Bedankt voor uw bezoek aan Nature.com. De browserversie die u gebruikt, biedt beperkte CSS-ondersteuning. Voor de beste ervaring raden we u aan een bijgewerkte browser te gebruiken (of de compatibiliteitsmodus in Internet Explorer uit te schakelen). Om de ondersteuning te kunnen blijven garanderen, zullen we de site in de tussentijd zonder stijlen en JavaScript weergeven.
Er is behoefte aan een betrouwbaar in-vitrosysteem dat de fysiologische omgeving van het hart nauwkeurig kan reproduceren voor medicijntesten. De beperkte beschikbaarheid van systemen voor de kweek van menselijk hartweefsel heeft geleid tot onnauwkeurige interpretaties van de effecten van hartmedicijnen. Hier hebben we een model voor de kweek van hartweefsel (CTCM) ontwikkeld dat hartcoupes elektromechanisch stimuleert en fysiologische rek ondergaat tijdens de systolische en diastolische fase van de hartcyclus. Na 12 dagen kweek verbeterde deze aanpak de levensvatbaarheid van hartcoupes gedeeltelijk, maar behield hun structurele integriteit niet volledig. Daarom ontdekten we na screening met kleine moleculen dat de toevoeging van 100 nM trijodothyronine (T3) en 1 μM dexamethason (Dex) aan ons medium de microstructuur van de coupes gedurende 12 dagen behield. In combinatie met T3/Dex-behandeling behield het CTCM-systeem de transcriptionele profielen, levensvatbaarheid, metabole activiteit en structurele integriteit gedurende 12 dagen op hetzelfde niveau als vers hartweefsel. Bovendien induceert overmatige uitrekking van hartweefsel in kweek hypertrofische cardiale signalering, wat bewijs levert voor het vermogen van CTCM om hypertrofische aandoeningen te imiteren die worden veroorzaakt door cardiale uitrekking. Concluderend kan CTCM de fysiologie en pathofysiologie van het hart in kweek over langere tijd modelleren, wat betrouwbare geneesmiddelenscreening mogelijk maakt.
Voorafgaand aan klinisch onderzoek zijn betrouwbare in-vitrosystemen nodig die de fysiologische omgeving van het menselijk hart nauwkeurig kunnen reproduceren. Dergelijke systemen moeten veranderingen in mechanische rek, hartslag en elektrofysiologische eigenschappen nabootsen. Diermodellen worden vaak gebruikt als screeningplatform voor hartfysiologie, maar de betrouwbaarheid ervan is beperkt in het weergeven van de effecten van geneesmiddelen in het menselijk hart1,2. Uiteindelijk is het Ideal Cardiac Tissue Culture Experimental Model (CTCM) een model dat zeer gevoelig en specifiek is voor diverse therapeutische en farmacologische interventies en de fysiologie en pathofysiologie van het menselijk hart nauwkeurig reproduceert3. De afwezigheid van een dergelijk systeem beperkt de ontdekking van nieuwe behandelingen voor hartfalen4,5 en heeft geleid tot cardiotoxiciteit van geneesmiddelen als een belangrijke reden voor het verdwijnen van de markt6.
In het afgelopen decennium zijn acht niet-cardiovasculaire geneesmiddelen uit de klinische praktijk gehaald omdat ze het QT-interval verlengen, wat leidt tot ventriculaire aritmieën en plotselinge dood7. Er is dus een toenemende behoefte aan betrouwbare preklinische screeningstrategieën om de cardiovasculaire werkzaamheid en toxiciteit te beoordelen. Het recente gebruik van door mensen geïnduceerde pluripotente stamcelafgeleide cardiomyocyten (hiPS-CM) bij geneesmiddelenscreening en toxiciteitstesten biedt een gedeeltelijke oplossing voor dit probleem. De onvolgroeide aard van hiPS-CM's en het gebrek aan multicellulaire complexiteit van hartweefsel vormen echter belangrijke beperkingen van deze methode. Recente studies hebben aangetoond dat deze beperking gedeeltelijk kan worden ondervangen door vroege hiPS-CM te gebruiken om hydrogels van hartweefsel te vormen kort na het begin van spontane contracties en de elektrische stimulatie geleidelijk te verhogen in de loop van de tijd. Deze hiPS-CM-microweefsels missen echter de volgroeide elektrofysiologische en contractiele eigenschappen van het volwassen myocard. Bovendien heeft menselijk hartweefsel een complexere structuur, bestaande uit een heterogene mix van verschillende celtypen, waaronder endotheelcellen, neuronen en stromale fibroblasten, onderling verbonden door specifieke sets extracellulaire matrixeiwitten. Deze heterogeniteit van niet-cardiomyocytpopulaties11,12,13 in het volwassen zoogdierhart vormt een belangrijke barrière voor het modelleren van hartweefsel met behulp van individuele celtypen. Deze belangrijke beperkingen benadrukken het belang van het ontwikkelen van methoden voor het kweken van intact myocardweefsel onder fysiologische en pathologische omstandigheden.
Gekweekte dunne (300 µm) coupes van het menselijk hart blijken een veelbelovend model te zijn voor intact menselijk myocard. Deze methode biedt toegang tot een compleet driedimensionaal multicellulair systeem, vergelijkbaar met menselijk hartweefsel. Tot 2019 werd het gebruik van gekweekte hartcoupes echter beperkt door de korte (24 uur) kweekoverleving. Dit is te wijten aan een aantal factoren, waaronder het gebrek aan fysisch-mechanische rek, de lucht-vloeistofinterface en het gebruik van eenvoudige media die niet voldoen aan de behoeften van hartweefsel. In 2019 hebben verschillende onderzoeksgroepen aangetoond dat het integreren van mechanische factoren in kweeksystemen voor hartweefsel de kweeklevensduur kan verlengen, de hartexpressie kan verbeteren en hartpathologie kan nabootsen. Twee elegante studies 17 en 18 tonen aan dat uniaxiale mechanische belasting een positief effect heeft op het hartfenotype tijdens de kweek. Deze studies maakten echter geen gebruik van de dynamische driedimensionale fysisch-mechanische belasting van de hartcyclus, aangezien hartsecties werden belast met ofwel isometrische trekkrachten 17 ofwel lineaire auxotone belasting 18 . Deze methoden van weefselrekking resulteerden in de onderdrukking van veel hartgenen of de overexpressie van genen geassocieerd met abnormale rekreacties. Met name Pitoulis et al. 19 ontwikkelden een dynamisch hartplakkweekbad voor reconstructie van de hartcyclus met behulp van krachttransducerfeedback en spanningsaandrijvingen. Hoewel dit systeem een ​​nauwkeurigere in vitro modellering van de hartcyclus mogelijk maakt, beperken de complexiteit en lage doorvoer van de methode de toepassing van dit systeem. Ons laboratorium heeft onlangs een vereenvoudigd kweeksysteem ontwikkeld met behulp van elektrische stimulatie en een geoptimaliseerd medium om de levensvatbaarheid van secties van varkens- en menselijk hartweefsel tot 6 dagen te behouden20,21.
In het huidige manuscript beschrijven we een model voor hartweefselkweek (CTCM) met behulp van secties van het varkenshart, dat humorale signalen bevat om de driedimensionale hartfysiologie en pathofysiologische distensie tijdens de hartcyclus te recapituleren. Dit CTCM kan de nauwkeurigheid van preklinische medicijnvoorspelling verhogen tot een niveau dat nog nooit eerder is bereikt door een kosteneffectief mid-throughput hartsysteem te bieden dat de fysiologie/pathofysiologie van het zoogdierhart nabootst voor preklinische medicijntests.
Hemodynamische mechanische signalen spelen een cruciale rol bij het handhaven van de cardiomyocytfunctie in vitro 22,23,24. In het huidige manuscript hebben we een CTCM (Figuur 1a) ontwikkeld die de volwassen cardiale omgeving kan nabootsen door zowel elektrische als mechanische stimulatie te induceren op fysiologische frequenties (1,2 Hz, 72 slagen per minuut). Om overmatige weefselrek tijdens de diastole te voorkomen, werd een 3D-printapparaat gebruikt om de weefselgrootte met 25% te vergroten (Figuur 1b). Elektrische pacing geïnduceerd door het C-PACE-systeem werd getimed om 100 ms vóór de systole te starten met behulp van een data-acquisitiesysteem om de hartcyclus volledig te reproduceren. Het weefselkweeksysteem maakt gebruik van een programmeerbare pneumatische actuator (LB Engineering, Duitsland) om cyclisch een flexibel siliconenmembraan te expanderen om expansie van de hartplakken in de bovenste kamer te veroorzaken. Het systeem werd via een druktransducer aangesloten op een externe luchtleiding, waardoor het mogelijk was om de druk (± 1 mmHg) en tijd (± 1 ms) nauwkeurig aan te passen (Figuur 1c).
a Bevestig de weefselcoupe aan de 7 mm steunring, weergegeven in blauw, in de kweekkamer van het apparaat. De kweekkamer is van de luchtkamer gescheiden door een dun, flexibel siliconenmembraan. Plaats een pakking tussen elke kamer om lekkage te voorkomen. Het deksel van het apparaat bevat grafietelektroden die elektrische stimulatie leveren. b Schematische weergave van het grote weefselapparaat, de geleidering en de steunring. De weefselcoupes (bruin) worden op het oversized apparaat geplaatst met de geleidering in de groef aan de buitenrand van het apparaat. Plaats met behulp van de geleider voorzichtig de met weefselacryllijm bedekte steunring over de coupe hartweefsel. c Grafiek die de tijd van elektrische stimulatie weergeeft als functie van de luchtkamerdruk, aangestuurd door een programmeerbare pneumatische actuator (PPD). Een data-acquisitieapparaat werd gebruikt om de elektrische stimulatie te synchroniseren met behulp van druksensoren. Wanneer de druk in de kweekkamer de ingestelde drempelwaarde bereikt, wordt een pulssignaal naar de C-PACE-EM gestuurd om elektrische stimulatie te activeren. d Afbeelding van vier CTCM's geplaatst op een couveuseplank. Vier apparaten zijn via een pneumatisch circuit verbonden met één PPD, en druksensoren worden in de hemostaseklep geplaatst om de druk in het pneumatische circuit te bewaken. Elk apparaat bevat zes weefselcoupes.
Met één pneumatische actuator konden we vier CTCM-apparaten aansturen, die elk zes weefselsecties konden bevatten (Fig. 1d). Bij CTCM wordt de luchtdruk in de luchtkamer omgezet in synchrone druk in de vloeistofkamer, wat leidt tot fysiologische expansie van de hartsnede (Figuur 2a en Aanvullende Film 1). Evaluatie van de weefselrek bij 80 mm Hg. Art. toonde een rek van de weefselsecties van 25% (Fig. 2b). Deze procentuele rek blijkt overeen te komen met een fysiologische sarcomeerlengte van 2,2–2,3 µm voor een normale contractiliteit van de hartsnede17,19,25. De weefselbeweging werd beoordeeld met behulp van aangepaste camera-instellingen (Aanvullende Figuur 1). De amplitude en snelheid van de weefselbeweging (Fig. 2c, d) kwamen overeen met de rek tijdens de hartcyclus en de tijd tijdens de systole en diastole (Fig. 2b). De rek en snelheid van het hartweefsel tijdens contractie en ontspanning bleven gedurende 12 dagen in kweek constant (Fig. 2f). Om het effect van elektrische stimulatie op de contractiliteit tijdens kweek te evalueren, ontwikkelden we een methode om actieve deformiteit te bepalen met behulp van een schaduwalgoritme (Aanvullende Fig. 2a,b). Zo konden we onderscheid maken tussen deformiteiten met en zonder elektrische stimulatie. Hetzelfde deel van het hart (Fig. 2f). In het beweegbare deel van de snede (R6-9) was de spanning tijdens elektrische stimulatie 20% hoger dan zonder elektrische stimulatie, wat wijst op de bijdrage van elektrische stimulatie aan de contractiele functie.
Representatieve sporen van de luchtkamerdruk, vloeistofkamerdruk en weefselbewegingsmetingen bevestigen dat de kamerdruk de vloeistofkamerdruk verandert, wat een overeenkomstige beweging van de weefselplak veroorzaakt. b Representatieve sporen van percentage rek (blauw) van weefselsecties die overeenkomen met percentage rek (oranje). c De gemeten beweging van de hartplak komt overeen met de gemeten bewegingssnelheid. (d) Representatieve trajecten van cyclische beweging (blauwe lijn) en snelheid (oranje stippellijn) in een plak van het hart. e Kwantificering van cyclustijd (n = 19 plakken per groep, van verschillende varkens), contractietijd (n = 19 plakken per groep, van verschillende varkens), relaxatietijd (n = 19 plakken per groep, van verschillende varkens), weefselbeweging (n = 25 plakken)/groep van verschillende varkens), pieksystolische snelheid (n = 24(D0), 25(D12) plakken/groep van verschillende varkens) en piekrelaxatiesnelheid (n = 24(D0), 25(D12) plakken/groep van verschillende varkens). De tweezijdige t-toets van Student toonde geen significant verschil in enige parameter. f Representatieve rekanalyse van weefselcoupes met (rood) en zonder (blauw) elektrische stimulatie, tien regionale gebieden van weefselcoupes uit dezelfde coupe. De onderste panelen tonen de kwantificering van het procentuele verschil in rek in weefselcoupes met en zonder elektrische stimulatie in tien gebieden uit verschillende coupes. (n = 8 plakjes/groep van verschillende varkens, er is een tweezijdige Student t-toets uitgevoerd; ****p < 0,0001, **p < 0,01, *p < 0,05). (n = 8 plakjes/groep van verschillende varkens, er is een tweezijdige Student t-toets uitgevoerd; ****p < 0,0001, **p < 0,01, *p < 0,05). (n = 8 срезов/группу от разных свиней, проводится двусторонний t-критерий Стьюдента; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05). (n = 8 secties/groep van verschillende varkens, tweezijdige Student's t-toets; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05). (n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p < 0,0001，**p < 0,01，*p < 0,05）。 (n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p < 0,0001，**p < 0,01，*p < 0,05）。 (n = 8 срезов/группу, от разных свиней, двусторонний критерий Стьюдента; ****p <0,0001, **p <0,01, *p <0,05). (n = 8 secties/groep, van verschillende varkens, tweezijdige Student's t-toets; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05).De foutbalken geven het gemiddelde ± de standaarddeviatie weer.
In ons vorige statische biomimetisch kweeksysteem voor hartplakken [20, 21] behielden we de levensvatbaarheid, functie en structurele integriteit van hartplakken gedurende 6 dagen door elektrische stimulatie toe te passen en de mediumsamenstelling te optimaliseren. Na 10 dagen daalden deze cijfers echter scherp. We zullen verwijzen naar secties die gekweekt zijn in ons vorige statische biomimetisch kweeksysteem 20, 21 controlecondities (Ctrl) en we zullen ons eerder geoptimaliseerde medium gebruiken als MC-condities en kweek onder gelijktijdige mechanische en elektrische stimulatie (CTCM). genaamd . Ten eerste hebben we vastgesteld dat mechanische stimulatie zonder elektrische stimulatie onvoldoende was om de levensvatbaarheid van het weefsel gedurende 6 dagen te behouden (Aanvullende figuur 3a,b). Interessant is dat met de introductie van fysio-mechanische en elektrische stimulatie met STCM de levensvatbaarheid van 12-daagse hartplakken hetzelfde bleef als in verse hartplakken onder MS-condities, maar niet onder Ctrl-condities, zoals aangetoond door MTT-analyse (figuur 1). 3a). Dit suggereert dat mechanische stimulatie en simulatie van de hartcyclus weefselcoupes twee keer zo lang levensvatbaar kunnen houden als gerapporteerd in ons vorige statische kweeksysteem. Beoordeling van de structurele integriteit van weefselcoupes door middel van immunolabeling van cardiaal troponine T en connexine 43 toonde echter aan dat de connexine 43-expressie significant hoger was in MC-weefsels op dag 12 dan in controles op dezelfde dag. Uniforme connexine 43-expressie en Z-schijfvorming bleven echter niet volledig behouden (Fig. 3b). We gebruiken een raamwerk voor kunstmatige intelligentie (AI) om de structurele integriteit van weefsel te kwantificeren26, en een beeldgebaseerde deep learning-pijplijn gebaseerd op troponine-T- en connexinekleuring43 om automatisch de structurele integriteit en fluorescentie van hartcoupes te kwantificeren in termen van lokalisatiesterkte. Deze methode maakt gebruik van een Convolutional Neural Network (CNN) en een deep learning-raamwerk om de structurele integriteit van hartweefsel betrouwbaar te kwantificeren op een geautomatiseerde en objectieve manier, zoals beschreven in de referentie. 26. MC-weefsel vertoonde een verbeterde structurele gelijkenis met dag 0 vergeleken met statische controlecoupes. Bovendien toonde Masson's trichroomkleuring een significant lager percentage fibrose onder MS-omstandigheden vergeleken met controlecoupes op dag 12 van de kweek (Figuur 3c). Hoewel CTCM de levensvatbaarheid van hartweefselcoupes op dag 12 verhoogde tot een niveau vergelijkbaar met dat van vers hartweefsel, verbeterde het de structurele integriteit van de hartcoupes niet significant.
Een staafdiagram toont de kwantificering van de MTT-levensvatbaarheid van verse hartplakken (D0) of hartplakkenkweek gedurende 12 dagen, hetzij in statische kweek (D12 Ctrl) of in CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) plakken/groep van verschillende varkens, er is een enkelvoudige ANOVA-test uitgevoerd; ####p < 0,0001 vergeleken met D0 en **p < 0,01 vergeleken met D12 Ctrl). Een staafdiagram toont de kwantificering van de MTT-levensvatbaarheid van verse hartplakken (D0) of hartplakkenkweek gedurende 12 dagen, hetzij in statische kweek (D12 Ctrl) of in CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) plakken/groep van verschillende varkens, er is een enkelvoudige ANOVA-test uitgevoerd; ####p < 0,0001 vergeleken met D0 en **p < 0,01 vergeleken met D12 Ctrl).het histogram toont de kwantificering van de levensvatbaarheid van verse MTT-hartcoupes (D0) of kweek van hartcoupes gedurende 12 dagen in statische kweek (D12-controle) of CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12-controle). ) ), 12 (D12 MC) coupes/groep van verschillende varkens, er wordt een eenrichtings-ANOVA-test uitgevoerd;####p < 0,0001 via D0 en **p < 0,01 via D12 Ctrl). ####p < 0,0001 vergeleken met D0 en **p < 0,01 vergeleken met D12 (Ctrl). a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切foto(D0)或心脏切片培养12 天的MTT 活力的量化),来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组,进行单向ANOVA测试；与D0 相比，####p < 0,0001，D12 Ctrl 相比，**p < 0,01)。 a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切foto(D0) ，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；与D0 相比，####p < 0,0001，与D12 Ctrl相比，**p。)histogram van de kwantificering van de levensvatbaarheid van MTT in verse hartsecties (D0) of hartsecties die 12 dagen lang in statische cultuur (D12-controle) of CTCM (D12 MC) zijn gekweekt (n = 18 (D0), 15 (D12-controle)), 12 (D12 MC) secties/groep van verschillende varkens, eenzijdige ANOVA-test;####p < 0,0001 via D0, **p < 0,01 via D12 Ctrl). ####p < 0,0001 vergeleken met D0, **p < 0,01 vergeleken met D12 Ctrl).b Troponine-T (groen), connexine 43 (rood) en DAPI (blauw) in vers geïsoleerde hartcoupes (D0) of hartcoupes gekweekt onder statische omstandigheden (Ctrl) of CTCM-omstandigheden (MC) gedurende 12 dagen) van representatieve immunofluorescentiebeelden (lege schaal = 100 µm). Kwantificering van de structurele integriteit van het hartweefsel met behulp van kunstmatige intelligentie (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) slices/groepen, elk afkomstig van een ander varken, er wordt een enkelvoudige ANOVA-test uitgevoerd; ####p < 0,0001 vergeleken met D0 en ****p < 0,0001 vergeleken met D12 Ctrl). Kwantificering van de structurele integriteit van het hartweefsel met behulp van kunstmatige intelligentie (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) slices/groepen, elk afkomstig van verschillende varkens, er wordt een enkelvoudige ANOVA-test uitgevoerd; ####p < 0,0001 vergeleken met D0 en ****p < 0,0001 vergeleken met D12 Ctrl). Количественная оценка структурной целостности сердечной ткани искусственным интеллектом (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) срезов/групп van разных свиней, проводится однофакторный тест ANOVA; ####p < 0,0001 met instellingen via D0 en ****p < 0,0001 met instellingen via D12 Ctrl). Kwantificering van de structurele integriteit van hartweefsel door middel van kunstmatige intelligentie (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) secties/groepen van verschillende varkens, enkelvoudige ANOVA-test uitgevoerd; ####p < 0,0001 versus met D0 en ****p < 0,0001 vergeleken met D12 Ctrl).人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) plakjes/groep elk van verschillende varkens, one-way ANOVA-test;####p < 0,0001 与D0相比，****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）。人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) plakjes/groep van elk verschillende varkens, one-way ANOVA-test;####p < 0,0001与D0相比，****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）。 Искусственный интеллект для количественной оценки структурной целостности сердечной ткани (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) срезов/группу каждой en разных свиней, односторонний тест ANOVA; ####p <0,0001 vs. D0 Для сравнения ****p < 0,0001 met behulp van D12 Ctrl). Kunstmatige intelligentie om de structurele integriteit van hartweefsel te kwantificeren (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) secties/groepen van elk verschillende varkens, enkelvoudige ANOVA-test; ####p<0,0001 vs. D0 Ter vergelijking ****p < 0,0001 vergeleken met D12 Ctrl). c Representatieve afbeeldingen (links) en kwantificering (rechts) voor hartplakken gekleurd met Masson's trichroomkleuring (Schaal kaal = 500 µm) (n = 10 plakken/groep, elk van een ander varken, er is een enkelvoudige ANOVA-test uitgevoerd; ####p < 0,0001 vergeleken met D0 en ***p < 0,001 vergeleken met D12 Ctrl). c Representatieve afbeeldingen (links) en kwantificering (rechts) voor hartplakken gekleurd met Masson's trichroomkleuring (Schaal kaal = 500 µm) (n = 10 plakken/groep, elk van verschillende varkens, er is een enkelvoudige ANOVA-test uitgevoerd; #### p < 0,0001 vergeleken met D0 en ***p < 0,001 vergeleken met D12 Ctrl). c Bedrijfsgegevens (слева) en оценка (справа) срезов сердца, окрашенных трихромным красителем Массона (масштаб без покрытия = 500 мкм) (n = 10 срезов/группу от разных свиней, выполняется односторонний тест ANOVA #### p < 0,0001 по сравнению с D0 en ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Representatieve afbeeldingen (links) en kwantificering (rechts) van hartsecties gekleurd met Masson's trichroomkleuring (ongecoate schaal = 500 µm) (n = 10 secties/groep van verschillende varkens, enkelvoudige ANOVA-test uitgevoerd; #### p < 0,0001 vergeleken met D0 en ***p < 0,001 vergeleken met D12 Ctrl). c 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像（左）和量化（右）（裸尺度= 500 µm）（n = 10个切片/组，每组来自不同的猪，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0,0001 与D0 相比，***p < 0,001 与D12 Ctrl 相比）。 C 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 （左 左） 量化 （右） 裸尺度 裸尺度 裸尺度裸尺度 = 500 µm） （n = 10 个 切片 组 每 组 来自 不同 猪 ， 进行 单向 单向 Anova 测试；#### p < 0,0001 与D0 相比，***p < 0,001 与D12 Ctrl 相比）。 c Bedrijfsgegevens (слева) en количественный анализ (справа) срезов сердца, окрашенных трихромным красителем Массона (чистая шкала = 500 мкм) (n = 10 срезов/группа, каждый от другой свиньи, протестировано с помощью однофакторного дисперсионного анализа ;### #p < 0,0001 via D0, ***p < 0,001 via D12 Ctrl). c Representatieve afbeeldingen (links) en kwantificering (rechts) van hartsecties gekleurd met Masson's trichroomkleuring (blanco = 500 µm) (n = 10 secties/groep, elk afkomstig van een ander varken, getest met behulp van een enkelvoudige variantieanalyse; ### # p < 0,0001 vergeleken met D0, ***p < 0,001 vergeleken met D12 Ctrl).De foutbalken geven het gemiddelde ± de standaarddeviatie weer.
Onze hypothese was dat door het toevoegen van kleine moleculen aan het kweekmedium de integriteit van cardiomyocyten verbeterd kon worden en de ontwikkeling van fibrose tijdens CTCM-kweek verminderd kon worden. Daarom hebben we gescreend op kleine moleculen met behulp van onze statische controleculturen20,21 vanwege het geringe aantal verstorende factoren. Dexamethason (Dex), trijodothyronine (T3) en SB431542 (SB) werden gekozen voor deze screening. Deze kleine moleculen zijn eerder gebruikt in hiPSC-CM-kweken om de maturatie van cardiomyocyten te induceren door de lengte van de sarcomeren, de T-tubuli en de geleidingssnelheid te verhogen. Bovendien is bekend dat zowel Dex (een glucocorticoïde) als SB ontstekingen onderdrukken29,30. Daarom hebben we getest of de toevoeging van één of een combinatie van deze kleine moleculen de structurele integriteit van hartsecties zou verbeteren. Voor de eerste screening werd de dosis van elke verbinding geselecteerd op basis van de concentraties die gewoonlijk in celkweekmodellen worden gebruikt (1 μM Dex27, 100 nM T327 en 2,5 μM SB31). Na 12 dagen kweek resulteerde de combinatie van T3 en Dex in optimale structurele integriteit van cardiomyocyten en minimale vezelremodellering (aanvullende figuren 4 en 5). Bovendien veroorzaakte het gebruik van dubbele of dubbele concentraties T3 en Dex schadelijke effecten in vergelijking met normale concentraties (aanvullende figuren 6a,b).
Na de eerste screening voerden we een directe vergelijking uit van 4 kweekomstandigheden (Figuur 4a): Ctrl: hartcoupes gekweekt in onze eerder beschreven statische kweek met ons geoptimaliseerde medium; 20.21 TD: T3 en Ctrl's toegevoegd Dex op woensdag; MC: hartcoupes gekweekt in CTCM met ons eerder geoptimaliseerde medium; en MT: CTCM met T3 en Dex toegevoegd aan het medium. Na 12 dagen kweek bleef de levensvatbaarheid van MS- en MT-weefsels gelijk aan die van vers weefsel, beoordeeld met de MTT-test (Figuur 4b). Interessant is dat de toevoeging van T3 en Dex aan transwell-culturen (TD) niet resulteerde in een significante verbetering van de levensvatbaarheid in vergelijking met Ctrl-omstandigheden, wat wijst op een belangrijke rol van mechanische stimulatie bij het behoud van de levensvatbaarheid van hartcoupes.
Een diagram van een experimenteel ontwerp waarin de vier kweekomstandigheden worden weergegeven die worden gebruikt om de effecten van mechanische stimulatie en T3/Dex-suppletie op medium gedurende 12 dagen te evalueren. b Staafdiagram toont kwantificering van levensvatbaarheid 12 dagen na kweek in alle 4 kweekomstandigheden (Ctrl, TD, MC en MT) vergeleken met verse hartplakken (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD en D12 MT), 12 (D12 MC) plakken/groep van verschillende varkens, eenzijdige ANOVA-test is uitgevoerd; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 vergeleken met D0 en **p < 0,01 vergeleken met D12 Ctrl). b Staafdiagram toont kwantificering van levensvatbaarheid 12 dagen na kweek in alle 4 kweekomstandigheden (Ctrl, TD, MC en MT) vergeleken met verse hartplakken (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD en D12 MT), 12 (D12 MC) plakken/groep van verschillende varkens, eenzijdige ANOVA-test is uitgevoerd; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 vergeleken met D0 en **p < 0,01 vergeleken met D12 ctrl). b Gebruikskrediet voor een periode van 12 maanden культивирования in во всех 4 условиях (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD en D12 MT), 12 (D12 MC) срезов/группу от разных свиней, проводится односторонний тест ANOVA; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 met D0 en **p < 0,01 met D12 Ctrl). b Het staafdiagram toont de kwantificering van de levensvatbaarheid op 12 dagen na de kweek in alle 4 kweekomstandigheden (controle, TD, MC en MT) vergeleken met verse hartcoupes (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD en D12 MT), 12 (D12 MC) coupes/groep van verschillende varkens, enkelvoudige ANOVA-test; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 versus D0 en **p < 0,01 vergeleken met D12 Ctrl). b 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) (n = 18 (D0)、15 (D12 Ctrl、D12 TD和D12 MT)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；####p < 0,0001，###p < 0,001 与D0相比，**p < 0,01 与D12 制）。b 4 12 (D12 MC) b Гистограмма, показывающая tussen 4 условия культивирования (контроль, TD, MC en MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD en D12 MT), met 12 (D12 MC) срезы/группа, односторонний тест ANOVA; ####p <0,0001, ###p <0,001 op basis van D0, **p <0,01 op basis van D12). b Histogram van alle 4 kweekomstandigheden (controle, TD, MC en MT) vergeleken met verse hartcoupes (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD en D12 MT), van verschillende varkens, 12 (D12 MC) coupes/groep, enkelvoudige ANOVA-test; ####p<0,0001, ###p<0,001 vs. D0, **p<0,01 vs. controle D12). c Staafdiagram toont de kwantificering van de glucosestroom 12 dagen na de kweek in alle 4 kweekomstandigheden (Ctrl, TD, MC en MT) vergeleken met verse hartplakken (D0) (n = 6 plakken/groep van verschillende varkens, er is een enkelvoudige ANOVA-test uitgevoerd; ###p < 0,001, vergeleken met D0 en ***p < 0,001 vergeleken met D12 Ctrl). c Staafdiagram toont de kwantificering van de glucosestroom 12 dagen na de kweek in alle 4 kweekomstandigheden (Ctrl, TD, MC en MT) vergeleken met verse hartplakken (D0) (n = 6 plakken/groep van verschillende varkens, er is een enkelvoudige ANOVA-test uitgevoerd; ###p < 0,001, vergeleken met D0 en ***p < 0,001 vergeleken met D12 Ctrl). c Гоказывает количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после культивирования in во всех 4 условиях культивирования (контроль, TD, MC en MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 6 срезов/группу van разных свиней, односторонний Bekijk ANOVA; ###p < 0,001 via D0 en ***p < 0,001 via D12 Ctrl). c Histogram toont de kwantificering van de glucosestroom 12 dagen na de kweek onder alle 4 kweekomstandigheden (controle, TD, MC en MT) vergeleken met verse hartsecties (D0) (n = 6 secties/groep van verschillende varkens, enkelvoudige ANOVA-test uitgevoerd; ###p < 0,001 vergeleken met D0 en ***p < 0,001 vergeleken met D12 Ctrl). c 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) 相比，培养后12天的葡萄糖通量定量（n = 6 片/组，来自不同猪，单向执行ANOVA 测试；###p < 0,001，与D0相比，***p < 0,001 与D12 Ctrl 相比）。 C 条形图 显示 所有 4 种 条件 (（ctrl 、 td 、 mc 和 mt) 新鲜 心脏 切片 切片 切片 相比 ，培养 后 后 12 天 的 通量 定量 （n = 6 片/组 ， 来自 猪 ， ， ， ， ， ， ， ， 猪ANOVA 测试；###p < 0,001，与D0 相比，***p < 0,001 与D12 Ctrl 相比）。 c Het apparaat kan 12 maanden duren культивирования для всех 4 условий культивирования (контроль, TD, MC en MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 6 срезов/группа, van свиней, односторонний Были проведены тесты ANOVA; ###p < 0,001 op basis van D0, ***p < 0,001 op basis van D12 (opname). c Histogram waarin de kwantificering van de glucosestroom op 12 dagen na de kweek voor alle 4 kweekomstandigheden (controle, TD, MC en MT) wordt weergegeven in vergelijking met verse hartcoupes (D0) (n = 6 coupes/groep, van verschillende varkens, unilateraal). Waar ANOVA-tests werden uitgevoerd, ###p < 0,001 in vergelijking met D0, ***p < 0,001 in vergelijking met D12 (controle).d Stamanalyseplots van verse (blauw), dag 12 MC (groen) en dag 12 MT (rood) weefsels op tien regionale weefselsectiepunten (n = 4 slices/groep, enkelvoudige ANOVA-test; er was geen significant verschil tussen de groepen). e Vulkaanplot met differentieel tot expressie gebrachte genen in verse hartcoupes (D0) vergeleken met hartcoupes gekweekt onder statische omstandigheden (Ctrl) of onder MT-omstandigheden (MT) gedurende 10-12 dagen. f Heatmap van sarcomeergenen voor hartcoupes gekweekt onder elk van de kweekomstandigheden. De foutbalken geven het gemiddelde ± standaarddeviatie weer.
Metabole afhankelijkheid van de overstap van vetzuuroxidatie naar glycolyse is een kenmerk van de dedifferentiatie van cardiomyocyten. Onrijpe cardiomyocyten gebruiken voornamelijk glucose voor ATP-productie en hebben hypoplastische mitochondriën met weinig cristae5,32. Analyses van glucosegebruik toonden aan dat het glucosegebruik onder MC- en MT-omstandigheden vergelijkbaar was met dat in weefsels van dag 0 (Figuur 4c). Ctrl-monsters vertoonden echter een significante toename in glucosegebruik vergeleken met vers weefsel. Dit wijst erop dat de combinatie van CTCM en T3/Dex de levensvatbaarheid van weefsel verbetert en het metabole fenotype van 12 dagen gekweekte hartcoupes behoudt. Bovendien toonde stamanalyse aan dat de stamniveaus gedurende 12 dagen onder MT- en MS-omstandigheden hetzelfde bleven als in vers hartweefsel (Figuur 4d).
Om de algehele impact van CTCM en T3/Dex op het globale transcriptionele landschap van hartsliceweefsel te analyseren, hebben we RNAseq uitgevoerd op hartslices uit alle vier de verschillende kweekomstandigheden (aanvullende gegevens 1). Interessant genoeg vertoonden MT-secties een hoge transcriptionele gelijkenis met vers hartweefsel, met slechts 16 differentieel tot expressie gebrachte genen van de 13.642. Zoals we echter eerder aantoonden, vertoonden Ctrl-secties 1229 differentieel tot expressie gebrachte genen na 10-12 dagen kweek (fig. 4e). Deze gegevens werden bevestigd door qRT-PCR van hart- en fibroblastgenen (aanvullende figuren 7a-c). Interessant genoeg vertoonden de Ctrl-secties een downregulatie van hart- en celcyclusgenen en activering van ontstekingsgenprogramma's. Deze gegevens suggereren dat dedifferentiatie, die normaal gesproken optreedt na langdurige kweek, volledig wordt verzwakt onder MT-omstandigheden (aanvullende figuren 8a,b). Zorgvuldige studie van sarcomeergenen toonde aan dat alleen onder MT-omstandigheden de genen die coderen voor het sarcomeer (Fig. 4f) en het ionkanaal (Aanvullende Fig. 9) behouden blijven, waardoor ze beschermd zijn tegen onderdrukking onder Ctrl-, TD- en MC-omstandigheden. Deze gegevens tonen aan dat met een combinatie van mechanische en humorale stimulatie (T3/Dex) het transcriptoom van de hartplakjes na 12 dagen kweek vergelijkbaar kan blijven met dat van verse hartplakjes.
Deze transcriptionele bevindingen worden ondersteund door het feit dat de structurele integriteit van cardiomyocyten in hartcoupes het best bewaard blijft onder MT-omstandigheden gedurende 12 dagen, zoals blijkt uit intacte en gelokaliseerde connexine 43 (Fig. 5a). Bovendien was de fibrose in hartcoupes onder MT-omstandigheden significant verminderd in vergelijking met Ctrl en vergelijkbaar met verse hartcoupes (Fig. 5b). Deze gegevens tonen aan dat de combinatie van mechanische stimulatie en T3/Dex-behandeling de hartstructuur in hartcoupes in kweek effectief behoudt.
a Representatieve immunofluorescentiebeelden van troponine-T (groen), connexine 43 (rood) en DAPI (blauw) in vers geïsoleerde hartcoupes (D0) of gekweekt gedurende 12 dagen in alle vier de hartcoupes-kweekomstandigheden (schaalbalk = 100 µm). ). Kwantificering van de structurele integriteit van het hartweefsel met behulp van kunstmatige intelligentie (n = 7 (D0 en D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC en D12 MT) slices/groepen van verschillende varkens, er wordt een enkelvoudige ANOVA-test uitgevoerd; ####p < 0,0001 vergeleken met D0 en *p < 0,05, of ****p < 0,0001 vergeleken met D12 Ctrl). Kwantificering van de structurele integriteit van het hartweefsel met behulp van kunstmatige intelligentie (n = 7 (D0 en D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC en D12 MT) slices/groepen van verschillende varkens, er wordt een enkelvoudige ANOVA-test uitgevoerd; #### p < 0,0001 vergeleken met D0 en *p < 0,05, of ****p < 0,0001 vergeleken met D12 Ctrl). De beste manier om dit te bereiken is (n = 7 (D0 en D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC en D12 MT) срезов/группу от разных свиней, проведен однофакторный тест ANOVA; #### p < 0,0001 met сравнению с D0 en *p < 0,05 en ****p < 0,0001 met сравнению с D12 Ctrl). Kwantificering van de structurele integriteit van hartweefsel met behulp van kunstmatige intelligentie (n = 7 (D0 en D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC en D12 MT) secties/groep van verschillende varkens, enkelvoudige ANOVA-test uitgevoerd; #### p < 0,0001 vergeleken met D0 en *p < 0,05 of ****p < 0,0001 vergeleken met D12 Ctrl).对不同猪的心脏组织结构完整性（n = 7（D0 和D12 Ctrl）、5（D12 TD、D12 MC 和D12 MT）切片/组）进行人工智能量化，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0,0001 与D0 和*p < 0,05 相比，或****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）。对 不同 猪 的 心脏 结构 完整性 (n = 7 （d0 和 d12 ctrl） （5 （d12 td 、 d12 mc 和 d12 mt） 组） ########## p < 0,0001 与D0 和*p < 0,05 相比，或****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）。Kwantificering van de structurele integriteit van hartweefsel met behulp van kunstmatige intelligentie bij verschillende varkens (n ​​= 7 (D0 en D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC en D12 MT) secties/groep) met een eenrichtings-ANOVA-test;#### p < 0,0001 met сравнению с D0 en *p < 0,05 en ****p < 0,0001 met сравнению с D12 Ctrl). #### p < 0,0001 vergeleken met D0 en *p < 0,05 of ****p < 0,0001 vergeleken met D12 Ctrl). b Representatieve afbeeldingen en kwantificering voor hartplakken gekleurd met Masson's trichroomkleuring (schaalbalk = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD en D12 MC), 9 (D12 MT) plakken/groep van verschillende varkens, eenzijdige ANOVA-test is uitgevoerd; ####p < 0,0001 vergeleken met D0 en ***p < 0,001, of ****p < 0,0001 vergeleken met D12 Ctrl). b Representatieve afbeeldingen en kwantificering voor hartplakken gekleurd met Masson's trichroomkleuring (schaalbalk = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD en D12 MC), 9 (D12 MT) plakken/groep van verschillende varkens, eenzijdige ANOVA-test is uitgevoerd; ####p < 0,0001 vergeleken met D0 en ***p < 0,001, of ****p < 0,0001 vergeleken met D12 Ctrl). b Gebruiks- en onderhoudsproducten voor het kopen van een product красителем Массона (масштабная линейка = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD en D12 MC), 9 (D12 MT) односторонний тест ANOVA ####p < 0,0001 по сравнению с D0 en ***p < 0,001 en ****p < 0,0001 via D12 Ctrl). b Representatieve afbeeldingen en kwantificering van hartsecties gekleurd met Masson's trichroomkleuring (schaalbalk = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD en D12 MC), 9 (D12 MT) secties/groep van verschillende varkens, uitgevoerd met een enkelvoudige ANOVA; ####p < 0,0001 versus D0 en ***p < 0,001 of ****p < 0,0001 versus D12 Ctrl). b Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像和量化（比例尺= 500 µm）（n = 10（D0、D12 Ctrl、D12 TD 和D12 MC），来自不同猪的9 个（D12 MT）切片/组，进行单因素方差分析；####p < 0,0001与D0 相比，***p < 0,001，或****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）。 b 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 和 量化 （比例 尺 尺 尺 = 500 µm） (n = 10 （d0 、 d12 ctrl 、 d12 td 和 d12 mc） 来自 不同 的 9 个 d12 mt 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切foto切foto ####p < 0,0001与D0 相比，***p < 0,001，或****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）。 b Gebruiks- en onderhoudsproducten voor het kopen van een product Массона (масштабная линейка = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD en D12 MC), 9 (D12 MT) met свиней / группы, один-способ ANOVA; ####p < 0,0001 met D0, ***p < 0,001 en ****p < 0,0001 met D12 Ctrl). b Representatieve afbeeldingen en kwantificering van hartcoupes gekleurd met Masson's trichroom (schaalbalk = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD en D12 MC), 9 (D12 MT) coupes van verschillende varkens/groepen, één ANOVA-methode; ####p < 0,0001 vergeleken met D0, ***p < 0,001 of ****p < 0,0001 vergeleken met D12 Ctrl).De foutbalken geven het gemiddelde ± de standaarddeviatie weer.
Ten slotte werd het vermogen van CTCM om cardiale hypertrofie na te bootsen beoordeeld door de rek van het hartweefsel te verhogen. Bij CTCM nam de piekdruk in de luchtkamer toe van 80 mmHg tot 80 mmHg. Art. (normale rek) tot 140 mmHg Art. (Fig. 6a). Dit komt overeen met een toename van 32% in rek (Fig. 6b), wat eerder werd getoond als het corresponderende percentage rek dat nodig is voor hartsecties om een ​​sarcomeerlengte te bereiken die vergelijkbaar is met die gezien bij hypertrofie. Rek en snelheid van hartweefsel tijdens contractie en relaxatie bleven constant gedurende zes dagen kweek (Fig. 6c). Hartweefsel uit MT-omstandigheden werd gedurende zes dagen onderworpen aan normale rek (MT (Normaal)) of overrek (MT (OS)). Al na vier dagen kweek was de hypertrofische biomarker NT-ProBNP significant verhoogd in het medium onder MT (OS) omstandigheden in vergelijking met MT (normale) omstandigheden (Fig. 7a). Bovendien nam de celgrootte in MT (OS) (Fig. 7b) na zes dagen kweken significant toe in vergelijking met coupes van MT-hart (normaal). Bovendien was de nucleaire translocatie van NFATC4 significant verhoogd in overrekt weefsel (Fig. 7c). Deze resultaten tonen de progressieve ontwikkeling van pathologische remodellering na hyperdistensie en ondersteunen het concept dat het CTCM-apparaat kan worden gebruikt als platform voor het bestuderen van rek-geïnduceerde cardiale hypertrofiesignalering.
Representatieve sporen van luchtkamerdruk, vloeistofkamerdruk en weefselbewegingsmetingen bevestigen dat de kamerdruk de vloeistofkamerdruk verandert, wat een overeenkomstige beweging van de weefselplak veroorzaakt. b Representatieve rekpercentage- en reksnelheidscurven voor normaal uitgerekte (oranje) en overgerekte (blauw) weefselsecties. c Staafdiagram met cyclustijd (n = 19 slices per groep, van verschillende varkens), contractietijd (n = 18-19 slices per groep, van verschillende varkens), relaxatietijd (n = 19 slices per groep, van verschillende varkens), amplitude van weefselbeweging (n = 14 slices/groep, van verschillende varkens), pieksystolische snelheid (n = 14 slices/groep, van verschillende varkens) en piekrelaxatiesnelheid (n = 14 (D0), 15 (D6) ) coupes/groepen) van verschillende varkens), tweezijdige Student's t-toets toonde geen significant verschil in enige parameter, wat aangeeft dat deze parameters constant bleven gedurende 6 dagen cultuur met overspanning. Foutbalken geven het gemiddelde ± standaarddeviatie weer.
a Kwantificering van de NT-ProBNP-concentratie in kweekmedia met behulp van een staafdiagram van hartplakken gekweekt onder MT-normale rek- (norm) of overstrek- (OS) omstandigheden (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm en D4 MTOS) plakken/groep van verschillende varkens. Er is een tweeweg-ANOVA uitgevoerd; **p < 0,01 vergeleken met normale rek). a Kwantificering van de NT-ProBNP-concentratie in kweekmedia met behulp van een staafdiagram van hartplakken gekweekt onder MT-normale rek- (norm) of overstrek- (OS) omstandigheden (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm en D4 MTOS) plakken/groep van verschillende varkens. Er is een tweeweg-ANOVA uitgevoerd; **p < 0,01 vergeleken met normale rek).Kwantitatief histogram van de NT-ProBNP-concentratie in kweekmedium uit hartplakken gekweekt onder omstandigheden van normale MT-rek (norm) of overrek (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm en D4).MTOS) plakken/groep van verschillende varkens, er is een tweefactorvariantieanalyse uitgevoerd;**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p < 0,01 vergeleken met normale rek). a 在MT 正常拉伸(Norm) 或过度拉伸(OS) 条件下培养的心脏切片培养基中NT-ProBNP浓度的条形图量化（n = 4 (D2 MTNorm)、3（D2 MTOS、D4 MTNorm 和D4 MTOS) een kwantificering van de NT-ProBNP-concentratie in hartplakken gekweekt onder MT-normale rek (Norm) of overrek (OS) omstandigheden (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm和D4 MTOS) van verschillende 猪的切片/组，可以双向方方发发动; **vergeleken met normaal strekken, p < 0,01).histogram Kwantificering van NT-ProBNP-concentraties in hartplakken gekweekt onder omstandigheden van normale MT-rek (norm) of overrek (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm) en D4 MTOS) plakken/groep van verschillende varkens, tweeweg-variantieanalyse;**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p < 0,01 vergeleken met normale rek). b Representatieve afbeeldingen van hartplakken gekleurd met troponine-T en WGA (links) en kwantificering van celgrootte (rechts) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) cellen/groep uit 10 verschillende plakken van verschillende varkens, er is een tweezijdige Student t-test uitgevoerd; ****p < 0,0001 vergeleken met normale rek). b Representatieve afbeeldingen van hartplakken gekleurd met troponine-T en WGA (links) en kwantificering van celgrootte (rechts) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) cellen/groep uit 10 verschillende plakken van verschillende varkens, er is een tweezijdige Student t-test uitgevoerd; ****p < 0,0001 vergeleken met normale rek). b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т en АЗП (слева) en количественного определения размера клеток (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) клеток/группу of 10 разных срезов от разных свиней, два- проводится хвостовой t-критерий Стьюдента ****p < 0,0001 по сравнению с нормальным растяжением). b Representatieve afbeeldingen van hartsecties gekleurd met troponine-T en AZP (links) en kwantificering van de celgrootte (rechts) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) cellen/groep uit 10 verschillende secties van verschillende varkens, er werd een tweezijdige t-toets van Student uitgevoerd; ****p < 0,0001 vergeleken met normale stam). b 用肌钙蛋白-T 和WGA（左）和细胞大小量化（右）染色的心脏切片的代表性图像（n = 330（D6 MTOS），来自不同猪的10 个不同切片的369（D6 MTNorm）细胞/组，两进行有尾学生t 检验；与正常拉伸相比，****p < 0,0001）。 b Representatieve afbeeldingen van hartplakken gekleurd met calcareïne-T en WGA (links) en celgrootte (rechts) (n = 330 (D6 MTOS), 369 van 10 verschillende plakken (D6 MTNorm)) Cellen/celtype, vergeleken met normale rek, ****p < 0,0001). b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т en АЗП (слева) en количественная оценка размера клеток (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) of 10 instellingen voor het instellen van de instellingen критерий Стьюдента; ****p < 0,0001 по сравнению с нормальным (onduidelijk, mogelijk een fout) b Representatieve afbeeldingen van hartsecties gekleurd met troponine-T en AZP (links) en kwantificering van celgrootte (rechts) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) uit 10 verschillende secties van verschillende varkens) Cellen/groep, tweezijdig criterium Student's t; ****p < 0,0001 vergeleken met normale stam). c Representatieve afbeeldingen voor dag 0 en dag 6 MTOS-hartplakken die zijn geïmmunolabeld voor troponine-T en NFATC4 en kwantificering van de translocatie van NFATC4 naar de kernen van CM's (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) plakken/groep van verschillende varkens, er is een tweezijdige Student t-test uitgevoerd; *p < 0,05). c Representatieve beelden voor dag 0 en dag 6 MTOS-hartplakken die zijn geïmmunolabeld voor troponine-T en NFATC4 en kwantificering van de translocatie van NFATC4 naar de kernen van CM's (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) plakken/groep van verschillende varkens, er is een tweezijdige Student t-test uitgevoerd; *p < 0,05). c Meer informatie over 0 en 6 MTOS, of meer тропонина-Т en NFATC4, en количественная оценка транслокации NFATC4 in ядра кавернозных клеток (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срезов/группу от разных свиней , выполняется двусторонний t-критерий Стьюдента *p < 0,05). c Representatieve beelden van hartsecties op dag 0 en 6 MTOS, immunogelabeld voor troponine-T en NFATC4, en kwantificering van NFATC4-translocatie in de kern van caverneuze cellen (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) plakjes/groep van verschillende varkens) uitgevoerd met een tweezijdige t-toets van Student; *p < 0,05). c 用于肌钙蛋白-T 和NFATC4 免疫标记的第0 天和第6 天MTOS NFATC4 易位至CM 细胞核的量化（n = 4 (D0)、3 (D6 MTOS)切片/组, 进行双尾学生t 检验；*p < 0,05)。 c Representatieve afbeeldingen van calcanine-T en NFATC4 immunolabeling 第0天和第6天MTOS hartplakken, en NFATC4 van verschillende NFATC4 易位至CM celkern的kwantiteit化 (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) 切礼/组,时间双尾学生et 电影;*p < 0,05). c Meer informatie over MTOS op 0 en 6 niveaus en NFATC4 en количественная оценка транслокации NFATC4 in ядра CM от разных свиней (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срез/группа, два- хвостатый t-критерий Стьюдента; *p < 0,05). c Representatieve afbeeldingen van MTOS-hartplakken op dag 0 en 6 voor troponine-T- en NFATC4-immunolabeling en kwantificering van NFATC4-translocatie in de kern van CM van verschillende varkens (n ​​= 4 (D0), 3 (D6 MTOS) plakken/groep, tweezijdig t-criterium Student; *p < 0,05).De foutbalken geven het gemiddelde ± de standaarddeviatie weer.
Translationeel cardiovasculair onderzoek vereist celmodellen die de cardiale omgeving nauwkeurig reproduceren. In deze studie werd een CTCM-apparaat ontwikkeld en gekarakteriseerd dat ultradunne delen van het hart kan stimuleren. Het CTCM-systeem omvat fysiologisch gesynchroniseerde elektromechanische stimulatie en verrijking met T3- en Dex-vloeistof. Wanneer varkenshartdelen aan deze factoren werden blootgesteld, bleven hun levensvatbaarheid, structurele integriteit, metabole activiteit en transcriptionele expressie na 12 dagen kweek gelijk aan die in vers hartweefsel. Bovendien kan overmatige uitrekking van hartweefsel hypertrofie van het hart veroorzaken, veroorzaakt door hyperextensie. Al met al ondersteunen deze resultaten de cruciale rol van fysiologische kweekomstandigheden bij het handhaven van een normaal hartfenotype en bieden ze een platform voor geneesmiddelenscreening.
Veel factoren dragen bij aan het creëren van een optimale omgeving voor het functioneren en overleven van cardiomyocyten. De meest voor de hand liggende factoren houden verband met (1) intercellulaire interacties, (2) elektromechanische stimulatie, (3) humorale factoren en (4) metabole substraten. Fysiologische cel-tot-celinteracties vereisen complexe driedimensionale netwerken van meerdere celtypen, ondersteund door een extracellulaire matrix. Zulke complexe cellulaire interacties zijn moeilijk in vitro te reconstrueren door co-cultuur van individuele celtypen, maar kunnen eenvoudig worden bereikt dankzij de organotypische aard van hartsecties.
Mechanische rek en elektrische stimulatie van cardiomyocyten zijn cruciaal voor het behoud van het hartfenotype33,34,35. Hoewel mechanische stimulatie veelvuldig is gebruikt voor de conditionering en rijping van hiPSC-CM, hebben verschillende elegante studies recentelijk geprobeerd om hartcoupes mechanisch te stimuleren in kweek met behulp van uniaxiale belasting. Deze studies tonen aan dat 2D uniaxiale mechanische belasting een positief effect heeft op het fenotype van het hart tijdens de kweek. In deze studies werden hartsecties belast met isometrische trekkrachten17, lineaire auxotone belasting18, of werd de hartcyclus gereconstrueerd met behulp van krachttransducerfeedback en spanningsaandrijvingen. Deze methoden maken echter gebruik van uniaxiale weefselrek zonder omgevingsoptimalisatie, wat resulteert in de onderdrukking van veel hartgenen of overexpressie van genen die geassocieerd worden met abnormale rekreacties. De hier beschreven CTCM biedt een 3D elektromechanische stimulus die de natuurlijke hartcyclus nabootst in termen van cyclustijd en fysiologische rek (25% rek, 40% systole, 60% diastole en 72 slagen per minuut). Hoewel deze driedimensionale mechanische stimulatie op zichzelf niet voldoende is om de integriteit van het weefsel te behouden, is een combinatie van humorale en mechanische stimulatie met behulp van T3/Dex vereist om de levensvatbaarheid, functie en integriteit van het weefsel adequaat te behouden.
Humorale factoren spelen een belangrijke rol bij het moduleren van het fenotype van het volwassen hart. Dit werd benadrukt in HiPS-CM-studies waarin T3 en Dex aan kweekmedia werden toegevoegd om celrijping te versnellen. T3 kan het transport van aminozuren, suikers en calcium door celmembranen beïnvloeden36. Bovendien bevordert T3 de expressie van MHC-α en de downregulatie van MHC-β, wat de vorming van snelle myofibrillen in volwassen cardiomyocyten bevordert in vergelijking met langzame myofibrillen in foetale CM. T3-deficiëntie bij hypothyreoïde patiënten resulteert in het verlies van myofibrillaire banden en een verminderde snelheid van tonusontwikkeling37. Dex werkt in op glucocorticoïdereceptoren en is aangetoond dat het de myocardiale contractiliteit verhoogt in geïsoleerde, doorbloede harten; 38 deze verbetering wordt vermoedelijk gerelateerd aan het effect op calciumdepositie-gedreven toegang (SOCE)39,40. Bovendien bindt Dex zich aan zijn receptoren, wat een brede intracellulaire respons veroorzaakt die de immuunfunctie en ontstekingen onderdrukt30.
Onze resultaten geven aan dat fysisch-mechanische stimulatie (MS) de algehele kweekprestaties verbeterde in vergelijking met Ctrl, maar er niet in slaagde de levensvatbaarheid, structurele integriteit en cardiale expressie gedurende 12 dagen in kweek te behouden. Vergeleken met Ctrl verbeterde de toevoeging van T3 en Dex aan CTCM (MT)-kweken de levensvatbaarheid en handhaafden ze vergelijkbare transcriptieprofielen, structurele integriteit en metabole activiteit met vers hartweefsel gedurende 12 dagen. Bovendien werd, door de mate van weefselrek te controleren, een hyperextensie-geïnduceerd cardiale hypertrofiemodel gecreëerd met behulp van STCM, wat de veelzijdigheid van het STCM-systeem illustreert. Opgemerkt moet worden dat hoewel cardiale remodellering en fibrose meestal intacte organen betreffen waarvan de circulerende cellen de juiste cytokines, fagocytose en andere remodelleringsfactoren kunnen leveren, delen van het hart nog steeds het fibrotische proces kunnen nabootsen als reactie op stress en trauma. in myofibroblasten. Dit is eerder geëvalueerd in dit cardiale slice-model. Opgemerkt dient te worden dat CTCM-parameters kunnen worden gemoduleerd door de druk/elektrische amplitude en frequentie te wijzigen om vele aandoeningen te simuleren, zoals tachycardie, bradycardie en mechanische circulatieondersteuning (mechanisch onbelast hart). Dit maakt het systeem geschikt voor een gemiddelde doorvoersnelheid voor medicijntesten. Het vermogen van CTCM om door overbelasting geïnduceerde cardiale hypertrofie te modelleren, maakt de weg vrij voor het testen van dit systeem voor gepersonaliseerde therapie. Concluderend toont de huidige studie aan dat mechanische rek en humorale stimulatie cruciaal zijn voor het in stand houden van de kweek van hartweefselcoupes.
Hoewel de hier gepresenteerde gegevens suggereren dat CTCM een veelbelovend platform is voor het modelleren van intact myocard, kent deze kweekmethode enkele beperkingen. De belangrijkste beperking van CTCM-kweek is dat het continue dynamische mechanische spanningen op de coupes uitoefent, waardoor het niet mogelijk is om de contracties van de hartcoupes tijdens elke cyclus actief te monitoren. Bovendien is de mogelijkheid om de systolische functie buiten kweeksystemen met behulp van traditionele krachtsensoren te evalueren, vanwege de kleine omvang van de hartcoupes (7 mm), beperkt. In het huidige manuscript ondervangen we deze beperking gedeeltelijk door optische spanning te evalueren als indicator van de contractiele functie. Deze beperking vereist echter verder onderzoek en kan in de toekomst worden aangepakt door methoden te introduceren voor optische monitoring van de functie van hartcoupes in kweek, zoals optische mapping met calcium en spanningsgevoelige kleurstoffen. Een andere beperking van CTCM is dat het werkmodel de fysiologische stress (voorbelasting en nabelasting) niet manipuleert. Bij CTCM werd druk in tegengestelde richtingen geïnduceerd om 25% fysiologische rek te reproduceren in diastole (volledige rek) en systole (contractieduur tijdens elektrische stimulatie) in zeer grote weefsels. Deze beperking zou in toekomstige CTCM-ontwerpen moeten worden weggenomen door adequate druk op het hartweefsel van beide kanten en door de exacte druk-volumeverhoudingen toe te passen die in de hartkamers voorkomen.
De door overstrekking geïnduceerde remodellering die in dit manuscript wordt beschreven, beperkt zich tot het nabootsen van hypertrofische hyperstrekkingssignalen. Dit model kan dus helpen bij het bestuderen van door strekking geïnduceerde hypertrofische signalering zonder de noodzaak van humorale of neurale factoren (die in dit systeem niet voorkomen). Verder onderzoek is nodig om de multipliciteit van CTCM te vergroten. Co-kweek met immuuncellen, circulerende plasmahumorale factoren en innervatie, bijvoorbeeld, zal de mogelijkheden voor ziektemodellering met CTCM verbeteren.
Dertien varkens werden in deze studie gebruikt. Alle dierproeven werden uitgevoerd volgens de institutionele richtlijnen en goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee van de Universiteit van Louisville. De aortaboog werd afgeklemd en het hart werd geperfuseerd met 1 liter steriele cardioplegie (110 mM NaCl, 1,2 mM CaCl2, 16 mM KCl, 16 mM MgCl2, 10 mM NaHCO3, 5 U/ml heparine, pH tot 7,4); De harten werden bewaard in ijskoude cardioplegische oplossing totdat ze op ijs naar het laboratorium werden vervoerd, wat gewoonlijk <10 min. duurt. De harten werden bewaard in ijskoude cardioplegische oplossing totdat ze op ijs naar het laboratorium werden vervoerd, wat gewoonlijk <10 min. duurt. als u een creditcard wilt kopen, что обычно занимает <10 мин. De harten werden bewaard in ijskoude cardioplegische oplossing totdat ze op ijs naar het laboratorium werden vervoerd, wat normaal gesproken <10 min. duurt.将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中,直到冰上运送到实验室,通常<10分钟。将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中,直到冰上运送到实验室,通常<10分钟。 Zorg ervoor dat u een creditcard heeft die op een lager niveau ligt dan <10 мин. Houd het hart op ijs voor cardioplegie tot transport naar het laboratorium op ijs, meestal <10 min.
Het CTCM-apparaat is ontwikkeld met SolidWorks computer-aided design (CAD) software. De kweekkamers, verdelers en luchtkamers zijn gemaakt van CNC-gestuurd, helder acrylplastic. De back-up ring met een diameter van 7 mm is in het midden gemaakt van hogedichtheidspolyethyleen (HDPE) en heeft een groef voor een o-ring, geschikt voor de siliconen o-ring die de onderliggende media afdicht. Een dun silicamembraan scheidt de kweekkamer van de scheidingsplaat. Het siliconenmembraan is lasergesneden uit een siliconenplaat van 0,02 inch dik en heeft een hardheid van 35A. De siliconen pakkingen aan de onder- en bovenkant zijn lasergesneden uit een siliconenplaat van 1/16 inch dik en hebben een hardheid van 50A. Schroeven en vleugelmoeren van roestvrij staal 316L worden gebruikt om het blok te bevestigen en een luchtdichte afsluiting te creëren.
Een speciale printplaat (PCB) is ontworpen om te worden geïntegreerd met het C-PACE-EM-systeem. De connectoren van de Zwitserse machine op de printplaat zijn verbonden met grafietelektroden via verzilverde koperdraden en bronzen 0-60 schroeven die in de elektroden zijn geschroefd. De printplaat wordt in de behuizing van de 3D-printer geplaatst.
Het CTCM-apparaat wordt aangestuurd door een programmeerbare pneumatische actuator (PPD) die een gecontroleerde circulatiedruk creëert, vergelijkbaar met een hartcyclus. Naarmate de druk in de luchtkamer toeneemt, zet het flexibele siliconenmembraan omhoog uit, waardoor het medium onder het weefsel wordt gedrukt. Het weefselgebied wordt vervolgens uitgerekt door deze uitstoting van vloeistof, wat de fysiologische uitzetting van het hart tijdens de diastole nabootst. Op het hoogtepunt van ontspanning werd elektrische stimulatie toegepast via grafietelektroden, waardoor de druk in de luchtkamer werd verlaagd en de weefselcoupes samentrokken. In de buis bevindt zich een hemostaseklep met een druksensor om de druk in het luchtsysteem te detecteren. De door de druksensor gemeten druk wordt toegepast op een datacollector die is aangesloten op de laptop. Dit maakt continue bewaking van de druk in de gaskamer mogelijk. Wanneer de maximale kamerdruk was bereikt (standaard 80 mmHg, 140 mmHg OS), werd het data-acquisitieapparaat opgedragen een signaal te sturen naar het C-PACE-EM-systeem om gedurende 2 ms een bifasisch spanningssignaal te genereren, ingesteld op 4 V.
Hartsecties werden verkregen en de kweekomstandigheden in 6 putjes werden als volgt uitgevoerd: Breng de geoogste harten over van het overdrachtsvat naar een schaal met koude (4 ° C) cardioplegie. De linker ventrikel werd geïsoleerd met een steriel mes en in stukken van 1-2 cm3 gesneden. Deze weefselblokken werden met weefsellijm aan weefselsteunen bevestigd en in een trillend microtoomweefselbad geplaatst met Tyrode's oplossing en continu geoxygeneerd (3 g/L 2,3-butaandionmonooxim (BDM), 140 mM NaCl (8,18 g). , 6 mM KCl (0,447 g), 10 mM D-glucose (1,86 g), 10 mM HEPES (2,38 g), 1 mM MgCl2 (1 ml 1 M oplossing), 1,8 mM CaCl2 (1,8 ml 1 M oplossing), tot 1 L ddH2O). De vibrerende microtoom werd ingesteld om plakjes van 300 µm dik te snijden met een frequentie van 80 Hz, een horizontale vibratieamplitude van 2 mm en een voortbewegingssnelheid van 0,03 mm/s. Het weefselbad was omgeven door ijs om de oplossing koel te houden en de temperatuur werd gehandhaafd op 4 °C. Breng weefselcoupes over van het microtoombad naar een incubatiebad met continu geoxygeneerde Tyrode-oplossing op ijs totdat er voldoende coupes zijn verkregen voor één kweekplaat. Voor transwell-culturen werden weefselcoupes bevestigd aan steriele polyurethaandragers van 6 mm breed en geplaatst in 6 ml geoptimaliseerd medium (199 medium, 1x ITS-supplement, 10% FBS, 5 ng/ml VEGF, 10 ng/ml FGF-alkalisch en 2x antibioticum-antischimmelmiddel). Elektrische stimulatie (10 V, frequentie 1,2 Hz) werd via de C-Pace op de weefselcoupes toegepast. Voor TD-omstandigheden werden bij elke mediumwisseling verse T3 en Dex toegevoegd in een concentratie van 100 nM en 1 μM. Het medium wordt driemaal daags verzadigd met zuurstof voordat het wordt vervangen. De weefselcoupes werden gekweekt in een incubator bij 37 °C en 5% CO2.
Voor CTCM-kweken werden weefselcoupes geplaatst op een speciaal gemaakte 3D-printer in een petrischaal met gemodificeerde Tyrode-oplossing. Het apparaat is ontworpen om de grootte van de hartplak met 25% van het oppervlak van de steunring te vergroten. Dit wordt gedaan om te voorkomen dat de hartcoupes uitrekken na het overbrengen van de Tyrode-oplossing naar het medium en tijdens de diastole. Met histoacryllijm werden coupes van 300 µm dik gefixeerd op een steunring met een diameter van 7 mm. Nadat de weefselcoupes aan de steunring zijn bevestigd, worden de overtollige weefselcoupes afgesneden en worden de aangehechte weefselcoupes teruggeplaatst in het bad met Tyrode-oplossing op ijs (4 °C) totdat er voldoende coupes zijn geprepareerd voor één apparaat. De totale verwerkingstijd voor alle apparaten mag niet langer zijn dan 2 uur. Nadat 6 weefselcoupes aan hun steunringen waren bevestigd, werd het CTCM-apparaat in elkaar gezet. De CTCM-kweekkamer is gevuld met 21 ml voorgeoxygeneerd medium. Breng de weefselcoupes over naar de kweekkamer en verwijder voorzichtig eventuele luchtbellen met een pipet. De weefselsectie wordt vervolgens in het gat geleid en voorzichtig op zijn plaats gedrukt. Plaats ten slotte de elektrodekap op het apparaat en breng het apparaat over naar de incubator. Sluit vervolgens de CTCM aan op de luchtslang en het C-PACE-EM-systeem. De pneumatische actuator opent en de luchtklep opent de CTCM. Het C-PACE-EM-systeem is geconfigureerd om 4 V bij 1,2 Hz te leveren tijdens bifasische pacing gedurende 2 ms. Het medium werd tweemaal per dag vervangen en de elektroden werden eenmaal per dag vervangen om ophoping van grafiet op de elektroden te voorkomen. Indien nodig kunnen weefselsecties uit hun kweekputjes worden verwijderd om eventuele luchtbellen te verwijderen. Voor MT-behandelingsomstandigheden werd bij elke mediumwisseling vers T3/Dex toegevoegd, met 100 nM T3 en 1 μM Dex. De CTCM-apparaten werden gekweekt in een incubator bij 37 °C en 5% CO2.
Om uitgerekte trajecten van hartplakken te verkrijgen, werd een speciaal camerasysteem ontwikkeld. Een spiegelreflexcamera (Canon Rebel T7i, Canon, Tokio, Japan) werd gebruikt met een Navitar Zoom 7000 18-108mm macrolens (Navitar, San Francisco, CA). De visualisatie werd uitgevoerd bij kamertemperatuur nadat het medium was vervangen door nieuw medium. De camera werd gepositioneerd onder een hoek van 51° en de video werd opgenomen met 30 frames per seconde. Eerst werd opensourcesoftware (MUSCLEMOTION43) gebruikt met Image-J om de beweging van de hartplakken te kwantificeren. Het masker werd gemaakt met MATLAB (MathWorks, Natick, MA, VS) om interessegebieden voor kloppende hartplakken te definiëren om ruis te voorkomen. Handmatig gesegmenteerde maskers werden toegepast op alle beelden in een framereeks en vervolgens doorgegeven aan de MUSCLEMOTION-plug-in. Muscle Motion gebruikt de gemiddelde intensiteit van de pixels in elk frame om de beweging ten opzichte van het referentieframe te kwantificeren. De gegevens werden geregistreerd, gefilterd en gebruikt om de cyclustijd te kwantificeren en de weefselrek tijdens de hartcyclus te beoordelen. De opgenomen video werd nabewerkt met een eerste-orde nulfase digitaal filter. Om de weefselrek (piek-tot-piek) te kwantificeren, werd een piek-tot-piekanalyse uitgevoerd om onderscheid te maken tussen pieken en dalen in het opgenomen signaal. Daarnaast werd detrending uitgevoerd met behulp van een 6e-orde polynoom om signaaldrift te elimineren. Er werd een programmacode ontwikkeld in MATLAB om de globale weefselbeweging, cyclustijd, relaxatietijd en contractietijd te bepalen (aanvullende programmacode 44).
Voor de rekanalyse hebben we, met behulp van dezelfde video's die we voor de beoordeling van mechanische rek hebben gemaakt, eerst twee afbeeldingen van bewegingspieken (het hoogste (bovenste) en laagste (onderste) bewegingspunt) getraceerd met behulp van de MUSCLEMOTION-software. Vervolgens hebben we de weefselgebieden gesegmenteerd en een schaduwalgoritme toegepast op het gesegmenteerde weefsel (aanvullende figuur 2a). Het gesegmenteerde weefsel werd vervolgens verdeeld in tien suboppervlakken en de spanning op elk oppervlak werd berekend met de volgende vergelijking: Rek = (Sup-Sdown)/Sdown, waarbij Sup en Sdown respectievelijk de afstand van de vorm tot de bovenste en onderste schaduw van de stof zijn (aanvullende figuur 2b).
Hartcoupes werden 48 uur gefixeerd in 4% paraformaldehyde. De gefixeerde weefsels werden 1 uur gedehydrateerd in 10% en 20% sucrose, vervolgens een nacht in 30% sucrose. De coupes werden vervolgens ingebed in een mengsel met optimale snijtemperatuur (OCT-compound) en geleidelijk ingevroren in een isopentaan/droogijsbad. Bewaar de OCT-inbeddingsblokken bij -80 °C tot ze gescheiden werden. De preparaten werden geprepareerd als coupes met een dikte van 8 μm.
Om OCT uit hartcoupes te verwijderen, verwarmt u de coupes 5 minuten op een verwarmingsblok bij 95 °C. Voeg 1 ml PBS toe aan elk glaasje en incubeer 30 minuten bij kamertemperatuur. Permeëer de coupes vervolgens door 0,1% Triton-X in PBS te zetten gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Om te voorkomen dat niet-specifieke antilichamen zich aan het monster binden, voegt u 1 ml 3% BSA-oplossing toe aan de coupes en incubeert u 1 uur bij kamertemperatuur. Verwijder vervolgens het BSA en spoel de coupes met PBS. Markeer elk monster met een potlood. Primaire antilichamen (verdund 1:200 in 1% BSA) (connexine 43 (Abcam; #AB11370), NFATC4 (Abcam; #AB99431) en troponine-T (Thermo Scientific; #MA5-12960) werden toegevoegd gedurende 90 minuten, vervolgens secundaire antilichamen (verdund 1:200 in 1% BSA) tegen muis Alexa Fluor 488 (Thermo Scientific; #A16079), tegen konijn Alexa Fluor 594 (Thermo Scientific; #T6391) gedurende nog eens 90 minuten. 3 keer gewassen met PBS Om doelkleuring te onderscheiden van achtergrond, gebruikten we alleen het secundaire antilichaam als controle. Ten slotte werd DAPI nucleaire kleuring toegevoegd en werden de objectglaasjes geplaatst in een vectashield (Vector Laboratories) en afgesloten met nagellak. -x vergroting) en Keyence-microscoop met 40x vergroting.
WGA-Alexa Fluor 555 (Thermo Scientific; #W32464) met 5 μg/ml in PBS werd gebruikt voor WGA-kleuring en gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur op gefixeerde coupes aangebracht. De objectglaasjes werden vervolgens gewassen met PBS en aan elk objectglaasje werd Sudan Black toegevoegd. De objectglaasjes werden vervolgens gewassen met PBS en vectashield-inbeddingsmedium toegevoegd. De objectglaasjes werden gevisualiseerd op een Keyence-microscoop met een vergroting van 40x.
OCT werd uit de monsters verwijderd zoals hierboven beschreven. Na het verwijderen van de OCT werden de objectglaasjes een nacht ondergedompeld in Bouin's oplossing. De objectglaasjes werden vervolgens 1 uur gespoeld met gedestilleerd water en vervolgens 10 minuten in een Bibrich aloëzuurfuchsineoplossing geplaatst. Vervolgens werden de objectglaasjes gewassen met gedestilleerd water en 10 minuten in een oplossing van 5% fosfomolybdeen/5% fosfowolfraamzuur geplaatst. Zonder te spoelen werden de objectglaasjes direct in de anilineblauwoplossing geplaatst gedurende 15 minuten. Vervolgens werden de objectglaasjes gewassen met gedestilleerd water en 2 minuten in een 1% azijnzuuroplossing geplaatst. De objectglaasjes werden gedroogd in 200 N ethanol en overgebracht naar xyleen. De gekleurde objectglaasjes werden gevisualiseerd met een Keyence-microscoop met een 10x objectief. Het percentage fibrose-oppervlakte werd gekwantificeerd met behulp van de Keyence Analyzer-software.
CyQUANT™ MTT Cell Viability Assay (Invitrogen, Carlsbad, CA), catalogusnummer V13154, volgens het protocol van de fabrikant met enkele aanpassingen. In het bijzonder werd een chirurgische punch met een diameter van 6 mm gebruikt om een ​​uniforme weefselgrootte te garanderen tijdens de MTT-analyse. Weefsels werden individueel uitgeplaat in de wells van een 12-wells plaat met MTT-substraat volgens het protocol van de fabrikant. De coupes worden gedurende 3 uur geïncubeerd bij 37 °C en het levende weefsel metaboliseert het MTT-substraat tot een paarse formazanverbinding. Vervang de MTT-oplossing door 1 ml DMSO en incubeer gedurende 15 minuten bij 37 °C om paarse formazan uit de hartcoupes te extraheren. Monsters werden 1:10 verdund in DMSO in 96-wells platen met een heldere bodem en de paarse kleurintensiteit werd gemeten bij 570 nm met behulp van een Cytation Plate Reader (BioTek). De waarden werden genormaliseerd naar het gewicht van elke hartcoupe.
Het medium van de hartslice werd vervangen door medium met 1 μCi/ml [5-3H]-glucose (Moravek Biochemicals, Brea, CA, VS) voor de glucosegebruikstest zoals eerder beschreven. Voeg na 4 uur incubatie 100 µl medium toe aan een open microcentrifugebuis met 100 µl 0,2 N HCl. Plaats de buis vervolgens in een scintillatiebuis met 500 µl dH₂O om [3H]₂O gedurende 72 uur bij 37 °C te verdampen. Verwijder vervolgens de microcentrifugebuis uit de scintillatiebuis en voeg 10 ml scintillatievloeistof toe. Scintillatietellingen werden uitgevoerd met een Tri-Carb 2900TR vloeistofscintillatieanalysator (Packard Bioscience Company, Meriden, CT, VS). Het glucosegebruik werd vervolgens berekend rekening houdend met de specifieke activiteit van [5-3H]-glucose, onvolledig evenwicht en achtergrond, verdunning van [5-3H]-glucose tot ongemerkte glucose en de efficiëntie van de scintillatieteller. De gegevens zijn genormaliseerd naar de massa van de hartsecties.
Na weefselhomogenisatie in Trizol werd RNA geïsoleerd uit hartsecties met behulp van de Qiagen miRNeasy Micro Kit #210874 volgens het protocol van de fabrikant. De voorbereiding, sequentiebepaling en data-analyse van de RNAsec-bibliotheek werden als volgt uitgevoerd:
1 μg RNA per monster werd gebruikt als uitgangsmateriaal voor de bereiding van de RNA-bibliotheek. Sequentiebibliotheken werden gegenereerd met behulp van de NEBNext UltraTM RNA Library Preparation Kit voor Illumina (NEB, VS) volgens de aanbevelingen van de fabrikant, en indexcodes werden toegevoegd aan de attribuutsequenties voor elk monster. Kort gezegd werd mRNA gezuiverd uit totaal RNA met behulp van magnetische kralen, verbonden met poly-T-oligonucleotiden. Fragmentatie wordt uitgevoerd met behulp van divalente kationen bij hoge temperatuur in NEBNext First Strand Synthesis Reaction Buffer (5X). De eerste streng cDNA werd gesynthetiseerd met behulp van willekeurige hexameerprimers en M-MuLV reverse transcriptase (RNase H-). De tweede streng cDNA werd vervolgens gesynthetiseerd met behulp van DNA-polymerase I en RNase H. De resterende overhangende delen worden door exonuclease/polymerase-activiteit omgezet in stompe uiteinden. Na adenylatie van het 3'-uiteinde van het DNA-fragment wordt een NEBNext-adapter met een haarspeldlusstructuur eraan bevestigd ter voorbereiding op hybridisatie. Voor de selectie van cDNA-fragmenten met een gewenste lengte van 150-200 bp werden bibliotheekfragmenten gezuiverd met behulp van het AMPure XP-systeem (Beckman Coulter, Beverly, VS). Vervolgens werd 3 μl USER Enzyme (NEB, VS) met op grootte geselecteerd cDNA, geligeerd met een adapter, gedurende 15 minuten bij 37 °C en vervolgens gedurende 5 minuten bij 95 °C gebruikt vóór PCR. PCR werd vervolgens uitgevoerd met Phusion High-Fidelity DNA-polymerase, universele PCR-primers en Index (X)-primers. Tot slot werden PCR-producten gezuiverd (AMPure XP-systeem) en werd de kwaliteit van de bibliotheek beoordeeld op een Agilent Bioanalyzer 2100-systeem. De cDNA-bibliotheek werd vervolgens gesequenced met behulp van een Novaseq-sequencer. Ruwe beeldbestanden van Illumina werden omgezet naar ruwe reads met behulp van CASAVA Base Calling. Ruwe data worden opgeslagen in FASTQ(fq)-bestanden die de readsequenties en bijbehorende basekwaliteiten bevatten. Selecteer HISAT2 om gefilterde sequencing reads te matchen met het Sscrofa11.1-referentiegenoom. Over het algemeen ondersteunt HISAT2 genomen van elke grootte, inclusief genomen groter dan 4 miljard basen, en voor de meeste parameters zijn standaardwaarden ingesteld. Splicing reads van RNA Seq-data kunnen efficiënt worden uitgelijnd met HISAT2, het snelste systeem dat momenteel beschikbaar is, met dezelfde of betere nauwkeurigheid dan welke andere methode dan ook.
De hoeveelheid transcripten weerspiegelt direct het niveau van genexpressie. Genexpressieniveaus worden bepaald aan de hand van de hoeveelheid transcripten (sequencing count) die geassocieerd zijn met het genoom of exonen. Het aantal reads is evenredig met de genexpressieniveaus, genlengte en sequentiediepte. FPKM (fragmenten per duizend basenparen gesequenced transcript per miljoen basenparen) werden berekend en de p-waarden van differentiële expressie werden bepaald met behulp van het DESeq2-pakket. Vervolgens berekenden we de false discovery rate (FDR) voor elke p-waarde met behulp van de Benjamini-Hochberg-methode9 op basis van de ingebouwde R-functie "p.adjust".
RNA geïsoleerd uit hartsecties werd omgezet in cDNA in een concentratie van 200 ng/μl met behulp van de SuperScript IV Vilo Mastermix van Thermo (Thermo, cat.nr. 11756050). Kwantitatieve RT-PCR werd uitgevoerd met behulp van een Applied Biosystems Endura Plate Microamp 384-wells transparante reactieplaat (Thermo, cat.nr. 4483319) en microamp optische lijm (Thermo, cat.nr. 4311971). Het reactiemengsel bestond uit 5 µl Taqman Fast Advanced Mastermix (Thermo, cat.nr. 4444557), 0,5 µl Taqman Primer en 3,5 µl H₂O per well. Standaard qPCR-cycli werden uitgevoerd en CT-waarden werden gemeten met een Applied Biosystems Quantstudio 5 real-time PCR-instrument (384-wells module; productnr. A28135). Taqman-primers werden gekocht bij Thermo (GAPDH (Ss03375629_u1), PARP12 (Ss06908795_m1), PKDCC (Ss06903874_m1), CYGB (Ss06900188_m1), RGL1 (Ss06868890_m1), ACTN1 (Ss01009508_mH), GATA4 (Ss03383805_u1), GJA1 (Ss03374839_u1), COL1A2 (Ss03375009_u1), COL3A1 (Ss04323794_m1), ACTA2 (Ss04245588_m1). De CT-waarden van alle monsters werden genormaliseerd naar het housekeeping-gen GAPDH.
De media-uitgave van NT-ProBNP werd beoordeeld met behulp van de NT-ProBNP-kit (varken) (cat.nr. MBS2086979, MyBioSource) volgens het protocol van de fabrikant. Kort gezegd werd 250 µl van elk monster en elke standaard in duplo aan elke well toegevoegd. Voeg direct na het toevoegen van het monster 50 µl assayreagens A toe aan elke well. Schud de plaat voorzichtig en sluit af met afdichtmiddel. Vervolgens werden de tabletten 1 uur bij 37 °C geïncubeerd. Zuig vervolgens de oplossing op en was de wells 4 keer met 350 µl 1X-wasoplossing, waarbij de wasoplossing elke keer 1-2 minuten werd geïncubeerd. Voeg vervolgens 100 µl assayreagens B per well toe en sluit af met plaatafdichtmiddel. De tablet werd voorzichtig geschud en 30 minuten bij 37 °C geïncubeerd. Zuig de oplossing op en was de wells 5 keer met 350 µl 1X-wasoplossing. Voeg 90 µl substraatoplossing toe aan elke well en sluit de plaat af. Incubeer de plaat 10-20 minuten bij 37 °C. Voeg 50 µl stopoplossing toe aan elke well. De plaat werd direct gemeten met een Cytation (BioTek) plaatlezer ingesteld op 450 nm.
Er werden poweranalyses uitgevoerd om de groepsgroottes te kiezen die >80% power leveren om een ​​absolute verandering van 10% in de parameter te detecteren met een Type I-foutpercentage van 5%. Er werden vermogensanalyses uitgevoerd om de groepsgroottes te kiezen die een vermogen van >80% leveren om een ​​absolute verandering van 10% in de parameter te detecteren met een Type I-foutpercentage van 5%. Meer dan 80% percentages для обнаружения 10% абсолютного изменения met een korting van 5% op I. Er werd een vermogensanalyse uitgevoerd om de groepsgroottes te selecteren die >80% vermogen zouden leveren om 10% absolute parameterverandering te detecteren met een Type I-foutpercentage van 5%.进行功效分析以选择将提供> 80%功效以检测参数中10%绝对变化和5%I型错误率的组大小。进行功效分析以选择将提供> 80%功效以检测参数中10%绝对变化和5%I型错误率的组大小。 Er zijn meer risico's dan 80% мощности для обнаружения 10% абсолютного изменения параметров en 5% частоты ошибок типа I. Er werd een poweranalyse uitgevoerd om een ​​groepsgrootte te selecteren die >80% power zou leveren om 10% absolute parameterverandering en 5% type I-foutpercentage te detecteren.Weefselsecties werden vóór het experiment willekeurig geselecteerd. Alle analyses waren conditieblind en de monsters werden pas gedecodeerd nadat alle gegevens waren geanalyseerd. GraphPad Prism-software (San Diego, Californië) werd gebruikt om alle statistische analyses uit te voeren. Voor alle statistieken werden p-waarden als significant beschouwd bij waarden <0,05. Voor alle statistieken werden p-waarden als significant beschouwd bij waarden < 0,05. Er is een lager percentage van <0,05. Voor alle statistieken werden p-waarden als significant beschouwd bij waarden < 0,05.对于所有统计数据，p 值在值<0,05 时被认为是显着的。对于所有统计数据，p 值在值<0,05 时被认为是显着的。 Er is een lager percentage van <0,05. Voor alle statistieken werden p-waarden als significant beschouwd bij waarden < 0,05.Een tweezijdige Student's t-toets werd uitgevoerd op de data met slechts twee vergelijkingen. Eenzijdige of tweezijdige ANOVA werd gebruikt om de significantie tussen meerdere groepen te bepalen. Bij het uitvoeren van post-hoctoetsen werd Tukey's correctie toegepast om rekening te houden met meerdere vergelijkingen. RNAsec-data hebben speciale statistische overwegingen bij het berekenen van FDR en p.adjust, zoals beschreven in de sectie Methoden.
Voor meer informatie over het onderzoeksontwerp, zie de samenvatting van het Nature Research Report die aan dit artikel is gekoppeld.