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E manaʻomia se faiga faʻatuatuaina i totonu o le vitro e mafai ona toe gaosia ma le saʻo le siosiomaga faʻaletino o le fatu mo suʻega fualaau faʻasaina. O le le lava o le maua o faiga faʻatoʻaga fatu o le tagata ua iʻu ai i le le saʻo o faʻamatalaga o aʻafiaga o fualaau faʻasaina o le fatu. O iinei, ua matou atiaʻe ai se faʻataʻitaʻiga o le faʻatoʻaga fatu (CTCM) lea e faʻaosofia ai le electromechanical slices o le fatu ma faia ai le physiological strength i le taimi o le systolic ma le diastolic phases o le cardiac cycle. Ina ua mavae aso e 12 o le faʻatoʻaga, o lenei auala na faʻaleleia atili ai le ola o vaega o le fatu, ae leʻi faʻasaoina atoatoa lo latou tulaga mautu. O le mea lea, ina ua maeʻa le suʻesuʻega o mole mole laiti, na matou iloa ai o le faʻaopoopoina o le 100 nM triiodothyronine (T3) ma le 1 μM dexamethasone (Dex) i la matou vailaʻau na tausia ai le microstructure o vaega mo le 12 aso. Faʻatasi ai ma le togafitiga T3/Dex, na tausia e le faiga CTCM ia faʻamatalaga faʻaliliu, ola, gaioiga metabolic, ma le tulaga mautu o le fausaga i le tulaga tutusa ma le fatu fou mo le 12 aso. E le gata i lea, o le tele o le faʻaloaloa o le fatu i le faʻatoʻaga e mafua ai le hypertrophic cardiac signaling, ma maua ai faʻamaoniga mo le mafai e le CTCM ona faʻataʻitaʻi tulaga hypertrophic na mafua mai i le cardiac strength. I le faaiuga, e mafai e le CTCM ona faʻataʻitaʻi le physiology ma le pathophysiology o le fatu i se aganuu i se taimi umi, ma mafai ai ona faia se suʻesuʻega faʻatuatuaina o fualaau faasaina.
A o le’i faia su’esu’ega fa’aklinikal, e mana’omia ni faiga fa’atuatuaina i totonu o le vitro e mafai ona toe gaosia ma le sa’o le siosiomaga fa’aletino o le fatu o le tagata. O ia faiga e tatau ona fa’ata’ita’i i le suia o le fa’aloaloa fa’amekanika, le tata o le fatu, ma meatotino eletise. O fa’ata’ita’iga o manu e masani ona fa’aaogaina o se fa’avae su’esu’e mo le physiology o le fatu ma le fa’atuatuaina fa’atapula’aina i le atagia mai o a’afiaga o vaila’au i le fatu o le tagata1,2. I le iuga, o le Ideal Cardiac Tissue Culture Experimental Model (CTCM) o se fa’ata’ita’iga e matua’i maaleale ma fa’apitoa mo le tele o togafitiga fa’afoma’i ma vaila’au, e toe gaosia ma le sa’o ai le physiology ma le pathophysiology o le fatu o le tagata3. O le leai o se faiga fa’apea e fa’atapula’aina ai le mauaina o togafitiga fou mo le fa’aletonu o le fatu4,5 ma ua mafua ai ona afaina ai le fatu o vaila’au o se mafua’aga autu mo le alu ese mai le maketi6.
I le sefulu tausaga ua tuanaʻi, e valu vailaʻau e lē mo le fatu ua aveesea mai le faʻaaogaina faafomaʻi ona e mafua ai le faʻalauteleina o le QT interval e oʻo atu ai i le ventricular arrhythmias ma le oti faʻafuaseʻi7. O le mea lea, o loʻo i ai se manaʻoga faʻateleina mo ni fuafuaga faʻamaonia mo le suʻesuʻeina muamua o le falemaʻi e iloilo ai le aoga ma le oona o le fatu. O le faʻaaogaina talu ai nei o human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPS-CM) i le suʻesuʻeina o vailaʻau ma suʻega oona ua maua ai se fofo faʻapitoa i lenei faʻafitauli. Peitaʻi, o le natura e leʻi matua o hiPS-CM ma le leai o se lavelave tele o le fatu o ni faʻatapulaʻaga tetele ia o lenei metotia. Ua faʻaalia e suʻesuʻega talu ai nei e mafai ona faʻatoʻilaloina lenei faʻatapulaʻaga e ala i le faʻaaogaina o le hiPS-CM vave e fausia ai ni hydrogels o le fatu i se taimi puʻupuʻu talu ona amata le faʻalavelave faʻafuaseʻi ma le faʻateleina malie o le faʻamalosia o le eletise i le aluga o taimi. Peitaʻi, o nei hiPS-CM microtissues e leai ni meatotino matua o le electrophysiological ma le contractile o le myocardium matua. E le gata i lea, o le fatu o le tagata e sili atu ona lavelave lona fausaga, e aofia ai se faʻafefiloi eseese o ituaiga sela eseese, e aofia ai sela endothelial, neurons, ma stromal fibroblasts, e fesoʻotaʻi e seti faʻapitoa o extracellular matrix proteins. O lenei eseesega o tagata e lē o ni cardiomyocyte11,12,13 i totonu o le fatu o manu matutua o se faʻalavelave tele lea i le faʻataʻitaʻiina o aʻano o le fatu e faʻaaoga ai ituaiga sela taʻitasi. O nei tapulaʻa tetele e faʻamamafa ai le taua o le atinaʻeina o metotia mo le faʻaleleia atili o aʻano o le myocardial i lalo o tulaga faʻaletino ma faʻamaʻi.
O vaega manifinifi (300 µm) o le fatu o le tagata ua fa'amaonia o se fa'ata'ita'iga lelei o le myocardium o le tagata e le'i fa'aleagaina. O lenei metotia e maua ai le avanoa i se faiga atoa e 3D multicellular e tutusa ma le aano o le fatu o le tagata. Peita'i, se'ia o'o i le 2019, o le fa'aaogaina o vaega o le fatu ua fa'aleleia sa fa'atapula'aina e le pu'upu'u (24 itula) o le ola o le fa'aleleia. O lenei mea e mafua mai i le tele o mea e aofia ai le leai o se fa'aloaloa fa'aletino-fa'amekanika, le feso'ota'iga o le ea-vai, ma le fa'aaogaina o ala fa'asalalau faigofie e le lagolagoina mana'oga o aano o le fatu. I le 2019, na fa'aalia ai e le tele o vaega su'esu'e o le fa'apipi'iina o mea fa'amekanika i totonu o faiga fa'aleleia o aano o le fatu e mafai ona fa'alauteleina le ola o le fa'aleleia, fa'aleleia atili ai le fa'aalia o le fatu, ma fa'ata'ita'i ai le pathology o le fatu. E lua su'esu'ega matagofie 17 ma le 18 o lo'o fa'aalia ai o le utaina fa'amekanika uniaxial e iai sona a'afiaga lelei i le phenotype o le fatu i le taimi o le fa'aleleia. Peita'i, o nei su'esu'ega e le'i fa'aaogaina le utaina fa'amekanika-tolu-dimensional o le ta'amilosaga o le fatu, talu ai o vaega o le fatu na utaina i malosiaga tensile isometric 17 po'o le utaina linear auxotonic 18. O nei metotia o le fa'aloaloa o a'ano na i'u ai i le taofiofia o le tele o kene fatu po'o le so'ona fa'aalia o kene e feso'ota'i ma tali fa'aloaloa e le masani ai. E taua tele, o Pitoulis et al. 19 na atia'e se ta'ele fa'atupuina o le fatu mo le toe fausiaina o le ta'amilosaga o le fatu e fa'aaoga ai le fa'amatalaga o le malosi o le transducer ma le fa'amalosia o le tension drives. E ui o lenei faiga e mafai ai ona sili atu le sa'o o le fa'ata'ita'iga o le ta'amilosaga o le fatu i totonu o le vitro, o le faigata ma le maualalo o le throughput o le metotia e fa'atapula'aina ai le fa'aogaina o lenei faiga. Talu ai nei na atia'e ai e la matou fale su'esu'e se faiga fa'atupuina faigofie e fa'aaoga ai le fa'aosofiaga eletise ma se auala fa'alelei e fa'atumauina ai le ola o vaega o le fatu pua'a ma le fatu o le tagata mo le 6 aso20,21.
I le tusitusiga o loʻo iai nei, matou te faʻamatalaina ai se faʻataʻitaʻiga o le totoina o aʻano o le fatu (CTCM) e faʻaaoga ai vaega o le fatu puaʻa e aofia ai faʻailoilo humoral e toe faʻafoʻi mai ai le physiology o le fatu e tolu-vaega ma le pathophysiological distension i le taimi o le taʻamilosaga o le fatu. E mafai e lenei CTCM ona faʻateleina le saʻo o le vavaloina o vailaʻau aʻo leʻi faʻataʻitaʻiina i se tulaga e leʻi ausia muamua e ala i le tuʻuina atu o se faiga taugofie, mid-throughput cardiac e faʻataʻitaʻi ai le physiology/pathophysiology o le fatu mammalian mo suʻega vailaʻau aʻo leʻi faʻataʻitaʻiina.
O fa'ailoilo fa'amekanika hemodynamic e taua tele i le fa'atumauina o le galuega a le cardiomyocyte i totonu o le vitro 22,23,24. I le tusitusiga o lo'o iai nei, ua matou atia'e se CTCM (Ata 1a) e mafai ona fa'ata'ita'i le siosiomaga o le fatu o tagata matutua e ala i le fa'aosofiaina o le fa'aosofiaina o le eletise ma le fa'amekanika i taimi masani fa'aletino (1.2 Hz, 72 ta i le minute). Ina ia 'alofia le so'ona fa'aloaloa o a'ano i le taimi o le diastole, na fa'aaogaina ai se masini lolomi 3D e fa'ateleina ai le tele o a'ano i le 25% (Ata 1b). O le saoasaoa eletise na fa'aosofia e le faiga C-PACE na fa'atulagaina e amata i le 100 ms a'o le'i o'o i le systole e fa'aaoga ai se faiga e maua ai fa'amatalaga e toe gaosia atoatoa ai le ta'amilosaga o le fatu. O le faiga o le totoina o a'ano e fa'aaoga ai se pneumatic actuator e mafai ona fa'apolokalameina (LB Engineering, Siamani) e fa'alautele ai se membrane silicone fetuutuunai e mafua ai le fa'alauteleina o fasi fatu i le potu pito i luga. O le faiga na fa'afeso'ota'i i se laina ea i fafo e ala i se transducer mamafa, lea na mafai ai ona fetu'una'i sa'o le mamafa (± 1 mmHg) ma le taimi (± 1 ms) (Ata 1c).
a Fa'apipi'i le vaega o le aano i le mama lagolago e 7 mm, o lo'o fa'aalia i le lanumoana, i totonu o le potu fa'ato'aga o le masini. O le potu fa'ato'aga e vavae'ese mai le potu ea e ala i se membrane silicone manifinifi ma fetuutuunai. Tu'u se gasket i le va o potu ta'itasi e puipuia ai mai le tafe. O le tapuni o le masini o lo'o i ai ni electrodes graphite e maua ai le fa'aosofiaina o le eletise. b Fa'atusa fa'ata'ita'iga o le masini tele o le aano, mama ta'iala ma le mama lagolago. O vaega o le aano (enaena) e tu'u i luga o le masini tele fa'atasi ai ma le mama ta'iala e tu'u i totonu o le ala i le pito i fafo o le masini. Fa'aaoga le ta'iala, tu'u ma le fa'aeteete le mama lagolago ua ufiufi i le kelu acrylic aano i luga o le vaega o le aano o le fatu. c Kalafi o lo'o fa'aalia ai le taimi o le fa'aosofiaina o le eletise e pei o se galuega tauave o le mamafa o le potu ea e pulea e se programmable pneumatic actuator (PPD). Sa fa'aaogaina se masini e maua ai fa'amatalaga e fa'afetaui ai le fa'aosofiaina o le eletise e fa'aaoga ai masini fa'alogo o le mamafa. A o'o atu le mamafa i totonu o le potu fa'ato'aga i le tulaga fa'atulagaina, e auina atu se fa'ailo o le pulse i le C-PACE-EM e fa'aosofia ai le fa'aosofiaina o le eletise. d Ata o CTCM e fa ua tu'u i luga o se fata incubator. E fa masini e feso'ota'i i le tasi PPD e ala i se matagaluega pneumatic, ma e fa'apipi'i masini e iloa ai le mamafa i totonu o le hemostatic valve e mata'ituina ai le mamafa i le matagaluega pneumatic. O masini ta'itasi e aofia ai vaega e ono o aano o le tino.
I le fa'aaogaina o se pneumatic actuator e tasi, na mafai ai ona matou pulea masini CTCM e 4, e mafai ona uuina vaega e 6 o le tino i masini ta'itasi (Ata 1d). I le CTCM, o le mamafa o le ea i totonu o le potu ea e liua i le mamafa fa'atasi i totonu o le potu vai ma fa'aosofia ai le fa'alauteleina fa'aletino o le fasi fatu (Ata 2a ma le Ata Fa'aopoopo 1). Iloiloga o le fa'aloaloa o le tino i le 80 mm Hg. O le Art. na fa'aalia ai le fa'aloaloa o vaega o le tino i le 25% (Ata 2b). O lenei pasene fa'aloaloa ua fa'aalia e fetaui ma le umi o le sarcomere fa'aletino o le 2.2–2.3 µm mo le fa'amalosi masani o le vaega o le fatu17,19,25. Na iloiloina le gaioiga o le tino e fa'aaoga ai fa'atulagaga o le meapueata fa'apitoa (Ata Fa'aopoopo 1). O le malosi ma le saoasaoa o le gaioiga o le tino (Ata 2c, d) e fetaui ma le fa'aloaloa i le taimi o le ta'amilosaga o le fatu ma le taimi i le taimi o le systole ma le diastole (Ata 2b). O le fa'aloaloa ma le saoasaoa o le tino o le fatu i le taimi o le fa'aitiitia ma le malolo na tumau pea mo le 12 aso i le aganu'u (Ata 2f). Ina ia iloilo le aafiaga o le fa'aosofiaga eletise i le fa'apupulaina o le fatu i le taimi o le totoina, na matou atia'e ai se metotia mo le fuafuaina o le fa'aletonu o le tino e fa'aaoga ai se algorithm o le fa'amalamalama (Fa'aopoopoga Ata 2a,b) ma sa mafai ona matou iloa le eseesega i le va o fa'aletonu e iai ma e leai se fa'aosofiaga eletise. O le vaega lava lea e tasi o le fatu (Ata 2f). I le vaega e mafai ona gaoioi o le tipi (R6-9), o le voltage i le taimi o le fa'aosofiaga eletise e 20% maualuga atu nai lo le leai o se fa'aosofiaga eletise, lea e fa'aalia ai le sao o le fa'aosofiaga eletise i le galuega fa'apupulaina.
O fa'ailoga fa'atusa o le mamafa o le potu ea, le mamafa o le potu vai, ma fua o le gaioiga o a'ano e fa'amaonia ai o le mamafa o le potu e suia ai le mamafa o le potu vai, ma mafua ai ona gaoioi tutusa le fasi a'ano. b Fa'ailoga fa'atusa o le pasene o le fa'aloaloa (lanumoana) o vaega o a'ano e fetaui ma le pasene o le fa'aloaloa (lanumoana). c O le gaioiga fuaina o le fasi fatu e ogatasi ma le saoasaoa o le gaioiga fuaina. (d) Ala fa'atusa o le gaioiga fa'ata'amilosaga (laina lanumoana) ma le saoasaoa (laina moli togitogi) i se fasi o le fatu. e Fuafuaina o le taimi o le ta'amilosaga (n = 19 fasi i le vaega, mai pua'a eseese), taimi e fa'aitiitia ai (n = 19 fasi i le vaega), taimi e malolo ai (n = 19 fasi i le vaega, mai pua'a eseese), gaioiga o a'ano (n = 25 ). fasi)/vaega mai pua'a eseese), saoasaoa maualuga o le systolic (n = 24(D0), 25(D12) fasi/vaega mai pua'a eseese) ma le fua fa'atatau o le malolo maualuga (n=24(D0), 25(D12) fasi/vaega mai pua'a eseese). O le t-test a le Two-tailed Student e le'i fa'aalia ai se eseesega taua i so'o se parakalafa. f O fa'ailoga o le au'ili'iliga o le fa'alavelave fa'atusa o vaega o a'ano ma le fa'aosofiaga eletise (mumu) ma le leai o se fa'aosofiaga eletise (lanumoana), e sefulu vaega fa'aitulagi o vaega o a'ano mai le vaega lava e tasi. O paneli pito i lalo o lo'o fa'aalia ai le fuaina o le pasene o le eseesega i le fa'alavelave i vaega o a'ano ma le leai o se fa'aosofiaga eletise i vaega e sefulu mai vaega eseese. (n = 8 fasi/vaega mai puaa eseese, ua faia le suega-t a le Two-tailed Student; ****p < 0.0001, **p < 0.01, *p < 0.05). (n = 8 fasi/vaega mai puaa eseese, ua faia le suega-t a le Two-tailed Student; ****p < 0.0001, **p < 0.01, *p < 0.05). (n = 8 срезов/группу от разных свиней, проводится двусторонний t-критерий Стьюдента; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05). (n = 8 vaega/vaega mai puaa eseese, suega-t a le Tamaititi A'oga e lua-si'usi'u; ****p<0.0001, **p<0.01, *p<0.05). （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p < 0.0001，**p < 0.01，*p < 0.05）。 （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p < 0.0001，**p < 0.01，*p < 0.05）。 (n = 8 срезов/группу, от разных свиней, двусторонний критерий Стьюдента; ****p <0,0001, **p <0,01, *p <0,05). (n = 8 vaega/vaega, mai puaa eseese, suega-t a le Tamaititi A'oga e lua-si'usi'u; ****p<0.0001, **p<0.01, *p<0.05).O pa sese e faʻatusalia ai le averesi ± le eseesega masani.
I la matou faiga fa'atupu fatu biomimetic static muamua [20, 21], na matou tausia le ola, galuega, ma le tulaga lelei o le fausaga o fasi fatu mo le 6 aso e ala i le fa'aogaina o le fa'aosofiaga eletise ma le fa'aleleia atili o le tu'ufa'atasiga o le medium. Peita'i, ina ua mavae aso e 10, na matua'i pa'u'ū lava nei fuainumera. O le a matou fa'asino i vaega na totoina i la matou faiga fa'atupu fatu biomimetic static muamua 20, 21 tulaga pulea (Ctrl) ma o le a matou fa'aogaina la matou medium na fa'aleleia muamua e pei o tulaga MC ma le fa'atupuina i lalo o le fa'aosofiaga fa'amekanika ma le eletise fa'atasi (CTCM). ua ta'ua . Muamua, na matou fuafuaina o le fa'aosofiaga fa'amekanika e aunoa ma le fa'aosofiaga eletise e le lava e fa'atumauina ai le ola o a'ano mo le 6 aso (Ata Fa'aopoopo 3a,b). O le mea e malie ai, fa'atasi ai ma le fa'alauiloaina o le fa'aosofiaga fa'a-fisio-mekanika ma le eletise e fa'aaoga ai le STCM, o le ola o vaega o le fatu i le 12 aso na tumau pea e pei o vaega fou o le fatu i lalo o tulaga MS, ae le o lalo o tulaga Ctrl, e pei ona fa'aalia e le au'ili'iliga MTT (Ata 1). 3a). O lenei mea e fa'ailoa mai ai o le fa'aosofiaga fa'amekanika ma le fa'ata'ita'iga o le ta'amilosaga o le fatu e mafai ona fa'atumauina ai vaega o a'ano mo le fa'aluaina o le umi e pei ona lipotia mai i la matou faiga fa'atupu fatu static muamua. Peita’i, o le iloiloga o le tulaga mautu o vaega o a’ano e ala i le fa’ailogaina o le fatu o le troponin T ma le connexin 43 na fa’aalia ai o le fa’aalia o le connexin 43 sa matua maualuga atu i a’ano o le MC i le aso 12 nai lo vaega fa’atonutonu i le aso lava lea. Peita’i, o le fa’aalia tutusa o le connexin 43 ma le fausiaina o le Z-disc e le’i fa’atumauina atoatoa (Ata 3b). Matou te fa’aaogaina se fa’avae o le atamai fa’apitoa (AI) e fa’atatau ai le tulaga mautu o a’ano26, o se paipa a’oa’oga loloto e fa’avae i luga o ata e fa’avae i luga o le troponin-T ma le valivali connexin43 e fa’atatau otometi ai le tulaga mautu o le fausaga ma le fluorescence o fasi fatu e tusa ai ma le malosi o le localization. O lenei metotia e fa’aaogaina ai se Convolutional Neural Network (CNN) ma se fa’avae a’oa’oga loloto e fa’atatau fa’atuatuaina ai le tulaga mautu o a’ano o le fatu i se auala otometi ma le le fa’aitu’au, e pei ona fa’amatalaina i le fa’asinomaga. 26. O a’ano o le MC na fa’aalia ai le tutusa lelei o le fausaga i le aso 0 pe a fa’atusatusa i vaega fa’atonutonu tumau. E le gata i lea, o le valivali trichrome a Masson na fa’aalia ai se pasene maualalo tele o fibrosis i lalo o tulaga MS pe a fa’atusatusa i tulaga fa’atonutonu i le aso 12 o le totoina (Ata 3c). E ui ina faʻateleina e le CTCM le malosi o vaega o le fatu i le aso 12 i se tulaga e tutusa ma le aano fou o le fatu, ae e leʻi faʻaleleia atili ai le tulaga mautu o le fausaga o vaega o le fatu.
O lo'o fa'aalia i le kalafi Pa le fa'atusatusaga o le olaola o le MTT o fasi fatu fou (D0) po'o le fa'ato'aga o fasi fatu mo le 12 aso i totonu o le fa'ato'aga tumau (D12 Ctrl) po'o le CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) fasi/vaega mai pua'a eseese, e faia le suega ANOVA e tasi le auala; ####p < 0.0001 fa'atusatusa i le D0 ma **p < 0.01 fa'atusatusa i le D12 Ctrl). O lo'o fa'aalia i se kalafi pa le fa'atusatusaga o le olaola o le MTT o fasi fatu fou (D0) po'o le fa'ato'aga o fasi fatu mo le 12 aso i totonu o le fa'ato'aga tumau (D12 Ctrl) po'o le CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) fasi/vaega mai pua'a eseese, e faia le suega ANOVA e tasi le auala; ####p < 0.0001 fa'atusatusa i le D0 ma **p < 0.01 fa'atusatusa i le D12 Ctrl).O le histogram o loʻo faʻaalia ai le fuaina o le olaola o vaega fou o le fatu MTT (D0) poʻo le faʻatoʻaga o vaega o le fatu mo le 12 aso i le faʻatoʻaga tumau (pulea D12) poʻo le CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (pulea D12). ) ), 12 (D12 MC) vaega/vaega mai puaa eseese, e faia se suega ANOVA e tasi le itu;####p < 0,0001 по сравнению с D0 и **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p < 0.0001 pe a fa'atusatusa i le D0 ma **p < 0.01 pe a fa'atusatusa i le D12 Ctrl). a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切)片(D0)片或心脏切片培养12 天的MTT 活力的量化)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单后行单后从相比，####p < 0.0001，与D12 Ctrl 相比，**p <0.01). a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切)片(D0)片，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；与D0 相比，####p < 0.0001，与D12 Ctrl).o le histogram o lo'o fa'aalia ai le fuaina o le ola o le MTT i vaega fou o le fatu (D0) po'o vaega o le fatu na totoina mo le 12 aso i le totoina tumau (pulea D12) po'o le CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (pulea D12)), 12 (D12 MC) vaega/vaega mai pua'a eseese, suega ANOVA e tasi le itu;####p < 0,0001 по сравнению с D0, **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p < 0.0001 pe a fa'atusatusa i le D0, **p < 0.01 pe a fa'atusatusa i le D12 Ctrl).b Troponin-T (lanumeamata), connexin 43 (mumu) ma le DAPI (lanumoana) i vaega o le fatu fou ua vavae ese (D0) po'o vaega o le fatu ua totoina i lalo o tulaga tumau (Ctrl) po'o tulaga CTCM (MC) mo le 12 aso) o ata fa'atusa o le immunofluorescence (fuafuaga gaogao = 100 µm). O le fuaina o le atamai fa'apitoa o le tulaga mautu o le fausaga o le fatu (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) fasi/vaega ta'itasi mai pua'a eseese, e faia le suega ANOVA e tasi le itu; ####p < 0.0001 pe a fa'atusatusa i le D0 ma le ****p < 0.0001 pe a fa'atusatusa i le D12 Ctrl). Fa'atatauga o le atamai fa'apitoa o le fa'amautuina o le fausaga o le fatu (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) fasi/vaega ta'itasi mai pua'a eseese, fa'atinoina le suega ANOVA e tasi le itu; ####p < 0.0001 fa'atusatusa i le D0 ma le ****p < 0.0001 fa'atusatusa i le D12 Ctrl). Количественная оценка структурной целостности сердечной тпкани искусственным интеллектом (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl/D12), . от разных свиней, проводится однофакторный тест ANOVA ####p < 0,0001 по сравнению с D0 и ****p < 0,0001 по сравнению Fuafuaina o le tulaga mautu o le fausaga o le fatu e ala i le atamai fa'apitoa (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) vaega/vaega mai pua'a eseese, suega ANOVA e tasi le itu na faia; ####p < 0.0001 fa'atusatusa i le D0 ma le ****p < 0.0001 fa'atusatusa i le D12 Ctrl).人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) fasi/vaega puaa eseese taitasi, su'ega ANOVA tasi itu;####p01 相0.****p01 ， 0.****p01 相0. < 0.0001 与D12 Ctrl 相比）.人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) fasi/vaega puaa eseese ta'itasi, su'ega ANOVA tasi itu;##000 < 盯他.##000 < 0.****p < 0.****p. < 0.0001 与D12 Ctrl 相比）. Искусственный интеллект для количественной оценки структурной целостности сердечной ткани (n = 7 (D0), 7 (D0), 7 (D12) Ctrl (D12) срезов/группу каждой из разных свиней, односторонний тест ANOVA ####p <0,0001 vs. D0 Для сравнения ****p < 0,0001 по сравню ). Atamai fa'apitoa e fua ai le tulaga mautu o le fatu (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) vaega/vaega ta'itasi o pua'a eseese, suega ANOVA e tasi le itu; ####p<0.0001 vs .D0 Mo le fa'atusatusaga ****p < 0.0001 fa'atusatusa i le D12 Ctrl). c Ata fa'atusa (agavale) ma le fa'atusatusaga (taumatau) mo fasi fatu ua valiina i le vali Masson's trichrome (Scale bare = 500 µm) (n = 10 fasi/vaega ta'itasi mai pua'a eseese, ua faia le suega ANOVA e tasi le itu; ####p < 0.0001 fa'atusatusa i le D0 ma le ***p < 0.001 fa'atusatusa i le D12 Ctrl). c Ata fa'atusa (agavale) ma le fa'atusatusaga (taumatau) mo fasi fatu ua valiina i le vali Masson's trichrome (Scale bare = 500 µm) (n = 10 fasi/vaega ta'itasi mai pua'a eseese, ua faia le suega ANOVA e tasi le itu; #### p < 0.0001 fa'atusatusa i le D0 ma le ***p < 0.001 fa'atusatusa i le D12 Ctrl). c Репрезентативные изображения (слева) ma количественная оценка (справа) срезов сердца, окрашенных трихромным краснамлате без покрытия = 500 мкм) (n = 10 срезов/группу от разных свиней, выполняется односторонний тест ANOVA; #### p < 0,00001 видео 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Ata fa'atusa (agavale) ma le fa'atusatusaga (taumatau) o vaega o le fatu ua valiina i le vali Masson's trichrome (fua e le'i valiina = 500 µm) (n = 10 vaega/vaega mai pua'a eseese, su'ega ANOVA e tasi le itu na faia; #### p < 0 .0001 fa'atusatusa i le D0 ma le ***p < 0.001 fa'atusatusa i le D12 Ctrl). c 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像（左）和量化（右）（裸尺度（裸尺度（裸尺度（ 0n0 度= 1个切片/组，每组来自不同的猪，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0.0001 与D0 相比，***p <0.0012 C 。 C 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 （左 左） 量化 （右） 裸尺度 裸尺度 裸尺度裸尺度 = 500 µm） （n = 10 个 切片 组 每 组 来自 不同 猪 ， 进行 单向 单向0.##0.与D0 相比，***p < 0.001 与D12 Ctrl 相比）. c Репрезентативные изображения (слева) ma количественный анализ (справа) срезов сердца, окрашенных трихромным красителка = 500 мкм) (n = 10 срезов/группа, каждый от другой свиньи, протестировано с помощью однофакторного дисперси <###; 0,0001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Ata fa'atusa (agavale) ma le aofa'i (taumatau) o vaega o le fatu ua valiina i le vali Masson's trichrome (avanoa = 500 µm) (n = 10 vaega/vaega, ta'itasi mai se pua'a eseese, fa'ata'ita'iina e ala i le au'ili'iliga o le eseesega i le itu e tasi;### # p < 0.0001 fa'atusatusa i le D0, ***p < 0.001 fa'atusatusa i le D12 Ctrl).O pa sese e faʻatusalia ai le averesi ± le eseesega masani.
Matou te manatu o le faaopoopoina o ni molelaiti laiti i le auala e totoina ai fatu, e mafai ona faaleleia atili ai le tulaga mautu o le cardiomyocyte ma faaitiitia ai le atinaeina o le fibrosis i le taimi o le totoina o fatu i le CTCM. O lea na matou suʻesuʻeina ai molelaiti laiti e faaaoga ai a matou aganuu pulea tumau20,21 ona o le itiiti o mea e fenumiai ai. O le Dexamethasone (Dex), triiodothyronine (T3), ma le SB431542 (SB) na filifilia mo lenei suʻesuʻega. O nei molelaiti laiti na faaaogaina muamua i aganuu hiPSC-CM e faatosina ai le matua o cardiomyocytes e ala i le faateleina o le umi o sarcomere, T-tubules, ma le saoasaoa o le conduction. E le gata i lea, o le Dex (o se glucocorticoid) ma le SB ua lauiloa e taofia ai le mumū29,30. O le mea lea, na matou tofotofoina pe o le aofia ai o le tasi po o se tuufaatasiga o nei molelaiti laiti o le a faaleleia atili ai le tulaga mautu o vaega o le fatu. Mo le suʻesuʻega muamua, o le fua o vailaau taitasi na filifilia e faavae i luga o le maualuga e masani ona faaaogaina i faataitaiga o le totoina o sela (1 μM Dex27, 100 nM T327, ma le 2.5 μM SB31). A maeʻa aso e 12 o le totoina, o le tuʻufaʻatasiga o le T3 ma le Dex na iʻu ai i le tulaga lelei atoatoa o le fausaga o le cardiomyocyte ma le itiiti ifo o le toe faʻafouina o le fibrous (Ata Faʻaopoopo 4 ma le 5). E le gata i lea, o le faʻaaogaina o le faaluaina pe faaluaina o nei tulaga o le T3 ma le Dex na maua ai ni aafiaga leaga pe a faʻatusatusa i tulaga masani (Ata Faʻaopoopo 6a,b).
A maeʻa le suʻesuʻega muamua, na matou faia se faʻatusatusaga ulu-i-ulu o tulaga faʻatoʻaga e 4 (Ata 4a): Ctrl: vaega o le fatu na totoina i la matou faʻatoʻaga tumau na faʻamatalaina muamua e faʻaaoga ai la matou auala faʻaleleia; 20.21 TD: T3 ma Ctrl s Faʻaopoopo Dex i le Aso Lulu; MC: vaega o le fatu na totoina i le CTCM e faʻaaoga ai la matou auala faʻaleleia muamua; ma MT: CTCM faʻatasi ai ma le T3 ma le Dex faʻaopoopo i le auala. A maeʻa aso e 12 o le totoina, o le olaola o aano o le MS ma le MT na tumau pea e pei o aano fou na iloiloina e le MTT assay (Ata 4b). O le mea e malie ai, o le faʻaopoopoina o le T3 ma le Dex i faʻatoʻaga transwell (TD) e leʻi iʻu ai i se faʻaleleia atili tele i le olaola pe a faʻatusatusa i tulaga Ctrl, e faʻaalia ai se matafaioi taua o le faʻaosofiaina faʻaletino i le tausia o le olaola o vaega o le fatu.
o se ata fa'ata'ita'i o le mamanu o lo'o fa'aalia ai tulaga e fa o le fa'ato'aga na fa'aaogaina e iloilo ai a'afiaga o le fa'aosofiaga fa'amekanika ma le fa'aopoopoga o le T3/Dex i luga o le vaila'au mo le 12 aso. b O le kalafi pa o loʻo faʻaalia ai le fuaina o le ola i le 12 aso talu ona totoina i tulaga uma e 4 o le totoina (Ctrl, TD, MC, ma le MT) pe a faʻatusatusa i fasi fatu fou (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD ma le D12 MT), 12 (D12 MC) fasi/vaega mai puaa eseese, ua faia le suega ANOVA e tasi le itu; ####p < 0.0001, ###p < 0.001 pe a faʻatusatusa i le D0 ma le **p < 0.01 pe a faʻatusatusa i le D12 Ctrl). b O le kalafi pa o loʻo faʻaalia ai le fuaina o le ola i le 12 aso talu ona totoina i tulaga uma e 4 o le totoina (Ctrl, TD, MC, ma le MT) pe a faʻatusatusa i fasi fatu fou (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD ma le D12 MT), 12 (D12 MC) fasi/vaega mai puaa eseese, ua faia le suega ANOVA e tasi le itu; ####p < 0.0001, ###p < 0.001 pe a faʻatusatusa i le D0 ma **p < 0.01 pe a faʻatusatusa i le D12 ctrl). b Fa'atonuga fa'apitoa mo le fa'atonuga o le fa'atonuga o le fa'atonuga o le fa'atonuga 12 mo le fa'atonuga o le fa'atonuga i le va'aiga o le 4 masina. (konetrona, TD, MC ma MT) fa'atasi ai ma сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD и D12 MT), 12)/D12 MT разных свиней, проводится односторонний тест ANOVA; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 по сравнению с D0 ma **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). b O le kalafi pa o loʻo faʻaalia ai le fuaina o le ola i le 12 aso talu ona faʻatoʻaga i tulaga uma e 4 o le faʻatoʻaga (pulea, TD, MC, ma le MT) pe a faʻatusatusa i vaega fou o le fatu (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD, ma le D12 MT), 12 (D12 MC) vaega/vaega mai puaa eseese, suega ANOVA e tasi le itu; ####p < 0.0001, ###p < 0.001 vs. D0 ma **p < 0.01 e faʻatusatusa i le D12 Ctrl). b 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) (n = 18 (Dl5) TD0和D12 MT)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；####p < 0.0001，###p < 0.001 ，p 0.001 ， 盎放0.与D12控制）.b 4 12 (D12 MC) e Гистограма, показывающая все 4 условия культивирования (контроль, TD, MC ma MT) po сравнению со свежими серди ца (8 DIRI) 15 (D12 Ctrl, D12 TD и D12 MT), от разных свиней 12 (D12 MC) срезы/группа, односторонний тест ANOVA ####p <0,0001, #0##p <0,0001, #0##p <0,0001, #0##p <0,0001, #0##p <0,0001, #0##p <0,0001, #0##p <0,0001, #0##p <0,0001, #0##p <0,0001, #0##p <0,0001, #0##p <0,0001, #0##p <0,0##p <0,0001, #0##p <0,0001, #0##p <0,0##p <0,01 по сравнению с tulafono D12). b Histogram o loʻo faʻaalia ai tulaga uma e 4 o le aganuʻu (pulea, TD, MC ma le MT) pe a faʻatusatusa i vaega fou o le fatu (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD ma le D12 MT), mai puaa eseese 12 (D12 MC) vaega/vaega, suega ANOVA e tasi le itu; ####p<0.0001, ###p<0.001 vs. D0, **p<0.01 vs. pulea D12). O le kalafi pa e faʻaalia ai le fuaina o le kulukose i le 12 aso talu ona faʻatoʻaga i tulaga uma e 4 o le faʻatoʻaga (Ctrl, TD, MC, ma le MT) pe a faʻatusatusa i fasi fatu fou (D0) (n = 6 fasi/vaega mai puaa eseese, faia le suega ANOVA e tasi le itu; ###p < 0.001, pe a faʻatusatusa i le D0 ma le ***p < 0.001 pe a faʻatusatusa i le D12 Ctrl). O le kalafi pa e faʻaalia ai le fuaina o le kulukose i le 12 aso talu ona faʻatoʻaga i tulaga uma e 4 o le faʻatoʻaga (Ctrl, TD, MC, ma le MT) pe a faʻatusatusa i fasi fatu fou (D0) (n = 6 fasi/vaega mai puaa eseese, faia le suega ANOVA e tasi le itu; ###p < 0.001, pe a faʻatusatusa i le D0 ma le ***p < 0.001 pe a faʻatusatusa i le D12 Ctrl). i Fa'atonuga fa'apitoa mo le fa'atonuga o le fa'atonuga o le fa'atonuga o le fa'atonuga o le fa'amalosaga 12 aso le fa'atonuga i le va o le 4 masina. (Konetron, TD, MC ma MT) e maua mai i le auaunaga i le lotoifale (D0) (n = 6 i le taimi o le pule a le malo mai le pule o le atunuu. ANOVA; ###p < 0,001 по сравнению с D0 ma ***p <0,001 по сравнению с D12 Ctrl). O le c Histogram o loʻo faʻaalia ai le fuaina o le glucose flux i le 12 aso talu ona faʻatoʻaga i lalo o tulaga uma e 4 o le faʻatoʻaga (pulea, TD, MC ma le MT) faʻatusatusa i vaega fou o le fatu (D0) (n = 6 vaega/vaega mai puaa eseese, o le suega ANOVA e tasi le itu na faia; ###p < 0.001 faʻatusatusa i le D0 ma le ***p < 0.001 faʻatusatusa i le D12 Ctrl). c 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) 相比，厹天的葡萄糖通量定量（n = 6 片/组，来自不同猪，单向执行ANOVA 测试；###p < 0.001 ，盎01 ，与D1 ，与D1与D12 Ctrl 相比）. C 条形图 显示 所有 4 种 条件 （（ctrl 、 td 、 mc 和 mt） 新鲜 心脏 切片 切片 切片培养 后 后 12 天 的 通量 定量 （n = 6 片/组 ， 来自 猪 ， ， ， ， ， ， ， 猪 猪单同行< 0.001，与D0 相比，***p < 0.001 与D12 Ctrl 相比）. c Гистограмама, показывающая количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после культивирования для всех для всех культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 6 срезов/группа, от разных сердца Были проведены тесты ANOVA ###p < 0,001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению с D12 (контроль). c Histogram o loʻo faʻaalia ai le fuaina o le glucose flux i le 12 aso talu ona faʻatoʻaga mo tulaga uma e 4 o le faʻatoʻaga (pulea, TD, MC, ma MT) faʻatusatusa i vaega fou o le fatu (D0) (n = 6 vaega/vaega, mai puaa eseese, i le itu e tasi. Sa faia ai suʻega ANOVA, ###p < 0.001 faʻatusatusa i le D0, ***p < 0.001 faʻatusatusa i le D12 (pulea).d Ata o le au'ili'iliga o le fa'ama'i o a'ano fou (lanumoana), aso 12 MC (lanumeamata), ma aso 12 MT (mumu) i vaega e sefulu o le vaega o a'ano (n = 4 fasi/vaega, suega ANOVA e tasi le itu; e leai se eseesega tele i le va o vaega). e Ata o le mauga mu o lo'o fa'aalia ai ni kene eseese o lo'o fa'aalia i vaega fou o le fatu (D0) pe a fa'atusatusa i vaega o le fatu na totoina i lalo o tulaga tumau (Ctrl) po'o lalo o tulaga MT (MT) mo le 10-12 aso. f Fa'afanua vevela o kene sarcomere mo vaega o le fatu na totoina i lalo o tulaga ta'itasi o le totoina. O pa sese e fa'atusalia ai le averesi ± tulaga fa'ata'ita'i.
O le faalagolago o le metabolism i le suiga mai le fatty acid oxidation i le glycolysis o se faailoga lea o le cardiomyocyte dedifferentiation. O cardiomyocyte e le'i matua e fa'aaogaina le glucose mo le gaosiga o le ATP ma e iai a latou mitochondria hypoplastic ma ni nai cristae5,32. O auiliiliga o le fa'aaogaina o le glucose na fa'aalia ai i lalo o tulaga MC ma MT, o le fa'aaogaina o le glucose e tutusa ma le fa'aaogaina o le glucose i le aso 0 (Ata 4c). Peita'i, o fa'ata'ita'iga Ctrl na fa'aalia ai se fa'aopoopoga tele i le fa'aaogaina o le glucose pe a fa'atusatusa i a'ano fou. O lo'o fa'aalia ai o le tu'ufa'atasiga o le CTCM ma le T3/Dex e fa'aleleia atili ai le ola o a'ano ma fa'asaoina le metabolic phenotype o vaega o le fatu ua totoina i le 12 aso. E le gata i lea, o le auiliiliga o le strain na fa'aalia ai o le maualuga o le strain na tumau pea e pei o a'ano fou o le fatu mo le 12 aso i lalo o tulaga MT ma MS (Ata 4d).
Ina ia iloiloina le aafiaga lautele o le CTCM ma le T3/Dex i le lalolagi atoa o le tusitusiga o le fatu, na matou faia ai le RNAseq i luga o fasi fatu mai tulaga eseese uma e fa o le totoina (Faʻamatalaga Faʻaopoopo 1). O le mea e malie ai, o vaega MT na faʻaalia ai le tutusa tele o le tusitusiga ma le fatu fou, ma na o le 16 na eseese le faʻaalia mai le 13,642 genes. Peitaʻi, e pei ona matou faʻaalia muamua, o fasi Ctrl na faʻaalia ai le 1229 genes eseese le faʻaalia ina ua mavae le 10–12 aso i le totoina (Ata 4e). O nei faʻamaumauga na faʻamaonia e le qRT-PCR o fatu ma fibroblast genes (Ata Faʻaopoopo 7a-c). O le mea e malie ai, o vaega Ctrl na faʻaalia ai le faʻaitiitia o genes o le fatu ma le taamilosaga o le sela ma le faʻagaoioia o polokalame o le mumū o genes. O nei faʻamaumauga e faʻaalia ai o le dedifferentiation, lea e masani ona tupu pe a uma le totoina mo se taimi umi, e matua faʻaitiitia lava i lalo o tulaga MT (Ata Faʻaopoopo 8a,b). O le suʻesuʻega ma le faʻaeteete o genes o sarcomere na faʻaalia ai e naʻo lalo o tulaga MT e faʻasaoina ai genes o loʻo faʻailoa ai le sarcomere (Ata 4f) ma le ion channel (Ata Faʻaopoopo 9), ma puipuia ai mai le taofiofia i lalo o tulaga Ctrl, TD, ma MC. O nei faʻamaumauga e faʻaalia ai faʻatasi ai ma le tuʻufaʻatasiga o le faʻaosofia faʻainisinia ma le humoral (T3/Dex), e mafai e le transcriptome o le fasi fatu ona tumau pea le tutusa ma fasi fatu fou pe a mavae aso e 12 i le totoina.
O nei fa'amaumauga fa'aliliuupu e lagolagoina e le mea moni e fa'apea, o le tulaga lelei o le fausaga o cardiomyocytes i vaega o le fatu e sili ona fa'asaoina i lalo o tulaga MT mo le 12 aso, e pei ona fa'aalia e le connexin 43 e le'i afaina ma fa'alotoifale (Ata 5a). E le gata i lea, o le fibrosis i vaega o le fatu i lalo o tulaga MT sa matua fa'aitiitia pe a fa'atusatusa i le Ctrl ma e tutusa ma vaega fou o le fatu (Ata 5b). O nei fa'amaumauga e fa'aalia ai o le tu'ufa'atasiga o le fa'aosofiaga fa'amekanika ma le togafitiga T3/Dex e fa'asaoina lelei ai le fausaga o le fatu i vaega o le fatu i le totoina.
o ata fa'atusa o le immunofluorescence o le troponin-T (lanumeamata), connexin 43 (mumu), ma le DAPI (lanumoana) i vaega o le fatu fou ua vavae'eseina (D0) pe fa'ato'aga mo le 12 aso i tulaga uma e fa o le fa'ato'aga o le vaega o le fatu (fua pa = 100 µm). ). O le fuaina o le atamai fa'apitoa o le tulaga mautu o le fausaga o le fatu (n = 7 (D0 ma le D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC ma le D12 MT) fasi/vaega mai pua'a eseese, e faia le suega ANOVA e tasi le itu; ####p < 0.0001 pe a fa'atusatusa i le D0 ma le *p < 0.05, po'o le ****p < 0.0001 pe a fa'atusatusa i le D12 Ctrl). Fa'atatauga o le atamai fa'apitoa o le fa'amautuina o le tulaga mautu o le fatu (n = 7 (D0 ma le D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC ma le D12 MT) fasi/vaega mai pua'a eseese, fa'atinoina le suega ANOVA e tasi le itu; #### p < 0.0001 fa'atusatusa i le D0 ma le *p < 0.05, po'o le ****p < 0.0001 fa'atusatusa i le D12 Ctrl). Количественная оценка структурной целостности ткани сердца с помощью искусственного интеллекта (n = 7 (D0 и TD12), TD12 (D0 и D12) D12 MT) срезов/группу от разных свиней, проведен однофакторный тест ANOVA #### p < 0,0001 по сравнению с D0 **** и0 и по <0,**** и по < 0,**** и по < 0,**** и по < 0,**** и по сравнению с D12 Ctrl). Fuafuaina o le tulaga mautu o le fausaga o le fatu e faʻaaogaina ai le atamai faʻapitoa (n = 7 (D0 ma le D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC ma le D12 MT) vaega/vaega mai puaa eseese, suega ANOVA e tasi le itu na faia; #### p < 0.0001 faʻatusatusa i le D0 ma le *p < 0.05 poʻo le ****p < 0.0001 faʻatusatusa i le D12 Ctrl).对不同猪的心脏组织结构完整性（n = 7（D0 和D12 Ctrl）、5（D12 TD、D12 MC 和D12 MT）切片/组）进行人工智能量化，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0.0001 与D0 和*p < 0.05 ，書所 0.05 ，書所 0.05 ，書是与D12 Ctrl 相比）.对 不同 猪 的 心脏 结构 完整性 （n = 7 （d0 和 d12 ctrl） （5 （d12 td 、 d12 mc 和 d1智能量 化 进行 单向 单向 单向 测试 ； ########## p < 0.0001 与D0 和*p < 0.05 相月0 ， 戸 相比 0.05 相比 ， 戸 相比 ， 戸 0.相比）.Fuafuaina o le tulaga mautu o le fausaga o le fatu e faʻaaogaina ai le atamai faʻapitoa i puaa eseese (n = 7 (D0 ma le D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC ma le D12 MT) vaega/vaega) faʻatasi ai ma se suega ANOVA e tasi le itu;#### p < 0,0001 по сравнению с D0 и *p < 0,05 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). #### p < 0.0001 pe a fa'atusatusa i le D0 ma le *p < 0.05 po'o le ****p < 0.0001 pe a fa'atusatusa i le D12 Ctrl). b Ata fa'atusa ma le fa'atusatusaga mo fasi fatu ua valiina i le vali Masson's trichrome (Scale bar = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD, ma le D12 MC), 9 (D12 MT) fasi/vaega mai pua'a eseese, faia le suega ANOVA e tasi le itu; ####p < 0.0001 fa'atusatusa i le D0 ma le ***p < 0.001, po'o le ****p < 0.0001 fa'atusatusa i le D12 Ctrl). b Ata fa'atusa ma le fa'atusatusaga mo fasi fatu ua valiina i le vali Masson's trichrome (Scale bar = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD, ma le D12 MC), 9 (D12 MT) fasi/vaega mai pua'a eseese, faia le suega ANOVA e tasi le itu; ####p < 0.0001 fa'atusatusa i le D0 ma le ***p < 0.001, po'o le ****p < 0.0001 fa'atusatusa i le D12 Ctrl). b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромным красителем Массона (5) мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD и D12 MC), 9 (D12 MT) срезов/группу от разных свиней, выполняется односторонний те1 ##0 сторонний те1 сравнению с D0 ma ***p <0,001 или ****p <0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). b Ata fa'atusa ma le fa'atusatusaga o vaega o le fatu ua valiina i le vali Masson's trichrome (scale bar = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD ma le D12 MC), 9 (D12 MT) vaega/vaega mai pua'a eseese, fa'atinoina le ANOVA i le itu e tasi; ####p < 0.0001 vs. D0 ma le ***p < 0.001 po'o le ****p < 0.0001 vs. D12 Ctrl). b 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像和量化（比例尺= 500 µm）！1D = 2、D1D10） TD 和D12 MC），来自不同猪的9 个（D12 MT）切片/组，进行单因素方差分析；####p < 0.0001 < 丯放01 0.001，或****p < 0.0001 与D12 Ctrl 相比）. b 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 和 量化 （比例 尺 尺 尺 = 500 µm） = 500 µm） 1（n） ctrl 、 d12 td 和 d12 mc） 来自 不同 的 9 个 d12 mt 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片/组，进行单因素方差分析；####p < 0.0001 与D0 相1 p <0 ，*0****p <0 ，*0**p <0，*0**p 0.0001 与D12 Ctrl 相比）. b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромом Массона (мастабная = лим50) (D0, D12 Ctrl, D12 TD и D12 MC), 9 (D12 MT) срезов от разных свиней / группы, один- способ ANOVA ####p <0,0001 по, ***001 по , ***001 по , ***001 по , ***001 по , ***001 по , ***001 по, ***001 по, ***001 по, ***001 по , ***001 по, ***001 по, ***001 по, ***001 по, ли сравин; ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). b Ata fa'atusa ma le fa'atusatusaga o vaega o le fatu ua valiina i le Masson's trichrome (scale bar = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD ma le D12 MC), 9 (D12 MT) vaega mai pua'a/vaega eseese, tasi le metotia ANOVA; ####p < 0.0001 fa'atusatusa i le D0, ***p < 0.001 po'o le ****p < 0.0001 fa'atusatusa i le D12 Ctrl).O pa sese e faʻatusalia ai le averesi ± le eseesega masani.
I le iuga, o le gafatia o le CTCM e faʻataʻitaʻi ai le hypertrophy o le fatu na iloiloina e ala i le faʻateleina o le faʻaloaloa o aano o le fatu. I le CTCM, o le mamafa o le potu ea na siʻitia mai le 80 mmHg i le 80 mmHg. Art. (faʻaloaloa masani) e oʻo atu i le 140 mmHg Art. (Ata 6a). E fetaui lea ma le 32% faʻaopoopoga i le faʻaloaloa (Ata 6b), lea na faʻaalia muamua o le pasene faʻaloaloa tutusa e manaʻomia mo vaega o le fatu e ausia ai le umi o le sarcomere e tutusa ma le mea na vaʻaia i le hypertrophy. O le faʻaloaloa ma le saoasaoa o aano o le fatu i le taimi o le faʻaitiitia ma le malolo na tumau pea i le ono aso o le totoina (Ata 6c). O aano o le fatu mai tulaga MT na faʻatinoina i le faʻaloaloa masani (MT (Masani)) poʻo tulaga faʻaloaloa tele (MT (OS)) mo le ono aso. Ina ua maeʻa aso e fa i le totoina, o le hypertrophic biomarker NT-ProBNP na matua siʻitia i le medium i lalo o tulaga MT (OS) pe a faʻatusatusa i tulaga MT (masani) (Ata 7a). E le gata i lea, ina ua maeʻa aso e ono o le totoina, o le tele o le sela i le MT (OS) (Ata 7b) na matua faʻateleina pe a faʻatusatusa i vaega o le fatu MT (masani). E le gata i lea, o le siitia o le NFATC4 nuclear sa matua faateleina i aano ua soona faaloaloa (Ata 7c). O nei taunuuga e faaalia ai le alualu i luma o le toe faaleleia o le pathological pe a uma le hyperdistension ma lagolagoina ai le manatu e mafai ona faaaoga le masini CTCM o se faavae e suesue ai le stretch-induced cardiac hypertrophy signaling.
O fa'ailoga fa'atusa o le mamafa o le potu ea, le mamafa o le potu vai, ma fua o le gaioiga o a'ano e fa'amaonia ai o le mamafa o le potu e suia ai le mamafa o le potu vai, ma mafua ai ona gaoioi tutusa le fasi a'ano. b O le pasene fa'aloaloa fa'atusa ma le fua fa'aloaloa mo vaega a'ano e masani ona fa'aloaloa (lanumoana) ma vaega a'ano ua fa'aloaloa tele (lanumoana). c O le kalafi pa e fa'aalia ai le taimi o le ta'amilosaga (n = 19 fasi i le vaega, mai pua'a eseese), taimi fa'apu'upu'u (n = 18-19 fasi i le vaega, mai pua'a eseese), taimi malolo (n = 19 fasi i le vaega, mai pua'a eseese) ), le tele o le gaioiga o a'ano (n = 14 fasi/vaega, mai pua'a eseese), le saoasaoa maualuga o le systolic (n = 14 fasi/vaega, mai pua'a eseese) ma le fua fa'ato'ato'a maualuga (n = 14 (D0), 15 (D6) ) vaega/vaega) mai pua'a eseese), o le t-test a le Student e lua-tailed e leai se eseesega taua i so'o se parakalafa, e fa'ailoa mai ai o nei parakalafa na tumau pea i le 6 aso o le totoina ma le overvoltage. O pa sese e fa'atusalia ai le averesi ± le fa'aletonu masani.
o le fa'atusatusaga o le kalafi pa o le maualuga o le NT-ProBNP i totonu o ala o fa'ato'aga mai fasi fatu na fa'ato'aga i lalo o tulaga masani o le MT (Norm) po'o le fa'aloaloa tele (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, ma le D4 MTOS) fasi/vaega mai pua'a eseese, fa'atinoina le ANOVA auala e lua; **p < 0.01 pe a fa'atusatusa i le fa'aloaloa masani). o le fa'atusatusaga o le kalafi pa o le maualuga o le NT-ProBNP i totonu o ala o fa'ato'aga mai fasi fatu na fa'ato'aga i lalo o tulaga masani o le MT (Norm) po'o le overstretching (OS) (n ​​= 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, ma le D4 MTOS) fasi/vaega mai pua'a eseese, ua fa'atinoina le ANOVA e lua-ala; **p < 0.01 pe a fa'atusatusa i le fa'ato'aga masani).O le histogram fa'atusatusa o le maualuga o le NT-ProBNP i totonu o le vaila'au fa'ato'aga mai fasi fatu na fa'ato'aga i lalo o tulaga o le fa'aloaloa masani o le MT (masani) po'o le fa'aloaloa tele (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, ma le D4).MTOS) fasi /vaega mai pua'a eseese, e faia le au'ili'iliga lua-vaega o le eseesega;**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p < 0.01 pe a fa'atusatusa i le fa'aloaloa masani). a 在MT 正常拉伸(Norm) 或过度拉伸(OS) 条件下培养的心脏切片培养基中NT-ProBNP 浓度的条件下培养的心脏切片培养基中NT-ProBNP 浓度的曾4 (D2 MTNorm)、3（D2 MTOS、D4 MTNorm 和D4 MTOS）来自不同猪的切片/组，进行双向方差分析；p不不不不为不不一不不上不不组，进行双向方差分析；p中中中文0.01). a Fuafuaga o le NT-ProBNP fa'asalaina i fasi fatu ua fa'atupuina i lalo o le MT masani fa'alautele (Norm) po'o le fa'ateleteleina (OS) tulaga (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm和D4 MTOS) mai ese'ese 猪的切片/组，可以双双; ** faʻatusatusa i le faʻalauteleina masani, p <0.01).histogram Fuaina o le maualuga o le NT-ProBNP i fasi fatu na totoina i lalo o tulaga o le MT stretch masani (masani) poʻo le overstretch (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm) ma le D4 MTOS) fasi/vaega mai puaa eseese, auiliiliga lua-itu o le eseesega;**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p < 0.01 pe a fa'atusatusa i le fa'aloaloa masani). b Ata fa'atusa mo fasi fatu ua valiina i le troponin-T ma le WGA (agavale) ma le fa'atusatusaga o le tele o le sela (taumatau) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) sela/vaega mai fasi eseese e 10 mai pua'a eseese, ua faia le Two-tailed Student t-test; ****p < 0.0001 pe a fa'atusatusa i le fa'aloaloa masani). b Ata fa'atusa mo fasi fatu ua valiina i le troponin-T ma le WGA (agavale) ma le fuaina o le tele o le sela (taumatau) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) sela/vaega mai fasi eseese e 10 mai pua'a eseese, ua faia le Two-tailed Student t-test; ****p < 0.0001 pe a fa'atusatusa i le fa'aloaloa masani). b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слева) и количественного опеникрадрад (sправа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) клеток/группу из 10 разных срезов от разных свиней, два- проводится х t-стой ****p < 0,0001 по сравнению с нормальным растяжением). b Ata fa'atusa o vaega o le fatu ua valiina i le troponin-T ma le AZP (agavale) ma le fuaina o le tele o le sela (taumatau) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) sela/vaega mai vaega eseese e 10 mai pua'a eseese, na faia le suega t-t a le Student e lua-si'usi'u; ****p < 0.0001 pe a fa'atusatusa i le ituaiga masani). b 用肌钙蛋白-T 和WGA（左）和细胞大小量化（右）染色的心脏切片的代表性（（6D33图MTOS），来自不同猪的10 个不同切片的369（D6 MTNorm）细胞/组，两进行有尾学生t检验；与正常拉伸相比，****p < 0.0001）。 b Ata fa'atusa o fasi fatu ua valiina i le calcarein-T ma le WGA (agavale) ma le tele o le sela (taumatau) (n = 330 (D6 MTOS), 369 mai fasi eseese e 10 (D6 MTNorm)) Sela/组，两方法有尾学生t test；fa'atusatusa i le fa'aloaloa masani，****p < 0.0001). b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слева) ma количественная оцленка (распенка) 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) из 10 различных срезов от разных свиней Клетки/группа, двусторонние критерий Ста;юд0н сравнению с нормальным растяжением). b Ata fa'atusa o vaega o le fatu ua valiina i le troponin-T ma le AZP (agavale) ma le fuaina o le tele o le sela (taumatau) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) mai vaega eseese e 10 mai pua'a eseese) Sela/vaega, fa'ailoga e lua-si'usi'u Student's t; ****p < 0.0001 pe a fa'atusatusa i le ituaiga masani). c Ata fa'atusa mo le aso 0 ma le aso 6 o fasi fatu MTOS ua fa'ailogaina mo le troponin-T ma le NFATC4 ma le fa'atusatusaga o le fesiita'iga o le NFATC4 i le nuclei o CMs (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) fasi/vaega mai pua'a eseese, ua faia le Two-tailed Student t-test; *p < 0.05). c Ata fa'atusa mo le aso 0 ma le aso 6 o fasi fatu MTOS ua fa'ailogaina mo le troponin-T ma le NFATC4 ma le fa'atusatusaga o le fesiita'iga o le NFATC4 i le nuclei o CMs (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) fasi/vaega mai pua'a eseese, ua faia le Two-tailed Student t-test; *p < 0.05). c Репрезентативные изображения для срезов сердца 0 ma 6 aso MTOS, fa'ailoga тропонина-Т и NFATC4, ma le колица. транслокации NFATC4 i ядра кавернозных клеток (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срезов/группу от разных свиней , выполндяетсястятся Стьюдента; *p < 0,05). c Ata fa'atusa mo vaega o le fatu i le 0 ma le 6 aso MTOS, fa'ailogaina mo le troponin-T ma le NFATC4, ma le fa'atatauina o le fa'aliliuina o le NFATC4 i totonu o le nucleus o sela cavernous (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) fasi/vaega mai pua'a eseese) na faia ai le t-test a le Student e lua-tailed; *p < 0.05). c 用于肌钙蛋白-T 和NFATC4 免疫标记的第0 天和第6 天MTOS心脏切片的代表性图像，以及来自不同猪的NFATC4 易位至CM 细胞核的量化（n = 4 (D0)片, MTOS4 (D0)〇进行双尾学生t 检验；*p < 0.05). c Fa'atusa ata o le calcanin-T ma le NFATC4 immunolabeling 第0天和第6天MTOS fasi fatu fatu, ma le NFATC4 mai NFATC4 易位至CM cell nucleus eseese (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) / 爇时间双尾学生et 电影；*p < 0.05). c Репрезентативные изображения срезов сердца MTOS i le 0 ma le 6 aso i le иммуномаркировки тропонином-Т ma NFATC4 и колицнч транслокации NFATC4 i ядра CM mai le разных свиней (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срез/группа, два- хвостатый t-критерий Сть0, *0). c Ata fa'atusa o fasi fatu MTOS i le aso 0 ma le 6 mo le fa'ailogaina o le troponin-T ma le NFATC4 ma le fa'atusatusaga o le fa'aliliuina o le NFATC4 i le nucleus o le CM mai pua'a eseese (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) fasi/vaega, t-criterion lua-si'usi'u Student's; *p < 0.05).O pa sese e faʻatusalia ai le averesi ± le eseesega masani.
O suʻesuʻega faʻaliliuina o le fatu e manaʻomia ai ni faʻataʻitaʻiga o sela e toe gaosia ma le saʻo le siosiomaga o le fatu. I lenei suʻesuʻega, na atiaʻe ma faʻamatalaina ai se masini CTCM e mafai ona faʻaosofia ai vaega manifinifi o le fatu. O le polokalama CTCM e aofia ai le faʻaosofiaina o le eletise faʻatino faʻatasi ma le faʻamalosia o le vai T3 ma le Dex. Ina ua faʻaalia vaega o le fatu puaʻa i nei mea, o lo latou olaola, le malosi o le fausaga, le gaioiga o le metabolism, ma le faʻaalia o le tusitusiga e tumau pea e pei o le aano fou o le fatu pe a mavae aso e 12 o le totoina. E le gata i lea, o le soona faʻaloaloa o le aano o le fatu e mafai ona mafua ai le hypertrophy o le fatu e mafua mai i le hyperextension. I le aotelega, o nei taunuuga e lagolagoina ai le matafaioi taua o tulaga o le totoina o aano i le tausia o se phenotype masani o le fatu ma maua ai se tulaga mo le suʻesuʻeina o fualaau faasaina.
E tele mea e fesoasoani i le fausiaina o se siosiomaga sili ona lelei mo le galue ma le ola o cardiomyocytes. O mea e sili ona manino o nei mea e fesoʻotaʻi ma le (1) fegalegaleaiga i le va o sela, (2) faʻaosofia eletise, (3) mea tau humoral, ma le (4) mea e faʻaaogaina ai le metabolism. O fegalegaleaiga faʻaletino i le va o sela e manaʻomia ai fesoʻotaʻiga faigata e tolu-vaega o ituaiga sela eseese e lagolagoina e se matrix extracellular. O ia fegalegaleaiga faigata i sela e faigata ona toe fausia i totonu o le vitro e ala i le faʻatupuina faʻatasi o ituaiga sela taʻitasi, ae e faigofie ona ausia e ala i le faʻaaogaina o le natura faʻapitoa o vaega o le fatu.
O le fa'aloaloa fa'amekanika ma le fa'aosofiaina eletise o cardiomyocytes e taua tele mo le fa'atumauina o le phenotype o le fatu33,34,35. E ui o le fa'aosofia fa'amekanika ua fa'aaogaina lautele mo le fa'atulagaina ma le matua o le hiPSC-CM, ae o le tele o su'esu'ega matagofie ua fa'ata'ita'iina talu ai nei le fa'aosofia fa'amekanika o fasi fatu i le totoina e fa'aaoga ai le uniaxial loading. O nei su'esu'ega e fa'aalia ai o le 2D uniaxial mechanical loading e iai sona a'afiaga lelei i le phenotype o le fatu i le taimi o le totoina. I nei su'esu'ega, o vaega o le fatu na fa'atumuina i le isometric tensile forces17, linear auxotonic loading18, pe na toe faia le ta'amilosaga o le fatu e fa'aaoga ai le force transducer feedback ma le tension drives. Peita'i, o nei metotia e fa'aaoga ai le uniaxial tissue stretch e aunoa ma le fa'aleleia atili o le siosiomaga, ma i'u ai i le taofia o le tele o genes o le fatu po'o le so'ona fa'aalia o genes e feso'ota'i ma tali fa'aloaloa e le masani ai. O le CTCM o lo'o fa'amatalaina iinei e maua ai se 3D electromechanical stimulus e fa'ata'ita'i ai le ta'amilosaga masani o le fatu i tulaga o le taimi o le ta'amilosaga ma le fa'aloaloa fa'aletino (25% fa'aloaloa, 40% systole, 60% diastole, ma le 72 beats i le minute). E ui o lenei faʻaosofiaga faʻamekanika e tolu-vaega e le lava lea e faʻatumauina ai le tumau o le aano, o se tuʻufaʻatasiga o le faʻaosofiaga humoral ma le faʻamekanika e faʻaaoga ai le T3/Dex e manaʻomia e faʻatumauina ai le ola lelei, galuega, ma le tumau o aano.
E taua tele le sao o mea tau le mafaufau i le fetu'una'iga o le ituaiga o le fatu o tagata matutua. Na fa'amamafaina lenei mea i su'esu'ega a le HiPS-CM lea na fa'aopoopoina ai le T3 ma le Dex i ala o fa'ato'aga e fa'avavevave ai le matua o le sela. Atonu e a'afia e le T3 le felauaiga o amino acids, suka ma le calcium i totonu o membrane o le sela36. E le gata i lea, e fa'alauiloa e le T3 le fa'aalia o le MHC-α ma le fa'aitiitia o le MHC-β, e fa'alauiloa ai le fausiaina o myofibrils vave i totonu o cardiomyocytes matutua pe a fa'atusatusa i myofibrils lemu i le CM pepe. O le le lava o le T3 i tagata mama'i e maua i le hypothyroidism e mafua ai le leiloa o fusi myofibrillar ma le fa'aitiitia o le saoasaoa o le atina'eina o le leo37. E galue le Dex i luga o glucocorticoid receptors ma ua fa'aalia e fa'ateleina ai le myocardial contractility i totonu o fatu tu'ufua; 38 o lenei fa'aleleia atili e manatu e feso'ota'i ma le a'afiaga i le calcium deposit-driven entry (SOCE) 39,40. E le gata i lea, e fusifusia e le Dex ona receptors, ma mafua ai se tali lautele i totonu o le sela e taofia ai le puipuiga o le tino ma le mumū30.
O a matou taunuuga e faʻaalia ai o le faʻaosofia faʻaletino faʻaletino (MS) na faʻaleleia atili ai le faʻatinoga atoa o le totoina o fatu pe a faʻatusatusa i le Ctrl, ae leʻi mafai ona faʻatumauina le ola, le faʻamautuina o le fausaga, ma le faʻaalia o le fatu i le 12 aso i le totoina o fatu. Pe a faʻatusatusa i le Ctrl, o le faʻaopoopoina o le T3 ma le Dex i totoina o fatu CTCM (MT) na faʻaleleia atili ai le ola ma faʻatumauina ai foliga tutusa o le faʻaliliuga, le faʻamautuina o le fausaga, ma le gaioiga o le metabolism ma aano fou o le fatu mo le 12 aso. E le gata i lea, i le puleaina o le tikeri o le faʻaloaloa o aano, o se faʻataʻitaʻiga o le hyperextension-induced cardiac hypertrophy na faia e faʻaaoga ai le STCM, e faʻaalia ai le fetuʻunaʻiga o le faiga STCM. E tatau ona maitauina e ui lava o le toe faʻaleleia o le fatu ma le fibrosis e masani ona aofia ai totoga e leʻi afaina o latou sela e mafai ona tuʻuina atu cytokines talafeagai faʻapea foʻi ma le phagocytosis ma isi mea e toe faʻaleleia ai, ae o vaega o le fatu e mafai lava ona faʻataʻitaʻi le faiga fibrotic e tali atu ai i le atuatuvale ma le manuʻa. i totonu o myofibroblasts. Ua uma ona iloiloina muamua lenei mea i lenei faʻataʻitaʻiga o le tipi o le fatu. E tatau ona maitauina o faʻasologa o le CTCM e mafai ona faʻafetaui e ala i le suia o le mamafa/eletise ma le tele o taimi e faʻataʻitaʻi ai le tele o tulaga e pei o le tachycardia, bradycardia, ma le lagolago faʻamekanika o le tafe toto (fatu e leʻi utaina). O lenei mea ua avea ai le faiga ma se auala e faʻaaogaina ai suʻega o fualaau faʻasaina. O le gafatia o le CTCM e faʻataʻitaʻi ai le faʻateleina o le fatu ona o le soona faʻamalosi e saunia ai le auala mo le suʻeina o lenei faiga mo togafitiga faʻapitoa. I le faʻaiʻuga, o le suʻesuʻega o loʻo iai nei ua faʻaalia ai o le faʻaloaloa faʻapitoa ma le faʻamalosia o le humoral e taua tele mo le tausia o le faʻaleleia o vaega o aʻano o le fatu.
E ui o faʻamaumauga o loʻo tuʻuina atu iinei e faʻailoa mai ai o le CTCM o se faʻavae e matua folafolaina mo le faʻataʻitaʻiina o le myocardium e leʻi aʻafia, ae o lenei metotia faʻatoʻaga e iai ni ona tapulaʻa. O le tapulaʻa autu o le faʻatoʻaga CTCM o le faʻamalosia lea o faʻalavelave faʻamekanika faifai pea i luga o fasi, lea e taofia ai le mafai ona mataʻituina lelei le faʻaitiitia o fasi fatu i taʻamilosaga taʻitasi. E le gata i lea, ona o le laʻititi o vaega o le fatu (7 mm), o le mafai ona iloilo le galuega systolic i fafo atu o faiga faʻatoʻaga e faʻaaoga ai masini faʻamalosi masani e faʻatapulaʻaina. I le tusitusiga o loʻo iai nei, ua matou faʻatoʻilaloina faʻatasi lenei tapulaʻa e ala i le iloiloina o le voltage opitika o se faʻailoga o le galuega faʻatoʻaga. Peitaʻi, o lenei tapulaʻa o le a manaʻomia ai nisi galuega ma e ono foia i le lumanaʻi e ala i le faʻalauiloaina o metotia mo le mataʻituina o le galuega a fasi fatu i le faʻatoʻaga, e pei o le faʻafanua opitika e faʻaaoga ai le calcium ma vali e maaleale i le voltage. O le isi tapulaʻa o le CTCM o le faʻataʻitaʻiga galue e le faʻaaogaina le faʻalavelave faʻaletino (preload ma afterload). I le CTCM, na faʻaosofia le mamafa i itu faʻafeagai e toe gaosia ai le 25% o le faʻaloaloa faʻaletino i le diastole (faʻaloaloa atoa) ma le systole (umi o le faʻaloaloa i le taimi o le faʻaosofiaina o le eletise) i aano tetele. E tatau ona aveese lenei tapulaʻa i mamanu CTCM i le lumanaʻi e ala i le mamafa talafeagai i luga o le aano o le fatu mai itu uma e lua ma le faʻaaogaina o le sootaga tonu o le mamafa-volume e tutupu i totonu o potu o le fatu.
O le toe fa'aleleia e mafua mai i le soona fa'aloaloa o lo'o lipotia mai i lenei tusitusiga ua fa'atapula'aina i le fa'ata'ita'iina o fa'ailoilo hypertrophic hyperstretch. O lea la, e mafai e lenei fa'ata'ita'iga ona fesoasoani i le su'esu'eina o fa'ailoilo hypertrophic e mafua mai i le fa'aloaloa e aunoa ma le mana'omia o mea tau humoral po'o neura (lea e le o iai i lenei faiga). E mana'omia nisi su'esu'ega e fa'ateleina ai le tele o CTCM, mo se fa'ata'ita'iga, o le fa'ato'aga fa'atasi ma sela puipuia, mea tau humoral plasma o lo'o fa'asalalauina, ma le innervation pe a fa'ato'aga fa'atasi ma sela neuronal o le a fa'aleleia atili ai avanoa o fa'ata'ita'iga o fa'ama'i ma le CTCM.
E sefulutolu pua'a na fa'aaogaina i lenei su'esu'ega. O togafitiga uma i manu na faia e tusa ai ma ta'iala fa'alapotopotoga ma na fa'amaonia e le Komiti Fa'alapotopotoga mo Tausiga ma le Fa'aaogaina o Manu a le Iunivesite o Louisville. Na fa'amau le auvae o le aorta ma fa'asusu le fatu i le 1 L o le cardioplegia mama (110 mM NaCl, 1.2 mM CaCl2, 16 mM KCl, 16 mM MgCl2, 10 mM NaHCO3, 5 U/mL heparin, pH e o'o atu i le 7.4); sa teuina fatu i totonu o se vailaau malulu e togafitia ai le fatu seia oo ina aveina i le fale suesue i luga o le aisa lea e masani lava <10 minute. sa teuina fatu i totonu o se vailaau malulu e togafitia ai le fatu seia oo ina aveina i le fale suesue i luga o le aisa lea e masani lava <10 minute. сердца хранили в ледяном кардиоплегическом растворе до транспортировки в лабораторию на льду, что обычно за10мает <. Sa teuina fatu i totonu o se vailaau malulu e pei o se aisa seia oo ina aveina i le fale suesue i luga o le aisa, lea e masani ona itiiti ifo i le 10 minute le umi.将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钟。将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钟。 Держите сердца в ледяной кардиоплегии до транспортировки в лабораторию на льду, обычно <10 min. Taofi fatu i luga o le aisa pe a iai fo'i le cardioplegia se'ia o'o i le taimi e ave ai i le fale su'esu'e i luga o le aisa, e masani lava <10 minute.
O le masini CTCM na atiaʻe i le polokalama faakomepiuta a le SolidWorks (CAD). O potu faʻatoʻaga, vaeluaga ma potu ea e faia i le palasitika acrylic manino CNC. O le mama tua e 7mm le lautele e faia i le polyethylene maualuga le mafiafia (HDPE) i le ogatotonu ma e iai se ala o-mama e faʻapipiʻi ai le mama silicone o-mama e faʻaaoga e faʻamaufaʻailoga ai le ala o faasalalauga i lalo. O se membrane silica manifinifi e vavaeʻese ai le potu faʻatoʻaga mai le ipu vavaeʻese. O le membrane silicone e tipiina i le laser mai le pepa silicone e 0.02″ le mafiafia ma e 35A lona malosi. O gasket silicone pito i lalo ma luga e tipiina i le laser mai le pepa silicone e 1/16″ le mafiafia ma e 50A lona malosi. O sikulima uʻamea e le gaoia 316L ma nati apaʻau e faʻaaoga mo le faʻamauina o le poloka ma faia se faʻamaufaʻailoga e le susu.
O se laupapa matagaluega lolomi faapitoa (PCB) ua mamanuina ina ia tuufaatasia ma le polokalama C-PACE-EM. O soketi feso'ota'i masini Suisi i luga o le PCB e feso'ota'i i eletise kalafi e ala i uaea kopa ua ufi i le siliva ma sikulima apamemea 0-60 ua fa'amauina i totonu o eletise. O le laupapa matagaluega lolomi ua tuu i totonu o le ufi o le masini lomitusi 3D.
O le masini CTCM e pulea e se pneumatic actuator e mafai ona polokalameina (PPD) lea e fausia ai se mamafa o le tafe toto e pei o se taamilosaga o le fatu. A o faateleina le mamafa i totonu o le potu ea, e faalauteleina i luga le membrane silicone fetuutuunai, ma faamalosia ai le vaega i lalo o le nofoaga o le aano. Ona faaloaloa lea o le vaega o le aano e ala i lenei tuliesea o le vai, e faataitai ai le faalauteleina faaletino o le fatu i le taimi o le diastole. I le tumutumuga o le malolo, sa faaaogaina ai le eletise e ala i electrodes graphite, lea na faaitiitia ai le mamafa i totonu o le potu ea ma mafua ai ona mimilo vaega o aano. I totonu o le paipa o loo i ai se valve hemostatic faatasi ai ma se sensor mamafa e iloa ai le mamafa i totonu o le faiga o le ea. O le mamafa e iloa e le sensor mamafa e faaaogaina i se tagata e aoina faamatalaga e fesoʻotaʻi ma le komepiuta feaveai. O lenei mea e mafai ai ona mataʻituina pea le mamafa i totonu o le potu kesi. Ina ua oo i le mamafa maualuga o le potu (tulaga masani 80 mmHg, 140 mmHg OS), sa faatonuina le masini e aoina faamatalaga e auina atu se faailoilo i le faiga C-PACE-EM e fausia ai se faailoilo voltage biphasic mo le 2 ms, seti i le 4 V.
Sa maua ni vaega o le fatu ma faia ni tulaga o le totoina i totonu o ni vaieli e 6 e pei ona taua i lalo: Fesiitai fatu ua seleseleina mai le ipu fesiitai i se fata o loʻo i ai le cardioplegia malulu (4° C.). Sa vavaeʻeseina le ventricle tauagavale i se lau mama ma tipiina i ni fasi e 1-2 cm3 le lautele. O nei poloka aano sa faʻapipiʻi i lagolago aano i le kelu aano ma tuʻu i totonu o se taʻele microtome e gatete o loʻo i ai le vaifofo Tyrode ma faʻaauau pea ona faʻaoksigenaina (3 g/L 2,3-butanedione monooxime (BDM), 140 mM NaCl (8.18 g) . ), 6 mM KCl (0.447 g), 10 mM D-glucose (1.86 g), 10 mM HEPES (2.38 g), 1 mM MgCl2 (1 ml 1 M vaifofo), 1.8 mM CaCl2 (1.8 ml 1 M vaifofo), e oʻo atu i le 1 L ddH2O). O le microtome gatete na setiina e tipi ni fasi pepa mafiafia e 300 µm i le televave o le 80 Hz, o le televave faalava o le 2 mm, ma le saoasaoa muamua o le 0.03 mm/s. O le tapu o aano sa siomia i le aisa e faamalūlū ai le vaifofo ma tausia le vevela i le 4°C. Fesiitai vaega o aano mai le tapu microtome i se tapu fa'asusu o lo'o i ai le vaifofo Tyrode ua fa'a'okeseneina pea i luga o le aisa se'ia lava vaega e lava mo le tasi ipu fa'ato'aga. Mo fa'ato'aga transwell, o vaega o aano sa fa'apipi'i i ni lagolago polyurethane mama e 6 mm le lautele ma tu'u i totonu o le 6 ml o le vaila'au fa'aleleia (199 vaila'au, 1x fa'aopoopoga ITS, 10% FBS, 5 ng/ml VEGF, 10 ng/ml FGF-alkaline ma le 2X vaila'au fa'ama'i-antifungal). O le fa'aosofiaga eletise (10 V, televave 1.2 Hz) sa fa'aogaina i vaega o aano e ala i le C-Pace. Mo tulaga TD, na fa'aopoopoina le T3 fou ma le Dex i le 100 nM ma le 1 μM i suiga ta'itasi o le medium. E fa'asusuina le medium i le okesene a'o le'i suia fa'atolu i le aso. O vaega o a'ano na fa'atupuina i totonu o se incubator i le 37°C ma le 5% CO2.
Mo fa'ato'aga CTCM, o vaega o a'ano sa tu'uina i luga o se lomitusi 3D fa'apitoa i totonu o se ipu Petri o lo'o i ai le vaila'au Tyrode ua suia. O le masini ua mamanuina e fa'ateleina le tele o le fasi o le fatu i le 25% o le lautele o le mama lagolago. O lenei mea ua faia ina ia aua ne'i fa'aloaloa vaega o le fatu pe a uma ona fa'aliliuina mai le vaila'au Tyrode i le vaila'au ma i le taimi o le diastole. I le fa'aaogaina o le kelu histoacrylic, o vaega e 300 µm le mafiafia sa fa'amauina i luga o se mama lagolago e 7 mm le lautele. A uma ona fa'apipi'i vaega o a'ano i le mama lagolago, tipi ese vaega o a'ano ua tele ma toe tu'u vaega o a'ano ua fa'apipi'i i totonu o le tapu o le vaila'au Tyrode i luga o le aisa (4°C) se'ia o'o ina saunia vaega e lava mo le tasi masini. O le taimi atoa e fa'agasolo ai mo masini uma e le tatau ona sili atu i le 2 itula. A uma ona fa'apipi'i vaega e 6 o a'ano i o latou mama lagolago, ona fa'apotopoto lea o le masini CTCM. O le potu fa'ato'aga CTCM ua uma ona fa'atumuina i le 21 ml o le vaila'au ua uma ona fa'aoksigenaina. Fa'aliliu vaega o a'ano i le potu fa'ato'aga ma aveese ma le fa'aeteete so'o se ea ea i se pipette. Ona taʻitaʻia lea o le vaega o le aano i totonu o le pu ma oomi mālie i lona nofoaga. Mulimuli ane, tuʻu le tapuni o le eletise i luga o le masini ma faʻaliliu le masini i le incubator. Ona faʻafesoʻotaʻi lea o le CTCM i le paipa ea ma le C-PACE-EM system. E tatala le pneumatic actuator ma tatala e le valve ea le CTCM. Na faʻatulagaina le C-PACE-EM system e tuʻuina atu le 4 V i le 1.2 Hz i le taimi o le biphasic pacing mo le 2 ms. E sui faalua le medium i le aso ma e sui faatasi electrodes i le aso e ʻalofia ai le faʻaputuina o le graphite i luga o electrodes. Afai e manaʻomia, e mafai ona aveese vaega o le aano mai a latou vaieli faʻatoʻaga e faʻateʻa ese ai soʻo se ea atonu na paʻuʻū i lalo ifo o latou. Mo tulaga o togafitiga MT, na faʻaopoopoina le T3/Dex fou i suiga taʻitasi o le medium ma le 100 nM T3 ma le 1 μM Dex. Na faʻatoʻagaina masini CTCM i totonu o se incubator i le 37°C ma le 5% CO2.
Ina ia maua ni ala ua fa'aloaloa o fasi fatu, na atia'e ai se faiga fa'apitoa o le meapueata. O se meapueata SLR (Canon Rebel T7i, Canon, Tokyo, Iapani) na fa'aaogaina fa'atasi ai ma se tioata macro Navitar Zoom 7000 18-108mm (Navitar, San Francisco, CA). Na faia le va'aiga i le vevela o le potu pe a uma ona sui le mea fa'aoga i se mea fa'aoga fou. O lo'o tu'u le meapueata i le tulimanu e 51° ma o lo'o pu'eina le vitio i le 30 fa'avaa i le sekone. Muamua, na fa'aaogaina ai se polokalama tatala (MUSCLEMOTION43) fa'atasi ai ma le Image-J e fa'atatau ai le gaioiga o fasi fatu. Na fatuina le ufimata e fa'aaoga ai le MATLAB (MathWorks, Natick, MA, ISA) e fa'amatalaina ai vaega e fiafia i ai mo le tata o fasi fatu ina ia 'alo'ese ai mai le pisa. O ufimata ua vaevaeina fa'ale-lima e fa'aoga i ata uma i se fa'asologa o fa'avaa ona tu'uina atu lea i le plug-in MUSCLEMOTION. E fa'aaoga e le Muscle Motion le averesi o le malosi o pixels i fa'avaa ta'itasi e fa'atatau ai lona gaioiga e fa'atatau i le fa'avaa fa'asino. Na pu'eina fa'amaumauga, fa'amama ma fa'aaoga e fa'atatau ai le taimi o le ta'amilosaga ma iloilo ai le fa'aloaloa o a'ano i le taimi o le ta'amilosaga o le fatu. O le vitio na pu'eina sa fa'agasoloina i tua e fa'aaoga ai se fa'amama numera zero-phase muamua. Mo le fuaina o le fa'aloaloa o a'ano (tumutumu-i-tumutumu), sa faia ai le su'esu'ega mai le tumutumu i le tumutumu e iloa ai le eseesega i le va o tumutumu ma le loloto i le fa'ailo na pu'eina. E le gata i lea, o le detrending e faia e fa'aaoga ai se polynomial lona 6 e aveese ai le fe'avea'i o fa'ailo. Sa atia'e le code o le polokalame i le MATLAB e fuafua ai le gaioiga o a'ano i le lalolagi atoa, taimi o le ta'amilosaga, taimi e malolo ai, ma le taimi e fa'apu'upu'u ai (Supplementary Program Code 44).
Mo le auiliiliga o le fa'alavelave, fa'aaoga vitio lava e tasi na fatuina mo le iloiloga o le fa'aloaloa fa'amekanika, na matou muamua su'eina ni ata se lua o lo'o fa'atusalia ai tumutumuga o gaioiga (o vaega aupito maualuga (luga) ma maualalo (maualalo) o le gaioiga) e tusa ai ma le polokalama MUSCLEMOTION. Ona matou vaevaeina lea o vaega o a'ano ma fa'aoga se ituaiga o algorithm o le fa'a'ofuofu i a'ano ua vaevaeina (Ata Fa'aopoopo 2a). Ona vaevaeina lea o a'ano ua vaevaeina i ni vaega e sefulu i lalo ifo, ma o le fa'alavelave i luga o luga ta'itasi na fuafuaina e fa'aaoga ai le fua fa'atatau lenei: Fa'alavelave = (Sup-Sdown)/Sdown, lea o Sup ma Sdown o mamao o le foliga mai ata pito i luga ma lalo o le ie, (Ata Fa'aopoopo .2b).
O vaega o le fatu na fa'amauina i le 4% paraformaldehyde mo le 48 itula. O aano o le fatu na fa'amauina na fa'amago i le 10% ma le 20% sucrose mo le 1 itula, ona fa'asusu lea i le 30% sucrose i le po atoa. Ona fa'asusu lea o vaega i totonu o le vaila'au e fa'amaluluina ai le vevela sili ona lelei (OCT compound) ma fa'a'aisa malie i totonu o se vaita'ele isopentane/aisa mago. Teu poloka e fa'apipi'i ai le OCT i le -80 °C se'ia o'o ina vaeluaina. Sa saunia ni fa'ase'e o ni vaega e 8 μm le mafiafia.
Ina ia aveese le OCT mai vaega o le fatu, fa'avevela fa'ase'e i luga o se poloka fa'avevela i le 95 °C mo le 5 minute. Fa'aopopo le 1 ml PBS i fa'ase'e ta'itasi ma fa'asusu mo le 30 minute i le vevela o le potu, ona fa'asusu lea o vaega e ala i le fa'atulagaina o le 0.1% Triton-X i le PBS mo le 15 minute i le vevela o le potu. Ina ia puipuia ni antibodies e le fa'apitoa mai le pipii atu i le fa'ata'ita'iga, fa'aopopo le 1 ml o le 3% BSA solution i fa'ase'e ma fa'asusu mo le 1 itula i le vevela o le potu. Ona aveese lea o le BSA ma fufulu fa'ase'e i le PBS. Fa'ailoga fa'ata'ita'iga ta'itasi i se penitala. O antibodies autū (fa'avaivaia 1:200 i le 1% BSA) (connexin 43 (Abcam; #AB11370), NFATC4 (Abcam; #AB99431) ma le troponin-T (Thermo Scientific; #MA5-12960) na fa'aopoopoina i le silia ma le 90 minute, ona fa'aopoopo lea o antibodies lona lua (fa'avaivaia 1:200 i le 1% BSA) e fa'asaga i le isumu Alexa Fluor 488 (Thermo Scientific; #A16079), e fa'asaga i le lapiti Alexa Fluor 594 (Thermo Scientific; #T6391) mo le isi 90 minute. Fufuluina fa'atolu i le PBS. Ina ia iloa le valiina o le sini mai le talaaga, na'o le antibody lona lua na matou fa'aaogaina e fai ma fa'ata'ita'iga. Mulimuli ane, na fa'aopoopoina le vali DAPI nuclear ma tu'u ai slides i totonu o se vectashield (Vector Laboratories) ma fa'amaufa'ailogaina i le vali fao. -x fa'ateleina) ma le microscope Keyence ma le fa'ateleina 40x.
O le WGA-Alexa Fluor 555 (Thermo Scientific; #W32464) i le 5 μg/ml i le PBS na fa'aaogaina mo le valivaliina o le WGA ma fa'apipi'i i vaega tumau mo le 30 minute i le vevela o le potu. Ona fufuluina lea o slides i le PBS ma fa'aopoopo le Sudan black i slides ta'itasi ma fa'asusu mo le 30 minute. Ona fufuluina lea o slides i le PBS ma fa'aopoopo le vectashield embedding medium. Na va'aia slides i luga o le microscope Keyence i le 40x fa'ateleina.
Sa aveese le OCT mai faʻataʻitaʻiga e pei ona faʻamatalaina i luga. A uma ona aveese le OCT, faʻasusu ia slides i le vai faʻamamā a Bouin i le po atoa. Ona fufulu lea o slides i le vai faʻamamā mo le 1 itula ona tuʻu lea i totonu o le Bibrich aloe acid fuchsin solution mo le 10 minute. Ona fufulu lea o slides i le vai faʻamamā ma tuʻu i totonu o se vai faʻamamā o le 5% phosphomolybdenum/5% phosphotungstic acid mo le 10 minute. E aunoa ma le fufuluina, faʻaliliu saʻo slides i totonu o le aniline blue solution mo le 15 minute. Ona fufulu lea o slides i le vai faʻamamā ma tuʻu i totonu o se 1% acetic acid solution mo le 2 minute. Sa faʻamago slides i le 200 N ethanol ma faʻaliliu i le xylene. Sa vaʻaia slides ua valivali e faʻaaoga ai se microscope Keyence ma se 10x objective. Sa fuaina le pasene o le fibrosis area e faʻaaoga ai le polokalama Keyence Analyzer.
CyQUANT™ MTT Cell Viability Assay (Invitrogen, Carlsbad, CA), numera o le lisi oloa V13154, e tusa ai ma le faiga masani a le kamupani gaosi oloa faatasi ai ma ni nai suiga. Ae maise lava, o se tui taotoga e 6 mm le lautele na faaaogaina e faamautinoa ai le tutusa o le tele o aano i le taimi o le auiliiliga o le MTT. Sa tuu eseese aano i totonu o pu o se ipu e 12-pu o loo i ai le MTT substrate e tusa ai ma le faiga masani a le kamupani gaosi oloa. O vaega e fa'asusu i le 37° C mo le 3 itula ma o le aano ola e fa'agaoioia le MTT substrate e fausia ai se formazan lanu violē. Sui le vaifofo MTT i le 1 ml DMSO ma fa'asusu i le 37°C mo le 15 minute e aveese ai le formazan lanu violē mai vaega o le fatu. O fa'ata'ita'iga na fa'avaivaia 1:10 i le DMSO i ipu pito i lalo manino e 96-pu ma fuaina le malosi o le lanu violē i le 570 nm e fa'aaoga ai se Cytation plate reader (BioTek). O faitauga na fa'atulagaina i le mamafa o fasi ta'itasi o le fatu.
O le vaega o le fatu na sui i le vaega o le fatu o loʻo i ai le 1 μCi/ml [5-3H]-glucose (Moravek Biochemicals, Brea, CA, ISA) mo le suʻega o le faʻaaogaina o le kulukose e pei ona faʻamatalaina muamua. A maeʻa itula e 4 o le faʻasusuina, faʻaopopo le 100 µl o le vaega i totonu o se paipa microcentrifuge tatala o loʻo i ai le 100 µl o le 0.2 N HCl. Ona tuʻu lea o le paipa i totonu o se paipa scintillation o loʻo i ai le 500 μl o le dH2O e faʻamamago ai le [3H]2O mo le 72 itula i le 37°C. Ona aveese lea o le paipa microcentrifuge mai le paipa scintillation ma faʻaopopo le 10 ml o le vai scintillation. Na faia le faitauga o scintillation e faʻaaoga ai le Tri-Carb 2900TR liquid scintillation analyzer (Packard Bioscience Company, Meriden, CT, ISA). Ona fuafuaina lea o le fa'aaogaina o le kulukose e ala i le amana'iaina o le [5-3H]-glucose specific activity, le incomplete equilibrium and background, dilution of [5-3H]-to unlabeled glucose, ma le scintillation counter efficiency. O fa'amaumauga ua fa'atulagaina i le mamafa o vaega o le fatu.
A maeʻa ona faʻafefiloi aano i le Trizol, ona vavaeʻeseina lea o le RNA mai vaega o le fatu e faʻaaoga ai le Qiagen miRNeasy Micro Kit #210874 e tusa ai ma le faʻatulagaga a le kamupani gaosi oloa. O le sauniuniga o le faletusi RNAsec, le faʻasologa ma le auʻiliʻiliga o faʻamaumauga na faia e pei ona taua i lalo:
1 μg o le RNA i le faʻataʻitaʻiga taʻitasi na faʻaaogaina o se mea amata mo le sauniuniga o le faletusi RNA. Na faia faletusi faʻasologa e faʻaaoga ai le NEBNext UltraTM RNA Library Preparation Kit mo Illumina (NEB, ISA) e mulimuli ai i fautuaga a le kamupani gaosi oloa, ma faʻaopoopoina ai faʻailoga faʻasino i faʻasologa o uiga mo faʻataʻitaʻiga taʻitasi. I se faapuupuuga, na faʻamamāina le mRNA mai le RNA atoa e faʻaaoga ai ni beads magnetic e faʻapipiʻi i le poly-T oligonucleotides. E faia le fragmentation e faʻaaoga ai ni divalent cations i le vevela maualuga i le NEBNext First Strand Synthesis Reaction Buffer (5X). Na faʻapipiʻiina le cDNA o le manoa muamua e faʻaaoga ai ni random hexamer primers ma le M-MuLV reverse transcriptase (RNase H-). Ona faʻapipiʻiina lea o le manoa lona lua o le cDNA e faʻaaoga ai le DNA polymerase I ma le RNase H. O isi overhangs e liua i pito blunt e ala i le exonuclease/polymerase activity. A maeʻa le adenylation o le pito 3′ o le fasi DNA, e faʻapipiʻi i ai se NEBNext Adapter ma se hairpin loop structure e saunia ai mo le hybridization. Mo le filifilia o fasi cDNA o le umi e manaʻomia 150-200 bp. Sa fa'amamāina vaega o le faletusi e fa'aaoga ai le AMPure XP system (Beckman Coulter, Beverly, ISA). Ona fa'aaoga lea o le 3 μl USER Enzyme (NEB, ISA) fa'atasi ai ma le cDNA ua filifilia i le tele ua fa'apipi'i i se adapter mo le 15 minute i le 37°C ona sosoo ai lea ma le 5 minute i le 95°C a'o le'i faia le PCR. Ona faia lea o le PCR e fa'aaoga ai le Phusion High-Fidelity DNA polymerase, universal PCR primers, ma Index (X) primers. Mulimuli ane, sa fa'amamāina oloa PCR (AMPure XP system) ma iloiloina le lelei o le faletusi i luga o le Agilent Bioanalyzer 2100 system. Ona fa'asologaina lea o le faletusi cDNA e fa'aaoga ai le Novaseq sequencer. O faila ata mata mai Illumina sa liua i faitauga mata e fa'aaoga ai le CASAVA Base Calling. O fa'amaumauga mata e teuina i faila fa'atulagaga FASTQ(fq) o lo'o i ai fa'asologa faitau ma uiga fa'avae talafeagai. Filifili le HISAT2 e fa'afetaui ai faitauga fa'asologa ua fa'amama i le genome fa'asino Sscrofa11.1. I se tulaga lautele, e lagolagoina e le HISAT2 genomes o soʻo se tele, e aofia ai genomes e sili atu i le 4 piliona faʻavae, ma o tau masani ua setiina mo le tele o parakalafa. O le faʻapipiʻiina o faitauga mai faʻamaumauga o le RNA Seq e mafai ona faʻatulagaina lelei e faʻaaoga ai le HISAT2, le faiga sili ona vave o loʻo maua i le taimi nei, faʻatasi ai ma le saʻo tutusa pe sili atu nai lo se isi lava metotia.
O le tele o tusitusiga e atagia sa'o ai le tulaga o le fa'aalia o kene. O tulaga o fa'aalia o kene e iloiloina e ala i le tele o tusitusiga (numera o fa'asologa) e feso'ota'i ma le genome po'o exons. O le aofa'i o faitauga e tutusa ma tulaga o fa'aalia o kene, umi o kene, ma le loloto o le fa'asologa. Na fuafuaina le FPKM (vaega i le afe o paga fa'avae o tusitusiga fa'asologa i le miliona o paga fa'avae) ma na fuafuaina P-values ​​​​o fa'aaliga eseese e fa'aaoga ai le afifi DESeq2. Ona matou fuafuaina lea o le fua faatatau o le iloa sese (FDR) mo P values ​​ta'itasi e fa'aaoga ai le metotia a Benjamini-Hochberg9 e fa'avae i luga o le galuega faatino R ua fausia i totonu "p.adjust".
O le RNA na vavae'ese mai vaega o le fatu na liua i le cDNA i le malosi o le 200 ng/μl e fa'aaoga ai le SuperScript IV Vilo Master mix mai Thermo (Thermo, cat. no. 11756050). Na faia le Quantitative RT-PCR e fa'aaoga ai le Applied Biosystems Endura Plate Microamp 384-well transparent reaction plate (Thermo, cat. no. 4483319) ma le microamp optical adhesive (Thermo, cat. no. 4311971). O le reaction mix e aofia ai le 5 µl Taqman Fast Advanced Master mix (Thermo, cat # 4444557), 0.5 µl Taqman Primer ma le 3.5 µl H2O na palu fa'atasi i le well. Na fa'atinoina ta'amilosaga masani o le qPCR ma na fuaina tau o le CT e fa'aaoga ai le Applied Biosystems Quantstudio 5 real-time PCR instrument (384-well module; product # A28135). Sa fa'atauina mai ia primers Taqman mai Thermo (GAPDH (Ss03375629_u1), PARP12 (Ss06908795_m1), PKDCC (Ss06903874_m1), CYGB (Ss06900188_m1), RGL1 (Ss06868890_m1), ACTN1 (Ss01009508_mH), GATA4 (Ss03383805_u1), GJA1 (Ss03374839_u1), COL1A2 (Ss03375009_u1), COL3A1 (Ss04323794_m1), ACTA2 (Ss04245588_m1). O tau o le CT o fa'ata'ita'iga uma sa fa'atulagaina i le housekeeping gene GAPDH.
Sa iloiloina le fa'asa'olotoina o le NT-ProBNP i ala o faasalalauga e fa'aaoga ai le pusa NT-ProBNP (pua'a) (Cat. No. MBS2086979, MyBioSource) e tusa ai ma le faiga a le kamupani gaosi oloa. I se faapuupuuga, e 250 µl o fa'ata'ita'iga ta'itasi ma le tulaga masani sa fa'aopoopoina fa'alua i pu ta'itasi. I le taimi lava na mae'a ai ona fa'aopoopo le fa'ata'ita'iga, fa'aopoopo le 50 µl o le Assay Reagent A i pu ta'itasi. Lūlū mālie le ipu ma fa'amaufa'ailoga i le fa'amaufa'ailoga. Ona fa'asusu lea o papamaa i le 37°C mo le 1 itula. Ona fa'asusu lea o le vaila'au ma fufulu pu fa'afa taimi i le 350 µl o le vaila'au fufulu 1X, fa'asusu le vaila'au fufulu mo le 1-2 minute i taimi ta'itasi. Ona fa'aopoopo lea o le 100 µl o le Assay Reagent B i pu ta'itasi ma fa'amaufa'ailoga i le fa'amaufa'ailoga o le ipu. Sa lūlū mālie le papamaa ma fa'asusu i le 37°C mo le 30 minute. Fa'asusu le vaila'au ma fufulu pu fa'afa taimi i le 350 µl o le vaila'au fufulu 1X. Fa'aopoopo le 90 µl o le vaila'au fa'apipi'i i pu ta'itasi ma tapuni le ipu. Fa'asusu le ipu i le 37°C mo le 10-20 minute. Fa'aopoopo le 50 µl o le Stop Solution i pu ta'itasi. Sa fuaina loa le ipu e fa'aaoga ai le Cytation (BioTek) plate reader ua seti i le 450 nm.
Sa faia auiliiliga o le malosiaga e filifili ai le tele o vaega lea o le a maua ai le >80% le malosiaga e iloa ai se suiga atoatoa e 10% i le parakalafa faatasi ai ma le fua faatatau o le sese o le Ituaiga I e 5%. Sa faia auiliiliga o le malosiaga e filifili ai le tele o vaega lea o le a maua ai le >80% le malosiaga e iloa ai se suiga atoatoa e 10% i le parakalafa faatasi ai ma le 5% fua faatatau o le sese o le Ituaiga I. Анализ мощности был выполнен для выбора размеров групп, которые обеспечат >80% мощности для обнаружения 10% изменения параметра с 5% частотой ошибок типа I. Sa faia le auiliiliga o le malosiaga e filifili ai le tele o vaega o le a maua ai le >80% le malosiaga e iloa ai le 10% o suiga atoatoa o le parakalafa faatasi ai ma le fua faatatau o le sese o le Ituaiga I e 5%.进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％I功效以检测参数中10％绝对变化和5％I他的生。进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％I功效以检测参数中10％绝对变化和5％I他的生。 Был проведен анализ мощности для выбора размера группы, который обеспечил бы > 80% мощности для обнаругложениа изменения параметров и 5% частоты ошибок типа I. Sa faia se auiliiliga o le malosi e filifili ai se tele o le vaega o le a maua ai le >80% le malosi e iloa ai le 10% o suiga atoatoa o le parakalafa ma le 5% o le fua faatatau o le sese ituaiga I.Sa filifilia fa'afuase'i vaega o a'ano a'o le'i faia le fa'ata'ita'iga. O au'ili'iliga uma sa le'i fa'aaogaina ni tulaga ma sa fa'aliliuina fa'ata'ita'iga pe a uma ona au'ili'iliina fa'amaumauga uma. Sa fa'aaogaina le polokalama GraphPad Prism (San Diego, CA) e fa'atino ai au'ili'iliga fa'amaufa'ailoga uma. Mo fuainumera uma, o p-values ​​sa manatu e taua i le <0.05. Mo fuainumera uma, o p-values ​​​​na manatu e taua i tau <0.05. Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. Mo fuainumera uma, o p-values ​​​​na manatu e taua i tau <0.05.对于所有统计数据，p 会在伀<0.05 时被认为是显着的。对于所有统计数据，p 会在伀<0.05 时被认为是显着的。 Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. Mo fuainumera uma, o p-values ​​​​na manatu e taua i tau <0.05.Sa faia le suega t-t a le Two-tailed Student i faʻamaumauga ma na o le 2 faʻatusatusaga. Sa faʻaaogaina le ANOVA e tasi le itu poʻo le lua itu e fuafua ai le taua i le va o vaega eseese. A faʻatinoina suega pe a maeʻa, sa faʻaaogaina le faʻasaʻoga a Tukey e faʻamatala ai faʻatusatusaga eseese. O faʻamaumauga RNAsec e iai ni mafaufauga faʻapitoa faʻamaumauga pe a faʻatatauina le FDR ma le p.adjust e pei ona faʻamatalaina i le vaega o Metotia.
Mo nisi faʻamatalaga e uiga i le mamanu o le suʻesuʻega, tagaʻi i le aotelega o le Nature Research Report o loʻo fesoʻotaʻi ma lenei tusiga.