Nature.com сайтына кіргеніңіз үшін рақмет. Сіз пайдаланып отырған браузер нұсқасында CSS қолдауы шектеулі. Ең жақсы тәжірибе алу үшін жаңартылған браузерді пайдалануды ұсынамыз (немесе Internet Explorer бағдарламасында үйлесімділік режимін өшіріңіз). Сонымен қатар, үздіксіз қолдауды қамтамасыз ету үшін сайтты стильдер мен JavaScriptсіз көрсетеміз.
Дәрілік заттарды сынау үшін жүректің физиологиялық ортасын дәл қайталай алатын сенімді in vitro жүйесіне қажеттілік бар. Адамның жүрек тіндерін өсіру жүйелерінің шектеулі қолжетімділігі жүрек дәрілік заттарының әсерін дұрыс түсіндірмеуге әкелді. Мұнда біз жүрек кесінділерін электромеханикалық түрде ынталандыратын және жүрек циклінің систолалық және диастолалық фазаларында физиологиялық созылудан өтетін жүрек тіндерін өсіру моделін (CTCM) әзірледік. 12 күндік өсіруден кейін бұл тәсіл жүрек кесінділерінің өміршеңдігін ішінара жақсартты, бірақ олардың құрылымдық тұтастығын толық сақтамады. Сондықтан, шағын молекулалық скринингтен кейін, біздің ортаға 100 нМ трийодтиронин (T3) және 1 мкМ дексаметазон (Dex) қосу кесінділердің микроқұрылымын 12 күн бойы сақтап қалғанын анықтадық. T3/Dex емімен бірге CTCM жүйесі транскрипциялық профильдерді, өміршеңдікті, метаболикалық белсенділікті және құрылымдық тұтастықты 12 күн бойы жаңа жүрек тінімен бірдей деңгейде сақтап қалды. Сонымен қатар, жүрек тінінің шамадан тыс созылуы өсіндідегі гипертрофиялық жүрек сигналын тудырады, бұл CTCM жүректің созылуынан туындаған гипертрофиялық жағдайларды имитациялау қабілетінің дәлелі болып табылады. Қорытындылай келе, CTCM ұзақ уақыт бойы өсіндідегі жүректің физиологиясы мен патофизиологиясын модельдей алады, бұл сенімді дәрілік скринингті жүргізуге мүмкіндік береді.
Клиникалық зерттеулерге дейін адам жүрегінің физиологиялық ортасын дәл қайталай алатын сенімді in vitro жүйелер қажет. Мұндай жүйелер өзгертілген механикалық созылуды, жүрек соғу жиілігін және электрофизиологиялық қасиеттерді имитациялауы керек. Жануарлар модельдері жүрек физиологиясын скринингтік платформа ретінде кеңінен қолданылады, адам жүрегіне дәрілік заттардың әсерін көрсетуде сенімділігі шектеулі1,2. Сайып келгенде, жүрек тіндерін өсірудің тамаша эксперименттік моделі (CTCM) - бұл адам жүрегінің физиологиясы мен патофизиологиясын дәл қайталайтын, әртүрлі терапиялық және фармакологиялық араласуларға өте сезімтал және ерекше модель3. Мұндай жүйенің болмауы жүрек жеткіліксіздігін емдеудің жаңа әдістерін ашуды шектейді4,5 және дәрілік кардиоуыттылықтың нарықтан шығудың негізгі себебі ретінде болуына әкелді6.
Соңғы онжылдықта сегіз жүрек-қан тамырлары емес дәрі клиникалық қолданудан алынып тасталды, себебі олар QT аралығының ұзаруына әкеліп соғады, бұл қарыншалық аритмияға және кенеттен өлімге әкеледі7. Осылайша, жүрек-қан тамырлары тиімділігі мен уыттылығын бағалау үшін сенімді клиникаға дейінгі скринингтік стратегияларға деген қажеттілік артып келеді. Жақында адамдардан туындаған плюрипотентті бағаналы жасушалардан алынған кардиомиоциттерді (hiPS-CM) дәрілік заттарды скринингтеу және уыттылықты тексеру кезінде қолдану бұл мәселені ішінара шешуге мүмкіндік береді. Дегенмен, hiPS-CM-нің жетілмеген сипаты және жүрек тінінің көп жасушалы күрделілігінің болмауы бұл әдістің негізгі шектеулері болып табылады. Жақында жүргізілген зерттеулер бұл шектеуді ерте hiPS-CM көмегімен жүрек тінінің гидрогельдерін өздігінен жиырылу басталғаннан кейін көп ұзамай қалыптастыру және уақыт өте келе электрлік ынталандыруды біртіндеп арттыру арқылы ішінара жоюға болатынын көрсетті. Дегенмен, бұл hiPS-CM микротіндерінде ересек миокардтың жетілген электрофизиологиялық және жиырылу қасиеттері жетіспейді. Сонымен қатар, адамның жүрек тінінің күрделі құрылымы бар, ол эндотелий жасушаларын, нейрондарды және стромальды фибробласттарды қоса алғанда, әртүрлі жасуша түрлерінің гетерогенді қоспасынан тұрады, олар жасушадан тыс матрица ақуыздарының белгілі бір жиынтығымен өзара байланысты. Ересек сүтқоректілердің жүрегіндегі кардиомиоцит емес популяциялардың11,12,13 бұл гетерогенділігі жеке жасуша түрлерін пайдаланып жүрек тінін модельдеуге үлкен кедергі болып табылады. Бұл негізгі шектеулер физиологиялық және патологиялық жағдайларда бүтін миокард тінін өсіру әдістерін әзірлеудің маңыздылығын атап көрсетеді.
Адам жүрегінің жіңішке (300 мкм) бөліктері адам миокардының бүтіндігінің перспективалы моделі болып шықты. Бұл әдіс адамның жүрек тініне ұқсас толық 3D көп жасушалы жүйеге қол жеткізуді қамтамасыз етеді. Дегенмен, 2019 жылға дейін жүрек бөліктерін пайдалану қысқа (24 сағат) дақылдың сақталуымен шектелді. Бұл бірқатар факторларға, соның ішінде физикалық-механикалық созылудың болмауына, ауа-сұйықтық интерфейсіне және жүрек тінінің қажеттіліктерін қолдамайтын қарапайым орталарды пайдалануға байланысты. 2019 жылы бірнеше зерттеу топтары жүрек тінінің дақыл жүйелеріне механикалық факторларды енгізу дақылдың өмір сүру мерзімін ұзартуға, жүрек экспрессиясын жақсартуға және жүрек патологиясын имитациялауға болатынын көрсетті. Екі талғампаз зерттеу 17 және 18 бір осьті механикалық жүктеме дақылдау кезінде жүрек фенотипіне оң әсер ететінін көрсетеді. Дегенмен, бұл зерттеулер жүрек циклінің динамикалық үш өлшемді физика-механикалық жүктемесін пайдаланбады, себебі жүрек бөліктері изометриялық созылу күштерімен 17 немесе сызықтық аукотоникалық жүктемемен 18 жүктелген. Тіндерді созудың бұл әдістері көптеген жүрек гендерін басуға немесе қалыптан тыс созылу реакцияларымен байланысты гендердің шамадан тыс экспрессиясына әкелді. Атап айтқанда, Питулис және т.б. 19 күш түрлендіргішінің кері байланысын және кернеу жетектерін қолдана отырып, жүрек циклін қалпына келтіру үшін динамикалық жүрек кесінділерін өсіру ваннасын жасады. Бұл жүйе in vitro жүрек циклін модельдеуді дәлірек жүргізуге мүмкіндік бергенімен, әдістің күрделілігі мен төмен өткізу қабілеті бұл жүйені қолдануды шектейді. Біздің зертханамыз жақында шошқа мен адам жүрек тінінің кесінділерінің тіршілік қабілетін 6 күнге дейін сақтау үшін электрлік ынталандыруды және оңтайландырылған ортаны пайдаланатын жеңілдетілген өсіру жүйесін жасады20,21.
Ағымдағы қолжазбада біз жүрек циклі кезінде үш өлшемді жүрек физиологиясы мен патофизиологиялық кеңеюін қайталау үшін гуморальды белгілерді қамтитын шошқа жүрегінің бөліктерін пайдаланатын жүрек тінінің дақылдау моделін (ЖТДМ) сипаттаймыз. Бұл ЖТДМ клиникаға дейінгі дәрілік заттарды сынау үшін сүтқоректілер жүрегінің физиологиясын/патофизиологиясын имитациялайтын тиімді, орташа өнімділіктегі жүрек жүйесін ұсыну арқылы клиникаға дейінгі дәрілік заттарды болжаудың дәлдігін бұрын-соңды болмаған деңгейге дейін арттыра алады.
Гемодинамикалық механикалық сигналдар in vitro 22,23,24 жағдайында кардиомиоциттердің қызметін сақтауда маңызды рөл атқарады. Ағымдағы қолжазбада біз физиологиялық жиіліктерде (1,2 Гц, минутына 72 соққы) электрлік және механикалық ынталандыруды индукциялау арқылы ересектердің жүрек ортасын имитациялай алатын CTCM (1a сурет) әзірледік. Диастола кезінде тіндердің шамадан тыс созылуын болдырмау үшін тіндердің өлшемін 25%-ға арттыру үшін 3D басып шығару құрылғысы пайдаланылды (1b сурет). C-PACE жүйесімен индукцияланған электрлік кардиостимуляция жүрек циклін толық қайталау үшін деректерді жинау жүйесін пайдаланып, систоладан 100 мс бұрын басталатындай етіп уақытқа орнатылды. Тіндерді өсіру жүйесі жоғарғы камерадағы жүрек кесінділерінің кеңеюін тудыру үшін икемді силикон мембрананы циклдік түрде кеңейту үшін бағдарламаланатын пневматикалық жетек құралын (LB Engineering, Германия) пайдаланады. Жүйе қысым түрлендіргіші арқылы сыртқы ауа желісіне қосылған, бұл қысымды (± 1 мм сын. бағ.) және уақытты (± 1 мс) дәл реттеуге мүмкіндік берді (1c сурет).
a Тін бөлігін құрылғының өсіру камерасының ішінде көк түспен көрсетілген 7 мм тірек сақинасына бекітіңіз. Өсіру камерасы ауа камерасынан жұқа икемді силикон мембранамен бөлінген. Ағып кетудің алдын алу үшін әр камераның арасына тығыздағыш қойыңыз. Құрылғының қақпағында электрлік ынталандыруды қамтамасыз ететін графит электродтары бар. b Үлкен тін құрылғысының, бағыттаушы сақинаның және тірек сақинасының схемалық көрінісі. Тін бөліктері (қоңыр) үлкен өлшемді құрылғыға орналастырылған, ал бағыттаушы сақина құрылғының сыртқы шетіндегі ойыққа орналастырылған. Бағыттаушыны пайдаланып, тіндік акрил желімімен қапталған тірек сақинасын жүрек тінінің кесіндісінің үстіне абайлап қойыңыз. c Бағдарламаланатын пневматикалық жетек (PPD) арқылы басқарылатын ауа камерасының қысымының функциясы ретінде электрлік ынталандыру уақытын көрсететін график. Қысым сенсорларын пайдаланып электрлік ынталандыруды синхрондау үшін деректер жинау құрылғысы пайдаланылды. Өсіру камерасындағы қысым белгіленген шекті деңгейге жеткенде, электрлік ынталандыруды іске қосу үшін C-PACE-EM-ге импульстік сигнал жіберіледі. d Инкубатор сөресіне орналастырылған төрт CTCM суреті. Пневматикалық тізбек арқылы бір PPD-ге төрт құрылғы қосылған, ал пневматикалық тізбектегі қысымды бақылау үшін қысым датчиктері гемостатикалық клапанға енгізілген. Әрбір құрылғыда алты тіндік бөлім бар.
Бір пневматикалық жетектің көмегімен біз әрқайсысы 6 тін бөлігін ұстай алатын 4 CTCM құрылғысын басқара алдық (1d-сурет). CTCM-де ауа камерасындағы ауа қысымы сұйықтық камерасындағы синхронды қысымға айналады және жүрек кесіндісінің физиологиялық кеңеюін тудырады (2a-сурет және 1-қосымша бейне). 80 мм сын. бағ. кезінде тіндердің созылуын бағалау тіндердің кесінділерінің 25%-ға созылуын көрсетті (2b-сурет). Бұл пайыздық созылу қалыпты жүрек кесіндісінің жиырылуы үшін 2,2-2,3 мкм физиологиялық саркомер ұзындығына сәйкес келетіні көрсетілген17,19,25. Тіндердің қозғалысы арнайы камера параметрлерін пайдаланып бағаланды (1-қосымша сурет). Тіндердің қозғалысының амплитудасы мен жылдамдығы (2c, d-сурет) жүрек циклі кезіндегі созылуға және систола мен диастола кезіндегі уақытқа сәйкес келді (2b-сурет). Жиырылу және релаксация кезіндегі жүрек тінінің созылуы мен жылдамдығы өсіруде 12 күн бойы тұрақты болып қалды (2f-сурет). Өсіру кезіндегі жиырылғыштыққа электрлік стимуляцияның әсерін бағалау үшін біз көлеңкелеу алгоритмін қолдана отырып, белсенді деформацияны анықтау әдісін әзірледік (2a,b қосымша сурет) және электрлік стимуляциясы бар және жоқ деформацияларды ажырата алдық. Жүректің сол бөлімі (2f сурет). Кесіндінің қозғалмалы аймағында (R6-9) электрлік стимуляция кезіндегі кернеу электрлік стимуляция болмаған кездегіге қарағанда 20%-ға жоғары болды, бұл электрлік стимуляцияның жиырылу функциясына қосқан үлесін көрсетеді.
Ауа камерасының қысымының, сұйықтық камерасының қысымының және тін қозғалысын өлшеудің типтік іздері камера қысымының сұйықтық камерасының қысымын өзгертетінін, тін кесіндісінің сәйкес қозғалысын тудыратынын растайды. b Пайыздық созылу (қызғылт сары) сәйкес келетін тін кесінділерінің пайыздық созылуының (көк) типтік іздері. c Жүрек кесіндісінің өлшенген қозғалысы өлшенген қозғалыс жылдамдығына сәйкес келеді. (d) Жүрек кесіндісіндегі циклдік қозғалыстың (көк сызық) және жылдамдықтың (қызғылт сары нүктелі сызық) типтік траекториялары. e Цикл уақытын (әр түрлі шошқалардан n = 19 кесінді, топта), жиырылу уақытын (әр түрлі шошқалардан n = 19 кесінді), релаксация уақытын (әр түрлі шошқалардан n = 19 кесінді, топта), тін қозғалысын (әр түрлі шошқалардан n = 25), шың систолалық жылдамдықты (әр түрлі шошқалардан n = 24(D0), 25(D12) кесінді/топ) және шыңдық релаксация жылдамдығын (n = 24(D0), 25(D12) кесінді/топта) сандық бағалау. Екі жақты Стьюденттің t-тесті ешқандай параметрде айтарлықтай айырмашылық көрсеткен жоқ. f Электрлік стимуляциясы бар (қызыл) және (көк) тін кесінділерінің репрезентативті деформация талдауының іздері, сол кесіндіден алынған тін кесінділерінің он аймақтық аймағы. Төменгі панельдерде әртүрлі кесінділерден алынған он аймақта электрлік стимуляциясы бар және онсыз тін кесінділеріндегі деформацияның пайыздық айырмашылығының сандық анықталуы көрсетілген. (n = әр түрлі шошқалардан алынған 8 тілім/топ, екі құйрықты студенттің t-тесті орындалады; ****p < 0.0001, **p < 0.01, *p < 0.05). (n = әр түрлі шошқалардан алынған 8 тілім/топ, екі құйрықты студенттің t-тесті орындалады; ****p < 0.0001, **p < 0.01, *p < 0.05). (n = 8 срезов/группу от разных свиней, проводится двусторонний t-критерий Стьюдента; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05). (n = 8 секция/топ, әртүрлі шошқалардан алынған, екі құйрықты Стьюденттің t-тестісі; ****p<0.0001, **p<0.01, *p<0.05). （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p <0,0001，**p <0,01，*5）0. （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p <0,0001，**p <0,01，*5）0. (n = 8 срезов/группу, от разных свиней, екі жақты критерий Стьюдента; ****p <0,0001, **p <0,01, *p <0,05). (n = 8 бөлім/топ, әртүрлі шошқалардан, екі құйрықты Стьюдент t-тест; ****p<0.0001, **p<0.01, *p<0.05).Қателік жолақтары орташа ± стандартты ауытқуды білдіреді.
Біздің алдыңғы статикалық биомиметикалық жүрек кесінділерін өсіру жүйемізде [20, 21] біз электрлік ынталандыруды қолдану және орта құрамын оңтайландыру арқылы жүрек кесінділерінің тіршілікке қабілеттілігін, функциясын және құрылымдық тұтастығын 6 күн бойы сақтап қалдық. Дегенмен, 10 күннен кейін бұл көрсеткіштер күрт төмендеді. Біз бұрынғы статикалық биомиметикалық өсіру жүйемізде 20, 21 бақылау шарттарында (Ctrl) өсірілген кесінділерге сілтеме жасаймыз және бұрын оңтайландырылған ортаны MC жағдайлары және бір мезгілде механикалық және электрлік ынталандыру (CTCM) кезінде өсіру ретінде пайдаланамыз. деп аталады. Біріншіден, біз электрлік ынталандырусыз механикалық ынталандыру тіндердің тіршілікке қабілеттілігін 6 күн бойы сақтау үшін жеткіліксіз екенін анықтадық (қосымша 3a,b сурет). Қызығы, STCM көмегімен физио-механикалық және электрлік ынталандыруды енгізумен 12 күндік жүрек кесінділерінің тіршілікке қабілеттілігі MS жағдайында жаңа жүрек кесінділеріндегідей қалды, бірақ MTT талдауы көрсеткендей (1-сурет). 3a). Бұл жүрек циклін механикалық ынталандыру және модельдеу тін кесінділерін бұрынғы статикалық өсіру жүйемізде хабарланғандай екі есе ұзақ өміршең ұстай алатынын көрсетеді. Дегенмен, жүрек тропонини Т және коннексин 43 иммунологиялық таңбалау арқылы тін бөлімдерінің құрылымдық тұтастығын бағалау 12-ші күні MC тіндерінде сол күнгі бақылау тобына қарағанда айтарлықтай жоғары болғанын көрсетті. Дегенмен, біркелкі connexin 43 экспрессиясы және Z-дискінің түзілуі толық сақталмады (3b-сурет). Біз тіндердің құрылымдық тұтастығын сандық бағалау үшін жасанды интеллект (ЖИ) құрылымын26, тропонин-Т және коннексин бояуына негізделген кескінге негізделген терең оқыту құбырын43 пайдаланып, жүрек кесінділерінің құрылымдық тұтастығы мен флуоресценциясын локализация күші тұрғысынан автоматты түрде сандық түрде анықтаймыз. Бұл әдіс анықтамалықта сипатталғандай, жүрек тінінің құрылымдық тұтастығын автоматтандырылған және бейтарап түрде сенімді түрде сандық бағалау үшін конволюциялық нейрондық желіні (CNN) және терең оқыту құрылымын пайдаланады. 26. MC тіндері статикалық бақылау бөлімдерімен салыстырғанда 0-ші күнге дейін құрылымдық ұқсастықтың жақсарғанын көрсетті. Сонымен қатар, Массонның трихромды бояуы склероз жағдайында 12-ші күнгі бақылау жағдайларымен салыстырғанда фиброздың айтарлықтай төмен пайызын көрсетті (3c-сурет). CTCM 12-ші күні жүрек тінінің кесінділерінің тіршілікке қабілеттілігін жаңа жүрек тінінің деңгейіне ұқсас деңгейге дейін арттырғанымен, жүрек кесінділерінің құрылымдық тұтастығын айтарлықтай жақсартпады.
Бағаналық графикте жаңа жүрек кесектерінің (D0) немесе жүрек кесектерінің MTT тіршілік қабілеттілігінің сандық бағалауы статикалық дақылда (D12 Ctrl) немесе CTCM (D12 MC) (әртүрлі шошқалардан алынған n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) кесектер/топта 12 күн бойы көрсетілген, ANOVA сынағы бір жақты орындалады; ####p < 0,0001 D0-мен салыстырғанда және **p < 0,01 D12 Ctrl-мен салыстырғанда). Бағаналық графикте жаңа жүрек кесектерінің (D0) немесе жүрек кесектерінің MTT тіршілік қабілеттілігінің сандық бағалауы статикалық дақылда (D12 Ctrl) немесе CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) кесектер/топта әр түрлі шошқалардан алынған, бір жақты ANOVA сынағы орындалады; ####p < 0,0001 D0-мен салыстырғанда және **p < 0,01 D12 Ctrl-мен салыстырғанда).Гистограммада MTT жаңа жүрек кесінділерінің (D0) тіршілікке қабілеттілігінің сандық бағалауы немесе жүрек кесінділерін статикалық дақылда (D12 бақылау) немесе CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 бақылау). ), 12 (D12 MC) кесінді/топта 12 күн бойы өсіру көрсетілген, бір жақты ANOVA сынағы орындалады;####p < 0,0001 по сравнению с D0 және **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p < D0-мен салыстырғанда 0,0001 және **p < D12 Ctrl-мен салыстырғанда 0,01). a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切(D0)片或心脏切片培养12 天的MTT 活力的量化)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，切片/绑，卛南测试；与D0 相比，####p < 0,0001，与D12 Ctrl 相比，**p < 0,01)。 a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切(D0)片，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；与D0 相比，####p < 0,000l C，与1D相比，**p。)жаңа жүрек кесінділерінде (D0) немесе статикалық дақылда (D12 бақылау) немесе CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 бақылау)), әртүрлі шошқалардан алынған 12 (D12 MC) кесінді/топта 12 күн бойы өсірілген жүрек кесінділеріндегі MTT тіршілік қабілетін сандық анықтауды көрсететін гистограмма, бір жақты ANOVA сынағы;####p < 0,0001 по сравнению с D0, **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p < D0-мен салыстырғанда 0,0001, **p < D12 Ctrl-мен салыстырғанда 0,01).b Тропонин-Т (жасыл), коннексин 43 (қызыл) және DAPI (көк) жаңадан оқшауланған жүрек кесінділерінде (D0) немесе жүрек кесінділерінде статикалық жағдайларда (Ctrl) немесе CTCM жағдайларында (MC) 12 күн бойы өсірілген) репрезентативті иммунофлуоресценциялық кескіндерде (бос шкала = 100 мкм). Жүрек тінінің құрылымдық тұтастығын жасанды интеллект арқылы сандық бағалау (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) әр түрлі шошқадан алынған тілімдер/топтар, бір жақты ANOVA сынағы орындалды; ####p < 0,0001 D0-мен салыстырғанда және ****p < 0,0001 D12 Ctrl-мен салыстырғанда). Жүрек тінінің құрылымдық тұтастығын жасанды интеллект арқылы сандық бағалау (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), әр түрлі шошқалардан алынған 5 (D12 MC) тілім/топ, бір жақты ANOVA сынағы орындалды; ####p < 0,0001 D0-мен салыстырғанда және ****p < 0,0001 D12 Ctrl-мен салыстырғанда). Количественная оценка структурной целостности сердечной ткани искусственным интеллектом (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) срезов/групп от разных свиней, проводится однофакторный тест ANOVA проводится < ##0#p; #0#0 ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). Жасанды интеллект арқылы жүрек тінінің құрылымдық тұтастығын сандық бағалау (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) әртүрлі шошқалардан алынған секциялар/топтар, бір жақты ANOVA сынағы жүргізілді; ####p < 0,0001, D0 және ****p < 0,0001, D12 Ctrl-мен салыстырғанда).人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) әр түрлі шошқа тілімдері/топтары, бір жақты ANOVA сынағы #0#0;#0;相比，****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）。人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) әр түрлі шошқалардың тілімдері/топтары, бір жақты ANOVA#01 сынағы #0.#0;与D0相比，****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）。 Искусственный интеллект для количественной оценки структурной целостности сердечной ткани (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) срезов/группу каждой из разных свиней, односторонний тест ANOVA; #,#0#0ля vs. < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). Жүрек тінінің құрылымдық тұтастығын сандық бағалауға арналған жасанды интеллект (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) әр түрлі шошқалардың әрқайсысының бөлімдері/топтары, бір жақты ANOVA сынағы; ####p<0.0001 vs .D0 Салыстыру үшін ****p < D12 Ctrl-мен салыстырғанда 0.0001). c Массон трихром бояуымен боялған жүрек кесінділерінің репрезентативтік кескіндері (сол жақта) және сандық бағалауы (оң жақта) (әр түрлі шошқадан алынған n = 10 кесінді/топ, бір жақты ANOVA сынағы орындалады; ####p < 0,0001 D0-мен салыстырғанда және ***p < 0,001 D12 Ctrl-мен салыстырғанда). c Массон трихром бояуымен боялған жүрек кесінділерінің репрезентативтік кескіндері (сол жақта) және сандық бағалауы (оң жақта) (әртүрлі шошқалардан алынған n = 10 кесінді/топ, бір жақты ANOVA сынағы орындалды; #### p < 0,0001 D0-мен салыстырғанда және ***p < 0,001 D12 Ctrl-мен салыстырғанда). c Репрезентативные изображения (слева) и количественная оценка (справа) срезов сердца, окрашенных трихромным красителем Массона (масштаб без покрытия = 500 мкм) (n = 10 срезов/группу от разных свиней, выполний тест ANO# #; 0,0001 по сравнению с D0 және ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Массон трихром бояуымен боялған жүрек кесінділерінің репрезентативтік кескіндері (сол жақта) және сандық бағалауы (оң жақта) (әртүрлі шошқалардан алынған n = 10 кесінді/топ, бір жақты ANOVA сынағы жүргізілді; #### p < 0.0001 D0-мен салыстырғанда және ***p < 0.001 D12 Ctrl-мен салыстырғанда). c 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像（左）和量化（右）（裸（右）（裸（右）（裸=m=Ｚ尺尺10 个切片/组，每组来自不同的猪，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0,0001 与D0 ， 每组来自不同的猪，进行单向Ctrl 相比）. C 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 （左 左） 量化 （右） 量化 （右） 裸尺庺度裸尺度 = 500 мкм） （n = 10 个 切片 组 每 组 来自 不同 猪 ， 进行 单向 单向 单向 An # # p # 0,0001 与D0 相比，***p < 0,001 与D12 Ctrl 相比）. c Репрезентативные изображения (слева) және количественный анализ (справа) срезов сердца, окрашенных трихромным красителем Массона (чистая шкала = 500 мкм) (n = 10 срезов/группа, каждый от другой срезовые дисвиньи, потеснические протестых) анализа ;### #p < 0,0001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Массонның трихром бояуымен боялған жүрек кесінділерінің репрезентативтік кескіндері (сол жақта) және сандық бағалауы (оң жақта) (бос = 500 мкм) (n = 10 кесінді/топ, әрқайсысы әртүрлі шошқадан алынған, дисперсияның бір жақты талдауымен тексерілген;### # p < 0.0001 D0-мен салыстырғанда, ***p < 0.001 D12 Ctrl-мен салыстырғанда).Қателік жолақтары орташа ± стандартты ауытқуды білдіреді.
Біз қоректік ортаға шағын молекулаларды қосу арқылы CTCM өсіру кезінде кардиомиоциттердің тұтастығын жақсартуға және фиброздың дамуын азайтуға болады деген болжам жасадық. Сондықтан біз шатастыратын факторлардың аздығына байланысты статикалық бақылау дақылдарын пайдаланып шағын молекулаларды скринингтен өткіздік20,21. Бұл скрининг үшін дексаметазон (Dex), трийодтиронин (T3) және SB431542 (SB) таңдалды. Бұл шағын молекулалар бұрын hiPSC-CM дақылдарында саркомер ұзындығын, Т-түтікшелерін және өткізгіштік жылдамдығын арттыру арқылы кардиомиоциттердің жетілуін индукциялау үшін қолданылған. Сонымен қатар, Dex (глюкокортикоид) және SB қабынуды басатыны белгілі29,30. Сондықтан біз осы шағын молекулалардың біреуін немесе олардың тіркесімін қосу жүрек бөлімдерінің құрылымдық тұтастығын жақсарта ма, жоқ па, тексердік. Бастапқы скрининг үшін әрбір қосылыстың дозасы жасуша дақылдары модельдерінде жиі қолданылатын концентрацияларға (1 мкМ Dex27, 100 нМ T327 және 2,5 мкМ SB31) негізделіп таңдалды. 12 күндік өсіруден кейін T3 және Dex комбинациясы кардиомиоциттердің құрылымдық тұтастығын оңтайлы түрде қамтамасыз етуге және талшықты ремоделдеуді минималды түрде қамтамасыз етуге әкелді (4 және 5 қосымша суреттер). Сонымен қатар, T3 және Dex концентрацияларының екі есе немесе екі еселенген мөлшерін қолдану қалыпты концентрациялармен салыстырғанда зиянды әсерлер тудырды (6a, b қосымша сурет).
Бастапқы скринингтен кейін біз 4 өсіру жағдайын бетпе-бет салыстырдық (4a-сурет): Ctrl: бұрын сипатталған статикалық өсіруде оңтайландырылған ортаны пайдаланып өсірілген жүрек кесінділері; 20.21 TD: Сәрсенбіде T3 және Ctrl қосылған Dex; MC: бұрын оңтайландырылған ортаны пайдаланып CTCM-де өсірілген жүрек кесінділері; және MT: ортаға T3 және Dex қосылған CTCM. 12 күндік өсіруден кейін MS және MT тіндерінің тіршілік қабілеті MTT талдауымен бағаланған жаңа тіндердегідей қалды (4b-сурет). Қызығы, трансвелл дақылдарына (TD) T3 және Dex қосу Ctrl жағдайларымен салыстырғанда тіршілік қабілетінің айтарлықтай жақсаруына әкелмеді, бұл жүрек кесінділерінің тіршілік қабілетін сақтауда механикалық ынталандырудың маңызды рөлін көрсетеді.
12 күн бойы ортада механикалық ынталандырудың және T3/Dex қоспасының әсерін бағалау үшін пайдаланылған төрт өсіру жағдайын бейнелейтін эксперименттік жобалау диаграммасы. b Бағаналық графикте барлық 4 өсіру жағдайында (Ctrl, TD, MC және MT) өсіруден кейінгі 12 күннен кейінгі тіршілікке қабілеттіліктің сандық бағалауы жаңа жүрек кесектерімен (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD және D12 MT), 12 (D12 MC) кесектер/топтармен әр түрлі шошқалардан алынған, бір жақты ANOVA сынағы орындалады; ####p < 0.0001, ###p < D0-мен салыстырғанда 0.001 және **p < 0.01 D12 Ctrl-мен салыстырғанда). b Бағаналық графикте барлық 4 өсіру жағдайында (Ctrl, TD, MC және MT) өсіруден кейінгі 12 күннен кейінгі тіршілікке қабілеттіліктің сандық бағалауы жаңа жүрек кесектерімен (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD және D12 MT), 12 (D12 MC) кесектер/топтармен әр түрлі шошқалардан алынған, бір жақты ANOVA сынағы орындалады; ####p < 0.0001, ###p < D0-мен салыстырғанда 0.001 және **p < 0.01 D12 ctrl-мен салыстырғанда). b Гистограмма показывает количественную оценку жизнеспособности через 12 дней культивирование всех 4 условиях культивирование (контроль, TD, MC және MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 18), (D0, 18), TD и D12 MT), 12 (D12 MC) срезов/группу от разных свиней, проводится односторонний тест ANOVA; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 по сравнению с D0 и **p < 0,01 сравнению D2). b Бағаналық графикте барлық 4 өсіру жағдайында (бақылау, TD, MC және MT) жаңа жүрек кесінділерімен (D0) салыстырғанда 12 күннен кейін тіршілікке қабілеттіліктің сандық бағалауы көрсетілген (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD және D12 MT), 12 (D12 MC) кесінді/топ әр түрлі шошқалардан алынған, бір жақты ANOVA сынағы; ####p < 0.0001, ###p < 0.001 vs. D0 және **p < 0.01 vs. D12 Ctrl). b 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) (n = 18 (D12Dl)) TD 和D12 MT)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；####p < 0.0001；####p < 0.0001；#0.0.0.相比，**p < 0,01 与D12控制）。b 4 12 (D12 MC) b Гистограмма, показывающая все 4 условия культивирование (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD және D12 MT), от 12 MC2D срезы/группа, односторонний тест ANOVA ####p <0,0001, ###p <0,001 по сравнению с D0, **p <0,01 по сравнению с контролем D12). b Гистограммада барлық 4 өсіру жағдайы (бақылау, TD, MC және MT) жаңа жүрек кесінділерімен (D0) салыстырылған (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD және D12 MT), әртүрлі шошқалардан алынған 12 (D12 MC) кесінді/топ, бір жақты ANOVA сынағы; ####p<0.0001, ###p<0.001 vs. D0, **p<0.01 vs. бақылау D12). c Бағаналық графикте барлық 4 өсіру жағдайында (Ctrl, TD, MC және MT) өсіргеннен кейінгі 12 күндегі глюкоза ағынының сандық анықталуы жаңа жүрек кесектерімен (D0) салыстырғанда көрсетілген (әртүрлі шошқалардан алынған n = 6 кесек/топ, бір жақты ANOVA сынағы орындалды; ###p < 0,001, D0-мен салыстырғанда және ***p < 0,001, D12 Ctrl-мен салыстырғанда). c Бағаналық графикте барлық 4 өсіру жағдайында (Ctrl, TD, MC және MT) өсіргеннен кейінгі 12 күндегі глюкоза ағынының сандық анықталуы жаңа жүрек кесектерімен (D0) салыстырғанда көрсетілген (әртүрлі шошқалардан алынған n = 6 кесек/топ, бір жақты ANOVA сынағы орындалды; ###p < 0,001, D0-мен салыстырғанда және ***p < 0,001, D12 Ctrl-мен салыстырғанда). c Гистограмма показывает количественную оценку потока глюкозы cherez 12 дней кейін культивирование всех 4 условиях культивирование (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 6 срезами, Выполняется тест ANOVA; ###p < 0,001 по сравнению с D0 және ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Гистограммада 4 өсіру жағдайында (бақылау, TD, MC және MT) өсіргеннен кейінгі 12 күндегі глюкоза ағынының сандық анықталуы жаңа жүрек кесінділерімен (D0) салыстырғанда көрсетілген (n = 6 кесінді/топ, әр түрлі шошқалардан алынған, бір жақты ANOVA сынағы жүргізілді; ###p < D0-мен салыстырғанда 0,001 және ***p < D12 Ctrl-мен салыстырғанда 0,001). c 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) 相比1）天的葡萄糖通量定量（n = 6 片/组，来自不同猪，单向执行ANOVA 测试；##01；###p < 0.相比，***p < 0,001 与D12 Ctrl 相比）。 C 条形图 显示 所有 4 种 条件 （（ctrl 、 td 、 mc 和 mt） 新鲜 心脏 新鲜 心脏 戇片 切片 切片 切片 切片， 培养 后 后 12 天 的 通量 定量 （n = 6 片/组 ， 来自 猪 ， ， ， ， ， ，猪单向执行ANOVA 测试；###p < 0,001，与D0 相比，***p < 0,001 与D12 Ctrl 相比）。 c Гистограмма, показывающая количественную оценку потока глюкозы через 12 дней культивирование для всех 4 условий культивирование (контроль, TD, MC және MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n =) односторонний Были проведены тесты ANOVA ###p < 0,001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению с D12 (бақылау). c Гистограммада барлық 4 өсіру жағдайында (бақылау, TD, MC және MT) жаңа жүрек кесінділерімен (D0) салыстырғанда 12 күндік глюкоза ағынының сандық анықталуы көрсетілген (n = 6 кесінді/топ, әртүрлі шошқалардан алынған, бір жақты). ANOVA сынақтары жүргізілді, ###p < 0,001 D0-мен салыстырғанда, ***p < 0,001 D12-мен салыстырғанда (бақылау).d Он аймақтық тін кесу нүктелеріндегі жаңа (көк), 12-ші күнгі MC (жасыл) және 12-ші күнгі MT (қызыл) тіндердің штамм талдау графигтері (n = 4 тілім/топ, бір жақты ANOVA сынағы; топтар арасында айтарлықтай айырмашылық болған жоқ). e Жанартау графигі жаңа жүрек кесінділеріндегі (D0) 10-12 күн бойы статикалық жағдайларда (Ctrl) немесе MT жағдайларында (MT) өсірілген жүрек кесінділерімен салыстырғанда дифференциалды экспрессияланған гендерді көрсетеді. f Әрбір өсіру жағдайында өсірілген жүрек кесінділері үшін саркомер гендерінің жылу картасы. Қателік жолақтары орташа ± стандартты ауытқуды білдіреді.
Май қышқылдарының тотығуынан гликолизге ауысуға метаболикалық тәуелділік кардиомиоциттердің дифференциациясының ерекше белгісі болып табылады. Жетілмеген кардиомиоциттер негізінен АТФ өндірісі үшін глюкозаны пайдаланады және аз кристалдары бар гипопластикалық митохондрияларға ие5,32. Глюкозаны пайдалану талдаулары MC және MT жағдайларында глюкозаны пайдалану 0-ші күнгі тіндердегіге ұқсас екенін көрсетті (4c-сурет). Дегенмен, Ctrl үлгілері жаңа тіндермен салыстырғанда глюкозаны пайдаланудың айтарлықтай артуын көрсетті. Бұл CTCM және T3/Dex комбинациясы тіндердің тіршілік ету қабілетін арттыратынын және 12 күндік өсірілген жүрек кесінділерінің метаболикалық фенотипін сақтайтынын көрсетеді. Сонымен қатар, штамм талдауы MT және MS жағдайларында 12 күн бойы жаңа жүрек тініндегідей штамм деңгейлері сақталғанын көрсетті (4d-сурет).
CTCM және T3/Dex-тің жүрек кесіндісі тінінің жаһандық транскрипциялық ландшафтына жалпы әсерін талдау үшін біз төрт түрлі өсіру жағдайларының барлығынан жүрек кесінділеріне RNAseq жүргіздік (Қосымша деректер 1). Қызығы, MT кесінділері жаңа жүрек тініне жоғары транскрипциялық ұқсастық көрсетті, 13 642 геннің тек 16-сы ғана дифференциалды түрде экспрессияланды. Дегенмен, бұрын көрсеткендей, Ctrl кесінділері 10-12 күн өсіруден кейін 1229 дифференциалды түрде экспрессияланған генді көрсетті (4e сурет). Бұл деректер жүрек және фибробласт гендерінің qRT-ПТР арқылы расталды (7a-c қосымша сурет). Қызығы, Ctrl кесінділері жүрек және жасуша циклі гендерінің төмендеуін және қабыну гені бағдарламаларының белсенділігін көрсетті. Бұл деректер ұзақ мерзімді өсіруден кейін әдетте пайда болатын дедифференциацияның MT жағдайларында толығымен әлсірегенін көрсетеді (8a,b қосымша сурет). Саркомер гендерін мұқият зерттеу тек MT жағдайларында ғана саркомерді (4f-сурет) және иондық каналды (қосымша 9-сурет) кодтайтын гендер сақталатынын, бұл оларды Ctrl, TD және MC жағдайларында басылудан қорғайтынын көрсетті. Бұл деректер механикалық және гуморальды стимуляцияның (T3/Dex) үйлесімімен жүрек кесіндісінің транскриптомы 12 күндік өсіруден кейін жаңа жүрек кесінділеріне ұқсас болып қала алатынын көрсетеді.
Бұл транскрипциялық зерттеулер жүрек кесінділеріндегі кардиомиоциттердің құрылымдық тұтастығы MT жағдайында 12 күн бойы жақсы сақталатындығымен расталады, бұл бүтін және локализацияланған коннексин 43 арқылы көрсетілген (5a-сурет). Сонымен қатар, MT жағдайында жүрек кесінділеріндегі фиброз Ctrl-мен салыстырғанда және жаңа жүрек кесінділерімен ұқсас айтарлықтай төмендеді (5b-сурет). Бұл деректер механикалық стимуляция мен T3/Dex емінің үйлесімі өсірілген жүрек кесінділерінде жүрек құрылымын тиімді түрде сақтайтынын көрсетеді.
a Жаңадан бөлінген жүрек кесінділеріндегі (D0) немесе жүрек кесіндісінің барлық төрт өсіру жағдайында 12 күн бойы өсірілген тропонин-Т (жасыл), коннексин 43 (қызыл) және DAPI (көк) типтік иммунофлуоресценциялық кескіндері (масштабты жолақ = 100 мкм). Жүрек тінінің құрылымдық тұтастығын жасанды интеллектпен сандық бағалау (n = 7 (D0 және D12 Ctrl), әр түрлі шошқалардан алынған 5 (D12 TD, D12 MC және D12 MT) тілім/топ, бір жақты ANOVA сынағы орындалды; ####p < 0,0001 D0 және *p < 0,05-пен салыстырғанда, немесе ****p < 0,0001 D12 Ctrl-мен салыстырғанда). Жүрек тінінің құрылымдық тұтастығын жасанды интеллектпен сандық бағалау (n = 7 (D0 және D12 Ctrl), әр түрлі шошқалардан алынған 5 (D12 TD, D12 MC және D12 MT) тілім/топ, бір жақты ANOVA сынағы орындалды; #### D0 және *p < 0,05-пен салыстырғанда p < 0,0001 немесе D12 Ctrl-мен салыстырғанда ****p < 0,0001). Количественная оценка структурной целостности ткани сердца с помощью искусственного интеллект (n = 7 (D0 және D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC және D12 MT) срезов/группу от разных свиней, проведенный A## #NOVA; 0,0001 по сравнению с D0 и *p < 0,05 немесе ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). Жасанды интеллект (n = 7 (D0 және D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC және D12 MT) әртүрлі шошқалардан алынған бөлімдер/топтар, бір жақты ANOVA сынағы жүргізілді; #### D0-мен салыстырғанда p < 0,0001 және *p < 0,05 немесе D12 Ctrl-мен салыстырғанда ****p < 0,0001).对不同猪的心脏组织结构完整性（n = 7（D0 和D12 Ctrl）、5（D12 TD、D12 MC 和D12 MT）切片/组）进行人工智能量化，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0,0001 与D0 和*5 減 p <0.（） 0,0001 与D12 Ctrl 相比）。对 不同 猪 的 心脏 结构 完整性 （n = 7 （d0 和 d12 ctrl） （5 （d12 td 、 d12 mc ） 缉 缉人工 智能量 化 进行 单向 单向 单向 测试 ； ######### p < 0,0001 与D0 和撌*p < 0,05p 0,0001 与D12 Ctrl 相比）。Әртүрлі шошқаларда (n = 7 (D0 және D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC және D12 MT) бөлімдер/топ) бір жақты ANOVA сынағымен жасанды интеллект көмегімен жүрек тінінің құрылымдық тұтастығын сандық анықтау;#### p < 0,0001 по сравнению с D0 и *p < 0,05 немесе ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). #### p < 0.0001 D0-мен салыстырғанда және *p < 0.05 немесе ****p < 0.0001 D12 Ctrl-мен салыстырғанда). b Массон трихром бояуымен боялған жүрек кесінділерінің репрезентативті кескіндері және сандық бағалауы (масштаб жолағы = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD және D12 MC), әртүрлі шошқалардан алынған 9 (D12 MT) кесінді/топ, бір жақты ANOVA сынағы орындалды; ####p < 0,0001 D0 және ***p < 0,001-мен салыстырғанда, немесе ****p < 0,0001 D12 Ctrl-мен салыстырғанда). b Массон трихром бояуымен боялған жүрек кесінділерінің репрезентативті кескіндері және сандық бағалауы (масштаб жолағы = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD және D12 MC), әртүрлі шошқалардан алынған 9 (D12 MT) кесінді/топ, бір жақты ANOVA сынағы орындалды; ####p < 0,0001 D0 және ***p < 0,001-мен салыстырғанда, немесе ****p < 0,0001 D12 Ctrl-мен салыстырғанда). b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромным красителем Массона (масштабная линейка = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD және D12 MT разг12), 9 рупх (с) свиней, выполняется односторонний тест ANOVA ####p < 0,0001 по сравнению с D0 және ***p < 0,001 немесе ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). b Массон трихром бояуымен боялған жүрек кесінділерінің репрезентативті кескіндері және сандық бағалауы (масштабты жолақ = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD және D12 MC), әр түрлі шошқалардан алынған 9 (D12 MT) кесінді/топ, бір жақты ANOVA әдісімен орындалды; ####p < 0,0001 vs. D0 және ***p < 0,001 немесе ****p < 0,0001 vs. D12 Ctrl). b 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像和量化（比例尺= 500 мкм）1（0D2D Ctrl、D12 TD 和D12 MC），来自不同猪的9 个（D12 MT）切片/组，进行单因素方差）0#p#0#p.与D0 相比，***p <0,001，或****p <0,0001 与D12 Ctrl 相比）。 b 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 和 量化 （比例 尺 尺 尺 = 500 （（0d（n（n d12 ctrl 、 d12 td 和 d12 mc） 来自 不同 的 9 个 d12 mt 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切 片切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片/组，进行单因素方差分析；####p < 0,0001 与D0 相比，***p <0,***p 0,0001 与D12 Ctrl 相比）。 b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромом Массона (масштабная линейка = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD және D12 MC), 9 (D12 от вин) способ ANOVA; ####p < 0,0001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 немесе ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). b Массон трихромымен (масштабты жолақ = 500 мкм) боялған жүрек кесінділерінің репрезентативті кескіндері және сандық бағалауы (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD және D12 MC), әртүрлі шошқалардан/топтардан алынған 9 (D12 MT) кесінділер, бір ANOVA әдісі; ####p < 0,0001 D0-мен салыстырғанда, ***p < 0,001 немесе ****p < 0,0001 D12 Ctrl-мен салыстырғанда).Қателік жолақтары орташа ± стандартты ауытқуды білдіреді.
Соңында, CTCM жүрек гипертрофиясын имитациялау қабілеті жүрек тінінің созылуын арттыру арқылы бағаланды. CTCM кезінде ауа камерасының шыңдық қысымы 80 мм сын. бағ. (қалыпты созылу) 140 мм сын. бағ. дейін өсті (6a-сурет). Бұл созылудың 32%-ға артуына сәйкес келеді (6b-сурет), бұл бұрын гипертрофияда байқалатын саркомер ұзындығына жету үшін жүрек кесінділері үшін қажетті тиісті пайыздық созылу ретінде көрсетілген. Жиырылу және релаксация кезінде жүрек тінінің созылуы мен жылдамдығы алты күндік өсіру кезінде тұрақты болып қалды (6c-сурет). MT жағдайындағы жүрек тіндері алты күн бойы қалыпты созылу (MT (қалыпты)) немесе шамадан тыс созылу жағдайларына (MT (OS)) ұшырады. Төрт күн өсіруден кейін гипертрофиялық биомаркер NT-ProBNP MT (OS) жағдайындағы ортада MT (қалыпты) жағдайлармен салыстырғанда айтарлықтай жоғарылады (7a-сурет). Сонымен қатар, алты күндік өсіруден кейін MT (OS) жасушаларының мөлшері (7b-сурет) MT жүрегінің бөліктерімен салыстырғанда айтарлықтай өсті (қалыпты). Сонымен қатар, NFATC4 ядролық транслокациясы шамадан тыс созылған тіндерде айтарлықтай өсті (7c-сурет). Бұл нәтижелер гиперсозылудан кейін патологиялық қайта құрудың прогрессивті дамуын көрсетеді және CTCM құрылғысын созылудан туындаған жүрек гипертрофиясы сигналын зерттеу үшін платформа ретінде пайдалануға болады деген тұжырымдаманы қолдайды.
Ауа камерасының қысымының, сұйықтық камерасының қысымының және тін қозғалысын өлшеудің типтік іздері камера қысымының сұйықтық камерасының қысымын өзгертетінін, тін кесіндісінің сәйкес қозғалысын тудыратынын растайды. b Қалыпты созылған (қызғылт сары) және шамадан тыс созылған (көк) тін бөліктері үшін типтік созылу пайызы мен созылу жылдамдығының қисықтары. c Цикл уақытын (әр түрлі шошқалардан алынған топта n = 19 тілім), жиырылу уақытын (әр түрлі шошқалардан алынған топта n = 18-19 тілім), релаксация уақытын (әр түрлі шошқалардан алынған топта n = 19 тілім), тін қозғалысының амплитудасын (әр түрлі шошқалардан алынған n = 14 тілім/топ), шың систолалық жылдамдықты (әр түрлі шошқалардан алынған n = 14 тілім/топ) және шың релаксация жылдамдығын (әр түрлі шошқалардан алынған n = 14 (D0), 15 (D6)) көрсететін бағаналық график, екі жақты Стьюденттің t-тестінде ешқандай параметрде айтарлықтай айырмашылық болған жоқ, бұл параметрлердің шамадан тыс кернеумен өсірудің 6 күні ішінде тұрақты болып қалғанын көрсетеді. Қателік жолақтары орташа ± стандартты ауытқуды білдіреді.
a Әртүрлі шошқалардан алынған MT қалыпты созылу (Норм) немесе шамадан тыс созылу (OS) жағдайларында (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm және D4 MTOS) кесектер/топтарда өсірілген жүрек кесектерінен алынған өсіру орталарындағы NT-ProBNP концентрациясының бағаналық графикалық сандық көрсеткіші, Екі жақты ANOVA орындалады; **қалыпты созылумен салыстырғанда p < 0,01). Әртүрлі шошқалардан алынған MT қалыпты созылу (Норм) немесе шамадан тыс созылу (OS) жағдайларында (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm және D4 MTOS) кесектер/топтарда өсірілген жүрек кесектерінен алынған өсіру орталарындағы NT-ProBNP концентрациясының бағаналық графикалық сандық көрсеткіші, екі жақты ANOVA орындалады; **қалыпты созылумен салыстырғанда p < 0,01).Әртүрлі шошқалардан алынған қалыпты MT созылу (норма) немесе шамадан тыс созылу (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm және D4).MTOS) кесектері/топ жағдайында өсірілген жүрек кесектерінен алынған қоректік ортадағы NT-ProBNP концентрациясының сандық гистограммасы, дисперсияның екі факторлы талдауы жүргізілді;**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **қалыпты созылумен салыстырғанда p < 0,01). a 在MT 正常拉伸(Norm) 或过度拉伸(OS) 条件下培养的心脏切片培养基中NT-ProBNP浓度的条形图量化（n = 4 (D2 MTNorm)、3（D2 MTOS、D4 MTNorm 和D4 MTOS）来自不同猪的切片/组，进行双向方差分析；**与正常拉伸相比，p < 0,01 a MT қалыпты созылу (Норма) немесе шамадан тыс созылу (OS) жағдайында (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm和D4 MTOS) әр түрлі жағдайларда өсірілген жүрек тіліктеріндегі NT-ProBNP концентрациясының сандық көрсеткіші.猪的切片/组，可以双向方方发发动; **қалыпты созылумен салыстырғанда, p <0,01).гистограмма Әртүрлі шошқалардан алынған қалыпты MT созылу (норма) немесе шамадан тыс созылу (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm) және D4 MTOS) кесектері/топтары жағдайында өсірілген жүрек кесектеріндегі NT-ProBNP концентрациясын сандық анықтау, дисперсияның екі жақты талдауы;**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **қалыпты созылумен салыстырғанда p < 0,01). b Тропонин-Т және WGA-мен боялған жүрек кесінділерінің репрезентативті кескіндері (сол жақта) және жасуша өлшемін сандық анықтау (оң жақта) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) жасуша/топ әртүрлі шошқалардың 10 түрлі кесіндісінен алынған, екі құйрықты студенттік t-тест орындалады; қалыпты созылумен салыстырғанда ****p < 0,0001). b Тропонин-Т және WGA-мен боялған жүрек кесінділерінің репрезентативті кескіндері (сол жақта) және жасуша өлшемін сандық анықтау (оң жақта) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) жасуша/топ әр түрлі шошқалардың 10 түрлі кесіндісінен алынған, екі құйрықты студенттің t-тесті орындалады; қалыпты созылумен салыстырғанда ****p < 0,0001). b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т және АЗП (слева) және количественного определения размера клеток (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) сразовные клеток/групп два- проводится хвостовой t-критерий Стьюдента ****p < 0,0001 по сравнению с нормальным растяжением). b Тропонин-Т және AZP-мен боялған жүрек кесінділерінің репрезентативтік суреттері (сол жақта) және жасуша өлшемін сандық анықтау (оң жақта) (n = 330 (D6 MTOS), екі құйрықты шошқалардың 10 түрлі кесіндісінен алынған 369 (D6 MTNorm) жасуша/топ, Стьюденттің t-тесті орындалды; қалыпты штамммен салыстырғанда ****p < 0,0001). b 用肌钙蛋白-T 和WGA（左）和细胞大小量化（右）染色的心脏切片的心脏切片的代脏切片的代表切片的代表往弗MTOS），来自不同猪的10 个不同切片的369（D6 MTNorm）细胞/组，两进行有尾t学检验；与正常拉伸相比，****p <0,0001）。 b Кальцареин-Т және WGA-мен боялған жүрек кесінділерінің (сол жақта) және жасуша өлшемінің (оң жақта) типтік суреттері (n = 330 (D6 MTOS), 10 түрлі кесіндіден 369 (D6 MTNorm)) Қалыпты созылумен салыстырғанда жасушалар/жүйелер, ****p < 0.0001). b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т және АЗП (слева) және количественная оценка размера клеток (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) 10 срезовые срезовки/ двусторонние критерий Стьюдента; ****p < 0,0001 по сравнению с нормальным растяжением). b Тропонин-Т және AZP-мен боялған жүрек кесінділерінің репрезентативтік суреттері (сол жақта) және жасуша өлшемін сандық анықтау (оң жақта) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) әртүрлі шошқалардың 10 түрлі кесіндісінен алынған) Жасушалар/топ, екі жақты критерий Стьюденттің t; ****p < 0,0001 қалыпты штамммен салыстырғанда). c Тропонин-T және NFATC4 үшін иммундық таңбаланған MTOS жүрек кесінділерінің 0 және 6-күндерінің типтік кескіндері және NFATC4-тің CM ядроларына транслокациясын сандық бағалау (n = 4 (D0), әртүрлі шошқалардан алынған 3 (D6 MTOS) кесінді/топ, Екі құйрықты Студент t-тесті орындалды; *p < 0,05). c Тропонин-T және NFATC4 үшін иммундық таңбаланған MTOS жүрек кесінділерінің 0 және 6-күндерінің типтік кескіндері және NFATC4-тің CM ядроларына транслокациясын сандық бағалау (n = 4 (D0), әртүрлі шошқалардан алынған 3 (D6 MTOS) кесінді/топ, екі құйрықты Студент t-тесті орындалды; *p <0,05). c Срезов сердца 0 және 6 күндік MTOS, тропонина-Т және NFATC4 үшін иммуномечены, және NFATC4 және ядра кавернозных клеток (n = 4 (D0), 3D срезговы срезговые MTOS) үшін өкілдік изображениялар , выполняется двусторонний t-критерий Стьюдента *p < 0,05); c 0 және 6 күндік MTOS кезіндегі жүрек кесінділерінің репрезентативтік кескіндері, тропонин-T және NFATC4 үшін иммундық таңбаланған және кавернозды жасушалардың ядросындағы NFATC4 транслокациясын сандық анықтау (n = 4 (D0), әртүрлі шошқалардан алынған 3 (D6 MTOS) тілім/топ) екі жақты Стьюдент t-тесті орындалды; *p < 0,05). c 用于肌钙蛋白-T 和NFATC4 免疫标记的第0 天和第6 天MTOS心脏切片的代表性图像，以及来自不同猪的NFATC4 易位至CM 细胞核的量化（6(MT4（0)切片/组, 进行双尾学生t 检验；*p < 0,05)。 c Калканин-T және NFATC4 иммунотаңбалау 第0天和第6天MTOS жүрек тілімдерінің және NFATC4 түрлі NFATC4 易位至CM жасуша ядросынан алынған репрезентативті кескіндер的quantity化 (n = 4 (D0), 3 MT (MT) 爻 D)时间双尾学生et 电影；*p < 0,05). c Репрезентативные изображения срезов сердца MTOS на 0 және 6 деннь үшін иммуномаркировки тропонином-Т және NFATC4 және количественная оценка транслокации NFATC4 в ядра CM от разных свиней (n = 4 (D0), 3 (D6/MTOS), д) t-критериий Стьюдента; *p < 0,05). c Әртүрлі шошқалардан алынған CM ядросындағы тропонин-T және NFATC4 иммунологиялық таңбалау және NFATC4 транслокациясын сандық анықтау үшін 0 және 6-шы күндердегі MTOS жүрек кесінділерінің типтік суреттері (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) кесінді/топ, екі жақты t-критерийі, Студенттік; *p < 0,05).Қателік жолақтары орташа ± стандартты ауытқуды білдіреді.
Трансляциялық жүрек-қан тамырлары зерттеулері жүрек ортасын дәл қайталайтын жасушалық модельдерді қажет етеді. Бұл зерттеуде жүректің ультра жұқа бөліктерін ынталандыра алатын CTCM құрылғысы жасалды және сипатталды. CTCM жүйесі физиологиялық синхрондалған электромеханикалық ынталандыруды және T3 және Dex сұйықтығын байытуды қамтиды. Шошқа жүрегінің бөліктері осы факторларға ұшыраған кезде, олардың тіршілік қабілеті, құрылымдық тұтастығы, метаболикалық белсенділігі және транскрипциялық экспрессиясы 12 күндік өсіруден кейін жаңа жүрек тініндегідей болып қалды. Сонымен қатар, жүрек тінінің шамадан тыс созылуы гиперэкстензиядан туындаған жүректің гипертрофиясын тудыруы мүмкін. Жалпы алғанда, бұл нәтижелер физиологиялық өсіру жағдайларының қалыпты жүрек фенотипін сақтаудағы маңызды рөлін қолдайды және дәрілік заттарды скринингтеу үшін платформа ұсынады.
Кардиомиоциттердің жұмыс істеуі мен тіршілігі үшін оңтайлы ортаны жасауға көптеген факторлар ықпал етеді. Бұл факторлардың ең айқындары (1) жасушааралық өзара әрекеттесулермен, (2) электромеханикалық ынталандырумен, (3) гуморальды факторлармен және (4) метаболикалық субстраттармен байланысты. Физиологиялық жасушааралық өзара әрекеттесулер жасушадан тыс матрицамен қолдау көрсетілетін бірнеше жасуша түрлерінің күрделі үш өлшемді желілерін қажет етеді. Мұндай күрделі жасушалық өзара әрекеттесулерді жеке жасуша түрлерін бірлесіп өсіру арқылы in vitro қалпына келтіру қиын, бірақ жүрек бөлімдерінің органотиптік сипатын пайдаланып оңай қол жеткізуге болады.
Кардиомиоциттердің механикалық созылуы және электрлік ынталандыруы жүрек фенотипін сақтау үшін өте маңызды33,34,35. Механикалық ынталандыру hiPSC-CM кондициясы мен жетілу үшін кеңінен қолданылғанымен, жақында бірнеше талғампаз зерттеулер жүрек кесінділерін бір осьті жүктемені қолдана отырып, өсіруде механикалық ынталандыруға тырысты. Бұл зерттеулер 2D бір осьті механикалық жүктеме өсіру кезінде жүректің фенотипіне оң әсер ететінін көрсетеді. Бұл зерттеулерде жүректің бөліктері изометриялық созылу күштерімен17, сызықтық аукотоникалық жүктемемен18 жүктелді немесе жүрек циклі күш түрлендіргішінің кері байланысы мен кернеу қозғағыштарын пайдаланып қайта жасалды. Дегенмен, бұл әдістер қоршаған ортаны оңтайландырусыз бір осьті тіндердің созылуын пайдаланады, бұл көптеген жүрек гендерін басуға немесе қалыптан тыс созылу реакцияларымен байланысты гендердің шамадан тыс экспрессиясына әкеледі. Мұнда сипатталған CTCM цикл уақыты мен физиологиялық созылу тұрғысынан табиғи жүрек циклін имитациялайтын 3D электромеханикалық ынталандыруды қамтамасыз етеді (25% созылу, 40% систола, 60% диастола және минутына 72 соққы). Тіндердің тұтастығын сақтау үшін бұл үш өлшемді механикалық стимуляцияның өзі жеткіліксіз болса да, тіндердің тіршілік қабілетін, функциясын және тұтастығын жеткілікті түрде сақтау үшін T3/Dex қолдана отырып, гуморальды және механикалық стимуляцияның үйлесімі қажет.
Гуморальды факторлар ересек жүрек фенотипін модуляциялауда маңызды рөл атқарады. Бұл жасушалардың жетілуін жеделдету үшін өсірілетін ортаға T3 және Dex қосылған HiPS-CM зерттеулерінде атап өтілді. T3 аминқышқылдарының, қанттардың және кальцийдің жасуша мембраналары арқылы тасымалдануына әсер етуі мүмкін36. Сонымен қатар, T3 MHC-α экспрессиясын және MHC-β төмендеуін күшейтеді, ұрықтың CM-дегі баяу жиырылатын миофибриллалармен салыстырғанда жетілген кардиомиоциттерде жылдам жиырылатын миофибриллалар түзілуін күшейтеді. Гипотиреозбен ауыратын науқастарда T3 жетіспеушілігі миофибриллалар жолақтарының жоғалуына және тонустың даму жылдамдығының төмендеуіне әкеледі37. Dex глюкокортикоидты рецепторларға әсер етеді және оқшауланған перфузияланған жүректерде миокардтың жиырылуын арттыратыны көрсетілген;38 бұл жақсару кальций шөгінділеріне (SOCE) әсер етуімен байланысты деп саналады39,40. Сонымен қатар, Dex өз рецепторларымен байланысады, бұл иммундық функция мен қабынуды басатын кең жасушаішілік реакцияны тудырады30.
Біздің нәтижелеріміз физикалық механикалық стимуляцияның (MS) Ctrl-мен салыстырғанда жалпы дақыл өнімділігін жақсартқанын, бірақ 12 күн ішінде дақылда тіршілікке қабілеттілікті, құрылымдық тұтастықты және жүрек экспрессиясын сақтай алмағанын көрсетеді. Ctrl-мен салыстырғанда, CTCM (MT) дақылдарына T3 және Dex қосу тіршілікке қабілеттілікті жақсартты және 12 күн бойы жаңа жүрек тінімен ұқсас транскрипция профильдерін, құрылымдық тұтастықты және метаболикалық белсенділікті сақтады. Сонымен қатар, тіндердің созылу дәрежесін бақылау арқылы STCM көмегімен гиперэкстензиядан туындаған жүрек гипертрофиясының моделі жасалды, бұл STCM жүйесінің әмбебаптығын көрсетеді. Жүректің қайта құрылуы мен фиброзына әдетте қан айналымындағы жасушалары тиісті цитокиндерді, сондай-ақ фагоцитозды және басқа да қайта құрылу факторларын қамтамасыз ете алатын бүтін мүшелер әсер етсе де, жүректің бөліктері стресс пен жарақатқа жауап ретінде фиброзды процесті имитациялай алатынын атап өткен жөн. миофибробласттарға. Бұл бұрын осы жүрек кесіндісінің моделінде бағаланған болатын. CTCM параметрлерін тахикардия, брадикардия және механикалық қан айналымын қолдау (механикалық жүктемесіз жүрек) сияқты көптеген жағдайларды модельдеу үшін қысымды/электрлік амплитуда мен жиілікті өзгерту арқылы модуляциялауға болатынын атап өткен жөн. Бұл жүйені дәрілік заттарды сынау үшін орташа өткізу қабілетіне айналдырады. CTCM-нің шамадан тыс күш түсіруден туындаған жүрек гипертрофиясын модельдеу мүмкіндігі бұл жүйені жеке терапия үшін сынауға жол ашады. Қорытындылай келе, осы зерттеу механикалық созылу және гуморальды ынталандыру жүрек тінінің кесінділерін өсіру үшін өте маңызды екенін көрсетеді.
Мұнда келтірілген деректер CTCM интактілі миокардты модельдеу үшін өте перспективалы платформа екенін көрсеткенімен, бұл өсіру әдісінің кейбір шектеулері бар. CTCM өсірудің негізгі шектеуі - кесінділерге үздіксіз динамикалық механикалық кернеулер түсіреді, бұл әрбір цикл кезінде жүрек кесінділерінің жиырылуын белсенді түрде бақылау мүмкіндігін болдырмайды. Сонымен қатар, жүрек кесінділерінің кіші өлшеміне (7 мм) байланысты дәстүрлі күш сенсорларын пайдаланып, өсіру жүйелерінен тыс систолалық функцияны бағалау мүмкіндігі шектеулі. Ағымдағы қолжазбада біз оптикалық кернеуді жиырылу функциясының индикаторы ретінде бағалау арқылы бұл шектеуді ішінара жеңеміз. Дегенмен, бұл шектеу қосымша жұмысты қажет етеді және болашақта кальций мен кернеуге сезімтал бояғыштарды пайдалана отырып оптикалық карта жасау сияқты өсірудегі жүрек кесінділерінің функциясын оптикалық бақылау әдістерін енгізу арқылы шешілуі мүмкін. CTCM-нің тағы бір шектеуі - жұмыс моделі физиологиялық стрессті (алдын ала жүктеу және кейінгі жүктеу) басқармайды. CTCM-де қысым өте үлкен тіндерде диастолада (толық созылу) және систолада (электрлік стимуляция кезіндегі жиырылу ұзақтығы) 25% физиологиялық созылуды көбейту үшін қарама-қарсы бағытта индукцияланды. Бұл шектеуді болашақ CTCM жобаларында жүрек тініне екі жағынан да жеткілікті қысым жасау және жүрек камераларында пайда болатын қысым-көлем қатынастарын дәл қолдану арқылы алып тастау керек.
Осы қолжазбада баяндалған шамадан тыс созылудан туындаған қайта құру гипертрофиялық гиперсозылу сигналдарын имитациялаумен шектеледі. Осылайша, бұл модель гуморальды немесе жүйке факторларына (бұл жүйеде жоқ) қажеттіліксіз созылудан туындаған гипертрофиялық сигнал беруді зерттеуге көмектесе алады. CTCM көптігін арттыру үшін қосымша зерттеулер қажет, мысалы, иммундық жасушалармен, айналымдағы плазма гуморальды факторларымен және нейрондық жасушалармен бірлесіп өсіру кезінде иннервация CTCM көмегімен ауруларды модельдеу мүмкіндіктерін жақсартады.
Бұл зерттеуде он үш шошқа пайдаланылды. Жануарларға жүргізілген барлық процедуралар мекемелік нұсқауларға сәйкес орындалды және Луисвилл университетінің жануарларды күту және пайдалану жөніндегі мекемелік комитетімен мақұлданды. Қолқа доғасы қысылып, жүрекке 1 л стерильді кардиоплегия (110 мМ NaCl, 1,2 мМ CaCl2, 16 мМ KCl, 16 мМ MgCl2, 10 мМ NaHCO3, 5 U/мл гепарин, рН 7,4 дейін) құйылды; Жүректер мұздай кардиоплегиялық ерітіндіде зертханаға мұзбен тасымалданғанға дейін сақталды, бұл әдетте 10 минуттан аз уақытты алады. Жүректер мұздай кардиоплегиялық ерітіндіде зертханаға мұзбен тасымалданғанға дейін сақталды, бұл әдетте 10 минуттан аз уақытты алады. сердца хранили в ледяном кардиоплегическом расстворе до транспортировки в лабораторию на льду, что обычно занимает <10 мин. Жүректер мұздай суық кардиоплегиялық ерітіндіде сақталды, ол әдетте 10 минуттан аз уақытты алады.将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10刂钟将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10刂钟 Держите сердца в ледяной кардиоплегии до транспортировки в лабораторию на льду, обычно <10 мин. Жүректі мұзда ұстаңыз, кардиоплегия кезінде зертханаға мұзбен жеткізілгенге дейін, әдетте <10 минут.
CTCM құрылғысы SolidWorks компьютерлік көмегімен жобалау (CAD) бағдарламалық жасақтамасында жасалған. Өсіру камералары, бөлгіштер және ауа камералары CNC мөлдір акрил пластиктен жасалған. Диаметрі 7 мм болатын қосалқы сақина ортасында жоғары тығыздықты полиэтиленнен (HDPE) жасалған және астындағы ортаны тығыздау үшін қолданылатын силикон сақинасын орналастыру үшін сақиналы ойығы бар. Жұқа кремний диоксиді мембранасы өсіру камерасын бөлу пластинасынан бөледі. Силикон мембранасы 0,02 дюйм қалыңдықтағы силикон парағынан лазермен кесілген және қаттылығы 35 А. Төменгі және жоғарғы силикон төсемдері 1/16 дюйм қалыңдықтағы силикон парағынан лазермен кесілген және қаттылығы 50 А. Блокты бекіту және ауа өткізбейтін тығыздағыш жасау үшін 316L тот баспайтын болаттан жасалған бұрандалар мен қанат гайкалары қолданылады.
Арнайы баспа схемасы (БС) C-PACE-EM жүйесімен біріктірілуге ​​арналған. БС-дағы швейцариялық машина қосқыштарының ұялары күміс жалатылған мыс сымдар және электродтарға бұралған қола 0-60 бұрандалар арқылы графит электродтарына қосылған. Баспа схемасы 3D принтердің қақпағына орналастырылған.
CTCM құрылғысы жүрек цикліне ұқсас басқарылатын қан айналымы қысымын жасайтын бағдарламаланатын пневматикалық жетек (PPD) арқылы басқарылады. Ауа камерасының ішіндегі қысым артқан сайын, икемді силикон мембранасы жоғары қарай кеңейіп, ортаны тін аймағының астына итереді. Содан кейін тін аймағы сұйықтықтың осы шығарылуымен созылады, бұл диастола кезінде жүректің физиологиялық кеңеюін имитациялайды. Релаксация шыңында графит электродтары арқылы электрлік ынталандыру қолданылды, бұл ауа камерасындағы қысымды төмендетіп, тін бөліктерінің жиырылуына әкелді. Құбырдың ішінде ауа жүйесіндегі қысымды анықтауға арналған қысым сенсоры бар гемостатикалық клапан орналасқан. Қысым сенсорымен сезілетін қысым ноутбукке қосылған деректер жинағышқа беріледі. Бұл газ камерасының ішіндегі қысымды үздіксіз бақылауға мүмкіндік береді. Максималды камера қысымына жеткенде (стандартты 80 мм сын. бағ., 140 мм сын. бағ. OS), деректерді жинау құрылғысына 4 В-қа орнатылған 2 мс үшін екі фазалы кернеу сигналын жасау үшін C-PACE-EM жүйесіне сигнал жіберуге тапсырыс берілді.
Жүрек кесінділері алынды және 6 ұңғымадағы өсіру жағдайлары келесідей орындалды: Жиналған жүректерді тасымалдау ыдысынан суық (4°C) кардиоплегия салынған науаға ауыстырыңыз. Сол жақ қарынша стерильді пышақпен оқшауланып, 1-2 см3 кесектерге кесілді. Бұл тін блоктары тін тіректеріне тін желімімен бекітіліп, Тирод ерітіндісі бар дірілдейтін микротом тін ваннасына орналастырылды және үздіксіз оттегімен қанықтырылды (3 г/л 2,3-бутандион монооксимі (BDM), 140 мМ NaCl (8,18 г), 6 мМ KCl (0,447 г), 10 мМ D-глюкоза (1,86 г), 10 мМ HEPES (2,38 г), 1 мМ MgCl2 (1 мл 1 М ерітінді), 1,8 мМ CaCl2 (1,8 мл 1 М ерітінді), 1 л ddH2O дейін). Дірілдейтін микротом 80 Гц жиілікте, көлденең діріл амплитудасы 2 мм және 0,03 мм/с ілгерілеу жылдамдығымен 300 мкм қалыңдықтағы кесектерді кесуге орнатылды. Ерітіндіні салқын ұстау үшін тін ваннасы мұзбен қоршалған және температура 4°C температурада сақталған. Бір дақыл пластинасына жеткілікті кесінділер алынғанша, микротом ваннасынан тін бөліктерін мұзда үздіксіз оттегімен қаныққан Тирод ерітіндісі бар инкубациялық ваннаға ауыстырыңыз. Трансвелл дақылдары үшін тін бөліктері стерильді 6 мм ені бар полиуретанды тіректерге бекітіліп, 6 мл оңтайландырылған ортаға (199 орта, 1x ITS қоспасы, 10% FBS, 5 нг/мл VEGF, 10 нг/мл FGF-сілтілік және 2X антибиотик-саңырауқұлаққа қарсы) орналастырылды. C-Pace арқылы тін бөліктеріне электрлік ынталандыру (10 В, жиілігі 1,2 Гц) қолданылды. TD жағдайлары үшін әрбір ортаны ауыстырған сайын жаңа T3 және Dex 100 нМ және 1 мкМ қосылды. Ортаны күніне 3 рет ауыстырмас бұрын оттегімен қанықтырылады. Тін кесінділері инкубаторда 37°C температурада және 5% CO2 деңгейінде өсірілді.
CTCM дақылдары үшін тін кесінділері модификацияланған Тирод ерітіндісі бар Петри ыдысындағы арнайы жасалған 3D принтерге орналастырылды. Құрылғы жүрек кесіндісінің өлшемін тірек сақинасы ауданының 25%-ына ұлғайтуға арналған. Бұл Тирод ерітіндісінен ортаға ауыстырылғаннан кейін және диастола кезінде жүрек кесінділері созылмауы үшін жасалады. Гистоакрил желімін пайдаланып, диаметрі 7 мм тірек сақинасына қалыңдығы 300 мкм кесінділер бекітілді. Тін кесінділерін тірек сақинасына бекіткеннен кейін, артық тін кесінділерін кесіп алып, бекітілген тін кесінділерін бір құрылғыға жеткілікті кесінділер дайындалғанша мұздағы (4°C) Тирод ерітіндісінің ваннасына қайта салыңыз. Барлық құрылғылар үшін жалпы өңдеу уақыты 2 сағаттан аспауы керек. 6 тін кесіндісі тірек сақиналарына бекітілгеннен кейін, CTCM құрылғысы жиналды. CTCM дақыл камерасы 21 мл алдын ала оттегімен қаныққан ортамен алдын ала толтырылған. Тін кесінділерін дақыл камерасына ауыстырып, ауа көпіршіктерін пипеткамен абайлап алып тастаңыз. Содан кейін тін бөлігі тесікке бағытталып, орнына ақырын басылады. Соңында, электрод қақпағын құрылғыға қойып, құрылғыны инкубаторға ауыстырыңыз. Содан кейін CTCM ауа түтігіне және C-PACE-EM жүйесіне қосылады. Пневматикалық жетек ашылады, ал ауа клапаны CTCM-ді ашады. C-PACE-EM жүйесі екі фазалы кардиостимуляция кезінде 2 мс бойы 1,2 Гц жиілікте 4 В кернеуді жеткізуге конфигурацияланған. Электродтарда графиттің жиналуын болдырмау үшін орта күніне екі рет, ал электродтар күніне бір рет ауыстырылып отырды. Қажет болған жағдайда, астына түсіп қалған ауа көпіршіктерін шығару үшін тін бөліктерін өсіру ұңғымаларынан алып тастауға болады. MT өңдеу жағдайлары үшін әрбір ортаны ауыстырған сайын T3/Dex 100 нМ T3 және 1 мкМ Dex қосылып, жаңадан қосылды. CTCM құрылғылары инкубаторда 37°C температурада және 5% CO2-де өсірілді.
Жүрек кесінділерінің созылған траекторияларын алу үшін арнайы камера жүйесі жасалды. Navitar Zoom 7000 18-108 мм макро линзасымен (Navitar, Сан-Франциско, Калифорния) SLR камерасы (Canon Rebel T7i, Canon, Токио, Жапония) пайдаланылды. Ортаны жаңа ортамен ауыстырғаннан кейін визуализация бөлме температурасында орындалды. Камера 51° бұрышта орналастырылған және бейне секундына 30 кадр жиілігінде жазылады. Алдымен, жүрек кесінділерінің қозғалысын сандық бағалау үшін Image-J көмегімен ашық бастапқы кодты бағдарламалық жасақтама (MUSCLEMOTION43) пайдаланылды. Маска шуды болдырмау үшін жүрек кесінділерінің соғуына қызығушылық аймақтарын анықтау үшін MATLAB (MathWorks, Natick, MA, АҚШ) көмегімен жасалды. Қолмен сегменттелген маскалар кадр тізбегіндегі барлық кескіндерге қолданылады, содан кейін MUSCLEMOTION плагиніне беріледі. Muscle Motion әрбір кадрдағы пикселдердің орташа қарқындылығын оның анықтамалық кадрға қатысты қозғалысын сандық бағалау үшін пайдаланады. Деректер жазылып, сүзіліп, цикл уақытын сандық анықтау және жүрек циклі кезінде тіндердің созылуын бағалау үшін пайдаланылды. Жазылған бейне бірінші ретті нөлдік фазалы сандық сүзгіні пайдаланып кейіннен өңделді. Тіндердің созылуын (шыңнан шыңға дейін) сандық анықтау үшін жазылған сигналдағы шыңдар мен төмендеулерді ажырату үшін шыңнан шыңға дейін талдау жүргізілді. Сонымен қатар, сигнал дрейфін жою үшін 6-шы ретті полиномды пайдаланып трендті детекторлау жүргізіледі. Бағдарлама коды MATLAB-та тіндердің жаһандық қозғалысын, цикл уақытын, релаксация уақытын және жиырылу уақытын анықтау үшін жасалды (қосымша бағдарлама коды 44).
Деформацияны талдау үшін механикалық созылуды бағалау үшін жасалған бейнелерді пайдаланып, алдымен MUSCLEMOTION бағдарламалық жасақтамасына сәйкес қозғалыс шыңдарын (қозғалыстың ең жоғары (жоғарғы) және ең төменгі (төменгі) нүктелерін) көрсететін екі кескінді алдық. Содан кейін біз тін аймақтарын сегменттеп, сегменттелген тінге көлеңкелеу алгоритмінің бір түрін қолдандық (қосымша 2a сурет). Содан кейін сегменттелген тін он ішкі қабатқа бөлінді, ал әр беттегі кернеу келесі теңдеуді пайдаланып есептелді: Деформация = (Жоғары-Жоғары)/Жоғары, мұндағы Жоғары және Жоғары - сәйкесінше матаның жоғарғы және төменгі көлеңкелерінен пішіннің қашықтығы (қосымша 2b сурет).
Жүрек кесінділері 4% параформальдегидте 48 сағат бойы бекітілді. Бекітілген тіндер 1 сағат бойы 10% және 20% сахарозада, содан кейін түні бойы 30% сахарозада сусыздандырылды. Содан кейін кесінділер оңтайлы кесу температурасы бар қосылысқа (OCT қосылысы) салынып, изопентан/құрғақ мұз ваннасында біртіндеп мұздатылды. OCT енгізу блоктарын бөліну кезінде -80 °C температурада сақтаңыз. Слайдтар қалыңдығы 8 мкм болатын кесінділер ретінде дайындалды.
Жүрек бөліктерінен OCT алу үшін, слайдтарды қыздыру блогында 95 °C температурада 5 минут қыздырыңыз. Әр слайдқа 1 мл PBS қосып, бөлме температурасында 30 минут инкубациялаңыз, содан кейін бөлме температурасында 15 минут бойы PBS-те 0,1% Triton-X қою арқылы кесінділерді енгіңіз. Спецификалық емес антиденелердің үлгіге байланысуына жол бермеу үшін слайдтарға 1 мл 3% BSA ерітіндісін қосып, бөлме температурасында 1 сағат инкубациялаңыз. Содан кейін BSA алынып, слайдтар PBS-пен жуылды. Әрбір үлгіні қарындашпен белгілеңіз. Бастапқы антиденелер (1% BSA ерітіндісінде 1:200 сұйылтылған) (connexin 43 (Abcam; #AB11370), NFATC4 (Abcam; #AB99431) және тропонин-T (Thermo Scientific; #MA5-12960) 90 минут ішінде қосылды, содан кейін қосымша 90 минут бойы тышқан Alexa Fluor 488 (Thermo Scientific; #A16079), қоян Alexa Fluor 594 (Thermo Scientific; #T6391) антиденелеріне қарсы екінші реттік антиденелер (1% BSA ерітіндісінде 1:200 сұйылтылған) қосылды. PBS-пен 3 рет жуылды. Нысаналы бояуды фондан ажырату үшін біз тек екінші реттік антиденені бақылау ретінде қолдандық. Соңында, DAPI ядролық бояуы қосылды және слайдтар vectashield (Vector Laboratories) аймағына орналастырылып, тырнақ бояуымен жабылды. -x үлкейту) және 40 есе үлкейтумен Keyence микроскопымен жабылды.
WGA бояуы үшін PBS-те 5 мкг/мл концентрациясындағы WGA-Alexa Fluor 555 (Thermo Scientific; #W32464) қолданылып, бөлме температурасында 30 минут бойы бекітілген кесінділерге жағылды. Содан кейін слайдтар PBS-пен жуылып, әр слайдқа Судан қарасы қосылып, 30 минут инкубацияланды. Содан кейін слайдтар PBS-пен жуылып, векташиелд ену ортасы қосылды. Слайдтар Кейнс микроскопында 40 есе үлкейтумен көрсетілді.
Жоғарыда сипатталғандай үлгілерден OCT алынды. OCT алынғаннан кейін, слайдтарды Буин ерітіндісіне түні бойы батырыңыз. Содан кейін слайдтар 1 сағат бойы дистилденген сумен шайылып, содан кейін Бибрих алоэ қышқылының фуксин ерітіндісіне 10 минутқа салынды. Содан кейін слайдтар дистилденген сумен жуылып, 5% фосфомолибден/5% фосфовольфрам қышқылының ерітіндісіне 10 минутқа салынды. Шаймай, слайдтарды 15 минут бойы тікелей анилин көк ерітіндісіне салыңыз. Содан кейін слайдтар дистилденген сумен жуылып, 1% сірке қышқылының ерітіндісіне 2 минутқа салынды. Слайдтар 200 Н этанолда кептіріліп, ксилолға ауыстырылды. Боялған слайдтар 10x объективі бар Keyence микроскопын пайдаланып көрінді. Фиброз ауданының пайызы Keyence Analyzer бағдарламалық жасақтамасын пайдаланып сандық түрде анықталды.
CyQUANT™ MTT жасушаларының тіршілік қабілетін талдау (Invitrogen, Карлсбад, Калифорния), каталог нөмірі V13154, өндірушінің хаттамасына сәйкес, кейбір өзгертулерімен. Атап айтқанда, MTT талдауы кезінде тіндердің біркелкі мөлшерін қамтамасыз ету үшін диаметрі 6 мм хирургиялық тескіш қолданылды. Тіндер өндірушінің хаттамасына сәйкес MTT субстраты бар 12 ұңғылы пластинаның ұяшықтарына жеке-жеке салынды. Бөліктер 37°C температурада 3 сағат бойы инкубацияланады, ал тірі тін MTT субстратын метаболиздеп, күлгін формазан қосылысын түзеді. MTT ерітіндісін 1 мл DMSO-мен ауыстырып, жүрек бөліктерінен күлгін формазанды алу үшін 37°C температурада 15 минут инкубациялаңыз. Үлгілер 96 ұңғылы мөлдір түбі бар пластиналарда DMSO-да 1:10 қатынасында сұйылтылды және күлгін түстің қарқындылығы 570 нм-де Cytation пластинасын оқу құрылғысын (BioTek) пайдаланып өлшенді. Көрсеткіштер жүректің әрбір кесіндісінің салмағына қарай қалыпқа келтірілді.
Жүрек кесіндісінің ортасы бұрын сипатталғандай глюкозаны пайдалануды талдау үшін 1 мкКи/мл [5-3H]-глюкозасы бар ортамен (Moravek Biochemicals, Brea, CA, АҚШ) ауыстырылды. 4 сағаттық инкубациядан кейін 100 мкл 0,2 Н HCl бар ашық микроцентрифуга түтігіне 100 мкл орта қосыңыз. Содан кейін түтік 37°C температурада 72 сағат бойы [3H]2O буландыру үшін 500 мкл dH2O бар сцинтилляциялық түтікке орналастырылды. Содан кейін микроцентрифугалық түтікті сцинтилляциялық түтіктен алып, 10 мл сцинтилляциялық сұйықтық қосыңыз. Сцинтилляциялық есептеулер Tri-Carb 2900TR сұйық сцинтилляциялық анализаторын (Packard Bioscience Company, Meriden, CT, АҚШ) пайдаланып жүргізілді. Содан кейін глюкозаның пайдаланылуы [5-3H]-глюкозаға тән белсенділікті, толық емес тепе-теңдікті және фонды, [5-3H]-ны таңбаланбаған глюкозаға сұйылтуды және сцинтилляцияға қарсы тиімділікті ескере отырып есептелді. Деректер жүрек бөлімдерінің массасына қалыпқа келтірілді.
Тризолда тіндерді гомогенизациялаудан кейін, өндірушінің хаттамасына сәйкес Qiagen miRNeasy Micro Kit #210874 көмегімен жүрек кесінділерінен РНҚ бөлініп алынды. РНҚ кітапханасын дайындау, секвенирлеу және деректерді талдау келесідей жүргізілді:
РНҚ кітапханасын дайындау үшін бастапқы материал ретінде әрбір үлгіге 1 мкг РНҚ пайдаланылды. Реттеу кітапханалары өндірушінің ұсыныстарына сәйкес Illumina үшін NEBNext UltraTM РНҚ кітапханасын дайындау жинағын (NEB, АҚШ) пайдаланып жасалды және әрбір үлгі үшін атрибут тізбектеріне индекс кодтары қосылды. Қысқаша айтқанда, мРНҚ поли-Т олигонуклеотидтерімен бекітілген магниттік моншақтарды пайдаланып жалпы РНҚ-дан тазартылды. Фрагментация NEBNext бірінші тізбекті синтездеу реакция буферінде (5X) жоғары температурада екі валентті катиондарды пайдаланып жүзеге асырылады. Бірінші тізбекті кДНҚ кездейсоқ гексамер праймерлері мен M-MuLV кері транскриптазасын (RNase H-) пайдаланып синтезделді. Екінші тізбекті кДНҚ ДНҚ полимераза I және RNase H арқылы синтезделеді. Қалған шығыңқы бөліктер экзонуклеаза/полимераза белсенділігі арқылы доғал ұштарға айналады. ДНҚ фрагментінің 3' ұшын аденилдегеннен кейін, оны будандастыруға дайындау үшін оған шаш тәрізді ілмек құрылымы бар NEBNext адаптері бекітіледі. Ұзындығы 150-200 б.п. артықшылықты кДНҚ фрагменттерін таңдау үшін кітапхана фрагменттері AMPure XP жүйесін (Beckman Coulter, Беверли, АҚШ) пайдаланып тазартылды. Содан кейін, адаптермен лигатураланған өлшемі таңдалған кДНҚ бар 3 мкл USER ферменті (NEB, АҚШ) ПТР алдында 37°C температурада 15 минут, содан кейін 95°C температурада 5 минут пайдаланылды. Содан кейін ПТР Phusion High-Fidelity ДНҚ полимеразасын, әмбебап ПТР праймерлерін және Index (X) праймерлерін пайдаланып жүргізілді. Соңында, ПТР өнімдері тазартылды (AMPure XP жүйесі) және кітапхана сапасы Agilent Bioanalyzer 2100 жүйесінде бағаланды. Содан кейін кДНҚ кітапханасы Novaseq секвенсорын пайдаланып секвенирленді. Illumina-дан алынған шикі кескін файлдары CASAVA Base Calling көмегімен шикі оқуларға түрлендірілді. Шикі деректер оқу тізбектері мен сәйкес негізгі сапаларды қамтитын FASTQ(fq) форматындағы файлдарда сақталады. Сүзілген секвенирлеу оқылымдарын Sscrofa11.1 анықтамалық геномымен сәйкестендіру үшін HISAT2 таңдаңыз. Жалпы, HISAT2 кез келген өлшемдегі геномдарды, соның ішінде 4 миллиард базадан үлкен геномдарды қолдайды және көптеген параметрлер үшін әдепкі мәндер орнатылған. РНҚ секвенция деректерінен сплайсинг оқылымдарын қазіргі уақытта қолжетімді ең жылдам жүйе HISAT2 арқылы кез келген басқа әдіспен бірдей немесе одан да жақсы дәлдікпен тиімді түрде туралауға болады.
Транскрипттердің көптігі ген экспрессиясының деңгейін тікелей көрсетеді. Ген экспрессиясының деңгейлері геноммен немесе экзондармен байланысты транскрипттердің көптігімен (секвенирлеу саны) бағаланады. Оқу саны ген экспрессиясының деңгейлеріне, ген ұзындығына және секвенирлеу тереңдігіне пропорционалды. FPKM (миллион базалық жұпқа шаққандағы транскрипттің мың базалық жұбына шаққандағы фрагменттер) есептелді және дифференциалды экспрессияның P-мәндері DESeq2 пакетін пайдаланып анықталды. Содан кейін біз кіріктірілген R-функциясы «p.adjust» негізінде Бенджамини-Хохберг әдісін9 пайдаланып, әрбір P мәні үшін жалған табу жылдамдығын (FDR) есептедік.
Жүрек кесінділерінен бөлінген РНҚ Thermo компаниясының SuperScript IV Vilo Master қоспасын (Thermo, cat. № 11756050) пайдаланып, 200 нг/мкл концентрациясында кДНҚ-ға айналдырылды. Сандық RT-ПТР Applied Biosystems Endura Plate Microamp 384-ұңғымалы мөлдір реакция пластинасын (Thermo, cat. № 4483319) және микроамперлік оптикалық желімді (Thermo, cat. № 4311971) пайдаланып жүргізілді. Реакция қоспасы 5 мкл Taqman Fast Advanced Master қоспасынан (Thermo, cat. № 4444557), 0,5 мкл Taqman Primer және әр ұңғыма үшін араласқан 3,5 мкл H2O-дан тұрды. Стандартты qPCR циклдері орындалды және КТ мәндері Applied Biosystems Quantstudio 5 нақты уақыттағы ПТР құралын (384-ұңғымалы модуль; өнім № A28135) пайдаланып өлшенді. Taqman праймерлері Thermo (GAPDH (Ss03375629_u1), PARP12 (Ss06908795_m1), PKDCC (Ss06903874_m1), CYGB (Ss06900188_m1), RGL1 (Ss06868890_m1), ACTN1 (Ss01009508_mH), GATA4 (Ss03383805_u1), GJA1 (Ss03374839_u1), COL1A2 (Ss03375009_u1), COL3A1 (Ss04323794_m1), ACTA2 (Ss04245588_m1) компанияларынан сатып алынды. Барлық үлгілердің КТ мәндері GAPDH үй шаруашылығы геніне қалыпқа келтірілді.
NT-ProBNP медиа-релизі өндірушінің хаттамасына сәйкес NT-ProBNP жинағын (шошқа) (каталог № MBS2086979, MyBioSource) пайдаланып бағаланды. Қысқаша айтқанда, әрбір ұңғымаға екі рет әр үлгі мен стандарттан 250 мкл қосылды. Үлгіні қосқаннан кейін бірден әр ұңғымаға 50 мкл талдау реагенті А қосыңыз. Пластинаны ақырын шайқап, герметикпен жабыңыз. Содан кейін таблеткалар 37°C температурада 1 сағат бойы инкубацияланды. Содан кейін ерітіндіні сорып алып, ұңғымаларды 350 мкл 1X жуу ерітіндісімен 4 рет жуыңыз, әр жолы жуу ерітіндісін 1-2 минут инкубациялаңыз. Содан кейін әр ұңғымаға 100 мкл талдау реагенті B қосып, пластина герметикпен жабыңыз. Таблетка ақырын шайқалып, 37°C температурада 30 минут инкубацияланды. Ерітіндіні сорып алып, ұңғымаларды 350 мкл 1X жуу ерітіндісімен 5 рет жуыңыз. Әрбір ұңғымаға 90 мкл субстрат ерітіндісін қосып, пластинаны жабыңыз. Пластинаны 37°C температурада 10-20 минут инкубациялаңыз. Әр ұңғымаға 50 мкл тоқтату ерітіндісін қосыңыз. Пластинаны дереу 450 нм-ге орнатылған Cytation (BioTek) пластина оқу құрылғысы арқылы өлшеңіз.
Параметрдегі 10% абсолютті өзгерісті анықтау үшін 5% I типті қателік деңгейімен >80% қуат беретін топ өлшемдерін таңдау үшін қуат талдаулары жүргізілді. Параметрдегі 10% абсолютті өзгерісті анықтау үшін 5% I типті қателік деңгейімен >80% қуат беретін топ өлшемдерін таңдау үшін қуат талдаулары жүргізілді. Анализ мощности был выполнен для выбора размеров, которые обеспечат >80% мощности үшін обнаружения 10% абсолютного изменения параметра с 5% частотой ошибок типа I. 5% I типті қателік деңгейімен 10% абсолютті параметр өзгерісін анықтау үшін >80% қуат беретін топ өлшемдерін таңдау мақсатында қуат талдауы жүргізілді.进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％I型错误率的组大小。进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％I型错误率的组大小。 Был проведен анализ мощности для выбора размера группы, который обеспечил бы > 80% мощности үшін обнаружения 10% абсолютного изменения параметров және 5% частоты ошибок типа I. 10% абсолютті параметр өзгерісін және 5% I типті қателік деңгейін анықтау үшін >80% қуат беретін топ өлшемін таңдау мақсатында қуат талдауы жүргізілді.Тәжірибе алдында тіндердің кесінділері кездейсоқ таңдалды. Барлық талдаулар шартты түрде жасалды және үлгілер барлық деректер талданғаннан кейін ғана декодталды. Барлық статистикалық талдауларды жүргізу үшін GraphPad Prism бағдарламалық жасақтамасы (Сан-Диего, Калифорния) пайдаланылды. Барлық статистика үшін p-мәндері <0,05 мәндерінде маңызды деп саналды. Барлық статистика үшін p-мәндері <0,05 мәндерінде маңызды деп саналды. Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. Барлық статистика үшін p-мәндері <0,05 мәндерінде маңызды деп саналды.对于所有统计数据，p 值在值<0,05 时被认为是显着的。对于所有统计数据，p 值在值<0,05 时被认为是显着的。 Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. Барлық статистика үшін p-мәндері <0,05 мәндерінде маңызды деп саналды.Екі жақты Стьюденттің t-тесті деректер бойынша тек 2 салыстырумен жүргізілді. Бірнеше топ арасындағы маңыздылықты анықтау үшін бір жақты немесе екі жақты ANOVA қолданылды. Post hoc тесттерін орындаған кезде бірнеше салыстыруларды ескеру үшін Тукидің түзетуі қолданылды. Әдістер бөлімінде сипатталғандай, FDR және p.adjust есептеу кезінде RNAsec деректері арнайы статистикалық ескерулерге ие.
Зерттеу дизайны туралы қосымша ақпарат алу үшін осы мақалаға сілтеме жасалған Nature Research Report аннотациясын қараңыз.