Nature.com भ्रमण गर्नुभएकोमा धन्यवाद।तपाईंले प्रयोग गरिरहनुभएको ब्राउजर संस्करणमा सीमित CSS समर्थन छ।उत्तम अनुभवको लागि, हामी तपाईंलाई अपडेट गरिएको ब्राउजर प्रयोग गर्न सिफारिस गर्छौं (वा इन्टरनेट एक्सप्लोररमा अनुकूलता मोड असक्षम गर्नुहोस्)।यस बीचमा, निरन्तर समर्थन सुनिश्चित गर्न, हामी शैली र जाभास्क्रिप्ट बिना साइट रेन्डर गर्नेछौं।
औषधि परीक्षणको लागि मुटुको शारीरिक वातावरणलाई सही रूपमा पुन: उत्पादन गर्न सक्ने भरपर्दो इन भिट्रो प्रणालीको आवश्यकता छ।मानव हृदय टिस्यु कल्चर प्रणालीको सीमित उपलब्धताले कार्डियक ड्रग प्रभावहरूको गलत व्याख्या निम्त्याएको छ।यहाँ, हामीले कार्डियक टिस्यु कल्चर मोडेल (CTCM) विकास गरेका छौं जसले इलेक्ट्रोमेकानिकली रूपमा हृदयको टुक्राहरूलाई उत्तेजित गर्छ र हृदय चक्रको सिस्टोलिक र डायस्टोलिक चरणहरूमा शारीरिक स्ट्रेचबाट गुज्र्छ।12 दिनको संस्कृति पछि, यस दृष्टिकोणले आंशिक रूपमा हृदय खण्डहरूको व्यवहार्यता सुधार गर्यो, तर तिनीहरूको संरचनात्मक अखण्डता पूर्ण रूपमा सुरक्षित गर्न सकेन।तसर्थ, सानो अणु स्क्रीनिंग पछि, हामीले हाम्रो माध्यममा 100 nM triiodothyronine (T3) र 1 μM dexamethasone (Dex) को थप्दा 12 दिनको लागि खण्डहरूको माइक्रोस्ट्रक्चर कायम राखेको फेला पार्यौं।T3/Dex उपचारको संयोजनमा, CTCM प्रणालीले ट्रान्सक्रिप्शनल प्रोफाइलहरू, व्यवहार्यता, चयापचय गतिविधि, र संरचनात्मक अखण्डतालाई 12 दिनको लागि ताजा हृदयको तन्तु जस्तै स्तरमा राख्यो।थप रूपमा, कल्चरमा कार्डियक टिश्युको अत्यधिक स्ट्रेचिङले हाइपरट्रोफिक कार्डियक सिग्नलिंगलाई प्रेरित गर्दछ, जसले कार्डियक स्ट्रेचद्वारा प्रेरित हाइपरट्रोफिक अवस्थाहरूको नक्कल गर्न CTCM को क्षमताको प्रमाण प्रदान गर्दछ।अन्तमा, CTCM ले लामो समयसम्म हृदयको फिजियोलोजी र प्याथोफिजियोलोजीलाई संस्कृतिमा मोडेल गर्न सक्छ, भरपर्दो औषधि स्क्रिनिङ सक्षम पार्दै।
नैदानिक ​​​​अनुसन्धान गर्नु अघि, भरपर्दो इन भिट्रो प्रणालीहरू आवश्यक छ जसले मानव हृदयको शारीरिक वातावरणलाई सही रूपमा पुन: उत्पादन गर्न सक्छ।त्यस्ता प्रणालीहरूले परिवर्तन गरिएको मेकानिकल स्ट्रेच, हृदय गति, र इलेक्ट्रोफिजियोलोजिकल गुणहरूको नक्कल गर्नुपर्छ।पशु मोडेलहरू सामान्यतया हृदय फिजियोलोजीको लागि स्क्रीनिंग प्लेटफर्मको रूपमा प्रयोग गरिन्छ मानव हृदयमा लागूपदार्थको प्रभावहरू प्रतिबिम्बित गर्न सीमित विश्वसनीयताको साथ १,२।अन्ततः, आदर्श कार्डियक टिस्यु कल्चर एक्सपेरिमेन्टल मोडेल (CTCM) एक मोडेल हो जुन अत्यधिक संवेदनशील र विभिन्न चिकित्सकीय र औषधीय हस्तक्षेपहरूको लागि विशिष्ट छ, सही रूपमा मानव हृदयको फिजियोलोजी र प्याथोफिजियोलोजीलाई पुन: उत्पादन गर्दछ।यस्तो प्रणालीको अनुपस्थितिले मुटुको विफलताको लागि नयाँ उपचारको खोजलाई सीमित गर्दछ 4,5 र बजारबाट बाहिर निस्कने प्रमुख कारणको रूपमा ड्रग कार्डियोटोक्सिसिटीलाई निम्त्याएको छ।
विगत एक दशकमा, आठ गैर-हृदय भास्कुलर औषधिहरू नैदानिक ​​​​प्रयोगबाट हटाइएका छन् किनभने तिनीहरूले QT अन्तराल लम्बाइको कारण निम्त्याउँछ वेंट्रिकुलर एरिथमिया र अचानक मृत्यु7।तसर्थ, कार्डियोभास्कुलर प्रभावकारिता र विषाक्तता मूल्याङ्कन गर्न भरपर्दो प्रिक्लिनिकल स्क्रीनिंग रणनीतिहरूको लागि बढ्दो आवश्यकता छ।औषधि परीक्षण र विषाक्तता परीक्षणमा मानव-प्रेरित प्लुरिपोटेन्ट स्टेम सेल-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स (hiPS-CM) को हालको प्रयोगले यस समस्याको आंशिक समाधान प्रदान गर्दछ।यद्यपि, hiPS-CMs को अपरिपक्व प्रकृति र कार्डियक टिश्यूको बहुसेलुलर जटिलताको कमी यस विधिको प्रमुख सीमाहरू हुन्।भर्खरैका अध्ययनहरूले देखाएका छन् कि यो सीमिततालाई प्रारम्भिक hiPS-CM प्रयोग गरेर सहज संकुचन सुरु भएको छिट्टै कार्डियक टिश्यू हाइड्रोजेलहरू बनाउन र समयसँगै बिस्तारै बिजुलीको उत्तेजना बढाएर हटाउन सकिन्छ।यद्यपि, यी hiPS-CM माइक्रोटिस्युहरूमा वयस्क मायोकार्डियमको परिपक्व इलेक्ट्रोफिजियोलोजिकल र संकुचन गुणहरू छैनन्।थप रूपमा, मानव हृदयको तन्तुको अधिक जटिल संरचना हुन्छ, जसमा विभिन्न सेल प्रकारहरूको विषम मिश्रण हुन्छ, जसमा एन्डोथेलियल कोशिकाहरू, न्यूरोन्सहरू, र स्ट्रोमल फाइब्रोब्लास्टहरू समावेश हुन्छन्, एक्स्ट्रासेलुलर म्याट्रिक्स प्रोटीनहरूको विशिष्ट सेटहरूद्वारा आपसमा जोडिएको हुन्छ।वयस्क स्तनधारी हृदयमा गैर-कार्डियोमायोसाइट जनसंख्याको यो विषमता 11,12,13 व्यक्तिगत कोशिका प्रकारहरू प्रयोग गरेर कार्डियक टिश्यूको मोडेलिङको लागि प्रमुख बाधा हो।यी प्रमुख सीमितताहरूले शारीरिक र रोगविज्ञान परिस्थितिहरूमा अक्षुण्ण मायोकार्डियल टिश्युलाई संवर्धन गर्ने विधिहरू विकास गर्ने महत्त्वलाई जोड दिन्छ।
मानव हृदयको पातलो (300 µm) खण्डहरू अक्षुण्ण मानव मायोकार्डियमको एक आशाजनक मोडेल साबित भएका छन्।यो विधिले मानव मुटुको तन्तु जस्तै पूर्ण थ्रीडी बहुसेलुलर प्रणालीमा पहुँच प्रदान गर्दछ।यद्यपि, 2019 सम्म, कल्चर गरिएको हृदय खण्डहरूको प्रयोग छोटो (24 h) संस्कृति अस्तित्व द्वारा सीमित थियो।यो भौतिक-मेकानिकल स्ट्रेच, एयर-लिक्विड इन्टरफेस, र कार्डियक टिस्युको आवश्यकतालाई समर्थन नगर्ने साधारण मिडियाको प्रयोग सहित धेरै कारकहरूको कारणले हो।2019 मा, धेरै अनुसन्धान समूहहरूले कार्डियक टिस्यु कल्चर प्रणालीहरूमा मेकानिकल कारकहरू समावेश गर्नाले संस्कृतिको जीवन विस्तार गर्न, हृदय अभिव्यक्ति सुधार गर्न, र कार्डियक रोगविज्ञानको नक्कल गर्न सक्छ भनेर प्रदर्शन गरे।दुई सुरुचिपूर्ण अध्ययन 17 र 18 ले देखाउँछ कि एकअक्षीय मेकानिकल लोडिङले संस्कृतिको समयमा कार्डियक फेनोटाइपमा सकारात्मक प्रभाव पार्छ।यद्यपि, यी अध्ययनहरूले कार्डियक चक्रको गतिशील त्रि-आयामी भौतिक-मेकानिकल लोडिङ प्रयोग गरेनन्, किनभने हृदय खण्डहरू या त आइसोमेट्रिक तन्य बल 17 वा रेखीय अक्सोटोनिक लोडिङ 18 सँग लोड गरिएको थियो।टिश्यु स्ट्रेचिङका यी विधिहरूले धेरै कार्डियाक जीनहरूको दमन वा असामान्य स्ट्रेच प्रतिक्रियाहरूसँग सम्बन्धित जीनहरूको ओभरएक्सप्रेसनको परिणामस्वरूप।उल्लेखनीय रूपमा, Pitoulis et al।19 ले बल ट्रान्सड्यूसर प्रतिक्रिया र तनाव ड्राइभ प्रयोग गरेर कार्डियक चक्र पुनर्निर्माणको लागि गतिशील हृदय स्लाइस कल्चर बाथ विकसित गर्यो।यद्यपि यो प्रणालीले भिट्रो कार्डियक साइकल मोडेलिङमा थप सटीकको लागि अनुमति दिन्छ, विधिको जटिलता र कम थ्रुपुटले यस प्रणालीको प्रयोगलाई सीमित गर्दछ।हाम्रो प्रयोगशालाले भर्खरै विद्युतीय उत्तेजना र पोर्सिन र मानव हृदयको तन्तुको खण्डहरू 6 दिनसम्मको लागि व्यवहार्यता कायम राख्न एक अनुकूलित माध्यम प्रयोग गरी सरलीकृत संस्कृति प्रणाली विकास गरेको छ।
हालको पाण्डुलिपिमा, हामीले कार्डियक टिस्यु कल्चर मोडेल (CTCM) को पोर्सिन हृदयको खण्डहरू प्रयोग गरेर वर्णन गर्दछौं जसले हृदय चक्रको क्रममा त्रि-आयामी कार्डियक फिजियोलोजी र प्याथोफिजियोलजिकल डिस्टेन्सनलाई पुन: क्यापिट्युलेट गर्न हास्य संकेतहरू समावेश गर्दछ।यो CTCM ले प्रि-क्लिनिकल ड्रग परीक्षणको लागि स्तनधारी हृदयको फिजियोलोजी/प्याथोफिजियोलोजीको नक्कल गर्ने लागत-प्रभावी, मध्य-थ्रुपुट कार्डियक प्रणाली प्रदान गरेर पूर्व-क्लिनिकल औषधि भविष्यवाणीको शुद्धतालाई पहिले कहिल्यै हासिल नगरेको स्तरमा बढाउन सक्छ।
हेमोडायनामिक मेकानिकल संकेतहरूले भिट्रो 22,23,24 मा कार्डियोमायोसाइट प्रकार्य कायम राख्न महत्त्वपूर्ण भूमिका खेल्छ।हालको पाण्डुलिपिमा, हामीले CTCM (चित्र 1a) को विकास गरेका छौं जसले शारीरिक फ्रिक्वेन्सीहरू (1.2 Hz, 72 बीट्स प्रति मिनेट) मा विद्युतीय र मेकानिकल उत्तेजना उत्पन्न गरेर वयस्क हृदयको वातावरणको नक्कल गर्न सक्छ।डायस्टोलको समयमा अत्याधिक टिश्यु स्ट्रेचबाट बच्न, टिस्यु साइज २५% (चित्र १बी) बढाउन थ्रीडी प्रिन्टिङ यन्त्र प्रयोग गरियो।C-PACE प्रणालीद्वारा प्रेरित विद्युतीय पेसिङलाई कार्डियक चक्रलाई पूर्ण रूपमा पुन: उत्पादन गर्न डेटा प्राप्ति प्रणाली प्रयोग गरेर सिस्टोल अघि 100 ms सुरु गर्न समय मिलाइएको थियो।टिस्यु कल्चर प्रणालीले माथिल्लो कक्षमा मुटुका टुक्राहरू विस्तार गर्नको लागि एक लचिलो सिलिकन झिल्लीलाई चक्रीय रूपमा विस्तार गर्न प्रोग्रामेबल वायमेटिक एक्चुएटर (LB इन्जिनियरिङ, जर्मनी) प्रयोग गर्दछ।प्रणाली एक दबाव ट्रान्सड्यूसर मार्फत बाह्य वायु लाइनमा जडान गरिएको थियो, जसले यसलाई सही रूपमा दबाब (± 1 mmHg) र समय (± 1 ms) (चित्र 1c) समायोजन गर्न सम्भव बनायो।
यन्त्रको कल्चर चेम्बर भित्र नीलो रंगमा देखाइएको ७ एमएम सपोर्ट रिङमा टिस्यु खण्ड जोड्नुहोस्।कल्चर च्याम्बरलाई पातलो लचिलो सिलिकन झिल्लीद्वारा वायु कक्षबाट अलग गरिएको छ।चुहावट रोक्नको लागि प्रत्येक चेम्बरको बीचमा ग्यास्केट राख्नुहोस्।यन्त्रको ढक्कनमा ग्रेफाइट इलेक्ट्रोडहरू छन् जसले विद्युतीय उत्तेजना प्रदान गर्दछ।b ठूलो टिस्यु उपकरण, गाइड रिंग र समर्थन औंठीको योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व।टिस्यु खण्डहरू (खैरो) यन्त्रको बाहिरी किनारामा ग्रोभमा राखिएको गाईड औंठीको साथ ठूलो यन्त्रमा राखिन्छ।गाइडको प्रयोग गरेर, कार्डियक टिस्युको खण्डमा टिस्यु एक्रिलिक टाँसेको लेप गरिएको समर्थन औंठीलाई ध्यानपूर्वक राख्नुहोस्।c प्रोग्रामेबल न्यूमेटिक एक्चुएटर (PPD) द्वारा नियन्त्रित एयर चेम्बर प्रेसरको कार्यको रूपमा विद्युतीय उत्तेजनाको समय देखाउने ग्राफ।एक डाटा अधिग्रहण उपकरण दबाव सेन्सर प्रयोग गरी विद्युत उत्तेजना सिंक्रोनाइज गर्न प्रयोग गरिएको थियो।जब कल्चर चेम्बरमा दबाब सेट थ्रेसहोल्डमा पुग्छ, एक पल्स सिग्नल C-PACE-EM मा पठाइन्छ बिजुली उत्तेजना ट्रिगर गर्न।d इन्क्यूबेटर शेल्फमा राखिएको चार CTCM को छवि।चार यन्त्रहरू वायमेटिक सर्किट मार्फत एक PPD मा जडान गरिएका छन्, र वायवीय सर्किटमा दबाब निगरानी गर्न हेमोस्टेटिक भल्भमा दबाव सेन्सरहरू सम्मिलित छन्।प्रत्येक यन्त्रमा छवटा तन्तु खण्डहरू हुन्छन्।
एउटै न्युमेटिक एक्ट्युएटर प्रयोग गरेर, हामीले ४ वटा CTCM यन्त्रहरू नियन्त्रण गर्न सक्षम भयौं, जसमध्ये प्रत्येकले ६ वटा तन्तु खण्डहरू (चित्र १d) समात्न सक्छ।CTCM मा, वायु कक्षमा हावाको दबाबलाई तरल कक्षमा सिंक्रोनस दबाबमा रूपान्तरण गरिन्छ र हृदयको टुक्राको शारीरिक विस्तारलाई प्रेरित गर्दछ (चित्र 2a र पूरक चलचित्र 1)।80 मिमी एचजीमा टिश्यू स्ट्रेचको मूल्याङ्कन।कला।25% (चित्र 2b) द्वारा टिश्यु खण्डहरू फैलिएको देखाइएको छ।यो प्रतिशत स्ट्रेच सामान्य हृदय खण्ड संकुचनको लागि 2.2-2.3 µm को शारीरिक sarcomere लम्बाइसँग मेल खाएको देखाइएको छ 17,19,25।टिश्यू आन्दोलन अनुकूलन क्यामेरा सेटिङहरू प्रयोग गरी मूल्याङ्कन गरिएको थियो (पूरक चित्र 1)।तन्तु आन्दोलनको आयाम र वेग (चित्र 2c, d) कार्डियक चक्र र सिस्टोल र डायस्टोल (चित्र 2b) को समयमा स्ट्रेचसँग मेल खान्छ।संकुचन र विश्रामको समयमा हृदयको तन्तुको स्ट्रेच र वेग संस्कृतिमा 12 दिनसम्म स्थिर रह्यो (चित्र 2f)।संस्कृतिको समयमा संकुचनमा विद्युतीय उत्तेजनाको प्रभावको मूल्याङ्कन गर्न, हामीले छायांकन एल्गोरिदम (पूरक चित्र 2a,b) को प्रयोग गरेर सक्रिय विकृति निर्धारण गर्ने विधि विकास गर्यौं र विद्युतीय उत्तेजनाको साथ र बिना विकृतिहरू बीच भेद गर्न सक्षम भयौं।मुटुको एउटै खण्ड (चित्र 2f)।कट (R6-9) को चल क्षेत्र मा, विद्युत उत्तेजना को समयमा भोल्टेज विद्युत उत्तेजना को अनुपस्थिति मा भन्दा 20% उच्च थियो, जसले संकुचन प्रकार्यमा विद्युतीय उत्तेजना को योगदान को संकेत गर्दछ।
हावा च्याम्बर दबाब, तरल चेम्बर दबाब, र टिश्यू आन्दोलन मापन को प्रतिनिधि ट्रेसहरूले पुष्टि गर्दछ कि चेम्बर दबाबले तरल च्याम्बर दबाब परिवर्तन गर्दछ, टिश्यु स्लाइस को एक समान आन्दोलन को कारण।b प्रतिशत स्ट्रेच (सुन्तला) सँग सम्बन्धित ऊतक खण्डहरूको प्रतिशत स्ट्रेच (नीलो) को प्रतिनिधि ट्रेसहरू।c कार्डियक स्लाइसको मापन गरिएको गति गतिको मापन गतिसँग अनुरूप छ।(d) हृदयको टुक्रामा चक्रीय गति (नीलो रेखा) र वेग (सुन्तला बिन्दु रेखा) को प्रतिनिधि प्रक्षेपणहरू।e चक्र समयको मात्रा (n = 19 स्लाइस प्रति समूह, विभिन्न सुँगुरहरूबाट), संकुचन समय (n = 19 स्लाइसहरू प्रति समूह), विश्राम समय (n = 19 प्रति समूह, विभिन्न सुँगुरहरूबाट), तन्तु आन्दोलन (n = 25)।स्लाइसहरू)/विभिन्न सुँगुरहरूबाट समूह), शिखर सिस्टोलिक वेग (n = 24(D0), 25 (D12) स्लाइसहरू/विभिन्न सुँगुरहरूबाट समूह) र शिखर विश्राम दर (n=24(D0), 25 (D12) विभिन्न सुँगुरहरूबाट स्लाइस/समूह)।दुई-पुच्छे विद्यार्थीको टी-टेस्टले कुनै पनि प्यारामिटरमा कुनै महत्त्वपूर्ण भिन्नता देखाएको छैन।f (रातो) र बिना (नीलो) विद्युतीय उत्तेजनाको साथ ऊतक खण्डहरूको प्रतिनिधि तनाव विश्लेषण ट्रेसहरू, एउटै खण्डबाट ऊतक खण्डहरूको दस क्षेत्रीय क्षेत्रहरू।तल्लो प्यानलहरूले विभिन्न खण्डहरूबाट दस क्षेत्रहरूमा विद्युतीय उत्तेजनाको साथ र बिना तन्तु खण्डहरूमा तनावमा प्रतिशत भिन्नताको मात्रा देखाउँदछ। (n = 8 स्लाइसहरू/विभिन्न सुँगुरहरूबाट समूह, दुई-पुच्छर विद्यार्थी t-परीक्षण गरिन्छ; ****p <0.0001, **p <0.01, *p <0.05)। (n = 8 स्लाइसहरू/विभिन्न सुँगुरहरूबाट समूह, दुई-पुच्छर विद्यार्थी t-परीक्षण गरिन्छ; ****p <0.0001, **p <0.01, *p <0.05)। (n = 8 срезов/группу от разных свиней, проводится двусторонний t-критерий Стьюдента; ****p<0,0001, **p<0,001, *p<0,5)। (n = विभिन्न सुँगुरहरूबाट 8 खण्ड/समूह, दुई-पुच्छर विद्यार्थीको टी-परीक्षा; ****p<0.0001, **p<0.01, *p<0.05)। （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；**p <0.0001,**p <0.01,*p <0.05）। （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；**p <0.0001,**p <0.01,*p <0.05）। (n = 8 срезов/группу, от разных свиней, двусторонний критерий Стьюдента; ****p <0,0001, **p <0,01, *p <0,05)। (n = 8 खण्ड/समूह, विभिन्न सुँगुरहरूबाट, दुई-पुच्छर विद्यार्थीको टी-टेस्ट; ****p<0.0001, **p<0.01, *p<0.05)।त्रुटि बारहरूले औसत ± मानक विचलन प्रतिनिधित्व गर्दछ।
हाम्रो अघिल्लो स्थिर बायोमिमेटिक हार्ट स्लाइस कल्चर प्रणाली [२०, २१] मा, हामीले विद्युतीय उत्तेजना लागू गरेर र मध्यम संरचनालाई अनुकूलन गरेर 6 दिनको लागि हृदय स्लाइसहरूको व्यवहार्यता, प्रकार्य, र संरचनात्मक अखण्डता कायम राख्यौं।यद्यपि, 10 दिन पछि, यी तथ्याङ्कहरू तीव्र रूपमा घट्यो।हामी हाम्रो अघिल्लो स्थिर बायोमिमेटिक कल्चर प्रणाली 20, 21 कन्ट्रोल कन्डिसन (Ctrl) मा कल्चर गरिएका खण्डहरूलाई सन्दर्भ गर्नेछौं र हामी MC अवस्थाहरू र एकसाथ मेकानिकल र इलेक्ट्रिकल स्टिमुलेशन (CTCM) अन्तर्गत कल्चरको रूपमा हाम्रो पहिलेको अनुकूलित माध्यम प्रयोग गर्नेछौं।भनिन्छ।पहिलो, हामीले निर्धारित गर्यौं कि विद्युतीय उत्तेजना बिना मेकानिकल उत्तेजना 6 दिनको लागि ऊतक व्यवहार्यता कायम राख्न अपर्याप्त थियो (पूरक चित्र 3a,b)।चाखलाग्दो कुरा के छ भने, STCM प्रयोग गरेर फिजियो-मेकानिकल र विद्युतीय उत्तेजनाको परिचयसँगै, 12-दिनको मुटुका खण्डहरूको व्यवहार्यता MS अवस्थाहरूमा ताजा हृदय खण्डहरूमा जस्तै रह्यो, तर Ctrl अवस्थाहरूमा होइन, MTT विश्लेषण (चित्र 1) द्वारा देखाइए अनुसार।3a)।यसले सुझाव दिन्छ कि मेकानिकल उत्तेजना र कार्डियक चक्रको सिमुलेशनले हाम्रो अघिल्लो स्थिर संस्कृति प्रणालीमा रिपोर्ट गरिएको भन्दा दुई पटकको लागि तन्तु खण्डहरूलाई व्यवहार्य राख्न सक्छ।यद्यपि, कार्डियक ट्रोपोनिन टी र कन्नेक्सिन 43 को इम्युनोलेबलिङद्वारा ऊतक खण्डहरूको संरचनात्मक अखण्डताको मूल्याङ्कनले देखाएको छ कि connexin 43 अभिव्यक्ति दिन 12 मा MC टिस्युहरूमा एकै दिनको नियन्त्रणमा भन्दा बढी थियो।यद्यपि, समान कन्नेक्सिन 43 अभिव्यक्ति र Z-डिस्क गठन पूर्ण रूपमा राखिएको थिएन (चित्र 3b)।हामी टिस्यु संरचनात्मक अखण्डता मापन गर्न कृत्रिम बुद्धिमत्ता (AI) फ्रेमवर्क प्रयोग गर्छौं, ट्रोपोनिन-T र connexin staining43 मा आधारित छवि-आधारित गहिरो लर्निंग पाइपलाइन स्थानीयकरणको बलको आधारमा हृदय स्लाइसहरूको संरचनात्मक अखण्डता र प्रतिदीप्ति स्वचालित रूपमा मापन गर्न।सन्दर्भमा वर्णन गरिए अनुसार यो विधिले कन्भोलुसनल न्यूरल नेटवर्क (CNN) र कार्डियक टिस्युको संरचनात्मक अखण्डतालाई विश्वसनीय रूपमा परिमाण गर्नको लागि प्रयोग गर्दछ।26. MC ऊतकले स्थिर नियन्त्रण खण्डहरूको तुलनामा दिन 0 मा सुधारिएको संरचनात्मक समानता देखायो।थप रूपमा, म्यासनको ट्राइक्रोम दागले संस्कृतिको 12 दिनको नियन्त्रण अवस्थाहरूको तुलनामा एमएस अवस्थाहरूमा फाइब्रोसिसको उल्लेखनीय रूपमा कम प्रतिशत प्रकट गर्‍यो (चित्र 3c)।जबकि CTCM ले हृदयको तन्तु खण्डहरूको व्यवहार्यतालाई 12 दिनमा ताजा हृदयको तन्तुको जस्तै स्तरमा बढायो, यसले हृदय खण्डहरूको संरचनात्मक अखण्डतालाई उल्लेखनीय रूपमा सुधार गर्न सकेन।
बार ग्राफले 12 दिनको लागि ताजा हृदय स्लाइसहरू (D0) वा हृदय स्लाइस कल्चरको MTT व्यवहार्यताको परिमाण देखाउँछ या त स्थिर कल्चर (D12 Ctrl) वा CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 Ctrl), 12 (D12 pigs, 12 बाट फरक तरिकाले परीक्षण गरिएको छ; ##p <0.0001 D0 को तुलनामा र **p <0.01 D12 Ctrl को तुलनामा)। एक बार ग्राफले 12 दिनको लागि ताजा हृदय स्लाइस (D0) वा हृदय स्लाइस कल्चरको MTT व्यवहार्यताको परिमाण देखाउँदछ या त स्थिर संस्कृति (D12 Ctrl) वा CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 बाट फरक तरिकाले परीक्षण गरिएको छ)। ###p <0.0001 D0 को तुलनामा र **p <0.01 D12 Ctrl को तुलनामा)।हिस्टोग्रामले स्थिर कल्चर (D12 नियन्त्रण) वा CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 नियन्त्रण) ) , 12 (D12 MC) फरक-फरक खण्डहरू, Agroup-VA परीक्षणहरू, 12 (D12 MC) मा 12 दिनको लागि MTT ताजा हृदय खण्डहरू (D0) वा हृदय खण्डहरूको कल्चरको व्यवहार्यताको परिमाण देखाउँछ।####p <0,0001 по сравнению с D0 र **p <0,01 по сравнению с D12 Ctrl)। ####p <0.0001 D0 को तुलनामा र **p <0.01 D12 Ctrl को तुलनामा)। a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切片 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切片12 天的MTT 活力的量化)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA，进行单向ANOVA ，D0r0p#测试；与D0 <#且0p#0. l 相比,**p <0.01)। a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心的 中新鲜心的 切片12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；与D0 相比,####p <0.0001，与D12 Ctrl 相比，**p।)हिस्टोग्रामले ताजा हृदय खण्डहरू (D0) वा हृदय खण्डहरूमा 12 दिनसम्म स्थिर कल्चर (D12 नियन्त्रण) वा CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 नियन्त्रण)), 12 (D12 MC) खण्डहरू/विभिन्न सुँगुरहरूबाट खण्डहरू/समूहहरूमा कल्चर गरिएको हृदय खण्डहरूमा MTT व्यवहार्यताको मात्रा देखाउँदै;####p <0,0001 по сравнению с D0, **p <0,01 по сравнению с D12 Ctrl)। ####p <0.0001 D0 को तुलनामा, **p <0.01 D12 Ctrl को तुलनामा)।b Troponin-T (हरियो), connexin 43 (रातो) र DAPI (नीलो) ताजा पृथक हृदय खण्डहरूमा (D0) वा हृदय खण्डहरू स्थिर अवस्था (Ctrl) वा CTCM अवस्था (MC) अन्तर्गत 12 दिनको लागि कल्चर गरिएको प्रतिनिधि इम्युनोफ्लोरेसेन्स छविहरू (खाली स्केल = 100 µm)। मुटुको तन्तु संरचनात्मक अखंडता (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) स्लाइस/समूहको विभिन्न सुँगुरहरूको कृत्रिम बुद्धिमत्ता परिमाण, एकतर्फी ANOVA परीक्षण गरिन्छ; ####p <0.0001 D0 र D0r 1 को तुलनामा *** 0.0001 तुलना गर्नुहोस्। हृदयको तन्तु संरचनात्मक अखंडता (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) स्लाइस/समूह विभिन्न सुँगुरहरूको कृत्रिम बुद्धिमत्ता परिमाण, एकतर्फी ANOVA परीक्षण गरिन्छ; ####p <0.0001 तुलना D0 र D0 r. ***01 को तुलनामा ***01)। Количественная оценка структурной целостности селостности сердечной ткани искусственным интелектом (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl) х свиней, проводится однофакторный тест ANOVA; ####p < 0,0001 по сравнению с D0 и ****p < 0,0001 по сравнению Crl D12)। आर्टिफिशियल इन्टेलिजेन्स (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) विभिन्न सुँगुरहरूबाट खण्डहरू/समूहहरूद्वारा हृदयको तन्तुको संरचनात्मक अखण्डताको परिमाणीकरण, एकतर्फी ANOVA परीक्षण गरिएको; ####p < 0.0001 vs. D01 r*** D0r 0.人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) स्लाइस/समूह प्रत्येक बिभिन्न सुँगुर, एक-तर्फी। ANOVA परीक्षण।比,****p <0.0001 与D12 Ctrl 相比）।人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) स्लाइस/विभिन्न सुँगुरहरूको प्रत्येक समूह, एकतर्फी ANOVA परीक्षण।比,****p <0.0001 与D12 Ctrl 相比）। Искусственный интеллект для количественной оценки структурной целостности сердечной ткани (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl/D12MC), й из разных свиней, односторонний тест ANOVA; ####p <0,0001 vs. D0 Для сравнения ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl)। हृदयको तन्तु (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) खण्डहरू/विभिन्न सुँगुरहरूको प्रत्येक समूह, एकतर्फी ANOVA परीक्षण; ####p<0.0001 vs .D0 तुलना गर्नको लागि कृत्रिम बुद्धिमत्ता। c प्रतिनिधि छविहरू (बायाँ) र मासनको ट्राइक्रोम दाग (स्केल बेयर = 500 µm) (स्केल बेयर = 500 µm) (n = 10 स्लाइसहरू/विभिन्न सुँगुरबाट प्रत्येक समूह, एकतर्फी ANOVA परीक्षण गरिएको छ; ####p। ० तुलनात्मक रूपमा (दायाँ) मुटुका टुक्राहरूका लागि; ####p <1 ० को तुलना गर्नुहोस्। rl)। c प्रतिनिधि छविहरू (बाँया) र मासनको ट्राइक्रोम दाग (स्केल बेयर = 500 µm) (scale bare = 500 µm) (n = 10 स्लाइसहरू/विभिन्न सुँगुरहरूबाट प्रत्येक समूह, एकतर्फी ANOVA परीक्षण गरिएको छ; #### p. 0 तुलनात्मक रूपमा (दायाँ) मुटुका टुक्राहरूका लागि; #### p। rl)। c Репрезентативные изображения (слева) и количественная оценка (справа) срезов сердца, окрашенных трихромным красибатебаслева тия = 500 мкм) (n = 10 срезов/группу от разных свиней, выполняется односторонний тест ANOVA; #### p < 0,00001 Dp0,0001 D12 Ctrl सँग RAVNENIю)। c प्रतिनिधि छविहरू (बाँया) र मासनको ट्राइक्रोम दाग (अनकोटेड स्केल = 500 µm) (n = 10 खण्डहरू/विभिन्न सुँगुरहरूबाट समूह, एकतर्फी ANOVA परीक्षण गरिएको; #### p < 0 .0001 को तुलनामा C; ***1 l.0001 को तुलनामा C)। c 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像（左）和量化（右）（裸尺度=0m0m0片/组，每组来自不同的猪，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0.0001 与D0 相比,***p < 0.001 且牼 C. C 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 （左 左） 量化 （右） 量化 （右） 度度度度带 裸尺度 裸带500 µm） （n = 10 个 切片 组 每 组 来自 不同 猪 ， 进行 单向 单向 单向 单向 Anova 测试） 0## 縔 00# # 1. ***p <0.001 与D12 Ctrl 相比）। c Репрезентативные изображения (слева) и количественный анализ (справа) срезов сердца, окрашенных трихромным (слева) км) (n = 10 срезов/группа, каждый от другой свиньи, протестировано с помощью однофакторного дисперсионного дисперсионного , #1 нию с D0, ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl)। c प्रतिनिधि छविहरू (बायाँ) र मासनको ट्राइक्रोम दाग (खाली = 500 µm) (खाली = 500 µm) (n = 10 खण्ड/समूह, प्रत्येक फरक सुँगुरबाट दागिएको हृदय खण्डहरूको परिमाण (दायाँ), भिन्नताको एकतर्फी विश्लेषणद्वारा परीक्षण गरिएको; ### # p <0. ***1 0 तुलना गर्नुहोस्। rl)।त्रुटि बारहरूले औसत ± मानक विचलन प्रतिनिधित्व गर्दछ।
हामीले परिकल्पना गर्यौं कि संस्कृति माध्यममा साना अणुहरू थपेर, कार्डियोमायोसाइट अखण्डता सुधार गर्न सकिन्छ र CTCM संस्कृतिको समयमा फाइब्रोसिस विकास कम हुन्छ।त्यसकारण हामीले हाम्रो स्थिर नियन्त्रण संस्कृतिहरू 20,21 प्रयोग गरेर साना अणुहरूको लागि स्क्रिनिङ गर्‍यौं।यस स्क्रिनको लागि Dexamethasone (Dex), triiodothyronine (T3), र SB431542 (SB) छनोट गरियो।यी साना अणुहरू पहिले hiPSC-CM संस्कृतिहरूमा sarcomere लम्बाइ, T-tubules, र प्रवाह वेग बढाएर कार्डियोमायोसाइट्सको परिपक्वता प्रेरित गर्न प्रयोग गरिएको थियो।थप रूपमा, दुबै डेक्स (एक ग्लुकोकोर्टिकोइड) र एसबी सूजनलाई दबाउन जानिन्छ 29,30।त्यसकारण, हामीले परीक्षण गर्यौं कि यी साना अणुहरूको एक समावेश वा संयोजनले हृदय खण्डहरूको संरचनात्मक अखण्डता सुधार गर्दछ।प्रारम्भिक स्क्रिनिङको लागि, प्रत्येक कम्पाउन्डको खुराक सामान्यतया सेल कल्चर मोडेलहरूमा प्रयोग हुने सांद्रताको आधारमा चयन गरिएको थियो (1 μM Dex27, 100 nM T327, र 2.5 μM SB31)।12 दिनको संस्कृति पछि, T3 र Dex को संयोजनले इष्टतम कार्डियोमायोसाइट संरचनात्मक अखण्डता र न्यूनतम फाइब्रस रिमोडेलिंग (पूरक आंकडा 4 र 5) मा परिणाम दिन्छ।थप रूपमा, T3 र Dex को यी सांद्रताको दोब्बर वा दोब्बर प्रयोगले सामान्य सांद्रताको तुलनामा हानिकारक प्रभावहरू उत्पादन गर्‍यो (पूरक चित्र 6a,b)।
प्रारम्भिक स्क्रिनिङ पछि, हामीले 4 संस्कृति अवस्थाहरूको हेड-टू-हेड तुलना प्रदर्शन गर्यौं (चित्र 4a): Ctrl: हाम्रो अनुकूलित माध्यम प्रयोग गरेर हाम्रो पहिले वर्णन गरिएको स्थिर संस्कृतिमा कल्चर गरिएको हृदय खण्डहरू;20.21 TD: T3 र Ctrl s बुधवार डेक्स थपियो;MC: हाम्रो पहिले अनुकूलित माध्यम प्रयोग गरेर CTCM मा हृदय खण्डहरू कल्चर गरियो;र MT: T3 र Dex सँग CTCM माध्यममा थपियो।12 दिनको खेती पछि, एमएस र एमटी टिस्युहरूको व्यवहार्यता एमटीटी परख (चित्र 4b) द्वारा मूल्याङ्कन गरिएको ताजा तन्तुहरूमा जस्तै रह्यो।चाखलाग्दो कुरा के छ भने, T3 र Dex लाई ट्रान्सवेल कल्चरहरू (TD) मा थप्दा Ctrl अवस्थाहरूको तुलनामा व्यवहार्यतामा उल्लेखनीय सुधार भएन, हृदय खण्डहरूको व्यवहार्यता कायम राख्न मेकानिकल उत्तेजनाको महत्त्वपूर्ण भूमिकालाई संकेत गर्दछ।
मेकानिकल स्टिमुलेशन र T3/Dex पूरकको माध्यममा १२ दिनको प्रभावको मूल्याङ्कन गर्न प्रयोग गरिने चार संस्कृति अवस्थाहरू चित्रण गर्ने प्रायोगिक डिजाइन रेखाचित्र। b बार ग्राफले ताजा हृदय स्लाइस (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD र D12 MT), 12 (D12 pigs, 12 (D12 pigs, MC, 12 बाट फरक परीक्षण गरिएको छ) सबै 4 संस्कृति अवस्थाहरू (Ctrl, TD, MC, र MT) मा 12 दिन पोस्ट कल्चरमा व्यवहार्यताको मात्रा देखाउँछ। ##p <0.0001, ###p <0.001 D0 को तुलनामा र **p <0.01 D12 Ctrl को तुलनामा)। b बार ग्राफले ताजा हृदय स्लाइस (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD र D12 MT), 12 (D12 pigs, 12 (D12 pigs, MC, 12 बाट फरक परीक्षण गरिएको छ) सबै 4 संस्कृति अवस्थाहरू (Ctrl, TD, MC, र MT) मा 12 दिन पोस्ट कल्चरमा व्यवहार्यताको मात्रा देखाउँछ। ##p <0.0001, ###p <0.001 D0 को तुलनामा र **p <0.01 D12 ctrl को तुलनामा)। ख TD, MC र MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD र D12 MT), 12 (D12 MC) й, проводится односторонний тест ANOVA; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 по сравнению с D0 и **p < 0,01 по сравнению Crl2 с)। b बार ग्राफले ताजा हृदय खण्डहरू (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD, र D12 MT), 12 (D12 TD, र D12 MT), 12 (D12 खण्ड, 12 (D12, 12 खण्ड, 12 खण्डमा फरक-फरक 4 कल्चर अवस्थाहरू (नियन्त्रण, TD, MC, र MT) मा 12 दिन पोस्ट कल्चरमा व्यवहार्यताको परिमाण देखाउँदछ। 0.0001, ###p <0.001 vs. D0 र **p <0.01 D12 Ctrl को तुलनामा)। b 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片、D0) (n = 18 (D0r12) (D0)和D12 MT)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；####p < 0.0001，###p <0.0D001，###p <0.0D0** 2控制)।b 4 12 (D12 MC) b Гистограмма, показывающая все 4 условия культивирования (कन्ट्रोल, TD, MC и MT) по сравнению со свежими со свежими (10D0D) 2 Ctrl, D12 TD र D12 MT), от разных свиней 12 (D12 MC) срезы/группа, односторонний тест ANOVA; ####p <0,0001, ###p <0,0,0,0001, ###p <0,0,0,0,0001 по сравнению с CONTROLEM D12)। b हिस्टोग्रामले ताजा हृदय खण्डहरू (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD र D12 MT) को तुलनामा सबै 4 संस्कृति अवस्थाहरू (नियन्त्रण, TD, MC र MT) देखाउँदै, विभिन्न सुँगुरहरू 12 (D12 MC) खण्डहरू/समूहहरूबाट, एकतर्फी ANOVA परीक्षण; #0p<#0p; ##0p<#0p.<#0p.<#0p.<#0p. 0, **p <0.01 बनाम नियन्त्रण D12)। c बार ग्राफले ताजा हृदय स्लाइसहरू (D0) (n = 6 स्लाइसहरू/विभिन्न सुँगुरहरूबाट समूह, एकतर्फी ANOVA परीक्षण गरिएको छ; ###p <0.0.0.0.***1, 0.0.0.01 ***1 तुलना गर्नुहोस्; ###p <0.00 र ***1.0.00 को तुलनामा। )। c बार ग्राफले ताजा हृदय स्लाइसहरू (D0) (n = 6 स्लाइसहरू/विभिन्न सुँगुरहरूबाट समूह, एकतर्फी ANOVA परीक्षण गरिएको छ; ###p <0.0.0.0.***1, 0.0.0.01 ***1 तुलना गर्नुहोस्; ###p <0.00 र ***1.0.00 को तुलनामा। )। c Гистограмма показывает количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после культивирования во всех , 4 усех , усех 4 एमसी र एमटी) по сравнению с D0 र ***p <0,001 по сравнению с D12 Ctrl)। c हिस्टोग्रामले ताजा हृदय खण्डहरू (D0) (n = 6 खण्डहरू/विभिन्न सुँगुरहरूबाट समूह, एकतर्फी ANOVA परीक्षण प्रदर्शन गरिएको; ###p <0.001 C तुलनामा D0 र ***1 l <0.001 तुलना गर्नुहोस्) सबै 4 संस्कृति अवस्थाहरू (नियन्त्रण, TD, MC र MT) अन्तर्गत 12 दिन पोस्ट-कल्चरमा ग्लुकोज प्रवाहको मात्रा देखाउँदछ। c 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片的(D0) 相比养切 有通量定量（n = 6 片/组，来自不同猪，单向执行ANOVA 测试；###p < 0.001，与D0 相比 0.001，与D0 相比 0.00p <0. )। C 条形图 显示 所有 4 种 条件 （（ctrl 、 td 、 mc 和 mt） 新鲜 心脏 切片 切片 心脏 切片切片后 后 12 天 的 通量 定量 （n = 6 片/组 ， 来自 猪 ， ， ， ， ， 猪 猪单 ， ， 猪 猪 单向执苏 # D 0 0 相比, ***p < 0.001 与D12 Ctrl 相比）। c Гистограмма, показывающая количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после культивирования для всеховивирования TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 6 срезов/группа, от разных свиней, одностороных свиней, одностороный свежими срезами сердца (D0) 0,001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению с D12 (controll)। c हिस्टोग्रामले सबै 4 संस्कृति अवस्थाहरू (नियन्त्रण, TD, MC, र MT) को लागि 12 दिन पोस्ट-कल्चरमा ग्लुकोज प्रवाहको मात्रा देखाउँदै ताजा हृदय खण्डहरू (D0) (n = 6 खण्डहरू/समूह, विभिन्न सुँगुरहरूबाट, एकपक्षीय ANOVA परीक्षणहरू प्रदर्शन गरिएको थियो, ###p <0.0, ***1 p <0.00, ***1 p <0.00 को तुलनामा)।d ताजा (नीलो), दिन 12 एमसी (हरियो), र दिन 12 एमटी (रातो) टिस्युहरूको स्ट्रेन विश्लेषण प्लटहरू दस क्षेत्रीय टिश्यु खण्ड बिन्दुहरूमा (n = 4 स्लाइस/समूह, एकतर्फी ANOVA परीक्षण; समूहहरू बीच कुनै महत्त्वपूर्ण भिन्नता थिएन)।e ज्वालामुखी प्लट 10-12 दिनको लागि स्थिर अवस्था (Ctrl) वा MT अवस्थाहरू (MT) अन्तर्गत कल्चर गरिएको हृदय खण्डहरूको तुलनामा ताजा हृदय खण्डहरू (D0) मा भिन्न रूपमा व्यक्त जीनहरू देखाउँदै।f प्रत्येक संस्कृति अवस्था अन्तर्गत संवर्धित हृदय खण्डहरूको लागि sarcomere जीन को हीटम्याप।त्रुटि बारहरूले औसत ± मानक विचलन प्रतिनिधित्व गर्दछ।
फ्याटी एसिड अक्सिडेशनबाट ग्लाइकोलिसिसमा स्विचमा मेटाबोलिक निर्भरता कार्डियोमायोसाइट विभेदको विशेषता हो।अपरिपक्व कार्डियोमायोसाइट्सले मुख्यतया एटीपी उत्पादनको लागि ग्लुकोज प्रयोग गर्दछ र केहि क्रिस्टा 5,32 संग हाइपोप्लास्टिक माइटोकोन्ड्रिया हुन्छ।ग्लुकोज उपयोग विश्लेषणहरूले देखायो कि MC र MT अवस्थाहरूमा, ग्लुकोजको उपयोग दिन 0 टिस्युहरूमा जस्तै थियो (चित्र 4c)।यद्यपि, Ctrl नमूनाहरूले ताजा तन्तुको तुलनामा ग्लुकोजको उपयोगमा उल्लेखनीय वृद्धि देखाएको छ।यसले संकेत गर्छ कि CTCM र T3/Dex को संयोजनले टिश्यु व्यवहार्यता बढाउँछ र 12-दिन कल्चर गरिएको हृदय खण्डहरूको मेटाबोलिक फेनोटाइपलाई सुरक्षित गर्दछ।थप रूपमा, तनाव विश्लेषणले MT र MS अवस्थाहरू (चित्र 4d) अन्तर्गत 12 दिनको लागि ताजा हृदयको तन्तुमा जस्तै तनावको स्तर उस्तै रहेको देखाएको छ।
कार्डियक स्लाइस टिश्युको ग्लोबल ट्रान्सक्रिप्शनल ल्यान्डस्केपमा CTCM र T3/Dex को समग्र प्रभावको विश्लेषण गर्न, हामीले RNAseq सबै चार फरक संस्कृति अवस्थाहरू (पूरक डेटा 1) बाट कार्डियक स्लाइसहरूमा प्रदर्शन गर्यौं।चाखलाग्दो कुरा के छ भने, MT खण्डहरूले ताजा हृदयको तन्तुसँग उच्च ट्रान्सक्रिप्शनल समानता देखाएको छ, 13,642 जीनहरूमध्ये केवल 16 भिन्न रूपमा व्यक्त गरिएको छ।यद्यपि, हामीले अघि देखाए जस्तै, Ctrl स्लाइसहरूले संस्कृतिमा 10-12 दिन पछि 1229 भिन्न रूपमा व्यक्त जीनहरू प्रदर्शन गरे (चित्र 4e)।यी डाटाहरू हृदय र फाइब्रोब्लास्ट जीनहरूको qRT-PCR द्वारा पुष्टि गरिएको थियो (पूरक चित्र। 7a-c)।चाखलाग्दो कुरा के छ भने, Ctrl खण्डहरूले कार्डियाक र सेल चक्र जीनहरूको डाउनरेगुलेसन र भडकाऊ जीन कार्यक्रमहरूको सक्रियता देखाउँदछ।यी तथ्याङ्कहरूले सुझाव दिन्छ कि विभेदन, जुन सामान्यतया दीर्घकालीन संस्कृति पछि हुन्छ, MT अवस्थाहरूमा पूर्ण रूपमा कम हुन्छ (पूरक चित्र 8a,b)।sarcomere genes को सावधानीपूर्वक अध्ययनले देखायो कि MT अवस्थाहरूमा मात्र sarcomere (Fig. 4f) र आयन च्यानल (पूरक चित्र 9) लाई एन्कोड गर्ने जीनहरू सुरक्षित हुन्छन्, तिनीहरूलाई Ctrl, TD, र MC परिस्थितिहरूमा दमनबाट जोगाउँछन्।यी डेटाले मेकानिकल र ह्युमरल स्टिमुलेशन (T3/Dex) को संयोजनको साथ, हृदयको टुक्रा ट्रान्सक्रिप्टोम संस्कृतिमा 12 दिन पछि ताजा हृदय स्लाइस जस्तै रहन सक्छ भनेर देखाउँछ।
यी ट्रान्सक्रिप्शनल निष्कर्षहरू तथ्यद्वारा समर्थित छन् कि हृदय खण्डहरूमा कार्डियोमायोसाइट्सको संरचनात्मक अखण्डता MT अवस्थाहरूमा 12 दिनको लागि राम्रोसँग सुरक्षित हुन्छ, जस्तै अक्षुण्ण र स्थानीयकरण कन्नेक्सिन 43 (चित्र 5a) द्वारा देखाइएको छ।थप रूपमा, MT सर्तहरू अन्तर्गत हृदय खण्डहरूमा फाइब्रोसिस Ctrl र ताजा हृदय खण्डहरू जस्तै (चित्र 5b) को तुलनामा उल्लेखनीय रूपमा कम भएको थियो।यी डेटाहरूले मेकानिकल उत्तेजना र T3/Dex उपचारको संयोजनले प्रभावकारी रूपमा संस्कृतिमा हृदय खण्डहरूमा हृदय संरचनालाई सुरक्षित राख्छ भनेर देखाउँछ।
ट्रोपोनिन-टी (हरियो), कोनेक्सिन 43 (रातो), र DAPI (निलो) को एक प्रतिनिधि इम्युनोफ्लोरेसेन्स छविहरू ताजा पृथक हृदय खण्डहरूमा (D0) वा सबै चार हृदय खण्ड कल्चर अवस्थाहरूमा 12 दिनको लागि कल्चर गरिएको (स्केल बार = 100 μm)।)। मुटुको तन्तु संरचनात्मक अखण्डता (n = 7 (D0 र D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC र D12 MT) स्लाइस/समूह बिभिन्न सुँगुरहरूको कृत्रिम बुद्धिमत्ता परिमाणीकरण, एकतर्फी ANOVA परीक्षण गरिन्छ; ####p <0.00.***p <*0.00 र ***1 तुलना गर्नुहोस्। 01 D12 Ctrl को तुलनामा)। हृदयको तन्तु संरचनात्मक अखण्डता (n = 7 (D0 र D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC र D12 MT) स्लाइस/समूह बिभिन्न सुँगुरहरूको कृत्रिम बुद्धिमत्ता परिमाणीकरण, एकतर्फी ANOVA परीक्षण गरिन्छ; #### p <0.00 p <*0.00 र ***1 तुलना गर्नुहोस्। 01 D12 Ctrl को तुलनामा)। Количественная оценка структурной целостности ткани сердца с помощью искусственного интеллекта (n = 7 (D0 и D12 Ctrl12MT), D012MT резов/группу от разных свиней, проведен однофакторный тест ANOVA; #### p < 0,0001 по сравнению с D0 и *p < 0,05, 0,005 २ Ctrl)। आर्टिफिसियल इन्टेलिजेन्स (n = 7 (D0 र D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC र D12 MT) विभिन्न सुँगुरहरूबाट खण्ड/समूह प्रयोग गरी हृदयको तन्तुको संरचनात्मक अखण्डताको परिमाणीकरण, एकतर्फी ANOVA परीक्षण गरिएको; #### p <0.0001* ****0.0010 वा तुलनात्मक D12 Ctrl को तुलनामा)।对不同猪的心脏组织结构完整性（n = 7（D0 和D12 Ctrl）、5（D12 TD、D12 MC工智能量化，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0.0001 与D0 和*p < 0.05 相比，或****p < 0.0001 Ct.对 不同 猪 的 心脏 结构 完整性 （n = 7 （d0 和 d12 ctrl） （5 （d12 td （5 （d12 td （d12 mc智能量 化 进行 单向 单向 单向 测试 ； ########## p < 0.0001 与D0 咖2*p < 0.05 相比 0.05相比)।एकतर्फी ANOVA परीक्षणको साथ विभिन्न सुँगुरहरू (n = 7 (D0 र D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC र D12 MT) खण्डहरू/समूहहरूमा कृत्रिम बुद्धिमत्ता प्रयोग गरेर हृदयको तन्तुको संरचनात्मक अखण्डताको परिमाणीकरण;#### p <0,0001 по сравнению с D0 र *p < 0,05 वा ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl)। #### p <0.0001 D0 को तुलनामा र *p <0.05 वा ****p <0.0001 D12 Ctrl को तुलनामा)। b प्रतिनिधि छविहरू र मासनको ट्राइक्रोम दाग (स्केल बार = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD, र D12 MC), 9 (D12 MT) स्लाइसहरूबाट दागिएको मुटुका टुक्राहरूको लागि परिमाण निर्धारण <#pgs/group फरक #pgs/group बाट प्रदर्शन गरिएको छ; ##0 #pgs/group is different; 0001 D0 र ***p <0.001 को तुलनामा, वा ****p <0.0001 D12 Ctrl को तुलनामा)। b प्रतिनिधि छविहरू र मासनको ट्राइक्रोम दाग (स्केल बार = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD, र D12 MC), 9 (D12 MT) स्लाइसहरूबाट दागिएको मुटुका टुक्राहरूको लागि परिमाण निर्धारण <#pgs/group फरक #pgs/group बाट प्रदर्शन गरिएको छ; ##0 #pgs/group is different; 0001 D0 र ***p <0.001 को तुलनामा, वा ****p <0.0001 D12 Ctrl को तुलनामा)। b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромным красителем Массона (= 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD र D12 MC), 9 (D12 MT) срезов/группу от разных свиней, выполняется односторонний тест #0012, << #01#017; D0 र ***p < 0,001 वा ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl)। b प्रतिनिधि छविहरू र मासनको ट्राइक्रोम दाग (स्केल बार = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD र D12 MC), 9 (D12 MT) खण्डहरू/विभिन्न सुँगुरहरूबाट खण्डहरू/समूहबाट दाग भएका हृदय खण्डहरूको परिमाणीकरण। 0 र ***p < 0.001 वा ****p < 0.0001 बनाम D12 Ctrl)। b 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像和量化（比例尺= 500 µm）（n = 10D10D1和D12 MC），来自不同猪的9 个（D12 MT）切片/组，进行单因素方差分曠素方差分析；####p <0.00*0p0**或****p <0.0001 与D12 Ctrl 相比）। b 用 Masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 和 量化 （比例 尺 尺 尺 = 500 µm） 1 d0r 、 d12 td 和 d12 mc） 来自 不同 的 9 个 d12 mt 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片/组，进行 单因素方差分析； 方差分析；####D0** <0p0* <p0 001,或****p <0.0001 与D12 Ctrl 相比）। b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромом Массона (мастшабная масштабная массона, мастшабная =10D0mn) Ctrl, D12 TD र D12 MC), 9 (D12 MT) срезов от разных свиней / группы, один- способ ANOVA; ####p < 0,0001 по <сравней, ***p <сравней, ***0001 0001 по сравнению с D12 Ctrl)। b प्रतिनिधि छविहरू र मासनको ट्राइक्रोम (स्केल बार = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD र D12 MC), 9 (D12 MT) खण्डहरू विभिन्न सुँगुर/समूहहरूबाट दागिएको हृदय खण्डहरूको परिमाणीकरण; <##0p0, <##0p0 विधि, <##0p0, <##0p० मा तुलना गर्नुहोस्। .001 वा ****p <0.0001 D12 Ctrl को तुलनामा)।त्रुटि बारहरूले औसत ± मानक विचलन प्रतिनिधित्व गर्दछ।
अन्तमा, कार्डियक हाइपरट्रोफीको नक्कल गर्न CTCM को क्षमता कार्डियक टिश्यू स्ट्रेच बढाएर मूल्याङ्कन गरिएको थियो।CTCM मा, शिखर हावा च्याम्बर दबाव 80 mmHg बाट 80 mmHg मा बढ्यो।कला।(सामान्य खिंचाव) 140 mmHg कला सम्म।(चित्र 6a)।यो स्ट्रेचमा 32% वृद्धिसँग मेल खान्छ (चित्र 6b), जुन पहिले हाइपरट्रोफीमा देखिने जस्तै सारकोमेर लम्बाइ हासिल गर्न हृदयको भागहरूको लागि आवश्यक समान प्रतिशत स्ट्रेचको रूपमा देखाइएको थियो।संकुचन र विश्रामको समयमा हृदयको तन्तुको स्ट्रेच र वेग संस्कृतिको छ दिनको अवधिमा स्थिर रह्यो (चित्र 6c)।एमटी अवस्थाबाट कार्डियक टिस्यु छ दिनको लागि सामान्य स्ट्रेच (MT (सामान्य)) वा ओभरस्ट्रेच अवस्था (MT (OS)) को अधीनमा थियो।पहिले नै संस्कृतिमा चार दिन पछि, हाइपरट्रोफिक बायोमार्कर NT-ProBNP MT (सामान्य) अवस्थाहरू (चित्र 7a) को तुलनामा MT (OS) अवस्थामा मध्यममा उल्लेखनीय रूपमा बढेको थियो।थप रूपमा, छ दिनको संस्कृति पछि, MT (OS) (चित्र 7b) मा कोषको आकार MT हृदय (सामान्य) को खण्डहरूको तुलनामा उल्लेखनीय रूपमा बढ्यो।थप रूपमा, NFATC4 आणविक ट्रान्सलोकेसन ओभरस्ट्रेच्ड टिस्युहरूमा उल्लेखनीय रूपमा बढेको थियो (चित्र 7c)।यी नतिजाहरूले हाइपरडिस्टेन्सन पछि प्याथोलजिकल रिमोडेलिंगको प्रगतिशील विकास देखाउँदछ र CTCM उपकरणलाई स्ट्रेच-प्रेरित कार्डियक हाइपरट्रोफी सिग्नलिङ अध्ययन गर्न प्लेटफर्मको रूपमा प्रयोग गर्न सकिन्छ भन्ने अवधारणालाई समर्थन गर्दछ।
हावा च्याम्बर दबाब, तरल चेम्बर दबाब, र टिश्यू आन्दोलन मापन को प्रतिनिधि ट्रेसहरूले पुष्टि गर्दछ कि चेम्बर दबाबले तरल च्याम्बर दबाब परिवर्तन गर्दछ, टिश्यु स्लाइस को एक समान आन्दोलन को कारण।b प्रतिनिधि स्ट्रेच प्रतिशत र सामान्य रूपमा फैलिएको (सुन्तला) र ओभरस्ट्रेच गरिएको (नीलो) टिस्यु खण्डहरूको लागि स्ट्रेच दर वक्र।c बार ग्राफले चक्र समय देखाउँदै (n = 19 स्लाइस प्रति समूह, विभिन्न सुँगुरहरूबाट), संकुचन समय (n = 18-19 स्लाइसहरू प्रति समूह, विभिन्न सुँगुरहरूबाट), विश्राम समय (n = 19 प्रति समूह, विभिन्न सुँगुरहरूबाट) ), ऊतक आन्दोलनको आयाम (n = 14 स्लाइसहरू, विभिन्न pigs/groups बाट n = 14 स्लाइसहरू, विभिन्न सुँगुरहरूबाट), es/समूह, विभिन्न सुँगुरहरूबाट) र शिखर विश्राम दर (n = 14 (D0), 15 (D6) ) खण्डहरू/समूहहरू) विभिन्न सुँगुरहरूबाट), दुई-पुच्छर विद्यार्थीको टी-परीक्षणले कुनै पनि प्यारामिटरमा कुनै महत्त्वपूर्ण भिन्नता देखाएको छैन, यसले देखाउँछ कि यी प्यारामिटरहरू ओभरभोल्टेजको साथ संस्कृतिको 6 दिनमा स्थिर रह्यो।त्रुटि बारहरूले औसत ± मानक विचलन प्रतिनिधित्व गर्दछ।
MT सामान्य स्ट्रेच (Norm) वा ओभरस्ट्रेचिङ (OS) सर्तहरू (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, र D4 MTOS) अन्तर्गत कल्चर स्लाइसहरूबाट कल्चर मिडियामा NT-ProBNP एकाग्रताको बार ग्राफ परिमाणीकरण। सामान्य स्ट्रेचमा)। MT सामान्य स्ट्रेच (Norm) वा ओभरस्ट्रेचिङ (OS) सर्तहरू (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, र D4 MTOS) स्लाइसहरू बाट अलग-अलग प्रदर्शन गरिएको हृदय स्लाइसहरूबाट कल्चर मिडियामा NT-ProBNP एकाग्रताको बार ग्राफ परिमाणीकरण; सामान्य स्ट्रेचको तुलनामा)।सामान्य MT स्ट्रेच (नर्म) वा ओभरस्ट्रेच (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, र D4) को सर्तहरूमा कल्चर गरिएको हृदय स्लाइसहरूबाट संस्कृति माध्यममा NT-ProBNP एकाग्रताको मात्रात्मक हिस्टोग्राम।**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением)। **p <0.01 सामान्य स्ट्रेचको तुलनामा)। a 在MT 正常拉伸(Norm) 或过度拉伸(OS) 条件下培养的心脏切片培养基中NT-ProBNP 浓度離 4 MTNorm) 、3（D2 MTOS、D4 MTNorm 和D4 MTOS）来自不同猪的切片/组，进行双向方差分析＋有減席0p0 )। MT सामान्य स्ट्रेच (नर्म) वा ओभरस्ट्रेच (ओएस) अवस्था (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm和D4 MTOS) अन्तर्गत विभिन्न 猪的切片猪的切片湄湄滥片 बाट हृदय स्लाइसहरूमा NT-ProBNP एकाग्रताको मात्रा।发发动; **सामान्य स्ट्रेचिङको तुलनामा, p <0.01)।सामान्य MT स्ट्रेच (नर्म) वा ओभरस्ट्रेच (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm) र D4 MTOS) स्लाइस/विभिन्न सुँगुरहरूको दुई-वेरी-वेरीएनासिसको सर्तहरूमा कल्चर गरिएको हृदय स्लाइसहरूमा NT-ProBNP सांद्रताको हिस्टोग्राम परिमाण;**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением)। **p <0.01 सामान्य स्ट्रेचको तुलनामा)। b हृदय स्लाइसहरूका लागि ट्रोपोनिन-T र WGA (बायाँ) र सेल साइज क्वान्टिफिकेशन (दायाँ) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) कोषहरू/समूहहरूका लागि विभिन्न सुँगुरहरूबाट 10 विभिन्न स्लाइसहरूबाट दाग भएका हृदयका टुक्राहरूका लागि प्रतिनिधि छविहरू। b हृदय स्लाइसहरूका लागि ट्रोपोनिन-T र WGA (बायाँ) र सेल साइज क्वान्टिफिकेशन (दायाँ) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) कोषहरू/समूहहरूका लागि विभिन्न सुँगुरहरूबाट 10 विभिन्न स्लाइसहरूबाट दाग भएका हृदयका टुक्राहरूका लागि प्रतिनिधि छविहरू, दुई-पुच्छरको स्टुडेन्ट्सको तुलनामा t-t-0 सामान्य तुलना गरिएको छ। b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слева) и количественноgo MTOS), 369 (D6 MTNorm) клеток/группу из 10 разных срезов от разных свиней, два- проводится хвостовой t-критерий, два- проводится хвостовой t-критерий*** ению с нормальным растяжением)। b ट्रोपोनिन-T र AZP (बाँया) र सेल साइज क्वान्टिफिकेशन (दायाँ) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) कोशिकाहरू/समूहहरूबाट 10 विभिन्न सुँगुरहरूबाट दागिएको हृदयका भागहरूको प्रतिनिधि छविहरू, दुई-पुच्छर विद्यार्थीको t-t-p0 मा तुलना गरिएको थियो। b 用肌钙蛋白-T 和WGA（左）和细胞大小量化（右）染色的心脏切片的心脏切片的心脏切片的代表性图 3 MT来自不同猪的10 个不同切片的369（D6 MTNorm）细胞/组，两进行有尾学生t**检验切片生t ०१)। b calcarein-T र WGA (बाँया) र सेल साइज (दायाँ) (n = 330 (D6 MTOS), 10 विभिन्न स्लाइसहरू (D6 MTNorm)) बाट 369) कोशिकाहरू/组，两方法有 normal testing ，组，两方法有田* परीक्षणको साथ दागिएको हृदय स्लाइसहरूको प्रतिनिधि छविहरू p <0.0001)। b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слева) и количественная оценка размето (D0MT) =6 369 (D6 MTNorm) из 10 различных срезов от разных свиней Клетки/группа, двусторонние критерий Стьюдента; ****p < 0, 0,0,0,000 стяжением)। b ट्रोपोनिन-T र AZP (बायाँ) र सेल साइज (दायाँ) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) विभिन्न सुँगुरहरूबाट 10 विभिन्न खण्डहरूबाट दागिएको हृदय खण्डहरूको प्रतिनिधि छविहरू, कक्ष/समूह, दुई-पुच्छर t मापदण्ड;****p <0.0001 सामान्य तनावको तुलनामा)। c दिन 0 र दिन 6 MTOS हृदय स्लाइसहरू ट्रोपोनिन-T र NFATC4 को लागि इम्युनोलालेबल गरिएको प्रतिनिधि छविहरू र NFATC4 को CMs (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) स्लाइसहरू/समूहको केन्द्रबिन्दुमा ट्रान्सलोकेशनको परिमाणीकरण विभिन्न सुँगुरहरूबाट प्रदर्शन गरिएको छ। c दिन 0 र दिन 6 MTOS हृदय स्लाइसहरू ट्रोपोनिन-T र NFATC4 को लागि इम्युनोलालेबल गरिएको प्रतिनिधि छविहरू र NFATC4 को CMs (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) स्लाइस/समूहको केन्द्रबिन्दुमा ट्रान्सलोकेशनको परिमाण निर्धारण। c Репрезентативные изображения для срезов сердца 0 и 6 दिन MTOS, иммуномеченых для тропонина-Т र NFATC4, и Nцображения срезов сердца FATC4 मा ядра кавернозных клеток (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срезов/группу от разных свиней , выполняется двусторонний , Светрий * t c 0 र 6 दिनको MTOS मा हृदय खण्डहरूका लागि प्रतिनिधि छविहरू, ट्रोपोनिन-T र NFATC4 को लागि इम्युनोलेबल गरिएको, र गुफाको कोशिकाहरूको केन्द्रकमा NFATC4 ट्रान्सलोकेसनको परिमाणीकरण (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) स्लाइसहरू/समूहहरू दुई अलग-अलग सुँगुरहरूबाट प्रदर्शन गरिएका विद्यार्थीहरूबाट;*p <0.05)। c 用于肌钙蛋白-T 和NFATC4 免疫标记的第0 天和第6 天MTOS 心脏切片的代表的代表的片的代表性图叇茻代表性图像，技表性图像，代表思易位至CM 细胞核的量化（n = 4 (D0)、3 (D6 MTOS) 切片/组, 进行双尾学生t 检验；*p <.0. c calcanin-T र NFATC4 इम्युनोलेबलिङ 第0天和第6天MTOS हृदय स्लाइसहरू, र NFATC4 को विभिन्न NFATC4 易位至CM सेल न्यूक्लियस 的 मात्रा化 (n = 4 (D0) 滶3 (D0) 化 (n = 4 (D0) 滶焇礈 化) को प्रतिनिधि छविहरू间双尾学生et 电影；*p <0.05)। c Репрезентативные изображения срезов сердца MTOS मा 0 र 6 दिनमा иммуномаркировки тропонином-Т र NFATC4 र NFATC4 र конличацовкастевическая сердца в ядра CM от разных свиней (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срез/группа, два- хвостатый t-критерий Стьюдента; *p < ०,०५)। c विभिन्न सुँगुरहरू (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) स्लाइस/समूह, 2-pcrit.0) बाट CM को न्यूक्लियसमा ट्रोपोनिन-T र NFATC4 इम्युनोलेबलिङ र NFATC4 ट्रान्सलोकेसनको मात्राको लागि दिन 0 र 6 मा MTOS हृदय स्लाइसहरूको प्रतिनिधि छविहरू।त्रुटि पट्टीहरूले मतलब ± मानक विचलन प्रतिनिधित्व गर्दछ।
अनुवादात्मक कार्डियोभास्कुलर अनुसन्धानलाई सेलुलर मोडेलहरू चाहिन्छ जसले हृदयको वातावरणलाई सही रूपमा पुन: उत्पादन गर्दछ।यस अध्ययनमा, एक CTCM उपकरण विकसित गरिएको थियो र हृदयको अल्ट्राथिन खण्डहरूलाई उत्तेजित गर्न सक्ने विशेषता थियो।CTCM प्रणालीले शारीरिक रूपमा सिंक्रोनाइज्ड इलेक्ट्रोमेकानिकल उत्तेजना र T3 र Dex तरल पदार्थ संवर्धन समावेश गर्दछ।जब पोर्सिन मुटुका खण्डहरू यी कारकहरूको सम्पर्कमा आए, तिनीहरूको व्यवहार्यता, संरचनात्मक अखण्डता, चयापचय गतिविधि, र ट्रान्सक्रिप्शनल अभिव्यक्ति 12 दिनको संस्कृति पछि ताजा हृदयको ऊतकमा जस्तै रह्यो।थप रूपमा, कार्डियक टिस्युको अत्यधिक स्ट्रेचिंगले हाइपरएक्सटेन्सनको कारणले मुटुको हाइपरट्रोफी निम्त्याउन सक्छ।समग्रमा, यी नतिजाहरूले सामान्य कार्डियक फेनोटाइप कायम राख्न शारीरिक संस्कृति अवस्थाहरूको महत्वपूर्ण भूमिकालाई समर्थन गर्दछ र औषधि स्क्रीनिंगको लागि प्लेटफर्म प्रदान गर्दछ।
धेरै कारकहरूले कार्डियोमायोसाइट्सको कार्य र अस्तित्वको लागि इष्टतम वातावरण सिर्जना गर्न योगदान गर्दछ।यी कारकहरू मध्ये सबैभन्दा स्पष्ट (1) इन्टरसेलुलर अन्तरक्रियाहरू, (2) इलेक्ट्रोमेकानिकल उत्तेजना, (3) humoral कारकहरू, र (4) मेटाबोलिक सब्सट्रेटहरूसँग सम्बन्धित छन्।फिजियोलोजिकल सेल-टु-सेल अन्तरक्रियाहरूलाई एक्स्ट्रासेलुलर म्याट्रिक्स द्वारा समर्थित बहु सेल प्रकारहरूको जटिल त्रि-आयामी नेटवर्कहरू चाहिन्छ।यस्तो जटिल सेलुलर अन्तरक्रियाहरू व्यक्तिगत सेल प्रकारहरूको सह-संस्कृतिद्वारा भिट्रोमा पुन: निर्माण गर्न गाह्रो हुन्छ, तर हृदय खण्डहरूको अर्गानोटाइपिक प्रकृति प्रयोग गरेर सजिलै हासिल गर्न सकिन्छ।
कार्डियक फेनोटाइप ३३,३४,३५ कायम राख्नका लागि कार्डियोमायोसाइट्सको मेकानिकल स्ट्रेच र विद्युतीय उत्तेजना महत्वपूर्ण हुन्छ।जबकि मेकानिकल उत्तेजना hiPSC-CM कन्डिसन र परिपक्वताको लागि व्यापक रूपमा प्रयोग गरिएको छ, धेरै सुरुचिपूर्ण अध्ययनहरूले भर्खरै अक्षीय लोडिङ प्रयोग गरेर संस्कृतिमा हृदय स्लाइसहरूको मेकानिकल उत्तेजनाको प्रयास गरेको छ।यी अध्ययनहरूले देखाउँदछ कि 2D uniaxial मेकानिकल लोडिङले संस्कृतिको समयमा हृदयको फेनोटाइपमा सकारात्मक प्रभाव पार्छ।यी अध्ययनहरूमा, हृदयका भागहरू या त आइसोमेट्रिक टेन्साइल बलहरू 17, रैखिक अक्सोटोनिक लोडिङ18, वा कार्डियक चक्रलाई बल ट्रान्सड्यूसर प्रतिक्रिया र तनाव ड्राइभहरू प्रयोग गरेर पुनःनिर्माण गरिएको थियो।यद्यपि, यी विधिहरूले वातावरणीय अप्टिमाइजेसन बिना एकअक्षीय टिश्यू स्ट्रेच प्रयोग गर्दछ, परिणामस्वरूप धेरै कार्डियाक जीनहरूको दमन वा असामान्य स्ट्रेच प्रतिक्रियाहरूसँग सम्बन्धित जीनहरूको ओभरएक्सप्रेसन।यहाँ वर्णन गरिएको CTCM ले 3D इलेक्ट्रोमेकानिकल उत्तेजना प्रदान गर्दछ जसले चक्र समय र शारीरिक स्ट्रेच (25% स्ट्रेच, 40% सिस्टोल, 60% डायस्टोल, र 72 बीट्स प्रति मिनेट) को सन्दर्भमा प्राकृतिक कार्डियक चक्रको नक्कल गर्दछ।यद्यपि यो त्रि-आयामी मेकानिकल उत्तेजना मात्र ऊतक अखण्डता कायम राख्न पर्याप्त छैन, T3/Dex प्रयोग गरेर humoral र मेकानिकल उत्तेजनाको संयोजन पर्याप्त रूपमा ऊतक व्यवहार्यता, कार्य, र अखण्डता कायम राख्न आवश्यक छ।
वयस्क हृदय फेनोटाइप परिमार्जन गर्न हास्य कारकहरूले महत्त्वपूर्ण भूमिका खेल्छन्।यो HiPS-CM अध्ययनहरूमा हाइलाइट गरिएको थियो जसमा T3 र Dex कल्चर मिडियामा सेल परिपक्वतालाई गति दिन थपिएको थियो।T3 ले कोशिका झिल्लीहरूमा एमिनो एसिड, चिनी र क्याल्सियमको यातायातलाई प्रभाव पार्न सक्छ।थप रूपमा, T3 ले MHC-α अभिव्यक्ति र MHC-β डाउनरेगुलेसनलाई बढावा दिन्छ, भ्रूण सीएममा ढिलो ट्विच मायोफिब्रिल्सको तुलनामा परिपक्व कार्डियोमायोसाइट्समा द्रुत ट्विच मायोफिब्रिल्सको गठनलाई बढावा दिन्छ।हाइपोथायराइड रोगीहरूमा T3 को कमीले मायोफिब्रिलर ब्यान्डहरू गुमाउँछ र टोन विकासको कम दरमा परिणाम दिन्छ।डेक्सले ग्लुकोकोर्टिकोइड रिसेप्टरहरूमा कार्य गर्दछ र पृथक परफ्युज्ड हृदयहरूमा मायोकार्डियल संकुचन बढाउन देखाइएको छ;38 यो सुधार क्याल्सियम डिपोजिट-संचालित प्रविष्टि (SOCE) 39,40 मा प्रभावसँग सम्बन्धित भएको मानिन्छ।थप रूपमा, डेक्सले यसको रिसेप्टरहरूसँग बाँध्छ, जसले प्रतिरक्षा प्रकार्य र सूजनलाई दबाउने फराकिलो इन्ट्रासेलुलर प्रतिक्रियाको कारण बनाउँछ।
हाम्रो परिणामहरूले संकेत गर्दछ कि भौतिक मेकानिकल उत्तेजना (MS) ले Ctrl को तुलनामा समग्र संस्कृति प्रदर्शनमा सुधार गर्यो, तर संस्कृतिमा 12 दिनमा व्यवहार्यता, संरचनात्मक अखण्डता, र हृदय अभिव्यक्ति कायम राख्न असफल भयो।Ctrl को तुलनामा, CTCM (MT) संस्कृतिहरूमा T3 र Dex को थप्दा व्यवहार्यता सुधार भयो र समान ट्रान्सक्रिप्शन प्रोफाइलहरू, संरचनात्मक अखण्डता, र 12 दिनको लागि ताजा हृदयको तन्तुसँग मेटाबोलिक गतिविधि कायम राखियो।थप रूपमा, टिश्यू स्ट्रेचको डिग्री नियन्त्रण गरेर, STCM प्रणालीको बहुमुखी प्रतिभालाई चित्रण गर्दै, STCM प्रयोग गरेर हाइपरएक्सटेन्सन-प्रेरित कार्डियक हाइपरट्रोफी मोडेल सिर्जना गरिएको थियो।यो ध्यान दिनुपर्छ कि कार्डियक रिमोडेलिंग र फाइब्रोसिसमा सामान्यतया अक्षुण्ण अंगहरू समावेश हुन्छन् जसको परिसंचरण कक्षहरूले उपयुक्त साइटोकाइनहरू साथै फागोसाइटोसिस र अन्य रिमोडेलिंग कारकहरू प्रदान गर्न सक्छन्, हृदयका भागहरूले अझै पनि तनाव र आघातको प्रतिक्रियामा फाइब्रोटिक प्रक्रियाको नक्कल गर्न सक्छन्।myofibroblasts मा।यो पहिले यो कार्डियक स्लाइस मोडेल मा मूल्याङ्कन गरिएको छ।यो ध्यान दिनुपर्छ कि CTCM प्यारामिटरहरू ट्याचकार्डिया, ब्राडीकार्डिया, र मेकानिकल सर्कुलेटरी सपोर्ट (मेकानिकल अनलोड गरिएको हृदय) जस्ता धेरै अवस्थाहरूको नक्कल गर्न दबाब/विद्युत आयाम र आवृत्ति परिवर्तन गरेर परिमार्जन गर्न सकिन्छ।यसले प्रणालीलाई औषधि परीक्षणको लागि एक माध्यम थ्रुपुट बनाउँछ।अत्यधिक परिश्रम-प्रेरित कार्डियक हाइपरट्रोफी मोडेल गर्न CTCM को क्षमताले व्यक्तिगत उपचारको लागि यस प्रणालीको परीक्षणको लागि मार्ग प्रशस्त गर्दछ।अन्तमा, हालको अध्ययनले मेकानिकल स्ट्रेच र ह्युमरल स्टिमुलेशन कार्डियक टिस्यु खण्डहरूको संस्कृति कायम राख्नको लागि महत्त्वपूर्ण छ भनेर देखाउँछ।
यद्यपि यहाँ प्रस्तुत डाटाले सुझाव दिन्छ कि CTCM अक्षुण्ण मायोकार्डियम मोडेलिङको लागि एक धेरै आशाजनक प्लेटफर्म हो, यो संस्कृति विधिमा केही सीमितताहरू छन्।CTCM संस्कृतिको मुख्य सीमितता यो हो कि यसले स्लाइसहरूमा निरन्तर गतिशील मेकानिकल तनावहरू लगाउँछ, जसले प्रत्येक चक्रको समयमा कार्डियक स्लाइस संकुचनहरू सक्रिय रूपमा निगरानी गर्ने क्षमतालाई रोक्छ।थप रूपमा, कार्डियक खण्डहरू (7 मिमी) को सानो आकारको कारण, परम्परागत बल सेन्सरहरू प्रयोग गरेर संस्कृति प्रणाली बाहिर सिस्टोलिक प्रकार्यको मूल्याङ्कन गर्ने क्षमता सीमित छ।हालको पाण्डुलिपिमा, हामीले संकुचन प्रकार्यको सूचकको रूपमा अप्टिकल भोल्टेजको मूल्याङ्कन गरेर आंशिक रूपमा यस सीमालाई पार गर्छौं।यद्यपि, यो सीमिततालाई थप कामको आवश्यकता पर्दछ र भविष्यमा संस्कृतिमा मुटुका टुक्राहरूको कार्यको अप्टिकल अनुगमनका लागि विधिहरू प्रस्तुत गरेर सम्बोधन गर्न सकिन्छ, जस्तै क्याल्सियम र भोल्टेज-संवेदनशील रंगहरू प्रयोग गरेर अप्टिकल म्यापिङ।CTCM को अर्को सीमा भनेको काम गर्ने मोडेलले शारीरिक तनाव (प्रीलोड र आफ्टलोड) लाई हेरफेर गर्दैन।CTCM मा, धेरै ठूला तन्तुहरूमा डायस्टोल (पूर्ण स्ट्रेच) र सिस्टोल (विद्युत उत्तेजनाको समयमा संकुचनको लम्बाइ) मा 25% शारीरिक स्ट्रेच पुन: उत्पादन गर्न विपरीत दिशाहरूमा दबाब प्रेरित गरिएको थियो।यो सीमा भविष्यको CTCM डिजाइनहरूमा दुवै पक्षबाट हृदयको तन्तुमा पर्याप्त दबाब दिएर र हृदयको कक्षहरूमा हुने सटीक दबाव-भोल्युम सम्बन्धहरू लागू गरेर हटाइनुपर्छ।
यस पाण्डुलिपिमा रिपोर्ट गरिएको ओभरस्ट्रेच-प्रेरित रिमोडेलिंग हाइपरट्रोफिक हाइपरस्ट्रेच संकेतहरूको नक्कल गर्न सीमित छ।तसर्थ, यस मोडेलले ह्युमरल वा न्यूरल कारकहरू (जुन यस प्रणालीमा अवस्थित छैन) को आवश्यकता बिना स्ट्रेच-प्रेरित हाइपरट्रोफिक सिग्नलको अध्ययनमा मद्दत गर्न सक्छ।CTCM को बहुलता बढाउन थप अध्ययनहरू आवश्यक छ, उदाहरणका लागि, प्रतिरक्षा कोशिकाहरूसँग सह-संस्कृति, प्लाज्मा ह्युमरल कारकहरू परिसंचरण, र न्युरोनल कोशिकाहरूसँग सह-संस्कृति गर्दा CTCM सँग रोग मोडलिङको सम्भावनाहरू सुधार गर्नेछ।
यस अध्ययनमा तेह्र सुँगुरहरू प्रयोग गरिएको थियो।सबै पशु प्रक्रियाहरू संस्थागत दिशानिर्देशहरू अनुसार प्रदर्शन गरिएको थियो र लुइसभिल विश्वविद्यालय संस्थागत पशु हेरचाह र प्रयोग समिति द्वारा अनुमोदन गरिएको थियो।महाधमनी आर्क क्ल्याम्प गरिएको थियो र मुटुलाई 1 L बाँझ कार्डियोप्लेजिया (110 mM NaCl, 1.2 mM CaCl2, 16 mM KCl, 16 mM MgCl2, 10 mM NaHCO3, 5 U/mL हेपरिन, pH 7 सम्म); मुटुहरू बरफमा प्रयोगशालामा ढुवानी नगरेसम्म आइस-कोल्ड कार्डियोप्लेजिक समाधानमा सुरक्षित गरिएको थियो जुन सामान्यतया <10 मिनेट हुन्छ। मुटुहरू बरफमा प्रयोगशालामा ढुवानी नगरेसम्म आइस-कोल्ड कार्डियोप्लेजिक समाधानमा सुरक्षित गरिएको थियो जुन सामान्यतया <10 मिनेट हुन्छ। сердца хранили в ледяном кардиоплегическом растворе до транспортировки в лабораторию на льду, что обычно занимает <10 мин. मुटुहरू बरफमा प्रयोगशालामा ढुवानी नगरेसम्म आइस-कोल्ड कार्डियोप्लेजिक समाधानमा भण्डारण गरिएको थियो, जुन सामान्यतया <10 मिनेट लाग्छ।将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中,直到冰上运送到实验室,通常<10分钟।将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中,直到冰上运送到实验室,通常<10分钟। Держите сердца в ледяной кардиоплегии до транспортировки в лабораторию на льду, обычно <10 min. बरफमा प्रयोगशालामा ढुवानी नगरेसम्म हृदयलाई आइस कार्डियोप्लेजियामा राख्नुहोस्, सामान्यतया <10 मिनेट।
CTCM उपकरण SolidWorks कम्प्युटर-एडेड डिजाइन (CAD) सफ्टवेयरमा विकसित गरिएको थियो।कल्चर चेम्बर, डिभाइडर र एयर चेम्बरहरू सीएनसी क्लियर एक्रिलिक प्लास्टिकबाट बनेका छन्।7mm व्यास ब्याक-अप रिंग बीचमा उच्च घनत्व पोलिथिलीन (HDPE) बाट बनेको छ र तल मिडिया सिल गर्न प्रयोग गरिने सिलिकन ओ-रिंग समायोजन गर्न ओ-रिङ ग्रूभ छ।पातलो सिलिका झिल्लीले कल्चर चेम्बरलाई सेपरेसन प्लेटबाट अलग गर्छ।सिलिकन झिल्ली ०.०२″ मोटो सिलिकन पानाबाट लेजर काटिएको छ र यसको कठोरता 35A छ।तल र शीर्ष सिलिकन गास्केटहरू 1/16″ मोटो सिलिकन पानाबाट लेजर काटिएका छन् र 50A को कठोरता छ।316L स्टेनलेस स्टील स्क्रू र पखेटा नटहरू ब्लक बाँध्न र वायुरोधी सिल सिर्जना गर्न प्रयोग गरिन्छ।
एक समर्पित मुद्रित सर्किट बोर्ड (PCB) C-PACE-EM प्रणाली संग एकीकृत गर्न डिजाइन गरिएको छ।PCB मा स्विस मेशिन कनेक्टर सकेटहरू ग्रेफाइट इलेक्ट्रोडहरूमा सिल्भर-प्लेटेड तामाको तारहरू र कांस्य 0-60 स्क्रूहरू इलेक्ट्रोडहरूमा जोडिएका छन्।मुद्रित सर्किट बोर्ड थ्रीडी प्रिन्टरको आवरणमा राखिएको छ।
CTCM यन्त्रलाई प्रोग्रामेबल न्यूमेटिक एक्टुएटर (PPD) द्वारा नियन्त्रित गरिन्छ जसले कार्डियक साइकल जस्तै नियन्त्रित परिसंचरण दबाव सिर्जना गर्दछ।वायु कक्ष भित्रको दबाब बढ्दै जाँदा, लचिलो सिलिकन झिल्ली माथितिर विस्तार हुन्छ, टिस्यु साइट मुनिको माध्यमलाई जबरजस्ती।तन्तुको क्षेत्र त्यसपछि तरल पदार्थको यो निष्कासनद्वारा फैलिनेछ, डायस्टोलको समयमा हृदयको शारीरिक विस्तारको नक्कल गर्दै।विश्रामको शिखरमा, ग्रेफाइट इलेक्ट्रोडहरू मार्फत विद्युतीय उत्तेजना लागू गरिएको थियो, जसले वायु कक्षमा दबाब कम गर्‍यो र ऊतक खण्डहरूको संकुचन निम्त्यायो।पाइप भित्र हावा प्रणालीमा दबाब पत्ता लगाउन दबाव सेन्सरको साथ हेमोस्टेटिक भल्भ छ।दबाब सेन्सर द्वारा महसुस गरिएको दबाब ल्यापटपमा जडान भएको डाटा कलेक्टरमा लागू हुन्छ।यसले ग्यास च्याम्बर भित्रको दबाबको निरन्तर निगरानीलाई अनुमति दिन्छ।जब अधिकतम चेम्बर दबाब पुग्यो (मानक 80 mmHg, 140 mmHg OS), डाटा अधिग्रहण उपकरणलाई 2 ms को लागि biphasic भोल्टेज संकेत उत्पन्न गर्न C-PACE-EM प्रणालीमा सिग्नल पठाउन आदेश दिइयो, 4 V मा सेट गरियो।
मुटुका खण्डहरू प्राप्त गरियो र 6 वटा कुवाहरूमा संस्कृति अवस्थाहरू निम्नानुसार प्रदर्शन गरियो: ट्रान्सफर पोतबाट कटाई गरिएको हृदयलाई चिसो (4 डिग्री सेल्सियस) कार्डियोप्लेजिया भएको ट्रेमा स्थानान्तरण गर्नुहोस्।बाँया भेन्ट्रिकललाई बाँझरहित ब्लेडले पृथक गरी १-२ सेमी ३ को टुक्रामा काटिएको थियो।यी टिस्यु ब्लकहरू टिस्यु एडेसिभको साथ टिस्यु सपोर्टमा जोडिएका थिए र टायरोडको घोल र लगातार अक्सिजनयुक्त (3 g/L 2,3-butanedione monooxime (BDM), 140 mM NaCl (8.18 g), m.6M4 (m.4g) m.4g (m.4g) लुकोज (1.86 ग्राम), 10 मिमी HEPES (2.38 ग्राम), 1 mM MgCl2 (1 ml 1 M समाधान), 1.8 mM CaCl2 (1.8 ml 1 M समाधान), 1 L ddH2O सम्म)।कम्पन गर्ने माइक्रोटोमलाई 80 Hz को फ्रिक्वेन्सीमा 300 µm बाक्लो स्लाइसहरू काट्न सेट गरिएको थियो, 2 mm को तेर्सो कम्पन आयाम, र 0.03 mm/s को अग्रिम दर।घोललाई चिसो राख्न टिस्यु बाथलाई बरफले घेरिएको थियो र तापमान ४ डिग्री सेल्सियसमा राखिएको थियो।माइक्रोटोम बाथबाट टिस्यु खण्डहरूलाई एक कल्चर प्लेटको लागि पर्याप्त खण्डहरू प्राप्त नभएसम्म बरफमा निरन्तर अक्सिजनयुक्त टाइरोड घोल भएको इन्क्युबेशन बाथमा स्थानान्तरण गर्नुहोस्।ट्रान्सवेल कल्चरहरूका लागि, टिस्यु खण्डहरूलाई बाँझ 6 मिमी चौडा पोलियुरेथेन समर्थनहरूसँग जोडिएको थियो र अनुकूलित माध्यमको 6 मिलीलीटरमा राखिएको थियो (199 मध्यम, 1x आईटीएस पूरक, 10% FBS, 5 ng/ml VEGF, 10 ng/ml FGF-alkaline र antifantifant-2)।विद्युतीय उत्तेजना (१० V, फ्रिक्वेन्सी १.२ हर्ट्ज) सी-पेस मार्फत टिश्यु खण्डहरूमा लागू गरिएको थियो।TD अवस्थाहरूको लागि, ताजा T3 र Dex प्रत्येक मध्यम परिवर्तनमा 100 nM र 1 μM मा थपियो।दिनको 3 पटक प्रतिस्थापन गर्नु अघि माध्यम अक्सिजन संग संतृप्त छ।टिस्यु खण्डहरूलाई इनक्यूबेटरमा ३७ डिग्री सेल्सियस र ५% CO2 मा कल्चर गरिएको थियो।
CTCM संस्कृतिहरूका लागि, टिस्यु खण्डहरू परिमार्जित Tyrode को समाधान भएको पेट्री डिशमा अनुकूलन-निर्मित 3D प्रिन्टरमा राखिएको थियो।यन्त्रलाई हृदयको टुक्राको आकारलाई समर्थन रिंगको क्षेत्रफलको 25% वृद्धि गर्न डिजाइन गरिएको हो।यो गरिन्छ ताकि टायरोडको घोलबाट माध्यममा र डायस्टोलको समयमा स्थानान्तरण गरिसकेपछि मुटुका खण्डहरू फैलिएन।हिस्टोएक्रिलिक ग्लु प्रयोग गरेर, खण्डहरू 300 µm बाक्लो समर्थन रिंग 7 मिमी व्यासमा फिक्स गरियो।टिस्यु खण्डहरूलाई सपोर्ट रिङमा जोडिसकेपछि, अतिरिक्त टिस्यु खण्डहरू काट्नुहोस् र एउटै यन्त्रको लागि पर्याप्त खण्डहरू तयार नभएसम्म बरफ (4°C) मा टायरोड घोलको बाथमा संलग्न टिस्यु खण्डहरू राख्नुहोस्।सबै उपकरणहरूको लागि कुल प्रशोधन समय 2 घण्टा भन्दा बढी हुनु हुँदैन।6 टिस्यु खण्डहरू तिनीहरूको समर्थन घण्टीहरूमा संलग्न गरिसकेपछि, CTCM यन्त्रलाई भेला गरियो।CTCM कल्चर च्याम्बर 21 एमएल प्रि-अक्सिजनयुक्त माध्यमले पूर्व-भरिएको छ।टिस्यु खण्डहरूलाई कल्चर च्याम्बरमा स्थानान्तरण गर्नुहोस् र पिपेटको साथ कुनै पनि हावाका बुलबुलेहरू सावधानीपूर्वक हटाउनुहोस्।टिस्यु खण्डलाई त्यसपछि प्वालमा निर्देशित गरिन्छ र बिस्तारै ठाउँमा थिचिन्छ।अन्तमा, उपकरणमा इलेक्ट्रोड टोपी राख्नुहोस् र उपकरणलाई इनक्यूबेटरमा स्थानान्तरण गर्नुहोस्।त्यसपछि CTCM लाई एयर ट्यूब र C-PACE-EM प्रणालीमा जडान गर्नुहोस्।वायमेटिक एक्ट्युएटर खुल्छ र एयर भल्भले CTCM खोल्छ।C-PACE-EM प्रणाली 2 ms को लागि biphasic pacing को समयमा 1.2 Hz मा 4 V डेलिभर गर्न कन्फिगर गरिएको थियो।माध्यम दिनमा दुई पटक परिवर्तन गरिएको थियो र इलेक्ट्रोडहरूमा ग्रेफाइट जम्मा हुनबाट बच्न दिनको एक पटक इलेक्ट्रोडहरू परिवर्तन गरियो।आवश्यक भएमा, टिस्यु खण्डहरू तिनीहरूको कल्चर इनारहरूबाट हटाउन सकिन्छ जुन तिनीहरूको मुनि खसेको हुनसक्ने कुनै पनि हावाका बुलबुलेहरू बाहिर निकाल्न सकिन्छ।MT उपचार अवस्थाहरूको लागि, T3/Dex 100 nM T3 र 1 μM Dex सँग प्रत्येक मध्यम परिवर्तनको साथ ताजा थपिएको थियो।CTCM यन्त्रहरूलाई इनक्यूबेटरमा ३७°C र ५% CO2 मा कल्चर गरिएको थियो।
मुटुका टुक्राहरूको तानिएको प्रक्षेपणहरू प्राप्त गर्न, एक विशेष क्यामेरा प्रणाली विकसित गरिएको थियो।एउटा SLR क्यामेरा (Canon Rebel T7i, Canon, Tokyo, Japan) Navitar Zoom 7000 18-108mm म्याक्रो लेन्स (Navitar, San Francisco, CA) सँग प्रयोग गरिएको थियो।भिजुअलाइजेसन कोठाको तापमानमा ताजा माध्यमको साथ माध्यम प्रतिस्थापन पछि प्रदर्शन गरिएको थियो।क्यामेरा 51° कोणमा राखिएको छ र भिडियो 30 फ्रेम प्रति सेकेन्डमा रेकर्ड गरिएको छ।पहिलो, ओपन सोर्स सफ्टवेयर (MUSCLEMOTION43) लाई Image-J को साथ प्रयोग गरिएको थियो हृदयको स्लाइसको गति मापन गर्न।मास्क MATLAB (MathWorks, Natick, MA, USA) को प्रयोग गरेर सिर्जना गरिएको हो जसले शोरबाट बच्नको लागि मुटुको टुक्राहरू पिट्ने रुचिको क्षेत्रहरू परिभाषित गर्दछ।म्यानुअल रूपमा विभाजित मास्कहरू फ्रेम अनुक्रममा सबै छविहरूमा लागू गरिन्छ र त्यसपछि MUSCLEMOTION प्लग-इनमा पास गरिन्छ।मसल मोशनले सन्दर्भ फ्रेमको सापेक्ष आफ्नो आन्दोलन परिमाण गर्न प्रत्येक फ्रेममा पिक्सेलको औसत तीव्रता प्रयोग गर्दछ।डाटा रेकर्ड गरिएको थियो, फिल्टर गरिएको थियो र चक्र समय को मात्रा मापन गर्न र कार्डियक चक्र को समयमा टिश्यू स्ट्रेच को आकलन गर्न को लागी प्रयोग गरियो।रेकर्ड गरिएको भिडियोलाई पहिलो-अर्डर शून्य-चरण डिजिटल फिल्टर प्रयोग गरेर पोस्ट-प्रोसेस गरिएको थियो।टिश्यु स्ट्रेच (पीक-टू-पीक) मापन गर्नको लागि, रेकर्ड गरिएको संकेतमा चुचुराहरू र ट्रफहरू बीच भेद गर्न शिखर-देखि-शिखर विश्लेषण प्रदर्शन गरिएको थियो।थप रूपमा, संकेत बहाव हटाउनको लागि 6 औं क्रम बहुपदी प्रयोग गरेर डिट्रेन्डिङ प्रदर्शन गरिन्छ।कार्यक्रम कोड MATLAB मा ग्लोबल टिश्यू गति, चक्र समय, विश्राम समय, र संकुचन समय (पूरक कार्यक्रम कोड 44) निर्धारण गर्न विकसित गरिएको थियो।
स्ट्रेन विश्लेषणको लागि, मेकानिकल स्ट्रेच मूल्याङ्कनका लागि सिर्जना गरिएका उही भिडियोहरू प्रयोग गरेर, हामीले MUSCLEMOTION सफ्टवेयरको आधारमा गति चुचुराहरू (उच्च (माथिल्लो) र सबैभन्दा तल्लो (तल्लो) गति बिन्दुहरू) प्रतिनिधित्व गर्ने दुई छविहरू पत्ता लगायौं।हामीले त्यसपछि टिश्यु क्षेत्रहरूलाई विभाजन गर्यौं र सेगमेन्ट गरिएको टिश्युमा छायांकन एल्गोरिदमको रूप लागू गर्‍यौं (पूरक चित्र 2a)।खण्डित तन्तुलाई त्यसपछि दस उपसतहहरूमा विभाजन गरिएको थियो, र निम्न समीकरण प्रयोग गरेर प्रत्येक सतहमा तनाव गणना गरिएको थियो: स्ट्रेन = (Sup-Sdown)/Sdown, जहाँ Sup र Sdown क्रमशः कपडाको माथि र तल्लो छायाबाट आकारको दूरी हो (पूरक चित्र। .2b)।
मुटुका खण्डहरू ४% प्याराफर्मल्डिहाइडमा ४८ घण्टासम्म फिक्स गरियो।स्थिर तन्तुहरू 10% र 20% सुक्रोजमा 1 घन्टाको लागि निर्जलित गरियो, त्यसपछि रातभर 30% सुक्रोजमा।त्यसपछि खण्डहरूलाई इष्टतम काट्ने तापमान कम्पाउन्ड (ओसीटी कम्पाउन्ड) मा इम्बेड गरिएको थियो र बिस्तारै आइसोपेन्टेन/ड्राइ आइस बाथमा जम्मा गरियो।OCT इम्बेडिङ ब्लकहरू -80 °C मा अलग नभएसम्म भण्डार गर्नुहोस्।स्लाइडहरू 8 μm को मोटाई संग सेक्सन को रूप मा तैयार गरियो।
मुटुका भागहरूबाट OCT हटाउनको लागि, 5 मिनेटको लागि 95 °C मा तताउने ब्लकमा स्लाइडहरू तताउनुहोस्।प्रत्येक स्लाइडमा 1 एमएल पीबीएस थप्नुहोस् र कोठाको तापक्रममा 30 मिनेटको लागि इन्क्युबेट गर्नुहोस्, त्यसपछि कोठाको तापक्रममा 15 मिनेटको लागि PBS मा 0.1% ट्राइटन-एक्स सेट गरेर खण्डहरू पार गर्नुहोस्।गैर-विशिष्ट एन्टिबडीहरूलाई नमूनामा बाँध्नबाट रोक्न, स्लाइडहरूमा 3% BSA समाधानको 1 मिलीलीटर थप्नुहोस् र कोठाको तापक्रममा 1 घण्टाको लागि इन्क्युबेट गर्नुहोस्।BSA त्यसपछि हटाइयो र स्लाइड PBS संग धोइयो।प्रत्येक नमूनालाई पेन्सिलले चिन्ह लगाउनुहोस्।प्राथमिक एन्टिबडीहरू (1% BSA मा 1:200 पातलो गरिएको) (connexin 43 (Abcam; #AB11370), NFATC4 (Abcam; #AB99431) र ट्रोपोनिन-T (थर्मो साइन्टिफिक; #MA5-12960) 90 मिनेटमा थपियो, त्यसपछि एलेक्स 2001 मा एलेक्स 200 विरुद्ध दोस्रो एन्टिबडीहरू थपियो। Fluor 488 (थर्मो साइन्टिफिक; #A16079), खरगोश Alexa Fluor 594 (थर्मो साइन्टिफिक; #T6391) को बिरूद्ध थप 90 मिनेटको लागि PBS को साथ 3 पटक धोइयो पृष्ठभूमिबाट लक्ष्य दाग छुट्याउन, हामीले केवल माध्यमिक एन्टिबडीलाई नियन्त्रणको रूपमा प्रयोग गर्यौं। अन्तमा, न्यूक्लियर भिडिएटरमा थपिएको थियो। प्रयोगशालाहरू) र नेल पालिसले सिल गरिएको छ। -x म्याग्निफिकेसन) र 40x म्याग्निफिकेसनको साथ कीन्स माइक्रोस्कोप।
WGA-Alexa Fluor 555 (Thermo Scientific; #W32464) PBS मा 5 μg/ml मा WGA स्टेनिङको लागि प्रयोग गरिएको थियो र कोठाको तापक्रममा 30 मिनेटको लागि निश्चित खण्डहरूमा लागू गरियो।त्यसपछि स्लाइडहरू पीबीएससँग धोइयो र प्रत्येक स्लाइडमा सुडान कालो थपियो र 30 मिनेटको लागि इन्क्युबेट गरियो।त्यसपछि स्लाइडहरू पीबीएससँग धोइयो र भेक्टशील्ड इम्बेडिङ माध्यम थपियो।स्लाइडहरू 40x म्याग्निफिकेसनमा Keyence माइक्रोस्कोपमा भिजुअलाइज गरिएको थियो।
OCT माथि वर्णन गरिए अनुसार नमूनाहरूबाट हटाइयो।OCT हटाइसकेपछि, स्लाइडहरू बोइनको समाधानमा रातभर डुबाउनुहोस्।त्यसपछि स्लाइडहरू 1 घन्टाको लागि डिस्टिल्ड पानीले कुल्ला गरियो र त्यसपछि 10 मिनेटको लागि बिब्रिच एलो एसिड फुचसिन घोलमा राखियो।त्यसपछि स्लाइडहरू आसुत पानीले धोएर 5% फस्फोमोलिब्डेनम/5% फस्फोटोङ्गस्टिक एसिडको घोलमा १० मिनेटको लागि राखियो।कुल्ला नगरिकन, स्लाइडहरूलाई 15 मिनेटको लागि सिधै एनिलिन निलो घोलमा स्थानान्तरण गर्नुहोस्।त्यसपछि स्लाइडहरू डिस्टिल्ड पानीले धोएर 2 मिनेटको लागि 1% एसिटिक एसिडको घोलमा राखियो।स्लाइडहरू 200 N इथेनॉलमा सुकाइयो र xylene मा स्थानान्तरण गरियो।दाग गरिएका स्लाइडहरू 10x उद्देश्यको साथ एक Keyence माइक्रोस्कोप प्रयोग गरेर कल्पना गरिएको थियो।फाइब्रोसिस क्षेत्र प्रतिशत Keyence विश्लेषक सफ्टवेयर प्रयोग गरेर परिमाण गरिएको थियो।
CyQUANT™ MTT सेल व्यवहार्यता परख (Invitrogen, Carlsbad, CA), क्याटलग नम्बर V13154, केहि परिमार्जन सहित निर्माताको प्रोटोकल अनुसार।विशेष गरी, एमटीटी विश्लेषणको क्रममा एकसमान टिश्यू साइज सुनिश्चित गर्न 6 मिमी व्यासको सर्जिकल पंच प्रयोग गरिएको थियो।टिस्युहरूलाई निर्माताको प्रोटोकल अनुसार MTT सब्सट्रेट भएको १२-वेल प्लेटको इनारहरूमा व्यक्तिगत रूपमा प्लेट गरिएको थियो।खण्डहरू ३७ डिग्री सेल्सियसमा ३ घण्टासम्म इन्क्युबेटेड हुन्छन् र जीवित तन्तुले MTT सब्सट्रेटलाई मेटाबोलाइज गरी बैजनी फोरमजान कम्पाउन्ड बनाउँछ।MTT घोललाई १ ml DMSO ले बदल्नुहोस् र मुटुका भागहरूबाट बैजनी फोरमजान निकाल्न १५ मिनेटको लागि ३७ डिग्री सेल्सियसमा इन्क्युबेट गर्नुहोस्।नमूनाहरू 1:10 मा DMSO मा 96-राम्रो स्पष्ट तल्लो प्लेटहरूमा पातलो गरियो र बैजनी रंगको तीव्रता 570 nm मा मापन गरिएको साइटेशन प्लेट रिडर (बायोटेक) प्रयोग गरेर।पढाइहरू हृदयको प्रत्येक टुक्राको वजनमा सामान्य गरिएको थियो।
हृदयको टुक्रा मिडियालाई 1 μCi/ml [5-3H] - ग्लुकोज (Moravek Biochemicals, Brea, CA, USA) समावेश गरिएको मिडियाले पहिले वर्णन गरिए अनुसार ग्लुकोज उपयोग परखको लागि प्रतिस्थापन गरिएको थियो।इन्क्युबेशनको 4 घण्टा पछि, 0.2 N HCl को 100 μl भएको खुला माइक्रोसेन्ट्रिफ्यूज ट्यूबमा 100 μl मध्यम थप्नुहोस्।त्यसपछि ट्यूबलाई 500 μl dH2O भएको सिन्टिलेशन ट्यूबमा [3H]2O 37 डिग्री सेल्सियसमा ७२ घण्टासम्म वाष्पीकरण गर्नको लागि राखियो।त्यसपछि सिन्टिलेशन ट्यूबबाट माइक्रोसेन्ट्रिफ्यूज ट्यूब हटाउनुहोस् र 10 मिलीलीटर सिन्टिलेशन फ्लुइड थप्नुहोस्।सिन्टिलेशन गणनाहरू Tri-Carb 2900TR तरल सिन्टिलेशन विश्लेषक (Packard Bioscience Company, Meriden, CT, USA) को प्रयोग गरेर प्रदर्शन गरिएको थियो।त्यसपछि ग्लुकोज उपयोगको गणना [5-3H]-ग्लुकोज विशिष्ट गतिविधि, अपूर्ण सन्तुलन र पृष्ठभूमि, [5-3H]-बाट लेबल नगरिएको ग्लुकोजमा, र सिन्टिलेशन काउन्टर दक्षतालाई ध्यानमा राखेर गणना गरिएको थियो।डाटा हृदयको खण्डहरूको मासमा सामान्यीकृत गरिन्छ।
Trizol मा टिस्यु होमोजेनाइजेसन पछि, निर्माताको प्रोटोकल अनुसार Qiagen miRNeasy माइक्रो किट #210874 प्रयोग गरेर RNA लाई हृदयको भागबाट अलग गरिएको थियो।RNAsec पुस्तकालय तयारी, अनुक्रम र डेटा विश्लेषण निम्न रूपमा प्रदर्शन गरिएको थियो:
प्रति नमूना 1 μg आरएनए आरएनए पुस्तकालयको तयारीको लागि प्रारम्भिक सामग्रीको रूपमा प्रयोग गरिएको थियो।अनुक्रमण पुस्तकालयहरू NEBNext UltraTM RNA Library Preparation Kit for Illumina (NEB, USA) को प्रयोग गरेर निर्माताको सिफारिसहरू पछ्याएर उत्पन्न गरियो, र प्रत्येक नमूनाको लागि विशेषता अनुक्रमहरूमा अनुक्रमणिका कोडहरू थपियो।छोटकरीमा, एमआरएनए कुल आरएनएबाट पोली-टी ओलिगोन्युक्लियोटाइडसँग जोडिएको चुम्बकीय मोतीहरू प्रयोग गरेर शुद्ध गरिएको थियो।NEBNext First Strand Synthesis Reaction Buffer (5X) मा उच्च तापक्रममा divalent cations प्रयोग गरेर खण्डीकरण गरिन्छ।पहिलो स्ट्र्यान्ड सीडीएनए अनियमित हेक्सामर प्राइमरहरू र M-MuLV रिभर्स ट्रान्सक्रिप्टेज (RNase H-) प्रयोग गरेर संश्लेषित गरिएको थियो।दोस्रो स्ट्र्यान्ड cDNA त्यसपछि DNA पोलिमरेज I र RNase H को प्रयोग गरेर संश्लेषित गरिन्छ। बाँकी ओभरह्याङ्गहरू exonuclease/polymerase गतिविधिद्वारा ब्लन्ट एन्डहरूमा रूपान्तरण हुन्छन्।DNA टुक्राको 3′ छेउको adenylation पछि, यसलाई हाइब्रिडाइजेशनको लागि तयार गर्नको लागि हेयरपिन लुप संरचना भएको NEBNext एडाप्टर जोडिएको छ।मनपर्ने लम्बाइको cDNA टुक्राहरूको चयनको लागि 150-200 bp।पुस्तकालयका टुक्राहरू AMPure XP प्रणाली (Beckman Coulter, Beverly, USA) को प्रयोग गरेर शुद्ध गरियो।त्यसपछि, 3 μl USER इन्जाइम (NEB, USA) आकार-चयनित cDNA को साथ एडाप्टरको साथ 15 मिनेटको लागि 37 ° C मा र त्यसपछि 5 मिनेटको लागि PCR अघि 95 ° C मा प्रयोग गरियो।PCR त्यसपछि फ्युजन हाई-फिडेलिटी डीएनए पोलिमरेज, युनिभर्सल पीसीआर प्राइमर, र इन्डेक्स (X) प्राइमरहरू प्रयोग गरेर प्रदर्शन गरिएको थियो।अन्तमा, PCR उत्पादनहरू शुद्ध गरियो (AMPure XP प्रणाली) र पुस्तकालयको गुणस्तर Agilent Bioanalyzer 2100 प्रणालीमा मूल्याङ्कन गरियो।cDNA पुस्तकालयलाई नोवासेक अनुक्रमक प्रयोग गरेर क्रमबद्ध गरिएको थियो।Illumina का कच्चा छवि फाइलहरू CASAVA बेस कलिङ प्रयोग गरेर कच्चा रिडहरूमा रूपान्तरण गरियो।कच्चा डाटा FASTQ(fq) ढाँचा फाइलहरूमा भण्डारण गरिन्छ जसमा पढ्ने अनुक्रमहरू र सम्बन्धित आधार गुणहरू समावेश हुन्छन्।Sscrofa11.1 सन्दर्भ जीनोममा फिल्टर गरिएको अनुक्रम पढ्नको लागि HISAT2 चयन गर्नुहोस्।सामान्यतया, HISAT2 ले कुनै पनि आकारको जीनोमहरूलाई समर्थन गर्दछ, 4 बिलियन आधारहरू भन्दा ठूला जीनोमहरू सहित, र धेरै प्यारामिटरहरूको लागि पूर्वनिर्धारित मानहरू सेट गरिन्छ।RNA Seq डेटाबाट पठनहरू स्प्लिसिङलाई HISAT2 को प्रयोग गरी कुशलतापूर्वक पङ्क्तिबद्ध गर्न सकिन्छ, हाल उपलब्ध सबैभन्दा छिटो प्रणाली, अन्य कुनै पनि विधि भन्दा उस्तै वा राम्रो शुद्धताका साथ।
ट्रान्सक्रिप्टहरूको प्रचुरताले सीधा जीन अभिव्यक्तिको स्तरलाई प्रतिबिम्बित गर्दछ।जीन अभिव्यक्ति स्तरहरू जीनोम वा एक्सोनहरूसँग सम्बन्धित ट्रान्सक्रिप्टहरू (अनुक्रम गणना) को प्रशस्तता द्वारा मूल्याङ्कन गरिन्छ।पढ्ने संख्या जीन अभिव्यक्ति स्तर, जीन लम्बाइ, र अनुक्रम गहिराई समानुपातिक छ।FPKM (ट्रान्स्क्रिप्टको प्रति हजार आधार जोडीहरू प्रति मिलियन आधार जोडीहरू अनुक्रमित) गणना गरियो र DESeq2 प्याकेज प्रयोग गरेर भिन्न अभिव्यक्तिको P-मानहरू निर्धारण गरियो।त्यसपछि हामीले बिल्ट-इन R- प्रकार्य "p.adjust" मा आधारित बेन्जामिनी-होचबर्ग विधि9 प्रयोग गरेर प्रत्येक P मानको लागि गलत खोज दर (FDR) गणना गर्यौं।
थर्मो (थर्मो, बिरालो नम्बर 11756050) बाट सुपरस्क्रिप्ट IV Vilo मास्टर मिक्स प्रयोग गरेर हृदयको भागहरूबाट अलग गरिएको RNA 200 ng/μl को एकाग्रतामा cDNA मा रूपान्तरण गरियो।परिमाणात्मक RT-PCR एप्लाइड बायोसिस्टम एन्डुरा प्लेट माइक्रोएम्प 384-वेल पारदर्शी प्रतिक्रिया प्लेट (थर्मो, बिरालो नम्बर 4483319) र माइक्रोएम्प अप्टिकल एडेसिभ (थर्मो, बिरालो नम्बर 4311971) को प्रयोग गरेर प्रदर्शन गरिएको थियो।प्रतिक्रिया मिश्रणमा 5 µl Taqman Fast Advanced Master Mix (Thermo, cat # 4444557), 0.5 µl Taqman प्राइमर र 3.5 µl H2O प्रति राम्रोसँग मिसाइएको थियो।मानक qPCR चक्रहरू चलाइएको थियो र CT मानहरू एप्लाइड बायोसिस्टम क्वान्टस्टुडियो 5 वास्तविक-समय PCR उपकरण (384-वेल मोड्युल; उत्पादन # A28135) प्रयोग गरेर मापन गरियो।Taqman प्राइमरहरू थर्मो (GAPDH (Ss03375629_u1), PARP12 (Ss06908795_m1), PKDCC (Ss06903874_m1), CYGB (Ss06900188_m1), RGL1 (Ss081018_m1), RGL1 (Ss08019_ACT), RGL1 (Ss08018_m1) बाट खरिद गरिएको थियो। 8_mH), GATA4 (Ss03383805_u1), GJA1 (Ss03374839_u1), COL1A2 (Ss03375009_u1 ), COL3A1 (Ss04323794_m1), ACTA2 (Ss042415) को सबै नमूना घरको सामान्य मानहरू e GAPDH।
NT-ProBNP को मिडिया रिलीजलाई निर्माताको प्रोटोकल अनुसार NT-ProBNP किट (पिग) (बिरालो नम्बर MBS2086979, MyBioSource) प्रयोग गरेर मूल्याङ्कन गरिएको थियो।छोटकरीमा, प्रत्येक नमूना र मानकको 250 μl प्रत्येक इनारमा डुप्लिकेटमा थपिएको थियो।नमूना थपेपछि तुरुन्तै प्रत्येक इनारमा ५० μl Assay Reagent A थप्नुहोस्।बिस्तारै प्लेट हल्लाउनुहोस् र सीलेन्टको साथ सील गर्नुहोस्।त्यसपछि ट्याब्लेटहरू 1 घण्टाको लागि 37 डिग्री सेल्सियसमा इन्क्युबेटेड गरियो।त्यसपछि घोललाई एस्पिरेट गर्नुहोस् र 350 μl 1X वाश सोल्युसनले 4 पटक कुवाहरू धुनुहोस्, प्रत्येक पटक 1-2 मिनेटको लागि धुने घोललाई इन्क्युब्याट गर्नुहोस्।त्यसपछि प्रति राम्रोसँग १०० μl Assay Reagent B थप्नुहोस् र प्लेट सीलेन्टको साथ सील गर्नुहोस्।ट्याब्लेट बिस्तारै हल्लियो र 37 डिग्री सेल्सियसमा 30 मिनेटको लागि इन्क्युबेटेड।घोललाई एस्पिरेट गर्नुहोस् र 350 μl 1X वाश सोल्युसनले 5 पटक कुवाहरू धुनुहोस्।प्रत्येक इनारमा ९० μl सब्सट्रेट समाधान थप्नुहोस् र प्लेटलाई बन्द गर्नुहोस्।प्लेटलाई 37 डिग्री सेल्सियसमा 10-20 मिनेटको लागि इनक्यूब गर्नुहोस्।प्रत्येक कुवामा ५० μl स्टप समाधान थप्नुहोस्।प्लेट तुरुन्तै 450 nm मा Cytation (BioTek) प्लेट रिडर सेट प्रयोग गरेर मापन गरियो।
पावर विश्लेषणहरू समूह आकारहरू छनौट गर्न प्रदर्शन गरिएको थियो जसले 5% प्रकार I त्रुटि दरको साथ प्यारामिटरमा 10% निरपेक्ष परिवर्तन पत्ता लगाउन > 80% पावर प्रदान गर्दछ। पावर विश्लेषणहरू समूह आकारहरू छनौट गर्न प्रदर्शन गरिएको थियो जसले 5% प्रकार I त्रुटि दरको साथ प्यारामिटरमा 10% निरपेक्ष परिवर्तन पत्ता लगाउन > 80% पावर प्रदान गर्दछ। Анализ мощности был выполнен для выбора размеров групп, которые обеспечат >80% мощности для обнаружения 10% абнаружения 5% частотой ошибок TIPA I. पावर विश्लेषण समूह आकारहरू चयन गर्न प्रदर्शन गरिएको थियो जसले 5% प्रकार I त्रुटि दरको साथ 10% निरपेक्ष प्यारामिटर परिवर्तन पत्ता लगाउन > 80% पावर प्रदान गर्दछ।进行功效分析以选择将提供>80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％I将枯变化和5％将提供.进行功效分析以选择将提供>80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％I将枯变化和5％将提供. Был проведен анализ мощности для выбора размера группы, который обеспечил бы > ८०% мощности для обнаружения 10% ETROV र 5% частоты ошибок TIPA I। एक पावर विश्लेषण समूह आकार चयन गर्न प्रदर्शन गरिएको थियो जसले 10% निरपेक्ष प्यारामिटर परिवर्तन र 5% प्रकार I त्रुटि दर पत्ता लगाउन > 80% पावर प्रदान गर्दछ।टिस्यु खण्डहरू प्रयोग अघि अनियमित रूपमा चयन गरिएको थियो।सबै विश्लेषणहरू अवस्था अन्धा थिए र सबै डेटा विश्लेषण गरिसकेपछि मात्र नमूनाहरू डिकोड गरिएको थियो।ग्राफप्याड प्रिज्म सफ्टवेयर (सान डिएगो, CA) सबै सांख्यिकीय विश्लेषणहरू प्रदर्शन गर्न प्रयोग गरिएको थियो। सबै तथ्याङ्कहरूको लागि, p-मानहरूलाई मान <0.05 मा महत्त्वपूर्ण मानिन्थ्यो। सबै तथ्याङ्कहरूका लागि, p-मानहरूलाई मानहरू <0.05 मा महत्त्वपूर्ण मानिन्थ्यो। Для всей статистики p-значения считались значимыmi pri значениях <0,05। सबै तथ्याङ्कहरूका लागि, p-मानहरूलाई मानहरू <0.05 मा महत्त्वपूर्ण मानिन्थ्यो।对于所有统计数据,p 值在值<0.05 时被认为是显着的।对于所有统计数据,p 值在值<0.05 时被认为是显着的। Для всей статистики p-значения считались значимыmi pri значениях <0,05। सबै तथ्याङ्कहरूका लागि, p-मानहरूलाई मानहरू <0.05 मा महत्त्वपूर्ण मानिन्थ्यो।दुई-पुच्छे विद्यार्थीको टी-टेस्ट डाटामा मात्र 2 तुलनाहरूको साथ प्रदर्शन गरिएको थियो।एक-तर्फी वा दुई-तर्फी ANOVA बहु समूहहरू बीचको महत्त्व निर्धारण गर्न प्रयोग गरिएको थियो।पोस्ट हक परीक्षणहरू प्रदर्शन गर्दा, Tukey को सुधार धेरै तुलनाहरूको लागि खातामा लागू गरियो।FDR र p.adjust गणना गर्दा RNAsec डेटामा विधिहरू खण्डमा वर्णन गरिएको विशेष सांख्यिकीय विचारहरू छन्।
अध्ययन डिजाइनको बारेमा थप जानकारीको लागि, यस लेखमा लिङ्क गरिएको प्रकृति अनुसन्धान रिपोर्ट सार हेर्नुहोस्।