснай камеры, выклікаючы адпаведны рух зрэзу тканіны. b Тыповыя крывыя працэнтнага расцяжэння і хуткасці расцяжэння для нармальна расцягнутых (аранжавыя) і перарасцягнутых (сінія) зрэзаў тканіны. c Гістаграма, якая паказвае час цыклу (n = 19 зрэзаў у групе, ад розных свіней), час скарачэння (n = 18-19 зрэзаў у групе, ад розных свіней), час рэлаксацыі (n = 19 зрэзаў у групе, ад розных свіней)), амплітуду руху тканіны (n = 14 зрэзаў/група, ад розных свіней), пікавую сісталічную хуткасць (n = 14 зрэзаў/група, ад розных свіней) і пікавую хуткасць рэлаксацыі (n = 14 (D0), 15 (D6) зрэзаў/груп) ад розных свіней), двухбаковы t-крытэрый Стьюдэнта не паказаў істотнай розніцы ні ў адным з параметраў, што сведчыць аб тым, што гэтыя параметры заставаліся нязменнымі на працягу 6 дзён культывавання з перанапружаннем. Палоскі памылак прадстаўляюць сярэдняе значэнне ± стандартнае адхіленне.
Гістаграма колькаснага вызначэння канцэнтрацыі NT-ProBNP у культуральным асяроддзі з зрэзаў сэрца, культываваных ва ўмовах нармальнага расцяжэння (Norm) або празмернага расцяжэння (OS) МТ (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm і D4 MTOS) зрэзы/група ад розных свіней, праведзены двухфактарны ANOVA; **p < 0,01 у параўнанні з нармальным расцяжэннем). Гістаграма колькаснага вызначэння канцэнтрацыі NT-ProBNP у культуральным асяроддзі з зрэзаў сэрца, культываваных ва ўмовах нармальнага расцяжэння (Norm) або празмернага расцяжэння (OS) МТ (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm і D4 MTOS) зрэзы/група ад розных свіней, праведзены двухфактарны ANOVA; **p < 0,01 у параўнанні з нармальным расцяжэннем).Колькасная гістаграма канцэнтрацыі NT-ProBNP у культуральным асяроддзі з зрэзаў сэрца, культываваных ва ўмовах нармальнага расцяжэння МТ (норма) або празмернага расцяжэння (ЗР) (n = 4 (D2 МТНорма), 3 (D2 МТНОРМА, D4 МТНОРМА і D4 МТНОРМА) зрэзы/група ад розных свіней, праведзены двухфактарны дысперсійны аналіз;**p <0,01 у параўнанні з нармальным расцяжэннем). **p < 0,01 у параўнанні з нармальным расцяжэннем). a 在MT 正常拉伸(Norm) 或过度拉伸(OS) 条件下培养的心脏切片培养基中NT-ProBNP浓度的条形图量化（n = 4 (D2 MTNorm)、3（D2 MTOS、D4 MTNorm 和D4 MTOS）来自不同猪的切片/组，进行双向方差分析；**与正常拉伸相比，p < 0,01). Колькасная ацэнка канцэнтрацыі NT-ProBNP у зрэзах сэрца, культывуемых ва ўмовах МТ нармальнага расцяжэння (Norm) або перанапружання (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm和D4 MTOS) з розных猪的切片/组，可以双向方方发发动 **у параўнанні з нармальным расцяжэннем, p <0,01).гістаграма. Колькасная ацэнка канцэнтрацый NT-ProBNP у зрэзах сэрца, культываваных ва ўмовах нармальнага расцяжэння МТ (норма) або празмернага расцяжэння (ЗР) (n = 4 (D2 МТНорма), 3 (D2 МТНОРМА, D4 МТНОРМА) і D4 МТОС) зрэзы/група ад розных свіней, двухфактарны дысперсійны аналіз;**p <0,01 у параўнанні з нармальным расцяжэннем). **p < 0,01 у параўнанні з нармальным расцяжэннем). b Тыповыя выявы зрэзаў сэрца, афарбаваных трапанінам-Т і WGA (злева), і колькасная ацэнка памеру клетак (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) клетак/група з 10 розных зрэзаў ад розных свіней, праведзены двухбаковы t-крытэрый Стьюдэнта; ****p < 0,0001 у параўнанні з нармальным расцяжэннем). b Тыповыя выявы зрэзаў сэрца, афарбаваных трапанінам-Т і WGA (злева), і колькасная ацэнка памеру клетак (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) клетак/група з 10 розных зрэзаў ад розных свіней, праведзены двухбаковы t-крытэрый Стьюдэнта; ****p < 0,0001 у параўнанні з нармальным расцяжэннем). b Рэпрэзентатыўныя выявы зрэзаў сэрца, афарбаваных трапанiнам-Т і АЗП (злева) і колькаснага вызначэння памеру клетак (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) клетак/групу з 10 розных зрэзаў ад розных свіней, два- праводзіцца хваставой t-крытэрый Сцюдэнта; ****p < 0,0001 у параўнанні з нармальным расцяжэннем). b Тыповыя выявы зрэзаў сэрца, афарбаваных трапанінам-Т і AZP (злева), і колькасная ацэнка памеру клетак (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) клетак/група з 10 розных зрэзаў ад розных свіней, быў праведзены двухбаковы t-крытэрый Стьюдэнта; ****p < 0,0001 у параўнанні з нармальным штамам). b 用肌钙蛋白-T 和WGA（左）和细胞大小量化（右）染色的心脏切片的代表性图像（n = 330（D6 MTOS），来自不同猪的10 个不同切片的369（D6 MTNorm）细胞/组，两进行有尾学生t 检验；与正常拉伸相比；****p <0,0001）。 b Тыповыя выявы зрэзаў сэрца, афарбаваных кальцарэінам-T і WGA (злева), і памер клетак (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 з 10 розных зрэзаў (D6 MTNorm)) Клеткі/组, t-тэст па шкале 两方法有尾学生 у параўнанні з нармальным расцяжэннем, ****p < 0,0001). b Рэпрэзентатыўныя выявы зрэзаў сэрца, афарбаваных трапанiнам-Т i АЗП (злева) i колькасная ацэнка памеру клетак (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) з 10 розных зрэзаў ад розных свіней Клеткі/групы, двухбаковыя крытэрыі Сцюдэнта; ****p < 0,0001 у параўнанні са звычайным расцяжэннем). b Тыповыя выявы зрэзаў сэрца, афарбаваных трапанінам-Т і AZP (злева), і колькасная ацэнка памеру клетак (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) з 10 розных зрэзаў ад розных свіней) Клеткі/група, двухбаковы крытэрый t Стьюдэнта; ****p < 0,0001 у параўнанні з нармальным штамам). c Тыповыя выявы зрэзаў сэрца MTOS на 0-ы і 6-ы дзень, імунамаркіраваных для трапаніна-Т і NFATC4, і колькасная ацэнка транслакацыі NFATC4 у ядры CM (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) зрэзы/група ад розных свіней, праведзены двухбаковы t-крытэрый Стьюдэнта; *p < 0,05). c Тыповыя выявы зрэзаў сэрца MTOS на 0-ы і 6-ы дзень, імунамаркіраваных для трапаніна-Т і NFATC4, і колькасная ацэнка транслакацыі NFATC4 у ядры CM (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) зрэзы/група ад розных свіней, праведзены двухбаковы t-крытэрый Стьюдэнта; *p < 0,05). c Рэпрэзентатыўныя выявы для зрэзаў сэрца 0 і 6 дзён MTOS, імунамечаных для трапоніна-Т і NFATC4, і колькасная адзнака транслакацыі NFATC4 у ядры кавернозных клетак (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) зрэзаў/групу ад розных свіней, выконваецца двухбаковы t-крытэрый Сцюдэнта; *p <0,05). c Тыповыя выявы зрэзаў сэрца праз 0 і 6 дзён пасля МТОС, імунамаркіраваных для трапаніна-Т і NFATC4, і колькасная ацэнка транслакацыі NFATC4 у ядры кавернозных клетак (n = 4 (D0), 3 (D6 МТОС) зрэзы/група ад розных свіней), выкананая з выкарыстаннем двухбаковага t-крытэрыя Стьюдэнта; *p < 0,05). c 用于肌钙蛋白-T 和NFATC4 免疫标记的第0 天和第6 天MTOS心脏切片的代表性图像，以及来自不同猪的NFATC4 易位至CM 细胞核的量化（n = 4 (D0)、3 (D6 MTOS)切片/组, 进行双尾学生t 检验；*p <0,05)。 c Рэпрэзентатыўныя выявы імуннай маркіроўкі кальканін-Т і NFATC4 第0天和第6天MTOS зрэзаў сэрца і NFATC4 з розных NFATC4 易位至ядра клетак CM 的колькасць化 (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) 切礼/组,时间双尾学生et 电影；*p <0,05). c Рэпрэзентатыўныя выявы зрэзаў сэрца MTOS на 0 і 6 дзён для імунамаркіроўкі тропонином-Т і NFATC4 і колькаснай ацэнкі транслакацыі NFATC4 у ядра CM ад розных свіней (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) зрэз/група, два хвастатыя t-крытэрыі Сцюдэнта; *p <0,05). c Тыповыя выявы зрэзаў сэрца MTOS на 0 і 6 дзень для імунамалявання трапанінам-Т і NFATC4 і колькаснай ацэнкі транслакацыі NFATC4 у ядры CM ад розных свіней (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) зрэзы/група, двухбаковы t-крытэрый Стьюдэнта; *p < 0,05).Палоскі памылак прадстаўляюць сярэдняе значэнне ± стандартнае адхіленне.
Для трансляцыйных даследаванняў сардэчна-сасудзістай сістэмы патрабуюцца клетачныя мадэлі, якія дакладна ўзнаўляе сардэчнае асяроддзе. У гэтым даследаванні была распрацавана і ахарактарызавана прылада CTCM, якая можа стымуляваць ультратонкія зрэзы сэрца. Сістэма CTCM уключае фізіялагічна сінхранізаваную электрамеханічную стымуляцыю і ўзбагачэнне вадкасцю T3 і Dex. Калі зрэзы сэрца свінні падвяргаліся ўздзеянню гэтых фактараў, іх жыццяздольнасць, структурная цэласнасць, метабалічная актыўнасць і транскрыпцыйная экспрэсія заставаліся такімі ж, як і ў свежай тканіны сэрца пасля 12 дзён культывавання. Акрамя таго, празмернае расцяжэнне сардэчнай тканіны можа выклікаць гіпертрафію сэрца, выкліканую гіперэкстэнзіяй. У цэлым, гэтыя вынікі пацвярджаюць важную ролю фізіялагічных умоў культывавання ў падтрыманні нармальнага сардэчнага фенатыпу і забяспечваюць платформу для скрынінга лекаў.
Шматлікія фактары спрыяюць стварэнню аптымальнага асяроддзя для функцыянавання і выжывання кардыяміяцытаў. Найбольш відавочныя з гэтых фактараў звязаны з (1) міжклеткавымі ўзаемадзеяннямі, (2) электрамеханічнай стымуляцыяй, (3) гумаральнымі фактарамі і (4) метабалічнымі субстратамі. Фізіялагічныя міжклеткавыя ўзаемадзеянні патрабуюць складаных трохмерных сетак некалькіх тыпаў клетак, якія падтрымліваюцца пазаклеткавым матрыксам. Такія складаныя клетачныя ўзаемадзеянні цяжка рэканструяваць in vitro шляхам сумеснага культывавання асобных тыпаў клетак, але іх можна лёгка дасягнуць, выкарыстоўваючы арганатыпічную прыроду зрэзаў сэрца.
Механічнае расцяжэнне і электрычная стымуляцыя кардыяміяцытаў маюць вырашальнае значэнне для падтрымання сардэчнага фенатыпу33,34,35. Хоць механічная стымуляцыя шырока выкарыстоўваецца для кандыцыянавання і паспявання hiPSC-CM, нядаўна было праведзена некалькі элегантных даследаванняў, у якіх была зроблена спроба механічнай стымуляцыі зрэзаў сэрца ў культуры з выкарыстаннем аднавосевай нагрузкі. Гэтыя даследаванні паказваюць, што 2D аднавосевая механічная нагрузка станоўча ўплывае на фенатып сэрца падчас культуры. У гэтых даследаваннях зрэзы сэрца альбо нагружаліся ізаметрычнымі сіламі расцяжэння17, лінейнай аўксатоннай нагрузкай18, альбо сардэчны цыкл быў адноўлены з выкарыстаннем зваротнай сувязі датчыка сілы і прывадаў нацяжэння. Аднак гэтыя метады выкарыстоўваюць аднавосевае расцяжэнне тканін без аптымізацыі навакольнага асяроддзя, што прыводзіць да падаўлення многіх сардэчных генаў або празмернай экспрэсіі генаў, звязаных з анамальнымі рэакцыямі расцяжэння. Апісаны тут CTCM забяспечвае 3D электрамеханічны стымул, які імітуе натуральны сардэчны цыкл з пункту гледжання часу цыклу і фізіялагічнага расцяжэння (25% расцяжэння, 40% сістолы, 60% дыястолы і 72 удары ў хвіліну). Нягледзячы на ​​тое, што гэтай трохмернай механічнай стымуляцыі недастаткова для падтрымання цэласнасці тканін, для належнага падтрымання жыццяздольнасці, функцыі і цэласнасці тканін неабходна спалучэнне гумаральнай і механічнай стымуляцыі з выкарыстаннем T3/Dex.
Гумаральныя фактары адыгрываюць важную ролю ў мадуляцыі фенатыпу сэрца дарослага чалавека. Гэта было падкрэслена ў даследаваннях HiPS-CM, у якіх Т3 і дэксаметазон дадавалі ў культуральныя асяроддзі для паскарэння паспявання клетак. Т3 можа ўплываць на транспарт амінакіслот, цукроў і кальцыя праз клеткавыя мембраны36. Акрамя таго, Т3 спрыяе экспрэсіі MHC-α і паніжэнню рэгуляцыі MHC-β, спрыяючы ўтварэнню хуткіх міяфібрыл у спелых кардыяміяцытах у параўнанні з павольнымі міяфібрыламі пры фетальным CM. Дэфіцыт Т3 у пацыентаў з гіпатэрыёзам прыводзіць да страты міяфібрылярных палос і зніжэння хуткасці развіцця тонусу37. Дэксаметазон дзейнічае на глюкакартыкоідныя рэцэптары і, як было паказана, павялічвае скарачальнасць міякарда ў ізаляваных перфузаваных сэрцах38; мяркуецца, што гэта паляпшэнне звязана з уздзеяннем на ўваход, выкліканы адкладамі кальцыя (SOCE)39,40. Акрамя таго, дэксаметазон звязваецца са сваімі рэцэптарамі, выклікаючы шырокі ўнутрыклетачны адказ, які падаўляе імунную функцыю і запаленне30.
Нашы вынікі паказваюць, што фізіка-механічная стымуляцыя (МС) палепшыла агульную прадукцыйнасць культуры ў параўнанні з Ctrl, але не змагла захаваць жыццяздольнасць, структурную цэласнасць і экспрэсію сардэчнай функцыі на працягу 12 дзён у культуры. У параўнанні з Ctrl, даданне T3 і Dex да культур CTCM (MT) палепшыла жыццяздольнасць і падтрымлівала падобныя профілі транскрыпцыі, структурную цэласнасць і метабалічную актыўнасць са свежай тканінай сэрца на працягу 12 дзён. Акрамя таго, кантралюючы ступень расцяжэння тканіны, з выкарыстаннем STCM была створана мадэль сардэчнай гіпертрафіі, выкліканай гіперэкстэнзіяй, што ілюструе ўніверсальнасць сістэмы STCM. Варта адзначыць, што, хоць рэмадэляванне сэрца і фіброз звычайна ўключаюць непашкоджаныя органы, цыркулюючыя клеткі якіх могуць забяспечваць адпаведныя цытакіны, а таксама фагацытоз і іншыя фактары рэмадэлявання, зрэзы сэрца ўсё яшчэ могуць імітаваць фіброзны працэс у адказ на стрэс і траўму. Гэта было раней ацэнена ў гэтай мадэлі сардэчнага зрэзу. Варта адзначыць, што параметры CTCM можна мадуляваць, змяняючы ціск/электрычную амплітуду і частату, каб імітаваць многія станы, такія як тахікардыя, брадыкардыя і механічная падтрымка кровазвароту (механічна ненагружанае сэрца). Гэта робіць сістэму сярэдняй прапускной здольнасцю для тэставання на наркотыкі. Здольнасць CTCM мадэляваць гіпертрафію сэрца, выкліканую перанапружаннем, адкрывае шлях для тэставання гэтай сістэмы для персаналізаванай тэрапіі. У заключэнне, дадзенае даследаванне паказвае, што механічнае расцяжэнне і гумаральная стымуляцыя маюць вырашальнае значэнне для падтрымання культуры зрэзаў сардэчнай тканіны.
Нягледзячы на ​​тое, што прадстаўленыя тут дадзеныя сведчаць аб тым, што КТКМ з'яўляецца вельмі перспектыўнай платформай для мадэлявання непашкоджанага міякарда, гэты метад культывавання мае некаторыя абмежаванні. Асноўным абмежаваннем КТКМ культывавання з'яўляецца тое, што яно накладвае пастаянныя дынамічныя механічныя нагрузкі на зрэзы, што выключае магчымасць актыўнага маніторынгу скарачэнняў сардэчных зрэзаў падчас кожнага цыклу. Акрамя таго, з-за малога памеру сардэчных зрэзаў (7 мм) магчымасць ацэнкі сісталічнай функцыі па-за сістэмамі культывавання з выкарыстаннем традыцыйных датчыкаў сілы абмежаваная. У гэтым рукапісе мы часткова пераадольваем гэта абмежаванне, ацэньваючы аптычнае напружанне як паказчык скарачальнай функцыі. Аднак гэта абмежаванне запатрабуе далейшай працы і можа быць вырашана ў будучыні шляхам укаранення метадаў аптычнага маніторынгу функцыі сардэчных зрэзаў у культуры, такіх як аптычнае картаграфаванне з выкарыстаннем кальцыевых і напружаннеадчувальных фарбавальнікаў. Яшчэ адным абмежаваннем КТКМ з'яўляецца тое, што рабочая мадэль не маніпулюе фізіялагічным напружаннем (папярэдняя і паслянагрузка). У КТКМ ціск індукаваўся ў процілеглых напрамках, каб узнавіць 25% фізіялагічнага расцяжэння ў дыясталу (поўнае расцяжэнне) і сістолу (працягласць скарачэння падчас электрычнай стымуляцыі) у вельмі вялікіх тканінах. Гэта абмежаванне павінна быць ліквідавана ў будучых распрацоўках КТКМ шляхам адэкватнага ціску на сардэчную тканіну з абодвух бакоў і шляхам ужывання дакладных суадносін ціску і аб'ёму, якія назіраюцца ў камерах сэрца.
Рэмадэляванне, выкліканае празмерным расцяжэннем, пра якое паведамляецца ў гэтым рукапісе, абмежавана імітацыяй сігналаў гіпертрафічнага гіперрасцяжэння. Такім чынам, гэтая мадэль можа дапамагчы ў вывучэнні сігналізацыі гіпертрафічнага тыпу, выкліканай расцяжэннем, без неабходнасці гумаральных або нейронавых фактараў (якія адсутнічаюць у гэтай сістэме). Неабходныя далейшыя даследаванні для павелічэння множнасці КТКМ, напрыклад, сумеснае культываванне з імуннымі клеткамі, цыркулюючымі гумаральнымі фактарамі плазмы і інервацыяй пры сумесным культываванні з нейрональнымі клеткамі палепшыць магчымасці мадэлявання захворванняў з дапамогай КТКМ.
У гэтым даследаванні выкарыстоўвалася трынаццаць свіней. Усе працэдуры на жывёлах праводзіліся ў адпаведнасці з інстытуцыйнымі рэкамендацыямі і былі ўхвалены Камітэтам па доглядзе і выкарыстанні жывёл Універсітэта Луісвіла. Дуга аорты была заціснута, і сэрца перфузавана 1 л стэрыльнай кардыяплегіі (110 мМ NaCl, 1,2 мМ CaCl2, 16 мМ KCl, 16 мМ MgCl2, 10 мМ NaHCO3, 5 адзінак/мл гепарыну, pH да 7,4); Сэрцы захоўваліся ў ледзяным кардыяплегічным растворы да транспарціроўкі ў лабараторыю на лёдзе, што звычайна складае <10 хвілін. Сэрцы захоўваліся ў ледзяным кардыяплегічным растворы да транспарціроўкі ў лабараторыю на лёдзе, што звычайна складае <10 хвілін. сэрца захоўвалі ў ледзяным кардиоплегическом растворы да транспарціроўкі ў лабараторыю на льду, што звычайна займае <10 мін. Сэрцы захоўваліся ў ледзяным кардыяплегічным растворы да транспарціроўкі ў лабараторыю на лёдзе, што звычайна займае <10 хвілін.将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钟。将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钟。 Трымаеце сэрца ў лядзяной кардыяплегіі да транспарціроўкі ў лабараторыю на льду, звычайна <10 мін. Трымайце сэрцы на лёдзе ў кардыяплегіі да транспарціроўкі ў лабараторыю на лёдзе, звычайна <10 хвілін.
Прылада CTCM была распрацавана ў праграмным забеспячэнні аўтаматызаванага праектавання (CAD) SolidWorks. Культуральныя камеры, перагародкі і паветраныя камеры выраблены з празрыстага акрылавага пластыка, вырабленага на станку з ЧПУ. Апорнае кольца дыяметрам 7 мм выраблена з поліэтылену высокай шчыльнасці (HDPE) у цэнтры і мае пазу для ўшчыльняльнага кольца, у якой размяшчаецца сіліконавае ўшчыльняльнае кольца, якое выкарыстоўваецца для герметызацыі асяроддзя пад ім. Тонкая дыяксідакрэмніевая мембрана аддзяляе культуральную камеру ад раздзяляльнай пласціны. Сіліконавая мембрана выразана лазерам з сіліконавага ліста таўшчынёй 0,02 цалі і мае цвёрдасць 35А. Ніжняя і верхняя сіліконавыя пракладкі выразаны лазерам з сіліконавага ліста таўшчынёй 1/16 цалі і маюць цвёрдасць 50А. Для мацавання блока і стварэння герметычнага ўшчыльнення выкарыстоўваюцца шрубы і гайкі-барашкі з нержавеючай сталі 316L.
Спецыяльная друкаваная плата (PCB) прызначана для інтэграцыі з сістэмай C-PACE-EM. Раз'ёмы швейцарскага станка на друкаванай плаце падключаны да графітавых электродаў з дапамогай пасярэбраных медных правадоў і бронзавых шруб 0-60, укручаных у электроды. Друкаваная плата размешчана ў вечку 3D-прынтара.
Прылада CTCM кіруецца праграмуемым пнеўматычным прывадам (PPD), які стварае кантраляваны ціск у крыві, падобны да сардэчнага цыклу. Па меры павелічэння ціску ўнутры паветранай камеры гнуткая сіліконавая мембрана пашыраецца ўверх, прымушаючы асяроддзе знаходзіцца пад участкам тканіны. Затым вобласць тканіны расцягваецца за кошт гэтага выкіду вадкасці, імітуючы фізіялагічнае пашырэнне сэрца падчас дыясталы. У піку рэлаксацыі праз графітавыя электроды ўжывалася электрычная стымуляцыя, якая зніжала ціск у паветранай камеры і выклікала скарачэнне зрэзаў тканін. Унутры трубы знаходзіцца гемастатычны клапан з датчыкам ціску для вызначэння ціску ў паветранай сістэме. Ціск, які вымярае датчык ціску, падаецца на калектар дадзеных, падлучаны да ноўтбука. Гэта дазваляе бесперапынна кантраляваць ціск унутры газавай камеры. Калі быў дасягнуты максімальны ціск у камеры (стандарт 80 мм рт.сл., АС 140 мм рт.сл.), прылада збору дадзеных атрымала загад адправіць сігнал у сістэму C-PACE-EM для генерацыі двухфазнага сігналу напружання на працягу 2 мс, усталяванага на 4 В.
Былі атрыманы зрэзы сэрца, і ўмовы культывавання ў 6 лунках былі выкананы наступным чынам: сабраныя сэрцы з пасудзіны для пераносу перанеслі ў паддон з халоднай (4°C) кардыяплегіяй. Левы страўнічак вылучылі стэрыльным лязом і нарэзалі на кавалкі па 1-2 см3. Гэтыя тканкавыя блокі прымацавалі да тканевых апор з дапамогай тканевага клею і змясцілі ў вібруючую тканевую ванну мікратома, якая змяшчала раствор Тырода, і бесперапынна насычалі кіслародам (3 г/л 2,3-бутандыёнмонааксіму (BDM), 140 мМ NaCl (8,18 г)), 6 мМ KCl (0,447 г), 10 мМ D-глюкозы (1,86 г), 10 мМ HEPES (2,38 г), 1 мМ MgCl2 (1 мл 1 М раствора), 1,8 мМ CaCl2 (1,8 мл 1 М раствора), да 1 л ddH2O). Вібрацыйны мікратом быў настроены на нарэзку зрэзаў таўшчынёй 300 мкм з частатой 80 Гц, гарызантальнай амплітудай ваганняў 2 мм і хуткасцю прасоўвання 0,03 мм/с. Ванна з тканінамі была акружана лёдам, каб раствор заставаўся прахалодным, а тэмпература падтрымлівалася на ўзроўні 4°C. Зрэзы тканін з ванны мікратома пераносілі ў інкубацыйную ванну, якая змяшчала пастаянна насычаны кіслародам раствор Тырода на лёдзе, пакуль не будзе атрымана дастаткова зрэзаў для адной культуральнай пласціны. Для празлункавых культур зрэзы тканін прымацоўвалі да стэрыльных поліўрэтанавых падставак шырынёй 6 мм і змяшчалі ў 6 мл аптымізаванага асяроддзя (асяроддзе 199, 1x дабаўка ITS, 10% FBS, 5 нг/мл VEGF, 10 нг/мл FGF-шчолачны і 2X антыбіётык-супрацьгрыбковы прэпарат). Электрычная стымуляцыя (10 В, частата 1,2 Гц) прымянялася да зрэзаў тканін праз C-Pace. Для ўмоў TD свежы T3 і Dex дадавалі ў канцэнтрацыі 100 нМ і 1 мкМ пры кожнай змене асяроддзя. Асяроддзе насычаюць кіслародам перад заменай 3 разы на дзень. Зрэзы тканін культывавалі ў інкубатары пры тэмпературы 37°C і 5% CO2.
Для культывавання CTCM зрэзы тканін змяшчалі на спецыяльна выраблены 3D-прынтар у чашку Петры, якая змяшчала мадыфікаваны раствор Тырода. Прылада прызначана для павелічэння памеру зрэзу сэрца на 25% ад плошчы апорнага кольца. Гэта робіцца для таго, каб зрэзы сэрца не расцягваліся пасля пераносу з раствора Тырода ў асяроддзе і падчас дыясталы. З дапамогай гістаакрылавага клею зрэзы таўшчынёй 300 мкм фіксавалі на апорным кольцы дыяметрам 7 мм. Пасля мацавання зрэзаў тканіны да апорнага кольца адразалі лішнія зрэзы тканіны і змяшчалі прымацаваныя зрэзы тканіны назад у ванну з растворам Тырода на лёдзе (4°C), пакуль не будзе падрыхтавана дастаткова зрэзаў для адной прылады. Агульны час апрацоўкі для ўсіх прылад не павінен перавышаць 2 гадзіны. Пасля таго, як 6 зрэзаў тканіны былі прымацаваны да іх апорных кольцаў, прылада CTCM была сабрана. Культуральная камера CTCM папярэдне запаўняецца 21 мл папярэдне насычанага кіслародам асяроддзя. Перанясіце зрэзы тканіны ў культуральную камеру і старанна выдаліце ​​любыя бурбалкі паветра піпеткай. Затым зрэз тканіны ўстаўляецца ў адтуліну і акуратна прыціскаецца да месца. Нарэшце, надзеньце каўпачок электрода на прыладу і перанясіце яе ў інкубатар. Затым падключыце CTCM да паветранай трубкі і сістэмы C-PACE-EM. Пнеўматычны прывад адкрываецца, і паветраны клапан адкрывае CTCM. Сістэма C-PACE-EM была настроена на падачу 4 В з частатой 1,2 Гц падчас двухфазнай стымуляцыі на працягу 2 мс. Асяроддзе мянялася двойчы на ​​дзень, а электроды — адзін раз у дзень, каб пазбегнуць назапашвання графіту на электродах. Пры неабходнасці зрэзы тканін можна выняць з іх культуральных лунак, каб выдаліць любыя паветраныя бурбалкі, якія маглі патрапіць пад іх. Для ўмоў апрацоўкі МТ свежы T3/Dex дадавалі пры кожнай змене асяроддзя са 100 нМ T3 і 1 мкМ Dex. Прылады CTCM культывавалі ў інкубатары пры тэмпературы 37°C і 5% CO2.
Для атрымання расцягнутых траекторый зрэзаў сэрца была распрацавана спецыяльная сістэма камер. Выкарыстоўвалася люстраная камера (Canon Rebel T7i, Canon, Токіо, Японія) з макрааб'ектывам Navitar Zoom 7000 18-108 мм (Navitar, Сан-Францыска, Каліфорнія). Візуалізацыя праводзілася пры пакаёвай тэмпературы пасля замены асяроддзя на свежае. Камера размяшчалася пад вуглом 51°, і відэа запісвалася з частатой 30 кадраў у секунду. Спачатку для колькаснай ацэнкі руху зрэзаў сэрца выкарыстоўвалася праграмнае забеспячэнне з адкрытым зыходным кодам (MUSCLEMOTION43) з Image-J. Маска была створана з дапамогай MATLAB (MathWorks, Natick, MA, ЗША) для вызначэння абласцей цікавасці для зрэзаў сэрца, якія б'юцца, каб пазбегнуць шуму. Сегментаваныя ўручную маскі ўжываліся да ўсіх малюнкаў у паслядоўнасці кадраў, а затым перадаваліся ў плагін MUSCLEMOTION. Muscle Motion выкарыстоўвае сярэднюю інтэнсіўнасць пікселяў у кожным кадры для колькаснай ацэнкі яго руху адносна апорнага кадра. Дадзеныя былі запісаны, адфільтраваны і выкарыстаны для колькаснай ацэнкі часу цыклу і ацэнкі расцяжэння тканін падчас сардэчнага цыклу. Запісанае відэа было апрацавана з выкарыстаннем лічбавага фільтра нулявой фазы першага парадку. Для колькаснай ацэнкі расцяжэння тканіны (ад піка да піка) быў праведзены адпікавы аналіз, каб адрозніць пікі і западзіны ў запісаным сігнале. Акрамя таго, для ліквідацыі дрэйфу сігналу было праведзена дэтрэндзінгаванне з выкарыстаннем палінома 6-га парадку. Праграмны код быў распрацаваны ў MATLAB для вызначэння глабальнага руху тканіны, часу цыклу, часу рэлаксацыі і часу скарачэння (дадатковы праграмны код 44).
Для аналізу дэфармацыі, выкарыстоўваючы тыя ж відэа, створаныя для ацэнкі механічнага расцяжэння, мы спачатку прасачылі дзве выявы, якія адлюстроўваюць пікі руху (найвышэйшую (верхнюю) і найніжэйшую (ніжнюю) кропкі руху) у адпаведнасці з праграмным забеспячэннем MUSCLEMOTION. Затым мы сегментавалі вобласці тканіны і ўжылі алгарытм ценявання да сегментаванай тканіны (Дадатковы мал. 2a). Сегментаваная тканіна была падзелена на дзесяць падпаверхняў, і напружанне на кожнай паверхні было разлічана з дапамогай наступнага ўраўнення: Дэфармацыя = (Sup-Sdown)/Sdown, дзе Sup і Sdown - гэта адлегласці формы ад верхняй і ніжняй ценяў тканіны адпаведна (Дадатковы мал. 2b).
Зрэзы сэрца фіксавалі ў 4% парафармальдэгіде на працягу 48 гадзін. Фіксаваныя тканіны абязводжвалі ў 10% і 20% цукрозе на працягу 1 гадзіны, затым у 30% цукрозе на працягу ночы. Затым зрэзы залівалі ў аптымальную тэмпературу рэзання (OCT-злучэнне) і паступова замарожвалі ў ванне з ізапентану і сухога лёду. Захоўвайце блокі для залівання OCT пры тэмпературы -80 °C да падзелу. Скрыпты рыхтавалі ў выглядзе зрэзаў таўшчынёй 8 мкм.
Каб выдаліць АКТ са зрэзаў сэрца, награвайце слайды на награвальным блоку пры тэмпературы 95 °C на працягу 5 хвілін. Дадайце 1 мл PBS на кожны слайд і інкубуйце на працягу 30 хвілін пры пакаёвай тэмпературы, затым пранікніце зрэзы, усталяваўшы 0,1% Triton-X у PBS на працягу 15 хвілін пры пакаёвай тэмпературы. Каб прадухіліць звязванне неспецыфічных антыцелаў з узорам, дадайце 1 мл 3% раствора BSA на слайды і інкубуйце на працягу 1 гадзіны пры пакаёвай тэмпературы. Затым BSA выдалялі, а слайды прамывалі PBS. Пазначце кожны ўзор алоўкам. Першасныя антыцелы (разведзеныя 1:200 у 1% BSA) (канексін 43 (Abcam; #AB11370), NFATC4 (Abcam; #AB99431) і трапанін-T (Thermo Scientific; #MA5-12960) дадавалі на працягу 90 хвілін, затым другасныя антыцелы (разведзеныя 1:200 у 1% BSA) супраць мышынай Alexa Fluor 488 (Thermo Scientific; #A16079), супраць трусінай Alexa Fluor 594 (Thermo Scientific; #T6391) на працягу дадатковых 90 хвілін. Прамывалі 3 разы PBS. Каб адрозніць мэтавае афарбоўванне ад фону, мы выкарыстоўвалі толькі другасныя антыцелы ў якасці кантролю. Нарэшце, дадавалі ядзерны фарбавальнік DAPI, і слайды змяшчалі ў ахоўную плёнку vectashield (Vector Laboratories) і запячатвалі лакам для пазногцяў. -x павелічэнне) і мікраскоп Keyence з 40-кратным павелічэннем.
Для афарбоўвання WGA выкарыстоўвалі WGA-Alexa Fluor 555 (Thermo Scientific; #W32464) у канцэнтрацыі 5 мкг/мл у PBS і наносілі на фіксаваныя зрэзы на 30 хвілін пры пакаёвай тэмпературы. Затым слайды прамывалі PBS, дадаючы суданскі чорны колер і інкубавалі на працягу 30 хвілін. Затым слайды прамывалі PBS і дадавалі асяроддзе для залівання vectashield. Слайды візуалізавалі на мікраскопе Keyence пры 40-кратным павелічэнні.
АКТ выдалялі з узораў, як апісана вышэй. Пасля выдалення АКТ, слайды апускалі ў раствор Буэна на ноч. Затым слайды прамывалі дыстыляванай вадой на 1 гадзіну, а затым змяшчалі ў раствор фуксіну алоэ кіслаты Бібрыха на 10 хвілін. Затым слайды прамывалі дыстыляванай вадой і змяшчалі ў раствор 5% фосфамалібдэна/5% фосфавальфрамавай кіслаты на 10 хвілін. Не прамываючы, пераносілі слайды непасрэдна ў раствор анілінавай сіні на 15 хвілін. Затым слайды прамывалі дыстыляванай вадой і змяшчалі ў 1% раствор воцатнай кіслаты на 2 хвіліны. Скрынкі высушвалі ў 200 N этаноле і пераносілі ў ксілол. Афарбаваныя слайды візуалізавалі з дапамогай мікраскопа Keyence з аб'ектывам 10x. Працэнт плошчы фіброзу вызначалі колькасна з дапамогай праграмнага забеспячэння Keyence Analyzer.
Аналіз жыццяздольнасці клетак CyQUANT™ MTT (Invitrogen, Карлсбад, Каліфорнія), нумар па каталогу V13154, выкананы ў адпаведнасці з пратаколам вытворцы з некаторымі мадыфікацыямі. У прыватнасці, для забеспячэння аднастайнага памеру тканіны падчас аналізу MTT выкарыстоўваўся хірургічны прабойнік дыяметрам 6 мм. Тканіны асобна высейвалі ў лункі 12-лункавага планшэта, які змяшчае субстрат MTT, у адпаведнасці з пратаколам вытворцы. Зрэзы інкубавалі пры тэмпературы 37°C на працягу 3 гадзін, і жывая тканіна метаболізавала субстрат MTT з утварэннем фіялетавага фармазану. Замянілі раствор MTT на 1 мл ДМСО і інкубавалі пры тэмпературы 37°C на працягу 15 хвілін, каб экстрагаваць фіялетавы фармазан са зрэзаў сэрца. Узоры разводзілі 1:10 у ДМСО ў 96-лункавых планшэтах з празрыстым дном, і інтэнсіўнасць фіялетавага колеру вымяралі пры 570 нм з дапамогай планшэтнага рыдэра Cytation (BioTek). Паказанні нармалізавалі па вазе кожнага зрэзу сэрца.
Асяроддзе для зрэзаў сэрца было заменена асяроддзем, якое змяшчала 1 мкКі/мл [5-3H]-глюкозы (Moravek Biochemicals, Брэа, Каліфорнія, ЗША) для аналізу ўтылізацыі глюкозы, як апісана раней. Пасля 4 гадзін інкубацыі дадайце 100 мкл асяроддзя ў адкрытую мікрацэнтрыфужную прабірку, якая змяшчае 100 мкл 0,2 N HCl. Затым прабірку змясцілі ў сцынтыляцыйную прабірку, якая змяшчае 500 мкл dH2O, для выпарвання [3H]2O на працягу 72 гадзін пры тэмпературы 37°C. Затым выміце мікрацэнтрыфужную прабірку з сцынтыляцыйнай прабіркі і дадайце 10 мл сцынтыляцыйнай вадкасці. Падлік сцынтыляцый праводзілі з дапамогай вадкаснага сцынтыляцыйнага аналізатара Tri-Carb 2900TR (Packard Bioscience Company, Мерыдэн, Канэктыкут, ЗША). Затым разлічвалі ўтылізацыю глюкозы з улікам удзельнай актыўнасці [5-3H]-глюкозы, няпоўнай раўнавагі і фону, развядзення [5-3H]-немечанай глюкозай і эфектыўнасці сцынтыляцыйнага лічыльніка. Дадзеныя нармалізавалі адносна масы зрэзаў сэрца.
Пасля гамагенізацыі тканін у Trizol РНК вылучалі з зрэзаў сэрца з выкарыстаннем набору Qiagen miRNeasy Micro Kit № 210874 у адпаведнасці з пратаколам вытворцы. Падрыхтоўка бібліятэкі RNAsec, секвенаванне і аналіз дадзеных праводзіліся наступным чынам:
1 мкг РНК на ўзор выкарыстоўваўся ў якасці зыходнага матэрыялу для падрыхтоўкі бібліятэкі РНК. Бібліятэкі секвенавання былі створаны з выкарыстаннем набору для падрыхтоўкі бібліятэк РНК NEBNext UltraTM для Illumina (NEB, ЗША) у адпаведнасці з рэкамендацыямі вытворцы, і індэксныя коды былі дададзены да атрыбутных паслядоўнасцей для кожнага ўзору. Карацей кажучы, мРНК была ачышчана ад агульнай РНК з выкарыстаннем магнітных шарыкаў, прымацаваных да полі-Т алігануклеатыдаў. Фрагментацыя праводзілася з выкарыстаннем двухвалентных катыёнаў пры высокай тэмпературы ў буферы для рэакцыі сінтэзу першага ланцуга NEBNext (5X). кДНК першага ланцуга была сінтэзавана з выкарыстаннем выпадковых гексамерных праймераў і зваротнай транскрыптазы M-MuLV (РНКаза H-). Затым кДНК другога ланцуга сінтэзавалася з выкарыстаннем ДНК-палімеразы I і РНКазы H. Астатнія выступаючыя часткі пераўтвараюцца ў тупыя канцы пад уздзеяннем экзонуклеазнай/палімеразнай актыўнасці. Пасля адэнілавання 3′-канца фрагмента ДНК да яго прымацоўваецца адаптар NEBNext са структурай шпількавай пятлі для падрыхтоўкі да гібрыдызацыі. Для адбору фрагментаў кДНК пераважнай даўжыні 150-200 пар асноў. Фрагменты бібліятэкі былі ачышчаны з выкарыстаннем сістэмы AMPure XP (Beckman Coulter, Беверлі, ЗША). Затым 3 мкл фермента USER (NEB, ЗША) з кДНК, адабранай па памеры, лігіраванай з дапамогай адаптара, выкарыстоўвалі на працягу 15 хвілін пры тэмпературы 37°C, а затым на працягу 5 хвілін пры 95°C перад ПЛР. ПЦР праводзілі з выкарыстаннем ДНК-палімеразы Phusion High-Fidelity, універсальных праймераў для ПЦР і праймераў Index (X). Нарэшце, прадукты ПЦР былі ачышчаны (сістэма AMPure XP), і якасць бібліятэкі ацэньвалася на сістэме Agilent Bioanalyzer 2100. Бібліятэка кДНК была секвенавана з выкарыстаннем секвенара Novaseq. Неапрацаваныя файлы малюнкаў з Illumina былі пераўтвораны ў неапрацаваныя счытванні з выкарыстаннем CASAVA Base Calling. Неапрацаваныя дадзеныя захоўваюцца ў файлах фармату FASTQ(fq), якія змяшчаюць паслядоўнасці счытванняў і адпаведныя якасці асноў. Выберыце HISAT2, каб супаставіць адфільтраваныя счытванні секвенавання з эталонным геномам Sscrofa11.1. У цэлым, HISAT2 падтрымлівае геномы любога памеру, у тым ліку геномы памерам больш за 4 мільярды асноў, і для большасці параметраў устаноўлены значэнні па змаўчанні. Сплайсінгавыя чытанні з дадзеных RNA Seq можна эфектыўна выраўнаваць з дапамогай HISAT2, самай хуткай сістэмы, даступнай у цяперашні час, з такой жа або лепшай дакладнасцю, чым любы іншы метад.
Колькасць транскрыптаў непасрэдна адлюстроўвае ўзровень экспрэсіі генаў. Узроўні экспрэсіі генаў ацэньваюцца па колькасці транскрыптаў (колькасць секвенаванняў), звязаных з геномам або экзонамі. Колькасць прачытанняў прапарцыйная ўзроўням экспрэсіі генаў, даўжыні гена і глыбіні секвенавання. FPKM (колькасць фрагментаў на тысячу пар асноў секвенаванага транскрыпту на мільён пар асноў) былі разлічаны, і P-значэнні дыферэнцыяльнай экспрэсіі былі вызначаны з выкарыстаннем пакета DESeq2. Затым мы разлічылі ўзровень ілжывых выяўленняў (FDR) для кожнага значэння P з выкарыстаннем метаду Бенджаміні-Хохберга9 на аснове ўбудаванай R-функцыі «p.adjust».
РНК, выдзеленая з зрэзаў сэрца, была пераўтворана ў кДНК у канцэнтрацыі 200 нг/мкл з выкарыстаннем сумесі SuperScript IV Vilo Master mix ад Thermo (Thermo, кат. № 11756050). Колькасная RT-PCR была праведзена з выкарыстаннем празрыстага рэакцыйнага пласціны Applied Biosystems Endura Plate Microamp на 384 лункі (Thermo, кат. № 4483319) і аптычнага клею Microamp (Thermo, кат. № 4311971). Рэакцыйная сумесь складалася з 5 мкл сумесі Taqman Fast Advanced Master mix (Thermo, кат. № 4444557), 0,5 мкл Taqman Primer і 3,5 мкл H2O, змяшаных на лунку. Стандартныя цыклы кПЛР былі праведзены, і значэнні CT былі вымераны з выкарыстаннем прыбора для ПЛР у рэжыме рэальнага часу Applied Biosystems Quantstudio 5 (384-лункавы модуль; прадукт № A28135). Праймеры Taqman былі набыты ў Thermo (GAPDH (Ss03375629_u1), PARP12 (Ss06908795_m1), PKDCC (Ss06903874_m1), CYGB (Ss06900188_m1), RGL1 (Ss06868890_m1), ACTN1 (Ss01009508_mH), GATA4 (Ss03383805_u1), GJA1 (Ss03374839_u1), COL1A2 (Ss03375009_u1), COL3A1 (Ss04323794_m1), ACTA2 (Ss04245588_m1). Значэнні CT усіх узораў былі нармалізаваны адносна гена хатняга ўтрымання GAPDH.
Вызваленне NT-ProBNP з асяроддзя ацэньвалі з выкарыстаннем набору NT-ProBNP (pig) (кат. № MBS2086979, MyBioSource) у адпаведнасці з пратаколам вытворцы. Карацей кажучы, у кожную лунку дадавалі па 250 мкл кожнага ўзору і стандарту ў двух экзэмплярах. Адразу пасля дадання ўзору дадайце 50 мкл рэагента для аналізу А ў кожную лунку. Акуратна страсяніце пласціну і зачыніце герметыкам. Затым планшэты інкубавалі пры тэмпературы 37°C на працягу 1 гадзіны. Затым адсмоктвайце раствор і прамывайце лункі 4 разы па 350 мкл раствора для прамывання 1X, інкубуючы раствор для прамывання па 1-2 хвіліны кожны раз. Затым дадайце па 100 мкл рэагента для аналізу B на лунку і зачыніце герметыкам для планшэта. Планшэт акуратна страсянулі і інкубавалі пры 37°C на працягу 30 хвілін. Адсмоктвайце раствор і прамывайце лункі 5 разоў па 350 мкл раствора для прамывання 1X. Дадайце 90 мкл раствора субстрата ў кожную лунку і зачыніце планшэт. Інкубуйце планшэт пры тэмпературы 37°C на працягу 10-20 хвілін. Дадайце 50 мкл стоп-раствора ў кожную лунку. Планшэт адразу ж вымяралі з дапамогай рыдэра планшэтаў Cytation (BioTek), усталяванага на 450 нм.
Для выбару памераў груп, якія забяспечаць магутнасць >80% для выяўлення 10% абсалютнай змены параметра з частатой памылак тыпу I 5%, быў праведзены аналіз магутнасці. Былі праведзены аналізы магутнасці, каб выбраць памеры груп, якія забяспечаць магутнасць >80% для выяўлення 10% абсалютнай змены параметра з 5% частатой памылак тыпу I. Аналіз магутнасці быў выкананы для выбару памераў групы, якія забяспечваюць >80% магутнасці для выяўленага змены 10% абсалютнага параметра з 5% частатой памылкі тыпу I. Быў праведзены аналіз магутнасці для выбару памераў груп, якія забяспечылі б магутнасць >80% для выяўлення 10% абсалютнай змены параметраў з частатой памылак тыпу I 5%.进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％I型错误率的组大小。进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％I型错误率的组大小。 Быў праведзены аналіз магутнасці для выбару памеру групы, які забяспечваў > 80% магутнасці для выяўлення змяненняў 10% абсалютнага параметра і 5% частаты памылак тыпу I. Быў праведзены аналіз магутнасці, каб выбраць памер групы, які забяспечыў бы магутнасць >80% для выяўлення 10% абсалютнай змены параметраў і 5% частаты памылак тыпу I.Зрэзы тканін былі выпадковым чынам адабраны перад эксперыментам. Усе аналізы былі сляпымі, і ўзоры былі расшыфраваны толькі пасля аналізу ўсіх дадзеных. Для выканання ўсіх статыстычных аналізаў выкарыстоўвалася праграмнае забеспячэнне GraphPad Prism (Сан-Дыега, Каліфорнія). Для ўсіх статыстычных дадзеных p-значэнні лічыліся значнымі пры значэннях <0,05. Для ўсіх статыстычных дадзеных p-значэнні лічыліся значнымі пры значэннях <0,05. Для ўсёй статыстыкі p-значэнні лічыліся значнымі пры значэннях <0,05. Для ўсіх статыстычных дадзеных p-значэнні лічыліся значнымі пры значэннях <0,05.对于所有统计数据，p 值在值<0,05 时被认为是显着的。对于所有统计数据，p 值在值<0,05 时被认为是显着的。 Для ўсёй статыстыкі p-значэнні лічыліся значнымі пры значэннях <0,05. Для ўсіх статыстычных дадзеных p-значэнні лічыліся значнымі пры значэннях <0,05.Двухбаковы t-крытэрый Стьюдэнта быў праведзены на дадзеных толькі з 2 параўнаннямі. Для вызначэння значнасці паміж некалькімі групамі выкарыстоўваўся аднафактарны або двухфактарны ANOVA. Пры правядзенні post hoc тэстаў для ўліку множных параўнанняў ужывалася карэкцыя Цьюкі. Дадзеныя RNAsec маюць асаблівыя статыстычныя асаблівасці пры разліку FDR і p.adjust, як апісана ў раздзеле "Метады".
Больш падрабязную інфармацыю пра дызайн даследавання глядзіце ў анатацыі даклада аб даследаванні ў натуры, спасылка на які ёсць у гэтым артыкуле.