Bedankt voor uw bezoek aan Nature.com. De browserversie die u gebruikt, biedt beperkte CSS-ondersteuning. Voor de beste ervaring raden we u aan een bijgewerkte browser te gebruiken (of de compatibiliteitsmodus in Internet Explorer uit te schakelen). Om de ondersteuning te blijven garanderen, zullen we de site in de tussentijd zonder stijlen en JavaScript weergeven.
Er is behoefte aan een betrouwbaar in vitro-systeem dat de fysiologische omgeving van het hart nauwkeurig kan nabootsen voor geneesmiddelenonderzoek. De beperkte beschikbaarheid van kweeksystemen voor menselijk hartweefsel heeft geleid tot onnauwkeurige interpretaties van de effecten van geneesmiddelen op het hart. Wij hebben een hartweefselkweekmodel (CTCM) ontwikkeld dat hartweefselcoupes elektromechanisch stimuleert en fysiologische rek ondergaat tijdens de systolische en diastolische fasen van de hartcyclus. Na 12 dagen kweken verbeterde deze aanpak de levensvatbaarheid van de hartcoupes gedeeltelijk, maar behield de structurele integriteit niet volledig. Na screening met kleine moleculen ontdekten we daarom dat de toevoeging van 100 nM trijodothyronine (T3) en 1 μM dexamethason (Dex) aan ons medium de microstructuur van de coupes gedurende 12 dagen behield. In combinatie met de T3/Dex-behandeling behield het CTCM-systeem de transcriptieprofielen, levensvatbaarheid, metabolische activiteit en structurele integriteit gedurende 12 dagen op hetzelfde niveau als vers hartweefsel. Bovendien induceert overmatige rek van hartweefsel in kweek hypertrofische cardiale signalering, wat aantoont dat CTCM in staat is hypertrofische omstandigheden na te bootsen die worden veroorzaakt door cardiale rek. Kortom, CTCM kan de fysiologie en pathofysiologie van het hart in kweek gedurende lange perioden modelleren, waardoor betrouwbare geneesmiddelenscreening mogelijk wordt.
Voordat klinisch onderzoek kan worden uitgevoerd, zijn betrouwbare in vitro-systemen nodig die de fysiologische omgeving van het menselijk hart nauwkeurig kunnen nabootsen. Dergelijke systemen moeten de veranderde mechanische rek, hartslag en elektrofysiologische eigenschappen nabootsen. Dierlijke modellen worden vaak gebruikt als screeningsplatform voor de hartfysiologie, maar de betrouwbaarheid ervan is beperkt als het gaat om het weerspiegelen van de effecten van geneesmiddelen op het menselijk hart1,2. Uiteindelijk is het ideale experimentele model voor hartweefselkweek (CTCM) een model dat zeer gevoelig en specifiek is voor diverse therapeutische en farmacologische interventies en dat de fysiologie en pathofysiologie van het menselijk hart nauwkeurig nabootst3. Het ontbreken van een dergelijk systeem beperkt de ontdekking van nieuwe behandelingen voor hartfalen4,5 en heeft ertoe geleid dat cardiotoxiciteit van geneesmiddelen een belangrijke reden is voor het terugtrekken van de markt6.
In de afgelopen tien jaar zijn acht niet-cardiovasculaire geneesmiddelen uit de klinische praktijk teruggetrokken omdat ze QT-intervalverlenging veroorzaken, wat leidt tot ventriculaire aritmieën en plotselinge dood7. Daarom is er een toenemende behoefte aan betrouwbare preklinische screeningsstrategieën om de cardiovasculaire werkzaamheid en toxiciteit te beoordelen. Het recente gebruik van uit menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen afgeleide cardiomyocyten (hiPS-CM) bij geneesmiddelenscreening en toxiciteitstesten biedt een gedeeltelijke oplossing voor dit probleem. De onrijpe aard van hiPS-CM's en het ontbreken van de multicellulaire complexiteit van hartweefsel vormen echter belangrijke beperkingen van deze methode. Recente studies hebben aangetoond dat deze beperking gedeeltelijk kan worden ondervangen door vroege hiPS-CM's te gebruiken om hydrogels van hartweefsel te vormen kort na het begin van spontane contracties en door de elektrische stimulatie in de loop van de tijd geleidelijk te verhogen. Deze hiPS-CM-microweefsels missen echter de volwassen elektrofysiologische en contractiele eigenschappen van het volwassen myocard. Daarnaast heeft menselijk hartweefsel een complexere structuur, bestaande uit een heterogene mix van verschillende celtypen, waaronder endotheelcellen, neuronen en stromale fibroblasten, die met elkaar verbonden zijn door specifieke sets van extracellulaire matrixeiwitten. Deze heterogeniteit van niet-cardiomyocytenpopulaties11,12,13 in het volwassen zoogdierhart vormt een grote belemmering voor het modelleren van hartweefsel met behulp van individuele celtypen. Deze belangrijke beperkingen benadrukken het belang van het ontwikkelen van methoden voor het kweken van intact myocardweefsel onder fysiologische en pathologische omstandigheden.
Gekweekte dunne (300 µm) coupes van het menselijk hart zijn een veelbelovend model gebleken voor intact menselijk myocard. Deze methode biedt toegang tot een compleet 3D-multicellulair systeem dat vergelijkbaar is met menselijk hartweefsel. Tot 2019 werd het gebruik van gekweekte hartcoupes echter beperkt door de korte overlevingsduur (24 uur). Dit is te wijten aan een aantal factoren, waaronder het ontbreken van fysisch-mechanische rek, de lucht-vloeistofinterface en het gebruik van eenvoudige media die niet voldoen aan de behoeften van hartweefsel. In 2019 hebben verschillende onderzoeksgroepen aangetoond dat het integreren van mechanische factoren in hartweefselkweeksystemen de levensduur van de kweek kan verlengen, de cardiale expressie kan verbeteren en cardiale pathologie kan nabootsen. Twee elegante studies 17 en 18 tonen aan dat uniaxiale mechanische belasting een positief effect heeft op het cardiale fenotype tijdens de kweek. Deze studies maakten echter geen gebruik van de dynamische driedimensionale fysisch-mechanische belasting van de hartcyclus, aangezien de hartcoupes werden belast met ofwel isometrische trekkrachten 17 ofwel lineaire auxotonische belasting 18. Deze methoden voor het uitrekken van weefsel resulteerden in de onderdrukking van veel hartgerelateerde genen of de overexpressie van genen die geassocieerd zijn met abnormale rekreacties. Met name Pitoulis et al. 19 ontwikkelden een dynamisch kweekbad voor hartweefselcoupes voor de reconstructie van de hartcyclus met behulp van feedback van krachttransducers en spanningsaandrijvingen. Hoewel dit systeem een ​​nauwkeurigere in vitro modellering van de hartcyclus mogelijk maakt, beperken de complexiteit en de lage doorvoer van de methode de toepassingsmogelijkheden ervan. Ons laboratorium heeft onlangs een vereenvoudigd kweeksysteem ontwikkeld met behulp van elektrische stimulatie en een geoptimaliseerd medium om de levensvatbaarheid van coupes van varkens- en menselijk hartweefsel tot wel 6 dagen te behouden20,21.
In dit manuscript beschrijven we een model voor hartweefselkweek (CTCM) met behulp van delen van het varkenshart, dat humorale signalen integreert om de driedimensionale hartfysiologie en pathofysiologische uitzetting tijdens de hartcyclus na te bootsen. Dit CTCM kan de nauwkeurigheid van preklinische geneesmiddelenvoorspellingen verhogen tot een ongekend niveau door een kosteneffectief, middelmatig doorvoer hartsysteem te bieden dat de fysiologie/pathofysiologie van het zoogdierhart nabootst voor preklinische geneesmiddelentests.
Hemodynamische mechanische signalen spelen een cruciale rol bij het in stand houden van de cardiomyocytenfunctie in vitro 22,23,24. In dit manuscript hebben we een CTCM (Figuur 1a) ontwikkeld dat de volwassen hartomgeving kan nabootsen door zowel elektrische als mechanische stimulatie op fysiologische frequenties (1,2 Hz, 72 slagen per minuut) te induceren. Om overmatige weefselrekking tijdens de diastole te voorkomen, werd een 3D-printer gebruikt om de weefselgrootte met 25% te vergroten (Figuur 1b). De elektrische pacing, geïnduceerd door het C-PACE-systeem, werd getimed om 100 ms vóór de systole te starten met behulp van een data-acquisitiesysteem om de hartcyclus volledig te reproduceren. Het weefselkweeksysteem maakt gebruik van een programmeerbare pneumatische actuator (LB Engineering, Duitsland) om een ​​flexibel siliconenmembraan cyclisch uit te zetten, waardoor de hartplakjes in de bovenste kamer uitzetten. Het systeem was via een druktransducer verbonden met een externe luchtleiding, waardoor de druk (± 1 mmHg) en de tijd (± 1 ms) nauwkeurig konden worden ingesteld (Figuur 1c).
a Bevestig het weefselcoupe aan de 7 mm steunring, weergegeven in blauw, in de kweekkamer van het apparaat. De kweekkamer is gescheiden van de luchtkamer door een dun, flexibel siliconenmembraan. Plaats een pakking tussen beide kamers om lekkage te voorkomen. Het deksel van het apparaat bevat grafietelektroden die elektrische stimulatie leveren. b Schematische weergave van het grote weefselapparaat, de geleidingsring en de steunring. De weefselcoupes (bruin) worden op het vergrote apparaat geplaatst, waarbij de geleidingsring in de groef aan de buitenrand van het apparaat wordt geplaatst. Gebruik de geleidingsring om de steunring, die is gecoat met weefselacryllijm, voorzichtig over de hartweefselcoupe te plaatsen. c Grafiek die de duur van de elektrische stimulatie weergeeft als functie van de luchtdruk in de kweekkamer, geregeld door een programmeerbare pneumatische actuator (PPD). Een data-acquisitieapparaat werd gebruikt om de elektrische stimulatie te synchroniseren met behulp van druksensoren. Wanneer de druk in de kweekkamer de ingestelde drempelwaarde bereikt, wordt een pulssignaal naar de C-PACE-EM gestuurd om de elektrische stimulatie te activeren. d Afbeelding van vier CTCM's geplaatst op een plank in een incubator. Vier apparaten zijn via een pneumatisch circuit met één PPD verbonden, en druksensoren zijn in de hemostatische klep geplaatst om de druk in het pneumatische circuit te bewaken. Elk apparaat bevat zes weefselcoupes.
Met behulp van één enkele pneumatische actuator konden we 4 CTCM-apparaten aansturen, die elk 6 weefselcoupes konden bevatten (Fig. 1d). In CTCM wordt de luchtdruk in de luchtkamer omgezet in synchrone druk in de vloeistofkamer, wat leidt tot fysiologische uitzetting van de hartcoupe (Figuur 2a en Aanvullende Video 1). Evaluatie van de weefselrek bij 80 mm Hg. Art. toonde een rek van de weefselcoupes van 25% (Fig. 2b). Van dit percentage rek is aangetoond dat het overeenkomt met een fysiologische sarcomeerlengte van 2,2–2,3 µm voor normale contractiliteit van hartweefselcoupes17,19,25. De weefselbeweging werd beoordeeld met behulp van aangepaste camera-instellingen (Aanvullende Figuur 1). De amplitude en snelheid van de weefselbeweging (Fig. 2c, d) correspondeerden met de rek tijdens de hartcyclus en de tijd tijdens systole en diastole (Fig. 2b). De rek en snelheid van het hartweefsel tijdens contractie en relaxatie bleven gedurende 12 dagen in kweek constant (Fig. 2f). Om het effect van elektrische stimulatie op de contractiliteit tijdens de kweek te evalueren, hebben we een methode ontwikkeld voor het bepalen van actieve vervorming met behulp van een arceringsalgoritme (aanvullende figuur 2a,b). Hiermee konden we onderscheid maken tussen vervormingen met en zonder elektrische stimulatie. Hetzelfde deel van het hart (figuur 2f). In het beweegbare gedeelte van de doorsnede (R6-9) was de spanning tijdens elektrische stimulatie 20% hoger dan in afwezigheid van elektrische stimulatie, wat wijst op de bijdrage van elektrische stimulatie aan de contractiele functie.
Representatieve metingen van de luchtdruk in de kamer, de vloeistofdruk in de kamer en de weefselbeweging bevestigen dat de kamerdruk de vloeistofdruk in de kamer verandert, wat een overeenkomstige beweging van de weefselplak veroorzaakt. b Representatieve metingen van de procentuele rek (blauw) van weefselsecties die overeenkomen met de procentuele rek (oranje). c De gemeten beweging van de hartplak is consistent met de gemeten bewegingssnelheid. (d) Representatieve trajecten van cyclische beweging (blauwe lijn) en snelheid (oranje stippellijn) in een plak van het hart. e Kwantificering van de cyclustijd (n = 19 plakken per groep, van verschillende varkens), contractietijd (n = 19 plakken per groep), relaxatietijd (n = 19 plakken per groep, van verschillende varkens), weefselbeweging (n = 25 plakken per groep, van verschillende varkens), pieksystolische snelheid (n = 24 (D0), 25 (D12) plakken per groep, van verschillende varkens) en piekrelaxatiesnelheid (n = 24 (D0), 25 (D12) plakken per groep, van verschillende varkens). Een tweezijdige Student's t-test toonde geen significant verschil aan in enige parameter. f Representatieve rek-analysesporen van weefselcoupes met (rood) en zonder (blauw) elektrische stimulatie, tien regionale gebieden van weefselcoupes uit dezelfde sectie. De onderste panelen tonen de kwantificering van het procentuele verschil in rek in weefselcoupes met en zonder elektrische stimulatie in tien gebieden uit verschillende secties. (n = 8 plakjes/groep van verschillende varkens, tweezijdige Student t-test uitgevoerd; ****p < 0,0001, **p < 0,01, *p < 0,05). (n = 8 plakjes/groep van verschillende varkens, tweezijdige Student t-test uitgevoerd; ****p < 0,0001, **p < 0,01, *p < 0,05). (n = 8 срезов/группу от разных свиней, проводится двусторонний t-критерий Стьюдента; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05). (n = 8 secties/groep van verschillende varkens, tweezijdige Student's t-test; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05). (n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p < 0,0001，**p < 0,01，*p < 0,05）。 (n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p < 0,0001，**p < 0,01，*p < 0,05）。 (n = 8 срезов/группу, от разных свиней, двусторонний критерий Стьюдента; ****p <0,0001, **p <0,01, *p <0,05). (n = 8 secties/groep, van verschillende varkens, tweezijdige Student's t-test; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05).Foutbalken geven het gemiddelde ± standaardafwijking weer.
In ons eerdere statische biomimetische kweeksysteem voor hartplakjes [20, 21] behielden we de levensvatbaarheid, functie en structurele integriteit van hartplakjes gedurende 6 dagen door elektrische stimulatie toe te passen en de samenstelling van het medium te optimaliseren. Na 10 dagen daalden deze waarden echter sterk. We zullen secties die gekweekt zijn in ons eerdere statische biomimetische kweeksysteem 20, 21 aanduiden als controlecondities (Ctrl) en we zullen ons eerder geoptimaliseerde medium gebruiken als MC-condities en kweken onder gelijktijdige mechanische en elektrische stimulatie (CTCM). Ten eerste stelden we vast dat mechanische stimulatie zonder elektrische stimulatie onvoldoende was om de weefsellevensvatbaarheid gedurende 6 dagen te behouden (Aanvullende figuur 3a,b). Interessant genoeg bleef de levensvatbaarheid van 12 dagen oude hartplakjes, met de introductie van fysiomechanische en elektrische stimulatie met behulp van STCM, gelijk aan die van verse hartplakjes onder MS-condities, maar niet onder Ctrl-condities, zoals blijkt uit de MTT-analyse (Figuur 1). 3a). Dit suggereert dat mechanische stimulatie en simulatie van de hartcyclus weefselcoupes twee keer zo lang levensvatbaar kunnen houden als gerapporteerd in ons eerdere statische kweeksysteem. Beoordeling van de structurele integriteit van weefselcoupes door middel van immunokleuring van cardiale troponine T en connexine 43 toonde echter aan dat de expressie van connexine 43 significant hoger was in MC-weefsels op dag 12 dan in controles op dezelfde dag. De uniforme expressie van connexine 43 en de vorming van Z-schijven werden echter niet volledig behouden (Fig. 3b). We gebruiken een raamwerk voor kunstmatige intelligentie (AI) om de structurele integriteit van weefsel te kwantificeren26, een op beelden gebaseerde deep learning-pipeline gebaseerd op troponine-T- en connexinekleuring43 om automatisch de structurele integriteit en fluorescentie van hartcoupes te kwantificeren in termen van lokalisatiesterkte. Deze methode maakt gebruik van een convolutioneel neuraal netwerk (CNN) en een deep learning-raamwerk om de structurele integriteit van hartweefsel op een betrouwbare, geautomatiseerde en onbevooroordeelde manier te kwantificeren, zoals beschreven in de referentie. 26. MC-weefsel vertoonde een verbeterde structurele gelijkenis met dag 0 in vergelijking met statische controlecoupes. Bovendien onthulde Masson-trichroomkleuring een significant lager percentage fibrose onder MS-omstandigheden in vergelijking met controleomstandigheden op dag 12 van de kweek (Fig. 3c). Hoewel CTCM de levensvatbaarheid van hartweefselcoupes op dag 12 verhoogde tot een niveau vergelijkbaar met dat van vers hartweefsel, verbeterde het de structurele integriteit van de hartcoupes niet significant.
Een staafdiagram toont de kwantificering van de MTT-levensvatbaarheid van verse hartplakjes (D0) of hartplakjes die 12 dagen in statische kweek (D12 Ctrl) of in CTCM (D12 MC) zijn gekweekt (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) plakjes/groep van verschillende varkens, eenrichtings-ANOVA-test uitgevoerd; ####p < 0,0001 vergeleken met D0 en **p < 0,01 vergeleken met D12 Ctrl). Een staafdiagram toont de kwantificering van de MTT-levensvatbaarheid van verse hartplakjes (D0) of hartplakjes die 12 dagen in statische kweek (D12 Ctrl) of in CTCM (D12 MC) zijn gekweekt (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) plakjes/groep van verschillende varkens, eenrichtings-ANOVA-test uitgevoerd; ####p < 0,0001 vergeleken met D0 en **p < 0,01 vergeleken met D12 Ctrl).Het histogram toont de kwantificering van de levensvatbaarheid van verse hartsecties (D0) of gekweekte hartsecties gedurende 12 dagen in statische kweek (D12 controle) of CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 controle)), 12 (D12 MC) secties/groep van verschillende varkens, er wordt een eenzijdige ANOVA-test uitgevoerd;####p < 0,0001 via D0 en **p < 0,01 via D12 Ctrl). ####p < 0,0001 vergeleken met D0 en **p < 0,01 vergeleken met D12 Ctrl). a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切foto(D0)或心脏切片培养12 天的MTT 活力的量化),来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组,进行单向ANOVA测试；与D0 相比，####p < 0,0001，D12 Ctrl 相比，**p < 0,01)。 a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切foto(D0) ，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；与D0 相比，####p < 0,0001，与D12 Ctrl相比，**p。)Histogram met de kwantificering van de MTT-levensvatbaarheid in verse hartsecties (D0) of hartsecties die 12 dagen in statische kweek (D12 controle) of CTCM (D12 MC) zijn gekweekt (n = 18 (D0), 15 (D12 controle)), 12 (D12 MC) secties/groep van verschillende varkens, eenrichtings-ANOVA-test;####p < 0,0001 via D0, **p < 0,01 via D12 Ctrl). ####p < 0,0001 vergeleken met D0, **p < 0,01 vergeleken met D12 Ctrl).b Troponine-T (groen), connexine 43 (rood) en DAPI (blauw) in vers geïsoleerde hartsecties (D0) of hartsecties gekweekt onder statische omstandigheden (Ctrl) of CTCM-omstandigheden (MC) gedurende 12 dagen) van representatieve immunofluorescentiebeelden (blanco schaal = 100 µm). Kwantificering van de structurele integriteit van het hartweefsel met behulp van kunstmatige intelligentie (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) plakjes/groep, elk afkomstig van verschillende varkens; eenrichtings-ANOVA-test uitgevoerd; ####p < 0,0001 vergeleken met D0 en ****p < 0,0001 vergeleken met D12 Ctrl). Kwantificering van de structurele integriteit van het hartweefsel met behulp van kunstmatige intelligentie (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) plakjes/groep, elk afkomstig van verschillende varkens; eenrichtings-ANOVA-test uitgevoerd; ####p < 0,0001 vergeleken met D0 en ****p < 0,0001 vergeleken met D12 Ctrl). Количественная оценка структурной целостности сердечной ткани искусственным интеллектом (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) срезов/групп van разных свиней, проводится однофакторный тест ANOVA; ####p < 0,0001 met сравнению с D0 en ****p < 0,0001 met сравнению с D12 Ctrl). Kwantificering van de structurele integriteit van hartweefsel door kunstmatige intelligentie (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) secties/groepen van verschillende varkens, eenrichtings-ANOVA-test uitgevoerd; ####p < 0,0001 versus D0 en ****p < 0,0001 vergeleken met D12 Ctrl).人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) plakjes/groep elk van verschillende varkens, one-way ANOVA-test;####p < 0,0001 与D0相比，****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）。人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) plakjes/groep van elk verschillende varkens, one-way ANOVA-test;####p < 0,0001与D0相比，****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）。 Искусственный интеллект для количественной оценки структурной целостности сердечной ткани (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) срезов/группу каждой en разных свиней, односторонний тест ANOVA; ####p <0,0001 vs. D0 Для сравнения ****p < 0,0001 met behulp van D12 Ctrl). Kunstmatige intelligentie om de structurele integriteit van hartweefsel te kwantificeren (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) secties/groep van verschillende varkens, eenrichtings-ANOVA-test; ####p<0,0001 vs. D0. Ter vergelijking: ****p < 0,0001 vergeleken met D12 Ctrl). c Representatieve afbeeldingen (links) en kwantificering (rechts) voor hartplakjes gekleurd met Masson's trichroomkleuring (Schaal = 500 µm) (n = 10 plakjes/groep van elk van verschillende varkens, eenrichtings-ANOVA-test uitgevoerd; ####p < 0,0001 vergeleken met D0 en ***p < 0,001 vergeleken met D12 Ctrl). c Representatieve afbeeldingen (links) en kwantificering (rechts) voor hartplakjes gekleurd met Masson's trichroomkleuring (Schaal = 500 µm) (n = 10 plakjes/groep van verschillende varkens, eenrichtings-ANOVA-test uitgevoerd; #### p < 0,0001 vergeleken met D0 en ***p < 0,001 vergeleken met D12 Ctrl). c Bedrijfsgegevens (слева) en оценка (справа) срезов сердца, окрашенных трихромным красителем Массона (масштаб без покрытия = 500 мкм) (n = 10 срезов/группу от разных свиней, выполняется односторонний тест ANOVA #### p < 0,0001 по сравнению с D0 en ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Representatieve afbeeldingen (links) en kwantificering (rechts) van hartdoorsneden gekleurd met Masson's trichroomkleuring (onbeklede schaal = 500 µm) (n = 10 doorsneden/groep van verschillende varkens, eenrichtings-ANOVA-test uitgevoerd; #### p < 0,0001 vergeleken met D0 en ***p < 0,001 vergeleken met D12 Ctrl). c 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像（左）和量化（右）（裸尺度= 500 µm）（n = 10个切片/组，每组来自不同的猪，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0,0001 与D0 相比，***p < 0,001 与D12 Ctrl 相比）。 C 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 （左 左） 量化 （右） 裸尺度 裸尺度 裸尺度裸尺度 = 500 µm） （n = 10 个 切片 组 每 组 来自 不同 猪 ， 进行 单向 单向 Anova 测试；#### p < 0,0001 与D0 相比，***p < 0,001 与D12 Ctrl 相比）。 c Bedrijfsgegevens (слева) en количественный анализ (справа) срезов сердца, окрашенных трихромным красителем Массона (чистая шкала = 500 мкм) (n = 10 срезов/группа, каждый от другой свиньи, протестировано с помощью однофакторного дисперсионного анализа ;### #p < 0,0001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Representatieve afbeeldingen (links) en kwantificering (rechts) van hartdoorsneden gekleurd met Masson's trichroomkleuring (blanco = 500 µm) (n = 10 doorsneden/groep, elk van een ander varken, getest met eenrichtingsvariantieanalyse; ### # p < 0,0001 vergeleken met D0, ***p < 0,001 vergeleken met D12 Ctrl).Foutbalken geven het gemiddelde ± standaardafwijking weer.
We veronderstelden dat door het toevoegen van kleine moleculen aan het kweekmedium de integriteit van cardiomyocyten verbeterd kon worden en de ontwikkeling van fibrose tijdens CTCM-kweek verminderd kon worden. Daarom hebben we, vanwege het geringe aantal verstorende factoren, kleine moleculen gescreend met behulp van onze statische controleculturen20,21. Dexamethason (Dex), trijodothyronine (T3) en SB431542 (SB) werden voor deze screening gekozen. Deze kleine moleculen zijn eerder gebruikt in hiPSC-CM-culturen om de rijping van cardiomyocyten te induceren door de sarcomeerlengte, T-tubuli en geleidingssnelheid te verhogen. Bovendien is van zowel Dex (een glucocorticoïde) als SB bekend dat ze ontstekingen onderdrukken29,30. Daarom hebben we onderzocht of de toevoeging van een of een combinatie van deze kleine moleculen de structurele integriteit van hartsecties zou verbeteren. Voor de eerste screening werd de dosis van elke verbinding gekozen op basis van de concentraties die gewoonlijk in celkweekmodellen worden gebruikt (1 μM Dex27, 100 nM T327 en 2,5 μM SB31). Na 12 dagen kweken resulteerde de combinatie van T3 en Dex in een optimale structurele integriteit van de cardiomyocyten en minimale vezelachtige remodellering (aanvullende figuren 4 en 5). Bovendien leidde het gebruik van dubbele of tweemaal deze concentraties van T3 en Dex tot schadelijke effecten in vergelijking met normale concentraties (aanvullende figuur 6a,b).
Na een eerste screening hebben we een directe vergelijking uitgevoerd tussen 4 kweekomstandigheden (Figuur 4a): Ctrl: hartsecties gekweekt in onze eerder beschreven statische kweek met ons geoptimaliseerde medium; 20.21 TD: T3 en Ctrl met toevoeging van Dex op woensdag; MC: hartsecties gekweekt in CTCM met ons eerder geoptimaliseerde medium; en MT: CTCM met T3 en Dex toegevoegd aan het medium. Na 12 dagen kweken bleef de levensvatbaarheid van MS- en MT-weefsels gelijk aan die van vers weefsel, zoals beoordeeld met de MTT-test (Figuur 4b). Opvallend is dat de toevoeging van T3 en Dex aan transwell-culturen (TD) niet resulteerde in een significante verbetering van de levensvatbaarheid in vergelijking met de Ctrl-omstandigheden, wat wijst op een belangrijke rol van mechanische stimulatie bij het behoud van de levensvatbaarheid van hartsecties.
Een diagram van het experimentele ontwerp dat de vier kweekomstandigheden weergeeft die werden gebruikt om de effecten van mechanische stimulatie en T3/Dex-suppletie op het medium gedurende 12 dagen te evalueren. b Staafdiagram toont de kwantificering van de levensvatbaarheid 12 dagen na de kweek in alle 4 kweekomstandigheden (Ctrl, TD, MC en MT) vergeleken met verse hartplakjes (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD en D12 MT), 12 (D12 MC) plakjes/groep van verschillende varkens, eenrichtings-ANOVA-test uitgevoerd; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 vergeleken met D0 en **p < 0,01 vergeleken met D12 Ctrl). b Staafdiagram toont de kwantificering van de levensvatbaarheid 12 dagen na de kweek in alle 4 kweekomstandigheden (Ctrl, TD, MC en MT) vergeleken met verse hartplakjes (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD en D12 MT), 12 (D12 MC) plakjes/groep van verschillende varkens, eenrichtings-ANOVA-test uitgevoerd; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 vergeleken met D0 en **p < 0,01 vergeleken met D12 ctrl). b Gebruikskrediet voor een periode van 12 maanden культивирования in во всех 4 условиях (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD en D12 MT), 12 (D12 MC) срезов/группу от разных свиней, проводится односторонний тест ANOVA; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 met D0 en **p < 0,01 met D12 Ctrl). b De staafgrafiek toont de kwantificering van de levensvatbaarheid 12 dagen na de kweek in alle 4 kweekomstandigheden (controle, TD, MC en MT) vergeleken met verse hartsecties (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD en D12 MT), 12 (D12 MC) secties/groep van verschillende varkens, eenrichtings-ANOVA-test; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 vs. D0 en **p < 0,01 vergeleken met D12 Ctrl). b 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) (n = 18 (D0)、15 (D12 Ctrl、D12 TD和D12 MT)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；####p < 0,0001，###p < 0,001 与D0相比，**p < 0,01 与D12 制）。b 4 12 (D12 MC) b Гистограмма, показывающая tussen 4 условия культивирования (контроль, TD, MC en MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD en D12 MT), van 12 (D12 MC) срезы/группа, односторонний тест ANOVA; ####p <0,0001, ###p <0,001 op basis van D0, **p <0,01 op basis van D12). b Histogram met alle 4 kweekomstandigheden (controle, TD, MC en MT) vergeleken met verse hartdoorsneden (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD en D12 MT), van verschillende varkens 12 (D12 MC) doorsneden/groep, eenrichtings-ANOVA-test; ####p<0,0001, ###p<0,001 vs. D0, **p<0,01 vs. controle D12). c Staafdiagram toont de kwantificering van de glucoseflux 12 dagen na de kweek in alle 4 kweekomstandigheden (Ctrl, TD, MC en MT) vergeleken met verse hartplakjes (D0) (n = 6 plakjes/groep van verschillende varkens, eenrichtings-ANOVA-test uitgevoerd; ###p < 0,001, vergeleken met D0 en ***p < 0,001 vergeleken met D12 Ctrl). c Staafdiagram toont de kwantificering van de glucoseflux 12 dagen na de kweek in alle 4 kweekomstandigheden (Ctrl, TD, MC en MT) vergeleken met verse hartplakjes (D0) (n = 6 plakjes/groep van verschillende varkens, eenrichtings-ANOVA-test uitgevoerd; ###p < 0,001, vergeleken met D0 en ***p < 0,001 vergeleken met D12 Ctrl). c Гоказывает количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после 4 jaar garantie (контроль, TD, MC en MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 6 срезов/группу от разных свиней, односторонний Выполняется тест ANOVA ###p < 0,001 по сравнению с D0 en ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Histogram toont de kwantificering van de glucoseflux 12 dagen na de kweek onder alle 4 kweekomstandigheden (controle, TD, MC en MT) vergeleken met verse hartdoorsneden (D0) (n = 6 doorsneden/groep van verschillende varkens, eenrichtings-ANOVA-test uitgevoerd; ###p < 0,001 vergeleken met D0 en ***p < 0,001 vergeleken met D12 Ctrl). c 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) 相比，培养后12天的葡萄糖通量定量（n = 6 片/组，来自不同猪，单向执行ANOVA 测试；###p < 0,001，与D0相比，***p < 0,001 与D12 Ctrl 相比）。 C 条形图 显示 所有 4 种 条件 (（ctrl 、 td 、 mc 和 mt) 新鲜 心脏 切片 切片 切片 相比 ，培养 后 后 12 天 的 通量 定量 （n = 6 片/组 ， 来自 猪 ， ， ， ， ， ， ， ， 猪ANOVA 测试；###p < 0,001，与D0 相比，***p < 0,001 与D12 Ctrl 相比）。 c Het apparaat kan 12 maanden duren культивирования для всех 4 условий культивирования (контроль, TD, MC en MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 6 срезов/группа, van свиней, односторонний Были проведены тесты ANOVA; ###p < 0,001 op basis van D0, ***p < 0,001 op basis van D12 (opname). c Histogram met kwantificering van de glucoseflux 12 dagen na de kweek voor alle 4 kweekomstandigheden (controle, TD, MC en MT) vergeleken met verse hartdoorsneden (D0) (n = 6 doorsneden/groep, van verschillende varkens, unilateraal). Er werden ANOVA-tests uitgevoerd, ###p < 0,001 vergeleken met D0, ***p < 0,001 vergeleken met D12 (controle).d. Stamanalyseplots van vers (blauw), 12 dagen MC (groen) en 12 dagen MT (rood) weefsel op tien regionale weefseldoorsnedepunten (n = 4 coupes/groep, eenrichtings-ANOVA-test; er was geen significant verschil tussen de groepen). e. Vulkaanplot met differentieel tot expressie gebrachte genen in verse hartdoorsneden (D0) vergeleken met hartdoorsneden gekweekt onder statische omstandigheden (Ctrl) of onder MT-omstandigheden (MT) gedurende 10-12 dagen. f. Heatmap van sarcomeergenen voor hartdoorsneden gekweekt onder elk van de kweekomstandigheden. Foutbalken geven het gemiddelde ± standaarddeviatie weer.
Metabolische afhankelijkheid van de omschakeling van vetzuuroxidatie naar glycolyse is een kenmerk van de dedifferentiatie van cardiomyocyten. Onrijpe cardiomyocyten gebruiken voornamelijk glucose voor ATP-productie en hebben hypoplastische mitochondriën met weinig cristae5,32. Analyses van glucosegebruik toonden aan dat onder MC- en MT-omstandigheden het glucosegebruik vergelijkbaar was met dat in weefsels van dag 0 (Figuur 4c). Ctrl-monsters vertoonden echter een significante toename in glucosegebruik vergeleken met vers weefsel. Dit duidt erop dat de combinatie van CTCM en T3/Dex de weefsellevensvatbaarheid verbetert en het metabolische fenotype van 12 dagen gekweekte hartsecties behoudt. Bovendien toonde de rekanalyse aan dat de rekniveaus gedurende 12 dagen onder MT- en MS-omstandigheden gelijk bleven aan die in vers hartweefsel (Figuur 4d).
Om de algehele impact van CTCM en T3/Dex op het globale transcriptionele landschap van hartweefselcoupes te analyseren, hebben we RNAseq uitgevoerd op hartcoupes van alle vier de verschillende kweekomstandigheden (Aanvullende gegevens 1). Interessant genoeg vertoonden MT-coupes een hoge transcriptionele gelijkenis met vers hartweefsel, met slechts 16 differentieel tot expressie gebrachte genen van de 13.642 genen. Zoals we eerder hebben aangetoond, vertoonden Ctrl-coupes echter 1229 differentieel tot expressie gebrachte genen na 10-12 dagen in kweek (Fig. 4e). Deze gegevens werden bevestigd door qRT-PCR van hart- en fibroblastgenen (Aanvullende figuur 7a-c). Opvallend is dat de Ctrl-coupes een neerregulatie vertoonden van hart- en celcyclusgenen en een activering van inflammatoire genprogramma's. Deze gegevens suggereren dat dedifferentiatie, die normaal gesproken optreedt na langdurige kweek, volledig wordt afgezwakt onder MT-omstandigheden (Aanvullende figuur 8a,b). Zorgvuldig onderzoek van sarcomeergenen toonde aan dat alleen onder MT-omstandigheden de genen die coderen voor het sarcomeer (Fig. 4f) en het ionenkanaal (Aanvullende Fig. 9) behouden blijven, waardoor ze beschermd worden tegen onderdrukking onder Ctrl-, TD- en MC-omstandigheden. Deze gegevens tonen aan dat met een combinatie van mechanische en humorale stimulatie (T3/Dex) het transcriptoom van hartplakjes na 12 dagen in kweek vergelijkbaar kan blijven met dat van verse hartplakjes.
Deze transcriptiebevindingen worden ondersteund door het feit dat de structurele integriteit van cardiomyocyten in hartsecties het best behouden blijft onder MT-omstandigheden gedurende 12 dagen, zoals blijkt uit intact en gelokaliseerd connexine 43 (Fig. 5a). Bovendien was de fibrose in hartsecties onder MT-omstandigheden significant verminderd in vergelijking met de controlegroep en vergelijkbaar met verse hartsecties (Fig. 5b). Deze gegevens tonen aan dat de combinatie van mechanische stimulatie en T3/Dex-behandeling de hartstructuur in gekweekte hartsecties effectief behoudt.
a Representatieve immunofluorescentiebeelden van troponine-T (groen), connexine 43 (rood) en DAPI (blauw) in vers geïsoleerde hartsecties (D0) of gekweekt gedurende 12 dagen onder alle vier de kweekomstandigheden voor hartsecties (schaalstreep = 100 µm). Kwantificering van de structurele integriteit van het hartweefsel met behulp van kunstmatige intelligentie (n = 7 (D0 en D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC en D12 MT) plakjes/groep van verschillende varkens, eenrichtings-ANOVA-test uitgevoerd; ####p < 0,0001 vergeleken met D0 en *p < 0,05, of ****p < 0,0001 vergeleken met D12 Ctrl). Kwantificering van de structurele integriteit van het hartweefsel met behulp van kunstmatige intelligentie (n = 7 (D0 en D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC en D12 MT) plakjes/groep van verschillende varkens, eenrichtings-ANOVA-test uitgevoerd; #### p < 0,0001 vergeleken met D0 en *p < 0,05, of ****p < 0,0001 vergeleken met D12 Ctrl). De beste manier om dit te bereiken is (n = 7 (D0 en D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC en D12 MT) срезов/группу met een analyse van de ANOVA; #### p < 0,0001 met сравнению с D0 en *p < 0,05 en ****p < 0,0001 met сравнению с D12 Ctrl). Kwantificering van de structurele integriteit van hartweefsel met behulp van kunstmatige intelligentie (n = 7 (D0 en D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC en D12 MT) secties/groep van verschillende varkens, eenrichtings-ANOVA-test uitgevoerd; #### p < 0,0001 vergeleken met D0 en *p < 0,05 of ****p < 0,0001 vergeleken met D12 Ctrl).对不同猪的心脏组织结构完整性（n = 7（D0 和D12 Ctrl）、5（D12 TD、D12 MC 和D12 MT）切片/组）进行人工智能量化，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0,0001 与D0 和*p < 0,05 相比，或****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）。对 不同 猪 的 心脏 结构 完整性 (n = 7 （d0 和 d12 ctrl） （5 （d12 td 、 d12 mc 和 d12 mt） 组） ########## p < 0,0001 与D0 和*p < 0,05 相比，或****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）。Kwantificering van de structurele integriteit van hartweefsel met behulp van kunstmatige intelligentie bij verschillende varkens (n ​​= 7 (D0 en D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC en D12 MT) secties/groep) met een eenzijdige ANOVA-test;#### p < 0,0001 met сравнению с D0 en *p < 0,05 en ****p < 0,0001 met сравнению с D12 Ctrl). #### p < 0,0001 vergeleken met D0 en *p < 0,05 of ****p < 0,0001 vergeleken met D12 Ctrl). b Representatieve afbeeldingen en kwantificering voor hartplakjes gekleurd met Masson's trichroomkleuring (schaalstreep = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD en D12 MC), 9 (D12 MT) plakjes/groep van verschillende varkens, eenrichtings-ANOVA-test uitgevoerd; ####p < 0,0001 vergeleken met D0 en ***p < 0,001, of ****p < 0,0001 vergeleken met D12 Ctrl). b Representatieve afbeeldingen en kwantificering voor hartplakjes gekleurd met Masson's trichroomkleuring (schaalstreep = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD en D12 MC), 9 (D12 MT) plakjes/groep van verschillende varkens, eenrichtings-ANOVA-test uitgevoerd; ####p < 0,0001 vergeleken met D0 en ***p < 0,001, of ****p < 0,0001 vergeleken met D12 Ctrl). b Gebruiks- en onderhoudsproducten voor het kopen van een product красителем Массона (масштабная линейка = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD en D12 MC), 9 (D12 MT) односторонний тест ANOVA ####p < 0,0001 по сравнению с D0 en ***p < 0,001 en ****p < 0,0001 via D12 Ctrl). b Representatieve afbeeldingen en kwantificering van hartdoorsneden gekleurd met Masson's trichroomkleuring (schaalstreep = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD en D12 MC), 9 (D12 MT) doorsneden/groep van verschillende varkens, eenrichtings-ANOVA uitgevoerd; ####p < 0,0001 versus D0 en ***p < 0,001 of ****p < 0,0001 versus D12 Ctrl). b Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像和量化（比例尺= 500 µm）（n = 10（D0、D12 Ctrl、D12 TD 和D12 MC），来自不同猪的9 个（D12 MT）切片/组，进行单因素方差分析；####p < 0,0001与D0 相比，***p < 0,001，或****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）。 b 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 和 量化 （比例 尺 尺 尺 = 500 µm） (n = 10 （d0 、 d12 ctrl 、 d12 td 和 d12 mc） 来自 不同 的 9 个 d12 mt 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切foto切foto ####p < 0,0001与D0 相比，***p < 0,001，或****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）。 b Gebruiks- en onderhoudsproducten voor het kopen van een product Массона (масштабная линейка = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD en D12 MC), 9 (D12 MT) срезов от разных свиней / группы, один- способ ANOVA; ####p < 0,0001 met D0, ***p < 0,001 en ****p < 0,0001 met D12 Ctrl). b Representatieve afbeeldingen en kwantificering van hartdoorsneden gekleurd met Masson's trichroom (schaalstreep = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD en D12 MC), 9 (D12 MT) doorsneden van verschillende varkens/groep, één ANOVA-methode; ####p < 0,0001 vergeleken met D0, ***p < 0,001 of ****p < 0,0001 vergeleken met D12 Ctrl).Foutbalken geven het gemiddelde ± standaardafwijking weer.
Ten slotte werd het vermogen van CTCM om harthypertrofie na te bootsen beoordeeld door de rek van het hartweefsel te verhogen. In CTCM nam de piekluchtdruk in de kamer toe van 80 mmHg tot 80 mmHg Art. (normale rek) tot 140 mmHg Art. (Fig. 6a). Dit komt overeen met een toename van 32% in rek (Fig. 6b), wat eerder werd aangetoond als het overeenkomstige percentage rek dat nodig is voor hartsecties om een ​​sarcomeerlengte te bereiken die vergelijkbaar is met die bij hypertrofie. De rek en snelheid van het hartweefsel tijdens contractie en relaxatie bleven constant gedurende zes dagen kweek (Fig. 6c). Hartweefsel uit MT-condities werd gedurende zes dagen blootgesteld aan normale rek (MT (Normaal)) of overrekcondities (MT (OS)). Al na vier dagen kweek was de hypertrofische biomarker NT-ProBNP significant verhoogd in het medium onder MT (OS)-condities vergeleken met MT (normaal)-condities (Fig. 7a). Bovendien nam na zes dagen kweken de celgrootte in MT (OS) (Fig. 7b) significant toe in vergelijking met secties van MT-hart (normaal). Daarnaast was de nucleaire translocatie van NFATC4 significant toegenomen in overrekte weefsels (Fig. 7c). Deze resultaten tonen de progressieve ontwikkeling van pathologische remodellering na hyperdistensie aan en ondersteunen het concept dat het CTCM-apparaat kan worden gebruikt als platform om signaaloverdracht bij door rek geïnduceerde harthypertrofie te bestuderen.
Representatieve metingen van de luchtdruk in de kamer, de vloeistofdruk in de kamer en de weefselbeweging bevestigen dat de kamerdruk de vloeistofdruk in de kamer beïnvloedt, wat een overeenkomstige beweging van de weefselplak veroorzaakt. b Representatieve rekpercentage- en reksnelheidscurven voor normaal uitgerekte (oranje) en overrekte (blauw) weefselcoupes. c Staafdiagram met de cyclustijd (n = 19 coupes per groep, van verschillende varkens), contractietijd (n = 18-19 coupes per groep, van verschillende varkens), relaxatietijd (n = 19 coupes per groep, van verschillende varkens), amplitude van de weefselbeweging (n = 14 coupes/groep, van verschillende varkens), pieksystolische snelheid (n = 14 coupes/groep, van verschillende varkens) en piekrelaxatiesnelheid (n = 14 (D0), 15 (D6)) coupes/groepen van verschillende varkens). Een tweezijdige Student's t-test toonde geen significant verschil in de parameters, wat aangeeft dat deze parameters constant bleven gedurende 6 dagen kweek met overspanning. Foutbalken geven het gemiddelde ± standaarddeviatie weer.
a. Kwantificering met behulp van een staafdiagram van de NT-ProBNP-concentratie in kweekmedia van hartplakjes gekweekt onder normale MT-rekcondities (Norm) of overrekcondities (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm en D4 MTOS) plakjes/groep van verschillende varkens, er is een tweeweg-ANOVA uitgevoerd; **p < 0,01 vergeleken met normale rek). a. Kwantificering met behulp van een staafdiagram van de NT-ProBNP-concentratie in kweekmedia van hartplakjes gekweekt onder normale MT-rekcondities (Norm) of overrekcondities (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm en D4 MTOS) plakjes/groep van verschillende varkens, er is een tweeweg-ANOVA uitgevoerd; **p < 0,01 vergeleken met normale rek).Kwantitatief histogram van de NT-ProBNP-concentratie in kweekmedium van hartplakjes gekweekt onder omstandigheden van normale MT-rek (norm) of overrek (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm en D4 MTOS) plakjes/groep van verschillende varkens, er wordt een tweefactoriële variantieanalyse uitgevoerd;**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p < 0,01 vergeleken met normale rek). a 在MT 正常拉伸(Norm) 或过度拉伸(OS) 条件下培养的心脏切片培养基中NT-ProBNP浓度的条形图量化（n = 4 (D2 MTNorm)、3（D2 MTOS、D4 MTNorm 和D4 MTOS) een kwantificering van de NT-ProBNP-concentratie in hartplakken gekweekt onder MT-normale rek (Norm) of overrek (OS) omstandigheden (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm和D4 MTOS) van verschillende 猪的切片/组，可以双向方方发发动; **vergeleken met normaal strekken, p < 0,01).Histogramkwantificering van NT-ProBNP-concentraties in hartplakjes gekweekt onder omstandigheden van normale MT-rek (norm) of overrek (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm) en D4 MTOS) plakjes/groep van verschillende varkens, tweeweg-variantieanalyse;**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p < 0,01 vergeleken met normale rek). b Representatieve afbeeldingen van hartdoorsneden gekleurd met troponine-T en WGA (links) en kwantificering van de celgrootte (rechts) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) cellen/groep van 10 verschillende doorsneden van verschillende varkens, tweezijdige Student t-test uitgevoerd; ****p < 0,0001 vergeleken met normale rek). b Representatieve afbeeldingen van hartdoorsneden gekleurd met troponine-T en WGA (links) en kwantificering van de celgrootte (rechts) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) cellen/groep van 10 verschillende doorsneden van verschillende varkens, tweezijdige Student t-test uitgevoerd; ****p < 0,0001 vergeleken met normale rek). b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т en АЗП (слева) en количественного определения размера клеток (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) клеток/группу of 10 разных срезов от разных свиней, два- проводится хвостовой t-критерий Стьюдента ****p < 0,0001 по сравнению с нормальным растяжением). b Representatieve afbeeldingen van hartdoorsneden gekleurd met troponine-T en AZP (links) en kwantificering van de celgrootte (rechts) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) cellen/groep uit 10 verschillende doorsneden van verschillende varkens, er werd een tweezijdige Student's t-test uitgevoerd; ****p < 0,0001 vergeleken met de normale stam). b 用肌钙蛋白-T 和WGA（左）和细胞大小量化（右）染色的心脏切片的代表性图像（n = 330（D6 MTOS），来自不同猪的10 个不同切片的369（D6 MTNorm）细胞/组，两进行有尾学生t 检验；与正常拉伸相比，****p < 0,0001）。 b Representatieve afbeeldingen van hartplakjes gekleurd met calcareïne-T en WGA (links) en celgrootte (rechts) (n = 330 (D6 MTOS), 369 uit 10 verschillende plakjes (D6 MTNorm)) Cellen/组，两方法有尾学生t test；compared with normal stretching,****p < 0.0001). b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т en АЗП (слева) en количественная оценка размера клеток (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) of 10 stappen in het bereik van de instellingen Стьюдента; ****p < 0,0001 по сравнению с нормальным растяжением). b Representatieve afbeeldingen van hartdoorsneden gekleurd met troponine-T en AZP (links) en kwantificering van de celgrootte (rechts) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) uit 10 verschillende doorsneden van verschillende varkens) Cellen/groep, tweezijdige Student's t-toets; ****p < 0,0001 vergeleken met normale stam). c Representatieve afbeeldingen van MTOS-hartsneden van dag 0 en dag 6, geïmmunolabels voor troponine-T en NFATC4, en kwantificering van de translocatie van NFATC4 naar de kernen van CM's (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) coupes/groep van verschillende varkens, tweezijdige Student t-test uitgevoerd; *p < 0,05). c Representatieve afbeeldingen van MTOS-hartsneden van dag 0 en dag 6, geïmmunolabels voor troponine-T en NFATC4, en kwantificering van de translocatie van NFATC4 naar de kernen van CM's (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) coupes/groep van verschillende varkens, tweezijdige Student t-test uitgevoerd; *p < 0,05). c Meer informatie over 0 en 6 MTOS, of meer тропонина-Т en NFATC4, en количественная оценка транслокации NFATC4 met een bereik van (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) / группу от разных свиней , выполняется двусторонний t-критерий Стьюдента *p < 0,05). c Representatieve afbeeldingen van hartdoorsneden op 0 en 6 dagen MTOS, geïmmunolabels voor troponine-T en NFATC4, en kwantificering van NFATC4-translocatie in de celkern van caverneuze cellen (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) coupes/groep van verschillende varkens) uitgevoerd met een tweezijdige Student's t-test; *p < 0,05). c 用于肌钙蛋白-T 和NFATC4 免疫标记的第0 天和第6 天MTOS NFATC4 易位至CM 细胞核的量化（n = 4 (D0)、3 (D6 MTOS)切片/组, 进行双尾学生t 检验；*p < 0,05)。 c Representatieve afbeeldingen van calcanine-T en NFATC4 immunolabeling 第0天和第6天MTOS hartplakken, en NFATC4 van verschillende NFATC4 易位至CM celkern的kwantiteit化 (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) 切礼/组,时间双尾学生et 电影；*p < 0,05). c Meer informatie over MTOS op 0 en 6 niveaus en NFATC4 en количественная оценка транслокации NFATC4 in ядра CM от разных свиней (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срез/группа, два- хвостатый t-критерий Стьюдента; *p < 0,05). c Representatieve afbeeldingen van MTOS-hartsneden op dag 0 en 6 voor troponine-T- en NFATC4-immunokleuring en kwantificering van NFATC4-translocatie in de kern van CM van verschillende varkens (n ​​= 4 (D0), 3 (D6 MTOS) sneden/groep, tweezijdige t-toets van Student; *p < 0,05).Foutbalken geven het gemiddelde ± standaardafwijking weer.
Translationeel cardiovasculair onderzoek vereist celmodellen die de cardiale omgeving nauwkeurig nabootsen. In deze studie werd een CTCM-apparaat ontwikkeld en gekarakteriseerd dat ultradunne coupes van het hart kan stimuleren. Het CTCM-systeem omvat fysiologisch gesynchroniseerde elektromechanische stimulatie en verrijking met T3- en Dex-vloeistof. Toen coupes van varkenshartweefsel aan deze factoren werden blootgesteld, bleven hun levensvatbaarheid, structurele integriteit, metabolische activiteit en transcriptie-expressie na 12 dagen kweek gelijk aan die van vers hartweefsel. Bovendien kan overmatige rek van hartweefsel hypertrofie van het hart veroorzaken als gevolg van hyperextensie. Over het geheel genomen ondersteunen deze resultaten de cruciale rol van fysiologische kweekomstandigheden bij het behoud van een normaal cardiaal fenotype en bieden ze een platform voor geneesmiddelenscreening.
Veel factoren dragen bij aan het creëren van een optimale omgeving voor het functioneren en de overleving van cardiomyocyten. De meest voor de hand liggende factoren hebben betrekking op (1) intercellulaire interacties, (2) elektromechanische stimulatie, (3) humorale factoren en (4) metabolische substraten. Fysiologische cel-tot-celinteracties vereisen complexe driedimensionale netwerken van meerdere celtypen, ondersteund door een extracellulaire matrix. Dergelijke complexe cellulaire interacties zijn moeilijk in vitro na te bootsen door co-cultuur van individuele celtypen, maar kunnen gemakkelijk worden bereikt door gebruik te maken van de organotypische aard van hartweefselcoupes.
Mechanische rek en elektrische stimulatie van cardiomyocyten zijn cruciaal voor het behoud van het cardiale fenotype33,34,35. Hoewel mechanische stimulatie veelvuldig is gebruikt voor de conditionering en rijping van hiPSC-CM's, hebben verschillende elegante studies recentelijk geprobeerd hartweefselcoupes in kweek mechanisch te stimuleren met behulp van uniaxiale belasting. Deze studies tonen aan dat 2D uniaxiale mechanische belasting een positief effect heeft op het fenotype van het hart tijdens de kweek. In deze studies werden delen van het hart belast met isometrische trekkrachten17, lineaire auxotonische belasting18, of werd de hartcyclus nagebootst met behulp van feedback van krachttransducers en spanningsaandrijvingen. Deze methoden maken echter gebruik van uniaxiale weefselrek zonder omgevingsoptimalisatie, wat resulteert in de onderdrukking van veel cardiale genen of overexpressie van genen die geassocieerd zijn met abnormale rekreacties. De hier beschreven CTCM biedt een 3D elektromechanische stimulus die de natuurlijke hartcyclus nabootst wat betreft cyclusduur en fysiologische rek (25% rek, 40% systole, 60% diastole en 72 slagen per minuut). Hoewel deze driedimensionale mechanische stimulatie op zichzelf niet voldoende is om de weefselintegriteit te behouden, is een combinatie van humorale en mechanische stimulatie met T3/Dex nodig om de levensvatbaarheid, functie en integriteit van het weefsel adequaat te waarborgen.
Humorale factoren spelen een belangrijke rol bij het moduleren van het volwassen hartfenotype. Dit werd benadrukt in HiPS-CM-onderzoeken waarbij T3 en Dex aan kweekmedia werden toegevoegd om de celrijping te versnellen. T3 kan het transport van aminozuren, suikers en calcium over celmembranen beïnvloeden36. Bovendien bevordert T3 de expressie van MHC-α en de downregulatie van MHC-β, waardoor de vorming van snel samentrekkende myofibrillen in volwassen cardiomyocyten wordt bevorderd in vergelijking met langzaam samentrekkende myofibrillen in foetale CM. T3-deficiëntie bij hypothyreoïde patiënten resulteert in het verlies van myofibrillaire banden en een verminderde snelheid van tonusontwikkeling37. Dex werkt in op glucocorticoïdreceptoren en is aangetoond dat het de myocardcontractiliteit verhoogt in geïsoleerde geperfuseerde harten;38 deze verbetering wordt verondersteld verband te houden met het effect op calciumdepositie-gedreven instroom (SOCE)39,40. Daarnaast bindt Dex aan zijn receptoren, wat een brede intracellulaire respons veroorzaakt die de immuunfunctie en ontsteking onderdrukt30.
Onze resultaten tonen aan dat fysieke mechanische stimulatie (MS) de algehele kweekprestaties verbeterde in vergelijking met de controlegroep (Ctrl), maar er niet in slaagde de levensvatbaarheid, structurele integriteit en cardiale expressie gedurende 12 dagen in kweek te behouden. In vergelijking met de controlegroep verbeterde de toevoeging van T3 en Dex aan CTCM (MT)-culturen de levensvatbaarheid en behield vergelijkbare transcriptieprofielen, structurele integriteit en metabolische activiteit als vers hartweefsel gedurende 12 dagen. Bovendien werd, door de mate van weefselrek te controleren, een door hyperextensie geïnduceerd model voor cardiale hypertrofie gecreëerd met behulp van STCM, wat de veelzijdigheid van het STCM-systeem illustreert. Het is belangrijk op te merken dat hoewel cardiale remodellering en fibrose meestal intacte organen betreffen waarvan de circulerende cellen de juiste cytokinen, fagocytose en andere remodelleringsfactoren kunnen leveren, delen van het hart het fibrotische proces als reactie op stress en trauma nog steeds kunnen nabootsen. Dit is eerder onderzocht in dit cardiale plakjesmodel. Het is belangrijk op te merken dat de CTCM-parameters kunnen worden gemoduleerd door de druk/elektrische amplitude en frequentie te veranderen om diverse omstandigheden te simuleren, zoals tachycardie, bradycardie en mechanische circulatoire ondersteuning (mechanisch ontlast hart). Dit maakt het systeem geschikt voor geneesmiddelentests met een gemiddelde doorvoer. De mogelijkheid van CTCM om door overbelasting veroorzaakte harthypertrofie te modelleren, opent de weg voor het testen van dit systeem voor gepersonaliseerde therapie. Kortom, deze studie toont aan dat mechanische rek en humorale stimulatie cruciaal zijn voor het in stand houden van de kweek van hartweefselcoupes.
Hoewel de hier gepresenteerde gegevens suggereren dat CTCM een veelbelovend platform is voor het modelleren van intact myocard, kent deze kweekmethode enkele beperkingen. De belangrijkste beperking van CTCM-kweek is dat het continu dynamische mechanische spanningen op de plakjes uitoefent, waardoor het niet mogelijk is om de contracties van de hartplakjes tijdens elke cyclus actief te monitoren. Bovendien is, vanwege de kleine afmetingen van de hartplakjes (7 mm), de mogelijkheid om de systolische functie buiten kweeksystemen te evalueren met behulp van traditionele krachtsensoren beperkt. In dit manuscript ondervangen we deze beperking gedeeltelijk door optische spanning te evalueren als indicator van de contractiele functie. Deze beperking vereist echter verder onderzoek en kan in de toekomst worden aangepakt door methoden te introduceren voor optische monitoring van de functie van hartplakjes in kweek, zoals optische mapping met behulp van calcium- en spanningsgevoelige kleurstoffen. Een andere beperking van CTCM is dat het werkmodel geen fysiologische stress (voorbelasting en nabezetting) manipuleert. Bij CTCM werd druk in tegengestelde richtingen geïnduceerd om 25% fysiologische rek in diastole (volledige rek) en systole (contractieduur tijdens elektrische stimulatie) in zeer grote weefsels te reproduceren. Deze beperking moet in toekomstige CTCM-ontwerpen worden weggenomen door voldoende druk op het hartweefsel van beide kanten uit te oefenen en door de exacte druk-volumeverhoudingen toe te passen die in de hartkamers voorkomen.
De in dit manuscript beschreven, door overrekking geïnduceerde hermodellering is beperkt tot het nabootsen van hypertrofische hyperrekkingssignalen. Dit model kan dus helpen bij de studie van door rek geïnduceerde hypertrofische signalering zonder de noodzaak van humorale of neurale factoren (die in dit systeem niet aanwezig zijn). Verder onderzoek is nodig om de veelzijdigheid van CTCM te vergroten, bijvoorbeeld door co-kweek met immuuncellen, circulerende humorale factoren in het plasma en innervatie bij co-kweek met neuronale cellen. Dit zal de mogelijkheden voor ziektemodellering met CTCM verbeteren.
Aan dit onderzoek namen dertien varkens deel. Alle dierproeven werden uitgevoerd in overeenstemming met de institutionele richtlijnen en goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee van de Universiteit van Louisville. De aortaboog werd afgeklemd en het hart werd geperfuseerd met 1 liter steriele cardioplegie (110 mM NaCl, 1,2 mM CaCl2, 16 mM KCl, 16 mM MgCl2, 10 mM NaHCO3, 5 U/ml heparine, pH tot 7,4); De harten werden bewaard in een ijskoude cardioplegische oplossing totdat ze op ijs naar het laboratorium werden vervoerd, wat meestal minder dan 10 minuten duurt. De harten werden bewaard in een ijskoude cardioplegische oplossing totdat ze op ijs naar het laboratorium werden vervoerd, wat meestal minder dan 10 minuten duurt. als u een creditcard wilt kopen, что обычно занимает <10 мин. De harten werden bewaard in een ijskoude cardioplegische oplossing totdat ze op ijs naar het laboratorium werden vervoerd, wat gewoonlijk minder dan 10 minuten duurt.将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中,直到冰上运送到实验室,通常<10分钟。将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中,直到冰上运送到实验室,通常<10分钟。 Zorg ervoor dat u een creditcard heeft die op een lager niveau ligt dan <10 мин. Houd de harten gekoeld (cardioplegie) tot het transport naar het laboratorium, meestal minder dan 10 minuten.
Het CTCM-apparaat is ontwikkeld met behulp van de CAD-software SolidWorks. De kweekkamers, scheidingswanden en luchtkamers zijn gemaakt van CNC-gefreesd helder acrylplastic. De steunring met een diameter van 7 mm is in het midden gemaakt van polyethyleen met hoge dichtheid (HDPE) en heeft een groef voor een O-ring, waarin de siliconen O-ring past die gebruikt wordt om het medium eronder af te dichten. Een dun silicamembraan scheidt de kweekkamer van de scheidingsplaat. Het siliconenmembraan is lasergesneden uit een 0,02 inch dikke siliconenplaat en heeft een hardheid van 35A. De siliconenpakkingen aan de onder- en bovenkant zijn lasergesneden uit een 1/16 inch dikke siliconenplaat en hebben een hardheid van 50A. Voor het bevestigen van het blok en het creëren van een luchtdichte afsluiting worden schroeven en vleugelmoeren van 316L roestvrij staal gebruikt.
Er is een speciaal ontworpen printplaat (PCB) ontwikkeld voor integratie met het C-PACE-EM-systeem. De Zwitserse machineconnectoren op de printplaat zijn via verzilverde koperdraden en bronzen 0-60 schroeven verbonden met grafietelektroden. De printplaat wordt in de behuizing van de 3D-printer geplaatst.
Het CTCM-apparaat wordt aangestuurd door een programmeerbare pneumatische actuator (PPD) die een gecontroleerde circulatiedruk creëert, vergelijkbaar met een hartcyclus. Naarmate de druk in de luchtkamer toeneemt, zet het flexibele siliconenmembraan naar boven uit, waardoor het medium onder het weefsel wordt geperst. Het weefsel wordt vervolgens uitgerekt door deze uitstoting van vloeistof, wat de fysiologische uitzetting van het hart tijdens de diastole nabootst. Op het hoogtepunt van de ontspanning werd elektrische stimulatie toegepast via grafietelektroden, waardoor de druk in de luchtkamer afnam en de weefseldelen samentrokken. In de buis bevindt zich een hemostatische klep met een druksensor om de druk in het luchtsysteem te meten. De door de druksensor gemeten druk wordt doorgegeven aan een dataverzamelaar die is aangesloten op een laptop. Dit maakt continue monitoring van de druk in de gaskamer mogelijk. Wanneer de maximale kamerdruk werd bereikt (standaard 80 mmHg, 140 mmHg OS), kreeg het data-acquisitieapparaat de opdracht om een ​​signaal naar het C-PACE-EM-systeem te sturen om een ​​bifasisch spanningssignaal van 4 V te genereren gedurende 2 ms.
Hartweefselcoupes werden verkregen en de kweekomstandigheden in 6 putjes werden als volgt uitgevoerd: De geoogste harten werden vanuit het transportvat overgebracht naar een bak met koude (4°C) cardioplegie. De linkerhartkamer werd met een steriel mesje geïsoleerd en in stukjes van 1-2 cm³ gesneden. Deze weefselblokjes werden met weefsellijm aan weefseldragers bevestigd en in een vibrerend microtoomweefselbad geplaatst dat Tyrode-oplossing bevatte en continu van zuurstof werd voorzien (3 g/L 2,3-butaandionmonooxime (BDM), 140 mM NaCl (8,18 g), 6 mM KCl (0,447 g), 10 mM D-glucose (1,86 g), 10 mM HEPES (2,38 g), 1 mM MgCl₂ (1 ml 1 M oplossing), 1,8 mM CaCl₂ (1,8 ml 1 M oplossing), tot 1 L gedestilleerd water). De vibrerende microtoom werd ingesteld om plakjes van 300 µm dik te snijden met een frequentie van 80 Hz, een horizontale vibratieamplitude van 2 mm en een aanvoersnelheid van 0,03 mm/s. Het weefselbad werd omgeven door ijs om de oplossing koel te houden en de temperatuur werd op 4 °C gehandhaafd. De weefselcoupes werden vanuit het microtoombad overgebracht naar een incubatiebad met continu van zuurstof voorziene Tyrode-oplossing op ijs totdat er voldoende coupes waren verkregen voor één kweekplaat. Voor transwell-culturen werden de weefselcoupes bevestigd aan steriele polyurethaan dragers van 6 mm breed en geplaatst in 6 ml geoptimaliseerd medium (199 medium, 1x ITS-supplement, 10% FBS, 5 ng/ml VEGF, 10 ng/ml FGF-alkalisch en 2x antibioticum-antischimmel). Elektrische stimulatie (10 V, frequentie 1,2 Hz) werd via de C-Pace op de weefselcoupes toegepast. Voor TD-condities werden verse T3 en Dex toegevoegd in concentraties van respectievelijk 100 nM en 1 μM bij elke mediumverversing. Het medium werd driemaal daags verzadigd met zuurstof voordat het werd ververst. Weefselcoupes werden gekweekt in een incubator bij 37 °C en 5% CO2.
Voor CTCM-culturen werden weefselcoupes op een speciaal ontworpen 3D-printer geplaatst in een petrischaal met gemodificeerde Tyrode-oplossing. Het apparaat is ontworpen om de grootte van de hartcoupe met 25% van het oppervlak van de steunring te vergroten. Dit zorgt ervoor dat de hartcoupes niet uitrekken na de overplaatsing van de Tyrode-oplossing naar het medium en tijdens de diastole. Met histoacryllijm werden coupes van 300 µm dik bevestigd op een steunring met een diameter van 7 mm. Nadat de weefselcoupes aan de steunring waren bevestigd, werden de overtollige coupes afgesneden en werden de bevestigde coupes teruggeplaatst in het bad met Tyrode-oplossing op ijs (4 °C) totdat er voldoende coupes voor één apparaat waren voorbereid. De totale verwerkingstijd voor alle apparaten mag niet langer dan 2 uur bedragen. Nadat 6 weefselcoupes aan hun steunringen waren bevestigd, werd het CTCM-apparaat geassembleerd. De CTCM-kweekkamer is vooraf gevuld met 21 ml voorgeoxygeneerd medium. Breng de weefselcoupes over naar de kweekkamer en verwijder voorzichtig eventuele luchtbellen met een pipet. Het weefselcoupe wordt vervolgens in het gat geleid en voorzichtig op zijn plaats gedrukt. Plaats ten slotte de elektrodekap op het apparaat en breng het apparaat over naar de incubator. Verbind vervolgens de CTCM met de luchtslang en het C-PACE-EM-systeem. De pneumatische actuator opent en de luchtklep opent de CTCM. Het C-PACE-EM-systeem was geconfigureerd om 4 V bij 1,2 Hz te leveren tijdens bifasische pacing gedurende 2 ms. Het medium werd tweemaal daags ververst en de elektroden werden eenmaal daags vervangen om ophoping van grafiet op de elektroden te voorkomen. Indien nodig kunnen weefselcoupes uit hun kweekputjes worden verwijderd om eventuele luchtbellen die eronder zijn gekomen te verwijderen. Voor MT-behandelingscondities werd T3/Dex vers toegevoegd bij elke mediumverversing met 100 nM T3 en 1 μM Dex. De CTCM-apparaten werden gekweekt in een incubator bij 37 °C en 5% CO2.
Om uitgerekte trajecten van hartdoorsneden te verkrijgen, werd een speciaal camerasysteem ontwikkeld. Er werd gebruikgemaakt van een spiegelreflexcamera (Canon Rebel T7i, Canon, Tokio, Japan) met een Navitar Zoom 7000 18-108mm macro-objectief (Navitar, San Francisco, CA). De visualisatie werd uitgevoerd bij kamertemperatuur na vervanging van het medium door vers medium. De camera werd onder een hoek van 51° geplaatst en de video werd opgenomen met 30 beelden per seconde. Eerst werd open-source software (MUSCLEMOTION43) gebruikt in combinatie met ImageJ om de beweging van de hartdoorsneden te kwantificeren. Het masker werd gemaakt met MATLAB (MathWorks, Natick, MA, VS) om interessegebieden voor kloppende hartdoorsneden te definiëren en ruis te vermijden. Handmatig gesegmenteerde maskers werden toegepast op alle beelden in een framesequentie en vervolgens doorgegeven aan de MUSCLEMOTION-plug-in. Muscle Motion gebruikt de gemiddelde intensiteit van de pixels in elk frame om de beweging ten opzichte van het referentieframe te kwantificeren. De gegevens werden geregistreerd, gefilterd en gebruikt om de cyclustijd te kwantificeren en de weefselrek tijdens de hartcyclus te beoordelen. De opgenomen video werd nabewerkt met een eerste-orde nul-fase digitaal filter. Om de weefselrek (piek-tot-piek) te kwantificeren, werd een piek-tot-piek-analyse uitgevoerd om onderscheid te maken tussen pieken en dalen in het opgenomen signaal. Daarnaast werd detrending uitgevoerd met behulp van een zesde-orde polynoom om signaaldrift te elimineren. Er werd programmacode ontwikkeld in MATLAB om de globale weefselbeweging, cyclustijd, relaxatietijd en contractietijd te bepalen (Aanvullende programmacode 44).
Voor de spanningsanalyse hebben we, met behulp van dezelfde video's die voor de mechanische rekmeting zijn gemaakt, eerst twee afbeeldingen getraceerd die de bewegingspieken weergeven (de hoogste (bovenste) en laagste (onderste) bewegingspunten) volgens de MUSCLEMOTION-software. Vervolgens hebben we de weefselgebieden gesegmenteerd en een soort schaduwalgoritme toegepast op het gesegmenteerde weefsel (aanvullende figuur 2a). Het gesegmenteerde weefsel werd vervolgens verdeeld in tien suboppervlakken en de spanning op elk oppervlak werd berekend met behulp van de volgende vergelijking: Spanning = (Boven-Onder)/Onder, waarbij Boven en Onder de schaduwen van de vorm respectievelijk de afstanden van de bovenste en onderste schaduwen van de stof zijn (aanvullende figuur 2b).
Hartweefselcoupes werden gedurende 48 uur gefixeerd in 4% paraformaldehyde. De gefixeerde weefsels werden gedehydrateerd in 10% en 20% sucrose gedurende 1 uur, en vervolgens een nacht in 30% sucrose. De coupes werden vervolgens ingebed in OCT-compound (Optimal Cutting Temperature compound) en geleidelijk bevroren in een isopentane/droogijsbad. Bewaar de OCT-inbeddingsblokken bij -80 °C tot de scheiding. Er werden coupes van 8 μm dikte gemaakt.
Om OCT uit hartweefselcoupes te verwijderen, verwarmt u de objectglaasjes gedurende 5 minuten op een verwarmingsblok op 95 °C. Voeg 1 ml PBS toe aan elk objectglaasje en incubeer dit gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Permeëer vervolgens de coupes door 0,1% Triton-X in PBS gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur te laten uitharden. Om te voorkomen dat niet-specifieke antilichamen zich aan het monster binden, voegt u 1 ml 3% BSA-oplossing toe aan de objectglaasjes en incubeert u dit gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Verwijder vervolgens de BSA en was de objectglaasjes met PBS. Markeer elk monster met een potlood. Primaire antilichamen (verdund 1:200 in 1% BSA) (connexine 43 (Abcam; #AB11370), NFATC4 (Abcam; #AB99431) en troponine-T (Thermo Scientific; #MA5-12960)) werden gedurende 90 minuten toegevoegd, waarna secundaire antilichamen (verdund 1:200 in 1% BSA) tegen muis Alexa Fluor 488 (Thermo Scientific; #A16079) en tegen konijn Alexa Fluor 594 (Thermo Scientific; #T6391) gedurende nog eens 90 minuten werden toegevoegd. De preparaten werden driemaal gewassen met PBS. Om de kleuring van het doelwit te onderscheiden van de achtergrondkleuring, werd alleen het secundaire antilichaam als controle gebruikt. Ten slotte werd DAPI-kernkleuring toegevoegd en werden de preparaten in een Vectashield (Vector Laboratories) geplaatst en afgesloten met nagellak. (x vergroting) en Keyence-microscoop met 40x vergroting.
WGA-Alexa Fluor 555 (Thermo Scientific; #W32464) in een concentratie van 5 μg/ml in PBS werd gebruikt voor WGA-kleuring en gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur op gefixeerde coupes aangebracht. De preparaten werden vervolgens gewassen met PBS en er werd Sudan Black aan toegevoegd, waarna ze 30 minuten werden geïncubeerd. Daarna werden de preparaten opnieuw gewassen met PBS en werd Vectashield-inbeddingsmedium toegevoegd. De preparaten werden bekeken onder een Keyence-microscoop met een vergroting van 40x.
OCT werd zoals hierboven beschreven van de monsters verwijderd. Na verwijdering van de OCT werden de objectglaasjes een nacht in Bouin-oplossing ondergedompeld. Vervolgens werden de objectglaasjes gedurende 1 uur met gedestilleerd water gespoeld en daarna 10 minuten in een Bibrich aloëzuur-fuchsine-oplossing geplaatst. Daarna werden de objectglaasjes met gedestilleerd water gewassen en 10 minuten in een oplossing van 5% fosfomolybdeen/5% fosfowolframzuur geplaatst. Zonder te spoelen werden de objectglaasjes direct in de anilineblauwe oplossing geplaatst gedurende 15 minuten. Vervolgens werden de objectglaasjes met gedestilleerd water gewassen en 2 minuten in een 1% azijnzuuroplossing geplaatst. De objectglaasjes werden gedroogd in 200 N ethanol en overgebracht naar xyleen. De gekleurde objectglaasjes werden bekeken met een Keyence-microscoop met een 10x objectief. Het percentage fibrosegebied werd gekwantificeerd met behulp van de Keyence Analyzer-software.
CyQUANT™ MTT Cell Viability Assay (Invitrogen, Carlsbad, CA), catalogusnummer V13154, werd uitgevoerd volgens het protocol van de fabrikant met enkele aanpassingen. In het bijzonder werd een chirurgische biopunctie met een diameter van 6 mm gebruikt om een ​​uniforme weefselgrootte te garanderen tijdens de MTT-analyse. Weefsels werden afzonderlijk in de putjes van een 12-wells plaat met MTT-substraat geplaatst volgens het protocol van de fabrikant. De coupes werden gedurende 3 uur bij 37 °C geïncubeerd, waarna het levende weefsel het MTT-substraat metaboliseerde tot een paarse formazanverbinding. De MTT-oplossing werd vervangen door 1 ml DMSO en gedurende 15 minuten bij 37 °C geïncubeerd om de paarse formazan uit de hartcoupes te extraheren. De monsters werden 1:10 verdund in DMSO in 96-wells platen met een transparante bodem en de intensiteit van de paarse kleur werd gemeten bij 570 nm met een Cytation plaatlezer (BioTek). De metingen werden genormaliseerd ten opzichte van het gewicht van elke hartcoupe.
Het medium van de hartweefselcoupes werd vervangen door medium dat 1 μCi/ml [5-3H]-glucose (Moravek Biochemicals, Brea, CA, VS) bevatte voor de glucosegebruikstest zoals eerder beschreven. Na 4 uur incubatie werd 100 µl medium toegevoegd aan een open microcentrifugebuisje met 100 µl 0,2 N HCl. Vervolgens werd het buisje in een scintillatiebuisje geplaatst met 500 µl gedestilleerd water om [3H]2O gedurende 72 uur bij 37 °C te laten verdampen. Daarna werd het microcentrifugebuisje uit het scintillatiebuisje verwijderd en werd 10 ml scintillatievloeistof toegevoegd. Scintillatietellingen werden uitgevoerd met een Tri-Carb 2900TR vloeistofscintillatie-analysator (Packard Bioscience Company, Meriden, CT, VS). Het glucoseverbruik werd vervolgens berekend rekening houdend met de specifieke activiteit van [5-3H]-glucose, onvolledig evenwicht en achtergrondruis, verdunning van [5-3H]-glucose ten opzichte van ongelabelde glucose en de efficiëntie van de scintillatieteller. De gegevens zijn genormaliseerd naar de massa van de hartsecties.
Na weefselhomogenisatie in Trizol werd RNA geïsoleerd uit hartweefselcoupes met behulp van de Qiagen miRNeasy Micro Kit #210874 volgens het protocol van de fabrikant. De voorbereiding van de RNAsec-bibliotheek, de sequentiebepaling en de data-analyse werden als volgt uitgevoerd:
1 μg RNA per monster werd gebruikt als uitgangsmateriaal voor de preparatie van de RNA-bibliotheek. Sequentiebibliotheken werden gegenereerd met behulp van de NEBNext UltraTM RNA Library Preparation Kit voor Illumina (NEB, VS) volgens de aanbevelingen van de fabrikant, en indexcodes werden toegevoegd aan de attribuutsequenties voor elk monster. Kort gezegd werd mRNA gezuiverd uit totaal RNA met behulp van magnetische kralen waaraan poly-T-oligonucleotiden waren bevestigd. Fragmentatie werd uitgevoerd met behulp van tweewaardige kationen bij hoge temperatuur in NEBNext First Strand Synthesis Reaction Buffer (5X). Eerste streng cDNA werd gesynthetiseerd met behulp van willekeurige hexameerprimers en M-MuLV reverse transcriptase (RNase H-). De tweede streng cDNA werd vervolgens gesynthetiseerd met behulp van DNA-polymerase I en RNase H. De resterende overhangen werden omgezet in stompe uiteinden door exonuclease/polymerase-activiteit. Na adenylering van het 3'-uiteinde van het DNA-fragment werd er een NEBNext Adapter met een hairpin-lusstructuur aan bevestigd ter voorbereiding op hybridisatie. Voor de selectie van cDNA-fragmenten met een gewenste lengte van 150-200 bp werden de bibliotheekfragmenten gezuiverd met behulp van het AMPure XP-systeem (Beckman Coulter, Beverly, VS). Vervolgens werd 3 μl USER Enzyme (NEB, VS) met het geselecteerde cDNA, geligeerd met een adapter, gedurende 15 minuten bij 37 °C en daarna gedurende 5 minuten bij 95 °C gebruikt vóór de PCR. De PCR werd vervolgens uitgevoerd met Phusion High-Fidelity DNA-polymerase, universele PCR-primers en Index (X)-primers. Ten slotte werden de PCR-producten gezuiverd (AMPure XP-systeem) en de bibliotheekkwaliteit beoordeeld met een Agilent Bioanalyzer 2100-systeem. De cDNA-bibliotheek werd vervolgens gesequenced met een Novaseq-sequencer. Ruwe beeldbestanden van Illumina werden omgezet naar ruwe reads met behulp van CASAVA Base Calling. Ruwe data worden opgeslagen in FASTQ(fq)-bestanden die de readsequenties en de bijbehorende basekwaliteiten bevatten. Selecteer HISAT2 om gefilterde sequentielezingen te matchen met het Sscrofa11.1-referentiegenome. HISAT2 ondersteunt over het algemeen genomen van elke grootte, inclusief genomen groter dan 4 miljard basen, en de meeste parameters zijn ingesteld op standaardwaarden. Splicing-lezingen uit RNA Seq-data kunnen efficiënt worden uitgelijnd met HISAT2, het snelste systeem dat momenteel beschikbaar is, met dezelfde of een betere nauwkeurigheid dan elke andere methode.
De hoeveelheid transcripten weerspiegelt direct het niveau van genexpressie. Genexpressieniveaus worden beoordeeld aan de hand van de hoeveelheid transcripten (aantal sequenties) die geassocieerd zijn met het genoom of de exonen. Het aantal reads is evenredig met de genexpressieniveaus, de genlengte en de sequentiediepte. FPKM (fragmenten per duizend basenparen van gesequenceerde transcripten per miljoen basenparen) werden berekend en P-waarden van differentiële expressie werden bepaald met behulp van het DESeq2-pakket. Vervolgens berekenden we de false discovery rate (FDR) voor elke P-waarde met behulp van de Benjamini-Hochberg-methode⁹ op basis van de ingebouwde R-functie "p.adjust".
RNA geïsoleerd uit hartweefselcoupes werd omgezet in cDNA met een concentratie van 200 ng/μl met behulp van de SuperScript IV Vilo Master mix van Thermo (Thermo, cat.nr. 11756050). Kwantitatieve RT-PCR werd uitgevoerd met een Applied Biosystems Endura Plate Microamp 384-wells transparante reactieplaat (Thermo, cat.nr. 4483319) en Microamp optische lijm (Thermo, cat.nr. 4311971). Het reactiemengsel bestond uit 5 µl Taqman Fast Advanced Master mix (Thermo, cat.nr. 4444557), 0,5 µl Taqman Primer en 3,5 µl H2O per putje. Standaard qPCR-cycli werden uitgevoerd en CT-waarden werden gemeten met een Applied Biosystems Quantstudio 5 real-time PCR-apparaat (384-wells module; productnr. A28135). Taqman-primers werden aangeschaft bij Thermo (GAPDH (Ss03375629_u1), PARP12 (Ss06908795_m1), PKDCC (Ss06903874_m1), CYGB (Ss06900188_m1), RGL1 (Ss06868890_m1), ACTN1 (Ss01009508_mH), GATA4 (Ss03383805_u1), GJA1 (Ss03374839_u1), COL1A2 (Ss03375009_u1), COL3A1 (Ss04323794_m1), ACTA2 (Ss04245588_m1)). De CT-waarden van alle monsters werden genormaliseerd ten opzichte van het housekeeping-gen GAPDH.
De media-afgifte van NT-ProBNP werd beoordeeld met behulp van de NT-ProBNP-kit (varken) (Cat.nr. MBS2086979, MyBioSource) volgens het protocol van de fabrikant. Kort gezegd werd 250 µl van elk monster en elke standaard in duplo aan elk putje toegevoegd. Direct na het toevoegen van het monster werd 50 µl van Assay Reagent A aan elk putje toegevoegd. De plaat werd voorzichtig geschud en afgesloten met een afdichtmiddel. Vervolgens werden de tabletten gedurende 1 uur bij 37 °C geïncubeerd. Daarna werd de oplossing afgezogen en werden de putjes 4 keer gewassen met 350 µl 1X wasoplossing, waarbij de wasoplossing telkens 1-2 minuten werd geïncubeerd. Vervolgens werd 100 µl van Assay Reagent B per putje toegevoegd en afgesloten met een afdichtmiddel. De tablet werd voorzichtig geschud en gedurende 30 minuten bij 37 °C geïncubeerd. Zuig de oplossing af en spoel de putjes 5 keer met 350 µl 1X wasoplossing. Voeg 90 µl substraatoplossing toe aan elk putje en sluit de plaat af. Incubeer de plaat gedurende 10-20 minuten bij 37°C. Voeg 50 µl stopoplossing toe aan elk putje. De plaat werd direct gemeten met een Cytation (BioTek) plaatlezer ingesteld op 450 nm.
Er werden poweranalyses uitgevoerd om de groepsgroottes te kiezen die een power van >80% opleveren om een ​​absolute verandering van 10% in de parameter te detecteren met een type I-foutkans van 5%. Er werden poweranalyses uitgevoerd om de groepsgroottes te kiezen die een power van >80% opleveren om een ​​absolute verandering van 10% in de parameter te detecteren met een type I-foutkans van 5%. Meer dan 80% percentages для обнаружения 10% абсолютного изменения met een korting van 5% op I. Er werd een poweranalyse uitgevoerd om groepsgroottes te selecteren die een power van >80% zouden opleveren om een ​​absolute parameterverandering van 10% te detecteren met een type I-foutkans van 5%.进行功效分析以选择将提供> 80%功效以检测参数中10%绝对变化和5%I型错误率的组大小。进行功效分析以选择将提供> 80%功效以检测参数中10%绝对变化和5%I型错误率的组大小。 Er zijn meer risico's dan 80% мощности для обнаружения 10% абсолютного изменения параметров en 5% частоты ошибок типа I. Er werd een poweranalyse uitgevoerd om een ​​groepsgrootte te selecteren die een power van >80% zou opleveren om een ​​absolute parameterverandering van 10% en een type I-foutkans van 5% te detecteren.Weefselcoupes werden willekeurig geselecteerd vóór het experiment. Alle analyses werden blind uitgevoerd en de monsters werden pas gedecodeerd nadat alle gegevens waren geanalyseerd. GraphPad Prism-software (San Diego, CA) werd gebruikt voor alle statistische analyses. Voor alle statistieken werden p-waarden als significant beschouwd bij waarden <0,05. Voor alle statistieken werden p-waarden als significant beschouwd bij waarden <0,05. Er is een lager percentage van <0,05. Voor alle statistieken werden p-waarden als significant beschouwd bij waarden <0,05.对于所有统计数据，p 值在值<0,05 时被认为是显着的。对于所有统计数据，p 值在值<0,05 时被认为是显着的。 Er is een lager percentage van <0,05. Voor alle statistieken werden p-waarden als significant beschouwd bij waarden <0,05.Er werd een tweezijdige Student's t-test uitgevoerd op de data met slechts 2 vergelijkingen. Een eenweg- of tweeweg-ANOVA werd gebruikt om de significantie tussen meerdere groepen te bepalen. Bij het uitvoeren van post-hoc-tests werd de Tukey-correctie toegepast om rekening te houden met meervoudige vergelijkingen. RNAsec-data hebben speciale statistische aandachtspunten bij het berekenen van FDR en p.adjust, zoals beschreven in de sectie Methoden.
Voor meer informatie over het onderzoeksontwerp, zie de samenvatting van het Nature Research Report die aan dit artikel is gekoppeld.