Faafetai mo le asiasi ile Nature.com. O le su'esu'ega o lo'o e fa'aogaina e fa'atapula'aina le lagolago a le CSS. Mo le poto sili ona lelei, matou te fautuaina oe e te faʻaogaina se suʻesuʻega fou (pe faʻamalo le Faiga Faʻatasi i Internet Explorer). I le taimi nei, ina ia mautinoa le faʻaauauina o le lagolago, matou te tuʻuina atu le saite e aunoa ma sitaili ma JavaScript.
O loʻo i ai le manaʻoga mo se faʻatuatuaina in vitro system e mafai ona toe faʻaleleia saʻo le siosiomaga faʻaletino o le fatu mo suʻega vailaʻau. O le fa'atapula'aina o le maua o faiga fa'aleaganu'u fatu o le tagata ua mafua ai ona le sa'o fa'auigaga o a'afiaga o vaila'au fa'atotonu fatu. O iinei, ua matou atiaʻe ai se faʻataʻitaʻiga faʻaleaganuʻu fatu (CTCM) e faʻaosoina faʻamalosi fatu fatu ma faʻaosoina le faʻalauteleina o le tino i le taimi o le systolic ma le diastolic vaega o le taamilosaga o le fatu. Ina ua maeʻa le 12 aso o le aganuu, o lenei faiga na faʻaleleia atili ai le faʻaogaina o vaega o fatu, ae e leʻi faʻasaoina atoatoa a latou faʻatonuga. O le mea lea, ina ua maeʻa suʻesuʻega mole mole laiti, na matou iloa ai o le faʻaopoopoga o le 100 nM triiodothyronine (T3) ma le 1 μM dexamethasone (Dex) i la matou auala na tausia ai le microstructure o vaega mo le 12 aso. I le tuʻufaʻatasia ma togafitiga T3 / Dex, o le CTCM system o loʻo tausia faʻamaumauga faʻaliliuga, faʻaogaina, gaioiga faʻasolosolo, ma le faʻatulagaina faʻamaoni i le tulaga tutusa e pei o fatu fatu fou mo 12 aso. E le gata i lea, o le tele o le faʻalauteleina o le fatu fatu i le aganuu e faʻaosoina ai le hypertrophic cardiac signaling, e maua ai faʻamaoniga mo le mafai e le CTCM ona faʻataʻitaʻiina tulaga hypertrophic faʻaosoina e le cardiac stretch. I le faaiuga, e mafai e le CTCM ona faʻataʻitaʻiina le physiology ma le pathophysiology o le fatu i le aganuu i taimi uumi, e mafai ai ona faʻamaonia le suʻesuʻeina o vailaʻau.
Aʻo leʻi faia suʻesuʻega faʻapitoa, e manaʻomia le faʻatuatuaina in vitro system e mafai ona toe gaosia saʻo le siosiomaga physiological o le fatu o le tagata. O ia faiga e tatau ona fa'ata'ita'i i suiga fa'ainisinia, ta'alili o le fatu, ma mea fa'aletino. O faʻataʻitaʻiga o manu e masani ona faʻaaogaina e fai ma faʻataʻitaʻiga suʻesuʻe mo le physiology cardiac ma faʻatapulaʻaina le faʻatuatuaina i le atagia o aʻafiaga o vailaʻau i le fatu o le tagata1,2. Mulimuli ane, o le Ideal Cardiac Tissue Culture Experimental Model (CTCM) o se faʻataʻitaʻiga e sili ona maaleale ma faʻapitoa mo togafitiga faʻapitoa ma vailaʻau faʻapitoa, toe faʻaleleia saʻo le physiology ma pathophysiology o le fatu o le tagata3. O le leai o sea faiga faʻatapulaʻa le mauaina o togafitiga fou mo le faʻaletonu o le fatu4,5 ma ua taʻitaʻia ai le cardiotoxicity fualaau o se mafuaʻaga tele mo le alu ese mai le maketi6.
I le sefulu tausaga ua tuana'i, e valu vaila'au e le'o fatu fatu ua ave'esea mai le fa'aogaina ile falema'i ona e mafua ai le fa'aumiumi ole taimi ole QT e o'o atu ai ile ventricular arrhythmias ma le oti fa'afuase'i7. O le mea lea, o loʻo i ai se manaʻoga faʻateleina mo taʻiala faʻapitoa suʻesuʻega faʻapitoa e iloilo ai le aoga o le cardiovascular ma le oona. O le fa'aaogaina lata mai nei o le cardiomyocytes e maua mai i le cell cell cell (hiPS-CM) i le su'esu'eina o vaila'au ma su'ega oona e maua ai se vaega o fofo i lenei fa'afitauli. Ae ui i lea, o le natura leʻo o le hiPS-CMs ma le leai o se faʻalavelave tele o le fatu fatu o ni tapulaʻa tele o lenei metotia. O suʻesuʻega talu ai nei ua faʻaalia ai o lenei tapulaʻa e mafai ona faʻatoʻilaloina i se vaega e ala i le faʻaaogaina vave o le hiPS-CM e faʻatupu ai faʻamaʻi fatu fatu i se taimi e leʻi leva ona amata le faʻalavelave faʻafuaseʻi ma faasolosolo malie le faʻaosofia o le eletise i le taimi. Ae ui i lea, o nei hiPS-CM microtissues e leai ni mea faʻaeletise faʻapitoa ma konekarate matua o le myocardium matua. E le gata i lea, o le fatu o le tagata e iai se fausaga e sili atu ona faigata, e aofia ai se faʻafefiloi eseese o ituaiga sela eseese, e aofia ai sela endothelial, neurons, ma stromal fibroblasts, e fesoʻotaʻi faʻatasi e seti faʻapitoa o matrix matrix proteins. O lenei heterogeneity o tagata e le o cardiomyocyte 11,12,13 i le fatu mammalian matutua o se pa puipui tele i le faʻataʻitaʻiina o le fatu fatu e faʻaaoga ai ituaiga sela taʻitasi. O nei tapula'a tetele o lo'o fa'amamafaina ai le taua o le atina'eina o metotia mo le fa'atupuina o le tino o le myocardial i lalo o le physiological ma pathological tulaga.
O vaega manifinifi (300 µm) o le fatu o le tagata ua fa'amaonia o se fa'ata'ita'iga lelei o le myocardium o le tagata. O lenei metotia e maua ai le avanoa i se 3D multicellular system atoatoa e tutusa ma fatu fatu o le tagata. Ae ui i lea, seia oʻo i le 2019, o le faʻaogaina o vaega faʻaleaganuʻu fatu na faʻatapulaʻaina e le ola puupuu (24 h) aganuu. E mafua lenei mea i le tele o mea e aofia ai le le lava o le faʻalauteleina o le tino-mechanical, le faʻaogaina o le ea-suavai, ma le faʻaogaina o ala faʻasalalau faigofie e le lagolagoina manaʻoga o le fatu fatu. I le 2019, e tele vaega suʻesuʻe na faʻaalia o le tuʻufaʻatasia o mea faʻainisinia i faiga faʻaleaganuʻu fatu e mafai ona faʻalauteleina ai le ola o aganuu, faʻaleleia le faʻaalia o le fatu, ma faʻataʻitaʻiina faʻamaʻi fatu. E lua suʻesuʻega mataʻina 17 ma le 18 o loʻo faʻaalia ai o le utaina o masini uniaxial e iai se aafiaga lelei i le fatu fatu i le taimi o aganuu. Ae ui i lea, o nei suʻesuʻega e leʻi faʻaogaina ai le faʻaogaina o le physico-mechanical faʻamalosi e tolu-dimensional o le taamilosaga o le loto, talu ai o vaega o le fatu na faʻapipiʻiina i le isometric tensile forces 17 poʻo le linear auxotonic loading 18. O nei metotia o le faʻalauteleina o aano na mafua ai le taofiofia o le tele o genes cardiac poʻo le faʻaalia o kenera e fesoʻotaʻi ma tali faʻalavelave faʻafuaseʻi. Ae maise, Pitoulis et al. 19 atia'e se ta'ele fa'aleaganu'u fa'ato'aga fatu mo le toe fa'aleleia o le ta'amilosaga o le fatu e fa'aaoga ai le fa'aogaina o le fa'aliliuga malosi ma fa'alavelave fa'alavelave. E ui lava o lenei faiga e mafai ai ona sili atu le saʻo i vitro cardiac cycle faʻataʻitaʻiga, o le lavelave ma le maualalo o le gaosiga o le auala e faʻatapulaʻaina ai le faʻaogaina o lenei faiga. O le matou fale su'esu'e talu ai nei na fausia ai se faiga fa'aleaganu'u fa'afaigofie e fa'aoga ai le fa'aosoina o le eletise ma se auala fa'atumauina e fa'amautu ai le fa'atumauina o vaega o puaa ma fatu fatu o le tagata mo le 6 aso20,21.
I le tusitusiga o loʻo i ai nei, matou te faʻamatalaina se faʻataʻitaʻiga aganuʻu o le fatu (CTCM) e faʻaaoga ai vaega o le fatu puaa e faʻapipiʻi ai faʻamatalaga malie e toe faʻamatalaina le tolu-dimensional cardiac physiology ma pathophysiological distension i le taimi o le taamilosaga o le fatu. O lenei CTCM e mafai ona faʻateleina le saʻo o faʻamaʻi faʻamaʻi faʻamaʻi i se tulaga e leʻi ausia muamua e ala i le tuʻuina atu o se tau faʻapitoa, ogatotonu o le faʻaogaina o le cardiac system e faʻataʻitaʻiina le physiology / pathophysiology o le fatu mammalian mo suʻesuʻega o vailaʻau muamua.
O faʻailoga faʻainisinia Hemodynamic e taua tele i le faʻamautuina o galuega cardiomyocyte i vitro 22,23,24. I le tusitusiga o loʻo i ai nei, ua matou atinaʻeina se CTCM (Ata 1a) e mafai ona faʻataʻitaʻiina le siosiomaga o le fatu matua e ala i le faʻaosofiaina o le eletise ma le masini faʻamalosi i laina o le physiological (1.2 Hz, 72 paʻu i le minute). Ina ia aloese mai le faʻalauteleina o le tino i le taimi o le diastole, sa faʻaaogaina se masini lomitusi 3D e faʻateleina ai le tele o le tino i le 25% (Fig. 1b). O le saoasaoa o le eletise na fa'aosoina e le C-PACE system na fa'atulaga e amata i le 100 ms a'o le'i fa'aogaina le fa'aogaina o le fa'aogaina o fa'amaumauga e toe fa'asolo atoa ai le taamilosaga o le fatu. O lo'o fa'aogaina e le faiga o le aganu'u a le tissue se fa'apolokalame pneumatic actuator (LB Engineering, Siamani) e fa'atupu fa'ata'amilomilo fa'alautele ai se pa'u silikoni fetu'una'i e fa'atupu ai le fa'alauteleina o fasi fatu i le potu pito i luga. O le faiga na fesoʻotaʻi atu i se laina ea i fafo e ala i se faʻasalalauga faʻamalosi, lea na mafai ai ona faʻafetaui saʻo le mamafa (± 1 mmHg) ma le taimi (± 1 ms) (Fig 1c).
Fa'apipi'i le vaega o mea i le mama lagolago 7 mm, o lo'o fa'aalia i le lanumoana, i totonu o le potu fa'aleaganu'u o le masini. O le potu fa'aleaganu'u e tu'u'ese'ese mai le potu ea e se pa'u silikoni fa'alelei manifinifi. Tu'u se kesi i le va o potu ta'itasi ina ia puipuia ai le gase. O le tapuni o le masini o loʻo i ai graphite electrodes e maua ai le eletise eletise. b Fa'ata'ita'iga fa'ata'ita'iga o le masini masini tele, mama ta'iala ma mama lagolago. O vaega o le aano (lanu enaena) e tu'u i luga o le masini lapo'a ma le mama ta'iala e tu'u i totonu o le tootoo i le pito i fafo o le masini. I le fa'aogaina o le ta'iala, tu'u ma le fa'aeteete le mama lagolago o lo'o ufiufi i le mea fa'apipi'i fa'apipi'i i luga o le vaega o le fatu. c Kalafi o lo'o fa'aalia ai le taimi o le fa'aosoina o le eletise e pei o se galuega o le mamafa o potu ea e pulea e se fa'apolokalame pneumatic actuator (PPD). O se masini e maua ai faʻamatalaga na faʻaogaina e faʻafetaui ai le faʻaosofia o le eletise e faʻaaoga ai masini faʻamalosi. A oʻo atu le mamafa i totonu o le potu faʻaleaganuʻu i le faʻamaufaʻailoga, e tuʻuina atu se faailo o le pulupulu i le C-PACE-EM e faʻaosoina ai le eletise. o Ata o CTCM e fa ua tuu i luga o se fata incubator. E fa masini e fesoʻotaʻi atu i le tasi PPD e ala i se taʻavale pneumatic, ma faʻapipiʻi masini faʻapipiʻi i totonu o le valve hemostatic e mataʻituina ai le mamafa i totonu o le eletise pneumatic. O masini ta'itasi o lo'o iai vaega e ono.
I le faʻaaogaina o se tasi pneumatic actuator, na mafai ai ona matou pulea le 4 CTCM masini, e mafai e ia mea taʻitasi ona faʻapipiʻi vaega 6 tissue (Fig. 1d). I totonu o le CTCM, o le mamafa o le ea i totonu o le potu ea ua liua i le mamafa faʻatasi i totonu o le potu vai ma faʻaosofia ai le faʻalauteleina o le physiological o le fasi fatu (Ata 2a ma Ata Ata Faʻaopoopo 1). Iloiloga o le faʻalauteleina o le tino ile 80 mm Hg. Art. fa'aalia le fa'aloaloa o vaega o a'a e 25% (Ata 2b). O lenei pasene faʻalautele ua faʻaalia e fetaui ma le umi o le sarcomere o le physiological o le 2.2-2.3 µm mo le faʻalavelave masani o le cardiac section17,19,25. Sa su'esu'eina le fa'aogaina o le tino i le fa'aogaina o meapueata fa'apitoa (Ata Fa'aopoopo 1). O le maualuga ma le saoasaoa o le gaioiga o le tino (Fig. 2c, d) e fetaui ma le faʻalauteleina i le taimi o le taamilosaga o le fatu ma le taimi i le taimi o le systole ma le diastole (Fig. 2b). O le fa'aloaloa ma le saosaoa o le fatu fatu i le taimi o le fa'aitiitia ma le malolo sa tumau pea mo le 12 aso i le aganuu (Ata 2f). Ina ia iloilo le aʻafiaga o le faʻamalosia o le eletise i luga o le konekarate i le taimi o le aganuʻu, na matou fausia ai se metotia mo le fuafuaina o le faʻaogaina o le faʻaogaina o le faʻaogaina o le algorithm faʻapipiʻi (Faʻaopoopo Ata 2a, b) ma mafai ai ona iloa le va o faʻalavelave faʻatasi ma le leai o se eletise. O le vaega lava lea o le fatu (Ata 2f). I totonu o le itulagi feaveaʻi o le tipi (R6-9), o le voltage i le taimi o le faʻamalosia o le eletise e 20% maualuga atu nai lo le leai o se faʻamalosi eletise, lea e faʻaalia ai le sao o le faʻamalosia o le eletise i le galuega faʻapipiʻi.
O fa'ailoga fa'atusa o le mamafa o le potu ea, le mamafa o le potu su'esu'e, ma le fuaina o fe'avea'i o mea e fa'amaonia ai o le mamafa o le potu e suia ai le mamafa o le vai, ma mafua ai se gaioiga tutusa o le fasi pepa. e Fa'atusaina fa'ailoga o le pasene fa'aloaloa (lanumoana) o vaega aano e tutusa ma le pasene fa'aloaloa (lanu moli). c O le fuaina o le gaioiga o le fasi fatu e ogatasi ma le fuaina o le saoasaoa o le gaioiga. (o) Fa'ata'ita'iga ala o le ta'amilosaga (laina lanumoana) ma le saoasaoa (laina togitogi moli) i totonu o se fasi fatu. e Fa'atatauina o le ta'amilosaga (n = 19 fasi i le vaega, mai pua'a eseese), taimi fa'aitiitiga (n = 19 fasi i le vaega), taimi malolo (n = 19 fasi i le vaega, mai pua'a eseese), fa'agaioiga o mea (n = 25). fasi)/vaega mai puaa eseese), tumutumu o le saoasaoa o le systolic (n = 24(D0), 25(D12) fasi/vaega mai puaa eseese) ma le maualuga o le malologa (n=24(D0), 25(D12) fasi/vaega mai puaa eseese). O le su'ega-t a Tamaiti e lua-tail e leai se eseesega tele i soo se parakalafa. f Fa'ata'ita'iga fa'ata'ita'iga su'esu'ega fa'ailoga o vaega aano o lo'o iai (mūmū) ma e aunoa ma le (lanumoana) fa'aosofia eletise, vaega fa'aitulagi e sefulu o vaega o a'ano mai le vaega lava e tasi. O laulau pito i lalo o loʻo faʻaalia ai le faʻatusatusaina o le pasene o le eseesega i le faʻalavelave i vaega o le tino ma le leai o se eletise eletise i vaega e sefulu mai vaega eseese. (n = 8 fasi / vaega mai puaa eseese, lua-tailed Student t-test ua faia; ****p <0.0001, **p <0.01, *p <0.05). (n = 8 fasi / vaega mai puaa eseese, lua-tailed Student t-test ua faia; ****p <0.0001, **p <0.01, *p <0.05). (n = 8 срезов/группу от разных свиней, проводится двусторонний t-критерий Стьюдента; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05). (n = 8 vaega/vaega mai puaa eseese, su'ega-t a Tamaiti-a'oga lua-si'u; ****p<0.0001, **p<0.01, *p<0.05). （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p < 0.0001，**p < 0.01，*p < 0.05）。 （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p < 0.0001，**p < 0.01，*p < 0.05）。 (n = 8 срезов/группу, от разных свиней, двусторонний критерий Стьюдента; ****p <0,0001, **p <0,01, *p <0,05). (n = 8 vaega/vaega, mai puaa eseese, lua-si'usi'u su'ega a Tamaiti aoga; ****p<0.0001, **p<0.01, *p<0.05).Fa'amau fa'aletonu o lo'o fa'atusalia ai le uiga ± fa'asologa masani.
I la matou faiga fa'aleaganu'u fatu biomimetic talu ai [20, 21], matou te fa'atumauina le fa'aogaina, galuega, ma le fa'atulagaina lelei o fasi fatu mo 6 aso e ala i le fa'aogaina o le fa'aosoina o le eletise ma le fa'amalieina o le tu'ufa'atasiga. Ae ui i lea, ina ua mavae le 10 aso, o nei fuainumera na paʻu tele. O le a matou va'ai i vaega na fa'aleaganu'u i la matou faiga fa'aleaganu'u fa'ato'aga 20, 21 tulaga fa'atonutonu (Ctrl) ma o le a matou fa'aogaina la matou auala na fa'atumauina muamua e pei o tulaga MC ma aganu'u i lalo o le fa'aoso fa'ainisinia ma le eletise (CTCM). valaauina . Muamua, na matou fuafuaina o le faʻamalosia o masini e aunoa ma le faʻamalosia o le eletise e le lava e faʻatumauina ai le faʻaogaina o le tino mo aso 6 (Faʻaopoopo Fig. 3a,b). O le mea e malie ai, faʻatasi ai ma le faʻaofiina o le faʻaogaina o le physio-mechanical ma le eletise e faʻaaoga ai le STCM, o le faʻaogaina o vaega o le fatu 12-aso na tumau pea e pei o vaega fou o le fatu i lalo o tulaga MS, ae le o lalo o le Ctrl tulaga, e pei ona faʻaalia e le MTT suʻesuʻega (Fig 1). 3a). O lo'o ta'u mai ai o le fa'aosoina fa'ainisinia ma le fa'ata'ita'iga o le taamilosaga o le loto e mafai ona fa'atumauina ai vaega o le tino e mafai ona fa'aluaina le umi e pei ona lipotia mai i la tatou faiga fa'aaganu'u fa'ata'atitia talu ai. Ae ui i lea, o le suʻesuʻeina o le faʻatulagaina o vaega o le tino e ala i le immunolabeling o le cardiac troponin T ma le connexin 43 na faʻaalia ai o le connexin 43 faʻamatalaga na sili atu le maualuga i le MC tissues i le aso 12 nai lo le pulea i le aso lava e tasi. Ae ui i lea, e leʻi faʻatumauina atoatoa le faʻaaliga connexin 43 ma le Z-disc (Fig. 3b). Matou te faʻaogaina se faʻataʻitaʻiga faʻapitoa (AI) e faʻatusatusa ai le faʻaogaina o le tino26, o se faʻataʻitaʻiga faʻavae aʻoaʻoga loloto e faʻavae i luga o le troponin-T ma le connexin staining43 e otometi ai le faʻatusatusaina o le faʻatulagaina ma le faʻafefe o fasi fatu i tulaga o le malosi o le localization. O lenei metotia e faʻaogaina ai le Convolutional Neural Network (CNN) ma se faʻataʻitaʻiga loloto aʻoaʻoga e faʻalagolago i le faʻatusatusaina o le faʻatulagaina o le fatu fatu i se faiga faʻapitoa ma le le faʻaituau, e pei ona faʻamatalaina i le faʻamatalaga. 26. MC tissue na faʻaalia le faʻaleleia atili o le faʻatulagaga tutusa i le aso 0 pe a faʻatusatusa i vaega faʻatonu. E le gata i lea, o le faʻaogaina o le trichrome a Masson na faʻaalia ai le maualalo o le pasene o fibrosis i lalo o tulaga MS pe a faʻatusatusa i tulaga faʻatonutonu i le aso 12 o aganuu (Fig. 3c). Aʻo faʻateleina e le CTCM le faʻaogaina o vaega o fatu fatu i le aso 12 i se tulaga tutusa ma le fatu fatu fou, e leʻi faʻaleleia atili ai le faʻatulagaina o vaega o fatu.
a Bar kalafi o loʻo faʻaalia ai le faʻatusatusaina o le MTT o le faʻaogaina o fasi fatu fou (D0) poʻo le aganuu fasi fatu mo le 12 aso a le o le tuʻufaʻatasia (D12 Ctrl) poʻo le CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) fasi/vaega/vaega e tasi le OVA.##0 su'ega, <0##0 su'ega e tasi, ANOVA0##. fa'atusatusa ile D0 ma le **p <0.01 fa'atusatusa ile D12 Ctrl). O le kalafi o le pa o loʻo faʻaalia ai le faʻatusatusaina o le MTT faʻaogaina o fasi fatu fou (D0) poʻo le aganuu fasi fatu mo le 12 aso a le o le tuʻufaʻatasia (D12 Ctrl) poʻo le CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl ), 12 (D12 MC) faʻataʻitaʻiga / faʻataʻitaʻiga <##p ; 0.0001 faʻatusatusa ile D0 ma **p <0.01 faʻatusatusa ile D12 Ctrl).o le histogram o loʻo faʻaalia ai le faʻatusatusaina o le faʻaogaina o le MTT fatu fou vaega (D0) poʻo le aganuu o vaega o le fatu mo le 12 aso i soʻo se aganuʻu faʻamau (D12 pule) poʻo CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 pule) ), 12 (D12 MC) vaega / vaega o le suʻega e tasi mai ANOVA, se tasi o suʻega;####p < 0,0001 по сравнению с D0 и **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p <0.0001 fa'atusatusa ile D0 ma le **p <0.01 fa'atusatusa ile D12 Ctrl). a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切)片(D0)片或心脏切片培养12 天的MTT 活力的量化)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单后行单后从相比，####p < 0.0001，与D12 Ctrl 相比，**p < 0.01). a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切)片(D0)片，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；与D0 相比，####p < 0.0001，与D12 Ctrl).histogram o loʻo faʻaalia ai le faʻatusatusaina o le MTT viability i vaega fou fatu (D0) poʻo vaega fatu faʻaleaganuʻu mo 12 aso i le aganuʻu static (D12 pule) poʻo le CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 pule)), 12 (D12 MC) vaega / vaega mai suʻega ANOVA eseese, tasi-auala suʻega ANOVA;####p < 0,0001 по сравнению с D0, **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p <0.0001 fa'atusatusa ile D0, **p <0.01 fa'atusatusa ile D12 Ctrl).b Troponin-T (lanu meamata), connexin 43 (mumu) ma le DAPI (lanumoana) i vaega fatu fou fou (D0) po'o vaega fatu ua fa'atupuina i lalo o tulaga fa'amau (Ctrl) po'o tulaga CTCM (MC) mo le 12 aso) o fa'atusa ata immunofluorescence (fua avanoa = 100 µm). Fa'ata'ita'iga fa'apitoa fa'atusatusaga o le fatu fatu fatu fa'atulagaina fa'amaoni (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) fasi/vaega ta'itasi mai pua'a 'ese'ese, tasi le ala su'ega ANOVA; ####p <0.0001 fa'atusatusa i le D0 ma le ****p <0.0001 fa'atusatusa i le D12 Ctrl). Fa'ata'ita'iga fa'apitoa fa'atusatusaga o le fatu fatu fatu fa'atulagaina fa'amaoni (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) fasi/vaega ta'itasi mai pua'a eseese, o le su'ega ANOVA e tasi e faia; ####p <0.0001 fa'atusatusa i le D0 ma le ****p <0.0001 fa'atusatusa i le D12 Ctrl). Количественная оценка структурной целостности сердечной тпкани искусственным интеллектом (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl/D12), . от разных свиней, проводится однофакторный тест ANOVA ####p < 0,0001 по сравнению с D0 и ****p < 0,0001 по сравнению Fuafuaga o le faʻatulagaina faʻamaoni o le fatu fatu e ala i le atamai faʻapitoa (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) vaega / vaega mai puaa eseese, suʻega ANOVA e tasi na faia; ####p <0.0001 vs. ma D0 ma ****p <0.0001 faʻatusatusa i le D0 ma le ****p <0.0001 Ctrl).人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) fasi/vaega puaa eseese taitasi, su'ega ANOVA tasi itu;####p01 相0.****p01 ， 0.****p01 相0. < 0.0001 与D12 Ctrl 相比）.人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) fasi/vaega puaa eseese ta'itasi, su'ega ANOVA tasi itu;##000 < 盯他.##000 < 0.****p < 0.****p. < 0.0001 与D12 Ctrl 相比）. Искусственный интеллект для количественной оценки структурной целостности сердечной ткани (n = 7 (D0), 7 (D0), 7 (D12) Ctrl (D12) срезов/группу каждой из разных свиней, односторонний тест ANOVA ####p <0,0001 vs. D0 Для сравнения ****p < 0,0001 по сравню ). Faʻamatalaga faʻapitoa e faʻatusatusa ai le faʻatulagaina o le fatu fatu (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) vaega / vaega taʻitasi o puaa eseese, suʻega ANOVA e tasi; c Fa'atusa ata (agavale) ma le fa'atusatusaga (taumatau) mo fasi fatu ua pisia i le stains trichrome a Masson (Scale bare = 500 µm) (n = 10 fasi/vaega ta'itasi mai pua'a 'ese'ese, fai le su'ega ANOVA e tasi; ####p <0.0001 fa'atusatusa i le D0 ma le ***p <0.001 pe a fa'atusatusa i le D0 ma le ***p <0.02 Ctrl). c Fa'atusa ata (agavale) ma le fa'atusatusaga (taumatau) mo fasi fatu ua pisia i le stains trichrome a Masson (Scale bare = 500 µm) (n = 10 fasi/vaega ta'itasi mai pua'a eseese, fai le su'ega ANOVA e tasi; #### p <0.0001 fa'atusatusa i le D0 ma le ***p <0.001 pe a fa'atusatusa i le D0 ma le ***p <0.0. c Репрезентативные изображения (слева) ma количественная оценка (справа) срезов сердца, окрашенных трихромным краснамлате без покрытия = 500 мкм) (n = 10 срезов/группу от разных свиней, выполняется односторонний тест ANOVA; #### p < 0,00001 видео 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Fa'atusa ata (agavale) ma le fa'atusatusaga (taumatau) o vaega o le fatu ua pisia i le stains trichrome a Masson (fua e le'i fa'apipi'iina = 500 µm) (n = 10 vaega/vaega mai pua'a eseese, su'ega ANOVA e tasi le ala; #### p <0 .0001 fa'atusatusa i le D0 ma le ***p <0.001 pe a fa'atusatusa i le D0 ma le ***p <0.001). c 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像（左）和量化（右）（裸尺度（裸尺度（裸尺度（ 0n0 度= 1个切片/组，每组来自不同的猪，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0.0001 与D0 相比，***p <0.0012 C 。 C 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 （左 左） 量化 （右） 裸尺度 裸尺度 裸尺度裸尺度 = 500 µm） （n = 10 个 切片 组 每 组 来自 不同 猪 ， 进行 单向 单向0.##0.与D0 相比，***p < 0.001 与D12 Ctrl 相比）。 c Репрезентативные изображения (слева) ma количественный анализ (справа) срезов сердца, окрашенных трихромным красителка = 500 мкм) (n = 10 срезов/группа, каждый от другой свиньи, протестировано с помощью однофакторного дисперси <###; 0,0001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Fa'atusa ata (agavale) ma le aofa'i (taumatau) o vaega o le fatu ua pisia i le stains trichrome a Masson (ganoa = 500 µm) (n = 10 vaega/vaega, ta'itasi mai se pua'a 'ese'ese, fa'ata'ita'iina e ala e tasi le su'esu'ega o eseesega ;#### # p <0.0001 fa'atusatusa i le D0, ***p <0.0.1 pe a fa'atusatusa i le D0, ***p <0.1).Fa'amau fa'aletonu o lo'o fa'atusalia ai le uiga ± fa'asologa masani.
Na matou manatu e ala i le faʻaopoopoina o molelaʻau laiti i le aganuu, e mafai ona faʻaleleia le amiosaʻo cardiomyocyte ma faʻaitiitia le atinaʻe fibrosis i le taimi o le aganuʻu CTCM. O lea na matou suʻesuʻeina ai mole mole laiti e faʻaaoga ai a matou aganuu faʻatonu20,21 ona o le laʻititi o mea faʻalavelave. Dexamethasone (Dex), triiodothyronine (T3), ma le SB431542 (SB) na filifilia mo lenei mata. O nei molelaiti laiti na faʻaaogaina muamua i aganuu hiPSC-CM e faʻaosofia ai le matua o cardiomyocytes e ala i le faʻateleina o le umi o le sarcomere, T-tubules, ma le saoasaoa o le faʻaogaina. E le gata i lea, o le Dex (se glucocorticoid) ma le SB ua lauiloa e taofiofia le mumū29,30. O le mea lea, matou te faʻataʻitaʻiina pe o le faʻaofiina o se tasi poʻo se tuʻufaʻatasiga o nei molelaiti laiti o le a faʻaleleia ai le faʻatulagaina o vaega o fatu. Mo suʻesuʻega muamua, o le fua o faʻalapotopotoga taʻitasi na filifilia e faʻavae i luga o faʻatonuga e masani ona faʻaaogaina i faʻataʻitaʻiga o aganuu (1 μM Dex27, 100 nM T327, ma le 2.5 μM SB31). A maeʻa le 12 aso o le aganuu, o le tuʻufaʻatasiga o le T3 ma le Dex na maua ai le amio saʻo lelei o le cardiomyocyte ma le toe faʻaleleia o fibrous (Faʻaopoopo Faʻaopoopo 4 ma le 5). E le gata i lea, o le faʻaogaina o le faʻaluaina pe faʻaluaina o nei faʻatonuga o le T3 ma le Dex na maua ai aʻafiaga leaga pe a faʻatusatusa i faʻasalalauga masani (Faʻaopoopo Ata 6a,b).
Ina ua mae'a su'esu'ega muamua, sa matou faia se fa'atusatusaga fa'auluuluga o tulaga fa'ale-aganu'u e 4 (Ata 4a): Ctrl: vaega o le fatu na fa'atupuina i la matou aganu'u fa'ata'ita'i na fa'amatalaina muamua e fa'aaoga ai la matou ala fa'apitoa; 20.21 TD: T3 ma Ctrl s Added Dex i le Aso Lulu; MC: vaega o le fatu ua fa'atupuina ile CTCM e fa'aoga ai la tatou fa'aoga lelei; ma le MT: CTCM faʻatasi ma T3 ma Dex faʻaopoopo i le alalaupapa. I le maeʻa ai o aso 12 o le faʻatoʻaga, o le faʻaogaina o le MS ma le MT na tumau pea e pei o ni mea fou na iloiloina e le MTT assay (Fig. 4b). O le mea e mataʻina ai, o le faʻaopoopoga o le T3 ma le Dex i le transwell cultures (TD) e leʻi iʻu ai i se faʻaleleia atili o le faʻaogaina pe a faʻatusatusa i tulaga Ctrl, e faʻaalia ai se matafaioi taua o le faʻamalosia o masini i le faatumauina o le gafatia o vaega o le fatu.
se fa'ata'ita'iga fa'ata'ita'iga fa'ata'ita'iga o lo'o fa'aalia ai tulaga fa'aleaganu'u e fa'aaogaina e iloilo ai a'afiaga o le fa'aosoina fa'ainisinia ma le T3/Dex fa'aopoopo i luga ole laiga mo le 12 aso. b Bar kalafi o loʻo faʻaalia ai le faʻatusatusaina o le ola 12 aso pe a maeʻa le aganuu i tulaga uma o le aganuʻu 4 (Ctrl, TD, MC, ma MT) pe a faʻatusatusa i fasi fatu fou (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD ma D12 MT), 12 (D12 MC) fasi/vaega faʻataʻitaʻiga, AN##p suʻega; 0.0001, ###p <0.001 fa'atusatusa ile D0 ma **p <0.01 fa'atusatusa ile D12 Ctrl). b Bar kalafi o loʻo faʻaalia ai le faʻatusatusaina o le ola 12 aso pe a maeʻa le aganuu i tulaga uma o le aganuʻu 4 (Ctrl, TD, MC, ma MT) pe a faʻatusatusa i fasi fatu fou (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD ma D12 MT), 12 (D12 MC) fasi/vaega faʻataʻitaʻiga, AN##p suʻega; 0.0001, ###p <0.001 fa'atusatusa ile D0 ma **p <0.01 fa'atusatusa ile D12 ctrl). b Fa'atonuga fa'apitoa mo le fa'atonuga o le fa'atonuga o le fa'atonuga o le fa'atonuga 12 mo le fa'atonuga o le fa'atonuga i le va'aiga o le 4 masina. (konetrona, TD, MC ma MT) fa'atasi ai ma сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD и D12 MT), 12)/D12 MT разных свиней, проводится односторонний тест ANOVA ####p < 0,0001, ##p < 0,001 по сравнению с D0 и **p < 0,01 по сравнсе ). b O le kalafi paʻu o loʻo faʻaalia ai le faʻatusatusaina o le faʻaogaina i le 12 aso pe a maeʻa le aganuʻu i tulaga uma o le aganuʻu 4 (pulea, TD, MC, ma MT) faʻatusatusa i vaega fatu fou (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD, ma D12 MT), 12 (D12 MC) suʻega suʻega / vaega ##pOVA; 0.0001, ###p <0.001 vs. D0 ma **p <0.01 e fa'atusatusa ile D12 Ctrl). b 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) (n = 18 (Dl5) TD0和D12 MT)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；####p < 0.0001，###p < 0.001 ，p 0.001 ， 盎放0.与D12控制）.e 4 12 (D12 MC) e Гистограма, показывающая все 4 условия культивирования (контроль, TD, MC ma MT) po сравнению со свежими серди ца (8 DIRI) 15 (D12 Ctrl, D12 TD и D12 MT), от разных свиней 12 (D12 MC) срезы/группа, односторонний тест ANOVA ####p <0,0001, #0##p <0,0001, #0##p <0,0001, #0##p <0,0001, #0##p <0,0001, #0##p <0,0001, #0##p <0,0001, #0##p <0,0001, #0##p <0,0001, #0##p <0,0001, #0##p <0,0001, #0##p <0,0##p <0,0001, #0##p <0,0001, #0##p <0,0##p <0,01 по сравнению с контролем D12). b Histogram o loʻo faʻaalia uma tulaga faʻaleaganuʻu 4 (pulea, TD, MC ma MT) faʻatusatusa i vaega fou o le fatu (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD ma D12 MT), mai puaa eseese 12 (D12 MC) vaega / vaega, suʻega ANOVA e tasi; ###0<0.0. **p<0.01 vs. pule D12). c Bar graph o loʻo faʻaalia ai le faʻatusatusaina o le kulukose flux 12 aso pe a maeʻa le aganuʻu i tulaga uma o le aganuʻu 4 (Ctrl, TD, MC, ma MT) faʻatusatusa i fasi fatu fou (D0) (n = 6 fasi / vaega mai puaa eseese, tasi le auala ANOVA suʻega e faia; ###p <0.001, faʻatusatusa i le D0 ma le ***p <0.001). c Bar graph o loʻo faʻaalia ai le faʻatusatusaina o le kulukose flux 12 aso pe a maeʻa le aganuʻu i tulaga uma o le aganuʻu 4 (Ctrl, TD, MC, ma MT) faʻatusatusa i fasi fatu fou (D0) (n = 6 fasi / vaega mai puaa eseese, tasi le auala ANOVA suʻega e faia; ###p <0.001, faʻatusatusa i le D0 ma le ***p <0.001). i Fa'atonuga fa'apitoa mo le fa'atonuga o le fa'atonuga o le fa'atonuga o le fa'atonuga o le fa'amalosaga 12 aso le fa'atonuga i le va o le 4 masina. (Konetron, TD, MC ma MT) e maua mai i le auaunaga i le lotoifale (D0) (n = 6 i le taimi o le pule a le malo mai le pule o le atunuu. ANOVA; ###p < 0,001 по сравнению с D0 и ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Histogram o loʻo faʻaalia ai le faʻatusatusaina o le kulukose flux 12 aso post-culture i lalo o tulaga uma o le aganuʻu 4 (pulea, TD, MC ma MT) faʻatusatusa i vaega fatu fou (D0) (n = 6 vaega / vaega mai puaa eseese, suʻega ANOVA e tasi na faia; ###p <0.001 faʻatusatusa i le D0 ma ***p <0.001 Ctrl faʻatusatusa i le D12). c 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) 相比，厹天的葡萄糖通量定量（n = 6 片/组，来自不同猪，单向执行ANOVA 测试；###p < 0.001 ，盎01 ，与D1 ，与D1与D12 Ctrl 相比）. C 条形图 显示 所有 4 种 条件 （（ctrl 、 td 、 mc 和 mt） 新鲜 心脏 切片 切片 切片培养 后 后 12 天 的 通量 定量 （n = 6 片/组 ， 来自 猪 ， ， ， ， ， ， ， 猪 猪单同行< 0.001，与D0 相比，***p < 0.001 与D12 Ctrl 相比）。 c Гистограмама, показывающая количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после культивирования для всех для всех культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 6 срезов/группа, от разных сердца Были проведены тесты ANOVA; ###p < 0,001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению с D12 (контроль). c Histogram o loʻo faʻaalia ai le faʻatusatusaina o le kulukose flux i le 12 aso pe a maeʻa le aganuu mo tulaga uma o le aganuʻu 4 (pule, TD, MC, ma MT) faʻatusatusa i vaega fatu fou (D0) (n = 6 vaega / vaega, mai puaa eseese, unilateral Na faia suʻega ANOVA, ###p <0.001 faʻatusatusa i le D0, ***p <0.001 faʻatusatusa i le D0, ***p <0.001).d Fuafuaga su'esu'ega fa'amama fou (lanu moana), aso 12 MC (lanu meamata), ma le aso 12 MT (mumu) i'a e sefulu vaega fa'aitulagi vaega (n = 4 fasi / vaega, su'ega ANOVA e tasi; e leai se eseesega tele i le va o vaega). u Fuafuaga o lo'o fa'aalia ai kenera o lo'o fa'aalia ese'ese i vaega fatu fou (D0) fa'atusatusa i vaega o fatu na fa'atupuina i lalo o tulaga fa'amau (Ctrl) po'o lalo ole MT (MT) mo le 10-12 aso. f Fa'afanua vevela o kenera sarcomere mo vaega o fatu na fa'atupuina i lalo o tulaga fa'aleaganu'u ta'itasi. Fa'amau fa'aletonu o lo'o fa'atusalia ai le uiga ± fa'asologa masani.
O le faʻalagolago i le metabolism i le suiga mai le faʻamaʻiina o le gaʻo gaʻo i le glycolysis o se faʻailoga o le faʻavasegaina o cardiomyocyte. O cardiomyocytes le matutua e fa'aaoga muamua le kulukose mo le gaosiga o le ATP ma maua ai le hypoplastic mitochondria ma nai cristae5,32. O su'esu'ega o le fa'aogaina o le kulukose na fa'aalia ai i lalo ole MC ma le MT, o le fa'aogaina o le kulukose e tutusa ma le fa'aoga ile aso 0 (Ata 4c). Peita'i, o fa'ata'ita'iga Ctrl na fa'aalia ai se fa'atuputeleina tele o le fa'aogaina o le kulukose pe a fa'atusatusa i le aano fou. O loʻo faʻaalia ai o le tuʻufaʻatasia o le CTCM ma le T3 / Dex e faʻaleleia ai le ola o le tino ma faʻasaoina le faʻamaʻi faʻamaʻi o le 12-day cultured heart sections. E le gata i lea, o suʻesuʻega faʻataʻitaʻiga na faʻaalia ai o tulaga faʻalavelave e tumau pea e pei o le fatu fatu fou mo 12 aso i lalo ole MT ma MS tulaga (Fig. 4d).
Ina ia auʻiliʻili le aofaʻi o aʻafiaga o le CTCM ma le T3 / Dex i luga o le faʻasologa o le lalolagi atoa o le fatu fasi fatu, matou te faia le RNAseq i luga o fasi fatu mai tulaga faʻale-aganuʻu uma e fa (Faʻamatalaga Faʻaopoopo 1). O le mea e malie ai, o vaega MT na faʻaalia ai le maualuga o le faʻaliliuga tutusa i fatu fatu fou, ma naʻo le 16 faʻaalia faʻaalia mai le 13,642 genes. Ae ui i lea, e pei ona matou faʻaalia muamua, o fasi Ctrl na faʻaalia 1229 faʻaaliga faʻaalia genes pe a uma le 10-12 aso i le aganuu (Fig. 4e). O nei faʻamaumauga na faʻamaonia e le qRT-PCR o fatu ma fibroblast genes (Faʻaopoopo Ata 7a-c). O le mea e malie ai, o vaega o le Ctrl na faʻaalia ai le faʻaitiitia o le faʻaogaina o le fatu ma le cell cycle genes ma le faʻagaoioia o polokalame faʻamaʻi. O nei faʻamatalaga o loʻo fautua mai ai o le faʻavasegaina, lea e masani ona tupu pe a uma le faʻatupuina o se taimi umi, e faʻaitiitia atoa i lalo ole MT tulaga (Faʻaopoopo Ata 8a, b). O suʻesuʻega faʻaeteete o genes sarcomere na faʻaalia ai e naʻo lalo ole MT tulaga o loʻo faʻapipiʻiina ai le sarcomere (Fig. 4f) ma le ion channel (Faʻaopoopo Fig. 9) faʻasaoina, puipuia i latou mai le taofiofia i lalo ole Ctrl, TD, ma MC tulaga. O nei fa'amaumauga o lo'o fa'aalia ai fa'atasi ai ma le tu'ufa'atasiga o le fa'aoso fa'ainisinia ma le aga malie (T3/Dex), e mafai ona tumau le fa'atusa o le fatu fasi fatu i fasi fatu fou pe a uma le 12 aso ile aganu'u.
O nei suʻesuʻega faʻasalalau e lagolagoina e le mea moni o le faʻatulagaina o le cardiomyocytes i totonu o vaega o le fatu e sili ona lelei ona faʻasaoina i lalo ole MT mo aso 12, e pei ona faʻaalia e le fesoʻotaʻiga faʻatasi ma le localized 43 (Fig 5a). E le gata i lea, o le fibrosis i vaega o le fatu i lalo o tulaga MT na matua faʻaititia pe a faʻatusatusa i le Ctrl ma tutusa ma vaega fou o le fatu (Fig. 5b). O nei faʻamaumauga o loʻo faʻaalia ai o le tuʻufaʻatasia o le faʻamalosiina o masini ma togafitiga T3 / Dex e faʻasaoina lelei le fausaga o le fatu i vaega o fatu i le aganuu.
a Sui immunofluorescence ata o le troponin-T (lanumeamata), connexin 43 (mumu), ma le DAPI (lanumoana) i vaega fatu fou faatoa vavae ese (D0) poʻo le faʻatupuina mo le 12 aso i tulaga faʻaleaganuʻu uma e fa (fua = 100 µm). ). Fa'ata'ita'iga fa'apitoa fa'afuainumera o le fatu fatu fatu fa'atulagaina fa'amaoni (n = 7 (D0 ma D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC ma D12 MT) fasi / vaega mai pua'a 'ese'ese, fa'ata'ita'i le ANOVA e tasi; ####p <0.0001 fa'atusatusa i le D0 ma le *p <0.0002, po'o le D0.002 <1. Ctrl). Fa'ata'ita'iga fa'apitoa fa'afuainumera o le fatu fatu fatu fa'atulagaina fa'amaoni (n = 7 (D0 ma D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC ma D12 MT) fasi / vaega mai pua'a eseese, tasi le auala ANOVA su'ega e faia; #### p <0.0001 fa'atusatusa i le D0 ma le *p <0.002, po'o le D0.02 <1. Ctrl). Количественная оценка структурной целостности ткани сердца с помощью искусственного интеллекта (n = 7 (D0 и TD12), TD12 (D0 и D12) D12 MT) срезов/группу от разных свиней, проведен однофакторный тест ANOVA #### p < 0,0001 по сравнению с D0 **** и0 и по <0,**** и по < 0,**** и по < 0,**** и по < 0,**** и по сравнению с D12 Ctrl). Fuafuaina o le faʻatulagaina faʻamaoni o fatu fatu e faʻaaoga ai le atamai faʻapitoa (n = 7 (D0 ma D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC ma D12 MT) vaega / vaega mai puaa eseese, tasi le auala ANOVA suʻega na faia; Ctrl).对不同猪的心脏组织结构完整性（n = 7（D0 和D12 Ctrl）、5（D12 TD、D12 MC 和D12 MT）切片/组）进行人工智能量化，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0.0001 与D0 和*p < 0.05 ，書所 0.05 ，書所 0.05 ，書是与D12 Ctrl 相比）.对 不同 猪 的 心脏 结构 完整性 （n = 7 （d0 和 d12 ctrl） （5 （d12 td 、 d12 mc 和 d1智能量 化 进行 单向 单向 单向 测试 ； ########## p < 0.0001 与D0 和*p < 0.05 相月0 ， 戸 相比 0.05 相比 ， 戸 相比 ， 戸 0.相比）.Fuafuaina o le faʻatulagaina faʻamaoni o fatu fatu e faʻaaoga ai le atamai faʻapitoa i puaa eseese (n = 7 (D0 ma D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC ma D12 MT) vaega / vaega) faʻatasi ai ma se suʻega ANOVA e tasi;#### p < 0,0001 по сравнению с D0 и *p < 0,05 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). #### p <0.0001 fa'atusatusa ile D0 ma le *p <0.05 po'o le ****p <0.0001 fa'atusatusa ile D12 Ctrl). b Fa'atusa ata ma fa'atusatusaga mo fasi fatu ua pisia i le stains trichrome a Masson (Scale bar = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD, ma D12 MC), 9 (D12 MT) fasi/vaega mai pua'a eseese, tasi le ala ANOVA su'ega <0##0 fa'atusa <1 ala ##0##p <1 le ANOVA ma le D12 MC; 0.001, poʻo le ****p <0.0001 faʻatusatusa ile D12 Ctrl). b Fa'atusa ata ma fa'atusatusaga mo fasi fatu ua pisia i le stains trichrome a Masson (Scale bar = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD, ma D12 MC), 9 (D12 MT) fasi/vaega mai pua'a eseese, tasi le ala ANOVA su'ega <0##0 fa'atusa <1 ala ##0##p <1 le ANOVA ma le D12 MC; 0.001, poʻo le ****p <0.0001 faʻatusatusa ile D12 Ctrl). b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромным красителем Массона (5) мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD и D12 MC), 9 (D12 MT) срезов/группу от разных свиней, выполняется односторонний те1 ##0 сторонний те1 сравнению с D0 ma ***p <0,001 po'o le ****p <0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). b Fa'atusa ata ma le fa'atusatusaina o vaega o le fatu ua pisia i le stains trichrome a Masson (scale bar = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD ma D12 MC), 9 (D12 MT) vaega/vaega mai pua'a eseese, faia <1-way ANOVA; ##0##p0 <1-way ANOVA; ##0#0. 0.001 po'o le ****p <0.0001 vs. D12 Ctrl). b 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像和量化（比例尺= 500 µm）！1D = 2、D1D10） TD 和D12 MC），来自不同猪的9 个（D12 MT）切片/组，进行单因素方差分析；####p < 0.0001 < 丯放01 0.001，或****p <0.0001与D12 Ctrl 相比）。 b 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 和 量化 （比例 尺 尺 尺 = 500 µm） = 500 µm） 1（n） ctrl 、 d12 td 和 d12 mc） 来自 不同 的 9 个 d12 mt 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片/组，进行单因素方差分析0（0##00）相比，***p < 0.001，或****p < 0.0001 与D12 Ctrl 相比）。 b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромом Массона (мастабная = лим50) (D0, D12 Ctrl, D12 TD и D12 MC), 9 (D12 MT) срезов от разных свиней / группы, один- способ ANOVA ####p <0,0001 по, ***001 по , ***001 по , ***001 по , ***001 по , ***001 по , ***001 по, ***001 по, ***001 по, ***001 по , ***001 по, ***001 по, ***001 по, ***001 по, ли сравин; ****p <0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). b Faʻatusa ata ma le faʻatusatusaina o vaega o le fatu ua pisia i le Masson's trichrome (scale bar = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD ma D12 MC), 9 (D12 MT) vaega mai puaa eseese / vaega, tasi ANOVA auala; ##000 <0. ***001 pe a faatusatusa i le ##0. ***p <0. ****p <0.0001 fa'atusatusa ile D12 Ctrl).Fa'amau fa'aletonu o lo'o fa'atusalia ai le uiga ± fa'asologa masani.
Mulimuli ane, o le gafatia o le CTCM e faʻataʻitaʻiina le hypertrophy cardiac na suʻesuʻeina e ala i le faʻalauteleina o le tino o le fatu. I le CTCM, o le maualuga o le mamafa o le potu ea na siitia mai le 80 mmHg i le 80 mmHg. Art. (fa'aloa masani) e o'o i le 140 mmHg Art. (Ata 6a). E fetaui lea ma le 32% o le faʻalauteleina o le faʻalauteleina (Fig. 6b), lea na faʻaalia muamua o le faʻasologa o pasene tutusa e manaʻomia mo vaega o le fatu e ausia ai le umi o le sarcomere e tutusa ma le vaʻaia i le hypertrophy. O le fa'aloaloa ma le saosaoa o le aano o le fatu i le taimi o le pa'u ma le malolo sa tumau pea i aso e ono o le aganuu (Ata 6c). O le fatu fatu mai tulaga MT na fa'atupuina i le fa'alauteleina masani (MT (Normal)) po'o tulaga fa'alautele (MT (OS)) mo aso e ono. Ua maeʻa aso e fa i le aganuʻu, o le hypertrophic biomarker NT-ProBNP na matua maualuga le maualuga i le ala i lalo ole MT (OS) tulaga faʻatusatusa ile MT (masani) tulaga (Fig. 7a). E le gata i lea, i le maeʻa ai o aso e ono o le faʻatupuina, o le tele o le cell i MT (OS) (Fig. 7b) na matua faʻateleina pe a faʻatusatusa i vaega o le fatu MT (masani). E le gata i lea, o le faʻaliliuga faaniukilia a le NFATC4 na matua faʻateleina i totonu o le tino faʻamalo (Fig. 7c). O nei faʻaiʻuga o loʻo faʻaalia ai le alualu i luma o le toe faʻaleleia o pathological pe a maeʻa le hyperdistension ma lagolagoina le manatu e mafai ona faʻaogaina le masini CTCM e fai ma faʻavae e suʻesuʻe ai le faʻatupuina o le hypertrophy cardiac signaling.
O fa'ailoga fa'atusa o le mamafa o le potu ea, le mamafa o le potu su'esu'e, ma le fuaina o fe'avea'i o mea e fa'amaonia ai o le mamafa o le potu e suia ai le mamafa o le vai, ma mafua ai se gaioiga tutusa o le fasi pepa. e Fa'atusaina le pasene fa'aloaloa ma fa'asolo fa'asologa pi'o mo vaega e masani ona fa'aloloa (lanu moli) ma le fa'aloaloa (lanumoana). c Bar kalafi o loʻo faʻaalia ai le taʻamilosaga taimi (n = 19 fasi i le vaega, mai puaa eseese), taimi faʻaitiitia (n = 18-19 fasi i le vaega, mai puaa eseese), taimi malolo (n = 19 fasi i le vaega, mai puaa eseese) ), le tele o le gaioiga o le tino (n = 14 fasi / vaega, mai puaa eseese, vaega pito i luga o puaa, kulupu eseese) fua faatatau malolo maualuga (n = 14 (D0), 15 (D6) ) vaega / vaega) mai puaa eseese), lua-tailed Student's t-suʻega na faʻaalia ai le leai o se eseesega tele i soʻo se parakalafa, e faʻaalia ai o nei taʻaloga na tumau pea i le taimi o 6 aso o le aganuu ma le overvoltage. Fa'amau fa'aletonu o lo'o fa'atusalia ai le uiga ± fa'asologa masani.
a Bar graph quantification of NT-ProBNP concentration in culture media from heart slices cultured under MT normal stretch (Norm) or overstretching (OS) condition (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, and D4 MTOS) fasi / vaega mai puaa eseese, Lua-ala ANOVA e faia; **p <0.01. a Bar kafa fuaina o le NT-ProBNP concentration i le aganuu ala o faasalalauga mai fasi fatu ua totoina i lalo o le MT masani faʻalautele (Norm) poʻo le faʻalauteleina (OS) tulaga (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, ma D4 MTOS) fasi / vaega mai puaa eseese, E faia le ANOVA e lua; **p <0.01 faʻatusatusa i le masani masani).Quantitative histogram of NT-ProBNP concentration in culture medium from heart slices cultured under conditions of normal MT stretch (masani) poʻo overstretch (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, ma D4) .MTOS) fasi / vaega mai puaa eseese, faʻataʻitaʻiga lua-faʻailoga o le eseesega e faia;**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p <0.01 faʻatusatusa i le faʻalauteleina masani). a 在MT 正常拉伸(Norm) 或过度拉伸(OS) 条件下培养的心脏切片培养基中NT-ProBNP 浓度的条件下培养的心脏切片培养基中NT-ProBNP 浓度的曾4 (D2 MTNorm)、3（D2 MTOS、D4 MTNorm 和D4 MTOS）来自不同猪的切片/组，进行双向方差分析；p不不不不为不不一不不上不不组，进行双向方差分析；p中中中文0.01). a Fuafuaga o le NT-ProBNP fa'asalaina i fasi fatu ua fa'atupuina i lalo o le MT masani fa'alautele (Norm) po'o le fa'ateleteleina (OS) tulaga (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm和D4 MTOS) mai ese'ese 猪的切片/组，可以双双; ** faʻatusatusa i le faʻalauteleina masani, p <0.01).histogram Fuainumeraina o NT-ProBNP concentrations i fasi fatu ua faʻatupuina i lalo o tulaga masani MT faʻalautele (masani) poʻo le faʻalauteleina (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm) ma D4 MTOS) fasi / vaega mai puaa eseese, suʻesuʻega e lua o le eseesega;**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p <0.01 faʻatusatusa i le faʻalauteleina masani). b Faʻatusa ata mo fasi fatu ua pisia i le troponin-T ma le WGA (agavale) ma le tele o le cell quantification (taumatau) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) sela / vaega mai 10 fasi pepa eseese mai puaa eseese, lua-tailed Student t-test ua faia; ****p <0.0001 faʻatusatusa i le faʻalautele masani). b Fa'atusa ata mo fasi fatu ua pisia i le troponin-T ma le WGA (agavale) ma le tele o le cell quantification (taumatau) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) sela / vaega mai 10 fasi pepa eseese mai pua'a eseese, lua-tailed Student t-test ua faia; ****p <0.0001 fa'atusatusa i le fa'alautele masani). b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слева) и количественного опеникрадрад (sправа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) клеток/группу из 10 разных срезов от разных свиней, два- проводится х t-стой ****p < 0,0001 по сравнению с нормальным растяжением). b Faʻatusa ata o vaega o le fatu ua pisia i le troponin-T ma le AZP (agavale) ma le tele o le cell quantification (taumatau) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) sela / vaega mai le 10 vaega eseese mai puaa eseese, lua-tailed Student's t-test na faia; ****p <0.001 faʻatusatusa i le masani masani). b 用肌钙蛋白-T 和WGA（左）和细胞大小量化（右）染色的心脏切片的代表性（（6D33图MTOS），来自不同猪的10 个不同切片的369（D6 MTNorm）细胞/组，两进行有尾学生t检验；与正常拉伸相比，****p < 0.0001）。 b Fa'atusa ata o fasi fatu ua pisia i le calcarein-T ma le WGA (agavale) ma le tele o sela (taumatau) (n = 330 (D6 MTOS), 369 mai fasi fasi fatu e 10 (D6 MTNorm)) Cells/组，两方法有尾学生p su'ega masani <0.compatred test；100. b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слева) ma количественная оцленка (распенка) 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) из 10 различных срезов от разных свиней Клетки/группа, двусторонние критерий Ста;юд0н сравнению с нормальным растяжением). b Faʻatusa ata o vaega o le fatu ua pisia i le troponin-T ma le AZP (agavale) ma le faʻatusatusaina o le tele o le cell (taumatau) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) mai le 10 vaega eseese mai puaa eseese) Cells / group, criterion lua-tailed Student's t; ****p <0.0001 pe a fa'atusatusa ile fa'alavelave masani). c Sui ata mo le aso 0 ma le aso 6 MTOS fasi fatu immunolabeled mo troponin-T ma NFATC4 ma quantification o le translocation o le NFATC4 i le nuclei o CMs (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) fasi / vaega mai puaa eseese, lua-tailed Student t-suʻega ua faia; * p <0.05). c Sui ata mo le aso 0 ma le aso 6 MTOS fasi fatu immunolabeled mo troponin-T ma NFATC4 ma quantification o le translocation o le NFATC4 i le nuclei o CMs (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) fasi / vaega mai puaa eseese , lua-tailed Student t-suʻega ua faia; * p <0.05. c Репрезентативные изображения для срезов сердца 0 ma 6 aso MTOS, fa'ailoga тропонина-Т и NFATC4, ma le колица. транслокации NFATC4 i ядра кавернозных клеток (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срезов/группу от разных свиней , выполндяетсястятся Стьюдента; *p < 0,05). c Sui ata mo vaega fatu i 0 ma 6 aso MTOS, immunolabeled mo troponin-T ma NFATC4, ma quantification o le NFATC4 translocation i le nucleus o sela cavernous (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) fasi / vaega mai puaa eseese) faia le lua-tailed Student t-suʻega; *p <0.05). c 用于肌钙蛋白-T 和NFATC4 免疫标记的第0 天和第6 天MTOS心脏切片的代表性图像，以及来自不同猪的NFATC4 易位至CM 细胞核的量化（n = 4 (D0)片, MTOS4 (D0)〇进行双尾学生t 检验；*p < 0.05). c Fa'atusa ata o le calcanin-T ma le NFATC4 immunolabeling 第0天和第6天MTOS fasi fatu fatu, ma le NFATC4 mai NFATC4 易位至CM cell nucleus eseese (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) / 爇时间双尾学生et 电影；*p < 0.05). c Репрезентативные изображения срезов сердца MTOS i le 0 ma le 6 aso i le иммуномаркировки тропонином-Т ma NFATC4 и колицнч транслокации NFATC4 i ядра CM mai le разных свиней (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срез/группа, два- хвостатый t-критерий Сть0, *0). c Fa'atusa ata o fasi fatu MTOS i le aso 0 ma le 6 mo troponin-T ma NFATC4 immunolabeling ma quantification o le NFATC4 translocation i totonu o le autu o CM mai puaa eseese (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) fasi / vaega, lua-tailed t -criterion Student's; *p <0.05).Fa'amau fa'aletonu o lo'o fa'atusalia ai le uiga ± fa'asologa masani.
Fa'aliliuga cardiovascular su'esu'ega e mana'omia ni fa'ata'ita'iga feavea'i e sa'o lelei ona toe gaosia le si'osi'omaga o le fatu. I lenei suʻesuʻega, na fausia ai se masini CTCM ma faʻaalia e mafai ona faʻaosofia vaega ultrathin o le fatu. O le faiga o le CTCM e aofia ai le physiologically synchronized electromechanical stimulation ma le T3 ma le Dex fluid enrichment. Ina ua faʻaalia vaega o le fatu puaa i nei mea, o lo latou gafatia, faʻatonuga faʻavae, gaioiga faʻasolosolo, ma faʻamatalaga tusitusia na tumau tutusa ma le fatu fatu fou pe a uma le 12 aso o le aganuu. E le gata i lea, o le tele o le faʻalauteleina o le fatu fatu e mafai ona mafua ai le hypertrophy o le fatu e mafua mai i le hyperextension. I le aotelega, o nei taunuʻuga e lagolagoina le taua tele o tulaga faʻale-aganuʻu o le physiological i le faatumauina o se faʻataʻitaʻiga masani o le fatu ma tuʻuina atu se faʻavae mo suʻesuʻega fualaau.
E tele mea e fesoasoani i le fatuina o se siosiomaga sili ona lelei mo le galue ma le ola o cardiomyocytes. O le mea sili ona manino o nei mea e fesoʻotaʻi ma (1) fesoʻotaʻiga intercellular, (2) faʻamalosi eletise eletise, (3) mea malie, ma le (4) mea faʻapitoa. Feso'ota'iga fa'ale-tino e mana'omia ai feso'ota'iga lavelave e tolu-dimensional o ituaiga sela e tele e lagolagoina e se matrix extracellular. O ia fegalegaleaiga faʻalavelave faʻapitoa e faigata ona toe faʻaleleia in vitro e ala i le tuʻufaʻatasia o ituaiga sela taʻitasi, ae mafai ona faigofie ona ausia i le faʻaogaina o le natura organotypic o vaega o fatu.
O le faʻaogaina o masini ma le faʻamalosi eletise o cardiomyocytes e taua tele mo le faʻatumauina o le fatu phenotype33,34,35. A'o fa'aogaina fa'ainisinia fa'ainisinia mo le fa'atulagaina o le hiPSC-CM ma le matua, o le tele o su'esu'ega aulelei na taumafai talu ai nei e fa'aoso fa'ainisinia o fasi fatu i le aganu'u e fa'aaoga ai le uta uniaxial. O nei suʻesuʻega o loʻo faʻaalia ai o le 2D uniaxial mechanical loading o loʻo i ai se aafiaga lelei i le phenotype o le fatu i le taimi o aganuu. I nei su'esu'ega, o vaega o le fatu na fa'atumuina ile isometric tensile forces17, linear auxotonic loading18, po'o le ta'amilosaga o le fatu na toe fa'aaogaina e fa'aaoga ai le fa'aogaina o le fa'aliliuga malosi ma fa'alavelave fa'alavelave. Ae ui i lea, o nei metotia e faʻaogaina ai le uniaxial tissue stretch e aunoa ma le suʻesuʻeina o le siosiomaga, e mafua ai le taofiofia o le tele o genes cardiac poʻo le overexpression o kenera e fesoʻotaʻi ma tali faʻalavelave faʻafuaseʻi. O le CTCM o loʻo faʻamatalaina iinei o loʻo tuʻuina atu ai le 3D electromechanical stimulus e faʻataʻitaʻiina le taamilosaga masani o le fatu i tulaga o le taamilosaga taimi ma le faʻalauteleina o le tino (25% faʻalautele, 40% systole, 60% diastole, ma 72 paʻu i le minute). E ui lava e le lava le faʻaogaina o masini e tolu-dimensional e faʻatumauina ai le amio saʻo, o le tuʻufaʻatasia o le faʻamalosi ma le faʻaogaina o masini e faʻaaoga ai le T3 / Dex e manaʻomia ina ia faʻatumauina lelei le faʻaogaina o le tino, galuega, ma le faʻamaoni.
O mea fa'aleagaga e iai sona sao taua i le fa'avasegaina o le fatu o tagata matutua. O lenei mea na faʻaalia i suʻesuʻega HiPS-CM lea na faʻaopoopoina ai le T3 ma le Dex i faʻasalalauga faʻaleaganuʻu e faʻavavevave ai le matua matua. T3 e ono a'afia ai le felauaiga o amino acids, suka ma le calcium i totonu o sela sela36. E le gata i lea, o le T3 o loʻo faʻalauiloaina le MHC-α faʻamatalaga ma le MHC-β downregulation, faʻalauiloaina le faʻatulagaina o myofibrils faʻavave vave i cardiomyocytes matutua faʻatusatusa i le faʻagesegese o myofibrils i fetal CM. O le le lava o le T3 i gasegase o le hypothyroid e mafua ai le leiloa o fusi o le myofibrillar ma le faʻaitiitia o le faʻatupulaia o le leo37. O le Dex e galue i luga o le glucocorticoid receptors ma ua faʻaalia e faʻateleina ai le myocardial contractility i totonu o fatu faʻafefeteina; 38 o lenei faʻaleleia o loʻo manatu e fesoʻotaʻi ma le aʻafiaga o le calcium deposit-driven entry (SOCE) 39,40. E le gata i lea, o Dex e fusifusia i ona tali, e mafua ai se tali lautele lautele e taofia ai le puipuiga ma le mumū30.
O a matou faʻaiʻuga e faʻaalia ai o le faʻamalosia o le tino (MS) na faʻaleleia atili le faʻatinoga o aganuʻu pe a faʻatusatusa i le Ctrl, ae na le mafai ona faʻatumauina le faʻaogaina, faʻatulagaina faʻamaoni, ma le faʻaalia o le loto ile 12 aso ile aganuu. Pe a faʻatusatusa i le Ctrl, faʻaopoopoga o T3 ma Dex i aganuʻu CTCM (MT) faʻaleleia atili le faʻaogaina ma faʻamautu faʻamatalaga faʻamatalaga tutusa, faʻatonuga faʻavae, ma gaioiga faʻasolosolo ma fatu fatu fou mo 12 aso. E le gata i lea, e ala i le puleaina o le maualuga o le faʻalauteleina o le tino, na faia ai se faʻataʻitaʻiga hypertrophy cardiac hyperextension-induced e faʻaaoga ai le STCM, e faʻaalia ai le agavaʻa o le STCM system. E tatau ona maitauina e ui lava o le toe faʻaleleia o le fatu ma le fibrosis e masani ona aofia ai totoga le atoatoa o latou sela taʻamilo e mafai ona maua ai cytokines talafeagai faʻapea foʻi ma le phagocytosis ma isi mea e toe faʻaleleia ai, o vaega o le fatu e mafai lava ona faʻataʻitaʻiina le faʻagasologa o le fibrotic e tali atu i le atuatuvale ma le faʻalavelave. i myofibroblasts. Ua uma ona iloiloina lenei mea i lenei ata fa'ata'i fatu fatu. E tatau ona maitauina e mafai ona faʻaogaina le CTCM e ala i le suia o le mamafa / eletise eletise ma le tele o taimi e faʻataʻitaʻi ai le tele o tulaga e pei o le tachycardia, bradycardia, ma le lagolago faʻainisinia (mechanical unloaded heart). O lea ua avea ai le faiga ma auala e fa'aogaina mo su'ega vaila'au. O le mafaia e le CTCM ona fa'ata'ita'iina le hypertrophy cardiac e fa'aosoina i le fa'aosoina o le fa'amalositino e fa'aavanoaina le ala mo le su'eina o lenei faiga mo togafitiga fa'apitoa. I le faaiuga, o le suʻesuʻega o loʻo i ai nei o loʻo faʻaalia ai o le faʻaogaina o masini ma le faʻamalosi malie e taua tele mo le faʻatumauina o le aganuu o vaega o le fatu.
E ui lava o faʻamatalaga o loʻo tuʻuina atu iinei o loʻo fautua mai ai o le CTCM o se tulaga faʻamaonia tele mo le faʻataʻitaʻiina o le myocardium atoatoa, o lenei metotia faʻaleaganuʻu e iai ni tapulaʻa. Ole tapula'a autu ole aganu'u a le CTCM o le fa'atupuina lea o fa'amalosiga fa'ainisinia fa'aauau i fasi pepa, lea e le mafai ai ona mata'itū toto'a fa'a'oto'otoga fatu i taimi ta'amilosaga ta'itasi. E le gata i lea, ona o le laʻititi o vaega o le fatu (7 mm), e faʻatapulaʻaina le gafatia e iloilo ai galuega systolic i fafo atu o faiga faʻaleaganuʻu e faʻaaoga ai masini faʻamalosi masani. I le tusitusiga o loʻo iai nei, matou te manumalo i se vaega o lenei tapulaʻa e ala i le iloiloina o le voltage opitika e fai ma faʻailoga o galuega faʻakonekarate. Ae ui i lea, o lenei tapulaʻa o le a manaʻomia ai nisi galuega ma e mafai ona faʻatalanoaina i le lumanaʻi e ala i le faʻalauiloaina o metotia mo le mataʻituina mataʻituina o le gaioiga o fasi fatu i le aganuu, e pei o le faʻafanua faʻapipiʻi e faʻaaoga ai le calcium ma le voltage-sensitive dyes. O le isi tapula'a o le CTCM o le fa'ata'ita'iga galue e le mafai ona fa'aogaina le fa'alavelave fa'aletino (muamua ma le utaina). I totonu o le CTCM, o le mamafa na faʻaosoina i itu faʻafeagai e toe gaosia ai le 25% physiological stretch i le diastole (faʻalautele atoa) ma le systole (umi o le faʻalavelave i le taimi o le faʻamalosia o le eletise) i totonu o masini tetele. O lenei tapulaʻa e tatau ona aveese i le lumanaʻi CTCM mamanu e ala i le mamafa o le mamafa i luga o le fatu fatu mai itu uma e lua ma le faʻaogaina o fesoʻotaʻiga saʻo-volume e tupu i totonu o potu o le fatu.
O le toe fa'aleleia o lo'o fa'aosoina o lo'o lipotia mai i lenei tusitusiga e fa'atapula'aina i le fa'ata'ita'iina o fa'ailoga hypertrophic hyperstretch. O le mea lea, o lenei faʻataʻitaʻiga e mafai ona fesoasoani i le suʻesuʻeina o faʻailoga hypertrophic faʻalauteleina e aunoa ma le manaʻomia o mea malie poʻo neural (e le o iai i lenei faiga). O isi suʻesuʻega e manaʻomia e faʻateleina ai le tele o le CTCM, mo se faʻataʻitaʻiga, faʻapipiʻi faʻatasi ma sela puipuia, faʻasalalau plasma humoral mea, ma le innervation pe a faʻapipiʻi faʻatasi ma sela neuronal o le a faʻaleleia ai avanoa o faʻamaʻi faʻataʻitaʻiga ma CTCM.
E sefulutolu puaa na fa'aaogaina i lenei su'esu'ega. O faʻataʻitaʻiga uma o manu na faia e tusa ai ma taʻiala faʻapitoa ma faʻamaonia e le Iunivesite o Louisville Institutional Animal Care and Use Committee. O le aortic arch na pipii ma le fatu na faʻafefeteina i le 1 L o le cardioplegia sterile (110 mM NaCl, 1.2 mM CaCl2, 16 mM KCl, 16 mM MgCl2, 10 mM NaHCO3, 5 U / mL heparin, pH e oʻo atu i le 7.4); o fatu na faʻasaoina ile aisa malulu cardioplegic solution seʻia oʻo ina ave ile fale suesue ile aisa e masani lava <10 min. o fatu na faʻasaoina ile aisa malulu cardioplegic solution seʻia oʻo ina ave ile fale suesue ile aisa e masani lava <10 min. сердца хранили в ледяном кардиоплегическом растворе до транспортировки в лабораторию на льду, что обычно за10мает <. fatu sa teuina i le aisa-maalili cardioplegic solution seia oo i le felauaiga i le falesuesue i luga o le aisa, lea e masani ona ave <10 min.将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钟。将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钟。 Держите сердца в ледяной кардиоплегии до транспортировки в лабораторию на льду, обычно <10 min. Taofi fatu ile aisa cardioplegia se'ia o'o ile felauaiga ile falesuesue ile aisa, masani <10 min.
O le masini CTCM na fausia ile SolidWorks computer-aided design (CAD) software. O potu faʻaleaganuʻu, vaeluaga ma potu ea o loʻo faia ile palasitika acrylic manino CNC. O le mama tua 7mm le lautele e faia i le polyethylene maualuga (HDPE) i le ogatotonu ma o loʻo i ai se o-mama mama e faʻaoga ai le silicone o-mama na faʻaaogaina e faʻamaufaʻailoga ai le aufaasālalau i lalo. O se membrane silica manifinifi e vavaeese ai le potu faʻaleaganuʻu mai le ipu vavae. O le pa'u silicone e tipi leisa mai le 0.02″ laupepa silikoni mafiafia ma e iai le maaa o le 35A. O le pito i lalo ma le pito pito i luga o pusa silikoni o loʻo tipiina leisa mai le 1/16″ laupepa silikoni mafiafia ma e iai le maaa o le 50A. 316L fa'ailoga uamea u'amea ma nati apa'au e fa'aoga mo le fa'amauina o le poloka ma fai ai se fa'amaufa'ailoga malulu.
O se laupapa fa'asalalau lolomi fa'apitoa (PCB) ua mamanuina e tu'ufa'atasia ma le C-PACE-EM system. O sockets connector masini Suiselani i luga o le PCB e fesootai i graphite electrodes e uaea apamemea apamemea ma 0-60 apamemea vili i le electrodes. O lo'o tu'u le laupapa fa'asalalau lolomi i le fa'avaa o le lomitusi 3D.
O le masini CTCM o lo'o pulea e se polokalame pneumatic actuator (PPD) e fa'atupuina ai le fa'atonuina o le ta'amilosaga e pei o le ta'amilosaga o le fatu. A'o fa'atupula'ia le mamafa i totonu o le potu o le ea, e fa'alautele atu i luga le pa'u o le silicone fe'avea'i, ma fa'amalosi ai le ala i lalo o le nofoaga. O le vaega o le 'ie o le a faʻalauteleina e lenei faʻateʻaina o le vai, faʻataʻitaʻiina le faʻalauteleina o le physiological o le fatu i le taimi o le diastole. I le pito i luga o le malologa, na faʻaogaina ai le faʻamalosia o le eletise e ala i graphite electrodes, lea na faʻaitiitia ai le mamafa i totonu o le potu ea ma mafua ai le faʻaitiitia o vaega o le tino. I totonu o le paipa o loʻo i ai se valve hemostatic ma se masini faʻamalosi e iloa ai le mamafa o le ea. O le mamafa e lagona e le masini faʻapipiʻi e faʻaoga i se aoina faʻamatalaga e fesoʻotaʻi ma le komepiuta. O lea e mafai ai ona mata'ituina pea le mamafa i totonu o le potu kesi. Ina ua oʻo i le maualuga o le mamafa o le potu (tulaga 80 mmHg, 140 mmHg OS), na faʻatonuina le masini e maua ai faʻamatalaga e tuʻuina atu se faʻailoga i le C-PACE-EM system e faʻatupu ai se faʻailoga eletise biphasic mo 2 ms, seti i le 4 V.
Na maua vaega o le fatu ma tulaga faʻaleaganuʻu i totonu o vaieli e 6 sa faia e pei ona taua i lalo: Faʻafeiloaʻi fatu ua seleseleina mai le vaʻa faʻafeiloaʻi i se fata o loʻo i ai le malulu (4° C.) cardioplegia. O le ventricle agavale sa tu'u'ese i se lau ma'i ma tipi i ni fasipepa 1-2 cm3. O nei poloka poloka na faʻapipiʻiina i lagolago a le tino ma faʻapipiʻi mea faʻapipiʻi ma tuʻu i totonu o se taele o le microtome vibrating o loʻo i ai le vaifofo a Tyrode ma faʻaauau pea le okesene (3 g / L 2,3-butanedione monooxime (BDM), 140 mM NaCl (8.18 g) . ), 6 mM KCl (0.447) , 6 mM KCl (0.447 g), 6 mM KCl (0.447 g) . 10 mM HEPES (2.38 g), 1 mM MgCl2 (1 ml 1 M solution), 1.8 mM CaCl2 (1.8 ml 1 M solution), e oo atu i le 1 L ddH2O). O le microtome vibrating na setiina e tipi 300 µm fasi fasi pepa mafiafia i le taimi ole 80 Hz, o le fa'alava o le vibration amplitude o le 2 mm, ma le maualuga o le 0.03 mm/s. Sa si'osi'omia le ta'ele i le aisa ina ia malu ai le vaifofo ma tausia le vevela ile 4°C. Fa'afesuia'i vaega mai le taele microtome ile ta'ele fa'ato'a o lo'o iai le vai vai o le Tyrode fa'aauau pea ile okesene ile aisa se'ia lava le vaega e maua mo le ipu fa'aleaganu'u tasi. Mo aganuʻu transwell, o vaega o le tino na faʻapipiʻi i le sterile 6 mm lautele polyurethane lagolago ma tuʻuina i le 6 ml o le ala sili ona lelei (199 medium, 1x ITS faaopoopo, 10% FBS, 5 ng / ml VEGF, 10 ng / ml FGF-alkaline ma 2X antibiotic-antifungal). O le faʻamalosi eletise (10 V, taimi 1.2 Hz) na faʻaaogaina i vaega o le tino e ala i le C-Pace. Mo tulaga TD, T3 fou ma Dex faʻaopoopo i le 100 nM ma le 1 μM i suiga taʻitasi. Ua tumu le ala ile okesene a'o le'i suia 3 taimi ile aso. O vaega o mea'ai sa fa'atupuina ile incubator ile 37°C ma le 5% CO2.
Mo aganu'u a le CTCM, sa tu'u vaega o mea'ai i luga o se lomitusi 3D fa'apitoa i totonu o se ipu Petri o lo'o iai le vaifofo a Tyrode. Ua mamanuina le masini e faateleina ai le tele o le fasi fatu e 25% o le vaega o le mama lagolago. E faia lenei mea ina ia le faʻalauteleina vaega o le fatu pe a uma ona faʻafeiloaʻi mai le vaifofo a Tyrode i le ala ma le taimi o le diastole. I le fa'aaogaina o le kelu histoacrylic, o vaega 300 µm mafiafia sa fa'amau i luga o se mama lagolago e 7 mm le lautele. A maeʻa ona faʻapipiʻi vaega o mea i le mama lagolago, tipi ese vaega o loʻo tele ma toe tuʻu i totonu o le taele o Tyrode solution i luga o le aisa (4°C) seʻia lava le vaega ua saunia mo se masini e tasi. Ole taimi ole gaioiga mo masini uma e le tatau ona sili atu ile 2 itula. Ina ua mae'a ona fa'apipi'i vaega e 6 i a latou mama lagolago, ona fa'apotopotoina lea o le masini CTCM. O le potu aganu'u a le CTCM ua fa'atumu muamua i le 21 ml fa'aonaponei fa'ameamea. Fa'afeiloa'i vaega o le 'a'ano i le potu fa'aa'aga ma aveese ma le fa'aeteete so'o se ea ea i se paipa. Ona ta'ita'iina lea o le vaega o le aano i totonu o le pu ma oomi lemu i totonu. Mulimuli ane, tuʻu le pulou eletise i luga o le masini ma faʻafeiloaʻi le masini i le incubator. Ona faʻafesoʻotaʻi lea o le CTCM i le paipa ea ma le C-PACE-EM system. O le pneumatic actuator e tatala ma tatala e le valve ea le CTCM. O le C-PACE-EM system na faʻatulagaina e tuʻuina atu le 4 V i le 1.2 Hz i le taimi o le biphasic pacing mo 2 ms. O le ala na suia faalua i le aso ma o le eletise na suia tasi i le aso e aloese ai mai le faaputuputuina o kalafi i luga o le eletise. Afai e mana'omia, e mafai ona 'ave'esea vaega o a'a mai a latou vaieli fa'aleaganu'u e fa'ate'a ese ai so'o se ea mata'ina atonu na pa'u i lalo. Mo togafitiga MT, T3/Dex na fa'aopoopoina fou i suiga ta'itasi ma le 100 nM T3 ma le 1 μM Dex. O masini CTCM na fa'atupuina ile incubator ile 37°C ma le 5% CO2.
Mo le mauaina o auala faʻalautele o fasi fatu, na atiaʻe ai se masini puʻeata faʻapitoa. O se mea pu'eata SLR (Canon Rebel T7i, Canon, Tokyo, Iapani) sa fa'aogaina ma se tioata fa'ata'ita'i o le Navitar Zoom 7000 18-108mm (Navitar, San Francisco, CA). Na fa'atinoina le va'aiga ile vevela ole potu pe a uma ona sui le ala ile ala fou. O le meapueata o loʻo tuʻuina i le 51 ° angle ma le vitio e puʻeina i le 30 faʻavaa i le sekone. Muamua, na fa'aogaina le polokalama fa'apipi'i (MUSCLEMOTION43) fa'atasi ma le Image-J e fa'atatau ai le gaioiga o fasi fatu. O le matapulepule na faia e faʻaaoga ai le MATLAB (MathWorks, Natick, MA, ISA) e faʻamatala ai itulagi e fiafia i ai mo le sasaina o fasi fatu e aloese ai mai le pisa. E fa'aoga matapulepule fa'avasegaina i ata uma i se fa'asologa fa'avaa ona pasi atu lea i le fa'apipi'i MUSCLEMOTION. Muscle Motion e fa'aaogaina le mamafa masani o pika i fa'avaa ta'itasi e fa'atatauina lona fegasoloa'i e fa'atatau i le fa'avaa fa'asino. Fa'amaumauga na fa'amauina, fa'amama ma fa'aoga e fa'atatau le ta'amilosaga taimi ma su'esu'e le fa'asolo atu o le tino i le taimi o le ta'amilosaga o le fatu. O le vitio na pu'eina na mae'a ona fa'aogaina e fa'aaoga ai se fa'amama numera numera zero-phase. Ina ia faʻatusatusaina le faʻalauteleina o le tino (peak-to-peak), sa faia le suʻesuʻega pito i luga e iloa ai le va o tumutumu ma ala i le faailo faʻamau. E le gata i lea, o le detrending e faia i le faʻaaogaina o le 6th order polynomial e faʻaumatia ai faʻailoga faʻafefe. O le polokalame code na fausia i le MATLAB e fuafua ai le gaioiga o le lalolagi, ta'amilosaga taimi, taimi malolo, ma le taimi fa'aitiitia (Polokalame Fa'aopoopo 44).
Mo su'esu'ega fa'aletonu, fa'aaoga ata lava e tasi na faia mo su'esu'ega fa'ainisinia, na matou su'eina muamua ni ata se lua o lo'o fa'atusalia ai tumutumu o gaioioiga (o le pito i luga (luga) ma le pito i lalo (lalo) o le gaioioiga) e tusa ai ma le polokalama MUSCLEMOTION. Ona matou vaevaeina lea o vaega o le tino ma faʻaogaina se ituaiga o faʻataʻitaʻiga algorithm i le vaega faʻapipiʻi (Faʻaopoopo Ata 2a). Ona vaevaeina lea o le vaega vaega i lalo ifo o le sefulu, ma o le mamafa i luga o luga taitasi na fuafuaina e faʻaaoga ai le faʻataʻitaʻiga: Strain = (Sup-Sdown) / Sdown, lea o le Sup ma le Sdown o le mamao lea o foliga mai le pito i luga ma lalo o ata o le ie, i le faasologa (Faʻaopoopo Ata .2b).
Sa fa'amauina vaega o le fatu ile 4% paraformaldehyde mo le 48 itula. Sa fa'amama le tino i le 10% ma le 20% sucrose mo le 1 h, ona fa'asolo lea i le 30% sucrose i le po. Ona fa'apipi'i lea o vaega i totonu o le vevela sili ona lelei (OCT compound) ma fa'a'aisa fa'a'aisa i totonu ole ta'ele aisa/isopentane. Teu poloka poloka fa'apipi'i OCT i le -80 °C se'ia o'o 'ese'ese. Sa saunia fa'ase'e o ni vaega e 8 μm le mafiafia.
Ina ia aveese le OCT mai vaega o le fatu, faʻamafanafana le faʻasolo i luga o se poloka faʻamafanafana ile 95 °C mo le 5 min. Faʻaopoopo le 1 ml PBS i faʻataʻitaʻiga taʻitasi ma faʻafefe mo le 30 minute i le vevela o le potu, ona faʻapipiʻi lea o vaega e ala i le setiina o le 0.1% Triton-X i le PBS mo le 15 minute i le vevela o le potu. Ina ia taofia fa'ama'i fa'apitoa mai le fusifusia i le fa'ata'ita'iga, fa'aopoopo le 1 ml o le 3% BSA solution i fa'ase'e ma fa'asusu mo le 1 itula ile vevela ole potu. Ona aveese lea o le BSA ma fufulu solo i le PBS. Faailoga faataitaiga taitasi i se penitala. O fa'ama'i fa'amuamua (diluted 1:200 i le 1% BSA) (connexin 43 (Abcam; #AB11370), NFATC4 (Abcam; #AB99431) ma le troponin-T (Thermo Scientific; #MA5-12960) na fa'aopoopoina i luga ole 90 minute, ona fa'aopoopoina lea i le 90 minute, ona fa'aopoopoina lea o antibodies B1 po'o B1200 (diluted) i luga ole 90 minute (diluted B1 Alexa): 488 (Thermo Scientific; #A16079), faasaga i le lapiti Alexa Fluor 594 (Thermo Scientific; #T6391) mo se faaopoopoga 90 minute Fufulu 3 taimi i le PBS Ina ia iloa le pisia sini mai tua, sa matou faaaogaina na o le antibody lona lua e fai ma pulea Mulimuli ane, sa tuu le lapisi faaniukilia le DAPI ma le pisia faaniukilia. fa'amaufa'ailogaina i fao fao -x fa'alautele) ma Keyence microscope fa'atasi ma le 40x fa'alautele.
WGA-Alexa Fluor 555 (Thermo Scientific; #W32464) i le 5 μg / ml i le PBS na faʻaaogaina mo le WGA staining ma faʻaoga i vaega faʻamautu mo minute 30 i le vevela o le potu. Ona fufulu lea o fa'ase'e i le PBS ma fa'aopoopo le Sudan uliuli i fa'ase'e ta'itasi ma fa'asusu mo le 30 minute. Ona fufuluina lea o ata i le PBS ma faʻaopopoina le vectashield embedding medium. Fa'ata'ita'i na va'aia i luga o le Keyence microscope ile 40x fa'alautele.
OCT na aveese mai faʻataʻitaʻiga e pei ona faʻamatalaina i luga. A mae'a ona aveese le OCT, fa'atofu fa'ata i le vaifofo a Bouin i le po. Ona fufulu lea o fa'ase'e i le vai fa'amama mo le 1 itula ona tu'u lea i se vaifofo fuchsin Bibrich aloe acid mo le 10 minute. Ona fufuluina lea o faʻataʻitaʻiga i vai faʻafefe ma tuʻu i totonu o se vaifofo o le 5% phosphomolybdenum / 5% phosphotungstic acid mo le 10 minute. A aunoa ma le fufuluina, fa'afeiloa'i sa'o le fa'ase'e i totonu ole vaifofo lanumoana aniline mo le 15 minute. Ona fufuluina lea o faʻataʻitaʻi i le vai faʻafefe ma tuʻu i totonu o le 1% acetic acid solution mo le 2 minute. Na fa'amago fa'ase'e ile 200 N ethanol ma tu'u ile xylene. O fa'ase'e pisipisia na va'aia i le fa'aogaina o le Keyence microscope ma le fa'amoemoe e 10x. Ole pasene ole vaega ole Fibrosis sa fa'atatau ile fa'aogaina ole Keyence Analyzer software.
CyQUANT™ MTT Cell Viability Assay (Invitrogen, Carlsbad, CA), numera o fa'amaumauga V13154, e tusa ai ma le fa'atonuga a le gaosiga ma nisi o suiga. Aemaise lava, o se ta'otoga tu'i ma le lautele o le 6 mm sa fa'aogaina e fa'amautinoa ai le tele o le tino i le taimi o su'esu'ega MTT. Na fa'apipi'i ta'itasi i totonu o vaieli o se ipu vaieli e 12 o lo'o iai le MTT substrate e tusa ai ma le fa'atonuga a le kamupani gaosi mea. O vaega o loʻo faʻapipiʻiina i le 37 ° C. mo le 3 itula ma o loʻo faʻaogaina e le tino ola le MTT substrate e fausia ai se vailaʻau formazan viole. Toe sui le vaifofo MTT ile 1 ml DMSO ma fa'asusu ile 37 °C mo le 15 minute e aveese mai ai le formazan viole mai vaega fatu. O faʻataʻitaʻiga na faʻafefeteina 1:10 i le DMSO i 96-lelei manino pito i lalo ipu ma lanu viole malosi fuaina i le 570 nm e faʻaaoga ai le Cytation plate reader (BioTek). O faitauga na fa'avasegaina i le mamafa o fasi fatu ta'itasi.
Na suia le faʻasalalauga o le fatu i le faʻasalalauga o loʻo i ai le 1 μCi / ml [5-3H]-glucose (Moravek Biochemicals, Brea, CA, USA) mo le faʻaaogaina o le kulukose e pei ona faamatalaina muamua. A maeʻa le 4 itula o faʻamaʻi, faʻaopopo le 100 µl o le medium i se faʻamau microcentrifuge o loʻo i ai le 100 μl o le 0.2 N HCl. Ona tu'u lea o le paipa i totonu o se paipa fa'afefete o lo'o i ai le 500 μl o le dH2O e fa'asao ai [3H]2O mo le 72 itula i le 37°C. Ona aveese lea o le microcentrifuge tube mai le scintillation tube ma faaopoopo le 10 ml o le scintillation vai. Na fa'atinoina le faitau aofa'i o le fa'aogaina o le Tri-Carb 2900TR su'esu'e su'esu'e vai (Packard Bioscience Company, Meriden, CT, ISA). Ona fuafua lea o le fa'aogaina o le kulukose e fa'atatau i le [5-3H]-glucose gaioioiga patino, le atoatoa o le paleni ma le talaaga, fa'afefeteina o le [5-3H]-i le kulukose e le'i fa'ailogaina, ma le scintillation fa'afetaui lelei. O faʻamaumauga e masani i le tele o vaega o le fatu.
Ina ua maeʻa le homogenization o mea i Trizol, na vavae ese le RNA mai vaega o fatu e faʻaaoga ai le Qiagen miRNeasy Micro Kit #210874 e tusa ai ma le faʻasologa o le gaosiga. O tapenaga a le faletusi RNAsec, fa'asologa ma su'esu'ega fa'amaumauga sa faia e pei ona taua i lalo:
1 μg o le RNA i le faʻataʻitaʻiga na faʻaaogaina e avea ma mea amata mo le saunia o le faletusi RNA. O le fa'asologa o faletusi na fa'atupuina i le fa'aogaina o le NEBNext UltraTM RNA Library Preparation Kit mo Illumina (NEB, ISA) i le mulimuli ai i fautuaga a le gaosiga, ma fa'aopoopo fa'ailoga fa'ailoga i fa'asologa o uiga mo fa'ata'ita'iga ta'itasi. I se faapuupuuga, o le mRNA na faʻamamaina mai le RNA atoa e faʻaaoga ai pulu mageta faʻapipiʻi i poly-T oligonucleotides. O le vaevaega o lo'o fa'atinoina i le fa'aaogaina o cation divalent ile vevela maualuga ile NEBNext First Strand Synthesis Reaction Buffer (5X). O le vaega muamua o le cDNA na fa'apipi'iina i le fa'aogaina o fa'asologa o le hexamer ma le M-MuLV reverse transcriptase (RNase H-). O le vaega lona lua o le cDNA e fa'apipi'iina lea e fa'aaoga ai le DNA polymerase I ma le RNase H. O lo'o totoe o lo'o fa'aliliuina i pito fa'ama'i e ala i le gaioiga exonuclease/polymerase. A maeʻa le adenylation o le 3' pito o le vaega DNA, o le NEBNext Adapter faʻatasi ai ma se fausaga matasele lauulu e faʻapipiʻi i ai e saunia ai mo le faʻafefiloi. Mo le filifilia o vaega o le cDNA e sili ona umi 150-200 bp. na fa'amamāina vaega o le faletusi i le fa'aogaina o le AMPure XP system (Beckman Coulter, Beverly, ISA). Ona, 3 μl USER Enzyme (NEB, ISA) faʻatasi ma le tele-filifilia cDNA faʻapipiʻiina ma se mea faʻapipiʻi sa faʻaaogaina mo le 15 minute i le 37 ° C ma mo le 5 minute i le 95 ° C aʻo leʻi PCR. Ona faia lea o le PCR e faaaoga ai le Phusion High-Fidelity DNA polymerase, universal PCR primers, ma Index (X) primers. Mulimuli ane, na fa'amamāina oloa PCR (AMPure XP system) ma su'esu'eina le tulaga lelei o le faletusi i le Agilent Bioanalyzer 2100 system. O le faletusi cDNA na faʻasolosolo faʻatasi e faʻaaoga ai le Novaseq sequencer. O faila ata mata'utia mai Illumina na liua i le faitau mata'utia e fa'aaoga ai le CASAVA Base Calling. O fa'amaumauga mata'utia o lo'o teuina i faila faila FASTQ(fq) o lo'o iai fa'asologa faitau ma uiga fa'avae tutusa. Filifili HISAT2 e fa'afetaui fa'asologa fa'asologa o lo'o fa'avasegaina i le Sscrofa11.1 reference genome. I se tulaga lautele, e lagolagoina e le HISAT2 genomes o soʻo se lapoʻa, e aofia ai genomes e sili atu nai lo le 4 piliona faʻavae, ma faʻamautu tulaga faʻaletonu mo le tele o tapulaʻa. O le fa'asoaina o faitau mai fa'amaumauga a le RNA Seq e mafai ona fa'aoga lelei i le fa'aogaina o le HISAT2, le faiga sili ona vave o lo'o avanoa nei, ma tutusa pe sili atu le sa'o nai lo se isi lava metotia.
O le tele o tusitusiga e atagia saʻo ai le maualuga o faʻamatalaga o kenera. E su'esu'eina le maualuga o fa'amatalaga i le tele o tusitusiga (fa'asologa o fa'asologa) e feso'ota'i ma le genome po'o le fa'asili. Ole aofa'i o faitau e fa'atatau ile fa'aaliga fa'atupu kenera, umi ole gene, ma le loloto ole fa'asologa. FPKM (vaega i le afe taitoalua faavae o tusitusiga faʻasologa i le miliona paʻu faavae) na fuafuaina ma P-taua o faʻamatalaga eseese na fuafuaina e faʻaaoga ai le DESeq2 afifi. Ona matou fuafuaina lea o le fua faatatau o le suʻesuʻeina sese (FDR) mo tau P taʻitasi e faʻaaoga ai le Benjamini-Hochberg method9 faʻavae i luga o le R-function ua fausia "p.adjust".
O le RNA vavae ese mai vaega o le fatu na liua i le cDNA i le maualuga o le 200 ng / μl e faʻaaoga ai le SuperScript IV Vilo Master mix mai Thermo (Thermo, cat. No. 11756050). Quantitative RT-PCR na faia i le faaaogaina o le Applied Biosystems Endura Plate Microamp 384-well transparent reaction plate (Thermo, cat. No. 4483319) ma microamp optical adhesive (Thermo, cat. No. 4311971). O le fa'afefiloi fa'afoliga e iai le 5 μl Taqman Fast Advanced Master mix (Thermo, cat # 4444557), 0.5 μl Taqman Primer ma le 3.5 μl H2O fa'afefiloi i le vaieli. Sa fa'atautaia ta'amilosaga masani qPCR ma sa fuaina le aofa'i o le CT e fa'aaoga ai le Applied Biosystems Quantstudio 5 mea faigaluega PCR taimi-moni (384-well module; oloa # A28135). Taqman primers na fa'atau mai Thermo (GAPDH (Ss03375629_u1), PARP12 (Ss06908795_m1), PKDCC (Ss06903874_m1), CYGB (Ss06900188_m1), RGL1 (Ss06868) (Ss01009508_mH), GATA4 (Ss03383805_u1), GJA1 (Ss03374839_u1), COL1A2 (Ss03375009_u1 ), COL3A1 (Ss04323794_m1), ACTA2 (S5s uma) fa'ata'ita'iga na fa'amanino i le gafa o le fale GAPDH.
O faʻasalalauga faʻasalalauga o le NT-ProBNP na iloiloina e faʻaaoga ai le pusa NT-ProBNP (puaa) (Cat. No. MBS2086979, MyBioSource) e tusa ai ma le faʻasologa o le gaosiga. Fa'apuupuu, 250 µl o fa'ata'ita'iga ta'itasi ma fa'ata'ita'iga na fa'aopoopoina fa'alua i vaieli ta'itasi. A mae'a loa ona fa'aopoopo le fa'ata'ita'iga, fa'aopoopo le 50 µl ole Assay Reagent A ile vaieli ta'itasi. Lulu malie le ipu ma fa'amaufa'ailoga. Ona fa'a'ofuina lea o fualaau i le 37°C mo le 1 itula. Ona su'e lea o le vaifofo ma fufulu vaieli 4 taimi i le 350 µl o le 1X wash solution, fa'a'a'u le vaifofo fufulu mo le 1-2 minute i taimi ta'itasi. Ona fa'aopoopo lea o le 100 µl o le Assay Reagent B ile vaieli ma fa'amaufa'ailoga i le ipu fa'amau. O le laulau na lulu lemu ma fa'asusu i le 37°C mo le 30 minute. Fufulu le vaifofo ma fufulu vaieli 5 taimi ile 350 µl ole 1X fufulu vaifofo. Fa'aopoopo le 90 µl o le vaifofo o le substrate i vaieli ta'itasi ma fa'amau le ipu. Taofi le ipu i le 37°C mo le 10-20 minute. Fa'aopoopo le 50 µl Stop Solution i vaieli taitasi. Na vave fuaina le ipu e faʻaaoga ai le Cytation (BioTek) plate reader seti i le 450 nm.
Sa faia su'esu'ega malosi e filifili ai le tele o vaega e maua ai le >80% malosiaga e iloa ai se 10% suiga atoatoa i le parakalafa ma le 5% Type I error rate. Sa faia su'esu'ega malosi e filifili ai le tele o vaega e maua ai le >80% malosiaga e iloa ai se 10% suiga atoatoa i le parakalafa ma le 5% Type I error rate. Анализ мощности был выполнен для выбора размеров групп, которые обеспечат >80% мощности для обнаружения 10% изменения параметра с 5% частотой ошибок типа I. Sa faia le su'esu'ega o le malosi e filifili ai le tele o vaega e maua ai le >80% malosiaga e iloa ai le 10% o le suiga o le parameter ma le 5% Type I error rate.进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％I功效以检测参数中10％绝对变化和5％I他的生。进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％I功效以检测参数中10％绝对变化和5％I他的生。 Был проведен анализ мощности для выбора размера группы, который обеспечил бы > 80% мощности для обнаругложениа изменения параметров и 5% частоты ошибок типа I. Sa faia se su'esu'ega malosi e filifili ai se vaega tele e maua ai le > 80% le malosi e iloa ai le 10% o le suiga o le parameter ma le 5% ituaiga I fua faatatau sese.Na filifilia fa'afuase'i vaega o 'ie a'o le'i faia le su'ega. O su'esu'ega uma e tauaso ma fa'ata'ita'iga na fa'ato'a fa'avasega pe a uma fa'amaumauga uma. GraphPad Prism software (San Diego, CA) sa fa'aaogaina e fa'atino ai su'esu'ega fa'afuainumera uma. Mo fa'amaumauga uma, p-taua na manatu taua i tau <0.05. Mo fa'amaumauga uma, p-taua na manatu taua i tau <0.05. Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. Mo fa'amaumauga uma, p-taua na manatu taua i tau <0.05.对于所有统计数据，p 会在伀<0.05 时被认为是显着的。对于所有统计数据，p 会在伀<0.05 时被认为是显着的。 Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. Mo fa'amaumauga uma, p-taua na manatu taua i tau <0.05.Na faia le su'ega-t a Tamaiti aoga lua-tailed i fa'amaumauga ma na'o le 2 fa'atusatusaga. O le ANOVA e tasi-auala pe lua-auala na faʻaaogaina e fuafua ai le taua i le va o le tele o vaega. A'o faia su'ega post hoc, sa fa'aoga le fa'asa'oga a Tukey e fa'atatau mo le tele o fa'atusatusaga. O fa'amaumauga a le RNAsec e iai fa'amatalaga fa'afuainumera fa'apitoa pe a fa'atatau le FDR ma le p.adjust e pei ona fa'amatalaina i le vaega Metotia.
Mo nisi faʻamatalaga e uiga i suʻesuʻega suʻesuʻega, vaʻai i le Nature Research Report faʻamatalaga e fesoʻotaʻi ma lenei tusiga.