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एक विश्वसनीय इन विट्रो प्रणाली की आवश्यकता है जो दवा परीक्षण के लिए हृदय के शारीरिक वातावरण को सटीक रूप से पुन: पेश कर सके। मानव हृदय ऊतक संवर्धन प्रणालियों की सीमित उपलब्धता ने हृदय संबंधी दवा प्रभावों की गलत व्याख्या की है। यहां, हमने एक हृदय ऊतक संवर्धन मॉडल (CTCM) विकसित किया है जो हृदय के स्लाइस को इलेक्ट्रोमैकेनिकल रूप से उत्तेजित करता है और हृदय चक्र के सिस्टोलिक और डायस्टोलिक चरणों के दौरान शारीरिक खिंचाव से गुजरता है। 12 दिनों की संस्कृति के बाद, इस दृष्टिकोण ने हृदय के खंडों की व्यवहार्यता में आंशिक रूप से सुधार किया, लेकिन उनकी संरचनात्मक अखंडता को पूरी तरह से संरक्षित नहीं किया। इसलिए, छोटे अणु स्क्रीनिंग के बाद, हमने पाया कि हमारे माध्यम में 100 nM ट्राईआयोडोथायोनिन (T3) और 1 μM डेक्सामेथासोन (Dex) को जोड़ने से 12 दिनों तक खंडों की सूक्ष्म संरचना बनी रही। T3/Dex उपचार के संयोजन में, CTCM प्रणाली ने 12 दिनों तक ताजा हृदय ऊतक के समान स्तर पर ट्रांसक्रिप्शनल प्रोफाइल, व्यवहार्यता, चयापचय गतिविधि और संरचनात्मक अखंडता को बनाए रखा। इसके अलावा, कल्चर में हृदय के ऊतकों का अत्यधिक खिंचाव हाइपरट्रॉफिक कार्डियक सिग्नलिंग को प्रेरित करता है, जो हृदय के खिंचाव से प्रेरित हाइपरट्रॉफिक स्थितियों की नकल करने के लिए CTCM की क्षमता का सबूत प्रदान करता है। निष्कर्ष में, CTCM लंबे समय तक कल्चर में हृदय के फिजियोलॉजी और पैथोफिजियोलॉजी को मॉडल कर सकता है, जिससे विश्वसनीय दवा स्क्रीनिंग संभव हो पाती है।
नैदानिक ​​अनुसंधान से पहले, विश्वसनीय इन विट्रो सिस्टम की आवश्यकता होती है जो मानव हृदय के शारीरिक वातावरण को सटीक रूप से पुन: पेश कर सके। ऐसी प्रणालियों को परिवर्तित यांत्रिक खिंचाव, हृदय गति और इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल गुणों की नकल करनी चाहिए। पशु मॉडल आमतौर पर मानव हृदय में दवाओं के प्रभावों को दर्शाने में सीमित विश्वसनीयता के साथ हृदय शरीर विज्ञान के लिए स्क्रीनिंग प्लेटफ़ॉर्म के रूप में उपयोग किए जाते हैं1,2। अंततः, आदर्श कार्डियक टिशू कल्चर प्रायोगिक मॉडल (CTCM) एक ऐसा मॉडल है जो विभिन्न चिकित्सीय और औषधीय हस्तक्षेपों के लिए अत्यधिक संवेदनशील और विशिष्ट है, जो मानव हृदय के शरीर विज्ञान और पैथोफिज़ियोलॉजी को सटीक रूप से पुन: प्रस्तुत करता है3। ऐसी प्रणाली की अनुपस्थिति हृदय विफलता4,5 के लिए नए उपचारों की खोज को सीमित करती है और इसने दवा कार्डियोटॉक्सिसिटी को बाजार से बाहर निकलने का एक प्रमुख कारण बना दिया है6।
पिछले दशक में, आठ गैर-हृदय संबंधी दवाओं को नैदानिक ​​​​उपयोग से वापस ले लिया गया है क्योंकि वे क्यूटी अंतराल को बढ़ा देती हैं जिससे वेंट्रिकुलर अतालता और अचानक मौत हो जाती है7। इस प्रकार, हृदय संबंधी प्रभावकारिता और विषाक्तता का आकलन करने के लिए विश्वसनीय प्रीक्लीनिकल स्क्रीनिंग रणनीतियों की बढ़ती आवश्यकता है। दवा स्क्रीनिंग और विषाक्तता परीक्षण में मानव-प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स (hiPS-CM) का हाल ही में उपयोग इस समस्या का आंशिक समाधान प्रदान करता है। हालांकि, hiPS-CM की अपरिपक्व प्रकृति और हृदय के ऊतकों की बहुकोशिकीय जटिलता की कमी इस पद्धति की प्रमुख सीमाएं हैं। हाल के अध्ययनों से पता चला है कि इस सीमा को प्रारंभिक hiPS-CM का उपयोग करके सहज संकुचन की शुरुआत के तुरंत बाद हृदय ऊतक हाइड्रोजेल बनाने और समय के साथ धीरे-धीरे विद्युत उत्तेजना बढ़ाकर आंशिक रूप से दूर किया जा सकता है इसके अलावा, मानव हृदय ऊतक की संरचना अधिक जटिल होती है, जिसमें विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं का विषम मिश्रण होता है, जिसमें एंडोथेलियल कोशिकाएँ, न्यूरॉन्स और स्ट्रोमल फाइब्रोब्लास्ट शामिल होते हैं, जो बाह्यकोशिकीय मैट्रिक्स प्रोटीन के विशिष्ट सेटों द्वारा परस्पर जुड़े होते हैं। वयस्क स्तनधारी हृदय में गैर-कार्डियोमायोसाइट आबादी11,12,13 की यह विषमता व्यक्तिगत कोशिका प्रकारों का उपयोग करके हृदय ऊतक के मॉडलिंग में एक प्रमुख बाधा है। ये प्रमुख सीमाएँ शारीरिक और रोग संबंधी स्थितियों के तहत बरकरार मायोकार्डियल ऊतक की खेती के लिए तरीकों को विकसित करने के महत्व पर जोर देती हैं।
मानव हृदय के सुसंस्कृत पतले (300 µm) खंड बरकरार मानव मायोकार्डियम का एक आशाजनक मॉडल साबित हुए हैं। यह विधि मानव हृदय ऊतक के समान एक पूर्ण 3D बहुकोशिकीय प्रणाली तक पहुँच प्रदान करती है। हालाँकि, 2019 तक, सुसंस्कृत हृदय खंडों का उपयोग कम (24 घंटे) संस्कृति अस्तित्व द्वारा सीमित था। यह कई कारकों के कारण है जिसमें भौतिक-यांत्रिक खिंचाव की कमी, वायु-तरल इंटरफ़ेस और सरल मीडिया का उपयोग शामिल है जो हृदय ऊतक की ज़रूरतों का समर्थन नहीं करते हैं। 2019 में, कई शोध समूहों ने प्रदर्शित किया कि हृदय ऊतक संवर्धन प्रणालियों में यांत्रिक कारकों को शामिल करने से संवर्धन जीवन का विस्तार हो सकता है, हृदय की अभिव्यक्ति में सुधार हो सकता है और हृदय विकृति की नकल हो सकती है। दो सुंदर अध्ययन 17 और 18 दिखाते हैं कि संस्कृति के दौरान एकअक्षीय यांत्रिक लोडिंग का हृदय फेनोटाइप पर सकारात्मक प्रभाव पड़ता है। हालांकि, इन अध्ययनों में हृदय चक्र के गतिशील त्रि-आयामी भौतिक-यांत्रिक लोडिंग का उपयोग नहीं किया गया था, क्योंकि हृदय वर्गों को या तो आइसोमेट्रिक तन्यता बलों 17 या रैखिक ऑक्सोटोनिक लोडिंग 18 के साथ लोड किया गया था। ऊतक खींचने के इन तरीकों के परिणामस्वरूप कई हृदय जीनों का दमन या असामान्य खिंचाव प्रतिक्रियाओं से जुड़े जीनों की अधिक अभिव्यक्ति हुई। उल्लेखनीय रूप से, पिटौलिस एट अल। 19 ने बल ट्रांसड्यूसर फीडबैक और तनाव ड्राइव का उपयोग करके हृदय चक्र पुनर्निर्माण के लिए एक गतिशील हृदय स्लाइस कल्चर बाथ विकसित किया। हालांकि यह प्रणाली इन विट्रो हृदय चक्र मॉडलिंग में अधिक सटीक होने की अनुमति देती है, लेकिन विधि की जटिलता और कम थ्रूपुट इस प्रणाली के अनुप्रयोग को सीमित करता है। हमारी प्रयोगशाला ने हाल
वर्तमान पांडुलिपि में, हम सुअर के हृदय के खंडों का उपयोग करके एक हृदय ऊतक संवर्धन मॉडल (CTCM) का वर्णन करते हैं जो हृदय चक्र के दौरान त्रि-आयामी हृदय शरीर क्रिया विज्ञान और पैथोफिजियोलॉजिकल फैलाव को पुनरावृत्त करने के लिए हास्य संकेतों को शामिल करता है। यह CTCM प्री-क्लीनिकल ड्रग भविष्यवाणी की सटीकता को पहले कभी हासिल नहीं किए गए स्तर तक बढ़ा सकता है, जो कि एक लागत प्रभावी, मध्य-थ्रूपुट कार्डियक सिस्टम प्रदान करके प्राप्त किया जा सकता है जो प्री-क्लीनिकल ड्रग परीक्षण के लिए स्तनधारी हृदय के शरीर क्रिया विज्ञान/पैथोफिजियोलॉजी की नकल करता है।
हेमोडायनामिक यांत्रिक संकेत इन विट्रो 22,23,24 में कार्डियोमायोसाइट फ़ंक्शन को बनाए रखने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। वर्तमान पांडुलिपि में, हमने एक CTCM (चित्र 1a) विकसित किया है जो शारीरिक आवृत्तियों (1.2 हर्ट्ज, 72 धड़कन प्रति मिनट) पर विद्युत और यांत्रिक उत्तेजना दोनों को प्रेरित करके वयस्क हृदय वातावरण की नकल कर सकता है। डायस्टोल के दौरान अत्यधिक ऊतक खिंचाव से बचने के लिए, ऊतक के आकार को 25% तक बढ़ाने के लिए एक 3D प्रिंटिंग डिवाइस का उपयोग किया गया था (चित्र 1b)। C-PACE सिस्टम द्वारा प्रेरित विद्युत पेसिंग को हृदय चक्र को पूरी तरह से पुन: पेश करने के लिए डेटा अधिग्रहण प्रणाली का उपयोग करके सिस्टोल से 100 ms पहले शुरू करने के लिए समयबद्ध किया गया था। ऊतक संवर्धन प्रणाली एक प्रोग्राम करने योग्य वायवीय एक्ट्यूएटर (LB इंजीनियरिंग, जर्मनी) का उपयोग करती है जो ऊपरी कक्ष में हृदय के स्लाइस के विस्तार का कारण बनने के लिए एक लचीली सिलिकॉन झिल्ली को चक्रीय रूप से विस्तारित करती है। यह प्रणाली एक प्रेशर ट्रांसड्यूसर के माध्यम से बाहरी एयर लाइन से जुड़ी हुई थी, जिससे दबाव (± 1 mmHg) और समय (± 1 ms) को सटीक रूप से समायोजित करना संभव हो गया (चित्र 1c)।
a डिवाइस के कल्चर चैंबर के अंदर नीले रंग में दिखाए गए 7 मिमी सपोर्ट रिंग में ऊतक अनुभाग को जोड़ें। कल्चर चैंबर को एक पतली लचीली सिलिकॉन झिल्ली द्वारा वायु कक्ष से अलग किया जाता है। रिसाव को रोकने के लिए प्रत्येक कक्ष के बीच एक गैसकेट रखें। डिवाइस के ढक्कन में ग्रेफाइट इलेक्ट्रोड होते हैं जो विद्युत उत्तेजना प्रदान करते हैं। b बड़े ऊतक डिवाइस, गाइड रिंग और सपोर्ट रिंग का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। ऊतक अनुभाग (भूरे रंग के) को बड़े आकार के डिवाइस पर रखा जाता है, जिसमें गाइड रिंग को डिवाइस के बाहरी किनारे पर खांचे में रखा जाता है। गाइड का उपयोग करते हुए, हृदय ऊतक के अनुभाग पर ऊतक ऐक्रेलिक चिपकने वाले के साथ लेपित सपोर्ट रिंग को सावधानीपूर्वक रखें। c एक प्रोग्रामेबल न्यूमेटिक एक्ट्यूएटर (PPD) द्वारा नियंत्रित वायु कक्ष दबाव के एक फ़ंक्शन के रूप में विद्युत उत्तेजना के समय को दर्शाने वाला ग्राफ़। दबाव सेंसर का उपयोग करके विद्युत उत्तेजना को सिंक्रनाइज़ करने के लिए एक डेटा अधिग्रहण डिवाइस का उपयोग किया गया था। जब कल्चर चैंबर में दबाव सेट थ्रेशोल्ड तक पहुँच जाता है, तो विद्युत उत्तेजना को ट्रिगर करने के लिए C-PACE-EM को एक पल्स सिग्नल भेजा जाता है। d इनक्यूबेटर शेल्फ पर रखे गए चार CTCM की छवि। चार डिवाइस एक पीपीडी से वायवीय सर्किट के माध्यम से जुड़े होते हैं, और वायवीय सर्किट में दबाव की निगरानी के लिए हेमोस्टेटिक वाल्व में दबाव सेंसर डाले जाते हैं। प्रत्येक डिवाइस में छह ऊतक खंड होते हैं।
एक एकल वायवीय एक्ट्यूएटर का उपयोग करके, हम 4 सीटीसीएम उपकरणों को नियंत्रित करने में सक्षम थे, जिनमें से प्रत्येक 6 ऊतक खंडों को पकड़ सकता था (चित्र 1डी)। सीटीसीएम में, वायु कक्ष में वायु दबाव द्रव कक्ष में समकालिक दबाव में परिवर्तित हो जाता है और हृदय स्लाइस के शारीरिक विस्तार को प्रेरित करता है (चित्र 2ए और पूरक मूवी 1)। 80 मिमी एचजी पर ऊतक खिंचाव का मूल्यांकन। आर्ट। ने ऊतक खंडों में 25% तक खिंचाव दिखाया (चित्र 2बी)। यह प्रतिशत खिंचाव सामान्य हृदय खंड संकुचनशीलता17,19,25 के लिए 2.2-2.3 µm की शारीरिक सार्कोमियर लंबाई के अनुरूप दिखाया गया है। ऊतक आंदोलन का मूल्यांकन कस्टम कैमरा सेटिंग्स (पूरक चित्र 1) का उपयोग करके किया गया था। ऊतक आंदोलन का आयाम और वेग (चित्र 2सी, डी) हृदय चक्र के दौरान खिंचाव और सिस्टोल और डायस्टोल के दौरान समय के अनुरूप था (चित्र 2बी)। संकुचन और विश्राम के दौरान हृदय ऊतक का खिंचाव और वेग संस्कृति में 12 दिनों तक स्थिर रहा (चित्र 2f)। संस्कृति के दौरान संकुचनशीलता पर विद्युत उत्तेजना के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए, हमने एक छायांकन एल्गोरिथ्म (पूरक चित्र 2a,b) का उपयोग करके सक्रिय विकृति का निर्धारण करने के लिए एक विधि विकसित की और विद्युत उत्तेजना के साथ और बिना विकृति के बीच अंतर करने में सक्षम थे। हृदय का एक ही भाग (चित्र 2f)। कट के चल क्षेत्र (R6-9) में, विद्युत उत्तेजना के दौरान वोल्टेज विद्युत उत्तेजना की अनुपस्थिति की तुलना में 20% अधिक था, जो संकुचन कार्य में विद्युत उत्तेजना के योगदान को इंगित करता है।
वायु कक्ष दबाव, द्रव कक्ष दबाव और ऊतक आंदोलन माप के प्रतिनिधि निशान इस बात की पुष्टि करते हैं कि कक्ष दबाव द्रव कक्ष दबाव को बदलता है, जिससे ऊतक स्लाइस की एक संगत गति होती है। b ऊतक खंडों के प्रतिशत खिंचाव (नीला) के प्रतिनिधि निशान खिंचाव (नारंगी) के प्रतिशत के अनुरूप हैं। c हृदय के स्लाइस की मापी गई गति गति की मापी गई गति के अनुरूप है। (d) हृदय के एक स्लाइस में चक्रीय गति (नीली रेखा) और वेग (नारंगी बिंदीदार रेखा) के प्रतिनिधि प्रक्षेप पथ। e चक्र समय का परिमाणीकरण (n = 19 स्लाइस प्रति समूह, विभिन्न सूअरों से), संकुचन समय (n = 19 स्लाइस प्रति समूह), विश्राम समय (n = 19 स्लाइस प्रति समूह, विभिन्न सूअरों से), ऊतक आंदोलन (n = 25) . स्लाइस) दो-पूंछ वाले छात्र के टी-परीक्षण ने किसी भी पैरामीटर में कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं दिखाया। f विद्युत उत्तेजना के साथ (लाल) और बिना (नीला) ऊतक खंडों के प्रतिनिधि तनाव विश्लेषण निशान, एक ही खंड से ऊतक खंडों के दस क्षेत्रीय क्षेत्र। नीचे के पैनल अलग-अलग खंडों से दस क्षेत्रों में विद्युत उत्तेजना के साथ और बिना ऊतक खंडों में तनाव में प्रतिशत अंतर की मात्रा का परिमाणीकरण दिखाते हैं। (n = विभिन्न सूअरों से 8 स्लाइस/समूह, दो-पूंछ वाला स्टूडेंट टी-परीक्षण किया जाता है; ****p < 0.0001, **p < 0.01, *p < 0.05)। (n = विभिन्न सूअरों से 8 स्लाइस/समूह, दो-पूंछ वाला स्टूडेंट टी-परीक्षण किया जाता है; ****p < 0.0001, **p < 0.01, *p < 0.05)। (n = 8 срезов/группу от разных свиней, проводится двусторонний t-критерий Стьюдента; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05). (n = विभिन्न सूअरों से 8 खंड/समूह, दो-पूंछ वाला स्टूडेंट का टी-परीक्षण; ****p<0.0001, **p<0.01, *p<0.05)। (n = 8 片/组, 来自不同的猪, 进行双尾学生t 检验；****p < 0.0001，**p < 0.01，*p < 0.05）。 (n = 8 片/组, 来自不同的猪, 进行双尾学生t 检验；****p < 0.0001，**p < 0.01，*p < 0.05）。 (n = 8 срезов/группу, от разных свиней, двусторонний критерий Стьюдента; ****p <0,0001, **p <0,01, *p <0,05). (n = 8 खंड/समूह, विभिन्न सूअरों से, दो-पूंछ वाला स्टूडेंट का टी-परीक्षण; ****p<0.0001, **p<0.01, *p<0.05)।त्रुटि बार माध्य ± मानक विचलन को दर्शाते हैं।
हमारे पिछले स्थिर बायोमिमेटिक हृदय स्लाइस कल्चर सिस्टम [20, 21] में, हमने विद्युत उत्तेजना लागू करके और माध्यम संरचना को अनुकूलित करके 6 दिनों के लिए हृदय स्लाइस की व्यवहार्यता, कार्य और संरचनात्मक अखंडता को बनाए रखा था। हालांकि, 10 दिनों के बाद, ये आंकड़े तेजी से गिर गए। हम अपने पिछले स्थिर बायोमिमेटिक कल्चर सिस्टम 20, 21 नियंत्रण स्थितियों (Ctrl) में संवर्धित अनुभागों का उल्लेख करेंगे और हम अपने पहले से अनुकूलित माध्यम का उपयोग MC स्थितियों और एक साथ यांत्रिक और विद्युत उत्तेजना (CTCM) के तहत संस्कृति के रूप में करेंगे। कहा जाता है। सबसे पहले, हमने यह निर्धारित किया कि विद्युत उत्तेजना के बिना यांत्रिक उत्तेजना 6 दिनों के लिए ऊतक व्यवहार्यता बनाए रखने के लिए अपर्याप्त थी (पूरक चित्र 3ए, बी)। दिलचस्प बात यह है कि एसटीसीएम का उपयोग करके फिजियो-मैकेनिकल और इलेक्ट्रिकल उत्तेजना की शुरुआत इससे पता चलता है कि हृदय चक्र की यांत्रिक उत्तेजना और अनुकरण ऊतक खंडों को हमारी पिछली स्थिर संस्कृति प्रणाली में बताए गए समय से दोगुने समय तक व्यवहार्य बनाए रख सकता है। हालांकि, हृदय ट्रोपोनिन टी और कॉनेक्सिन 43 की इम्यूनोलेबलिंग द्वारा ऊतक खंडों की संरचनात्मक अखंडता का आकलन दिखाता है कि उसी दिन नियंत्रण की तुलना में 12वें दिन MC ऊतकों में कॉनेक्सिन 43 की अभिव्यक्ति काफी अधिक थी। हालांकि, एकसमान कॉनेक्सिन 43 अभिव्यक्ति और Z-डिस्क गठन पूरी तरह से बनाए नहीं रखा गया था (चित्र 3बी)। हम ऊतक संरचनात्मक अखंडता26 को मापने के लिए एक कृत्रिम बुद्धिमत्ता (AI) ढांचे का उपयोग करते हैं, स्थानीयकरण की ताकत के संदर्भ में हृदय के टुकड़ों की संरचनात्मक अखंडता और प्रतिदीप्ति को स्वचालित रूप से मापने के लिए ट्रोपोनिन-टी और कॉनेक्सिन धुंधलापन43 पर आधारित एक छवि-आधारित गहन शिक्षण पाइपलाइन का उपयोग करते हैं। यह विधि एक कन्वोल्यूशनल न्यूरल नेटवर्क (CNN) और एक गहन शिक्षण ढांचे का उपयोग करती है ताकि हृदय के ऊतकों की संरचनात्मक अखंडता को स्वचालित और निष्पक्ष तरीके से विश्वसनीय रूप से मापा जा सके, जैसा कि संदर्भ में वर्णित है। 26. MC ऊतक ने स्थिर नियंत्रण खंडों की तुलना में दिन 0 पर बेहतर संरचनात्मक समानता दिखाई। इसके अलावा, मैसन के ट्राइक्रोम धुंधलापन ने संस्कृति के दिन 12 पर नियंत्रण स्थितियों की तुलना में एमएस स्थितियों के तहत फाइब्रोसिस के काफी कम प्रतिशत का खुलासा किया (चित्र 3c)। जबकि CTCM ने 12वें दिन हृदय ऊतक खंडों की व्यवहार्यता को ताजा हृदय ऊतक के समान स्तर तक बढ़ा दिया, लेकिन इसने हृदय खंडों की संरचनात्मक अखंडता में महत्वपूर्ण रूप से सुधार नहीं किया।
एक बार ग्राफ ताजा हृदय स्लाइस (D0) या हृदय स्लाइस संस्कृति की एमटीटी व्यवहार्यता की मात्रा का 12 दिनों के लिए स्थिर संस्कृति (D12 Ctrl) या CTCM (D12 MC) में मात्रा का पता लगाता है (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) स्लाइस / समूह विभिन्न सूअरों से, एक तरफा एनोवा परीक्षण किया जाता है; ####p < 0.0001 की तुलना में D0 और **p < 0.01 की तुलना में D12 Ctrl)। एक बार ग्राफ ताजा हृदय स्लाइस (D0) या हृदय स्लाइस संस्कृति की एमटीटी व्यवहार्यता की मात्रा का 12 दिनों के लिए स्थिर संस्कृति (D12 Ctrl) या CTCM (D12 MC) में मात्रा का पता लगाता है (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl ), 12 (D12 MC) स्लाइस / विभिन्न सूअरों से समूह, एक तरफा एनोवा परीक्षण किया जाता है; ####p < 0.0001 की तुलना में D0 और **p < 0.01 की तुलना में D12 Ctrl)।हिस्टोग्राम एमटीटी ताजा हृदय खंडों (डी0) या 12 दिनों के लिए स्थैतिक संस्कृति (डी12 नियंत्रण) या सीटीसीएम (डी12 एमसी) (एन = 18 (डी0), 15 (डी12 नियंत्रण)) में हृदय खंडों की संस्कृति की व्यवहार्यता की मात्रा का पता चलता है, विभिन्न सूअरों से 12 (डी12 एमसी) खंड/समूह, एकतरफा एनोवा परीक्षण किया जाता है;####p < 0,0001 по сравнению с D0 и **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p < 0.0001 की तुलना में D0 और **p < 0.01 की तुलना में D12 Ctrl). एक नियंत्रण कक्ष कुंजी (D12 Ctrl) और CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) कुंजीपटल कुंजी (D0) 12 से अधिक एमटीटी से अधिक तस्वीरें), 12 (डी12 एमसी) से 12 तस्वीरें/12, एमटीटी से 12 साल पहले एनोवा测试；与D0 相比,####p < 0.0001, D12 Ctrl, **p < 0.01)。 एक नियंत्रण कक्ष कुंजी (D12 Ctrl) और CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) कुंजीपटल कुंजी (D0) ，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；与D0 相比，####p < 0.0001，与D12 Ctrl ठीक है,**पी。)ताजा हृदय खंडों (डी0) या स्थैतिक संस्कृति (डी12 नियंत्रण) या सीटीसीएम (डी12 एमसी) में 12 दिनों के लिए संवर्धित हृदय खंडों में एमटीटी व्यवहार्यता की मात्रा को दर्शाने वाला हिस्टोग्राम (एन = 18 (डी0), 15 (डी12 नियंत्रण)), विभिन्न सूअरों से 12 (डी12 एमसी) खंड/समूह, एक-तरफ़ा एनोवा परीक्षण;####p < 0,0001 по сравнению с D0, **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p < 0.0001 की तुलना में D0, **p < 0.01 की तुलना में D12 Ctrl).ख. ट्रोपोनिन-टी (हरा), कनैक्सिन 43 (लाल) और डीएपीआई (नीला) ताजा पृथक हृदय खंडों (डी0) या स्थैतिक स्थितियों (Ctrl) या सीटीसीएम स्थितियों (एमसी) के तहत 12 दिनों के लिए संवर्धित हृदय खंडों में) प्रतिनिधि इम्यूनोफ्लोरेसेंस छवियों (रिक्त स्केल = 100 µm) की। हृदय ऊतक संरचनात्मक अखंडता का कृत्रिम बुद्धिमत्ता परिमाणीकरण (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) स्लाइस/समूह प्रत्येक अलग-अलग पिग से, एक-तरफ़ा ANOVA परीक्षण किया जाता है; ####p < 0.0001 D0 की तुलना में और ****p < 0.0001 D12 Ctrl की तुलना में)। हृदय ऊतक संरचनात्मक अखंडता का कृत्रिम बुद्धिमत्ता परिमाणीकरण (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) स्लाइस/विभिन्न सूअरों से प्रत्येक समूह, एक-तरफ़ा ANOVA परीक्षण किया जाता है; ####p < 0.0001 D0 की तुलना में और ****p < 0.0001 D12 Ctrl की तुलना में)। Количественная оценка структурной целостности сердечной ткани искусственным интеллектом (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) срезов/групп от разных свиней, проводится однофакторный тест एनोवा; ####p < 0,0001 по сравнению с D0 и ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). कृत्रिम बुद्धिमत्ता द्वारा हृदय ऊतक की संरचनात्मक अखंडता का परिमाणीकरण (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) विभिन्न सूअरों से अनुभाग/समूह, एक-तरफ़ा ANOVA परीक्षण किया गया; ####p < 0.0001 बनाम D0 के साथ और ****p < 0.0001 D12 Ctrl की तुलना में)।人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) स्लाइस/प्रत्येक अलग-अलग सुअर का समूह, एक-तरफ़ा ANOVA परीक्षण;####p < 0.0001 与D0 ठीक है,****p < 0.0001, D12 Ctrl, कुंजी।人工智能量化心脏组织结构完整性n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) स्लाइस/अलग-अलग सूअरों का समूह, एक-तरफ़ा एनोवा परीक्षण;####p < 0.0001 D0 कुंजी,****p < 0.0001, D12 Ctrl कुंजी）。 Искусственный интеллект для количественной оценки структурной целостности сердечной ткани (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) срезов/группу каждой из разных свиней, односторонний тест एनोवा; ####p <0,0001 बनाम D0 Для сравнения ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). हृदय के ऊतकों की संरचनात्मक अखंडता को मापने के लिए कृत्रिम बुद्धिमत्ता (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) विभिन्न सूअरों के खंड/समूह, एक-तरफ़ा ANOVA परीक्षण; ####p<0.0001 बनाम .D0 तुलना के लिए ****d12 Ctrl की तुलना में p < 0.0001)। सी मैसन के ट्राइक्रोम स्टेन (स्केल नंगे = 500 µm) के साथ दागे गए हृदय स्लाइस के लिए प्रतिनिधि चित्र (बाएं) और मात्रा (दाएं) (n = 10 स्लाइस/अलग-अलग सूअर से प्रत्येक समूह, एक-तरफ़ा ANOVA परीक्षण किया जाता है; ####p < 0.0001 की तुलना में D0 और ***p < 0.001 की तुलना में D12 Ctrl)। सी मैसन के ट्राइक्रोम स्टेन (स्केल नंगे = 500 µm) के साथ दागे गए हृदय स्लाइस के लिए प्रतिनिधि चित्र (बाएं) और मात्रा (दाएं) (n = 10 स्लाइस/विभिन्न सूअरों से प्रत्येक समूह, एक-तरफ़ा ANOVA परीक्षण किया जाता है; #### p < 0.0001 की तुलना में D0 और ***p < 0.001 की तुलना में D12 Ctrl)। c Репрезентативные изображения (слева) и количественная оценка (справа) срезов сердца, окрашенных трихромным красителем Массона (масштаб без покрытия = 500 мкм) (n = 10 срезов/группу от разных свиней, अतिरिक्त विवरण एनोवा; сравнению с D12 Ctrl). सी मैसन के ट्राइक्रोम स्टेन (अनकोटेड स्केल = 500 µm) से रंगे हृदय खंडों के प्रतिनिधि चित्र (बाएं) और परिमाणीकरण (दाएं) (n = विभिन्न सूअरों से 10 खंड/समूह, एकतरफा ANOVA परीक्षण किया गया; #### p < 0 .0001 की तुलना में D0 और ***p < 0.001 की तुलना में D12 Ctrl)। सी मेसन को 500 µm (500 µm) की आवश्यकता होती है 10 个切片/组,每组来自不同的猪,进行单向ANOVA 测试；#### p < 0.0001 与D0 相比，***p < 0.001 D12 Ctrl उत्तर）。 C 用 mason 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 （左 左） 量化 （右） 裸尺度 裸尺度 裸尺度माप = 500 µm） (n = 10 个 切片 组 每 组 来自 不同 猪 ， 进行 单向 单向 Anova 测试；#### p < 0.0001 D0 कुंजी,***p < 0.001 और D12 Ctrl कुंजी）。 c Репрезентативные изображения (слева) и количественный анализ (справа) срезов сердца, окрашенных трихромным красителем Массона (чистая шкала = 500 мкм) (n = 10 срезов/группа, каждый от другой свиньи, протестировано с помощью однофакторного дисперсионного анализа ;### #p < 0,0001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). सी मैसन के ट्राइक्रोम स्टेन (रिक्त = 500 µm) के साथ अभिरंजित हृदय खंडों के प्रतिनिधि चित्र (बाएं) और परिमाणीकरण (दाएं) (n = 10 खंड/समूह, प्रत्येक एक अलग सूअर से, एकतरफा विचरण विश्लेषण द्वारा परीक्षण किया गया; ### # p < 0.0001 की तुलना में D0, ***p < 0.001 की तुलना में D12 Ctrl)।त्रुटि बार माध्य ± मानक विचलन को दर्शाते हैं।
हमने अनुमान लगाया कि संवर्धन माध्यम में छोटे अणुओं को जोड़ने से, CTCM संवर्धन के दौरान कार्डियोमायोसाइट अखंडता में सुधार किया जा सकता है और फाइब्रोसिस विकास को कम किया जा सकता है। इसलिए हमने भ्रमित करने वाले कारकों की कम संख्या के कारण हमारे स्थिर नियंत्रण संवर्धनों20,21 का उपयोग करके छोटे अणुओं की जांच की। इस स्क्रीनिंग के लिए डेक्सामेथासोन (डेक्स), ट्राईआयोडोथायोनिन (T3), और SB431542 (SB) को चुना गया। इन छोटे अणुओं का उपयोग पहले hiPSC-CM संवर्धनों में सार्कोमियर लंबाई, T-ट्यूब्यूल और चालन वेग को बढ़ाकर कार्डियोमायोसाइट्स की परिपक्वता को प्रेरित करने के लिए किया गया है। इसके अलावा, डेक्स (एक ग्लूकोकोर्टिकॉइड) और SB दोनों सूजन को दबाने के लिए जाने जाते हैं29,30। इसलिए, हमने परीक्षण किया कि क्या इन छोटे अणुओं में से एक या इनके संयोजन को शामिल करने से हृदय खंडों की संरचनात्मक अखंडता में सुधार होगा। प्रारंभिक जांच के लिए, प्रत्येक यौगिक की खुराक का चयन सेल कल्चर मॉडल (1 μM Dex27, 100 nM T327, और 2.5 μM SB31) में आमतौर पर इस्तेमाल की जाने वाली सांद्रता के आधार पर किया गया था। 12 दिनों की संस्कृति के बाद, T3 और Dex के संयोजन के परिणामस्वरूप इष्टतम कार्डियोमायोसाइट संरचनात्मक अखंडता और न्यूनतम रेशेदार रीमॉडलिंग हुई (पूरक चित्र 4 और 5)। इसके अलावा, T3 और Dex की इन सांद्रताओं के दोगुने या दोगुने उपयोग से सामान्य सांद्रता की तुलना में हानिकारक प्रभाव उत्पन्न हुए (पूरक चित्र 6a,b)।
आरंभिक जांच के बाद, हमने 4 संवर्धन स्थितियों (चित्र 4a) की आमने-सामने तुलना की: Ctrl: हमारे अनुकूलित माध्यम का उपयोग करके हमारे पहले वर्णित स्थैतिक संवर्धन में संवर्धित हृदय खंड; 20.21 TD: T3 और Ctrl ने बुधवार को Dex जोड़ा; MC: हमारे पहले से अनुकूलित माध्यम का उपयोग करके CTCM में संवर्धित हृदय खंड; और MT: T3 और Dex के साथ CTCM को माध्यम में जोड़ा गया। संवर्धन के 12 दिनों के बाद, MS ​​और MT ऊतकों की व्यवहार्यता MTT परख द्वारा मूल्यांकित ताज़े ऊतकों के समान ही रही (चित्र 4b)। दिलचस्प बात यह है कि ट्रांसवेल संवर्धन (TD) में T3 और Dex को जोड़ने से Ctrl स्थितियों की तुलना में व्यवहार्यता में कोई महत्वपूर्ण सुधार नहीं हुआ
एक प्रायोगिक डिजाइन आरेख जिसमें 12 दिनों के लिए माध्यम पर यांत्रिक उत्तेजना और टी 3/डेक्स अनुपूरण के प्रभावों का मूल्यांकन करने के लिए उपयोग की जाने वाली चार संस्कृति स्थितियों को दर्शाया गया है। बार ग्राफ सभी 4 संवर्धन स्थितियों (Ctrl, TD, MC, और MT) में 12 दिनों के संवर्धन के बाद व्यवहार्यता के परिमाणीकरण को ताजा हृदय स्लाइस (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD और D12 MT), 12 (D12 MC) स्लाइस/समूह विभिन्न सूअरों से, एक-तरफ़ा ANOVA परीक्षण किया जाता है; ####p < 0.0001, ###p < 0.001 D0 की तुलना में और **p < 0.01 D12 Ctrl की तुलना में) की तुलना में दिखाता है। बार ग्राफ सभी 4 संवर्धन स्थितियों (Ctrl, TD, MC, और MT) में 12 दिनों के संवर्धन के बाद व्यवहार्यता के परिमाणीकरण को ताजा हृदय स्लाइस (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD और D12 MT), 12 (D12 MC) स्लाइस/समूह विभिन्न सूअरों से, एक-तरफ़ा ANOVA परीक्षण किया जाता है; ####p < 0.0001, ###p < 0.001 D0 की तुलना में और **p < 0.01 D12 ctrl की तुलना में) की तुलना में दिखाता है। b Гистограмма показывает количественную оценку жизнеспособности 12 दिनों की अवधि के लिए 4 दिनों तक की खरीदारी культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD и D12 MT), 12 (D12 MC) срезов/группу от разных свиней, проводится односторонний тест एनोवा; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 по сравнению с D0 и **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). बार ग्राफ सभी 4 संवर्धन स्थितियों (नियंत्रण, टीडी, एमसी और एमटी) में ताजा हृदय खंडों (डी0) की तुलना में संवर्धन के 12 दिनों बाद व्यवहार्यता की मात्रा का पता लगाता है (एन = 18 (डी0), 15 (डी12 सीटीआरएल, डी12 टीडी और डी12 एमटी), 12 (डी12 एमसी) खंड/समूह विभिन्न सूअरों से, एक तरफा एनोवा परीक्षण; ####पी < 0.0001, ###पी < 0.001 बनाम डी0 और **पी < 0.01 डी12 सीटीआरएल की तुलना में)। b 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) (n = 18 (D0)、15 (D12 Ctrl、D12 TD) D12 MT)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组,进行单向ANOVA 测试；####p < 0.0001,###p < 0.001 与D0 ठीक है,**p < 0.01 प्रति D12 त्रुटि）।बी 4 12 (डी12 एमसी) b Гистограмма, показывающая все 4 условия культивирования (контроль, TD, MC और MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD и D12 MT), от разных свиней 12 (D12 MC) срезы/группа, односторонний тест ANOVA; ####p <0,0001, ###p <0,001 по сравнению с D0, **p <0,01 по сравнению с контролем D12). ख. सभी 4 संवर्धन स्थितियों (नियंत्रण, टीडी, एमसी और एमटी) को ताजा हृदय खंडों (डी0) (एन = 18 (डी0), 15 (डी12 सीटीआरएल, डी12 टीडी और डी12 एमटी) की तुलना में दर्शाने वाला हिस्टोग्राम, विभिन्न सूअरों से 12 (डी12 एमसी) खंड/समूह, एक-तरफ़ा एनोवा परीक्षण; ####पी<0.0001, ###पी<0.001 बनाम डी0, **पी<0.01 बनाम नियंत्रण डी12)। सी बार ग्राफ सभी 4 संवर्धन स्थितियों (Ctrl, TD, MC, और MT) में संवर्धन के 12 दिनों के बाद ग्लूकोज प्रवाह की मात्रा को ताजा हृदय स्लाइस (D0) की तुलना में दर्शाता है (n = विभिन्न सूअरों से 6 स्लाइस/समूह, एक-तरफ़ा ANOVA परीक्षण किया जाता है; ###p < 0.001, D0 की तुलना में और ***p < 0.001 D12 Ctrl की तुलना में)। सी बार ग्राफ सभी 4 संवर्धन स्थितियों (Ctrl, TD, MC, और MT) में संवर्धन के 12 दिनों के बाद ग्लूकोज प्रवाह की मात्रा को ताजा हृदय स्लाइस (D0) की तुलना में दर्शाता है (n = विभिन्न सूअरों से 6 स्लाइस/समूह, एक-तरफ़ा ANOVA परीक्षण किया जाता है; ###p < 0.001, D0 की तुलना में और ***p < 0.001 D12 Ctrl की तुलना में)। c Гистограмма показывает количественную оценку потока глюкозы через 12 4 साल से कम समय में 4 साल की छूट культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами सेरेडी (डी0) (एन = 6 करोड़ Выполняется тест एनोवा; ###p < 0,001 по сравнению с D0 и ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c हिस्टोग्राम सभी 4 संवर्धन स्थितियों (नियंत्रण, टीडी, एमसी और एमटी) के तहत संवर्धन के 12 दिनों के बाद ग्लूकोज प्रवाह की मात्रा को ताजा हृदय खंडों (डी0) की तुलना में दर्शाता है (एन = विभिन्न सूअरों से 6 खंड/समूह, एकतरफा एनोवा परीक्षण किया गया; डी0 की तुलना में ###पी < 0.001 और डी12 सीटीआरएल की तुलना में ***पी < 0.001)। c 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) 相比，培养后12天的葡萄糖通量定量（n = 6 片/组,来自不同猪,单向执行ANOVA 测试；###p < 0.001，与D0 त्रुटि,***पी < 0.001 D12 Ctrl कुंजी）。 C को डाउनलोड करने के लिए 4 चरणों का पालन करें (Ctrl 、 td 、 mc 和 mt)।培养 后 后 12 天 的 通量 定量 （n = 6 片/组 , 来自 猪 , ， ， ， ， ， ， ， 猪猪单向行行ANOVA त्रुटि;###p < 0.001,与D0 त्रुटि,***p < 0.001, या D12 Ctrl कुंजी）。 c Гистограмма, показывающая количественную оценку потока глюкозы 12 दिनों की अवधि के लिए 4 दिनों तक की खरीदारी культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами सेरेडी (D0) (n = 6 срезов/группа, от разных свиней, односторонний Были проведены тесты एनोवा; ###p < 0,001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению с D12 (контроль). c सभी 4 संवर्धन स्थितियों (नियंत्रण, टीडी, एमसी, और एमटी) के लिए संवर्धन के 12 दिनों के बाद ग्लूकोज प्रवाह की मात्रा दर्शाने वाला हिस्टोग्राम, ताजा हृदय खंडों (डी0) की तुलना में (एन = 6 खंड/समूह, विभिन्न सूअरों से, एकतरफा एनोवा परीक्षण किए गए, ###पी < 0.001 डी0 की तुलना में, ***पी < 0.001 डी12 (नियंत्रण) की तुलना में।d दस क्षेत्रीय ऊतक खंड बिंदुओं पर ताजा (नीला), दिन 12 MC (हरा), और दिन 12 MT (लाल) ऊतकों के तनाव विश्लेषण प्लॉट (n = 4 स्लाइस/समूह, एकतरफा ANOVA परीक्षण; समूहों के बीच कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं था)। e ज्वालामुखी प्लॉट 10-12 दिनों के लिए स्थिर स्थितियों (Ctrl) या MT स्थितियों (MT) के तहत संवर्धित हृदय खंडों की तुलना में ताजा हृदय खंडों (D0) में भिन्न रूप से व्यक्त जीन दिखाता है। f प्रत्येक संवर्धन स्थितियों के तहत संवर्धित हृदय खंडों के लिए सार्कोमियर जीन का हीटमैप। त्रुटि बार औसत ± मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करते हैं।
फैटी एसिड ऑक्सीकरण से ग्लाइकोलाइसिस में स्विच पर चयापचय निर्भरता कार्डियोमायोसाइट विभेदन की एक पहचान है। अपरिपक्व कार्डियोमायोसाइट्स मुख्य रूप से एटीपी उत्पादन के लिए ग्लूकोज का उपयोग करते हैं और उनमें कुछ क्रिस्टे के साथ हाइपोप्लास्टिक माइटोकॉन्ड्रिया होते हैं5,32। ग्लूकोज उपयोग विश्लेषण से पता चला है कि MC और MT स्थितियों के तहत, ग्लूकोज उपयोग दिन 0 ऊतकों (चित्र 4c) के समान था। हालांकि, Ctrl नमूनों ने ताजा ऊतक की तुलना में ग्लूकोज उपयोग में उल्लेखनीय वृद्धि दिखाई। यह दर्शाता है कि CTCM और T3/Dex का संयोजन ऊतक व्यवहार्यता को बढ़ाता है और 12-दिन के सुसंस्कृत हृदय खंडों के चयापचय फेनोटाइप को संरक्षित करता है। इसके अलावा, तनाव विश्लेषण से पता चला है कि MT और MS स्थितियों के तहत 12 दिनों के लिए तनाव का स्तर ताजा हृदय ऊतक के समान ही रहा (चित्र 4d)।
हृदय स्लाइस ऊतक के वैश्विक ट्रांस्क्रिप्शनल परिदृश्य पर CTCM और T3/Dex के समग्र प्रभाव का विश्लेषण करने के लिए, हमने सभी चार अलग-अलग संस्कृति स्थितियों (पूरक डेटा 1) से हृदय स्लाइस पर RNAseq का प्रदर्शन किया। दिलचस्प बात यह है कि MT खंडों ने ताज़े हृदय ऊतक के साथ उच्च ट्रांस्क्रिप्शनल समानता दिखाई, जिसमें 13,642 जीनों में से केवल 16 अलग-अलग व्यक्त किए गए थे। हालांकि, जैसा कि हमने पहले दिखाया था, Ctrl स्लाइस ने संस्कृति में 10-12 दिनों के बाद 1229 अलग-अलग व्यक्त जीन प्रदर्शित किए (चित्र 4e)। इन आंकड़ों की पुष्टि हृदय और फाइब्रोब्लास्ट जीन के qRT-PCR द्वारा की गई (पूरक चित्र 7a-c)। दिलचस्प बात यह है कि Ctrl खंडों ने हृदय और कोशिका चक्र जीनों का डाउनरेगुलेशन और भड़काऊ जीन कार्यक्रमों का सक्रियण दिखाया सार्कोमियर जीन के सावधानीपूर्वक अध्ययन से पता चला कि केवल MT स्थितियों के तहत सार्कोमियर (चित्र 4f) और आयन चैनल (पूरक चित्र 9) को एन्कोड करने वाले जीन संरक्षित हैं, जो उन्हें Ctrl, TD और MC स्थितियों के तहत दमन से बचाते हैं। ये डेटा प्रदर्शित करते हैं कि यांत्रिक और हास्य उत्तेजना (T3/Dex) के संयोजन के साथ, हृदय स्लाइस ट्रांसक्रिप्टोम संस्कृति में 12 दिनों के बाद ताजा हृदय स्लाइस के समान रह सकता है।
इन ट्रांसक्रिप्शनल निष्कर्षों का समर्थन इस तथ्य से होता है कि हृदय खंडों में कार्डियोमायोसाइट्स की संरचनात्मक अखंडता 12 दिनों के लिए MT स्थितियों के तहत सबसे अच्छी तरह से संरक्षित है, जैसा कि बरकरार और स्थानीयकृत कॉनेक्सिन 43 (चित्र 5 ए) द्वारा दिखाया गया है। इसके अलावा, MT स्थितियों के तहत हृदय खंडों में फाइब्रोसिस Ctrl की तुलना में काफी कम हो गया था और ताजा हृदय खंडों के समान था (चित्र 5 बी)। ये डेटा प्रदर्शित करते हैं कि यांत्रिक उत्तेजना और T3/Dex उपचार का संयोजन संस्कृति में हृदय खंडों में हृदय संरचना को प्रभावी ढंग से संरक्षित करता है।
ट्रोपोनिन-टी (हरा), कॉनेक्सिन 43 (लाल), और डीएपीआई (नीला) की प्रतिनिधि इम्यूनोफ्लोरेसेंस छवियां ताजा पृथक हृदय खंडों (डी0) में या सभी चार हृदय खंड संस्कृति स्थितियों (स्केल बार = 100 µm) में 12 दिनों के लिए संवर्धित। हृदय ऊतक संरचनात्मक अखंडता का कृत्रिम बुद्धिमत्ता परिमाणीकरण (n = 7 (D0 और D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC और D12 MT) विभिन्न सूअरों से स्लाइस/समूह, एक-तरफ़ा ANOVA परीक्षण किया जाता है; ####p < 0.0001 की तुलना में D0 और *p < 0.05, या ****p < 0.0001 की तुलना में D12 Ctrl)। हृदय ऊतक संरचनात्मक अखंडता का कृत्रिम बुद्धिमत्ता परिमाणीकरण (n = 7 (D0 और D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC और D12 MT) विभिन्न सूअरों से स्लाइस/समूह, एक-तरफ़ा ANOVA परीक्षण किया जाता है; #### p < 0.0001 की तुलना में D0 और *p < 0.05, या ****p < 0.0001 की तुलना में D12 Ctrl)। Количественная оценка структурной целостности ткани сердца с помощью искусственного интеллекта (n = 7 (D0 और D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC और D12 MT) उत्पाद विवरण #### p < 0,0001 по сравнению с D0 и *p < 0,05 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). कृत्रिम बुद्धिमत्ता का उपयोग करके हृदय के ऊतकों की संरचनात्मक अखंडता का परिमाणीकरण (n = 7 (D0 और D12 Ctrl), विभिन्न सूअरों से 5 (D12 TD, D12 MC और D12 MT) खंड/समूह, एकतरफा ANOVA परीक्षण किया गया; #### p < 0.0001 की तुलना में D0 और *p < 0.05 या ****p < 0.0001 की तुलना में D12 Ctrl)।对不同猪的心脏组织结构完整性 （N = 7 （D0 和 D12 Ctrl 、 （5 （D12 TD 、 D12 MC 和 D12 MT）切片/组）进行人工智能量化，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0.0001 与D0 和*p < 0.05 相比，或****p < 0.0001 से D12 Ctrl कुंजी）。एक बार फिर से क्लिक करें (n = 7 (d0 और d12 ctrl) (5) (d12 td 、 d12 mc और d12 mt)人工 智能量 化 进行 单向 单向 单向 测试 ； ######### p < 0.0001 与D0 和*p < 0.05 相比，或****p < 0.0001 D12 Ctrl कुंजी）。एक-तरफ़ा एनोवा परीक्षण के साथ विभिन्न सूअरों (n = 7 (D0 और D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC और D12 MT) अनुभाग/समूह) में कृत्रिम बुद्धिमत्ता का उपयोग करके हृदय के ऊतकों की संरचनात्मक अखंडता का परिमाणीकरण;#### p < 0,0001 по сравнению с D0 и *p < 0,05 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). #### p < 0.0001 की तुलना में D0 और *p < 0.05 या ****p < 0.0001 की तुलना में D12 (Ctrl)। बी मैसन के ट्राइक्रोम स्टेन (स्केल बार = 500 µm) से रंगे हृदय के स्लाइस के लिए प्रतिनिधि चित्र और मात्रा का निर्धारण (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD, और D12 MC), विभिन्न सूअरों से 9 (D12 MT) स्लाइस/समूह, एकतरफा ANOVA परीक्षण किया जाता है; ####p < 0.0001 की तुलना में D0 और ***p < 0.001, या ****p < 0.0001 की तुलना में D12 Ctrl)। बी मैसन के ट्राइक्रोम स्टेन (स्केल बार = 500 µm) से रंगे हृदय के स्लाइस के लिए प्रतिनिधि चित्र और मात्रा का निर्धारण (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD, और D12 MC), विभिन्न सूअरों से 9 (D12 MT) स्लाइस/समूह, एकतरफा ANOVA परीक्षण किया जाता है; ####p < 0.0001 की तुलना में D0 और ***p < 0.001, या ****p < 0.0001 की तुलना में D12 Ctrl)। b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов सेरेडी, окраштабная линейка = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD और D12 MC), 9 (D12 MT) срезов/группу от разных свиней, выполняется односторонний тест ANOVA; ****पी < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). बी मैसन के ट्राइक्रोम स्टेन (स्केल बार = 500 µm) से रंगे हृदय खंडों की प्रतिनिधि छवियां और मात्रा का निर्धारण (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD और D12 MC), विभिन्न सूअरों से 9 (D12 MT) खंड/समूह, एकतरफा ANOVA निष्पादित; ####p < 0.0001 बनाम D0 और ***p < 0.001 या ****p < 0.0001 बनाम D12 Ctrl)। b 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像和量化（比例尺=500 µm）（n = 10（D0、D12 Ctrl, D12 TD और D12 MC，，来自不同猪的9 个（D12 MT）切片/组，进行单因素方差分析；####p < 0.0001与D0 ठीक है,***p < 0.001, या****p < 0.0001, D12 Ctrl कुंजी）。 b 用 mason 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 和 量化 （比例 尺 尺 尺 = 500 µm） （n = 10 （d0 、 d12 ctrl 、 d12 td और d12 mc） 9 个 d12 mt पर क्लिक करें切 तस्वीरें तस्वीरें और तस्वीरें D0 का उपयोग करें,***p < 0.001,या****p < 0.0001 का उपयोग करें D12 Ctrl का उपयोग करें）。 b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов सेरेडी, окрашенных трихромом Массона (масштабная линейка = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD और D12 MC), 9 (D12 MT) срезов от разных свиней / группы, один- способ ANOVA; ####p < 0,0001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). बी मैसन के ट्राइक्रोम (स्केल बार = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD और D12 MC) के साथ अभिरंजित हृदय खंडों की प्रतिनिधि छवियां और मात्रा का निर्धारण, विभिन्न सूअरों/समूह से 9 (D12 MT) खंड, एक ANOVA विधि; ####p < 0.0001 की तुलना में D0, ***p < 0.001 या ****p < 0.0001 की तुलना में D12 Ctrl)।त्रुटि बार माध्य ± मानक विचलन को दर्शाते हैं।
अंत में, हृदय के ऊतकों के खिंचाव को बढ़ाकर हृदय की अतिवृद्धि की नकल करने की CTCM की क्षमता का मूल्यांकन किया गया। CTCM में, अधिकतम वायु कक्ष दाब ​​80 mmHg से बढ़कर 80 mmHg. Art. (सामान्य खिंचाव) से 140 mmHg Art. (चित्र 6a) तक हो गया। यह खिंचाव में 32% वृद्धि के अनुरूप है (चित्र 6b), जिसे पहले हृदय के खंडों के लिए आवश्यक प्रतिशत खिंचाव के रूप में दिखाया गया था ताकि अतिवृद्धि में देखी गई सार्कोमियर लंबाई प्राप्त हो सके। संकुचन और विश्राम के दौरान हृदय के ऊतकों का खिंचाव और वेग संस्कृति के छह दिनों के दौरान स्थिर रहा (चित्र 6c)। MT स्थितियों से हृदय के ऊतकों को छह दिनों के लिए सामान्य खिंचाव (MT (सामान्य)) या अधिक खिंचाव की स्थिति (MT (OS)) के अधीन किया गया। संस्कृति में चार दिनों के बाद ही, MT (OS) स्थितियों की तुलना में MT (सामान्य) स्थितियों के तहत माध्यम में हाइपरट्रॉफिक बायोमार्कर NT-ProBNP काफी हद तक बढ़ गया था (चित्र 7a)। इसके अलावा, छह दिनों की संस्कृति के बाद, MT (OS) (चित्र 7b) में सेल का आकार MT हृदय (सामान्य) के खंडों की तुलना में काफी बढ़ गया। इसके अलावा, NFATC4 परमाणु स्थानांतरण अत्यधिक फैले हुए ऊतकों (चित्र 7c) में काफी बढ़ गया था। ये परिणाम हाइपरडिस्टेन्शन के बाद पैथोलॉजिकल रीमॉडलिंग के प्रगतिशील विकास को दर्शाते हैं और इस अवधारणा का समर्थन करते हैं कि CTCM डिवाइस को स्ट्रेच-प्रेरित कार्डियक हाइपरट्रॉफी सिग्नलिंग का अध्ययन करने के लिए एक प्लेटफ़ॉर्म के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है।
वायु कक्ष दबाव, द्रव कक्ष दबाव और ऊतक आंदोलन माप के प्रतिनिधि निशान इस बात की पुष्टि करते हैं कि कक्ष दबाव द्रव कक्ष दबाव को बदल देता है, जिससे ऊतक स्लाइस की इसी तरह की गति होती है। ख सामान्य रूप से फैले हुए (नारंगी) और अत्यधिक फैले हुए (नीले) ऊतक खंडों के लिए प्रतिनिधि खिंचाव प्रतिशत और खिंचाव दर वक्र। ग चक्र समय (n = 19 स्लाइस प्रति समूह, विभिन्न सूअरों से), संकुचन समय (n = 18-19 स्लाइस प्रति समूह, विभिन्न सूअरों से), विश्राम समय (n = 19 स्लाइस प्रति समूह, विभिन्न सूअरों से) दिखाने वाला बार ग्राफ ), ऊतक आंदोलन का आयाम (n = 14 स्लाइस/समूह, विभिन्न सूअरों से), पीक सिस्टोलिक वेग (n = 14 स्लाइस/समूह, विभिन्न सूअरों से) और पीक विश्राम दर (n = 14 (डी0), त्रुटि बार माध्य ± मानक विचलन को दर्शाते हैं।
एमटी सामान्य खिंचाव (मानक) या अधिक खिंचाव (ओएस) स्थितियों के तहत संवर्धित हृदय स्लाइस से संवर्धन मीडिया में एनटी-प्रोबीएनपी सांद्रता का बार ग्राफ परिमाणीकरण (एन = 4 (डी2 एमटीनॉर्म), 3 (डी2 एमटीओएस, डी4 एमटीनॉर्म, और डी4 एमटीओएस) स्लाइस/विभिन्न सूअरों से समूह, दो-तरफा एनोवा किया जाता है; ** सामान्य खिंचाव की तुलना में p < 0.01)। एमटी सामान्य खिंचाव (नॉर्म) या ओवरस्ट्रेचिंग (ओएस) स्थितियों के तहत संवर्धित हृदय स्लाइस से संस्कृति मीडिया में एनटी-प्रोबीएनपी एकाग्रता का बार ग्राफ मात्रा का ठहराव (एन = 4 (डी 2 एमटीनॉर्म), 3 (डी 2 एमटीओएस, डी 4 एमटीनॉर्म, और डी 4 एमटीओएस) स्लाइस / समूह विभिन्न सूअरों से, दो-तरफा एनोवा किया जाता है; ** सामान्य खिंचाव की तुलना में पी < 0.01)।सामान्य एमटी खिंचाव (मानक) या ओवरस्ट्रेच (ओएस) (एन = 4 (डी 2 एमटी नॉर्म), 3 (डी 2 एमटीओएस, डी 4 एमटी नॉर्म, और डी 4) .एमटीओएस) स्लाइस / विभिन्न सूअरों से समूह की स्थितियों के तहत संवर्धित हृदय स्लाइस से संवर्धन माध्यम में एनटी-प्रोबीएनपी एकाग्रता का मात्रात्मक हिस्टोग्राम, विचरण का दो-कारक विश्लेषण किया जाता है;**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p < 0.01 सामान्य खिंचाव की तुलना में). MT-ProBNP को डाउनलोड करने के लिए MT-ProBNP की आवश्यकता होती है पूर्ण आकार का डेटा (n = 4 (D2 MTNorm)), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm और D4) एमटीओएस (एमटीओएस) के अनुसार फोटो / फोटो, अतिरिक्त डेटा की आवश्यकता होती है; ** अधिक डेटा की आवश्यकता होती है, पी < 0.01）। एमटी सामान्य खिंचाव (नॉर्म) या ओवरस्ट्रेच (ओएस) स्थितियों (एन = 4 (डी 2 एमटी नॉर्म), 3 (डी 2 एमटीओएस, डी 4 एमटी नॉर्म और डी 4 एमटीओएस) के तहत अलग-अलग हृदय स्लाइस में एनटी-प्रोबीएनपी एकाग्रता की मात्रा सामान्य स्ट्रेचिंग की तुलना में, पी <0.01)।हिस्टोग्राम सामान्य एमटी खिंचाव (मानक) या ओवरस्ट्रेच (ओएस) (एन = 4 (डी 2 एमटीनॉर्म), 3 (डी 2 एमटीओएस, डी 4 एमटीनॉर्म) और डी 4 एमटीओएस) स्लाइस / समूह विभिन्न सूअरों से, विचरण का दो-तरफ़ा विश्लेषण की स्थिति के तहत संवर्धित हृदय स्लाइस में एनटी-प्रोबीएनपी सांद्रता का परिमाणीकरण;**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p < 0.01 सामान्य खिंचाव की तुलना में). b ट्रोपोनिन-टी और डब्लूजीए (बाएं) के साथ अभिरंजित हृदय स्लाइस के लिए प्रतिनिधि चित्र और कोशिका आकार परिमाणीकरण (दाएं) (एन = 330 (डी 6 एमटीओएस), 369 (डी 6 एमटीनॉर्म) कोशिकाएं/विभिन्न सूअरों के 10 अलग-अलग स्लाइस से समूह, दो-पूंछ वाला स्टूडेंट टी-परीक्षण किया गया है; सामान्य खिंचाव की तुलना में ****p < 0.0001)। b ट्रोपोनिन-टी और डब्लूजीए (बाएं) के साथ अभिरंजित हृदय स्लाइस के लिए प्रतिनिधि चित्र और कोशिका आकार परिमाणीकरण (दाएं) (एन = 330 (डी 6 एमटीओएस), 369 (डी 6 एमटीनॉर्म) कोशिकाएं/विभिन्न सूअरों के 10 अलग-अलग स्लाइस से समूह, दो-पूंछ वाला स्टूडेंट टी-परीक्षण किया गया है; सामान्य खिंचाव की तुलना में ****p < 0.0001)। b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т और АЗП (слева) और количественного определения размера клеток (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) клеток/группу из 10 разных срезов от разных свиней, два- проводится хвостовой t-критерий Стьюдента; ****p < 0,0001 по сравнению с нормальным растяжением). b ट्रोपोनिन-टी और AZP से अभिरंजित हृदय खंडों की प्रतिनिधि छवियां (बाएं) और कोशिका आकार परिमाणीकरण (दाएं) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) कोशिकाएं/समूह विभिन्न सूअरों के 10 विभिन्न खंडों से, दो-पूंछ वाले स्टूडेंट का टी-परीक्षण किया गया; सामान्य तनाव की तुलना में ****p < 0.0001)। b 用肌钙蛋白-T 和WGA（左） और 细胞大小量化（右） 染色的心脏切片的代表性图像（n = 330（D6 MTOS），个不同猪的10 个不同切片的369（D6 MTNorm）细胞/组，两进行有尾学生t उत्तर: 与正常拉伸相比,****p < 0.0001）。 बी कैल्केरिन-टी और डब्लूजीए (बाएं) और कोशिका आकार (दाएं) के साथ दागे गए हृदय स्लाइस की प्रतिनिधि छवियां (एन = 330 (डी6 एमटीओएस), 10 अलग-अलग स्लाइसों से 369 (डी6 एमटीनॉर्म)) कोशिकाएं/तरल, गैर-विशिष्ट एंटीजन माप टी परीक्षण; सामान्य स्ट्रेचिंग के साथ तुलना, *****पी < 0.0001)। b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т और АЗП (слева) और количественная оценка размера клеток (справа) (एन = 330 (डी6 एमटीओएस), 369 (डी6 एमटीनॉर्म) या 10 मिलियन डॉलर से अधिक की कीमत पर क्लेट/लाइनर, двусторонние критерий Стьюдента; ****p < 0,0001 по сравнению с нормальным (विघटन). b ट्रोपोनिन-टी और AZP से अभिरंजित हृदय खंडों की प्रतिनिधि छवियां (बाएं) और कोशिका आकार का परिमाणीकरण (दाएं) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) विभिन्न सूअरों के 10 विभिन्न खंडों से) कोशिकाएं/समूह, दो-पूंछ वाला मानदंड छात्र का t; ****p < 0.0001 सामान्य तनाव की तुलना में)। सी दिन 0 और दिन 6 MTOS हृदय स्लाइस के लिए प्रतिनिधि चित्र ट्रोपोनिन-टी और एनएफएटीसी4 के लिए इम्यूनोलेबल किए गए और सीएम के नाभिक में एनएफएटीसी4 के स्थानांतरण की मात्रा का निर्धारण (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) स्लाइस / समूह विभिन्न सूअरों से, दो-पूंछ वाले छात्र टी-परीक्षण किया जाता है; *p < 0.05)। सी दिन 0 और दिन 6 एमटीओएस हृदय स्लाइस के लिए प्रतिनिधि छवियां ट्रोपोनिन-टी और एनएफएटीसी 4 के लिए इम्यूनोलेबल की गईं और सीएम के नाभिक में एनएफएटीसी 4 के स्थानांतरण की मात्रा का निर्धारण (एन = 4 (डी 0), 3 (डी 6 एमटीओएस) स्लाइस / समूह विभिन्न सूअरों से, दो-पूंछ वाले छात्र टी-परीक्षण किया जाता है; * पी < 0.05)। c Репрезентативные изображения для срезов сердца 0 и 6 दिन MTOS, имуномеченых для тропонина-Т और NFATC4, और количественная оценка транслокации NFATC4 в ядра кавернозных клеток (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срезов/группу от разных свиней , выполняется двусторонний t-критерий Стьюдента; सी 0 और 6 दिन एमटीओएस पर हृदय खंडों के लिए प्रतिनिधि छवियां, ट्रोपोनिन-टी और एनएफएटीसी4 के लिए इम्यूनोलेबल, और गुफाओं वाली कोशिकाओं के नाभिक में एनएफएटीसी4 स्थानांतरण की मात्रा (एन = 4 (डी0), 3 (डी6 एमटीओएस) स्लाइस/विभिन्न सूअरों से समूह) दो-पूंछ वाले छात्र के टी-परीक्षण का प्रदर्शन; * पी < 0.05)। c 用于肌钙蛋白-T और NFATC4 免疫标记的第0 天和第6 MTOS एनएफएटीसी 4 एनएफएटीसी 4 एनएफएटीसीएन = 4 (डी0)、3 (डी6 एमटीओएस)切片/组, 进行双尾学生t 检验；*p < 0.05)。 सी कैल्केनिन-टी और एनएफएटीसी4 इम्युनोलेबलिंग की प्रतिनिधि छवियां 0 से अधिक एमटीओएस हृदय स्लाइस, और एनएफएटीसी4 विभिन्न एनएफएटीसी4 से सीएम सेल न्यूक्लियस मात्रा (एन = 4 (डी0), 3 (डी 6 एमटीओएस) से संबंधित हैं।时间双尾学生et 电影；*p < 0.05). c Репрезентативные изображения срезов сердца MTOS на 0 и 6 दिन имуномаркировки тропонином-Т और NFATC4 और количественная оценка транслокации NFATC4 в ядра CM от разных свиней (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срез/группа, два- хвостатый t-критерий Стьюдента; *p < 0,05). सी ट्रोपोनिन-टी और एनएफएटीसी4 इम्यूनोलेबलिंग के लिए दिन 0 और 6 पर एमटीओएस हृदय स्लाइस की प्रतिनिधि छवियां और विभिन्न सूअरों से सीएम के नाभिक में एनएफएटीसी4 स्थानांतरण की मात्रा का निर्धारण (एन = 4 (डी0), 3 (डी6 एमटीओएस) स्लाइस/समूह, दो-पूंछ वाले टी-मानदंड छात्र; *पी < 0.05)।त्रुटि बार माध्य ± मानक विचलन को दर्शाते हैं।
ट्रांसलेशनल कार्डियोवैस्कुलर रिसर्च के लिए सेलुलर मॉडल की आवश्यकता होती है जो हृदय के वातावरण को सटीक रूप से पुन: पेश करते हैं। इस अध्ययन में, एक CTCM डिवाइस विकसित की गई और उसकी विशेषता बताई गई जो हृदय के अल्ट्राथिन सेक्शन को उत्तेजित कर सकती है। CTCM प्रणाली में शारीरिक रूप से समकालिक इलेक्ट्रोमैकेनिकल उत्तेजना और T3 और Dex द्रव संवर्धन शामिल है। जब सूअर के हृदय के हिस्सों को इन कारकों के संपर्क में लाया गया, तो उनकी व्यवहार्यता, संरचनात्मक अखंडता, चयापचय गतिविधि और ट्रांसक्रिप्शनल अभिव्यक्ति 12 दिनों की संस्कृति के बाद ताजा हृदय ऊतक के समान ही रही। इसके अलावा, हृदय के ऊतकों का अत्यधिक खिंचाव हाइपरएक्सटेंशन के कारण हृदय की अतिवृद्धि का कारण बन सकता है। कुल मिलाकर, ये परिणाम एक सामान्य हृदय संबंधी फेनोटाइप को बनाए रखने में शारीरिक संस्कृति स्थितियों की महत्वपूर्ण भूमिका का समर्थन करते हैं और दवा स्क्रीनिंग के लिए एक मंच प्रदान करते हैं।
कार्डियोमायोसाइट्स के कामकाज और अस्तित्व के लिए एक इष्टतम वातावरण बनाने में कई कारक योगदान करते हैं। इनमें से सबसे स्पष्ट कारक (1) अंतरकोशिकीय अंतःक्रियाएं, (2) इलेक्ट्रोमैकेनिकल उत्तेजना, (3) हास्य कारक और (4) चयापचय सब्सट्रेट से संबंधित हैं। शारीरिक कोशिका-से-कोशिका अंतःक्रियाओं के लिए एक बाह्य कोशिकीय मैट्रिक्स द्वारा समर्थित कई प्रकार की कोशिकाओं के जटिल त्रि-आयामी नेटवर्क की आवश्यकता होती है। इस तरह की जटिल कोशिकीय अंतःक्रियाओं को अलग-अलग कोशिका प्रकारों की सह-संस्कृति द्वारा इन विट्रो में पुनर्निर्माण करना मुश्किल है, लेकिन हृदय वर्गों की ऑर्गेनोटाइपिक प्रकृति का उपयोग करके आसानी से प्राप्त किया जा सकता है।
कार्डियोमायोसाइट्स का यांत्रिक खिंचाव और विद्युत उत्तेजना हृदय संबंधी फेनोटाइप33,34,35 को बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण है। जबकि यांत्रिक उत्तेजना का व्यापक रूप से hiPSC-CM कंडीशनिंग और परिपक्वता के लिए उपयोग किया गया है, कई शानदार अध्ययनों ने हाल ही में एक अक्षीय लोडिंग का उपयोग करके संस्कृति में हृदय स्लाइस के यांत्रिक उत्तेजना का प्रयास किया है। ये अध्ययन दर्शाते हैं कि 2D एक अक्षीय यांत्रिक लोडिंग का संस्कृति के दौरान हृदय के फेनोटाइप पर सकारात्मक प्रभाव पड़ता है। इन अध्ययनों में, हृदय के खंडों को या तो आइसोमेट्रिक तन्यता बलों17, रैखिक ऑक्सोटोनिक लोडिंग18 के साथ लोड किया गया था, या बल ट्रांसड्यूसर फीडबैक और तनाव ड्राइव का उपयोग करके हृदय चक्र को फिर से बनाया गया था। हालाँकि, ये विधियाँ पर्यावरण अनुकूलन के बिना एक अक्षीय ऊतक खिंचाव का उपयोग करती हैं, जिसके परिणामस्वरूप कई हृदय जीनों का दमन होता है या असामान्य खिंचाव प्रतिक्रियाओं से जुड़े जीनों की अधिक अभिव्यक्ति होती है। यहाँ वर्णित CTCM एक 3D इलेक्ट्रोमैकेनिकल उत्तेजना प्रदान करता है जो चक्र समय और शारीरिक खिंचाव (25% खिंचाव, 40% सिस्टोल, 60% डायस्टोल और 72 धड़कन प्रति मिनट) के संदर्भ में प्राकृतिक हृदय चक्र की नकल करता है। हालाँकि यह तीन-आयामी यांत्रिक उत्तेजना अकेले ऊतक अखंडता को बनाए रखने के लिए पर्याप्त नहीं है, लेकिन ऊतक व्यवहार्यता, कार्य और अखंडता को पर्याप्त रूप से बनाए रखने के लिए T3/Dex का उपयोग करके हास्य और यांत्रिक उत्तेजना का संयोजन आवश्यक है।
वयस्क हृदय फेनोटाइप को संशोधित करने में हास्य कारक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। यह HiPS-CM अध्ययनों में उजागर किया गया था जिसमें सेल परिपक्वता को तेज करने के लिए T3 और Dex को कल्चर मीडिया में जोड़ा गया था। T3 कोशिका झिल्लियों के पार अमीनो एसिड, शर्करा और कैल्शियम के परिवहन को प्रभावित कर सकता है36। इसके अलावा, T3 MHC-α अभिव्यक्ति और MHC-β डाउनरेगुलेशन को बढ़ावा देता है, जो भ्रूण CM में धीमी गति से चिकोटी मायोफिब्रिल की तुलना में परिपक्व कार्डियोमायोसाइट्स में तेज़ चिकोटी मायोफिब्रिल के गठन को बढ़ावा देता है। हाइपोथायरायड रोगियों में T3 की कमी से मायोफिब्रिलर बैंड की हानि और टोन विकास की दर में कमी होती है37। डेक्स ग्लूकोकोर्टिकॉइड रिसेप्टर्स पर कार्य करता है और अलग-अलग परफ्यूज़ किए गए दिलों में मायोकार्डियल सिकुड़न को बढ़ाता है; 38 यह सुधार कैल्शियम जमा-संचालित प्रविष्टि (SOCE) 39,40 पर प्रभाव से संबंधित माना जाता है। इसके अलावा, डेक्स अपने रिसेप्टर्स से जुड़ता है, जिससे एक व्यापक अंतःकोशिकीय प्रतिक्रिया उत्पन्न होती है जो प्रतिरक्षा कार्य और सूजन को दबा देती है30।
हमारे परिणामों से संकेत मिलता है कि भौतिक यांत्रिक उत्तेजना (एमएस) ने Ctrl की तुलना में समग्र संस्कृति प्रदर्शन में सुधार किया, लेकिन संस्कृति में 12 दिनों में व्यवहार्यता, संरचनात्मक अखंडता और हृदय की अभिव्यक्ति को बनाए रखने में विफल रहा। Ctrl की तुलना में, CTCM (MT) संस्कृतियों में T3 और Dex को शामिल करने से व्यवहार्यता में सुधार हुआ और 12 दिनों के लिए ताजा हृदय ऊतक के साथ समान प्रतिलेखन प्रोफाइल, संरचनात्मक अखंडता और चयापचय गतिविधि को बनाए रखा। इसके अलावा, ऊतक खिंचाव की डिग्री को नियंत्रित करके, STCM का उपयोग करके एक हाइपरएक्सटेंशन-प्रेरित कार्डियक हाइपरट्रॉफी मॉडल बनाया गया था, जो STCM प्रणाली की बहुमुखी प्रतिभा को दर्शाता है। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि हालांकि कार्डियक रीमॉडलिंग और फाइब्रोसिस में आमतौर पर बरकरार अंग शामिल होते हैं जिनकी परिसंचारी कोशिकाएं उपयुक्त साइटोकिन्स के साथ-साथ फेगोसाइटोसिस और अन्य रीमॉडलिंग कारक प्रदान कर सकती हैं यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि CTCM मापदंडों को दबाव/विद्युत आयाम और आवृत्ति को बदलकर कई स्थितियों जैसे कि टैचीकार्डिया, ब्रैडीकार्डिया और मैकेनिकल सर्कुलेटरी सपोर्ट (मैकेनिकल अनलोडेड हार्ट) का अनुकरण करके संशोधित किया जा सकता है। यह सिस्टम को ड्रग परीक्षण के लिए एक माध्यम बनाता है। ओवरएक्सर्टेशन-प्रेरित कार्डियक हाइपरट्रॉफी को मॉडल करने की CTCM की क्षमता व्यक्तिगत चिकित्सा के लिए इस सिस्टम के परीक्षण का मार्ग प्रशस्त करती है। निष्कर्ष में, वर्तमान अध्ययन दर्शाता है कि कार्डियक ऊतक वर्गों की संस्कृति को बनाए रखने के लिए यांत्रिक खिंचाव और हास्य उत्तेजना महत्वपूर्ण हैं।
यद्यपि यहाँ प्रस्तुत डेटा यह सुझाव देते हैं कि CTCM अक्षुण्ण मायोकार्डियम के मॉडलिंग के लिए एक बहुत ही आशाजनक प्लेटफ़ॉर्म है, इस संस्कृति विधि की कुछ सीमाएँ हैं। CTCM संस्कृति की मुख्य सीमा यह है कि यह स्लाइस पर निरंतर गतिशील यांत्रिक तनाव लगाता है, जो प्रत्येक चक्र के दौरान हृदय स्लाइस संकुचन की सक्रिय रूप से निगरानी करने की क्षमता को रोकता है। इसके अलावा, हृदय वर्गों (7 मिमी) के छोटे आकार के कारण, पारंपरिक बल सेंसर का उपयोग करके संस्कृति प्रणालियों के बाहर सिस्टोलिक फ़ंक्शन का मूल्यांकन करने की क्षमता सीमित है। वर्तमान पांडुलिपि में, हम संकुचनशील कार्य के संकेतक के रूप में ऑप्टिकल वोल्टेज का मूल्यांकन करके इस सीमा को आंशिक रूप से दूर करते हैं। हालाँकि, इस सीमा को और अधिक काम करने की आवश्यकता होगी और भविष्य में संस्कृति में हृदय स्लाइस के कार्य की ऑप्टिकल निगरानी के लिए विधियों को पेश करके इसे संबोधित किया जा सकता है, जैसे कि कैल्शियम और वोल्टेज-संवेदनशील रंगों का उपयोग करके ऑप्टिकल मैपिंग। CTCM की एक और सीमा यह है कि कार्यशील मॉडल शारीरिक तनाव (प्रीलोड और आफ्टरलोड) में हेरफेर नहीं करता है। सीटीसीएम में, बहुत बड़े ऊतकों में डायस्टोल (पूर्ण खिंचाव) और सिस्टोल (विद्युत उत्तेजना के दौरान संकुचन की लंबाई) में 25% शारीरिक खिंचाव को पुन: उत्पन्न करने के लिए विपरीत दिशाओं में दबाव प्रेरित किया गया था। भविष्य के सीटीसीएम डिज़ाइनों में हृदय के ऊतकों पर दोनों तरफ से पर्याप्त दबाव और हृदय के कक्षों में होने वाले सटीक दबाव-मात्रा संबंधों को लागू करके इस सीमा को हटाया जाना चाहिए।
इस पांडुलिपि में रिपोर्ट की गई ओवरस्ट्रेच-प्रेरित रीमॉडलिंग हाइपरट्रॉफिक हाइपरस्ट्रेच संकेतों की नकल करने तक सीमित है। इस प्रकार, यह मॉडल ह्यूमरल या तंत्रिका कारकों (जो इस प्रणाली में मौजूद नहीं हैं) की आवश्यकता के बिना खिंचाव-प्रेरित हाइपरट्रॉफिक सिग्नलिंग के अध्ययन में मदद कर सकता है। CTCM की बहुलता को बढ़ाने के लिए आगे के अध्ययनों की आवश्यकता है, उदाहरण के लिए, प्रतिरक्षा कोशिकाओं के साथ सह-संवर्धन, परिसंचारी प्लाज्मा ह्यूमरल कारक, और न्यूरोनल कोशिकाओं के साथ सह-संवर्धन करते समय तंत्रिकाकरण CTCM के साथ रोग मॉडलिंग की संभावनाओं को बेहतर बनाएगा।
इस अध्ययन में तेरह सूअरों का इस्तेमाल किया गया था। सभी पशु प्रक्रियाएं संस्थागत दिशा-निर्देशों के अनुसार की गईं और लुइसविले विश्वविद्यालय की संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित की गईं। महाधमनी चाप को क्लैंप किया गया और हृदय को 1 लीटर स्टेराइल कार्डियोप्लेजिया (110 mM NaCl, 1.2 mM CaCl2, 16 mM KCl, 16 mM MgCl2, 10 mM NaHCO3, 5 U/mL हेपरिन, pH 7.4 तक) से भरा गया; हृदय को बर्फ के ठंडे कार्डियोप्लेजिक घोल में तब तक संरक्षित रखा जाता है जब तक कि उसे बर्फ पर प्रयोगशाला में नहीं ले जाया जाता, जो आमतौर पर <10 मिनट होता है। हृदय को बर्फ के ठंडे कार्डियोप्लेजिक घोल में तब तक संरक्षित रखा जाता है जब तक कि उसे बर्फ पर प्रयोगशाला में नहीं ले जाया जाता, जो आमतौर पर <10 मिनट होता है। сердца хранили в ледяном кардиоплегическом растворе до транспортировки в лабораторию на льду, что обычно занимает <10 мин. हृदय को बर्फ के ठंडे कार्डियोप्लेजिक घोल में तब तक संग्रहीत किया गया जब तक कि उसे बर्फ पर प्रयोगशाला में नहीं ले जाया गया, जिसमें आमतौर पर <10 मिनट लगते हैं।将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中,直到冰上运送到实验室,通常<10分钟。将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中,直到冰上运送到实验室,通常<10分钟。 Держите сердца в ледяной кардиоплегии до транспортировки в лабораторию на льду, обычно <10 мин. हृदय को बर्फ पर प्रयोगशाला में ले जाने तक, आमतौर पर <10 मिनट तक, बर्फ कार्डियोप्लेजिया पर रखें।
CTCM डिवाइस को SolidWorks कंप्यूटर एडेड डिज़ाइन (CAD) सॉफ़्टवेयर में विकसित किया गया था। कल्चर चैंबर, डिवाइडर और एयर चैंबर CNC क्लियर ऐक्रेलिक प्लास्टिक से बने हैं। 7 मिमी व्यास वाली बैक-अप रिंग बीच में हाई डेंसिटी पॉलीइथाइलीन (HDPE) से बनी है और इसमें सिलिकॉन ओ-रिंग को समायोजित करने के लिए एक ओ-रिंग ग्रूव है जिसका उपयोग मीडिया को सील करने के लिए किया जाता है। एक पतली सिलिका झिल्ली कल्चर चैंबर को सेपरेशन प्लेट से अलग करती है। सिलिकॉन झिल्ली 0.02″ मोटी सिलिकॉन शीट से लेजर कट की गई है और इसकी कठोरता 35A है। नीचे और ऊपर के सिलिकॉन गैस्केट 1/16″ मोटी सिलिकॉन शीट से लेजर कट किए गए हैं और इनकी कठोरता 50A है। ब्लॉक को जकड़ने और एयरटाइट सील बनाने के लिए 316L स्टेनलेस स्टील स्क्रू और विंग नट का उपयोग किया जाता है।
एक समर्पित मुद्रित सर्किट बोर्ड (पीसीबी) को सी-पेस-ईएम सिस्टम के साथ एकीकृत करने के लिए डिज़ाइन किया गया है। पीसीबी पर स्विस मशीन कनेक्टर सॉकेट सिल्वर-प्लेटेड कॉपर वायर और इलेक्ट्रोड में लगे कांस्य 0-60 स्क्रू द्वारा ग्रेफाइट इलेक्ट्रोड से जुड़े होते हैं। मुद्रित सर्किट बोर्ड को 3डी प्रिंटर के कवर में रखा जाता है।
सीटीसीएम डिवाइस को एक प्रोग्रामेबल न्यूमेटिक एक्ट्यूएटर (पीपीडी) द्वारा नियंत्रित किया जाता है जो हृदय चक्र के समान एक नियंत्रित संचार दबाव बनाता है। जैसे ही वायु कक्ष के अंदर दबाव बढ़ता है, लचीली सिलिकॉन झिल्ली ऊपर की ओर फैलती है, जिससे माध्यम ऊतक स्थल के नीचे चला जाता है। फिर ऊतक का क्षेत्र द्रव के इस निष्कासन से फैल जाएगा, जो डायस्टोल के दौरान हृदय के शारीरिक विस्तार की नकल करता है। विश्राम के चरम पर, ग्रेफाइट इलेक्ट्रोड के माध्यम से विद्युत उत्तेजना लागू की गई, जिससे वायु कक्ष में दबाव कम हो गया और ऊतक वर्गों का संकुचन हुआ। पाइप के अंदर एक हेमोस्टेटिक वाल्व होता है जिसमें वायु प्रणाली में दबाव का पता लगाने के लिए एक प्रेशर सेंसर होता है। प्रेशर सेंसर द्वारा महसूस किया गया दबाव लैपटॉप से ​​​​जुड़े डेटा कलेक्टर पर लागू होता है। यह गैस चैंबर के अंदर दबाव की निरंतर निगरानी की अनुमति देता है। जब अधिकतम कक्ष दबाव (मानक 80 mmHg, 140 mmHg OS) पर पहुंच गया, तो डेटा अधिग्रहण डिवाइस को C-PACE-EM सिस्टम को एक संकेत भेजने का आदेश दिया गया, ताकि 2 ms के लिए 4 V पर सेट द्वि-चरणीय वोल्टेज संकेत उत्पन्न किया जा सके।
हृदय के खंड प्राप्त किए गए और 6 कुओं में संस्कृति की स्थिति इस प्रकार निष्पादित की गई: निकाले गए हृदयों को स्थानांतरण पात्र से ठंडे (4 डिग्री सेल्सियस) कार्डियोप्लेजिया वाले ट्रे में स्थानांतरित करें। बाएं वेंट्रिकल को एक बाँझ ब्लेड से अलग किया गया और 1-2 सेमी3 के टुकड़ों में काटा गया। इन ऊतक ब्लॉकों को ऊतक चिपकने वाले के साथ ऊतक समर्थन से जोड़ा गया और टायरोड के घोल युक्त एक कंपन वाले माइक्रोटोम ऊतक स्नान में रखा गया और लगातार ऑक्सीजनयुक्त किया गया (3 ग्राम/एल 2,3-ब्यूटेनडियोन मोनोऑक्साइम (बीडीएम), 140 मिमी NaCl (8.18 ग्राम)। ), 6 मिमी KCl (0.447 ग्राम), 10 मिमी डी-ग्लूकोज (1.86 ग्राम), 10 मिमी HEPES (2.38 ग्राम), कंपन करने वाले माइक्रोटोम को 80 हर्ट्ज की आवृत्ति, 2 मिमी के क्षैतिज कंपन आयाम और 0.03 मिमी/सेकेंड की अग्रिम दर पर 300 माइक्रोन मोटी स्लाइस काटने के लिए सेट किया गया था। समाधान को ठंडा रखने के लिए ऊतक स्नान को बर्फ से घेर दिया गया था और तापमान 4 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखा गया था। एक संस्कृति प्लेट के लिए पर्याप्त खंड प्राप्त होने तक माइक्रोटोम स्नान से ऊतक खंडों को बर्फ पर लगातार ऑक्सीजनयुक्त टायरोड समाधान युक्त ऊष्मायन स्नान में स्थानांतरित करें। ट्रांसवेल संस्कृतियों के लिए, ऊतक खंडों को बाँझ 6 मिमी चौड़े पॉलीयूरेथेन समर्थन से जोड़ा गया था और 6 मिलीलीटर अनुकूलित माध्यम (199 माध्यम, 1x आईटीएस पूरक, 10% एफबीएस, 5 एनजी/एमएल वीईजीएफ, 10 एनजी/एमएल एफजीएफ-क्षारीय और 2 एक्स एंटीबायोटिक-एंटीफंगल) में रखा गया था टीडी स्थितियों के लिए, प्रत्येक माध्यम परिवर्तन पर 100 एनएम और 1 माइक्रोन पर ताजा टी3 और डेक्स मिलाया गया। प्रतिस्थापन से पहले माध्यम को दिन में 3 बार ऑक्सीजन से संतृप्त किया जाता है। ऊतक खंडों को 37 डिग्री सेल्सियस और 5% CO2 पर एक इनक्यूबेटर में संवर्धित किया गया।
CTCM कल्चर के लिए, ऊतक खंडों को एक कस्टम-निर्मित 3D प्रिंटर पर पेट्री डिश में रखा गया था जिसमें संशोधित टायरोड का घोल था। डिवाइस को सपोर्ट रिंग के क्षेत्र के 25% तक हृदय के स्लाइस के आकार को बढ़ाने के लिए डिज़ाइन किया गया है। ऐसा इसलिए किया जाता है ताकि टायरोड के घोल से माध्यम में स्थानांतरित होने के बाद और डायस्टोल के दौरान हृदय के खंड खिंच न जाएं। हिस्टोएक्रिलिक गोंद का उपयोग करते हुए, 300 µm मोटे खंडों को 7 मिमी व्यास वाले सपोर्ट रिंग पर स्थिर किया गया। ऊतक खंडों को सपोर्ट रिंग से जोड़ने के बाद, अतिरिक्त ऊतक खंडों को काट लें और जुड़े हुए ऊतक खंडों को बर्फ (4°C) पर टायरोड के घोल के स्नान में वापस रखें जब तक कि एक डिवाइस के लिए पर्याप्त खंड तैयार न हो जाएं। सभी उपकरणों के लिए कुल प्रसंस्करण समय 2 घंटे से अधिक नहीं होना चाहिए। 6 ऊतक खंडों को उनके सपोर्ट रिंग से जोड़ने के बाद, CTCM डिवाइस को इकट्ठा किया गया। CTCM कल्चर चैंबर 21 मिली प्री-ऑक्सीजनेटेड माध्यम से पहले से भरा हुआ है। ऊतक खंडों को कल्चर चैंबर में स्थानांतरित करें और पिपेट से सावधानीपूर्वक किसी भी हवाई बुलबुले को हटा दें। फिर ऊतक खंड को छेद में निर्देशित किया जाता है और धीरे से जगह में दबाया जाता है। अंत में, डिवाइस पर इलेक्ट्रोड कैप रखें और डिवाइस को इनक्यूबेटर में स्थानांतरित करें। फिर CTCM को एयर ट्यूब और C-PACE-EM सिस्टम से कनेक्ट करें। वायवीय एक्ट्यूएटर खुलता है और एयर वाल्व CTCM को खोलता है। C-PACE-EM सिस्टम को 2 ms के लिए द्वि-चरणीय पेसिंग के दौरान 1.2 Hz पर 4 V देने के लिए कॉन्फ़िगर किया गया था। इलेक्ट्रोड पर ग्रेफाइट के संचय से बचने के लिए दिन में दो बार माध्यम बदला गया और इलेक्ट्रोड को दिन में एक बार बदला गया। यदि आवश्यक हो, तो ऊतक खंडों को उनके कल्चर वेल से हटाया जा सकता है ताकि उनके नीचे गिरने वाले किसी भी हवाई बुलबुले को बाहर निकाला जा सके। MT उपचार स्थितियों के लिए, T3/Dex को 100 nM T3 और 1 μM Dex के साथ प्रत्येक माध्यम परिवर्तन के साथ ताज़ा जोड़ा गया था। सीटीसीएम उपकरणों को 37°C और 5% CO2 पर एक इनक्यूबेटर में संवर्धित किया गया।
हृदय के टुकड़ों के फैले हुए प्रक्षेप पथ प्राप्त करने के लिए, एक विशेष कैमरा प्रणाली विकसित की गई थी। एक SLR कैमरा (कैनन रेबेल T7i, कैनन, टोक्यो, जापान) का उपयोग नेविटर ज़ूम 7000 18-108 मिमी मैक्रो लेंस (नेविटर, सैन फ्रांसिस्को, CA) के साथ किया गया था। माध्यम को नए माध्यम से बदलने के बाद कमरे के तापमान पर विज़ुअलाइज़ेशन किया गया था। कैमरे को 51 डिग्री के कोण पर रखा गया है और वीडियो 30 फ्रेम प्रति सेकंड पर रिकॉर्ड किया गया है। सबसे पहले, हृदय के टुकड़ों की गति को मापने के लिए इमेज-जे के साथ ओपन सोर्स सॉफ़्टवेयर (MUSCLEMOTION43) का उपयोग किया गया था। शोर से बचने के लिए धड़कते हुए हृदय के टुकड़ों के लिए रुचि के क्षेत्रों को परिभाषित करने के लिए MATLAB (MathWorks, Natick, MA, USA) का उपयोग करके मास्क बनाया गया था। मैन्युअल रूप से खंडित मास्क एक फ्रेम अनुक्रम में सभी छवियों पर लागू होते हैं और फिर MUSCLEMOTION प्लग-इन को पास कर दिए जाते हैं। मसल मोशन संदर्भ फ्रेम के सापेक्ष अपनी गति को मापने के लिए प्रत्येक फ्रेम में पिक्सेल की औसत तीव्रता का उपयोग करता है। डेटा रिकॉर्ड किया गया, फ़िल्टर किया गया और हृदय चक्र के दौरान चक्र समय को मापने और ऊतक खिंचाव का आकलन करने के लिए उपयोग किया गया। रिकॉर्ड किए गए वीडियो को पहले क्रम के शून्य-चरण डिजिटल फ़िल्टर का उपयोग करके पोस्ट-प्रोसेस किया गया था। ऊतक खिंचाव (पीक-टू-पीक) को मापने के लिए, रिकॉर्ड किए गए सिग्नल में चोटियों और गर्तों के बीच अंतर करने के लिए पीक-टू-पीक विश्लेषण किया गया था। इसके अलावा, सिग्नल बहाव को खत्म करने के लिए 6वें क्रम के बहुपद का उपयोग करके डिट्रेंडिंग की जाती है। वैश्विक ऊतक गति, चक्र समय, विश्राम समय और संकुचन समय (पूरक कार्यक्रम कोड 44) निर्धारित करने के लिए MATLAB में प्रोग्राम कोड विकसित किया गया था।
तनाव विश्लेषण के लिए, यांत्रिक खिंचाव मूल्यांकन के लिए बनाए गए उन्हीं वीडियो का उपयोग करते हुए, हमने सबसे पहले MUSCLEMOTION सॉफ़्टवेयर के अनुसार गति चोटियों (गति के उच्चतम (ऊपरी) और निम्नतम (निचले) बिंदु) को दर्शाने वाली दो छवियों का पता लगाया। फिर हमने ऊतक क्षेत्रों को विभाजित किया और खंडित ऊतक (पूरक चित्र 2a) पर छायांकन एल्गोरिथ्म का एक रूप लागू किया। फिर खंडित ऊतक को दस उपसतहों में विभाजित किया गया, और प्रत्येक सतह पर तनाव की गणना निम्नलिखित समीकरण का उपयोग करके की गई: तनाव = (सुप-एसडाउन)/एसडाउन, जहाँ सुप और एसडाउन क्रमशः कपड़े की ऊपरी और निचली छाया से आकृति की दूरी हैं (पूरक चित्र .2b)।
हृदय के खंडों को 48 घंटों के लिए 4% पैराफॉर्मलडिहाइड में स्थिर किया गया। स्थिर ऊतकों को 1 घंटे के लिए 10% और 20% सुक्रोज में निर्जलित किया गया, फिर रात भर 30% सुक्रोज में रखा गया। फिर खंडों को इष्टतम कटिंग तापमान यौगिक (OCT यौगिक) में एम्बेड किया गया और धीरे-धीरे आइसोपेंटेन/सूखी बर्फ के स्नान में जमाया गया। अलग होने तक OCT एम्बेडिंग ब्लॉक को -80 °C पर स्टोर करें। स्लाइड्स को 8 μm की मोटाई वाले खंडों के रूप में तैयार किया गया था।
हृदय के खंडों से OCT को हटाने के लिए, स्लाइड को 5 मिनट के लिए 95 °C पर हीटिंग ब्लॉक पर गर्म करें। प्रत्येक स्लाइड में 1 मिली PBS डालें और कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें, फिर कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए PBS में 0.1% ट्राइटन-एक्स सेट करके खंडों को पर्मेट करें। गैर-विशिष्ट एंटीबॉडी को नमूने से बंधने से रोकने के लिए, स्लाइड में 3% BSA घोल का 1 मिली डालें और कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें। फिर BSA को हटा दिया गया और स्लाइड को PBS से धोया गया। प्रत्येक नमूने को पेंसिल से चिह्नित करें। प्राथमिक एंटीबॉडी (1% बीएसए में 1:200 पतला) (कनेक्सिन 43 (एबकैम; #AB11370), एनएफएटीसी4 (एबकैम; #AB99431) और ट्रोपोनिन-टी (थर्मो साइंटिफिक; #MA5-12960) को 90 मिनट के लिए जोड़ा गया, फिर द्वितीयक एंटीबॉडी (1% बीएसए में 1:200 पतला) माउस एलेक्सा फ्लुओर 488 (थर्मो साइंटिफिक; #A16079) के खिलाफ, खरगोश एलेक्सा फ्लुओर 594 (थर्मो साइंटिफिक; #T6391) के खिलाफ अतिरिक्त 90 मिनट के लिए पीबीएस के साथ 3 बार धोया गया। पृष्ठभूमि से लक्ष्य धुंधलापन को अलग करने के लिए, हमने नियंत्रण के रूप में केवल द्वितीयक एंटीबॉडी का उपयोग किया। अंत में, डीएपीआई परमाणु दाग ​​जोड़ा गया
WGA स्टेनिंग के लिए PBS में 5 μg/ml पर WGA-एलेक्सा फ्लुअर 555 (थर्मो साइंटिफिक; #W32464) का इस्तेमाल किया गया और कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए फिक्स्ड सेक्शन पर लगाया गया। फिर स्लाइड्स को PBS से धोया गया और प्रत्येक स्लाइड में सूडान ब्लैक मिलाया गया और 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट किया गया। फिर स्लाइड्स को PBS से धोया गया और वेक्टाशील्ड एम्बेडिंग मीडियम मिलाया गया। स्लाइड्स को 40x आवर्धन पर कीन्स माइक्रोस्कोप पर देखा गया।
OCT को नमूनों से ऊपर बताए अनुसार निकाला गया। OCT को निकालने के बाद, स्लाइड्स को रात भर बौइन के घोल में डुबोकर रखें। फिर स्लाइड्स को 1 घंटे के लिए आसुत जल से धोया गया और फिर 10 मिनट के लिए बिब्रीच एलो एसिड फ्यूशिन घोल में रखा गया। फिर स्लाइड्स को आसुत जल से धोया गया और 10 मिनट के लिए 5% फॉस्फोमोलिब्डेनम/5% फॉस्फोटंगस्टिक एसिड के घोल में रखा गया। बिना धोए, स्लाइड्स को सीधे 15 मिनट के लिए एनिलिन ब्लू घोल में स्थानांतरित करें। फिर स्लाइड्स को आसुत जल से धोया गया और 2 मिनट के लिए 1% एसिटिक एसिड घोल में रखा गया। स्लाइड्स को 200 एन इथेनॉल में सुखाया गया और ज़ाइलीन में स्थानांतरित किया गया। 10x ऑब्जेक्टिव वाले कीन्स माइक्रोस्कोप का उपयोग करके स्टेन की गई स्लाइड्स को देखा गया। कीन्स एनालाइज़र सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके फ़ाइब्रोसिस क्षेत्र प्रतिशत की मात्रा निर्धारित की गई।
CyQUANT™ MTT सेल वायबिलिटी परख (इंविट्रोजन, कार्ल्सबैड, CA), कैटलॉग नंबर V13154, कुछ संशोधनों के साथ निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार। विशेष रूप से, MTT विश्लेषण के दौरान एक समान ऊतक आकार सुनिश्चित करने के लिए 6 मिमी व्यास वाले सर्जिकल पंच का उपयोग किया गया था। निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार MTT सब्सट्रेट युक्त 12-वेल प्लेट के कुओं में ऊतकों को व्यक्तिगत रूप से प्लेट किया गया था। अनुभागों को 37° C पर 3 घंटे के लिए इनक्यूबेट किया जाता है और जीवित ऊतक MTT सब्सट्रेट को मेटाबोलाइज़ करके बैंगनी फ़ॉर्मेज़न यौगिक बनाता है। MTT घोल को 1 मिली DMSO से बदलें और हृदय अनुभागों से बैंगनी फ़ॉर्मेज़न निकालने के लिए 37 °C पर 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। नमूने 96-वेल क्लियर बॉटम प्लेट में DMSO में 1:10 के अनुपात में पतला किए गए और साइटेशन प्लेट रीडर (बायोटेक) का उपयोग करके 570 एनएम पर बैंगनी रंग की तीव्रता मापी गई। रीडिंग को हृदय के प्रत्येक स्लाइस के वजन के अनुसार सामान्यीकृत किया गया।
पहले बताए गए अनुसार ग्लूकोज उपयोग परख के लिए हार्ट स्लाइस मीडिया को 1 μCi/ml [5-3H]-ग्लूकोज (मोरेवेक बायोकेमिकल्स, ब्रेआ, CA, USA) युक्त मीडिया से बदला गया। 4 घंटे के इनक्यूबेशन के बाद, 100 µl मीडियम को एक खुली माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में डालें जिसमें 100 µl 0.2 N HCl हो। फिर ट्यूब को 500 μl dH2O युक्त एक सिंटिलेशन ट्यूब में रखा गया ताकि 37°C पर 72 घंटे के लिए [3H]2O वाष्पित हो जाए। फिर माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब को सिंटिलेशन ट्यूब से निकालें और 10 ml सिंटिलेशन द्रव डालें। ट्राई-कार्ब 2900TR लिक्विड सिंटिलेशन एनालाइजर (पैकार्ड बायोसाइंस कंपनी, मेरिडेन, CT, USA) का उपयोग करके सिंटिलेशन काउंट किए गए। फिर ग्लूकोज उपयोग की गणना [5-3H]-ग्लूकोज विशिष्ट गतिविधि, अपूर्ण संतुलन और पृष्ठभूमि, [5-3H]-अनलेबल ग्लूकोज के लिए कमजोर पड़ने और सिंटिलेशन काउंटर दक्षता को ध्यान में रखते हुए की गई। डेटा को हृदय के वर्गों के द्रव्यमान के लिए सामान्यीकृत किया जाता है।
ट्राइज़ोल में ऊतक समरूपीकरण के बाद, निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार क्यूजेन मिरनेसी माइक्रो किट #210874 का उपयोग करके हृदय के खंडों से आरएनए को अलग किया गया। आरएनएसेक लाइब्रेरी की तैयारी, अनुक्रमण और डेटा विश्लेषण निम्नानुसार किया गया:
आरएनए लाइब्रेरी की तैयारी के लिए शुरुआती सामग्री के रूप में प्रति नमूना 1 μg आरएनए का उपयोग किया गया था। निर्माता की सिफारिशों का पालन करते हुए इल्युमिना (एनईबी, यूएसए) के लिए एनईबीनेक्स्ट अल्ट्राटीएम आरएनए लाइब्रेरी तैयारी किट का उपयोग करके अनुक्रमण पुस्तकालय तैयार किए गए थे, और प्रत्येक नमूने के लिए विशेषता अनुक्रमों में सूचकांक कोड जोड़े गए थे। संक्षेप में, पॉली-टी ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स से जुड़े चुंबकीय मोतियों का उपयोग करके कुल आरएनए से mRNA को शुद्ध किया गया था। NEBNext फर्स्ट स्ट्रैंड सिंथेसिस रिएक्शन बफर (5X) में उच्च तापमान पर द्विसंयोजक धनायनों का उपयोग करके विखंडन किया जाता है। पहले स्ट्रैंड cDNA को यादृच्छिक हेक्सामर प्राइमर और M-MuLV रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस (RNase H-) का उपयोग करके संश्लेषित किया गया था। दूसरे स्ट्रैंड cDNA को फिर DNA पॉलीमरेज़ I और RNase H का उपयोग करके संश्लेषित किया जाता है। शेष ओवरहैंग को एक्सोन्यूक्लिअस/पॉलीमरेज़ गतिविधि द्वारा कुंद सिरों में बदल दिया जाता है। डीएनए खंड के 3' छोर के एडेनिलीकरण के बाद, इसे हाइब्रिडाइजेशन के लिए तैयार करने के लिए हेयरपिन लूप संरचना वाला एक NEBNext एडाप्टर इससे जोड़ा जाता है। 150-200 bp की पसंदीदा लंबाई के cDNA खंडों के चयन के लिए, AMPure XP सिस्टम (बेकमैन कॉल्टर, बेवर्ली, यूएसए) का उपयोग करके लाइब्रेरी के टुकड़ों को शुद्ध किया गया। फिर, 3 μl USER एंजाइम (NEB, USA) को एक एडाप्टर के साथ लिगेट करके आकार-चयनित cDNA के साथ PCR से पहले 37°C पर 15 मिनट और फिर 95°C पर 5 मिनट के लिए इस्तेमाल किया गया। फिर पीसीआर को फ्यूज़न हाई-फ़िडेलिटी डीएनए पॉलीमरेज़, यूनिवर्सल पीसीआर प्राइमर और इंडेक्स (X) प्राइमर का उपयोग करके किया गया। अंत में, पीसीआर उत्पादों को शुद्ध किया गया (AMPure XP सिस्टम) और लाइब्रेरी की गुणवत्ता का मूल्यांकन एजिलेंट बायोएनालाइज़र 2100 सिस्टम पर किया गया। फिर नोवासेक सीक्वेंसर का उपयोग करके cDNA लाइब्रेरी को अनुक्रमित किया गया। इल्युमिना से कच्ची छवि फ़ाइलों को CASAVA बेस कॉलिंग का उपयोग करके कच्ची रीड में परिवर्तित किया गया। कच्चे डेटा को FASTQ(fq) प्रारूप फ़ाइलों में संग्रहीत किया जाता है जिसमें रीड अनुक्रम और संबंधित आधार गुण होते हैं। फ़िल्टर किए गए अनुक्रमण रीड को Sscrofa11.1 संदर्भ जीनोम से मिलान करने के लिए HISAT2 का चयन करें। सामान्य तौर पर, HISAT2 किसी भी आकार के जीनोम का समर्थन करता है, जिसमें 4 बिलियन बेस से बड़े जीनोम शामिल हैं, और अधिकांश मापदंडों के लिए डिफ़ॉल्ट मान सेट किए गए हैं। RNA Seq डेटा से स्प्लिसिंग रीड को HISAT2 का उपयोग करके कुशलतापूर्वक संरेखित किया जा सकता है, जो वर्तमान में उपलब्ध सबसे तेज़ प्रणाली है, किसी भी अन्य विधि की तुलना में समान या बेहतर सटीकता के साथ।
ट्रांसक्रिप्ट की बहुतायत सीधे जीन अभिव्यक्ति के स्तर को दर्शाती है। जीन अभिव्यक्ति के स्तर का आकलन जीनोम या एक्सॉन से जुड़े ट्रांसक्रिप्ट (सीक्वेंसिंग काउंट) की बहुतायत से किया जाता है। रीड की संख्या जीन अभिव्यक्ति के स्तर, जीन की लंबाई और अनुक्रमण गहराई के समानुपाती होती है। FPKM (प्रति मिलियन बेस पेयर में अनुक्रमित ट्रांसक्रिप्ट के प्रति हज़ार बेस पेयर के टुकड़े) की गणना की गई और DESeq2 पैकेज का उपयोग करके अंतर अभिव्यक्ति के P-मान निर्धारित किए गए। फिर हमने बिल्ट-इन R-फ़ंक्शन "p.adjust" के आधार पर बेंजामिनी-होचबर्ग विधि9 का उपयोग करके प्रत्येक P मान के लिए झूठी खोज दर (FDR) की गणना की।
थर्मो (थर्मो, कैट. नं. 11756050) से सुपरस्क्रिप्ट IV विलो मास्टर मिक्स का उपयोग करके हृदय खंडों से अलग किए गए RNA को 200 ng/μl की सांद्रता पर cDNA में परिवर्तित किया गया। क्वांटिटेटिव RT-PCR को एप्लाइड बायोसिस्टम्स एंडुरा प्लेट माइक्रोएम्प 384-वेल ट्रांसपेरेंट रिएक्शन प्लेट (थर्मो, कैट. नं. 4483319) और माइक्रोएम्प ऑप्टिकल एडहेसिव (थर्मो, कैट. नं. 4311971) का उपयोग करके किया गया। रिएक्शन मिक्सचर में 5 µl टैकमैन फास्ट एडवांस्ड मास्टर मिक्स (थर्मो, कैट # 4444557), 0.5 µl टैकमैन प्राइमर और 3.5 µl H2O प्रति वेल मिलाया गया। मानक qPCR चक्र चलाए गए और एप्लाइड बायोसिस्टम्स क्वांटस्टूडियो 5 रियल-टाइम PCR इंस्ट्रूमेंट (384-वेल मॉड्यूल; उत्पाद # A28135) का उपयोग करके CT मान मापा गया। टैकमैन प्राइमर्स थर्मो (GAPDH (Ss03375629_u1), PARP12 (Ss06908795_m1), PKDCC (Ss06903874_m1), CYGB (Ss06900188_m1), RGL1 (Ss06868890_m1), ACTN1 (Ss01009508_mH), GATA4 (Ss03383805_u1), GJA1 (Ss03374839_u1), COL1A2 (Ss03375009_u1 ), COL3A1 (Ss04323794_m1), ACTA2 (Ss04245588_m1) से खरीदे गए थे। सभी नमूनों के सीटी मान हाउसकीपिंग जीन GAPDH के लिए सामान्यीकृत किए गए थे।
निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार NT-ProBNP के मीडिया रिलीज का मूल्यांकन NT-ProBNP किट (पिग) (कैट. नं. MBS2086979, MyBioSource) का उपयोग करके किया गया था। संक्षेप में, प्रत्येक नमूने और मानक के 250 µl को प्रत्येक वेल में डुप्लिकेट में जोड़ा गया था। नमूना जोड़ने के तुरंत बाद, प्रत्येक वेल में परख अभिकर्मक A के 50 µl जोड़ें। प्लेट को धीरे से हिलाएं और सीलेंट के साथ सील करें। फिर गोलियों को 1 घंटे के लिए 37°C पर इनक्यूबेट किया गया। फिर घोल को एस्पिरेट करें और 1X वॉश घोल के 350 µl से 4 बार कुओं को धोएँ, हर बार 1-2 मिनट के लिए वॉश घोल को इनक्यूबेट करें। घोल को चूसें और 1X वॉश घोल के 350 µl से 5 बार कुओं को धोएँ। प्रत्येक कुएँ में 90 µl सब्सट्रेट घोल डालें और प्लेट को सील करें। प्लेट को 37°C पर 10-20 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। प्रत्येक कुएँ में 50 µl स्टॉप सॉल्यूशन डालें। प्लेट को तुरंत 450 nm पर सेट किए गए साइटेशन (बायोटेक) प्लेट रीडर का उपयोग करके मापा गया।
समूह आकार चुनने के लिए शक्ति विश्लेषण किया गया, जो 5% प्रकार I त्रुटि दर के साथ पैरामीटर में 10% पूर्ण परिवर्तन का पता लगाने के लिए 80% से अधिक शक्ति प्रदान करेगा। समूह आकार चुनने के लिए शक्ति विश्लेषण किया गया, जो 5% प्रकार I त्रुटि दर के साथ पैरामीटर में 10% पूर्ण परिवर्तन का पता लगाने के लिए 80% से अधिक शक्ति प्रदान करेगा। Анализ мощности был выполнен для выбора размеров групп, которые अधिक जानकारी >80% अतिरिक्त आय 10% अतिरिक्त आय параметра с 5% частотой ошибок типа I. समूह आकार का चयन करने के लिए शक्ति विश्लेषण किया गया, जो 5% प्रकार I त्रुटि दर के साथ 10% निरपेक्ष पैरामीटर परिवर्तन का पता लगाने के लिए 80% से अधिक शक्ति प्रदान करेगा।进行功效分析以选择将提供> 80% से अधिक की कीमत 10% से अधिक नहीं है और 5% से अधिक नहीं है।进行功效分析以选择将提供> 80% से अधिक की कीमत 10% से अधिक नहीं है और 5% से अधिक नहीं है। Был проведен анализ мощности для выбора размера группы, который अतिरिक्त राशि > 80% अधिक आय 10% वार्षिक आय параметров и 5% частоты ошибок типа I. एक समूह आकार का चयन करने के लिए एक शक्ति विश्लेषण किया गया था जो 10% निरपेक्ष पैरामीटर परिवर्तन और 5% प्रकार I त्रुटि दर का पता लगाने के लिए 80% से अधिक शक्ति प्रदान करेगा।प्रयोग से पहले ऊतक के टुकड़ों को यादृच्छिक रूप से चुना गया था। सभी विश्लेषण स्थिति-अंधा थे और सभी डेटा का विश्लेषण करने के बाद ही नमूनों को डिकोड किया गया था। सभी सांख्यिकीय विश्लेषण करने के लिए ग्राफपैड प्रिज्म सॉफ्टवेयर (सैन डिएगो, सीए) का उपयोग किया गया था। सभी सांख्यिकी के लिए, p-मान <0.05 पर महत्वपूर्ण माने गए। सभी सांख्यिकी के लिए, p-मान <0.05 पर महत्वपूर्ण माने गए। Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. सभी सांख्यिकी के लिए, p-मान <0.05 पर महत्वपूर्ण माने गए।对于所有统计数据,p 值在值<0.05 时被认为是显着的。对于所有统计数据,p 值在值<0.05 时被认为是显着的。 Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. सभी सांख्यिकी के लिए, p-मान <0.05 पर महत्वपूर्ण माने गए।डेटा पर दो-पूंछ वाले स्टूडेंट का टी-टेस्ट केवल 2 तुलनाओं के साथ किया गया था। कई समूहों के बीच महत्व निर्धारित करने के लिए एक-तरफ़ा या दो-तरफ़ा ANOVA का उपयोग किया गया था। पोस्ट हॉक परीक्षण करते समय, कई तुलनाओं को ध्यान में रखते हुए ट्यूकी के सुधार को लागू किया गया था। RNAsec डेटा में FDR और p.adjust की गणना करते समय विशेष सांख्यिकीय विचार होते हैं जैसा कि विधियों अनुभाग में वर्णित है।
अध्ययन डिज़ाइन के बारे में अधिक जानकारी के लिए इस लेख से जुड़े नेचर रिसर्च रिपोर्ट सार को देखें।