از بازدید شما از Nature.com متشکریم. نسخه مرورگری که استفاده می‌کنید پشتیبانی محدودی از CSS دارد. برای بهترین تجربه، توصیه می‌کنیم از یک مرورگر به‌روز استفاده کنید (یا حالت سازگاری را در Internet Explorer غیرفعال کنید). در عین حال، برای اطمینان از ادامه پشتیبانی، سایت را بدون استایل‌ها و جاوا اسکریپت رندر خواهیم کرد.
نیاز به یک سیستم آزمایشگاهی (in vitro) قابل اعتماد وجود دارد که بتواند محیط فیزیولوژیکی قلب را برای آزمایش دارو به طور دقیق بازتولید کند. دسترسی محدود به سیستم‌های کشت بافت قلب انسان منجر به تفسیرهای نادرست از اثرات داروهای قلبی شده است. در اینجا، ما یک مدل کشت بافت قلب (CTCM) ایجاد کرده‌ایم که به صورت الکترومکانیکی برش‌های قلب را تحریک می‌کند و در طول فازهای سیستولیک و دیاستولیک چرخه قلبی تحت کشش فیزیولوژیکی قرار می‌گیرد. پس از 12 روز کشت، این رویکرد تا حدی زنده ماندن بخش‌های قلب را بهبود بخشید، اما یکپارچگی ساختاری آنها را به طور کامل حفظ نکرد. بنابراین، پس از غربالگری مولکول‌های کوچک، دریافتیم که افزودن 100 نانومولار تری یدوتیرونین (T3) و 1 میکرومولار دگزامتازون (Dex) به محیط کشت ما، ریزساختار بخش‌ها را به مدت 12 روز حفظ کرد. در ترکیب با تیمار T3/Dex، سیستم CTCM پروفایل‌های رونویسی، زنده ماندن، فعالیت متابولیک و یکپارچگی ساختاری را در همان سطح بافت قلب تازه به مدت 12 روز حفظ کرد. علاوه بر این، کشش بیش از حد بافت قلب در محیط کشت، سیگنالینگ قلبی هیپرتروفیک را القا می‌کند و شواهدی را برای توانایی CTCM در تقلید از شرایط هیپرتروفیک ناشی از کشش قلب ارائه می‌دهد. در نتیجه، CTCM می‌تواند فیزیولوژی و پاتوفیزیولوژی قلب را در محیط کشت برای مدت طولانی مدل‌سازی کند و غربالگری دارویی قابل اعتمادی را امکان‌پذیر سازد.
قبل از تحقیقات بالینی، به سیستم‌های آزمایشگاهی (in vitro) قابل اعتمادی نیاز است که بتوانند محیط فیزیولوژیکی قلب انسان را به طور دقیق بازتولید کنند. چنین سیستم‌هایی باید کشش مکانیکی تغییر یافته، ضربان قلب و خواص الکتروفیزیولوژیکی را تقلید کنند. مدل‌های حیوانی معمولاً به عنوان یک پلتفرم غربالگری برای فیزیولوژی قلب با قابلیت اطمینان محدود در انعکاس اثرات داروها در قلب انسان استفاده می‌شوند1،2. در نهایت، مدل آزمایشگاهی کشت بافت قلبی ایده‌آل (CTCM) مدلی است که برای مداخلات درمانی و دارویی مختلف بسیار حساس و اختصاصی است و فیزیولوژی و پاتوفیزیولوژی قلب انسان را به طور دقیق بازتولید می‌کند3. فقدان چنین سیستمی، کشف درمان‌های جدید برای نارسایی قلبی را محدود می‌کند4،5 و منجر به سمیت قلبی دارو به عنوان دلیل اصلی خروج از بازار شده است6.
در طول دهه گذشته، هشت داروی غیر قلبی عروقی به دلیل ایجاد طولانی شدن فاصله QT که منجر به آریتمی‌های بطنی و مرگ ناگهانی می‌شود، از استفاده بالینی کنار گذاشته شده‌اند.7 بنابراین، نیاز فزاینده‌ای به استراتژی‌های غربالگری پیش‌بالینی قابل اعتماد برای ارزیابی اثربخشی و سمیت قلبی عروقی وجود دارد. استفاده اخیر از کاردیومیوسیت‌های مشتق از سلول‌های بنیادی پرتوان القایی انسانی (hiPS-CM) در غربالگری دارو و آزمایش سمیت، راه‌حلی نسبی برای این مشکل ارائه می‌دهد. با این حال، ماهیت نابالغ hiPS-CMها و عدم پیچیدگی چند سلولی بافت قلبی، محدودیت‌های اصلی این روش هستند. مطالعات اخیر نشان داده‌اند که این محدودیت را می‌توان تا حدودی با استفاده از hiPS-CMهای اولیه برای تشکیل هیدروژل‌های بافت قلبی اندکی پس از شروع انقباضات خودبه‌خودی و افزایش تدریجی تحریک الکتریکی در طول زمان، برطرف کرد. با این حال، این ریزبافت‌های hiPS-CM فاقد خواص الکتروفیزیولوژیکی و انقباضی بالغ میوکارد بالغ هستند. علاوه بر این، بافت قلب انسان ساختار پیچیده‌تری دارد که شامل ترکیبی ناهمگن از انواع مختلف سلول، از جمله سلول‌های اندوتلیال، نورون‌ها و فیبروبلاست‌های استرومایی است که توسط مجموعه‌های خاصی از پروتئین‌های ماتریکس خارج سلولی به هم متصل شده‌اند. این ناهمگونی جمعیت‌های غیرکاردیومیوسیت11،12،13 در قلب پستانداران بالغ، مانع اصلی برای مدل‌سازی بافت قلب با استفاده از انواع سلول‌های منفرد است. این محدودیت‌های اصلی بر اهمیت توسعه روش‌هایی برای کشت بافت میوکارد سالم در شرایط فیزیولوژیکی و پاتولوژیکی تأکید می‌کند.
بخش‌های نازک کشت‌شده (300 میکرومتر) از قلب انسان، مدلی امیدوارکننده از میوکارد سالم انسان هستند. این روش دسترسی به یک سیستم چندسلولی سه‌بعدی کامل مشابه بافت قلب انسان را فراهم می‌کند. با این حال، تا سال 2019، استفاده از بخش‌های کشت‌شده قلب به دلیل بقای کوتاه مدت (24 ساعته) کشت محدود بود. این امر به دلیل عوامل مختلفی از جمله عدم کشش فیزیکی-مکانیکی، رابط هوا-مایع و استفاده از محیط‌های ساده‌ای است که نیازهای بافت قلب را پشتیبانی نمی‌کنند. در سال 2019، چندین گروه تحقیقاتی نشان دادند که گنجاندن عوامل مکانیکی در سیستم‌های کشت بافت قلب می‌تواند عمر کشت را افزایش دهد، بیان قلبی را بهبود بخشد و آسیب‌شناسی قلبی را تقلید کند. دو مطالعه زیبا 17 و 18 نشان می‌دهند که بارگذاری مکانیکی تک‌محوری تأثیر مثبتی بر فنوتیپ قلبی در طول کشت دارد. با این حال، این مطالعات از بارگذاری فیزیکی-مکانیکی سه‌بعدی پویا در چرخه قلب استفاده نکردند، زیرا بخش‌های قلب با نیروهای کششی ایزومتریک 17 یا بارگذاری آکسوتونیک خطی 18 بارگذاری شدند. این روش‌های کشش بافت منجر به سرکوب بسیاری از ژن‌های قلبی یا بیان بیش از حد ژن‌های مرتبط با پاسخ‌های کششی غیرطبیعی شد. نکته قابل توجه این است که پیتولیس و همکارانش 19 یک حمام کشت برشی از قلب پویا برای بازسازی چرخه قلبی با استفاده از بازخورد مبدل نیرو و محرک‌های کششی توسعه دادند. اگرچه این سیستم امکان مدل‌سازی دقیق‌تر چرخه قلبی در شرایط آزمایشگاهی را فراهم می‌کند، پیچیدگی و توان عملیاتی پایین این روش، کاربرد این سیستم را محدود می‌کند. آزمایشگاه ما اخیراً یک سیستم کشت ساده‌شده با استفاده از تحریک الکتریکی و یک محیط کشت بهینه‌شده برای حفظ زیست‌پذیری بخش‌هایی از بافت قلب خوک و انسان تا 6 روز توسعه داده است20،21.
در مقاله حاضر، ما یک مدل کشت بافت قلبی (CTCM) را با استفاده از بخش‌هایی از قلب خوک توصیف می‌کنیم که نشانه‌های هومورال را برای شبیه‌سازی فیزیولوژی قلبی سه‌بعدی و اتساع پاتوفیزیولوژیکی در طول چرخه قلبی در بر می‌گیرد. این CTCM می‌تواند با ارائه یک سیستم قلبی مقرون‌به‌صرفه و با توان عملیاتی متوسط ​​که فیزیولوژی/پاتوفیزیولوژی قلب پستانداران را برای آزمایش‌های پیش‌بالینی دارو تقلید می‌کند، دقت پیش‌بینی پیش‌بالینی دارو را به سطحی که قبلاً هرگز به آن دست نیافته بود، افزایش دهد.
سیگنال‌های مکانیکی همودینامیک نقش مهمی در حفظ عملکرد کاردیومیوسیت‌ها در شرایط آزمایشگاهی (in vitro) ایفا می‌کنند. 22،23،24. در نسخه خطی فعلی، ما یک CTCM (شکل 1a) توسعه داده‌ایم که می‌تواند با القای تحریک الکتریکی و مکانیکی در فرکانس‌های فیزیولوژیکی (1.2 هرتز، 72 ضربه در دقیقه) محیط قلب بزرگسالان را تقلید کند. برای جلوگیری از کشش بیش از حد بافت در طول دیاستول، از یک دستگاه چاپ سه‌بعدی برای افزایش اندازه بافت تا 25٪ استفاده شد (شکل 1b). ضربان‌سازی الکتریکی القا شده توسط سیستم C-PACE طوری زمان‌بندی شد که 100 میلی‌ثانیه قبل از سیستول با استفاده از یک سیستم جمع‌آوری داده شروع شود تا چرخه قلبی را به طور کامل بازتولید کند. سیستم کشت بافت از یک محرک پنوماتیک قابل برنامه‌ریزی (LB Engineering، آلمان) برای انبساط چرخه‌ای یک غشای سیلیکونی انعطاف‌پذیر استفاده می‌کند تا باعث انبساط برش‌های قلب در محفظه فوقانی شود. این سیستم از طریق یک مبدل فشار به یک خط هوای خارجی متصل شد که امکان تنظیم دقیق فشار (± 1 میلی‌متر جیوه) و زمان (± 1 میلی‌ثانیه) را فراهم می‌کرد (شکل 1c).
الف) بخش بافت را به حلقه نگهدارنده ۷ میلی‌متری که با رنگ آبی نشان داده شده است، درون محفظه کشت دستگاه متصل کنید. محفظه کشت توسط یک غشای سیلیکونی نازک و انعطاف‌پذیر از محفظه هوا جدا می‌شود. برای جلوگیری از نشت، یک واشر بین هر محفظه قرار دهید. درب دستگاه حاوی الکترودهای گرافیتی است که تحریک الکتریکی را فراهم می‌کنند. ب) نمایش شماتیک دستگاه بافت بزرگ، حلقه راهنما و حلقه نگهدارنده. بخش‌های بافت (قهوه‌ای) روی دستگاه بزرگ قرار می‌گیرند و حلقه راهنما در شیار لبه بیرونی دستگاه قرار می‌گیرد. با استفاده از راهنما، حلقه نگهدارنده پوشش داده شده با چسب اکریلیک بافت را با دقت روی بخش بافت قلب قرار دهید. ج) نموداری که زمان تحریک الکتریکی را به عنوان تابعی از فشار محفظه هوا که توسط یک محرک پنوماتیک قابل برنامه‌ریزی (PPD) کنترل می‌شود، نشان می‌دهد. از یک دستگاه جمع‌آوری داده برای همگام‌سازی تحریک الکتریکی با استفاده از حسگرهای فشار استفاده شد. هنگامی که فشار در محفظه کشت به آستانه تعیین شده می‌رسد، یک سیگنال پالس به C-PACE-EM ارسال می‌شود تا تحریک الکتریکی را آغاز کند. د) تصویر چهار CTCM که روی قفسه انکوباتور قرار گرفته‌اند. چهار دستگاه از طریق یک مدار پنوماتیک به یک PPD متصل هستند و حسگرهای فشار برای نظارت بر فشار در مدار پنوماتیک به دریچه هموستاتیک وارد می‌شوند. هر دستگاه شامل شش بخش بافتی است.
با استفاده از یک محرک پنوماتیکی واحد، ما توانستیم 4 دستگاه CTCM را کنترل کنیم که هر کدام می‌توانستند 6 بخش بافتی را در خود جای دهند (شکل 1d). در CTCM، فشار هوا در محفظه هوا به فشار همزمان در محفظه مایع تبدیل می‌شود و باعث انبساط فیزیولوژیکی برش قلب می‌شود (شکل 2a و فیلم تکمیلی 1). ارزیابی کشش بافت در فشار 80 میلی‌متر جیوه. Art. کشش بخش‌های بافتی را 25٪ نشان داد (شکل 2b). نشان داده شده است که این درصد کشش با طول سارکومر فیزیولوژیکی 2.2 تا 2.3 میکرومتر برای انقباض طبیعی بخش قلب مطابقت دارد17،19،25. حرکت بافت با استفاده از تنظیمات دوربین سفارشی ارزیابی شد (شکل تکمیلی 1). دامنه و سرعت حرکت بافت (شکل 2c، d) با کشش در طول چرخه قلبی و زمان در طول سیستول و دیاستول مطابقت داشت (شکل 2b). کشش و سرعت بافت قلب در طول انقباض و استراحت به مدت 12 روز در محیط کشت ثابت ماند (شکل 2f). برای ارزیابی تأثیر تحریک الکتریکی بر انقباض‌پذیری در طول کشت، ما روشی را برای تعیین بدشکلی فعال با استفاده از الگوریتم سایه‌زنی (شکل تکمیلی 2a، b) توسعه دادیم و توانستیم بین بدشکلی‌ها با و بدون تحریک الکتریکی تمایز قائل شویم. همان بخش از قلب (شکل 2f). در ناحیه متحرک برش (R6-9)، ولتاژ در طول تحریک الکتریکی 20٪ بیشتر از عدم وجود تحریک الکتریکی بود، که نشان دهنده سهم تحریک الکتریکی در عملکرد انقباضی است.
ردپاهای نماینده فشار محفظه هوا، فشار محفظه مایع و اندازه‌گیری‌های حرکت بافت تأیید می‌کنند که فشار محفظه، فشار محفظه مایع را تغییر می‌دهد و باعث حرکت متناظر برش بافت می‌شود. ب ردپاهای نماینده درصد کشش (آبی) بخش‌های بافت مربوط به درصد کشش (نارنجی). ج حرکت اندازه‌گیری شده برش قلبی با سرعت حرکت اندازه‌گیری شده سازگار است. (د) مسیرهای نماینده حرکت چرخه‌ای (خط آبی) و سرعت (خط نقطه‌چین نارنجی) در یک برش از قلب. ه) کمی‌سازی زمان چرخه (n = 19 برش در هر گروه، از خوک‌های مختلف)، زمان انقباض (n = 19 برش در هر گروه)، زمان استراحت (n = 19 برش در هر گروه، از خوک‌های مختلف)، حرکت بافت (n = 25 برش)/گروه از خوک‌های مختلف)، حداکثر سرعت سیستولیک (n = 24(D0)، 25(D12) برش/گروه از خوک‌های مختلف) و حداکثر نرخ استراحت (n = 24(D0)، 25(D12) برش/گروه از خوک‌های مختلف). آزمون تی-استیودنت دوطرفه هیچ تفاوت معنی‌داری را در هیچ پارامتری نشان نداد. f. تحلیل کرنش نماینده، ردپای مقاطع بافتی با (قرمز) و بدون (آبی)، ده ناحیه منطقه‌ای از مقاطع بافتی از همان مقطع. پنل‌های پایینی، کمّی‌سازی درصد اختلاف کرنش در مقاطع بافتی با و بدون تحریک الکتریکی در ده ناحیه از مقاطع مختلف را نشان می‌دهند. (n = 8 برش/گروه از خوک‌های مختلف، آزمون t دوطرفه استیودنت انجام شد؛ ****p < 0.0001، **p < 0.01، *p < 0.05). (n = 8 برش/گروه از خوک‌های مختلف، آزمون t دوطرفه استیودنت انجام شد؛ ****p < 0.0001، **p < 0.01، *p < 0.05). (n = 8 срезов/группу от разных свиней, проводится двусторонний t-критерий Стьюдента; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05). (n = 8 بخش/گروه از خوک‌های مختلف، آزمون t دوطرفه؛ ****p<0.0001، **p<0.01، *p<0.05). （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p <0.0001，**p <0.01，5p <0.01，5p （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p <0.0001，**p <0.01，5p <0.01，5p (n = 8 срезов/группу, от разных свиней, двусторонний критерий Стьюдента; ****p <0,0001, **p <0,01, *p <0,05). (n = 8 بخش/گروه، از خوک‌های مختلف، آزمون t دوطرفه؛ ****p<0.0001، **p<0.01، *p<0.05).میله‌های خطا نشان دهنده میانگین ± انحراف معیار هستند.
در سیستم کشت استاتیک برش‌های قلب بیومیمتیک قبلی ما [20، 21]، ما با اعمال تحریک الکتریکی و بهینه‌سازی ترکیب محیط کشت، زیست‌پذیری، عملکرد و یکپارچگی ساختاری برش‌های قلب را به مدت 6 روز حفظ کردیم. با این حال، پس از 10 روز، این ارقام به شدت کاهش یافت. ما به بخش‌های کشت شده در سیستم کشت استاتیک بیومیمتیک قبلی خود 20، 21 در شرایط کنترل (Ctrl) اشاره خواهیم کرد و از محیط کشت بهینه شده قبلی خود به عنوان شرایط MC و کشت تحت تحریک مکانیکی و الکتریکی همزمان (CTCM) استفاده خواهیم کرد. ابتدا، ما مشخص کردیم که تحریک مکانیکی بدون تحریک الکتریکی برای حفظ زیست‌پذیری بافت به مدت 6 روز کافی نیست (شکل تکمیلی 3a، b). جالب توجه است که با معرفی تحریک فیزیکی-مکانیکی و الکتریکی با استفاده از STCM، زیست‌پذیری بخش‌های قلب 12 روزه مانند بخش‌های قلب تازه تحت شرایط MS باقی ماند، اما تحت شرایط Ctrl اینطور نبود، همانطور که توسط آنالیز MTT نشان داده شده است (شکل 1). 3a). این نشان می‌دهد که تحریک مکانیکی و شبیه‌سازی چرخه قلبی می‌تواند بخش‌های بافتی را دو برابر بیشتر از آنچه در سیستم کشت استاتیک قبلی ما گزارش شده است، زنده نگه دارد. با این حال، ارزیابی یکپارچگی ساختاری مقاطع بافتی با استفاده از ایمونولیبلینگ تروپونین T قلبی و کانکسین 43 نشان داد که بیان کانکسین 43 در بافت‌های MC در روز 12 به طور قابل توجهی بالاتر از گروه کنترل در همان روز بود. با این حال، بیان یکنواخت کانکسین 43 و تشکیل دیسک Z به طور کامل حفظ نشد (شکل 3b). ما از یک چارچوب هوش مصنوعی (AI) برای تعیین کمیت یکپارچگی ساختاری بافت26، یک خط لوله یادگیری عمیق مبتنی بر تصویر مبتنی بر رنگ‌آمیزی تروپونین-T و کانکسین43 برای تعیین کمیت خودکار یکپارچگی ساختاری و فلورسانس برش‌های قلب از نظر قدرت محلی‌سازی استفاده می‌کنیم. این روش از یک شبکه عصبی کانولوشنی (CNN) و یک چارچوب یادگیری عمیق برای تعیین کمیت قابل اعتماد یکپارچگی ساختاری بافت قلب به شیوه‌ای خودکار و بی‌طرفانه، همانطور که در مرجع توضیح داده شده است، استفاده می‌کند. 26. بافت MC در مقایسه با بخش‌های کنترل استاتیک، شباهت ساختاری بهتری نسبت به روز 0 نشان داد. علاوه بر این، رنگ‌آمیزی تری‌کروم ماسون درصد فیبروز را در شرایط MS در مقایسه با شرایط کنترل در روز 12 کشت به طور قابل توجهی پایین‌تر نشان داد (شکل 3c). در حالی که CTCM زیست‌پذیری بخش‌های بافت قلب را در روز 12 به سطحی مشابه بافت قلب تازه افزایش داد، اما یکپارچگی ساختاری بخش‌های قلب را به طور قابل توجهی بهبود نبخشید.
نمودار میله‌ای، کمی‌سازی زیست‌پذیری MTT برش‌های قلب تازه (D0) یا کشت برش‌های قلب را به مدت 12 روز، چه در کشت استاتیک (D12 Ctrl) و چه در CTCM (D12 MC) نشان می‌دهد (n = 18 (D0)، 15 (D12 Ctrl)، 12 (D12 MC) برش/گروه از خوک‌های مختلف، آزمون ANOVA یک‌طرفه انجام شده است؛ #####p < 0.0001 در مقایسه با D0 و **p < 0.01 در مقایسه با D12 Ctrl). نمودار میله‌ای، کمی‌سازی زیست‌پذیری MTT برش‌های قلب تازه (D0) یا کشت برش‌های قلب را به مدت 12 روز، چه در کشت استاتیک (D12 Ctrl) و چه در CTCM (D12 MC) نشان می‌دهد (n = 18 (D0)، 15 (D12 Ctrl)، 12 (D12 MC) برش/گروه از خوک‌های مختلف، آزمون ANOVA یک‌طرفه انجام شده است؛ #####p < 0.0001 در مقایسه با D0 و **p < 0.01 در مقایسه با D12 Ctrl).هیستوگرام، کمی‌سازی زیست‌پذیری بخش‌های قلب تازه MTT (D0) یا کشت بخش‌های قلب به مدت 12 روز را در کشت استاتیک (کنترل D12) یا CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0)، 15 (کنترل D12). ) 12 (D12 MC) بخش/گروه از خوک‌های مختلف نشان می‌دهد، آزمون ANOVA یک‌طرفه انجام می‌شود؛####p < 0,0001 در сравнению с D0 و **p < 0,01 در сравнению با D12 Ctrl). ####p < 0.0001 در مقایسه با D0 و **p < 0.01 در مقایسه با D12 Ctrl). a或心脏切片培养12 天的MTT 活力的量化)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，过测试；与D0 相比，####p < 0.0001，与D12 Ctrl 相比，**p <0.01). a ，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；与D0 相比，#####p < 0.0 l C相比،**p.)هیستوگرام نشان دهنده کمی سازی زیست پذیری MTT در برش های قلب تازه (D0) یا برش های قلب کشت شده به مدت 12 روز در کشت استاتیک (کنترل D12) یا CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0)، 15 (کنترل D12))، 12 (D12 MC) بخش/گروه از خوک های مختلف، آزمون ANOVA یک طرفه؛####p < 0,0001 در сравнению с D0، ** p < 0,01 در сравнению با D12 Ctrl). ####p < 0.0001 در مقایسه با D0، **p < 0.01 در مقایسه با D12 (کنترل).b تروپونین-T (سبز)، کانکسین ۴۳ (قرمز) و DAPI (آبی) در بخش‌های تازه جدا شده قلب (D0) یا بخش‌های قلب کشت داده شده تحت شرایط استاتیک (Ctrl) یا شرایط CTCM (MC) به مدت ۱۲ روز) از تصاویر ایمونوفلورسانس نماینده (مقیاس خالی = ۱۰۰ میکرومتر). کمی‌سازی هوش مصنوعی از یکپارچگی ساختاری بافت قلب (n = 7 (D0)، 7 (D12 Ctrl)، 5 (D12 MC) برش/گروه هر کدام از خوک‌های مختلف، آزمون آنالیز واریانس یک‌طرفه انجام شد؛ ####p < 0.0001 در مقایسه با D0 و ****p < 0.0001 در مقایسه با D12 Ctrl). سنجش هوش مصنوعی از یکپارچگی ساختاری بافت قلب (n = 7 (D0)، 7 (D12 Ctrl)، 5 (D12 MC) برش/گروه از هر خوک مختلف، آزمون آنالیز واریانس یک طرفه انجام شد؛ ####p < 0.0001 در مقایسه با D0 و ****p < 0.0001 در مقایسه با D12 Ctrl). Количественная оценка структурной целостности сердечной ткани искусственным интеллектом (n = 7 (D0)، 7 (D12 Ctrl)، 5 (D12 MC) срезов/групп от разных свиней, проводится однофакторный тест ANOVA; ####p < 0,0001 در сравнению с D0 و ****p < 0,0001 по сравнению со D12 Ctrl). کمی‌سازی یکپارچگی ساختاری بافت قلب توسط هوش مصنوعی (n = 7 (D0)، 7 (D12 Ctrl)، 5 (D12 MC) بخش/گروه از خوک‌های مختلف، آزمون آنالیز واریانس یک‌طرفه انجام شد؛ ####p < 0.0001 در مقایسه با D0 و ****p < 0.0001 در مقایسه با D12 Ctrl).人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0)، 7 (D12 Ctrl)، 5 (D12 MC) برش/گروه هر کدام از خوک های مختلف، تست ANOVA یک طرفه相比，****p <0.0001 与D12 Ctrl 相比）.人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0)، 7 (D12 Ctrl)، 5 (D12 MC) برش/گروه هر یک از خوک های مختلف، تست ANOVA یک طرفه.###0p <1;与D0相比，****p <0.0001 与D12 Ctrl 相比）. Искусственный интеллект для количественной оценки структурной целостности сердечной ткани (n = 7 (D0)، 7 (D12 Ctrl)، 5 (D12 MC) срезов/группу каждой из разных свиней, односторонний тест ANOVA; ####p <0,0001 در مقابل D0 Для сравнения ****p < 0,0001 по сравнению со D12 Ctrl). هوش مصنوعی برای تعیین کمیت یکپارچگی ساختاری بافت قلب (n = 7 (D0)، 7 (D12 Ctrl)، 5 (D12 MC) بخش/گروه از هر خوک مختلف، آزمون ANOVA یک طرفه؛ ####p<0.0001 در مقابل .D0 برای مقایسه ****p < 0.0001 در مقایسه با D12 Ctrl). ج تصاویر نماینده (چپ) و کمیت‌سنجی (راست) برای برش‌های قلب رنگ‌آمیزی شده با رنگ‌آمیزی تری‌کروم ماسون (مقیاس خالی = ۵۰۰ میکرومتر) (n = ۱۰ برش/گروه هر کدام از خوک‌های مختلف، آزمون آنالیز واریانس یک‌طرفه انجام شده است؛ ####p < 0.0001 در مقایسه با D0 و ***p < 0.001 در مقایسه با D12 Ctrl). ج تصاویر نماینده (چپ) و کمیت‌سنجی (راست) برای برش‌های قلب رنگ‌آمیزی شده با رنگ‌آمیزی تری‌کروم ماسون (مقیاس خالی = ۵۰۰ میکرومتر) (n = ۱۰ برش/گروه از هر خوک مختلف، آزمون آنالیز واریانس یک‌طرفه انجام شده است؛ #### p < 0.0001 در مقایسه با D0 و ***p < 0.001 در مقایسه با D12 Ctrl). c Репрезентативные изображения (слева) и количественная оценка (справа) срезов سرдца, окрашенных трихромным красителем Massona (масштаб без покрытия = 500 mkm) (n = 10 srezov/grupпу от разных свиней, выполняется رابطهторонний тест ANOVA; #### p < 0,0001 در sravneniyu با D0 و ***p < 0,001 по сравнению با Ctrl D12). ج تصاویر نماینده (چپ) و کمی‌سازی (راست) از بخش‌های قلب رنگ‌آمیزی شده با رنگ‌آمیزی تری‌کروم ماسون (مقیاس بدون پوشش = ۵۰۰ میکرومتر) (n = ۱۰ بخش/گروه از خوک‌های مختلف، آزمون آنالیز واریانس یک‌طرفه انجام شد؛ #### p < 0.0001 در مقایسه با D0 و ***p < 0.001 در مقایسه با D12 Ctrl). c 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像（左）和量化（右）（裸M）（表性图像（左）和量化（右）（裸M）（裸尃个切片/组，每组来自不同的猪，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0.0001 与D0 相D0 相0，20，相比）. C 用 Masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 （左 左） 量化 （右） 裸尣庣度裸尺度 = 500μm） （n = 10 0.0001 与D0 相比，***p <0.001 与D12 Ctrl 相比）. c Репрезентативные изображения (слева) и количественный آنлиз (справа) срезов سرдца, окрашенных трихромным красителем Massona (чистая) шкала = 500 mkm) (n = 10 срезов/группа, каждый од другой свиньи, протестировано с помощью однофакторного дисперсионного анализа ;### #p < 0,0001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c تصاویر نماینده (چپ) و سنجش کمی (راست) از بخش‌های قلب رنگ‌آمیزی شده با رنگ‌آمیزی تری‌کروم ماسون (خالی = ۵۰۰ میکرومتر) (n = ۱۰ بخش/گروه، هر کدام از یک خوک متفاوت، آزمایش شده با آنالیز واریانس یک طرفه؛### # p < 0.0001 در مقایسه با D0، ***p < 0.001 در مقایسه با D12 Ctrl).میله‌های خطا نشان دهنده میانگین ± انحراف معیار هستند.
ما فرض کردیم که با افزودن مولکول‌های کوچک به محیط کشت، می‌توان یکپارچگی کاردیومیوسیت‌ها را بهبود بخشید و توسعه فیبروز را در طول کشت CTCM کاهش داد. بنابراین، به دلیل تعداد کم عوامل مخدوش‌کننده، با استفاده از کشت‌های کنترل استاتیک خود، مولکول‌های کوچک را غربالگری کردیم20،21. دگزامتازون (Dex)، تری‌یدوتیرونین (T3) و SB431542 (SB) برای این غربالگری انتخاب شدند. این مولکول‌های کوچک قبلاً در کشت‌های hiPSC-CM برای القای بلوغ کاردیومیوسیت‌ها با افزایش طول سارکومر، لوله‌های T و سرعت هدایت استفاده شده‌اند. علاوه بر این، هم Dex (یک گلوکوکورتیکوئید) و هم SB به عنوان سرکوب‌کننده التهاب شناخته شده‌اند29،30. بنابراین، ما آزمایش کردیم که آیا افزودن یک یا ترکیبی از این مولکول‌های کوچک، یکپارچگی ساختاری بخش‌های قلب را بهبود می‌بخشد یا خیر. برای غربالگری اولیه، دوز هر ترکیب بر اساس غلظت‌های رایج مورد استفاده در مدل‌های کشت سلولی (1 میکرومولار Dex27، 100 نانومولار T327 و 2.5 میکرومولار SB31) انتخاب شد. پس از 12 روز کشت، ترکیب T3 و Dex منجر به یکپارچگی ساختاری بهینه کاردیومیوسیت و حداقل بازسازی فیبری شد (شکل‌های تکمیلی 4 و 5). علاوه بر این، استفاده از غلظت‌های دو یا دو برابر این غلظت‌ها از T3 و Dex اثرات زیان‌آوری در مقایسه با غلظت‌های طبیعی ایجاد کرد (شکل‌های تکمیلی 6a،b).
پس از غربالگری اولیه، ما مقایسه‌ای رو در رو از 4 شرایط کشت انجام دادیم (شکل 4a): Ctrl: بخش‌های قلبی که در کشت استاتیک قبلاً شرح داده شده ما با استفاده از محیط بهینه شده ما کشت داده شدند؛ 20.21 TD: T3 و Ctrl s که Dex را در روز چهارشنبه اضافه کردند؛ MC: بخش‌های قلبی که در CTCM با استفاده از محیط بهینه شده قبلی ما کشت داده شدند؛ و MT: CTCM با T3 و Dex اضافه شده به محیط. پس از 12 روز کشت، زنده ماندن بافت‌های MS و MT همانند بافت‌های تازه ارزیابی شده توسط سنجش MTT باقی ماند (شکل 4b). جالب توجه است که افزودن T3 و Dex به کشت‌های ترانس‌ول (TD) منجر به بهبود قابل توجهی در زنده ماندن در مقایسه با شرایط Ctrl نشد، که نشان دهنده نقش مهم تحریک مکانیکی در حفظ زنده ماندن بخش‌های قلبی است.
نمودار طراحی آزمایش که چهار شرایط کشت مورد استفاده برای ارزیابی اثرات تحریک مکانیکی و مکمل T3/Dex بر روی محیط کشت را به مدت 12 روز نشان می‌دهد. نمودار میله‌ای b، میزان زنده‌مانی را 12 روز پس از کشت در هر 4 شرایط کشت (Ctrl، TD، MC و MT) در مقایسه با برش‌های قلب تازه (D0) نشان می‌دهد (n = 18 (D0)، 15 (D12 Ctrl، D12 TD و D12 MT)، 12 (D12 MC) برش/گروه از خوک‌های مختلف، آزمون آنالیز واریانس یک‌طرفه انجام شده است؛ ####p < 0.0001، ###p < 0.001 در مقایسه با D0 و **p < 0.01 در مقایسه با D12 Ctrl). نمودار میله‌ای b، میزان زنده‌مانی را ۱۲ روز پس از کشت در هر ۴ شرایط کشت (Ctrl، TD، MC و MT) در مقایسه با برش‌های قلب تازه (D0) نشان می‌دهد (n = 18 (D0)، 15 (D12 Ctrl، D12 TD و D12 MT)، 12 (D12 MC) برش/گروه از خوک‌های مختلف، آزمون آنالیز واریانس یک‌طرفه انجام شده است؛ ####p < 0.0001، ###p < 0.001 در مقایسه با D0 و **p < 0.01 در مقایسه با D12 ctrl). b Гистограмма показывает количественную оценку жизнеспособности через 12 дней после культивирования во всех 4 شرایطях культивирования (کنترل، TD، MC و MT) по сравнению со свежими срезами سرдца (D0) (n = 18 (D0)، 15 (D12 Ctrl، D12 TD و D12 MT)، 12 (D12 MC) сотрезов/групне проводится رابطهторонний тест ANOVA; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 по сравнению с D0 و **p < 0,01 по сравнению با D12 Ctrl). b نمودار میله‌ای، کمیت‌سنجی زیست‌پذیری را در 12 روز پس از کشت در هر 4 شرایط کشت (کنترل، TD، MC و MT) در مقایسه با بخش‌های قلب تازه (D0) نشان می‌دهد (n = 18 (D0)، 15 (D12 Ctrl، D12 TD و D12 MT)، 12 (D12 MC) بخش/گروه از خوک‌های مختلف، آزمون ANOVA یک‌طرفه؛ ####p < 0.0001، ###p < 0.001 در مقابل D0 و **p < 0.01 در مقایسه با D12 Ctrl). b. TD 和D12 MT)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；####p <0.000##p <0.000##01，相比،**p <0.01 与D12控制）.ب ۴ ۱۲ (دی۱۲ ام‌سی) b Гистограмма، показывающая все 4 شرطя культивирования (کنترل، TD، MC و MT) در sravneniyu با کليه ذرات سرخامي سرو (D0) (n = 18 (D0)، 15 (D12 Ctrl، D12 TD)، و D12 разных свиней 12 (D12 MC) срезы/группа, رابطهторонний тест ANOVA; ####p <0,0001, ###p <0,001 по сравнению с D0, **p <0,01 по сравнению со контролем D12). ب. هیستوگرام نشان دهنده هر 4 شرایط کشت (کنترل، TD، MC و MT) در مقایسه با بخش‌های قلب تازه (D0) (n = 18 (D0)، 15 (D12 Ctrl، D12 TD و D12 MT)، از خوک‌های مختلف 12 بخش/گروه (D12 MC)، آزمون ANOVA یک طرفه؛ ####p<0.0001، ###p<0.001 در مقابل D0، **p<0.01 در مقابل کنترل D12). نمودار ستونی c، کمیت‌سنجی شار گلوکز را 12 روز پس از کشت در هر 4 شرایط کشت (Ctrl، TD، MC و MT) در مقایسه با برش‌های قلب تازه (D0) نشان می‌دهد (n = 6 برش/گروه از خوک‌های مختلف، آزمون ANOVA یک‌طرفه انجام شده است؛ ###p < 0.001، در مقایسه با D0 و ***p < 0.001 در مقایسه با D12 Ctrl). نمودار ستونی c، کمیت‌سنجی شار گلوکز را 12 روز پس از کشت در هر 4 شرایط کشت (Ctrl، TD، MC و MT) در مقایسه با برش‌های قلب تازه (D0) نشان می‌دهد (n = 6 برش/گروه از خوک‌های مختلف، آزمون ANOVA یک‌طرفه انجام شده است؛ ###p < 0.001، در مقایسه با D0 و ***p < 0.001 در مقایسه با D12 Ctrl). c Gistogramma показывает количественную оценку потока глюкозы через 12 دی بعد از культивирования во всех 4 شرایطях культивирования (کنترل، TD، MC و MT) با انحراف با همه رنگ‌ها (D0) (n = 6 واحد/گروه از یک گروه متفاوت، نسبتاً مستقیم تست ANOVA؛ ###p < 0,001 در сравнению с D0 و ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). هیستوگرام c، کمیت شار گلوکز را 12 روز پس از کشت تحت هر 4 شرایط کشت (کنترل، TD، MC و MT) در مقایسه با بخش‌های قلب تازه (D0) نشان می‌دهد (n = 6 بخش/گروه از خوک‌های مختلف، آزمون ANOVA یک‌طرفه انجام شد؛ ###p < 0.001 در مقایسه با D0 و ***p < 0.001 در مقایسه با D12 Ctrl). c 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) 相毹弌弌天的葡萄糖通量定量（n = 6 片/组，来自不同猪，单向执行他他测试；#0##p < 0.相比，***p <0.001 与D12 Ctrl 相比）. C 条形图 显示 所有 4 种 条件 （（ctrl 、 td 、 mc 和 mt） 新鲜 心脏 切片 切片 切片 切片培养 后 后 12 天 的 通量 定量 （n = 6 片/组 , 来自 猪 , , , , , , , ,猪单向执行ANOVA 测试；###p <0.001，与D0 相比，***p <0.001 与D12 Ctrl 相比）. c Gistogramma, показывающая количественную оценку потока глюкозы через 12 دی بعد از культивирования для всех 4 شرایطй культивирования (کنترل، TD، MC و MT) با انحراف با همه رنگها (D0) (n = 6 واحد/گروپپا، از دو گروه مختلف، نسبت به گروه проведены тесты ANOVA; ###p < 0,001 در sravneniyu با D0, ***p < 0,001 по сравнению с D12 (کنترل). هیستوگرام c نشان دهنده کمی سازی شار گلوکز در 12 روز پس از کشت برای هر 4 شرایط کشت (کنترل، TD، MC و MT) در مقایسه با برش‌های قلب تازه (D0) (n = 6 برش/گروه، از خوک‌های مختلف، آزمون‌های ANOVA یک طرفه انجام شد، ###p < 0.001 در مقایسه با D0، ***p < 0.001 در مقایسه با D12 (کنترل).د نمودارهای آنالیز سویه بافت‌های تازه (آبی)، روز دوازدهم MC (سبز) و روز دوازدهم MT (قرمز) در ده نقطه برش بافت منطقه‌ای (n = 4 برش در هر گروه، آزمون ANOVA یک‌طرفه؛ تفاوت معنی‌داری بین گروه‌ها وجود نداشت). ه نمودار آتشفشانی که ژن‌های با بیان متفاوت را در برش‌های قلب تازه (D0) در مقایسه با برش‌های قلب کشت‌شده در شرایط ایستا (Ctrl) یا تحت شرایط MT (MT) به مدت 10-12 روز نشان می‌دهد. و نقشه حرارتی ژن‌های سارکومر برای برش‌های قلب کشت‌شده در هر یک از شرایط کشت. میله‌های خطا نشان دهنده میانگین ± انحراف معیار هستند.
وابستگی متابولیکی به تغییر از اکسیداسیون اسیدهای چرب به گلیکولیز، از ویژگی‌های بارز تمایززدایی کاردیومیوسیت‌ها است. کاردیومیوسیت‌های نابالغ در درجه اول از گلوکز برای تولید ATP استفاده می‌کنند و میتوکندری‌های هیپوپلاستیک با تعداد کمی کریستا دارند5،32. تجزیه و تحلیل استفاده از گلوکز نشان داد که در شرایط MC و MT، استفاده از گلوکز مشابه بافت‌های روز 0 بود (شکل 4c). با این حال، نمونه‌های Ctrl افزایش قابل توجهی در استفاده از گلوکز در مقایسه با بافت تازه نشان دادند. این نشان می‌دهد که ترکیب CTCM و T3/Dex باعث افزایش زنده ماندن بافت و حفظ فنوتیپ متابولیک بخش‌های قلب کشت شده 12 روزه می‌شود. علاوه بر این، تجزیه و تحلیل سویه نشان داد که سطح سویه به مدت 12 روز تحت شرایط MT و MS مانند بافت قلب تازه باقی مانده است (شکل 4d).
برای تجزیه و تحلیل تأثیر کلی CTCM و T3/Dex بر چشم‌انداز رونویسی جهانی بافت برش‌های قلبی، RNAseq را روی برش‌های قلبی از هر چهار شرایط کشت مختلف انجام دادیم (داده‌های تکمیلی 1). جالب توجه است که بخش‌های MT شباهت رونویسی بالایی با بافت قلب تازه نشان دادند، و تنها 16 ژن از 13642 ژن به صورت متفاوت بیان شدند. با این حال، همانطور که قبلاً نشان دادیم، برش‌های Ctrl پس از 10 تا 12 روز کشت، 1229 ژن با بیان متفاوت را نشان دادند (شکل 4e). این داده‌ها توسط qRT-PCR ژن‌های قلب و فیبروبلاست تأیید شدند (شکل تکمیلی 7a-c). جالب توجه است که بخش‌های Ctrl کاهش بیان ژن‌های قلبی و چرخه سلولی و فعال شدن برنامه‌های ژن التهابی را نشان دادند. این داده‌ها نشان می‌دهند که تمایززدایی، که معمولاً پس از کشت طولانی مدت رخ می‌دهد، تحت شرایط MT کاملاً کاهش می‌یابد (شکل تکمیلی 8a،b). مطالعه دقیق ژن‌های سارکومر نشان داد که تنها تحت شرایط MT، ژن‌های کدکننده سارکومر (شکل 4f) و کانال یونی (شکل تکمیلی 9) حفظ می‌شوند و از سرکوب آنها در شرایط Ctrl، TD و MC جلوگیری می‌شود. این داده‌ها نشان می‌دهند که با ترکیبی از تحریک مکانیکی و هومورال (T3/Dex)، ترانسکریپتوم برش قلب می‌تواند پس از 12 روز کشت، مشابه برش‌های قلب تازه باقی بماند.
این یافته‌های رونویسی با این واقعیت پشتیبانی می‌شوند که یکپارچگی ساختاری کاردیومیوسیت‌ها در برش‌های قلب در شرایط MT به مدت 12 روز به بهترین شکل حفظ می‌شود، همانطور که توسط کانکسین 43 دست نخورده و موضعی نشان داده شده است (شکل 5a). علاوه بر این، فیبروز در برش‌های قلب تحت شرایط MT در مقایسه با Ctrl به طور قابل توجهی کاهش یافته و مشابه برش‌های قلب تازه است (شکل 5b). این داده‌ها نشان می‌دهند که ترکیب تحریک مکانیکی و درمان T3/Dex به طور موثری ساختار قلب را در برش‌های قلب در کشت حفظ می‌کند.
تصاویر ایمونوفلورسانس نمونه‌ای از تروپونین-T (سبز)، کانکسین ۴۳ (قرمز) و DAPI (آبی) در بخش‌های تازه جدا شده قلب (D0) یا کشت داده شده به مدت ۱۲ روز در هر چهار شرایط کشت بخش‌های قلب (خط مقیاس = ۱۰۰ میکرومتر). سنجش هوش مصنوعی از یکپارچگی ساختاری بافت قلب (n = 7 (D0 و D12 Ctrl)، 5 (D12 TD، D12 MC و D12 MT) برش/گروه از خوک‌های مختلف، آزمون آنالیز واریانس یک‌طرفه انجام شد؛ ####p < 0.0001 در مقایسه با D0 و *p < 0.05، یا ****p < 0.0001 در مقایسه با D12 Ctrl). سنجش هوش مصنوعی از یکپارچگی ساختاری بافت قلب (n = 7 (D0 و D12 Ctrl)، 5 (D12 TD، D12 MC و D12 MT) برش/گروه از خوک‌های مختلف، آزمون آنالیز واریانس یک‌طرفه انجام شد؛ #### p < 0.0001 در مقایسه با D0 و *p < 0.05، یا ****p < 0.0001 در مقایسه با D12 Ctrl). Количественная оценка структурной целостности ткани сердца с помощью искусственного интеллекта (n = 7 (D0 و D12 Ctrl)، 5 (D12 TD، D12 MC و D12 MT) срезов/группу от разных свиней, проведен однофакторный тест ANOVA; #### p < 0,0001 по сравнению с D0 و *p < 0,05 یا ****p < 0,0001 по сравнению با D12 Ctrl). کمی‌سازی یکپارچگی ساختاری بافت قلب با استفاده از هوش مصنوعی (n = 7 (D0 و D12 Ctrl)، 5 (D12 TD، D12 MC و D12 MT) بخش/گروه از خوک‌های مختلف، آزمون آنالیز واریانس یک‌طرفه انجام شد؛ #### p < 0.0001 در مقایسه با D0 و *p < 0.05 یا ****p < 0.0001 در مقایسه با D12 Ctrl).对不同猪的心脏组织结构完整性（n = 7（D0 和D12 Ctrl）、5（D12 TD、D12 MC 和D12 MT）切片/组）进行人工智能量化，进行单向ANOVA 测试；#### p <0.0001 与D0 和0*p <0.0001 与D0 和0*p < 0.0001 与D12 Ctrl 相比）.对 不同 猪 的 心脏 结构 完整性 （n = 7 （d0 和 d12 ctrl） （5 （d12 td 、 d12 m ） d1 mc人工 智能量 化 进行 单向 单向 单向 测试 ； ########## p <0.0001 与D0 咔，*p <0.0. 0.0001 与D12 Ctrl 相比）.کمی‌سازی یکپارچگی ساختاری بافت قلب با استفاده از هوش مصنوعی در خوک‌های مختلف (n = 7 (D0 و D12 Ctrl)، 5 (D12 TD، D12 MC و D12 MT) بخش/گروه) با آزمون ANOVA یک‌طرفه؛#### p < 0,0001 по сравнению с D0 و *p < 0,05 یا ****p < 0,0001 по сравнению با D12 Ctrl). #### p < 0.0001 در مقایسه با D0 و *p < 0.05 یا ****p < 0.0001 در مقایسه با D12 Ctrl). b تصاویر نمونه و کمی‌سازی برش‌های قلب رنگ‌آمیزی شده با رنگ‌آمیزی تری‌کروم ماسون (خط مقیاس = ۵۰۰ میکرومتر) (n = ۱۰ (D0، D12 Ctrl، D12 TD و D12 MC)، ۹ برش/گروه (D12 MT) از خوک‌های مختلف، آزمون آنالیز واریانس یک‌طرفه انجام شده است؛ ####p < 0.0001 در مقایسه با D0 و ***p < 0.001، یا ****p < 0.0001 در مقایسه با D12 Ctrl). b تصاویر نمونه و کمی‌سازی برش‌های قلب رنگ‌آمیزی شده با رنگ‌آمیزی تری‌کروم ماسون (خط مقیاس = ۵۰۰ میکرومتر) (n = ۱۰ (D0، D12 Ctrl، D12 TD و D12 MC)، ۹ برش/گروه (D12 MT) از خوک‌های مختلف، آزمون آنالیز واریانس یک‌طرفه انجام شده است؛ ####p < 0.0001 در مقایسه با D0 و ***p < 0.001، یا ****p < 0.0001 در مقایسه با D12 Ctrl). b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов سرдца, окрашенных трихромным красителем Massona (масштабная линейка = 500 mkm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD and D12 MC), 9 (D12 MT) srezov/grupпу от разных свиней, выполняется رابطهторонний тест ANOVA; ####p < 0,0001 p<0,0001 по 0,0001 D ****p < 0,0001 по сравнению با Ctrl D12). b تصاویر نمایشی و کمی‌سازی بخش‌های قلب رنگ‌آمیزی شده با رنگ‌آمیزی تری‌کروم ماسون (نوار مقیاس = ۵۰۰ میکرومتر) (n = ۱۰ (D0، D12 Ctrl، D12 TD و D12 MC)، ۹ (D12 MT) بخش/گروه از خوک‌های مختلف، انجام آنالیز واریانس یک‌طرفه؛ #####p < 0.0001 در مقابل D0 و ***p < 0.001 یا ****p < 0.0001 در مقابل D12 Ctrl). b 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像和量化（比例尺= 500μm）1（1（D=0 Ctrl、D12 TD 和D12 MC），来自不同猪的9 个（D12 MT）切片/组，进行单因素方差的9#p00.与D0 相比，***p < 0.001，或****p <0.0001 与D12 Ctrl 相比）. b 用 mason 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 和 量化d12 ctrl 、 d12 td 和 d12 mc） 来自 不同 的 9 个 d12 mt 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片/组，进行单因素方差分析中方差分析；0.#0#D；0.相比，***p <0.001，或****p <0.0001 与D12 Ctrl 相比）. b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов سرдца, окрашенных трихромом Massona (масштабная линейка = 500 mkm) (n = 10 (D0, D12) Ctrl، D12 TD و D12 MC)، 9 (D12 MT) срезов от разных свиней / группы, один- способ ANOVA; ####p < 0,0001 برای سراب با D0, ***p < 0,001 یا ****p < 0,0001 در سراونهنیю با D12 Ctrl). ب تصاویر نمایشی و کمی‌سازی بخش‌های قلب رنگ‌آمیزی شده با تری‌کروم ماسون (مقیاس نواری = ۵۰۰ میکرومتر) (n = ۱۰ (D0، D12 Ctrl، D12 TD و D12 MC)، ۹ (D12 MT) بخش از خوک‌ها/گروه‌های مختلف، یک روش ANOVA؛ ####p < 0.0001 در مقایسه با D0، ***p < 0.001 یا ****p < 0.0001 در مقایسه با D12 Ctrl).میله‌های خطا نشان دهنده میانگین ± انحراف معیار هستند.
در نهایت، توانایی CTCM در تقلید هیپرتروفی قلبی با افزایش کشش بافت قلب ارزیابی شد. در CTCM، حداکثر فشار محفظه هوا از 80 میلی‌متر جیوه به 80 میلی‌متر جیوه (کشش طبیعی) تا 140 میلی‌متر جیوه افزایش یافت (شکل 6a). این مربوط به افزایش 32 درصدی کشش است (شکل 6b)، که قبلاً به عنوان درصد کشش مربوطه مورد نیاز برای بخش‌های قلب برای دستیابی به طول سارکومر مشابه آنچه در هیپرتروفی دیده می‌شود، نشان داده شده بود. کشش و سرعت بافت قلب در طول انقباض و استراحت در طول شش روز کشت ثابت ماند (شکل 6c). بافت قلب از شرایط MT به مدت شش روز تحت کشش طبیعی (MT (عادی)) یا شرایط کشش بیش از حد (MT (OS)) قرار گرفت. پس از چهار روز کشت، نشانگر زیستی هیپرتروفیک NT-ProBNP در محیط تحت شرایط MT (OS) در مقایسه با شرایط MT (عادی) به طور قابل توجهی افزایش یافت (شکل 7a). علاوه بر این، پس از شش روز کشت، اندازه سلول در MT (OS) (شکل 7b) در مقایسه با بخش‌هایی از قلب MT (طبیعی) به طور قابل توجهی افزایش یافت. علاوه بر این، جابجایی هسته‌ای NFATC4 در بافت‌های بیش از حد کشیده شده به طور قابل توجهی افزایش یافت (شکل 7c). این نتایج، توسعه تدریجی بازسازی پاتولوژیک پس از افزایش بیش از حد فشار خون را نشان می‌دهد و از این مفهوم پشتیبانی می‌کند که دستگاه CTCM می‌تواند به عنوان بستری برای مطالعه سیگنالینگ هیپرتروفی قلبی ناشی از کشش استفاده شود.
مقادیر شاخص فشار محفظه هوا، فشار محفظه مایع و اندازه‌گیری‌های حرکت بافت تأیید می‌کنند که فشار محفظه، فشار محفظه مایع را تغییر می‌دهد و باعث حرکت متناظر برش بافت می‌شود. ب) منحنی‌های درصد کشش و نرخ کشش برای بخش‌های بافتی که به طور معمول کشیده شده‌اند (نارنجی) و بیش از حد کشیده شده‌اند (آبی). ج) نمودار میله‌ای که زمان چرخه (n = 19 برش در هر گروه، از خوک‌های مختلف)، زمان انقباض (n = 18-19 برش در هر گروه، از خوک‌های مختلف)، زمان استراحت (n = 19 برش در هر گروه، از خوک‌های مختلف) را نشان می‌دهد، دامنه حرکت بافت (n = 14 برش/گروه، از خوک‌های مختلف)، حداکثر سرعت سیستولیک (n = 14 برش/گروه، از خوک‌های مختلف) و حداکثر سرعت استراحت (n = 14 (D0)، 15 (D6) بخش/گروه) از خوک‌های مختلف)، آزمون t-استیودنت دو طرفه هیچ تفاوت معنی‌داری در هیچ پارامتری نشان نداد، که نشان می‌دهد این پارامترها در طول 6 روز کشت با ولتاژ بیش از حد ثابت مانده‌اند. میله‌های خطا نشان دهنده میانگین ± انحراف معیار هستند.
نمودار میله‌ای برای تعیین کمی غلظت NT-ProBNP در محیط کشت از برش‌های قلب کشت‌شده تحت شرایط کشش طبیعی MT (Norm) یا کشش بیش از حد (OS) (n = 4 (D2 MTNorm)، 3 (D2 MTOS، D4 MTNorm و D4 MTOS) برش/گروه از خوک‌های مختلف، آنالیز واریانس دوطرفه انجام شده است؛ **p < 0.01 در مقایسه با کشش طبیعی). نمودار میله‌ای برای تعیین کمی غلظت NT-ProBNP در محیط کشت از برش‌های قلب کشت‌شده تحت شرایط کشش طبیعی MT (Norm) یا کشش بیش از حد (OS) (n = 4 (D2 MTNorm)، 3 (D2 MTOS، D4 MTNorm و D4 MTOS) برش/گروه از خوک‌های مختلف، آنالیز واریانس دوطرفه انجام شده است؛ **p < 0.01 در مقایسه با کشش طبیعی).هیستوگرام کمی غلظت NT-ProBNP در محیط کشت از برش‌های قلب کشت داده شده تحت شرایط کشش طبیعی MT (نرمال) یا کشش بیش از حد (OS) (n = 4 (D2 MTNorm)، 3 (D2 MTOS، D4 MTNorm و D4).MTOS) برش/گروه از خوک‌های مختلف، تجزیه و تحلیل واریانس دو عاملی انجام شده است.**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p < 0.01 در مقایسه با کشش طبیعی). یک 在MT 正常拉伸(هنجار) 或过度拉伸(OS) 条件下培养的心脏切片培养基中NT-ProBNP浓度的条形图量化（n = 4 (D2 MTNorm)、3（D2 MTOS、D4 MTNorm 和D4 MTOS）来自不同猪的切片/组，进行双向方差分析；**与正常拉伸相比，p <0.01 کمی سازی غلظت NT-ProBNP در برش های قلب کشت شده تحت شرایط کشش طبیعی MT (Norm) یا کشش بیش از حد (OS) (n=4 (D2 MTNorm)، 3 (D2 MTOS، D4 MTNorm和D4 MTOS) از شرایط مختلف猪的切片/组，可以双向方方发发动 **در مقایسه با کشش معمولی، p <0.01).هیستوگرام کمی‌سازی غلظت NT-ProBNP در برش‌های قلب کشت‌شده تحت شرایط کشش طبیعی MT (نرمال) یا کشش بیش از حد (OS) (n = 4 (D2 MTNorm)، 3 (D2 MTOS، D4 MTNorm) و D4 MTOS) برش/گروه از خوک‌های مختلف، آنالیز واریانس دوطرفه؛**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p < 0.01 در مقایسه با کشش طبیعی). ب تصاویر نماینده برای برش‌های قلب رنگ‌آمیزی شده با تروپونین-T و WGA (چپ) و تعیین اندازه سلول (راست) (n = 330 (D6 MTOS)، 369 (D6 MTNorm) سلول/گروه از 10 برش مختلف از خوک‌های مختلف، آزمون t دو طرفه انجام شده است؛ ****p < 0.0001 در مقایسه با کشش طبیعی). ب تصاویر نماینده برای برش‌های قلب رنگ‌آمیزی شده با تروپونین-T و WGA (چپ) و تعیین اندازه سلول (راست) (n = 330 (D6 MTOS)، 369 (D6 MTNorm) سلول/گروه از 10 برش مختلف از خوک‌های مختلف، آزمون t دو طرفه انجام شده است؛ ****p < 0.0001 در مقایسه با کشش طبیعی). b Репрезентативные изображения срезов سرдца، окрашенных troponinom-T و AZP (sleva) و colichestvennogo مشخصيя размера клеток (справа) (n = 330 (D6 MTOS)، 369 (D6 MTNorm) клеток/группу из 10 разных срезов от разных свиней, دو- проводится хвостовой t-критерий Стьюдента; ****p < 0,0001 по сравнению с нормальным растяжением). b تصاویر نمایشی از بخش‌های قلب رنگ‌آمیزی شده با تروپونین-T و AZP (چپ) و اندازه‌گیری اندازه سلول (راست) (n = 330 (D6 MTOS)، 369 (D6 MTNorm) سلول/گروه از 10 بخش مختلف از خوک‌های مختلف، آزمون t-استیودنت دوطرفه انجام شد؛ ****p < 0.0001 در مقایسه با سویه طبیعی). b 用肌钙蛋白-T 和WGA（左）和细胞大小量化（右）染色的心脏切片的心脏切片的代化（右）染色的心脏切片的代表MTOS），来自不同猪的10 个不同切片的369（D6 MTNorm）细胞/组，两进行有尾学生t 检验；与正常拉伸相比，****p <0.0001）. ب تصاویر نمایشی از برش‌های قلب رنگ‌آمیزی شده با calcarein-T و WGA (چپ) و اندازه سلول (راست) (n = 330 (D6 MTOS)، 369 از 10 برش مختلف (D6 MTNorm)) سلول‌ها/组، 两方法有尾学生 آزمون t؛ در مقایسه با کشش طبیعی، ****p < 0.0001). b Репрезентативные изображения срезов سرдца, окрашенных troponinom-T و AZP (слева) и количественная оценка размера клеток (справа) (n = 330) (D6 MTOS)، 369 (D6 MTNorm) из 10 различных срезов от разных свиней Клетки/группа, двусторонние критерий Стьюдента; ****p < 0,0001 по сравнению с нормальным راستینژنیم). ب تصاویر نمایشی از بخش‌های قلب رنگ‌آمیزی شده با تروپونین-T و AZP (چپ) و تعیین کمیت اندازه سلول (راست) (n = 330 (D6 MTOS)، 369 (D6 MTNorm) از 10 بخش مختلف از خوک‌های مختلف) سلول‌ها/گروه، معیار دو دامنه‌ای t دانشجویی؛ ****p < 0.0001 در مقایسه با سویه نرمال). تصاویر نماینده برای برش‌های قلب MTOS روز ۰ و روز ۶ که برای تروپونین-T و NFATC4 ایمن‌سازی شده‌اند و تعیین مقدار انتقال NFATC4 به هسته‌های CMها (n = ۴ (D0)، ۳ (D6 MTOS) برش/گروه از خوک‌های مختلف، آزمون t دو طرفه انجام شده است؛ *p < ۰.۰۵). تصاویر نماینده برای برش‌های قلب MTOS روز ۰ و روز ۶ که برای تروپونین-T و NFATC4 ایمن‌سازی شده‌اند و تعیین مقدار انتقال NFATC4 به هسته‌های CMها (n = ۴ (D0)، ۳ (D6 MTOS) برش/گروه از خوک‌های مختلف، آزمون t دو طرفه انجام شده است؛ *p < ۰.۰۵). c. NFATC4 در ядра кавернозных клеток (n = 4 (D0)، 3 (D6 MTOS) срезов/группу от разных свиней , выполняется двусторонний t-критерий Стьюдента; *p < 0,05). c تصاویر نماینده برای برش‌های قلب در روزهای 0 و 6 MTOS، که برای تروپونین-T و NFATC4 ایمن‌سازی شده بودند، و تعیین مقدار جابجایی NFATC4 در هسته سلول‌های کاورنو (n = 4 (D0)، 3 (D6 MTOS) برش/گروه از خوک‌های مختلف) با آزمون t-استیودنت دوطرفه انجام شد؛ *p < 0.05). c 用于肌钙蛋白-T 和NFATC4 免疫标记的第0 天和第6 天MTOS心脏切片的代表性图像，以及来自不同猪的NFATC4 易位至CM 细胞核的量化 (3（0D)切片/组، 进行双尾学生t 检验；*p <0.05). c تصاویری از calcanin-T و NFATC4 نشان‌گذاری ایمنی 第0天和第6天MTOS برش‌های قلب، و NFATC4 از هسته سلول‌های NFATC4 易位至CM 的 کمیت (n = 4 (D6MTOS)،时间双尾学生et 电影；*p <0.05). c. транслокации NFATC4 в ядра CM от разных свиней (n = 4 (D0)، 3 (D6 MTOS) срез/группа، دو- хвостатый t-критерий Стьюдента; *p < 0.05). ج. تصاویر نمایشی از برش‌های قلب MTOS در روزهای 0 و 6 برای ایمنولابلینگ تروپونین-T و NFATC4 و تعیین مقدار جابجایی NFATC4 در هسته CM از خوک‌های مختلف (n = 4 (D0)، 3 (D6 MTOS) برش/گروه، معیار t دو طرفه Student؛ *p < 0.05).میله‌های خطا نشان دهنده میانگین ± انحراف معیار هستند.
تحقیقات قلبی عروقی کاربردی نیازمند مدل‌های سلولی است که محیط قلبی را به طور دقیق بازتولید کنند. در این مطالعه، یک دستگاه CTCM توسعه داده و مشخص شد که می‌تواند بخش‌های بسیار نازک قلب را تحریک کند. سیستم CTCM شامل تحریک الکترومکانیکی هماهنگ فیزیولوژیکی و غنی‌سازی مایع T3 و Dex است. هنگامی که بخش‌های قلب خوک در معرض این عوامل قرار گرفتند، زنده ماندن، یکپارچگی ساختاری، فعالیت متابولیک و بیان رونویسی آنها پس از 12 روز کشت، مانند بافت قلب تازه باقی ماند. علاوه بر این، کشش بیش از حد بافت قلب می‌تواند باعث هیپرتروفی قلب ناشی از کشش بیش از حد شود. به طور کلی، این نتایج از نقش حیاتی شرایط کشت فیزیولوژیکی در حفظ فنوتیپ طبیعی قلب پشتیبانی می‌کند و بستری برای غربالگری دارو فراهم می‌کند.
عوامل زیادی در ایجاد یک محیط بهینه برای عملکرد و بقای کاردیومیوسیت‌ها نقش دارند. بارزترین این عوامل مربوط به (1) تعاملات بین سلولی، (2) تحریک الکترومکانیکی، (3) عوامل هومورال و (4) سوبستراهای متابولیکی هستند. تعاملات فیزیولوژیکی سلول به سلول نیاز به شبکه‌های سه‌بعدی پیچیده‌ای از انواع مختلف سلول دارد که توسط یک ماتریکس خارج سلولی پشتیبانی می‌شوند. بازسازی چنین تعاملات سلولی پیچیده‌ای در شرایط آزمایشگاهی با کشت همزمان انواع سلول‌های منفرد دشوار است، اما می‌توان به راحتی با استفاده از ماهیت ارگانوتیپی بخش‌های قلب به آنها دست یافت.
کشش مکانیکی و تحریک الکتریکی کاردیومیوسیت‌ها برای حفظ فنوتیپ قلبی حیاتی هستند33،34،35. در حالی که تحریک مکانیکی به طور گسترده برای آماده‌سازی و بلوغ hiPSC-CM استفاده شده است، اخیراً چندین مطالعه‌ی دقیق، تحریک مکانیکی برش‌های قلب در کشت را با استفاده از بارگذاری تک‌محوری انجام داده‌اند. این مطالعات نشان می‌دهد که بارگذاری مکانیکی تک‌محوری دوبعدی تأثیر مثبتی بر فنوتیپ قلب در طول کشت دارد. در این مطالعات، بخش‌هایی از قلب یا با نیروهای کششی ایزومتریک17، بارگذاری آکسوتونیک خطی18 بارگذاری شدند، یا چرخه قلبی با استفاده از بازخورد مبدل نیرو و محرک‌های کششی بازسازی شد. با این حال، این روش‌ها از کشش بافت تک‌محوری بدون بهینه‌سازی محیطی استفاده می‌کنند که منجر به سرکوب بسیاری از ژن‌های قلبی یا بیان بیش از حد ژن‌های مرتبط با پاسخ‌های کششی غیرطبیعی می‌شود. CTCM شرح داده شده در اینجا یک محرک الکترومکانیکی سه‌بعدی ارائه می‌دهد که چرخه قلبی طبیعی را از نظر زمان چرخه و کشش فیزیولوژیکی (25٪ کشش، 40٪ سیستول، 60٪ دیاستول و 72 ضربان در دقیقه) تقلید می‌کند. اگرچه این تحریک مکانیکی سه‌بعدی به تنهایی برای حفظ یکپارچگی بافت کافی نیست، اما ترکیبی از تحریک هومورال و مکانیکی با استفاده از T3/Dex برای حفظ کافی زیست‌پذیری، عملکرد و یکپارچگی بافت مورد نیاز است.
عوامل هومورال نقش مهمی در تعدیل فنوتیپ قلب بالغ دارند. این موضوع در مطالعات HiPS-CM که در آن T3 و Dex به محیط کشت اضافه شدند تا بلوغ سلولی را تسریع کنند، برجسته شد. T3 ممکن است بر انتقال اسیدهای آمینه، قندها و کلسیم از طریق غشاهای سلولی تأثیر بگذارد36. علاوه بر این، T3 بیان MHC-α و تنظیم کاهشی MHC-β را افزایش می‌دهد و تشکیل میوفیبریل‌های تند انقباض را در کاردیومیوسیت‌های بالغ در مقایسه با میوفیبریل‌های کند انقباض در کاردیومیوسیت‌های جنینی افزایش می‌دهد. کمبود T3 در بیماران هیپوتیروئید منجر به از بین رفتن باندهای میوفیبریل و کاهش سرعت رشد تون می‌شود37. Dex بر گیرنده‌های گلوکوکورتیکوئیدی عمل می‌کند و نشان داده شده است که انقباض میوکارد را در قلب‌های ایزوله پرفیوژن شده افزایش می‌دهد38 تصور می‌شود که این بهبود با تأثیر بر ورود ناشی از رسوب کلسیم (SOCE) 39،40 مرتبط باشد. علاوه بر این، Dex به گیرنده‌های خود متصل می‌شود و باعث یک پاسخ درون سلولی گسترده می‌شود که عملکرد ایمنی و التهاب را سرکوب می‌کند30.
نتایج ما نشان می‌دهد که تحریک مکانیکی فیزیکی (MS) در مقایسه با Ctrl عملکرد کلی کشت را بهبود بخشیده است، اما نتوانسته است زنده‌مانی، یکپارچگی ساختاری و بیان قلبی را طی 12 روز در کشت حفظ کند. در مقایسه با Ctrl، افزودن T3 و Dex به کشت‌های CTCM (MT) زنده‌مانی را بهبود بخشیده و پروفایل‌های رونویسی، یکپارچگی ساختاری و فعالیت متابولیکی مشابه را با بافت قلب تازه به مدت 12 روز حفظ کرده است. علاوه بر این، با کنترل درجه کشش بافت، یک مدل هیپرتروفی قلبی ناشی از کشش بیش از حد با استفاده از STCM ایجاد شد که تطبیق‌پذیری سیستم STCM را نشان می‌دهد. لازم به ذکر است که اگرچه بازسازی و فیبروز قلبی معمولاً شامل اندام‌های سالمی است که سلول‌های در گردش آنها می‌توانند سیتوکین‌های مناسب و همچنین فاگوسیتوز و سایر عوامل بازسازی را فراهم کنند، بخش‌هایی از قلب هنوز هم می‌توانند فرآیند فیبروز را در پاسخ به استرس و تروما تقلید کنند. به میوفیبروبلاست‌ها. این موضوع قبلاً در این مدل برش قلبی ارزیابی شده است. لازم به ذکر است که پارامترهای CTCM را می‌توان با تغییر دامنه و فرکانس فشار/الکتریکی برای شبیه‌سازی بسیاری از شرایط مانند تاکی‌کاردی، برادی‌کاردی و پشتیبانی گردش خون مکانیکی (قلب بدون بار مکانیکی) تعدیل کرد. این امر، سیستم را به یک توان عملیاتی متوسط ​​برای آزمایش دارو تبدیل می‌کند. توانایی CTCM در مدل‌سازی هیپرتروفی قلبی ناشی از فشار بیش از حد، راه را برای آزمایش این سیستم برای درمان شخصی‌سازی‌شده هموار می‌کند. در نتیجه، مطالعه حاضر نشان می‌دهد که کشش مکانیکی و تحریک هومورال برای حفظ کشت بخش‌های بافت قلب بسیار مهم هستند.
اگرچه داده‌های ارائه شده در اینجا نشان می‌دهد که CTCM یک پلتفرم بسیار امیدوارکننده برای مدل‌سازی میوکارد سالم است، اما این روش کشت محدودیت‌هایی دارد. محدودیت اصلی کشت CTCM این است که تنش‌های مکانیکی دینامیکی مداوم را بر روی برش‌ها اعمال می‌کند، که مانع از توانایی نظارت فعال بر انقباضات برش‌های قلبی در طول هر چرخه می‌شود. علاوه بر این، به دلیل اندازه کوچک بخش‌های قلبی (7 میلی‌متر)، توانایی ارزیابی عملکرد سیستولیک خارج از سیستم‌های کشت با استفاده از حسگرهای نیروی سنتی محدود است. در نسخه فعلی، ما تا حدی با ارزیابی ولتاژ نوری به عنوان شاخصی از عملکرد انقباضی بر این محدودیت غلبه می‌کنیم. با این حال، این محدودیت نیاز به کار بیشتر دارد و ممکن است در آینده با معرفی روش‌هایی برای نظارت نوری بر عملکرد برش‌های قلب در کشت، مانند نقشه‌برداری نوری با استفاده از رنگ‌های حساس به کلسیم و ولتاژ، برطرف شود. یکی دیگر از محدودیت‌های CTCM این است که مدل کاری، استرس فیزیولوژیکی (پیش‌بار و پس‌بار) را دستکاری نمی‌کند. در CTCM، فشار در جهت‌های مخالف القا شد تا 25٪ کشش فیزیولوژیکی در دیاستول (کشش کامل) و سیستول (طول انقباض در طول تحریک الکتریکی) در بافت‌های بسیار بزرگ تولید شود. این محدودیت باید در طرح‌های آینده CTCM با فشار کافی بر بافت قلب از هر دو طرف و با اعمال روابط دقیق فشار-حجم که در حفره‌های قلب وجود دارد، برطرف شود.
بازسازی ناشی از کشش بیش از حد که در این مقاله گزارش شده است، محدود به تقلید سیگنال‌های هایپراسترچ هیپرتروفیک است. بنابراین، این مدل می‌تواند در مطالعه سیگنالینگ هیپرتروفیک ناشی از کشش بدون نیاز به عوامل هومورال یا عصبی (که در این سیستم وجود ندارند) کمک کند. مطالعات بیشتری برای افزایش تعدد CTCM مورد نیاز است، به عنوان مثال، کشت همزمان با سلول‌های ایمنی، عوامل هومورال پلاسمای در گردش و عصب‌دهی هنگام کشت همزمان با سلول‌های عصبی، امکان مدل‌سازی بیماری با CTCM را بهبود می‌بخشد.
در این مطالعه از سیزده خوک استفاده شد. تمام مراحل انجام کار روی حیوانات مطابق با دستورالعمل‌های سازمانی انجام شد و توسط کمیته مراقبت و استفاده از حیوانات سازمانی دانشگاه لوئیزویل تأیید شد. قوس آئورت بسته شد و قلب با ۱ لیتر کاردیوپلژی استریل (۱۱۰ میلی‌مولار NaCl، ۱.۲ میلی‌مولار CaCl2، ۱۶ میلی‌مولار KCl، ۱۶ میلی‌مولار MgCl2، ۱۰ میلی‌مولار NaHCO3، ۵ واحد در میلی‌لیتر هپارین، pH تا ۷.۴) پرفیوژن شد. قلب‌ها تا زمان انتقال به آزمایشگاه روی یخ که معمولاً کمتر از ۱۰ دقیقه طول می‌کشد، در محلول کاردیوپلژیک سرد نگهداری شدند. قلب‌ها تا زمان انتقال به آزمایشگاه روی یخ که معمولاً کمتر از ۱۰ دقیقه طول می‌کشد، در محلول کاردیوپلژیک سرد نگهداری شدند. سردца хранили در ледяном кардиоплегическом محلوله تا حمل و نقل در آزمایشگاه های لدو، chto obыchno زیر 10 دقیقه. قلب‌ها تا زمان انتقال به آزمایشگاه روی یخ، که معمولاً کمتر از 10 دقیقه طول می‌کشد، در محلول کاردیوپلژیک سرد شده با یخ نگهداری شدند.将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钒将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钒 Держите сердца во ледяной кардиоплегии до транспортировки در آزمایشگاه های льду, обычно <10 دقیقه. قلب‌ها را تا زمان انتقال به آزمایشگاه روی یخ، معمولاً کمتر از ۱۰ دقیقه، روی یخ نگه دارید.
دستگاه CTCM در نرم‌افزار طراحی به کمک کامپیوتر (CAD) در نرم‌افزار SolidWorks توسعه داده شده است. محفظه‌های کشت، جداکننده‌ها و محفظه‌های هوا از پلاستیک اکریلیک شفاف CNC ساخته شده‌اند. حلقه پشتیبان با قطر 7 میلی‌متر در مرکز از پلی‌اتیلن با چگالی بالا (HDPE) ساخته شده و دارای یک شیار اورینگ برای قرار دادن اورینگ سیلیکونی مورد استفاده برای آب‌بندی محیط کشت در زیر آن است. یک غشای سیلیسی نازک، محفظه کشت را از صفحه جداسازی جدا می‌کند. غشای سیلیکونی از ورق سیلیکونی به ضخامت 0.02 اینچ با لیزر برش داده شده و سختی آن 35A است. واشرهای سیلیکونی پایین و بالا از ورق سیلیکونی به ضخامت 1/16 اینچ با لیزر برش داده شده و سختی آن 50A است. پیچ‌ها و مهره‌های بالدار از جنس استیل ضد زنگ 316L برای بستن بلوک و ایجاد یک آب‌بندی هوابندی شده استفاده می‌شوند.
یک برد مدار چاپی (PCB) اختصاصی برای ادغام با سیستم C-PACE-EM طراحی شده است. سوکت‌های رابط ماشین سوئیسی روی PCB توسط سیم‌های مسی با روکش نقره و پیچ‌های برنزی 0-60 که به الکترودها پیچ شده‌اند، به الکترودهای گرافیتی متصل می‌شوند. برد مدار چاپی در پوشش چاپگر سه‌بعدی قرار می‌گیرد.
دستگاه CTCM توسط یک محرک پنوماتیکی قابل برنامه‌ریزی (PPD) کنترل می‌شود که فشار گردش خون کنترل‌شده‌ای مشابه چرخه قلبی ایجاد می‌کند. با افزایش فشار داخل محفظه هوا، غشای سیلیکونی انعطاف‌پذیر به سمت بالا منبسط می‌شود و محیط را به زیر محل بافت فشار می‌دهد. سپس با این خروج مایع، ناحیه بافت کشیده می‌شود و انبساط فیزیولوژیکی قلب در طول دیاستول را تقلید می‌کند. در اوج آرامش، تحریک الکتریکی از طریق الکترودهای گرافیتی اعمال شد که فشار داخل محفظه هوا را کاهش داده و باعث انقباض بخش‌های بافت می‌شود. در داخل لوله یک شیر هموستاتیک با یک حسگر فشار برای تشخیص فشار در سیستم هوا وجود دارد. فشار حس شده توسط حسگر فشار به یک جمع‌کننده داده متصل به لپ‌تاپ اعمال می‌شود. این امر امکان نظارت مداوم بر فشار داخل محفظه گاز را فراهم می‌کند. هنگامی که حداکثر فشار محفظه به دست آمد (استاندارد ۸۰ میلی‌متر جیوه، ۱۴۰ میلی‌متر جیوه OS)، به دستگاه جمع‌آوری داده دستور داده شد تا سیگنالی را به سیستم C-PACE-EM ارسال کند تا یک سیگنال ولتاژ دوفازی به مدت ۲ میلی‌ثانیه، تنظیم شده روی ۴ ولت، تولید کند.
برش‌های قلب تهیه شد و شرایط کشت در 6 چاهک به شرح زیر انجام شد: قلب‌های برداشت شده از ظرف انتقال به سینی حاوی کاردیوپلژی سرد (4 درجه سانتیگراد) منتقل شدند. بطن چپ با یک تیغه استریل جدا شده و به قطعات 1-2 سانتی‌متر مکعبی بریده شد. این بلوک‌های بافتی با چسب بافتی به پایه‌های بافتی متصل شده و در یک حمام بافت میکروتوم لرزان حاوی محلول تایرود قرار داده شدند و به طور مداوم اکسیژنه شدند (3 گرم در لیتر 2،3-بوتان دیون مونوکسیم (BDM)، 140 میلی‌مولار NaCl (8.18 گرم)، 6 میلی‌مولار KCl (0.447 گرم)، 10 میلی‌مولار D-گلوکز (1.86 گرم)، 10 میلی‌مولار HEPES (2.38 گرم)، 1 میلی‌مولار MgCl2 (1 میلی‌لیتر محلول 1 مولار)، 1.8 میلی‌مولار CaCl2 (1.8 میلی‌لیتر محلول 1 مولار)، تا 1 لیتر ddH2O). میکروتوم ارتعاشی طوری تنظیم شد که برش‌هایی به ضخامت ۳۰۰ میکرومتر را با فرکانس ۸۰ هرتز، دامنه ارتعاش افقی ۲ میلی‌متر و سرعت پیشروی ۰.۰۳ میلی‌متر بر ثانیه برش دهد. حمام بافت با یخ احاطه شده بود تا محلول خنک بماند و دما در ۴ درجه سانتیگراد حفظ شد. برش‌های بافتی را از حمام میکروتوم به یک حمام انکوباسیون حاوی محلول تایرود اکسیژنه شده مداوم روی یخ منتقل کنید تا برش‌های کافی برای یک پلیت کشت به دست آید. برای کشت‌های ترانس‌ول، برش‌های بافتی به پایه‌های پلی اورتان استریل به عرض ۶ میلی‌متر متصل شده و در ۶ میلی‌لیتر محیط کشت بهینه شده (۱۹۹ میکرومتر محیط کشت، ۱ برابر مکمل ITS، ۱۰٪ FBS، ۵ نانوگرم در میلی‌لیتر VEGF، ۱۰ نانوگرم در میلی‌لیتر FGF-قلیایی و ۲ برابر آنتی‌بیوتیک-ضدقارچ) قرار داده شدند. تحریک الکتریکی (۱۰ ولت، فرکانس ۱.۲ هرتز) از طریق C-Pace به برش‌های بافتی اعمال شد. برای شرایط TD، T3 و Dex تازه با غلظت‌های ۱۰۰ نانومولار و ۱ میکرومولار در هر تعویض محیط کشت اضافه شدند. محیط کشت قبل از تعویض، ۳ بار در روز با اکسیژن اشباع می‌شود. برش‌های بافتی در انکوباتور با دمای ۳۷ درجه سانتی‌گراد و ۵٪ CO2 کشت داده شدند.
برای کشت‌های CTCM، برش‌های بافتی روی یک چاپگر سه‌بعدی سفارشی در یک پتری دیش حاوی محلول اصلاح‌شده تایرود قرار داده شدند. این دستگاه به گونه‌ای طراحی شده است که اندازه برش قلب را تا ۲۵٪ از مساحت حلقه نگهدارنده افزایش دهد. این کار به گونه‌ای انجام می‌شود که برش‌های قلب پس از انتقال از محلول تایرود به محیط و در طول دیاستول کشیده نشوند. با استفاده از چسب هیستوآکریلیک، برش‌هایی با ضخامت ۳۰۰ میکرومتر روی یک حلقه نگهدارنده به قطر ۷ میلی‌متر ثابت شدند. پس از اتصال برش‌های بافتی به حلقه نگهدارنده، برش‌های بافتی اضافی را بریده و برش‌های بافتی متصل شده را دوباره در حمام محلول تایرود روی یخ (۴ درجه سانتیگراد) قرار دهید تا برش‌های کافی برای یک دستگاه آماده شوند. کل زمان پردازش برای همه دستگاه‌ها نباید بیش از ۲ ساعت باشد. پس از اتصال ۶ برش بافتی به حلقه‌های نگهدارنده، دستگاه CTCM مونتاژ شد. محفظه کشت CTCM از قبل با ۲۱ میلی‌لیتر محیط کشت از پیش اکسیژنه شده پر شده است. برش‌های بافتی را به محفظه کشت منتقل کرده و هرگونه حباب هوا را با دقت با پیپت خارج کنید. سپس بخش بافتی به داخل سوراخ هدایت شده و به آرامی در جای خود فشار داده می‌شود. در نهایت، کلاهک الکترود را روی دستگاه قرار داده و دستگاه را به انکوباتور منتقل کنید. سپس CTCM را به لوله هوا و سیستم C-PACE-EM وصل کنید. محرک پنوماتیک باز می‌شود و شیر هوا CTCM را باز می‌کند. سیستم C-PACE-EM طوری پیکربندی شده بود که 4 ولت با فرکانس 1.2 هرتز را در طول ضربان‌سازی دو فازی به مدت 2 میلی‌ثانیه ارائه دهد. محیط کشت دو بار در روز و الکترودها یک بار در روز تعویض می‌شدند تا از تجمع گرافیت روی الکترودها جلوگیری شود. در صورت لزوم، می‌توان بخش‌های بافتی را از چاهک‌های کشت خود خارج کرد تا هرگونه حباب هوایی که ممکن است زیر آنها افتاده باشد، خارج شود. برای شرایط تیمار MT، T3/Dex با هر تعویض محیط کشت با 100 نانومولار T3 و 1 میکرومولار Dex تازه اضافه شد. دستگاه‌های CTCM در انکوباتور با دمای 37 درجه سانتیگراد و 5٪ CO2 کشت داده شدند.
برای به دست آوردن مسیرهای کشیده شده برش‌های قلب، یک سیستم دوربین ویژه توسعه داده شد. یک دوربین SLR (Canon Rebel T7i، Canon، توکیو، ژاپن) با یک لنز ماکرو Navitar Zoom 7000 18-108mm (Navitar، سانفرانسیسکو، کالیفرنیا) استفاده شد. تجسم در دمای اتاق پس از جایگزینی محیط با محیط تازه انجام شد. دوربین در زاویه 51 درجه قرار گرفته و فیلم با سرعت 30 فریم در ثانیه ضبط می‌شود. ابتدا، از نرم‌افزار متن‌باز (MUSCLEMOTION43) با Image-J برای تعیین کمیت حرکت برش‌های قلب استفاده شد. ماسک با استفاده از MATLAB (MathWorks، Natick، MA، ایالات متحده آمریکا) ایجاد شد تا مناطق مورد نظر برای برش‌های قلب تپنده برای جلوگیری از نویز تعریف شود. ماسک‌های تقسیم‌بندی شده دستی به تمام تصاویر در یک توالی فریم اعمال می‌شوند و سپس به افزونه MUSCLEMOTION منتقل می‌شوند. Muscle Motion از شدت متوسط ​​پیکسل‌ها در هر فریم برای تعیین کمیت حرکت آن نسبت به فریم مرجع استفاده می‌کند. داده‌ها ثبت، فیلتر و برای تعیین کمیت زمان چرخه و ارزیابی کشش بافت در طول چرخه قلبی استفاده شدند. ویدیوی ضبط شده با استفاده از یک فیلتر دیجیتال فاز صفر مرتبه اول پس‌پردازش شد. برای تعیین کمیت کشش بافت (پیک تا پیک)، آنالیز پیک تا پیک برای تمایز بین قله‌ها و دره‌ها در سیگنال ضبط شده انجام شد. علاوه بر این، روندزدایی با استفاده از یک چندجمله‌ای مرتبه ششم برای حذف رانش سیگنال انجام می‌شود. کد برنامه در MATLAB برای تعیین حرکت کلی بافت، زمان چرخه، زمان استراحت و زمان انقباض (کد برنامه تکمیلی ۴۴) توسعه داده شد.
برای تحلیل کرنش، با استفاده از همان ویدیوهایی که برای ارزیابی کشش مکانیکی ایجاد شده بودند، ابتدا دو تصویر که نشان‌دهنده‌ی قله‌های حرکت (بالاترین (بالاترین) و پایین‌ترین (پایین‌ترین) نقاط حرکت) بودند را طبق نرم‌افزار MUSCLEMOTION ردیابی کردیم. سپس نواحی بافت را قطعه‌بندی کردیم و نوعی الگوریتم سایه‌زنی را بر روی بافت قطعه‌بندی شده اعمال کردیم (شکل تکمیلی 2a). سپس بافت قطعه‌بندی شده به ده زیرسطح تقسیم شد و تنش روی هر سطح با استفاده از معادله‌ی زیر محاسبه شد: کرنش = (Sup-Sdown)/Sdown، که در آن Sup و Sdown به ترتیب فاصله‌ی شکل از سایه‌های بالا و پایین پارچه هستند (شکل تکمیلی 2b).
بخش‌های قلب به مدت ۴۸ ساعت در پارافرمالدهید ۴٪ تثبیت شدند. بافت‌های تثبیت‌شده به مدت ۱ ساعت در ساکارز ۱۰٪ و ۲۰٪ و سپس در ساکارز ۳۰٪ به مدت یک شب دهیدراته شدند. سپس بخش‌ها در ترکیب دمای برش بهینه (ترکیب OCT) قرار داده شدند و به تدریج در حمام ایزوپنتان/یخ خشک منجمد شدند. بلوک‌های جاسازی OCT را تا زمان جداسازی در دمای ۸۰- درجه سانتیگراد نگهداری کنید. اسلایدها به صورت برش‌هایی با ضخامت ۸ میکرومتر تهیه شدند.
برای حذف OCT از برش‌های قلب، اسلایدها را به مدت ۵ دقیقه روی یک بلوک گرمایشی در دمای ۹۵ درجه سانتیگراد گرم کنید. ۱ میلی‌لیتر PBS به هر اسلاید اضافه کنید و به مدت ۳۰ دقیقه در دمای اتاق انکوبه کنید، سپس با قرار دادن ۰.۱٪ Triton-X در PBS به مدت ۱۵ دقیقه در دمای اتاق، برش‌ها را نفوذ دهید. برای جلوگیری از اتصال آنتی‌بادی‌های غیر اختصاصی به نمونه، ۱ میلی‌لیتر محلول ۳٪ BSA را به اسلایدها اضافه کنید و به مدت ۱ ساعت در دمای اتاق انکوبه کنید. سپس BSA برداشته شد و اسلایدها با PBS شسته شدند. هر نمونه را با مداد علامت بزنید. آنتی‌بادی‌های اولیه (رقیق‌شده ۱:۲۰۰ در ۱٪ BSA) (کانکسین ۴۳ (Abcam; #AB11370)، NFATC4 (Abcam; #AB99431) و تروپونین-T (Thermo Scientific; #MA5-12960) طی ۹۰ دقیقه اضافه شدند، سپس آنتی‌بادی‌های ثانویه (رقیق‌شده ۱:۲۰۰ در ۱٪ BSA) علیه موش Alexa Fluor 488 (Thermo Scientific; #A16079) و علیه خرگوش Alexa Fluor 594 (Thermo Scientific; #T6391) به مدت ۹۰ دقیقه دیگر اضافه شدند. ۳ بار با PBS شسته شدند. برای تشخیص رنگ‌آمیزی هدف از پس‌زمینه، فقط از آنتی‌بادی ثانویه به عنوان کنترل استفاده کردیم. در نهایت، رنگ هسته‌ای DAPI اضافه شد و اسلایدها در یک وکتاشیلد (Vector Laboratories) قرار داده شده و با لاک ناخن مهر و موم شدند. بزرگنمایی -x) و میکروسکوپ Keyence با بزرگنمایی ۴۰x.
رنگ WGA-Alexa Fluor 555 (Thermo Scientific; #W32464) با غلظت 5 میکروگرم در میلی‌لیتر در PBS برای رنگ‌آمیزی WGA استفاده شد و به مدت 30 دقیقه در دمای اتاق روی مقاطع ثابت قرار داده شد. سپس اسلایدها با PBS شسته شدند و سودان سیاه به هر اسلاید اضافه شد و به مدت 30 دقیقه انکوبه شد. سپس اسلایدها با PBS شسته شدند و محیط کشت وکتاشیلد اضافه شد. اسلایدها با میکروسکوپ Keyence با بزرگنمایی 40 برابر مشاهده شدند.
OCT همانطور که در بالا توضیح داده شد از نمونه‌ها خارج شد. پس از خارج کردن OCT، اسلایدها را به مدت یک شب در محلول بوئن غوطه‌ور کنید. سپس اسلایدها به مدت ۱ ساعت با آب مقطر شسته شده و سپس به مدت ۱۰ دقیقه در محلول فوشین اسید آلوئه بیبریچ قرار داده شدند. سپس اسلایدها با آب مقطر شسته شده و به مدت ۱۰ دقیقه در محلول ۵٪ فسفومولیبدنوم/۵٪ فسفوتنگستیک اسید قرار داده شدند. بدون آبکشی، اسلایدها را مستقیماً به مدت ۱۵ دقیقه به محلول آنیلین بلو منتقل کنید. سپس اسلایدها با آب مقطر شسته شده و به مدت ۲ دقیقه در محلول ۱٪ اسید استیک قرار داده شدند. اسلایدها در اتانول ۲۰۰ نرمال خشک شده و به زایلن منتقل شدند. اسلایدهای رنگ‌آمیزی شده با استفاده از میکروسکوپ کینس با عدسی شیئی ۱۰x مشاهده شدند. درصد ناحیه فیبروز با استفاده از نرم‌افزار کینس آنالایزر تعیین شد.
سنجش زیست‌پذیری سلولی CyQUANT™ MTT (Invitrogen، Carlsbad، CA)، شماره کاتالوگ V13154، طبق پروتکل سازنده با برخی اصلاحات. به طور خاص، از یک پانچ جراحی با قطر 6 میلی‌متر برای اطمینان از اندازه یکنواخت بافت در طول آنالیز MTT استفاده شد. بافت‌ها به صورت جداگانه در چاهک‌های یک پلیت 12 چاهکی حاوی سوبسترای MTT طبق پروتکل سازنده کشت داده شدند. برش‌ها به مدت 3 ساعت در دمای 37 درجه سانتیگراد انکوبه می‌شوند و بافت زنده، سوبسترای MTT را متابولیزه می‌کند تا یک ترکیب فورمازان بنفش تشکیل دهد. محلول MTT را با 1 میلی‌لیتر DMSO جایگزین کنید و به مدت 15 دقیقه در دمای 37 درجه سانتیگراد انکوبه کنید تا فورمازان بنفش از برش‌های قلب استخراج شود. نمونه‌ها در پلیت‌های 96 چاهکی با ته شفاف به نسبت 1:10 در DMSO رقیق شدند و شدت رنگ بنفش با استفاده از دستگاه خوانش پلیت Cytation (BioTek) در طول موج 570 نانومتر اندازه‌گیری شد. مقادیر خوانده شده نسبت به وزن هر برش از قلب نرمال‌سازی شدند.
محیط کشت برش قلب با محیط کشت حاوی 1 میکروکوری بر میلی‌لیتر [5-3H]-گلوکز (Moravek Biochemicals، Brea، CA، USA) برای سنجش مصرف گلوکز، همانطور که قبلاً توضیح داده شد، جایگزین شد. پس از 4 ساعت انکوباسیون، 100 میکرولیتر محیط کشت را به یک لوله میکروسانتریفیوژ باز حاوی 100 میکرولیتر HCl 0.2 نرمال اضافه کنید. سپس لوله در یک لوله سنتلیاسیون حاوی 500 میکرولیتر dH2O قرار داده شد تا [3H]2O به مدت 72 ساعت در دمای 37 درجه سانتیگراد تبخیر شود. سپس لوله میکروسانتریفیوژ را از لوله سنتلیاسیون خارج کرده و 10 میلی‌لیتر مایع سنتلیاسیون اضافه کنید. شمارش‌های سنتلیاسیون با استفاده از یک آنالیزور سنتلیاسیون مایع Tri-Carb 2900TR (شرکت Packard Bioscience، Meriden، CT، USA) انجام شد. سپس میزان مصرف گلوکز با در نظر گرفتن فعالیت ویژه [5-3H]-گلوکز، تعادل ناقص و پس‌زمینه، رقیق‌سازی [5-3H]-به گلوکز بدون برچسب و راندمان شمارنده سوسوزن محاسبه شد. داده‌ها نسبت به جرم بخش‌های قلب نرمال‌سازی شدند.
پس از همگن‌سازی بافت در Trizol، RNA از بخش‌های قلب با استفاده از کیت Qiagen miRNeasy Micro شماره ۲۱۰۸۷۴ طبق پروتکل سازنده جدا شد. تهیه کتابخانه RNAsec، تعیین توالی و تجزیه و تحلیل داده‌ها به شرح زیر انجام شد:
۱ میکروگرم RNA در هر نمونه به عنوان ماده اولیه برای تهیه کتابخانه RNA استفاده شد. کتابخانه‌های توالی‌یابی با استفاده از کیت آماده‌سازی کتابخانه RNA NEBNext UltraTM برای Illumina (NEB، ایالات متحده) طبق توصیه‌های سازنده تولید شدند و کدهای شاخص به توالی‌های ویژگی برای هر نمونه اضافه شدند. به طور خلاصه، mRNA با استفاده از دانه‌های مغناطیسی متصل به الیگونوکلئوتیدهای پلی-T از RNA کل خالص‌سازی شد. قطعه قطعه شدن با استفاده از کاتیون‌های دو ظرفیتی در دمای بالا در بافر واکنش سنتز رشته اول NEBNext (5X) انجام می‌شود. cDNA رشته اول با استفاده از آغازگرهای هگزامر تصادفی و رونویسی معکوس M-MuLV (RNase H-) سنتز شد. سپس cDNA رشته دوم با استفاده از DNA پلیمراز I و RNase H سنتز می‌شود. زائده‌های باقی مانده توسط فعالیت اگزونوکلئاز/پلیمراز به انتهای صاف تبدیل می‌شوند. پس از آدنیلاسیون انتهای ۳' قطعه DNA، یک آداپتور NEBNext با ساختار حلقه مویی به آن متصل می‌شود تا آن را برای هیبریداسیون آماده کند. برای انتخاب قطعات cDNA با طول ترجیحی ۱۵۰-۲۰۰ جفت باز، قطعات کتابخانه با استفاده از سیستم AMPure XP (Beckman Coulter، Beverly، USA) خالص‌سازی شدند. سپس، ۳ میکرولیتر آنزیم USER (NEB، USA) با cDNA انتخاب‌شده با اندازه که با آداپتور متصل شده بود، به مدت ۱۵ دقیقه در دمای ۳۷ درجه سانتیگراد و سپس به مدت ۵ دقیقه در دمای ۹۵ درجه سانتیگراد قبل از PCR استفاده شد. سپس PCR با استفاده از DNA پلیمراز Phusion High-Fidelity، پرایمرهای PCR جهانی و پرایمرهای Index (X) انجام شد. در نهایت، محصولات PCR خالص‌سازی شدند (سیستم AMPure XP) و کیفیت کتابخانه با سیستم Agilent Bioanalyzer 2100 ارزیابی شد. سپس کتابخانه cDNA با استفاده از یک توالی‌یاب Novaseq توالی‌یابی شد. فایل‌های تصویر خام از Illumina با استفاده از CASAVA Base Calling به خوانش‌های خام تبدیل شدند. داده‌های خام در فایل‌های با فرمت FASTQ(fq) ذخیره می‌شوند که حاوی توالی‌های خوانده‌شده و کیفیت‌های پایه مربوطه هستند. برای تطبیق توالی‌یابی‌های فیلتر شده با ژنوم مرجع Sscrofa11.1، HISAT2 را انتخاب کنید. به طور کلی، HISAT2 از ژنوم‌هایی با هر اندازه‌ای، از جمله ژنوم‌های بزرگتر از ۴ میلیارد باز، پشتیبانی می‌کند و مقادیر پیش‌فرض برای اکثر پارامترها تنظیم شده است. می‌توان با استفاده از HISAT2، سریع‌ترین سیستم موجود در حال حاضر، با دقتی مشابه یا بهتر از هر روش دیگری، خوانش‌های پیرایش از داده‌های RNA Seq را به طور مؤثر هم‌تراز کرد.
فراوانی رونوشت‌ها مستقیماً نشان‌دهنده‌ی سطح بیان ژن است. سطح بیان ژن با فراوانی رونوشت‌ها (تعداد توالی‌یابی) مرتبط با ژنوم یا اگزون‌ها ارزیابی می‌شود. تعداد خوانش‌ها متناسب با سطح بیان ژن، طول ژن و عمق توالی‌یابی است. FPKM (قطعات در هر هزار جفت باز از رونوشت توالی‌یابی شده در هر میلیون جفت باز) محاسبه شد و مقادیر P بیان افتراقی با استفاده از بسته DESeq2 تعیین شد. سپس نرخ کشف کاذب (FDR) را برای هر مقدار P با استفاده از روش Benjamini-Hochberg9 بر اساس تابع R داخلی "p.adjust" محاسبه کردیم.
RNA جدا شده از بخش‌های قلب با غلظت 200 نانوگرم در میکرولیتر با استفاده از مخلوط SuperScript IV Vilo Master از Thermo (Thermo، شماره کاتالوگ 11756050) به cDNA تبدیل شد. RT-PCR کمی با استفاده از یک پلیت واکنش شفاف 384 خانه‌ای Applied Biosystems Endura Plate Microamp (Thermo، شماره کاتالوگ 4483319) و چسب نوری microamp (Thermo، شماره کاتالوگ 4311971) انجام شد. مخلوط واکنش شامل 5 میکرولیتر مخلوط Taqman Fast Advanced Master (Thermo، شماره کاتالوگ 4444557)، 0.5 میکرولیتر Taqman Primer و 3.5 میکرولیتر H2O مخلوط شده در هر خانه بود. چرخه‌های استاندارد qPCR اجرا شدند و مقادیر CT با استفاده از دستگاه PCR بلادرنگ Applied Biosystems Quantstudio 5 (ماژول 384 خانه‌ای؛ شماره محصول A28135) اندازه‌گیری شدند. پرایمرهای Taqman از Thermo (GAPDH (Ss03375629_u1)، PARP12 (Ss06908795_m1)، PKDCC (Ss06903874_m1)، CYGB (Ss06900188_m1)، RGL1 (Ss06868890_m1)، ACTN1 (Ss01009508_mH)، GATA4 (Ss03383805_u1)، GJA1 (Ss03374839_u1)، COL1A2 (Ss03375009_u1)، COL3A1 (Ss04323794_m1)، ACTA2 (Ss04245588_m1) خریداری شدند. مقادیر CT همه نمونه‌ها نسبت به ژن خانه‌دار GAPDH نرمال‌سازی شد.
آزادسازی NT-ProBNP از محیط کشت با استفاده از کیت NT-ProBNP (خوک) (شماره کاتالوگ MBS2086979، MyBioSource) طبق پروتکل سازنده ارزیابی شد. به طور خلاصه، 250 میکرولیتر از هر نمونه و استاندارد به صورت تکراری به هر چاهک اضافه شد. بلافاصله پس از اضافه کردن نمونه، 50 میکرولیتر معرف سنجش A را به هر چاهک اضافه کنید. پلیت را به آرامی تکان دهید و با درزگیر ببندید. سپس قرص‌ها به مدت 1 ساعت در دمای 37 درجه سانتیگراد انکوبه شدند. سپس محلول را آسپیره کرده و چاهک‌ها را 4 بار با 350 میکرولیتر محلول شستشوی 1X بشویید و هر بار محلول شستشو را به مدت 1-2 دقیقه انکوبه کنید. سپس 100 میکرولیتر معرف سنجش B را به ازای هر چاهک اضافه کنید و با درزگیر پلیت ببندید. قرص به آرامی تکان داده شد و به مدت 30 دقیقه در دمای 37 درجه سانتیگراد انکوبه شد. محلول را آسپیره کنید و چاهک‌ها را ۵ بار با ۳۵۰ میکرولیتر محلول شستشوی ۱X بشویید. ۹۰ میکرولیتر محلول سوبسترا به هر چاهک اضافه کنید و درب پلیت را ببندید. پلیت را به مدت ۱۰ تا ۲۰ دقیقه در دمای ۳۷ درجه سانتیگراد انکوبه کنید. ۵۰ میکرولیتر محلول متوقف کننده به هر چاهک اضافه کنید. پلیت بلافاصله با استفاده از دستگاه خوانش پلیت Cytation (BioTek) که در طول موج ۴۵۰ نانومتر تنظیم شده بود، اندازه‌گیری شد.
تحلیل‌های توان برای انتخاب اندازه‌های گروه انجام شد که توان بیش از ۸۰٪ را برای تشخیص ۱۰٪ تغییر مطلق در پارامتر با نرخ خطای نوع اول ۵٪ فراهم می‌کنند. تحلیل‌های توان برای انتخاب اندازه‌های گروه انجام شد که توان بیش از ۸۰٪ را برای تشخیص ۱۰٪ تغییر مطلق در پارامتر با نرخ خطای نوع اول ۵٪ فراهم می‌کنند. آنالیز мощности был выполнен для выбора размеров групп, которые обеспечат > 80% موщности для обнаружения 10% абсолютного изменения پارامتر با 5% частотой ошибок نوع I. تحلیل توان برای انتخاب اندازه‌های گروهی انجام شد که توان بیش از ۸۰٪ را برای تشخیص ۱۰٪ تغییر پارامتر مطلق با نرخ خطای نوع اول ۵٪ فراهم کنند.进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％I型错误率的组大小。进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％I型错误率的组大小。 Был проведен анализ мощности для выбора размера группы, который обеспечил бы > 80% قابلیت 10% 10% پارامتر و 5% частоты ошибок نوع I. یک تحلیل توان برای انتخاب اندازه گروهی انجام شد که توان بیش از ۸۰٪ را برای تشخیص ۱۰٪ تغییر پارامتر مطلق و نرخ خطای نوع اول ۵٪ فراهم کند.مقاطع بافتی قبل از آزمایش به صورت تصادفی انتخاب شدند. همه تجزیه و تحلیل‌ها به صورت کور شرطی انجام شد و نمونه‌ها تنها پس از تجزیه و تحلیل تمام داده‌ها رمزگشایی شدند. برای انجام تمام تجزیه و تحلیل‌های آماری از نرم‌افزار GraphPad Prism (سن دیگو، کالیفرنیا) استفاده شد. برای تمام آماره‌ها، مقادیر p در مقادیر <0.05 معنی‌دار در نظر گرفته شدند. برای تمام آمارها، مقادیر p در مقادیر کمتر از 0.05 معنی‌دار در نظر گرفته شدند. Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. برای تمام آمارها، مقادیر p در مقادیر کمتر از 0.05 معنی‌دار در نظر گرفته شدند.对于所有统计数据，p 值在值<0.05 时被认为是显着的。对于所有统计数据，p 值在值<0.05 时被认为是显着的。 Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. برای تمام آمارها، مقادیر p در مقادیر کمتر از 0.05 معنی‌دار در نظر گرفته شدند.آزمون تی استیودنت دوطرفه روی داده‌ها با تنها ۲ مقایسه انجام شد. برای تعیین معناداری بین چندین گروه از آنالیز واریانس یک‌طرفه یا دوطرفه استفاده شد. هنگام انجام آزمون‌های تعقیبی، تصحیح توکی برای در نظر گرفتن مقایسه‌های چندگانه اعمال شد. داده‌های RNAsec هنگام محاسبه FDR و p.adjust ملاحظات آماری خاصی دارند، همانطور که در بخش روش‌ها توضیح داده شده است.
برای اطلاعات بیشتر در مورد طراحی مطالعه، به چکیده گزارش تحقیقات طبیعت که به این مقاله لینک شده است، مراجعه کنید.