Nature.com saytına daxil olduğunuz üçün təşəkkür edirik.İstifadə etdiyiniz brauzer versiyasında məhdud CSS dəstəyi var.Ən yaxşı təcrübə üçün sizə yenilənmiş brauzerdən istifadə etməyi tövsiyə edirik (və ya Internet Explorer-də Uyğunluq rejimini söndürün).Bu arada, davamlı dəstəyi təmin etmək üçün biz saytı üslub və JavaScript olmadan təqdim edəcəyik.
Dərman sınağı üçün ürəyin fizioloji mühitini dəqiq şəkildə təkrarlaya bilən etibarlı in vitro sistemə ehtiyac var.İnsan ürək toxuması mədəniyyət sistemlərinin məhdud mövcudluğu ürək dərmanlarının təsirlərinin qeyri-dəqiq şərhinə səbəb olmuşdur.Burada biz ürək dövrünün sistolik və diastolik fazaları zamanı ürək dilimlərini elektromekanik şəkildə stimullaşdıran və fizioloji uzanmaya məruz qalan ürək toxuma mədəniyyəti modelini (CTCM) hazırlamışıq.12 günlük mədəniyyətdən sonra bu yanaşma ürək bölmələrinin canlılığını qismən yaxşılaşdırdı, lakin onların struktur bütövlüyünü tam olaraq qorumadı.Buna görə də, kiçik molekullu skrininqdən sonra müəyyən etdik ki, mühitimizə 100 nM triiodotironin (T3) və 1 μM deksametazon (Dex) əlavə edilməsi 12 gün ərzində bölmələrin mikrostrukturunu qoruyub saxlayır.T3/Dex müalicəsi ilə birlikdə CTCM sistemi transkripsiya profillərini, canlılığı, metabolik aktivliyi və struktur bütövlüyünü 12 gün ərzində təzə ürək toxuması ilə eyni səviyyədə saxladı.Bundan əlavə, mədəniyyətdə ürək toxumasının həddindən artıq uzanması hipertrofik ürək siqnalına səbəb olur, bu da CTCM-nin ürəyin uzanması nəticəsində yaranan hipertrofik şərtləri təqlid etmək qabiliyyətinə dəlil təmin edir.Nəticə olaraq, CTCM uzun müddət ərzində mədəniyyətdə ürəyin fiziologiyasını və patofiziologiyasını modelləşdirə bilər ki, bu da etibarlı dərman skrininqinə imkan verir.
Klinik tədqiqatdan əvvəl insan ürəyinin fizioloji mühitini dəqiq şəkildə təkrarlaya bilən etibarlı in vitro sistemlərə ehtiyac var.Belə sistemlər dəyişdirilmiş mexaniki uzanma, ürək dərəcəsi və elektrofizioloji xüsusiyyətləri təqlid etməlidir.Heyvan modelləri dərmanların insan ürəyinə təsirini əks etdirən məhdud etibarlılıqla ürək fiziologiyası üçün skrininq platforması kimi istifadə olunur1,2.Nəhayət, İdeal Ürək Toxuması Mədəniyyəti Eksperimental Modeli (CTCM) müxtəlif terapevtik və farmakoloji müdaxilələr üçün yüksək həssas və spesifik olan, insan ürəyinin fiziologiyasını və patofiziologiyasını dəqiq şəkildə əks etdirən modeldir3.Belə bir sistemin olmaması ürək çatışmazlığı üçün yeni müalicə üsullarının kəşfini məhdudlaşdırır4,5 və bazardan çıxmaq üçün əsas səbəb kimi dərmanların kardiotoksikliyinə səbəb olmuşdur6.
Son onillikdə ürək-damar sistemi ilə əlaqəli olmayan səkkiz dərman klinik istifadədən çıxarılıb, çünki onlar mədəcik aritmiyalarına və qəfil ölümə səbəb olan QT intervalının uzanmasına səbəb olur7.Beləliklə, ürək-damar sisteminin effektivliyini və toksikliyini qiymətləndirmək üçün etibarlı preklinik skrininq strategiyalarına artan ehtiyac var.Dərmanların skrininqində və toksiklik testində insan tərəfindən induksiya olunan pluripotent kök hüceyrə törəmə kardiyomiyositlərin (hiPS-CM) son istifadəsi bu problemin qismən həllini təmin edir.Bununla belə, hiPS-CM-lərin yetişməmiş təbiəti və ürək toxumasının çoxhüceyrəli mürəkkəbliyinin olmaması bu metodun əsas məhdudiyyətləridir.Son tədqiqatlar göstərdi ki, kortəbii daralmaların başlanmasından qısa müddət sonra ürək toxuması hidrogelləri yaratmaq üçün erkən hiPS-CM-dən istifadə etməklə və zamanla elektrik stimulyasiyasını tədricən artırmaqla bu məhdudiyyət qismən aradan qaldırıla bilər.Bununla belə, bu hiPS-CM mikrotoxumalarında yetkin miokardın yetkin elektrofizioloji və kontraktil xüsusiyyətləri yoxdur.Bundan əlavə, insan ürək toxuması hüceyrədənkənar matriks zülallarının xüsusi dəstləri ilə bir-birinə bağlı olan endotel hüceyrələri, neyronlar və stromal fibroblastlar daxil olmaqla müxtəlif hüceyrə növlərinin heterojen qarışığından ibarət daha mürəkkəb bir quruluşa malikdir.Yetkin məməlilərin ürəyində kardiyomiyosit olmayan populyasiyaların11,12,13 bu heterojenliyi fərdi hüceyrə növlərindən istifadə edərək ürək toxumasının modelləşdirilməsinə əsas maneədir.Bu əsas məhdudiyyətlər fizioloji və patoloji şəraitdə bütöv miokard toxumasının becərilməsi üçün metodların işlənib hazırlanmasının vacibliyini vurğulayır.
İnsan ürəyinin kultivasiya edilmiş nazik (300 µm) hissələrinin sağlam insan miokardının perspektivli modeli olduğunu sübut etdi.Bu üsul insan ürək toxumasına bənzər tam 3D çoxhüceyrəli sistemə çıxışı təmin edir.Bununla belə, 2019-cu ilə qədər mədəni ürək hissələrinin istifadəsi qısa (24 saat) mədəniyyətin sağ qalma müddəti ilə məhdudlaşdı.Bu, fiziki-mexaniki uzanmanın olmaması, hava-maye interfeysi və ürək toxumasının ehtiyaclarını dəstəkləməyən sadə medianın istifadəsi kimi bir sıra amillərlə bağlıdır.2019-cu ildə bir neçə tədqiqat qrupu göstərdi ki, mexaniki faktorların ürək toxuma mədəniyyəti sistemlərinə daxil edilməsi mədəniyyət ömrünü uzada, ürəyin ifadəsini yaxşılaşdıra və ürək patologiyasını təqlid edə bilər.İki zərif tədqiqat 17 və 18 göstərir ki, biroxlu mexaniki yükləmə mədəniyyət zamanı ürək fenotipinə müsbət təsir göstərir.Bununla belə, bu tədqiqatlar ürək dövrünün dinamik üçölçülü fiziki-mexaniki yükündən istifadə etməmişdir, çünki ürək bölmələri ya izometrik dartılma qüvvələri 17, ya da xətti auksotonik yükləmə 18 ilə yüklənmişdir.Bu toxuma uzanma üsulları bir çox ürək genlərinin yatırılması və ya anormal uzanma reaksiyaları ilə əlaqəli genlərin həddindən artıq ifadəsi ilə nəticələndi.Xüsusilə, Pitoulis et al.19, güc çeviricisi rəyi və gərginlik ötürücülərindən istifadə edərək, ürək dövranının yenidən qurulması üçün dinamik ürək dilim mədəniyyət vannası hazırladı.Bu sistem in vitro ürək dövranının daha dəqiq modelləşdirilməsinə imkan versə də, metodun mürəkkəbliyi və aşağı ötürmə qabiliyyəti bu sistemin tətbiqini məhdudlaşdırır.Laboratoriyamız bu yaxınlarda 6 günə qədər donuz və insan ürək toxumasının hissələrinin canlılığını qorumaq üçün elektrik stimullaşdırılması və optimallaşdırılmış mühitdən istifadə edərək sadələşdirilmiş mədəniyyət sistemi işləyib hazırlamışdır20,21.
Hazırkı əlyazmada biz ürək dövrü ərzində üçölçülü ürək fiziologiyasını və patofizioloji gərginliyi təkrarlamaq üçün humoral işarələri özündə birləşdirən donuz ürəyinin bölmələrindən istifadə edərək ürək toxuma mədəniyyəti modelini (CTCM) təsvir edirik.Bu CTCM, klinikadan əvvəlki dərman sınağı üçün məməli ürəyinin fiziologiyasını/patofiziologiyasını təqlid edən sərfəli, orta məhsuldarlıqlı ürək sistemini təmin etməklə, klinikadan əvvəlki dərman proqnozunun dəqiqliyini heç vaxt əldə edilməmiş səviyyəyə yüksəldə bilər.
Hemodinamik mexaniki siqnallar kardiyomiyosit funksiyasının in vitro 22,23,24 saxlanmasında mühüm rol oynayır.Hazırkı əlyazmada biz fizioloji tezliklərdə (1,2 Hz, dəqiqədə 72 döyüntü) həm elektrik, həm də mexaniki stimullaşdırıcı təsir göstərməklə böyüklərin ürək mühitini təqlid edə bilən CTCM (Şəkil 1a) hazırlamışıq.Diastol zamanı toxumaların həddindən artıq uzanmasının qarşısını almaq üçün toxuma ölçüsünü 25% artırmaq üçün 3D çap cihazı istifadə edilmişdir (şək. 1b).C-PACE sistemi tərəfindən induksiya olunan elektrik pacing, ürək dövranını tam şəkildə bərpa etmək üçün məlumat toplama sistemindən istifadə edərək sistoladan 100 ms əvvəl başlaması üçün təyin edildi.Toxuma mədəniyyəti sistemi, yuxarı kamerada ürək dilimlərinin genişlənməsinə səbəb olmaq üçün çevik silikon membranı dövri olaraq genişləndirmək üçün proqramlaşdırıla bilən pnevmatik aktuatordan (LB Engineering, Almaniya) istifadə edir.Sistem təzyiq çeviricisi vasitəsilə xarici hava xəttinə qoşulmuşdur ki, bu da təzyiqi (± 1 mmHg) və vaxtı (± 1 ms) dəqiq tənzimləməyə imkan vermişdir (Şəkil 1c).
a Toxuma bölməsini cihazın mədəniyyət kamerasının içərisində mavi rənglə göstərilən 7 mm dayaq halqasına yapışdırın.Mədəniyyət kamerası hava kamerasından nazik elastik silikon membranla ayrılır.Sızmaların qarşısını almaq üçün hər kamera arasında bir conta qoyun.Cihazın qapağında elektrik stimullaşdırılmasını təmin edən qrafit elektrodlar var.b Böyük toxuma qurğusunun, istiqamətləndirici halqanın və dayaq halqasının sxematik təsviri.Toxuma bölmələri (qəhvəyi) cihazın xarici kənarındakı oluğa yerləşdirilən bələdçi halqa ilə böyük ölçülü cihaza yerləşdirilir.Bələdçidən istifadə edərək, toxuma akril yapışdırıcısı ilə örtülmüş dəstək halqasını ürək toxumasının bölməsinə diqqətlə qoyun.c Proqramlaşdırıla bilən pnevmatik ötürücü (PPD) tərəfindən idarə olunan hava kamerasının təzyiqinin funksiyası kimi elektrik stimullaşdırılması vaxtını göstərən qrafik.Təzyiq sensorlarından istifadə edərək elektrik stimullaşdırılmasını sinxronlaşdırmaq üçün məlumat toplama cihazı istifadə edilmişdir.Mədəniyyət kamerasındakı təzyiq müəyyən edilmiş həddə çatdıqda, elektrik stimullaşdırılmasını işə salmaq üçün C-PACE-EM-ə nəbz siqnalı göndərilir.d İnkubator rəfinə yerləşdirilən dörd CTCM-nin şəkli.Dörd cihaz pnevmatik dövrə vasitəsilə bir PPD-yə qoşulur və pnevmatik dövrədə təzyiqi izləmək üçün təzyiq sensorları hemostatik klapana daxil edilir.Hər bir cihaz altı toxuma bölməsindən ibarətdir.
Tək pnevmatik aktuatordan istifadə edərək, hər biri 6 toxuma bölməsini saxlaya bilən 4 CTCM cihazını idarə edə bildik (şəkil 1d).CTCM-də hava kamerasındakı hava təzyiqi maye kamerasında sinxron təzyiqə çevrilir və ürək diliminin fizioloji genişlənməsinə səbəb olur (Şəkil 2a və Əlavə Film 1).80 mm Hg-də toxuma uzanmasının qiymətləndirilməsi.İncəsənət.toxuma bölmələrinin 25% uzanmasını göstərdi (Şəkil 2b).Bu faiz uzanmasının normal ürək bölməsinin kontraktilliyi üçün 2,2-2,3 µm olan fizioloji sarkomer uzunluğuna uyğun olduğu göstərilmişdir17,19,25.Dokuların hərəkəti xüsusi kamera parametrlərindən istifadə etməklə qiymətləndirilmişdir (Əlavə Şəkil 1).Toxuma hərəkətinin amplitudası və sürəti (Şəkil 2c, d) ürək dövrü ərzində uzanmağa və sistol və diastola zamanı vaxta uyğun gəlirdi (Şəkil 2b).Daralma və istirahət zamanı ürək toxumasının uzanması və sürəti mədəniyyətdə 12 gün ərzində sabit qaldı (Şəkil 2f).Elektrik stimulyasiyasının kultura zamanı kontraktilliyə təsirini qiymətləndirmək üçün kölgə alqoritmindən istifadə edərək aktiv deformasiyanın müəyyən edilməsi metodunu işləyib hazırladıq (Əlavə Şəkil 2a,b) və deformasiyaları elektrik stimullaşdırılması ilə və ya olmadan ayırd edə bildik.Ürəyin eyni bölməsi (şəkil 2f).Kəsmənin hərəkətli bölgəsində (R6-9) elektrik stimullaşdırılması zamanı gərginlik elektrik stimullaşdırılması olmadıqda olduğundan 20% yüksək idi ki, bu da elektrik stimullaşdırılmasının kontraktil funksiyaya töhfəsini göstərir.
Hava kamerasının təzyiqinin, maye kamerasının təzyiqinin və toxuma hərəkətinin ölçülməsinin nümunəvi izləri kameranın təzyiqinin maye kamerasının təzyiqini dəyişdirdiyini və toxuma diliminin müvafiq hərəkətinə səbəb olduğunu təsdiqləyir.b Faiz uzadılmasına (narıncı) uyğun olan toxuma hissələrinin faiz uzanmasının (mavi) nümayəndəsi izləri.c Ürək diliminin ölçülən hərəkəti ölçülən hərəkət sürətinə uyğundur.(d) Ürəyin bir dilimində siklik hərəkətin (mavi xətt) və sürətin (narıncı nöqtəli xətt) təmsil traektoriyaları.e Döngü vaxtının kəmiyyəti (qrup başına n = 19 dilim, müxtəlif donuzlardan), daralma müddəti (qrup başına n = 19 dilim), istirahət vaxtı (n = qrup başına 19 dilim, müxtəlif donuzlardan), toxuma hərəkəti (n = 25).dilimlər)/müxtəlif donuzlardan qrup), pik sistolik sürət (n = 24(D0), müxtəlif donuzlardan 25(D12) dilim/qrup) və pik relaksasiya dərəcəsi (n=24(D0), 25(D12) dilim/qrup müxtəlif donuzlardan).İki quyruqlu Tələbənin t-testi heç bir parametrdə əhəmiyyətli fərq göstərmədi.f (qırmızı) və (mavi) elektrik stimullaşdırılması olmadan toxuma bölmələrinin nümayəndəsi gərginlik təhlili izləri, eyni bölmədən toxuma bölmələrinin on regional sahəsi.Aşağı panellər müxtəlif bölmələrdən on sahədə elektrik stimulyasiyası olan və olmayan toxuma bölmələrində gərginliyin faiz fərqinin kəmiyyətini göstərir. (Müxtəlif donuzlardan n = 8 dilim/qrup, İki quyruqlu Tələbə t-testi aparılır; ****p < 0,0001, **p < 0,01, *p < 0,05). (Müxtəlif donuzlardan n = 8 dilim/qrup, İki quyruqlu Tələbə t-testi aparılır; ****p < 0,0001, **p < 0,01, *p < 0,05). (n = 8 срезов/группу от разных свиней, проводится двусторонний t-kriteriy Stьюдента; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05). (n = müxtəlif donuzlardan 8 bölmə/qrup, iki quyruqlu Tələbənin t-testi; ****p<0.0001, **p<0.01, *p<0.05). （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p < 0,0001，**p < 0,01，*5）0. （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p < 0,0001，**p < 0,01，*5）0. (n = 8 срезов/группу, от разных свиней, двусторонний стьюдента; ****p <0,0001, **p <0,01, *p <0,05). (n = 8 bölmə/qrup, müxtəlif donuzlardan, iki quyruqlu Tələbənin t-testi; ****p<0.0001, **p<0.01, *p<0.05).Səhv çubuqları orta ± standart sapmanı təmsil edir.
Əvvəlki statik biomimetik ürək dilim mədəniyyət sistemimizdə [20, 21] biz elektrik stimullaşdırılması tətbiq etməklə və orta tərkibini optimallaşdırmaqla ürək dilimlərinin canlılığını, funksiyasını və struktur bütövlüyünü 6 gün ərzində saxladıq.Lakin 10 gündən sonra bu rəqəmlər kəskin şəkildə aşağı düşüb.Biz əvvəlki statik biomimetik mədəniyyət sistemimizdə 20, 21 nəzarət şərtlərində (Ctrl) yetişdirilmiş bölmələrə istinad edəcəyik və biz əvvəllər optimallaşdırılmış mühitimizdən MC şərtləri və eyni vaxtda mexaniki və elektrik stimullaşdırılması (CTCM) altında mədəniyyət kimi istifadə edəcəyik.çağırdı.Birincisi, elektrik stimullaşdırılması olmadan mexaniki stimullaşdırmanın 6 gün ərzində toxuma canlılığını qorumaq üçün kifayət olmadığını müəyyən etdik (Əlavə Şəkil 3a, b).Maraqlıdır ki, STCM-dən istifadə edərək fizio-mexaniki və elektrik stimullaşdırılmasının tətbiqi ilə 12 günlük ürək bölmələrinin həyat qabiliyyəti MTT analizi ilə göstərildiyi kimi, MS şəraitində təzə ürək bölmələrində olduğu kimi eyni qaldı, lakin Ctrl şəraitində deyil (Şəkil 1).3a).Bu, ürək dövrünün mexaniki stimullaşdırılması və simulyasiyasının toxuma hissələrini əvvəlki statik mədəniyyət sistemimizdə bildiriləndən iki dəfə uzun müddət canlı saxlaya biləcəyini göstərir.Bununla belə, ürək troponin T və konneksin 43-ün immuno-etiketlənməsi ilə toxuma hissələrinin struktur bütövlüyünün qiymətləndirilməsi göstərdi ki, konneksin 43 ifadəsi MC toxumalarında 12-ci gündə eyni gündə nəzarət edilənlərə nisbətən əhəmiyyətli dərəcədə yüksək olub.Bununla belə, vahid konneksin 43 ifadəsi və Z-disk formalaşması tam olaraq qorunmur (Şəkil 3b).Biz toxuma struktur bütövlüyünü ölçmək üçün süni intellekt (AI) çərçivəsindən26, lokalizasiyanın gücü baxımından ürək dilimlərinin struktur bütövlüyünü və flüoresansını avtomatik olaraq ölçmək üçün troponin-T və konneksin boyanmasına43 əsaslanan təsvirə əsaslanan dərin öyrənmə boru kəmərindən istifadə edirik.Bu üsul, arayışda təsvir olunduğu kimi, avtomatlaşdırılmış və qərəzsiz şəkildə ürək toxumasının struktur bütövlüyünü etibarlı şəkildə qiymətləndirmək üçün Convolutional Neyron Network (CNN) və dərin öyrənmə çərçivəsindən istifadə edir.26. MC toxuması statik nəzarət bölmələri ilə müqayisədə 0-cı günə qədər təkmilləşdirilmiş struktur oxşarlıq göstərdi.Bundan əlavə, Massonun trixrom boyaması mədəniyyətin 12-ci günündə nəzarət şərtləri ilə müqayisədə MS şəraitində fibrozun əhəmiyyətli dərəcədə aşağı faizini aşkar etdi (Şəkil 3c).CTCM ürək toxuması bölmələrinin 12-ci gündə canlılığını təzə ürək toxumasına bənzər səviyyəyə yüksəltsə də, ürək hissələrinin struktur bütövlüyünü əhəmiyyətli dərəcədə yaxşılaşdırmadı.
Ştrix qrafiki statik kulturada (D12 Ctrl) və ya CTCM-də (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) 12 gün ərzində təzə ürək dilimlərinin (D0) və ya ürək dilimləri kulturasının MTT canlılığının kəmiyyətini göstərir. D0 ilə müqayisədə 0,0001 və D12 Ctrl ilə müqayisədə **p < 0,01). Ştrix qrafiki statik kulturada (D12 Ctrl) və ya CTCM-də (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl ), 12 (D12 Ctrl ), 12 gün ərzində təzə ürək dilimlərinin (D0) və ya ürək dilimləri mədəniyyətinin MTT canlılığının kəmiyyətini göstərir. D0 ilə müqayisədə < 0,0001 və D12 Ctrl ilə müqayisədə **p < 0,01).histoqram statik kulturada (D12 nəzarət) və ya CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 nəzarət). ) ), 12 (D12 MC) bölmələrində 12 gün ərzində MTT təzə ürək bölmələrinin (D0) və ya ürək kəsiklərinin kulturasının canlılığının kəmiyyətini göstərir.####p < 0,0001 üçün сравнению с D0 və **p < 0,01 üçün сравнению с D12 Ctrl). D0 ilə müqayisədə ####p < 0,0001 və D12 Ctrl ilə müqayisədə **p < 0,01). a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏刟切(D12 Ctrl) 12 天的MTT 活力的量化)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测行单向ANOVA 测行单向ANOVA 测行单向ANOVA 测行单向ANOVA 测行单向ANOVA 测行单向ANOVA 测行单向ANOVA 12 12 来自不同猪的12 (D12 MC) 01，与D12 Ctrl 相比，**p <0.01)。 a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切(D12 Ctrl) 中新鲜心脏切(D12 Ctrl) 12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；与D0 相比，####p < 0,0001，与D12 Ctrl 相ぼ＀**pstatik kulturada (D12 nəzarəti) və ya CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 nəzarət)) , 12 (D12 MC) bölmələr/qrup, müxtəlif ANOVA-dan 12 gün ərzində becərilmiş təzə ürək bölmələrində (D0) və ya ürək bölmələrində MTT canlılığının kəmiyyətini göstərən histoqram;####p < 0,0001 üçün сравнению с D0, **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p < 0,0001 D0 ilə müqayisədə, **p < 0,01 D12 Ctrl ilə müqayisədə).b Troponin-T (yaşıl), konneksin 43 (qırmızı) və DAPI (mavi) təzə təcrid olunmuş ürək bölmələrində (D0) və ya statik şəraitdə (Ctrl) və ya CTCM şəraitində (MC) 12 gün ərzində becərilmiş ürək bölmələrində təmsil olunan immunofluoressensiya şəkilləri (boş miqyas = 100 µm). Ürək toxumasının struktur bütövlüyünün süni intellektlə ölçülməsi (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) dilim/qrup hər biri müxtəlif donuzdan, birtərəfli ANOVA testi aparılır; D0 və D0 və ****0 C1 ilə müqayisədə ####p < 0.0001. ****p <10). Ürək toxumasının struktur bütövlüyünün süni intellektlə ölçülməsi (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), hər biri müxtəlif donuzlardan 5 (D12 MC) dilim/qrup, birtərəfli ANOVA testi həyata keçirilir; ####p < 0.0001 D0 və D0.02 ilə müqayisədə C0.02). Количественная оценка структурной целостности сердечной ткани искусственным intellektom (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) müxtəlif svineylərdən srezov/grupp, provoditsya birdən-birə faktorlu test ANOVA-nı təqdim etdi < ##0#p <s#0#p; ##0#p ,0001 üçün D12 Ctrl ilə). Süni intellekt (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), müxtəlif donuzlardan 5 (D12 MC) bölmələr/qruplar, birtərəfli ANOVA testi aparıldı; ####p <0.0001 qarşı D0 və D0.0.0 ilə müqayisədə) ürək toxumasının struktur bütövlüyünün kəmiyyətinin müəyyən edilməsi.人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) müxtəlif donuz dilimləri/qrupları, birtərəfli ANOVA testi #0 #0;#0;#0;#0;比，****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）。人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) dilimləri/qrupları müxtəlif donuzların hər biri, birtərəfli ANOVA testi#0D#01;比，****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）。 Iskusstvennyy intellekt for colichestvennoy osenki strukturnoy celostnosti serdechnoy tkani (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) srezov/gruppu kajdoy iz geniş sviney, birdən-birə test ANOVA; ##0#0 <, D#0#01 <, D#0#01. 001 üçün сравнению с D12 Ctrl). Ürək toxumasının struktur bütövlüyünün kəmiyyətini təyin etmək üçün süni intellekt (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) bölmə/qrup müxtəlif donuzların hər biri, birtərəfli ANOVA testi; ####p<0.0001 vs .D0 Müqayisə üçün D0.0trl <0****0). c Masson trixrom ləkəsi ilə boyanmış ürək dilimləri üçün (solda) və kəmiyyət göstəriciləri (sağda) (n = 10 dilim/qrup müxtəlif donuzlardan hər biri, birtərəfli ANOVA testi aparılır; ####p < 0.0001 ilə müqayisədə D0 və ***p <0.0001 ilə müqayisədə D1). c Masson trixrom ləkəsi ilə boyanmış ürək dilimləri üçün (solda) və kəmiyyət göstəriciləri (sağda) (n = 10 dilim/qrup müxtəlif donuzlardan hər biri, birtərəfli ANOVA testi aparılır; #### p < 0.0001 ilə müqayisədə D.0 və ***1 p < 0.0001 ilə müqayisədə). c Reprezentativnıe изображения (слева) və количественная оценка (справа) срезов сердца, окрашенных трихромным красителем Массона (масштаб без покрытия = 500 мкм) (n = 10 srezov/gruppu on разных свиней, выпость выполня, pNOVA01, p##0; по сравнению с D0 və ***p < 0,001 üçün сравнению с D12 Ctrl). c Masson trixrom ləkəsi ilə boyanmış ürək hissələrinin (solda) və kəmiyyət göstəricilərinin (sağda) təsviri (n = müxtəlif donuzlardan 10 bölmə/qrup, birtərəfli ANOVA testi aparıldı; #### p < 0 .0001 D0 və ***1 ilə müqayisədə D0.0 və ***1 ilə müqayisədə). c 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像（左）和量化（右）（裸（右）（裸（右）（裸（右）（裸（右）（裸=尺0µ 尺0µ切片/组，每组来自不同的猪，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0.0001 与D0 相比， 0.0.1*p ）. C 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 （左 左） 量化 （右） 裸尺度 裸尺度度 = 500 µm） （n = 10 个 切片 组 每 组 来自 不同 猪 ， 进行 单向 单向 单向 单向 Anova （0#0 浕 测0#0. Anova （0#0.相比，***p < 0,001 与D12 Ctrl 相比）。 c Reprezentativnıe izobrajeniya (слева) и количественный анализ (справа) срезов сердца, окрашенных трихромным красителем Массона (чистая шкала = 500 мкм) (n = 10 srezov/qruppa, kajdırıy ot drugoy disvinytori, potesno pervo; ## #p < 0,0001 üçün сравнению с D0, ***p < 0,001 po сравнению с D12 Ctrl). c Masson trixrom ləkəsi (boş = 500 µm) ilə boyanmış ürək hissələrinin təmsilçi şəkilləri (solda) və kəmiyyət göstəriciləri (sağda) (n = 10 bölmə/qrup, hər biri fərqli donuzdan, birtərəfli dispersiya təhlili ilə sınaqdan keçirilmişdir ;### # p < 0.0001 ilə müqayisədə D1.0, ***p <0.0001 ilə müqayisədə C1.0).Səhv çubuqları orta ± standart sapmanı təmsil edir.
Biz fərz etdik ki, mədəniyyət mühitinə kiçik molekullar əlavə etməklə, CTCM mədəniyyəti zamanı kardiyomiyositlərin bütövlüyü yaxşılaşdırıla və fibroz inkişafı azaldıla bilər.Buna görə də az sayda qarışıq faktorlara görə statik nəzarət mədəniyyətlərimizdən20,21 istifadə edərək kiçik molekulları yoxladıq.Bu ekran üçün deksametazon (Dex), triiodotironin (T3) və SB431542 (SB) seçilmişdir.Bu kiçik molekullar əvvəllər sarkomer uzunluğunu, T-borucuqlarını və keçirmə sürətini artırmaqla kardiyomiyositlərin yetişməsinə təkan vermək üçün hiPSC-CM mədəniyyətlərində istifadə edilmişdir.Bundan əlavə, həm Dex (bir qlükokortikoid) həm də SB-nin iltihabı yatırdığı bilinir29,30.Buna görə də, biz bu kiçik molekulların birinin və ya birləşməsinin daxil edilməsinin ürək hissələrinin struktur bütövlüyünü yaxşılaşdırıb-yaxşılamayacağını sınadıq.İlkin skrininq üçün hər bir birləşmənin dozası hüceyrə mədəniyyəti modellərində (1 μM Dex27, 100 nM T327 və 2.5 μM SB31) ümumi istifadə edilən konsentrasiyalar əsasında seçilmişdir.12 günlük mədəniyyətdən sonra T3 və Dex-in birləşməsi optimal kardiyomiyositin struktur bütövlüyü və minimal lifli remodeling ilə nəticələndi (Əlavə Şəkil 4 və 5).Bundan əlavə, bu T3 və Dex konsentrasiyalarının ikiqat və ya ikiqat istifadəsi normal konsentrasiyalarla müqayisədə zərərli təsirlər yaratdı (Əlavə Şəkil 6a, b).
İlkin müayinədən sonra biz 4 mədəniyyət şəraitinin baş-başa müqayisəsini həyata keçirdik (Şəkil 4a): Ctrl: optimallaşdırılmış mühitimizdən istifadə edərək əvvəllər təsvir edilmiş statik mədəniyyətimizdə becərilmiş ürək bölmələri;20.21 TD: T3 və Ctrl s Çərşənbə günü Əlavə Dex;MC: əvvəllər optimallaşdırılmış mühitimizdən istifadə edərək CTCM-də becərilmiş ürək bölmələri;və MT: mühitə əlavə edilmiş T3 və Dex ilə CTCM.12 gün becərildikdən sonra MS və MT toxumalarının canlılığı MTT analizi ilə qiymətləndirilən təzə toxumalarda olduğu kimi qaldı (Şəkil 4b).Maraqlıdır ki, transwell mədəniyyətlərinə (TD) T3 və Dex əlavə edilməsi Ctrl şərtləri ilə müqayisədə canlılığın əhəmiyyətli dərəcədə yaxşılaşması ilə nəticələnmədi, bu da ürək bölmələrinin canlılığının saxlanmasında mexaniki stimullaşdırmanın mühüm rolunu göstərir.
Mexanik stimullaşdırmanın və T3/Dex əlavəsinin 12 gün ərzində mühitə təsirini qiymətləndirmək üçün istifadə edilən dörd mədəniyyət şəraitini əks etdirən Eksperimental dizayn diaqramı. b Ştrix qrafiki təzə ürək dilimləri (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD və D12 MT), 12 (D12 MC) ilə müqayisədə bütün 4 mədəniyyət şəraitində (Ctrl, TD, MC və MT) kulturadan 12 gün sonra canlılığın kəmiyyətini göstərir, ##pg; 0,0001, D0 ilə müqayisədə ###p < 0,001 və D12 Ctrl ilə müqayisədə **p < 0,01). b Ştrix qrafiki təzə ürək dilimləri (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD və D12 MT), 12 (D12 MC) ilə müqayisədə bütün 4 mədəniyyət şəraitində (Ctrl, TD, MC və MT) kulturadan 12 gün sonra canlılığın kəmiyyətini göstərir, ##pg; 0,0001, D0 ilə müqayisədə ###p < 0,001 və D12 ctrl ilə müqayisədə **p < 0,01). b Гистограмма 12 gündən sonra bütün 4 mədəniyyətə (idarəetmə, TD, MC və MT) uyğun olaraq 12 gündən sonra mədəniyyətlə təmin olunur. 2 MT), 12 (D12 MC) srezov/gruppu from sviney, provoditsya односторонний test ANOVA; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 po sravnenию с D0 və **p < 0,01 po сравнению с D1). b Ştrix qrafiki təzə ürək bölmələri (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD və D12 MT), 12 (D12 MC) ilə müqayisədə bütün 4 mədəniyyət şəraitində (nəzarət, TD, MC və MT) kulturadan sonrakı 12 gün ərzində canlılığın kəmiyyətini göstərir. 0001, D12 Ctrl ilə müqayisədə ###p < 0,001 və D0 ilə **p < 0,01). b 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) (n = 18 (D12Dl)Dl) D12 MT). .01 与D12控制）。b 4 12 (D12 MC) b Гистограмма, показывающая все 4 условия культивирования (контроль, TD, MC və MT) üçün sravnenию və svejimi srezami сердца (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD və D12 MT), MC22 və s. оронний test ANOVA; ####p <0,0001, ###p <0,001 по сравнению с D0, **p <0,01 по сравнению с контролем D12). b Təzə ürək kəsikləri (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD və D12 MT), müxtəlif donuzlardan 12 (D12 MC) bölmə/qrup, birtərəfli ANOVA testi (D0) ilə müqayisədə bütün 4 mədəniyyət şəraitini (nəzarət, TD, MC və MT) göstərən histoqramma, birtərəfli ANOVA testi (D0) ##0, #0#0. 0, **p<0.01 və nəzarət D12). c Ştrix qrafiki təzə ürək dilimləri (D0) ilə müqayisədə bütün 4 mədəniyyət şəraitində (Ctrl, TD, MC və MT) kulturadan 12 gün sonra qlükoza axınının kəmiyyətini göstərir (n = 6 dilim/müxtəlif donuzlardan, birtərəfli ANOVA testi aparılır; ###p < 0.001 və ***p <tr, D0 ilə müqayisədə D0 və ***p <1). c Ştrix qrafiki təzə ürək dilimləri (D0) ilə müqayisədə bütün 4 mədəniyyət şəraitində (Ctrl, TD, MC və MT) kulturadan 12 gün sonra qlükoza axınının kəmiyyətini göstərir (n = 6 dilim/müxtəlif donuzlardan, birtərəfli ANOVA testi aparılır; ###p < 0.001 və ***p <tr, D0 ilə müqayisədə D0 və ***p <1). c Гистограмма 12 gündən sonra bütün 4 xidmət (nəzarət, TD, MC və MT) üçün 12 gündən sonra kultivasiya edir. ся test ANOVA; ###p < 0,001 üçün сравнению с D0 və ***p < 0,001 üçün sравнению с D12 Ctrl). c Histoqram təzə ürək bölmələri (D0) ilə müqayisədə bütün 4 mədəniyyət şəraitində (nəzarət, TD, MC və MT) kulturadan 12 gün sonra qlükoza axınının kəmiyyətini göstərir (n = müxtəlif donuzlardan 6 bölmə/qrup, birtərəfli ANOVA testi aparıldı ; ###p < 0,001 D0 və ***0 C1 ilə müqayisədə C1 <tr). c 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) 相毡片(D0) 相毡缐囸比弐弐囸糖通量定量（n = 6 片/组，来自不同猪，单向执行ANOVA 测试；###p < 0.001，与01，与0*D0. trl 相比）。 C 条形图 显示 所有 4 种 条件 （（ctrl 、 td 、 mc 和 mt） 新鲜 心脏 新鲜 心脏 切片 切片 切片 创片养 后 后 12 天 的 通量 定量 （n = 6 片/组 ， 来自 猪 ， ， ， ， ， 来 ， ， AN －测试；###p < 0,001，与D0 相比，***p < 0,001 与D12 Ctrl 相比）。 c Гистограмма, показывающая количественную оценку потока глюкозы cherez 12 gün sonra bütün 4 usloviy mədəniyyət üçün (nəzarət, TD, MC və MT) üçün sravnenuyu so svejimi srezami serdca (D0) (n = svejimi srezosti serdca (n) yli проведены тесты ANOVA; ###p < 0,001 po sravneniю с D0, ***p < 0,001 po сравнению с D12 (kontrol). c Təzə ürək bölmələri (D0) ilə müqayisədə bütün 4 mədəniyyət şəraiti (nəzarət, TD, MC və MT) üçün kulturadan sonrakı 12 gün ərzində qlükoza axınının kəmiyyətini göstərən histoqram (n = 6 bölmə/qrup, müxtəlif donuzlardan, birtərəfli ANOVA testləri aparılıbmı, ###p < 0,000, ***p <1 ilə müqayisədə D0,001).d Təzə (mavi), 12-ci gün MC (yaşıl) və 12-ci gün MT (qırmızı) toxumaların on regional toxuma bölmə nöqtəsində (n = 4 dilim/qrup, birtərəfli ANOVA testi; qruplar arasında əhəmiyyətli fərq yox idi) gərginlik təhlili sahələri.e 10-12 gün ərzində statik şəraitdə (Ctrl) və ya MT şəraitində (MT) yetişdirilmiş ürək bölmələri ilə müqayisədə təzə ürək bölmələrində (D0) diferensial şəkildə ifadə edilmiş genləri göstərən vulkan süjeti.f Hər bir mədəniyyət şəraitində becərilmiş ürək bölmələri üçün sarkomer genlərinin istilik xəritəsi.Səhv çubuqları orta ± standart sapmanı təmsil edir.
Yağ turşularının oksidləşməsindən qlikolizə keçiddən metabolik asılılıq kardiyomiyositlərin deferentasiyasının əlamətidir.Yetişməmiş kardiyomiyositlər ilk növbədə ATP istehsalı üçün qlükoza istifadə edir və bir neçə kristalı hipoplastik mitoxondriyaya malikdir5,32.Qlükoza istifadəsi təhlilləri göstərdi ki, MC və MT şəraitində qlükoza istifadəsi 0-cu gün toxumalarında olduğu kimidir (Şəkil 4c).Bununla belə, Ctrl nümunələri təzə toxuma ilə müqayisədə qlükoza istifadəsində əhəmiyyətli artım göstərdi.Bu onu göstərir ki, CTCM və T3/Dex-in kombinasiyası toxumaların canlılığını artırır və 12 günlük becərilmiş ürək bölmələrinin metabolik fenotipini qoruyur.Bundan əlavə, gərginlik təhlili göstərdi ki, gərginlik səviyyələri MT və MS şəraitində 12 gün ərzində təzə ürək toxumasında olduğu kimi qalır (Şəkil 4d).
CTCM və T3/Dex-in ürək dilim toxumasının qlobal transkripsiya mənzərəsinə ümumi təsirini təhlil etmək üçün biz dörd fərqli mədəniyyət şəraitindən ürək dilimlərində RNAseq həyata keçirdik (Əlavə Məlumat 1).Maraqlıdır ki, MT bölmələri 13,642 gendən yalnız 16-sı diferensial şəkildə ifadə edilmiş təzə ürək toxumasına yüksək transkripsiya oxşarlığı göstərdi.Bununla belə, daha əvvəl göstərdiyimiz kimi, Ctrl dilimləri mədəniyyətdə 10-12 gündən sonra 1229 diferensial şəkildə ifadə edilmiş genləri nümayiş etdirdi (Şəkil 4e).Bu məlumatlar ürək və fibroblast genlərinin qRT-PCR ilə təsdiqləndi (Əlavə Şəkil 7a-c).Maraqlıdır ki, Ctrl bölmələri ürək və hüceyrə dövrü genlərinin aşağı tənzimlənməsini və iltihablı gen proqramlarının aktivləşdirilməsini göstərdi.Bu məlumatlar göstərir ki, normal olaraq uzun müddətli kultivasiyadan sonra baş verən dedifferensasiya MT şəraitində tamamilə zəifləyir (Əlavə Şəkil 8a, b).Sarkomer genlərinin diqqətlə tədqiqi göstərdi ki, yalnız MT şəraitində sarkomeri (Şəkil 4f) və ion kanalını (Əlavə Şəkil 9) kodlayan genlər Ctrl, TD və MC şərtləri altında onları bastırılmadan qoruyur.Bu məlumatlar göstərir ki, mexaniki və humoral stimullaşdırmanın (T3/Dex) kombinasiyası ilə ürək dilimi transkriptomu mədəniyyətdə 12 gündən sonra təzə ürək dilimlərinə bənzər qala bilər.
Bu transkripsiya tapıntıları ürək bölmələrində kardiyomiyositlərin struktur bütövlüyünün 12 gün ərzində MT şəraitində ən yaxşı şəkildə qorunduğu faktı ilə dəstəklənir, bütöv və lokallaşdırılmış konneksin 43 (Şəkil 5a).Bundan əlavə, MT şəraitində ürək bölmələrində fibroz Ctrl ilə müqayisədə əhəmiyyətli dərəcədə azaldı və təzə ürək bölmələrinə bənzər (Şəkil 5b).Bu məlumatlar göstərir ki, mexaniki stimullaşdırma və T3/Dex müalicəsinin birləşməsi mədəniyyətdə ürək hissələrində ürək strukturunu effektiv şəkildə qoruyur.
a Troponin-T (yaşıl), konneksin 43 (qırmızı) və DAPI (mavi) yeni təcrid olunmuş ürək bölmələrində (D0) və ya 12 gün ərzində hər dörd ürək bölməsi mədəniyyət şəraitində yetişdirilmiş (miqyas çubuğu = 100 µm) reprezentativ immunofluoressensiya şəkilləri.). Ürək toxumasının struktur bütövlüyünün süni intellektlə ölçülməsi (n = 7 (D0 və D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC və D12 MT) dilim/qrup müxtəlif donuzlardan, birtərəfli ANOVA testi həyata keçirilir; ####p < 0.0000 və ya D12 0.01 ilə müqayisədə <0.0****01, D12 Ctrl ilə müqayisədə). Ürək toxumasının struktur bütövlüyünün süni intellektlə ölçülməsi (n = 7 (D0 və D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC və D12 MT) dilim/qrup müxtəlif donuzlardan, birtərəfli ANOVA testi aparılır; #### p < 0.0000 və ya D12 0.01 ilə müqayisədə <0.0001 və ya <0.00.0. D12 Ctrl ilə müqayisədə). Количественная оценка структурной целостности ткани сердца с помощью искусственного intellekta (n = 7 (D0 və D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC və D12 MT) srezov/gruppu from fakults sviney, provenyy p#00, provenyy p#0, A#00; равнению с D0 i *p < 0,05 və ya ****p < 0,0001 üçün сравнению с D12 Ctrl). Süni intellekt (n = 7 (D0 və D12 Ctrl), müxtəlif donuzlardan 5 (D12 TD, D12 MC və D12 MT) bölmələr/qruplardan istifadə etməklə ürək toxumasının struktur bütövlüyünün kəmiyyətinin müəyyən edilməsi, birtərəfli ANOVA testi aparılmışdır; #### p < 0.0000 və *5.0 ilə müqayisədə D****0 və *5.0.0 ilə müqayisədə. D12 Ctrl).对不同猪的心脏组织结构完整性（n = 7（D0 和D12 Ctrl）、5（D12 TD、D12 MC 和D12 和載仛工智能量化，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0,0001 与D0 和*p < 0,05 相比，或****p < 0,000 相比，或****p < 0,000D对 不同 猪 的 心脏 结构 完整性 （n = 7 （d0 和 d12 ctrl） （5 （d12 td 、 d12 （2 mc） 以巺智能量 化 进行 单向 单向 单向 测试 ； ######### p < 0,0001 与D0 和*p < 0,05 済****0 書1****0，書1****0相比）.Birtərəfli ANOVA testi ilə müxtəlif donuzlarda (n = 7 (D0 və D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC və D12 MT) bölmələr/qrup) süni intellektdən istifadə edərək ürək toxumasının struktur bütövlüyünün kəmiyyətinin müəyyən edilməsi;#### p < 0,0001 po сравнению с D0 и *p < 0,05 və ya ****p < 0,0001 po сравнению с D12 Ctrl). #### D0 ilə müqayisədə p < 0,0001 və D12 Ctrl ilə müqayisədə *p < 0,05 və ya ****p < 0,0001). b Masson trixrom ləkəsi ilə boyanmış ürək dilimləri üçün təmsil şəkilləri və kəmiyyət göstəriciləri (Ölçək çubuğu = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD və D12 MC), 9 (D12 MT) dilim/qrup müxtəlif donuzlardan #0VA #0 ilə müqayisə edildi; D0 və ***p < 0,001 və ya D12 Ctrl ilə müqayisədə ****p < 0,0001). b Masson trixrom ləkəsi ilə boyanmış ürək dilimləri üçün təmsil şəkilləri və kəmiyyət göstəriciləri (Ölçək çubuğu = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD və D12 MC), 9 (D12 MT) dilim/qrup müxtəlif donuzlardan #0VA #0 ilə müqayisə edildi; D0 və ***p < 0,001 və ya D12 Ctrl ilə müqayisədə ****p < 0,0001). b Reprezentativnıe izobrajeniya və kolichestvennaya osenka srezov сердца, окрашенных трихромным красителем Массона (масштабная линейка = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD və D12 TD və D12 MC), 9 D12 və MTK, 9D (srup) ется односторонний test ANOVA; ####p < 0,0001 по сравнению с D0 və ***p < 0,001 və ya ****p < 0,0001 po сравнению с D12 Ctrl). b Masson trixrom ləkəsi (miqyas çubuğu = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD və D12 MC), müxtəlif donuzlardan 9 (D12 MT) bölmələr/qrup, birtərəfli ANOVA və yerinə yetirilən Nümayəndə şəkilləri və ürək hissələrinin kəmiyyət göstəriciləri, yerinə yetirilən birtərəfli ANOVA və ***##00. <##00. 001 və ya ****p < 0,0001 və D12 Ctrl). b 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像和量化（比例尺= 500 µm）1！lD1D1D）1！lD1D和D12 MC），来自不同猪的9 个（D12 MT）切片/组，进行单因素方差分析；0.##0**p <1；###0*0D p < 0,001，或****p <0,0001 与D12 Ctrl 相比）。 b 用 Masson 三 色 色 染料 染料 染料 染料 的 染料 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 代表性 代表性 代表性 代表性 和 D12 mc, d1 的 9 个 D12 mc 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片因素 方 差 分析; #### p <0.0001 与 d0 相比, *** p <0.001, 或 **** p <0.0001 与 d12 ctrl 相比). b Reprezentativnıe izobrajeniya və количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромом Массона (масштабная линейка = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD və D12 MC), 9 (D12 MT və NO) ; ####p < 0,0001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 və ya ****p < 0,0001 üçün сравнению с D12 Ctrl). b Masson trixromu (miqyas çubuğu = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD və D12 MC), müxtəlif donuz/qrupdan 9 (D12 MT) bölməsi, bir ANOVA metodu, bir ANOVA üsulu ilə boyanmış nümunə şəkilləri və ürək hissələrinin kəmiyyəti; ##0#0 ilə müqayisədə; #0#0, ***0#0. ****p < 0,0001 D12 Ctrl ilə müqayisədə).Səhv çubuqları orta ± standart sapmanı təmsil edir.
Nəhayət, CTCM-nin ürək hipertrofiyasını təqlid etmək qabiliyyəti ürək toxumasının uzanmasını artırmaqla qiymətləndirildi.CTCM-də hava kamerasının pik təzyiqi 80 mmHg-dən 80 mmHg-ə yüksəldi.İncəsənət.(normal uzanma) 140 mmHg-ə qədər Art.(Şəkil 6a).Bu, əvvəllər hipertrofiyada göründüyünə bənzər bir sarkomer uzunluğuna nail olmaq üçün ürək bölmələri üçün tələb olunan müvafiq faiz uzanması kimi göstərilən uzanmada 32% artıma uyğundur (Şəkil 6b).Daralma və istirahət zamanı ürək toxumasının uzanması və sürəti altı günlük mədəniyyət ərzində sabit qaldı (Şəkil 6c).MT şəraitindən olan ürək toxuması altı gün ərzində normal uzanma (MT (Normal)) və ya həddindən artıq gərginlik (MT (OS)) vəziyyətinə məruz qaldı.Artıq mədəniyyətdə dörd gündən sonra hipertrofik biomarker NT-ProBNP MT (normal) şərtlərlə müqayisədə MT (OS) şəraitində mühitdə əhəmiyyətli dərəcədə yüksəlmişdir (Şəkil 7a).Bundan əlavə, kultivasiya altı gün sonra, MT (OS) (Şəkil. 7b) hüceyrə ölçüsü MT ürək (normal) bölmələri ilə müqayisədə əhəmiyyətli dərəcədə artmışdır.Bundan əlavə, NFATC4 nüvə translokasiyası həddindən artıq uzanan toxumalarda əhəmiyyətli dərəcədə artmışdır (Şəkil 7c).Bu nəticələr hiperdistenziyadan sonra patoloji yenidən qurulmasının mütərəqqi inkişafını göstərir və CTCM cihazının uzanma ilə bağlı ürək hipertrofiyası siqnalını öyrənmək üçün platforma kimi istifadə oluna biləcəyi konsepsiyasını dəstəkləyir.
Hava kamerasının təzyiqinin, maye kamerasının təzyiqinin və toxuma hərəkətinin ölçülməsinin nümunəvi izləri kameranın təzyiqinin maye kamerasının təzyiqini dəyişdirdiyini və toxuma diliminin müvafiq hərəkətinə səbəb olduğunu təsdiqləyir.b Normalda uzanan (narıncı) və həddən artıq uzanan (mavi) toxuma bölmələri üçün təmsil olunan uzanma faizi və uzanma dərəcəsi əyriləri.c Döngə vaxtını (n = qrup başına 19 dilim, müxtəlif donuzlardan), daralma müddətini (n = qrup başına 18-19 dilim, müxtəlif donuzlardan), relaksasiya müddətini (n = qrup başına 19 dilim, müxtəlif donuzlardan) ), toxuma hərəkətinin amplitudasını (n = 14, müxtəlif donuzlardan) göstərən qrafa dilimlər/qrup, müxtəlif donuzlardan) və pik relaksasiya dərəcəsi (n = 14 (D0), 15 (D6) ) bölmələr/qruplar) müxtəlif donuzlardan), iki quyruqlu Tələbənin t-testi heç bir parametrdə əhəmiyyətli fərq göstərmədi, bu parametrlərin həddindən artıq gərginliklə mədəniyyətin 6 günü ərzində sabit qaldığını göstərir.Səhv çubuqları orta ± standart sapmanı təmsil edir.
a MT normal uzanma (Norm) və ya həddən artıq uzanma (OS) şərtləri (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm və D4 MTOS) dilimləri/qrupu altında becərilmiş ürək dilimlərindən mədəniyyət mühitində NT-ProBNP konsentrasiyasının bar qrafiki ilə ölçülməsi, normal ANO01-dən iki ilə müqayisə edilmişdir. tch). a MT normal uzanma (Norm) və ya həddən artıq uzanma (OS) şərtləri (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm və D4 MTOS) dilimləri/qrupu) altında becərilmiş ürək dilimlərindən mədəniyyət mühitində NT-ProBNP konsentrasiyasının bar qrafik kəmiyyəti, normaldan fərqli olaraq iki-NO1 VA arasında yerinə yetirilir. uzanır).Normal MT uzanması (norma) və ya həddən artıq uzanma (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm və D4).MTOS) şəraitində becərilmiş ürək dilimlərindən mədəniyyət mühitində NT-ProBNP konsentrasiyasının kəmiyyət histoqramı, iki fərqli pik analizindən həyata keçirilən dilimlər/qrup;**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p <0,01 normal uzanma ilə müqayisədə). a 在MT 正常拉伸(Norm) 或过度拉伸(OS) 条件下培养的心脏切片培心脏切片培养基中NT-ProBNP 斄式弛4 (D2 MTNorm)、3（D2 MTOS、D4 MTNorm 和D4 MTOS）来自不同猪的切片/组，进行双向方差（伛游**比，p <0,01）。 a MT normal uzanma (Norm) və ya həddən artıq uzanma (OS) şərtləri (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, D4 MTOS) altında becərilmiş ürək dilimlərində NT-ProBNP konsentrasiyasının kəmiyyət göstəricisi.发发动; **normal uzanma ilə müqayisədə, p <0.01).histoqram Normal MT uzanması (norma) və ya həddən artıq uzanma (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm) və D4 MTOS) şəraitində becərilmiş ürək dilimlərində NT-ProBNP konsentrasiyalarının kəmiyyətinin müəyyən edilməsi, müxtəlif donuzlardan alınan dilim/qrup, ikitərəfli fərq analizi;**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p <0,01 normal uzanma ilə müqayisədə). b Troponin-T və WGA (solda) və hüceyrə ölçüsünün ölçülməsi (sağda) ilə boyanmış ürək dilimləri üçün reprezentativ şəkillər (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) müxtəlif donuzlardan 10 müxtəlif dilimdən hüceyrə/qrup, İki quyruqlu Tələbə t-testi ****01 ilə müqayisədə normal həyata keçirilir. ****01). b Troponin-T və WGA (solda) və hüceyrə ölçüsünün ölçülməsi (sağda) ilə boyanmış ürək dilimləri üçün reprezentativ şəkillər (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) müxtəlif donuzlardan 10 müxtəlif dilimdən hüceyrə/qrup, İki quyruqlu Tələbə t-testi normal həyata keçirilir; ****00 ilə müqayisədə). b Reprezentativnıe izobrajeniya srezov serdca, okrashennıx troponnom-T və AZP (sleva) və kolichestvenngo optredelens razmera kletok (sprava) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) 100-dən çox sərxoşluq, itsya хвостовой t-kriteriy Styudenta;****p < 0,0001 по сравнению с нормальным растяжением). b Troponin-T və AZP (solda) və hüceyrə ölçüsünün ölçülməsi (sağda) ilə boyanmış ürək bölmələrinin nümayəndəsi şəkilləri (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) müxtəlif donuzlardan 10 müxtəlif bölmədən hüceyrələr/qrup, iki quyruqlu Tələbənin t-testi normal ****001 ilə müqayisə edildi). b 用肌钙蛋白-T 和WGA（左）和细胞大小量化（右）染色的心脏切片的心脏切片的代脏切片的代表切片的代表往开），来自不同猪的10 个不同切片的369（D6 MTNorm）细胞/组，两进行有尾渍同猪的10 个不同切片的369比，****p <0,0001）。 b Kalkarin-T və WGA (solda) və hüceyrə ölçüsü (sağda) ilə boyanmış ürək dilimlərinin reprezentativ şəkilləri (n = 330 (D6 MTOS), 10 müxtəlif dilimdən 369 (D6 MTNorm)) Hüceyrələr/组，两方组，两方组，两方组，两方t，两方t 唰t，两方t） ，****p <0,0001). b Reprezentativnıe izobrajeniya srezov serdca, okrashennıx troponinom-T və AZP (sleva) və koliçestvennaya osenka razmera kletok (sprava) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) 10 müxtəlif ölçülü, 10 m. e şərt Стьюдента;****p < 0,0001 по сравнению с нормальным растяжением). b Troponin-T və AZP ilə boyanmış ürək hissələrinin reprezentativ şəkilləri (solda) və hüceyrə ölçüsünün ölçülməsi (sağda) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) müxtəlif donuzlardan 10 müxtəlif bölmədən) Hüceyrələr/qrup, iki quyruqlu tələbə meyarı;****p < 0,0001 normal gərginliklə müqayisədə). c 0-cu gün və 6-cı gün MTOS ürək dilimləri üçün troponin-T və NFATC4 üçün immuno-etiketli təsvirlər və NFATC4-ün CM-lərin nüvələrinə köçürülməsinin kəmiyyəti (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) dilim/qrup müxtəlif donuzlardan, iki-quyruqlu Tələbələr yerinə yetirildi; *t <p0.0). c Gün 0 və gün 6 MTOS ürək dilimləri üçün troponin-T və NFATC4 və NFATC4-ün CM-lərin nüvələrinə köçürülməsinin kəmiyyəti üçün immunobeledləşdirilmiş MTOS ürək dilimləri üçün nümayəndə şəkilləri (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) dilim/qrup müxtəlif donuzlardan , İki-quyruqlu Tələbə ; iki quyruqlu sınaqdan keçirilmişdir). c 0 və 6 gün MTOS, troponina-T və NFATC4 üçün immunomeceniyalar, və NFATC4 və yadra kavernoznıx kletok (n = 4 (D0), 3D bölməsində) ötürülməsi üçün NFATC4 üçün nümayəndəliklər. няется двусторонний t-kriteriy Styudenta; *p < 0,05). c 0 və 6 günlük MTOS-da ürək bölmələri üçün troponin-T və NFATC4 üçün immuno-etiketli təsvirlər və kavernoz hüceyrələrin nüvəsində NFATC4 translokasiyasının kəmiyyəti (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) dilimləri/qrupu müxtəlif donuzlardan) iki quyruqlu Tələbə testini həyata keçirdi;*p <0,05). c 用于肌钙蛋白-T 和NFATC4 免疫标记的第0 天和第6 天MTOS 心脏切片的代表性的代表性囍图图图图图用的NFATC4 易位至CM 细胞核的量化（n = 4 (D0)、3 (D6 MTOS) 切片/组, 进行双尾学锟t ＀05.0*p. c Müxtəlif NFATC4 易位至CM hüceyrə nüvəsindən 第0天和第6天MTOS ürək dilimlərinin və NFATC4-ün kalkanin-T və NFATC4 immunolabelinqinin təsviri təsvirləri的kəmiyyət化 (n = 4 (D0), 3D (n = 4 (D0)),双尾学生et 电影；*p < 0,05). c NFATC4 və NFATC4 üçün immunomarkirovki troponom-T və NFATC4 üçün müxtəlif səviyyələrdə (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) və ya CM-də translokasiyalar üçün NFATC4 üçün 0 və 6 gün ərzində MTOS təqdim olunur. ьюдента; *p < 0,05). c Müxtəlif donuzlardan (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) dilim/qrup, iki quyruqlu Student *0.c) troponin-T və NFATC4 immunolabelinqi və CM nüvəsində NFATC4 translokasiyasının kəmiyyəti üçün 0 və 6-cı gündə MTOS ürək dilimlərinin nümayəndəsi şəkilləri.Səhv çubuqları orta ± standart sapmanı təmsil edir.
Translational ürək-damar tədqiqatları ürək mühitini dəqiq şəkildə təkrarlayan hüceyrə modellərini tələb edir.Bu işdə ürəyin ultranazik hissələrini stimullaşdıra bilən CTCM cihazı hazırlanmış və xarakterizə edilmişdir.CTCM sisteminə fizioloji olaraq sinxronlaşdırılmış elektromexaniki stimullaşdırma və T3 və Dex mayelərinin zənginləşdirilməsi daxildir.Donuz ürək bölmələri bu amillərə məruz qaldıqda, onların canlılığı, struktur bütövlüyü, metabolik aktivliyi və transkripsiya ifadəsi 12 günlük kulturadan sonra təzə ürək toxumasında olduğu kimi qaldı.Bundan əlavə, ürək toxumasının həddindən artıq uzanması hiperextension səbəb olan ürəyin hipertrofiyasına səbəb ola bilər.Ümumiyyətlə, bu nəticələr normal ürək fenotipinin saxlanmasında fizioloji mədəniyyət şəraitinin kritik rolunu dəstəkləyir və dərmanların yoxlanılması üçün bir platforma təmin edir.
Bir çox amillər kardiyomiyositlərin işləməsi və yaşaması üçün optimal mühitin yaradılmasına kömək edir.Bu amillərdən ən bariz olanı (1) hüceyrələrarası qarşılıqlı əlaqə, (2) elektromexaniki stimullaşdırma, (3) humoral amillər və (4) metabolik substratlarla bağlıdır.Fizioloji hüceyrə-hüceyrə qarşılıqlı əlaqəsi hüceyrədənkənar matris tərəfindən dəstəklənən çoxlu hüceyrə tiplərinin kompleks üçölçülü şəbəkələrini tələb edir.Bu cür mürəkkəb hüceyrə qarşılıqlı təsirlərini fərdi hüceyrə növlərinin birgə mədəniyyəti ilə in vitro şəkildə yenidən qurmaq çətindir, lakin ürək bölmələrinin orqanotip təbiətindən istifadə etməklə asanlıqla əldə edilə bilər.
Kardiyomiyositlərin mexaniki uzanması və elektrik stimullaşdırılması ürək fenotipini saxlamaq üçün vacibdir33,34,35.Mexanik stimullaşdırma hiPSC-CM-nin kondisionerləşdirilməsi və yetkinləşməsi üçün geniş istifadə olunsa da, bir neçə zərif tədqiqat bu yaxınlarda biroxlu yükləmədən istifadə edərək mədəniyyətdə ürək dilimlərinin mexaniki stimullaşdırılmasına cəhd etmişdir.Bu tədqiqatlar göstərir ki, 2D biroxlu mexaniki yüklənmə mədəniyyət zamanı ürəyin fenotipinə müsbət təsir göstərir.Bu tədqiqatlarda ürəyin bölmələri ya izometrik dartılma qüvvələri17, xətti auksotonik yükləmə18 ilə yüklənmiş, ya da güc çeviricisinin əks əlaqəsi və gərginlik ötürücülərindən istifadə edərək ürək dövrü yenidən yaradılmışdır.Bununla belə, bu üsullar ətraf mühitin optimallaşdırılması olmadan biroxlu toxuma uzanmasından istifadə edir, nəticədə bir çox ürək genlərinin yatırılması və ya anormal uzanma reaksiyaları ilə əlaqəli genlərin həddindən artıq ifadəsi.Burada təsvir edilən CTCM, dövrün vaxtı və fizioloji uzanma (25% uzanma, 40% sistol, 60% diastol və dəqiqədə 72 vuruş) baxımından təbii ürək dövranını təqlid edən 3D elektromexaniki stimul təmin edir.Təkcə bu üçölçülü mexaniki stimullaşdırma toxuma bütövlüyünü qorumaq üçün kifayət etməsə də, toxumaların canlılığını, funksiyasını və bütövlüyünü adekvat saxlamaq üçün T3/Dex istifadə edərək humoral və mexaniki stimullaşdırmanın kombinasiyası tələb olunur.
Humoral amillər yetkin ürək fenotipinin modulyasiyasında mühüm rol oynayır.Bu, hüceyrə yetişməsini sürətləndirmək üçün mədəniyyət mühitinə T3 və Dex əlavə edildiyi HiPS-CM tədqiqatlarında vurğulandı.T3 amin turşularının, şəkərlərin və kalsiumun hüceyrə membranları vasitəsilə daşınmasına təsir göstərə bilər36.Bundan əlavə, T3, MHC-α ifadəsini və MHC-β aşağı tənzimlənməsini təşviq edərək, dölün CM-də yavaş bükülən miofibrillərlə müqayisədə yetkin kardiyomiyositlərdə sürətli bükülmə miofibrillərinin meydana gəlməsini təşviq edir.Hipotiroidli xəstələrdə T3 çatışmazlığı miofibrilyar zolaqların itirilməsi və tonus inkişaf sürətinin azalması ilə nəticələnir37.Dex qlükokortikoid reseptorlarına təsir göstərir və təcrid olunmuş perfuziya edilmiş ürəklərdə miokardın kontraktilliyini artırdığı göstərilmişdir;38 bu təkmilləşdirmənin kalsium depozitinə əsaslanan girişə (SOCE) təsiri ilə əlaqəli olduğu düşünülür 39,40.Bundan əlavə, Dex onun reseptorlarına bağlanaraq, immun funksiyasını və iltihabı boğan geniş hüceyrədaxili reaksiyaya səbəb olur30.
Nəticələrimiz göstərir ki, fiziki mexaniki stimullaşdırma (MS) Ctrl ilə müqayisədə ümumi mədəniyyət performansını yaxşılaşdırdı, lakin mədəniyyətdə 12 gün ərzində canlılığı, struktur bütövlüyünü və ürək ifadəsini qoruya bilmədi.Ctrl ilə müqayisədə, CTCM (MT) mədəniyyətlərinə T3 və Dex əlavə edilməsi canlılığı yaxşılaşdırdı və oxşar transkripsiya profillərini, struktur bütövlüyünü və 12 gün ərzində təzə ürək toxuması ilə metabolik aktivliyi qorudu.Bundan əlavə, toxumaların uzanma dərəcəsinə nəzarət etməklə, STCM sisteminin çox yönlülüyünü göstərən STCM-dən istifadə edərək hiperextension səbəb olan ürək hipertrofiyası modeli yaradılmışdır.Qeyd etmək lazımdır ki, ürəyin yenidən qurulması və fibrozda adətən dövriyyədə olan hüceyrələri müvafiq sitokinləri, eləcə də faqositoz və digər remodeling amillərini təmin edə bilən bütöv orqanlar iştirak etsə də, ürəyin bölmələri hələ də stress və travmaya cavab olaraq fibrotik prosesi təqlid edə bilir.miofibroblastlara çevrilir.Bu, əvvəllər bu ürək dilim modelində qiymətləndirilmişdir.Qeyd etmək lazımdır ki, CTCM parametrləri taxikardiya, bradikardiya və mexaniki qan dövranı dəstəyi (mexaniki yüklənməmiş ürək) kimi bir çox vəziyyəti simulyasiya etmək üçün təzyiq/elektrik amplitüdünü və tezliyini dəyişdirərək modulyasiya edilə bilər.Bu, sistemi dərman testi üçün orta ötürmə qabiliyyətinə çevirir.CTCM-nin həddindən artıq gərginlikdən qaynaqlanan ürək hipertrofiyasını modelləşdirmək qabiliyyəti bu sistemin fərdiləşdirilmiş terapiya üçün sınaqdan keçirilməsinə yol açır.Nəticə olaraq, bu tədqiqat göstərir ki, mexaniki uzanma və humoral stimullaşdırma ürək toxuması bölmələrinin mədəniyyətini qorumaq üçün vacibdir.
Burada təqdim olunan məlumatlar CTCM-nin bütöv miokardın modelləşdirilməsi üçün çox perspektivli bir platforma olduğunu düşünsə də, bu mədəniyyət metodunun bəzi məhdudiyyətləri var.CTCM mədəniyyətinin əsas məhdudiyyəti dilimlərə davamlı dinamik mexaniki gərginliklər tətbiq etməsidir ki, bu da hər bir dövr ərzində ürək dilimlərinin daralmalarını aktiv şəkildə izləmək imkanını istisna edir.Bundan əlavə, ürək bölmələrinin kiçik ölçüsü (7 mm) səbəbindən ənənəvi güc sensorlarından istifadə edərək mədəniyyət sistemlərindən kənarda sistolik funksiyanı qiymətləndirmək imkanı məhduddur.Hazırkı əlyazmada optik gərginliyi kontraktil funksiyanın göstəricisi kimi qiymətləndirərək bu məhdudiyyəti qismən dəf edirik.Bununla belə, bu məhdudiyyət əlavə iş tələb edəcək və gələcəkdə kalsium və gərginliyə həssas boyalardan istifadə edərək optik xəritəçəkmə kimi mədəniyyətdə ürək dilimlərinin funksiyasının optik monitorinqi üsullarının tətbiqi ilə həll edilə bilər.CTCM-nin başqa bir məhdudiyyəti, işləyən modelin fizioloji stressi (əvvəlcədən və sonrakı yükləmə) manipulyasiya etməməsidir.CTCM-də çox böyük toxumalarda diastolda (tam uzanma) və sistolda (elektrik stimullaşdırma zamanı daralma uzunluğu) 25% fizioloji uzanma yaratmaq üçün əks istiqamətlərdə təzyiq induksiya edilmişdir.Bu məhdudiyyət gələcək CTCM dizaynlarında hər iki tərəfdən ürək toxumasına adekvat təzyiq etməklə və ürəyin kameralarında baş verən dəqiq təzyiq-həcm əlaqələrini tətbiq etməklə aradan qaldırılmalıdır.
Bu əlyazmada bildirilən həddən artıq uzanma ilə bağlı yenidən qurulma hipertrofik hiperstreç siqnallarını təqlid etməklə məhdudlaşır.Beləliklə, bu model humoral və ya sinir amillərinə (bu sistemdə mövcud olmayan) ehtiyac olmadan uzanan hipertrofik siqnalın öyrənilməsində kömək edə bilər.CTCM-nin çoxluğunu artırmaq üçün əlavə tədqiqatlara ehtiyac var, məsələn, immun hüceyrələri ilə birgə kulturasiya, dövran edən plazma humoral faktorları və neyron hüceyrələrlə birgə kulturasiya zamanı innervasiya CTCM ilə xəstəliyin modelləşdirilməsi imkanlarını yaxşılaşdıracaq.
Bu tədqiqatda on üç donuzdan istifadə edilmişdir.Bütün heyvan prosedurları institusional qaydalara uyğun olaraq həyata keçirilmiş və Louisville Universitetinin Heyvanlara Baxım və İstifadə Komitəsi tərəfindən təsdiq edilmişdir.Aorta qövsü sıxıldı və ürəyə 1 L steril kardioplegiya (110 mM NaCl, 1.2 mM CaCl2, 16 mM KCl, 16 mM MgCl2, 10 mM NaHCO3, 5 U/mL heparin, pH4-ə qədər) perfuziya edildi. ürəklər adətən <10 dəq olan buz üzərində laboratoriyaya daşınana qədər buz kimi soyuq kardioplegik məhlulda saxlanılır. ürəklər adətən <10 dəq olan buz üzərində laboratoriyaya daşınana qədər buz kimi soyuq kardioplegik məhlulda saxlanılır. сердца хранили в ледяном кардиоплегическом расстворе до транспортировки в лабораторию на льду, что обычно занимает <10 min. ürəklər buz üzərində laboratoriyaya daşınana qədər buz kimi soyuq kardioplegik məhlulda saxlanılır, bu adətən <10 dəqiqə çəkir.将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10刂钟将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10刂钟 Держите сердца в ледяной кардиоплегия до транспортировки в лабораторию на льду, обычно <10 min. Laboratoriyaya buz üzərində daşınana qədər ürəkləri buz üzərində saxlayın, adətən <10 dəq.
CTCM cihazı SolidWorks kompüter dəstəkli dizayn (CAD) proqramında hazırlanmışdır.Mədəniyyət kameraları, bölücülər və hava kameraları CNC şəffaf akril plastikdən hazırlanır.7 mm diametrli ehtiyat halqa mərkəzdə yüksək sıxlıqlı polietilendən (HDPE) hazırlanır və altındakı medianı möhürləmək üçün istifadə edilən silikon o-halqanı yerləşdirmək üçün o-halqa yivə malikdir.İncə silisium membran mədəniyyət kamerasını ayırma lövhəsindən ayırır.Silikon membran 0,02 ″ qalınlığında silikon təbəqədən lazerlə kəsilir və 35A sərtliyə malikdir.Alt və üst silikon contalar 1/16 ″ qalınlığında silikon təbəqədən lazerlə kəsilib və 50A sərtliyə malikdir.316L paslanmayan polad vintlər və qanad qoz-fındıqları blokun bərkidilməsi və hermetik sızdırmazlığın yaradılması üçün istifadə olunur.
Xüsusi çap dövrə lövhəsi (PCB) C-PACE-EM sistemi ilə inteqrasiya olunmaq üçün nəzərdə tutulmuşdur.PCB-də İsveçrə maşınının birləşdirici yuvaları gümüş örtüklü mis naqillər və elektrodlara vidalanmış bürünc 0-60 vintlər vasitəsilə qrafit elektrodlara birləşdirilir.Çap edilmiş elektron lövhə 3D printerin qapağına yerləşdirilib.
CTCM cihazı ürək dövrünə bənzər idarə olunan qan dövranı təzyiqi yaradan proqramlaşdırıla bilən pnevmatik aktuator (PPD) tərəfindən idarə olunur.Hava kamerasının içərisində təzyiq artdıqca, elastik silikon membran yuxarıya doğru genişlənir və mühiti toxuma sahəsinin altına məcbur edir.Doku sahəsi daha sonra diastol zamanı ürəyin fizioloji genişlənməsini təqlid edərək mayenin bu xaric edilməsi ilə uzanacaq.Relaksiyanın zirvəsində, qrafit elektrodlar vasitəsilə elektrik stimullaşdırılması tətbiq olundu, bu, hava kamerasındakı təzyiqi azaltdı və toxuma hissələrinin büzülməsinə səbəb oldu.Borunun içərisində hava sistemindəki təzyiqi aşkar etmək üçün təzyiq sensoru olan bir hemostatik klapan var.Təzyiq sensoru tərəfindən hiss edilən təzyiq laptopa qoşulmuş məlumat toplayıcıya tətbiq edilir.Bu, qaz kamerasının daxilində təzyiqin davamlı monitorinqinə imkan verir.Maksimum kamera təzyiqinə çatdıqda (standart 80 mmHg, 140 mmHg OS), məlumat toplama cihazına C-PACE-EM sisteminə 4 V-a təyin edilmiş 2 ms üçün ikifazalı gərginlik siqnalı yaratmaq üçün siqnal göndərmək əmri verildi.
Ürək kəsikləri alınmış və 6 quyuda mədəniyyət şəraiti aşağıdakı kimi yerinə yetirilmişdir: Yığılan ürəkləri köçürmə qabından soyuq (4°C) kardioplegiya olan qaba köçürün.Sol mədəcik steril bıçaqla təcrid olunmuş və 1-2 sm3-lik parçalara kəsilmişdir.Bu toxuma blokları toxuma yapışdırıcısı ilə toxuma dayaqlarına yapışdırılıb və tərkibində Tyrode məhlulu olan titrəmə mikrotomlu toxuma vannasına yerləşdirilib və davamlı olaraq oksigenləşdirilib (3 q/L 2,3-butanedion monooksim (BDM), 140 mM NaCl (8,18 q) . ), (6 mM4.8 q) 6 g), 10 mM HEPES (2,38 q), 1 mM MgCl2 (1 ml 1 M məhlulu), 1,8 mM CaCl2 (1,8 ml 1 M məhlul), 1 L ddH2O qədər).Titrəmə mikrotomu 80 Hz tezlikdə, 2 mm üfüqi vibrasiya amplitudasında və 0,03 mm/s irəli sürətdə 300 µm qalınlığında dilimlər kəsmək üçün təyin edilmişdir.Məhlulu sərin saxlamaq üçün toxuma vannası buzla əhatə olunmuş və temperatur 4°C-də saxlanılmışdır.Bir mədəniyyət lövhəsi üçün kifayət qədər bölmə əldə olunana qədər toxuma hissələrini mikrotom vannasından buz üzərində davamlı oksigenləşdirilmiş Tyrode məhlulu olan inkubasiya vannasına köçürün.Transwell mədəniyyətləri üçün toxuma bölmələri steril 6 mm genişlikdə poliuretan dayaqlara yapışdırıldı və 6 ml optimallaşdırılmış mühitə yerləşdirildi (199 mühit, 1x İTS əlavəsi, 10% FBS, 5 ng/ml VEGF, 10 ng/ml FGF-qələvi və 2X antibiotik-göbələk).C-Pace vasitəsilə toxuma hissələrinə elektrik stimullaşdırılması (10 V, tezlik 1,2 Hz) tətbiq edilmişdir.TD şərtləri üçün hər bir mühit dəyişikliyində 100 nM və 1 μM-də təzə T3 və Dex əlavə edildi.Orta gündə 3 dəfə dəyişdirilmədən əvvəl oksigenlə doyurulur.Toxuma hissələri inkubatorda 37°C və 5% CO2-də becərildi.
CTCM kulturları üçün toxuma bölmələri dəyişdirilmiş Tyrode məhlulu olan Petri qabında xüsusi hazırlanmış 3D printerə yerləşdirildi.Cihaz ürək diliminin ölçüsünü dəstək halqasının sahəsinin 25% -ə qədər artırmaq üçün hazırlanmışdır.Bu, ürəyin hissələrinin Tyrode məhlulundan mühitə köçürüldükdən sonra və diastola zamanı uzanmaması üçün edilir.Histoakril yapışqan istifadə edərək, 300 µm qalınlığında kəsiklər 7 mm diametrli bir dayaq halqasına sabitlənmişdir.Toxuma hissələrini dayaq halqasına bağladıqdan sonra, artıq toxuma hissələrini kəsin və bir cihaz üçün kifayət qədər hissələr hazırlanana qədər birləşdirilmiş toxuma hissələrini yenidən buz üzərində (4°C) Tyrode məhlulu vannasına qoyun.Bütün cihazlar üçün ümumi emal müddəti 2 saatdan çox olmamalıdır.6 toxuma bölməsi onların dayaq halqalarına birləşdirildikdən sonra CTCM cihazı yığılmışdır.CTCM mədəniyyət kamerası əvvəlcədən 21 ml əvvəlcədən oksigenləşdirilmiş mühitlə doldurulur.Toxuma hissələrini mədəniyyət kamerasına köçürün və hər hansı bir hava qabarcığını pipetlə diqqətlə çıxarın.Sonra toxuma bölməsi çuxura yönəldilir və yumşaq bir şəkildə yerə basılır.Nəhayət, elektrod qapağını cihazın üzərinə qoyun və cihazı inkubatora köçürün.Sonra CTCM-ni hava borusu və C-PACE-EM sisteminə birləşdirin.Pnevmatik ötürücü açılır və hava klapan CTCM-ni açır.C-PACE-EM sistemi 2 ms üçün ikifazalı pacing zamanı 1,2 Hz-də 4 V çatdırmaq üçün konfiqurasiya edilmişdir.Mühit gündə iki dəfə dəyişdirildi və elektrodlarda qrafit yığılmaması üçün gündə bir dəfə elektrodlar dəyişdirildi.Lazım gələrsə, toxuma bölmələri onların altına düşmüş hava qabarcıqlarını çıxarmaq üçün onların mədəni quyularından çıxarıla bilər.MT müalicə şərtləri üçün T3/Dex 100 nM T3 və 1 μM Dex ilə hər orta dəyişikliklə təzə əlavə edildi.CTCM cihazları 37°C və 5% CO2-də inkubatorda becərildi.
Ürək dilimlərinin uzanmış traektoriyalarını əldə etmək üçün xüsusi kamera sistemi hazırlanmışdır.SLR kamera (Canon Rebel T7i, Canon, Tokyo, Yaponiya) Navitar Zoom 7000 18-108 mm makro obyektivlə (Navitar, San Francisco, CA) istifadə edilmişdir.Vizuallaşdırma mühiti təzə mühitlə əvəz etdikdən sonra otaq temperaturunda aparılmışdır.Kamera 51° bucaq altında yerləşdirilib və video saniyədə 30 kadr sürətlə qeydə alınır.Əvvəlcə açıq mənbə proqramı (MUSCLEMOTION43) ürək dilimlərinin hərəkətini ölçmək üçün Image-J ilə birlikdə istifadə edilmişdir.Maska MATLAB (MathWorks, Natick, MA, ABŞ) istifadə edərək səs-küyün qarşısını almaq üçün ürək dilimlərinin döyülməsi üçün maraq dairələrini müəyyən etmək üçün yaradılmışdır.Əl ilə seqmentləşdirilmiş maskalar çərçivə ardıcıllığında bütün şəkillərə tətbiq edilir və sonra MUSCLEMOTION plagininə ötürülür.Əzələ Hərəkəti istinad çərçivəsinə nisbətən hərəkətinin kəmiyyətini müəyyən etmək üçün hər kadrdakı piksellərin orta intensivliyindən istifadə edir.Məlumatlar qeydə alınmış, süzülmüş və dövriyyə müddətini ölçmək və ürək dövrü ərzində toxumaların uzanmasını qiymətləndirmək üçün istifadə edilmişdir.Qeydə alınmış video birinci dərəcəli sıfır fazalı rəqəmsal filtrdən istifadə edilərək sonradan işlənib.Dokuların uzanmasını (zirvədən zirvəyə) ölçmək üçün qeydə alınmış siqnalda zirvələri və çökəklikləri ayırd etmək üçün zirvədən zirvəyə analiz aparıldı.Bundan əlavə, siqnal sürüşməsini aradan qaldırmaq üçün 6-cı dərəcəli polinomdan istifadə etməklə detrendinq aparılır.Proqram kodu MATLAB-da qlobal toxuma hərəkətini, dövrə vaxtını, relaksasiya vaxtını və daralma vaxtını təyin etmək üçün hazırlanmışdır (Əlavə Proqram Kodu 44).
Gərginliyin təhlili üçün, mexaniki uzanma qiymətləndirməsi üçün yaradılmış eyni videolardan istifadə edərək, biz əvvəlcə MUSCLEMOTION proqramına uyğun olaraq hərəkət zirvələrini (ən yüksək (yuxarı) və ən aşağı (aşağı) hərəkət nöqtələri) təmsil edən iki təsviri izlədik.Sonra toxuma bölgələrini seqmentləşdirdik və seqmentlənmiş toxumaya kölgələmə alqoritmi formasını tətbiq etdik (Əlavə Şəkil 2a).Daha sonra seqmentləşdirilmiş toxuma on yeraltı təbəqəyə bölündü və hər bir səthdəki gərginlik aşağıdakı tənlikdən istifadə edərək hesablandı: Gərginlik = (Sup-Sdown)/Sdown, burada Sup və Sdown müvafiq olaraq formanın parçanın yuxarı və aşağı kölgələrindən olan məsafələridir (Əlavə Şəkil .2b).
Ürək bölmələri 48 saat ərzində 4% paraformaldehiddə fiksasiya edilmişdir.Sabit toxumalar 1 saat ərzində 10% və 20% sukrozda, sonra bir gecədə 30% saxarozada susuzlaşdırıldı.Bölmələr daha sonra optimal kəsmə temperaturu birləşməsinə (OKT tərkibi) daxil edildi və izopentan/quru buz banyosunda tədricən donduruldu.OCT yerləşdirmə bloklarını ayrılana qədər -80 °C-də saxlayın.Slaydlar 8 μm qalınlığında kəsiklər şəklində hazırlanmışdır.
OKT-ni ürək bölmələrindən çıxarmaq üçün slaydları 95 °C-də 5 dəqiqə qızdırın.Hər slaydda 1 ml PBS əlavə edin və otaq temperaturunda 30 dəqiqə inkubasiya edin, sonra otaq temperaturunda 15 dəqiqə ərzində PBS-də 0,1% Triton-X təyin edərək bölmələrə nüfuz edin.Qeyri-spesifik antikorların nümunəyə bağlanmasının qarşısını almaq üçün slaydlara 1 ml 3% BSA məhlulu əlavə edin və otaq temperaturunda 1 saat inkubasiya edin.Sonra BSA çıxarıldı və slaydlar PBS ilə yuyuldu.Hər bir nümunəni qələmlə qeyd edin.İbtidai antikorlar (1% BSA-da 1:200 nisbətində seyreltilmiş) (connexin 43 (Abcam; #AB11370), NFATC4 (Abcam; #AB99431) və troponin-T (Thermo Scientific; #MA5-12960) 90 dəqiqə ərzində ikinci antikorlar əlavə edildi (BSA10di): siçan Alexa Fluor 488 (Thermo Scientific; #A16079), dovşan Alexa Fluor 594 (Thermo Scientific; #T6391) qarşı əlavə 90 dəqiqə PBS ilə 3 dəfə yuyulur Hədəf ləkəsini fondan ayırmaq üçün biz yalnız ikinci dərəcəli antikordan istifadə etdik. vectashield (Vector Laboratories) və dırnaq lakı ilə möhürlənmiş. -x böyütmə) və 40x böyüdücü ilə Keyence mikroskopu.
WGA-Alexa Fluor 555 (Thermo Scientific; #W32464) PBS-də 5 μg/ml WGA boyama üçün istifadə edildi və 30 dəqiqə otaq temperaturunda sabit bölmələrə tətbiq edildi.Sonra slaydlar PBS ilə yuyuldu və hər slaydın üzərinə Sudan qara əlavə edildi və 30 dəqiqə inkubasiya edildi.Sonra slaydlar PBS ilə yuyuldu və vectashield yerləşdirmə mühiti əlavə edildi.Slaydlar Keyence mikroskopunda 40x böyütmə ilə görüntülənib.
OCT yuxarıda göstərildiyi kimi nümunələrdən çıxarıldı.OCT-ni çıxardıqdan sonra slaydları bir gecədə Bouin məhluluna batırın.Sonra slaydlar 1 saat distillə edilmiş su ilə yuyuldu və sonra 10 dəqiqə Bibrich aloe turşusu fuksin məhluluna yerləşdirildi.Sonra slaydlar distillə edilmiş su ilə yuyulur və 10 dəqiqə ərzində 5% fosfomolibden/5% fosfotunqstik turşu məhluluna qoyulur.Durulamadan, slaydları 15 dəqiqə birbaşa anilin mavisi məhluluna köçürün.Sonra slaydlar distillə edilmiş su ilə yuyulur və 2 dəqiqə 1% sirkə turşusu məhluluna qoyulur.Slaydlar 200 N etanolda qurudulmuş və ksilenə köçürülmüşdür.Ləkələnmiş slaydlar 10x obyektivli Keyence mikroskopundan istifadə edərək görüntülənib.Fibroz sahəsinin faizi Keyence Analyzer proqramından istifadə etməklə ölçüldü.
CyQUANT™ MTT Hüceyrə Canlılığı Təhlili (Invitrogen, Carlsbad, CA), kataloq nömrəsi V13154, bəzi dəyişikliklərlə istehsalçının protokoluna uyğun olaraq.Xüsusilə, MTT analizi zamanı vahid toxuma ölçüsünü təmin etmək üçün 6 mm diametrli cərrahi punch istifadə edilmişdir.Toxumalar istehsalçının protokoluna uyğun olaraq MTT substratı olan 12 quyu boşqabın quyularına ayrı-ayrılıqda örtülmüşdür.Bölmələr 37°C-də 3 saat ərzində inkubasiya edilir və canlı toxuma MTT substratını metabolizə edərək bənövşəyi formazan birləşməsini əmələ gətirir.MTT məhlulunu 1 ml DMSO ilə əvəz edin və ürək hissələrindən bənövşəyi formazan çıxarmaq üçün 37 °C-də 15 dəqiqə inkubasiya edin.Nümunələr DMSO-da 1:10 nisbətində 96 quyu şəffaf dib plitələrində seyreltildi və Sitasiya lövhəsi oxuyucusu (BioTek) istifadə edərək 570 nm-də bənövşəyi rəng intensivliyi ölçüldü.Oxumalar ürəyin hər bir diliminin ağırlığına görə normallaşdırıldı.
Ürək diliminin mediası əvvəllər təsvir olunduğu kimi qlükoza istifadəsi analizi üçün 1 μCi/ml [5-3H]-qlükoza (Moravek Biochemicals, Brea, CA, ABŞ) olan media ilə əvəz edilmişdir.4 saatlıq inkubasiyadan sonra 100 µl 0,2 N HCl olan açıq mikrosentrifuqa borusuna 100 µl mühit əlavə edin.Sonra boru [3H]2O-nu 72 saat ərzində 37°C-də buxarlamaq üçün 500 μl dH2O olan sintillyasiya borusuna yerləşdirildi.Sonra mikrosentrifuqa borusunu sintillyasiya borusundan çıxarın və 10 ml sintillyasiya mayesi əlavə edin.Parıldama sayları Tri-Carb 2900TR maye ssintilasiya analizatorundan (Packard Bioscience Company, Meriden, CT, ABŞ) istifadə edilərək aparılmışdır.Daha sonra qlükoza istifadəsi [5-3H]-qlükoza xüsusi aktivliyi, natamam tarazlıq və fon, [5-3H]-nin etiketlənməmiş qlükozaya seyreltilməsi və sintilasiya sayğacının effektivliyi nəzərə alınmaqla hesablanmışdır.Məlumatlar ürəyin hissələrinin kütləsinə normallaşdırılır.
Trizolda toxuma homogenləşdirilməsindən sonra RNT istehsalçının protokoluna uyğun olaraq Qiagen miRNeasy Micro Kit #210874 istifadə edərək ürək bölmələrindən təcrid olundu.RNAsec kitabxanasının hazırlanması, ardıcıllığı və məlumatların təhlili aşağıdakı kimi həyata keçirildi:
Hər nümunə üçün 1 μg RNT RNT kitabxanasının hazırlanması üçün başlanğıc material kimi istifadə edilmişdir.İstehsalçının tövsiyələrinə uyğun olaraq Illumina (NEB, ABŞ) üçün NEBNext UltraTM RNT Kitabxana Hazırlıq Dəstindən istifadə etməklə ardıcıllıq kitabxanaları yaradıldı və hər bir nümunə üçün atribut ardıcıllığına indeks kodları əlavə edildi.Qısaca olaraq, mRNT poli-T oliqonukleotidləri ilə birləşdirilmiş maqnit muncuqlardan istifadə edərək ümumi RNT-dən təmizləndi.Parçalanma NEBNext First Strand Synthesis Reaction Buferində (5X) yüksək temperaturda ikivalentli kationlardan istifadə etməklə həyata keçirilir.Birinci zəncir cDNT təsadüfi heksamer primerləri və M-MuLV tərs transkriptaza (RNase H-) istifadə edərək sintez edilmişdir.İkinci zəncir cDNT daha sonra DNT polimeraza I və RNase H istifadə edərək sintez edilir. Qalan çıxıntılar ekzonükleaza/polimeraza fəaliyyəti ilə küt uclara çevrilir.DNT fraqmentinin 3′ ucunun adenilizasiyasından sonra onu hibridləşdirməyə hazırlamaq üçün ona saç sancağı ilgək quruluşuna malik NEBNext Adapter əlavə edilir.Üstünlük uzunluğu 150-200 bp cDNA fraqmentlərinin seçilməsi üçün.kitabxana fraqmentləri AMPure XP sistemindən (Beckman Coulter, Beverly, ABŞ) istifadə edərək təmizlənmişdir.Daha sonra PCR-dən əvvəl 37°C-də 15 dəqiqə, sonra isə 95°C-də 5 dəqiqə ərzində adapterlə bağlanmış ölçüsü seçilmiş cDNA ilə 3 μl USER Enzim (NEB, ABŞ) istifadə edilmişdir.Daha sonra Phusion High-Fidelity DNT polimeraza, universal PCR primerləri və İndeks (X) primerlərindən istifadə etməklə PCR həyata keçirilib.Nəhayət, PCR məhsulları təmizləndi (AMPure XP sistemi) və kitabxana keyfiyyəti Agilent Bioanalyzer 2100 sistemində qiymətləndirildi.Daha sonra cDNT kitabxanası Novaseq sequencerindən istifadə edilərək ardıcıllaşdırıldı.Illumina-dan xam şəkil faylları CASAVA Base Calling istifadə edərək xam oxunuşlara çevrildi.Xam məlumat oxu ardıcıllığı və müvafiq əsas keyfiyyətlərdən ibarət FASTQ(fq) formatlı fayllarda saxlanılır.Sscrofa11.1 istinad genomuna süzülmüş ardıcıllıq oxunuşlarını uyğunlaşdırmaq üçün HISAT2 seçin.Ümumiyyətlə, HISAT2 istənilən ölçülü genomları, o cümlədən 4 milyard bazadan böyük genomları dəstəkləyir və əksər parametrlər üçün standart dəyərlər müəyyən edilir.RNT Seq məlumatlarından əlavə oxunuşlar, hazırda mövcud olan ən sürətli sistem olan HISAT2-dən istifadə etməklə hər hansı digər üsulla eyni və ya daha yaxşı dəqiqliklə səmərəli şəkildə uyğunlaşdırıla bilər.
Transkriptlərin bolluğu birbaşa gen ifadəsinin səviyyəsini əks etdirir.Gen ifadə səviyyələri genom və ya eksonlarla əlaqəli transkriptlərin bolluğu (ardıcıllıq sayı) ilə qiymətləndirilir.Oxumaların sayı gen ifadə səviyyələri, gen uzunluğu və ardıcıllıq dərinliyi ilə mütənasibdir.FPKM (bir milyon baza cütü üçün ardıcıl olaraq hər min əsas cüt transkript üçün fraqmentlər) hesablanmış və DESeq2 paketindən istifadə edərək diferensial ifadənin P-qiymətləri müəyyən edilmişdir.Daha sonra daxili R-funksiyası “p.adjust” əsasında Benjamini-Hochberg metodundan9 istifadə edərək hər bir P dəyəri üçün saxta kəşf dərəcəsini (FDR) hesabladıq.
Ürək bölmələrindən təcrid olunmuş RNT Thermo-dan (Thermo, cat. no. 11756050) SuperScript IV Vilo Master qarışığından istifadə etməklə 200 ng/μl konsentrasiyada cDNA-ya çevrildi.Kəmiyyət RT-PZR Tətbiq olunan Biosystems Endura Plate Microamp 384 quyulu şəffaf reaksiya lövhəsi (Thermo, cat. no. 4483319) və mikroamp optik yapışdırıcı (Thermo, cat. no. 4311971) istifadə edilməklə həyata keçirilib.Reaksiya qarışığı hər quyu üçün qarışdırılmış 5 µl Taqman Fast Advanced Master mix (Thermo, cat # 4444557), 0,5 µl Taqman Primer və 3,5 µl H2O-dan ibarət idi.Standart qPCR dövrləri işə salındı ​​və CT dəyərləri Applied Biosystems Quantstudio 5 real vaxt PCR alətindən (384 quyu modul; məhsul # A28135) istifadə edilərək ölçüldü.Taqman astarları Thermo (GAPDH (Ss03375629_u1), PARP12 (Ss06908795_m1), PKDCC (Ss06903874_m1), CYGB (Ss06900188_m1), RGL1 (Ss06900188_m1), RGL1 (S89106), PARP12 (Ss06908795_m1), satın alınıb. 8_mH), GATA4 (Ss03383805_u1), GJA1 (Ss03374839_u1), COL1A2 (Ss03375009_u1), COL3A1 (Ss04323794_m1), ACTA2 (Ss042415-ə uyğun olaraq bütün nümunələr normallaşdırıldı. APDH.
NT-ProBNP-nin media buraxılışı istehsalçının protokoluna uyğun olaraq NT-ProBNP dəsti (donuz) (Kat. No. MBS2086979, MyBioSource) istifadə edərək qiymətləndirilib.Qısaca olaraq, hər bir nümunədən və standartdan 250 µl hər quyuya iki nüsxədə əlavə edildi.Nümunəni əlavə etdikdən dərhal sonra hər quyuya 50 µl Assay Reagent A əlavə edin.Plitəni yumşaq bir şəkildə silkələyin və mastik ilə bağlayın.Sonra tabletlər 37 ° C-də 1 saat inkubasiya edildi.Sonra məhlulu aspire edin və quyuları 350 µl 1X yuma məhlulu ilə 4 dəfə yuyun, yuma məhlulunu hər dəfə 1-2 dəqiqə inkubasiya edin.Sonra hər quyuya 100 µl Təhlil Reagenti B əlavə edin və boşqab mastik ilə bağlayın.Tablet yumşaq bir şəkildə sarsıldı və 30 dəqiqə 37 ° C-də inkubasiya edildi.Məhlulu aspire edin və quyuları 5 dəfə 350 µl 1X yuma məhlulu ilə yuyun.Hər quyuya 90 µl substrat məhlulu əlavə edin və lövhəni bağlayın.Plitəni 37°C-də 10-20 dəqiqə inkubasiya edin.Hər quyuya 50 µl Stop Solution əlavə edin.Plitə dərhal 450 nm-də quraşdırılmış Cytation (BioTek) boşqab oxuyucusu ilə ölçüldü.
5% Tip I xəta dərəcəsi ilə parametrdə 10% mütləq dəyişikliyi aşkar etmək üçün >80% güc təmin edəcək qrup ölçülərini seçmək üçün güc analizləri aparıldı. 5% Tip I xəta dərəcəsi ilə parametrdə 10% mütləq dəyişikliyi aşkar etmək üçün >80% güc təmin edəcək qrup ölçülərini seçmək üçün güc analizləri aparıldı. 10% çox izmeniya parametrləri üçün 10% çox izmeniya üçün 80% -dən çox fərqli qruplar üçün təhlil edin. 5% Tip I səhv dərəcəsi ilə 10% mütləq parametr dəyişikliyini aşkar etmək üçün >80% güc təmin edəcək qrup ölçülərini seçmək üçün güc təhlili aparıldı.进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％对变化和5％行变化和错I变南进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％对变化和5％行变化和错I变南 10% həddən artıq istifadə parametrləri və 5% növbə I. 10% mütləq parametr dəyişikliyini və 5% tip I xəta dərəcəsini aşkar etmək üçün >80% güc təmin edəcək qrup ölçüsünü seçmək üçün güc təhlili aparıldı.Təcrübədən əvvəl toxuma bölmələri təsadüfi seçildi.Bütün təhlillər kor vəziyyətdə idi və nümunələr yalnız bütün məlumatlar təhlil edildikdən sonra deşifr edildi.Bütün statistik analizləri yerinə yetirmək üçün GraphPad Prism proqram təminatından (San Dieqo, Kaliforniya) istifadə edilmişdir. Bütün statistik məlumatlar üçün p-dəyərləri <0,05 dəyərində əhəmiyyətli hesab edilmişdir. Bütün statistikalar üçün p-dəyərləri <0,05 dəyərində əhəmiyyətli hesab edilmişdir. <0,05 statistik məlumat üçün. Bütün statistikalar üçün p-dəyərləri <0,05 dəyərində əhəmiyyətli hesab edilmişdir.对于所有统计数据，p 值在值<0.05 时被认为是显着的。对于所有统计数据，p 值在值<0.05 时被认为是显着的。 <0,05 statistik məlumat üçün. Bütün statistikalar üçün p-dəyərləri <0,05 dəyərində əhəmiyyətli hesab edilmişdir.İki quyruqlu Tələbənin t-testi yalnız 2 müqayisə ilə məlumatlar üzərində aparıldı.Çox qruplar arasında əhəmiyyəti müəyyən etmək üçün bir və ya iki tərəfli ANOVA istifadə edilmişdir.Post hoc testləri həyata keçirərkən, çoxsaylı müqayisələri nəzərə almaq üçün Tukey korreksiyası tətbiq edilmişdir.RNAsec məlumatlarında Metodlar bölməsində təsvir olunduğu kimi FDR və p.adjust hesablanarkən xüsusi statistik mülahizələrə malikdir.
Tədqiqat dizaynı haqqında daha çox məlumat üçün bu məqalə ilə əlaqəli Təbiət Tədqiqat Hesabatının xülasəsinə baxın.