Nature.com saytına daxil olduğunuz üçün təşəkkür edirik. İstifadə etdiyiniz brauzer versiyasında məhdud CSS dəstəyi var. Ən yaxşı təcrübə üçün yenilənmiş brauzerdən istifadə etməyinizi (və ya Internet Explorer-də Uyğunluq Rejimini deaktiv etməyinizi) tövsiyə edirik. Bu vaxt ərzində davamlı dəstəyi təmin etmək üçün saytı stillər və JavaScript olmadan render edəcəyik.
Dərman testi üçün ürəyin fizioloji mühitini dəqiq şəkildə təkrarlaya bilən etibarlı bir in vitro sistemə ehtiyac var. İnsan ürək toxuması kulturası sistemlərinin məhdud mövcudluğu ürək dərmanlarının təsirlərinin qeyri-dəqiq şərhlərinə səbəb olmuşdur. Burada ürək kəsiklərini elektromexaniki olaraq stimullaşdıran və ürək dövrünün sistolik və diastolik fazaları zamanı fizioloji dartılmaya məruz qalan ürək toxuması kulturası modeli (CTCM) hazırladıq. 12 günlük kulturadan sonra bu yanaşma ürək hissələrinin canlılığını qismən yaxşılaşdırdı, lakin onların struktur bütövlüyünü tam qorumadı. Buna görə də, kiçik molekullu skrininqdən sonra mühitimizə 100 nM triiodothyronine (T3) və 1 μM deksametazon (Dex) əlavə edilməsinin 12 gün ərzində hissələrin mikrostrukturunu qoruduğunu aşkar etdik. T3/Dex müalicəsi ilə birlikdə CTCM sistemi transkripsiya profillərini, canlılığı, metabolik aktivliyi və struktur bütövlüyünü 12 gün ərzində təzə ürək toxuması ilə eyni səviyyədə saxladı. Bundan əlavə, ürək toxumasının kulturada həddindən artıq uzanması hipertrofik ürək siqnalına səbəb olur və bu da CTCM-in ürək dartılması nəticəsində yaranan hipertrofik vəziyyətləri təqlid etmək qabiliyyətinə dair dəlil təqdim edir. Nəticə olaraq, CTCM uzun müddət ərzində kulturada ürəyin fiziologiyasını və patofiziologiyasını modelləşdirə bilər və bu da etibarlı dərman müayinəsinə imkan verir.
Klinik tədqiqatlardan əvvəl insan ürəyinin fizioloji mühitini dəqiq şəkildə təkrarlaya bilən etibarlı in vitro sistemlərə ehtiyac var. Bu cür sistemlər dəyişdirilmiş mexaniki dartılma, ürək döyüntüsü və elektrofizioloji xüsusiyyətləri təqlid etməlidir. Heyvan modelləri, insan ürəyində dərmanların təsirini əks etdirməkdə məhdud etibarlılıqla ürək fiziologiyası üçün skrininq platforması kimi istifadə olunur1,2. Nəticədə, İdeal Ürək Toxuması Mədəniyyəti Eksperimental Modeli (CTCM), insan ürəyinin fiziologiyasını və patofiziologiyasını dəqiq şəkildə təkrarlayan, müxtəlif terapevtik və farmakoloji müdaxilələr üçün yüksək həssaslıq və spesifiklik göstərən bir modeldir3. Belə bir sistemin olmaması ürək çatışmazlığı üçün yeni müalicələrin kəşfini məhdudlaşdırır4,5 və dərmanların kardiotoksikliyinin bazardan çıxmasının əsas səbəbi kimi qəbul edilməsinə səbəb olmuşdur6.
Son on ildə səkkiz qeyri-ürək-damar dərmanı klinik istifadədən çıxarılıb, çünki onlar QT intervalının uzanmasına səbəb olur və mədəcik aritmiyalarına və qəfil ölümə səbəb olur7. Beləliklə, ürək-damar effektivliyini və toksikliyini qiymətləndirmək üçün etibarlı preklinik müayinə strategiyalarına artan ehtiyac var. Dərman müayinəsi və toksiklik testində insan tərəfindən induksiya edilən pluripotent kök hüceyrə mənşəli kardiomiositlərin (hiPS-CM) son zamanlarda istifadəsi bu problemin qismən həllini təmin edir. Lakin, hiPS-CM-lərin yetişməmiş təbiəti və ürək toxumasının çoxhüceyrəli mürəkkəbliyinin olmaması bu metodun əsas məhdudiyyətləridir. Son tədqiqatlar göstərir ki, bu məhdudiyyəti spontan sancılar başladıqdan qısa müddət sonra ürək toxuması hidrogellərini yaratmaq üçün erkən hiPS-CM istifadə etməklə və zamanla tədricən elektrik stimullaşdırılmasını artırmaqla qismən aradan qaldırmaq olar. Lakin, bu hiPS-CM mikrotoxumalarında yetkin miokardın yetkin elektrofizioloji və yığılma xüsusiyyətləri yoxdur. Bundan əlavə, insan ürək toxuması daha mürəkkəb bir quruluşa malikdir və endotel hüceyrələri, neyronlar və stromal fibroblastlar da daxil olmaqla, müxtəlif hüceyrə növlərinin heterojen qarışığından ibarətdir və hüceyrədənkənar matris zülallarının spesifik dəstləri ilə bir-birinə bağlıdır. Yetkin məməli ürəyində qeyri-kardiomiosit populyasiyalarının11,12,13 bu heterojenliyi fərdi hüceyrə növlərindən istifadə edərək ürək toxumasının modelləşdirilməsində əsas maneədir. Bu əsas məhdudiyyətlər fizioloji və patoloji şəraitdə bütöv miokard toxumasının becərilməsi üçün metodların hazırlanmasının vacibliyini vurğulayır.
İnsan ürəyinin nazik (300 µm) kəsiklərinin becərilməsi, bütöv insan miokardının perspektivli bir modeli olduğunu sübut etmişdir. Bu metod, insan ürək toxumasına bənzər tam 3D çoxhüceyrəli sistemə çıxış təmin edir. Lakin, 2019-cu ilə qədər becərilmiş ürək kəsiklərinin istifadəsi qısa (24 saat) becərmə müddəti ilə məhdudlaşırdı. Bu, fiziki-mexaniki dartılmanın olmaması, hava-maye interfeysi və ürək toxumasının ehtiyaclarını dəstəkləməyən sadə mühitlərin istifadəsi daxil olmaqla bir sıra amillərlə əlaqədardır. 2019-cu ildə bir neçə tədqiqat qrupu göstərdi ki, ürək toxuması becərmə sistemlərinə mexaniki amillərin daxil edilməsi becərmə müddətini uzada, ürək ifadəsini yaxşılaşdıra və ürək patologiyasını təqlid edə bilər. İki zərif tədqiqat 17 və 18 göstərir ki, tək oxlu mexaniki yük becərmə zamanı ürək fenotipinə müsbət təsir göstərir. Lakin, bu tədqiqatlar ürək kəsikləri ya izometrik dartılma qüvvələri 17, ya da xətti auxotonik yük 18 ilə yükləndiyindən ürək dövrünün dinamik üçölçülü fiziki-mexaniki yüklənməsindən istifadə etməmişdir. Bu toxuma dartılması üsulları bir çox ürək geninin basdırılmasına və ya anormal dartılma reaksiyaları ilə əlaqəli genlərin həddindən artıq ifadə olunmasına səbəb oldu. Xüsusilə, Pitoulis və digərləri 19 güc çevirici geribildirimi və gərginlik sürücülərindən istifadə edərək ürək dövrünün yenidən qurulması üçün dinamik ürək diliminin kultura vannası hazırladılar. Bu sistem daha dəqiq in vitro ürək dövrünün modelləşdirilməsinə imkan versə də, metodun mürəkkəbliyi və aşağı ötürmə qabiliyyəti bu sistemin tətbiqini məhdudlaşdırır. Laboratoriyamız bu yaxınlarda donuz və insan ürək toxuması hissələrinin canlılığını 6 günə qədər qorumaq üçün elektrik stimullaşdırması və optimallaşdırılmış mühitdən istifadə edərək sadələşdirilmiş kultura sistemi hazırladı20,21.
Hazırkı əlyazmada, ürək dövrü ərzində üçölçülü ürək fiziologiyasını və patofizioloji genişlənməni təkrarlamaq üçün humoral işarələri özündə birləşdirən donuz ürəyinin bölmələrindən istifadə edərək ürək toxuması kulturası modelini (CTCM) təsvir edirik. Bu CTCM, klinik öncəsi dərman testi üçün məməli ürəyinin fiziologiyasını/patofiziologiyasını təqlid edən səmərəli, orta məhsuldarlıqlı ürək sistemi təmin etməklə, klinik öncəsi dərman proqnozunun dəqiqliyini əvvəllər heç vaxt əldə edilməmiş bir səviyyəyə qaldıra bilər.
Hemodinamik mexaniki siqnallar in vitro 22,23,24 şəraitində kardiomiosit funksiyasının qorunmasında mühüm rol oynayır. Hazırkı əlyazmada, həm elektrik, həm də mexaniki stimullaşdırmanı fizioloji tezliklərdə (1,2 Hz, dəqiqədə 72 vuruş) induksiya etməklə yetkin ürək mühitini təqlid edə bilən CTCM (Şəkil 1a) hazırlamışıq. Diastol zamanı toxumaların həddindən artıq uzanmasının qarşısını almaq üçün toxuma ölçüsünü 25% artırmaq üçün 3D çap cihazı istifadə edilmişdir (Şəkil 1b). C-PACE sistemi tərəfindən induksiya edilən elektrik stimulyasiyası ürək dövrünü tam şəkildə təkrarlamaq üçün məlumat toplama sistemindən istifadə edərək sistoldan 100 ms əvvəl başlamağa vaxtlanmışdır. Toxuma kulturası sistemi, yuxarı kamerada ürək dilimlərinin genişlənməsinə səbəb olmaq üçün çevik silikon membranı dövri olaraq genişləndirmək üçün proqramlaşdırıla bilən pnevmatik aktuatordan (LB Engineering, Almaniya) istifadə edir. Sistem təzyiq çeviricisi vasitəsilə xarici hava xəttinə qoşulmuşdur ki, bu da təzyiqi (± 1 mm civə sütunu) və vaxtı (± 1 ms) dəqiq tənzimləməyə imkan vermişdir (Şəkil 1c).
a Toxuma hissəsini cihazın kulturasiya kamerasının içərisində mavi rəngdə göstərilən 7 mm dayaq halqasına birləşdirin. Kulturasiya kamerası hava kamerasından nazik elastik silikon membranla ayrılmışdır. Sızmaların qarşısını almaq üçün hər kameranın arasına bir conta qoyun. Cihazın qapağında elektrik stimulyasiyası təmin edən qrafit elektrodlar var. b Böyük toxuma cihazının, istiqamətləndirici halqanın və dayaq halqasının sxematik təsviri. Toxuma bölmələri (qəhvəyi) böyük ölçülü cihazın üzərinə, istiqamətləndirici halqa isə cihazın xarici kənarındakı yivə yerləşdirilir. Rəhbərdən istifadə edərək, toxuma akril yapışdırıcısı ilə örtülmüş dayaq halqasını ürək toxuması bölməsinin üzərinə diqqətlə qoyun. c Proqramlaşdırıla bilən pnevmatik aktuator (PPD) tərəfindən idarə olunan hava kamerası təzyiqinin funksiyası kimi elektrik stimulyasiyasının vaxtını göstərən qrafik. Təzyiq sensorlarından istifadə edərək elektrik stimulyasiyasını sinxronlaşdırmaq üçün məlumat toplama cihazı istifadə edilmişdir. Kulturasiya kamerasındakı təzyiq müəyyən edilmiş həddə çatdıqda, elektrik stimulyasiyasını tetiklemek üçün C-PACE-EM-ə impuls siqnalı göndərilir. d İnkubator rəfinə yerləşdirilmiş dörd CTCM-in təsviri. Pnevmatik dövrə vasitəsilə bir PPD-yə dörd cihaz qoşulub və pnevmatik dövrədəki təzyiqi izləmək üçün təzyiq sensorları hemostatik klapana daxil edilir. Hər cihaz altı toxuma hissəsindən ibarətdir.
Tək pnevmatik aktuatordan istifadə edərək, hər biri 6 toxuma hissəsini saxlaya bilən 4 CTCM cihazını idarə edə bildik (Şəkil 1d). CTCM-də hava kamerasındakı hava təzyiqi maye kamerasındakı sinxron təzyiqə çevrilir və ürək diliminin fizioloji genişlənməsinə səbəb olur (Şəkil 2a və Əlavə Film 1). 80 mm civə sütununda toxuma dartılmasının qiymətləndirilməsi. Sənətdə toxuma hissələrinin 25% dartılması göstərilmişdir (Şəkil 2b). Bu faiz dartılmasının normal ürək bölməsinin yığılma qabiliyyəti üçün 2,2-2,3 µm fizioloji sarkomer uzunluğuna uyğun olduğu göstərilmişdir17,19,25. Toxuma hərəkəti xüsusi kamera parametrlərindən istifadə etməklə qiymətləndirilmişdir (Əlavə Şəkil 1). Toxuma hərəkətinin amplitudası və sürəti (Şəkil 2c, d) ürək dövrü ərzində dartılmaya və sistol və diastol zamanı vaxta uyğun gəlirdi (Şəkil 2b). Dartılma və relaksasiya zamanı ürək toxumasının dartılması və sürəti kulturada 12 gün ərzində sabit qalmışdır (Şəkil 2f). Kultivasiya zamanı elektrik stimullaşdırmasının yığılma qabiliyyətinə təsirini qiymətləndirmək üçün kölgələndirmə alqoritmindən istifadə edərək aktiv deformasiyanı təyin etmək üçün bir metod hazırladıq (Əlavə Şəkil 2a,b) və elektrik stimullaşdırması olan və olmayan deformasiyaları ayırd edə bildik. Ürəyin eyni hissəsi (Şəkil 2f). Kəsimin hərəkətli bölgəsində (R6-9) elektrik stimullaşdırması zamanı gərginlik elektrik stimullaşdırması olmadığı zaman gərginlikdən 20% yüksək idi ki, bu da elektrik stimullaşdırmasının yığılma funksiyasına verdiyi töhfəni göstərir.
Hava kamerası təzyiqinin, maye kamerası təzyiqinin və toxuma hərəkəti ölçmələrinin nümunəvi izləri kamera təzyiqinin maye kamerası təzyiqini dəyişdirdiyini və toxuma diliminin müvafiq hərəkətinə səbəb olduğunu təsdiqləyir. b Faiz uzanmasına (narıncı) uyğun toxuma hissələrinin faiz dartılmasının (mavi) nümunəvi izləri. c Ürək diliminin ölçülmüş hərəkəti ölçülmüş hərəkət sürəti ilə uyğundur. (d) Ürəyin bir dilimində tsiklik hərəkətin (mavi xətt) və sürətin (narıncı nöqtəli xətt) nümunəvi trayektoriyaları. e Dövr müddətinin (müxtəlif donuzlardan qrup başına n = 19 dilim), daralma vaxtının (qrup başına n = 19 dilim), relaksasiya vaxtının (müxtəlif donuzlardan qrup başına n = 19 dilim), toxuma hərəkətinin (müxtəlif donuzlardan qrup başına n = 25), pik sistolik sürətin (mövcud donuzlardan n = 24(D0), 25(D12) dilim/qrup) və pik relaksasiya sürətinin (mövcud donuzlardan n = 24(D0), 25(D12) dilim/qrup) kəmiyyətləndirilməsi. İki quyruqlu Student t-testi heç bir parametrdə əhəmiyyətli bir fərq göstərmədi. f (qırmızı) və (mavi) elektrik stimulyasiyası olmayan toxuma kəsiklərinin reprezentativ gərginlik analizi izləri, eyni kəsikdən toxuma kəsiklərinin on regional sahəsi. Alt panellər müxtəlif kəsiklərdən on sahədə elektrik stimulyasiyası olan və olmayan toxuma kəsiklərində gərginlikdəki faiz fərqinin kəmiyyətləndirilməsini göstərir. (n = müxtəlif donuzlardan 8 dilim/qrup, İkiquyruqlu Tələbə t-testi aparılır; ****p < 0.0001, **p < 0.01, *p < 0.05). (n = müxtəlif donuzlardan 8 dilim/qrup, İkiquyruqlu Tələbə t-testi aparılır; ****p < 0.0001, **p < 0.01, *p < 0.05). (n = 8 срезов/группу от разных свиней, проводится двусторонний t-kriteriy Stьюдента; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05). (n = müxtəlif donuzlardan 8 bölmə/qrup, ikiquyruqlu Student t-testi; ****p<0.0001, **p<0.01, *p<0.05). （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p < 0,0001，**p < 0,01，*5）0. （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p < 0,0001，**p < 0,01，*5）0. (n = 8 срезов/группу, от разных свиней, двусторонний стьюдента; ****p <0,0001, **p <0,01, *p <0,05). (n = 8 bölmə/qrup, müxtəlif donuzlardan, ikiquyruqlu Student t-testi; ****p<0.0001, **p<0.01, *p<0.05).Xəta zolaqları orta ± standart sapmanı təmsil edir.
Əvvəlki statik biomimetik ürək dilimlərinin kultura sistemimizdə [20, 21], elektrik stimulyasiyası tətbiq etməklə və mühit tərkibini optimallaşdırmaqla ürək dilimlərinin canlılığını, funksiyasını və struktur bütövlüyünü 6 gün ərzində qoruduq. Lakin, 10 gündən sonra bu rəqəmlər kəskin şəkildə aşağı düşdü. Əvvəlki statik biomimetik kultura sistemimizdə 20, 21 nəzarət şərtlərində (Ctrl) becərilən kəsiklərə istinad edəcəyik və əvvəllər optimallaşdırılmış mühitimizi MC şərtləri və eyni vaxtda mexaniki və elektrik stimulyasiyası (CTCM) altında kultura kimi istifadə edəcəyik. Əvvəlcə elektrik stimulyasiyası olmadan mexaniki stimullaşdırmanın toxuma canlılığını 6 gün saxlamaq üçün kifayət etmədiyini müəyyən etdik (Əlavə Şəkil 3a,b). Maraqlıdır ki, STCM istifadə edərək fizio-mexaniki və elektrik stimulyasiyasının tətbiqi ilə 12 günlük ürək kəsiklərinin canlılığı MS şəraitində təzə ürək kəsiklərindəki kimi qaldı, lakin MTT analizi ilə göstərildiyi kimi Ctrl şərtləri altında qalmadı (Şəkil 1). Bu, ürək dövrünün mexaniki stimullaşdırılması və simulyasiyasının toxuma kəsiklərini əvvəlki statik kultura sistemimizdə bildirildiyindən iki dəfə uzun müddət canlı saxlaya biləcəyini göstərir. Lakin, ürək troponini T və konneksin 43-ün immunoloji etiketlənməsi ilə toxuma hissələrinin struktur bütövlüyünün qiymətləndirilməsi göstərdi ki, 12-ci gündə MC toxumalarında konneksin 43 ifadəsi eyni gündə nəzarət qrupundakılara nisbətən xeyli yüksək idi. Lakin, vahid konneksin 43 ifadəsi və Z-disk əmələ gəlməsi tam qorunmadı (Şəkil 3b). Toxuma struktur bütövlüyünü ölçmək üçün süni intellekt (Sİ) çərçivəsindən26, ürək dilimlərinin struktur bütövlüyünü və flüoresansını lokalizasiya gücü baxımından avtomatik olaraq ölçmək üçün troponin-T və konneksin boyanmasına43 əsaslanan təsvir əsaslı dərin öyrənmə boru kəmərindən istifadə edirik. Bu metod, istinadda təsvir edildiyi kimi, ürək toxumasının struktur bütövlüyünü avtomatlaşdırılmış və qərəzsiz şəkildə etibarlı şəkildə ölçmək üçün Konvolyusiya Neyron Şəbəkəsindən (CNN) və dərin öyrənmə çərçivəsindən istifadə edir. 26. MC toxuması statik nəzarət bölmələri ilə müqayisədə 0-cı günə nisbətən daha yaxşı struktur oxşarlığı göstərdi. Bundan əlavə, Massonun trixrom boyanması, kulturanın 12-ci günündə nəzarət şəraiti ilə müqayisədə MS şəraitində fibrozun əhəmiyyətli dərəcədə aşağı faizini aşkar etdi (Şəkil 3c). CTCM ürək toxuması bölmələrinin canlılığını 12-ci gündə təzə ürək toxuması ilə oxşar səviyyəyə qaldırsa da, ürək bölmələrinin struktur bütövlüyünü əhəmiyyətli dərəcədə yaxşılaşdırmadı.
Sütun qrafiki, statik kulturada (D12 Ctrl) və ya CTCM-də (D12 MC) 12 gün ərzində təzə ürək dilimlərinin (D0) və ya ürək dilimlərinin kulturasının MTT canlılığının kəmiyyətləndirilməsini göstərir (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) müxtəlif donuzlardan alınmış dilim/qrup, birtərəfli ANOVA testi aparılır; ####p < 0.0001 D0 ilə müqayisədə və **p < 0.01 D12 Ctrl ilə müqayisədə). Sütun qrafiki, statik kulturada (D12 Ctrl) və ya CTCM-də (D12 MC) 12 gün ərzində təzə ürək dilimlərinin (D0) və ya ürək dilimlərinin kulturasının MTT canlılığının kəmiyyətləndirilməsini göstərir (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) müxtəlif donuzlardan alınmış dilim/qrup, birtərəfli ANOVA testi aparılır; ####p < 0.0001 D0 ilə müqayisədə və **p < 0.01 D12 Ctrl ilə müqayisədə).histoqram, müxtəlif donuzlardan alınmış MTT təzə ürək kəsiklərinin (D0) və ya ürək kəsiklərinin 12 gün ərzində statik kulturada (D12 nəzarət) və ya CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 nəzarət). ), 12 (D12 MC) kəsik/qrupda yaşama qabiliyyətinin kəmiyyətləndirilməsini göstərir, birtərəfli ANOVA testi aparılır;####p < 0,0001 üçün сравнению с D0 və **p < 0,01 üçün сравнению с D12 Ctrl). ####p < D0 ilə müqayisədə 0.0001 və **p < D12 ilə müqayisədə 0.01 Ctrl). a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切(D0)片或心脏切片培养12 天的MTT 活力的量化)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，切片/组，卛VA测试；与D0 相比，####p < 0.0001，与D12 Ctrl 相比，**p < 0.01)。 a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切(D0)片，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；与D0 相比，####p < 0.000l，与1D相比，**p。)Təzə ürək kəsiklərində (D0) və ya 12 gün ərzində statik kulturada (D12 nəzarət) və ya CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 nəzarət)), müxtəlif donuzlardan alınmış 12 (D12 MC) kəsik/qrupda becərilən ürək kəsiklərində MTT-nin canlılığının kəmiyyətləndirilməsini göstərən histoqram, birtərəfli ANOVA testi;####p < 0,0001 üçün сравнению с D0, **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p < D0 ilə müqayisədə 0.0001, **p < D12 ilə müqayisədə 0.01 Ctrl).b Troponin-T (yaşıl), connexin 43 (qırmızı) və DAPI (mavi) təzə təcrid olunmuş ürək kəsiklərində (D0) və ya statik şəraitdə (Ctrl) və ya CTCM şəraitində (MC) 12 gün ərzində becərilən ürək kəsiklərində) təmsilçi immunoflüoresans təsvirlərinin (boş miqyas = 100 µm). Ürək toxumasının struktur bütövlüyünün süni intellektlə kəmiyyətləndirilməsi (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) müxtəlif donuzlardan dilim/qrup, birtərəfli ANOVA testi aparılır; ####p < 0.0001 D0 ilə müqayisədə və ****p < 0.0001 D12 Ctrl ilə müqayisədə). Ürək toxumasının struktur bütövlüyünün süni intellektlə kəmiyyətləndirilməsi (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) müxtəlif donuzlardan dilim/qrup, birtərəfli ANOVA testi aparılır; ####p < 0.0001 D0 ilə müqayisədə və ****p < 0.0001 D12 Ctrl ilə müqayisədə). Количественная оценка структурной целостности сердечной ткани искусственным intellektom (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) müxtəlif svineylərdən srezov/grupp, provoditsya birdən-birə faktorlu test ANOVA-nı təqdim etdi < ##0#p; ##0#0 ****p < 0,0001 üçün сравнению с D12 Ctrl). Süni intellekt vasitəsilə ürək toxumasının struktur bütövlüyünün kəmiyyətləndirilməsi (müxtəlif donuzlardan n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) bölmə/qrup, birtərəfli ANOVA testi aparılıb; ####p < 0.0001, D0 və ****p < 0.0001 ilə müqayisədə D12 Ctrl ilə müqayisədə).人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) müxtəlif donuz dilimləri/qrupları, birtərəfli ANOVA testi #0#0;#0;#0;相比，****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）。人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) müxtəlif donuzların hər birinin dilimləri/qrupları, birtərəfli ANOVA testi#01;#01;与D0相比，****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）。 Iskusstvennyy intellekt for kolichestvennoy osenki strukturnoy celostnosti serdechnoy tkani (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) srezov/gruppu kajdoy iz müxtəlif sviney, birdən-birə test ANOVA; #, #0#p1 qarşı; #, #0#p. D12 Ctrl ilə < 0,0001). Ürək toxumasının struktur bütövlüyünü ölçmək üçün süni intellekt (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) müxtəlif donuzların hər birini bölmə/qruplaşdırmaq, birtərəfli ANOVA testi; ####p<0.0001 vs .D0 Müqayisə üçün ****p < 0.0001 D12 Ctrl ilə müqayisədə). c Masson trixrom boyama üsulu ilə boyanmış ürək dilimləri üçün təmsilçi şəkillər (solda) və kəmiyyətləndirmə (sağda) (müxtəlif donuzlardan hər biri n = 10 dilim/qrup, birtərəfli ANOVA testi aparılır; ####p < D0 ilə müqayisədə 0.0001 və ***p < D12 Ctrl ilə müqayisədə 0.001). c Masson trixrom boyama üsulu ilə boyanmış ürək dilimləri üçün təmsilçi şəkillər (solda) və kəmiyyətləndirmə (sağda) (müxtəlif donuzlardan n = 10 dilim/qrup, birtərəfli ANOVA testi aparılır; #### p < D0 ilə müqayisədə 0.0001 və ***p < D12 Ctrl ilə müqayisədə 0.001). c Reprezentativnıe изображения (слева) и количественная оценка (справа) срезов сердца, окрашенных трихромным красителем Массона (масштаб без покрытия = 500 мкм) (n = 10 srezov/gruppu on разных свиней, выпностный test A # #; D0 və ***p < 0,001 üçün D12 Ctrl üçün sravnenию 0,0001). c Masson trixrom boyama üsulu ilə boyanmış ürək kəsiklərinin təsvirləri (solda) və kəmiyyətləndirilməsi (sağda) (müxtəlif donuzlardan n = 10 kəsik/qrup, birtərəfli ANOVA testi aparılmışdır; #### D0 ilə müqayisədə p < 0.0001 və D12 Ctrl ilə müqayisədə ***p < 0.001). c 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像（左）和量化（右）（裸=m（右）（裸=尺0µn 10 个切片/组，每组来自不同的猪，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0.0001 与D0 ， 每组来自不同的猪， Ctrl 相比）. C 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 （左 左） 量化 （右） 裸尺度 庺度裸尺度 = 500 µm） （n = 10 个 切片 组 每 组 来自 不同 猪 ， 进行 单向 单向 单向 # # p # 0,0001 与D0 相比，***p < 0,001 与D12 Ctrl 相比）. c Reprezentativnıe izobrajeniya (слева) и количественный анализ (справа) срезов сердца, окрашенных трихромным красителем Массона (чистая шкала = 500 мкм) (n = 10 srezov/qruppa, kajdırıy ot drugoy disvinytor, potesno pervo) анализа ;### #p < 0,0001 üçün сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Masson trixrom boyama üsulu ilə boyanmış ürək kəsiklərinin (boş = 500 µm) təmsilçi təsvirləri (solda) və kəmiyyətləndirilməsi (sağda) (hər biri fərqli bir donuzdan olan n = 10 kəsik/qrup, birtərəfli dispersiya təhlili ilə sınaqdan keçirilmişdir ;### # p < 0.0001 D0 ilə müqayisədə, ***p < 0.001 D12 ilə müqayisədə Ctrl).Xəta zolaqları orta ± standart sapmanı təmsil edir.
Biz fərziyyə irəli sürdük ki, kultura mühitinə kiçik molekullar əlavə etməklə, CTCM kulturası zamanı kardiomiosit bütövlüyü yaxşılaşdırıla və fibroz inkişafının azala bilər. Buna görə də, az sayda qarışıq amillər olduğuna görə statik nəzarət kulturalarımızdan istifadə edərək kiçik molekullar üçün skrininq apardıq20,21. Bu skrininq üçün deksametazon (Dex), triiodothyronine (T3) və SB431542 (SB) seçildi. Bu kiçik molekullar əvvəllər hiPSC-CM kulturalarında sarkomer uzunluğunu, T-borularını və keçiricilik sürətini artırmaqla kardiomiositlərin yetkinləşməsini stimullaşdırmaq üçün istifadə edilmişdir. Bundan əlavə, həm Dex (qlükokortikoid), həm də SB-nin iltihabı yatırdığı məlumdur29,30. Buna görə də, bu kiçik molekullardan birinin və ya onların kombinasiyasının daxil edilməsinin ürək hissələrinin struktur bütövlüyünü yaxşılaşdırıb-yaxşılaşdırmayacağını sınaqdan keçirdik. İlkin skrininq üçün hər bir birləşmənin dozası hüceyrə kulturası modellərində geniş istifadə olunan konsentrasiyalara (1 μM Dex27, 100 nM T327 və 2.5 μM SB31) əsasən seçildi. 12 günlük kulturadan sonra T3 və Dex-in kombinasiyası optimal kardiomiosit struktur bütövlüyünə və minimal lifli remodelinqə səbəb oldu (Əlavə Şəkillər 4 və 5). Bundan əlavə, bu T3 və Dex konsentrasiyalarının ikiqat və ya ikiqat istifadəsi normal konsentrasiyalarla müqayisədə zərərli təsirlər yaratdı (Əlavə Şəkil 6a, b).
İlkin müayinədən sonra 4 becərmə şəraitinin üz-üzə müqayisəsini apardıq (Şəkil 4a): Ctrl: optimallaşdırılmış mühitimizdən istifadə edərək əvvəllər təsvir etdiyimiz statik kulturada becərilən ürək hissələri; 20.21 TD: Çərşənbə günü T3 və Ctrl əlavə edilmiş Dex; MC: əvvəllər optimallaşdırılmış mühitimizdən istifadə edərək CTCM-də becərilən ürək hissələri; və MT: mühitə T3 və Dex əlavə edilmiş CTCM. 12 günlük becərmədən sonra MS və MT toxumalarının canlılığı MTT analizi ilə qiymətləndirilən təzə toxumalardakı kimi qaldı (Şəkil 4b). Maraqlıdır ki, transvell kulturalarına (TD) T3 və Dex əlavə edilməsi Ctrl şərtləri ilə müqayisədə canlılığın əhəmiyyətli dərəcədə yaxşılaşmasına səbəb olmadı ki, bu da ürək hissələrinin canlılığının qorunmasında mexaniki stimullaşdırmanın mühüm rol oynadığını göstərir.
12 gün ərzində mühitdə mexaniki stimullaşdırmanın və T3/Dex əlavəsinin təsirlərini qiymətləndirmək üçün istifadə edilən dörd becərmə şəraitini təsvir edən eksperimental dizayn diaqramı. b Sütun qrafiki, müxtəlif donuzlardan götürülmüş təzə ürək dilimləri (D0) ilə müqayisədə bütün 4 becərmə şəraitində (Ctrl, TD, MC və MT) 12 gün sonra canlılığın kəmiyyətcə qiymətləndirilməsini göstərir (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD və D12 MT), 12 (D12 MC) dilim/qrup, birtərəfli ANOVA testi aparılır; ####p < 0.0001, ###p < D0 ilə müqayisədə 0.001 və **p < 0.01 D12 Ctrl ilə müqayisədə). b Sütun qrafiki, müxtəlif donuzlardan götürülmüş təzə ürək dilimləri (D0) ilə müqayisədə bütün 4 becərmə şəraitində (Ctrl, TD, MC və MT) 12 gün sonra canlılığın kəmiyyətcə qiymətləndirilməsini göstərir (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD və D12 MT), 12 (D12 MC) dilim/qrup, birtərəfli ANOVA testi aparılır; ####p < 0.0001, ###p < D0 ilə müqayisədə 0.001 və **p < D12 ctrl ilə müqayisədə 0.01). b Гистограмма 12 gündən sonra bütün 4 xidmət (nəzarət, TD, MC və MT) üzrə 12 gündən sonra mədəniyyəti qoruyur. TD и D12 MT), 12 (D12 MC) срезов/группу от разных свиней, проводится односторонний test ANOVA; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 по сравнению с D0 и **p < 0,01 сравнению D2). b Sütun qrafiki, təzə ürək kəsikləri (D0) ilə müqayisədə bütün 4 becərmə şəraitində (nəzarət, TD, MC və MT) 12 günlük becərmə sonrası canlılığın kəmiyyətləndirilməsini göstərir (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD və D12 MT), 12 (D12 MC) müxtəlif donuzlardan alınmış kəsik/qrup, birtərəfli ANOVA testi; ####p < 0.0001, ###p < 0.001 vs. D0 və **p < 0.01 D12 Ctrl ilə müqayisədə). b 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) (n = 18 (D12Dl)) TD 和D12 MT)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；####p < 0.0001；####p < 0.0001Ｘ#0.0.0.相比，**p < 0.01 与D12控制）。b 4 12 (D12 MC) b Гистограмма, показывающая все 4 условия культивирования (контроль, TD, MC i MT) üçün sravnenuyu və svejimi srezami serdca (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD və D12 MT), MC12, və 2012 срезы/группа, односторонний тест ANOVA ####p <0,0001, ###p <0,001 по сравнению с D0, **p <0,01 по сравнению с контролем D12). b Təzə ürək kəsikləri (D0) ilə müqayisədə bütün 4 becərmə şəraitini (nəzarət, TD, MC və MT) göstərən histoqram (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD və D12 MT), müxtəlif donuzlardan 12 (D12 MC) kəsik/qrup, birtərəfli ANOVA testi; ####p<0.0001, ###p<0.001 vs. D0, **p<0.01 vs. nəzarət D12). c Sütun qrafiki, 4 becərmə şəraitinin hamısında (Ctrl, TD, MC və MT) təzə ürək dilimləri (D0) ilə müqayisədə 12 gün sonra qlükoza axınının kəmiyyətləndirilməsini göstərir (müxtəlif donuzlardan alınan n = 6 dilim/qrup, birtərəfli ANOVA testi aparılır; ###p < 0.001, D0 ilə müqayisədə və ***p < 0.001, D12 Ctrl ilə müqayisədə). c Sütun qrafiki, 4 becərmə şəraitinin hamısında (Ctrl, TD, MC və MT) təzə ürək dilimləri (D0) ilə müqayisədə 12 gün sonra qlükoza axınının kəmiyyətləndirilməsini göstərir (müxtəlif donuzlardan alınan n = 6 dilim/qrup, birtərəfli ANOVA testi aparılır; ###p < 0.001, D0 ilə müqayisədə və ***p < 0.001, D12 Ctrl ilə müqayisədə). c Гистограмма показывает количественную оценку потока глюкозы cherez 12 gün ərzində bütün 4 xidmətlər mədəniyyəti (nəzarət, TD, MC və MT) üzrə sravneniyu so svejimi srezami serdca (D0) (n = 6 ədəd) Выполняется тест ANOVA; ###p < 0,001 по сравнению с D0 və ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Histoqram, təzə ürək kəsikləri (D0) ilə müqayisədə bütün 4 kultura şəraitində (nəzarət, TD, MC və MT) kulturadan 12 gün sonra qlükoza axınının kəmiyyətləndirilməsini göstərir (n = müxtəlif donuzlardan 6 kəsik/qrup, birtərəfli ANOVA testi aparılmışdır; ###p < D0 ilə müqayisədə 0.001 və ***p < D12 Ctrl ilə müqayisədə 0.001). c 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) 相比1弅）天的葡萄糖通量定量（n = 6 片/组，来自不同猪，单向执行ANOVA 测试；##01；#0#p < 0.相比，***p < 0,001 与D12 Ctrl 相比）。 C 条形图 显示 所有 4 种 条件 （（ctrl 、 td 、 mc 和 mt） 新鲜 心脏 切片 切片 切片 切片 切片 切片， 培养 后 后 12 天 的 通量 定量 （n = 6 片/组 ， 来自 猪 ， ， ， ， ， ， ， ，猪单向执行ANOVA 测试；###p < 0.001，与D0 相比，***p < 0.001 与D12 Ctrl 相比）。 c Гистограмма, показывающая количественную оценку потока глюкозы cherez 12 gün sonra bütün 4 usloviy mədəniyyət üçün (nəzarət, TD, MC və MT) üzrə sravnenuyu ilə svejimi srezey serdca (D0) (n =) односторонний Были проведены тесты ANOVA ###p < 0,001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению с D12 (kontrol). c Histoqram, kulturadan 12 gün sonra bütün 4 kultura şəraitində (nəzarət, TD, MC və MT) təzə ürək kəsikləri (D0) ilə müqayisədə qlükoza axınının kəmiyyətləndirilməsini göstərir (n = 6 kəsik/qrup, müxtəlif donuzlardan, birtərəfli). ANOVA testləri aparılıbmı, ###p < 0.001 D0 ilə müqayisədə, ***p < 0.001 D12 ilə müqayisədə (nəzarət).d On regional toxuma kəsmə nöqtəsində təzə (mavi), 12-ci gün MC (yaşıl) və 12-ci gün MT (qırmızı) toxumalarının gərginlik analizi qrafikləri (n = 4 dilim/qrup, birtərəfli ANOVA testi; qruplar arasında əhəmiyyətli bir fərq yox idi). e 10-12 gün ərzində statik şəraitdə (Ctrl) və ya MT şəraitində (MT) becərilən ürək bölmələri ilə müqayisədə təzə ürək bölmələrində (D0) fərqli ifadə olunmuş genləri göstərən vulkan qrafiki. f Hər bir becərmə şəraitində becərilən ürək bölmələri üçün sarkomer genlərinin istilik xəritəsi. Xəta zolaqları orta ± standart sapmanı təmsil edir.
Yağ turşusu oksidləşməsindən qlikolizə keçiddən metabolik asılılıq kardiomiositlərin dediferensiasiyasının əlamətidir. Yetişməmiş kardiomiositlər əsasən ATF istehsalı üçün qlükozadan istifadə edir və az miqdarda kristallarla hipoplastik mitoxondrilərə malikdirlər5,32. Qlükoza istifadəsinin təhlilləri göstərdi ki, MC və MT şəraitində qlükoza istifadəsinin 0-cı gün toxumalarındakına bənzər olduğu müşahidə olunur (Şəkil 4c). Lakin, Ctrl nümunələri təzə toxuma ilə müqayisədə qlükoza istifadəsində əhəmiyyətli dərəcədə artım göstərdi. Bu, CTCM və T3/Dex kombinasiyasının toxuma canlılığını artırdığını və 12 günlük becərilən ürək kəsiklərinin metabolik fenotipini qoruduğunu göstərir. Bundan əlavə, ştamm təhlili göstərdi ki, ştamm səviyyələri MT və MS şəraitində 12 gün ərzində təzə ürək toxumasındakı ilə eyni qalıb (Şəkil 4d).
CTCM və T3/Dex-in ürək dilim toxumasının qlobal transkripsiya mənzərəsinə ümumi təsirini təhlil etmək üçün dörd fərqli becərmə şəraitindən ürək dilimləri üzərində RNT seqmenti apardıq (Əlavə Məlumat 1). Maraqlıdır ki, MT bölmələri təzə ürək toxumasına yüksək transkripsiya oxşarlığı göstərdi, 13.642 gendən yalnız 16-sı fərqli şəkildə ifadə edildi. Lakin, əvvəllər göstərdiyimiz kimi, Ctrl bölmələri 10-12 gün becərmədən sonra 1229 fərqli şəkildə ifadə edilən gen nümayiş etdirdi (Şəkil 4e). Bu məlumatlar ürək və fibroblast genlərinin qRT-PCR ilə təsdiqləndi (Əlavə Şəkil 7a-c). Maraqlıdır ki, Ctrl bölmələri ürək və hüceyrə dövrü genlərinin aşağı tənzimlənməsini və iltihab gen proqramlarının aktivləşməsini göstərdi. Bu məlumatlar göstərir ki, normal olaraq uzunmüddətli becərmədən sonra baş verən dediferensiasiya MT şəraitində tamamilə zəifləyir (Əlavə Şəkil 8a,b). Sarkomer genlərinin diqqətlə öyrənilməsi göstərdi ki, yalnız MT şəraitində sarkomeri (Şəkil 4f) və ion kanalını (Əlavə Şəkil 9) kodlayan genlər qorunur və bu da onları Ctrl, TD və MC şəraitində basqıdan qoruyur. Bu məlumatlar göstərir ki, mexaniki və humoral stimullaşdırmanın (T3/Dex) kombinasiyası ilə ürək dilim transkriptomu 12 gün ərzində becərildikdən sonra təzə ürək dilimlərinə bənzər qala bilər.
Bu transkripsiya tapıntıları, ürək kəsiklərindəki kardiomiositlərin struktur bütövlüyünün MT şəraitində ən yaxşı şəkildə 12 gün ərzində qorunması ilə dəstəklənir ki, bu da bütöv və lokallaşdırılmış konneksin 43-də göstərilmişdir (Şəkil 5a). Bundan əlavə, MT şəraitində ürək kəsiklərində fibroz Ctrl ilə müqayisədə əhəmiyyətli dərəcədə azalmış və təzə ürək kəsiklərinə bənzər şəkildə olmuşdur (Şəkil 5b). Bu məlumatlar göstərir ki, mexaniki stimullaşdırma və T3/Dex müalicəsinin kombinasiyası ürək kəsiklərində ürək quruluşunu kulturada effektiv şəkildə qoruyur.
a Təzə təcrid olunmuş ürək kəsiklərində (D0) və ya ürək kəsiklərinin dörd kultura şəraitində 12 gün ərzində becərilən troponin-T (yaşıl), connexin 43 (qırmızı) və DAPI-nin (mavi) təmsilçi immunofluoresensiya görüntüləri (miqyas zolağı = 100 µm). Süni intellektlə ürək toxumasının struktur bütövlüyünün kəmiyyətləndirilməsi (n = 7 (D0 və D12 Ctrl), müxtəlif donuzlardan 5 (D12 TD, D12 MC və D12 MT) dilim/qrup, birtərəfli ANOVA testi aparılır; ####p < 0.0001, D0 və *p < 0.05 ilə müqayisədə və ya ****p < 0.0001, D12 Ctrl ilə müqayisədə). Süni intellektlə ürək toxumasının struktur bütövlüyünün kəmiyyətləndirilməsi (n = 7 (D0 və D12 Ctrl), müxtəlif donuzlardan 5 (D12 TD, D12 MC və D12 MT) dilim/qrup, birtərəfli ANOVA testi aparılır; #### D0 və *p < 0.05 ilə müqayisədə p < 0.0001 və ya D12 Ctrl ilə müqayisədə ****p < 0.0001). Количественная оценка структурной целостности ткани сердца с помощью искусственного intellekta (n = 7 (D0 və D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC və D12 MT) srezov/gruppu from fakults sviney, proveden A## ##VA; 0,0001 üçün сравнению с D0 və *p < 0,05 və ya ****p < 0,0001 üçün D12 Ctrl). Süni intellektdən istifadə edərək ürək toxumasının struktur bütövlüyünün kəmiyyətləndirilməsi (n = 7 (D0 və D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC və D12 MT) müxtəlif donuzlardan kəsik/qrup, birtərəfli ANOVA testi aparılmışdır; #### D0 ilə müqayisədə p < 0.0001 və *p < 0.05 və ya D12 Ctrl ilə müqayisədə ****p < 0.0001).对不同猪的心脏组织结构完整性（n = 7（D0 和D12 Ctrl）、5（D12 TD,D12 MC 和D12 MT）切片/组）进行人工智能量化，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0.0001 与D0 和*5 減0.0001 与D12 Ctrl 相比）。对 不同 猪 的 心脏 结构 完整性 （n = 7 （d0 和 d12 ctrl） （5 （d12 td 、 d12， 12 mc 弉人工 智能量 化 进行 单向 单向 单向 测试 ； ######### p < 0,0001 与D0 和撌*p < 0,05p 0.0001 与D12 Ctrl 相比）。Müxtəlif donuzlarda (n = 7 (D0 və D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC və D12 MT) bölmə/qrup) süni intellektdən istifadə edərək ürək toxumasının struktur bütövlüyünün kəmiyyətləndirilməsi birtərəfli ANOVA testi ilə;#### p < 0,0001 po сравнению с D0 и *p < 0,05 və ya ****p < 0,0001 po сравнению с D12 Ctrl). #### D0 ilə müqayisədə p < 0.0001 və D12 ilə müqayisədə *p < 0.05 və ya ****p < 0.0001 Ctrl). b Masson trixrom boyama üsulu ilə boyanmış ürək dilimləri üçün təmsilçi təsvirlər və kəmiyyətləndirmə (Miqyas zolağı = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD və D12 MC), müxtəlif donuzlardan 9 (D12 MT) dilim/qrup, birtərəfli ANOVA testi aparılır; ####p < 0.0001 D0 və ***p < 0.001 ilə müqayisədə və ya ****p < 0.0001 D12 Ctrl ilə müqayisədə). b Masson trixrom boyama üsulu ilə boyanmış ürək dilimləri üçün təmsilçi təsvirlər və kəmiyyətləndirmə (Miqyas zolağı = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD və D12 MC), müxtəlif donuzlardan 9 (D12 MT) dilim/qrup, birtərəfli ANOVA testi aparılır; ####p < 0.0001 D0 və ***p < 0.001 ilə müqayisədə və ya ****p < 0.0001 D12 Ctrl ilə müqayisədə). b Nümayəndəlik nişanı və kolichestvennaya oценка срезов сердца, окрашенных трихромным красителем Массона (масштабная линейка = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD və D12 MT2 MT), 9 (s) свиней, выполняется односторонний test ANOVA ####p < 0,0001 по сравнению с D0 və ***p < 0,001 və ya ****p < 0,0001 po сравнению с D12 Ctrl). b Masson trixrom boyama üsulu ilə boyanmış ürək kəsiklərinin nümunəvi təsvirləri və kəmiyyətləndirilməsi (miqyas zolağı = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD və D12 MC), müxtəlif donuzlardan götürülmüş 9 (D12 MT) kəsik/qrup, birtərəfli ANOVA ilə yerinə yetirilmişdir; ####p < 0.0001 vs. D0 və ***p < 0.001 və ya ****p < 0.0001 vs. D12 Ctrl). b 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像和量化（比例尺= 500 µm）1（0（2D = Ctrl、D12 TD 和D12 MC），来自不同猪的9 个（D12 MT）切片/组，进行单因素方差）0#p#0#p与D0 相比，***p < 0,001，或****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）。 b 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 和 量化 （比例 尺 尺 尺 = 500 µm（0dn = d12 ctrl 、 d12 td 和 d12 mc） 来自 不同 的 9 个 d12 mt 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 etkilenine bahset切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片/组，进行单因素方差分析；####p < 0.0001 与D0 相比，***p <0.**p 0.0001 与D12 Ctrl 相比）。 b Reprezentativnıe izobrajeniya və количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромом Массона (масштабная линейка = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD və D12 MC), 9 (D12 от MT) способ ANOVA; ####p < 0,0001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 və ya ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). b Masson trixromu (miqyas zolağı = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD və D12 MC), müxtəlif donuzlardan/qruplardan 9 (D12 MT) kəsik, bir ANOVA metodu ilə boyanmış ürək kəsiklərinin təmsilçi təsvirləri və kəmiyyətləndirilməsi; ####p < 0.0001 D0 ilə müqayisədə, ***p < 0.001 və ya ****p < 0.0001 D12 Ctrl ilə müqayisədə).Xəta zolaqları orta ± standart sapmanı təmsil edir.
Nəhayət, CTCM-in ürək hipertrofiyasını təqlid etmək qabiliyyəti ürək toxumasının dartılmasını artırmaqla qiymətləndirildi. CTCM-də pik hava kamerası təzyiqi 80 mm civə sütunundan (normal dartılma) 140 mm civə sütununa qədər artdı (Şəkil 6a). Bu, dartılmanın 32% artmasına uyğundur (Şəkil 6b), bu da əvvəllər hipertrofiyada müşahidə olunana bənzər bir sarkomer uzunluğuna nail olmaq üçün ürək kəsikləri üçün tələb olunan müvafiq faiz dartılması kimi göstərilmişdir. Dartılma və relaksasiya zamanı ürək toxumasının dartılması və sürəti altı günlük becərmə zamanı sabit qaldı (Şəkil 6c). MT şəraitindən alınan ürək toxuması altı gün ərzində normal dartılmaya (MT (Normal)) və ya həddindən artıq dartılma şəraitinə (MT (OS)) məruz qaldı. Artıq dörd gün becərildikdən sonra hipertrofik biomarker NT-ProBNP, MT (OS) şəraitində MT (normal) şəraitlə müqayisədə əhəmiyyətli dərəcədə yüksəldi (Şəkil 7a). Bundan əlavə, altı günlük becərmədən sonra MT-də (OS) hüceyrə ölçüsü (Şəkil 7b) MT ürəyinin kəsikləri ilə müqayisədə əhəmiyyətli dərəcədə artmışdır (normal). Bundan əlavə, həddindən artıq dartılmış toxumalarda NFATC4 nüvə translokasiyası əhəmiyyətli dərəcədə artmışdır (Şəkil 7c). Bu nəticələr hiper dartılmadan sonra patoloji yenidənqurmanın mütərəqqi inkişafını göstərir və CTCM cihazının dartılma ilə induksiya olunmuş ürək hipertrofiyası siqnalını öyrənmək üçün platforma kimi istifadə edilə biləcəyi konsepsiyasını dəstəkləyir.
Hava kamerası təzyiqinin, maye kamerası təzyiqinin və toxuma hərəkəti ölçmələrinin nümunəvi izləri kamera təzyiqinin maye kamerası təzyiqini dəyişdirdiyini və toxuma diliminin müvafiq hərəkətinə səbəb olduğunu təsdiqləyir. b Normal olaraq dartılmış (narıncı) və həddindən artıq dartılmış (mavi) toxuma bölmələri üçün nümunəvi dartılma faizi və dartılma sürəti əyriləri. c Dövr müddətini (müxtəlif donuzlardan qrup başına n = 19 dilim), daralma vaxtını (müxtəlif donuzlardan qrup başına n = 18-19 dilim), relaksasiya vaxtını (müxtəlif donuzlardan qrup başına n = 19 dilim)), toxuma hərəkətinin amplitudasını (müxtəlif donuzlardan n = 14 dilim/qrup), pik sistolik sürəti (müxtəlif donuzlardan n = 14 dilim/qrup) və pik relaksasiya sürətini (müxtəlif donuzlardan n = 14 (D0), 15 (D6)) göstərən sütun qrafiki, iki quyruqlu Student t-testi heç bir parametrdə əhəmiyyətli bir fərq göstərmədi, bu da bu parametrlərin həddindən artıq gərginliklə 6 günlük becərmə zamanı sabit qaldığını göstərir. Xəta zolaqları orta ± standart sapmanı təmsil edir.
a Müxtəlif donuzlardan MT normal dartılma (Norm) və ya həddindən artıq dartılma (OS) şərtləri (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm və D4 MTOS) dilim/qrup altında becərilən ürək dilimlərindən alınan becərmə mühitində NT-ProBNP konsentrasiyasının sütun qrafiki ilə kəmiyyətləndirilməsi, İki tərəfli ANOVA aparılır; **normal dartılma ilə müqayisədə p < 0.01). a) Müxtəlif donuzlardan MT normal dartılma (Norm) və ya həddindən artıq dartılma (OS) şərtləri (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm və D4 MTOS) dilim/qrup altında becərilən ürək dilimlərindən alınan becərmə mühitində NT-ProBNP konsentrasiyasının sütun qrafiki ilə kəmiyyətləndirilməsi, İki tərəfli ANOVA aparılır; **normal dartılma ilə müqayisədə p < 0.01).Müxtəlif donuzlardan normal MT dartılması (norm) və ya həddindən artıq dartılma (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm və D4).MTOS) dilimləri/qrupu şəraitində becərilən ürək dilimlərindən alınan kultura mühitində NT-ProBNP konsentrasiyasının kəmiyyət histoqramı, iki faktorlu dispersiya təhlili aparılır;**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **normal dartılma ilə müqayisədə p < 0.01). a 在MT 正常拉伸(Norm) 或过度拉伸(OS) 条件下培养的心脏切片培养基中NT-ProBNP浓度的条形图量化（n = 4 (D2 MTNorm)、3（D2 MTOS、D4 MTNorm 和D4 MTOS）来自不同猪的切片/组，进行双向方差分析；**与正常拉伸相比，p < 0.01 a MT normal uzanma (Norm) və ya həddən artıq uzanma (OS) şərtləri (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm和D4 MTOS) altında yetişdirilmiş ürək dilimlərində NT-ProBNP konsentrasiyasının kəmiyyəti.猪的切片/组，可以双向方方发发动; **normal uzanma ilə müqayisədə, p <0,01).histoqram Müxtəlif donuzlardan normal MT dartılması (normal) və ya həddindən artıq dartılma (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm) və D4 MTOS) dilim/qrup şəraitində becərilən ürək dilimlərində NT-ProBNP konsentrasiyalarının kəmiyyətləndirilməsi, iki tərəfli dispersiya təhlili;**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **normal dartılma ilə müqayisədə p < 0.01). b Troponin-T və WGA ilə boyanmış ürək dilimləri (solda) və hüceyrə ölçüsünün kəmiyyətləndirilməsi (sağda) üçün reprezentativ şəkillər (n = 330 (D6 MTOS), müxtəlif donuzlardan alınan 10 fərqli dilimdən 369 (D6 MTNorm) hüceyrə/qrup, İkiquyruqlu Tələbə t-testi aparılır; normal dartılma ilə müqayisədə ****p < 0.0001). b Troponin-T və WGA ilə boyanmış ürək dilimləri üçün reprezentativ şəkillər (solda) və hüceyrə ölçüsünün kəmiyyətləndirilməsi (sağda) (n = 330 (D6 MTOS), müxtəlif donuzlardan alınan 10 fərqli dilimdən 369 (D6 MTNorm) hüceyrə/qrup, İkiquyruqlu Tələbə t-testi aparılır; normal dartılma ilə müqayisədə ****p < 0.0001). b Nümayəndəlik izləyiciləri srezov serdca, okrashennıx troponinom-T və AZP (sleva) və kolichestvenngo optredelens razmera kletok (sprava) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) srazovny kletok/grup два- проводится хвостовой t-критерий Стьюдента ****p < 0,0001 по сравнению с нормальным растяжением). b Troponin-T və AZP ilə boyanmış ürək kəsiklərinin reprezentativ şəkilləri (solda) və hüceyrə ölçüsünün kəmiyyətləndirilməsi (sağda) (n = 330 (D6 MTOS), müxtəlif donuzlardan 10 fərqli kəsikdən 369 (D6 MTNorm) hüceyrə/qrup, ikiquyruqlu Student t-testi aparılmışdır; normal ştammla müqayisədə ****p < 0.0001). b 用肌钙蛋白-T 和WGA（左）和细胞大小量化（右）染色的心脏切片的心脏切片的代脏切片的代表切片的代表往开MTOS），来自不同猪的10 个不同切片的369（D6 MTNorm）细胞/组，两进行有尾t学检验；与正常拉伸相比，****p < 0,0001）。 b Kalkerin-T və WGA ilə boyanmış ürək dilimlərinin (solda) və hüceyrə ölçüsünün (sağda) təsvirləri (n = 330 (D6 MTOS), 10 müxtəlif dilimdən 369 (D6 MTNorm)) Hüceyrələr/Hüceyrələr, Normal dartılma ilə müqayisədə,****p < 0.0001). b Nümunəvi izləyicilər serdca, okrashennıx troponinom-T və AZP (sleva) və kolichestvennaya osenka razmera kletok (sprava) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) 10 ədəd kəsişmə, kəsişmələr, двусторонние критерий Стьюдента; ****p < 0,0001 по сравнению с нормальным растяжением). b Troponin-T və AZP ilə boyanmış ürək kəsiklərinin təsvirləri (solda) və hüceyrə ölçüsünün kəmiyyətləndirilməsi (sağda) (müxtəlif donuzlardan götürülmüş 10 fərqli kəsikdən n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm)) Hüceyrələr/qrup, ikiquyruqlu meyar Studentin t; ****p < 0.0001 normal gərginliklə müqayisədə). c Troponin-T və NFATC4 üçün immunoloji nişanlanmış MTOS ürək dilimlərinin 0-cı və 6-cı günlər üçün reprezentativ şəkillər və NFATC4-ün CM-lərin nüvələrinə translokasiyasının kəmiyyətləndirilməsi (n = 4 (D0), müxtəlif donuzlardan 3 (D6 MTOS) dilim/qrup, İkiquyruqlu Tələbə t-testi aparılır; *p < 0.05). c Troponin-T və NFATC4 üçün immunoloji nişanlanmış MTOS ürək dilimlərinin 0-cı və 6-cı günlər üçün reprezentativ şəkillər və NFATC4-ün CM-lərin nüvələrinə translokasiyasının kəmiyyətləndirilməsi (n = 4 (D0), müxtəlif donuzlardan 3 (D6 MTOS) dilim/qrup, İkiquyruqlu Tələbə t-testi aparılır; *p < 0.05). c 0 və 6 gün MTOS, troponina-T və NFATC4 üçün immunomeceniyalar, və NFATC4 və yadra kavernoznıx kletok (n = 4 (D0), 3D bölməsi) üçün NFATC4 translokasiyaları üçün nümayəndəliklər , выполняется двусторонний t-kriteriy Stьюдента *p < 0,05); c 0 və 6-cı günlərdə MTOS-da ürək kəsikləri üçün reprezentativ şəkillər, troponin-T və NFATC4 üçün immunoqrafik etiketlənmiş və kavernoz hüceyrələrin nüvəsində NFATC4 translokasiyasının kəmiyyətləndirilməsi (n = 4 (D0), müxtəlif donuzlardan 3 (D6 MTOS) dilim/qrup) ikiquyruqlu Student t-testi ilə yerinə yetirilmişdir; *p < 0.05). c 用于肌钙蛋白-T 和NFATC4 免疫标记的第0 天和第6 天MTOS心脏切片的代表性图像，以及来自不同猪的NFATC4 易位至CM 细胞核的量化！Dn = (MT4（0)切片/组, 进行双尾学生t 检验；*p < 0,05)。 c Kalkanin-T və NFATC4 immunobeling 第0天和第6天MTOS ürək dilimlərinin və NFATC4-ün müxtəlif NFATC4 易位至CM hüceyrə nüvəsindən olan reprezentativ şəkilləri的kəmiyyət化 (n = 4 (D0), 3 MT (MT6)时间双尾学生et 电影；*p < 0,05). c NFATC4 və NFATC4 üçün immunomarkirovki troponom-T və NFATC4 üçün müxtəlif səviyyələrdə (n = 4 (D0), 3 (D6/MTOS), 3 (D6-MTOS) CM-də translokasiyalar üçün NFATC4 üçün 0 və 6 gün ərzində MTOS nüsxələri. t-kriteriy Stьюдента; *p < 0,05). c Müxtəlif donuzlardan (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) dilim/qrup, ikiquyruqlu t-meyarına görə Student; *p < 0.05) CM nüvəsində troponin-T və NFATC4 immunoqrafik etiketlənməsi və NFATC4 translokasiyasının kəmiyyətləndirilməsi üçün 0 və 6-cı günlərdə MTOS ürək dilimlərinin təmsilçi şəkilləri.Xəta zolaqları orta ± standart sapmanı təmsil edir.
Translyasiya ürək-damar tədqiqatları ürək mühitini dəqiq şəkildə əks etdirən hüceyrə modelləri tələb edir. Bu tədqiqatda ürəyin ultra nazik hissələrini stimullaşdıra bilən bir CTCM cihazı hazırlanmış və xarakterizə edilmişdir. CTCM sistemi fizioloji olaraq sinxronlaşdırılmış elektromexaniki stimullaşdırma və T3 və Dex mayesinin zənginləşdirilməsini əhatə edir. Donuz ürək hissələri bu amillərə məruz qaldıqda, onların canlılığı, struktur bütövlüyü, metabolik aktivliyi və transkripsiya ifadəsi 12 günlük becərmədən sonra təzə ürək toxumasında olduğu kimi qalmışdır. Bundan əlavə, ürək toxumasının həddindən artıq uzanması hiperekstenziya nəticəsində ürəyin hipertrofiyasına səbəb ola bilər. Ümumilikdə, bu nəticələr normal ürək fenotipinin qorunmasında fizioloji becərmə şəraitinin kritik rolunu dəstəkləyir və dərman müayinəsi üçün platforma təmin edir.
Kardiomiositlərin fəaliyyəti və yaşaması üçün optimal mühitin yaradılmasına bir çox amillər təsir göstərir. Bu amillərdən ən barizləri (1) hüceyrələrarası qarşılıqlı təsirlər, (2) elektromexaniki stimullaşdırma, (3) humoral amillər və (4) metabolik substratlarla əlaqədardır. Fizioloji hüceyrələrarası qarşılıqlı təsirlər hüceyrədənkənar matris tərəfindən dəstəklənən çoxsaylı hüceyrə tiplərinin mürəkkəb üçölçülü şəbəkələrini tələb edir. Bu cür mürəkkəb hüceyrə qarşılıqlı təsirlərini fərdi hüceyrə tiplərinin birgə becərilməsi ilə in vitro şəkildə bərpa etmək çətindir, lakin ürək hissələrinin orqanotipik təbiətindən istifadə etməklə asanlıqla əldə etmək olar.
Kardiomiositlərin mexaniki dartılması və elektrik stimullaşdırılması ürək fenotipinin qorunması üçün vacibdir33,34,35. Mexaniki stimullaşdırma hiPSC-CM kondisionerləşdirilməsi və yetkinləşməsi üçün geniş istifadə olunsa da, bir neçə zərif tədqiqat bu yaxınlarda ürək dilimlərinin tək oxlu yüklənmədən istifadə edərək mədəniyyətdə mexaniki stimullaşdırılmasına cəhd etmişdir. Bu tədqiqatlar göstərir ki, 2D tək oxlu mexaniki yüklənmə mədəniyyət zamanı ürəyin fenotipinə müsbət təsir göstərir. Bu tədqiqatlarda ürəyin hissələri ya izometrik dartılma qüvvələri17, xətti auksotonik yüklənmə18 ilə yüklənmiş, ya da ürək dövrü güc ötürücü geribildirimi və gərginlik sürücüləri istifadə edilərək yenidən yaradılmışdır. Lakin, bu metodlar ətraf mühitin optimallaşdırılması olmadan tək oxlu toxuma dartılmasından istifadə edir və bu da bir çox ürək geninin basdırılmasına və ya anormal dartılma reaksiyaları ilə əlaqəli genlərin həddindən artıq ifadə olunmasına səbəb olur. Burada təsvir edilən CTCM, dövr müddəti və fizioloji dartılma baxımından təbii ürək dövrünü təqlid edən 3D elektromexaniki stimul təmin edir (25% dartılma, 40% sistol, 60% diastol və dəqiqədə 72 vuruş). Bu üçölçülü mexaniki stimullaşdırma toxuma bütövlüyünü qorumaq üçün kifayət etməsə də, toxumanın canlılığını, funksiyasını və bütövlüyünü kifayət qədər qorumaq üçün T3/Dex istifadə edərək humoral və mexaniki stimullaşdırmanın kombinasiyası tələb olunur.
Humoral amillər yetkin ürək fenotipinin modulyasiyasında mühüm rol oynayır. Bu, hüceyrə yetkinləşməsini sürətləndirmək üçün T3 və Dex-in becərmə mühitinə əlavə edildiyi HiPS-CM tədqiqatlarında vurğulanmışdır. T3 amin turşularının, şəkərlərin və kalsiumun hüceyrə membranları vasitəsilə daşınmasına təsir göstərə bilər36. Bundan əlavə, T3, yetkin kardiomiositlərdə sürətli büzüşmə miofibrillərinin əmələ gəlməsini təşviq edərək, fetal CM-də yavaş büzüşmə miofibrilləri ilə müqayisədə MHC-α ifadəsini və MHC-β aşağı tənzimlənməsini təşviq edir. Hipotiroid xəstələrində T3 çatışmazlığı miofibrilyar zolaqların itirilməsinə və tonus inkişaf sürətinin azalmasına səbəb olur37. Dex qlükokortikoid reseptorlarına təsir göstərir və təcrid olunmuş perfuziya olunmuş ürəklərdə miokard yığılma qabiliyyətini artırdığı göstərilmişdir38; bu yaxşılaşmanın kalsium çöküntüsünə əsaslanan girişə (SOCE) təsiri ilə əlaqəli olduğu düşünülür39,40. Bundan əlavə, Dex reseptorlarına bağlanır və immun funksiyasını və iltihabı basqılayan geniş hüceyrədaxili reaksiyaya səbəb olur30.
Nəticələrimiz göstərir ki, fiziki mexaniki stimullaşdırma (MS) Ctrl ilə müqayisədə ümumi kultura performansını yaxşılaşdırıb, lakin kulturada 12 gün ərzində canlılığı, struktur bütövlüyünü və ürək ifadəsini qoruyub saxlaya bilməyib. Ctrl ilə müqayisədə CTCM (MT) kulturalarına T3 və Dex əlavə edilməsi canlılığı yaxşılaşdırıb və 12 gün ərzində təzə ürək toxuması ilə oxşar transkripsiya profillərini, struktur bütövlüyünü və metabolik aktivliyi qoruyub saxlayıb. Bundan əlavə, toxuma dartılma dərəcəsini idarə etməklə, STCM istifadə edərək hiperekstenziya ilə induksiya edilmiş ürək hipertrofiyası modeli yaradılıb ki, bu da STCM sisteminin çox yönlülüyünü göstərir. Qeyd etmək lazımdır ki, ürəyin yenidən qurulması və fibrozu adətən qan dövranında olan hüceyrələri müvafiq sitokinləri, eləcə də faqositoz və digər yenidən qurulma amillərini təmin edə bilən bütöv orqanları əhatə etsə də, ürəyin hissələri stress və travmaya cavab olaraq fibrotik prosesi təqlid edə bilər. miofibroblastlara. Bu, əvvəllər bu ürək dilim modelində qiymətləndirilib. Qeyd etmək lazımdır ki, CTCM parametrləri taxikardiya, bradikardiya və mexaniki qan dövranı dəstəyi (mexaniki yüklənməmiş ürək) kimi bir çox vəziyyəti simulyasiya etmək üçün təzyiq/elektrik amplitudasını və tezliyini dəyişdirməklə modulyasiya edilə bilər. Bu, sistemi dərman testi üçün orta məhsuldarlığa çevirir. CTCM-in həddindən artıq gərginlikdən qaynaqlanan ürək hipertrofiyasını modelləşdirmək qabiliyyəti bu sistemi fərdiləşdirilmiş terapiya üçün sınaqdan keçirməyin yolunu açır. Nəticə olaraq, bu tədqiqat göstərir ki, mexaniki dartılma və humoral stimullaşdırma ürək toxuması kəsiklərinin kulturasını qorumaq üçün vacibdir.
Burada təqdim olunan məlumatlar CTCM-in bütöv miokardın modelləşdirilməsi üçün çox perspektivli bir platforma olduğunu göstərsə də, bu becərmə metodunun bəzi məhdudiyyətləri var. CTCM becərilməsinin əsas məhdudiyyəti, kəsiklərə davamlı dinamik mexaniki gərginliklər tətbiq etməsidir ki, bu da hər dövr ərzində ürək kəsiklərinin yığılmasını aktiv şəkildə izləmək imkanını istisna edir. Bundan əlavə, ürək kəsiklərinin kiçik ölçüsü (7 mm) səbəbindən ənənəvi qüvvə sensorlarından istifadə edərək becərmə sistemlərindən kənarda sistolik funksiyanı qiymətləndirmək imkanı məhduddur. Hazırkı əlyazmada, optik gərginliyi yığılma funksiyasının göstəricisi kimi qiymətləndirməklə bu məhdudiyyəti qismən aradan qaldırırıq. Lakin, bu məhdudiyyət əlavə iş tələb edəcək və gələcəkdə kalsium və gərginliyə həssas boyalardan istifadə edərək optik xəritələşdirmə kimi becərmədə ürək kəsiklərinin funksiyasının optik monitorinqi üçün metodlar tətbiq etməklə həll edilə bilər. CTCM-in digər bir məhdudiyyəti, işçi modelin fizioloji stressi (əvvəlcədən yükləmə və sonradan yükləmə) manipulyasiya etməməsidir. CTCM-də çox böyük toxumalarda diastolda (tam uzanma) və sistolda (elektrik stimulyasiyası zamanı yığılma uzunluğu) 25% fizioloji uzanmanı yaratmaq üçün təzyiq əks istiqamətlərdə induksiya edilmişdir. Bu məhdudiyyət gələcək CTCM dizaynlarında hər iki tərəfdən ürək toxumasına adekvat təzyiq göstərməklə və ürəyin kameralarında baş verən dəqiq təzyiq-həcm əlaqələrini tətbiq etməklə aradan qaldırılmalıdır.
Bu əlyazmada bildirilən həddindən artıq dartılma ilə induksiya edilmiş remodelinq hipertrofik hiperdartılma siqnallarını təqlid etməklə məhdudlaşır. Beləliklə, bu model humoral və ya neyron faktorlarına (bu sistemdə mövcud olmayan) ehtiyac olmadan dartılma ilə induksiya edilmiş hipertrofik siqnalın öyrənilməsinə kömək edə bilər. CTCM-in çoxluğunu artırmaq üçün əlavə tədqiqatlar tələb olunur, məsələn, immun hüceyrələri ilə birgə becərmə, dövran edən plazma humoral amilləri və neyron hüceyrələri ilə birgə becərmə zamanı innervasiya CTCM ilə xəstəliklərin modelləşdirilməsi imkanlarını artıracaq.
Bu tədqiqatda on üç donuzdan istifadə edilmişdir. Bütün heyvan prosedurları institutsional qaydalara uyğun olaraq həyata keçirilmiş və Luisvil Universitetinin İnstitusional Heyvanlara Baxım və İstifadə Komitəsi tərəfindən təsdiq edilmişdir. Aorta qövsü sıxılmış və ürəyə 1 litr steril kardioplegiya (110 mM NaCl, 1.2 mM CaCl2, 16 mM KCl, 16 mM MgCl2, 10 mM NaHCO3, 5 U/ml heparin, pH 7.4-ə qədər) ilə perfuziya edilmişdir; Ürəklər, adətən 10 dəqiqədən az müddətdə buz üzərində laboratoriyaya daşınana qədər buz kimi soyuq kardioplegik məhlulda saxlanıldı. Ürəklər, adətən 10 dəqiqədən az müddətdə buz üzərində laboratoriyaya daşınana qədər buz kimi soyuq kardioplegik məhlulda saxlanıldı. сердца хранили в ледяном кардиоплегическом расстворе до транспортировки в лабораторию на льду, что обычно занимает <10 min. ürəklər, adətən 10 dəqiqədən az vaxt aparan buz üzərində laboratoriyaya daşınana qədər buz kimi soyuq kardioplegik məhlulda saxlanılırdı.将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10刂钟将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10刂钟 Держите сердца в ледяной кардиоплегия до транспортировки в лабораторию на льду, обычно <10 min. Kardioplegiya zamanı ürəklər buz üzərində laboratoriyaya aparılana qədər, adətən 10 dəqiqədən az müddətə buz üzərində saxlanılmalıdır.
CTCM cihazı SolidWorks kompüter dəstəkli dizayn (CAD) proqram təminatında hazırlanmışdır. Kultivasiya kameraları, bölücülər və hava kameraları CNC şəffaf akril plastikdən hazırlanmışdır. 7 mm diametrli ehtiyat halqa mərkəzdə yüksək sıxlıqlı polietilendən (HDPE) hazırlanmışdır və altındakı mühiti möhürləmək üçün istifadə olunan silikon O-halqasını yerləşdirmək üçün O-halqa yivinə malikdir. Nazik silisium membran kultivasiya kamerasını ayırıcı lövhədən ayırır. Silikon membran 0,02 düym qalınlığında silikon təbəqədən lazerlə kəsilir və 35A sərtliyə malikdir. Alt və üst silikon contalar 1/16 düym qalınlığında silikon təbəqədən lazerlə kəsilir və 50A sərtliyə malikdir. Bloku bərkitmək və hava keçirməyən möhür yaratmaq üçün 316L paslanmayan polad vintlər və qanad qaykaları istifadə olunur.
Xüsusi çap dövrə lövhəsi (PCB) C-PACE-EM sistemi ilə inteqrasiya olunmaq üçün hazırlanmışdır. PCB-dəki İsveçrə maşın konnektor yuvaları gümüş örtüklü mis məftillər və elektrodlara vidalanmış bürünc 0-60 vintlər vasitəsilə qrafit elektrodlarına birləşdirilir. Çap dövrə lövhəsi 3D printerin qapağına yerləşdirilib.
CTCM cihazı ürək dövrünə bənzər idarə olunan qan dövranı təzyiqi yaradan proqramlaşdırıla bilən pnevmatik aktuator (PPD) tərəfindən idarə olunur. Hava kamerasının içərisindəki təzyiq artdıqca, çevik silikon membran yuxarıya doğru genişlənir və mühit toxuma sahəsinin altına məcbur edilir. Daha sonra toxuma sahəsi mayenin bu xaric edilməsi ilə daralacaq və diastol zamanı ürəyin fizioloji genişlənməsini təqlid edəcək. Relaksasiya zirvəsində qrafit elektrodları vasitəsilə elektrik stimulyasiyası tətbiq edildi ki, bu da hava kamerasındakı təzyiqi azaldıb toxuma hissələrinin büzülməsinə səbəb oldu. Borunun içərisində hava sistemindəki təzyiqi aşkar etmək üçün təzyiq sensoru olan hemostatik klapan var. Təzyiq sensoru tərəfindən hiss edilən təzyiq noutbuka qoşulmuş məlumat toplayıcıya tətbiq olunur. Bu, qaz kamerasının içərisindəki təzyiqin davamlı monitorinqini təmin edir. Maksimum kamera təzyiqinə (standart 80 mm civə sütunu, 140 mm civə sütunu OS) çatdıqda, məlumat toplama cihazına 4 V-a təyin edilmiş 2 ms üçün iki fazalı gərginlik siqnalı yaratmaq üçün C-PACE-EM sisteminə siqnal göndərmək əmri verildi.
Ürək kəsikləri alındı ​​və 6 quyuda becərmə şəraiti aşağıdakı kimi aparıldı: Yığılan ürəklər köçürmə qabından soyuq (4°C) kardioplegiya olan bir qaba köçürüldü. Sol mədəcik steril bıçaqla təcrid edildi və 1-2 sm3 hissələrə kəsildi. Bu toxuma blokları toxuma yapışdırıcısı ilə toxuma dayaqlarına birləşdirildi və Tyrode məhlulu olan titrəyən mikrotom toxuma vannasına yerləşdirildi və davamlı olaraq oksigenlə zənginləşdirildi (3 q/L 2,3-butandion monooksim (BDM), 140 mM NaCl (8.18 q), 6 mM KCl (0.447 q), 10 mM D-qlükoza (1.86 q), 10 mM HEPES (2.38 q), 1 mM MgCl2 (1 ml 1 M məhlul), 1.8 mM CaCl2 (1.8 ml 1 M məhlul), 1 L ddH2O-ya qədər). Titrəmə mikrotomu 80 Hz tezliyində, 2 mm üfüqi vibrasiya amplitudasında və 0,03 mm/s irəliləmə sürətində 300 µm qalınlığında dilimlər kəsmək üçün təyin edilmişdir. Məhlulu sərin saxlamaq üçün toxuma vannası buzla əhatə olunmuş və temperatur 4°C-də saxlanılmışdır. Bir mədəniyyət lövhəsi üçün kifayət qədər hissə əldə edilənə qədər toxuma hissələrini mikrotom vannasından buz üzərində davamlı oksigenləşdirilmiş Tyrode məhlulu olan inkubasiya vannasına köçürün. Transvell mədəniyyətləri üçün toxuma hissələri steril 6 mm enində poliuretan dayaqlara bərkidilmiş və 6 ml optimallaşdırılmış mühitə (199 mühit, 1x ITS əlavəsi, 10% FBS, 5 ng/ml VEGF, 10 ng/ml FGF-qələvi və 2X antibiotik-göbələk əleyhinə) yerləşdirilmişdir. C-Pace vasitəsilə toxuma hissələrinə elektrik stimulyasiyası (10 V, tezlik 1,2 Hz) tətbiq edilmişdir. TD şəraitində, hər mühit dəyişikliyində 100 nM və 1 μM-də təzə T3 və Dex əlavə edildi. Mühit gündə 3 dəfə dəyişdirilməzdən əvvəl oksigenlə doymuş olur. Toxuma kəsikləri 37°C və 5% CO2-də inkubatorda becərildi.
CTCM kulturaları üçün toxuma kəsikləri modifikasiya olunmuş Tyrode məhlulu olan Petri qabında xüsusi hazırlanmış 3D printerə yerləşdirilib. Cihaz ürək diliminin ölçüsünü dayaq halqasının sahəsinin 25%-i artırmaq üçün nəzərdə tutulub. Bu, Tyrode məhlulundan mühitə köçürüldükdən və diastol zamanı ürəyin kəsiklərinin uzanmaması üçün edilir. Histoakril yapışqan istifadə edərək, 300 µm qalınlığında kəsiklər 7 mm diametrli dayaq halqasına bərkidilib. Toxuma kəsiklərini dayaq halqasına bərkitdikdən sonra artıq toxuma kəsiklərini kəsin və bir cihaz üçün kifayət qədər kəsiklər hazır olana qədər birləşdirilmiş toxuma kəsiklərini buz üzərində (4°C) Tyrode məhlulu vannasına geri qoyun. Bütün cihazlar üçün ümumi emal müddəti 2 saatdan çox olmamalıdır. 6 toxuma kəsiyi dayaq halqalarına bərkidildikdən sonra CTCM cihazı yığılıb. CTCM kultura kamerası əvvəlcədən 21 ml əvvəlcədən oksigenləşdirilmiş mühitlə doldurulub. Toxuma kəsiklərini kultura kamerasına köçürün və hər hansı hava qabarcıqlarını pipetlə diqqətlə təmizləyin. Daha sonra toxuma hissəsi dəliyə yönəldilir və yavaşca yerinə basılır. Nəhayət, elektrod qapağını cihazın üzərinə qoyun və cihazı inkubatora köçürün. Sonra CTCM-i hava borusuna və C-PACE-EM sisteminə qoşun. Pnevmatik aktuator açılır və hava klapanı CTCM-i açır. C-PACE-EM sistemi iki fazalı stimullaşdırma zamanı 2 ms ərzində 1,2 Hz-də 4 V enerji vermək üçün konfiqurasiya edilmişdir. Elektrodlarda qrafit yığılmasının qarşısını almaq üçün mühit gündə iki dəfə, elektrodlar isə gündə bir dəfə dəyişdirilirdi. Lazım gələrsə, altlarına düşmüş ola biləcək hər hansı hava qabarcıqlarını xaric etmək üçün toxuma hissələri onların becərmə quyularından çıxarıla bilər. MT müalicə şəraiti üçün hər mühit dəyişikliyi ilə T3/Dex 100 nM T3 və 1 μM Dex ilə təzə əlavə edildi. CTCM cihazları 37°C və 5% CO2-də inkubatorda becərildi.
Ürək dilimlərinin uzanmış trayektoriyalarını əldə etmək üçün xüsusi kamera sistemi hazırlanmışdır. Navitar Zoom 7000 18-108mm makro linzası (Navitar, San Fransisko, Kaliforniya) ilə birlikdə SLR kamera (Canon Rebel T7i, Canon, Tokio, Yaponiya) istifadə edilmişdir. Vizuallaşdırma mühiti təzə mühitlə əvəz etdikdən sonra otaq temperaturunda aparılmışdır. Kamera 51° bucaq altında yerləşdirilir və video saniyədə 30 kadr sürətlə qeydə alınır. Əvvəlcə ürək dilimlərinin hərəkətini ölçmək üçün Image-J ilə açıq mənbəli proqram təminatı (MUSCLEMOTION43) istifadə edilmişdir. Maska, səs-küyün qarşısını almaq üçün ürək dilimlərinin döyünməsi üçün maraq dairələrini təyin etmək məqsədilə MATLAB (MathWorks, Natick, MA, ABŞ) istifadə edilərək yaradılmışdır. Əl ilə seqmentləşdirilmiş maskalar bütün şəkillərə kadr ardıcıllığında tətbiq olunur və sonra MUSCLEMOTION plagininə ötürülür. Muscle Motion, istinad kadrına nisbətən hərəkətini ölçmək üçün hər kadrdakı piksellərin orta intensivliyindən istifadə edir. Məlumatlar qeydə alınıb, süzülüb və ürək dövrü ərzində dövr müddətini ölçmək və toxuma dartılmasını qiymətləndirmək üçün istifadə edilib. Yazılan video birinci dərəcəli sıfır fazalı rəqəmsal filtrdən istifadə edərək sonradan emal edilib. Toxuma dartılmasını (pikdən pikə) ölçmək üçün qeydə alınan siqnalda pikləri və çökmələri ayırd etmək üçün pikdən pikə analiz aparılıb. Bundan əlavə, siqnal sürüşməsini aradan qaldırmaq üçün 6-cı dərəcəli polinomdan istifadə edərək trendlərin detrendi aparılır. Qlobal toxuma hərəkətini, dövr müddətini, relaksasiya vaxtını və daralma vaxtını təyin etmək üçün MATLAB-da proqram kodu hazırlanmışdır (Əlavə Proqram Kodu 44).
Gərginlik təhlili üçün, mexaniki dartılma qiymətləndirməsi üçün yaradılmış eyni videolardan istifadə edərək, əvvəlcə MUSCLEMOTION proqram təminatına uyğun olaraq hərəkət zirvələrini (ən yüksək (yuxarı) və ən aşağı (aşağı) hərəkət nöqtələrini) təmsil edən iki təsviri izlədik. Daha sonra toxuma bölgələrini seqmentləşdirdik və seqmentləşdirilmiş toxumaya bir formada kölgələmə alqoritmi tətbiq etdik (Əlavə Şəkil 2a). Seqmentləşdirilmiş toxuma daha sonra on alt təbəqəyə bölündü və hər səthdəki gərginlik aşağıdakı tənliklə hesablandı: Gərginlik = (Yuxarı-Aşağı)/Aşağı, burada Yuxarı və Aşağı müvafiq olaraq formanın parçanın yuxarı və aşağı kölgələrindən məsafələridir (Əlavə Şəkil 2b).
Ürək kəsikləri 4% paraformaldehiddə 48 saat fiksasiya edildi. Fiksasiya edilmiş toxumalar 1 saat 10% və 20% saxarozada, sonra isə bir gecə 30% saxarozada susuzlaşdırıldı. Daha sonra kəsiklər optimal kəsmə temperaturu birləşməsinə (OCT birləşməsinə) basdırıldı və tədricən izopentan/quru buz vannasında donduruldu. OCT yerləşdirmə bloklarını ayrılana qədər -80 °C-də saxlayın. Slaydlar 8 μm qalınlığında kəsiklər şəklində hazırlandı.
Ürək kəsiklərindən OCT-ni çıxarmaq üçün slaydları 95 °C-də 5 dəqiqə qızdırın. Hər slayda 1 ml PBS əlavə edin və otaq temperaturunda 30 dəqiqə inkubasiya edin, sonra otaq temperaturunda 15 dəqiqə PBS-də 0,1% Triton-X həll edərək kəsikləri hopdurun. Qeyri-spesifik antikorların nümunəyə bağlanmasının qarşısını almaq üçün slaydlara 1 ml 3% BSA məhlulu əlavə edin və otaq temperaturunda 1 saat inkubasiya edin. Daha sonra BSA çıxarıldı və slaydlar PBS ilə yuyuldu. Hər nümunəni qələmlə işarələyin. İlkin antikorlar (1% BSA-da 1:200 nisbətində durulaşdırılmış) (connexin 43 (Abcam; #AB11370), NFATC4 (Abcam; #AB99431) və troponin-T (Thermo Scientific; #MA5-12960) 90 dəqiqə ərzində, daha sonra siçan Alexa Fluor 488 (Thermo Scientific; #A16079)-a qarşı ikincili antikorlar (1% BSA-da 1:200 nisbətində durulaşdırılmış), dovşan Alexa Fluor 594 (Thermo Scientific; #T6391)-ə qarşı əlavə 90 dəqiqə ərzində əlavə edildi. Hədəf boyanmasını fondan ayırmaq üçün yalnız ikincili antikordan nəzarət olaraq istifadə etdik. Nəhayət, DAPI nüvə boyası əlavə edildi və slaydlar vectashield-ə (Vector Laboratories) yerləşdirildi və dırnaq boyası ilə möhürləndi. -x böyütmə) və 40x böyütmə ilə Keyence mikroskopu ilə möhürləndi.
WGA boyama üçün PBS-də 5 μg/ml nisbətində WGA-Alexa Fluor 555 (Thermo Scientific; #W32464) istifadə edildi və otaq temperaturunda 30 dəqiqə ərzində sabit hissələrə tətbiq edildi. Daha sonra slaydlar PBS ilə yuyuldu və hər slayda Sudan qarası əlavə edildi və 30 dəqiqə inkubasiya edildi. Daha sonra slaydlar PBS ilə yuyuldu və vectashield yerləşdirmə mühiti əlavə edildi. Slaydlar Keyence mikroskopunda 40x böyüdücü ilə görüntüləndi.
Nümunələrdən yuxarıda təsvir edildiyi kimi OCT çıxarıldı. OCT çıxarıldıqdan sonra slaydlar bir gecə ərzində Bouin məhluluna batırıldı. Daha sonra slaydlar 1 saat distillə edilmiş su ilə yuyuldu və sonra 10 dəqiqə Bibrich aloe turşusu fuchsin məhluluna yerləşdirildi. Daha sonra slaydlar distillə edilmiş su ilə yuyuldu və 10 dəqiqə ərzində 5% fosfomolibden/5% fosfotunqstik turşusu məhluluna yerləşdirildi. Yaxalamadan slaydları birbaşa 15 dəqiqə ərzində anilin mavisi məhluluna köçürün. Daha sonra slaydlar distillə edilmiş su ilə yuyuldu və 2 dəqiqə ərzində 1% sirkə turşusu məhluluna yerləşdirildi. Slaydlar 200 N etanolda quruduldu və ksilol köçürüldü. Ləkəli slaydlar 10x obyektivli Keyence mikroskopu ilə vizuallaşdırıldı. Fibroz sahəsinin faizi Keyence Analyzer proqram təminatı istifadə edilərək ölçüldü.
CyQUANT™ MTT Hüceyrə Canlılığı Təhlili (Invitrogen, Carlsbad, CA), kataloq nömrəsi V13154, istehsalçının protokoluna uyğun olaraq, bəzi dəyişikliklərlə birlikdə. Xüsusilə, MTT analizi zamanı toxuma ölçüsünün vahid olmasını təmin etmək üçün diametri 6 mm olan cərrahi yumruq istifadə edilmişdir. Toxumalar istehsalçının protokoluna uyğun olaraq MTT substratı olan 12 quyulu lövhənin quyularına ayrıca yerləşdirilmişdir. Kəsiklər 37°C-də 3 saat inkubasiya edilir və canlı toxuma MTT substratını metabolizə edərək bənövşəyi formazan birləşməsini əmələ gətirir. MTT məhlulu 1 ml DMSO ilə əvəz edilir və ürək kəsiklərindən bənövşəyi formazan çıxarmaq üçün 37°C-də 15 dəqiqə inkubasiya edilir. Nümunələr 96 quyulu şəffaf alt lövhələrdə DMSO-da 1:10 nisbətində durulaşdırıldı və bənövşəyi rəng intensivliyi 570 nm-də Cytation lövhə oxuyucusu (BioTek) istifadə edilərək ölçüldü. Oxunuşlar ürəyin hər bir diliminin çəkisinə uyğun olaraq normallaşdırıldı.
Ürək dilim mühiti, əvvəllər təsvir edildiyi kimi, qlükoza utilizasiyası analizi üçün 1 μCi/ml [5-3H]-qlükoza (Moravek Biochemicals, Brea, CA, ABŞ) tərkibli mühitlə əvəz edildi. 4 saatlıq inkubasiyadan sonra, 100 µl 0,2 N HCl ehtiva edən açıq mikrosantrifüj borusuna 100 µl mühit əlavə edin. Daha sonra boru 37°C-də 72 saat ərzində [3H]2O buxarlanması üçün 500 μl dH2O ehtiva edən sintillyasiya borusuna yerləşdirildi. Daha sonra mikrosantrifüj borusunu sintillyasiya borusundan çıxarın və 10 ml sintillyasiya mayesi əlavə edin. Sintillyasiya saymaları Tri-Carb 2900TR maye sintillyasiya analizatoru (Packard Bioscience Company, Meriden, CT, ABŞ) istifadə edilərək aparıldı. Daha sonra qlükoza istifadəsi [5-3H]-qlükozaya xas aktivlik, natamam tarazlıq və fon, [5-3H]-ın etiketlənməmiş qlükozaya durulaşdırılması və sintillyasiya əks effekti nəzərə alınmaqla hesablanmışdır. Məlumatlar ürəyin hissələrinin kütləsinə normallaşdırılır.
Trizol-da toxuma homogenizasiyasından sonra, istehsalçının protokoluna uyğun olaraq Qiagen miRNeasy Micro Kit #210874 istifadə edərək ürək kəsiklərindən RNT təcrid edildi. RNTeks kitabxanasının hazırlanması, ardıcıllığı və məlumatların təhlili aşağıdakı kimi aparıldı:
Nümunə başına 1 μg RNT, RNT kitabxanasının hazırlanması üçün başlanğıc material kimi istifadə edilmişdir. Ardıcıllıq kitabxanaları istehsalçının tövsiyələrinə uyğun olaraq NEBNext UltraTM RNT Kitabxana Hazırlıq Dəsti (NEB, ABŞ) istifadə edilərək Illumina üçün yaradıldı və hər nümunə üçün atribut ardıcıllıqlarına indeks kodları əlavə edildi. Qısaca desək, mRNT poli-T oliqonukleotidləri ilə birləşdirilmiş maqnit muncuqları istifadə edilərək ümumi RNT-dən təmizləndi. Fraqmentasiya NEBNext Birinci Zəncir Sintez Reaksiya Buferində (5X) yüksək temperaturda ikivalentli kationlar istifadə edilərək həyata keçirilir. Birinci zəncir kDNT təsadüfi heksamer praymerləri və M-MuLV tərs transkriptaza (RNase H-) istifadə edilərək sintez edilmişdir. İkinci zəncir kDNT daha sonra DNT polimeraza I və RNase H istifadə edilərək sintez edilir. Qalan çıxıntılar eksonukleaza/polimeraza aktivliyi ilə küt uclara çevrilir. DNT fraqmentinin 3′ ucunun adenilləşdirilməsindən sonra, hibridləşməyə hazırlamaq üçün ona saç sancağı halqası quruluşuna malik NEBNext Adapteri bağlanır. Üstünlük verilən 150-200 bp uzunluqlu kDNT fraqmentlərinin seçilməsi üçün kitabxana fraqmentləri AMPure XP sistemi (Beckman Coulter, Beverly, ABŞ) istifadə edilərək təmizləndi. Daha sonra, PCR-dən əvvəl ölçüsü seçilmiş kDNT ilə adapterlə bağlanmış 3 μl USER fermenti (NEB, ABŞ) 37°C-də 15 dəqiqə, sonra isə 95°C-də 5 dəqiqə istifadə edildi. Daha sonra PCR Phusion High-Fidelity DNT polimerazı, universal PCR praymerləri və Index (X) praymerləri istifadə edilərək həyata keçirildi. Nəhayət, PCR məhsulları təmizləndi (AMPure XP sistemi) və kitabxana keyfiyyəti Agilent Bioanalyzer 2100 sistemində qiymətləndirildi. Daha sonra kDNT kitabxanası Novaseq sekvenseri istifadə edilərək ardıcıllaşdırıldı. Illumina-dan xam şəkil faylları CASAVA Base Calling istifadə edilərək xam oxunuşlara çevrildi. Xam məlumatlar oxunuş ardıcıllıqlarını və müvafiq əsas keyfiyyətləri ehtiva edən FASTQ(fq) formatlı fayllarda saxlanılır. Süzgülənmiş ardıcıllıq oxunuşlarını Sscrofa11.1 istinad genomuna uyğunlaşdırmaq üçün HISAT2 seçin. Ümumiyyətlə, HISAT2, 4 milyard bazadan böyük genomlar da daxil olmaqla, istənilən ölçülü genomları dəstəkləyir və əksər parametrlər üçün standart dəyərlər təyin olunur. RNT Seq məlumatlarından birləşdirici oxunuşlar, hazırda mövcud olan ən sürətli sistem olan HISAT2 istifadə edərək, digər metodlarla eyni və ya daha yaxşı dəqiqliklə səmərəli şəkildə uyğunlaşdırıla bilər.
Transkriptlərin bolluğu birbaşa gen ifadəsinin səviyyəsini əks etdirir. Gen ifadəsi səviyyələri genom və ya ekzonlarla əlaqəli transkriptlərin bolluğu (ardıcıllıq sayı) ilə qiymətləndirilir. Oxunmaların sayı gen ifadəsi səviyyələri, gen uzunluğu və ardıcıllıq dərinliyi ilə mütənasibdir. FPKM (milyon baza cütü başına ardıcıllıqla təyin olunmuş transkriptin min baza cütünə düşən fraqmentlər) hesablandı və diferensial ifadənin P-dəyərləri DESeq2 paketi istifadə edilərək təyin edildi. Daha sonra daxili R-funksiyası "p.adjust" əsasında Benjamini-Hochberg metodundan9 istifadə edərək hər P dəyəri üçün yalançı kəşf nisbətini (FDR) hesabladıq.
Ürək kəsiklərindən təcrid olunmuş RNT, Thermo şirkətinin SuperScript IV Vilo Master qarışığı (Thermo, cat. no. 11756050) istifadə edilərək 200 ng/μl konsentrasiyasında kDNT-yə çevrildi. Kəmiyyət RT-PCR, Applied Biosystems Endura Plate Microamp 384 quyusu şəffaf reaksiya lövhəsi (Thermo, cat. no. 4483319) və mikroamp optik yapışdırıcı (Thermo, cat. no. 4311971) istifadə edilərək həyata keçirildi. Reaksiya qarışığı 5 µl Taqman Fast Advanced Master qarışığından (Thermo, cat # 4444557), 0,5 µl Taqman Primerindən və hər quyuda 3,5 µl qarışdırılmış H2O-dan ibarət idi. Standart qPCR dövrləri işlədildi və KT dəyərləri Applied Biosystems Quantstudio 5 real vaxt PCR cihazı (384 quyu modulu; məhsul # A28135) istifadə edilərək ölçüldü. Taqman praymerləri Thermo (GAPDH (Ss03375629_u1), PARP12 (Ss06908795_m1), PKDCC (Ss06903874_m1), CYGB (Ss06900188_m1), RGL1 (Ss06868890_m1), ACTN1 (Ss01009508_mH), GATA4 (Ss03383805_u1), GJA1 (Ss03374839_u1), COL1A2 (Ss03375009_u1), COL3A1 (Ss04323794_m1), ACTA2 (Ss04245588_m1) şirkətlərindən alınmışdır. Bütün nümunələrin KT dəyərləri GAPDH ev təsərrüfatı geninə normallaşdırılıb.
NT-ProBNP-nin mediada yayımlanması istehsalçının protokoluna uyğun olaraq NT-ProBNP dəsti (donuz) (Kat. № MBS2086979, MyBioSource) istifadə edilərək qiymətləndirildi. Qısaca desək, hər quyuya hər nümunədən və standartdan 250 µl ikiqat nüsxədə əlavə edildi. Nümunəni əlavə etdikdən dərhal sonra hər quyuya 50 µl A Təcrübə Reagenti əlavə edin. Plitəni yavaşca silkələyin və mastiklə möhürləyin. Sonra tabletlər 37°C-də 1 saat inkubasiya edildi. Sonra məhlulu sorub quyuları 350 µl 1X yuma məhlulu ilə 4 dəfə yuyun, hər dəfə yuma məhlulu 1-2 dəqiqə inkubasiya edin. Sonra hər quyuya 100 µl B Təcrübə Reagenti əlavə edin və plitə mastiklə möhürləyin. Tablet yavaşca silkələndi və 37°C-də 30 dəqiqə inkubasiya edildi. Məhlulu sorub quyuları 350 µl 1X yuma məhlulu ilə 5 dəfə yuyun. Hər quyuya 90 µl substrat məhlulu əlavə edin və lövhəni bağlayın. Plitəni 37°C-də 10-20 dəqiqə inkubasiya edin. Hər quyuya 50 µl Stop Məhlulu əlavə edin. Plitə dərhal 450 nm-də quraşdırılmış Cytation (BioTek) lövhə oxuyucusu ilə ölçüldü.
Parametrdə 10% mütləq dəyişikliyi aşkar etmək üçün 5% I Tip səhv nisbəti ilə >80% güc təmin edəcək qrup ölçülərini seçmək üçün güc təhlilləri aparılmışdır. Parametrdə 10% mütləq dəyişikliyi aşkar etmək üçün 5% I Tip səhv nisbəti ilə >80% güc təmin edəcək qrup ölçülərini seçmək üçün güc təhlilləri aparılmışdır. 10% çox izmeniya parametrləri üçün 10% çox izmeniya üçün 80% -dən çox fərqli qruplar üçün təhlil edin. 5% I Tip səhv nisbəti ilə 10% mütləq parametr dəyişikliyini aşkar etmək üçün >80% güc təmin edəcək qrup ölçülərini seçmək məqsədilə güc təhlili aparılmışdır.进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％I型错误率的组大小。进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％I型错误率的组大小。 10% həddən artıq istifadə parametrləri və 5% növbə I. 10% mütləq parametr dəyişikliyini və 5% I tip səhv nisbətini aşkar etmək üçün >80% güc təmin edəcək bir qrup ölçüsü seçmək üçün güc təhlili aparılmışdır.Təcrübədən əvvəl toxuma kəsikləri təsadüfi olaraq seçildi. Bütün analizlər şərti olaraq aparıldı və nümunələr yalnız bütün məlumatlar təhlil edildikdən sonra deşifrə edildi. Bütün statistik təhlilləri aparmaq üçün GraphPad Prism proqram təminatından (San Dieqo, Kaliforniya) istifadə edildi. Bütün statistikalar üçün p-dəyərləri <0.05 dəyərlərində əhəmiyyətli hesab edilmişdir. Bütün statistikalar üçün p-dəyərləri <0.05 dəyərlərində əhəmiyyətli hesab edilmişdir. <0,05 statistik məlumat üçün. Bütün statistikalar üçün p-dəyərləri <0.05 dəyərlərində əhəmiyyətli hesab edilmişdir.对于所有统计数据，p 值在值<0.05 时被认为是显着的。对于所有统计数据，p 值在值<0.05 时被认为是显着的。 <0,05 statistik məlumat üçün. Bütün statistikalar üçün p-dəyərləri <0.05 dəyərlərində əhəmiyyətli hesab edilmişdir.İki quyruqlu Tələbə t-testi məlumatlar üzərində yalnız 2 müqayisə ilə aparılmışdır. Bir və ya iki tərəfli ANOVA çoxsaylı qruplar arasında əhəmiyyəti müəyyən etmək üçün istifadə edilmişdir. Post-hoc testləri aparılarkən, çoxsaylı müqayisələri nəzərə almaq üçün Tukey düzəlişi tətbiq edilmişdir. Metodlar bölməsində təsvir edildiyi kimi, FDR və p.adjust hesablanarkən RNAsec məlumatları xüsusi statistik mülahizələrə malikdir.
Tədqiqat dizaynı haqqında daha çox məlumat üçün bu məqaləyə keçid verən Təbiət Tədqiqatı Hesabatının xülasəsinə baxın.