Misaotra anao nitsidika ny Nature.com. Voafetra ny fanohanana CSS amin'ny dikan-tranonkala ampiasainao. Ho an'ny traikefa tsara indrindra, manoro hevitra anao izahay hampiasa navigateur nohavaozina (na hanafoana ny Compatibility Mode ao amin'ny Internet Explorer). Mandritra izany fotoana izany, mba hahazoana antoka fa mitohy ny fanohanana, dia hampiseho ny tranonkala tsy misy styles sy JavaScript izahay.
Ilaina ny rafitra azo itokisana in vitro izay afaka mamerina amin'ny laoniny ny tontolo ara-batana ao am-po ho an'ny fitiliana fanafody. Ny tsy fahampian'ny rafitra fambolena sela ao am-pon'olombelona dia nitarika ho amin'ny fandikana tsy marina ny vokatry ny fanafody ao am-po. Eto izahay dia namorona modely fambolena sela ao am-po (CTCM) izay mandrisika ny silaka fo amin'ny alàlan'ny elektromekanika ary mandalo fihenjanana ara-batana mandritra ny dingana systolic sy diastolic amin'ny tsingerin'ny fo. Rehefa afaka 12 andro fambolena, ity fomba fiasa ity dia nanatsara ny fahafahan'ny fizarana ao am-po, saingy tsy niaro tanteraka ny maha-ara-drafitra azy ireo. Noho izany, taorian'ny fitiliana molekiola kely, dia hitanay fa ny fanampiana triiodothyronine (T3) 100 nM sy dexamethasone (Dex) 1 μM tamin'ny fitaovanay dia nitazona ny mikrofirafitry ny fizarana nandritra ny 12 andro. Miaraka amin'ny fitsaboana T3/Dex, ny rafitra CTCM dia nitazona ny mombamomba ny transcription, ny fahavelomana, ny asa metabolika, ary ny maha-ara-drafitra amin'ny ambaratonga mitovy amin'ny sela ao am-po vaovao nandritra ny 12 andro. Ankoatra izany, ny fihenjanana tafahoatra ny sela ao am-po amin'ny kolontsaina dia miteraka famantarana hypertrophic cardiac, manome porofo ho an'ny fahafahan'ny CTCM manahaka ny toe-javatra hypertrophic vokatry ny fihenjanana cardiac. Ho fehiny, ny CTCM dia afaka mamolavola ny fiziolojia sy ny patofiziolojian'ny fo ao anaty kolontsaina mandritra ny fotoana maharitra, ka ahafahana manao fitiliana fanafody azo antoka.
Alohan'ny fikarohana ara-pitsaboana, ilaina ny rafitra azo itokisana in vitro izay afaka mamerina amin'ny laoniny ny tontolo ara-batana ao am-pon'olombelona. Ireo rafitra ireo dia tokony hanahaka ny fiovan'ny fihetsehana mekanika, ny tahan'ny fo ary ny toetra elektrofiziolojika. Ny modely biby dia matetika ampiasaina ho sehatra fitiliana ny fiziolojian'ny fo miaraka amin'ny fahatokisana voafetra amin'ny fanehoana ny vokatry ny fanafody ao am-pon'olombelona1,2. Amin'ny farany, ny Ideal Cardiac Tissue Culture Experimental Model (CTCM) dia modely izay tena saro-pady sy manokana ho an'ny fitsaboana sy fanafody isan-karazany, mamerina amin'ny laoniny ny fiziolojia sy ny pathophysiology ao am-pon'olombelona3. Ny tsy fisian'ny rafitra toy izany dia mametra ny fahitana fitsaboana vaovao ho an'ny tsy fahombiazan'ny fo4,5 ary nitarika ho amin'ny aretim-po vokatry ny fanafody ho antony lehibe hialana amin'ny tsena6.
Nandritra ny folo taona lasa, fanafody valo tsy ampiasaina amin'ny aretim-po no nesorina tamin'ny fampiasana ara-pitsaboana satria miteraka fanalavana ny elanelam-potoana QT izay mitarika arrhythmia ventricular sy fahafatesana tampoka7. Noho izany, mitombo ny filàna paikady fitiliana mialoha ny fitsaboana azo antoka mba hanombanana ny fahombiazan'ny fo sy ny poizina. Ny fampiasana vao haingana ny cardiomyocytes avy amin'ny sela fototra pluripotent (hiPS-CM) avy amin'ny olombelona amin'ny fitiliana fanafody sy ny fitiliana poizina dia manome vahaolana amin'ny ampahany amin'ity olana ity. Na izany aza, ny tsy fahamatoran'ny hiPS-CM sy ny tsy fahampian'ny fahasarotan'ny sela maro ao amin'ny fo no fetra lehibe amin'ity fomba ity. Ny fanadihadiana vao haingana dia naneho fa io fetra io dia azo resena amin'ny ampahany amin'ny fampiasana hiPS-CM mialoha mba hamoronana hydrogels amin'ny sela ao amin'ny fo fotoana fohy aorian'ny nanombohan'ny fihenjanana tampoka sy ny fitomboan'ny fientanentanana elektrika tsikelikely rehefa mandeha ny fotoana. Na izany aza, ireo sela bitika hiPS-CM ireo dia tsy manana ny toetra electrophysiological sy contractile matotra an'ny myocardium olon-dehibe. Ankoatra izany, ny sela ao amin'ny fo olombelona dia manana rafitra sarotra kokoa, izay ahitana fifangaroan'ny karazana sela samihafa, anisan'izany ny sela endothelial, neurons, ary fibroblasts stromal, mifamatotra amin'ny andiana proteinina matrix extracellular manokana. Ity tsy fitoviana eo amin'ny isan'ny mponina tsy kardiomiosit11,12,13 ao amin'ny fon'ny biby mampinono olon-dehibe ity dia sakana lehibe amin'ny famolavolana ny sela ao am-po amin'ny fampiasana karazana sela tsirairay. Ireo fetra lehibe ireo dia manantitrantitra ny maha-zava-dehibe ny fampivoarana fomba fambolena sela ao am-po tsy simba ao anatin'ny toe-javatra ara-batana sy ara-patholojika.
Voaporofo fa modely mampanantena ho an'ny myocardium olombelona tsy simba ireo fizarana manify (300 µm) novolena. Ity fomba ity dia manome fidirana amin'ny rafitra 3D multicellular feno mitovy amin'ny sela ao am-pon'olombelona. Na izany aza, hatramin'ny taona 2019, ny fampiasana fizarana fo novolena dia voafetra noho ny faharetan'ny kolontsaina fohy (24 ora). Izany dia noho ny antony maro, anisan'izany ny tsy fisian'ny fihenjanana ara-batana-mekanika, ny fifandraisana misy eo amin'ny rivotra sy ny ranoka, ary ny fampiasana fitaovana tsotra izay tsy mahazaka ny filàn'ny sela ao am-po. Tamin'ny taona 2019, vondrona mpikaroka maromaro no naneho fa ny fampidirana singa mekanika ao amin'ny rafitra kolontsaina sela ao am-po dia afaka manalava ny androm-piainan'ny kolontsaina, manatsara ny fanehoana ny fo, ary manahaka ny pathologie fo. Fikarohana roa kanto 17 sy 18 no mampiseho fa ny enta-mavesatra mekanika uniaxial dia misy fiantraikany tsara amin'ny phenotype fo mandritra ny kolontsaina. Na izany aza, ireo fanadihadiana ireo dia tsy nampiasa ny enta-mavesatra ara-batana-mekanika telo dimensions dinamika amin'ny tsingerin'ny fo, satria ny fizarana fo dia feno hery tensile isometric 17 na enta-mavesatra auxotonic linear 18. Ireo fomba fanenjanana sela ireo dia niafara tamin'ny fanakanana ny fototarazo maro ao am-po na ny fihoaram-pefy tafahoatra mifandraika amin'ny fihetsika mivelatra tsy ara-dalàna. Tsara homarihina fa i Pitoulis et al. 19 dia namorona fandroana kolontsaina silaka fo mavitrika ho an'ny fanarenana ny tsingerin'ny fo amin'ny alàlan'ny fampiasana ny valin-kafatra avy amin'ny transducer hery sy ny fihenjanana. Na dia mamela ny fanaovana modely marina kokoa amin'ny tsingerin'ny fo in vitro aza ity rafitra ity, ny fahasarotana sy ny fahafahan'ny fomba ambany dia mametra ny fampiharana ity rafitra ity. Vao haingana ny laboratoara anay dia namorona rafitra kolontsaina tsotra mampiasa fanentanana elektrika sy fitaovana nohatsaraina mba hihazonana ny fahaveloman'ny sombin-taolana fo kisoa sy olombelona hatramin'ny 6 andro20,21.
Ato amin'ity sora-tanana ity dia mamaritra modely kolontsaina sela fo (CTCM) izahay izay mampiasa ampahan'ny fon-kisoa izay mampiditra famantarana humoral mba hamerenana ny fiziolojian'ny fo telo refy sy ny fivontosan'ny pathophysiologique mandritra ny tsingerin'ny fo. Ity CTCM ity dia afaka mampitombo ny fahamarinan'ny faminaniana fanafody mialoha ny fitsaboana amin'ny ambaratonga mbola tsy tratrarina teo aloha amin'ny alàlan'ny fanomezana rafitra fo antonony sy mahomby amin'ny vidiny izay manahaka ny fiziolojia/pathophysiologie an'ny fon'ny biby mampinono ho an'ny fitiliana fanafody mialoha ny fitsaboana.
Mitana anjara toerana lehibe amin'ny fitazonana ny fiasan'ny cardiomyocyte in vitro 22,23,24 ny famantarana mekanika hemodynamic. Ato amin'ity sora-tanana ity dia namorona CTCM (Sary 1a) izahay izay afaka manahaka ny tontolo iainan'ny fo olon-dehibe amin'ny alàlan'ny fanentanana elektrika sy mekanika amin'ny matetika ara-batana (1.2 Hz, 72 fitempon'ny fo isaky ny minitra). Mba hisorohana ny fihenjanana tafahoatra amin'ny sela mandritra ny diastole, dia nampiasaina ny fitaovana fanontana 3D mba hampitomboana ny haben'ny sela amin'ny 25% (Sary 1b). Ny hafainganam-pandeha elektrika ateraky ny rafitra C-PACE dia nohavaozina hanomboka 100 ms alohan'ny systole amin'ny alàlan'ny fampiasana rafitra fanangonana angon-drakitra mba hamerenana tanteraka ny tsingerin'ny fo. Ny rafitra kolontsaina sela dia mampiasa actuator pneumatic azo fandaharana (LB Engineering, Alemaina) mba hanitarana tsikelikely ny fonon-taolana silicone mora mivelatra mba hiteraka fanitarana ny silaka fo ao amin'ny efitrano ambony. Ny rafitra dia mifandray amin'ny tsipika rivotra ivelany amin'ny alàlan'ny transducer tsindry, izay nahafahana nanitsy tsara ny tsindry (± 1 mmHg) sy ny fotoana (± 1 ms) (Sary 1c).
a Ampifandraiso amin'ny peratra fanohanana 7 mm, aseho amin'ny loko manga, ao anatin'ny efitrano fambolena ny fizarana sela. Ny efitrano fambolena dia misaraka amin'ny efitrano rivotra amin'ny alalan'ny fonon-tsilo manify sy mora miolaka. Apetraho eo anelanelan'ny efitrano tsirairay ny gasket mba hisorohana ny fivoahana. Ny saron'ny fitaovana dia misy elektroda grafita izay manome fientanentanana elektrika. b Fanehoana kisarisary ny fitaovana sela lehibe, ny peratra mpitari-dalana ary ny peratra fanohanana. Ny fizarana sela (volontsôkôlà) dia apetraka eo amin'ny fitaovana lehibe miaraka amin'ny peratra mpitari-dalana napetraka ao amin'ny lavaka eo amin'ny sisiny ivelany amin'ny fitaovana. Ampiasao ny mpitari-dalana, apetraho tsara eo ambonin'ny fizarana sela fo ny peratra fanohanana voarakotra lakaoly akrilika sela. c Tabilao mampiseho ny fotoana fientanentanana elektrika ho toy ny fiasan'ny tsindrin'ny efitrano rivotra fehezin'ny actuator pneumatic azo fandaharana (PPD). Nampiasaina ny fitaovana fanangonana angon-drakitra mba hampifanarahana ny fientanentanana elektrika amin'ny fampiasana sensor tsindry. Rehefa mahatratra ny tokonam-baravarana napetraka ny tsindry ao amin'ny efitrano fambolena, dia alefa any amin'ny C-PACE-EM ny famantarana pulse mba hampihetsika ny fientanentanana elektrika. d Sary misy CTCM efatra napetraka eo amin'ny talantalana incubator. Misy fitaovana efatra mifandray amin'ny PPD iray amin'ny alalan'ny circuit pneumatic, ary ampidirina ao amin'ny valva hemostatic ny sensor-tsindry mba hanaraha-maso ny tsindry ao amin'ny circuit pneumatic. Ny fitaovana tsirairay dia misy fizarana sela enina.
Nampiasa "actuator pneumatic" tokana izahay, ka afaka nifehy fitaovana CTCM 4, izay samy afaka mitazona fizarana sela 6 (Sary 1d). Ao amin'ny CTCM, ny tsindrin'ny rivotra ao amin'ny efitrano rivotra dia miova ho tsindry mifanaraka amin'ny tsindry ao amin'ny efitrano tsiranoka ary miteraka fanitarana ara-batana ny silaka fo (Sary 2a sy Sarimihetsika Fanampiny 1). Fanombanana ny fihenjanan'ny sela amin'ny 80 mm Hg. Ny Art. dia naneho ny fihenjanan'ny fizarana sela 25% (Sary 2b). Io fihenjanan'ny isan-jato io dia naseho fa mifanaraka amin'ny halavan'ny sarcomere ara-batana 2.2–2.3 µm ho an'ny fihenjanan'ny fizarana fo ara-dalàna17,19,25. Notombanana tamin'ny fampiasana fakan-tsary manokana ny fihetsehan'ny sela (Sary Fanampiny 1). Ny amplitude sy ny hafainganam-pandehan'ny fihetsehan'ny sela (Sary 2c, d) dia mifanaraka amin'ny fihenjanan'ny sela mandritra ny tsingerin'ny fo sy ny fotoana mandritra ny systole sy diastole (Sary 2b). Ny fihenjanan'ny sela fo sy ny hafainganam-pandehany mandritra ny fihenjanan'ny sela mandritra ny fihenjanan'ny fo sy ny fialan-tsasatra dia nijanona ho tsy miova nandritra ny 12 andro tao amin'ny kolontsaina (Sary 2f). Mba hanombanana ny fiantraikan'ny fientanentanana elektrika amin'ny fihenjanana mandritra ny fambolena, dia namorona fomba iray hamaritana ny fiovaovan'ny endrika mavitrika izahay amin'ny fampiasana algorithm shading (Sary Fanampiny 2a, b) ary afaka nanavaka ny fiovaovan'ny endrika misy sy tsy misy fientanentanana elektrika. Ny fizarana mitovy amin'ny fo (Sary 2f). Ao amin'ny faritra mihetsika amin'ny tapaka (R6-9), ny voltazy mandritra ny fientanentanana elektrika dia 20% ambony noho ny tsy fisian'ny fientanentanana elektrika, izay manondro ny fandraisan'anjaran'ny fientanentanana elektrika amin'ny fiasan'ny fihenjanana.
Ny soritr'aretin'ny tsindrin'ny efitrano rivotra, ny tsindrin'ny efitrano ranoka, ary ny fandrefesana ny fihetsehan'ny sela dia manamafy fa ny tsindrin'ny efitrano dia manova ny tsindrin'ny efitrano ranoka, ka miteraka fihetsehana mifanaraka amin'izany amin'ny silaka sela. b Ny soritr'aretin'ny isan-jaton'ny fivelarana (manga) amin'ny fizarana sela mifanaraka amin'ny isan-jaton'ny fivelarana (volomboasary). c Ny fihetsehana voarefy amin'ny silaka fo dia mifanaraka amin'ny hafainganam-pandehan'ny fihetsehana voarefy. (d) Ny lalan'ny fihetsehana cyclic (tsipika manga) sy ny hafainganam-pandeha (tsipika teboteboka volomboasary) ao amin'ny silaka fo. e Fandrefesana ny fotoana tsingerina (n = silaka 19 isaky ny vondrona, avy amin'ny kisoa samihafa), ny fotoana fihenan'ny tsindry (n = silaka 19 isaky ny vondrona), ny fotoana fialan-tsasatra (n = silaka 19 isaky ny vondrona, avy amin'ny kisoa samihafa), ny fihetsehan'ny sela (n = 25 ). silaka)/vondrona avy amin'ny kisoa samihafa), ny hafainganam-pandeha systolic ambony indrindra (n = 24(D0), silaka 25(D12)/vondrona avy amin'ny kisoa samihafa) ary ny tahan'ny fialan-tsasatra ambony indrindra (n=24(D0), silaka 25(D12)/vondrona avy amin'ny kisoa samihafa). Ny t-test an'ny Two-tailed Student dia tsy naneho fahasamihafana manan-danja tamin'ny parameter rehetra. f Famakafakana ny soritr'aretin'ny fihenjanana amin'ny fizarana sela misy fanentanana elektrika (mena) sy tsy misy (manga), faritra folo amin'ny fizarana sela avy amin'ny fizarana iray ihany. Ny takelaka ambany dia mampiseho ny fandrefesana ny isan-jaton'ny fahasamihafan'ny fihenjanana amin'ny fizarana sela misy sy tsy misy fanentanana elektrika amin'ny faritra folo avy amin'ny fizarana samihafa. (n = silaka 8/vondrona avy amin'ny kisoa samihafa, natao ny fitsapana-t an'ny mpianatra roa rambony; ****p < 0.0001, **p < 0.01, *p < 0.05). (n = silaka 8/vondrona avy amin'ny kisoa samihafa, natao ny fitsapana-t an'ny mpianatra roa rambony; ****p < 0.0001, **p < 0.01, *p < 0.05). (n = 8 срезов/группу от разных свиней, проводится двусторонний t-критерий Стьюдента; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05). (n = fizarana 8/vondrona avy amin'ny kisoa samihafa, fitsapana-t an'ny Mpianatra roa rambony; ****p<0.0001, **p<0.01, *p<0.05). （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p < 0.0001，**p < 0.01，*p < 0.05）。 （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p < 0.0001，**p < 0.01，*p < 0.05）。 (n = 8 срезов/группу, от разных свиней, двусторонний критерий Стьюдента; ****p <0,0001, **p <0,01, *p <0,05). (n = fizarana 8/vondrona, avy amin'ny kisoa samihafa, fitsapana-t an'ny Mpianatra roa rambony; ****p<0.0001, **p<0.01, *p<0.05).Ny bara fahadisoana dia maneho ny salan'isa ± fivilian-dàlana mahazatra.
Tao amin'ny rafitra fambolena silaka fo biomimetika statika teo aloha [20, 21], dia nitazona ny fahavelomana, ny fiasa ary ny fahamarinan'ny rafitry ny silaka fo nandritra ny 6 andro izahay tamin'ny alàlan'ny fampiharana ny fanentanana elektrika sy ny fanatsarana ny firafitry ny fitaovana. Na izany aza, rehefa afaka 10 andro, dia nihena be ireo tarehimarika ireo. Hanondro ireo fizarana novolena tao amin'ny rafitra fambolena biomimetika statika teo aloha 20, 21 fepetra fanaraha-maso (Ctrl) izahay ary hampiasa ny fitaovana nohatsaraina teo aloha ho toy ny fepetra MC sy ny kolontsaina eo ambany fanentanana mekanika sy elektrika miaraka (CTCM). antsoina hoe . Voalohany, dia nanapa-kevitra izahay fa ny fanentanana mekanika tsy misy fanentanana elektrika dia tsy ampy hihazonana ny fahaveloman'ny sela mandritra ny 6 andro (Sary Fanampiny 3a,b). Mahaliana fa tamin'ny fampidirana ny fanentanana ara-batana-mekanika sy elektrika amin'ny fampiasana STCM, dia nijanona ho toy ny tamin'ny fizarana fo vaovao teo ambanin'ny fepetra MS ny fahaveloman'ny fizarana fo 12 andro, fa tsy teo ambanin'ny fepetra Ctrl, araka ny asehon'ny fanadihadiana MTT (Sary 1). 3a). Izany dia manondro fa ny fanentanana mekanika sy ny simulation ny tsingerin'ny fo dia afaka mitazona ny fizarana sela ho velona avo roa heny noho ny voalaza tao amin'ny rafitra fambolena statika teo aloha. Na izany aza, ny fanombanana ny fahamarinan'ny firafitry ny fizarana sela amin'ny alàlan'ny immunolabeling ny troponin T sy connexin 43 ao am-po dia naneho fa ny fanehoana connexin 43 dia avo kokoa amin'ny sela MC amin'ny andro faha-12 raha oharina amin'ny fanaraha-maso amin'io andro io ihany. Na izany aza, ny fanehoana connexin 43 mitovy sy ny fiforonan'ny kapila Z dia tsy voatazona tanteraka (Sary 3b). Mampiasa rafitra faharanitan-tsaina artifisialy (AI) izahay mba handrefesana ny fahamarinan'ny firafitry ny sela26, fantsona fianarana lalina mifototra amin'ny sary mifototra amin'ny troponin-T sy ny fandokoana connexin43 mba handrefesana ho azy ny fahamarinan'ny firafitry ny sela sy ny fluorescence amin'ny lafiny tanjaky ny toerana misy azy. Ity fomba ity dia mampiasa Convolutional Neural Network (CNN) sy rafitra fianarana lalina mba handrefesana azo antoka ny fahamarinan'ny firafitry ny sela ao am-po amin'ny fomba mandeha ho azy sy tsy mitanila, araka ny voalaza ao amin'ny referansa. 26. Ny sela MC dia naneho fitoviana ara-drafitra nihatsara tamin'ny andro faha-0 raha oharina amin'ny fizarana fanaraha-maso static. Ho fanampin'izany, ny fandokoana trichrome an'i Masson dia naneho isan-jato ambany kokoa amin'ny fibrosis amin'ny toe-javatra MS raha oharina amin'ny toe-javatra fanaraha-maso amin'ny andro faha-12 amin'ny kolontsaina (Sary 3c). Na dia nampitombo ny fahafahan'ny fizarana sela ao am-po ho velona mitovy amin'ny an'ny sela vaovao aza ny CTCM tamin'ny andro faha-12, dia tsy nanatsara be loatra ny fahamarinan'ny rafitry ny fizarana ao am-po izany.
Ny grafika Bar dia mampiseho ny fandrefesana ny fahafahan'ny silaka fo vaovao (D0) na ny kolontsaina silaka fo ampiasaina amin'ny MTT mandritra ny 12 andro, na ao anaty kolontsaina tsy mihetsika (D12 Ctrl) na ao amin'ny CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) silaka/vondrona avy amin'ny kisoa samihafa, atao ny fitsapana ANOVA amin'ny fomba iray; ####p < 0.0001 raha oharina amin'ny D0 ary **p < 0.01 raha oharina amin'ny D12 Ctrl). Ny grafika Bar dia mampiseho ny fandrefesana ny fahafahan'ny silaka fo vaovao (D0) na ny kolontsaina silaka fo ampiasaina amin'ny MTT mandritra ny 12 andro, na ao anaty kolontsaina tsy mihetsika (D12 Ctrl) na ao anaty CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), silaka/vondrona 12 (D12 MC) avy amin'ny kisoa samihafa, atao ny fitsapana ANOVA amin'ny fomba iray; ####p < 0.0001 raha oharina amin'ny D0 ary **p < 0.01 raha oharina amin'ny D12 Ctrl).Ny histograma dia mampiseho ny fandrefesana ny fahaveloman'ny fizarana fo vaovao MTT (D0) na ny kolontsaina fizarana fo mandritra ny 12 andro na amin'ny kolontsaina tsy mihetsika (fanaraha-maso D12) na CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (fanaraha-maso D12). ) ), fizarana/vondrona 12 (D12 MC) avy amin'ny kisoa samihafa, atao ny fitsapana ANOVA tokana;####p < 0,0001 по сравнению с D0 и **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p < 0.0001 raha oharina amin'ny D0 ary **p < 0.01 raha oharina amin'ny D12 Ctrl). a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切)片(D0)片或心脏切片培养12 天的MTT 活力的量化)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单后行单后与相比，####p < 0.0001，与D12 Ctrl 相比，**p < 0.01). a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切)片(D0)片，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；与D0 相比，####p < 0.0001，与用 Ctrl)histograma mampiseho ny fandrefesana ny fahafahan'ny MTT velona ao amin'ny fizarana fo vaovao (D0) na fizarana fo novolena nandritra ny 12 andro tao anaty kolontsaina tsy mihetsika (fanaraha-maso D12) na CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (fanaraha-maso D12)), fizarana/vondrona 12 (D12 MC) avy amin'ny kisoa samihafa, fitsapana ANOVA tokana;####p < 0,0001 по сравнению с D0, **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p < 0.0001 raha oharina amin'ny D0, **p < 0.01 raha oharina amin'ny D12 Ctrl).b Troponin-T (maitso), connexin 43 (mena) ary DAPI (manga) ao anaty fizarana fo vao avy nosarahina (D0) na fizarana fo novolena tamin'ny fepetra tsy miovaova (Ctrl) na fepetra CTCM (MC) nandritra ny 12 andro) amin'ny sary immunofluorescence solontena (ambaratonga banga = 100 µm). Fandrefesana ny fahamarinan'ny rafitry ny sela ao am-po amin'ny alalan'ny faharanitan-tsaina artifisialy (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) silaka/vondrona avy amin'ny kisoa samihafa, atao ny fitsapana ANOVA tokana; ####p < 0.0001 raha oharina amin'ny D0 ary ****p < 0.0001 raha oharina amin'ny D12 Ctrl). Fandrefesana ny fahamarinan'ny rafitry ny sela ao am-po amin'ny alalan'ny faharanitan-tsaina artifisialy (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) silaka/vondrona avy amin'ny kisoa samihafa, atao ny fitsapana ANOVA tokana; ####p < 0.0001 raha oharina amin'ny D0 ary ****p < 0.0001 raha oharina amin'ny D12 Ctrl). Количественная оценка структурной целостности сердечной тпкани искусственным интеллектом (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 7 (D12 Ctrl) от разных свиней, проводится однофакторный тест ANOVA; Fandrefesana ny fahamarinan'ny rafitry ny sela ao am-po amin'ny alàlan'ny faharanitan-tsaina artifisialy (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) fizarana/vondrona avy amin'ny kisoa samihafa, fitsapana ANOVA tokana natao; ####p < 0.0001 raha oharina amin'ny D0 sy ****p < 0.0001 raha oharina amin'ny D12 Ctrl).人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) silaka/vondrona tsirairay avy amin'ny kisoa samihafa, fitsapana ANOVA lalana iray;####p01 相0001 ，####p01 ， ####p01 相0. < 0.0001 与 D12 Ctrl 相比）.人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) silaka/vondrona isaky ny kisoa isan-karazany, andrana ANOVA lalana iray;##p0 < 0. < 0.0001 与 D12 Ctrl 相比）. Искусственный интеллект для количественной оценки структурной целостности сердечной ткани (n = 7 (D0), 12 (D0) Ctrl (D12) Ctrl (D12) срезов/группу каждой из разных свиней, односторонний тест ANOVA; Faharanitan-tsaina artifisialy mba handrefesana ny fahamarinan'ny rafitry ny sela ao am-po (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) fizarana/vondrona tsirairay amin'ireo kisoa samihafa, fitsapana ANOVA tokana; ####p<0.0001 vs .D0 Ho fampitahana ****p < 0.0001 raha oharina amin'ny D12 Ctrl). c Sary maneho (ankavia) sy fandrefesana (ankavanana) ho an'ny silaka fo nolokoina tamin'ny loko trichrome Masson (Scale bare = 500 µm) (n = silaka 10/vondrona avy amin'ny kisoa samihafa, atao ny fitsapana ANOVA tokana; ####p < 0.0001 raha oharina amin'ny D0 ary ***p < 0.001 raha oharina amin'ny D12 Ctrl). c Sary maneho (ankavia) sy fandrefesana (ankavanana) ho an'ny silaka fo nolokoina tamin'ny loko trichrome Masson (Scale bare = 500 µm) (n = silaka 10/vondrona avy amin'ny kisoa samihafa, atao ny fitsapana ANOVA tokana; #### p < 0.0001 raha oharina amin'ny D0 ary ***p < 0.001 raha oharina amin'ny D12 Ctrl). c Репрезентативные изображения (слева) и количественная оценка (справа) срезов сердца, ary без покрытия = 500 мкм) (n = 10 срезов/группу от разных свиней, выполняется односторонний тест ANOVA; #### p < 0,00001 сведный 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Sary maneho (ankavia) sy fandrefesana (ankavanana) ny fizarana fo nolokoina tamin'ny loko trichrome Masson (ambaratonga tsy voaloko = 500 µm) (n = fizarana 10/vondrona avy amin'ny kisoa samihafa, fitsapana ANOVA tokana natao; #### p < 0 .0001 raha oharina amin'ny D0 ary ***p < 0.001 raha oharina amin'ny D12 Ctrl). c 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像（左）和量化（右）（裸尺度（裸尺度 （裸尺度 = 5（n0）个切片/组，每组来自不同的猪，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0.0001 与D0 相比，***p < 0.001 C 。 C 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 （左 左） 量化 （右） 裸尺度 裸尺度 裸尺度裸尺度 = 500 µm） （n = 10 个 切片 组 每 组 来自 不同 猪 ， 进行 单向 单向 单向 0##0.与D0 相比，***p < 0.001 与D12 Ctrl 相比）. c Репрезентативные изображения (слева) и количественный анализ (справа) срезов сердца, ary = 500 мкм) (n = 10 срезов/группа, каждый от другой свиньи, протестировано с помощью однофакторного дисперси <###; 0,0001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Sary maneho (ankavia) sy fandrefesana (ankavanana) amin'ny fizarana fo nolokoina tamin'ny loko trichrome Masson (tsy misy soratra = 500 µm) (n = fizarana 10/vondrona, avy amin'ny kisoa samihafa, nosedraina tamin'ny alalan'ny fanadihadiana ny fiovaovana amin'ny lafiny iray;### # p < 0.0001 raha oharina amin'ny D0, ***p < 0.001 raha oharina amin'ny D12 Ctrl).Ny bara fahadisoana dia maneho ny salan'isa ± fivilian-dàlana mahazatra.
Nieritreritra izahay fa amin'ny alàlan'ny fampidirana molekiola kely amin'ny fitaovana fambolena, dia azo hatsaraina ny fahamarinan'ny kardiomiosità ary mihena ny fivoaran'ny fibrosis mandritra ny fambolena CTCM. Noho izany dia nojerenay ireo molekiola kely tamin'ny fampiasana ny kolontsaina fanaraha-maso statika anay20,21 noho ny vitsy an'isa amin'ireo anton-javatra mampifangaro. Dexamethasone (Dex), triiodothyronine (T3), ary SB431542 (SB) no nofidina ho an'ity fitiliana ity. Ireo molekiola kely ireo dia efa nampiasaina tamin'ny kolontsaina hiPSC-CM teo aloha mba hamporisihana ny fahamatoran'ny kardiomiosità amin'ny alàlan'ny fampitomboana ny halavan'ny sarcomere, ny T-tubules, ary ny hafainganam-pandehan'ny fitarihana. Ho fanampin'izany, samy fantatra fa manakana ny fivontosana ny Dex (glucocorticoid) sy SB29,30. Noho izany, dia notsapainay raha toa ka hanatsara ny fahamarinan'ny rafitry ny fizarana fo ny fampidirana iray na fitambaran'ireo molekiola kely ireo. Ho an'ny fitiliana voalohany, ny fatran'ny fitambarana tsirairay dia nofidina mifototra amin'ny fifantohana ampiasaina matetika amin'ny modely fambolena sela (1 μM Dex27, 100 nM T327, ary 2.5 μM SB31). Rehefa avy novolena nandritra ny 12 andro, ny fampiarahana ny T3 sy Dex dia niafara tamin'ny fahamarinan'ny rafitry ny kardiomiosità tsara indrindra sy ny fanavaozana ny fibrous kely indrindra (Sary Fanampiny 4 sy 5). Ankoatra izany, ny fampiasana avo roa heny na avo roa heny amin'ireo fifantohana T3 sy Dex ireo dia niteraka voka-dratsy raha oharina amin'ny fifantohana mahazatra (Sary Fanampiny 6a, b).
Taorian'ny fitiliana voalohany, dia nanao fampitahana mivantana ny toe-javatra 4 momba ny kolontsaina izahay (Sary 4a): Ctrl: fizarana fo novolena tao amin'ny kolontsaina statika voalaza teo aloha tamin'ny fampiasana ny fitaovana nohatsarainay; 20.21 TD: T3 sy Ctrl s Nanampy Dex ny Alarobia; MC: fizarana fo novolena tao amin'ny CTCM tamin'ny fampiasana ny fitaovana nohatsarainay teo aloha; ary MT: CTCM miaraka amin'ny T3 sy Dex nampiana tao amin'ny fitaovana. Rehefa afaka 12 andro nambolena, dia nijanona ho mitovy amin'ny sela vaovao nojerena tamin'ny alalan'ny MTT assay ny fahafahan'ny sela MS sy MT miaina (Sary 4b). Mahaliana fa ny fanampiana T3 sy Dex tamin'ny kolontsaina transwell (TD) dia tsy nahatonga fanatsarana lehibe teo amin'ny fahafahan'ny sela velona raha oharina amin'ny toe-javatra Ctrl, izay manondro ny anjara toerana lehibe amin'ny fanentanana mekanika amin'ny fitazonana ny fahafahan'ny fizarana fo miaina.
Kisarisary fanandramana mampiseho ireo fepetra efatra momba ny kolontsaina ampiasaina hanombanana ny vokatry ny fientanentanana mekanika sy ny famenoana T3/Dex amin'ny akora mandritra ny 12 andro. b Ny grafika bara dia mampiseho ny fandrefesana ny fahavelomana 12 andro aorian'ny fambolena amin'ny toe-javatra fambolena 4 rehetra (Ctrl, TD, MC, ary MT) raha oharina amin'ny silaka fo vaovao (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD ary D12 MT), silaka/vondrona 12 (D12 MC) avy amin'ny kisoa samihafa, atao ny fitsapana ANOVA tokana; ####p < 0.0001, ###p < 0.001 raha oharina amin'ny D0 ary **p < 0.01 raha oharina amin'ny D12 Ctrl). b Ny grafika bara dia mampiseho ny fandrefesana ny fahavelomana 12 andro aorian'ny fambolena amin'ny toe-javatra fambolena 4 rehetra (Ctrl, TD, MC, ary MT) raha oharina amin'ny silaka fo vaovao (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD ary D12 MT), silaka/vondrona 12 (D12 MC) avy amin'ny kisoa samihafa, atao ny fitsapana ANOVA tokana; ####p < 0.0001, ###p < 0.001 raha oharina amin'ny D0 ary **p < 0.01 raha oharina amin'ny D12 ctrl). b Гистограма показывает количественую оценку жизнеспособности через 12 дней после культивирования во вселох 4 (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD и D12 MT), 12 (D12 MT), 12 (D12 MT) разных свиней, проводится односторонний тест ANOVA; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 по сравнению с D0 и **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). b Ny grafika bara dia mampiseho ny fandrefesana ny fahavelomana amin'ny 12 andro aorian'ny fambolena amin'ny toe-javatra fambolena 4 rehetra (fanaraha-maso, TD, MC, ary MT) raha ampitahaina amin'ny fizarana fo vaovao (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD, ary D12 MT), fizarana/vondrona 12 (D12 MC) avy amin'ny kisoa samihafa, fitsapana ANOVA tokana; ####p < 0.0001, ###p < 0.001 vs. D0 sy **p < 0.01 raha ampitahaina amin'ny D12 Ctrl). b 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) (n = 18 (Dl5) 、 TD 18 (D0)、和D12 MT)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；####p < 0.0001，###p < 0.001 ，p < 0.001 ，p < 0.001 与与D12控制）.b 4 12 (D12 MC) b Гистограмама, показывающая все 4 условия культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими (сердими (сердими) (сердими) (сердими) (сердими) (сердими) 15. <0,01 по сравнению с контролем D12). b Histograma mampiseho ny fepetra rehetra momba ny kolontsaina 4 (fanaraha-maso, TD, MC ary MT) raha ampitahaina amin'ny fizarana fo vaovao (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD ary D12 MT), avy amin'ny fizarana/vondrona kisoa 12 (D12 MC) samihafa, fitsapana ANOVA tokana; ####p<0.0001, ###p<0.001 vs. D0, **p<0.01 vs. fanaraha-maso D12). Ny grafika bara dia mampiseho ny fandrefesana ny fikorianan'ny gliokaozy 12 andro aorian'ny fambolena amin'ny toe-javatra fambolena 4 rehetra (Ctrl, TD, MC, ary MT) raha oharina amin'ny silaka fo vaovao (D0) (n = silaka 6/vondrona avy amin'ny kisoa samihafa, atao ny fitsapana ANOVA tokana; ###p < 0.001, raha oharina amin'ny D0 ary ***p < 0.001 raha oharina amin'ny D12 Ctrl). Ny grafika bara dia mampiseho ny fandrefesana ny fikorianan'ny gliokaozy 12 andro aorian'ny fambolena amin'ny toe-javatra fambolena 4 rehetra (Ctrl, TD, MC, ary MT) raha oharina amin'ny silaka fo vaovao (D0) (n = silaka 6/vondrona avy amin'ny kisoa samihafa, atao ny fitsapana ANOVA tokana; ###p < 0.001, raha oharina amin'ny D0 ary ***p < 0.001 raha oharina amin'ny D12 Ctrl). c Гистограма показывает количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после культивирования во всенко 4 усех (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 6 срезов/группу от разных свиней, роднин стоясти) ANOVA; ###p < 0,001 по сравнению с D0 sy ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). Ny Histograma c dia mampiseho ny fandrefesana ny fikorianan'ny gliokaozy 12 andro aorian'ny fambolena eo ambanin'ny fepetra fambolena 4 rehetra (fanaraha-maso, TD, MC ary MT) raha oharina amin'ny fizarana fo vaovao (D0) (n = fizarana 6/vondrona avy amin'ny kisoa samihafa, fitsapana ANOVA tokana natao; ###p < 0.001 raha oharina amin'ny D0 ary ***p < 0.001 raha oharina amin'ny D12 Ctrl). c 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) 相比，厹天的葡萄糖通量定量（n = 6 片/组，来自不同猪，单向执行ANOVA 测试；###p < 0.001 ，盎所 0.001 ，与 D1与D12 Ctrl 相比）. C 条形图 显示 所有 4 种 条件 （（ctrl 、 td 、 mc 和 mt） 新鲜 心脏 切片 切片 ， 片 切片培养 后 后 12 天 的 通量 定量 （n = 6 片/组 ， 来自 猪 ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， 猪 猪单同行< 0.001，与D0 相比，***p < 0.001 与D12 Ctrl 相比）. c Гистограма, показывающая количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после культивирования для всех для всех культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 6 срезов/группа, avy amin'ny разинных Были проведены тесты ANOVA ###p < 0,001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению с D12 (контроль). c Histograma mampiseho ny fandrefesana ny fivezivezen'ny gliokaozy 12 andro aorian'ny fambolena ho an'ny toe-javatra 4 rehetra amin'ny fambolena (fanaraha-maso, TD, MC, ary MT) raha oharina amin'ny fizarana fo vaovao (D0) (n = fizarana 6/vondrona, avy amin'ny kisoa samihafa, tokana. Raha natao ny fitsapana ANOVA, ###p < 0.001 raha oharina amin'ny D0, ***p < 0.001 raha oharina amin'ny D12 (fanaraha-maso).d Tetika fanadihadiana momba ny fihenjanana amin'ny sela vaovao (manga), MC (maitso) andro faha-12, ary MT (mena) andro faha-12 amin'ny teboka folo amin'ny fizarana sela (n = silaka 4/vondrona, fitsapana ANOVA tokana; tsy nisy fahasamihafana lehibe teo amin'ireo vondrona). e Tetika Volkano mampiseho ireo fototarazo maneho fahasamihafana ao amin'ny fizarana fo vaovao (D0) raha oharina amin'ny fizarana fo novolena tamin'ny toe-javatra tsy miova (Ctrl) na tamin'ny toe-javatra MT (MT) nandritra ny 10-12 andro. f Sarintany mafana amin'ny fototarazo sarcomere ho an'ny fizarana fo novolena tamin'ny toe-javatra tsirairay avy. Ny bara diso dia maneho ny salan'isa ± fivilian-dàlana mahazatra.
Ny fiankinan-doha amin'ny metabolisma amin'ny fifindrana avy amin'ny oksidasiona asidra matavy mankany amin'ny glycolysis dia mariky ny dedifferentiation cardiomyocyte. Ny cardiomyocyte tsy matotra dia mampiasa glucose voalohany indrindra amin'ny famokarana ATP ary manana mitochondria hypoplastic miaraka amin'ny cristae vitsivitsy5,32. Ny fanadihadiana momba ny fampiasana glucose dia naneho fa amin'ny toe-javatra MC sy MT, ny fampiasana glucose dia mitovy amin'ny an'ny sela andro 0 (Sary 4c). Na izany aza, ny santionan'ny Ctrl dia naneho fitomboana be dia be amin'ny fampiasana glucose raha oharina amin'ny sela vaovao. Izany dia manondro fa ny fitambaran'ny CTCM sy T3/Dex dia manatsara ny fahaveloman'ny sela ary miaro ny phenotype metabolika amin'ny fizarana fo novolena 12 andro. Ho fanampin'izany, ny fanadihadiana momba ny fihenjanana dia naneho fa ny haavon'ny fihenjanana dia nijanona ho mitovy amin'ny sela fo vaovao nandritra ny 12 andro tamin'ny toe-javatra MT sy MS (Sary 4d).
Mba handinihana ny fiantraikan'ny CTCM sy T3/Dex amin'ny tontolon'ny fandikana manerantany ny sela silaka fo, dia nanao RNAseq tamin'ny silaka fo avy amin'ny toe-javatra efatra samihafa amin'ny kolontsaina izahay (Angon-drakitra Fanampiny 1). Mahaliana fa ny fizarana MT dia naneho fitoviana avo lenta amin'ny fandikana amin'ny sela fo vaovao, miaraka amin'ny gène 16 samihafa ihany no nanehoany ny tenany tamin'ny gène 13 642. Na izany aza, araka ny nasehonay teo aloha, ny silaka Ctrl dia naneho gène 1229 samihafa ny fanehoany ny tenany taorian'ny 10–12 andro tao amin'ny kolontsaina (Sary 4e). Ireo angon-drakitra ireo dia nohamafisin'ny qRT-PCR an'ny gène fo sy fibroblast (Sary Fanampiny 7a-c). Mahaliana fa ny fizarana Ctrl dia naneho fihenan'ny gène fo sy ny tsingerin'ny sela ary ny fampandehanana ny fandaharan'asan'ny gène mamaivay. Ireo angon-drakitra ireo dia manondro fa ny dedifferentiation, izay matetika mitranga aorian'ny fambolena maharitra, dia mihena tanteraka amin'ny toe-javatra MT (Sary Fanampiny 8a,b). Ny fandinihana tsara ny fototarazon'ny sarcomere dia naneho fa ao anatin'ny fepetra MT ihany no voatahiry ireo fototarazo mandika ny sarcomere (Sary 4f) sy ny fantsona ion (Sary Fanampiny 9), miaro azy ireo amin'ny fanakanana eo ambanin'ny fepetra Ctrl, TD, ary MC. Ireo angon-drakitra ireo dia mampiseho fa amin'ny alalan'ny fampifangaroana ny fanentanana mekanika sy humoral (T3/Dex), ny transcriptome amin'ny silaka fo dia afaka mijanona ho mitovy amin'ny silaka fo vaovao rehefa afaka 12 andro ao anaty kolontsaina.
Ireo zavatra hita tamin'ny fandikana ireo dia tohanan'ny zava-misy fa ny fahamarinan'ny rafitry ny kardiomiosit ao amin'ny fizarana fo dia voatahiry tsara indrindra ao anatin'ny fepetra MT mandritra ny 12 andro, araka ny asehon'ny connexin 43 tsy simba sy eo an-toerana (Sary 5a). Ankoatra izany, ny fibrosis ao amin'ny fizarana fo ao anatin'ny fepetra MT dia nihena be raha oharina amin'ny Ctrl ary mitovy amin'ny fizarana fo vaovao (Sary 5b). Ireo angon-drakitra ireo dia mampiseho fa ny fitambaran'ny fientanentanana mekanika sy ny fitsaboana T3/Dex dia miaro tsara ny rafitry ny fo ao amin'ny fizarana fo ao anaty kolontsaina.
Sary immunofluorescence solontenan'ny troponin-T (maitso), connexin 43 (mena), ary DAPI (manga) ao anaty fizarana fo vao avy nosarahina (D0) na novolena nandritra ny 12 andro tamin'ny fepetra efatra rehetra momba ny kolontsaina fizarana fo (bar mizana = 100 µm). ). Fandrefesana ny fahamarinan'ny rafitry ny sela ao am-po amin'ny alalan'ny faharanitan-tsaina artifisialy (n = 7 (D0 sy D12 Ctrl), silaka/vondrona 5 (D12 TD, D12 MC sy D12 MT) avy amin'ny kisoa samihafa, atao ny fitsapana ANOVA tokana; ####p < 0.0001 raha oharina amin'ny D0 sy *p < 0.05, na ****p < 0.0001 raha oharina amin'ny D12 Ctrl). Fandrefesana ny fahamarinan'ny rafitry ny sela ao am-po amin'ny alalan'ny faharanitan-tsaina artifisialy (n = 7 (D0 sy D12 Ctrl), silaka/vondrona 5 (D12 TD, D12 MC sy D12 MT) avy amin'ny kisoa samihafa, atao ny fitsapana ANOVA tokana; #### p < 0.0001 raha oharina amin'ny D0 sy *p < 0.05, na ****p < 0.0001 raha oharina amin'ny D12 Ctrl). Количественная оценка структурной целостности ткани сердца с помощью искусственного интеллекта (n = 7 (D0 и D15) D12 MT) срезов/группу от разных свиней, проведен однофакторный тест ANOVA #### p < 0,0001 по сравнению с D0 ,**** и0 ли с D0 ,**** и и по < 0,**** и по < 0,**** и по < 0,**** и сравнению с D12 Ctrl). Fandrefesana ny fahamarinan'ny rafitry ny sela ao am-po amin'ny fampiasana faharanitan-tsaina artifisialy (n = 7 (D0 sy D12 Ctrl), fizarana/vondrona 5 (D12 TD, D12 MC sy D12 MT) avy amin'ny kisoa samihafa, fitsapana ANOVA tokana natao; #### p < 0.0001 raha oharina amin'ny D0 sy *p < 0.05 na ****p < 0.0001 raha oharina amin'ny D12 Ctrl).对不同猪的心脏组织结构完整性（n = 7（D0 和D12 Ctrl）、5（D12 TD,D12 MC 和D12 MT）切片/组）进行人工智能量化，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0.0001 与D0 和*p < 0.05 ，書有 p < 0.05 ，書所05与D12 Ctrl 相比）.对 不同 猪 的 心脏 结构 完整性 （n = 7 （d0 和 d12 ctrl） （5 （d12 td 、 d12 mc 和 d1智能量 化 进行 单向 单向 单向 测试 ； ########## p < 0.0001 与D0 和*p < 0.05 相月0 ， 戸 相 0.相比）.Fandrefesana ny fahamarinan'ny rafitry ny sela ao am-po amin'ny fampiasana faharanitan-tsaina artifisialy amin'ny kisoa samihafa (n = 7 (D0 sy D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC sy D12 MT) fizarana/vondrona) miaraka amin'ny fitsapana ANOVA tokana;#### p < 0,0001 по сравнению с D0 и *p < 0,05 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). #### p < 0.0001 raha oharina amin'ny D0 ary *p < 0.05 na ****p < 0.0001 raha oharina amin'ny D12 Ctrl). b Sary maneho sy fandrefesana ny isan'ny silaka fo nolokoina tamin'ny loko trichrome Masson (Scale bar = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD, ary D12 MC), silaka/vondrona 9 (D12 MT) avy amin'ny kisoa samihafa, natao ny fitsapana ANOVA tokana; ####p < 0.0001 raha oharina amin'ny D0 sy ***p < 0.001, na ****p < 0.0001 raha oharina amin'ny D12 Ctrl). b Sary maneho sy fandrefesana ny isan'ny silaka fo nolokoina tamin'ny loko trichrome Masson (Scale bar = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD, ary D12 MC), silaka/vondrona 9 (D12 MT) avy amin'ny kisoa samihafa, natao ny fitsapana ANOVA tokana; ####p < 0.0001 raha oharina amin'ny D0 sy ***p < 0.001, na ****p < 0.0001 raha oharina amin'ny D12 Ctrl). b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромным красителем Массона 0 = массона мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD и D12 MC), 9 (D12 MT) срезов/группу от разных свиней, выполняется односторонний односторонний ##0, ##0 ANOVA; сравнению с D0 и ***p < 0,001 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). b Sary maneho sy fandrefesana ny fizarana fo nolokoina tamin'ny loko trichrome Masson (bara mizana = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD ary D12 MC), fizarana/vondrona 9 (D12 MT) avy amin'ny kisoa samihafa, natao ANOVA tokana; ####p < 0.0001 vs. D0 sy ***p < 0.001 na ****p < 0.0001 vs. D12 Ctrl). b 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像和量化（比例尺= 500 µm）！D = 10（D10）！Dl = 10） TD 和D12 MC），来自不同猪的9 个（D12 MT）切片/组，进行单因素方差分析；####p < 0.00001 0.001，或****p < 0.0001 与D12 Ctrl 相比）. b 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 和 量化 （比例 尺 尺 尺 = 500 µm） = 500 µm） ） ctrl 、 d12 td 和 d12 mc） 来自 不同 的 9 个 d12 mt 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片/组，进行单因素方差分析；####p < 0.0001 与D0 相比 ， *0****p <0. 0.0001 与D12 Ctrl 相比）. b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромом Массона (мастабная = лим50) (D0, D12 Ctrl, D12 TD и D12 MC), 9 (D12 MT) срезов от разных свиней / группы, один- способ ANOVA ####p < 0,0001 по, *******p < 0,0001 по, *** лю сра; ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). b Sary maneho sy fandrefesana ny fizarana fo nolokoina tamin'ny trichrome Masson (bara mizana = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD ary D12 MC), fizarana 9 (D12 MT) avy amin'ny kisoa/vondrona samihafa, fomba ANOVA iray; ####p < 0.0001 raha oharina amin'ny D0, ***p < 0.001 na ****p < 0.0001 raha oharina amin'ny D12 Ctrl).Ny bara fahadisoana dia maneho ny salan'isa ± fivilian-dàlana mahazatra.
Farany, ny fahafahan'ny CTCM manahaka ny hypertrophy cardiac dia nojerena tamin'ny alàlan'ny fampitomboana ny fihenjanan'ny sela cardiac. Tao amin'ny CTCM, nitombo avy amin'ny 80 mmHg ka hatramin'ny 80 mmHg ny tsindrin'ny efitrano rivotra ambony indrindra. Art. (fihenjanan'ny ara-dalàna) hatramin'ny 140 mmHg Art. (Sary 6a). Mifanitsy amin'ny fitomboana 32% amin'ny fihenjanan'ny sela izany (Sary 6b), izay naseho teo aloha ho toy ny isan-jato fihenjanan'ny sela cardiac mifanaraka amin'izany ilaina mba hahazoana halavan'ny sarcomere mitovy amin'ny hita amin'ny hypertrophy. Ny fihenjanan'ny sela cardiac sy ny hafainganam-pandehan'ny sela cardiac mandritra ny fihenan-kery sy ny fialan-tsasatra dia nijanona ho tsy miova nandritra ny enina andro nanaovana fambolena (Sary 6c). Ny sela cardiac avy amin'ny toe-javatra MT dia nampiharana fihenjanan'ny sela cardiac (MT (Ara-dalàna)) na fihenjanan'ny sela cardiac (OS)) nandritra ny enina andro. Efa taorian'ny efatra andro nanaovana fambolena, dia niakatra be ny biomarker hypertrophic NT-ProBNP tao amin'ny tontolo iainana teo ambanin'ny toe-javatra MT (OS) raha oharina amin'ny toe-javatra MT (ara-dalàna) (Sary 7a). Ho fanampin'izany, rehefa afaka enina andro nanaovana fambolena, dia nitombo be ny haben'ny sela ao amin'ny MT (OS) (Sary 7b) raha oharina amin'ny faritra ao amin'ny fo MT (ara-dalàna). Ankoatra izany, nitombo be ny fifindran'ny nokleary NFATC4 tao amin'ny sela mivelatra loatra (Sary 7c). Ireo valiny ireo dia mampiseho ny fivoarana miandalana amin'ny fanavaozana ara-patholojika aorian'ny hyperdistension ary manohana ny hevitra fa ny fitaovana CTCM dia azo ampiasaina ho sehatra handinihana ny famantarana ny hypertrophy cardiac vokatry ny fihenjanana.
Ny soritr'aretin'ny tsindrin'ny efitrano rivotra, ny tsindrin'ny efitrano ranoka, ary ny fandrefesana ny fihetsehan'ny sela dia manamafy fa ny tsindrin'ny efitrano dia manova ny tsindrin'ny efitrano ranoka, ka miteraka fihetsehana mifanaraka amin'izany amin'ny silaka sela. b Ny isan-jaton'ny fihenjanana sy ny fiolahana maneho ny tahan'ny fihenjanana ho an'ny fizarana sela mihenjana ara-dalàna (volomboasary) sy mihenjana loatra (manga). c Ny grafika bara mampiseho ny fotoana tsingerina (n = silaka 19 isaky ny vondrona, avy amin'ny kisoa samihafa), ny fotoana fihenana (n = silaka 18-19 isaky ny vondrona, avy amin'ny kisoa samihafa), ny fotoana fialan-tsasatra (n = silaka 19 isaky ny vondrona, avy amin'ny kisoa samihafa) ), ny haben'ny fihetsehan'ny sela (n = silaka 14/vondrona, avy amin'ny kisoa samihafa), ny hafainganam-pandeha ambony indrindra systolic (n = silaka 14/vondrona, avy amin'ny kisoa samihafa) ary ny tahan'ny fialan-tsasatra ambony indrindra (n = 14 (D0), 15 (D6) ) fizarana/vondrona) avy amin'ny kisoa samihafa), ny fitsapana t roa-rambony an'ny Student dia tsy naneho fahasamihafana manan-danja tamin'ny paramètre rehetra, izay manondro fa ireo paramètre ireo dia nijanona ho tsy miova nandritra ny 6 andro nikoloana niaraka tamin'ny overvoltage. Ny bara fahadisoana dia maneho ny salan'isa ± fivilian-dàlana mahazatra.
Fandrefesana ny fifantohan'ny NT-ProBNP ao anaty media fambolena avy amin'ny silaka fo ambolena eo ambanin'ny fepetra MT normal stretch (Norm) na overstretching (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, ary D4 MTOS) silaka/vondrona avy amin'ny kisoa samihafa, ANOVA roa lalana no atao; **p < 0.01 raha oharina amin'ny stretch mahazatra). Fandrefesana ny fifantohan'ny NT-ProBNP ao anaty media fambolena avy amin'ny silaka fo ambolena eo ambanin'ny fepetra MT normal stretch (Norm) na overstretching (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, ary D4 MTOS) silaka/vondrona avy amin'ny kisoa samihafa, ANOVA roa lalana no atao; **p < 0.01 raha oharina amin'ny stretch mahazatra).Histograma isaina amin'ny fifantohana NT-ProBNP ao anaty fitaovana fambolena avy amin'ny silaka fo ambolena eo ambanin'ny fepetra ara-dalàna MT stretch (norm) na overstretch (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, ary D4).MTOS) silaka/vondrona avy amin'ny kisoa samihafa, atao ny famakafakana ny fiovaovan'ny singa roa;**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p < 0.01 raha oharina amin'ny fihenjanana mahazatra). a 在MT 正常拉伸(Norm) 或过度拉伸(OS) 条件下培养的心脏切片培养基中NT-ProBNP 浓度的条度的条度4 (D2 MTNorm)、3（D2 MTOS、D4 MTNorm 和D4 MTOS）来自不同猪的切片/组，进行双向方差分析；p中方差分析；中中与与与0.01). Famaritana ny fifantohan'ny NT-ProBNP amin'ny silaka am-po voavolavola amin'ny fepetra MT normal (Norm) na overstretch (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm和D4 MTOS) avy amin'ny 猪的切片/组，可以喌双; ** raha ampitahaina amin'ny fanitarana ara-dalàna, p <0.01).histograma Fandrefesana ny fifantohana NT-ProBNP ao amin'ny silaka fo ambolena eo ambanin'ny fepetra ara-dalàna MT stretch (norm) na overstretch (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm) ary D4 MTOS) silaka/vondrona avy amin'ny kisoa samihafa, fanadihadiana roa sosona momba ny fiovaovana;**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p < 0.01 raha oharina amin'ny fihenjanana mahazatra). b Sary maneho ny silaka fo voaloko troponin-T sy WGA (ankavia) ary ny fandrefesana ny haben'ny sela (ankavanana) (n = 330 (D6 MTOS), sela 369 (D6 MTNorm)/vondrona avy amin'ny silaka 10 samihafa avy amin'ny kisoa samihafa, natao ny fitsapana t-mpianatra roa rambony; ****p < 0.0001 raha oharina amin'ny fihenjanana mahazatra). b Sary maneho ny silaka fo voaloko troponin-T sy WGA (ankavia) ary ny fandrefesana ny haben'ny sela (ankavanana) (n = 330 (D6 MTOS), sela 369 (D6 MTNorm)/vondrona avy amin'ny silaka 10 samihafa avy amin'ny kisoa samihafa, natao ny fitsapana t-mpianatra roa rambony; ****p < 0.0001 raha oharina amin'ny fihenjanana mahazatra). b. (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) клеток/группу из 10 разных срезов от разных свиней, два- проводится х t-стой ****p < 0,0001 по сравнению с нормальным растяжением). b Sary maneho ny fizarana fo voaloko troponin-T sy AZP (ankavia) ary ny fandrefesana ny haben'ny sela (ankavanana) (n = 330 (D6 MTOS), sela 369 (D6 MTNorm)/vondrona avy amin'ny fizarana 10 samihafa avy amin'ny kisoa samihafa, natao ny fitsapana t-Student roa rambony; ****p < 0.0001 raha oharina amin'ny karazana mahazatra). b 用肌钙蛋白-T 和WGA（左）和细胞大小量化（右）染色的心脏切片的代表性（小量化（右）染色的心脏切片的代表性（图像MTOS），来自不同猪的10 个不同切片的369（D6 MTNorm）细胞/组，两进行有尾学生t检验；与正常拉伸相比，****p < 0.0001）。 b Sary maneho ny silaka fo nolokoina tamin'ny calcarein-T sy WGA (ankavia) ary ny haben'ny sela (ankavanana) (n = 330 (D6 MTOS), 369 avy amin'ny silaka 10 samihafa (D6 MTNorm)) Sela/组，两方法有尾学生t test；raha ampitahaina amin'ny fivelarana ara-dalàna，****p < 0.0001). b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слева) и количественная оцленка (разменка) 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) из 10 различных срезов от разных свиней Клетки/группа, двусторонние критерий Ста;юд0н сравнению с нормальным растяжением). b Sary maneho ny fizarana fo voaloko troponin-T sy AZP (ankavia) ary fandrefesana ny haben'ny sela (ankavanana) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) avy amin'ny fizarana 10 samihafa avy amin'ny kisoa samihafa) Sela/vondrona, fepetra roa sosona t an'ny mpianatra; ****p < 0.0001 raha oharina amin'ny karazana mahazatra). c Sary maneho ny silaka fon'ny MTOS andro faha-0 sy faha-6 nasiana marika immunolabel ho an'ny troponin-T sy NFATC4 ary fandrefesana ny fifindran'ny NFATC4 mankany amin'ny vihy CM (n = 4 (D0), silaka/vondrona 3 (D6 MTOS) avy amin'ny kisoa samihafa, natao ny fitsapana t-mpianatra roa rambony; *p < 0.05). c Sary maneho ny silaka fon'ny MTOS andro faha-0 sy faha-6 nasiana marika immunolabel ho an'ny troponin-T sy NFATC4 ary ny fandrefesana ny fifindran'ny NFATC4 mankany amin'ny vihy CM (n = 4 (D0), silaka/vondrona 3 (D6 MTOS) avy amin'ny kisoa samihafa, Two-tailed Student t-test no atao; *p < 0.05). c Репрезентативные изображения для срезов сердца 0 и 6 дней MTOS, иммуномеченых для тропонина-Т и NFATC4, и колицич транслокации NFATC4 в ядра кавернозных клеток (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срезов/группу от разных свиней , вылнядяетсрикрирой Стьюдента; *p < 0,05). c Sary maneho ny fizarana fo amin'ny MTOS 0 sy 6 andro, nasiana marika immunomarked ho an'ny troponin-T sy NFATC4, ary ny fandrefesana ny fifindran'ny NFATC4 ao amin'ny atin'ny sela cavernous (n = 4 (D0), silaka/vondrona 3 (D6 MTOS) avy amin'ny kisoa samihafa) natao tamin'ny fitsapana t-Student roa rambony; *p < 0.05). c 用于肌钙蛋白-T 和NFATC4 免疫标记的第0 天和第6 天MTOS心脏切片的代表性图像，以及来自不同猪的NFATC4 易位至CM 细胞核的量化（n = 4 (D0)、 MTOS) 3 (D0)、进行双尾学生t 检验；*p < 0.05). c Sary solontenan'ny calcanin-T sy NFATC4 immunolabeling 第0天和第6天MTOS heart slices, ary NFATC4 avy amin'ny NFATC4 易位至CM cell nucleus 的 quantity化 (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) / 爇时间双尾学生et 电影；*p < 0.05). c Репрезентативные изображения срезов сердца MTOS amin'ny 0 и 6 день для иммуномаркировки тропонином-Т и NFATC4 и колицнч транслокации NFATC4 в ядра CM от разных свиней (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срез/группа, два- хвостатый t-критерий Сть0, *0). c Sary maneho ny silaka fon'ny MTOS amin'ny andro faha-0 sy faha-6 ho an'ny fametahana marika troponin-T sy NFATC4 ary ny fandrefesana ny fifindran'ny NFATC4 ao amin'ny atin'ny CM avy amin'ny kisoa samihafa (n = 4 (D0), silaka/vondrona 3 (D6 MTOS), mpianatra manana t-criterion roa rambony; *p < 0.05).Ny bara diso dia maneho ny salan'isa ± ny fivilian-dàlana mahazatra.
Ny fikarohana momba ny aretim-po amin'ny alalan'ny fandikana dia mitaky modely sela izay mamerina tsara ny tontolo manodidina ny fo. Ato amin'ity fandalinana ity, dia novolavolaina sy nofaritana ny fitaovana CTCM izay afaka mandrisika ireo faritra manify dia manify ao am-po. Ny rafitra CTCM dia ahitana fanentanana elektromekanika mifanaraka ara-batana sy fanatsarana ny ranon-javatra T3 sy Dex. Rehefa nampiharina tamin'ireo singa ireo ny faritra fon'ny kisoa, dia nijanona ho toy ny ao amin'ny sela fo vaovao ny fahavelomany, ny fahamarinan'ny firafiny, ny fiasan'ny metabolika, ary ny fanehoana ny fandikana azy ireo taorian'ny 12 andro nikoloana azy. Ankoatra izany, ny fihenjanana tafahoatra amin'ny sela fo dia mety hiteraka hypertrophy amin'ny fo vokatry ny hyperextension. Amin'ny ankapobeny, ireo valiny ireo dia manohana ny anjara toerana lehibe amin'ny toe-javatra ara-batana amin'ny fitazonana ny endriky ny fo ara-dalàna ary manome sehatra ho an'ny fitiliana fanafody.
Maro ireo anton-javatra mandray anjara amin'ny famoronana tontolo iainana tsara indrindra ho an'ny fiasan'ny cardiomyocytes sy ny fahavelomany. Ny miharihary indrindra amin'ireo anton-javatra ireo dia mifandraika amin'ny (1) fifandraisana eo amin'ny sela, (2) fanentanana elektromekanika, (3) anton-javatra humoral, ary (4) substrates metabolika. Ny fifandraisana ara-batana eo amin'ny sela sy ny sela dia mitaky tambajotra telo dimensions sarotra misy karazana sela maro tohanan'ny matrix extracellular. Sarotra ny mamerina amin'ny laoniny in vitro ny fifandraisana sela sarotra toy izany amin'ny alàlan'ny fambolena miaraka ny karazana sela tsirairay, saingy azo tanterahina mora foana amin'ny alàlan'ny toetra organotype an'ny fizarana fo.
Tena ilaina amin'ny fitazonana ny endriky ny fo ny fihenjanana mekanika sy ny fanentanana elektrika ny cardiomyocytes33,34,35. Na dia efa nampiasaina betsaka aza ny fanentanana mekanika ho an'ny fanamafisana sy ny fahamatorana hiPSC-CM, dia vao haingana no nanandrana fanentanana mekanika ny silaka fo amin'ny kolontsaina mampiasa ny enta-mavesatra uniaxial. Ireo fandalinana ireo dia mampiseho fa ny enta-mavesatra mekanika 2D uniaxial dia misy fiantraikany tsara amin'ny endriky ny fo mandritra ny kolontsaina. Amin'ireo fandalinana ireo, ny ampahan'ny fo dia na nofenoina hery tensile isometric17, enta-mavesatra linear auxotonic18, na ny tsingerin'ny fo dia naverina noforonina tamin'ny alàlan'ny feedback transducer force sy tension drives. Na izany aza, ireo fomba ireo dia mampiasa fihenjanana sela uniaxial tsy misy fanatsarana ny tontolo iainana, ka miteraka fanakanana ny fototarazo fo maro na fanehoana tafahoatra ny fototarazo mifandraika amin'ny valinteny fihenjanana tsy ara-dalàna. Ny CTCM voalaza eto dia manome fanentanana elektromekanika 3D izay manahaka ny tsingerin'ny fo voajanahary amin'ny resaka fotoana tsingerina sy fihenjanana ara-batana (fihenjanana 25%, systole 40%, diastole 60%, ary 72 beats isan-minitra). Na dia tsy ampy hihazonana ny fahamarinan'ny sela aza ity fientanentanana mekanika telo refy ity irery, dia ilaina ny fitambaran'ny fientanentanana humoral sy mekanika amin'ny fampiasana T3/Dex mba hihazonana tsara ny fahavelomana, ny fiasana ary ny fahamarinan'ny sela.
Mitana anjara toerana lehibe amin'ny fanovana ny endriky ny fon'ny olon-dehibe ny singa humoral. Nasongadina tao amin'ny fanadihadiana HiPS-CM izany izay nampiana ny T3 sy Dex tamin'ny fitaovana fambolena mba hanafainganana ny fahamatorana sela. Mety hisy fiantraikany amin'ny fitaterana asidra amine, siramamy ary kalsioma manerana ny fonon'ny sela ny T33. Ankoatra izany, ny T3 dia mampiroborobo ny fanehoana MHC-α sy ny fihenan'ny MHC-β, mampiroborobo ny fiforonan'ny myofibrils mihetsika haingana ao amin'ny cardiomyocytes matotra raha oharina amin'ny myofibrils mihetsika miadana ao amin'ny CM foetus. Ny tsy fahampian'ny T3 amin'ny marary hypothyroid dia miteraka fahaverezan'ny tarika myofibrillar sy fihenan'ny tahan'ny fivoaran'ny feo37. Miasa amin'ny receptors glucocorticoid ny Dex ary hita fa mampitombo ny contractility myocardial ao amin'ny fo mitokana; 38 ity fanatsarana ity dia heverina fa mifandray amin'ny fiantraikany amin'ny fidirana calcium deposit-driven (SOCE) 39,40. Ankoatra izany, ny Dex dia mifamatotra amin'ny receptors azy, ka miteraka valinteny intracellular midadasika izay manakana ny fiasan'ny hery fiarovana sy ny fivontosana30.
Ny valin'ny fikarohanay dia mampiseho fa ny fanentanana ara-batana mekanika (MS) dia nanatsara ny fahombiazan'ny kolontsaina amin'ny ankapobeny raha oharina amin'ny Ctrl, saingy tsy nahavita nitazona ny fahavelomana, ny fahamarinan'ny rafitra, ary ny fanehoana ny fo nandritra ny 12 andro tao amin'ny kolontsaina. Raha ampitahaina amin'ny Ctrl, ny fanampiana T3 sy Dex tamin'ny kolontsaina CTCM (MT) dia nanatsara ny fahavelomana ary nitazona ny mombamomba ny fandikana mitovy, ny fahamarinan'ny rafitra, ary ny asa metabolika miaraka amin'ny sela fo vaovao mandritra ny 12 andro. Ho fanampin'izany, tamin'ny alàlan'ny fanaraha-maso ny haavon'ny fivelaran'ny sela, dia noforonina ny modely hypertrophy cardiac vokatry ny hyperextension tamin'ny fampiasana STCM, izay mampiseho ny fahaiza-manaon'ny rafitra STCM. Tsara homarihina fa na dia matetika aza ny fanavaozana ny fo sy ny fibrosis dia misy taova tsy simba izay afaka manome ny cytokines mety ary koa ny phagocytosis sy ny singa fanavaozana hafa, ny ampahan'ny fo dia mbola afaka manahaka ny fizotran'ny fibrotic ho setrin'ny adin-tsaina sy ny ratra. Efa nodinihina teo aloha tao amin'ity modely tapa-cardiac ity izany. Tsara homarihina fa ny masontsivana CTCM dia azo ovaina amin'ny alàlan'ny fanovana ny amplitude sy ny matetika amin'ny tsindry/elektrika mba hanahafana ny toe-javatra maro toy ny tachycardia, bradycardia, ary fanohanana ny fivezivezen'ny ra mekanika (fo tsy misy herinaratra mekanika). Izany dia mahatonga ny rafitra ho antonony amin'ny fitiliana zava-mahadomelina. Ny fahafahan'ny CTCM mamolavola ny fiakaran'ny tosidrà vokatry ny fiezahana tafahoatra dia manokatra lalana ho an'ny fitsapana ity rafitra ity ho an'ny fitsaboana manokana. Ho famaranana, ity fanadihadiana ity dia mampiseho fa ny fihenjanana mekanika sy ny fanentanana humoral dia tena ilaina amin'ny fitazonana ny kolontsaina amin'ny fizarana sela ao am-po.
Na dia milaza aza ny angon-drakitra aseho eto fa sehatra tena mampanantena ho an'ny famolavolana ny myocardium tsy simba ny CTCM, dia misy fetrany ihany ity fomba fambolena ity. Ny fetrany lehibe amin'ny fambolena CTCM dia ny fametrahana fihenjanana mekanika dinamika mitohy amin'ny silaka, izay manakana ny fahafahana manara-maso mavitrika ny fihenjanan'ny silaka fo mandritra ny tsingerina tsirairay. Ankoatra izany, noho ny haben'ny fizarana fo kely (7 mm), dia voafetra ny fahafahana manombana ny fiasan'ny systolic ivelan'ny rafitra fambolena amin'ny alàlan'ny sensor hery nentim-paharazana. Ao amin'ny sora-tanana ankehitriny, dia nandresy ampahany tamin'io fetrany io izahay tamin'ny alàlan'ny fanombanana ny voltase optika ho toy ny famantarana ny fiasan'ny contractile. Na izany aza, ity fetrany ity dia mitaky asa bebe kokoa ary mety ho voavaha amin'ny ho avy amin'ny alàlan'ny fampidirana fomba fanaraha-maso optika ny asan'ny silaka fo amin'ny fambolena, toy ny sarintany optika amin'ny alàlan'ny kalsioma sy loko saro-pady amin'ny voltase. Ny fetrany iray hafa amin'ny CTCM dia ny tsy fifehezan'ny modely miasa ny fihenjanana ara-batana (preload sy afterload). Ao amin'ny CTCM, ny tsindry dia nateraka tamin'ny lalana mifanohitra mba hamerenana ny fihenjanana ara-batana 25% amin'ny diastole (fihenjanana feno) sy systole (faharetan'ny fihenjanana mandritra ny fanentanana elektrika) amin'ny sela lehibe dia lehibe. Tokony hesorina amin'ny endrika CTCM amin'ny ho avy io fetra io amin'ny alàlan'ny fanerena sahaza ny sela ao am-po avy amin'ny andaniny roa ary amin'ny fampiharana ny fifandraisana marina eo amin'ny tsindry sy ny volume izay mitranga ao amin'ny efi-po.
Ny fanavaozana vokatry ny fihenjanana tafahoatra voalaza ato amin'ity sora-tanana ity dia voafetra amin'ny fanahafana ireo famantarana hyperstretch hypertrophic. Noho izany, ity modely ity dia afaka manampy amin'ny fandalinana ny famantarana hypertrophic vokatry ny fihenjanana tsy mila singa humoral na neural (izay tsy misy ato amin'ity rafitra ity). Ilaina ny fanadihadiana fanampiny mba hampitomboana ny hamaroan'ny CTCM, ohatra, ny fiaraha-miompy amin'ny sela fiarovana, ny singa humoral plasma mikoriana, ary ny innervation rehefa miara-miompy amin'ny sela neuronal dia hanatsara ny mety ho fanaovana modely aretina amin'ny CTCM.
Kisoa telo ambin'ny folo no nampiasaina tamin'ity fandalinana ity. Ny fomba fitsaboana biby rehetra dia natao mifanaraka amin'ny torolàlana momba ny andrim-panjakana ary neken'ny Komitin'ny Fikarakarana sy Fampiasana Biby ao amin'ny Oniversiten'i Louisville. Nohidiana ny andohalambo aorta ary nofenoina rano 1 L ny fo (110 mM NaCl, 1.2 mM CaCl2, 16 mM KCl, 16 mM MgCl2, 10 mM NaHCO3, 5 U/mL heparin, pH hatramin'ny 7.4); Notehirizina tao anaty vahaolana mangatsiaka be ho an'ny aretim-po ny fo mandra-pitaterana azy ireo any amin'ny laboratoara eo ambony ranomandry izay mazàna <10 minitra. Notehirizina tao anaty vahaolana mangatsiaka be ho an'ny aretim-po ny fo mandra-pitaterana azy ireo any amin'ny laboratoara eo ambony ranomandry izay mazàna <10 minitra. сердца хранили в ледяном кардиоплегическом растворе до транспортировки в лабораторию на льду, что обычно за10мает <. Notehirizina tao anaty vahaolana mangatsiaka be ho an'ny aretim-po ny fo mandra-pitaterana azy ireo any amin'ny laboratoara amin'ny ranomandry, izay mazàna maharitra <10 minitra.将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钟。将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钟。 Держите сердца в ледяной кардиоплегии до транспортировки в лабораторию на льду, обычно <10 мин. Tazomy eo ambony ranomandry ny fo raha misy cardioplegia mandra-pitaterana azy any amin'ny laboratoara eo ambony ranomandry, matetika latsaky ny 10 minitra.
Novolavolaina tamin'ny rindrambaiko famolavolana (CAD) an'ny SolidWorks ny fitaovana CTCM. Vita amin'ny plastika akrilika mazava CNC ny efitrano fambolena, ny mpanasaraka ary ny efitrano rivotra. Vita amin'ny polyethylene avo lenta (HDPE) eo afovoany ny peratra fanohanana 7mm ny savaivony ary misy lavaka peratra-o mba handraisana ny peratra-o silikônina ampiasaina hanidiana ny fitaovana eo ambaniny. Misy fonon-silikônina manify manasaraka ny efitrano fambolena amin'ny takelaka fisarahana. Voakapa tamin'ny laser avy amin'ny takelaka silikônina 0.02″ ny fonon-silikônina ary manana hamafin'ny 35A. Voakapa tamin'ny laser avy amin'ny takelaka silikônina 1/16″ ny gasket silikônina ambany sy ambony ary manana hamafin'ny 50A. Visy vy tsy misy harafesina 316L sy voanjo elatra no ampiasaina hamehezana ny sakana sy hamoronana tombo-kase tsy miditra rivotra.
Natao hampidirina amin'ny rafitra C-PACE-EM ny solaitrabe circuit pirinty (PCB). Ny socket connector an'ny milina soisa eo amin'ny PCB dia mifandray amin'ny elektrôda grafita amin'ny alalan'ny tariby varahina voapetaka volafotsy sy visy varahina 0-60 izay visy ao anatin'ireo elektrôda. Ny solaitrabe circuit pirinty dia apetraka ao amin'ny fonon'ny mpanonta 3D.
Ny fitaovana CTCM dia fehezin'ny "programmable pneumatic actuator" (PPD) izay mamorona tsindry fivezivezena voafehy mitovy amin'ny tsingerin'ny fo. Rehefa mitombo ny tsindry ao anatin'ny efitrano rivotra, dia mivelatra miakatra ny fonon'ny silikônina mora miolaka, ka manosika ny fitaovana ho eo ambanin'ny toerana misy ny sela. Avy eo dia hivelatra amin'ny alalan'ity fandroahana ranoka ity ny velaran'ny sela, manahaka ny fivelaran'ny fo ara-batana mandritra ny diastole. Amin'ny fara tampon'ny fialan-tsasatra, dia ampiharina amin'ny alalan'ny elektroda grafita ny fanentanana elektrika, izay mampihena ny tsindry ao amin'ny efitrano rivotra ary miteraka fihenan'ny fizarana sela. Ao anatin'ny fantsona dia misy valva hemostatic misy sensor tsindry mba hamantarana ny tsindry ao amin'ny rafitra rivotra. Ny tsindry tsapan'ny sensor tsindry dia ampiharina amin'ny mpanangona angon-drakitra mifandray amin'ny solosaina finday. Izany dia ahafahana manara-maso tsy tapaka ny tsindry ao anatin'ny efitrano entona. Rehefa tratra ny tsindry ambony indrindra ao amin'ny efitrano (standard 80 mmHg, 140 mmHg OS), dia nasaina nandefa famantarana tany amin'ny rafitra C-PACE-EM ny fitaovana fanangonana angon-drakitra mba hamoronana famantarana voltase biphasic mandritra ny 2 ms, napetraka amin'ny 4 V.
Noraisina ny fizarana fo ary natao toy izao ny fomba fambolena tao anaty lavaka 6: Afindrao avy ao anaty fitoeran-javatra famindrana ireo fo voaangona avy ao anaty fitoeran-javatra mankany amin'ny lovia misy cardioplegia mangatsiaka (4° C.). Notokanana tamin'ny lelany sterile ny ventricle havia ary notapatapahina ho sombintsombiny 1-2 cm3. Ireo sakana sela ireo dia nafatotra tamin'ny fanohanana sela tamin'ny lakaoly sela ary napetraka tao anaty fandroana sela microtome mihovotrovotra misy vahaolana Tyrode ary nasiana oksizenina tsy tapaka (3 g/L 2,3-butanedione monooxime (BDM), 140 mM NaCl (8.18 g) . ), 6 mM KCl (0.447 g), 10 mM D-glucose (1.86 g), 10 mM HEPES (2.38 g), 1 mM MgCl2 (vahaolana 1 ml 1 M), 1.8 mM CaCl2 (vahaolana 1.8 ml 1 M), hatramin'ny 1 L ddH2O). Napetraka hanapaka silaka matevina 300 µm amin'ny matetika 80 Hz, miaraka amin'ny hovitrovitra mitsivalana 2 mm, ary tahan'ny fandrosoana 0.03 mm/s ny mikrôtôma mihovotrovotra. Voahodidin'ny ranomandry ny kovetabe mba hampangatsiaka ny vahaolana ary notazonina tamin'ny 4°C ny mari-pana. Afindrao ny sombin-taolana avy amin'ny kovetabe mikraoba mankany amin'ny kovetabe famelomana misy vahaolana Tyrode misy oksizenina tsy tapaka eo ambony ranomandry mandra-pahazoana sombin-taolana ampy ho an'ny takelaka fambolena iray. Ho an'ny kolontsaina transwell, ny sombin-taolana dia nafatotra tamin'ny fanohanana polyurethane sterile 6 mm ny sakany ary napetraka tao anaty 6 ml amin'ny fitaovana nohatsaraina (fitaovana 199, fanampin-tsakafo ITS 1x, FBS 10%, VEGF 5 ng/ml, FGF-alkaline 10 ng/ml ary antibiotika-antifungal 2X). Nampiharina tamin'ny sombin-taolana tamin'ny alàlan'ny C-Pace ny fanentanana elektrika (10 V, matetika 1.2 Hz). Ho an'ny toe-javatra TD, dia nampiana T3 sy Dex vaovao tamin'ny 100 nM sy 1 μM isaky ny fanovana ny fitaovana. Totoina amin'ny oksizenina intelo isan'andro ny fitaovana alohan'ny hanoloana azy. Novolena tao anaty incubator tamin'ny 37°C sy 5% CO2 ny sombin-sela.
Ho an'ny kolontsaina CTCM, napetraka teo amin'ny mpanonta 3D namboarina manokana tao anaty lovia Petri misy vahaolana Tyrode novaina ny fizarana sela. Natao hampitombo ny haben'ny silaka fo amin'ny 25% amin'ny velaran'ny peratra fanohanana ny fitaovana. Izany dia atao mba tsy hivelatra ireo fizarana fo rehefa avy nafindra avy amin'ny vahaolana Tyrode mankany amin'ny fitaovana ary mandritra ny diastole. Nampiasa lakaoly histoacrylic, napetraka teo amin'ny peratra fanohanana 7 mm ny savaivony ny fizarana 300 µm matevina. Rehefa avy nametaka ny fizarana sela amin'ny peratra fanohanana, dia tapaho ny fizarana sela mihoatra ary avereno ao anaty rano fandroana misy vahaolana Tyrode eo ambony ranomandry (4°C) ireo fizarana sela miraikitra mandra-pahatongan'ny fizarana ampy ho an'ny fitaovana iray. Tsy tokony hihoatra ny 2 ora ny fotoana fanodinana ho an'ny fitaovana rehetra. Rehefa avy nametaka ny fizarana sela 6 amin'ny peratra fanohanana azy ireo, dia natambatra ny fitaovana CTCM. Fenoina mialoha amin'ny fitaovana misy oksizenina 21 ml ny efitrano kolontsaina CTCM. Afindrao any amin'ny efitrano kolontsaina ny fizarana sela ary esory tsara ny rivotra miboiboika amin'ny pipette. Avy eo dia tarihina hiditra ao anaty lavaka ny fizarana sela ary tsindriana moramora eo amin'ny toerany. Farany, apetraho eo amin'ny fitaovana ny sarom-elektrôda ary afindrao ao amin'ny incubator ny fitaovana. Avy eo dia ampifandraiso amin'ny fantsona rivotra sy ny rafitra C-PACE-EM ny CTCM. Misokatra ny actuator pneumatic ary manokatra ny CTCM ny valva rivotra. Ny rafitra C-PACE-EM dia namboarina mba hanome 4 V amin'ny 1.2 Hz mandritra ny dingana biphasic mandritra ny 2 ms. Novaina indroa isan'andro ny fitaovana ary novaina indray mandeha isan'andro ny elektrôda mba hisorohana ny fiangonan'ny grafita eo amin'ny elektrôda. Raha ilaina, dia azo esorina amin'ny lavadrano fambolena ny fizarana sela mba hanesorana izay rivotra miboiboika mety ho latsaka eo ambaniny. Ho an'ny fepetra fitsaboana MT, dia nampiana T3/Dex vaovao isaky ny fanovana fitaovana miaraka amin'ny 100 nM T3 sy 1 μM Dex. Nambolena tao anaty incubator tamin'ny 37°C sy 5% CO2 ny fitaovana CTCM.
Mba hahazoana ny lalan-kizorana mivelatra amin'ny silaka fo, dia nisy rafitra fakantsary manokana novolavolaina. Fakan-tsary SLR (Canon Rebel T7i, Canon, Tokyo, Japon) no nampiasaina niaraka tamin'ny Navitar Zoom 7000 18-108mm macro lens (Navitar, San Francisco, CA). Natao tamin'ny mari-pana ao an-trano ny sary rehefa avy nosoloina fitaovana vaovao ny fitaovana. Napetraka amin'ny zoro 51° ny fakantsary ary voarakitra amin'ny frame 30 isan-tsegondra ny horonan-tsary. Voalohany, nampiasaina niaraka tamin'ny Image-J ny rindrambaiko open source (MUSCLEMOTION43) mba handrefesana ny fihetsiky ny silaka fo. Noforonina tamin'ny fampiasana MATLAB (MathWorks, Natick, MA, Etazonia) ny saron-tava mba hamaritana ireo faritra mahaliana amin'ny fikapohana ny silaka fo mba hisorohana ny tabataba. Ampiharina amin'ny sary rehetra ao anaty frame ny saron-tava voazarazara tanana ary avy eo alefa any amin'ny MUSCLEMOTION plug-in. Mampiasa ny hamafin'ny piksela ao amin'ny frame tsirairay ny Muscle Motion mba handrefesana ny fihetsehany mifandraika amin'ny frame reference. Noraketina, nosivana ary nampiasaina handrefesana ny fotoana tsingerina sy hanombanana ny fihenjanana amin'ny sela mandritra ny tsingerin'ny fo ny angon-drakitra. Nojerena taorian'ny fanodinana ny lahatsary voarakitra tamin'ny fampiasana sivana nomerika dingana voalohany amin'ny zero. Mba handrefesana ny fivelaran'ny sela (hatramin'ny fara tampony), dia natao ny fanadihadiana avy amin'ny fara tampony mba hanavahana ny fara tampony sy ny ambany ao amin'ny famantarana voarakitra. Ho fanampin'izany, dia tanterahina ny detrending amin'ny fampiasana polinômia laharana faha-6 mba hanafoanana ny fivezivezen'ny famantarana. Novolavolaina tao amin'ny MATLAB ny kaody fandaharana mba hamaritana ny fihetsehan'ny sela manerantany, ny fotoana tsingerina, ny fotoana fialan-tsasatra, ary ny fotoana fihenana (Kaody Fandaharana Fanampiny 44).
Ho an'ny famakafakana ny fihenjanana, amin'ny fampiasana ireo horonan-tsary mitovy noforonina ho an'ny fanombanana ny fihenjanana mekanika, dia nanara-maso sary roa maneho ny tendron'ny fihetsehana aloha izahay (ny teboka fihetsehana avo indrindra (ambony) sy ambany indrindra (ambany)) araka ny rindrambaiko MUSCLEMOTION. Avy eo dia nozarainay ireo faritra misy sela ary nampihatra endrika algorithma alokaloka tamin'ny sela voazara (Sary Fanampiny 2a). Avy eo dia nozaraina ho folo ambanin'ny tany ny sela voazara, ary ny fihenjanana amin'ny velarana tsirairay dia nokajiana tamin'ny fampiasana ity fampitoviana manaraka ity: Fihenjanana = (Sup-Sdown)/Sdown, izay Sup sy Sdown dia ny elanelan'ny endrika avy amin'ny aloka ambony sy ambany amin'ny lamba, tsirairay avy (Sary Fanampiny .2b).
Napetraka tao anaty paraformaldehyde 4% nandritra ny 48 ora ireo fizarana fo. Nohamainina tao anaty sucrose 10% sy 20% nandritra ny 1 ora ny sela voaraikitra, avy eo tao anaty sucrose 30% nandritra ny alina. Avy eo dia natsofoka tao anaty fitambarana mari-pana tsara indrindra (OCT compound) ireo fizarana ary nangatsiaka tsikelikely tao anaty rano fandroana isopentane/ranomandry maina. Tehirizo amin'ny -80 °C ireo sakana fametrahana OCT mandra-pisaraka. Nomanina ho fizarana misy hatevina 8 μm ireo slide.
Mba hanesorana ny OCT amin'ny fizarana fo, hafanaina eo amin'ny sakana fanafanana amin'ny 95 °C mandritra ny 5 minitra ireo slide. Ampio 1 ml PBS amin'ny slide tsirairay ary atsobohy mandritra ny 30 minitra amin'ny mari-pana efitrano, avy eo dia atsobohy ao anaty PBS mandritra ny 15 minitra amin'ny mari-pana efitrano ireo fizarana. Mba hisorohana ny fifamatoran'ny antikôra tsy manokana amin'ny santionany, ampio 1 ml amin'ny vahaolana BSA 3% amin'ny slide ary atsobohy mandritra ny 1 ora amin'ny mari-pana efitrano. Nesorina avy eo ny BSA ary nosasana tamin'ny PBS ireo slide. Asio marika amin'ny pensilihazo ny santionany tsirairay. Nampiana nandritra ny 90 minitra ny antikôra voalohany (nafangaro 1:200 tao anaty 1% BSA) (connexin 43 (Abcam; #AB11370), NFATC4 (Abcam; #AB99431) ary troponin-T (Thermo Scientific; #MA5-12960), avy eo dia nampiana antikôra faharoa (nafangaro 1:200 tao anaty 1% BSA) tamin'ny totozy Alexa Fluor 488 (Thermo Scientific; #A16079), tamin'ny bitro Alexa Fluor 594 (Thermo Scientific; #T6391) nandritra ny 90 minitra fanampiny. Nosasana in-3 tamin'ny PBS. Mba hanavahana ny fandokoana lasibatra amin'ny fototra, dia ny antikôra faharoa ihany no nampiasainay ho fanaraha-maso. Farany, nampiana ny fandokoana nokleary DAPI ary napetraka tao anaty vectashield (Vector Laboratories) ireo slide ary nofehezina tamin'ny loko fantsika. (Fampitomboana -x) sy mikroskopia Keyence miaraka amin'ny fampitomboana 40x.
Nampiasaina ho an'ny fandokoana WGA ny WGA-Alexa Fluor 555 (Thermo Scientific; #W32464) tamin'ny 5 μg/ml tao anaty PBS ary napetahana tamin'ny faritra raikitra nandritra ny 30 minitra tamin'ny mari-pana ao an-trano. Nosasana tamin'ny PBS avy eo ireo slide ary nampiana Sudan black tamin'ny slide tsirairay ary notehirizina nandritra ny 30 minitra. Nosasana tamin'ny PBS avy eo ireo slide ary nampiana vectashield embedding medium. Nojerena tamin'ny mikroskopia Keyence tamin'ny fampitomboana 40x ireo slide.
Nesorina tamin'ireo santionany araka ny voalaza etsy ambony ny OCT. Rehefa avy nesorina ny OCT dia atsobohy ao anaty vahaolana Bouin mandritra ny alina ireo slide. Nosasana tamin'ny rano madio nandritra ny adiny 1 ireo slide ary avy eo napetraka tao anaty vahaolana Bibrich aloe acid fuchsin nandritra ny 10 minitra. Avy eo dia nosasana tamin'ny rano madio ireo slide ary napetraka tao anaty vahaolana misy asidra phosphomolybdenum 5%/asidra phosphotungstic 5% nandritra ny 10 minitra. Tsy mila kobanina fa afindra mivantana ao anaty vahaolana manga aniline mandritra ny 15 minitra ireo slide. Avy eo dia nosasana tamin'ny rano madio ireo slide ary napetraka tao anaty vahaolana asidra acetic 1% nandritra ny 2 minitra. Nohamainina tamin'ny etanol 200 N ireo slide ary nafindra tao anaty xylene. Nojerena tamin'ny alalan'ny mikroskopia Keyence miaraka amin'ny tanjona 10x ireo slide voaloko. Norefesina tamin'ny alalan'ny rindrambaiko Keyence Analyzer ny isan-jaton'ny velaran'ny fibrosis.
CyQUANT™ MTT Cell Viability Assay (Invitrogen, Carlsbad, CA), laharana katalaogy V13154, araka ny protocole-n'ny mpanamboatra miaraka amin'ny fanovana sasany. Indrindra indrindra, nampiasaina ny punch fandidiana misy savaivony 6 mm mba hahazoana antoka fa mitovy ny haben'ny sela mandritra ny fanadihadiana MTT. Napetraka tsirairay tao anaty lavaka misy takelaka 12 misy substrate MTT ny sela araka ny protocole-n'ny mpanamboatra. Avela hilona amin'ny 37° C mandritra ny 3 ora ireo fizarana ary ny sela velona dia manova ny substrate MTT mba hamorona fitambarana formazan volomparasy. Soloy DMSO 1 ml ny vahaolana MTT ary avela hilona amin'ny 37°C mandritra ny 15 minitra mba hanesorana formazan volomparasy avy amin'ny fizarana fo. Nohamainina 1:10 tao anaty DMSO tao anaty takelaka ambany mazava misy lavaka 96 ireo santionany ary norefesina tamin'ny 570 nm ny hamafin'ny loko volomparasy tamin'ny fampiasana mpamaky takelaka Cytation (BioTek). Namboarina araka ny lanjan'ny silaka tsirairay amin'ny fo ny famakiana.
Nosoloina fitaovana misy 1 μCi/ml [5-3H]-glucose (Moravek Biochemicals, Brea, CA, Etazonia) ny fitaovana notapatapahina fo mba hanaovana ny famakafakana ny fampiasana gliokaozy araka ny voalaza teo aloha. Rehefa afaka 4 ora niompiana, dia ampio 100 µl ny fitaovana ao anaty fantsona microcentrifuge misokatra misy 100 µl 0.2 N HCl. Avy eo dia napetraka tao anaty fantsona scintillation misy 500 μl dH2O ny fantsona mba ho etona mandritra ny 72 ora amin'ny 37°C. Avy eo dia esory amin'ny fantsona scintillation ny fantsona microcentrifuge ary ampio 10 ml ny ranon-javatra scintillation. Natao tamin'ny fampiasana Tri-Carb 2900TR liquid scintillation analyzer (Packard Bioscience Company, Meriden, CT, Etazonia) ny fanisana scintillation. Avy eo dia nokajiana ny fampiasana gliokaozy ka noraisina ny fiasan'ny gliokaozy [5-3H], ny tsy fahatomombanan'ny fifandanjana sy ny fiaviana, ny fanalefahana ny [5-3H] ho lasa gliokaozy tsy misy marika, ary ny fahombiazan'ny fanoherana ny scintillation. Namboarina araka ny lanjan'ny fizarana ao am-po ny angon-drakitra.
Rehefa avy nampitovy ny sela tao amin'ny Trizol, dia nalaina avy amin'ny fizarana fo ny RNA tamin'ny fampiasana ny Qiagen miRNeasy Micro Kit #210874 araka ny protocole-n'ny mpanamboatra. Natao toy izao manaraka izao ny fanomanana, ny fandaharana ary ny famakafakana angon-drakitra tao amin'ny tranomboky RNAsec:
1 μg ny RNA isaky ny santionany no nampiasaina ho fitaovana fanombohana ny fanomanana ny tranomboky RNA. Noforonina tamin'ny alalan'ny NEBNext UltraTM RNA Library Preparation Kit ho an'ny Illumina (NEB, Etazonia) ny tranomboky fandaharana, araka ny tolo-kevitry ny mpanamboatra, ary nampiana kaody fanondroana tao amin'ny filaharan'ny toetra ho an'ny santionany tsirairay. Raha fintinina, nodiovina avy amin'ny RNA manontolo ny mRNA tamin'ny fampiasana vakana magnetika mifamatotra amin'ny poly-T oligonucleotides. Ny fanaparitahana dia tanterahina amin'ny fampiasana cation divalent amin'ny mari-pana avo ao amin'ny NEBNext First Strand Synthesis Reaction Buffer (5X). Ny cDNA kofehy voalohany dia novokarina tamin'ny alalan'ny fampiasana primer hexamer kisendrasendra sy M-MuLV reverse transcriptase (RNase H-). Ny cDNA kofehy faharoa dia avy eo novokarina tamin'ny alalan'ny DNA polymerase I sy RNase H. Ny overhangs sisa tavela dia novaina ho tendrony blunt amin'ny alalan'ny asan'ny exonuclease/polymerase. Aorian'ny adenylation ny tendrony 3′ amin'ny sombin-ADN, dia misy NEBNext Adapter misy rafitra hairpin loop mifatotra aminy mba hanomanana azy amin'ny hybridization. Ho an'ny fisafidianana sombin-cDNA amin'ny halavany tiana 150-200 bp. Nodiovina tamin'ny alalan'ny rafitra AMPure XP (Beckman Coulter, Beverly, Etazonia) ireo sombin-tahiry ao amin'ny tranomboky. Avy eo, USER Enzyme 3 μl (NEB, Etazonia) miaraka amin'ny cDNA voafantina araka ny habe nofatorana tamin'ny adaptatera no nampiasaina nandritra ny 15 minitra tamin'ny 37°C ary avy eo nandritra ny 5 minitra tamin'ny 95°C talohan'ny PCR. Natao tamin'ny alalan'ny Phusion High-Fidelity DNA polymerase, universal PCR primers, ary Index (X) primers ny PCR. Farany, nodiovina (AMPure XP system) ireo vokatra PCR ary nojerena tamin'ny alalan'ny rafitra Agilent Bioanalyzer 2100 ny kalitaon'ny tranomboky. Nojerena avy eo ny filaharan'ny tranomboky cDNA tamin'ny alalan'ny Novaseq sequencer. Novaina ho famakiana manta ny rakitra sary manta avy amin'ny Illumina tamin'ny alalan'ny CASAVA Base Calling. Tehirizina ao anaty rakitra endrika FASTQ(fq) izay misy filaharan'ny famakiana sy ny toetra fototra mifanaraka amin'izany ny angon-drakitra manta. Safidio ny HISAT2 mba hampifanarahana ny famakiana filaharan'ny voasivana amin'ny genome Sscrofa11.1 reference. Amin'ny ankapobeny, ny HISAT2 dia manohana ny genome amin'ny habe rehetra, anisan'izany ny genome lehibe kokoa noho ny 4 lavitrisa fototra, ary ny sanda mahazatra dia napetraka ho an'ny ankamaroan'ny masontsivana. Ny famakiana splicing avy amin'ny angon-drakitra RNA Seq dia azo ampifanarahana tsara amin'ny alàlan'ny HISAT2, ny rafitra haingana indrindra misy amin'izao fotoana izao, miaraka amin'ny fahamarinan'ny fomba mitovy na tsara kokoa noho ny fomba hafa rehetra.
Ny habetsahan'ny transcripts dia maneho mivantana ny haavon'ny fanehoana fototarazo. Ny haavon'ny fanehoana fototarazo dia tombanana amin'ny habetsahan'ny transcripts (isan'ny filaharana) mifandraika amin'ny genome na exons. Ny isan'ny famakiana dia mifandraika amin'ny haavon'ny fanehoana fototarazo, ny halavan'ny fototarazo, ary ny halaliny filaharana. Nokajiana ny FPKM (sombiny isaky ny arivo mpivady fototra amin'ny transcript filaharana isaky ny tapitrisa mpivady fototra) ary voafaritra ny sandan'ny P amin'ny fanehoana fahasamihafana amin'ny alàlan'ny fonosana DESeq2. Avy eo dia nokajianay ny tahan'ny fahitana diso (FDR) ho an'ny sandan'ny P tsirairay amin'ny alàlan'ny fomba Benjamini-Hochberg9 mifototra amin'ny fiasa R "p.adjust" namboarina.
Ny ARN nalaina avy amin'ny fizarana fo dia novaina ho cDNA tamin'ny fifantohana 200 ng/μl tamin'ny fampiasana ny SuperScript IV Vilo Master mix avy amin'ny Thermo (Thermo, cat. no. 11756050). Ny RT-PCR quantitative dia natao tamin'ny fampiasana takelaka fanehoan-kevitra mangarahara Applied Biosystems Endura Plate Microamp 384-well (Thermo, cat. no. 4483319) sy lakaoly optika microamp (Thermo, cat. no. 4311971). Ny fangaro fanehoan-kevitra dia nahitana fangaro Taqman Fast Advanced Master 5 µl (Thermo, cat # 4444557), Taqman Primer 0.5 µl ary H2O 3.5 µl nafangaro isaky ny lavaka. Natao ny tsingerin'ny qPCR mahazatra ary ny sandan'ny CT dia norefesina tamin'ny fampiasana fitaovana PCR real-time Applied Biosystems Quantstudio 5 (môdiola 384-well; vokatra # A28135). Novidina avy amin'ny Thermo (GAPDH (Ss03375629_u1), PARP12 (Ss06908795_m1), PKDCC (Ss06903874_m1), CYGB (Ss06900188_m1), RGL1 (Ss06868890_m1), ACTN1 (Ss01009508_mH), GATA4 (Ss03383805_u1), GJA1 (Ss03374839_u1), COL1A2 (Ss03375009_u1), COL3A1 (Ss04323794_m1), ACTA2 (Ss04245588_m1) ny sandan'ny CT an'ny santionany rehetra. Namboarina ho amin'ny fototarazo GAPDH ny sandan'ny CT an'ny santionany rehetra.
Nodinihina tamin'ny alalan'ny kitapo NT-ProBNP (pig) (Cat. No. MBS2086979, MyBioSource) ny famoahana ny NT-ProBNP araka ny protocole-n'ny mpanamboatra. Raha fintinina, nampiana indroa isaky ny lavaka ny 250 µl amin'ny santionany sy ny fenitra tsirairay. Avy hatrany rehefa avy nampiana ny santionany, dia ampio 50 µl amin'ny Assay Reagent A amin'ny lavaka tsirairay. Ahintsano moramora ny takelaka ary asio tombo-kase. Avy eo dia notehirizina tamin'ny 37°C nandritra ny adiny 1 ny takelaka. Avy eo dia sintonina ny vahaolana ary sasao in-4 amin'ny vahaolana fanasana 1X 350 µl, ary atsobohy mandritra ny 1-2 minitra isaky ny mandeha ny vahaolana fanasana. Avy eo dia ampio 100 µl amin'ny Assay Reagent B isaky ny lavaka ary asio tombo-kase amin'ny tombo-kase. Nohozongozonina moramora ny takelaka ary notehirizina tamin'ny 37°C nandritra ny 30 minitra. Sintonina ny vahaolana ary sasao in-5 amin'ny vahaolana fanasana 1X 350 µl. Ampio 90 µl amin'ny vahaolana substrate amin'ny lavaka tsirairay ary asio tombo-kase ny takelaka. Avela hilona amin'ny 37°C mandritra ny 10-20 minitra ny takelaka. Ampio 50 µl amin'ny vahaolana Stop amin'ny lavaka tsirairay. Norefesina avy hatrany ny takelaka tamin'ny fampiasana mpamaky takelaka Cytation (BioTek) napetraka amin'ny 450 nm.
Natao ny fanadihadiana ny hery mba hisafidianana ny haben'ny vondrona izay hanome hery >80% hamantarana fiovana tanteraka 10% amin'ny masontsivana miaraka amin'ny tahan'ny hadisoana Karazana I 5%. Natao ny fanadihadiana ny hery mba hisafidianana ny haben'ny vondrona izay hanome hery >80% hamantarana fiovana tanteraka 10% amin'ny masontsivana miaraka amin'ny tahan'ny hadisoana Karazana I 5%. Анализ мощности был выполнен для выбора размеров групп, которые обеспечат >80% мощности для обнаруженибт 10% изменения параметра с 5% частотой ошибок типа I. Natao ny fanadihadiana ny hery mba hisafidianana ny haben'ny vondrona izay hanome hery >80% hamantarana ny fiovan'ny masontsivana tanteraka 10% miaraka amin'ny tahan'ny hadisoana Karazana I 5%.进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％I功效以检测参数中10％绝对变化和5％I小甎田。进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％I功效以检测参数中10％绝对变化和5％I小甎田。 Был проведен анализ мощности для выбора размера группы, который обеспечил бы > 80% мощности для обнаругложениа изменения параметров и 5% частоты ошибок типа I. Natao ny fanadihadiana ny hery mba hisafidianana haben'ny vondrona izay hanome hery >80% hamantarana ny fiovan'ny masontsivana tanteraka 10% sy ny tahan'ny hadisoana karazana I 5%.Nofantenana kisendrasendra ireo fizarana sela talohan'ny fanandramana. Tsy nisy fandinihana ny toe-javatra rehetra ary novahana ny santionany rehefa avy nohadihadiana ny angon-drakitra rehetra. Nampiasaina hanaovana ny fanadihadiana statistika rehetra ny rindrambaiko GraphPad Prism (San Diego, CA). Ho an'ny antontan'isa rehetra, ny sandan'ny p dia noheverina ho manan-danja amin'ny sanda <0.05. Ho an'ny antontan'isa rehetra, ny sandan'ny p dia noheverina ho manan-danja amin'ny sanda <0.05. Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. Ho an'ny antontan'isa rehetra, ny sandan'ny p dia noheverina ho manan-danja amin'ny sanda <0.05.对于所有统计数据，p 值在会<0.05 时被认为是显着的。对于所有统计数据，p 值在会<0.05 时被认为是显着的。 Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. Ho an'ny antontan'isa rehetra, ny sandan'ny p dia noheverina ho manan-danja amin'ny sanda <0.05.Natao tamin'ny angona ny fitsapana t-mpianatra roa sosona miaraka amin'ny fampitahana 2 monja. Nampiasaina ny ANOVA tokana na roa sosona mba hamaritana ny maha-zava-dehibe eo amin'ny vondrona maromaro. Rehefa nanao fitsapana post hoc, dia nampiharina ny fanitsiana an'i Tukey mba handraisana an-tsaina ny fampitahana maromaro. Ny angon-drakitra RNAsec dia manana fiheverana statistika manokana rehefa kajy ny FDR sy p.adjust araka ny voalaza ao amin'ny fizarana Methods.
Raha mila fanazavana fanampiny momba ny famolavolana ny fandalinana, jereo ny famintinana ny Tatitra Fikarohana Momba ny Nature mifandray amin'ity lahatsoratra ity.