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दवा परीक्षण के लिए हृदय के शारीरिक वातावरण को सटीक रूप से पुन: उत्पन्न करने में सक्षम एक विश्वसनीय इन विट्रो प्रणाली की आवश्यकता है। मानव हृदय ऊतक संवर्धन प्रणालियों की सीमित उपलब्धता के कारण हृदय पर दवाओं के प्रभावों की व्याख्या गलत हुई है। यहाँ, हमने एक हृदय ऊतक संवर्धन मॉडल (सीटीसीएम) विकसित किया है जो हृदय के टुकड़ों को विद्युत यांत्रिक रूप से उत्तेजित करता है और हृदय चक्र के सिस्टोलिक और डायस्टोलिक चरणों के दौरान शारीरिक खिंचाव से गुजरता है। 12 दिनों के संवर्धन के बाद, इस विधि से हृदय के टुकड़ों की व्यवहार्यता में आंशिक सुधार हुआ, लेकिन उनकी संरचनात्मक अखंडता पूरी तरह से संरक्षित नहीं हुई। इसलिए, छोटे अणुओं की स्क्रीनिंग के बाद, हमने पाया कि हमारे माध्यम में 100 nM ट्राइआयोडोथायरोनिन (T3) और 1 μM डेक्सामेथासोन (Dex) मिलाने से टुकड़ों की सूक्ष्म संरचना 12 दिनों तक बनी रही। T3/Dex उपचार के साथ, सीटीसीएम प्रणाली ने 12 दिनों तक ताजे हृदय ऊतक के समान स्तर पर प्रतिलेखन प्रोफाइल, व्यवहार्यता, चयापचय गतिविधि और संरचनात्मक अखंडता को बनाए रखा। इसके अतिरिक्त, कल्चर में हृदय ऊतक के अत्यधिक खिंचाव से हाइपरट्रॉफिक कार्डियक सिग्नलिंग उत्पन्न होती है, जो हृदय खिंचाव से प्रेरित हाइपरट्रॉफिक स्थितियों की नकल करने की सीटीसीएम की क्षमता का प्रमाण प्रदान करती है। निष्कर्षतः, सीटीसीएम लंबे समय तक कल्चर में हृदय की शरीरक्रिया और विकृति का मॉडल प्रस्तुत कर सकती है, जिससे विश्वसनीय दवा स्क्रीनिंग संभव हो पाती है।
नैदानिक ​​अनुसंधान से पहले, विश्वसनीय इन विट्रो प्रणालियों की आवश्यकता होती है जो मानव हृदय के शारीरिक वातावरण को सटीक रूप से पुन: उत्पन्न कर सकें। ऐसी प्रणालियों को परिवर्तित यांत्रिक खिंचाव, हृदय गति और विद्युतशारीरिक गुणों का अनुकरण करना चाहिए। पशु मॉडल आमतौर पर हृदय शरीर विज्ञान के लिए एक स्क्रीनिंग प्लेटफॉर्म के रूप में उपयोग किए जाते हैं, लेकिन मानव हृदय में दवाओं के प्रभावों को प्रतिबिंबित करने में इनकी विश्वसनीयता सीमित होती है1,2। अंततः, आदर्श कार्डियक टिश्यू कल्चर एक्सपेरिमेंटल मॉडल (सीटीसीएम) एक ऐसा मॉडल है जो विभिन्न चिकित्सीय और औषधीय हस्तक्षेपों के लिए अत्यधिक संवेदनशील और विशिष्ट होता है, और मानव हृदय के शरीर विज्ञान और विकृति विज्ञान को सटीक रूप से पुन: उत्पन्न करता है3। ऐसी प्रणाली की अनुपस्थिति हृदय विफलता के नए उपचारों की खोज को सीमित करती है4,5 और दवा कार्डियोटॉक्सिसिटी को बाजार से बाहर निकलने का एक प्रमुख कारण बनाती है6।
पिछले एक दशक में, आठ गैर-हृदय संबंधी दवाओं को नैदानिक ​​उपयोग से हटा दिया गया है क्योंकि वे क्यूटी अंतराल को बढ़ा देती हैं, जिससे वेंट्रिकुलर अतालता और अचानक मृत्यु हो सकती है।7 इसलिए, हृदय संबंधी प्रभावकारिता और विषाक्तता का आकलन करने के लिए विश्वसनीय पूर्व-नैदानिक ​​स्क्रीनिंग रणनीतियों की आवश्यकता बढ़ रही है। दवा स्क्रीनिंग और विषाक्तता परीक्षण में मानव-प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स (hiPS-CM) का हालिया उपयोग इस समस्या का आंशिक समाधान प्रदान करता है। हालांकि, hiPS-CM की अपरिपक्व प्रकृति और हृदय ऊतक की बहुकोशिकीय जटिलता की कमी इस विधि की प्रमुख सीमाएँ हैं। हाल के अध्ययनों से पता चला है कि सहज संकुचन की शुरुआत के तुरंत बाद हृदय ऊतक हाइड्रोजेल बनाने के लिए प्रारंभिक hiPS-CM का उपयोग करके और समय के साथ धीरे-धीरे विद्युत उत्तेजना बढ़ाकर इस सीमा को आंशिक रूप से दूर किया जा सकता है। हालांकि, इन hiPS-CM सूक्ष्म ऊतकों में वयस्क मायोकार्डियम के परिपक्व विद्युतशारीरिक और संकुचनशील गुण नहीं होते हैं। इसके अतिरिक्त, मानव हृदय ऊतक की संरचना अधिक जटिल होती है, जिसमें एंडोथेलियल कोशिकाओं, न्यूरॉन्स और स्ट्रोमल फाइब्रोब्लास्ट सहित विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं का एक विषम मिश्रण होता है, जो विशिष्ट बाह्यकोशिकीय मैट्रिक्स प्रोटीन के समूहों द्वारा आपस में जुड़े होते हैं। वयस्क स्तनधारी हृदय में गैर-कार्डियोमायोसाइट आबादी की यह विषमता11,12,13 व्यक्तिगत कोशिका प्रकारों का उपयोग करके हृदय ऊतक का मॉडल बनाने में एक प्रमुख बाधा है। ये प्रमुख सीमाएँ शारीरिक और रोग संबंधी स्थितियों के तहत अक्षुण्ण मायोकार्डियल ऊतक को संवर्धित करने की विधियों को विकसित करने के महत्व पर बल देती हैं।
मानव हृदय के संवर्धित पतले (300 µm) खंडों को अक्षुण्ण मानव मायोकार्डियम के एक आशाजनक मॉडल के रूप में सिद्ध किया गया है। यह विधि मानव हृदय ऊतक के समान एक पूर्ण 3D बहुकोशिकीय प्रणाली तक पहुँच प्रदान करती है। हालाँकि, 2019 तक, संवर्धित हृदय खंडों का उपयोग उनकी कम (24 घंटे) संवर्धन अवधि के कारण सीमित था। इसका कारण कई कारक थे, जिनमें भौतिक-यांत्रिक खिंचाव की कमी, वायु-तरल इंटरफ़ेस और सरल माध्यमों का उपयोग शामिल था जो हृदय ऊतक की आवश्यकताओं को पूरा नहीं करते थे। 2019 में, कई शोध समूहों ने प्रदर्शित किया कि हृदय ऊतक संवर्धन प्रणालियों में यांत्रिक कारकों को शामिल करने से संवर्धन अवधि बढ़ाई जा सकती है, हृदय अभिव्यक्ति में सुधार किया जा सकता है और हृदय विकृति की नकल की जा सकती है। दो उत्कृष्ट अध्ययन 17 और 18 दर्शाते हैं कि एकअक्षीय यांत्रिक भारण का संवर्धन के दौरान हृदय फेनोटाइप पर सकारात्मक प्रभाव पड़ता है। हालांकि, इन अध्ययनों में हृदय चक्र के गतिशील त्रि-आयामी भौतिक-यांत्रिक भार का उपयोग नहीं किया गया, क्योंकि हृदय के खंडों पर या तो आइसोमेट्रिक तन्य बल 17 या रैखिक ऑक्सोटोनिक भार 18 लगाया गया था। ऊतक खिंचाव की इन विधियों के परिणामस्वरूप कई हृदय जीनों का दमन हुआ या असामान्य खिंचाव प्रतिक्रियाओं से जुड़े जीनों की अति-अभिव्यक्ति हुई। विशेष रूप से, पिटौलिस एट अल. 19 ने बल ट्रांसड्यूसर फीडबैक और तनाव ड्राइव का उपयोग करके हृदय चक्र पुनर्निर्माण के लिए एक गतिशील हृदय स्लाइस कल्चर बाथ विकसित किया। हालांकि यह प्रणाली अधिक सटीक इन विट्रो हृदय चक्र मॉडलिंग की अनुमति देती है, विधि की जटिलता और कम थ्रूपुट इस प्रणाली के अनुप्रयोग को सीमित करती है। हमारी प्रयोगशाला ने हाल ही में विद्युत उत्तेजना और एक अनुकूलित माध्यम का उपयोग करके एक सरलीकृत कल्चर प्रणाली विकसित की है ताकि सूअर और मानव हृदय ऊतक के खंडों की व्यवहार्यता को 6 दिनों तक बनाए रखा जा सके20,21।
इस लेख में, हम सूअर के हृदय के भागों का उपयोग करके एक कार्डियक टिश्यू कल्चर मॉडल (सीटीसीएम) का वर्णन करते हैं, जिसमें तीन-आयामी हृदय क्रिया विज्ञान और हृदय चक्र के दौरान होने वाले विकृतिजनन को दोहराने के लिए ह्यूमरल संकेतों को शामिल किया गया है। यह सीटीसीएम, प्री-क्लिनिकल दवा परीक्षण के लिए स्तनधारी हृदय के क्रिया विज्ञान/विकृतिजन्य क्रिया विज्ञान की नकल करने वाली एक किफायती, मध्यम-थ्रूपुट कार्डियक प्रणाली प्रदान करके, पूर्व-नैदानिक ​​दवा पूर्वानुमान की सटीकता को अभूतपूर्व स्तर तक बढ़ा सकता है।
हेमोडायनामिक यांत्रिक संकेत इन विट्रो में कार्डियोमायोसाइट फ़ंक्शन को बनाए रखने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं 22,23,24। वर्तमान पांडुलिपि में, हमने एक सीटीसीएम (चित्र 1ए) विकसित किया है जो शारीरिक आवृत्तियों (1.2 हर्ट्ज़, 72 धड़कन प्रति मिनट) पर विद्युत और यांत्रिक उत्तेजना दोनों को प्रेरित करके वयस्क हृदय वातावरण की नकल कर सकता है। डायस्टोल के दौरान ऊतक के अत्यधिक खिंचाव से बचने के लिए, ऊतक के आकार को 25% तक बढ़ाने के लिए 3डी प्रिंटिंग उपकरण का उपयोग किया गया (चित्र 1बी)। सी-पेस प्रणाली द्वारा प्रेरित विद्युत पेसिंग को कार्डियक चक्र को पूरी तरह से पुन: उत्पन्न करने के लिए डेटा अधिग्रहण प्रणाली का उपयोग करके सिस्टोल से 100 एमएस पहले शुरू करने के लिए समयबद्ध किया गया था। ऊतक संवर्धन प्रणाली ऊपरी कक्ष में हृदय स्लाइस के विस्तार का कारण बनने के लिए एक लचीली सिलिकॉन झिल्ली को चक्रीय रूप से विस्तारित करने के लिए एक प्रोग्राम करने योग्य वायवीय एक्चुएटर (एलबी इंजीनियरिंग, जर्मनी) का उपयोग करती है। यह प्रणाली एक प्रेशर ट्रांसड्यूसर के माध्यम से एक बाहरी एयर लाइन से जुड़ी हुई थी, जिससे दबाव (± 1 mmHg) और समय (± 1 ms) को सटीक रूप से समायोजित करना संभव हो गया (चित्र 1c)।
a) डिवाइस के कल्चर चैंबर के अंदर, नीले रंग में दिखाए गए 7 मिमी सपोर्ट रिंग पर ऊतक के टुकड़े को लगाएं। कल्चर चैंबर को एयर चैंबर से एक पतली, लचीली सिलिकॉन झिल्ली द्वारा अलग किया जाता है। रिसाव को रोकने के लिए प्रत्येक चैंबर के बीच एक गैस्केट लगाएं। डिवाइस के ढक्कन में ग्रेफाइट इलेक्ट्रोड होते हैं जो विद्युत उत्तेजना प्रदान करते हैं। b) बड़े ऊतक डिवाइस, गाइड रिंग और सपोर्ट रिंग का योजनाबद्ध निरूपण। ऊतक के टुकड़े (भूरे रंग के) बड़े आकार के डिवाइस पर रखे जाते हैं, जिसमें गाइड रिंग डिवाइस के बाहरी किनारे पर बने खांचे में रखी होती है। गाइड का उपयोग करके, ऊतक ऐक्रेलिक चिपकने वाले पदार्थ से लेपित सपोर्ट रिंग को हृदय ऊतक के टुकड़े के ऊपर सावधानीपूर्वक रखें। c) प्रोग्रामेबल न्यूमेटिक एक्चुएटर (PPD) द्वारा नियंत्रित एयर चैंबर के दबाव के फलन के रूप में विद्युत उत्तेजना के समय को दर्शाने वाला ग्राफ। दबाव सेंसर का उपयोग करके विद्युत उत्तेजना को सिंक्रनाइज़ करने के लिए एक डेटा अधिग्रहण डिवाइस का उपयोग किया गया था। जब कल्चर चैंबर में दबाव निर्धारित सीमा तक पहुँच जाता है, तो विद्युत उत्तेजना को ट्रिगर करने के लिए C-PACE-EM को एक पल्स सिग्नल भेजा जाता है। d) इनक्यूबेटर शेल्फ पर रखे गए चार CTCM की छवि। एक पीपीडी से चार उपकरण वायवीय परिपथ के माध्यम से जुड़े होते हैं, और वायवीय परिपथ में दबाव की निगरानी के लिए हेमोस्टैटिक वाल्व में दबाव सेंसर लगाए जाते हैं। प्रत्येक उपकरण में ऊतक के छह खंड होते हैं।
एक एकल वायवीय एक्चुएटर का उपयोग करके, हम 4 सीटीसीएम उपकरणों को नियंत्रित करने में सक्षम थे, जिनमें से प्रत्येक में ऊतक के 6 खंड रखे जा सकते थे (चित्र 1d)। सीटीसीएम में, वायु कक्ष में वायु दाब द्रव कक्ष में समकालिक दाब में परिवर्तित हो जाता है और हृदय के स्लाइस का शारीरिक विस्तार प्रेरित करता है (चित्र 2a और पूरक मूवी 1)। 80 मिमी एचजी पर ऊतक खिंचाव का मूल्यांकन करने पर ऊतक खंडों में 25% तक खिंचाव देखा गया (चित्र 2b)। यह प्रतिशत खिंचाव सामान्य हृदय खंड संकुचनशीलता के लिए 2.2-2.3 µm की शारीरिक सार्कोमेयर लंबाई के अनुरूप दिखाया गया है17,19,25। ऊतक गति का आकलन कस्टम कैमरा सेटिंग्स का उपयोग करके किया गया (पूरक चित्र 1)। ऊतक गति का आयाम और वेग (चित्र 2c, d) हृदय चक्र के दौरान खिंचाव और सिस्टोल और डायस्टोल के दौरान समय के अनुरूप था (चित्र 2b)। कल्चर में 12 दिनों तक संकुचन और शिथिलन के दौरान हृदय ऊतक का खिंचाव और वेग स्थिर रहा (चित्र 2f)। कल्चर के दौरान संकुचनशीलता पर विद्युत उत्तेजना के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए, हमने एक शेडिंग एल्गोरिदम (पूरक चित्र 2a,b) का उपयोग करके सक्रिय विकृति का निर्धारण करने की विधि विकसित की और विद्युत उत्तेजना के साथ और बिना विकृतियों के बीच अंतर करने में सक्षम रहे। हृदय का वही भाग (चित्र 2f)। कट के चल क्षेत्र (R6-9) में, विद्युत उत्तेजना के दौरान वोल्टेज विद्युत उत्तेजना की अनुपस्थिति की तुलना में 20% अधिक था, जो संकुचन क्रिया में विद्युत उत्तेजना के योगदान को दर्शाता है।
वायु कक्ष दाब, द्रव कक्ष दाब ​​और ऊतक गति माप के प्रतिनिधि निशान इस बात की पुष्टि करते हैं कि कक्ष दाब ​​द्रव कक्ष दाब ​​को बदलता है, जिससे ऊतक स्लाइस की तदनुसार गति होती है। b) प्रतिशत खिंचाव (नारंगी) के अनुरूप ऊतक खंडों के प्रतिशत खिंचाव (नीला) के प्रतिनिधि निशान। c) हृदय स्लाइस की मापी गई गति, गति की मापी गई गति के अनुरूप है। (d) हृदय के एक स्लाइस में चक्रीय गति (नीली रेखा) और वेग (नारंगी बिंदीदार रेखा) के प्रतिनिधि प्रक्षेप पथ। e) चक्र समय (n = 19 स्लाइस प्रति समूह, विभिन्न सूअरों से), संकुचन समय (n = 19 स्लाइस प्रति समूह), विश्राम समय (n = 19 स्लाइस प्रति समूह, विभिन्न सूअरों से), ऊतक गति (n = 25 स्लाइस/समूह, विभिन्न सूअरों से), शिखर सिस्टोलिक वेग (n = 24(D0), 25(D12) स्लाइस/समूह, विभिन्न सूअरों से) और शिखर विश्राम दर (n=24(D0), 25(D12) स्लाइस/समूह, विभिन्न सूअरों से) का मात्रात्मक विश्लेषण। दो-पूंछ वाले स्टूडेंट के टी-परीक्षण से किसी भी पैरामीटर में कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं पाया गया। f विद्युत उत्तेजना के साथ (लाल) और बिना (नीला) ऊतक अनुभागों के प्रतिनिधि तनाव विश्लेषण ट्रेस, एक ही अनुभाग से ऊतक अनुभागों के दस क्षेत्रीय क्षेत्र। निचले पैनल विभिन्न अनुभागों के दस क्षेत्रों में विद्युत उत्तेजना के साथ और बिना ऊतक अनुभागों में तनाव में प्रतिशत अंतर का मात्रात्मक विश्लेषण दर्शाते हैं। (n = 8 स्लाइस/समूह विभिन्न सूअरों से, दो-तरफ़ा स्टूडेंट टी-परीक्षण किया गया; ****p < 0.0001, **p < 0.01, *p < 0.05)। (n = 8 स्लाइस/समूह विभिन्न सूअरों से, दो-तरफ़ा स्टूडेंट टी-परीक्षण किया गया; ****p < 0.0001, **p < 0.01, *p < 0.05)। (n = 8 срезов/группу от разных свиней, проводится двусторонний t-критерий Стьюдента; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05). (n = 8 खंड/समूह विभिन्न सूअरों से, दो-तरफ़ा स्टूडेंट का टी-परीक्षण; ****p<0.0001, **p<0.01, *p<0.05)। (n = 8 片/组, 来自不同的猪, 进行双尾学生t 检验；****p < 0.0001，**p < 0.01，*p < 0.05）。 (n = 8 片/组, 来自不同的猪, 进行双尾学生t 检验；****p < 0.0001，**p < 0.01，*p < 0.05）。 (n = 8 срезов/группу, от разных свиней, двусторонний критерий Стьюдента; ****p <0,0001, **p <0,01, *p <0,05). (n = 8 खंड/समूह, विभिन्न सूअरों से, दो-तरफ़ा स्टूडेंट का टी-परीक्षण; ****p<0.0001, **p<0.01, *p<0.05)।त्रुटि बार माध्य ± मानक विचलन को दर्शाते हैं।
हमारे पिछले स्थिर बायोमिमेटिक हृदय स्लाइस कल्चर सिस्टम [20, 21] में, हमने विद्युत उत्तेजना लागू करके और माध्यम की संरचना को अनुकूलित करके 6 दिनों तक हृदय स्लाइस की व्यवहार्यता, कार्यक्षमता और संरचनात्मक अखंडता को बनाए रखा। हालाँकि, 10 दिनों के बाद, ये आंकड़े तेजी से गिर गए। हम अपने पिछले स्थिर बायोमिमेटिक कल्चर सिस्टम 20, 21 में संवर्धित अनुभागों को नियंत्रण स्थितियों (Ctrl) के रूप में संदर्भित करेंगे और हम अपने पूर्व अनुकूलित माध्यम को MC स्थितियों के रूप में उपयोग करेंगे और एक साथ यांत्रिक और विद्युत उत्तेजना (CTCM) के तहत संवर्धन करेंगे। सबसे पहले, हमने निर्धारित किया कि विद्युत उत्तेजना के बिना यांत्रिक उत्तेजना 6 दिनों तक ऊतक की व्यवहार्यता बनाए रखने के लिए अपर्याप्त थी (पूरक चित्र 3a,b)। दिलचस्प बात यह है कि STCM का उपयोग करके भौतिक-यांत्रिक और विद्युत उत्तेजना शुरू करने के साथ, 12-दिन के हृदय अनुभागों की व्यवहार्यता MS स्थितियों के तहत ताजे हृदय अनुभागों के समान ही रही, लेकिन Ctrl स्थितियों के तहत नहीं, जैसा कि MTT विश्लेषण (चित्र 1) द्वारा दिखाया गया है। 3a)। इससे पता चलता है कि यांत्रिक उत्तेजना और हृदय चक्र के अनुकरण से ऊतक के नमूनों को हमारे पिछले स्थिर संवर्धन प्रणाली की तुलना में दोगुने समय तक व्यवहार्य रखा जा सकता है। हालांकि, कार्डियक ट्रोपोनिन टी और कनेक्सिन 43 के इम्यूनोलैबलिंग द्वारा ऊतक के नमूनों की संरचनात्मक अखंडता के आकलन से पता चला कि एमसी ऊतकों में कनेक्सिन 43 की अभिव्यक्ति 12वें दिन नियंत्रण समूह की तुलना में काफी अधिक थी। हालांकि, एकसमान कनेक्सिन 43 अभिव्यक्ति और जेड-डिस्क निर्माण पूरी तरह से बरकरार नहीं रहे (चित्र 3बी)। हम ऊतक की संरचनात्मक अखंडता26 को मापने के लिए एक कृत्रिम बुद्धिमत्ता (एआई) फ्रेमवर्क का उपयोग करते हैं, और स्थानीयकरण की शक्ति के संदर्भ में हृदय के टुकड़ों की संरचनात्मक अखंडता और प्रतिदीप्ति को स्वचालित रूप से मापने के लिए ट्रोपोनिन-टी और कनेक्सिन स्टेनिंग43 पर आधारित एक छवि-आधारित डीप लर्निंग पाइपलाइन का उपयोग करते हैं। यह विधि संदर्भ में वर्णित अनुसार, स्वचालित और निष्पक्ष तरीके से हृदय ऊतक की संरचनात्मक अखंडता को विश्वसनीय रूप से मापने के लिए एक कनवोल्यूशनल न्यूरल नेटवर्क (सीएनएन) और एक डीप लर्निंग फ्रेमवर्क का उपयोग करती है। 26. स्थिर नियंत्रण अनुभागों की तुलना में एमसी ऊतक ने दिन 0 के समान बेहतर संरचनात्मक समानता प्रदर्शित की। इसके अतिरिक्त, मैसन के ट्राइक्रोम स्टेनिंग से पता चला कि कल्चर के 12वें दिन नियंत्रण स्थितियों की तुलना में एमएस स्थितियों के अंतर्गत फाइब्रोसिस का प्रतिशत काफी कम था (चित्र 3सी)। हालांकि सीटीसीएम ने 12वें दिन हृदय ऊतक अनुभागों की व्यवहार्यता को ताजे हृदय ऊतक के समान स्तर तक बढ़ा दिया, लेकिन इसने हृदय अनुभागों की संरचनात्मक अखंडता में कोई महत्वपूर्ण सुधार नहीं किया।
बार ग्राफ ताजे हृदय के टुकड़ों (D0) या 12 दिनों तक स्थिर संवर्धन (D12 Ctrl) या CTCM (D12 MC) में संवर्धित हृदय के टुकड़ों की MTT व्यवहार्यता के मात्रात्मक विश्लेषण को दर्शाता है (विभिन्न सूअरों से लिए गए n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) टुकड़े/समूह, एकतरफा ANOVA परीक्षण किया गया; ####p < 0.0001 की तुलना D0 से और **p < 0.01 की तुलना D12 Ctrl से की गई)। बार ग्राफ ताजे हृदय के टुकड़ों (D0) या 12 दिनों तक स्थिर संवर्धन (D12 Ctrl) या CTCM (D12 MC) में संवर्धित हृदय के टुकड़ों की MTT व्यवहार्यता के मात्रात्मक विश्लेषण को दर्शाता है (विभिन्न सूअरों से लिए गए n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) टुकड़े/समूह, एकतरफा ANOVA परीक्षण किया गया; ####p < 0.0001 की तुलना D0 से और **p < 0.01 की तुलना D12 Ctrl से की गई)।हिस्टोग्राम एमटीटी ताजे हृदय अनुभागों (डी0) या स्थिर संस्कृति (डी12 नियंत्रण) या सीटीसीएम (डी12 एमसी) में 12 दिनों के लिए हृदय अनुभागों की संस्कृति की व्यवहार्यता के मात्रात्मक विश्लेषण को दर्शाता है (n = 18 (डी0), 15 (डी12 नियंत्रण)), 12 (डी12 एमसी) अनुभाग/समूह विभिन्न सूअरों से, एक-तरफ़ा एनोवा परीक्षण किया जाता है;####p < 0,0001 по сравнению с D0 и **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p < 0.0001 की तुलना में D0 और **p < 0.01 की तुलना में D12 Ctrl)। एक नियंत्रण कक्ष कुंजी (D12 Ctrl) और CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) कुंजीपटल कुंजी (D0) 12 से अधिक एमटीटी से अधिक तस्वीरें), 12 (डी12 एमसी) से 12 तस्वीरें/12, एमटीटी से 12 साल पहले एनोवा测试；与D0 相比,####p < 0.0001，D12 Ctrl नियंत्रण，**p < 0.01)。 एक नियंत्रण कक्ष कुंजी (D12 Ctrl) और CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) कुंजीपटल कुंजी (D0) ，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；与D0 相比，####p < 0.0001，与D12 Ctrl ठीक है,**पी。)ताजा हृदय के नमूनों (D0) या स्थिर संवर्धन (D12 नियंत्रण) या सीटीसीएम (D12 एमसी) में 12 दिनों तक संवर्धित हृदय के नमूनों में एमटीटी व्यवहार्यता के मात्रात्मक विश्लेषण को दर्शाने वाला हिस्टोग्राम (n = 18 (D0), 15 (D12 नियंत्रण)), 12 (D12 एमसी) नमूने/समूह विभिन्न सूअरों से लिए गए, एकतरफा एनोवा परीक्षण;####p < 0,0001 по сравнению с D0, **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p < 0.0001 की तुलना में D0, **p < 0.01 की तुलना में D12 Ctrl)।प्रतिनिधि इम्यूनोफ्लोरेसेंस छवियों (ब्लैंक स्केल = 100 µm) में ताजे पृथक हृदय अनुभागों (D0) या स्थिर स्थितियों (Ctrl) या CTCM स्थितियों (MC) के तहत 12 दिनों तक संवर्धित हृदय अनुभागों में ट्रोपोनिन-टी (हरा), कनेक्सिन 43 (लाल) और DAPI (नीला) (D0)। हृदय ऊतक की संरचनात्मक अखंडता का कृत्रिम बुद्धिमत्ता द्वारा मात्रात्मक विश्लेषण (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) स्लाइस/समूह, प्रत्येक अलग-अलग सुअर से, एक-तरफ़ा ANOVA परीक्षण किया गया; ####p < 0.0001 की तुलना D0 से और ****p < 0.0001 की तुलना D12 Ctrl से की गई)। हृदय ऊतक की संरचनात्मक अखंडता का कृत्रिम बुद्धिमत्ता द्वारा मात्रात्मक विश्लेषण (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) स्लाइस/समूह, प्रत्येक अलग-अलग सूअरों से, एक-तरफ़ा ANOVA परीक्षण किया गया; ####p < 0.0001 की तुलना D0 से और ****p < 0.0001 की तुलना D12 Ctrl से की गई)। Количественная оценка структурной целостности сердечной ткани искусственным интеллектом (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) срезов/групп от разных свиней, проводится однофакторный тест एनोवा; ####p < 0,0001 по сравнению с D0 и ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). कृत्रिम बुद्धिमत्ता द्वारा हृदय ऊतक की संरचनात्मक अखंडता का मात्रात्मक निर्धारण (विभिन्न सूअरों से लिए गए n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) अनुभाग/समूह, एक-तरफ़ा ANOVA परीक्षण किया गया; ####p < 0.0001 बनाम D0 और ****p < 0.0001 की तुलना D12 Ctrl से की गई)।人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) स्लाइस/प्रत्येक अलग-अलग सुअर का समूह, एक-तरफ़ा ANOVA परीक्षण;####p < 0.0001 与D0 ठीक है,****p < 0.0001, D12 Ctrl, कुंजी।人工智能量化心脏组织结构完整性n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) स्लाइस/अलग-अलग सूअरों का समूह, एक-तरफ़ा एनोवा परीक्षण;####p < 0.0001 D0 कुंजी,****p < 0.0001, D12 Ctrl कुंजी）。 Искусственный интеллект для количественной оценки структурной целостности сердечной ткани (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) срезов/группу каждой из разных свиней, односторонний тест एनोवा; ####p <0,0001 बनाम D0 Для сравнения ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). कृत्रिम बुद्धिमत्ता का उपयोग हृदय ऊतक की संरचनात्मक अखंडता को मापने के लिए किया गया (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) अनुभाग/समूह, प्रत्येक अलग-अलग सूअरों के, एक-तरफ़ा ANOVA परीक्षण; ####p<0.0001 बनाम D0 तुलना के लिए ****p < 0.0001 की तुलना D12 Ctrl से की गई)। सी. मैसन के ट्राइक्रोम स्टेन से रंगे हृदय के स्लाइस के लिए प्रतिनिधि चित्र (बाएं) और मात्रा निर्धारण (दाएं) (स्केल बार = 500 µm) (n = 10 स्लाइस/समूह, प्रत्येक अलग-अलग सुअर से, एक-तरफ़ा एनोवा परीक्षण किया गया; ####p < 0.0001 की तुलना D0 से और ***p < 0.001 की तुलना D12 कंट्रोल से)। सी. मैसन के ट्राइक्रोम स्टेन से रंगे हृदय के टुकड़ों के लिए प्रतिनिधि चित्र (बाएं) और मात्रा निर्धारण (दाएं) (स्केल बार = 500 µm) (n = 10 टुकड़े/समूह, प्रत्येक अलग-अलग सूअरों से, एक-तरफ़ा एनोवा परीक्षण किया गया; #### p < 0.0001 की तुलना D0 से और ***p < 0.001 की तुलना D12 कंट्रोल से)। c Репрезентативные изображения (слева) и количественная оценка (справа) срезов сердца, окрашенных трихромным красителем Массона (масштаб без покрытия = 500 мкм) (n = 10 срезов/группу от разных свиней, अतिरिक्त विवरण एनोवा; сравнению с D12 Ctrl). सी. मैसन के ट्राइक्रोम स्टेन से रंगे हृदय के अनुभागों की प्रतिनिधि छवियां (बाएं) और मात्रा निर्धारण (दाएं) (अनकोटेड स्केल = 500 µm) (विभिन्न सूअरों से 10 अनुभाग/समूह, एक-तरफ़ा एनोवा परीक्षण किया गया; #### p < 0.0001 की तुलना D0 से और ***p < 0.001 की तुलना D12 कंट्रोल से)। सी मेसन को 500 µm (500 µm) की आवश्यकता होती है 10 个切片/组,每组来自不同的猪,进行单向ANOVA 测试；#### p < 0.0001 与D0 相比，***p < 0.001 D12 Ctrl ठीक है） C 用 mason 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 （左 左） 量化 （右） 裸尺度 裸尺度 裸尺度माप = 500 µm） (n = 10 个 切片 组 每 组 来自 不同 猪 ， 进行 单向 单向 Anova 测试；#### p < 0.0001 与D0 ठीक है,***p < 0.001, D12 Ctrl, कुंजी। c Репрезентативные изображения (слева) и количественный анализ (справа) срезов сердца, окрашенных трихромным красителем Массона (чистая шкала = 500 мкм) (n = 10 срезов/группа, каждый от другой свиньи, протестировано с помощью однофакторного дисперсионного анализа ;### #p < 0,0001 पी.ओ сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). सी. मैसन के ट्राइक्रोम स्टेन (ब्लैंक = 500 µm) से रंगे हृदय के अनुभागों की प्रतिनिधि छवियां (बाएं) और मात्रा निर्धारण (दाएं) (n = 10 अनुभाग/समूह, प्रत्येक एक अलग सुअर से, एक-तरफ़ा विश्लेषण द्वारा परीक्षण किया गया; ### # p < 0.0001 की तुलना में D0, ***p < 0.001 की तुलना में D12 कंट्रोल)।त्रुटि बार माध्य ± मानक विचलन को दर्शाते हैं।
हमने परिकल्पना की कि कल्चर माध्यम में छोटे अणुओं को मिलाने से, सीटीसीएम कल्चर के दौरान कार्डियोमायोसाइट अखंडता में सुधार हो सकता है और फाइब्रोसिस का विकास कम हो सकता है। इसलिए, कम संख्या में भ्रमित करने वाले कारकों के कारण, हमने अपने स्थिर नियंत्रण कल्चर20,21 का उपयोग करके छोटे अणुओं की जांच की। इस जांच के लिए डेक्सामेथासोन (डेक्स), ट्राईआयोडोथायरोनिन (टी3) और एसबी431542 (एसबी) को चुना गया। इन छोटे अणुओं का उपयोग पहले hiPSC-CM कल्चर में सार्कोमेयर की लंबाई, टी-ट्यूबल और चालन वेग को बढ़ाकर कार्डियोमायोसाइटों के परिपक्वन को प्रेरित करने के लिए किया गया है। इसके अलावा, डेक्स (एक ग्लूकोकोर्टिकॉइड) और एसबी दोनों सूजन को दबाने के लिए जाने जाते हैं29,30। इसलिए, हमने परीक्षण किया कि क्या इनमें से एक या एक से अधिक छोटे अणुओं को शामिल करने से हृदय के भागों की संरचनात्मक अखंडता में सुधार होगा। प्रारंभिक जांच के लिए, प्रत्येक यौगिक की खुराक का चयन सेल कल्चर मॉडल में आमतौर पर उपयोग की जाने वाली सांद्रता (1 μM Dex27, 100 nM T327, और 2.5 μM SB31) के आधार पर किया गया था। 12 दिनों के कल्चर के बाद, T3 और Dex के संयोजन से कार्डियोमायोसाइट की संरचनात्मक अखंडता इष्टतम रही और रेशेदार पुनर्निर्माण न्यूनतम हुआ (पूरक चित्र 4 और 5)। इसके अतिरिक्त, T3 और Dex की इन सांद्रताओं से दोगुनी या दोगुनी सांद्रताओं के उपयोग से सामान्य सांद्रताओं की तुलना में हानिकारक प्रभाव उत्पन्न हुए (पूरक चित्र 6a,b)।
प्रारंभिक स्क्रीनिंग के बाद, हमने 4 संवर्धन स्थितियों की आमने-सामने तुलना की (चित्र 4a): Ctrl: हृदय के खंडों को हमारे पहले वर्णित स्थिर संवर्धन में हमारे अनुकूलित माध्यम का उपयोग करके संवर्धित किया गया; 20.21 TD: T3 और Ctrl में बुधवार को Dex मिलाया गया; MC: हृदय के खंडों को हमारे पहले अनुकूलित माध्यम का उपयोग करके CTCM में संवर्धित किया गया; और MT: CTCM में T3 और Dex मिलाया गया। 12 दिनों के संवर्धन के बाद, MTT परख द्वारा मूल्यांकन किए गए MS और MT ऊतकों की व्यवहार्यता ताजे ऊतकों के समान ही रही (चित्र 4b)। दिलचस्प बात यह है कि ट्रांसवेल संवर्धनों (TD) में T3 और Dex मिलाने से Ctrl स्थितियों की तुलना में व्यवहार्यता में कोई महत्वपूर्ण सुधार नहीं हुआ, जो हृदय के खंडों की व्यवहार्यता बनाए रखने में यांत्रिक उत्तेजना की महत्वपूर्ण भूमिका को दर्शाता है।
a प्रायोगिक डिजाइन आरेख जो 12 दिनों तक माध्यम पर यांत्रिक उत्तेजना और T3/Dex अनुपूरण के प्रभावों का मूल्यांकन करने के लिए उपयोग की जाने वाली चार संवर्धन स्थितियों को दर्शाता है। b बार ग्राफ सभी 4 संवर्धन स्थितियों (Ctrl, TD, MC, और MT) में ताजे हृदय स्लाइस (D0) की तुलना में संवर्धन के 12 दिन बाद व्यवहार्यता का मात्रात्मक विश्लेषण दर्शाता है (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD और D12 MT), 12 (D12 MC) स्लाइस/समूह विभिन्न सूअरों से लिए गए, एक-तरफ़ा ANOVA परीक्षण किया गया; ####p < 0.0001, ###p < 0.001 की तुलना D0 से और **p < 0.01 की तुलना D12 Ctrl से की गई)। b बार ग्राफ सभी 4 संवर्धन स्थितियों (Ctrl, TD, MC, और MT) में 12 दिन बाद संवर्धन के बाद व्यवहार्यता के मात्रात्मक माप को ताजे हृदय स्लाइस (D0) की तुलना में दर्शाता है (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD और D12 MT), 12 (D12 MC) स्लाइस/समूह विभिन्न सूअरों से, एक-तरफ़ा ANOVA परीक्षण किया गया; ####p < 0.0001, ###p < 0.001 D0 की तुलना में और **p < 0.01 D12 ctrl की तुलना में)। b Гистограмма показывает количественную оценку жизнеспособности 12 दिनों की अवधि के लिए 4 दिनों तक की खरीदारी культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD и D12 MT), 12 (D12 MC) срезов/группу от разных свиней, проводится односторонний тест एनोवा; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 по сравнению с D0 и **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). b) बार ग्राफ सभी 4 संवर्धन स्थितियों (नियंत्रण, टीडी, एमसी और एमटी) में ताजे हृदय खंडों (डी0) की तुलना में संवर्धन के 12 दिन बाद व्यवहार्यता के मात्रात्मक माप को दर्शाता है (n = 18 (डी0), 15 (डी12 कंट्रोल, डी12 टीडी और डी12 एमटी), 12 (डी12 एमसी) खंड/समूह विभिन्न सूअरों से, एकतरफा एनोवा परीक्षण; ####p < 0.0001, ###p < 0.001 बनाम डी0 और **p < 0.01 डी12 कंट्रोल की तुलना में)। b 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) (n = 18 (D0)、15 (D12 Ctrl、D12 TD) D12 MT)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组,进行单向ANOVA 测试；####p < 0.0001,###p < 0.001 与D0 ठीक है,**p < 0.01 प्रति D12 त्रुटि）।बी 4 12 (डी12 एमसी) b Гистограмма, показывающая все 4 условия культивирования (контроль, TD, MC और MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD и D12 MT), от разных свиней 12 (D12 MC) срезы/группа, односторонний тест ANOVA; ####p <0,0001, ###p <0,001 по сравнению с D0, **p <0,01 по сравнению с контролем D12). बी हिस्टोग्राम सभी 4 संवर्धन स्थितियों (नियंत्रण, टीडी, एमसी और एमटी) की तुलना ताजे हृदय अनुभागों (डी0) से दर्शाता है (एन = 18 (डी0), 15 (डी12 कंट्रोल, डी12 टीडी और डी12 एमटी), विभिन्न सूअरों से 12 (डी12 एमसी) अनुभाग/समूह, एक-तरफ़ा एनोवा परीक्षण; ####p<0.0001, ###p<0.001 बनाम डी0, **p<0.01 बनाम नियंत्रण डी12)। बार ग्राफ सभी 4 संवर्धन स्थितियों (Ctrl, TD, MC, और MT) में संवर्धन के 12 दिन बाद ग्लूकोज प्रवाह के मात्रात्मक विश्लेषण को ताजे हृदय स्लाइस (D0) की तुलना में दर्शाता है (विभिन्न सूअरों से 6 स्लाइस/समूह, एक-तरफ़ा ANOVA परीक्षण किया गया; ###p < 0.001, D0 की तुलना में और ***p < 0.001 D12 Ctrl की तुलना में)। बार ग्राफ सभी 4 संवर्धन स्थितियों (Ctrl, TD, MC, और MT) में संवर्धन के 12 दिन बाद ग्लूकोज प्रवाह के मात्रात्मक विश्लेषण को ताजे हृदय स्लाइस (D0) की तुलना में दर्शाता है (विभिन्न सूअरों से 6 स्लाइस/समूह, एक-तरफ़ा ANOVA परीक्षण किया गया; ###p < 0.001, D0 की तुलना में और ***p < 0.001 D12 Ctrl की तुलना में)। c Гистограмма показывает количественную оценку потока глюкозы через 12 4 वर्ष से कम समय में एक वर्ष से अधिक समय तक ऋण प्राप्त करना (कोनटाइल, टीडी, एमसी और एमटी) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 6) срезов/группу от разных свиней, односторонний Выполняется тест ANOVA ###p <; 0,001 по сравнению с D0 и ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). सी हिस्टोग्राम सभी 4 संवर्धन स्थितियों (नियंत्रण, टीडी, एमसी और एमटी) के तहत संवर्धन के 12 दिन बाद ग्लूकोज प्रवाह के मात्रात्मक विश्लेषण को दर्शाता है, जिसकी तुलना ताजे हृदय अनुभागों (डी0) से की गई है (विभिन्न सूअरों से 6 अनुभाग/समूह, एक-तरफ़ा एनोवा परीक्षण किया गया; ###पी < 0.001 डी0 की तुलना में और ***पी < 0.001 डी12 कंट्रोल की तुलना में)। c 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) 相比，培养后12天的葡萄糖通量定量（n = 6 片/组,来自不同猪,单向执行ANOVA 测试；###p < 0.001，与D0 त्रुटि,***p < 0.001, D12 Ctrl ठीक है） C को डाउनलोड करने के लिए 4 चरणों का पालन करें (Ctrl 、 td 、 mc 和 mt)।培养 后 后 12 天 的 通量 定量 （n = 6 片/组 , 来自 猪 , ， ， ， ， ， ， ， 猪猪单向行行ANOVA त्रुटि;###p < 0.001,与D0 त्रुटि,***p < 0.001, या D12 Ctrl कुंजी）。 c Гистограмма, показывающая количественную оценку потока глюкозы 12 दिनों की अवधि के लिए 4 दिनों तक की खरीदारी культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами सेरेडी (D0) (n = 6 срезов/группа, от разных свиней, односторонний Были проведены тесты एनोवा; ###p < 0,001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению с D12 (контроль). सी हिस्टोग्राम सभी 4 संवर्धन स्थितियों (नियंत्रण, टीडी, एमसी और एमटी) के लिए संवर्धन के 12 दिन बाद ग्लूकोज प्रवाह के मात्रात्मक विश्लेषण को दर्शाता है, जिसकी तुलना ताजे हृदय अनुभागों (डी0) से की गई है (एन = 6 अनुभाग/समूह, विभिन्न सूअरों से, एकतरफा)। जहां एनोवा परीक्षण किए गए, ###पी < 0.001 डी0 की तुलना में, ***पी < 0.001 डी12 (नियंत्रण) की तुलना में।d. दस क्षेत्रीय ऊतक अनुभाग बिंदुओं पर ताजे (नीले), 12 दिन के एमसी (हरे) और 12 दिन के एमटी (लाल) ऊतकों के स्ट्रेन विश्लेषण प्लॉट (n = 4 स्लाइस/समूह, एक-तरफ़ा एनोवा परीक्षण; समूहों के बीच कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं था)। e. वोल्केनो प्लॉट ताजे हृदय अनुभागों (D0) में भिन्न रूप से व्यक्त जीन को दर्शाता है, जिनकी तुलना स्थिर परिस्थितियों (Ctrl) या एमटी परिस्थितियों (MT) में 10-12 दिनों तक संवर्धित हृदय अनुभागों से की गई है। f. प्रत्येक संवर्धन स्थिति के तहत संवर्धित हृदय अनुभागों के लिए सार्कोमेयर जीन का हीटमैप। त्रुटि बार माध्य ± मानक विचलन को दर्शाते हैं।
वसा अम्ल ऑक्सीकरण से ग्लाइकोलिसिस में परिवर्तन पर चयापचय निर्भरता कार्डियोमायोसाइट अविवेकीकरण की एक प्रमुख विशेषता है। अपरिपक्व कार्डियोमायोसाइट्स मुख्य रूप से एटीपी उत्पादन के लिए ग्लूकोज का उपयोग करते हैं और इनमें कम क्रिस्टी वाले हाइपोप्लास्टिक माइटोकॉन्ड्रिया होते हैं5,32। ग्लूकोज उपयोग विश्लेषण से पता चला कि एमसी और एमटी स्थितियों के तहत, ग्लूकोज उपयोग दिन 0 के ऊतकों के समान था (चित्र 4सी)। हालांकि, कंट्रोल नमूनों में ताजे ऊतक की तुलना में ग्लूकोज उपयोग में उल्लेखनीय वृद्धि देखी गई। यह दर्शाता है कि सीटीसीएम और टी3/डेक्स का संयोजन ऊतक की व्यवहार्यता को बढ़ाता है और 12 दिनों तक संवर्धित हृदय खंडों के चयापचय संबंधी फेनोटाइप को संरक्षित करता है। इसके अलावा, स्ट्रेन विश्लेषण से पता चला कि एमटी और एमएस स्थितियों के तहत 12 दिनों तक ताजे हृदय ऊतक के समान ही स्ट्रेन स्तर बना रहा (चित्र 4डी)।
हृदय के स्लाइस ऊतक के वैश्विक प्रतिलेखन परिदृश्य पर सीटीसीएम और टी3/डेक्स के समग्र प्रभाव का विश्लेषण करने के लिए, हमने चारों अलग-अलग संवर्धन स्थितियों से प्राप्त हृदय स्लाइस पर आरएनएसेक किया (पूरक डेटा 1)। दिलचस्प बात यह है कि एमटी अनुभागों ने ताजे हृदय ऊतक के साथ उच्च प्रतिलेखन समानता दिखाई, जिसमें 13,642 जीनों में से केवल 16 जीन ही भिन्न रूप से अभिव्यक्त थे। हालांकि, जैसा कि हमने पहले दिखाया था, 10-12 दिनों के संवर्धन के बाद कंट्रोल स्लाइस में 1229 जीन भिन्न रूप से अभिव्यक्त हुए (चित्र 4ई)। इन आंकड़ों की पुष्टि हृदय और फाइब्रोब्लास्ट जीनों के क्यूआरटी-पीसीआर द्वारा की गई (पूरक चित्र 7ए-सी)। दिलचस्प बात यह है कि कंट्रोल अनुभागों में हृदय और कोशिका चक्र जीनों का अवक्रमण और सूजन संबंधी जीन कार्यक्रमों का सक्रियण देखा गया। ये आंकड़े बताते हैं कि अविभेदन, जो सामान्यतः दीर्घकालिक संवर्धन के बाद होता है, एमटी स्थितियों के अंतर्गत पूरी तरह से कम हो जाता है (पूरक चित्र 8ए,बी)। सार्कोमेयर जीनों के सावधानीपूर्वक अध्ययन से पता चला कि केवल एमटी परिस्थितियों में ही सार्कोमेयर (चित्र 4f) और आयन चैनल (पूरक चित्र 9) को एन्कोड करने वाले जीन संरक्षित रहते हैं, जिससे वे कंट्रोल, टीडी और एमसी परिस्थितियों में दमन से सुरक्षित रहते हैं। ये आंकड़े दर्शाते हैं कि यांत्रिक और ह्यूमरल उत्तेजना (T3/Dex) के संयोजन से, हृदय स्लाइस का ट्रांसक्रिप्टोम 12 दिनों तक कल्चर में रखे जाने के बाद भी ताजे हृदय स्लाइस के समान बना रह सकता है।
इन प्रतिलेखन संबंधी निष्कर्षों की पुष्टि इस तथ्य से होती है कि हृदय के नमूनों में कार्डियोमायोसाइट्स की संरचनात्मक अखंडता 12 दिनों तक एमटी स्थितियों में सर्वोत्तम रूप से संरक्षित रहती है, जैसा कि अक्षुण्ण और स्थानीयकृत कनेक्सिन 43 (चित्र 5ए) द्वारा दर्शाया गया है। इसके अतिरिक्त, एमटी स्थितियों में हृदय के नमूनों में फाइब्रोसिस कंट्रोल की तुलना में काफी कम हो गया था और ताजे हृदय के नमूनों के समान था (चित्र 5बी)। ये आंकड़े दर्शाते हैं कि यांत्रिक उत्तेजना और टी3/डेक्स उपचार का संयोजन कल्चर में हृदय के नमूनों में हृदय संरचना को प्रभावी ढंग से संरक्षित करता है।
ताजे पृथक किए गए हृदय खंडों (D0) या चारों हृदय खंड संवर्धन स्थितियों में 12 दिनों तक संवर्धित किए गए हृदय खंडों में ट्रोपोनिन-टी (हरा), कनेक्सिन 43 (लाल) और डीएपीआई (नीला) की प्रतिनिधि प्रतिरक्षाप्रवाह छवियां (स्केल बार = 100 µm)। हृदय ऊतक की संरचनात्मक अखंडता का कृत्रिम बुद्धिमत्ता द्वारा मात्रात्मक विश्लेषण (विभिन्न सूअरों से लिए गए n = 7 (D0 और D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC और D12 MT) स्लाइस/समूह, एक-तरफ़ा ANOVA परीक्षण किया गया; ####p < 0.0001 की तुलना D0 से और *p < 0.05, या ****p < 0.0001 की तुलना D12 Ctrl से की गई)। हृदय ऊतक की संरचनात्मक अखंडता का कृत्रिम बुद्धिमत्ता द्वारा मात्रात्मक विश्लेषण (विभिन्न सूअरों से लिए गए n = 7 (D0 और D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC और D12 MT) स्लाइस/समूह, एक-तरफ़ा ANOVA परीक्षण किया गया; #### p < 0.0001 की तुलना D0 से और *p < 0.05, या ****p < 0.0001 की तुलना D12 Ctrl से की गई)। Количественная оценка структурной целостности ткани сердца с помощью искусственного интеллекта (n = 7 (D0 और D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC और D12 MT) срезов/группу от разных свиней, проведен однофакторный тест एनोवा; #### p < 0,0001 по сравнению с D0 и *p < 0,05 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). कृत्रिम बुद्धिमत्ता का उपयोग करके हृदय ऊतक की संरचनात्मक अखंडता का मात्रात्मक विश्लेषण (विभिन्न सूअरों से लिए गए n = 7 (D0 और D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC और D12 MT) अनुभाग/समूह, एक-तरफ़ा ANOVA परीक्षण किया गया; #### p < 0.0001 की तुलना D0 से और *p < 0.05 या ****p < 0.0001 की तुलना D12 Ctrl से की गई)।对不同猪的心脏组织结构完整性（n = 7（D0 和D12 Ctrl）、5（D12 TD、D12 MC 和D12 MT）切片/组）进行人工智能量化，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0.0001 与D0 和*p < 0.05 相比，或****p < 0.0001 से D12 Ctrl कुंजी）。एक बार फिर से क्लिक करें (n = 7 (d0 और d12 ctrl) (5) (d12 td 、 d12 mc और d12 mt)人工 智能量 化 进行 单向 单向 单向 测试 ； ######### p < 0.0001 与D0 和*p < 0.05 相比，或****p < 0.0001 与D12 Ctrl कुंजी）。विभिन्न सूअरों में कृत्रिम बुद्धिमत्ता का उपयोग करके हृदय ऊतक की संरचनात्मक अखंडता का मात्रात्मक विश्लेषण (n = 7 (D0 और D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC और D12 MT) अनुभाग/समूह) एक-तरफ़ा ANOVA परीक्षण के साथ किया गया;#### p < 0,0001 по сравнению с D0 и *p < 0,05 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). #### p < 0.0001 की तुलना D0 से और *p < 0.05 या ****p < 0.0001 की तुलना D12 Ctrl से)। b) मैसन के ट्राइक्रोम स्टेन से रंगे हृदय के टुकड़ों की प्रतिनिधि छवियां और मात्रा निर्धारण (स्केल बार = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD, और D12 MC), 9 (D12 MT) टुकड़े/समूह विभिन्न सूअरों से, एक-तरफ़ा ANOVA परीक्षण किया गया; ####p < 0.0001 की तुलना में D0 और ***p < 0.001, या ****p < 0.0001 की तुलना में D12 Ctrl)। b) मैसन के ट्राइक्रोम स्टेन से रंगे हृदय के टुकड़ों की प्रतिनिधि छवियां और मात्रा निर्धारण (स्केल बार = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD, और D12 MC), 9 (D12 MT) टुकड़े/समूह विभिन्न सूअरों से, एक-तरफ़ा ANOVA परीक्षण किया गया; ####p < 0.0001 की तुलना में D0 और ***p < 0.001, या ****p < 0.0001 की तुलना में D12 Ctrl)। b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов सेरेडी, окраштабная линейка = 500 μкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD और D12 MC), 9 (D12 MT) срезов/группу от разных свиней, выполняется односторонний тест ANOVA; ****पी <0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). b) मैसन के ट्राइक्रोम स्टेन से रंगे हृदय के अनुभागों की प्रतिनिधि छवियां और मात्रा निर्धारण (स्केल बार = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD और D12 MC), 9 (D12 MT) अनुभाग/समूह विभिन्न सूअरों से, एक-तरफ़ा ANOVA किया गया; ####p < 0.0001 बनाम D0 और ***p < 0.001 या ****p < 0.0001 बनाम D12 Ctrl)। b 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像和量化（比例尺=500 µm）（n = 10（D0、D12 Ctrl, D12 TD और D12 MC，，来自不同猪的9 个（D12 MT）切片/组，进行单因素方差分析；####p < 0.0001与D0 相比，***p < 0.001, ********p < 0.0001, D12 Ctrl, 比）。 b 用 mason 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 和 量化 （比例 尺 尺 尺 = 500 µm） （n = 10 （d0 、 d12 ctrl 、 d12 td और d12 mc） 9 个 d12 mt पर क्लिक करें切 तस्वीरें तस्वीरें और तस्वीरें D0 का उपयोग करें,***p < 0.001,या****p < 0.0001 का उपयोग करें D12 Ctrl का उपयोग करें）。 b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов सेरेडी, окрашенных трихромом Массона (масштабная линейка = 500 мкм) (n = 10 (D0, डी12 Ctrl, D12 TD और D12 MC), 9 (D12 MT) срезов от разных свиней / группы, один- способ ANOVA; ####p < 0,0001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). b) मैसन के ट्राइक्रोम से रंगे हृदय के अनुभागों की प्रतिनिधि छवियां और मात्रा निर्धारण (स्केल बार = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD और D12 MC), 9 (D12 MT) अनुभाग विभिन्न सूअरों/समूह से, एक ANOVA विधि; ####p < 0.0001 की तुलना में D0, ***p < 0.001 या ****p < 0.0001 की तुलना में D12 Ctrl)।त्रुटि बार माध्य ± मानक विचलन को दर्शाते हैं।
अंत में, हृदय अतिवृद्धि की नकल करने की सीटीसीएम की क्षमता का आकलन हृदय ऊतक खिंचाव को बढ़ाकर किया गया। सीटीसीएम में, वायु कक्ष का अधिकतम दाब 80 mmHg से बढ़कर 140 mmHg तक हो गया (चित्र 6a)। यह खिंचाव में 32% की वृद्धि दर्शाता है (चित्र 6b), जिसे पहले हृदय के भागों के लिए आवश्यक खिंचाव प्रतिशत के रूप में दर्शाया गया था ताकि अतिवृद्धि में देखी गई सार्कोमेयर लंबाई के समान लंबाई प्राप्त की जा सके। संकुचन और शिथिलता के दौरान हृदय ऊतक का खिंचाव और वेग छह दिनों की संवर्धन अवधि के दौरान स्थिर रहा (चित्र 6c)। एमटी स्थितियों से प्राप्त हृदय ऊतक को छह दिनों तक सामान्य खिंचाव (एमटी (सामान्य)) या अतिखिंचाव स्थितियों (एमटी (ओएस)) के अधीन रखा गया। संवर्धन में चार दिनों के बाद ही, एमटी (ओएस) स्थितियों के अंतर्गत माध्यम में अतिवृद्धिकारी बायोमार्कर एनटी-प्रोबीएनपी, एमटी (सामान्य) स्थितियों की तुलना में काफी अधिक पाया गया (चित्र 7a)। इसके अतिरिक्त, छह दिनों तक कल्चर करने के बाद, एमटी (ओएस) में कोशिका का आकार (चित्र 7बी) एमटी हृदय (सामान्य) के अनुभागों की तुलना में काफी बढ़ गया। साथ ही, अतिविस्तारित ऊतकों में एनएफएटीसी4 नाभिकीय स्थानांतरण में भी उल्लेखनीय वृद्धि देखी गई (चित्र 7सी)। ये परिणाम अतिविस्तार के बाद रोग संबंधी पुनर्रचना के क्रमिक विकास को दर्शाते हैं और इस अवधारणा का समर्थन करते हैं कि सीटीसीएम उपकरण का उपयोग खिंचाव-प्रेरित हृदय अतिवृद्धि संकेतन के अध्ययन के लिए एक मंच के रूप में किया जा सकता है।
वायु कक्ष दाब, द्रव कक्ष दाब ​​और ऊतक गति माप के प्रतिनिधि निशान इस बात की पुष्टि करते हैं कि कक्ष दाब ​​द्रव कक्ष दाब ​​को बदलता है, जिससे ऊतक स्लाइस की तदनुसार गति होती है। b सामान्य रूप से खींचे गए (नारंगी) और अतिखींचे गए (नीले) ऊतक खंडों के लिए प्रतिनिधि खिंचाव प्रतिशत और खिंचाव दर वक्र। c बार ग्राफ चक्र समय (n = 19 स्लाइस प्रति समूह, विभिन्न सूअरों से), संकुचन समय (n = 18-19 स्लाइस प्रति समूह, विभिन्न सूअरों से), विश्राम समय (n = 19 स्लाइस प्रति समूह, विभिन्न सूअरों से), ऊतक गति का आयाम (n = 14 स्लाइस/समूह, विभिन्न सूअरों से), शिखर सिस्टोलिक वेग (n = 14 स्लाइस/समूह, विभिन्न सूअरों से) और शिखर विश्राम दर (n = 14 (D0), 15 (D6) खंड/समूह) को दर्शाता है। दो-तरफ़ा स्टूडेंट के t-परीक्षण ने किसी भी पैरामीटर में कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं दिखाया, यह दर्शाता है कि ये पैरामीटर अतिवोल्टेज के साथ 6 दिनों के संवर्धन के दौरान स्थिर रहे। त्रुटि बार माध्य ± मानक विचलन को दर्शाते हैं।
सामान्य खिंचाव (Norm) या अतिखिंचाव (OS) स्थितियों के तहत संवर्धित हृदय स्लाइस से प्राप्त कल्चर मीडिया में NT-ProBNP सांद्रता का बार ग्राफ मात्रात्मक विश्लेषण (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, और D4 MTOS) स्लाइस/समूह विभिन्न सूअरों से लिए गए, दो-तरफ़ा ANOVA का प्रदर्शन किया गया; **p < 0.01 सामान्य खिंचाव की तुलना में)। सामान्य खिंचाव (Norm) या अतिखिंचाव (OS) स्थितियों के तहत संवर्धित हृदय स्लाइस से संस्कृति मीडिया में NT-ProBNP सांद्रता का बार ग्राफ मात्रात्मक विश्लेषण (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, और D4 MTOS) स्लाइस/समूह विभिन्न सूअरों से, दो-तरफ़ा ANOVA किया गया; **p < 0.01 सामान्य खिंचाव की तुलना में)।सामान्य एमटी खिंचाव (नॉर्म) या अतिखिंचाव (ओएस) की स्थितियों के तहत संवर्धित हृदय स्लाइस से प्राप्त कल्चर मीडियम में एनटी-प्रोबीएनपी सांद्रता का मात्रात्मक हिस्टोग्राम (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, और D4) स्लाइस / समूह विभिन्न सूअरों से लिए गए) का विश्लेषण किया गया है; दो-कारक विचरण विश्लेषण किया गया है।**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). (सामान्य खिंचाव की तुलना में p < 0.01)। MT-ProBNP को डाउनलोड करने के लिए MT-ProBNP की आवश्यकता होती है पूर्ण आकार का डेटा (n = 4 (D2 MTNorm)), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm और D4) MTOS）来自不同猪的切片/组，进行双向方差分析；**与正常拉伸相比，p < 0.01)। एमटी सामान्य खिंचाव (नॉर्म) या ओवरस्ट्रेच (ओएस) स्थितियों (एन = 4 (डी 2 एमटी नॉर्म), 3 (डी 2 एमटीओएस, डी 4 एमटी नॉर्म और डी 4 एमटीओएस) के तहत अलग-अलग हृदय स्लाइस में एनटी-प्रोबीएनपी एकाग्रता की मात्रा सामान्य स्ट्रेचिंग की तुलना में, पी <0.01)।सामान्य एमटी खिंचाव (नॉर्म) या अतिखिंचाव (ओएस) की स्थितियों के तहत संवर्धित हृदय स्लाइस में एनटी-प्रोबीएनपी सांद्रता का हिस्टोग्राम मात्रा निर्धारण (n = 4 (डी2 एमटीनॉर्म), 3 (डी2 एमटीओएस, डी4 एमटीनॉर्म) और डी4 एमटीओएस) स्लाइस/समूह विभिन्न सूअरों से, दो-तरफ़ा विश्लेषण;**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). (सामान्य खिंचाव की तुलना में p < 0.01)। b) ट्रोपोनिन-टी और डब्ल्यूजीए से रंगे हृदय स्लाइस (बाएं) और कोशिका आकार मात्रा निर्धारण (दाएं) के लिए प्रतिनिधि छवियां (n = 330 (डी6 एमटीओएस), 369 (डी6 एमटीनॉर्म) कोशिकाएं/समूह, विभिन्न सूअरों से 10 अलग-अलग स्लाइस से, दो-तरफ़ा स्टूडेंट टी-परीक्षण किया गया; ****p < 0.0001 सामान्य खिंचाव की तुलना में)। b) ट्रोपोनिन-टी और डब्ल्यूजीए से रंगे हृदय के टुकड़ों की प्रतिनिधि छवियां (बाएं) और कोशिका आकार का मात्रात्मक विश्लेषण (दाएं) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) कोशिकाएं/समूह, विभिन्न सूअरों से लिए गए 10 अलग-अलग टुकड़ों से, दो-तरफ़ा स्टूडेंट टी-परीक्षण किया गया; ****p < 0.0001 सामान्य खिंचाव की तुलना में)। b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т और АЗП (слева) और количественного определения размера клеток (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) клеток/группу из 10 разных срезов от разных свиней, два- проводится хвостовой t-критерий Стьюдента; ****p < 0,0001 по сравнению с нормальным растяжением). b) ट्रोपोनिन-टी और एजेडपी से रंगे हृदय के अनुभागों की प्रतिनिधि छवियां (बाएं) और कोशिका आकार का मात्रात्मक विश्लेषण (दाएं) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) कोशिकाएं/समूह, विभिन्न सूअरों के 10 अलग-अलग अनुभागों से, दो-तरफ़ा स्टूडेंट के टी-परीक्षण का प्रदर्शन किया गया; ****p < 0.0001 सामान्य स्ट्रेन की तुलना में)। b 用肌钙蛋白-T 和WGA（左） और 细胞大小量化（右） 染色的心脏切片的代表性图像（n = 330（D6 MTOS），个不同猪的10 个不同切片的369（D6 MTNorm）细胞/组，两进行有尾学生t उत्तर: 与正常拉伸相比,****p < 0.0001）。 b) कैल्केरिन-टी और डब्ल्यूजीए (बाएं) से रंगे हृदय के स्लाइस की प्रतिनिधि छवियां और कोशिका आकार (दाएं) (n = 330 (D6 MTOS), 10 अलग-अलग स्लाइस से 369 (D6 MTNorm)) कोशिकाएं/समूह, दोनों विधियों में टी परीक्षण है; सामान्य खिंचाव की तुलना में, ****p < 0.0001)। b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т और АЗП (слева) और количественная оценка размера клеток (справа) (एन = 330 (डी6 एमटीओएस), 369 (डी6 एमटीनॉर्म) या 10 मिलियन डॉलर प्रति मिलियन क्लेट/группа, двусторонние критерий Стьюдента; ****p < 0,0001 по сравнению с нормальным растяжением). b) ट्रोपोनिन-टी और एजेडपी से रंगे हृदय के अनुभागों की प्रतिनिधि छवियां (बाएं) और कोशिका आकार का परिमाणीकरण (दाएं) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) विभिन्न सूअरों के 10 अलग-अलग अनुभागों से) कोशिकाएं/समूह, दो-तरफ़ा मानदंड स्टूडेंट का टी; ****p < 0.0001 सामान्य स्ट्रेन की तुलना में)। दिन 0 और दिन 6 के एमटीओएस हृदय स्लाइस के प्रतिनिधि चित्र, ट्रोपोनिन-टी और एनएफएटीसी4 के लिए इम्यूनोलैबल्ड और सीएम के नाभिक में एनएफएटीसी4 के स्थानांतरण का मात्रात्मक विश्लेषण (n = 4 (डी0), 3 (डी6 एमटीओएस) स्लाइस/समूह विभिन्न सूअरों से, दो-तरफ़ा स्टूडेंट टी-परीक्षण किया गया; *पी < 0.05)। दिन 0 और दिन 6 के एमटीओएस हृदय स्लाइस के प्रतिनिधि चित्र, ट्रोपोनिन-टी और एनएफएटीसी4 के लिए इम्यूनोलैबल्ड और सीएम के नाभिक में एनएफएटीसी4 के स्थानांतरण का मात्रात्मक विश्लेषण (n = 4 (डी0), 3 (डी6 एमटीओएस) स्लाइस/समूह विभिन्न सूअरों से, दो-तरफ़ा स्टूडेंट टी-परीक्षण किया गया; *पी < 0.05)। c Репрезентативные изображения для срезов сердца 0 и 6 दिन MTOS, имуномеченых для тропонина-Т और NFATC4, और количественная оценка транслокации NFATC4 в ядра кавернозных клеток (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срезов/группу от разных свиней , выполняется двусторонний t-критерий Стьюдента; सी. हृदय के अनुभागों के लिए प्रतिनिधि छवियां, 0 और 6 दिन एमटीओएस पर, ट्रोपोनिन-टी और एनएफएटीसी4 के लिए इम्यूनोलैबल्ड, और कैवर्नस कोशिकाओं के नाभिक में एनएफएटीसी4 ट्रांसलोकेशन का मात्रात्मक विश्लेषण (n = 4 (डी0), 3 (डी6 एमटीओएस) स्लाइस/समूह विभिन्न सूअरों से) दो-तरफ़ा स्टूडेंट के टी-परीक्षण का प्रदर्शन किया गया; *पी < 0.05)। c 用于肌钙蛋白-T और NFATC4 免疫标记的第0 天和第6 MTOS एनएफएटीसी 4 एनएफएटीसी 4 एनएफएटीसीएन = 4 (डी0)、3 (डी6 एमटीओएस)切片/组, 进行双尾学生t 检验；*p < 0.05)。 सी कैल्केनिन-टी और एनएफएटीसी4 इम्युनोलेबलिंग की प्रतिनिधि छवियां 0 से अधिक एमटीओएस हृदय स्लाइस, और विभिन्न एनएफएटीसी4 से एनएफएटीसी4, सीएम सेल न्यूक्लियस मात्रा (एन = 4 (डी0), 3 (डी6 एमटीओएस) से भिन्न हैं।时间双尾学生et 电影；*p < 0.05). c Репрезентативные изображения срезов сердца MTOS на 0 и 6 दिन имуномаркировки тропонином-Т और NFATC4 और количественная оценка транслокации NFATC4 в ядра CM от разных свиней (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срез/группа, два- хвостатый t-критерий Стьюдента; *p < 0,05). सी. विभिन्न सूअरों से प्राप्त सीएम के नाभिक में ट्रोपोनिन-टी और एनएफएटीसी4 इम्यूनोलैबलिंग और एनएफएटीसी4 ट्रांसलोकेशन के मात्रात्मक विश्लेषण के लिए दिन 0 और 6 पर एमटीओएस हृदय स्लाइस की प्रतिनिधि छवियां (एन = 4 (डी0), 3 (डी6 एमटीओएस) स्लाइस/समूह, दो-तरफ़ा टी-मानदंड स्टूडेंट का; *पी < 0.05)।त्रुटि बार माध्य ± मानक विचलन को दर्शाते हैं।
हृदय संबंधी अनुसंधान में ऐसे कोशिकीय मॉडल की आवश्यकता होती है जो हृदय के वातावरण को सटीक रूप से पुन: उत्पन्न कर सकें। इस अध्ययन में, एक सीटीसीएम उपकरण विकसित और उसकी विशेषताओं का अध्ययन किया गया जो हृदय के अतिपतले खंडों को उत्तेजित कर सकता है। सीटीसीएम प्रणाली में शारीरिक रूप से सिंक्रनाइज़्ड विद्युतयांत्रिक उत्तेजना और टी3 तथा डेक्स द्रव संवर्धन शामिल हैं। जब सूअर के हृदय के खंडों को इन कारकों के संपर्क में लाया गया, तो 12 दिनों की संवर्धन अवधि के बाद भी उनकी व्यवहार्यता, संरचनात्मक अखंडता, चयापचय गतिविधि और प्रतिलेखन अभिव्यक्ति ताजे हृदय ऊतक के समान ही बनी रही। इसके अतिरिक्त, हृदय ऊतक के अत्यधिक खिंचाव से अतिविस्तार के कारण हृदय में अतिवृद्धि हो सकती है। कुल मिलाकर, ये परिणाम सामान्य हृदय संबंधी फेनोटाइप को बनाए रखने में शारीरिक संवर्धन स्थितियों की महत्वपूर्ण भूमिका का समर्थन करते हैं और दवा परीक्षण के लिए एक मंच प्रदान करते हैं।
हृदय कोशिकाओं के कार्य और जीवित रहने के लिए अनुकूलतम वातावरण बनाने में कई कारक योगदान देते हैं। इनमें से सबसे स्पष्ट कारक (1) अंतरकोशिकीय अंतःक्रियाएं, (2) विद्युतयांत्रिक उत्तेजना, (3) ह्यूमरल कारक और (4) चयापचय सब्सट्रेट से संबंधित हैं। शारीरिक कोशिका-से-कोशिका अंतःक्रियाओं के लिए बाह्यकोशिकीय मैट्रिक्स द्वारा समर्थित कई प्रकार की कोशिकाओं के जटिल त्रि-आयामी नेटवर्क की आवश्यकता होती है। इस प्रकार की जटिल कोशिकीय अंतःक्रियाओं को व्यक्तिगत कोशिका प्रकारों के सह-संवर्धन द्वारा इन विट्रो में पुनर्निर्मित करना कठिन है, लेकिन हृदय के भागों की अंग-विशिष्ट प्रकृति का उपयोग करके इसे आसानी से प्राप्त किया जा सकता है।
हृदय कोशिकाओं के यांत्रिक खिंचाव और विद्युत उत्तेजना हृदय के विशिष्ट स्वरूप को बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण हैं।33,34,35 हालांकि hiPSC-CM कंडीशनिंग और परिपक्वता के लिए यांत्रिक उत्तेजना का व्यापक रूप से उपयोग किया जाता रहा है, हाल ही में कई उत्कृष्ट अध्ययनों ने एकअक्षीय लोडिंग का उपयोग करके कल्चर में हृदय के टुकड़ों की यांत्रिक उत्तेजना का प्रयास किया है। ये अध्ययन दर्शाते हैं कि 2D एकअक्षीय यांत्रिक लोडिंग का कल्चर के दौरान हृदय के विशिष्ट स्वरूप पर सकारात्मक प्रभाव पड़ता है। इन अध्ययनों में, हृदय के भागों को या तो आइसोमेट्रिक तन्यता बलों17, रैखिक ऑक्सोटोनिक लोडिंग18 से लोड किया गया था, या बल ट्रांसड्यूसर फीडबैक और तनाव ड्राइव का उपयोग करके हृदय चक्र को पुन: उत्पन्न किया गया था। हालांकि, ये विधियां पर्यावरणीय अनुकूलन के बिना एकअक्षीय ऊतक खिंचाव का उपयोग करती हैं, जिसके परिणामस्वरूप कई हृदय जीन का दमन होता है या असामान्य खिंचाव प्रतिक्रियाओं से जुड़े जीन का अति-अभिव्यक्ति होती है। यहां वर्णित सीटीसीएम एक त्रिविमीय विद्युतयांत्रिक उत्तेजना प्रदान करता है जो चक्र समय और शारीरिक खिंचाव (25% खिंचाव, 40% सिस्टोल, 60% डायस्टोल और 72 धड़कन प्रति मिनट) के संदर्भ में प्राकृतिक हृदय चक्र की नकल करता है। हालांकि यह त्रिविमीय यांत्रिक उत्तेजना अकेले ऊतक अखंडता को बनाए रखने के लिए पर्याप्त नहीं है, ऊतक की व्यवहार्यता, कार्य और अखंडता को पर्याप्त रूप से बनाए रखने के लिए टी3/डेक्स का उपयोग करके ह्यूमरल और यांत्रिक उत्तेजना के संयोजन की आवश्यकता होती है।
वयस्क हृदय के फेनोटाइप को नियंत्रित करने में ह्यूमोरल कारक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। यह बात HiPS-CM अध्ययनों में उजागर हुई, जिनमें कोशिका परिपक्वता को तेज करने के लिए कल्चर मीडिया में T3 और Dex मिलाए गए थे। T3 कोशिका झिल्लियों के पार अमीनो एसिड, शर्करा और कैल्शियम के परिवहन को प्रभावित कर सकता है36। इसके अतिरिक्त, T3 MHC-α अभिव्यक्ति और MHC-β डाउनरेगुलेशन को बढ़ावा देता है, जिससे भ्रूण CM में धीमी गति से सिकुड़ने वाले मायोफाइब्रिल्स की तुलना में परिपक्व कार्डियोमायोसाइट्स में तीव्र गति से सिकुड़ने वाले मायोफाइब्रिल्स का निर्माण होता है। हाइपोथायरायड रोगियों में T3 की कमी से मायोफाइब्रिलर बैंड का नुकसान होता है और टोन विकास की दर कम हो जाती है37। Dex ग्लूकोकोर्टिकॉइड रिसेप्टर्स पर कार्य करता है और पृथक परफ्यूज्ड हृदयों में मायोकार्डियल संकुचनशीलता को बढ़ाने के लिए दिखाया गया है; 38 यह सुधार कैल्शियम जमाव-संचालित प्रवेश (SOCE) 39,40 पर प्रभाव से संबंधित माना जाता है। इसके अतिरिक्त, Dex अपने रिसेप्टर्स से बंधता है, जिससे एक व्यापक इंट्रासेलुलर प्रतिक्रिया होती है जो प्रतिरक्षा कार्य और सूजन को दबाती है30।
हमारे परिणामों से पता चलता है कि भौतिक यांत्रिक उत्तेजना (एमएस) ने कंट्रोल की तुलना में समग्र कल्चर प्रदर्शन में सुधार किया, लेकिन कल्चर में 12 दिनों तक व्यवहार्यता, संरचनात्मक अखंडता और कार्डियक अभिव्यक्ति को बनाए रखने में विफल रही। कंट्रोल की तुलना में, सीटीसीएम (एमटी) कल्चर में टी3 और डेक्स मिलाने से व्यवहार्यता में सुधार हुआ और ताजे हृदय ऊतक के साथ 12 दिनों तक समान ट्रांसक्रिप्शन प्रोफाइल, संरचनात्मक अखंडता और चयापचय गतिविधि बनी रही। इसके अलावा, ऊतक खिंचाव की मात्रा को नियंत्रित करके, एसटीसीएम का उपयोग करके एक हाइपरएक्सटेंशन-प्रेरित कार्डियक हाइपरट्रॉफी मॉडल बनाया गया, जो एसटीसीएम प्रणाली की बहुमुखी प्रतिभा को दर्शाता है। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि यद्यपि कार्डियक रीमॉडेलिंग और फाइब्रोसिस में आमतौर पर अक्षुण्ण अंग शामिल होते हैं जिनकी परिसंचारी कोशिकाएं उपयुक्त साइटोकाइन के साथ-साथ फैगोसाइटोसिस और अन्य रीमॉडेलिंग कारक प्रदान कर सकती हैं, हृदय के खंड अभी भी तनाव और आघात के जवाब में फाइब्रोटिक प्रक्रिया की नकल कर सकते हैं। मायोफाइब्रोब्लास्ट में परिवर्तित। इसका मूल्यांकन पहले इस कार्डियक स्लाइस मॉडल में किया गया है। यह ध्यान देने योग्य है कि सीटीसीएम मापदंडों को दबाव/विद्युत आयाम और आवृत्ति को बदलकर नियंत्रित किया जा सकता है, जिससे टैकीकार्डिया, ब्रैडीकार्डिया और यांत्रिक परिसंचरण समर्थन (यांत्रिक रूप से भारहीन हृदय) जैसी कई स्थितियों का अनुकरण किया जा सकता है। यह प्रणाली को दवा परीक्षण के लिए मध्यम क्षमता वाली बनाती है। अति-व्यायाम से प्रेरित हृदय अतिवृद्धि को मॉडल करने की सीटीसीएम की क्षमता व्यक्तिगत चिकित्सा के लिए इस प्रणाली के परीक्षण का मार्ग प्रशस्त करती है। निष्कर्षतः, वर्तमान अध्ययन दर्शाता है कि हृदय ऊतक के नमूनों की संवर्धन प्रक्रिया को बनाए रखने के लिए यांत्रिक खिंचाव और ह्यूमरल उत्तेजना महत्वपूर्ण हैं।
हालांकि यहां प्रस्तुत आंकड़े बताते हैं कि CTCM अक्षुण्ण मायोकार्डियम के मॉडलिंग के लिए एक बहुत ही आशाजनक मंच है, लेकिन इस संवर्धन विधि की कुछ सीमाएँ हैं। CTCM संवर्धन की मुख्य सीमा यह है कि यह स्लाइस पर निरंतर गतिशील यांत्रिक तनाव डालता है, जिससे प्रत्येक चक्र के दौरान कार्डियक स्लाइस संकुचन की सक्रिय रूप से निगरानी करना संभव नहीं हो पाता है। इसके अलावा, कार्डियक सेक्शन के छोटे आकार (7 मिमी) के कारण, पारंपरिक बल सेंसर का उपयोग करके संवर्धन प्रणालियों के बाहर सिस्टोलिक कार्य का मूल्यांकन करने की क्षमता सीमित है। वर्तमान पांडुलिपि में, हमने संकुचन कार्य के संकेतक के रूप में ऑप्टिकल वोल्टेज का मूल्यांकन करके इस सीमा को आंशिक रूप से दूर किया है। हालांकि, इस सीमा पर और अधिक कार्य करने की आवश्यकता होगी और भविष्य में कैल्शियम और वोल्टेज-संवेदनशील रंगों का उपयोग करके ऑप्टिकल मैपिंग जैसी संवर्धन में हृदय स्लाइस के कार्य की ऑप्टिकल निगरानी के लिए विधियों को लागू करके इसे दूर किया जा सकता है। CTCM की एक अन्य सीमा यह है कि कार्यशील मॉडल शारीरिक तनाव (प्रीलोड और आफ्टरलोड) को नियंत्रित नहीं करता है। CTCM में, बहुत बड़े ऊतकों में डायस्टोल (पूर्ण खिंचाव) और सिस्टोल (विद्युत उत्तेजना के दौरान संकुचन की अवधि) में 25% शारीरिक खिंचाव को पुन: उत्पन्न करने के लिए विपरीत दिशाओं में दबाव प्रेरित किया गया था। हृदय के ऊतकों पर दोनों ओर से पर्याप्त दबाव डालकर और हृदय के कक्षों में होने वाले सटीक दबाव-आयतन संबंधों को लागू करके भविष्य के सीटीसीएम डिजाइनों में इस सीमा को दूर किया जाना चाहिए।
इस पांडुलिपि में वर्णित अति खिंचाव-प्रेरित रीमॉडलिंग, हाइपरट्रॉफिक अति खिंचाव संकेतों की नकल तक ही सीमित है। इस प्रकार, यह मॉडल ह्यूमरल या न्यूरल कारकों (जो इस प्रणाली में मौजूद नहीं हैं) की आवश्यकता के बिना, खिंचाव-प्रेरित हाइपरट्रॉफिक सिग्नलिंग के अध्ययन में सहायक हो सकता है। सीटीसीएम की विविधता बढ़ाने के लिए आगे के अध्ययनों की आवश्यकता है, उदाहरण के लिए, प्रतिरक्षा कोशिकाओं के साथ सह-संवर्धन, परिसंचारी प्लाज्मा ह्यूमरल कारक, और तंत्रिका कोशिकाओं के साथ सह-संवर्धन करते समय तंत्रिका तंत्र का समावेश, सीटीसीएम के साथ रोग मॉडलिंग की संभावनाओं को बेहतर बनाएगा।
इस अध्ययन में तेरह सूअरों का उपयोग किया गया था। सभी पशु प्रक्रियाओं को संस्थागत दिशानिर्देशों के अनुसार किया गया था और लुइसविले विश्वविद्यालय की संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था। महाधमनी चाप को क्लैंप किया गया और हृदय को 1 लीटर बाँझ कार्डियोप्लेगिया (110 mM NaCl, 1.2 mM CaCl2, 16 mM KCl, 16 mM MgCl2, 10 mM NaHCO3, 5 U/mL हेपरिन, pH 7.4 तक) से परफ्यूज़ किया गया; हृदयों को बर्फ के ठंडे कार्डियोप्लेजिक घोल में संरक्षित रखा गया था जब तक कि उन्हें बर्फ पर रखकर प्रयोगशाला में नहीं ले जाया गया, जिसमें आमतौर पर 10 मिनट से कम समय लगता है। हृदयों को बर्फ के ठंडे कार्डियोप्लेजिक घोल में संरक्षित रखा गया था जब तक कि उन्हें बर्फ पर रखकर प्रयोगशाला में नहीं ले जाया गया, जिसमें आमतौर पर 10 मिनट से कम समय लगता है। сердца хранили в ледяном кардиоплегическом растворе до транспортировки в лабораторию на льду, что обычно занимает <10 мин. प्रयोगशाला में ले जाने तक हृदयों को बर्फ के ठंडे कार्डियोप्लेजिक घोल में रखा जाता था, जिसमें आमतौर पर 10 मिनट से भी कम समय लगता है।将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中,直到冰上运送到实验室,通常<10分钟。将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中,直到冰上运送到实验室,通常<10分钟。 Держите сердца в ледяной кардиоплегии до транспортировки в лабораторию на льду, обычно <10 мин. प्रयोगशाला में ले जाने तक हृदय को बर्फ पर रखकर कार्डियोप्लेगिया की स्थिति में रखें, आमतौर पर 10 मिनट से कम समय के लिए।
सीटीसीएम उपकरण को सॉलिडवर्क्स कंप्यूटर-एडेड डिज़ाइन (CAD) सॉफ़्टवेयर में विकसित किया गया था। कल्चर चैंबर, डिवाइडर और एयर चैंबर सीएनसी क्लियर ऐक्रेलिक प्लास्टिक से बने हैं। केंद्र में 7 मिमी व्यास का बैक-अप रिंग उच्च घनत्व पॉलीइथिलीन (HDPE) से बना है और इसमें नीचे के मीडिया को सील करने के लिए उपयोग किए जाने वाले सिलिकॉन ओ-रिंग को समायोजित करने के लिए एक ओ-रिंग ग्रूव है। एक पतली सिलिका झिल्ली कल्चर चैंबर को पृथक्करण प्लेट से अलग करती है। सिलिकॉन झिल्ली को 0.02 इंच मोटी सिलिकॉन शीट से लेजर कटिंग द्वारा बनाया गया है और इसकी कठोरता 35A है। नीचे और ऊपर के सिलिकॉन गैस्केट को 1/16 इंच मोटी सिलिकॉन शीट से लेजर कटिंग द्वारा बनाया गया है और इसकी कठोरता 50A है। ब्लॉक को कसने और वायुरोधी सील बनाने के लिए 316L स्टेनलेस स्टील के स्क्रू और विंग नट का उपयोग किया जाता है।
एक विशेष प्रिंटेड सर्किट बोर्ड (पीसीबी) को सी-पेस-ईएम सिस्टम के साथ एकीकृत करने के लिए डिज़ाइन किया गया है। पीसीबी पर स्थित स्विस मशीन कनेक्टर सॉकेट को सिल्वर-प्लेटेड कॉपर तारों और इलेक्ट्रोड में कसे हुए ब्रॉन्ज़ 0-60 स्क्रू के माध्यम से ग्रेफाइट इलेक्ट्रोड से जोड़ा गया है। प्रिंटेड सर्किट बोर्ड को 3डी प्रिंटर के कवर में रखा गया है।
सीटीसीएम उपकरण एक प्रोग्रामेबल न्यूमेटिक एक्चुएटर (पीपीडी) द्वारा नियंत्रित होता है, जो हृदय चक्र के समान नियंत्रित परिसंचारी दबाव उत्पन्न करता है। जैसे ही वायु कक्ष के अंदर दबाव बढ़ता है, लचीली सिलिकॉन झिल्ली ऊपर की ओर फैलती है, जिससे ऊतक के नीचे का माध्यम ऊपर की ओर धकेला जाता है। इस द्रव के निकलने से ऊतक का क्षेत्र खिंच जाता है, जो डायस्टोल के दौरान हृदय के शारीरिक विस्तार की नकल करता है। शिथिलता के चरम पर, ग्रेफाइट इलेक्ट्रोड के माध्यम से विद्युत उत्तेजना दी जाती है, जिससे वायु कक्ष में दबाव कम हो जाता है और ऊतक के हिस्सों में संकुचन होता है। पाइप के अंदर एक हेमोस्टैटिक वाल्व होता है जिसमें वायु प्रणाली में दबाव का पता लगाने के लिए एक दबाव सेंसर लगा होता है। दबाव सेंसर द्वारा मापा गया दबाव लैपटॉप से ​​जुड़े डेटा संग्राहक को भेजा जाता है। इससे गैस कक्ष के अंदर के दबाव की निरंतर निगरानी संभव हो पाती है। जब अधिकतम चैम्बर दबाव (मानक 80 mmHg, 140 mmHg OS) तक पहुँच गया, तो डेटा अधिग्रहण उपकरण को C-PACE-EM सिस्टम को एक संकेत भेजने का आदेश दिया गया ताकि 2 मिलीसेकंड के लिए 4 V पर सेट एक द्विचरणीय वोल्टेज संकेत उत्पन्न किया जा सके।
हृदय के अंश प्राप्त किए गए और 6 कुओं में संवर्धन की स्थितियाँ निम्नानुसार की गईं: निकाले गए हृदयों को स्थानांतरण पात्र से ठंडे (4°C) कार्डियोप्लेगिया युक्त ट्रे में स्थानांतरित किया गया। बाएँ निलय को एक निष्फल ब्लेड से अलग किया गया और 1-2 cm³ के टुकड़ों में काटा गया। इन ऊतक ब्लॉकों को ऊतक चिपकने वाले पदार्थ से ऊतक आधारों पर चिपकाया गया और टायरोड के विलयन से युक्त कंपनशील माइक्रोटोम ऊतक स्नान में रखा गया, जिसमें निरंतर ऑक्सीजन युक्त घोल (3 g/L 2,3-ब्यूटानेडियोन मोनोऑक्साइम (BDM), 140 mM NaCl (8.18 g), 6 mM KCl (0.447 g), 10 mM D-ग्लूकोज (1.86 g), 10 mM HEPES (2.38 g), 1 mM MgCl₂ (1 ml 1 M विलयन), 1.8 mM CaCl₂ (1.8 ml 1 M विलयन), और 1 L तक ddH₂O) मौजूद था। वाइब्रेटिंग माइक्रोटोम को 80 हर्ट्ज़ की आवृत्ति, 2 मिमी के क्षैतिज कंपन आयाम और 0.03 मिमी/सेकंड की अग्रिम दर पर 300 µm मोटी स्लाइस काटने के लिए सेट किया गया था। ऊतक स्नान को बर्फ से घेर कर रखा गया था ताकि घोल ठंडा रहे और तापमान 4°C पर बनाए रखा जा सके। ऊतक के टुकड़ों को माइक्रोटोम स्नान से बर्फ पर रखे निरंतर ऑक्सीजन युक्त टायरोड घोल वाले इनक्यूबेशन स्नान में तब तक स्थानांतरित करें जब तक कि एक कल्चर प्लेट के लिए पर्याप्त टुकड़े प्राप्त न हो जाएं। ट्रांसवेल कल्चर के लिए, ऊतक के टुकड़ों को 6 मिमी चौड़े स्टेराइल पॉलीयूरेथेन सपोर्ट से जोड़ा गया और 6 मिलीलीटर अनुकूलित माध्यम (199 माध्यम, 1x ITS सप्लीमेंट, 10% FBS, 5 ng/ml VEGF, 10 ng/ml FGF-क्षारीय और 2X एंटीबायोटिक-एंटीफंगल) में रखा गया। C-Pace के माध्यम से ऊतक के टुकड़ों पर विद्युत उत्तेजना (10 V, आवृत्ति 1.2 हर्ट्ज़) लागू की गई। टीडी परिस्थितियों के लिए, प्रत्येक माध्यम परिवर्तन पर 100 nM और 1 μM की मात्रा में ताज़ा T3 और Dex मिलाया गया। माध्यम को दिन में 3 बार बदलने से पहले ऑक्सीजन से संतृप्त किया गया। ऊतक के नमूनों को 37°C और 5% CO2 वाले इनक्यूबेटर में संवर्धित किया गया।
सीटीसीएम कल्चर के लिए, ऊतक के टुकड़ों को संशोधित टायरोड विलयन से भरे पेट्री डिश में विशेष रूप से निर्मित 3डी प्रिंटर पर रखा गया था। यह उपकरण हृदय के स्लाइस के आकार को सपोर्ट रिंग के क्षेत्रफल के 25% तक बढ़ाने के लिए डिज़ाइन किया गया है। ऐसा इसलिए किया जाता है ताकि टायरोड विलयन से माध्यम में स्थानांतरित होने के बाद और डायस्टोल के दौरान हृदय के टुकड़े खिंच न जाएं। हिस्टोएक्रिलिक गोंद का उपयोग करके, 300 µm मोटे टुकड़ों को 7 mm व्यास के सपोर्ट रिंग पर फिक्स किया गया। ऊतक के टुकड़ों को सपोर्ट रिंग से जोड़ने के बाद, अतिरिक्त ऊतक के टुकड़ों को काट दिया गया और जुड़े हुए ऊतक के टुकड़ों को वापस बर्फ (4°C) पर रखे टायरोड विलयन के घोल में तब तक रखा गया जब तक कि एक उपकरण के लिए पर्याप्त टुकड़े तैयार न हो जाएं। सभी उपकरणों के लिए कुल प्रसंस्करण समय 2 घंटे से अधिक नहीं होना चाहिए। 6 ऊतक के टुकड़ों को उनके सपोर्ट रिंग से जोड़ने के बाद, सीटीसीएम उपकरण को असेंबल किया गया। सीटीसीएम कल्चर चैंबर को 21 मिलीलीटर पूर्व-ऑक्सीजनयुक्त माध्यम से पहले से भरा जाता है। ऊतक के टुकड़ों को कल्चर चैंबर में स्थानांतरित करें और पिपेट की सहायता से हवा के बुलबुले सावधानीपूर्वक निकाल दें। फिर ऊतक के टुकड़े को छेद में डालें और धीरे से दबाकर जगह पर सेट करें। अंत में, इलेक्ट्रोड कैप को डिवाइस पर लगाएं और डिवाइस को इनक्यूबेटर में स्थानांतरित करें। इसके बाद CTCM को एयर ट्यूब और C-PACE-EM सिस्टम से कनेक्ट करें। न्यूमेटिक एक्चुएटर खुलता है और एयर वाल्व CTCM को खोलता है। C-PACE-EM सिस्टम को 2 मिलीसेकंड के लिए बाइफेसिक पेसिंग के दौरान 1.2 हर्ट्ज़ पर 4 वोल्ट देने के लिए कॉन्फ़िगर किया गया था। माध्यम को दिन में दो बार और इलेक्ट्रोड को दिन में एक बार बदला जाता था ताकि इलेक्ट्रोड पर ग्रेफाइट जमा न हो। यदि आवश्यक हो, तो ऊतक के टुकड़ों को उनके कल्चर वेल से निकालकर उनके नीचे फंसे हवा के बुलबुले निकाले जा सकते हैं। MT उपचार स्थितियों के लिए, प्रत्येक माध्यम परिवर्तन के साथ 100 nM T3 और 1 μM Dex के साथ T3/Dex को ताजा रूप से मिलाया गया। सीटीसीएम उपकरणों को 37°C तापमान और 5% CO2 वाले इनक्यूबेटर में कल्चर किया गया।
हृदय के स्लाइसों की विस्तारित गति प्राप्त करने के लिए, एक विशेष कैमरा प्रणाली विकसित की गई। एक SLR कैमरा (Canon Rebel T7i, Canon, टोक्यो, जापान) का उपयोग Navitar Zoom 7000 18-108mm मैक्रो लेंस (Navitar, सैन फ्रांसिस्को, कैलिफ़ोर्निया) के साथ किया गया। विज़ुअलाइज़ेशन कमरे के तापमान पर, माध्यम को ताज़ा माध्यम से बदलने के बाद किया गया। कैमरे को 51° के कोण पर रखा गया और वीडियो को 30 फ्रेम प्रति सेकंड की दर से रिकॉर्ड किया गया। सबसे पहले, हृदय के स्लाइसों की गति को मापने के लिए Image-J के साथ ओपन सोर्स सॉफ़्टवेयर (MUSCLEMOTION43) का उपयोग किया गया। शोर से बचने के लिए, धड़कते हृदय के स्लाइसों के लिए रुचि के क्षेत्रों को परिभाषित करने के लिए MATLAB (MathWorks, नैटिक, मैसाचुसेट्स, यूएसए) का उपयोग करके मास्क बनाया गया। मैन्युअल रूप से सेगमेंट किए गए मास्क को एक फ्रेम अनुक्रम में सभी छवियों पर लागू किया गया और फिर MUSCLEMOTION प्लग-इन को भेजा गया। Muscle Motion प्रत्येक फ्रेम में पिक्सेल की औसत तीव्रता का उपयोग संदर्भ फ्रेम के सापेक्ष उसकी गति को मापने के लिए करता है। डेटा को रिकॉर्ड किया गया, फ़िल्टर किया गया और हृदय चक्र के दौरान चक्र समय को मापने और ऊतक खिंचाव का आकलन करने के लिए उपयोग किया गया। रिकॉर्ड किए गए वीडियो को प्रथम-क्रम शून्य-चरण डिजिटल फ़िल्टर का उपयोग करके पोस्ट-प्रोसेस किया गया। ऊतक खिंचाव (पीक-टू-पीक) को मापने के लिए, रिकॉर्ड किए गए सिग्नल में पीक और ट्रफ के बीच अंतर करने के लिए पीक-टू-पीक विश्लेषण किया गया। इसके अतिरिक्त, सिग्नल ड्रिफ्ट को समाप्त करने के लिए छठे क्रम के बहुपद का उपयोग करके डिट्रेंडिंग की गई। समग्र ऊतक गति, चक्र समय, विश्राम समय और संकुचन समय निर्धारित करने के लिए MATLAB में प्रोग्राम कोड विकसित किया गया (पूरक प्रोग्राम कोड 44)।
तनाव विश्लेषण के लिए, यांत्रिक खिंचाव आकलन के लिए बनाए गए उन्हीं वीडियो का उपयोग करते हुए, हमने सबसे पहले MUSCLEMOTION सॉफ़्टवेयर के अनुसार गति शिखरों (गति के उच्चतम (ऊपरी) और निम्नतम (निचले) बिंदुओं) को दर्शाने वाली दो छवियों का पता लगाया। फिर हमने ऊतक क्षेत्रों को खंडित किया और खंडित ऊतक पर एक प्रकार का शेडिंग एल्गोरिदम लागू किया (पूरक चित्र 2a)। खंडित ऊतक को फिर दस उप-सतहों में विभाजित किया गया, और प्रत्येक सतह पर तनाव की गणना निम्न समीकरण का उपयोग करके की गई: तनाव = (ऊपरी - निचली) / निचली, जहाँ ऊपरी और निचली क्रमशः कपड़े की ऊपरी और निचली छाया से आकृति की दूरी हैं (पूरक चित्र 2b)।
हृदय के नमूनों को 4% पैराफॉर्मेल्डिहाइड में 48 घंटे के लिए स्थिर किया गया। स्थिर किए गए ऊतकों को 10% और 20% सुक्रोज में 1 घंटे के लिए, फिर 30% सुक्रोज में रात भर के लिए निर्जलित किया गया। इसके बाद नमूनों को इष्टतम काटने के तापमान यौगिक (ओसीटी यौगिक) में एम्बेड किया गया और आइसोपेंटेन/शुष्क बर्फ के घोल में धीरे-धीरे जमाया गया। पृथक्करण तक ओसीटी एम्बेडिंग ब्लॉकों को -80°C पर संग्रहित किया गया। स्लाइड को 8 माइक्रोमीटर मोटाई के नमूनों के रूप में तैयार किया गया।
हृदय के नमूनों से OCT को हटाने के लिए, स्लाइड को हीटिंग ब्लॉक पर 95°C पर 5 मिनट तक गर्म करें। प्रत्येक स्लाइड में 1 मिलीलीटर PBS डालें और कमरे के तापमान पर 30 मिनट तक रखें। फिर, 0.1% ट्राइटन-X को PBS में घोलकर 15 मिनट तक कमरे के तापमान पर रखकर नमूनों को पारगम्य बनाएं। नमूने से गैर-विशिष्ट एंटीबॉडी को जुड़ने से रोकने के लिए, स्लाइड में 1 मिलीलीटर 3% BSA घोल डालें और कमरे के तापमान पर 1 घंटे तक रखें। इसके बाद, BSA को हटा दें और स्लाइड को PBS से धो लें। प्रत्येक नमूने पर पेंसिल से निशान लगाएं। प्राथमिक एंटीबॉडी (1% बीएसए में 1:200 के अनुपात में तनुकृत) (कनेक्सिन 43 (एबकैम; #AB11370), एनएफएटीसी4 (एबकैम; #AB99431) और ट्रोपोनिन-टी (थर्मो साइंटिफिक; #MA5-12960)) को 90 मिनट में डाला गया, फिर द्वितीयक एंटीबॉडी (1% बीएसए में 1:200 के अनुपात में तनुकृत) को माउस एलेक्सा फ्लोरो 488 (थर्मो साइंटिफिक; #A16079) और रैबिट एलेक्सा फ्लोरो 594 (थर्मो साइंटिफिक; #T6391) के विरुद्ध अतिरिक्त 90 मिनट के लिए डाला गया। पीबीएस से 3 बार धोया गया। लक्ष्य स्टेनिंग को पृष्ठभूमि से अलग करने के लिए, हमने केवल द्वितीयक एंटीबॉडी को नियंत्रण के रूप में उपयोग किया। अंत में, डीएपीआई न्यूक्लियर स्टेन डाला गया और स्लाइड्स को वेक्टाशील्ड (वेक्टर लेबोरेटरीज) में रखा गया और नेल पॉलिश से सील कर दिया गया। -x आवर्धन) और 40x आवर्धन वाले कीएन्स माइक्रोस्कोप का उपयोग किया गया।
WGA-Alexa Fluor 555 (Thermo Scientific; #W32464) को 5 μg/ml सांद्रता पर PBS में घोलकर WGA स्टेनिंग के लिए उपयोग किया गया और इसे स्थिर किए गए सेक्शन पर कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए लगाया गया। इसके बाद स्लाइड्स को PBS से धोया गया और प्रत्येक स्लाइड पर सूडान ब्लैक डाला गया और 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट किया गया। फिर स्लाइड्स को PBS से धोया गया और वेक्टाशील्ड एम्बेडिंग मीडियम डाला गया। स्लाइड्स को Keyence माइक्रोस्कोप पर 40x आवर्धन पर देखा गया।
ऊपर बताए गए तरीके से नमूनों से OCT को हटा दिया गया। OCT हटाने के बाद, स्लाइड्स को रात भर बोइन के घोल में डुबोकर रखा गया। फिर स्लाइड्स को 1 घंटे तक आसुत जल से धोया गया और उसके बाद 10 मिनट के लिए बिब्रिच एलो एसिड फ्यूसिन घोल में रखा गया। फिर स्लाइड्स को आसुत जल से धोकर 10 मिनट के लिए 5% फॉस्फोमोलीब्डेनम/5% फॉस्फोटंगस्टिक एसिड के घोल में रखा गया। बिना धोए, स्लाइड्स को सीधे 15 मिनट के लिए एनिलिन ब्लू घोल में डाल दिया गया। फिर स्लाइड्स को आसुत जल से धोकर 2 मिनट के लिए 1% एसिटिक एसिड के घोल में रखा गया। स्लाइड्स को 200 N इथेनॉल में सुखाकर जाइलीन में स्थानांतरित किया गया। रंगीन स्लाइड्स को 10x ऑब्जेक्टिव वाले कीएन्स माइक्रोस्कोप का उपयोग करके देखा गया। फाइब्रोसिस क्षेत्र प्रतिशत को कीएन्स एनालाइजर सॉफ्टवेयर का उपयोग करके मापा गया।
CyQUANT™ MTT सेल वायबिलिटी एसे (Invitrogen, Carlsbad, CA), कैटलॉग नंबर V13154, निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार कुछ संशोधनों के साथ किया गया। विशेष रूप से, MTT विश्लेषण के दौरान ऊतक के एकसमान आकार को सुनिश्चित करने के लिए 6 मिमी व्यास वाले सर्जिकल पंच का उपयोग किया गया। निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार, ऊतकों को MTT सब्सट्रेट युक्त 12-वेल प्लेट के कुओं में अलग-अलग रखा गया। सेक्शन को 37°C पर 3 घंटे के लिए इनक्यूबेट किया गया और जीवित ऊतक ने MTT सब्सट्रेट को मेटाबोलाइज़ करके एक बैंगनी फोरमाज़ान यौगिक बनाया। MTT घोल को 1 मिलीलीटर DMSO से बदलें और हृदय सेक्शन से बैंगनी फोरमाज़ान निकालने के लिए 37°C पर 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। नमूनों को 96-वेल क्लियर बॉटम प्लेट में DMSO में 1:10 के अनुपात में पतला किया गया और साइटेशन प्लेट रीडर (BioTek) का उपयोग करके 570 nm पर बैंगनी रंग की तीव्रता मापी गई। रीडिंग को हृदय के प्रत्येक स्लाइस के वजन के अनुसार सामान्यीकृत किया गया।
पहले बताए गए तरीके के अनुसार ग्लूकोज उपयोग परीक्षण के लिए हृदय स्लाइस मीडिया को 1 μCi/ml [5-3H]-ग्लूकोज (मोरावेक बायोकेमिकल्स, ब्रेआ, कैलिफोर्निया, यूएसए) युक्त मीडिया से बदल दिया गया। 4 घंटे के इनक्यूबेशन के बाद, 100 µl 0.2 N HCl युक्त एक खुली माइक्रोसेन्ट्रीफ्यूज ट्यूब में 100 µl माध्यम डालें। फिर ट्यूब को 500 ¼l dH2O युक्त एक स्किन्टिलेशन ट्यूब में रखा गया ताकि 37°C पर 72 घंटे तक [3H]2O वाष्पित हो जाए। इसके बाद माइक्रोसेन्ट्रीफ्यूज ट्यूब को स्किन्टिलेशन ट्यूब से निकालें और 10 ml स्किन्टिलेशन द्रव डालें। स्किन्टिलेशन गणना ट्राई-कार्ब 2900TR लिक्विड स्किन्टिलेशन एनालाइजर (पैकार्ड बायोसाइंस कंपनी, मेरिडेन, कनेक्टिकट, यूएसए) का उपयोग करके की गई। इसके बाद [5-3H]-ग्लूकोज की विशिष्ट गतिविधि, अपूर्ण संतुलन और पृष्ठभूमि, [5-3H]-का अचिह्नित ग्लूकोज में तनुकरण और जगमगाहट प्रतिक की दक्षता को ध्यान में रखते हुए ग्लूकोज के उपयोग की गणना की गई। डेटा को हृदय के भागों के द्रव्यमान के अनुसार सामान्यीकृत किया गया है।
ट्राइज़ोल में ऊतक समरूपीकरण के बाद, निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार कियाजेन miRNeasy माइक्रो किट #210874 का उपयोग करके हृदय के भागों से RNA को पृथक किया गया। RNAsec लाइब्रेरी की तैयारी, अनुक्रमण और डेटा विश्लेषण निम्नानुसार किया गया:
प्रत्येक नमूने से 1 माइक्रोग्राम आरएनए का उपयोग आरएनए लाइब्रेरी तैयार करने के लिए प्रारंभिक सामग्री के रूप में किया गया था। सीक्वेंसिंग लाइब्रेरी को एनईबीनेक्स्ट अल्ट्रा™ आरएनए लाइब्रेरी प्रिपरेशन किट फॉर इलुमिना (एनईबी, यूएसए) का उपयोग करके निर्माता की सिफारिशों के अनुसार तैयार किया गया था, और प्रत्येक नमूने के लिए विशेषता अनुक्रमों में इंडेक्स कोड जोड़े गए थे। संक्षेप में, पॉली-टी ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड से जुड़े चुंबकीय मोतियों का उपयोग करके कुल आरएनए से एमआरएनए को शुद्ध किया गया था। एनईबीनेक्स्ट फर्स्ट स्ट्रैंड सिंथेसिस रिएक्शन बफर (5X) में उच्च तापमान पर द्विसंयोजक धनायनों का उपयोग करके विखंडन किया गया था। रैंडम हेक्सामर प्राइमर और एम-एमयूएलवी रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेस (आरएनएज एच-) का उपयोग करके प्रथम स्ट्रैंड सीडीएनए का संश्लेषण किया गया था। इसके बाद डीएनए पॉलीमरेज I और आरनएज एच का उपयोग करके द्वितीय स्ट्रैंड सीडीएनए का संश्लेषण किया गया। शेष ओवरहैंग्स को एक्सोन्यूक्लिएज/पॉलीमरेज गतिविधि द्वारा कुंद सिरों में परिवर्तित किया गया। डीएनए खंड के 3′ सिरे के एडिनिलेशन के बाद, संकरण के लिए इसे तैयार करने हेतु इसमें हेयरपिन लूप संरचना वाला NEBNext एडेप्टर जोड़ा जाता है। 150-200 bp की पसंदीदा लंबाई के सीडीएनए खंडों के चयन के लिए, लाइब्रेरी खंडों को AMPure XP सिस्टम (बेकमैन कूल्टर, बेवर्ली, यूएसए) का उपयोग करके शुद्ध किया गया। फिर, आकार-चयनित सीडीएनए को एडेप्टर के साथ जोड़कर 3 μl USER एंजाइम (NEB, यूएसए) के साथ PCR से पहले 37°C पर 15 मिनट और फिर 95°C पर 5 मिनट के लिए प्रयोग किया गया। इसके बाद, Phusion हाई-फिडेलिटी डीएनए पॉलीमरेज़, यूनिवर्सल पीसीआर प्राइमर और इंडेक्स (X) प्राइमर का उपयोग करके पीसीआर किया गया। अंत में, पीसीआर उत्पादों को (AMPure XP सिस्टम द्वारा) शुद्ध किया गया और Agilent Bioanalyzer 2100 सिस्टम पर लाइब्रेरी की गुणवत्ता का आकलन किया गया। फिर, नोवासेक सीक्वेंसर का उपयोग करके सीडीएनए लाइब्रेरी का अनुक्रमण किया गया। इलुमिना से प्राप्त रॉ इमेज फाइलों को CASAVA बेस कॉलिंग का उपयोग करके रॉ रीड्स में परिवर्तित किया गया। रॉ डेटा को FASTQ (fq) फॉर्मेट की फाइलों में संग्रहित किया जाता है जिनमें रीड सीक्वेंस और संबंधित बेस क्वालिटी शामिल होती हैं। फ़िल्टर किए गए सीक्वेंसिंग रीड्स को Sscrofa11.1 रेफरेंस जीनोम से मिलाने के लिए HISAT2 का चयन करें। सामान्य तौर पर, HISAT2 किसी भी आकार के जीनोम को सपोर्ट करता है, जिसमें 4 बिलियन बेस से बड़े जीनोम भी शामिल हैं, और अधिकांश पैरामीटर के लिए डिफ़ॉल्ट मान निर्धारित होते हैं। RNA Seq डेटा से प्राप्त स्प्लिसिंग रीड्स को HISAT2 का उपयोग करके कुशलतापूर्वक अलाइन किया जा सकता है, जो वर्तमान में उपलब्ध सबसे तेज़ सिस्टम है, और इसकी सटीकता किसी भी अन्य विधि के समान या उससे बेहतर है।
ट्रांसक्रिप्ट की प्रचुरता सीधे जीन अभिव्यक्ति के स्तर को दर्शाती है। जीन अभिव्यक्ति के स्तर का आकलन जीनोम या एक्सॉन से जुड़े ट्रांसक्रिप्ट (अनुक्रमण गणना) की प्रचुरता द्वारा किया जाता है। रीड की संख्या जीन अभिव्यक्ति के स्तर, जीन की लंबाई और अनुक्रमण गहराई के समानुपाती होती है। FPKM (प्रति दस लाख बेस पेयर अनुक्रमित ट्रांसक्रिप्ट के प्रति हजार बेस पेयर खंड) की गणना की गई और DESeq2 पैकेज का उपयोग करके विभेदक अभिव्यक्ति के P-मान निर्धारित किए गए। इसके बाद, हमने R के अंतर्निहित फ़ंक्शन "p.adjust" के आधार पर बेनजामिनी-होचबर्ग विधि9 का उपयोग करके प्रत्येक P मान के लिए गलत खोज दर (FDR) की गणना की।
हृदय के नमूनों से पृथक किए गए RNA को थर्मो (Thermo, कैटलॉग संख्या 11756050) के सुपरस्क्रिप्ट IV विलो मास्टर मिक्स का उपयोग करके 200 ng/μl की सांद्रता पर cDNA में परिवर्तित किया गया। एप्लाइड बायोसिस्टम्स एंडुरा प्लेट माइक्रोएम्प 384-वेल पारदर्शी रिएक्शन प्लेट (Thermo, कैटलॉग संख्या 4483319) और माइक्रोएम्प ऑप्टिकल एडहेसिव (Thermo, कैटलॉग संख्या 4311971) का उपयोग करके मात्रात्मक RT-PCR किया गया। रिएक्शन मिश्रण में प्रत्येक वेल में 5 µl टैकमैन फास्ट एडवांस्ड मास्टर मिक्स (Thermo, कैटलॉग संख्या 4444557), 0.5 µl टैकमैन प्राइमर और 3.5 µl पानी मिलाया गया था। मानक qPCR चक्र चलाए गए और एप्लाइड बायोसिस्टम्स क्वांटस्टूडियो 5 रियल-टाइम PCR उपकरण (384-वेल मॉड्यूल; उत्पाद संख्या A28135) का उपयोग करके CT मान मापा गया। टैकमैन प्राइमर थर्मो से खरीदे गए थे (GAPDH (Ss03375629_u1), PARP12 (Ss06908795_m1), PKDCC (Ss06903874_m1), CYGB (Ss06900188_m1), RGL1 (Ss06868890_m1), ACTN1 (Ss01009508_mH), GATA4 (Ss03383805_u1), GJA1 (Ss03374839_u1), COL1A2 (Ss03375009_u1), COL3A1 (Ss04323794_m1), ACTA2 (Ss04245588_m1)। सभी नमूनों के CT मानों को हाउसकीपिंग जीन GAPDH के लिए सामान्यीकृत किया गया था।
एनटी-प्रोबीएनपी के मीडिया रिलीज का आकलन एनटी-प्रोबीएनपी किट (सूअर) (कैट. नं. MBS2086979, MyBioSource) का उपयोग करके निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार किया गया। संक्षेप में, प्रत्येक नमूने और मानक के 250 µl को प्रत्येक वेल में दो बार डाला गया। नमूना डालने के तुरंत बाद, प्रत्येक वेल में 50 µl एसे रिएजेंट A डालें। प्लेट को धीरे से हिलाएं और सीलेंट से सील करें। फिर गोलियों को 37°C पर 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट किया गया। इसके बाद घोल को एस्पिरेट करें और वेल्स को 350 µl 1X वॉश सॉल्यूशन से 4 बार धोएं, प्रत्येक बार वॉश सॉल्यूशन को 1-2 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। फिर प्रत्येक वेल में 100 µl एसे रिएजेंट B डालें और प्लेट सीलेंट से सील करें। गोली को धीरे से हिलाया गया और 37°C पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट किया गया। विलयन को निकाल लें और कुओं को 350 µl 1X वॉश विलयन से 5 बार धोएँ। प्रत्येक कुएं में 90 µl सबस्ट्रेट विलयन डालें और प्लेट को सील कर दें। प्लेट को 37°C पर 10-20 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। प्रत्येक कुएं में 50 µl स्टॉप विलयन डालें। प्लेट को तुरंत 450 nm पर सेट किए गए साइटेशन (बायोटेक) प्लेट रीडर का उपयोग करके मापा गया।
पैरामीटर में 10% के निरपेक्ष परिवर्तन का पता लगाने के लिए 80% से अधिक शक्ति प्रदान करने वाले समूह आकारों का चयन करने के लिए शक्ति विश्लेषण किया गया, जिसमें टाइप I त्रुटि दर 5% है। पैरामीटर में 10% के निरपेक्ष परिवर्तन का पता लगाने के लिए 80% से अधिक शक्ति प्रदान करने वाले समूह आकारों का चयन करने के लिए शक्ति विश्लेषण किया गया, जिसमें टाइप I त्रुटि दर 5% है। Анализ мощности был выполнен для выбора размеров групп, которые अधिक जानकारी >80% अतिरिक्त आय 10% अतिरिक्त आय параметра с 5% частотой ошибок типа I. समूह के आकार का चयन करने के लिए शक्ति विश्लेषण किया गया ताकि 5% टाइप I त्रुटि दर के साथ 10% निरपेक्ष पैरामीटर परिवर्तन का पता लगाने के लिए 80% से अधिक शक्ति प्रदान की जा सके।进行功效分析以选择将提供> 80% से अधिक की कीमत 10% से अधिक नहीं है और 5% से अधिक नहीं है।进行功效分析以选择将提供> 80% से अधिक की कीमत 10% से अधिक नहीं है और 5% से अधिक नहीं है। Был проведен анализ мощности для выбора размера группы, который अतिरिक्त राशि > 80% अधिक आय 10% वार्षिक आय параметров и 5% частоты ошибок типа I. एक पावर विश्लेषण किया गया ताकि एक ऐसे समूह आकार का चयन किया जा सके जो 10% निरपेक्ष पैरामीटर परिवर्तन और 5% टाइप I त्रुटि दर का पता लगाने के लिए >80% पावर प्रदान करे।प्रयोग से पहले ऊतक के नमूनों का चयन यादृच्छिक रूप से किया गया था। सभी विश्लेषण स्थिति-अंधाधुंध तरीके से किए गए और सभी डेटा का विश्लेषण हो जाने के बाद ही नमूनों को डिकोड किया गया। सभी सांख्यिकीय विश्लेषणों के लिए ग्राफपैड प्रिज्म सॉफ्टवेयर (सैन डिएगो, कैलिफोर्निया) का उपयोग किया गया। सभी सांख्यिकी के लिए, p-मान 0.05 से कम होने पर महत्वपूर्ण माने गए। सभी सांख्यिकी के लिए, p-मान 0.05 से कम होने पर महत्वपूर्ण माने गए। Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. सभी सांख्यिकी के लिए, p-मान 0.05 से कम होने पर महत्वपूर्ण माने गए।对于所有统计数据,p 值在值<0.05 时被认为是显着的。对于所有统计数据,p 值在值<0.05 时被认为是显着的。 Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. सभी सांख्यिकी के लिए, p-मान 0.05 से कम होने पर महत्वपूर्ण माने गए।केवल दो तुलनाओं वाले डेटा पर द्विपूंछित स्टूडेंट टी-परीक्षण किया गया। एकाधिक समूहों के बीच सार्थकता निर्धारित करने के लिए एकतरफ़ा या द्विपूंछ एनोवा का उपयोग किया गया। पोस्ट हॉक परीक्षण करते समय, एकाधिक तुलनाओं को ध्यान में रखने के लिए ट्यूकी सुधार लागू किया गया। आरएनएसेक डेटा के लिए एफडीआर और पी.एडजस्ट की गणना करते समय विशेष सांख्यिकीय विचारणीय बिंदु होते हैं, जैसा कि विधि अनुभाग में वर्णित है।
अध्ययन के डिजाइन के बारे में अधिक जानकारी के लिए, इस लेख से जुड़े नेचर रिसर्च रिपोर्ट के सारांश को देखें।