Terima kasih telah mengunjungi Nature.com. Versi peramban yang Anda gunakan memiliki dukungan CSS yang terbatas. Untuk pengalaman terbaik, kami sarankan Anda menggunakan peramban yang lebih baru (atau menonaktifkan Mode Kompatibilitas di Internet Explorer). Sementara itu, untuk memastikan dukungan berkelanjutan, kami akan menampilkan situs tanpa gaya dan JavaScript.
Diperlukan sistem in vitro yang andal yang dapat mereproduksi lingkungan fisiologis jantung secara akurat untuk pengujian obat. Ketersediaan sistem kultur jaringan jantung manusia yang terbatas telah menyebabkan interpretasi yang tidak akurat tentang efek obat pada jantung. Di sini, kami telah mengembangkan model kultur jaringan jantung (CTCM) yang secara elektromekanis menstimulasi irisan jantung dan mengalami peregangan fisiologis selama fase sistolik dan diastolik siklus jantung. Setelah 12 hari kultur, pendekatan ini sebagian meningkatkan viabilitas irisan jantung, tetapi tidak sepenuhnya mempertahankan integritas strukturalnya. Oleh karena itu, setelah penyaringan molekul kecil, kami menemukan bahwa penambahan 100 nM triiodothyronine (T3) dan 1 μM deksametason (Dex) ke media kami mempertahankan mikrostruktur irisan selama 12 hari. Dalam kombinasi dengan pengobatan T3/Dex, sistem CTCM mempertahankan profil transkripsi, viabilitas, aktivitas metabolik, dan integritas struktural pada tingkat yang sama dengan jaringan jantung segar selama 12 hari. Selain itu, peregangan berlebihan jaringan jantung dalam kultur menginduksi sinyal hipertrofi jantung, memberikan bukti kemampuan CTCM untuk meniru kondisi hipertrofi yang diinduksi oleh peregangan jantung. Kesimpulannya, CTCM dapat memodelkan fisiologi dan patofisiologi jantung dalam kultur dalam jangka waktu yang lama, sehingga memungkinkan skrining obat yang andal.
Sebelum penelitian klinis, diperlukan sistem in vitro yang andal yang dapat mereproduksi lingkungan fisiologis jantung manusia secara akurat. Sistem tersebut harus meniru perubahan peregangan mekanis, detak jantung, dan sifat elektrofisiologis. Model hewan umumnya digunakan sebagai platform penyaringan untuk fisiologi jantung dengan keandalan terbatas dalam mencerminkan efek obat pada jantung manusia1,2. Pada akhirnya, Model Eksperimental Kultur Jaringan Jantung Ideal (CTCM) adalah model yang sangat sensitif dan spesifik untuk berbagai intervensi terapeutik dan farmakologis, yang secara akurat mereproduksi fisiologi dan patofisiologi jantung manusia3. Ketiadaan sistem seperti itu membatasi penemuan pengobatan baru untuk gagal jantung4,5 dan telah menyebabkan kardiotoksisitas obat sebagai alasan utama untuk keluar dari pasar6.
Selama dekade terakhir, delapan obat non-kardiovaskular telah ditarik dari penggunaan klinis karena menyebabkan perpanjangan interval QT yang mengakibatkan aritmia ventrikel dan kematian mendadak7. Dengan demikian, terdapat peningkatan kebutuhan akan strategi skrining praklinis yang andal untuk menilai efikasi dan toksisitas kardiovaskular. Penggunaan kardiomiosit yang berasal dari sel induk pluripoten terinduksi manusia (hiPS-CM) baru-baru ini dalam skrining obat dan pengujian toksisitas memberikan solusi parsial untuk masalah ini. Namun, sifat hiPS-CM yang belum matang dan kurangnya kompleksitas multiseluler jaringan jantung merupakan keterbatasan utama dari metode ini. Studi terbaru menunjukkan bahwa keterbatasan ini dapat sebagian diatasi dengan menggunakan hiPS-CM awal untuk membentuk hidrogel jaringan jantung segera setelah dimulainya kontraksi spontan dan secara bertahap meningkatkan stimulasi listrik dari waktu ke waktu. Namun, mikrotisu hiPS-CM ini kekurangan sifat elektrofisiologis dan kontraktil yang matang dari miokardium dewasa. Selain itu, jaringan jantung manusia memiliki struktur yang lebih kompleks, terdiri dari campuran heterogen berbagai jenis sel, termasuk sel endotel, neuron, dan fibroblas stroma, yang dihubungkan oleh serangkaian protein matriks ekstraseluler tertentu. Heterogenitas populasi non-kardiomiosit11,12,13 di jantung mamalia dewasa merupakan hambatan utama untuk memodelkan jaringan jantung menggunakan jenis sel individual. Keterbatasan utama ini menekankan pentingnya mengembangkan metode untuk mengkultur jaringan miokard utuh dalam kondisi fisiologis dan patologis.
Sayatan tipis (300 µm) jantung manusia yang dikultur telah terbukti menjadi model miokardium manusia utuh yang menjanjikan. Metode ini memberikan akses ke sistem multiseluler 3D lengkap yang mirip dengan jaringan jantung manusia. Namun, hingga tahun 2019, penggunaan sayatan jantung yang dikultur terbatas karena masa hidup kultur yang singkat (24 jam). Hal ini disebabkan oleh sejumlah faktor termasuk kurangnya peregangan fisik-mekanis, antarmuka udara-cair, dan penggunaan media sederhana yang tidak mendukung kebutuhan jaringan jantung. Pada tahun 2019, beberapa kelompok penelitian menunjukkan bahwa penggabungan faktor mekanis ke dalam sistem kultur jaringan jantung dapat memperpanjang masa hidup kultur, meningkatkan ekspresi jantung, dan meniru patologi jantung. Dua studi elegan 17 dan 18 menunjukkan bahwa pembebanan mekanis uniaksial memiliki efek positif pada fenotipe jantung selama kultur. Namun, studi-studi ini tidak menggunakan pembebanan fisik-mekanis tiga dimensi dinamis dari siklus jantung, karena sayatan jantung dibebani dengan gaya tarik isometrik 17 atau pembebanan auksotonik linier 18. Metode peregangan jaringan ini mengakibatkan penekanan banyak gen jantung atau ekspresi berlebihan gen yang terkait dengan respons peregangan abnormal. Khususnya, Pitoulis dkk. 19 mengembangkan bak kultur irisan jantung dinamis untuk rekonstruksi siklus jantung menggunakan umpan balik transduser gaya dan penggerak tegangan. Meskipun sistem ini memungkinkan pemodelan siklus jantung in vitro yang lebih akurat, kompleksitas dan throughput yang rendah dari metode ini membatasi penerapan sistem ini. Laboratorium kami baru-baru ini mengembangkan sistem kultur yang disederhanakan menggunakan stimulasi listrik dan media yang dioptimalkan untuk mempertahankan viabilitas potongan jaringan jantung babi dan manusia hingga 6 hari20,21.
Dalam manuskrip ini, kami menjelaskan model kultur jaringan jantung (CTCM) menggunakan potongan jantung babi yang menggabungkan isyarat humoral untuk merekapitulasi fisiologi jantung tiga dimensi dan distensi patofisiologis selama siklus jantung. CTCM ini dapat meningkatkan akurasi prediksi obat praklinis ke tingkat yang belum pernah dicapai sebelumnya dengan menyediakan sistem jantung berkapasitas sedang yang hemat biaya dan meniru fisiologi/patofisiologi jantung mamalia untuk pengujian obat praklinis.
Sinyal mekanik hemodinamik memainkan peran penting dalam menjaga fungsi kardiomiosit secara in vitro 22,23,24. Dalam manuskrip ini, kami telah mengembangkan CTCM (Gambar 1a) yang dapat meniru lingkungan jantung dewasa dengan menginduksi stimulasi listrik dan mekanik pada frekuensi fisiologis (1,2 Hz, 72 denyut per menit). Untuk menghindari peregangan jaringan yang berlebihan selama diastol, perangkat pencetak 3D digunakan untuk meningkatkan ukuran jaringan sebesar 25% (Gambar 1b). Pacing listrik yang diinduksi oleh sistem C-PACE diatur waktunya untuk dimulai 100 ms sebelum sistol menggunakan sistem akuisisi data untuk mereproduksi siklus jantung sepenuhnya. Sistem kultur jaringan menggunakan aktuator pneumatik yang dapat diprogram (LB Engineering, Jerman) untuk secara siklik memperluas membran silikon fleksibel untuk menyebabkan perluasan irisan jantung di ruang atas. Sistem ini dihubungkan ke saluran udara eksternal melalui transduser tekanan, yang memungkinkan untuk menyesuaikan tekanan (± 1 mmHg) dan waktu (± 1 ms) secara akurat (Gambar 1c).
a. Tempelkan potongan jaringan ke cincin penyangga 7 mm, yang ditunjukkan dengan warna biru, di dalam ruang kultur perangkat. Ruang kultur dipisahkan dari ruang udara oleh membran silikon tipis yang fleksibel. Pasang gasket di antara setiap ruang untuk mencegah kebocoran. Tutup perangkat berisi elektroda grafit yang memberikan stimulasi listrik. b. Representasi skematis dari perangkat jaringan besar, cincin pemandu, dan cincin penyangga. Potongan jaringan (coklat) ditempatkan pada perangkat berukuran besar dengan cincin pemandu ditempatkan di alur pada tepi luar perangkat. Dengan menggunakan pemandu, letakkan cincin penyangga yang dilapisi perekat akrilik jaringan dengan hati-hati di atas potongan jaringan jantung. c. Grafik yang menunjukkan waktu stimulasi listrik sebagai fungsi tekanan ruang udara yang dikendalikan oleh aktuator pneumatik terprogram (PPD). Perangkat akuisisi data digunakan untuk menyinkronkan stimulasi listrik menggunakan sensor tekanan. Ketika tekanan di ruang kultur mencapai ambang batas yang ditetapkan, sinyal pulsa dikirim ke C-PACE-EM untuk memicu stimulasi listrik. d. Gambar empat CTCM yang ditempatkan di rak inkubator. Empat perangkat dihubungkan ke satu PPD melalui sirkuit pneumatik, dan sensor tekanan dimasukkan ke dalam katup hemostatik untuk memantau tekanan dalam sirkuit pneumatik. Setiap perangkat berisi enam bagian jaringan.
Dengan menggunakan aktuator pneumatik tunggal, kami mampu mengontrol 4 perangkat CTCM, yang masing-masing dapat menampung 6 potongan jaringan (Gambar 1d). Dalam CTCM, tekanan udara di ruang udara diubah menjadi tekanan sinkron di ruang cairan dan menginduksi ekspansi fisiologis irisan jantung (Gambar 2a dan Video Tambahan 1). Evaluasi peregangan jaringan pada 80 mm Hg menunjukkan peregangan potongan jaringan sebesar 25% (Gambar 2b). Persentase peregangan ini telah terbukti sesuai dengan panjang sarkomer fisiologis 2,2–2,3 µm untuk kontraktilitas potongan jantung normal17,19,25. Pergerakan jaringan dinilai menggunakan pengaturan kamera khusus (Gambar Tambahan 1). Amplitudo dan kecepatan pergerakan jaringan (Gambar 2c, d) sesuai dengan peregangan selama siklus jantung dan waktu selama sistol dan diastol (Gambar 2b). Peregangan dan kecepatan jaringan jantung selama kontraksi dan relaksasi tetap konstan selama 12 hari dalam kultur (Gambar 2f). Untuk mengevaluasi efek stimulasi listrik pada kontraktilitas selama kultur, kami mengembangkan metode untuk menentukan deformitas aktif menggunakan algoritma pewarnaan (Gambar Tambahan 2a,b) dan mampu membedakan antara deformitas dengan dan tanpa stimulasi listrik. Bagian jantung yang sama (Gambar 2f). Di daerah yang dapat digerakkan pada potongan (R6-9), tegangan selama stimulasi listrik 20% lebih tinggi daripada tanpa stimulasi listrik, yang menunjukkan kontribusi stimulasi listrik terhadap fungsi kontraktil.
a) Grafik representatif pengukuran tekanan ruang udara, tekanan ruang cairan, dan pergerakan jaringan mengkonfirmasi bahwa perubahan tekanan ruang udara memengaruhi tekanan ruang cairan, menyebabkan pergerakan irisan jaringan yang sesuai. b) Grafik representatif persentase peregangan (biru) dari potongan jaringan yang sesuai dengan persentase peregangan (oranye). c) Pergerakan irisan jantung yang terukur konsisten dengan kecepatan gerak yang terukur. (d) Trajektori representatif dari gerakan siklik (garis biru) dan kecepatan (garis putus-putus oranye) pada irisan jantung. e) Kuantifikasi waktu siklus (n = 19 irisan per kelompok, dari babi yang berbeda), waktu kontraksi (n = 19 irisan per kelompok), waktu relaksasi (n = 19 irisan per kelompok, dari babi yang berbeda), pergerakan jaringan (n = 25 irisan/kelompok dari babi yang berbeda), kecepatan sistolik puncak (n = 24 (D0), 25 (D12) irisan/kelompok dari babi yang berbeda) dan laju relaksasi puncak (n = 24 (D0), 25 (D12) irisan/kelompok dari babi yang berbeda). Uji t Student dua arah menunjukkan tidak ada perbedaan signifikan pada parameter apa pun. f Jejak analisis regangan representatif dari potongan jaringan dengan (merah) dan tanpa (biru) stimulasi listrik, sepuluh area regional potongan jaringan dari bagian yang sama. Panel bawah menunjukkan kuantifikasi perbedaan persentase regangan pada potongan jaringan dengan dan tanpa stimulasi listrik di sepuluh area dari bagian yang berbeda. (n = 8 irisan/kelompok dari babi yang berbeda, Uji t Student dua arah dilakukan; ****p < 0,0001, **p < 0,01, *p < 0,05). (n = 8 irisan/kelompok dari babi yang berbeda, Uji t Student dua arah dilakukan; ****p < 0,0001, **p < 0,01, *p < 0,05). (n = 8 срезов/группу от разных свиней, проводится двусторонний t-критерий Стьюдента; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05). (n = 8 bagian/kelompok dari babi yang berbeda, uji t Student dua arah; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05). （n = 8 片/组,来自不同的猪,进行双尾学生t 检验；****p < 0,0001,**p < 0,01,*p < 0,05）。 （n = 8 片/组,来自不同的猪,进行双尾学生t 检验；****p < 0,0001,**p < 0,01,*p < 0,05）。 (n = 8 hari/tahun, от разных свиней, двусторонний критерий Стьюдента; ****p <0,0001, **p <0,01, *p <0,05). (n = 8 bagian/kelompok, dari babi yang berbeda, uji t Student dua arah; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05).Batas kesalahan menunjukkan nilai rata-rata ± deviasi standar.
Dalam sistem kultur irisan jantung biomimetik statis kami sebelumnya [20, 21], kami mempertahankan viabilitas, fungsi, dan integritas struktural irisan jantung selama 6 hari dengan menerapkan stimulasi listrik dan mengoptimalkan komposisi medium. Namun, setelah 10 hari, angka-angka ini menurun tajam. Kami akan menyebut irisan yang dikultur dalam sistem kultur biomimetik statis kami sebelumnya [20, 21] sebagai kondisi kontrol (Ctrl) dan kami akan menggunakan medium yang telah dioptimalkan sebelumnya sebagai kondisi MC dan kultur di bawah stimulasi mekanik dan listrik simultan (CTCM). Pertama, kami menentukan bahwa stimulasi mekanik tanpa stimulasi listrik tidak cukup untuk mempertahankan viabilitas jaringan selama 6 hari (Gambar Tambahan 3a,b). Menariknya, dengan diperkenalkannya stimulasi fisik-mekanik dan listrik menggunakan STCM, viabilitas irisan jantung 12 hari tetap sama seperti pada irisan jantung segar di bawah kondisi MS, tetapi tidak di bawah kondisi Ctrl, seperti yang ditunjukkan oleh analisis MTT (Gambar 1). 3a). Hal ini menunjukkan bahwa stimulasi mekanis dan simulasi siklus jantung dapat menjaga kelangsungan hidup potongan jaringan dua kali lebih lama dibandingkan yang dilaporkan dalam sistem kultur statis kami sebelumnya. Namun, penilaian integritas struktural potongan jaringan dengan imunolabeling troponin T jantung dan connexin 43 menunjukkan bahwa ekspresi connexin 43 secara signifikan lebih tinggi pada jaringan MC pada hari ke-12 dibandingkan pada kontrol pada hari yang sama. Namun, ekspresi connexin 43 yang seragam dan pembentukan Z-disc tidak sepenuhnya dipertahankan (Gambar 3b). Kami menggunakan kerangka kerja kecerdasan buatan (AI) untuk mengukur integritas struktural jaringan26, sebuah pipeline pembelajaran mendalam berbasis gambar berdasarkan pewarnaan troponin-T dan connexin43 untuk secara otomatis mengukur integritas struktural dan fluoresensi irisan jantung dalam hal kekuatan lokalisasi. Metode ini menggunakan Jaringan Saraf Konvolusional (CNN) dan kerangka kerja pembelajaran mendalam untuk mengukur integritas struktural jaringan jantung secara andal dan otomatis, seperti yang dijelaskan dalam referensi. 26. Jaringan MC menunjukkan peningkatan kesamaan struktural pada hari ke-0 dibandingkan dengan potongan kontrol statis. Selain itu, pewarnaan trikrom Masson mengungkapkan persentase fibrosis yang secara signifikan lebih rendah pada kondisi MS dibandingkan dengan kondisi kontrol pada hari ke-12 kultur (Gambar 3c). Meskipun CTCM meningkatkan viabilitas potongan jaringan jantung pada hari ke-12 hingga tingkat yang mirip dengan jaringan jantung segar, CTCM tidak secara signifikan meningkatkan integritas struktural potongan jantung tersebut.
Grafik batang menunjukkan kuantifikasi viabilitas MTT dari irisan jantung segar (D0) atau irisan jantung yang dikultur selama 12 hari baik dalam kultur statis (D12 Ctrl) atau dalam CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) irisan/kelompok dari babi yang berbeda, uji ANOVA satu arah dilakukan; ####p < 0,0001 dibandingkan dengan D0 dan **p < 0,01 dibandingkan dengan D12 Ctrl). Grafik batang menunjukkan kuantifikasi viabilitas MTT dari irisan jantung segar (D0) atau irisan jantung yang dikultur selama 12 hari baik dalam kultur statis (D12 Ctrl) atau dalam CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) irisan/kelompok dari babi yang berbeda, uji ANOVA satu arah dilakukan; ####p < 0,0001 dibandingkan dengan D0 dan **p < 0,01 dibandingkan dengan D12 Ctrl).Histogram menunjukkan kuantifikasi viabilitas potongan jantung segar MTT (D0) atau kultur potongan jantung selama 12 hari dalam kultur statis (kontrol D12) atau CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (kontrol D12)), 12 (D12 MC) potongan/kelompok dari babi yang berbeda, uji ANOVA satu arah dilakukan;####p < 0,0001 по сравнению с D0 dan **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p < 0,0001 dibandingkan dengan D0 dan **p < 0,01 dibandingkan dengan D12 Ctrl). a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切片(D0)或心脏切片培养12 天的MTT 活力的量化),来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA测试；与D0 相比，####p < 0,0001,与D12 Ctrl,**p < 0,01)。 a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切片(D0) ,来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组,进行单向ANOVA 测试；与D0 相比,####p < 0.0001,与D12 Ctrl 相比,**p。)Histogram yang menunjukkan kuantifikasi viabilitas MTT pada potongan jantung segar (D0) atau potongan jantung yang dikultur selama 12 hari dalam kultur statis (kontrol D12) atau CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (kontrol D12)), 12 (D12 MC) potongan/kelompok dari babi yang berbeda, uji ANOVA satu arah;####p < 0,0001 по сравнению с D0, **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p < 0,0001 dibandingkan dengan D0, **p < 0,01 dibandingkan dengan D12 Ctrl).b Troponin-T (hijau), connexin 43 (merah) dan DAPI (biru) pada potongan jantung yang baru diisolasi (D0) atau potongan jantung yang dikultur dalam kondisi statis (Ctrl) atau kondisi CTCM (MC) selama 12 hari) dari gambar imunofluoresensi representatif (skala kosong = 100 µm). Kuantifikasi kecerdasan buatan terhadap integritas struktural jaringan jantung (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) irisan/kelompok masing-masing dari babi yang berbeda, uji ANOVA satu arah dilakukan; ####p < 0,0001 dibandingkan dengan D0 dan ****p < 0,0001 dibandingkan dengan D12 Ctrl). Kuantifikasi kecerdasan buatan terhadap integritas struktural jaringan jantung (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) irisan/kelompok masing-masing dari babi yang berbeda, uji ANOVA satu arah dilakukan; ####p < 0,0001 dibandingkan dengan D0 dan ****p < 0,0001 dibandingkan dengan D12 Ctrl). Количественная оценка структурной целостности сердечной ткани искусственным интеллектом (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) срезов/групп от разных tentu saja, tes ANOVA; ####p < 0,0001 по сравнению с D0 dan ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). Kuantifikasi integritas struktural jaringan jantung dengan kecerdasan buatan (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) bagian/kelompok dari babi yang berbeda, uji ANOVA satu arah dilakukan; ####p < 0,0001 dibandingkan dengan D0 dan ****p < 0,0001 dibandingkan dengan D12 Ctrl).人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) irisan/kelompok masing-masing babi berbeda, uji ANOVA satu arah;####p < 0.0001 与D0相比,****p < 0.0001 与D12 Ctrl 相比）。人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) irisan/kelompok masing-masing babi berbeda, uji ANOVA satu arah;####p < 0,0001与D0相比,****p < 0.0001 与D12 Ctrl 相比）。 интеллект для количественной оценки структурной целостности сердечной ткани (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) срезов/группу каждой из oleh karena itu, uji ANOVA; ####p <0,0001 vs. D0 Для сравнения ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). Kecerdasan buatan untuk mengukur integritas struktural jaringan jantung (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) bagian/kelompok masing-masing babi yang berbeda, uji ANOVA satu arah; ####p<0,0001 vs .D0 Untuk perbandingan ****p < 0,0001 dibandingkan dengan D12 Ctrl). c Gambar representatif (kiri) dan kuantifikasi (kanan) untuk irisan jantung yang diwarnai dengan pewarna trikrom Masson (Skala = 500 µm) (n = 10 irisan/kelompok masing-masing dari babi yang berbeda, uji ANOVA satu arah dilakukan; ####p < 0,0001 dibandingkan dengan D0 dan ***p < 0,001 dibandingkan dengan D12 Ctrl). c Gambar representatif (kiri) dan kuantifikasi (kanan) untuk irisan jantung yang diwarnai dengan pewarna trikrom Masson (Skala = 500 µm) (n = 10 irisan/kelompok masing-masing dari babi yang berbeda, uji ANOVA satu arah dilakukan; #### p < 0,0001 dibandingkan dengan D0 dan ***p < 0,001 dibandingkan dengan D12 Ctrl). c Репрезентативные изображения (слева) и количественная оценка (справа) срезов сердца, окрашенных трихромным красителем Массона (масштаб без покрытия = 500 mm) (n = 10 срезов/группу от разных свиней, выполняется односторонний tes ANOVA; #### p < 0,0001 по сравнению с D0 dan ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Gambar representatif (kiri) dan kuantifikasi (kanan) dari potongan jantung yang diwarnai dengan pewarna trikrom Masson (skala tanpa lapisan = 500 µm) (n = 10 potongan/kelompok dari babi yang berbeda, uji ANOVA satu arah dilakukan; #### p < 0,0001 dibandingkan dengan D0 dan ***p < 0,001 dibandingkan dengan D12 Ctrl). c 用Masson三色染料染色的心脏切片的代表性图像（左）和量化（右）（裸尺度= 500 µm）（n = 10 个切片/组，每组来自不同的猪，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0.0001 与D0 相比，***p < 0.001 与D12 Ctrl 相比）。 C 用 Masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 （左 左） 量化 （右） 裸尺度 裸尺度 裸尺度裸尺度 = 500 µm） （n = 10 个 切片 组 每 组 来自 不同 猪 , 进行 单向 单向 Anova 测试；#### p < 0,0001与D0 相比,***p < 0.001 与D12 Ctrl 相比）。 c Репрезентативные изображения (слева) и количественный анализ (справа) срезов сердца, окрашенных трихромным красителем Массона (чистая шкала = 500 mm) (n = 10 срезов/группа, каждый от другой свиньи, протестировано с помощью однофакторного дисперсионного анализа ;### #p < 0,0001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Gambar representatif (kiri) dan kuantifikasi (kanan) dari potongan jantung yang diwarnai dengan pewarna trikrom Masson (blank = 500 µm) (n = 10 potongan/kelompok, masing-masing dari babi yang berbeda, diuji dengan analisis varians satu arah; ### # p < 0,0001 dibandingkan dengan D0, ***p < 0,001 dibandingkan dengan D12 Ctrl).Batas kesalahan menunjukkan nilai rata-rata ± deviasi standar.
Kami berhipotesis bahwa dengan menambahkan molekul kecil ke media kultur, integritas kardiomiosit dapat ditingkatkan dan perkembangan fibrosis dapat dikurangi selama kultur CTCM. Oleh karena itu, kami melakukan skrining molekul kecil menggunakan kultur kontrol statis kami20,21 karena jumlah faktor pengganggu yang sedikit. Deksametason (Dex), triiodothyronine (T3), dan SB431542 (SB) dipilih untuk skrining ini. Molekul kecil ini sebelumnya telah digunakan dalam kultur hiPSC-CM untuk menginduksi pematangan kardiomiosit dengan meningkatkan panjang sarkomer, tubulus T, dan kecepatan konduksi. Selain itu, baik Dex (glukokortikoid) dan SB diketahui dapat menekan peradangan29,30. Oleh karena itu, kami menguji apakah penambahan satu atau kombinasi dari molekul kecil ini akan meningkatkan integritas struktural potongan jantung. Untuk penyaringan awal, dosis masing-masing senyawa dipilih berdasarkan konsentrasi yang umum digunakan dalam model kultur sel (1 μM Dex27, 100 nM T327, dan 2,5 μM SB31). Setelah 12 hari kultur, kombinasi T3 dan Dex menghasilkan integritas struktural kardiomiosit yang optimal dan remodeling fibrosa minimal (Gambar Tambahan 4 dan 5). Selain itu, penggunaan dua kali lipat konsentrasi T3 dan Dex ini menghasilkan efek merugikan dibandingkan dengan konsentrasi normal (Gambar Tambahan 6a,b).
Setelah penyaringan awal, kami melakukan perbandingan langsung dari 4 kondisi kultur (Gambar 4a): Ctrl: potongan jantung yang dikultur dalam kultur statis yang telah kami jelaskan sebelumnya menggunakan media yang telah kami optimalkan; TD: T3 dan Ctrl ditambahkan Dex pada hari Rabu; MC: potongan jantung yang dikultur dalam CTCM menggunakan media yang telah kami optimalkan sebelumnya; dan MT: CTCM dengan penambahan T3 dan Dex ke dalam media. Setelah 12 hari kultivasi, viabilitas jaringan MS dan MT tetap sama seperti pada jaringan segar yang dinilai dengan uji MTT (Gambar 4b). Menariknya, penambahan T3 dan Dex ke kultur transwell (TD) tidak menghasilkan peningkatan viabilitas yang signifikan dibandingkan dengan kondisi Ctrl, menunjukkan peran penting stimulasi mekanis dalam menjaga viabilitas potongan jantung.
Diagram desain eksperimental yang menggambarkan empat kondisi kultur yang digunakan untuk mengevaluasi efek stimulasi mekanik dan suplementasi T3/Dex pada media selama 12 hari. b Grafik batang menunjukkan kuantifikasi viabilitas 12 hari pasca kultur pada keempat kondisi kultur (Ctrl, TD, MC, dan MT) dibandingkan dengan irisan jantung segar (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD dan D12 MT), 12 (D12 MC) irisan/kelompok dari babi yang berbeda, uji ANOVA satu arah dilakukan; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 dibandingkan dengan D0 dan **p < 0,01 dibandingkan dengan D12 Ctrl). b Grafik batang menunjukkan kuantifikasi viabilitas 12 hari pasca kultur pada keempat kondisi kultur (Ctrl, TD, MC, dan MT) dibandingkan dengan irisan jantung segar (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD dan D12 MT), 12 (D12 MC) irisan/kelompok dari babi yang berbeda, uji ANOVA satu arah dilakukan; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 dibandingkan dengan D0 dan **p < 0,01 dibandingkan dengan D12 ctrl). b Kepemilikan Layanan Pelanggan setelah 12 hari kerja культивирования dalam 4 bulan культивирования (контроль, TD, MC dan MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD dan D12 MT), 12 (D12 MC) срезов/группу от разных свиней, penggunaan tes ANOVA; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 по сравнению с D0 dan **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). b Grafik batang menunjukkan kuantifikasi viabilitas pada 12 hari pasca kultur dalam semua 4 kondisi kultur (kontrol, TD, MC, dan MT) dibandingkan dengan potongan jantung segar (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD, dan D12 MT), 12 (D12 MC) potongan/kelompok dari babi yang berbeda, uji ANOVA satu arah; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 vs. D0 dan **p < 0,01 dibandingkan dengan D12 Ctrl). b 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) (n = 18 (D0)、15 (D12 Ctrl、D12 TD 和D12 MT),来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组,进行单向ANOVA 测试；####p < 0.0001，###p < 0.001 与D0 相比,**p < 0.01 与D12控制）。b 4 12 (D12 MC) b Гистограмма, показывающая все 4 условия культивирования (контроль, TD, MC dan MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD dan D12 MT), от разных свиней 12 (D12 MC) срезы/группа, односторонний тест ANOVA; ####p <0,0001, ###p <0,001 по сравнению с D0, **p <0,01 по сравнению с контролем D12). b Histogram yang menunjukkan keempat kondisi kultur (kontrol, TD, MC, dan MT) dibandingkan dengan potongan jantung segar (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD, dan D12 MT), dari babi yang berbeda 12 (D12 MC) potongan/kelompok, uji ANOVA satu arah; ####p<0,0001, ###p<0,001 vs. D0, **p<0,01 vs. kontrol D12). c Grafik batang menunjukkan kuantifikasi fluks glukosa 12 hari setelah kultur pada keempat kondisi kultur (Ctrl, TD, MC, dan MT) dibandingkan dengan irisan jantung segar (D0) (n = 6 irisan/kelompok dari babi yang berbeda, uji ANOVA satu arah dilakukan; ###p < 0,001, dibandingkan dengan D0 dan ***p < 0,001 dibandingkan dengan D12 Ctrl). c Grafik batang menunjukkan kuantifikasi fluks glukosa 12 hari setelah kultur pada keempat kondisi kultur (Ctrl, TD, MC, dan MT) dibandingkan dengan irisan jantung segar (D0) (n = 6 irisan/kelompok dari babi yang berbeda, uji ANOVA satu arah dilakukan; ###p < 0,001, dibandingkan dengan D0 dan ***p < 0,001 dibandingkan dengan D12 Ctrl). c Panduan Pengguna yang Dapat Dipakai Гистограмма показывает количественную оценку потока глюкозы через 12 hari yang lalu tagihan untuk 4 tagihan (контроль, TD, MC dan MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 6 срезов/группу от разных свиней, односторонний Выполняется тест ANOVA; ###p < 0,001 по сравнению с D0 и ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Histogram menunjukkan kuantifikasi fluks glukosa 12 hari pasca-kultur di bawah keempat kondisi kultur (kontrol, TD, MC, dan MT) dibandingkan dengan potongan jantung segar (D0) (n = 6 potongan/kelompok dari babi yang berbeda, uji ANOVA satu arah dilakukan; ###p < 0,001 dibandingkan dengan D0 dan ***p < 0,001 dibandingkan dengan D12 Ctrl). c 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) 相比，培养后12天的葡萄糖通量定量（n = 6 片/组,来自不同猪,单向执行ANOVA 测试；###p < 0.001,与D0 相比,***p < 0,001 与D12 Ctrl 相比）。 C 条形图 显示 所有 4 种 条件 （（ctrl 、 td 、 mc 和 mt） 新鲜 心脏 切片 切片 切片 相比 , 培养后 后 12 天 的 通量 定量 （n = 6 片/组 , 来自 猪 , , , , , , 猪 猪单向执行ANOVA 测试；###p < 0,001,与D0 相比,***p < 0,001 与D12 Ctrl 相比）。 c Layanan, Layanan Pelanggan Глюкозы через 12 hari kerja pembayaran untuk 4 bulan культивирования (контроль, TD, MC dan MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 6 срезов/группа, от разных свиней, односторонний Были melalui tes ANOVA; ###p < 0,001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению с D12 (контроль). c Histogram yang menunjukkan kuantifikasi fluks glukosa pada 12 hari pasca-kultur untuk semua 4 kondisi kultur (kontrol, TD, MC, dan MT) dibandingkan dengan potongan jantung segar (D0) (n = 6 potongan/kelompok, dari babi yang berbeda, unilateral). Uji ANOVA dilakukan, ###p < 0,001 dibandingkan dengan D0, ***p < 0,001 dibandingkan dengan D12 (kontrol).d. Plot analisis regangan jaringan segar (biru), MC hari ke-12 (hijau), dan MT hari ke-12 (merah) pada sepuluh titik penampang jaringan regional (n = 4 irisan/kelompok, uji ANOVA satu arah; tidak ada perbedaan signifikan antar kelompok). e. Plot gunung berapi yang menunjukkan gen yang diekspresikan secara berbeda pada potongan jantung segar (D0) dibandingkan dengan potongan jantung yang dikultur dalam kondisi statis (Ctrl) atau dalam kondisi MT (MT) selama 10-12 hari. f. Peta panas gen sarkomer untuk potongan jantung yang dikultur dalam masing-masing kondisi kultur. Batang kesalahan mewakili rata-rata ± deviasi standar.
Ketergantungan metabolisme pada peralihan dari oksidasi asam lemak ke glikolisis merupakan ciri khas dediferensiasi kardiomiosit. Kardiomiosit imatur terutama menggunakan glukosa untuk produksi ATP dan memiliki mitokondria hipoplastik dengan sedikit krista5,32. Analisis pemanfaatan glukosa menunjukkan bahwa dalam kondisi MC dan MT, pemanfaatan glukosa serupa dengan pada jaringan hari ke-0 (Gambar 4c). Namun, sampel Ctrl menunjukkan peningkatan signifikan dalam pemanfaatan glukosa dibandingkan dengan jaringan segar. Hal ini menunjukkan bahwa kombinasi CTCM dan T3/Dex meningkatkan viabilitas jaringan dan mempertahankan fenotipe metabolik dari potongan jantung yang dikultur selama 12 hari. Selain itu, analisis regangan menunjukkan bahwa tingkat regangan tetap sama seperti pada jaringan jantung segar selama 12 hari dalam kondisi MT dan MS (Gambar 4d).
Untuk menganalisis dampak keseluruhan CTCM dan T3/Dex pada lanskap transkripsi global jaringan irisan jantung, kami melakukan RNAseq pada irisan jantung dari keempat kondisi kultur yang berbeda (Data Tambahan 1). Menariknya, irisan MT menunjukkan kemiripan transkripsi yang tinggi dengan jaringan jantung segar, dengan hanya 16 gen yang diekspresikan secara berbeda dari 13.642 gen. Namun, seperti yang telah kami tunjukkan sebelumnya, irisan Ctrl menunjukkan 1229 gen yang diekspresikan secara berbeda setelah 10–12 hari dalam kultur (Gambar 4e). Data ini dikonfirmasi oleh qRT-PCR gen jantung dan fibroblas (Gambar Tambahan 7a-c). Menariknya, irisan Ctrl menunjukkan penurunan regulasi gen jantung dan siklus sel serta aktivasi program gen inflamasi. Data ini menunjukkan bahwa dediferensiasi, yang biasanya terjadi setelah kultur jangka panjang, sepenuhnya dilemahkan dalam kondisi MT (Gambar Tambahan 8a,b). Studi cermat terhadap gen sarkomer menunjukkan bahwa hanya dalam kondisi MT gen yang mengkode sarkomer (Gambar 4f) dan saluran ion (Gambar Tambahan 9) tetap terjaga, melindunginya dari penekanan dalam kondisi Ctrl, TD, dan MC. Data ini menunjukkan bahwa dengan kombinasi stimulasi mekanik dan humoral (T3/Dex), transkriptom irisan jantung dapat tetap mirip dengan irisan jantung segar setelah 12 hari dalam kultur.
Temuan transkripsional ini didukung oleh fakta bahwa integritas struktural kardiomiosit pada potongan jantung paling terjaga di bawah kondisi MT selama 12 hari, seperti yang ditunjukkan oleh koneksin 43 yang utuh dan terlokalisasi (Gambar 5a). Selain itu, fibrosis pada potongan jantung di bawah kondisi MT berkurang secara signifikan dibandingkan dengan Ctrl dan serupa dengan potongan jantung segar (Gambar 5b). Data ini menunjukkan bahwa kombinasi stimulasi mekanik dan pengobatan T3/Dex secara efektif mempertahankan struktur jantung pada potongan jantung dalam kultur.
a. Gambar imunofluoresensi representatif dari troponin-T (hijau), connexin 43 (merah), dan DAPI (biru) pada potongan jantung yang baru diisolasi (D0) atau dikultur selama 12 hari dalam keempat kondisi kultur potongan jantung (skala bar = 100 µm). Kuantifikasi kecerdasan buatan terhadap integritas struktural jaringan jantung (n = 7 (D0 dan D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC dan D12 MT) irisan/kelompok dari babi yang berbeda, uji ANOVA satu arah dilakukan; ####p < 0,0001 dibandingkan dengan D0 dan *p < 0,05, atau ****p < 0,0001 dibandingkan dengan D12 Ctrl). Kuantifikasi kecerdasan buatan terhadap integritas struktural jaringan jantung (n = 7 (D0 dan D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC dan D12 MT) irisan/kelompok dari babi yang berbeda, uji ANOVA satu arah dilakukan; #### p < 0,0001 dibandingkan dengan D0 dan *p < 0,05, atau ****p < 0,0001 dibandingkan dengan D12 Ctrl). Kolektifitas yang diperlukan untuk menentukan nilai yang diinginkan (n = 7 (D0 dan D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC dan D12 MT) срезов/группу oleh karena itu, kami menggunakan tes ANOVA; #### p < 0,0001 по сравнению с D0 и *p < 0,05 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). Kuantifikasi integritas struktural jaringan jantung menggunakan kecerdasan buatan (n = 7 (D0 dan D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC dan D12 MT) bagian/kelompok dari babi yang berbeda, uji ANOVA satu arah dilakukan; #### p < 0,0001 dibandingkan dengan D0 dan *p < 0,05 atau ****p < 0,0001 dibandingkan dengan D12 Ctrl).对不同猪的心脏组织结构完整性（n = 7（D0 和D12 Ctrl）、5（D12 TD、D12 MC 和D12 MT）切片/组）进行人工智能量化,进行单向ANOVA 测试；#### p < 0.0001 与D0 和*p < 0.05 相比,或****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）。对 不同 猪 的 心脏 结构 完整性 （n = 7 （d0 和 d12 ctrl） （5 （d12 td 、 d12 mc 和 d12 mt） 组）人工 智能量 化 进行 单向 单向 单向 测试 ； ########## p < 0,0001 与D0 和*p < 0,05 相比,或****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）。Kuantifikasi integritas struktural jaringan jantung menggunakan kecerdasan buatan pada babi yang berbeda (n = 7 (D0 dan D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC dan D12 MT) bagian/kelompok) dengan uji ANOVA satu arah;#### p < 0,0001 по сравнению с D0 и *p < 0,05 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). #### p < 0,0001 dibandingkan dengan D0 dan *p < 0,05 atau ****p < 0,0001 dibandingkan dengan D12 Ctrl). b. Gambar representatif dan kuantifikasi untuk irisan jantung yang diwarnai dengan pewarna trikrom Masson (Skala bar = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD, dan D12 MC), 9 (D12 MT) irisan/kelompok dari babi yang berbeda, uji ANOVA satu arah dilakukan; ####p < 0,0001 dibandingkan dengan D0 dan ***p < 0,001, atau ****p < 0,0001 dibandingkan dengan D12 Ctrl). b. Gambar representatif dan kuantifikasi untuk irisan jantung yang diwarnai dengan pewarna trikrom Masson (Skala bar = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD, dan D12 MC), 9 (D12 MT) irisan/kelompok dari babi yang berbeda, uji ANOVA satu arah dilakukan; ####p < 0,0001 dibandingkan dengan D0 dan ***p < 0,001, atau ****p < 0,0001 dibandingkan dengan D12 Ctrl). b Penyimpanan dan penyimpanan yang diperlukan secara berkala, waktu yang ditentukan красителем Массона (масштабная линейка = 500 mm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD dan D12 MC), 9 (D12 MT) срезов/группу от разных свиней, выполняется односторонний uji ANOVA; ####p < 0,0001 по сравнению с D0 и ***p < 0,001 atau ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). b. Gambar representatif dan kuantifikasi potongan jantung yang diwarnai dengan pewarna trikrom Masson (skala bar = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD dan D12 MC), 9 (D12 MT) potongan/kelompok dari babi yang berbeda, dilakukan ANOVA satu arah; ####p < 0,0001 vs. D0 dan ***p < 0,001 atau ****p < 0,0001 vs. D12 Ctrl). b 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像和量化（比例尺= 500 µm）（n = 10（D0、D12 Ctrl、D12 TD和D12 MC），来自不同猪的9 个（D12 MT）切片/组，进行单因素方差分析；####p < 0.0001 与D0 相比,***p < 0.001,或****p < 0.0001 与D12 Ctrl 相比）。 b 用 Masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 和 量化 （比例 尺 尺 尺 = 500 µm） （n = 10 （d0 、 d12 ctrl 、 d12 td 和 d12 mc） 来自 不同 的 9 个 d12 mt 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片foto 切片 与D0相比,***p < 0.001,或***p < 0.0001 与D12 Ctrl 相比）。 b Menanyakan dan menangani masalah yang ada, окрашенных трихромом Массона (масштабная линейка = 500 mm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD dan D12 MC), 9 (D12 MT) срезов от разных свиней / группы, один- способ ANOVA; ####p < 0,0001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 atau ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). b. Gambar representatif dan kuantifikasi potongan jantung yang diwarnai dengan trikrom Masson (skala bar = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD dan D12 MC), 9 (D12 MT) potongan dari babi/kelompok yang berbeda, satu metode ANOVA; ####p < 0,0001 dibandingkan dengan D0, ***p < 0,001 atau ****p < 0,0001 dibandingkan dengan D12 Ctrl).Batas kesalahan menunjukkan nilai rata-rata ± deviasi standar.
Terakhir, kemampuan CTCM untuk meniru hipertrofi jantung dinilai dengan meningkatkan peregangan jaringan jantung. Dalam CTCM, tekanan ruang udara puncak meningkat dari 80 mmHg menjadi 80 mmHg Art. (peregangan normal) hingga 140 mmHg Art. (Gambar 6a). Ini sesuai dengan peningkatan peregangan sebesar 32% (Gambar 6b), yang sebelumnya ditunjukkan sebagai persentase peregangan yang diperlukan agar potongan jantung mencapai panjang sarkomer yang mirip dengan yang terlihat pada hipertrofi. Peregangan dan kecepatan jaringan jantung selama kontraksi dan relaksasi tetap konstan selama enam hari kultur (Gambar 6c). Jaringan jantung dari kondisi MT dikenai peregangan normal (MT (Normal)) atau kondisi peregangan berlebih (MT (OS)) selama enam hari. Setelah empat hari dalam kultur, biomarker hipertrofi NT-ProBNP meningkat secara signifikan dalam medium di bawah kondisi MT (OS) dibandingkan dengan kondisi MT (normal) (Gambar 7a). Selain itu, setelah enam hari kultur, ukuran sel di MT (OS) (Gambar 7b) meningkat secara signifikan dibandingkan dengan bagian jantung MT (normal). Selanjutnya, translokasi nuklir NFATC4 meningkat secara signifikan pada jaringan yang mengalami peregangan berlebihan (Gambar 7c). Hasil ini menunjukkan perkembangan progresif remodeling patologis setelah hiperdistensi dan mendukung konsep bahwa perangkat CTCM dapat digunakan sebagai platform untuk mempelajari sinyal hipertrofi jantung yang diinduksi peregangan.
Grafik representatif dari pengukuran tekanan ruang udara, tekanan ruang fluida, dan pergerakan jaringan mengkonfirmasi bahwa perubahan tekanan ruang udara memengaruhi tekanan ruang fluida, menyebabkan pergerakan irisan jaringan yang sesuai. b Kurva persentase peregangan dan laju peregangan representatif untuk bagian jaringan yang diregangkan secara normal (oranye) dan yang diregangkan berlebihan (biru). c Grafik batang yang menunjukkan waktu siklus (n = 19 irisan per kelompok, dari babi yang berbeda), waktu kontraksi (n = 18-19 irisan per kelompok, dari babi yang berbeda), waktu relaksasi (n = 19 irisan per kelompok, dari babi yang berbeda), amplitudo pergerakan jaringan (n = 14 irisan/kelompok, dari babi yang berbeda), kecepatan sistolik puncak (n = 14 irisan/kelompok, dari babi yang berbeda) dan laju relaksasi puncak (n = 14 (D0), 15 (D6)) irisan/kelompok) dari babi yang berbeda), uji t Student dua arah menunjukkan tidak ada perbedaan signifikan pada parameter apa pun, menunjukkan bahwa parameter ini tetap konstan selama 6 hari kultur dengan tegangan berlebih. Batang kesalahan mewakili rata-rata ± deviasi standar.
a Grafik batang yang mengukur konsentrasi NT-ProBNP dalam media kultur dari irisan jantung yang dikultur di bawah kondisi peregangan MT normal (Norm) atau peregangan berlebih (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, dan D4 MTOS) irisan/kelompok dari babi yang berbeda, ANOVA dua arah dilakukan; **p < 0,01 dibandingkan dengan peregangan normal). a Grafik batang yang mengukur konsentrasi NT-ProBNP dalam media kultur dari irisan jantung yang dikultur di bawah kondisi peregangan MT normal (Norm) atau peregangan berlebih (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, dan D4 MTOS) irisan/kelompok dari babi yang berbeda, ANOVA dua arah dilakukan; **p < 0,01 dibandingkan dengan peregangan normal).Histogram kuantitatif konsentrasi NT-ProBNP dalam media kultur dari irisan jantung yang dikultur dalam kondisi peregangan MT normal (norm) atau peregangan berlebih (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, dan D4 MTOS) irisan/kelompok dari babi yang berbeda, analisis varians dua faktor dilakukan;**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p < 0,01 dibandingkan dengan peregangan normal). a 在MT 正常拉伸(Norm) 或过度拉伸(OS) 条件下培养的心脏切片培养基中NT-ProBNP浓度的条形图量化（n = 4 (D2 MTNorm)、3（D2 MTOS、D4 MTNorm 和D4 MTOS）来自不同猪的切片/组,进行双向方差分析；**与正常拉伸相比,p < 0,01). a Kuantifikasi konsentrasi NT-ProBNP pada irisan jantung yang dikultur pada kondisi MT normal stretch (Norm) atau overstretch (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm和D4 MTOS) dari 猪的切片/组，可以双向方方发发动; **dibandingkan dengan peregangan normal, p <0,01).Histogram Kuantifikasi konsentrasi NT-ProBNP pada irisan jantung yang dikultur dalam kondisi peregangan MT normal (norm) atau peregangan berlebih (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm) dan D4 MTOS) irisan/kelompok dari babi yang berbeda, analisis varians dua arah;**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p < 0,01 dibandingkan dengan peregangan normal). b. Gambar representatif untuk irisan jantung yang diwarnai dengan troponin-T dan WGA (kiri) dan kuantifikasi ukuran sel (kanan) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) sel/kelompok dari 10 irisan berbeda dari babi yang berbeda, Uji t Student dua sisi dilakukan; ****p < 0,0001 dibandingkan dengan peregangan normal). b. Gambar representatif untuk irisan jantung yang diwarnai dengan troponin-T dan WGA (kiri) dan kuantifikasi ukuran sel (kanan) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) sel/kelompok dari 10 irisan berbeda dari babi yang berbeda, Uji t Student dua sisi dilakukan; ****p < 0,0001 dibandingkan dengan peregangan normal). b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слева) и количественного размера клеток (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) клеток/группу из 10 разных срезов от разных свиней, два- проводится хвостовой t-критерий Стьюдента;****p < 0,0001 по сравнению с нормальным растяжением). b. Gambar representatif dari potongan jantung yang diwarnai dengan troponin-T dan AZP (kiri) dan kuantifikasi ukuran sel (kanan) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) sel/kelompok dari 10 potongan berbeda dari babi yang berbeda, uji t Student dua arah dilakukan; ****p < 0,0001 dibandingkan dengan strain normal). b 用肌钙蛋白-T 和WGA（左）和细胞大小量化（右）染色的心脏切片的代表性图像（n = 330（D6 MTOS）,来自不同猪的10 个不同切片的369（D6 MTNorm）细胞/组，两进行有尾学生t 检验；与正常拉伸相比,****p < 0,0001）。 b Gambar representatif irisan jantung yang diwarnai dengan calcarein-T dan WGA (kiri) dan ukuran sel (kanan) (n = 330 (D6 MTOS), 369 dari 10 irisan berbeda (D6 MTNorm)) Sel/组，两方法有尾学生t test；dibandingkan dengan peregangan normal，****p < 0,0001). b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слева) и количественная оценка размера клеток (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) dan 10 различных срезов от разных свиней Клетки/группа, двусторонние критерий Стьюдента; ****p < 0,0001 по сравнению с нормальным растяжением). b. Gambar representatif dari potongan jantung yang diwarnai dengan troponin-T dan AZP (kiri) dan kuantifikasi ukuran sel (kanan) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) dari 10 potongan berbeda dari babi yang berbeda) Sel/kelompok, kriteria t Student dua sisi; ****p < 0,0001 dibandingkan dengan strain normal). c. Gambar representatif untuk irisan jantung MTOS hari ke-0 dan hari ke-6 yang diberi label imun untuk troponin-T dan NFATC4 dan kuantifikasi translokasi NFATC4 ke inti CM (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) irisan/kelompok dari babi yang berbeda, Uji t Student dua sisi dilakukan; *p < 0,05). c. Gambar representatif untuk irisan jantung MTOS hari ke-0 dan hari ke-6 yang diimunolabel untuk troponin-T dan NFATC4 dan kuantifikasi translokasi NFATC4 ke inti CM (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) irisan/kelompok dari babi yang berbeda, Uji t Student dua sisi dilakukan; *p < 0,05). c Pelatihan untuk 0 dan 6 hari MTOS, иммуномеченых для тропонина-Т и NFATC4, dan konektor lainnya NFATC4 dalam ядра кавернозных клеток (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срезов/группу от разных свиней , выполняется двусторонний t-критерий Стьюдента; c Gambar representatif untuk potongan jantung pada 0 dan 6 hari MTOS, diimunolabel untuk troponin-T dan NFATC4, dan kuantifikasi translokasi NFATC4 di nukleus sel kavernosa (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) irisan/kelompok dari babi yang berbeda) dilakukan uji t Student dua sisi; *p < 0,05). c 用于肌钙蛋白-T 和NFATC4 免疫标记的第0 天和第6 天MTOS n = 4 (D0)、3 (D6 MTOS)切片/组, 进行双尾学生t 检验；*p < 0.05)。 c Gambar representatif dari imunolabeling calcanin-T dan NFATC4 第0天和第6天MTOS irisan jantung, dan NFATC4 dari inti sel NFATC4 易位至CM yang berbeda的kuantitas化 (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) 切礼/组,时间双尾学生et 电影；*p < 0,05). c Pengaturan MTOS pada 0 dan 6 hari setelah MTOS-Т dan NFATC4 dan количественная оценка транслокации NFATC4 dalam CM от разных свиней (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срез/группа, хвостатый t-критерий Стьюдента; *p < 0,05). c. Gambar representatif irisan jantung MTOS pada hari ke-0 dan ke-6 untuk imunolabeling troponin-T dan NFATC4 serta kuantifikasi translokasi NFATC4 di nukleus CM dari babi yang berbeda (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) irisan/kelompok, kriteria t dua sisi Student; *p < 0,05).Batas kesalahan menunjukkan nilai rata-rata ± deviasi standar.
Penelitian kardiovaskular translasional membutuhkan model seluler yang secara akurat mereproduksi lingkungan jantung. Dalam studi ini, perangkat CTCM dikembangkan dan dikarakterisasi yang dapat menstimulasi bagian jantung yang sangat tipis. Sistem CTCM mencakup stimulasi elektromekanik yang disinkronkan secara fisiologis dan pengayaan cairan T3 dan Dex. Ketika potongan jantung babi terpapar faktor-faktor ini, viabilitas, integritas struktural, aktivitas metabolik, dan ekspresi transkripsionalnya tetap sama seperti pada jaringan jantung segar setelah 12 hari kultur. Selain itu, peregangan berlebihan pada jaringan jantung dapat menyebabkan hipertrofi jantung yang disebabkan oleh hiperekstensi. Secara keseluruhan, hasil ini mendukung peran penting kondisi kultur fisiologis dalam mempertahankan fenotipe jantung normal dan menyediakan platform untuk skrining obat.
Banyak faktor yang berkontribusi dalam menciptakan lingkungan optimal untuk fungsi dan kelangsungan hidup kardiomiosit. Faktor yang paling jelas terkait dengan (1) interaksi antar sel, (2) stimulasi elektromekanik, (3) faktor humoral, dan (4) substrat metabolik. Interaksi sel-ke-sel fisiologis membutuhkan jaringan tiga dimensi kompleks dari berbagai jenis sel yang didukung oleh matriks ekstraseluler. Interaksi seluler kompleks seperti itu sulit direkonstruksi secara in vitro dengan ko-kultur jenis sel individual, tetapi dapat dengan mudah dicapai dengan menggunakan sifat organotipik dari potongan jantung.
Peregangan mekanis dan stimulasi listrik kardiomiosit sangat penting untuk mempertahankan fenotipe jantung33,34,35. Meskipun stimulasi mekanis telah banyak digunakan untuk pengkondisian dan pematangan hiPSC-CM, beberapa studi elegan baru-baru ini mencoba stimulasi mekanis irisan jantung dalam kultur menggunakan pembebanan uniaksial. Studi-studi ini menunjukkan bahwa pembebanan mekanis uniaksial 2D memiliki efek positif pada fenotipe jantung selama kultur. Dalam studi-studi ini, bagian-bagian jantung dibebani dengan gaya tarik isometrik17, pembebanan auksotonik linier18, atau siklus jantung direkonstruksi menggunakan umpan balik transduser gaya dan penggerak tegangan. Namun, metode-metode ini menggunakan peregangan jaringan uniaksial tanpa optimasi lingkungan, yang mengakibatkan penekanan banyak gen jantung atau ekspresi berlebihan gen yang terkait dengan respons peregangan abnormal. CTCM yang dijelaskan di sini menyediakan stimulus elektromekanis 3D yang meniru siklus jantung alami dalam hal waktu siklus dan peregangan fisiologis (peregangan 25%, sistol 40%, diastol 60%, dan 72 denyut per menit). Meskipun stimulasi mekanik tiga dimensi saja tidak cukup untuk menjaga integritas jaringan, kombinasi stimulasi humoral dan mekanik menggunakan T3/Dex diperlukan untuk menjaga kelangsungan hidup, fungsi, dan integritas jaringan secara memadai.
Faktor humoral memainkan peran penting dalam memodulasi fenotipe jantung dewasa. Hal ini disorot dalam studi HiPS-CM di mana T3 dan Dex ditambahkan ke media kultur untuk mempercepat pematangan sel. T3 dapat memengaruhi transportasi asam amino, gula, dan kalsium melintasi membran sel36. Selain itu, T3 meningkatkan ekspresi MHC-α dan penurunan regulasi MHC-β, mendorong pembentukan miofibril berkedut cepat pada kardiomiosit dewasa dibandingkan dengan miofibril berkedut lambat pada CM janin. Defisiensi T3 pada pasien hipotiroid mengakibatkan hilangnya pita miofibril dan penurunan laju perkembangan tonus37. Dex bekerja pada reseptor glukokortikoid dan telah terbukti meningkatkan kontraktilitas miokardium pada jantung yang diisolasi dan diperfusi;38 peningkatan ini dianggap terkait dengan efek pada masuknya endapan kalsium (SOCE)39,40. Selain itu, Dex berikatan dengan reseptornya, menyebabkan respons intraseluler yang luas yang menekan fungsi imun dan peradangan30.
Hasil kami menunjukkan bahwa stimulasi mekanik fisik (MS) meningkatkan kinerja kultur secara keseluruhan dibandingkan dengan Ctrl, tetapi gagal mempertahankan viabilitas, integritas struktural, dan ekspresi jantung selama 12 hari dalam kultur. Dibandingkan dengan Ctrl, penambahan T3 dan Dex ke kultur CTCM (MT) meningkatkan viabilitas dan mempertahankan profil transkripsi, integritas struktural, dan aktivitas metabolik yang serupa dengan jaringan jantung segar selama 12 hari. Selain itu, dengan mengontrol tingkat peregangan jaringan, model hipertrofi jantung yang diinduksi hiperekstensi dibuat menggunakan STCM, yang menggambarkan fleksibilitas sistem STCM. Perlu dicatat bahwa meskipun remodeling dan fibrosis jantung biasanya melibatkan organ utuh yang sel-sel sirkulasinya dapat menyediakan sitokin yang sesuai serta fagositosis dan faktor remodeling lainnya, bagian jantung masih dapat meniru proses fibrotik sebagai respons terhadap stres dan trauma. menjadi miofibroblas. Hal ini telah dievaluasi sebelumnya dalam model irisan jantung ini. Perlu dicatat bahwa parameter CTCM dapat dimodulasi dengan mengubah tekanan/amplitudo listrik dan frekuensi untuk mensimulasikan banyak kondisi seperti takikardia, bradikardia, dan dukungan sirkulasi mekanis (jantung yang tidak terbebani secara mekanis). Hal ini menjadikan sistem ini memiliki kapasitas sedang untuk pengujian obat. Kemampuan CTCM untuk memodelkan hipertrofi jantung yang diinduksi oleh kelelahan berlebihan membuka jalan untuk menguji sistem ini untuk terapi personalisasi. Kesimpulannya, penelitian ini menunjukkan bahwa peregangan mekanis dan stimulasi humoral sangat penting untuk mempertahankan kultur potongan jaringan jantung.
Meskipun data yang disajikan di sini menunjukkan bahwa CTCM merupakan platform yang sangat menjanjikan untuk memodelkan miokardium utuh, metode kultur ini memiliki beberapa keterbatasan. Keterbatasan utama kultur CTCM adalah bahwa ia memberikan tekanan mekanik dinamis terus-menerus pada irisan, yang menghalangi kemampuan untuk secara aktif memantau kontraksi irisan jantung selama setiap siklus. Selain itu, karena ukuran irisan jantung yang kecil (7 mm), kemampuan untuk mengevaluasi fungsi sistolik di luar sistem kultur menggunakan sensor gaya tradisional terbatas. Dalam manuskrip ini, kami sebagian mengatasi keterbatasan ini dengan mengevaluasi tegangan optik sebagai indikator fungsi kontraktil. Namun, keterbatasan ini memerlukan pekerjaan lebih lanjut dan dapat diatasi di masa mendatang dengan memperkenalkan metode untuk pemantauan optik fungsi irisan jantung dalam kultur, seperti pemetaan optik menggunakan pewarna sensitif kalsium dan tegangan. Keterbatasan lain dari CTCM adalah bahwa model kerja tidak memanipulasi tekanan fisiologis (preload dan afterload). Dalam CTCM, tekanan diinduksi dalam arah yang berlawanan untuk mereproduksi peregangan fisiologis 25% pada diastol (peregangan penuh) dan sistol (panjang kontraksi selama stimulasi listrik) pada jaringan yang sangat besar. Keterbatasan ini harus dihilangkan dalam desain CTCM di masa mendatang dengan memberikan tekanan yang memadai pada jaringan jantung dari kedua sisi dan dengan menerapkan hubungan tekanan-volume yang tepat yang terjadi di dalam bilik-bilik jantung.
Remodeling yang diinduksi oleh peregangan berlebihan yang dilaporkan dalam manuskrip ini terbatas pada meniru sinyal peregangan hipertrofik. Dengan demikian, model ini dapat membantu dalam studi pensinyalan hipertrofik yang diinduksi oleh peregangan tanpa memerlukan faktor humoral atau saraf (yang tidak ada dalam sistem ini). Studi lebih lanjut diperlukan untuk meningkatkan keragaman CTCM, misalnya, kultur bersama dengan sel imun, faktor humoral plasma yang bersirkulasi, dan inervasi ketika kultur bersama dengan sel saraf akan meningkatkan kemungkinan pemodelan penyakit dengan CTCM.
Tiga belas ekor babi digunakan dalam penelitian ini. Semua prosedur terhadap hewan dilakukan sesuai dengan pedoman institusional dan telah disetujui oleh Komite Perawatan dan Penggunaan Hewan Institusional Universitas Louisville. Lengkungan aorta dijepit dan jantung diperfusi dengan 1 L kardioplegia steril (110 mM NaCl, 1,2 mM CaCl2, 16 mM KCl, 16 mM MgCl2, 10 mM NaHCO3, 5 U/mL heparin, pH hingga 7,4); Jantung-jantung tersebut diawetkan dalam larutan kardioplegik sedingin es hingga diangkut ke laboratorium di atas es, yang biasanya memakan waktu kurang dari 10 menit. Jantung-jantung tersebut diawetkan dalam larutan kardioplegik sedingin es hingga diangkut ke laboratorium di atas es, yang biasanya memakan waktu kurang dari 10 menit. сердца хранили в ледяном кардиоплегическом растворе до транспортировки в лабораторию на льду, что обычно занимает <10 мин. Jantung disimpan dalam larutan kardioplegik sedingin es hingga diangkut ke laboratorium dengan menggunakan es, yang biasanya memakan waktu kurang dari 10 menit.)) Держите сердца в ледяной кардиоплегии до транспортировки в лабораторию на льду, обычно <10 мин. Simpan jantung dalam wadah berisi es (kardioplegia) hingga diangkut ke laboratorium dalam wadah berisi es, biasanya kurang dari 10 menit.
Perangkat CTCM dikembangkan menggunakan perangkat lunak desain berbantuan komputer (CAD) SolidWorks. Ruang kultur, pembatas, dan ruang udara terbuat dari plastik akrilik bening CNC. Cincin penahan berdiameter 7 mm terbuat dari polietilen densitas tinggi (HDPE) di bagian tengah dan memiliki alur cincin-O untuk menampung cincin-O silikon yang digunakan untuk menyegel media di bawahnya. Membran silika tipis memisahkan ruang kultur dari pelat pemisah. Membran silikon dipotong laser dari lembaran silikon setebal 0,02 inci dan memiliki kekerasan 35A. Gasket silikon bawah dan atas dipotong laser dari lembaran silikon setebal 1/16 inci dan memiliki kekerasan 50A. Sekrup dan mur sayap baja tahan karat 316L digunakan untuk mengencangkan blok dan menciptakan segel kedap udara.
Papan sirkuit tercetak (PCB) khusus dirancang untuk diintegrasikan dengan sistem C-PACE-EM. Soket konektor mesin Swiss pada PCB dihubungkan ke elektroda grafit dengan kawat tembaga berlapis perak dan sekrup perunggu 0-60 yang disekrupkan ke elektroda. Papan sirkuit tercetak ditempatkan di dalam penutup printer 3D.
Perangkat CTCM dikendalikan oleh aktuator pneumatik terprogram (PPD) yang menciptakan tekanan sirkulasi terkontrol yang mirip dengan siklus jantung. Saat tekanan di dalam ruang udara meningkat, membran silikon fleksibel mengembang ke atas, memaksa medium di bawah lokasi jaringan. Area jaringan kemudian akan meregang akibat pengeluaran cairan ini, meniru ekspansi fisiologis jantung selama diastol. Pada puncak relaksasi, stimulasi listrik diterapkan melalui elektroda grafit, yang mengurangi tekanan di ruang udara dan menyebabkan kontraksi bagian jaringan. Di dalam pipa terdapat katup hemostatik dengan sensor tekanan untuk mendeteksi tekanan dalam sistem udara. Tekanan yang dideteksi oleh sensor tekanan diterapkan ke pengumpul data yang terhubung ke laptop. Hal ini memungkinkan pemantauan tekanan di dalam ruang gas secara terus menerus. Ketika tekanan ruang maksimum tercapai (standar 80 mmHg, 140 mmHg OS), perangkat akuisisi data diperintahkan untuk mengirimkan sinyal ke sistem C-PACE-EM untuk menghasilkan sinyal tegangan bifasik selama 2 ms, yang diatur ke 4 V.
Potongan jantung diperoleh dan kondisi kultur dalam 6 sumur dilakukan sebagai berikut: Pindahkan jantung yang dipanen dari wadah transfer ke nampan berisi kardioplegia dingin (4°C). Ventrikel kiri diisolasi dengan pisau steril dan dipotong menjadi potongan-potongan berukuran 1-2 cm³. Blok jaringan ini ditempelkan pada penyangga jaringan dengan perekat jaringan dan ditempatkan dalam bak jaringan mikrotom getar yang berisi larutan Tyrode dan dioksigenasi terus menerus (3 g/L 2,3-butanedion monooxime (BDM), 140 mM NaCl (8,18 g), 6 mM KCl (0,447 g), 10 mM D-glukosa (1,86 g), 10 mM HEPES (2,38 g), 1 mM MgCl2 (1 ml larutan 1 M), 1,8 mM CaCl2 (1,8 ml larutan 1 M), hingga 1 L ddH2O). Mikrotom getar diatur untuk memotong irisan setebal 300 µm pada frekuensi 80 Hz, amplitudo getaran horizontal 2 mm, dan kecepatan maju 0,03 mm/s. Bak jaringan dikelilingi es untuk menjaga larutan tetap dingin dan suhu dipertahankan pada 4°C. Pindahkan potongan jaringan dari bak mikrotom ke bak inkubasi yang berisi larutan Tyrode yang terus-menerus dioksigenasi di atas es hingga diperoleh cukup potongan untuk satu cawan kultur. Untuk kultur transwell, potongan jaringan ditempelkan pada penyangga poliuretan steril selebar 6 mm dan ditempatkan dalam 6 ml medium yang dioptimalkan (medium 199, suplemen ITS 1x, 10% FBS, 5 ng/ml VEGF, 10 ng/ml FGF-alkalin dan antibiotik-antifungal 2X). Stimulasi listrik (10 V, frekuensi 1,2 Hz) diterapkan pada potongan jaringan melalui C-Pace. Untuk kondisi TD, T3 dan Dex segar ditambahkan masing-masing pada konsentrasi 100 nM dan 1 μM pada setiap penggantian medium. Medium dijenuhkan dengan oksigen sebelum penggantian sebanyak 3 kali sehari. Potongan jaringan dikultur dalam inkubator pada suhu 37°C dan 5% CO2.
Untuk kultur CTCM, potongan jaringan ditempatkan pada printer 3D khusus dalam cawan Petri yang berisi larutan Tyrode yang dimodifikasi. Perangkat ini dirancang untuk meningkatkan ukuran potongan jantung sebesar 25% dari luas cincin penyangga. Hal ini dilakukan agar potongan jantung tidak meregang setelah dipindahkan dari larutan Tyrode ke medium dan selama diastol. Menggunakan lem histoakrilik, potongan setebal 300 µm difiksasi pada cincin penyangga berdiameter 7 mm. Setelah menempelkan potongan jaringan ke cincin penyangga, potong kelebihan potongan jaringan dan tempatkan kembali potongan jaringan yang telah ditempelkan ke dalam larutan Tyrode di atas es (4°C) hingga cukup banyak potongan yang disiapkan untuk satu perangkat. Total waktu pemrosesan untuk semua perangkat tidak boleh melebihi 2 jam. Setelah 6 potongan jaringan ditempelkan ke cincin penyangganya, perangkat CTCM dirakit. Ruang kultur CTCM diisi terlebih dahulu dengan 21 ml medium yang telah dioksigenasi sebelumnya. Pindahkan potongan jaringan ke ruang kultur dan dengan hati-hati hilangkan gelembung udara dengan pipet. Potongan jaringan kemudian diarahkan ke dalam lubang dan ditekan perlahan hingga terpasang. Terakhir, pasang penutup elektroda pada perangkat dan pindahkan perangkat ke inkubator. Kemudian hubungkan CTCM ke tabung udara dan sistem C-PACE-EM. Aktuator pneumatik terbuka dan katup udara membuka CTCM. Sistem C-PACE-EM dikonfigurasi untuk memberikan tegangan 4 V pada frekuensi 1,2 Hz selama pacu bifasik selama 2 ms. Medium diganti dua kali sehari dan elektroda diganti sekali sehari untuk menghindari penumpukan grafit pada elektroda. Jika perlu, potongan jaringan dapat dikeluarkan dari sumur kulturnya untuk mengeluarkan gelembung udara yang mungkin jatuh di bawahnya. Untuk kondisi perawatan MT, T3/Dex ditambahkan segar setiap kali penggantian medium dengan 100 nM T3 dan 1 μM Dex. Perangkat CTCM dikultur dalam inkubator pada suhu 37°C dan 5% CO2.
Untuk mendapatkan lintasan irisan jantung yang diregangkan, sistem kamera khusus dikembangkan. Kamera SLR (Canon Rebel T7i, Canon, Tokyo, Jepang) digunakan dengan lensa makro Navitar Zoom 7000 18-108mm (Navitar, San Francisco, CA). Visualisasi dilakukan pada suhu ruangan setelah mengganti medium dengan medium baru. Kamera diposisikan pada sudut 51° dan video direkam pada 30 frame per detik. Pertama, perangkat lunak sumber terbuka (MUSCLEMOTION43) digunakan dengan Image-J untuk mengukur pergerakan irisan jantung. Masker dibuat menggunakan MATLAB (MathWorks, Natick, MA, USA) untuk mendefinisikan area yang diminati untuk irisan jantung yang berdetak guna menghindari noise. Masker yang disegmentasi secara manual diterapkan pada semua gambar dalam urutan frame dan kemudian diteruskan ke plug-in MUSCLEMOTION. Muscle Motion menggunakan intensitas rata-rata piksel di setiap frame untuk mengukur pergerakannya relatif terhadap frame referensi. Data direkam, difilter, dan digunakan untuk mengukur waktu siklus dan menilai peregangan jaringan selama siklus jantung. Video yang direkam diproses lebih lanjut menggunakan filter digital fase nol orde pertama. Untuk mengukur peregangan jaringan (puncak ke puncak), analisis puncak ke puncak dilakukan untuk membedakan antara puncak dan lembah dalam sinyal yang direkam. Selain itu, penghilangan tren dilakukan menggunakan polinomial orde ke-6 untuk menghilangkan pergeseran sinyal. Kode program dikembangkan di MATLAB untuk menentukan gerakan jaringan global, waktu siklus, waktu relaksasi, dan waktu kontraksi (Kode Program Tambahan 44).
Untuk analisis regangan, menggunakan video yang sama yang dibuat untuk penilaian peregangan mekanis, pertama-tama kami menelusuri dua gambar yang mewakili puncak gerakan (titik tertinggi (atas) dan terendah (bawah) gerakan) sesuai dengan perangkat lunak MUSCLEMOTION. Kemudian kami melakukan segmentasi wilayah jaringan dan menerapkan algoritma pewarnaan pada jaringan yang telah disegmentasi (Gambar Tambahan 2a). Jaringan yang telah disegmentasi kemudian dibagi menjadi sepuluh subpermukaan, dan tegangan pada setiap permukaan dihitung menggunakan persamaan berikut: Regangan = (Sup-Sdown)/Sdown, di mana Sup dan Sdown adalah jarak bentuk dari bayangan atas dan bawah kain, masing-masing (Gambar Tambahan 2b).
Potongan jantung difiksasi dalam paraformaldehida 4% selama 48 jam. Jaringan yang telah difiksasi didehidrasi dalam sukrosa 10% dan 20% selama 1 jam, kemudian dalam sukrosa 30% semalaman. Potongan-potongan tersebut kemudian ditanamkan dalam senyawa suhu pemotongan optimal (senyawa OCT) dan dibekukan secara bertahap dalam rendaman isopentana/es kering. Simpan blok penanaman OCT pada suhu -80 °C hingga pemisahan. Preparasi slide dilakukan dengan ketebalan 8 μm.
Untuk menghilangkan OCT dari potongan jantung, panaskan slide pada blok pemanas pada suhu 95 °C selama 5 menit. Tambahkan 1 ml PBS ke setiap slide dan inkubasi selama 30 menit pada suhu kamar, kemudian permeasi potongan dengan menambahkan 0,1% Triton-X dalam PBS selama 15 menit pada suhu kamar. Untuk mencegah antibodi non-spesifik mengikat sampel, tambahkan 1 ml larutan BSA 3% ke slide dan inkubasi selama 1 jam pada suhu kamar. BSA kemudian dihilangkan dan slide dicuci dengan PBS. Tandai setiap sampel dengan pensil. Antibodi primer (diencerkan 1:200 dalam 1% BSA) (koneksin 43 (Abcam; #AB11370), NFATC4 (Abcam; #AB99431) dan troponin-T (Thermo Scientific; #MA5-12960)) ditambahkan selama 90 menit, kemudian antibodi sekunder (diencerkan 1:200 dalam 1% BSA) terhadap Alexa Fluor 488 tikus (Thermo Scientific; #A16079), terhadap Alexa Fluor 594 kelinci (Thermo Scientific; #T6391) selama 90 menit tambahan. Dicuci 3 kali dengan PBS. Untuk membedakan pewarnaan target dari latar belakang, kami hanya menggunakan antibodi sekunder sebagai kontrol. Terakhir, pewarna inti DAPI ditambahkan dan slide ditempatkan dalam vectashield (Vector Laboratories) dan disegel dengan cat kuku. -perbesaran x) dan mikroskop Keyence dengan perbesaran 40x.
WGA-Alexa Fluor 555 (Thermo Scientific; #W32464) dengan konsentrasi 5 μg/ml dalam PBS digunakan untuk pewarnaan WGA dan diaplikasikan pada bagian yang telah difiksasi selama 30 menit pada suhu ruang. Kemudian, preparat dicuci dengan PBS dan ditambahkan Sudan Black ke setiap preparat, lalu diinkubasi selama 30 menit. Setelah itu, preparat dicuci dengan PBS dan ditambahkan medium embedding Vectashield. Preparat diamati menggunakan mikroskop Keyence dengan perbesaran 40x.
OCT dihilangkan dari sampel seperti yang dijelaskan di atas. Setelah menghilangkan OCT, rendam slide dalam larutan Bouin semalaman. Slide kemudian dibilas dengan air suling selama 1 jam dan kemudian ditempatkan dalam larutan Bibrich aloe acid fuchsin selama 10 menit. Kemudian slide dicuci dengan air suling dan ditempatkan dalam larutan 5% fosfomolibdenum/5% asam fosfotungstat selama 10 menit. Tanpa dibilas, pindahkan slide langsung ke dalam larutan anilin biru selama 15 menit. Kemudian slide dicuci dengan air suling dan ditempatkan dalam larutan asam asetat 1% selama 2 menit. Slide dikeringkan dalam etanol 200 N dan dipindahkan ke xylene. Slide yang telah diwarnai divisualisasikan menggunakan mikroskop Keyence dengan lensa objektif 10x. Persentase area fibrosis diukur menggunakan perangkat lunak Keyence Analyzer.
Uji Viabilitas Sel CyQUANT™ MTT (Invitrogen, Carlsbad, CA), nomor katalog V13154, sesuai dengan protokol pabrikan dengan beberapa modifikasi. Secara khusus, punch bedah dengan diameter 6 mm digunakan untuk memastikan ukuran jaringan yang seragam selama analisis MTT. Jaringan ditempatkan satu per satu ke dalam sumur pelat 12 sumur yang berisi substrat MTT sesuai dengan protokol pabrikan. Potongan diinkubasi pada suhu 37°C selama 3 jam dan jaringan hidup memetabolisme substrat MTT untuk membentuk senyawa formazan ungu. Ganti larutan MTT dengan 1 ml DMSO dan inkubasi pada suhu 37°C selama 15 menit untuk mengekstrak formazan ungu dari potongan jantung. Sampel diencerkan 1:10 dalam DMSO dalam pelat dasar bening 96 sumur dan intensitas warna ungu diukur pada 570 nm menggunakan pembaca pelat Cytation (BioTek). Pembacaan dinormalisasi terhadap berat setiap potongan jantung.
Media irisan jantung diganti dengan media yang mengandung 1 μCi/ml [5-3H]-glukosa (Moravek Biochemicals, Brea, CA, USA) untuk pengujian pemanfaatan glukosa seperti yang dijelaskan sebelumnya. Setelah inkubasi selama 4 jam, tambahkan 100 µl media ke dalam tabung mikrosentrifuga terbuka yang berisi 100 µl HCl 0,2 N. Kemudian tabung tersebut ditempatkan dalam tabung sintilasi yang berisi 500 μl dH2O untuk menguapkan [3H]2O selama 72 jam pada suhu 37°C. Kemudian keluarkan tabung mikrosentrifuga dari tabung sintilasi dan tambahkan 10 ml cairan sintilasi. Penghitungan sintilasi dilakukan menggunakan penganalisis sintilasi cair Tri-Carb 2900TR (Packard Bioscience Company, Meriden, CT, USA). Penggunaan glukosa kemudian dihitung dengan mempertimbangkan aktivitas spesifik [5-3H]-glukosa, kesetimbangan tidak lengkap dan latar belakang, pengenceran [5-3H]- terhadap glukosa tak berlabel, dan efisiensi penghitung sintilasi. Data dinormalisasi terhadap massa potongan jantung.
Setelah homogenisasi jaringan dalam Trizol, RNA diisolasi dari potongan jantung menggunakan Kit Qiagen miRNeasy Micro #210874 sesuai dengan protokol pabrikan. Persiapan pustaka RNAsec, pengurutan, dan analisis data dilakukan sebagai berikut:
1 μg RNA per sampel digunakan sebagai bahan awal untuk pembuatan pustaka RNA. Pustaka sekuensing dihasilkan menggunakan NEBNext UltraTM RNA Library Preparation Kit for Illumina (NEB, USA) mengikuti rekomendasi pabrikan, dan kode indeks ditambahkan ke urutan atribut untuk setiap sampel. Secara singkat, mRNA dimurnikan dari total RNA menggunakan manik-manik magnetik yang diikat dengan oligonukleotida poli-T. Fragmentasi dilakukan menggunakan kation divalen pada suhu tinggi dalam NEBNext First Strand Synthesis Reaction Buffer (5X). cDNA untai pertama disintesis menggunakan primer heksamer acak dan transkriptase balik M-MuLV (RNase H-). cDNA untai kedua kemudian disintesis menggunakan DNA polimerase I dan RNase H. Ujung-ujung yang tersisa diubah menjadi ujung tumpul oleh aktivitas eksonuklease/polimerase. Setelah adenilasi ujung 3′ fragmen DNA, adaptor NEBNext dengan struktur loop jepit rambut dilekatkan padanya untuk mempersiapkannya untuk hibridisasi. Untuk seleksi fragmen cDNA dengan panjang yang diinginkan 150-200 bp, fragmen pustaka dimurnikan menggunakan sistem AMPure XP (Beckman Coulter, Beverly, USA). Kemudian, 3 μl enzim USER (NEB, USA) dengan cDNA yang telah diseleksi ukurannya dan diligasi dengan adaptor digunakan selama 15 menit pada suhu 37°C dan kemudian selama 5 menit pada suhu 95°C sebelum PCR. PCR kemudian dilakukan menggunakan polimerase DNA Phusion High-Fidelity, primer PCR universal, dan primer Indeks (X). Terakhir, produk PCR dimurnikan (sistem AMPure XP) dan kualitas pustaka dinilai pada sistem Agilent Bioanalyzer 2100. Pustaka cDNA kemudian diurutkan menggunakan sequencer Novaseq. File gambar mentah dari Illumina dikonversi menjadi bacaan mentah menggunakan CASAVA Base Calling. Data mentah disimpan dalam file format FASTQ (fq) yang berisi urutan bacaan dan kualitas basa yang sesuai. Pilih HISAT2 untuk mencocokkan bacaan sekuensing yang telah difilter dengan genom referensi Sscrofa11.1. Secara umum, HISAT2 mendukung genom dengan ukuran apa pun, termasuk genom yang lebih besar dari 4 miliar basa, dan nilai default telah ditetapkan untuk sebagian besar parameter. Bacaan penyambungan dari data RNA Seq dapat disejajarkan secara efisien menggunakan HISAT2, sistem tercepat yang tersedia saat ini, dengan akurasi yang sama atau lebih baik daripada metode lainnya.
Kelimpahan transkrip secara langsung mencerminkan tingkat ekspresi gen. Tingkat ekspresi gen dinilai berdasarkan kelimpahan transkrip (jumlah sekuensing) yang terkait dengan genom atau ekson. Jumlah bacaan berbanding lurus dengan tingkat ekspresi gen, panjang gen, dan kedalaman sekuensing. FPKM (fragmen per seribu pasangan basa transkrip yang diurutkan per juta pasangan basa) dihitung dan nilai P ekspresi diferensial ditentukan menggunakan paket DESeq2. Kemudian kami menghitung tingkat penemuan palsu (FDR) untuk setiap nilai P menggunakan metode Benjamini-Hochberg9 berdasarkan fungsi R bawaan “p.adjust”.
RNA yang diisolasi dari potongan jantung diubah menjadi cDNA pada konsentrasi 200 ng/μl menggunakan SuperScript IV Vilo Master mix dari Thermo (Thermo, no. katalog 11756050). RT-PCR kuantitatif dilakukan menggunakan pelat reaksi transparan Applied Biosystems Endura Plate Microamp 384-well (Thermo, no. katalog 4483319) dan perekat optik microamp (Thermo, no. katalog 4311971). Campuran reaksi terdiri dari 5 µl Taqman Fast Advanced Master mix (Thermo, no. katalog 4444557), 0,5 µl Taqman Primer, dan 3,5 µl H2O yang dicampur per sumur. Siklus qPCR standar dijalankan dan nilai CT diukur menggunakan instrumen PCR real-time Applied Biosystems Quantstudio 5 (modul 384-well; produk # A28135). Primer Taqman dibeli dari Thermo (GAPDH (Ss03375629_u1), PARP12 (Ss06908795_m1), PKDCC (Ss06903874_m1), CYGB (Ss06900188_m1), RGL1 (Ss06868890_m1), ACTN1 (Ss01009508_mH), GATA4 (Ss03383805_u1), GJA1 (Ss03374839_u1), COL1A2 (Ss03375009_u1), COL3A1 (Ss04323794_m1), ACTA2 (Ss04245588_m1)). Nilai CT dari semua sampel dinormalisasi terhadap gen pengontrol GAPDH.
Pelepasan media NT-ProBNP dinilai menggunakan kit NT-ProBNP (babi) (No. Katalog MBS2086979, MyBioSource) sesuai dengan protokol pabrikan. Secara singkat, 250 µl dari setiap sampel dan standar ditambahkan secara duplikat ke setiap sumur. Segera setelah menambahkan sampel, tambahkan 50 µl Reagen Uji A ke setiap sumur. Kocok pelat secara perlahan dan tutup dengan perekat. Kemudian tablet diinkubasi pada suhu 37°C selama 1 jam. Kemudian sedot larutan dan cuci sumur 4 kali dengan 350 µl larutan pencuci 1X, inkubasi larutan pencuci selama 1-2 menit setiap kali. Kemudian tambahkan 100 µl Reagen Uji B per sumur dan tutup dengan perekat pelat. Tablet dikocok perlahan dan diinkubasi pada suhu 37°C selama 30 menit. Sedot larutan dan cuci sumur sebanyak 5 kali dengan 350 µl larutan pencuci 1X. Tambahkan 90 µl larutan substrat ke setiap sumur dan tutup pelat. Inkubasi pelat pada suhu 37°C selama 10-20 menit. Tambahkan 50 µl Larutan Penghenti ke setiap sumur. Pelat segera diukur menggunakan pembaca pelat Cytation (BioTek) yang diatur pada 450 nm.
Analisis daya statistik dilakukan untuk memilih ukuran kelompok yang akan memberikan daya statistik >80% untuk mendeteksi perubahan absolut 10% pada parameter dengan tingkat kesalahan Tipe I sebesar 5%. Analisis daya dilakukan untuk memilih ukuran kelompok yang akan memberikan daya >80% untuk mendeteksi perubahan absolut 10% pada parameter dengan tingkat kesalahan Tipe I sebesar 5%. Анализ мощности выполнен для выбора размеров групп, которые обеспечат >80% moщности для pembayaran 10% pembayaran параметра с 5% частотой ошибок типа I. Analisis daya dilakukan untuk memilih ukuran kelompok yang akan memberikan daya >80% untuk mendeteksi perubahan parameter absolut 10% dengan tingkat kesalahan Tipe I sebesar 5%.进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％I型错误率的组大小。进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％I型错误率的组大小。 Jika Anda menghitung jumlah tagihan yang harus dibayar, tingkat bunga > 80% dapat dihitung. pembayaran 10% pembayaran параметров dan 5% частоты ошибоктипа I. Analisis kekuatan statistik dilakukan untuk memilih ukuran kelompok yang akan memberikan kekuatan statistik >80% untuk mendeteksi perubahan parameter absolut sebesar 10% dan tingkat kesalahan tipe I sebesar 5%.Potongan jaringan dipilih secara acak sebelum percobaan. Semua analisis dilakukan secara buta terhadap kondisi dan sampel hanya didekode setelah semua data dianalisis. Perangkat lunak GraphPad Prism (San Diego, CA) digunakan untuk melakukan semua analisis statistik. Untuk semua statistik, nilai p dianggap signifikan jika nilainya <0,05. Untuk semua statistik, nilai p dianggap signifikan pada nilai <0,05. Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. Untuk semua statistik, nilai p dianggap signifikan pada nilai <0,05.对于所有统计数据,p 值在值<0.05 时被认为是显着的。对于所有统计数据,p 值在值<0.05 时被认为是显着的。 Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. Untuk semua statistik, nilai p dianggap signifikan pada nilai <0,05.Uji t Student dua arah dilakukan pada data dengan hanya 2 perbandingan. ANOVA satu arah atau dua arah digunakan untuk menentukan signifikansi antar beberapa kelompok. Saat melakukan uji post hoc, koreksi Tukey diterapkan untuk memperhitungkan perbandingan berganda. Data RNAsec memiliki pertimbangan statistik khusus saat menghitung FDR dan p.adjust seperti yang dijelaskan di bagian Metode.
Untuk informasi lebih lanjut mengenai desain penelitian, lihat abstrak Nature Research Report yang ditautkan pada artikel ini.