Terima kasih telah mengunjungi Nature.com. Versi browser yang Anda gunakan memiliki dukungan CSS yang terbatas. Untuk pengalaman terbaik, kami sarankan Anda menggunakan browser yang diperbarui (atau nonaktifkan Mode Kompatibilitas di Internet Explorer). Sementara itu, untuk memastikan dukungan yang berkelanjutan, kami akan menampilkan situs tanpa gaya dan JavaScript.
Ada kebutuhan untuk sistem in vitro yang andal yang dapat secara akurat mereproduksi lingkungan fisiologis jantung untuk pengujian obat. Ketersediaan terbatas sistem kultur jaringan jantung manusia telah menyebabkan interpretasi yang tidak akurat dari efek obat jantung. Di sini, kami telah mengembangkan model kultur jaringan jantung (CTCM) yang secara elektromekanis merangsang irisan jantung dan mengalami peregangan fisiologis selama fase sistolik dan diastolik dari siklus jantung. Setelah 12 hari kultur, pendekatan ini sebagian meningkatkan viabilitas bagian jantung, tetapi tidak sepenuhnya mempertahankan integritas strukturalnya. Oleh karena itu, setelah skrining molekul kecil, kami menemukan bahwa penambahan 100 nM triiodothyronine (T3) dan 1 μM deksametason (Dex) ke media kami mempertahankan mikrostruktur bagian selama 12 hari. Dalam kombinasi dengan pengobatan T3/Dex, sistem CTCM mempertahankan profil transkripsi, viabilitas, aktivitas metabolik, dan integritas struktural pada tingkat yang sama dengan jaringan jantung segar selama 12 hari. Selain itu, peregangan jaringan jantung yang berlebihan dalam kultur menyebabkan sinyal jantung hipertrofik, yang memberikan bukti kemampuan CTCM untuk meniru kondisi hipertrofik yang disebabkan oleh peregangan jantung. Sebagai kesimpulan, CTCM dapat memodelkan fisiologi dan patofisiologi jantung dalam kultur dalam jangka waktu yang lama, sehingga memungkinkan penyaringan obat yang andal.
Sebelum penelitian klinis, diperlukan sistem in vitro yang andal yang dapat secara akurat mereproduksi lingkungan fisiologis jantung manusia. Sistem tersebut harus meniru perubahan peregangan mekanis, denyut jantung, dan sifat elektrofisiologis. Model hewan umumnya digunakan sebagai platform penyaringan untuk fisiologi jantung dengan keandalan terbatas dalam mencerminkan efek obat pada jantung manusia1,2. Pada akhirnya, Model Eksperimental Kultur Jaringan Jantung Ideal (CTCM) adalah model yang sangat sensitif dan spesifik untuk berbagai intervensi terapeutik dan farmakologis, yang secara akurat mereproduksi fisiologi dan patofisiologi jantung manusia3. Tidak adanya sistem tersebut membatasi penemuan pengobatan baru untuk gagal jantung4,5 dan telah menyebabkan kardiotoksisitas obat sebagai alasan utama untuk keluar dari pasar6.
Selama dekade terakhir, delapan obat non-kardiovaskular telah ditarik dari penggunaan klinis karena menyebabkan perpanjangan interval QT yang menyebabkan aritmia ventrikel dan kematian mendadak7. Dengan demikian, ada peningkatan kebutuhan untuk strategi skrining praklinis yang andal untuk menilai kemanjuran dan toksisitas kardiovaskular. Penggunaan kardiomiosit yang berasal dari sel punca pluripoten yang diinduksi manusia (hiPS-CM) baru-baru ini dalam skrining obat dan pengujian toksisitas memberikan solusi parsial untuk masalah ini. Namun, sifat hiPS-CM yang belum matang dan kurangnya kompleksitas multiseluler jaringan jantung merupakan keterbatasan utama dari metode ini. Studi terbaru telah menunjukkan bahwa keterbatasan ini sebagian dapat diatasi dengan menggunakan hiPS-CM awal untuk membentuk hidrogel jaringan jantung segera setelah timbulnya kontraksi spontan dan secara bertahap meningkatkan stimulasi listrik dari waktu ke waktu. Namun, jaringan mikro hiPS-CM ini tidak memiliki sifat elektrofisiologis dan kontraktil yang matang dari miokardium dewasa. Selain itu, jaringan jantung manusia memiliki struktur yang lebih kompleks, yang terdiri dari campuran heterogen berbagai jenis sel, termasuk sel endotel, neuron, dan fibroblas stroma, yang saling terhubung oleh serangkaian protein matriks ekstraseluler tertentu. Heterogenitas populasi non-kardiomiosit11,12,13 pada jantung mamalia dewasa ini merupakan hambatan utama dalam pemodelan jaringan jantung menggunakan jenis sel individual. Keterbatasan utama ini menekankan pentingnya pengembangan metode untuk membudidayakan jaringan miokardium utuh dalam kondisi fisiologis dan patologis.
Bagian tipis (300 µm) yang dikultur dari jantung manusia telah terbukti menjadi model miokardium manusia yang utuh yang menjanjikan. Metode ini menyediakan akses ke sistem multiseluler 3D lengkap yang mirip dengan jaringan jantung manusia. Namun, hingga tahun 2019, penggunaan bagian jantung yang dikultur dibatasi oleh kelangsungan hidup kultur yang pendek (24 jam). Hal ini disebabkan oleh sejumlah faktor termasuk kurangnya peregangan fisik-mekanis, antarmuka udara-cairan, dan penggunaan media sederhana yang tidak mendukung kebutuhan jaringan jantung. Pada tahun 2019, beberapa kelompok penelitian menunjukkan bahwa menggabungkan faktor mekanis ke dalam sistem kultur jaringan jantung dapat memperpanjang umur kultur, meningkatkan ekspresi jantung, dan meniru patologi jantung. Dua penelitian elegan 17 dan 18 menunjukkan bahwa pembebanan mekanis uniaxial memiliki efek positif pada fenotipe jantung selama kultur. Namun, penelitian ini tidak menggunakan pembebanan fisiko-mekanis tiga dimensi dinamis dari siklus jantung, karena bagian jantung dibebani dengan gaya tarik isometrik 17 atau pembebanan auksotonik linear 18 . Metode peregangan jaringan ini mengakibatkan penekanan banyak gen jantung atau ekspresi berlebihan gen yang terkait dengan respons peregangan abnormal. Khususnya, Pitoulis dkk. 19 mengembangkan bak kultur irisan jantung dinamis untuk rekonstruksi siklus jantung menggunakan umpan balik transduser gaya dan penggerak tegangan. Meskipun sistem ini memungkinkan pemodelan siklus jantung in vitro yang lebih akurat, kompleksitas dan rendahnya hasil metode ini membatasi penerapan sistem ini. Laboratorium kami baru-baru ini mengembangkan sistem kultur yang disederhanakan menggunakan stimulasi listrik dan media yang dioptimalkan untuk mempertahankan viabilitas potongan jaringan jantung babi dan manusia hingga 6 hari20,21.
Dalam naskah saat ini, kami menjelaskan model kultur jaringan jantung (CTCM) menggunakan potongan jantung babi yang menggabungkan isyarat humoral untuk merangkum fisiologi jantung tiga dimensi dan distensi patofisiologis selama siklus jantung. CTCM ini dapat meningkatkan akurasi prediksi obat praklinis ke tingkat yang belum pernah dicapai sebelumnya dengan menyediakan sistem jantung yang hemat biaya dan berthroughput sedang yang meniru fisiologi/patofisiologi jantung mamalia untuk pengujian obat praklinis.
Sinyal mekanis hemodinamik memainkan peran penting dalam mempertahankan fungsi kardiomiosit in vitro 22,23,24. Dalam naskah saat ini, kami telah mengembangkan CTCM (Gambar 1a) yang dapat meniru lingkungan jantung dewasa dengan menginduksi stimulasi listrik dan mekanis pada frekuensi fisiologis (1,2 Hz, 72 denyut per menit). Untuk menghindari peregangan jaringan yang berlebihan selama diastol, perangkat pencetakan 3D digunakan untuk meningkatkan ukuran jaringan hingga 25% (Gbr. 1b). Pacing listrik yang diinduksi oleh sistem C-PACE diatur waktunya untuk mulai 100 ms sebelum sistole menggunakan sistem akuisisi data untuk mereproduksi siklus jantung sepenuhnya. Sistem kultur jaringan menggunakan aktuator pneumatik yang dapat diprogram (LB Engineering, Jerman) untuk secara siklis memperluas membran silikon yang fleksibel untuk menyebabkan perluasan irisan jantung di ruang atas. Sistem dihubungkan ke saluran udara eksternal melalui transduser tekanan, yang memungkinkan untuk secara akurat menyesuaikan tekanan (± 1 mmHg) dan waktu (± 1 ms) (Gbr. 1c).
a Pasangkan potongan jaringan ke cincin penyangga 7 mm, yang ditunjukkan dengan warna biru, di dalam ruang kultur perangkat. Ruang kultur dipisahkan dari ruang udara oleh membran silikon tipis yang fleksibel. Letakkan paking di antara setiap ruang untuk mencegah kebocoran. Tutup perangkat berisi elektroda grafit yang memberikan stimulasi listrik. b Representasi skematis perangkat jaringan besar, cincin pemandu, dan cincin penyangga. Potongan jaringan (coklat) diletakkan pada perangkat berukuran besar dengan cincin pemandu diletakkan di alur pada tepi luar perangkat. Dengan menggunakan pemandu, letakkan cincin penyangga yang dilapisi perekat akrilik jaringan dengan hati-hati di atas potongan jaringan jantung. c Grafik yang menunjukkan waktu stimulasi listrik sebagai fungsi tekanan ruang udara yang dikontrol oleh aktuator pneumatik terprogram (PPD). Perangkat akuisisi data digunakan untuk menyinkronkan stimulasi listrik menggunakan sensor tekanan. Ketika tekanan di ruang kultur mencapai ambang batas yang ditetapkan, sinyal pulsa dikirim ke C-PACE-EM untuk memicu stimulasi listrik. d Gambar empat CTCM yang diletakkan di rak inkubator. Empat perangkat dihubungkan ke satu PPD melalui sirkuit pneumatik, dan sensor tekanan dimasukkan ke dalam katup hemostatik untuk memantau tekanan di sirkuit pneumatik. Setiap perangkat berisi enam bagian jaringan.
Dengan menggunakan aktuator pneumatik tunggal, kami dapat mengendalikan 4 perangkat CTCM, yang masing-masing dapat menampung 6 bagian jaringan (Gbr. 1d). Dalam CTCM, tekanan udara di ruang udara diubah menjadi tekanan sinkron di ruang cairan dan menginduksi ekspansi fisiologis irisan jantung (Gambar 2a dan Film Tambahan 1). Evaluasi regangan jaringan pada 80 mm Hg. Seni. menunjukkan peregangan bagian jaringan sebesar 25% (Gbr. 2b). Persentase peregangan ini telah terbukti sesuai dengan panjang sarkomer fisiologis 2,2–2,3 µm untuk kontraktilitas bagian jantung normal17,19,25. Pergerakan jaringan dinilai menggunakan pengaturan kamera khusus (Gambar Tambahan 1). Amplitudo dan kecepatan pergerakan jaringan (Gbr. 2c, d) sesuai dengan regangan selama siklus jantung dan waktu selama sistol dan diastol (Gbr. 2b). Regangan dan kecepatan jaringan jantung selama kontraksi dan relaksasi tetap konstan selama 12 hari dalam kultur (Gbr. 2f). Untuk mengevaluasi efek stimulasi listrik pada kontraktilitas selama kultur, kami mengembangkan metode untuk menentukan deformitas aktif menggunakan algoritma shading (Gambar Tambahan 2a,b) dan mampu membedakan antara deformitas dengan dan tanpa stimulasi listrik. Bagian jantung yang sama (Gambar 2f). Di daerah potongan yang dapat digerakkan (R6-9), voltase selama stimulasi listrik 20% lebih tinggi daripada tanpa adanya stimulasi listrik, yang menunjukkan kontribusi stimulasi listrik terhadap fungsi kontraktil.
Jejak representatif tekanan ruang udara, tekanan ruang cairan, dan pengukuran pergerakan jaringan mengonfirmasi bahwa tekanan ruang mengubah tekanan ruang cairan, yang menyebabkan pergerakan irisan jaringan yang sesuai. b Jejak representatif dari persen regangan (biru) dari bagian jaringan yang sesuai dengan persen regangan (oranye). c Gerakan irisan jantung yang terukur konsisten dengan kecepatan gerak yang terukur. (d) Lintasan representatif gerakan siklik (garis biru) dan kecepatan (garis putus-putus oranye) dalam irisan jantung. e Kuantifikasi waktu siklus (n = 19 irisan per kelompok, dari babi yang berbeda), waktu kontraksi (n = 19 irisan per kelompok), waktu relaksasi (n = 19 irisan per kelompok, dari babi yang berbeda), pergerakan jaringan (n = 25 irisan)/kelompok dari babi yang berbeda), kecepatan sistolik puncak (n = 24(D0), 25(D12) irisan/kelompok dari babi yang berbeda) dan laju relaksasi puncak (n=24(D0), 25(D12) irisan/kelompok dari babi yang berbeda). Uji t-Student dua-ekor tidak menunjukkan perbedaan signifikan dalam parameter apa pun. f Jejak analisis regangan representatif dari potongan jaringan dengan (merah) dan tanpa (biru) stimulasi listrik, sepuluh area regional potongan jaringan dari potongan yang sama. Panel bawah menunjukkan kuantifikasi perbedaan persentase regangan pada potongan jaringan dengan dan tanpa stimulasi listrik di sepuluh area dari potongan yang berbeda. (n = 8 irisan/kelompok dari babi yang berbeda, Uji t Student dua sisi dilakukan; ****p < 0,0001, **p < 0,01, *p < 0,05). (n = 8 irisan/kelompok dari babi yang berbeda, Uji t Student dua sisi dilakukan; ****p < 0,0001, **p < 0,01, *p < 0,05). (n = 8 срезов/группу от разных свиней, проводится двусторонний t-критерий Стьюдента; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05). (n = 8 bagian/kelompok dari babi yang berbeda, uji-t Siswa dua sisi; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05). （n = 8 片/组,来自不同的猪,进行双尾学生t 检验；****p < 0,0001,**p < 0,01,*p < 0,05）。 （n = 8 片/组,来自不同的猪,进行双尾学生t 检验；****p < 0,0001,**p < 0,01,*p < 0,05）。 (n = 8 hari/hari, от разных свиней, двусторонний критерий Стьюдента; ****p <0,0001, **p <0,01, *p <0,05). (n = 8 bagian/kelompok, dari babi yang berbeda, uji-t Siswa dua sisi; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05).Batang kesalahan menunjukkan nilai rata-rata ± simpangan baku.
Dalam sistem kultur irisan jantung biomimetik statis kami sebelumnya [20, 21], kami mempertahankan viabilitas, fungsi, dan integritas struktural irisan jantung selama 6 hari dengan menerapkan stimulasi listrik dan mengoptimalkan komposisi medium. Namun, setelah 10 hari, angka-angka ini turun tajam. Kami akan merujuk pada bagian yang dikultur dalam sistem kultur biomimetik statis kami sebelumnya 20, 21 kondisi kontrol (Ctrl) dan kami akan menggunakan medium kami yang dioptimalkan sebelumnya sebagai kondisi MC dan kultur di bawah stimulasi mekanis dan listrik simultan (CTCM). disebut . Pertama, kami menentukan bahwa stimulasi mekanis tanpa stimulasi listrik tidak cukup untuk mempertahankan viabilitas jaringan selama 6 hari (Gambar Tambahan 3a,b). Menariknya, dengan diperkenalkannya stimulasi fisio-mekanis dan listrik menggunakan STCM, viabilitas bagian jantung 12 hari tetap sama seperti pada bagian jantung segar dalam kondisi MS, tetapi tidak dalam kondisi Ctrl, seperti yang ditunjukkan oleh analisis MTT (Gbr. 1). 3a). Hal ini menunjukkan bahwa stimulasi mekanis dan simulasi siklus jantung dapat menjaga bagian jaringan tetap hidup dua kali lebih lama daripada yang dilaporkan dalam sistem kultur statis kami sebelumnya. Namun, penilaian integritas struktural bagian jaringan dengan imunolabeling troponin T jantung dan connexin 43 menunjukkan bahwa ekspresi connexin 43 secara signifikan lebih tinggi pada jaringan MC pada hari ke-12 dibandingkan pada kontrol pada hari yang sama. Namun, ekspresi connexin 43 yang seragam dan pembentukan cakram Z tidak sepenuhnya dipertahankan (Gbr. 3b). Kami menggunakan kerangka kerja kecerdasan buatan (AI) untuk mengukur integritas struktural jaringan26, alur pembelajaran mendalam berbasis gambar berdasarkan pewarnaan troponin-T dan connexin43 untuk secara otomatis mengukur integritas struktural dan fluoresensi irisan jantung dalam hal kekuatan lokalisasi. Metode ini menggunakan Jaringan Syaraf Konvolusional (CNN) dan kerangka kerja pembelajaran mendalam untuk mengukur integritas struktural jaringan jantung secara andal dengan cara yang otomatis dan tidak bias, seperti yang dijelaskan dalam referensi. 26. Jaringan MC menunjukkan peningkatan kesamaan struktural pada hari ke-0 dibandingkan dengan bagian kontrol statis. Selain itu, pewarnaan trikrom Masson menunjukkan persentase fibrosis yang jauh lebih rendah dalam kondisi MS dibandingkan dengan kondisi kontrol pada hari ke-12 kultur (Gbr. 3c). Sementara CTCM meningkatkan viabilitas potongan jaringan jantung pada hari ke-12 ke tingkat yang mirip dengan jaringan jantung segar, hal itu tidak meningkatkan integritas struktural potongan jantung secara signifikan.
Grafik batang menunjukkan kuantifikasi viabilitas MTT dari irisan jantung segar (D0) atau kultur irisan jantung selama 12 hari baik dalam kultur statis (D12 Ctrl) atau dalam CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) irisan/kelompok dari babi yang berbeda, uji ANOVA satu arah dilakukan; ####p < 0,0001 dibandingkan dengan D0 dan **p < 0,01 dibandingkan dengan D12 Ctrl). Grafik batang menunjukkan kuantifikasi viabilitas MTT dari irisan jantung segar (D0) atau kultur irisan jantung selama 12 hari baik dalam kultur statis (D12 Ctrl) atau dalam CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) irisan/kelompok dari babi yang berbeda, uji ANOVA satu arah dilakukan; ####p < 0,0001 dibandingkan dengan D0 dan **p < 0,01 dibandingkan dengan D12 Ctrl).histogram menunjukkan kuantifikasi viabilitas potongan jantung segar MTT (D0) atau kultur potongan jantung selama 12 hari dalam kultur statis (kontrol D12) atau CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (kontrol D12). ) ), 12 (D12 MC) potongan/kelompok dari babi yang berbeda, uji ANOVA satu arah dilakukan;####p < 0,0001 по сравнению с D0 dan **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p < 0,0001 dibandingkan dengan D0 dan **p < 0,01 dibandingkan dengan D12 Ctrl). a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切片(D0)或心脏切片培养12 天的MTT 活力的量化),来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA测试；与D0 相比，####p < 0,0001,与D12 Ctrl,**p < 0,01)。 a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切片(D0) ,来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组,进行单向ANOVA 测试；与D0 相比,####p < 0.0001,与D12 Ctrl 相比,**p。)histogram yang menunjukkan kuantifikasi viabilitas MTT pada potongan jantung segar (D0) atau potongan jantung yang dikultur selama 12 hari dalam kultur statis (kontrol D12) atau CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (kontrol D12)), 12 (D12 MC) potongan/kelompok dari babi yang berbeda, uji ANOVA satu arah;####p < 0,0001 по сравнению с D0, **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p < 0,0001 dibandingkan dengan D0, **p < 0,01 dibandingkan dengan D12 Ctrl).b Troponin-T (hijau), connexin 43 (merah) dan DAPI (biru) pada irisan jantung yang baru diisolasi (D0) atau irisan jantung yang dikultur dalam kondisi statis (Ctrl) atau kondisi CTCM (MC) selama 12 hari) dari gambar imunofluoresensi representatif (skala kosong = 100 µm). Kuantifikasi kecerdasan buatan terhadap integritas struktural jaringan jantung (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) irisan/kelompok masing-masing dari babi yang berbeda, uji ANOVA satu arah dilakukan; ####p < 0,0001 dibandingkan dengan D0 dan ****p < 0,0001 dibandingkan dengan D12 Ctrl). Kuantifikasi kecerdasan buatan terhadap integritas struktural jaringan jantung (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) irisan/kelompok masing-masing dari babi yang berbeda, uji ANOVA satu arah dilakukan; ####p < 0,0001 dibandingkan dengan D0 dan ****p < 0,0001 dibandingkan dengan D12 Ctrl). Количественная оценка структурной целостности сердечной ткани искусственным интеллектом (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) срезов/групп от разных tentu saja, tes ANOVA; ####p < 0,0001 по сравнению с D0 dan ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). Kuantifikasi integritas struktural jaringan jantung dengan kecerdasan buatan (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) bagian/kelompok dari babi yang berbeda, uji ANOVA satu arah dilakukan; ####p < 0,0001 vs. dengan D0 dan ****p < 0,0001 dibandingkan dengan D12 Ctrl).人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) irisan/kelompok masing-masing babi berbeda, uji ANOVA satu arah;####p < 0.0001 与D0相比,****p < 0.0001 与D12 Ctrl 相比）。人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) irisan/kelompok masing-masing babi berbeda, uji ANOVA satu arah;####p < 0,0001与D0相比,****p < 0.0001 与D12 Ctrl 相比）。 интеллект для количественной оценки структурной целостности сердечной ткани (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) срезов/группу каждой из oleh karena itu, uji ANOVA; ####p <0,0001 vs. D0 Для сравнения ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). Kecerdasan buatan untuk mengukur integritas struktural jaringan jantung (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) bagian/kelompok masing-masing babi yang berbeda, uji ANOVA satu arah; ####p<0,0001 vs.D0 Sebagai perbandingan ****p < 0,0001 dibandingkan dengan D12 Ctrl). c Gambaran representatif (kiri) dan kuantifikasi (kanan) untuk irisan jantung yang diwarnai dengan pewarna trikrom Masson (Skala kosong = 500 µm) (n = 10 irisan/kelompok masing-masing dari babi yang berbeda, uji ANOVA satu arah dilakukan; ####p < 0,0001 dibandingkan dengan D0 dan ***p < 0,001 dibandingkan dengan D12 Ctrl). c Gambaran representatif (kiri) dan kuantifikasi (kanan) untuk irisan jantung yang diwarnai dengan pewarna trikrom Masson (Skala telanjang = 500 µm) (n = 10 irisan/kelompok masing-masing dari babi yang berbeda, uji ANOVA satu arah dilakukan; #### p < 0,0001 dibandingkan dengan D0 dan ***p < 0,001 dibandingkan dengan D12 Ctrl). c Репрезентативные изображения (слева) и количественная оценка (справа) срезов сердца, окрашенных трихромным красителем Массона (масштаб без покрытия = 500 mm) (n = 10 срезов/группу от разных свиней, выполняется односторонний tes ANOVA; #### p < 0,0001 по сравнению с D0 dan ***p < 0,001 по tekan D12 Ctrl). c Gambaran representatif (kiri) dan kuantifikasi (kanan) irisan jantung yang diwarnai dengan pewarna trikrom Masson (skala tak dilapisi = 500 µm) (n = 10 irisan/kelompok dari babi yang berbeda, dilakukan uji ANOVA satu arah; #### p < 0,0001 dibandingkan dengan D0 dan ***p < 0,001 dibandingkan dengan D12 Ctrl). c 用Masson三色染料染色的心脏切片的代表性图像（左）和量化（右）（裸尺度= 500 µm）（n = 10 个切片/组，每组来自不同的猪，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0.0001 与D0 相比，***p < 0.001 与D12 Ctrl 相比）。 C 用 Masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 （左 左） 量化 （右） 裸尺度 裸尺度 裸尺度裸尺度 = 500 µm） （n = 10 个 切片 组 每 组 来自 不同 猪 , 进行 单向 单向 Anova 测试；#### p < 0,0001与D0 相比,***p < 0.001 与D12 Ctrl 相比）。 c Репрезентативные изображения (слева) и количественный анализ (справа) срезов сердца, окрашенных трихромным красителем Массона (чистая шкала = 500 mm) (n = 10 срезов/группа, каждый от другой свиньи, протестировано с помощью analisis tambahan ;### #p < 0,0001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Gambaran representatif (kiri) dan kuantisasi (kanan) irisan jantung yang diwarnai dengan pewarna trikrom Masson (kosong = 500 µm) (n = 10 irisan/kelompok, masing-masing dari babi yang berbeda, diuji dengan analisis varians satu arah ;### # p < 0,0001 dibandingkan dengan D0, ***p < 0,001 dibandingkan dengan D12 Ctrl).Batang kesalahan menunjukkan nilai rata-rata ± simpangan baku.
Kami berhipotesis bahwa dengan menambahkan molekul kecil ke media kultur, integritas kardiomiosit dapat ditingkatkan dan perkembangan fibrosis berkurang selama kultur CTCM. Oleh karena itu, kami menyaring molekul kecil menggunakan kultur kontrol statis kami20,21 karena sedikitnya jumlah faktor pengganggu. Deksametason (Dex), triiodotironin (T3), dan SB431542 (SB) dipilih untuk penyaringan ini. Molekul-molekul kecil ini sebelumnya telah digunakan dalam kultur hiPSC-CM untuk menginduksi pematangan kardiomiosit dengan meningkatkan panjang sarkomer, tubulus T, dan kecepatan konduksi. Selain itu, baik Dex (glukokortikoid) dan SB diketahui dapat menekan peradangan29,30. Oleh karena itu, kami menguji apakah penyertaan satu atau kombinasi molekul-molekul kecil ini akan meningkatkan integritas struktural bagian-bagian jantung. Untuk penyaringan awal, dosis masing-masing senyawa dipilih berdasarkan konsentrasi yang umum digunakan dalam model kultur sel (1 μM Dex27, 100 nM T327, dan 2,5 μM SB31). Setelah 12 hari kultur, kombinasi T3 dan Dex menghasilkan integritas struktural kardiomiosit yang optimal dan remodeling fibrosa yang minimal (Gambar Tambahan 4 dan 5). Selain itu, penggunaan dua kali lipat atau dua kali lipat konsentrasi T3 dan Dex ini menghasilkan efek yang merugikan dibandingkan dengan konsentrasi normal (Gambar Tambahan 6a,b).
Bahasa Indonesia: Setelah penyaringan awal, kami melakukan perbandingan langsung dari 4 kondisi kultur (Gambar 4a): Ctrl: irisan jantung dikultur dalam kultur statis yang kami jelaskan sebelumnya menggunakan media kami yang dioptimalkan; 20.21 TD: T3 dan Ctrl s Menambahkan Dex pada hari Rabu; MC: irisan jantung dikultur dalam CTCM menggunakan media kami yang dioptimalkan sebelumnya; dan MT: CTCM dengan T3 dan Dex ditambahkan ke media. Setelah 12 hari budidaya, viabilitas jaringan MS dan MT tetap sama seperti pada jaringan segar yang dinilai dengan uji MTT (Gbr. 4b). Menariknya, penambahan T3 dan Dex ke kultur transwell (TD) tidak menghasilkan peningkatan viabilitas yang signifikan dibandingkan dengan kondisi Ctrl, yang menunjukkan peran penting stimulasi mekanis dalam mempertahankan viabilitas irisan jantung.
diagram desain Eksperimental yang menggambarkan empat kondisi kultur yang digunakan untuk mengevaluasi efek stimulasi mekanis dan suplementasi T3/Dex pada media selama 12 hari. b Grafik batang menunjukkan kuantifikasi viabilitas 12 hari pasca kultur dalam semua 4 kondisi kultur (Ctrl, TD, MC, dan MT) dibandingkan dengan irisan jantung segar (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD, dan D12 MT), 12 (D12 MC) irisan/kelompok dari babi yang berbeda, uji ANOVA satu arah dilakukan; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 dibandingkan dengan D0 dan **p < 0,01 dibandingkan dengan D12 Ctrl). b Grafik batang menunjukkan kuantifikasi viabilitas 12 hari pasca kultur dalam semua 4 kondisi kultur (Ctrl, TD, MC, dan MT) dibandingkan dengan irisan jantung segar (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD, dan D12 MT), 12 (D12 MC) irisan/kelompok dari babi yang berbeda, uji ANOVA satu arah dilakukan; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 dibandingkan dengan D0 dan **p < 0,01 dibandingkan dengan D12 ctrl). b Kepemilikan Layanan Pelanggan setelah 12 hari kerja культивирования dalam 4 bulan культивирования (контроль, TD, MC dan MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD dan D12 MT), 12 (D12 MC) срезов/группу от разных свиней, penggunaan tes ANOVA; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 по сравнению с D0 dan **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). b Grafik batang menunjukkan kuantifikasi viabilitas pada 12 hari pasca kultur dalam semua 4 kondisi kultur (kontrol, TD, MC, dan MT) dibandingkan dengan irisan jantung segar (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD, dan D12 MT), 12 (D12 MC) irisan/kelompok dari babi yang berbeda, uji ANOVA satu arah; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 vs. D0 dan **p < 0,01 dibandingkan dengan D12 Ctrl). b 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) (n = 18 (D0)、15 (D12 Ctrl、D12 TD 和D12 MT),来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组,进行单向ANOVA 测试；####p < 0.0001，###p < 0.001 与D0 相比,**p < 0.01 与D12控制）。b4 12 (D12MC) b Гистограмма, показывающая все 4 условия культивирования (контроль, TD, MC dan MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD dan D12 MT), dari 12 (D12 MC) срезы/группа, односторонний тест ANOVA; ####p <0,0001, ###p <0,001 по сравнению с D0, **p <0,01 по сравнению с контролем D12). b Histogram yang menunjukkan semua 4 kondisi kultur (kontrol, TD, MC, dan MT) dibandingkan dengan potongan jantung segar (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD, dan D12 MT), dari babi yang berbeda 12 (D12 MC) potongan/kelompok, uji ANOVA satu arah; ####p<0,0001, ###p<0,001 vs. D0, **p<0,01 vs. kontrol D12). c Grafik batang menunjukkan kuantifikasi fluks glukosa 12 hari pasca kultur dalam semua 4 kondisi kultur (Ctrl, TD, MC, dan MT) dibandingkan dengan irisan jantung segar (D0) (n = 6 irisan/kelompok dari babi yang berbeda, uji ANOVA satu arah dilakukan; ###p < 0,001, dibandingkan dengan D0 dan ***p < 0,001 dibandingkan dengan D12 Ctrl). c Grafik batang menunjukkan kuantifikasi fluks glukosa 12 hari pasca kultur dalam semua 4 kondisi kultur (Ctrl, TD, MC, dan MT) dibandingkan dengan irisan jantung segar (D0) (n = 6 irisan/kelompok dari babi yang berbeda, uji ANOVA satu arah dilakukan; ###p < 0,001, dibandingkan dengan D0 dan ***p < 0,001 dibandingkan dengan D12 Ctrl). c Panduan Pengguna yang Dapat Dipakai Гистограмма показывает количественную оценку потока глюкозы через 12 hari yang lalu культивирования dalam 4 bulan культивирования (контроль, TD, MC dan MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 6 срезов/группу от разных свиней, односторонний Kami menggunakan ANOVA; ###p < 0,001 по сравнению с D0 и ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Histogram menunjukkan kuantifikasi fluks glukosa 12 hari pasca kultur pada seluruh 4 kondisi kultur (kontrol, TD, MC, dan MT) dibandingkan dengan irisan jantung segar (D0) (n = 6 irisan/kelompok dari babi yang berbeda, uji ANOVA satu arah dilakukan; ###p < 0,001 dibandingkan dengan D0 dan ***p < 0,001 dibandingkan dengan D12 Ctrl). c 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) 相比，培养后12天的葡萄糖通量定量（n = 6 片/组,来自不同猪,单向执行ANOVA 测试；###p < 0.001,与D0 相比,***p < 0,001 与D12 Ctrl 相比）。 C 条形图 显示 所有 4 种 条件 （（ctrl 、 td 、 mc 和 mt） 新鲜 心脏 切片 切片 切片 相比 , 培养后 后 12 天 的 通量 定量 （n = 6 片/组 , 来自 猪 , , , , , , 猪 猪单向执行ANOVA 测试；###p < 0,001,与D0 相比,***p < 0,001 与D12 Ctrl 相比）。 c Layanan, Layanan Pelanggan Глюкозы через 12 hari kerja pembayaran untuk 4 bulan культивирования (контроль, TD, MC dan MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 6 срезов/группа, от разных свиней, односторонний Были melalui tes ANOVA; ###p < 0,001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению с D12 (контроль). c Histogram yang menunjukkan kuantifikasi fluks glukosa pada 12 hari pasca kultur untuk semua 4 kondisi kultur (kontrol, TD, MC, dan MT) dibandingkan dengan irisan jantung segar (D0) (n = 6 irisan/kelompok, dari babi yang berbeda, unilateral Di mana uji ANOVA dilakukan, ###p < 0,001 dibandingkan dengan D0, ***p < 0,001 dibandingkan dengan D12 (kontrol).d Plot analisis galur jaringan segar (biru), MC hari ke-12 (hijau), dan MT hari ke-12 (merah) di sepuluh titik irisan jaringan regional (n = 4 irisan/kelompok, uji ANOVA satu arah; tidak ada perbedaan signifikan antar kelompok). e Plot gunung berapi yang menunjukkan gen yang diekspresikan secara berbeda pada irisan jantung segar (D0) dibandingkan dengan irisan jantung yang dikultur dalam kondisi statis (Ctrl) atau dalam kondisi MT (MT) selama 10-12 hari. f Peta panas gen sarkomer untuk irisan jantung yang dikultur dalam setiap kondisi kultur. Batang galat menunjukkan rata-rata ± simpangan baku.
Ketergantungan metabolik pada peralihan dari oksidasi asam lemak ke glikolisis merupakan ciri khas dediferensiasi kardiomiosit. Kardiomiosit yang belum matang terutama menggunakan glukosa untuk produksi ATP dan memiliki mitokondria hipoplastik dengan sedikit krista5,32. Analisis penggunaan glukosa menunjukkan bahwa dalam kondisi MC dan MT, penggunaan glukosa serupa dengan yang ada di jaringan hari ke-0 (Gambar 4c). Namun, sampel Ctrl menunjukkan peningkatan signifikan dalam penggunaan glukosa dibandingkan dengan jaringan segar. Hal ini menunjukkan bahwa kombinasi CTCM dan T3/Dex meningkatkan viabilitas jaringan dan mempertahankan fenotipe metabolik dari potongan jantung yang dikultur selama 12 hari. Selain itu, analisis regangan menunjukkan bahwa kadar regangan tetap sama seperti pada jaringan jantung segar selama 12 hari dalam kondisi MT dan MS (Gbr. 4d).
Untuk menganalisis dampak keseluruhan CTCM dan T3/Dex pada lanskap transkripsi global jaringan irisan jantung, kami melakukan RNAseq pada irisan jantung dari keempat kondisi kultur yang berbeda (Data Tambahan 1). Menariknya, bagian MT menunjukkan kesamaan transkripsi yang tinggi dengan jaringan jantung segar, dengan hanya 16 yang diekspresikan secara berbeda dari 13.642 gen. Namun, seperti yang kami tunjukkan sebelumnya, irisan Ctrl menampilkan 1229 gen yang diekspresikan secara berbeda setelah 10–12 hari dalam kultur (Gbr. 4e). Data ini dikonfirmasi oleh qRT-PCR gen jantung dan fibroblas (Gbr. Tambahan 7a-c). Menariknya, bagian Ctrl menunjukkan penurunan regulasi gen jantung dan siklus sel serta aktivasi program gen inflamasi. Data ini menunjukkan bahwa dedifferensiasi, yang biasanya terjadi setelah kultur jangka panjang, sepenuhnya dilemahkan dalam kondisi MT (Gbr. Tambahan 8a,b). Studi yang cermat terhadap gen sarkomer menunjukkan bahwa hanya dalam kondisi MT gen yang mengkode sarkomer (Gbr. 4f) dan saluran ion (Gbr. Tambahan 9) terpelihara, melindunginya dari penekanan dalam kondisi Ctrl, TD, dan MC. Data ini menunjukkan bahwa dengan kombinasi stimulasi mekanis dan humoral (T3/Dex), transkriptom irisan jantung dapat tetap mirip dengan irisan jantung segar setelah 12 hari dalam kultur.
Temuan transkripsi ini didukung oleh fakta bahwa integritas struktural kardiomiosit pada irisan jantung paling baik dipertahankan dalam kondisi MT selama 12 hari, seperti yang ditunjukkan oleh connexin 43 yang utuh dan terlokalisasi (Gbr. 5a). Selain itu, fibrosis pada irisan jantung dalam kondisi MT berkurang secara signifikan dibandingkan dengan Ctrl dan serupa dengan irisan jantung segar (Gbr. 5b). Data ini menunjukkan bahwa kombinasi stimulasi mekanis dan pengobatan T3/Dex secara efektif mempertahankan struktur jantung pada irisan jantung dalam kultur.
Gambaran imunofluoresensi representatif dari troponin-T (hijau), connexin 43 (merah), dan DAPI (biru) pada irisan jantung yang baru diisolasi (D0) atau dikultur selama 12 hari pada keempat kondisi kultur irisan jantung (skala batang = 100 µm). ). Kuantifikasi kecerdasan buatan terhadap integritas struktural jaringan jantung (n = 7 (D0 dan D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC, dan D12 MT) irisan/kelompok dari babi yang berbeda, uji ANOVA satu arah dilakukan; ####p < 0,0001 dibandingkan dengan D0 dan *p < 0,05, atau ****p < 0,0001 dibandingkan dengan D12 Ctrl). Kuantifikasi kecerdasan buatan terhadap integritas struktural jaringan jantung (n = 7 (D0 dan D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC dan D12 MT) irisan/kelompok dari babi yang berbeda, uji ANOVA satu arah dilakukan; #### p < 0,0001 dibandingkan dengan D0 dan *p < 0,05, atau ****p < 0,0001 dibandingkan dengan D12 Ctrl). Kolektifitas yang diperlukan untuk menentukan nilai yang diinginkan (n = 7 (D0 dan D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC dan D12 MT) срезов/группу oleh karena itu, kami menggunakan tes ANOVA; #### p < 0,0001 по сравнению с D0 и *p < 0,05 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). Kuantifikasi integritas struktural jaringan jantung menggunakan kecerdasan buatan (n = 7 (D0 dan D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC dan D12 MT) bagian/kelompok dari babi yang berbeda, uji ANOVA satu arah dilakukan; #### p < 0,0001 dibandingkan dengan D0 dan *p < 0,05 atau ****p < 0,0001 dibandingkan dengan D12 Ctrl).对不同猪的心脏组织结构完整性（n = 7（D0 和D12 Ctrl）、5（D12 TD、D12 MC 和D12 MT）切片/组）进行人工智能量化,进行单向ANOVA 测试；#### p < 0.0001 与D0 和*p < 0.05 相比,或****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）。对 不同 猪 的 心脏 结构 完整性 （n = 7 （d0 和 d12 ctrl） （5 （d12 td 、 d12 mc 和 d12 mt） 组）人工 智能量 化 进行 单向 单向 单向 测试 ； ########## p < 0,0001 与D0 和*p < 0,05 相比,或****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）。Kuantifikasi integritas struktural jaringan jantung menggunakan kecerdasan buatan pada babi yang berbeda (n = 7 (D0 dan D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC dan D12 MT) bagian/kelompok) dengan uji ANOVA satu arah;#### p < 0,0001 по сравнению с D0 и *p < 0,05 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). #### p < 0,0001 dibandingkan dengan D0 dan *p < 0,05 atau ****p < 0,0001 dibandingkan dengan D12 Ctrl). b Gambaran representatif dan kuantifikasi untuk irisan jantung yang diwarnai dengan pewarna trikrom Masson (Skala batang = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD, dan D12 MC), 9 (D12 MT) irisan/kelompok dari babi yang berbeda, uji ANOVA satu arah dilakukan; ####p < 0,0001 dibandingkan dengan D0 dan ***p < 0,001, atau ****p < 0,0001 dibandingkan dengan D12 Ctrl). b Gambaran representatif dan kuantifikasi untuk irisan jantung yang diwarnai dengan pewarna trikrom Masson (Skala batang = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD, dan D12 MC), 9 (D12 MT) irisan/kelompok dari babi yang berbeda, uji ANOVA satu arah dilakukan; ####p < 0,0001 dibandingkan dengan D0 dan ***p < 0,001, atau ****p < 0,0001 dibandingkan dengan D12 Ctrl). b Penyimpanan dan penyimpanan yang diperlukan secara berkala, waktu yang ditentukan красителем Массона (масштабная линейка = 500 mm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD dan D12 MC), 9 (D12 MT) срезов/группу от разных свиней, выполняется односторонний uji ANOVA; ####p < 0,0001 по сравнению с D0 и ***p < 0,001 atau ****p < 0,0001 tekan D12 Ctrl). b Gambaran representatif dan kuantifikasi irisan jantung yang diwarnai dengan pewarna trikrom Masson (skala batang = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD, dan D12 MC), 9 (D12 MT) irisan/kelompok dari babi yang berbeda, dilakukan ANOVA satu arah; ####p < 0,0001 vs. D0 dan ***p < 0,001 atau ****p < 0,0001 vs. D12 Ctrl). b 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像和量化（比例尺= 500 µm）（n = 10（D0、D12 Ctrl、D12 TD和D12 MC），来自不同猪的9 个（D12 MT）切片/组，进行单因素方差分析；####p < 0.0001 与D0 相比,***p < 0.001,或****p < 0.0001 与D12 Ctrl 相比）。 b 用 Masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 和 量化 （比例 尺 尺 尺 = 500 µm） （n = 10 （d0 、 d12 ctrl 、 d12 td 和 d12 mc） 来自 不同 的 9 个 d12 mt 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 与D0相比,***p < 0.001,或***p < 0.0001 与D12 Ctrl 相比）。 b Menanyakan dan menangani masalah yang ada, окрашенных трихромом Массона (масштабная линейка = 500 mm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD dan D12 MC), 9 (D12 MT) срезов от разных свиней / группы, один- способ ANOVA; ####p < 0,0001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 atau ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). b Gambaran representatif dan kuantifikasi irisan jantung yang diwarnai dengan trikrom Masson (skala batang = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD, dan D12 MC), 9 (D12 MT) irisan dari babi yang berbeda/kelompok, satu metode ANOVA; ####p < 0,0001 dibandingkan dengan D0, ***p < 0,001 atau ****p < 0,0001 dibandingkan dengan D12 Ctrl).Batang kesalahan menunjukkan nilai rata-rata ± simpangan baku.
Akhirnya, kemampuan CTCM untuk meniru hipertrofi jantung dinilai dengan meningkatkan regangan jaringan jantung. Dalam CTCM, tekanan ruang udara puncak meningkat dari 80 mmHg menjadi 80 mmHg. Seni. (regangan normal) hingga 140 mmHg Seni. (Gbr. 6a). Ini sesuai dengan peningkatan regangan sebesar 32% (Gbr. 6b), yang sebelumnya ditunjukkan sebagai persentase regangan yang sesuai yang diperlukan untuk irisan jantung untuk mencapai panjang sarkomer yang mirip dengan yang terlihat pada hipertrofi. Peregangan dan kecepatan jaringan jantung selama kontraksi dan relaksasi tetap konstan selama enam hari kultur (Gbr. 6c). Jaringan jantung dari kondisi MT mengalami regangan normal (MT (Normal)) atau kondisi regangan berlebih (MT (OS)) selama enam hari. Setelah empat hari dalam kultur, biomarker hipertrofik NT-ProBNP meningkat secara signifikan dalam medium dalam kondisi MT (OS) dibandingkan dengan kondisi MT (normal) (Gbr. 7a). Selain itu, setelah enam hari kultur, ukuran sel di MT (OS) (Gbr. 7b) meningkat secara signifikan dibandingkan dengan bagian jantung MT (normal). Selain itu, translokasi nuklir NFATC4 meningkat secara signifikan pada jaringan yang terlalu meregang (Gbr. 7c). Hasil ini menunjukkan perkembangan progresif dari remodeling patologis setelah hiperdistensi dan mendukung konsep bahwa perangkat CTCM dapat digunakan sebagai platform untuk mempelajari sinyal hipertrofi jantung yang diinduksi peregangan.
Jejak representatif dari tekanan ruang udara, tekanan ruang cairan, dan pengukuran pergerakan jaringan mengonfirmasi bahwa tekanan ruang mengubah tekanan ruang cairan, yang menyebabkan pergerakan irisan jaringan yang sesuai. b Kurva persentase peregangan dan laju peregangan representatif untuk bagian jaringan yang diregangkan secara normal (oranye) dan yang diregangkan berlebihan (biru). c Grafik batang yang menunjukkan waktu siklus (n = 19 irisan per kelompok, dari babi yang berbeda), waktu kontraksi (n = 18-19 irisan per kelompok, dari babi yang berbeda), waktu relaksasi (n = 19 irisan per kelompok, dari babi yang berbeda), amplitudo pergerakan jaringan (n = 14 irisan/kelompok, dari babi yang berbeda), kecepatan sistolik puncak (n = 14 irisan/kelompok, dari babi yang berbeda) dan laju relaksasi puncak (n = 14 (D0), 15 (D6) ) bagian/kelompok) dari babi yang berbeda), uji-t Student dua sisi tidak menunjukkan perbedaan signifikan dalam parameter apa pun, yang menunjukkan bahwa parameter ini tetap konstan selama 6 hari kultur dengan tegangan lebih. Batang kesalahan mewakili mean ± simpangan baku.
Grafik batang kuantifikasi konsentrasi NT-ProBNP dalam media kultur dari irisan jantung yang dikultur dalam kondisi peregangan normal MT (Norm) atau peregangan berlebihan (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, dan D4 MTOS) irisan/kelompok dari babi yang berbeda, ANOVA dua arah dilakukan; **p < 0,01 dibandingkan dengan peregangan normal). Grafik batang kuantifikasi konsentrasi NT-ProBNP dalam media kultur dari irisan jantung yang dikultur dalam kondisi peregangan normal MT (Norm) atau peregangan berlebihan (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, dan D4 MTOS) irisan/kelompok dari babi yang berbeda, ANOVA dua arah dilakukan; **p < 0,01 dibandingkan dengan peregangan normal).Histogram kuantitatif konsentrasi NT-ProBNP dalam media kultur dari irisan jantung yang dikultur dalam kondisi regangan MT normal (norm) atau regangan berlebih (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, dan D4).MTOS) irisan / kelompok dari babi yang berbeda, analisis varians dua faktor dilakukan;**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p < 0,01 dibandingkan dengan peregangan normal). a 在MT 正常拉伸(Norm) 或过度拉伸(OS) 条件下培养的心脏切片培养基中NT-ProBNP浓度的条形图量化（n = 4 (D2 MTNorm)、3（D2 MTOS、D4 MTNorm 和D4 MTOS）来自不同猪的切片/组,进行双向方差分析；**与正常拉伸相比,p < 0,01). a Kuantifikasi konsentrasi NT-ProBNP pada irisan jantung yang dikultur pada kondisi MT normal stretch (Norm) atau overstretch (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm和D4 MTOS) dari 猪的切片/组，可以双向方方发发动; **dibandingkan dengan peregangan normal, p <0,01).histogram Kuantifikasi konsentrasi NT-ProBNP pada irisan jantung yang dikultur dalam kondisi peregangan MT normal (norm) atau peregangan berlebih (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm) dan D4 MTOS) irisan/kelompok dari babi yang berbeda, analisis varians dua arah;**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p < 0,01 dibandingkan dengan peregangan normal). b Gambaran representatif untuk irisan jantung yang diwarnai dengan troponin-T dan WGA (kiri) serta kuantifikasi ukuran sel (kanan) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) sel/kelompok dari 10 irisan berbeda dari babi yang berbeda, Uji-t Student dua sisi dilakukan; ****p < 0,0001 dibandingkan dengan regangan normal). b Gambaran representatif untuk irisan jantung yang diwarnai dengan troponin-T dan WGA (kiri) serta kuantifikasi ukuran sel (kanan) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) sel/kelompok dari 10 irisan berbeda dari babi yang berbeda, Uji-t Student dua sisi dilakukan; ****p < 0,0001 dibandingkan dengan regangan normal). b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слева) и количественного размера клеток (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) клеток/группу из 10 разных срезов от разных свиней, два- проводится хвостовой t-критерий Стьюдента;****p < 0,0001 по сравнению с нормальным растяжением). b Gambaran representatif irisan jantung yang diwarnai dengan troponin-T dan AZP (kiri) dan kuantifikasi ukuran sel (kanan) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) sel/kelompok dari 10 irisan berbeda dari babi yang berbeda, uji-t Student dua sisi dilakukan; ****p < 0,0001 dibandingkan dengan galur normal). b 用肌钙蛋白-T 和WGA（左）和细胞大小量化（右）染色的心脏切片的代表性图像（n = 330（D6 MTOS）,来自不同猪的10 个不同切片的369（D6 MTNorm）细胞/组，两进行有尾学生t 检验；与正常拉伸相比,****p < 0,0001）。 b Gambaran representatif irisan jantung yang diwarnai dengan kalkarein-T dan WGA (kiri) serta ukuran sel (kanan) (n = 330 (D6 MTOS), 369 dari 10 irisan berbeda (D6 MTNorm)) Sel/sel, uji t independen；dibandingkan dengan peregangan normal，****p < 0,0001). b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слева) и количественная оценка размера клеток (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) dan 10 poin atau 10 poin atau lebih, nilai kredit Стьюдента; ****p < 0,0001 по сравнению с нормальным (penerapan). b Gambaran representatif irisan jantung yang diwarnai dengan troponin-T dan AZP (kiri) dan kuantifikasi ukuran sel (kanan) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) dari 10 irisan berbeda dari babi yang berbeda) Sel/kelompok, kriteria dua sisi Student's t; ****p < 0,0001 dibandingkan dengan galur normal). c Gambaran representatif untuk irisan jantung MTOS hari ke-0 dan ke-6 yang diberi label imun untuk troponin-T dan NFATC4 dan kuantifikasi translokasi NFATC4 ke nukleus CM (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) irisan/kelompok dari babi yang berbeda, dilakukan uji-t Student dua sisi; *p < 0,05). c Gambaran representatif untuk irisan jantung MTOS hari ke-0 dan ke-6 yang diberi label imun untuk troponin-T dan NFATC4 dan kuantifikasi translokasi NFATC4 ke dalam nukleus CM (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) irisan/kelompok dari babi yang berbeda. Dilakukan uji-t Student dua sisi; *p < 0,05). c Pelatihan untuk 0 dan 6 hari MTOS, иммуномеченых для тропонина-Т и NFATC4, dan konektor lainnya NFATC4 dalam ядра кавернозных клеток (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срезов/группу от разных свиней , выполняется двусторонний t-критерий Стьюдента; c Gambaran representatif untuk irisan jantung pada MTOS hari ke-0 dan ke-6, yang diberi label imun untuk troponin-T dan NFATC4, dan kuantifikasi translokasi NFATC4 dalam nukleus sel kavernosa (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) irisan/kelompok dari babi yang berbeda) dilakukan uji-t Student dua sisi; *p < 0,05). c 用于肌钙蛋白-T 和NFATC4 免疫标记的第0 天和第6 天MTOS n = 4 (D0)、3 (D6 MTOS)切片/组, 进行双尾学生t 检验；*p < 0.05)。 c Gambar representatif dari imunolabeling calcanin-T dan NFATC4 第0天和第6天MTOS irisan jantung, dan NFATC4 dari inti sel NFATC4 易位至CM yang berbeda的kuantitas化 (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) 切礼/组,时间双尾学生et 电影；*p < 0,05). c Pengaturan MTOS pada 0 dan 6 hari setelah MTOS-Т dan NFATC4 dan количественная оценка транслокации NFATC4 dalam CM от разных свиней (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срез/группа, хвостатый t-критерий Стьюдента; *p < 0,05). c Gambaran representatif irisan jantung MTOS pada hari ke-0 dan ke-6 untuk imunolabeling troponin-T dan NFATC4 serta kuantifikasi translokasi NFATC4 di dalam nukleus CM dari berbagai babi (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) irisan/kelompok, kriteria-t dua sisi Student; *p < 0,05).Batang kesalahan menunjukkan rata-rata ± deviasi standar.
Penelitian kardiovaskular translasional memerlukan model seluler yang secara akurat mereproduksi lingkungan jantung. Dalam penelitian ini, perangkat CTCM dikembangkan dan dikarakterisasi yang dapat menstimulasi bagian jantung yang sangat tipis. Sistem CTCM mencakup stimulasi elektromekanis yang disinkronkan secara fisiologis dan pengayaan cairan T3 dan Dex. Ketika bagian jantung babi terpapar faktor-faktor ini, viabilitas, integritas struktural, aktivitas metabolik, dan ekspresi transkripsi tetap sama seperti pada jaringan jantung segar setelah 12 hari kultur. Selain itu, peregangan jaringan jantung yang berlebihan dapat menyebabkan hipertrofi jantung yang disebabkan oleh hiperekstensi. Secara keseluruhan, hasil ini mendukung peran penting kondisi kultur fisiologis dalam mempertahankan fenotipe jantung normal dan menyediakan platform untuk skrining obat.
Banyak faktor yang berkontribusi dalam menciptakan lingkungan yang optimal untuk fungsi dan kelangsungan hidup kardiomiosit. Faktor-faktor yang paling jelas terkait dengan (1) interaksi antarsel, (2) stimulasi elektromekanis, (3) faktor humoral, dan (4) substrat metabolik. Interaksi sel-ke-sel fisiologis memerlukan jaringan tiga dimensi yang kompleks dari berbagai jenis sel yang didukung oleh matriks ekstraseluler. Interaksi seluler yang kompleks tersebut sulit direkonstruksi secara in vitro melalui kultur bersama jenis sel individual, tetapi dapat dicapai dengan mudah menggunakan sifat organotipik dari potongan jantung.
Peregangan mekanis dan stimulasi listrik kardiomiosit sangat penting untuk mempertahankan fenotipe jantung33,34,35. Sementara stimulasi mekanis telah banyak digunakan untuk pengkondisian dan pematangan hiPSC-CM, beberapa penelitian elegan baru-baru ini mencoba stimulasi mekanis irisan jantung dalam kultur menggunakan pembebanan uniaxial. Penelitian ini menunjukkan bahwa pembebanan mekanis uniaxial 2D memiliki efek positif pada fenotipe jantung selama kultur. Dalam penelitian ini, bagian jantung dibebani dengan gaya tarik isometrik17, pembebanan auksotonik linear18, atau siklus jantung diciptakan kembali menggunakan umpan balik transduser gaya dan penggerak tegangan. Namun, metode ini menggunakan peregangan jaringan uniaxial tanpa pengoptimalan lingkungan, yang mengakibatkan penekanan banyak gen jantung atau ekspresi berlebihan gen yang terkait dengan respons peregangan abnormal. CTCM yang dijelaskan di sini memberikan stimulus elektromekanis 3D yang meniru siklus jantung alami dalam hal waktu siklus dan peregangan fisiologis (peregangan 25%, sistole 40%, diastole 60%, dan 72 denyut per menit). Meskipun stimulasi mekanis tiga dimensi ini saja tidak cukup untuk menjaga integritas jaringan, kombinasi stimulasi humoral dan mekanis menggunakan T3/Dex diperlukan untuk menjaga viabilitas, fungsi, dan integritas jaringan secara memadai.
Faktor humoral memainkan peran penting dalam memodulasi fenotipe jantung dewasa. Hal ini disorot dalam studi HiPS-CM di mana T3 dan Dex ditambahkan ke media kultur untuk mempercepat pematangan sel. T3 dapat memengaruhi pengangkutan asam amino, gula, dan kalsium melintasi membran sel36. Selain itu, T3 meningkatkan ekspresi MHC-α dan penurunan regulasi MHC-β, yang mendorong pembentukan miofibril kedutan cepat pada kardiomiosit dewasa dibandingkan dengan miofibril kedutan lambat pada CM janin. Defisiensi T3 pada pasien hipotiroid menyebabkan hilangnya pita miofibril dan penurunan laju perkembangan tonus37. Dex bekerja pada reseptor glukokortikoid dan telah terbukti meningkatkan kontraktilitas miokardium pada jantung yang perfusinya terisolasi;38 peningkatan ini diduga terkait dengan efek pada masukan yang didorong oleh endapan kalsium (SOCE)39,40. Selain itu, Dex mengikat reseptornya, yang menyebabkan respons intraseluler yang luas yang menekan fungsi imun dan peradangan30.
Hasil kami menunjukkan bahwa stimulasi mekanis fisik (MS) meningkatkan kinerja kultur secara keseluruhan dibandingkan dengan Ctrl, tetapi gagal mempertahankan viabilitas, integritas struktural, dan ekspresi jantung selama 12 hari dalam kultur. Dibandingkan dengan Ctrl, penambahan T3 dan Dex ke kultur CTCM (MT) meningkatkan viabilitas dan mempertahankan profil transkripsi, integritas struktural, dan aktivitas metabolik yang sama dengan jaringan jantung segar selama 12 hari. Selain itu, dengan mengendalikan tingkat peregangan jaringan, model hipertrofi jantung yang diinduksi hiperekstensi dibuat menggunakan STCM, yang menggambarkan fleksibilitas sistem STCM. Perlu dicatat bahwa meskipun remodeling dan fibrosis jantung biasanya melibatkan organ utuh yang sel-selnya yang bersirkulasi dapat menyediakan sitokin yang tepat serta fagositosis dan faktor remodeling lainnya, bagian-bagian jantung masih dapat meniru proses fibrotik sebagai respons terhadap stres dan trauma. menjadi miofibroblas. Ini telah dievaluasi sebelumnya dalam model irisan jantung ini. Perlu dicatat bahwa parameter CTCM dapat dimodulasi dengan mengubah tekanan/amplitudo dan frekuensi listrik untuk mensimulasikan banyak kondisi seperti takikardia, bradikardia, dan dukungan sirkulasi mekanis (jantung tanpa beban mekanis). Hal ini menjadikan sistem ini memiliki throughput sedang untuk pengujian obat. Kemampuan CTCM untuk memodelkan hipertrofi jantung yang disebabkan oleh kelelahan membuka jalan untuk menguji sistem ini untuk terapi yang dipersonalisasi. Sebagai kesimpulan, penelitian saat ini menunjukkan bahwa peregangan mekanis dan stimulasi humoral sangat penting untuk mempertahankan kultur potongan jaringan jantung.
Meskipun data yang disajikan di sini menunjukkan bahwa CTCM merupakan platform yang sangat menjanjikan untuk pemodelan miokardium utuh, metode kultur ini memiliki beberapa keterbatasan. Keterbatasan utama kultur CTCM adalah bahwa ia memaksakan tekanan mekanis dinamis yang berkelanjutan pada irisan, yang menghalangi kemampuan untuk secara aktif memantau kontraksi irisan jantung selama setiap siklus. Selain itu, karena ukuran irisan jantung yang kecil (7 mm), kemampuan untuk mengevaluasi fungsi sistolik di luar sistem kultur menggunakan sensor gaya tradisional terbatas. Dalam naskah saat ini, kami mengatasi sebagian keterbatasan ini dengan mengevaluasi tegangan optik sebagai indikator fungsi kontraktil. Namun, keterbatasan ini akan memerlukan pekerjaan lebih lanjut dan dapat diatasi di masa mendatang dengan memperkenalkan metode untuk pemantauan optik fungsi irisan jantung dalam kultur, seperti pemetaan optik menggunakan kalsium dan pewarna peka tegangan. Keterbatasan lain dari CTCM adalah bahwa model kerja tidak memanipulasi tekanan fisiologis (beban awal dan beban akhir). Dalam CTCM, tekanan diinduksi dalam arah yang berlawanan untuk menghasilkan regangan fisiologis 25% dalam diastol (regangan penuh) dan sistol (panjang kontraksi selama stimulasi listrik) dalam jaringan yang sangat besar. Keterbatasan ini harus dihilangkan dalam desain CTCM di masa mendatang melalui pemberian tekanan yang memadai pada jaringan jantung dari kedua sisi dan dengan menerapkan hubungan tekanan-volume yang tepat seperti yang terjadi di dalam bilik jantung.
Remodeling akibat peregangan berlebihan yang dilaporkan dalam manuskrip ini terbatas pada peniruan sinyal hiperregangan hipertrofik. Dengan demikian, model ini dapat membantu dalam studi sinyal hipertrofik akibat peregangan tanpa memerlukan faktor humoral atau neural (yang tidak ada dalam sistem ini). Studi lebih lanjut diperlukan untuk meningkatkan multiplisitas CTCM, misalnya, kultur bersama dengan sel imun, faktor humoral plasma yang bersirkulasi, dan persarafan saat kultur bersama dengan sel neuronal akan meningkatkan kemungkinan pemodelan penyakit dengan CTCM.
Tiga belas ekor babi digunakan dalam penelitian ini. Semua prosedur pada hewan dilakukan sesuai dengan pedoman institusional dan telah disetujui oleh Komite Perawatan dan Penggunaan Hewan Institusional Universitas Louisville. Lengkungan aorta dijepit dan jantung diperfusi dengan 1 L kardioplegia steril (110 mM NaCl, 1,2 mM CaCl2, 16 mM KCl, 16 mM MgCl2, 10 mM NaHCO3, 5 U/mL heparin, pH hingga 7,4); Jantung diawetkan dalam larutan kardioplegik dingin hingga diangkut ke laboratorium di atas es yang biasanya <10 menit. Jantung diawetkan dalam larutan kardioplegik dingin hingga diangkut ke laboratorium di atas es yang biasanya <10 menit. сердца хранили в ледяном кардиоплегическом растворе до транспортировки в лабораторию на льду, что обычно занимает <10 мин. Jantung disimpan dalam larutan kardioplegik dingin hingga diangkut ke laboratorium di atas es, yang biasanya memakan waktu <10 menit.)) Держите сердца в ледяной кардиоплегии до транспортировки в лабораторию на льду, обычно <10 мин. Simpan jantung di atas es kardioplegia sampai diangkut ke laboratorium di atas es, biasanya <10 menit.
Perangkat CTCM dikembangkan dalam perangkat lunak desain berbantuan komputer (CAD) SolidWorks. Ruang kultur, pembagi, dan ruang udara terbuat dari plastik akrilik bening CNC. Cincin penopang berdiameter 7 mm terbuat dari polietilena berdensitas tinggi (HDPE) di bagian tengah dan memiliki alur o-ring untuk menampung o-ring silikon yang digunakan untuk menyegel media di bawahnya. Membran silika tipis memisahkan ruang kultur dari pelat pemisah. Membran silikon dipotong laser dari lembaran silikon setebal 0,02″ dan memiliki kekerasan 35A. Gasket silikon bagian bawah dan atas dipotong laser dari lembaran silikon setebal 1/16″ dan memiliki kekerasan 50A. Sekrup baja tahan karat 316L dan mur sayap digunakan untuk mengencangkan blok dan menciptakan segel kedap udara.
Papan sirkuit cetak (PCB) khusus dirancang untuk diintegrasikan dengan sistem C-PACE-EM. Soket konektor mesin Swiss pada PCB dihubungkan ke elektroda grafit dengan kabel tembaga berlapis perak dan sekrup perunggu 0-60 yang disekrup ke elektroda. Papan sirkuit cetak ditempatkan di penutup printer 3D.
Alat CTCM dikendalikan oleh aktuator pneumatik terprogram (PPD) yang menciptakan tekanan sirkulasi terkontrol yang mirip dengan siklus jantung. Saat tekanan di dalam ruang udara meningkat, membran silikon fleksibel mengembang ke atas, memaksa media berada di bawah lokasi jaringan. Area jaringan kemudian akan diregangkan oleh pengeluaran cairan ini, meniru ekspansi fisiologis jantung selama diastol. Pada puncak relaksasi, stimulasi listrik diterapkan melalui elektroda grafit, yang mengurangi tekanan di ruang udara dan menyebabkan kontraksi bagian jaringan. Di dalam pipa terdapat katup hemostatik dengan sensor tekanan untuk mendeteksi tekanan dalam sistem udara. Tekanan yang dideteksi oleh sensor tekanan diterapkan ke pengumpul data yang terhubung ke laptop. Ini memungkinkan pemantauan tekanan di dalam ruang gas secara terus-menerus. Ketika tekanan ruang maksimum tercapai (standar 80 mmHg, OS 140 mmHg), perangkat akuisisi data diperintahkan untuk mengirim sinyal ke sistem C-PACE-EM untuk menghasilkan sinyal tegangan bifasik selama 2 ms, ditetapkan ke 4 V.
Potongan jantung diperoleh dan kondisi kultur dalam 6 sumur dilakukan sebagai berikut: Pindahkan jantung yang dipanen dari bejana transfer ke baki yang berisi kardioplegia dingin (4° C). Ventrikel kiri diisolasi dengan pisau steril dan dipotong menjadi potongan-potongan berukuran 1-2 cm3. Blok jaringan ini ditempelkan pada penyangga jaringan dengan perekat jaringan dan ditempatkan dalam bak jaringan mikrotom bergetar yang berisi larutan Tyrode dan terus-menerus dioksigenasi (3 g/L 2,3-butanedione monooxime (BDM), 140 mM NaCl (8,18 g). ), 6 mM KCl (0,447 g), 10 mM D-glukosa (1,86 g), 10 mM HEPES (2,38 g), 1 mM MgCl2 (1 ml larutan 1 M), 1,8 mM CaCl2 (1,8 ml larutan 1 M), hingga 1 L ddH2O). Mikrotom yang bergetar diatur untuk memotong irisan setebal 300 µm pada frekuensi 80 Hz, amplitudo getaran horizontal 2 mm, dan laju gerak 0,03 mm/s. Bak jaringan dikelilingi oleh es untuk menjaga larutan tetap dingin dan suhu dipertahankan pada 4°C. Pindahkan irisan jaringan dari bak mikrotom ke bak inkubasi yang berisi larutan Tyrode yang diberi oksigen terus-menerus di atas es hingga diperoleh irisan yang cukup untuk satu pelat kultur. Untuk kultur transwell, irisan jaringan ditempelkan pada penyangga poliuretan steril selebar 6 mm dan ditempatkan dalam 6 ml media yang dioptimalkan (media 199, suplemen ITS 1x, FBS 10%, VEGF 5 ng/ml, FGF-alkali 10 ng/ml, dan antibiotik-antijamur 2X). Stimulasi listrik (10 V, frekuensi 1,2 Hz) diterapkan pada irisan jaringan melalui C-Pace. Untuk kondisi TD, T3 dan Dex segar ditambahkan pada 100 nM dan 1 μM pada setiap penggantian medium. Medium dijenuhkan dengan oksigen sebelum penggantian sebanyak 3 kali sehari. Potongan jaringan dikultur dalam inkubator pada suhu 37°C dan 5% CO2.
Untuk kultur CTCM, potongan jaringan ditempatkan pada printer 3D yang dibuat khusus dalam cawan Petri yang berisi larutan Tyrode yang dimodifikasi. Perangkat ini dirancang untuk meningkatkan ukuran irisan jantung hingga 25% dari luas cincin penyangga. Hal ini dilakukan agar potongan jantung tidak meregang setelah dipindahkan dari larutan Tyrode ke medium dan selama diastol. Menggunakan lem histoakrilik, potongan setebal 300 µm dipasang pada cincin penyangga berdiameter 7 mm. Setelah menempelkan potongan jaringan ke cincin penyangga, potong potongan jaringan yang berlebih dan letakkan kembali potongan jaringan yang menempel ke dalam bak larutan Tyrode di atas es (4°C) hingga cukup banyak potongan yang disiapkan untuk satu perangkat. Total waktu pemrosesan untuk semua perangkat tidak boleh lebih dari 2 jam. Setelah 6 potongan jaringan ditempelkan ke cincin penyangganya, perangkat CTCM dirakit. Ruang kultur CTCM diisi terlebih dahulu dengan 21 ml medium pra-oksigenasi. Pindahkan potongan jaringan ke dalam ruang kultur dan singkirkan gelembung udara dengan hati-hati menggunakan pipet. Potongan jaringan kemudian diarahkan ke dalam lubang dan ditekan dengan lembut ke tempatnya. Terakhir, pasang tutup elektroda pada perangkat dan pindahkan perangkat ke inkubator. Kemudian hubungkan CTCM ke tabung udara dan sistem C-PACE-EM. Aktuator pneumatik terbuka dan katup udara membuka CTCM. Sistem C-PACE-EM dikonfigurasi untuk mengalirkan 4 V pada 1,2 Hz selama pengaturan kecepatan bifasik selama 2 ms. Media diganti dua kali sehari dan elektroda diganti sekali sehari untuk menghindari akumulasi grafit pada elektroda. Jika perlu, potongan jaringan dapat dikeluarkan dari sumur kultur untuk mengeluarkan gelembung udara yang mungkin jatuh di bawahnya. Untuk kondisi perawatan MT, T3/Dex ditambahkan segar dengan setiap penggantian media dengan 100 nM T3 dan 1 μM Dex. Perangkat CTCM dikultur dalam inkubator pada suhu 37°C dan 5% CO2.
Untuk memperoleh lintasan irisan jantung yang terentang, sistem kamera khusus dikembangkan. Kamera SLR (Canon Rebel T7i, Canon, Tokyo, Jepang) digunakan dengan lensa makro Navitar Zoom 7000 18-108mm (Navitar, San Francisco, CA). Visualisasi dilakukan pada suhu ruangan setelah mengganti media dengan media baru. Kamera diposisikan pada sudut 51° dan video direkam pada 30 bingkai per detik. Pertama, perangkat lunak sumber terbuka (MUSCLEMOTION43) digunakan dengan Image-J untuk mengukur gerakan irisan jantung. Masker dibuat menggunakan MATLAB (MathWorks, Natick, MA, AS) untuk menentukan wilayah yang diinginkan untuk detak irisan jantung guna menghindari noise. Masker yang tersegmentasi secara manual diterapkan ke semua gambar dalam urutan bingkai dan kemudian diteruskan ke plug-in MUSCLEMOTION. Muscle Motion menggunakan intensitas rata-rata piksel di setiap bingkai untuk mengukur gerakannya relatif terhadap bingkai referensi. Data direkam, difilter, dan digunakan untuk mengukur waktu siklus dan menilai peregangan jaringan selama siklus jantung. Video yang direkam diproses pasca menggunakan filter digital fase nol orde pertama. Untuk mengukur peregangan jaringan (puncak ke puncak), analisis puncak ke puncak dilakukan untuk membedakan antara puncak dan palung dalam sinyal yang direkam. Selain itu, detrending dilakukan menggunakan polinomial orde ke-6 untuk menghilangkan pergeseran sinyal. Kode program dikembangkan dalam MATLAB untuk menentukan gerakan jaringan global, waktu siklus, waktu relaksasi, dan waktu kontraksi (Kode Program Tambahan 44).
Untuk analisis regangan, menggunakan video yang sama yang dibuat untuk penilaian regangan mekanis, pertama-tama kami menelusuri dua gambar yang mewakili puncak gerakan (titik gerakan tertinggi (atas) dan terendah (bawah)) menurut perangkat lunak MUSCLEMOTION. Kami kemudian melakukan segmentasi pada daerah jaringan dan menerapkan bentuk algoritma bayangan pada jaringan yang disegmentasi (Gambar Tambahan 2a). Jaringan yang disegmentasi kemudian dibagi menjadi sepuluh subpermukaan, dan tekanan pada setiap permukaan dihitung menggunakan persamaan berikut: Regangan = (Sup-Sdown)/Sdown, di mana Sup dan Sdown adalah jarak bentuk dari bayangan atas dan bawah kain, masing-masing (Gambar Tambahan .2b).
Potongan jantung difiksasi dalam 4% paraformaldehida selama 48 jam. Jaringan yang difiksasi didehidrasi dalam 10% dan 20% sukrosa selama 1 jam, kemudian dalam 30% sukrosa semalaman. Potongan tersebut kemudian ditanam dalam senyawa suhu pemotongan optimum (senyawa OCT) dan dibekukan secara bertahap dalam bak isopentana/es kering. Simpan blok penanaman OCT pada suhu -80 °C hingga pemisahan. Kaca objek disiapkan sebagai potongan dengan ketebalan 8 μm.
Untuk menghilangkan OCT dari irisan jantung, panaskan slide pada blok pemanas pada suhu 95 °C selama 5 menit. Tambahkan 1 ml PBS ke setiap slide dan inkubasi selama 30 menit pada suhu ruangan, lalu rendam irisan tersebut dengan 0,1% Triton-X dalam PBS selama 15 menit pada suhu ruangan. Untuk mencegah antibodi non-spesifik mengikat sampel, tambahkan 1 ml larutan BSA 3% ke slide dan inkubasi selama 1 jam pada suhu ruangan. BSA kemudian dihilangkan dan slide dicuci dengan PBS. Tandai setiap sampel dengan pensil. Antibodi primer (diencerkan 1:200 dalam 1% BSA) (connexin 43 (Abcam; #AB11370), NFATC4 (Abcam; #AB99431) dan troponin-T (Thermo Scientific; #MA5-12960) ditambahkan selama 90 menit, kemudian antibodi sekunder (diencerkan 1:200 dalam 1% BSA) terhadap mouse Alexa Fluor 488 (Thermo Scientific; #A16079), terhadap kelinci Alexa Fluor 594 (Thermo Scientific; #T6391) selama 90 menit tambahan. Dicuci 3 kali dengan PBS Untuk membedakan pewarnaan target dari latar belakang, kami hanya menggunakan antibodi sekunder sebagai kontrol. Akhirnya, pewarna nuklir DAPI ditambahkan dan slide ditempatkan dalam vectashield (Vector Laboratories) dan disegel dengan cat kuku. Pembesaran -x) dan mikroskop Keyence dengan pembesaran 40x.
WGA-Alexa Fluor 555 (Thermo Scientific; #W32464) pada 5 μg/ml dalam PBS digunakan untuk pewarnaan WGA dan diaplikasikan pada irisan tetap selama 30 menit pada suhu ruangan. Kemudian, slide dicuci dengan PBS dan Sudan black ditambahkan ke setiap slide dan diinkubasi selama 30 menit. Kemudian, slide dicuci dengan PBS dan ditambahkan media penyisipan vectashield. Slide divisualisasikan pada mikroskop Keyence pada perbesaran 40x.
OCT dikeluarkan dari sampel seperti dijelaskan di atas. Setelah mengeluarkan OCT, rendam slide dalam larutan Bouin semalaman. Slide kemudian dibilas dengan air suling selama 1 jam dan kemudian ditempatkan dalam larutan Bibrich aloe acid fuchsin selama 10 menit. Kemudian slide dicuci dengan air suling dan ditempatkan dalam larutan 5% phosphomolybdenum/5% phosphotungstic acid selama 10 menit. Tanpa membilas, pindahkan slide langsung ke dalam larutan aniline blue selama 15 menit. Kemudian slide dicuci dengan air suling dan ditempatkan dalam larutan asam asetat 1% selama 2 menit. Slide dikeringkan dalam etanol 200 N dan dipindahkan ke xylene. Slide yang diwarnai divisualisasikan menggunakan mikroskop Keyence dengan tujuan 10x. Persentase area fibrosis dihitung menggunakan perangkat lunak Keyence Analyzer.
CyQUANT™ MTT Cell Viability Assay (Invitrogen, Carlsbad, CA), nomor katalog V13154, sesuai dengan protokol pabrik dengan beberapa modifikasi. Secara khusus, tusuk bedah dengan diameter 6 mm digunakan untuk memastikan ukuran jaringan yang seragam selama analisis MTT. Jaringan ditanam satu per satu ke dalam sumur pelat 12 sumur yang berisi substrat MTT sesuai dengan protokol pabrik. Irisan tersebut diinkubasi pada suhu 37°C selama 3 jam dan jaringan hidup memetabolisme substrat MTT untuk membentuk senyawa formazan ungu. Ganti larutan MTT dengan 1 ml DMSO dan inkubasi pada suhu 37 °C selama 15 menit untuk mengekstrak formazan ungu dari irisan jantung. Sampel diencerkan 1:10 dalam DMSO dalam pelat dasar bening 96 sumur dan intensitas warna ungu diukur pada 570 nm menggunakan pembaca pelat Cytation (BioTek). Hasil pembacaan dinormalisasi dengan berat setiap irisan jantung.
Media irisan jantung diganti dengan media yang mengandung 1 μCi/ml [5-3H]-glukosa (Moravek Biochemicals, Brea, CA, AS) untuk uji penggunaan glukosa seperti yang dijelaskan sebelumnya. Setelah 4 jam inkubasi, tambahkan 100 µl media ke tabung mikrosentrifus terbuka yang berisi 100 µl HCl 0,2 N. Kemudian tabung tersebut ditempatkan dalam tabung sintilasi yang berisi 500 μl dH2O untuk menguapkan [3H]2O selama 72 jam pada suhu 37°C. Kemudian keluarkan tabung mikrosentrifus dari tabung sintilasi dan tambahkan 10 ml cairan sintilasi. Penghitungan sintilasi dilakukan menggunakan penganalisa sintilasi cair Tri-Carb 2900TR (Packard Bioscience Company, Meriden, CT, AS). Pemanfaatan glukosa kemudian dihitung dengan mempertimbangkan aktivitas spesifik glukosa [5-3H], keseimbangan dan latar belakang yang tidak lengkap, pengenceran [5-3H] menjadi glukosa yang tidak berlabel, dan efisiensi penghitung sintilasi. Data dinormalisasi ke massa bagian jantung.
Setelah homogenisasi jaringan dalam Trizol, RNA diisolasi dari irisan jantung menggunakan Qiagen miRNeasy Micro Kit #210874 sesuai dengan protokol pabrik pembuatnya. Persiapan pustaka RNAsec, pengurutan, dan analisis data dilakukan sebagai berikut:
1 μg RNA per sampel digunakan sebagai bahan awal untuk persiapan pustaka RNA. Pustaka sekuensing dibuat menggunakan NEBNext UltraTM RNA Library Preparation Kit untuk Illumina (NEB, AS) mengikuti rekomendasi produsen, dan kode indeks ditambahkan ke urutan atribut untuk setiap sampel. Secara singkat, mRNA dimurnikan dari total RNA menggunakan manik-manik magnetik yang diikat dengan oligonukleotida poli-T. Fragmentasi dilakukan menggunakan kation divalen pada suhu tinggi dalam NEBNext First Strand Synthesis Reaction Buffer (5X). cDNA untai pertama disintesis menggunakan primer heksamer acak dan transkriptase balik M-MuLV (RNase H-). cDNA untai kedua kemudian disintesis menggunakan DNA polimerase I dan RNase H. Sisa overhang diubah menjadi ujung tumpul oleh aktivitas eksonuklease/polimerase. Setelah adenilasi ujung 3′ fragmen DNA, Adaptor NEBNext dengan struktur loop jepit rambut dipasang padanya untuk mempersiapkannya untuk hibridisasi. Untuk pemilihan fragmen cDNA dengan panjang yang disukai 150-200 bp, fragmen pustaka dimurnikan menggunakan sistem AMPure XP (Beckman Coulter, Beverly, AS). Kemudian, 3 μl USER Enzyme (NEB, AS) dengan cDNA yang dipilih ukurannya diligasikan dengan adaptor digunakan selama 15 menit pada suhu 37°C dan kemudian selama 5 menit pada suhu 95°C sebelum PCR. PCR kemudian dilakukan menggunakan DNA polimerase Phusion High-Fidelity, primer PCR universal, dan primer Index (X). Akhirnya, produk PCR dimurnikan (sistem AMPure XP) dan kualitas pustaka dinilai pada sistem Agilent Bioanalyzer 2100. Pustaka cDNA kemudian diurutkan menggunakan sequencer Novaseq. File gambar mentah dari Illumina diubah menjadi bacaan mentah menggunakan CASAVA Base Calling. Data mentah disimpan dalam file format FASTQ(fq) yang berisi urutan bacaan dan kualitas basa yang sesuai. Pilih HISAT2 untuk mencocokkan pembacaan sekuensing yang difilter dengan genom referensi Sscrofa11.1. Secara umum, HISAT2 mendukung genom dengan ukuran apa pun, termasuk genom yang lebih besar dari 4 miliar basa, dan nilai default ditetapkan untuk sebagian besar parameter. Pembacaan penyambungan dari data RNA Seq dapat diselaraskan secara efisien menggunakan HISAT2, sistem tercepat yang tersedia saat ini, dengan akurasi yang sama atau lebih baik daripada metode lainnya.
Kelimpahan transkrip secara langsung mencerminkan tingkat ekspresi gen. Tingkat ekspresi gen dinilai berdasarkan kelimpahan transkrip (jumlah sekuensing) yang terkait dengan genom atau ekson. Jumlah pembacaan sebanding dengan tingkat ekspresi gen, panjang gen, dan kedalaman sekuensing. FPKM (fragmen per seribu pasangan basa transkrip yang diurutkan per juta pasangan basa) dihitung dan nilai-P ekspresi diferensial ditentukan menggunakan paket DESeq2. Kami kemudian menghitung tingkat penemuan palsu (FDR) untuk setiap nilai P menggunakan metode Benjamini-Hochberg9 berdasarkan fungsi R bawaan “p.adjust”.
RNA yang diisolasi dari irisan jantung diubah menjadi cDNA pada konsentrasi 200 ng/μl menggunakan campuran SuperScript IV Vilo Master dari Thermo (Thermo, nomor kat. 11756050). RT-PCR kuantitatif dilakukan menggunakan pelat reaksi transparan Applied Biosystems Endura Plate Microamp 384-well (Thermo, nomor kat. 4483319) dan perekat optik microamp (Thermo, nomor kat. 4311971). Campuran reaksi terdiri dari campuran Taqman Fast Advanced Master 5 µl (Thermo, nomor kat. 4444557), Taqman Primer 0,5 µl, dan H2O 3,5 µl yang dicampur per well. Siklus qPCR standar dijalankan dan nilai CT diukur menggunakan instrumen PCR real-time Applied Biosystems Quantstudio 5 (modul 384-well; nomor produk A28135). Primer Taqman dibeli dari Thermo (GAPDH (Ss03375629_u1), PARP12 (Ss06908795_m1), PKDCC (Ss06903874_m1), CYGB (Ss06900188_m1), RGL1 (Ss06868890_m1), ACTN1 (Ss01009508_mH), GATA4 (Ss03383805_u1), GJA1 (Ss03374839_u1), COL1A2 (Ss03375009_u1), COL3A1 (Ss04323794_m1), ACTA2 (Ss04245588_m1) Nilai CT dari semua sampel dinormalisasi ke gen housekeeping GAPDH.
Pelepasan media NT-ProBNP dinilai menggunakan kit NT-ProBNP (babi) (Nomor Katalog MBS2086979, MyBioSource) sesuai dengan protokol pabrik pembuat. Secara singkat, 250 µl dari setiap sampel dan standar ditambahkan secara duplo ke setiap sumur. Segera setelah menambahkan sampel, tambahkan 50 µl Reagen Uji A ke setiap sumur. Kocok pelat dengan lembut dan tutup dengan sealant. Kemudian tablet diinkubasi pada suhu 37°C selama 1 jam. Kemudian aspirasikan larutan dan cuci sumur 4 kali dengan 350 µl larutan pencuci 1X, inkubasi larutan pencuci selama 1-2 menit setiap kali. Kemudian tambahkan 100 µl Reagen Uji B per sumur dan tutup dengan sealant pelat. Tablet dikocok dengan lembut dan diinkubasi pada suhu 37°C selama 30 menit. Aspirasikan larutan dan cuci sumur sebanyak 5 kali dengan 350 µl larutan pencuci 1X. Tambahkan 90 µl larutan substrat ke setiap sumur dan tutup pelat. Inkubasi pelat pada suhu 37°C selama 10-20 menit. Tambahkan 50 µl Stop Solution ke setiap sumur. Pelat segera diukur menggunakan pembaca pelat Cytation (BioTek) yang diatur pada 450 nm.
Analisis daya dilakukan untuk memilih ukuran kelompok yang akan memberikan daya >80% untuk mendeteksi perubahan absolut sebesar 10% dalam parameter dengan tingkat kesalahan Tipe I sebesar 5%. Analisis daya dilakukan untuk memilih ukuran kelompok yang akan memberikan daya >80% untuk mendeteksi perubahan absolut 10% dalam parameter dengan tingkat kesalahan Tipe I 5%. Анализ мощности выполнен для выбора размеров групп, которые обеспечат >80% moщности для pembayaran 10% pembayaran параметра с 5% частотой ошибок типа I. Analisis daya dilakukan untuk memilih ukuran kelompok yang akan memberikan daya >80% untuk mendeteksi 10% perubahan parameter absolut dengan tingkat kesalahan Tipe I 5%.进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％I型错误率的组大小。进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％I型错误率的组大小。 Jika Anda menghitung jumlah tagihan yang harus dibayar, tingkat bunga > 80% dapat dihitung. pembayaran 10% pembayaran параметров dan 5% частоты ошибоктипа I. Analisis daya dilakukan untuk memilih ukuran kelompok yang akan menyediakan daya >80% untuk mendeteksi 10% perubahan parameter absolut dan tingkat kesalahan tipe I 5%.Potongan jaringan dipilih secara acak sebelum percobaan. Semua analisis dilakukan tanpa memperhatikan kondisi dan sampel didekodekan hanya setelah semua data dianalisis. Perangkat lunak GraphPad Prism (San Diego, CA) digunakan untuk melakukan semua analisis statistik. Untuk semua statistik, nilai-p dianggap signifikan pada nilai <0,05. Untuk semua statistik, nilai-p dianggap signifikan pada nilai <0,05. Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. Untuk semua statistik, nilai-p dianggap signifikan pada nilai <0,05.对于所有统计数据,p 值在值<0.05 时被认为是显着的。对于所有统计数据,p 值在值<0.05 时被认为是显着的。 Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. Untuk semua statistik, nilai-p dianggap signifikan pada nilai <0,05.Uji t Student dua sisi dilakukan pada data dengan hanya 2 perbandingan. ANOVA satu arah atau dua arah digunakan untuk menentukan signifikansi antara beberapa kelompok. Saat melakukan uji post hoc, koreksi Tukey diterapkan untuk memperhitungkan beberapa perbandingan. Data RNAsec memiliki pertimbangan statistik khusus saat menghitung FDR dan p.adjust seperti yang dijelaskan di bagian Metode.
Untuk informasi lebih lanjut tentang desain penelitian, lihat abstrak Laporan Penelitian Nature yang ditautkan ke artikel ini.