Misaotra anao nitsidika ny Nature.com.Ny kinova browser ampiasainao dia manana fanohanana CSS voafetra.Mba hahazoana traikefa tsara indrindra, manoro hevitra anao izahay hampiasa navigateur nohavaozina (na esory ny Compatibility Mode amin'ny Internet Explorer).Mandritra izany fotoana izany, mba hiantohana ny fanohizana ny fanohanana, dia hanolotra ny tranokala tsy misy fomba sy JavaScript izahay.
Ilaina ny rafitra in vitro azo itokisana izay afaka mamerina tsara ny tontolo ara-batana ao amin'ny fo ho an'ny fitiliana zava-mahadomelina.Ny tsy fahampian'ny rafi-kolontsain'ny vatan'olombelona dia nahatonga ny fandikana tsy marina momba ny vokatry ny zava-mahadomelina amin'ny fo.Eto izahay dia namolavola modely kolontsaina tissy kardia (CTCM) izay manentana amin'ny alàlan'ny electromechanika ny fitepon'ny fo ary mandalo fisehon'ny vatana mandritra ny dingana systolika sy diastolika amin'ny tsingerin'ny fo.Taorian'ny kolontsaina nandritra ny 12 andro, io fomba fiasa io dia nanatsara ny ampahany amin'ny fizotry ny fo, saingy tsy niaro tanteraka ny fahamarinan'ny rafitra.Noho izany, taorian'ny fitiliana molekiola kely dia hitanay fa ny fanampiana ny 100 nM triiodothyronine (T3) sy ny 1 μM dexamethasone (Dex) amin'ny medianay dia nitazona ny microstructure amin'ny fizarana mandritra ny 12 andro.Miaraka amin'ny fitsaboana T3 / Dex, ny rafitra CTCM dia nitazona ny mombamomba ny transcriptional, ny fahafaha-manao, ny hetsika metabolika, ary ny fahamendrehana ara-drafitra amin'ny ambaratonga mitovy amin'ny tavy fo vaovao mandritra ny 12 andro.Ankoatr'izay, ny fanitarana tafahoatra ny tadin'ny fo ao amin'ny kolontsaina dia miteraka famantarana hypertrophic cardiac, manome porofo ny fahafahan'ny CTCM maka tahaka ny toe-javatra hypertrophic ateraky ny fihenjanan'ny fo.Ho fehin-kevitra, ny CTCM dia afaka mamolavola ny physiologie sy ny pathophysiologie ny fo amin'ny kolontsaina mandritra ny fotoana maharitra, ahafahana mijery ny zava-mahadomelina azo antoka.
Alohan'ny fikarohana klinika, ilaina ny rafitra in vitro azo itokisana izay afaka mamerina tsara ny tontolo ara-batana ao amin'ny fon'ny olombelona.Ny rafitra toy izany dia tokony haka tahaka ny fiovan'ny mekanika, ny tahan'ny fo, ary ny toetran'ny electrophysiologique.Ny modelin'ny biby dia matetika ampiasaina ho sehatra fitiliana ho an'ny physiology cardiac izay azo itokisana voafetra amin'ny fanehoana ny vokatry ny zava-mahadomelina ao amin'ny fon'ny olombelona1,2.Amin'ny farany, ny Modely Experimental Modely Cardiac Tissue Culture Experimental Model (CTCM) dia modely izay tena saro-pady sy manokana amin'ny fitsabahana ara-pahasalamana sy pharmacological isan-karazany, mamerina amin'ny fomba marina ny physiology sy ny pathophysiology ny fon'ny olombelona3.Ny tsy fisian'ny rafitra toy izany dia mametra ny fahitana fitsaboana vaovao ho an'ny tsy fahombiazan'ny fo4,5 ary nahatonga ny cardiotoxicity zava-mahadomelina ho antony lehibe hialana amin'ny tsena6.
Tao anatin'ny folo taona lasa, fanafody valo tsy cardiovaskular no nesorina tamin'ny fampiasana klinika satria miteraka fanalavana ny elanelan'ny QT ka miteraka arrhythmia ventricular sy fahafatesana tampoka7.Noho izany, mihamitombo ny filana ny paikady fitiliana preclinical azo antoka mba hanombanana ny fahombiazan'ny fo sy ny poizina.Ny fampiasana vao haingana ny cardiomyocytes azo avy amin'ny cellules pluripotent (hiPS-CM) amin'ny fitiliana zava-mahadomelina sy ny fitiliana ny poizina dia manome vahaolana amin'ity olana ity.Na izany aza, ny toetra tsy matotra amin'ny hiPS-CMs sy ny tsy fahampian'ny fahasarotana multicellular amin'ny tavy kardia dia fetra lehibe amin'ity fomba ity.Ny fandinihana vao haingana dia naneho fa io fetra io dia azo resena amin'ny ampahany amin'ny fampiasana hiPS-CM tany am-boalohany mba hamoronana hydrogels ho an'ny ati-doha taoriana kelin'ny nanombohan'ny contractions ho azy ary mampitombo tsikelikely ny fanentanana elektrika rehefa mandeha ny fotoana.Na izany aza, ireo microtissues hiPS-CM ireo dia tsy manana ny fananana electrophysiological sy contractile matotra amin'ny myocardium olon-dehibe.Ankoatra izany, ny vatan'ny olombelona dia manana rafitra sarotra kokoa, ahitana fifangaroana heterogène amin'ny karazana sela isan-karazany, anisan'izany ny endothelial cellules, neurons, ary stromal fibroblasts, mifandray amin'ny proteinina matrix extracellular manokana.Ity heterogeneity ny mponina tsy cardiomyocyte11,12,13 ao amin'ny fo mampinono olon-dehibe dia sakana lehibe amin'ny modelin'ny sela cardiac mampiasa karazana sela tsirairay.Ireo fameperana lehibe ireo dia manantitrantitra ny maha-zava-dehibe ny fampivoarana ny fomba fikolokoloana ny tavy myocardial intact eo ambanin'ny toe-javatra ara-batana sy ara-batana.
Ny ampahany manify (300 µm) novolavolaina ao amin'ny fon'olombelona dia voaporofo fa modely tsara ho an'ny myocardium olombelona tsy misy dikany.Ity fomba ity dia manome fidirana amin'ny rafitra multicellular 3D feno mitovy amin'ny vatan'ny olombelona.Na izany aza, hatramin'ny taona 2019, ny fampiasana ny fizarana fo kolontsaina dia noferan'ny fahaveloman'ny kolontsaina fohy (24 h).Izany dia noho ny antony maromaro ao anatin'izany ny tsy fahampian'ny fihenjanana ara-batana-mekanika, ny fifandraisana amin'ny rivotra-liquid, ary ny fampiasana haino aman-jery tsotra izay tsy mahazaka ny filan'ny tadin'ny fo.Tamin'ny taona 2019, vondrona mpikaroka maromaro no naneho fa ny fampidirana ireo singa mekanika ao anatin'ny rafitra kolontsaina tavy amin'ny fo dia afaka manitatra ny fiainan'ny kolontsaina, manatsara ny fihetseham-po ary maka tahaka ny aretin'ny fo.Ny fandinihana roa kanto 17 sy 18 dia mampiseho fa misy fiantraikany tsara eo amin'ny phenotype cardiac mandritra ny kolontsaina ny fampidinana mekanika uniaxial.Na izany aza, ireo fanadihadiana ireo dia tsy nampiasa ny enta-mavesatry ny fizika-mekanika telo-dimensional amin'ny tsingerin'ny kardia, satria ny fizarana fo dia feno na amin'ny hery tensile isometrika 17 na mavesatra auxotonic linear 18.Ireo fomba fanitarana ny tavy ireo dia nahatonga ny fanafoanana ny fototarazon'ny fo maro na ny fanehoana tafahoatra ny fototarazo mifandray amin'ny valin-kafatra tsy ara-dalàna.Marihina fa Pitoulis et al.Ny 19 dia namolavola fandroana kolontsaina mihetsiketsika mihetsiketsika ho an'ny fanarenana ny tsingerin'ny fo amin'ny fampiasana tamberina transducer hery sy fihenjanana.Na dia mamela modely amin'ny tsingerina in vitro cardiac marina kokoa aza ity rafitra ity, dia mametra ny fampiharana an'io rafitra io ny fahasarotana sy ny fihenan'ny fomba.Ny laboratoaranay dia vao haingana no namolavola rafitra kolontsaina notsorina tamin'ny alàlan'ny famporisihana elektrika sy fitaovana azo ampiasaina mba hihazonana ny fahafahan'ny ampahany amin'ny kisoa sy ny fon'ny olombelona hatramin'ny 6 andro20,21.
Ao amin'ny sora-tanana amin'izao fotoana izao, dia manoritsoritra modely ara-kolontsain'ny kardia (CTCM) amin'ny fampiasana ampahany amin'ny fon'ny kisoa izay mirakitra famantarana mahatsikaiky mba hamerenana ny fizika kardia telo-dimensional sy ny fihanaky ny pathophysiologique mandritra ny tsingerin'ny fo.Ity CTCM ity dia afaka mampitombo ny fahamarinan'ny vinavinan'ny zava-mahadomelina alohan'ny klinika amin'ny ambaratonga tsy mbola tratra teo aloha amin'ny alàlan'ny fanomezana rafitra kardia midadasika lafo vidy izay maka tahaka ny physiology / pathophysiology ny fo mampinono ho an'ny fitsapana zava-mahadomelina mialoha ny klinika.
Ny famantarana mekanika hemodynamic dia mitana anjara toerana lehibe amin'ny fitazonana ny fiasan'ny cardiomyocyte in vitro 22,23,24.Ao amin'ny sora-tanana amin'izao fotoana izao, dia namolavola CTCM (sary 1a) izahay izay afaka maka tahaka ny tontolon'ny kardia olon-dehibe amin'ny alàlan'ny fanentanana elektrika sy mekanika amin'ny fatran'ny physiologique (1.2 Hz, 72 beats isa-minitra).Mba hisorohana ny fihanaky ny tavy be loatra mandritra ny diastole, dia nampiasaina ny fitaovana fanontam-pirinty 3D mba hampitomboana ny haben'ny tavy amin'ny 25% (sary 1b).Ny fandehanana elektrônika natosiky ny rafitra C-PACE dia nomanina hanomboka 100 ms alohan'ny systole amin'ny fampiasana rafitra fanangonana angon-drakitra mba hamoahana tanteraka ny tsingerin'ny fo.Ny rafitra kolontsaina tissue dia mampiasa pneumatic actuator programmable (LB Engineering, Alemana) mba hanitarana tsingerina ny fonon'ny silikônika malefaka mba hahatonga ny fanitarana ny fo ao amin'ny efitrano ambony.Ny rafitra dia mifandray amin'ny tsipika ivelany ivelany amin'ny alàlan'ny transducer fanerena, izay nahafahana nanitsy tsara ny tsindry (± 1 mmHg) sy ny fotoana (± 1 ms) (sary 1c).
a Ampifandraiso amin'ny peratra fanohanana 7 mm, aseho amin'ny loko manga, ao anatin'ny efitranon'ny kolontsainan'ny fitaovana ny fizarana tissue.Ny efitranon'ny kolontsaina dia misaraka amin'ny efitranon'ny rivotra amin'ny alàlan'ny fonon'ny silicone malefaka.Asio gasket eo anelanelan'ny efitrano tsirairay mba hisorohana ny fivoahana.Ny saron'ilay fitaovana dia misy electrodes graphite izay manome fanentanana elektrika.b Fampisehoana schematic amin'ny fitaovana tavy lehibe, peratra fitarihana ary peratra fanohanana.Apetraka eo amin'ilay fitaovana lehibe kokoa ireo tapa-damba (volontsôkôlà) miaraka amin'ny peratra mpitari-dalana napetraka ao amin'ny lavaka eo amin'ny sisiny ivelany amin'ilay fitaovana.Amin'ny fampiasana ny torolalana, apetraho tsara ny peratra fanohanana voarakotra amin'ny adhesive acrylic tissue eo ambonin'ny ampahany amin'ny tadin'ny fo.c Saripika mampiseho ny fotoana famporisihana elektrika ho toy ny fiasan'ny tsindry amin'ny efi-drivotra fehezin'ny actuator pneumatic programmable (PPD).Nisy fitaovana fanangonana angon-drakitra nampiasaina mba hampifanaraka ny fanentanana elektrika amin'ny alàlan'ny sensor fanerena.Rehefa tonga any amin'ny tokonam-baravarana napetraka ny tsindry ao amin'ny efitrano kolontsaina, dia alefa any amin'ny C-PACE-EM ny mari-pandrefesana iray mba hanentanana ny fanentanana elektrika.d Sarin'ny CTCM efatra napetraka eo amin'ny talantalana incubator.Ny fitaovana efatra dia mifandray amin'ny PPD iray amin'ny alàlan'ny circuit pneumatic, ary ampidirina ao amin'ny valve hemostatic ny sensor sensor mba hanaraha-maso ny tsindry ao amin'ny circuit pneumatic.Ny fitaovana tsirairay dia misy fizarana sela enina.
Tamin'ny alalan'ny pneumatic actuator tokana, dia afaka nifehy ny fitaovana 4 CTCM izahay, izay samy afaka mitazona fizarana 6 (sary 1d).Ao amin'ny CTCM, ny tsindry amin'ny rivotra ao amin'ny efitranon'ny rivotra dia miova ho fanerena synchronous ao amin'ny efitranon'ny fluid ary mampirisika ny fanitarana ara-batana ny fo (sary 2a sy sarimihetsika fanampiny 1).Fanombanana ny fihenjanan'ny tavy amin'ny 80 mm Hg.Art.dia nampiseho fihenjanana 25% ny fizaran'ny tavy (sary 2b).Ity halehiben'ny isan-jato ity dia naseho fa mifanaraka amin'ny halavan'ny sarcomere ara-batana 2.2-2.3 µm ho an'ny contractility fizarana cardiac mahazatra17,19,25.Ny fihetsiketsehan'ny tavy dia nodinihina tamin'ny fampiasana fakantsary manokana (sary 1 fanampiny).Ny amplitude sy ny hafainganam-pandehan'ny fihetsiketsehana (sary 2c, d) dia mifanaraka amin'ny fihenjanana mandritra ny tsingerin'ny fo sy ny fotoana mandritra ny systole sy diastole (sary 2b).Ny fihenjanana sy ny hafainganam-pandehan'ny tadin'ny cardiac nandritra ny fifandonana sy ny fialan-tsasatra dia nijanona tsy tapaka nandritra ny 12 andro tamin'ny kolontsaina (sary 2f).Mba hanombanana ny fiantraikan'ny fanentanana elektrônika amin'ny fifanarahana mandritra ny kolontsaina, dia namolavola fomba iray hamaritana ny fiovan'ny toetr'andro amin'ny alàlan'ny algorithm shading (fanampiny sary 2a, b) izahay ary afaka nanavaka ny deformity miaraka amin'ny tsy misy herinaratra elektrika.Ny ampahany amin'ny fo (sary 2f).Ao amin'ny faritra mihetsiketsika amin'ny tapaka (R6-9), ny voltase nandritra ny fanentanana elektrika dia 20% ambony noho ny tsy fisian'ny fanentanana elektrika, izay manondro ny fandraisan'anjaran'ny fanentanana elektrika amin'ny fiasan'ny contractile.
Ny soritr'aretin'ny tsindrin'ny efi-drivotra, ny fandrefesana ny fihetsehan'ny ranon-javatra, ary ny fandrefesana ny fihetsehan'ny tavy dia manamafy fa ny fanerena ao amin'ny efitrano dia manova ny tsindry ao amin'ny efitranon'ny fluid, ka miteraka hetsika mifanaraka amin'ny tadin'ny tavy.b Ny soritr'aretin'ny isan-jato mivelatra (manga) amin'ny ampahany amin'ny tavy mifanandrify amin'ny fihenjanana isan-jato (voasary).c Mifanaraka amin'ny hafainganam-pandehan'ny fandrefesana ny fihetsehan'ny silaka fo.(d) Ny dingan'ny fihetsehana mihodinkodina (tsipika manga) sy ny hafainganam-pandeha (tsipika mivolom-boasary) amin'ny ampahany amin'ny fo.e Famaritana ny vanim-potoanan'ny tsingerina (n = 19 silaka isaky ny vondrona, avy amin'ny kisoa samy hafa), ny fotoana fampihenana (n = 19 silaka isaky ny vondrona), fotoana fialan-tsasatra (n = 19 silaka isaky ny vondrona, avy amin'ny kisoa samihafa), ny fihetsehan'ny sela (n = 25).slices)/vondrona avy amin'ny kisoa isan-karazany), velocity systolic peak (n = 24(D0), 25(D12) slices/groupe avy amin'ny kisoa samihafa) ary ny taham-pialan-tsasatra ambony indrindra (n=24(D0), 25(D12) slices/groupe avy amin'ny kisoa samihafa).Ny t-test an'ny Student roa-tailed dia tsy nahitana fahasamihafana lehibe amin'ny paramètre rehetra.f Famakafakana fihenjanana misolo tena ny fizarazaran'ny tavy miaraka amin'ny (mena) sy tsy misy famporisihana elektrika (manga), faritra folo amin'ny faritra misy tavy avy amin'ny fizarana iray ihany.Ny tontonana ambany dia mampiseho ny fandrefesana ny isan-jaton'ny fahasamihafan'ny fihenjanana ao amin'ny faritra misy tavy misy sy tsy misy famporisihana elektrika amin'ny faritra folo avy amin'ny fizarana samihafa. (n = 8 slices / vondrona avy amin'ny kisoa samihafa, T-test mpianatra roa-tailed dia natao; **** p <0.0001, ** p <0.01, * p <0.05). (n = 8 slices / vondrona avy amin'ny kisoa samihafa, T-test mpianatra roa-tailed dia natao; **** p <0.0001, ** p <0.01, * p <0.05). (n = 8 срезов/группу от разных свиней, проводится двусторонний t-критерий Стьюдента; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05). (n = fizarana/vondrona 8 avy amin'ny kisoa samihafa, t-test an'ny mpianatra roa rambony; **** p <0.0001, ** p <0.01, * p <0.05). （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p < 0.0001，**p < 0.01，*p < 0.05）。 （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p < 0.0001，**p < 0.01，*p < 0.05）。 (n = 8 срезов/группу, от разных свиней, двусторонний критерий Стьюдента; ****p <0,0001, **p <0,01, *p <0,05). (n = fizarana/vondrona 8, avy amin'ny kisoa samihafa, t-test an'ny mpianatra roa rambony; **** p <0.0001, ** p <0.01, * p <0.05).Ny barana diso dia maneho ny mean ± deviation mahazatra.
Ao amin'ny rafitra kolontsaina kolontsaina biomimetika teo aloha [20, 21], dia nitazona ny fahamendrehana, ny fiasa ary ny tsy fivadihan'ny rafitry ny fo mandritra ny andro 6 izahay amin'ny fampiharana ny fanentanana elektrika sy ny fanatsarana ny firafitry ny antonony.Na izany aza, taorian'ny 10 andro dia nihena be ireo tarehimarika ireo.Hiresaka amin'ny fizarana novolavolaina tao amin'ny rafitra kolontsaina biomimetika static teo aloha 20, 21 fepetra mifehy (Ctrl) isika ary hampiasa ny fitaovana nataontsika teo aloha ho toy ny fepetra sy kolontsaina MC eo ambanin'ny fanentanana mekanika sy elektrika (CTCM).antsoina .Voalohany, nanapa-kevitra izahay fa ny fanentanana mekanika tsy misy fanentanana elektrika dia tsy ampy amin'ny fitazonana ny fahafahan'ny tavy mandritra ny 6 andro (fanampiny sary 3a, b).Mahaliana fa miaraka amin'ny fampidirana ny fanentanana ara-batana-mekanika sy elektrônika amin'ny fampiasana STCM, ny fahafahan'ny fizarana fo 12 andro dia nijanona ho toy ny ao amin'ny fizarana fo vaovao amin'ny fepetra MS, fa tsy amin'ny fepetra Ctrl, araka ny asehon'ny fanadihadiana MTT (sary 1).3a).Izany dia manondro fa ny fanentanana mekanika sy ny simulation ny tsingerin'ny fo dia afaka mitazona ny fizarana sela ho indroa mihoatra noho ny voalaza ao amin'ny rafitra kolontsaina static teo aloha.Na izany aza, ny fanombanana ny fahamendrehana ara-drafitra amin'ny fizarana sela amin'ny alàlan'ny immunolabeling ny troponin T sy ny connexin 43 dia nampiseho fa ny fanehoana connexin 43 dia avo kokoa amin'ny tavy MC amin'ny andro 12 noho ny fanaraha-maso amin'ny andro iray.Na izany aza, tsy voahazona tanteraka ny fanehoana connexin 43 sy ny fananganana Z-disc (sary 3b).Mampiasa rafitra artificial intelligence (AI) izahay mba hamaritana ny fahamendrehana ara-drafitra26, fantsona fianarana lalina mifototra amin'ny sary mifototra amin'ny troponin-T sy connexin staining43 mba hamaritana ho azy ny fahamendrehana ara-drafitra sy ny fluorescence amin'ny tadin'ny fo amin'ny resaka tanjaky ny localization.Ity fomba ity dia mampiasa Network Neural Convolutional (CNN) sy rafitra fianarana lalina mba hamaritana ny fahamendrehan'ny rafitry ny tavy kardia amin'ny fomba mandeha ho azy sy tsy miangatra, araka ny voalaza ao amin'ny reference.26. Ny sela MC dia nampiseho fitoviana ara-drafitra tsara kokoa amin'ny andro 0 raha oharina amin'ny fizarana fanaraha-maso static.Ankoatr'izay, ny fametahana trichrome an'i Masson dia nanambara ny isan-jaton'ny fibrosis ambany kokoa amin'ny fepetra MS raha oharina amin'ny fepetra mifehy ny andro 12 amin'ny kolontsaina (sary 3c).Raha ny CTCM dia nampitombo ny fahafahan'ny fizaran'ny tadin'ny fo tamin'ny andro 12 ho amin'ny ambaratonga mitovy amin'ny vatan'ny fo vaovao, dia tsy nanatsara ny fahamendrehana ara-drafitra ny fizarana fo izany.
Ny sarin'ny Bar dia mampiseho ny fampitomboana ny fahafahan'ny MTT amin'ny kolontsaina fo vaovao (D0) na kolontsaina tapa-pofo mandritra ny 12 andro na amin'ny kolontsaina static (D12 Ctrl) na amin'ny CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) slices / groupe iray; raha ampitahaina amin'ny kisoa isan-karazany ny D##0, ary 12 (D12 MC). **p <0.01 raha oharina amin'ny D12 Ctrl). Ny sarin'ny Bar dia mampiseho ny fampitomboana ny fahafahan'ny MTT amin'ny kolontsaina fo vaovao (D0) na kolontsaina tapa-pofo mandritra ny 12 andro na amin'ny kolontsaina static (D12 Ctrl) na amin'ny CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl ), 12 (D12 MC) slices/groupe iray, raha ampitahaina amin'ny kisoa isan-karazany ny D12 MC. ary **p <0.01 raha oharina amin'ny D12 Ctrl).Ny histograma dia mampiseho ny fatran'ny viability ny MTT fresh heart sections (D0) na kolontsaina fizaran'ny fo mandritra ny 12 andro amin'ny kolontsaina static (D12 control) na CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 control).), 12 (D12 MC) fizarana / vondrona;####p < 0,0001 по сравнению с D0 и **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p <0.0001 raha oharina amin'ny D0 sy **p <0.01 raha oharina amin'ny D12 Ctrl). a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切 幇(D12 MC) 12 天的MTT 活力的量化)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；与 <D0 ，与D0 ，与不切 ，与D0 ，与D0 ， ##0 .相比，**p < 0.01). a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切 猇(D12 Ctrl) 12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；与D0 相比，####p < 0.0001，与D12 Ctrl 相比，**p。)histograma mampiseho ny habetsahan'ny MTT viability ao amin'ny fo vaovao fizarana (D0) na ny fo fizarana kolontsaina nandritra ny 12 andro ao amin'ny static kolontsaina (D12 fanaraha-maso) na CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 fanaraha-maso)), 12 (D12 MC) fizarana/vondrona avy amin'ny kisoa samy hafa ANOVA;####p < 0,0001 по сравнению с D0, **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p <0.0001 raha oharina amin'ny D0, **p <0.01 raha oharina amin'ny D12 Ctrl).b Troponin-T (maitso), connexin 43 (mena) ary DAPI (manga) ao amin'ny fizarana fo vao mitoka-monina (D0) na ny fizaran'ny fo kolontsaina amin'ny toe-javatra static (Ctrl) na ny fepetra CTCM (MC) mandritra ny 12 andro) amin'ny sarin'ny immunofluorescence solontena (blank scale = 100 µm). Famaritana ny faharanitan-tsaina artifisialy momba ny fahamendrehana ara-drafitra ao amin'ny fo (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) slices / vondrona tsirairay avy amin'ny kisoa samihafa, ny fitsapana ANOVA tokana dia atao; #### p <0.0001 raha oharina amin'ny D0 sy **** p <0.0001 raha oharina amin'ny D12 Ctrl). Ny fatran'ny faharanitan-tsaina artifisialy momba ny fahamendrehana ara-drafitra ao amin'ny fo (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) slices / vondrona tsirairay avy amin'ny kisoa samihafa, ny fitsapana ANOVA tokana dia atao; #### p <0.0001 raha oharina amin'ny D0 sy **** p <0.0001 raha oharina amin'ny D12 Ctrl). Количественная оценка структурной целостности сердечной тпкани искусственным интеллектом (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl2), 7 (D12 Ctrl2), 7 (D12 Ctrl2) зных свиней, проводится однофакторный тест ANOVA; ####p < 0,0001 по сравнению с D0 и ****p < 0,0001 по сравнению Ctrlс D12). Famaritana ny fahamendrehana ara-drafitra ny tavy kardia amin'ny alàlan'ny faharanitan-tsaina (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) fizarana / vondrona avy amin'ny kisoa samihafa, fitsapana ANOVA tokana natao; #### p <0.0001 vs. miaraka amin'ny D0 sy ****p <0.0001 raha oharina amin'ny D012 Ctrl).人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) silaka/vondrona tsirairay avy amin'ny kisoa isan-karazany, fitsapana ANOVA amin'ny lalana iray;####00 < 玸0##p01 ，0.****p01 ，0.****p01 ，0. 001 与D12 Ctrl 相比）.人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) silaka/vondrona isaky ny kisoa isan-karazany, andrana ANOVA lalana iray;##p0 < 0.0. 001 与D12 Ctrl 相比）. Искусственный интеллект для количественной оценки структурной целостности сердечной ткани (n = 7 (D0), срl2 (D12) Ctrl (D0), Ctrl2 (D12) у каждой из разных свиней, односторонний тест ANOVA; ####p <0,0001 vs. D0 Для сравнения ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). Ny faharanitan-tsaina artifisialy mba hamaritana ny fahamendrehana ara-drafitra amin'ny tadin'ny fo (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) fizarana / vondrona tsirairay amin'ny kisoa samihafa, fitsapana ANOVA tokana; #### p<0.0001 vs .D0 Ho fampitahana ****p <0.0001 Ctrl raha oharina amin'ny D). c Sary misolo tena (ankavia) sy famaritana (ankavanana) ho an'ny silaka fo voaloto amin'ny tasy trichrome an'i Masson (Scale bare = 500 µm) (n = 10 slices/groupe tsirairay avy amin'ny kisoa samy hafa, natao ny fitsapana ANOVA tokana; ####p <0.0001 raha oharina amin'ny D0 sy ***p <0.0001 raha oharina amin'ny D0 sy ***p <0.0001 C raha ampitahaina amin'ny D0 sy ***p <0.000). c Sary misolo tena (ankavia) sy ny famaritana (ankavanana) ho an'ny silaka fo voaloto amin'ny tasy trichrome an'i Masson (Scale bare = 500 µm) (n = 10 slices/groupe tsirairay avy amin'ny kisoa samihafa, natao ny fitsapana ANOVA tokana; #### p <0.0001 raha oharina amin'ny D0 sy ***ptr <0.0. c Репрезентативные изображения (слева) и количественная оценка (справа) срезов сердца, ary ытия = 500 мкм) (n = 10 срезов/группу от разных свиней, выполняется односторонний тест ANOVA; #### p < 0,0001 по синей, выполняется односторонний тест ANOVA; нию с D12 Ctrl). c Sarin'ny solontena (ankavia) sy ny fampitomboana (ankavanana) ny fizarana fo voaloto amin'ny tadin'ny trichrome an'i Masson (skala tsy misy loko = 500 µm) (n = fizarana 10 / vondrona avy amin'ny kisoa samihafa, fitsapana ANOVA tokana natao; #### p <0 .0001 raha oharina amin'ny D0 sy ***p <0.001 raha oharina amin'ny D0.0001). c 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像（左）和量化（右）（裸尺度 （裸尺度 （裸尺度 （裸尺度 （右（ 代 5 度片/组，每组来自不同的猪，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0.0001 与D0 相比，）p < 0.001 与D1 。 C 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 （左 左） 量化 （右） 裸尺度 裸尺度 裸尺度 裸度500 µm） （n = 10 个 切片 组 每 组 来自 不同 猪 ， 进行 单向 单向 单向 Anova 测##00； 中测0；一0##0；0.## p < 0.001 与 D12 Ctrl 相比）。 c Репрезентативные изображения (слева) и количественный анализ (справа) срезов сердца, окрашенных трихромным красител 5 мкм) (n = 10 срезов/группа, каждый от другой свиньи, протестировано с помощью однофакторного дисперсио;#0,0 заго; нению с D0, ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Sarin'ny solontena (ankavia) sy ny fatra (ankavanana) ny fizaran'ny fo voaloto amin'ny tasy trichrome an'i Masson (blank = 500 µm) (n = fizarana 10/vondrona, samy avy amin'ny kisoa hafa, notsapaina tamin'ny famakafakana fomba iray ny variance ;### # p <0.0001 raha oharina amin'ny D0, ***ptr <0.1).Ny barana diso dia maneho ny mean ± deviation mahazatra.
Noheverinay fa amin'ny fampidirana molekiola kely amin'ny kolontsaina, dia azo hatsaraina ny fahamendrehan'ny cardiomyocyte ary mihena ny fivoaran'ny fibrosis mandritra ny kolontsaina CTCM.Noho izany dia nijery molekiola kely izahay tamin'ny fampiasana ny kolontsaina fanaraha-maso static20,21 noho ny fahavitsian'ny anton-javatra mampikorontana.Dexamethasone (Dex), triiodothyronine (T3), ary SB431542 (SB) no nofidina ho an'ity efijery ity.Ireo molekiola kely ireo dia efa nampiasaina taloha tao amin'ny kolontsaina hiPSC-CM mba hamporisihana ny fahamatorana ny cardiomyocytes amin'ny alàlan'ny fampitomboana ny halavan'ny sarcomere, ny T-tubules, ary ny hafainganam-pandehan'ny conduction.Ankoatr'izay, ny Dex (glukokortikoid) sy ny SB dia fantatra fa manafoana ny areti-maso29,30.Noho izany, nozahanay raha mety hanatsara ny firafitry ny fizaran'ny fo ny fampidirana iray na fitambaran'ireo molekiola kely ireo.Ho an'ny fitiliana voalohany, ny fatran'ny fitambarana tsirairay dia nofantenana mifototra amin'ny fifantohana matetika ampiasaina amin'ny modely kolontsaina sela (1 μM Dex27, 100 nM T327, ary 2.5 μM SB31).Taorian'ny kolontsaina 12 andro, ny fitambaran'ny T3 sy Dex dia nahatonga ny fahamendrehana ara-drafitra kardiomyocyte tsara indrindra ary ny fanavaozana fibrous kely indrindra (sary fanampiny 4 sy 5).Ankoatr'izay, ny fampiasana avo roa heny na avo roa heny amin'ny T3 sy Dex dia niteraka fiantraikany ratsy raha oharina amin'ny fifantohana ara-dalàna (Fig. 6a, b fanampiny).
Taorian'ny fizahana voalohany, dia nanao fampitahana amin'ny loha-doha amin'ny fepetran'ny kolontsaina 4 izahay (sary 4a): Ctrl: fizaràn'ny fo voavolavola ao amin'ny kolontsaina static voalaza teo aloha amin'ny alàlan'ny fitaovana optimized;20.21 TD: T3 sy Ctrl s Added Dex ny alarobia;MC: fizarana fo novolavolaina tamin'ny CTCM tamin'ny alàlan'ny fitaovana nataontsika teo aloha;ary MT: CTCM miaraka amin'ny T3 sy Dex ampiana amin'ny fitaovana.Taorian'ny 12 andro nambolena, ny fahafahan'ny tavy MS sy MT dia nitovy tamin'ny tavy vaovao voatomban'ny MTT assay (sary 4b).Mahaliana fa ny fampidirana T3 sy Dex amin'ny kolontsaina transwell (TD) dia tsy niteraka fanatsarana lehibe amin'ny fahavitrihana raha oharina amin'ny fepetra Ctrl, izay manondro ny anjara toerana lehibe amin'ny fanentanana mekanika amin'ny fitazonana ny fahafahan'ny fizarana fo.
kisary famolavolana andrana mampiseho ireo fepetra kolontsaina efatra ampiasaina hanombanana ny vokatry ny fanentanana mekanika sy ny famenoana T3/Dex amin'ny antonony mandritra ny 12 andro. b Bar dia mampiseho ny habetsahan'ny viability 12 andro aorian'ny kolontsaina amin'ny toe-piainana 4 rehetra (Ctrl, TD, MC, ary MT) raha oharina amin'ny fo vaovao slices (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD ary D12 MT), 12 (D12 MC) slices / ###0, 12 (D12 MC) slices / ###0 OVA, ###0 ; p <0.001 raha oharina amin'ny D0 sy **p <0.01 raha oharina amin'ny D12 Ctrl). b Bar dia mampiseho ny habetsahan'ny viability 12 andro aorian'ny kolontsaina amin'ny toe-piainana 4 rehetra (Ctrl, TD, MC, ary MT) raha oharina amin'ny fo vaovao slices (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD ary D12 MT), 12 (D12 MC) slices / ###0, 12 (D12 MC) slices / ###0 OVA, ###0 ; p <0.001 raha oharina amin'ny D0 sy **p <0.01 raha oharina amin'ny D12 ctrl). b Гистограма показывает количественую оценку жизнеспособности через 12 дней после культивирования ao amin'ny toko faha-4 роль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD и D12 MT), 12 (D12 MC) усвра (D12 MC) й, проводится односторонний тест ANOVA; ####p < 0,0001, ##p < 0,001 по сравнению с D0 и **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). b Ny tabilao bar dia mampiseho ny fatran'ny viability amin'ny 12 andro aorian'ny kolontsaina amin'ny fepetra kolontsaina 4 rehetra (fifehezana, TD, MC, ary MT) raha ampitahaina amin'ny fizarana fo vaovao (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD, ary D12 MT), 12 (D12 MC, MC, ary MT) raha ampitahaina amin'ny fizarana fo vaovao (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD, ary D12 MT) p <0.001 vs. D0 sy **p <0.01 raha ampitahaina amin'ny D12 Ctrl). b 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) (n = 18 (Dl5) 、 TD 18 (D0) 、 12 MT)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；####p < 0.0001，##p < 0.001 与与 D0 ， D0 ， D0 . ）.b 4 12 (D12 MC) b Гистограмма, показывающая все 4 условия культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими (сежими (сердирования (контроль, TD, MC и MT)) по сравнению со свежими (сердими (сердирования (контроль, TD, MC и MT)) по сравнению со свежими (сердими (сердими) (сердими) (сердими (сердин) = 1 (1 D) 12 Ctrl, D12 TD ary D12 MT), avy amin'ny разных свиней 12 (D12 MC) срезы/группа, односторонний тест ANOVA; внению с контролем D12). b Histograma mampiseho ny fepetran'ny kolontsaina 4 (fifehezana, TD, MC ary MT) raha oharina amin'ny fizarana fo vaovao (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD ary D12 MT), avy amin'ny kisoa samihafa 12 (D12 MC) fizarana / vondrona, fitsapana ANOVA tokana; ##0<0,0. 1 vs. fanaraha-maso D12). c Bar graph dia mampiseho ny habetsahan'ny glucose flux 12 andro aorian'ny kolontsaina amin'ny toe-piainana 4 rehetra (Ctrl, TD, MC, ary MT) raha ampitahaina amin'ny slices fo vaovao (D0) (n = 6 slices / vondrona avy amin'ny kisoa samihafa, ny fitsapana ANOVA tokana dia atao; ###p <0.001, raha oharina amin'ny D0 sy *** p <0.001 raha oharina amin'ny D1 Ctrl). c Bar graph dia mampiseho ny habetsahan'ny glucose flux 12 andro aorian'ny kolontsaina amin'ny toe-piainana 4 rehetra (Ctrl, TD, MC, ary MT) raha ampitahaina amin'ny slices fo vaovao (D0) (n = 6 slices / vondrona avy amin'ny kisoa samihafa, ny fitsapana ANOVA tokana dia atao; ###p <0.001, raha oharina amin'ny D0 sy *** p <0.001 raha oharina amin'ny D1 Ctrl). c Гистограма показывает количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после культивирования во всех 4 тролух ь, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 6 срезов/группу от разных свиней, одностотялнин, одностоялнин 0 по сравнению с D0 и ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Histograma mampiseho ny habetsahan'ny glucose flux 12 andro aorian'ny kolontsaina eo ambanin'ny fepetra kolontsaina 4 rehetra (fifehezana, TD, MC ary MT) raha ampitahaina amin'ny fizarana fo vaovao (D0) (n = fizarana 6 / vondrona avy amin'ny kisoa samihafa, fitsapana ANOVA tokana natao; ###p <0.001 raha oharina amin'ny D0 sy *** p <0.001 Ctrl raha oharina amin'ny D1). c 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) 相比 的吹城通量定量（n = 6 片/组，来自不同猪，单向执行ANOVA 测试；###p < 0.001，与D0 相比， 0）p1 。 C 条形图 显示 所有 4 种 条件 （（ctrl 、 td 、 mc 和 mt） 新鲜 心脏 切片 切片 ， 切片后 后 12 天 的 通量 定量 （n = 6 片/组 ， 来自 猪 ， ， ， ， ， ， ， ， 猪 猪单向执 猪单向执行向0.相比，***p < 0.001 与D12 Ctrl 相比）。 c Гистограма, показывающая количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после культивирования для вселько для нтроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 6 срезов/группа, avy amin'ny разных свежими срезами сердца (D0) (n = 6 срезов/группа, avy amin'ny разных свиней, терностровительный стород; ##p < 0,001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению с D12 (контроль). c Histograma mampiseho ny habetsahan'ny glucose flux amin'ny andro 12 post-culture ho an'ny fepetra kolontsaina 4 (fifehezana, TD, MC, ary MT) raha ampitahaina amin'ny fizarana fo vaovao (D0) (n = 6 fizarana / vondrona, avy amin'ny kisoa samihafa, unilateral dia natao ny fitsapana ANOVA, ###p <0.001 raha oharina amin'ny D0, *** p <0.001 raha oharina amin'ny D0, *** p <0.d Famakafakana fanindroany ny tavy vaovao (manga), andro 12 MC (maitso), ary andro 12 MT (mena) amin'ny teboka folo eo amin'ny faritra (n = 4 slices / vondrona, fitsapana ANOVA tokana; tsy misy fahasamihafana lehibe eo amin'ny vondrona).e Tetika volkano mampiseho fototarazo miavaka amin'ny fizarana fo vaovao (D0) raha ampitahaina amin'ny fizaran'ny fo voavoly ao anatin'ny toe-javatra static (Ctrl) na ao anatin'ny fepetra MT (MT) mandritra ny 10-12 andro.f Sarintanin'ny fototarazo sarcomere ho an'ny fizaran'ny fo voavoly ao anatin'ny fepetran'ny kolontsaina tsirairay.Ny barana diso dia maneho ny mean ± deviation mahazatra.
Ny fiankinan-doha amin'ny metabolika amin'ny fifindran'ny asidra matavy mankany amin'ny glycolysis dia mariky ny tsy fitoviana amin'ny cardiomyocyte.Ny cardiomyocytes tsy matotra dia mampiasa glucose amin'ny famokarana ATP ary manana mitochondria hypoplastic miaraka amin'ny cristae5,32 vitsy.Ny famakafakana ny fampiasana glucose dia nampiseho fa eo ambanin'ny fepetra MC sy MT, ny fampiasana glucose dia mitovy amin'ny an'ny andro 0 tissues (sary 4c).Na izany aza, ny santionany Ctrl dia nampiseho fitomboana lehibe amin'ny fampiasana glucose raha oharina amin'ny tavy vaovao.Izany dia manondro fa ny fitambaran'ny CTCM sy T3 / Dex dia manatsara ny fahafahan'ny sela ary mitahiry ny phenotype metabolika amin'ny fizarana fo kolontsaina 12 andro.Fanampin'izany, ny fanadihadiana momba ny tebiteby dia naneho fa ny haavon'ny tebiteby dia nitovy tamin'ny taolam-pon'ny fo vaovao nandritra ny 12 andro teo ambanin'ny fepetra MT sy MS (sary 4d).
Mba handinihana ny fiantraikan'ny CTCM sy T3 / Dex amin'ny tontolon'ny transcriptional maneran-tany amin'ny tadin'ny kardia, dia nanao RNAseq izahay tamin'ny tadin'ny fo avy amin'ny fepetra kolontsaina efatra samihafa (Data fanampiny 1).Mahaliana fa ny fizarana MT dia naneho fitoviana ambony amin'ny transcriptional amin'ny tavy fo vaovao, ary 16 ihany no aseho amin'ny fototarazo 13,642.Na izany aza, araka ny nasehontsika teo aloha, ny tsipika Ctrl dia naneho fototarazo 1229 tsy mitovy amin'ny kolontsaina taorian'ny andro 10-12 tao amin'ny kolontsaina (sary 4e).Ireo angon-drakitra ireo dia nohamafisin'ny qRT-PCR ny fototarazo fo sy fibroblast (fanampiny sary 7a-c).Mahaliana fa ny fizarana Ctrl dia nampiseho ny fihenan'ny fototarazony kardia sy sela ary ny fampahavitrihana ny programa fototarazo mamaivay.Ireo angon-drakitra ireo dia manoro hevitra fa ny dedifferentiation, izay mitranga matetika aorian'ny kolontsaina maharitra, dia mihena tanteraka amin'ny fepetra MT (Fig. 8a, b fanampiny).Ny fandinihana amim-pitandremana ny fototarazo sarcomere dia nampiseho fa ao anatin'ny fepetra MT ihany no voatahiry ny fototarazo manodidin'ny sarcomere (sary 4f) sy ny fantsona ion (sary fanampiny 9), miaro azy ireo amin'ny fanafoanana eo ambanin'ny fepetra Ctrl, TD, ary MC.Ireo angon-drakitra ireo dia mampiseho fa miaraka amin'ny fampifangaroana ny fanentanana mekanika sy humoral (T3 / Dex), ny transcriptome heart slice dia mety hitoetra mitovy amin'ny tapa-pofo vaovao aorian'ny 12 andro amin'ny kolontsaina.
Ireo fikarohana transcriptional ireo dia tohanan'ny zava-misy fa ny fahamendrehana ara-drafitra ny cardiomyocytes amin'ny fizarana fo dia voatahiry tsara indrindra amin'ny fepetra MT mandritra ny 12 andro, araka ny asehon'ny connexin 43 tsy misy dikany sy eo an-toerana (sary 5a).Ankoatra izany, ny fibrosis ao amin'ny fizarana fo eo ambanin'ny fepetra MT dia nihena be raha oharina amin'ny Ctrl ary mitovy amin'ny fizarana fo vaovao (sary 5b).Ireo angon-drakitra ireo dia mampiseho fa ny fampifangaroana ny fanentanana mekanika sy ny fitsaboana T3 / Dex dia mitahiry tsara ny rafitry ny fo ao amin'ny fizarana fo amin'ny kolontsaina.
Sarin'ny immunofluorescence solontenan'ny troponin-T (maitso), connexin 43 (mena), ary DAPI (manga) ao amin'ny fizarana fo vao mitoka-monina (D0) na kolontsaina mandritra ny 12 andro amin'ny toe-piainana kolontsaina efatra (scale bar = 100 µm).). Famaritana ny faharanitan-tsaina artifisialy momba ny fahamendrehana ara-drafitra ao amin'ny fo (n = 7 (D0 sy D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC ary D12 MT) slices / vondrona avy amin'ny kisoa samihafa, ny fitsapana ANOVA tokana dia atao; ####p <0.0001 raha oharina amin'ny D0 sy *p <0.0005, na D0. Famaritana ny faharanitan-tsaina artifisialy momba ny fahamendrehana ara-drafitra ao amin'ny fo (n = 7 (D0 sy D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC ary D12 MT) slices / vondrona avy amin'ny kisoa samihafa, ny fitsapana ANOVA tokana dia atao; #### p <0.0001 raha oharina amin'ny D0 sy *p <0.0005, na D0. Количественная оценка структурной целостности ткани сердца с помощью искусственного интеллекта (n = 7 (D0 и 2 MC), D12 MC (D0 2 D12) срезов/группу от разных свиней, проведен однофакторный тест ANOVA; 2 Ctrl). Famaritana ny fahamendrehana ara-drafitra amin'ny vatan'ny fo amin'ny fampiasana faharanitan-tsaina artifisialy (n = 7 (D0 sy D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC ary D12 MT) fizarana / vondrona avy amin'ny kisoa samihafa, fitsapana ANOVA tokana natao; #### p <0.0001 raha ampitahaina amin'ny D0 sy *p <0.000 tr <1.000 na ny D0 sy *p <**** p <0.005.对不同猪的心脏组织结构完整性（n = 7（D0 和D12 Ctrl）、5（D12 TD、D12 MC 和人/廇至）智能量化，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0.0001 与D0 和*p < 0.05 相比，或****p < 0.0001 与缛毀 D12 Ctr.对 不同 猪 的 心脏 结构 完整性 （n = 7 （d0 和 d12 ctrl） （5 （d12 td 、 d12 mc 癄和 d1量 化 进行 单向 单向 单向 测试 ； ########## p < 0,0001 与D0 和*p < 0,05 相比，或****p < 0.Famaritana ny fahamendrehana ara-drafitra ny tavy kardia amin'ny fampiasana faharanitan-tsaina amin'ny kisoa samihafa (n = 7 (D0 sy D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC ary D12 MT) fizarana / vondrona) miaraka amin'ny fitsapana ANOVA tokana;#### p < 0,0001 по сравнению с D0 и *p < 0,05 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). #### p <0.0001 raha oharina amin'ny D0 sy *p <0.05 na ****p <0.0001 raha oharina amin'ny D12 Ctrl). b Sary maneho sy famaritana ho an'ny silaka fo voaloto amin'ny tasy trichrome an'i Masson (Scale bar = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD, ary D12 MC), 9 (D12 MT) silaka/vondrona avy amin'ny kisoa samihafa, atao amin'ny alàlan'ny ##0##0 <0 p <0 p <0. 1, na ****p <0.0001 raha oharina amin'ny D12 Ctrl). b Sary maneho sy famaritana ho an'ny silaka fo voaloto amin'ny tasy trichrome an'i Masson (Scale bar = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD, ary D12 MC), 9 (D12 MT) silaka/vondrona avy amin'ny kisoa samihafa, atao amin'ny alàlan'ny ##0##0 <0 p <0 p <0. 1, na ****p <0.0001 raha oharina amin'ny D12 Ctrl). b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромным красителем Массона (массона 5) = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD и D12 MC), 9 (D12 MT) срезов/группу от разных свиней, выполняется односторонний теp01 ,## расский теp ANOVA 0,##0; ***p < 0,001 na ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). b Sary maneho sy fandrefesana ny fizaran'ny fo voaloto amin'ny tasy trichrome an'i Masson (baro mizana = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD ary D12 MC), fizarana/vondrona 9 (D12 MT) avy amin'ny kisoa samihafa, natao <1p 0. p <0.0001 vs. D12 Ctrl). b 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像和量化（比例尺= 500 µm）！D = 10）（n = 10（D 10（D 10） D12 MC），来自不同猪的9 个（D12 MT）切片/组，进行单因素方差分析；##****##p < 0.0001 ，*p*p ​​< 0.0001 ，*p*** 0.0001 与D12 Ctrl 相比）. b 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 和 量化 （比例 尺 尺 尺 尺 = 500 µm） ） ） ） ） 、 d12 td 和 d12 mc） 来自 不同 的 9 个 d12 mt 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片/组，进行单因素方差分析；####p < 0.0001 ， 曾001， 盠方差分析；####p < 0.0001 ， 更 0.001 ， 盠001， 盠方差分析；####p < . ****p < 0.0001 与 D12 Ctrl 相比）。 b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромом Массона (масштабная = лим50) 2 Ctrl, D12 TD ary D12 MC), 9 (D12 MT) срезов от разных свиней / группы, один- способ ANOVA; по сравнению с D12 Ctrl). b Sarin'ny solontena sy ny fanombanana ny fizaran'ny fo voaloto amin'ny trichrome an'i Masson (baro mizana = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD ary D12 MC), fizarana 9 (D12 MT) avy amin'ny kisoa / vondrona samihafa, fomba ANOVA iray; ####p <0. .0001 raha oharina amin'ny D12 Ctrl).Ny barana diso dia maneho ny mean ± deviation mahazatra.
Farany, ny fahafahan'ny CTCM maka tahaka ny hypertrophy kardia dia nodinihina tamin'ny fampitomboana ny tadin'ny fo.Ao amin'ny CTCM, ny tosidra ambony indrindra amin'ny efitranon'ny rivotra dia nitombo avy amin'ny 80 mmHg ka hatramin'ny 80 mmHg.Art.(fihenjanana ara-dalàna) hatramin'ny 140 mmHg Art.(sary 6a).Izany dia mifanitsy amin'ny fitomboan'ny 32% amin'ny fihenjanana (sary 6b), izay naseho teo aloha ho toy ny taham-pahavitrihana mifanaraka amin'izany ilaina amin'ny fizarana fo mba hahatratrarana ny halavan'ny sarcomere mitovy amin'ny hita amin'ny hypertrophy.Ny fihenjanana sy ny hafainganam-pandehan'ny tadin'ny cardiac nandritra ny fifandonana sy ny fialan-tsasatra dia nijanona tsy tapaka nandritra ny enina andro kolontsaina (sary 6c).Ny tadin'ny kardia avy amin'ny fepetra MT dia niharan'ny fihenjanana ara-dalàna (MT (Normal)) na ny fepetra tafahoatra (MT (OS)) nandritra ny enina andro.Efa taorian'ny efatra andro tao amin'ny kolontsaina, ny biomarker hypertrophic NT-ProBNP dia nitombo be tao amin'ny medium eo ambanin'ny fepetra MT (OS) raha oharina amin'ny fepetra MT (ara-dalàna) (sary 7a).Ankoatr'izay, taorian'ny enina andro nanaovana kolontsaina, dia nitombo be ny haben'ny sela ao amin'ny MT (OS) (sary 7b) raha oharina amin'ny ampahany amin'ny fo MT (ara-dalàna).Ankoatr'izay, ny translocation nokleary NFATC4 dia nitombo be tamin'ny tavy tafahoatra (sary 7c).Ireo vokatra ireo dia mampiseho ny fivoarana miandalana amin'ny fanavaozana ny pathological taorian'ny hyperdistension ary manohana ny hevitra fa ny fitaovana CTCM dia azo ampiasaina ho sehatra hianarana ny famantarana hypertrophy cardiac induced.
Ny soritr'aretin'ny tsindrin'ny efi-drivotra, ny fandrefesana ny fihetsehan'ny tavy, ary ny fandrefesana ny fihetsehan'ny tavy dia manamafy fa ny tsindry ao amin'ny efi-trano dia manova ny tsindry ao amin'ny efitranon'ny fluid, ka miteraka fihetsehana mifanaraka amin'ilay silaka.b Misolo tena ny isan-jaton'ny fihintsiana sy ny fiolahana mivelatra ho an'ny faritra mivelatra (voankazo) sy mivelatra be (manga).c Sarin'ny bar mampiseho ny fotoana tsingerina (n = 19 slices isaky ny vondrona, avy amin'ny kisoa samihafa), ny fotoana contraction (n = 18-19 slices isaky ny vondrona, avy amin'ny kisoa samy hafa), fotoana fialan-tsasatra (n = 19 slices isaky ny vondrona, avy amin'ny kisoa samihafa) ), ny amplitude ny tissue hetsika (n = 14 slices/groupe, avy amin'ny kisoa isan-karazany), peak systolic 1 taham-pamokarana n = 14 (D0), 15 (D6) ) fizarana / vondrona) avy amin'ny kisoa samihafa), ny t-test an'ny mpianatra roa-tailed dia tsy nahitana fahasamihafana lehibe amin'ny paramètre rehetra, izay manondro fa ireo mari-pamantarana ireo dia nijanona tsy tapaka nandritra ny 6 andro kolontsaina miaraka amin'ny overvoltage.Ny barana diso dia maneho ny mean ± deviation mahazatra.
a Bar graph quantification of NT-ProBNP concentration in culture media from heart slices culted under MT normal stretch (Norm) na overstretching (OS) fepetra (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, ary D4 MTOS) slices / groupe avy amin'ny kisoa samihafa, ANOVA roa-dalana dia atao; ** p <0.01 a Bar graph quantification of NT-ProBNP concentration in culture media from heart slices culted under MT normal stretch (Norm) na overstretching (OS) fepetra (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, ary D4 MTOS) slices/groups avy amin'ny kisoa samy hafa, ANOVA roa-dalana dia atao; **p <0.01 raha oharina amin'ny ara-dalàna.Histograma quantitative amin'ny fifantohana NT-ProBNP amin'ny media kolontsaina avy amin'ny ati-doha voavoly ao anatin'ny fepetra ara-dalàna MT (norme) na overstretch (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, ary D4) .**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p <0.01 raha ampitahaina amin'ny fihenjanana mahazatra). a 在MT 正常拉伸(Norm) 或过度拉伸(OS) 条件下培养的心脏切片培养基中NT-ProBNP 浓度的浓度的心脏切片培养基中NT-ProBNP 浓度的2 Norm)、3（D2 MTOS、D4 MTNorm 和D4 MTOS）来自不同猪的切片/组，进行双向方差分析；**与正弛**与正帯与与正弛 Famaritana ny fatran'ny NT-ProBNP ao amin'ny tapa-pony voavolavola ao anatin'ny fepetra MT normal (Norm) na overstretch (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm和D4 MTOS) avy amin'ny 猪的切片/组，可以双可可受可受受受受受年; , p <0.01).histogram Famaritana ny fatran'ny NT-ProBNP ao amin'ny sôkôla ao amin'ny fo voavoly amin'ny fepetra ara-dalàna MT (norma) na overstretch (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm) ary D4 MTOS) slices / vondrona avy amin'ny kisoa samihafa, fanadihadiana roa momba ny variana;**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p <0.01 raha ampitahaina amin'ny fihenjanana mahazatra). b Sarin'ny solontena ho an'ny atiny fo voaloto amin'ny troponin-T sy WGA (ankavia) ary ny haben'ny sela (ankavanana) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) sela / vondrona avy amin'ny 10 samihafa avy amin'ny kisoa samihafa, T-test mpianatra roa-tailed dia atao; **** p <0.0001 raha oharina amin'ny ara-dalàna). b Sarin'ny solontena ho an'ny tsipìka fo voaloto amin'ny troponin-T sy WGA (ankavia) ary ny haben'ny sela (ankavanana) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) sela / vondrona avy amin'ny 10 samihafa avy amin'ny kisoa samihafa, T-test mpianatra roa-tailed dia atao; ****p <0.0001 raha oharina amin'ny ara-dalàna). b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слева) и количественного опредрак (слева) и количественного опредрак 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) клеток/группу из 10 разных срезов от разных свиней, два- проводится хвостовой срезов от разных свиней, два- проводится хвостовой t-крид **** ; сравнению с нормальным растяжением). b Sarin'ny solontenan'ny fizarana fo voaloto amin'ny troponin-T sy AZP (ankavia) ary ny haben'ny sela (ankavanana) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) sela / vondrona avy amin'ny fizarana 10 samihafa avy amin'ny kisoa samy hafa, natao ny t-test an'ny mpianatra roa-tailed; ****p <0.001 raha oharina amin'ny tebiteby mahazatra). b 用肌钙蛋白-T 和WGA（左）和细胞大小量化（右）染色的心脏切片的代表性（小量化（右）染色的心脏切片的代表性（（3图图片自不同猪的10 个不同切片的369（D6 MTNorm）细胞/组，两进行有尾学生t 检验；与曉天0. ）. b Sarin'ny sarin'ny silaka fo voaloto amin'ny calcarein-T sy WGA (ankavia) ary ny haben'ny sela (ankavanana) (n = 330 (D6 MTOS), 369 avy amin'ny silaka 10 samihafa (D6 MTNorm)) Cells/组，两方法有尾学生t test ；0 normal. b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слева) и количественная оцленная оцленка (слет3к) 6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) из 10 различных срезов от разных свиней Клетки/группа, двусторонние критерий Стьюдента 0, ****00 льным растяжением). b Sarin'ny solontenan'ny fizaran'ny fo voaloto amin'ny troponin-T sy AZP (ankavia) ary ny haben'ny sela (ankavanana) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) avy amin'ny fizarana 10 samihafa avy amin'ny kisoa samihafa) Cells / groupe, criterion roa-tailed Student's t;****p <0,0001 raha ampitahaina amin'ny tebiteby mahazatra). c Sary solontena ho an'ny andro 0 sy andro 6 MTOS heart slices immunolabeled ho troponin-T sy NFATC4 ary ny fanombanana ny fandikana ny NFATC4 amin'ny nuclei ny CMs (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) slices / vondrona avy amin'ny kisoa samy hafa, T-test mpianatra roa-tailed dia atao; * p <0.05). c Sary solontena ho an'ny andro 0 sy andro 6 MTOS heart slices immunolabeled ho troponin-T sy NFATC4 ary ny famaritana ny translocation ny NFATC4 amin'ny nuclei ny CMs (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) slices / vondrona avy amin'ny kisoa samy hafa, Two-tailed Student t-test dia atao; * p <0.05. c Репрезентативные изображения для срезов сердца 0 и 6 дней MTOS, иммуномеченых для тропонина-Т и NFATC4, и котинрацч FATC4 в ядра кавернозных клеток (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срезов/группу от разных свиней , выполняется двустонюрюд двустонкид *t-str0; c sary solontena ho an'ny fizarana fo amin'ny 0 sy 6 andro MTOS, immunolabeled ho an'ny troponin-T sy NFATC4, ary ny fanombanana ny translocation NFATC4 ao amin'ny ivon'ny sela cavernous (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) slices / vondrona avy amin'ny kisoa samihafa) dia nanao t-test mpianatra roa-tailed;*p <0.05). c 用于肌钙蛋白-T 和NFATC4 免疫标记的第0 天和第6 天MTOS 心脏切片的代表性图像，中图减，于于易位至CM 细胞核的量化（n = 4 (D0)、3 (D6 MTOS) 切片/组, 进行双尾学生t 检验；*p < 。 c Sary solontenan'ny calcanin-T sy NFATC4 immunolabeling 第0天和第6天MTOS heart slices, ary NFATC4 avy amin'ny NFATC4 易位至CM cell nucleus 的 quantity化 (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) 制生et 电影；*p < 0.05). c Репрезентативные изображения срезов сердца MTOS amin'ny 0 и 6 день для иммуномаркировки трононином-Т и NFATC4 и котилицнч FATC4 в ядра CM от разных свиней (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срез/группа, два- хвостатый t-критерий Стьюдента; *p < 0,05). c Sarin'ny solontenan'ny atiny MTOS amin'ny andro 0 sy 6 ho an'ny immunolabeling troponin-T sy NFATC4 ary ny fampitomboana ny translocation NFATC4 ao amin'ny ivon'ny CM avy amin'ny kisoa samihafa (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) slices / group, roa-tailed t -criterion Student's; * p <0.05).Ny bara misy hadisoana dia maneho mean ± deviation mahazatra.
Ny fikarohana momba ny aretim-po amin'ny fandikana dia mitaky modely finday izay mamokatra tsara ny tontolon'ny fo.Ao anatin'ity fanadihadiana ity, dia nisy fitaovana CTCM novolavolaina sy nohazavaina izay afaka mandrisika ny faritra ultrathin ao amin'ny fo.Ny rafitra CTCM dia misy ny fanentanana elektromekanika physiologically synchronized ary ny fampitomboana ny fluid T3 sy Dex.Rehefa tratran'ireo lafin-javatra ireo ny ampahany amin'ny fon'ny kisoa, dia nitovy tamin'ny taolam-po vaovao taorian'ny kolontsaina 12 andro ny fahavitan'izy ireo, ny fahamendrehany ara-drafitra, ny hetsika metabolika, ary ny fitenin'ny transcription.Ankoatr'izay, ny fihenjanana tafahoatra amin'ny tadin'ny fo dia mety miteraka hypertrophy amin'ny fo vokatry ny hyperextension.Amin'ny ankapobeny, ireo vokatra ireo dia manohana ny anjara andraikitry ny kolontsaina ara-batana amin'ny fitazonana ny phenotype cardiac mahazatra ary manome sehatra ho an'ny fitiliana zava-mahadomelina.
Antony maro no manampy amin'ny famoronana tontolo tsara indrindra ho an'ny fampandehanana sy ny fahaveloman'ny cardiomyocytes.Ny tena miharihary amin'ireo lafin-javatra ireo dia mifandray amin'ny (1) fifaneraserana intercellular, (2) fanentanana electromechanika, (3) anton-javatra mahatsikaiky, ary (4) substrates metabolika.Ny fifaneraserana amin'ny sela physiologique dia mitaky tamba-jotra telo dimension'ny karazana sela maro tohanan'ny matrix extracellular.Ny fifaneraserana amin'ny sela sarotra toy izany dia sarotra ny manangana in vitro amin'ny alàlan'ny kolontsaina miaraka amin'ny karazana sela tsirairay, saingy azo atao mora foana amin'ny fampiasana ny toetran'ny organotypic amin'ny fizarana fo.
Ny fizotry ny mekanika sy ny fanentanana elektrika amin'ny cardiomyocytes dia tena ilaina amin'ny fitazonana ny phenotype cardiac33,34,35.Raha ny famporisihana mekanika dia nampiasaina betsaka ho an'ny fifehezana sy fahamatorana hiPSC-CM, ny fanadihadiana kanto maro dia nanandrana ny famporisihana mekanika amin'ny tapa-po amin'ny kolontsaina amin'ny fampiasana uniaxial loading.Ireo fanadihadiana ireo dia mampiseho fa misy fiantraikany tsara eo amin'ny phenotype ny fo mandritra ny kolontsaina ny 2D uniaxial mechanical loading.Ao anatin'ireo fanadihadiana ireo, ny ampahany amin'ny fo dia nafenina tamin'ny herin'ny tensile isometrika17, ny loading auxotonic linear18, na ny tsingerin'ny fo dia noforonina tamin'ny alàlan'ny fanehoan-kevitry ny transducer hery sy ny fihenjanana.Na izany aza, ireo fomba ireo dia mampiasa fihenjanan'ny tavy uniaxial tsy misy fanatsarana ny tontolo iainana, ka miteraka fanafoanana ny fototarazo cardiac maro na ny fanehoana tafahoatra ny fototarazo mifandray amin'ny valin-kafatra tsy ara-dalàna.Ny CTCM voalaza eto dia manome stimuli electromechanika 3D izay maka tahaka ny tsingerin'ny fo voajanahary amin'ny resaka fotoana tsingerina sy ny fihenjanana ara-batana (25% stretch, 40% systole, 60% diastole, ary 72 beats isa-minitra).Na dia tsy ampy amin'ny fitazonana ny fahamendrehan'ny sela fotsiny aza ity fanentanana mekanika telo-dimensional ity, ny fampifangaroana ny fanentanana humoral sy mekanika amin'ny fampiasana T3 / Dex dia ilaina mba hitazonana ny fahafaha-manao, ny asany ary ny fahamendrehana.
Ny anton-javatra mahatsikaiky dia manana anjara toerana lehibe amin'ny fanovana ny phenotype fo olon-dehibe.Izany dia nasongadina tamin'ny fandalinana HiPS-CM izay nampidirina tamin'ny haino aman-jery kolontsaina ny T3 sy Dex mba hanafaingana ny fahamatorana sela.Ny T3 dia mety hisy fiantraikany amin'ny fitaterana ny asidra amine, siramamy ary kalsioma manerana ny sela membrane36.Ankoatra izany, ny T3 dia mampiroborobo ny fitenenana MHC-α sy ny fihenan'ny MHC-β, mampiroborobo ny fananganana myofibrils haingana amin'ny cardiomyocytes matotra raha oharina amin'ny myofibrils miadana amin'ny CM foetus.Ny tsy fahampian'ny T3 amin'ny mararin'ny hypothyroid dia miteraka ny fahaverezan'ny tarika myofibrillar ary ny fihenan'ny fivoaran'ny tonony37.Dex dia miasa amin'ny receptors glucocorticoid ary hita fa mampitombo ny fihenan'ny myocardial ao amin'ny fo mitokana;38 ity fanatsarana ity dia heverina fa misy ifandraisany amin'ny fiantraikany amin'ny fidirana entin'ny calcium deposit-driven (SOCE) 39,40.Ankoatr'izay, ny Dex dia mifatotra amin'ny mpandray azy, ka miteraka valin-kafatra midadasika amin'ny intracellular izay manafoana ny fiasan'ny immune sy ny areti-maso30.
Ny valiny dia manondro fa ny fanentanana ara-mekanika ara-batana (MS) dia nanatsara ny fahombiazan'ny kolontsaina ankapobeny raha oharina amin'ny Ctrl, saingy tsy nahavita nitazona ny fahavelomana, ny fahamendrehana ara-drafitra, ary ny fitenenana fo nandritra ny andro 12 tamin'ny kolontsaina.Raha ampitahaina amin'ny Ctrl, ny fampidirana T3 sy Dex amin'ny kolontsaina CTCM (MT) dia nanatsara ny fahavitrihana ary nitazona ny mombamomba ny fandikana mitovy, ny fahamendrehana ara-drafitra, ary ny hetsika metabolika miaraka amin'ny tavy fo vaovao mandritra ny andro 12.Ankoatr'izay, amin'ny fanaraha-maso ny haavon'ny fihenjanan'ny tavy, dia noforonina tamin'ny fampiasana STCM ny modelim-pandrefesana hyperextension-induced cardiac, izay mampiseho ny fahaizan'ny rafitra STCM.Tsara ho marihina fa na dia matetika aza ny fanavaozana ny fo sy ny fibrosis dia misy taova tsy misy dikany izay ny sela mivezivezy dia afaka manome ny cytokines mifanaraka amin'izany ary koa ny phagocytosis sy ireo anton-javatra fanovana hafa, ny ampahany amin'ny fo dia mbola afaka maka tahaka ny fizotry ny fibra ho setrin'ny adin-tsaina sy ny trauma.Hiverina any amin'ny myofibroblasts.Ity dia efa nodinihina teo aloha tamin'ity modely cardiac slice ity.Tsara homarihina fa ny masontsivana CTCM dia azo ovaina amin'ny alàlan'ny fanovana ny tsindry / amplitude elektrika sy ny matetika mba hanahafana ny toe-javatra maro toy ny tachycardia, bradycardia, ary fanohanana mekanika mivezivezy (fo tsy misy entana mekanika).Izany dia mahatonga ny rafitra ho fampandehanana antonony amin'ny fitiliana zava-mahadomelina.Ny fahafahan'ny CTCM mamolavola ny hypertrophy kardia vokatry ny overexertion-induced cardiac dia manome lalana ny fitsapana ity rafitra ity ho an'ny fitsaboana manokana.Ho fehin-kevitra, ny fandinihana amin'izao fotoana izao dia mampiseho fa ny fihenjanana mekanika sy ny fanentanana humoral dia tena zava-dehibe amin'ny fitazonana ny kolontsain'ny fizaran'ny tadin'ny fo.
Na dia ny angon-drakitra aseho eto aza dia milaza fa ny CTCM dia sehatra tena mampanantena amin'ny famolavolana ny myocardium intact, ity fomba kolontsaina ity dia misy fetrany.Ny fetra lehibe indrindra amin'ny kolontsaina CTCM dia ny fanerena ny tsindry mekanika mavitrika amin'ny silaka, izay manakana ny fahafahana manara-maso mavitrika ny fihenan'ny fo mandritra ny tsingerina tsirairay.Ankoatr'izay, noho ny haben'ny fizarana cardiac (7 mm) dia voafetra ihany ny fahaizana manombana ny fiasan'ny systolika ivelan'ny rafitra kolontsaina mampiasa sensor sensor hery nentim-paharazana.Ao amin'ny sora-tanana amin'izao fotoana izao, dia mandresy amin'ny ampahany amin'io fetra io isika amin'ny fanombanana ny voltase optika ho famantarana ny fiasan'ny contractile.Na izany aza, io famerana io dia mitaky asa bebe kokoa ary mety ho voavaha amin'ny ho avy amin'ny fampidirana fomba fanaraha-maso optika ny fiasan'ny tapa-po amin'ny kolontsaina, toy ny sarintany optika mampiasa kalsioma sy loko malefaka.Ny fetran'ny CTCM iray hafa dia ny hoe ny modely miasa dia tsy manodinkodina ny adin-tsaina ara-batana (preload sy afterload).Ao amin'ny CTCM, ny tsindry dia nampidirina tamin'ny lalana mifanohitra amin'ny famokarana 25% ara-batana amin'ny diastole (fihenjanana feno) sy systole (halava amin'ny fifandonana mandritra ny fanentanana elektrika) amin'ny tavy lehibe.Io fetra io dia tokony hesorina amin'ny famolavolana CTCM ho avy amin'ny alàlan'ny fanerena sahaza ny tadin'ny fo avy amin'ny andaniny roa ary amin'ny fampiharana ny fifandraisana marina amin'ny haben'ny tsindry izay mitranga ao amin'ny efitranon'ny fo.
Ny fanavaozana mihoapampana-induced voalaza ato amin'ity sora-tanana ity dia voafetra amin'ny maka tahaka ny famantarana hyperstretch hypertrophic.Noho izany, ity maodely ity dia afaka manampy amin'ny fandalinana ny famantarana hypertrophic mihetsiketsika tsy mila antony mahatsikaiky na neural (izay tsy misy amin'ity rafitra ity).Ilaina ny fandinihana fanampiny mba hampitomboana ny hamaroan'ny CTCM, ohatra, ny fiaraha-miombon'antoka amin'ny sela immune, ny fampielezam-peo amin'ny plasma humoral, ary ny innervation rehefa miara-miasa amin'ny sela neuronal dia hanatsara ny mety hisian'ny aretina modeling miaraka amin'ny CTCM.
Kisoa telo ambin'ny folo no nampiasaina tamin'ity fianarana ity.Ny fomba fiasa biby rehetra dia natao araka ny torolàlana andrim-panjakana ary nankatoavin'ny Komitin'ny Fikarakarana sy Fampiasana Biby ao amin'ny Oniversiten'i Louisville.Nopetahana ny andohalambo aorta ary nopotehina tamin'ny 1 L ny cardioplegia sterile (110 mM NaCl, 1.2 mM CaCl2, 16 mM KCl, 16 mM MgCl2, 10 mM NaHCO3, 5 U / mL heparin, pH hatramin'ny 7.4); ny fo dia voatahiry ao anaty ranomandry mangatsiaka vahaolana cardioplegique mandra-pitaterana any amin'ny laboratoara amin'ny ranomandry izay matetika <10 min. ny fo dia voatahiry ao anaty ranomandry mangatsiaka vahaolana cardioplegique mandra-pitaterana any amin'ny laboratoara amin'ny ranomandry izay matetika <10 min. сердца хранили в ледяном кардиоплегическом растворе до транспортировки в лабораторию на льду, что обычно за10мает <. Ny fo dia voatahiry ao anaty ranomandry mangatsiaka mangatsiaka mandra-pitaterana any amin'ny laboratoara amin'ny ranomandry, izay maharitra <10 min.将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钟。将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钟。 Держите сердца в ледяной кардиоплегии до транспортировки в лабораторию на льду, обычно <10 мин. Tazony amin'ny kardioplegia gilasy ny fo mandra-pitaterana any amin'ny laboratoara amin'ny ranomandry, matetika <10 min.
Ny fitaovana CTCM dia novolavolaina tamin'ny rindrambaiko SolidWorks Computer Aided Design (CAD).Ny efitranon'ny kolontsaina, ny fizarana ary ny efitranon'ny rivotra dia vita amin'ny plastika acryl mazava CNC.Ny peratra back-up savaivony 7mm dia vita amin'ny polyethylene avo lenta (HDPE) ao afovoany ary misy peratra o-peratra mba handraisana ny o-peratra silikônina ampiasaina hamehezana ny haino aman-jery ao ambaniny.Ny fonon'ny silica manify dia manasaraka ny efitrano kolontsaina amin'ny takelaka fisarahana.Ny fonon'ny silicone dia notapatapahina tamin'ny 0.02″ takelaka silicone matevina ary manana hamafin'ny 35A.Ny gaskets silicone ambany sy ambony dia notapatapahina tamin'ny laser 1/16″ takelaka silicone matevina ary manana hamafin'ny 50A.Visy vy tsy misy vy 316L sy voanjo elatra dia ampiasaina amin'ny famatorana ny sakana sy hamoronana tombo-kase tsy misy rivotra.
Ny biraon'ny circuit printy natokana ho an'ny faritra (PCB) dia natao mba hampidirana ny rafitra C-PACE-EM.Ny sockets connector machine soisa eo amin'ny PCB dia mifandray amin'ny electrodes graphite amin'ny alalan'ny tariby varahina nopetahana volafotsy sy ny visy 0-60 varahina mipetaka amin'ny electrodes.Apetraka eo amin'ny fonon'ny mpanonta 3D ny takelaka fizaran-tany vita pirinty.
Ny fitaovana CTCM dia fehezin'ny programmable pneumatic actuator (PPD) izay mamorona tsindrin-drivotra voafehy mitovy amin'ny tsingerin'ny fo.Rehefa mitombo ny tsindry ao anatin'ny efitranon'ny rivotra, dia mivelatra miakatra ny fonon'ny silikônika malefaka, ka manery ny mpanelanelana eo ambanin'ny tranokala.Ny faritry ny tavy dia hivelatra amin'ny alàlan'ity fandroahana ranon-javatra ity, maka tahaka ny fiparitahan'ny fo ara-batana mandritra ny diastole.Tamin'ny fara tampon'ny fialan-tsasatra, ny fanentanana elektrika dia nampiharina tamin'ny alàlan'ny electrodes graphite, izay nampihena ny tsindry tao amin'ny efitranon'ny rivotra ary nahatonga ny fihenan'ny fizarana sela.Ao anatin'ny sodina dia misy valva hemostatic misy sensor fanerena hamantarana ny tsindry ao amin'ny rafitry ny rivotra.Ny tsindry tsapa amin'ny sensor fanerena dia ampiharina amin'ny mpanangona angona mifandray amin'ny solosaina finday.Izany dia mamela ny fanaraha-maso tsy tapaka ny tsindry ao anatin'ny entona entona.Rehefa tratra ny tsindry ambony indrindra amin'ny efitrano (80 mmHg, 140 mmHg OS), dia nasaina nandefa famantarana ho an'ny rafitra C-PACE-EM ny fitaovana fanangonam-baovao mba hamokarana mari-pandrefesana biphasic ho an'ny 2 ms, napetraka amin'ny 4 V.
Natao ny fizarana fo ary natao toy izao manaraka izao ny toetry ny kolontsaina tao amin'ny lavadrano 6: Afindrao amin'ny lovia misy kardioplegia mangatsiaka (4° C.) ny fo voaangona avy ao amin'ny fitoeran'entana.Ny ventricle havia dia notokanana tamin'ny lamosina sterile ary notapatapahina tamin'ny 1-2 cm3.Ireo blocs ireo dia napetaka tamin'ny tohan'ny tissue miaraka amin'ny adhesive tissue ary napetraka tao anaty bain microtome vibrating misy ranon'i Tyrode ary misy oksizenina tsy tapaka (3 g / L 2,3-butanedione monooxime (BDM), 140 mM NaCl (8.18 g) . ), 6 mM KCl (0.447 g), 6 mM KCl (0.447 g) . PES (2,38 g), 1 mM MgCl2 (1 ml 1 M vahaolana), 1,8 mM CaCl2 (1,8 ml 1 M vahaolana), hatramin'ny 1 L ddH2O).Ny microtome vibration dia napetraka mba hanapaka silaka matevina 300 µm amin'ny matetika 80 Hz, amplitude hovitrovitra mitsivalana 2 mm, ary 0,03 mm / s ny tahan'ny fandrosoana.Ny rano fandroana dia voahodidin'ny ranomandry mba hitazonana ny vahaolana mangatsiaka ary ny mari-pana amin'ny 4 ° C.Alefaso amin'ny ranomandry ny ampahany amin'ny tavy avy amin'ny bain microtome mankany amin'ny fandroana incubation misy vahaolana Tyrode misy oxygène mitohy amin'ny ranomandry mandra-pahazoana fizarana ampy ho an'ny takelaka kolontsaina iray.Ho an'ny kolontsaina transwell, ny fizarana tissue dia napetaka tamin'ny fanohanana polyurethane 6 mm malalaka ary napetraka tao amin'ny 6 ml ny medium optimized (199 medium, 1x ITS supplement, 10% FBS, 5 ng / ml VEGF, 10 ng / ml FGF-alkalina ary 2X antibiotika-antifungal).Ny famporisihana elektrika (10 V, matetika 1.2 Hz) dia nampiharina tamin'ny fizarana sela amin'ny alàlan'ny C-Pace.Ho an'ny fepetra TD, ny T3 sy Dex vaovao dia nampiana tamin'ny 100 nM sy 1 μM isaky ny fiovana antonony.Feno oksizenina ilay fitaovana alohan'ny fanoloana in-3 isan'andro.Ny fizarana tissue dia nokolokoloina tao anaty incubator amin'ny 37 ° C sy 5% CO2.
Ho an'ny kolontsaina CTCM, dia napetraka eo amin'ny mpanonta printy 3D vita amin'ny fomba manokana ny fizarana tavy ao anaty lovia Petri misy vahaolana Tyrode novaina.Ny fitaovana dia natao hampitomboana ny haben'ny sombin'ny fo amin'ny 25% amin'ny faritry ny peratra fanohanana.Izany dia atao mba tsy hivelatra ny ampahany amin'ny fo rehefa avy nafindra avy amin'ny vahaolana Tyrode mankany amin'ny medium sy mandritra ny diastole.Amin'ny fampiasana lakaoly histoacrylic, ny fizarana 300 µm matevina dia napetraka amin'ny peratra fanohanana 7 mm ny savaivony.Aorian'ny fametahana ny ampahany amin'ny tavy amin'ny peratra fanohanana dia tapaho ireo ampahany amin'ny tavy be loatra ary avereno ao anaty rano fandroana amin'ny vahaolana Tyrode amin'ny ranomandry (4 ° C) mandra-pahavitan'ny fizarana ampy ho an'ny fitaovana iray.Tsy tokony hihoatra ny 2 ora ny fitambaran'ny fotoana fanodinana ho an'ny fitaovana rehetra.Rehefa avy niraikitra tamin'ny peratra fanohanan'izy ireo ny fizarana sela 6, dia natambatra ny fitaovana CTCM.Ny efitranon'ny kolontsaina CTCM dia feno 21 ml mialoha ny oksizenina.Alefaso any amin'ny efitranon'ny kolontsaina ny ampahany amin'ny tavy ary esory tsara izay bubbles amin'ny pipette.Ampidirina ao anatin'ilay lavaka ilay faritra misy tavy ary apetraka moramora amin'ny toerany.Farany, apetraho eo amin'ny fitaovana ny satroka electrode ary alefaso any amin'ny incubator ilay fitaovana.Avy eo dia mampifandray ny CTCM amin'ny fantsona rivotra sy ny rafitra C-PACE-EM.Misokatra ny actuator pneumatic ary manokatra ny CTCM ny valva rivotra.Ny rafitra C-PACE-EM dia namboarina mba hanaterana 4 V amin'ny 1.2 Hz mandritra ny pacing biphasic mandritra ny 2 ms.Ovaina indroa isan'andro ny fitaovana ary novaina indray mandeha isan'andro ny electrodes mba hisorohana ny fivondronan'ny graphite amin'ny electrodes.Raha ilaina, dia azo esorina ao amin'ny fantsakana ny kolontsainany ny ampahany amin'ny tavy mba handroahana izay bubbles mety ho latsaka ao ambaniny.Ho an'ny fepetra fitsaboana MT, T3 / Dex dia nampiana vaovao isaky ny fiovana antonony miaraka amin'ny 100 nM T3 sy 1 μM Dex.Ny fitaovana CTCM dia nokolokoloina tao anaty incubator amin'ny 37 ° C sy 5% CO2.
Mba hahazoana lalana mivelatra amin'ny silaka fo, dia nisy rafitra fakantsary manokana novolavolaina.Fakan-tsary SLR (Canon Rebel T7i, Canon, Tokyo, Japana) no nampiasaina niaraka tamin'ny fakantsary macro Navitar Zoom 7000 18-108mm (Navitar, San Francisco, CA).Ny fijerena maso dia natao tamin'ny mari-pana amin'ny efitrano taorian'ny fanoloana ny fitaovana vaovao.Ny fakan-tsary dia napetraka amin'ny zoro 51° ary ny horonan-tsary dia voarakitra amin'ny sary 30 isan-tsegondra.Voalohany, ny rindrambaiko open source (MUSCLEMOTION43) dia nampiasaina tamin'ny Image-J mba hamaritana ny fihetsiky ny fo.Ny saron-tava dia noforonina tamin'ny fampiasana MATLAB (MathWorks, Natick, MA, Etazonia) mba hamaritana faritra mahaliana amin'ny fikapohana tapa-po mba hisorohana ny tabataba.Saron-tava nozaraina tanana dia ampiharina amin'ny sary rehetra amin'ny filaharan'ny frame ary avy eo afindra amin'ny plug-in MUSCLEMOTION.Ny Muscle Motion dia mampiasa ny salan'isan'ny pixel isaky ny frame mba hamaritana ny fivezivezeny mifandraika amin'ny frame reference.Ny angon-drakitra dia voarakitra, voasivana ary nampiasaina mba hamaritana ny vanim-potoanan'ny tsingerina ary hanombanana ny fihanaky ny tavy mandritra ny tsingerin'ny fo.Ny horonan-tsary voarakitra dia nokarakaraina taorian'ny fampiasana sivana nomerika zero-phase laharana voalohany.Mba hamaritana ny fisehon'ny sela (peak-to-peak), dia natao ny famakafakana ny tendrony amin'ny tendrony mba hanavahana ny tendrony sy ny tavy amin'ny famantarana voarakitra.Ankoatr'izay, ny detrending dia atao amin'ny alàlan'ny polynomial laharana faha-6 mba hanafoanana ny fifindran'ny famantarana.Ny fehezan-dalàna momba ny programa dia novolavolaina tao amin'ny MATLAB mba hamaritana ny fihetsehan'ny sela eran-tany, ny vanim-potoanan'ny tsingerin'ny fotoana, ny fotoana fialan-tsasatra, ary ny fotoana fihenam-bidy (Code 44 fanampiny).
Ho an'ny famakafakana fihenjanana, amin'ny fampiasana ireo horonan-tsary noforonina ho an'ny fanombantombanana ara-mekanika, dia nanara-maso voalohany ny sary roa maneho ny tampon'ny fihetsiketsehana (ny teboka ambony indrindra (ambony) sy ambany indrindra (ambany) araka ny rindrambaiko MUSCLEMOTION.Avy eo dia nozarainay ny faritry ny tavy ary nampiharina ny endriky ny algorithm shading amin'ny tavy voazara (sary fanampiny 2a).Nozaraina ho folo ambanin'ny tany ny tavy voazarazara, ary ny adin-tsaina eo amin'ny sehatra tsirairay dia kajy amin'ny fampiasana izao manaraka izao: Strain = (Sup-Sdown) / Sdown, izay ny Sup sy Sdown dia ny halaviran'ny endrika avy amin'ny alokaloka ambony sy ambany amin'ny lamba, tsirairay avy (Fig.2b fanampiny).
Ny fizarana fo dia napetraka amin'ny paraformaldehyde 4% mandritra ny 48 ora.Ny tavy raikitra dia nodiovina tamin'ny 10% sy 20% sucrose mandritra ny 1 ora, avy eo amin'ny 30% sucrose mandritra ny alina.Avy eo dia natsofoka tao amin'ny fitambaran'ny mari-pana fanapahana tsara indrindra (OCT compound) ireo fizarana ary navaingana tsikelikely tao anaty rano fandroana isopentane/maina.Tehirizo ao amin'ny -80 °C ny bloc embedding OCT mandra-pisaraka.Ny slides dia nomanina ho fizarana misy hatevin'ny 8 μm.
Mba hanesorana ny OCT amin'ny ampahany amin'ny fo, dia hafanaina amin'ny 95 ° C mandritra ny 5 minitra ireo slides amin'ny fanafanana.Ampio 1 ml PBS isaky ny slide ary atsipazo mandritra ny 30 minitra amin'ny mari-pana amin'ny efitrano, ary atsipazo ireo fizarana amin'ny fametrahana 0.1% Triton-X ao amin'ny PBS mandritra ny 15 minitra amin'ny mari-pana.Mba hisorohana ny antikora tsy voafaritra amin'ny fatorana amin'ny santionany, ampio 1 ml ny vahaolana BSA 3% amin'ny slides ary atsofohy mandritra ny 1 ora amin'ny mari-pana.Nesorina avy eo ny BSA ary nosasana tamin'ny PBS ny slides.Mariho amin'ny pensilihazo ny santionany tsirairay.Ny antibody voalohany (voadio 1: 200 amin'ny 1% BSA) (connexin 43 (Abcam; # AB11370), NFATC4 (Abcam; # AB99431) ary troponin-T (Thermo Scientific; #MA5-12960) dia nampiana nandritra ny 90 minitra, avy eo dia nampidirina tamin'ny antibody faharoa 1 (%20SA0) amin'ny 90 minitra (Flu) Thermo Scientific; #A16079), manohitra ny bitro Alexa Fluor 594 (Thermo Scientific; #T6391) mandritra ny 90 minitra fanampiny Nosasana in-3 tamin'ny PBS Mba hanavahana ny fandokoana kendrena amin'ny ambadika dia tsy nampiasa afa-tsy ny antibody faharoa izahay ho fanaraha-maso. Farany, nasiana tasy nokleary DAPI ary napetaka tamin'ny protektora vectateur (napetraka ao anaty labozia vectateur). fanamafisam-peo) ary mikraoskaopy Keyence miaraka amin'ny fampitomboana 40x.
WGA-Alexa Fluor 555 (Thermo Scientific; #W32464) amin'ny 5 μg / ml ao amin'ny PBS dia nampiasaina ho an'ny WGA staining ary nampiharina tamin'ny fizarana raikitra nandritra ny 30 minitra amin'ny mari-pana amin'ny efitrano.Avy eo dia nosasana tamin'ny PBS ireo slides ary nasiana mainty Soudan isaky ny slide ary natsofoka nandritra ny 30 minitra.Avy eo dia nosasana tamin'ny PBS ny slides ary nampiana ny medium embedding vectashield.Ny slides dia naseho tamin'ny mikraoskaopy Keyence tamin'ny fampitomboana 40x.
OCT dia nesorina tamin'ny santionany araka ny voalaza etsy ambony.Rehefa avy nesorina ny OCT dia atsobohy ao anaty vahaolana Bouin mandritra ny alina ny slides.Kobanina tamin’ny rano nodiovina nandritra ny adiny 1 ny slides ary napetrany tao anaty vahaolana fuchsin asidra aloe Bibrich mandritra ny 10 minitra.Avy eo dia nosasana tamin'ny rano voadio ny slides ary napetraka tao anaty vahaolana 5% phosphomolybdenum / 5% asidra phosphotungstic mandritra ny 10 minitra.Raha tsy misy kobanina dia afindrao mivantana ao anaty vahaolana manga aniline mandritra ny 15 minitra ny slides.Avy eo dia nosasana tamin'ny rano voadio ny slides ary napetraka tao anaty vahaolana asidra acetic 1% mandritra ny 2 minitra.Ny slides dia maina tamin'ny ethanol 200 N ary nafindra tany amin'ny xylene.Nojerena tamin'ny alalan'ny mikraoskaopy Keyence misy tanjona 10x ny sary mihetsika voaloko.Ny isan-jaton'ny faritra fibrose dia nofaritana tamin'ny alàlan'ny rindrambaiko Keyence Analyzer.
CyQUANT™ MTT Cell Viability Assay (Invitrogen, Carlsbad, CA), katalaogy laharan'ny V13154, araka ny protocole mpanamboatra misy fanovana sasany.Indrindra indrindra, ny totohondry fandidiana misy savaivony 6 mm dia nampiasaina mba hiantohana ny haben'ny sela fanamiana mandritra ny fanadihadiana MTT.Nopetahana tsirairay tao anaty lavaka fantsakana misy takelaka fantsakana 12 misy substrate MTT ny tavy araka ny protocole an'ny mpanamboatra.Ny fizarana dia incubated amin'ny 37 ° C. mandritra ny 3 ora ary ny sela velona metabolizes ny MTT substrate mba hamorona volomparasy formazan fitambarana.Soloy amin'ny 1 ml DMSO ny vahaolana MTT ary atsofohy amin'ny 37 ° C mandritra ny 15 minitra mba hanesorana ny formazan volomparasy amin'ny fizarana fo.Ny santionany dia nopotehina 1:10 tao amin'ny DMSO tao amin'ny takelaka ambany 96-tsara ary ny loko volomparasy norefesina tamin'ny 570 nm mampiasa mpamaky takelaka Cytation (BioTek).Ny famakiana dia natao ara-dalàna araka ny lanjan'ny ampahany tsirairay amin'ny fo.
Ny haino aman-jery tapaka fo dia nosoloina media misy 1 μCi / ml [5-3H]-glucose (Moravek Biochemicals, Brea, CA, USA) ho an'ny famakafakana ny fampiasana glucose araka ny voalaza teo aloha.Aorian'ny 4 ora incubation, ampio 100 µl medium ho an'ny fantsona microcentrifuge misokatra misy 100 µl HCl 0,2 N.Avy eo dia napetraka tao anaty fantsona scintillation misy 500 μl of dH2O ilay fantsona mba hihena [3H]2O mandritra ny 72 ora amin'ny 37 ° C.Esory avy eo ny fantsona microcentrifuge avy amin'ny fantsona scintillation ary ampio 10 ml ny scintillation fluid.Ny fanisana scintillation dia natao tamin'ny alàlan'ny Tri-Carb 2900TR liquid scintillation analyzer (Packard Bioscience Company, Meriden, CT, Etazonia).Ny fampiasana glucose dia nokajiana tamin'ny alàlan'ny hetsika manokana [5-3H]-glucose, ny equilibrium tsy feno sy ny fiaviana, ny dilution ny [5-3H] - amin'ny glucose tsy misy marika, ary ny fahombiazan'ny fanoherana ny scintillation.Ny angon-drakitra dia normalized amin'ny faobe ny fizarana ny fo.
Taorian'ny homogenization ny sela ao amin'ny Trizol, ny RNA dia natokana tamin'ny fizarana fo tamin'ny alàlan'ny Qiagen miRNeasy Micro Kit #210874 araka ny protocole mpanamboatra.Ny fanomanana tranomboky RNAsec, ny filaharana ary ny famakafakana data dia natao toy izao manaraka izao:
1 μg ny RNA isaky ny santionany dia nampiasaina ho fitaovana fanombohana ho an'ny fanomanana ny tranomboky RNA.Ny famakiam-boky sequencing dia noforonina tamin'ny fampiasana ny NEBNext UltraTM RNA Library Preparation Kit ho an'ny Illumina (NEB, Etazonia) manaraka ny tolo-kevitry ny mpanamboatra, ary ny kaody fanondroana dia nampiana ny filaharan'ny toetra ho an'ny santionany tsirairay.Fohy, ny mRNA dia nodiovina tamin'ny totalin'ny RNA tamin'ny fampiasana vakana magnetika mifatotra amin'ny poly-T oligonucleotides.Ny fizarazarana dia atao amin'ny fampiasana cation divalent amin'ny hafanana avo ao amin'ny NEBNext First Strand Synthesis Reaction Buffer (5X).Ny cDNA voalohany dia novolavolaina tamin'ny fampiasana primer hexamer random sy M-MuLV reverse transcriptase (RNase H-).Ny cDNA tady faharoa dia atambatra amin'ny alalan'ny ADN polymerase I sy RNase H. Ny sisa tavela dia ovaina ho blunt farany amin'ny hetsika exonuclease/polymerase.Aorian'ny adenylation ny faran'ny 3′ amin'ny ampahany ADN dia misy Adapter NEBNext misy firafitry ny fehiloha volo miraikitra aminy mba hanomanana azy amin'ny hybridization.Ho an'ny fifantenana ny sombiny cDNA amin'ny halavany 150-200 bp.nodiovina tamin'ny alalan'ny rafitra AMPure XP (Beckman Coulter, Beverly, Etazonia) ny sombin-taratasy fitehirizam-boky.Avy eo, 3 μl USER Enzyme (NEB, Etazonia) miaraka amin'ny cDNA voafantina habe miaraka amin'ny adaptatera dia nampiasaina nandritra ny 15 minitra tamin'ny 37 ° C ary avy eo nandritra ny 5 minitra tamin'ny 95 ° C alohan'ny PCR.Ny PCR dia natao tamin'ny fampiasana Phusion High-Fidelity DNA polymerase, universal PCR primers, ary Index (X) primers.Farany, nodiovina ny vokatra PCR (rafitra AMPure XP) ary nodinihina tamin'ny rafitra Agilent Bioanalyzer 2100 ny kalitaon'ny tranomboky.Ny tranombokin'ny cDNA dia nofaritana tamin'ny alàlan'ny sequencer Novaseq.Ny rakitra sary manta avy amin'ny Illumina dia novana ho vakiteny manta tamin'ny fampiasana CASAVA Base Calling.Ny angona manta dia voatahiry amin'ny rakitra FASTQ(fq) izay misy filaharana mamaky sy toetra fototra mifanaraka amin'izany.Safidio ny HISAT2 hifanaraka amin'ny filaharana voasivana vakiana amin'ny genome reference Sscrofa11.1.Amin'ny ankapobeny, ny HISAT2 dia manohana ny fototarazo amin'ny habe rehetra, ao anatin'izany ny fototarazo lehibe kokoa noho ny 4 lavitrisa fototra, ary ny sanda default dia napetraka ho an'ny ankamaroan'ny masontsivana.Ny famakiana famakiana avy amin'ny angon-drakitra RNA Seq dia azo ampifanarahana amin'ny fomba mahomby amin'ny fampiasana HISAT2, rafitra haingana indrindra misy amin'izao fotoana izao, mitovy na tsara kokoa noho ny fomba hafa rehetra.
Ny habetsahan'ny transcript dia maneho mivantana ny haavon'ny fanehoana ny fototarazo.Ny haavon'ny fanehoana ny fototarazo dia tombanana amin'ny habetsahan'ny transcripts (fanisana filaharana) mifandray amin'ny génome na exon.Ny isan'ny vakiteny dia mifanandrify amin'ny haavon'ny fanehoana ny fototarazo, ny halavan'ny fototarazo ary ny halalin'ny filaharana.Ny FPKM (sombiny isaky ny mpivady fototra arivo amin'ny transcript sequence isaky ny mpivady fototra) dia nokajiana ary ny sanda P-n'ny fanehoan-kevitra samihafa dia nofaritana tamin'ny alàlan'ny fonosana DESeq2.Avy eo dia nanao kajy ny tahan'ny fahitana diso (FDR) ho an'ny sanda P tsirairay izahay amin'ny fampiasana ny fomba Benjamini-Hochberg9 mifototra amin'ny R-function "p.adjust" naorina.
Ny ARN mitoka-monina avy amin'ny fizarana fo dia niova ho cDNA amin'ny fifantohana 200 ng / μl amin'ny fampiasana ny SuperScript IV Vilo Master mix avy amin'ny Thermo (Thermo, cat. No. 11756050).Quantitative RT-PCR dia natao tamin'ny fampiasana ny Applied Biosystems Endura Plate Microamp 384-tsara mangarahara fanehoan-kevitra takelaka (Thermo, cat. No. 4483319) sy microamp Optical adhesive (Thermo, cat. No. 4311971).Ny fangaro fanehoan-kevitra dia nahitana 5 µl Taqman Fast Advanced Master mix (Thermo, cat # 4444557), 0.5 µl Taqman Primer ary 3.5 µl H2O mifangaro isaky ny lavadrano.Ny tsingerin'ny qPCR mahazatra dia natao ary norefesina ny sanda CT tamin'ny fampiasana fitaovana PCR Applied Biosystems Quantstudio 5 (module 384-well; vokatra # A28135).Ny primer Taqman dia novidina avy amin'ny Thermo (GAPDH (Ss03375629_u1), PARP12 (Ss06908795_m1), PKDCC (Ss06903874_m1), CYGB (Ss06900188_m1), RGL1 (Ss06908795_m1) ), GATA4 (Ss03383805_u1), GJA1 (Ss03374839_u1), COL1A2 (Ss03375009_u1 ), COL3A1 (Ss04323794_m1), ACTA2 (Ss04245588_m1) ny santionan'ny CT rehetra.
Ny famotsorana ny media NT-ProBNP dia nodinihina tamin'ny alàlan'ny kitapo NT-ProBNP (kisoa) (Kat. No. MBS2086979, MyBioSource) araka ny protocole mpanamboatra.Fohy, 250 µl isaky ny santionany sy ny fenitra dia nampiana dika mitovy isaky ny lavadrano.Avy hatrany aorian'ny fampidirana ny santionany dia ampio 50 µl Assay Reagent A isaky ny lavadrano.Ahetsiketsika moramora ny takelaka ary asio tombo-kase.Avy eo dia natsofoka tamin'ny 37 ° C nandritra ny adiny iray ny takelaka.Avy eo dia atsipazo ny vahaolana ary sasao in-4 amin'ny 350 µl of 1X wash solution ny lavaka fantsakana, ary atsipazo ao anatin'ny 1-2 minitra isaky ny minitra.Avy eo dia ampio 100 µl Assay Reagent B isaky ny lavadrano ary asio tombo-kase amin'ny takelaka.Nohozongozonina moramora ilay takelaka ary natsofoka tamin’ny 37°C nandritra ny 30 minitra.Atsipazo ny vahaolana ary sasao in-5 ny fantsakana amin'ny 350 µl 1X solution wash.Ampio vahaolana substrate 90 µl isaky ny lavaka ary asio tombo-kase ny takelaka.Atsofohy amin'ny 37 ° C ny takelaka mandritra ny 10-20 minitra.Ampio 50 µl Stop Solution isaky ny lavadrano.Ny takelaka dia norefesina avy hatrany tamin'ny fampiasana mpamaky takelaka Cytation (BioTek) napetraka amin'ny 450 nm.
Ny famakafakana herinaratra dia natao mba hisafidianana ny haben'ny vondrona izay hanome hery> 80% hamantarana ny fiovana tanteraka 10% amin'ny parameter misy taham-pahadisoana 5% Type I. Ny famakafakana herinaratra dia natao mba hisafidianana ny haben'ny vondrona izay hanome hery> 80% hamantarana ny fiovana tanteraka 10% amin'ny parameter misy taham-pahadisoana 5% Type I. Анализ мощности был выполнен для выбора размеров групп, которые обеспечат >80% мощности для обнаружения 10% раметра с 5% частотой ошибок типа I. Ny famakafakana herinaratra dia natao mba hisafidianana ny haben'ny vondrona izay hanome hery> 80% hamantarana 10% ny fiovan'ny mari-pamantarana tanteraka miaraka amin'ny taham-pahadisoana 5% Type I.进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％I功效以检测参数中10％绝对变化和5％I小甎田。进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％I功效以检测参数中10％绝对变化和5％I小甎田。 Был проведен анализ мощности для выбора размера группы, который обеспечил бы > 80% мощности для обнаругеления обнаругеления я параметров и 5% частоты ошибок типа I. Ny famakafakana herinaratra dia natao mba hisafidianana ny haben'ny vondrona izay hanome hery> 80% hamantarana 10% ny fiovan'ny mari-pamantarana tanteraka ary 5% ny tahan'ny fahadisoana karazana I.Nofantenana kisendrasendra ny fizarana tissue alohan'ny fanandramana.Ny famakafakana rehetra dia jamban'ny fepetra ary ny santionany dia novakiana rehefa avy nodinihina ny angon-drakitra rehetra.Ny rindrambaiko GraphPad Prism (San Diego, CA) dia nampiasaina hanaovana ny famakafakana statistika rehetra. Ho an'ny antontan'isa rehetra, ny p-values ​​dia heverina ho manan-danja amin'ny sanda <0.05. Ho an'ny antontan'isa rehetra, ny p-values ​​dia heverina ho manan-danja amin'ny sanda <0.05. Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. Ho an'ny antontan'isa rehetra, ny p-values ​​dia heverina ho manan-danja amin'ny sanda <0.05.对于所有统计数据，p 值在会<0.05 时被认为是显着的。对于所有统计数据，p 值在会<0.05 时被认为是显着的。 Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. Ho an'ny antontan'isa rehetra, ny p-values ​​dia heverina ho manan-danja amin'ny sanda <0.05.Ny t-test an'ny mpianatra roa rambo dia natao tamin'ny angon-drakitra miaraka amin'ny fampitahana 2 ihany.Ny ANOVA amin'ny fomba tokana na roa dia nampiasaina mba hamaritana ny maha-zava-dehibe ny vondrona maromaro.Rehefa manao andrana post hoc dia nampiharina ny fanitsiana nataon'i Tukey ho fampitahana maro.Ny angona RNAsec dia manana fiheverana statistika manokana rehefa manao kajy FDR sy p.adjust araka ny voalaza ao amin'ny fizarana Methods.
Raha mila fanazavana fanampiny momba ny famolavolana fandalinana dia jereo ny sarintanin'ny Nature Research Report mifandray amin'ity lahatsoratra ity.