Daalụ maka ịga leta Nature.com. Ụdị ihe nchọgharị ị na-eji nwere nkwado CSS pere mpe. Maka ahụmịhe kachasị mma, anyị na-akwado ka ị jiri ihe nchọgharị emelitere (ma ọ bụ gbanyụọ Ọnọdụ Ndakọrịta na Internet Explorer). Ka ọ dị ugbu a, iji hụ na nkwado na-aga n'ihu, anyị ga-egosi saịtị ahụ na-enweghị ụdị na JavaScript.
Ọ dị mkpa maka sistemụ in vitro a pụrụ ịtụkwasị obi nke nwere ike ịmụgharị gburugburu ebe obibi nke obi nke ọma maka nnwale ọgwụ. N'ihi na obere usoro ọdịbendị anụ ahụ mmadụ edugala na nkọwa na-ezighi ezi nke mmetụta ọgwụ obi. N'ebe a, anyị emepụtala ụdị omenala anụ ahụ obi (CTCM) nke na-akpali mkpụrụ obi site na elektrọnik ma na-agafe mgbatị ahụ n'oge usoro systolic na diastolic nke okirikiri obi. Mgbe ụbọchị iri na abụọ nke ọdịbendị gasịrị, ụzọ a mere ka akụkụ obi dịkwuo mma, mana ọ kwadoghị iguzosi ike n'ezi ihe ha. Ya mere, mgbe enyochachara obere molekul, anyị chọpụtara na mgbakwunye nke 100 nM triiodothyronine (T3) na 1 μM dexamethasone (Dex) na usoro anyị nọgidere na-enwe obere nhazi nke akụkụ ahụ ruo ụbọchị iri na abụọ. Na njikọta na ọgwụgwọ T3/Dex, sistemụ CTCM nọgidere na-enwe profaịlụ ederede, ịdị ndụ, ọrụ metabolic, na iguzosi ike n'ezi ihe n'otu ọkwa dị ka anụ ahụ obi ọhụrụ ruo ụbọchị iri na abụọ. Tinyere nke ahụ, oke ịgbatị akwara obi n'ọdịnala na-akpali mgbaàmà obi hypertrophic, na-enye ihe akaebe na ikike CTCM nwere iṅomi ọnọdụ hypertrophic nke mgbatị obi kpatara. Na mmechi, CTCM nwere ike ịme ihe nlereanya nke physiology na pathophysiology nke obi n'ọdịnala ruo ogologo oge, na-eme ka a hụ na a pụrụ ịtụkwasị obi na nyocha ọgwụ.
Tupu e mee nnyocha ahụike, a chọrọ usoro in vitro a pụrụ ịtụkwasị obi nke nwere ike imegharị gburugburu ebe obibi nke obi mmadụ nke ọma. Sistemụ ndị dị otú ahụ kwesịrị iṅomi mgbanwe usoro mekaniki, ọsọ obi, na njirimara electrophysiological. A na-ejikarị ụdị anụmanụ eme ihe dị ka ikpo okwu nyocha maka physiology obi na ntụkwasị obi pere mpe n'igosipụta mmetụta nke ọgwụ na obi mmadụ1,2. N'ikpeazụ, Ideal Cardiac Tissue Culture Experimental Model (CTCM) bụ ụdị nke nwere mmetụta dị ukwuu ma dị iche iche maka ọgwụgwọ na ọgwụ dị iche iche, na-emegharị physiology na pathophysiology nke obi mmadụ nke ọma3. Enweghị usoro dị otú ahụ na-egbochi nchọpụta nke ọgwụgwọ ọhụrụ maka ịda mbà n'obi4,5 ma edugawo na nsị obi ọgwụ dị ka isi ihe kpatara ịpụ na ahịa6.
N'ime afọ iri gara aga, a kwụsịla iji ọgwụ asatọ na-abụghị nke obi n'ọgwụ n'ihi na ha na-akpata ogologo oge QT nke na-eduga n'ọrịa obi na ọnwụ mberede7. Ya mere, enwere mkpa dị ukwuu maka atụmatụ nyocha preclinical a pụrụ ịdabere na ya iji chọpụta irè obi na nsí. Ojiji ọhụrụ nke cardiomyocytes sitere na mkpụrụ ndụ pluripotent (hiPS-CM) nke mmadụ kpatara n'oge na-adịbeghị anya na nyocha ọgwụ na nnwale nsí na-enye ngwọta nke nsogbu a. Agbanyeghị, ọdịdị na-eto eto nke hiPS-CMs na enweghị mgbagwoju anya multicellular nke anụ ahụ obi bụ oke mgbochi nke usoro a. Ọmụmụ ihe ndị na-adịbeghị anya egosila na enwere ike imeri mmachi a site na iji hiPS-CM mbụ mepụta hydrogels anụ ahụ obi obere oge mgbe mmalite nke mkpụkọ mberede na-amalite ma jiri nwayọọ nwayọọ na-amụba mkpali eletriki ka oge na-aga. Agbanyeghị, obere anụ ahụ hiPS-CM ndị a enweghị ihe onwunwe electrophysiological na contractile nke myocardium toro eto. Na mgbakwunye, anụ ahụ obi mmadụ nwere nhazi dị mgbagwoju anya karị, nke nwere ngwakọta dị iche iche nke ụdị mkpụrụ ndụ dị iche iche, gụnyere mkpụrụ ndụ endothelial, neurons, na stromal fibroblasts, nke ejikọtara site na otu protein extracellular matrix pụrụ iche. Ụdị dị iche iche nke ọnụọgụgụ ndị na-abụghị nke obi11,12,13 n'ime obi anụmanụ toro eto bụ ihe mgbochi dị ukwuu na imepụta anụ ahụ obi site na iji ụdị mkpụrụ ndụ nke ọ bụla. Mmachi ndị a dị mkpa na-emesi ike mkpa ọ dị ịmepụta ụzọ maka ịzụlite anụ ahụ myocardial na-adịghị emebi emebi n'okpuru ọnọdụ ahụike na ọrịa.
Akụkụ obi mmadụ dị gịrịgịrị (300 µm) egosila na ọ bụ ihe nlereanya dị mma maka myocardium mmadụ na-adịgide adịgide. Usoro a na-enye ohere ịnweta sistemụ 3D zuru oke nke yiri anụ ahụ obi mmadụ. Agbanyeghị, ruo 2019, ojiji nke akụkụ obi a zụlitere etolite ebelatala site na obere oge (awa 24) nke ọdịbendị. Nke a bụ n'ihi ọtụtụ ihe gụnyere enweghị mgbatị anụ ahụ-mechanical, njikọ ikuku-mmiri mmiri, na ojiji nke mgbasa ozi dị mfe nke na-anaghị akwado mkpa anụ ahụ obi. Na 2019, ọtụtụ otu nyocha gosipụtara na itinye ihe ndị dị n'ime sistemụ omenala anụ ahụ obi nwere ike ịgbatị ndụ omenala, melite ngosipụta obi, ma ṅomie ọrịa obi. Ọmụmụ ihe abụọ mara mma 17 na 18 na-egosi na ibu ibu dị iche iche nwere mmetụta dị mma na ụdị obi n'oge ọdịbendị. Agbanyeghị, ọmụmụ ihe ndị a ejighị ibu ibu dị iche iche nke usoro obi, ebe ọ bụ na akụkụ obi nwere ike tensile isometric 17 ma ọ bụ ibu ibu linear auxotonic 18. Usoro ndị a nke ịgbatị anụ ahụ butere nkwụsịtụ nke ọtụtụ mkpụrụ ndụ ihe nketa obi ma ọ bụ oke ngosipụta nke mkpụrụ ndụ ihe nketa metụtara mmeghachi omume mgbatị ahụ na-adịghị mma. Nke kachasị mkpa, Pitoulis et al. 19 mepụtara bat nke ọdịbendị mkpụrụ obi na-agbanwe agbanwe maka nhazigharị okirikiri obi site na iji nzaghachi transducer ike na draịva nrụgide. Ọ bụ ezie na sistemụ a na-enye ohere maka nhazi okirikiri obi in vitro ziri ezi karị, mgbagwoju anya na obere mmepụta nke usoro ahụ na-egbochi ojiji nke sistemụ a. Ụlọ nyocha anyị emepụtala usoro omenala dị mfe n'oge na-adịbeghị anya site na iji mkpali eletriki na usoro kachasị mma iji nọgide na-enwe ike nke akụkụ nke anụ ezi na anụ ahụ obi mmadụ ruo ụbọchị 620,21.
N'akwụkwọ edemede dị ugbu a, anyị na-akọwa ụdị omenala anụ ahụ obi (CTCM) site na iji akụkụ nke obi porcine nke na-agụnye ihe ngosi humoral iji weghachite physiology obi atọ na mgbasa pathophysiological n'oge usoro obi. CTCM a nwere ike ime ka izi ezi nke amụma ọgwụ tupu ọgwụgwọ ruo n'ọkwa a na-enwetabeghị mbụ site n'inye sistemụ obi dị ọnụ ala, nke na-arụ ọrụ n'etiti nke na-eṅomi physiology/pathophysiology nke obi anụmanụ maka nnwale ọgwụ tupu ọgwụgwọ.
Ihe mgbaàmà mekanikal hemodynamic na-arụ ọrụ dị oke mkpa n'ịnọgide na-enwe ọrụ cardiomyocyte na vitro 22,23,24. N'akwụkwọ edemede dị ugbu a, anyị emepụtala CTCM (Foto 1a) nke nwere ike iṅomi gburugburu obi ndị toro eto site n'ịkpalite ma mkpali eletriki na nke mekanikal na ugboro ole physiological (1.2 Hz, 72 beats kwa nkeji). Iji zere ịgbatị anụ ahụ gabigara ókè n'oge diastole, ejiri ngwaọrụ mbipụta 3D mee ka nha anụ ahụ dịkwuo elu site na 25% (Foto 1b). E nyere oge iji malite 100 ms tupu systole site na iji sistemụ nnweta data iji mepụtaghachi okirikiri obi zuru oke. Sistemụ omenala anụ ahụ na-eji ihe na-eme ka pneumatic rụọ ọrụ (LB Engineering, Germany) iji gbasaa akpụkpọ silicone na-agbanwe agbanwe iji mee ka mgbasawanye nke mkpụrụ obi dị n'ime ụlọ elu. E jikọtara sistemụ ahụ na ahịrị ikuku mpụga site na ihe na-agbanwe nrụgide, nke mere ka o kwe omume ịhazi nrụgide ahụ nke ọma (± 1 mmHg) na oge (± 1 ms) (Foto 1c).
a Jikọọ akụkụ anụ ahụ na mgbanaka nkwado 7 mm, nke egosiri na acha anụnụ anụnụ, n'ime ụlọ ọdịbendị nke ngwaọrụ ahụ. A na-ekewapụ ụlọ ọdịbendị ahụ site na mkpuchi silicone dị gịrịgịrị. Debe gasket n'etiti ụlọ ọ bụla iji gbochie mmiri ịgbapụta. Mkpuchi nke ngwaọrụ ahụ nwere elektrọd graphite nke na-enye mkpali eletriki. b Ngosipụta atụmatụ nke ngwaọrụ anụ ahụ buru ibu, mgbanaka nduzi na mgbanaka nkwado. A na-etinye akụkụ anụ ahụ (agba aja aja) na ngwaọrụ buru ibu yana mgbanaka nduzi etinye na oghere dị na nsọtụ mpụta nke ngwaọrụ ahụ. Jiri ntuziaka ahụ, jiri nlezianya tinye mgbanaka nkwado nke ejiri ihe nrapado acrylic nke anụ ahụ kpuchie n'elu akụkụ nke anụ ahụ obi. c Graph na-egosi oge mkpali eletriki dị ka ọrụ nke nrụgide ụlọ ikuku nke onye na-eme ihe na-emegharị pneumatic (PPD) na-achịkwa. Ejiri ngwaọrụ nnweta data mee ka mkpali eletriki mekọrịta site na iji ihe mmetụta nrụgide. Mgbe nrụgide dị na ụlọ omenala ruru oke setịpụrụ, a na-eziga akara mkpali na C-PACE-EM iji kpalite mkpali eletriki. d Foto nke CTCM anọ etinyere na shelf incubator. A na-ejikọ ngwaọrụ anọ na otu PPD site na sekit pneumatic, a na-etinyekwa ihe mmetụta nrụgide n'ime valvụ hemostatic iji nyochaa nrụgide dị na sekit pneumatic. Ngwaọrụ ọ bụla nwere akụkụ anụ ahụ isii.
Site n'iji otu ihe na-eme ka ikuku rụọ ọrụ, anyị nwere ike ijikwa ngwaọrụ CTCM anọ, nke ọ bụla n'ime ha nwere ike ijide akụkụ anụ ahụ isii (Foto 1d). Na CTCM, a na-agbanwe nrụgide ikuku dị n'ime ụlọ ikuku ka ọ bụrụ nrụgide synchronous na ụlọ mmiri mmiri ma na-akpali mmụba nke akụkụ obi (Foto 2a na Ihe nkiri Mgbakwunye 1). Nyocha nke ịgbatị anụ ahụ na 80 mm Hg. Art. gosiri ịgbatị akụkụ anụ ahụ site na 25% (Foto 2b). Egosila na ịgbatị pasent a kwekọrọ na ogologo sarcomere physiological nke 2.2–2.3 µm maka nkwekọrịta akụkụ obi nkịtị17,19,25. E jiri ntọala igwefoto omenala nyochaa mmegharị anụ ahụ (Foto Mgbakwunye 1). Oke na ọsọ nke mmegharị anụ ahụ (Foto 2c, d) kwekọrọ na ịgbatị n'oge okirikiri obi na oge n'oge systole na diastole (Foto 2b). Mgbatị na ọsọ nke anụ ahụ obi n'oge mgbatị na izu ike nọgidere na-adịgide ruo ụbọchị 12 na omenala (Foto 2f). Iji nyochaa mmetụta nke mkpali eletriki na nrụgide n'oge ọdịbendị, anyị mepụtara ụzọ maka ịchọpụta ntụpọ na-arụ ọrụ site na iji algọridim shading (Foto mgbakwunye 2a,b) ma nwee ike ịmata ọdịiche dị n'etiti ntụpọ na mkpali eletriki na enweghị ya. Akụkụ ahụ nke obi (Foto 2f). Na mpaghara a na-agagharị agagharị nke mbepụ (R6-9), voltaji n'oge mkpali eletriki dị elu 20% karịa na enweghị mkpali eletriki, nke na-egosi onyinye nke mkpali eletriki na ọrụ nkwekọrịta.
Ihe ndị a na-ahụ maka nrụgide ụlọ ikuku, nrụgide ụlọ mmiri, na nha mmegharị anụ ahụ na-egosi na nrụgide ụlọ na-agbanwe nrụgide ụlọ mmiri, na-eme ka akụkụ anụ ahụ na-agagharị. b Ihe ndị a na-ahụ maka pasentị nke mgbatị (acha anụnụ anụnụ) nke akụkụ anụ ahụ kwekọrọ na mgbatị pasentị (acha oroma). c Njem a tụrụ nke akụkụ obi kwekọrọ na ọsọ ngagharị a tụrụ. (d) Usoro ngagharị cyclic (ahịrị anụnụ anụnụ) na ọsọ (ahịrị oroma ntụpọ) na obere akụkụ obi. e Ngụkọta oge okirikiri (n = obere akụkụ 19 kwa otu, site na obere akụkụ, site na obere akụkụ dị iche iche), oge mkpụmkpụ (n = obere akụkụ 19 kwa otu), oge ezumike (n = obere akụkụ 19 kwa otu, site na obere akụkụ dị iche iche), mmegharị anụ ahụ (n = 25). obere akụkụ)/otu sitere na obere akụkụ site na obere akụkụ systolic (n = 24(D0), obere akụkụ 25(D12) site na obere akụkụ/otu sitere na obere akụkụ (n = 24(D0), obere akụkụ 25(D12) site na obere akụkụ/otu sitere na obere akụkụ ezì dị iche iche). Nnwale t nke nwa akwụkwọ nwere ọdụ abụọ egosighi nnukwu ọdịiche na obere akụkụ ọ bụla. f Nlele nrụgide ndị a na-anọchite anya nke akụkụ anụ ahụ nwere mkpali eletriki (acha uhie uhie) na nke na-enweghị (acha anụnụ anụnụ), mpaghara mpaghara iri nke akụkụ anụ ahụ site na otu ngalaba ahụ. Paịlị ala na-egosi nha nke ọdịiche pasentị na nrụgide na ngalaba anụ ahụ yana na-enweghị mkpali eletriki na mpaghara iri site na ngalaba dị iche iche. (n = Mpekere asatọ/otu sitere na ezi dị iche iche, a na-eme ule t-nwa akwụkwọ nwere ọdụ abụọ; ****p < 0.0001, **p < 0.01, *p < 0.05). (n = Mpekere asatọ/otu sitere na ezi dị iche iche, a na-eme ule t-nwa akwụkwọ nwere ọdụ abụọ; ****p < 0.0001, **p < 0.01, *p < 0.05). (n = 8 срезов/группу от разных свиней, проводится двусторонний t-критерий Стьюдента; ****p<0,0001, **p<0,01, **p<0,01). (n = ngalaba/otu asatọ sitere na ezi dị iche iche, ule t nke nwa akwụkwọ nwere ọdụ abụọ; ****p<0.0001, **p<0.01, *p<0.05). (n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p <0.0001 **p <0.01 *p <0.05） (n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p <0.0001 **p <0.01 *p <0.05） (n = 8 срезов/группу, от разных свиней, двусторонний критерий Стьюдента; **** p <0,0001, **p <0,01, *p <0,05). (n = ngalaba/otu asatọ, site na ezi dị iche iche, ule t nke nwa akwụkwọ nwere ọdụ abụọ; ****p<0.0001, **p<0.01, *p<0.05).Ogwe njehie na-anọchite anya nkezi ± nkewa ọkọlọtọ.
N'usoro omenala biomimetic obi anyị gara aga [20, 21], anyị nọgidere na-enwe ike ịdị ndụ, ọrụ, na iguzosi ike n'ezi ihe nke mkpụrụ obi ruo ụbọchị isii site n'itinye mkpali eletriki na ime ka nhazi etiti ahụ ka mma. Agbanyeghị, mgbe ụbọchị iri gasịrị, ọnụọgụgụ ndị a dara nke ukwuu. Anyị ga-ezo aka na ngalaba ndị a zụlitere na sistemụ omenala biomimetic anyị gara aga 20, 21 ọnọdụ njikwa (Ctrl) anyị ga-ejikwa usoro anyị kachasị mma dị ka ọnọdụ na omenala MC n'okpuru mkpali mekaniki na eletriki n'otu oge (CTCM). nke a kpọrọ . Nke mbụ, anyị kpebiri na mkpali mekaniki na-enweghị mkpali eletrik ezughi oke iji nọgide na-enwe ike ịdị ndụ anụ ahụ ruo ụbọchị isii (Foto mgbakwunye 3a, b). N'ụzọ na-adọrọ mmasị, site na iwebata mkpali physiological-mekaniki na eletriki site na iji STCM, ike nke mkpụrụ obi ụbọchị iri na abụọ nọgidere otu ihe ahụ dị na ngalaba obi ọhụrụ n'okpuru ọnọdụ MS, mana ọ bụghị n'okpuru ọnọdụ Ctrl, dịka nyocha MTT gosiri (Foto 1). 3a). Nke a na-egosi na mkpali mekaniki na ịme ihe atụ nke okirikiri obi nwere ike ime ka akụkụ anụ ahụ dị ndụ ruo ugboro abụọ karịa ka akọwara na sistemụ omenala static anyị gara aga. Agbanyeghị, nyocha nke iguzosi ike n'ezi ihe nke akụkụ anụ ahụ site na iji immunolabeling nke troponin obi T na connexin 43 gosiri na ngosipụta connexin 43 dị elu nke ukwuu na anụ ahụ MC n'ụbọchị nke 12 karịa na njikwa n'otu ụbọchị ahụ. Agbanyeghị, e meghị ka ngosipụta njikọ 43 na nhazi Z-disk dị n'otu oge (Fig. 3b). Anyị na-eji usoro ọgụgụ isi arụrụ arụ (AI) iji tụọ iguzosi ike n'ezi ihe nke anụ ahụ26, ọkpọkọ mmụta miri emi dabere na onyonyo dabere na troponin-T na connexin staining43 iji tụọ iguzosi ike n'ezi ihe na fluorescence nke iberibe obi na akpaghị aka n'ihe gbasara ike nke ebe obibi. Usoro a na-eji Convolutional Neural Network (CNN) na usoro mmụta miri emi iji tụọ iguzosi ike n'ezi ihe nke anụ ahụ obi n'ụzọ akpaaka na nke na-enweghị ajọ mbunobi, dịka akọwara na ntụaka ahụ. 26. MC anụ ahụ gosipụtara myirịta nhazi ka mma na ụbọchị 0 ma e jiri ya tụnyere ngalaba njikwa static. Na mgbakwunye, ntụpọ trichrome nke Masson kpughere pasentị dị ala nke fibrosis n'okpuru ọnọdụ MS ma e jiri ya tụnyere ọnọdụ njikwa na ụbọchị nke 12 nke ọdịbendị (Fig. 3c). Ọ bụ ezie na CTCM mụbara ike nke akụkụ anụ ahụ obi na ụbọchị nke iri na abụọ ruo n'ọkwa yiri nke anụ ahụ obi ọhụrụ, o meghị ka akụkụ obi dị mma nke ukwuu.
Grafụ Bar na-egosi nha nke ike MTT nke mkpụrụ obi ọhụrụ (D0) ma ọ bụ mkpụrụ obi maka ụbọchị iri na abụọ ma n'ọdịnala static (D12 Ctrl) ma ọ bụ na CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) iberibe/otu sitere na ezi dị iche iche, otu ụzọ esi eme ule ANOVA; ####p < 0.0001 ma e jiri ya tụnyere D0 na **p < 0.01 ma e jiri ya tụnyere D12 Ctrl). Grafụ Bar na-egosi nha nke ike MTT nke mkpụrụ obi ọhụrụ (D0) ma ọ bụ mkpụrụ obi maka ụbọchị iri na abụọ ma n'ọdịnala static (D12 Ctrl) ma ọ bụ na CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) iberibe/otu sitere na ezi dị iche iche, otu ụzọ esi eme ule ANOVA; ####p < 0.0001 ma e jiri ya tụnyere D0 na **p < 0.01 ma e jiri ya tụnyere D12 Ctrl).histogram na-egosi nha nke ike nke akụkụ obi ọhụrụ MTT (D0) ma ọ bụ ọdịbendị nke akụkụ obi ruo ụbọchị iri na abụọ n'ime omenala static (njikwa D12) ma ọ bụ CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (njikwa D12). )), ngalaba/otu 12 (D12 MC) sitere na ezi dị iche iche, a na-eme ule ANOVA otu ụzọ;####p <0,0001 pо сравнению с D0 и **p <0,01 pо сравнению с D12 Ctrl). ####p < 0.0001 ma e jiri ya tụnyere D0 na **p < 0.01 ma e jiri ya tụnyere D12 Ctrl). a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切片(D0)或心脏切片培养12 天的MTT 活力的量化)，来自不同猪的12 (D12 MC)相比，####p <0.0001，与D12 Ctrl 相比, *** p <0.01). a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切片(D0) ，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；与D0 相比，####p < 0.0001 ， trl ， 与D12*histogram na-egosi nha nke ike MTT na ngalaba obi ọhụrụ (D0) ma ọ bụ ngalaba obi a zụlitere ruo ụbọchị iri na abụọ na omenala static (njikwa D12) ma ọ bụ CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (njikwa D12)), ngalaba/otu 12 (D12 MC) sitere na ezi dị iche iche, ule ANOVA otu ụzọ;####p <0,0001 pо сравнению с D0, **p <0,01 pо сравнению с D12 Ctrl). ####p < 0.0001 ma e jiri ya tụnyere D0, **p < 0.01 ma e jiri ya tụnyere D12 Ctrl).b Troponin-T (akwụkwọ ndụ akwụkwọ ndụ), connexin 43 (ọbara ọbara) na DAPI (acha anụnụ anụnụ) n'ime akụkụ obi dị ọhụrụ (D0) ma ọ bụ akụkụ obi nke a zụlitere n'okpuru ọnọdụ static (Ctrl) ma ọ bụ ọnọdụ CTCM (MC) ruo ụbọchị 12) nke onyonyo immunofluorescence nnọchiteanya (ọnụọgụ oghere = 100 µm). Nnwale ọgụgụ isi arụrụ arụ nke ịdị ọcha nke anụ ahụ obi (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) mpekere/ìgwè nke ọ bụla site na ezi dị iche iche, a na-eme ule ANOVA otu ụzọ; ####p < 0.0001 ma e jiri ya tụnyere D0 na ****p < 0.0001 ma e jiri ya tụnyere D12 Ctrl). Nnwale ọgụgụ isi arụrụ arụ nke ịdị ọcha nke anụ ahụ obi (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) mpekere/ìgwè nke ọ bụla site na ezi dị iche iche, a na-eme ule ANOVA otu ụzọ; ####p < 0.0001 ma e jiri ya tụnyere D0 na ****p < 0.0001 ma e jiri ya tụnyere D12 Ctrl). Количественная оценка структурной целостности сердечной ткани искусственным интеллектом (n = 7 (D0), 7 (D15), 7 (D12) срезов/групп от разных свиней, проводится однофакторный тест ANOVA; D12 Ctrl). Ngụkọta nke nhazi nke anụ ahụ obi site na ọgụgụ isi arụrụ arụ (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) ngalaba/ìgwè sitere na ezi dị iche iche, emere ule ANOVA otu ụzọ; ####p < 0.0001 vs. na D0 na ****p < 0.0001 ma e jiri ya tụnyere D12 Ctrl).人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) mpekere / otu nke ọ bụla nke ezi ezi, otu ụzọ ANOVA ule;#0#0相比，****p <0.0001 与D12 Ctrl 相比）.人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) Mpekere / otu nke ọ bụla nke pigs dị iche iche, otu ụzọ ANOVA ule;#0#0p;与D0相比，****p <0.0001 与D12 Ctrl 相比）. Искусственный интеллект для количественной оценки структурной целостности сердечной ткани (n = 7 (D0), 7 (D0), 7 (D0), 7 (D0) срезов/группу каждой из разных свиней, односторонний тест ANOVA; ####p <0,0001 vs. D0 Для сравнения ****p <0,10 Ctrl). Ọgụgụ isi arụrụ arụ iji chọpụta nha nha nke anụ ahụ obi (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) ngalaba/chịkọta nke ọ bụla n'ime ezi dị iche iche, ule ANOVA otu ụzọ; ####p<0.0001 vs .D0 Maka ntụnyere ****p < 0.0001 ma e jiri ya tụnyere D12 Ctrl). c Foto ndị a na-anọchite anya (n'aka ekpe) na nha (n'aka nri) maka iberibe obi e ji agba Masson's trichrome techie (Scale bare = 500 µm) (n = Mpekere iri/otu nke ọ bụla site na ezi dị iche iche, a na-eme ule ANOVA otu ụzọ; ####p < 0.0001 ma e jiri ya tụnyere D0 na ***p < 0.001 ma e jiri ya tụnyere D12 Ctrl). c Foto ndị a na-anọchite anya (n'aka ekpe) na nha (n'aka nri) maka iberibe obi e ji agba Masson's trichrome (Scale bare = 500 µm) mee (n = Mpekere iri/otu nke ọ bụla site na ezi dị iche iche, a na-eme ule ANOVA otu ụzọ; #### p < 0.0001 ma e jiri ya tụnyere D0 na ***p < 0.001 ma e jiri ya tụnyere D12 Ctrl). c Репрезентативные изображения (слева) Массона (масштаб без покрытия = 500 мкм) (n = 10 срезов/группу от разных свиней, выполняется одностор 0,0001 na сравнению с D0 na ***p <0,001 na сравнению с D12 Ctrl). c Foto ndị a na-anọchite anya (n'aka ekpe) na nha (n'aka nri) nke akụkụ obi e ji ntụpọ trichrome nke Masson mee (ọnụọgụ a na-ekpuchighị ekpuchi = 500 µm) mee (n = ngalaba iri/otu sitere na ezi dị iche iche, a nwalere ule ANOVA otu ụzọ; #### p < 0 .0001 ma e jiri ya tụnyere D0 na ***p < 0.001 ma e jiri ya tụnyere D12 Ctrl). c 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像（左）和量化（右）（裸尺度（（裸尺度）（（裸尺度）（（5个切片/组，每组来自不同的猪，进行单向ANOVA 测试；#### p <0.0001 与D0 相比，***0 1 <0相比). C 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 （左 左） 量化裸尺度 = 500 µm） （n = 10 个 切片 组 每 组 来自 不同 猪 ， 进行 单向 单向 Anova#p. 0.0001 与D0 相比，***p <0.001 与D12 Ctrl 相比）. c Репрезентативные изображения (слева) Массона (чистая шкала = 500 мкм) однофакторного дисперсионного анализа ;### #p <0,0001 na сравнению с D0, ***p <0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Foto ndị a na-anọchite anya (n'aka ekpe) na ọnụọgụ (n'aka nri) nke akụkụ obi e ji ntụpọ trichrome nke Masson mee ka ọ dị ọcha (oghere = 500 µm) (n = ngalaba iri/otu, nke ọ bụla sitere na ezi dị iche, nke a nwalere site na nyocha otu ụzọ nke ọdịiche;### # p < 0.0001 ma e jiri ya tụnyere D0, ***p < 0.001 ma e jiri ya tụnyere D12 Ctrl).Ogwe njehie na-anọchite anya nkezi ± nkewa ọkọlọtọ.
Anyị chere na site n'ịgbakwunye obere molekul na usoro ọdịbendị, enwere ike imeziwanye iguzosi ike n'ezi ihe nke cardiomyocyte ma belata mmepe fibrosis n'oge ọdịbendị CTCM. Ya mere, anyị nyochachara maka obere molekul site na iji omenala njikwa static anyị20,21 n'ihi obere ọnụọgụ ihe ndị na-agbagwoju anya. Ahọpụtara Dexamethasone (Dex), triiodothyronine (T3), na SB431542 (SB) maka nyocha a. Ejirila obere molekul ndị a na omenala hiPSC-CM iji kpalite ntozu nke cardiomyocytes site na ịbawanye ogologo sarcomere, T-tubules, na ọsọ conduction. Na mgbakwunye, a maara ma Dex (glucocorticoid) na SB na-egbochi mbufụt29,30. Ya mere, anyị nwalere ma itinye otu ma ọ bụ njikọta nke obere molekul ndị a ga-eme ka iguzosi ike n'ezi ihe nke akụkụ obi ka mma. Maka nyocha mbụ, ahọpụtara dose nke ngwakọta ọ bụla dabere na mkpokọta a na-ejikarị na ụdị omenala sel (1 μM Dex27, 100 nM T327, na 2.5 μM SB31). Mgbe ụbọchị iri na abụọ nke mmepe ahụ gasịrị, njikọta nke T3 na Dex mere ka usoro nhazi obi na akwara obi dịkwuo mma ma nwee obere mgbanwe eriri afọ (Foto mgbakwunye 4 na 5). Na mgbakwunye, iji okpukpu abụọ ma ọ bụ okpukpu abụọ nke T3 na Dex emepụtara mmetụta ọjọọ ma e jiri ya tụnyere mkpokọta nkịtị (Foto mgbakwunye 6a,b).
Mgbe anyị mechara nyocha mbụ, anyị mere ntụnyere isi na isi nke ọnọdụ ọdịbendị anọ (Foto 4a): Ctrl: ngalaba obi a zụlitere n'ọdịnala anyị akọwapụtara na mbụ site na iji usoro anyị kachasị mma; 20.21 TD: T3 na Ctrl s Agbakwunyere Dex na Wenezdee; MC: ngalaba obi a zụlitere na CTCM site na iji usoro anyị kachasị mma; na MT: CTCM nwere T3 na Dex agbakwunyere na usoro ahụ. Mgbe ụbọchị iri na abụọ nke ịkọ ihe gasịrị, ike nke anụ ahụ MS na MT nọgidere otu ihe ahụ dị ka anụ ahụ ọhụrụ a nwalere site na nnwale MTT (Foto 4b). N'ụzọ na-adọrọ mmasị, mgbakwunye nke T3 na Dex na omenala transwell (TD) emeghị ka ọ dịkwuo mma ma e jiri ya tụnyere ọnọdụ Ctrl, na-egosi ọrụ dị mkpa nke mkpali igwe na ịnọgide na-enwe ike nke akụkụ obi.
eserese nhazi nnwale nke na-egosi ọnọdụ ọdịbendị anọ e ji enyocha mmetụta nke mkpali igwe na mgbakwunye T3/Dex na ihe na-eme ka ọ dị ndụ ruo ụbọchị iri na abụọ. b Grafụ mmanya na-egosi ọnụọgụ nke ike ndụ ụbọchị iri na abụọ mgbe ọdịbendị gasịrị n'ọnọdụ ọdịbendị anọ niile (Ctrl, TD, MC, na MT) ma e jiri ya tụnyere mkpụrụ obi ọhụrụ (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD na D12 MT), mkpụrụ 12 (D12 MC) sitere na ezi dị iche iche, a na-eme ule ANOVA otu ụzọ; ####p < 0.0001, ###p < 0.001 ma e jiri ya tụnyere D0 na **p < 0.01 ma e jiri ya tụnyere D12 Ctrl). b Grafụ mmanya na-egosi ọnụọgụ nke ike ndụ ụbọchị iri na abụọ mgbe ọdịbendị gasịrị n'ọnọdụ ọdịbendị anọ niile (Ctrl, TD, MC, na MT) ma e jiri ya tụnyere mkpụrụ obi ọhụrụ (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD na D12 MT), mpekere 12 (D12 MC) sitere na ezi dị iche iche, a na-eme ule ANOVA otu ụzọ; ####p < 0.0001, ###p < 0.001 ma e jiri ya tụnyere D0 na **p < 0.01 ma e jiri ya tụnyere ctrl D12). b Гистограмма показывает количественую оценку культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl ), D12 Ctrl MC) срезов/группу от разных свиней, проводится односторонний тест ANOVA; ####p <0,0001, ###p <0,001 по сравнению с D0 na **p <0,01 na сравнению с D12 Ctrl). b Grafụ mmanya ahụ na-egosi nha nke ndụ na ụbọchị iri na abụọ mgbe ọdịbendị gasịrị na ọnọdụ omenala anọ niile (njikwa, TD, MC, na MT) ma e jiri ya tụnyere ngalaba obi ọhụrụ (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD, na D12 MT), ngalaba/otu 12 (D12 MC) sitere na ezi dị iche iche, ule ANOVA otu ụzọ; ####p < 0.0001, ###p < 0.001 vs. D0 na **p < 0.01 ma e jiri ya tụnyere D12 Ctrl). b 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) (n = 18 (D0)和D12 MT)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 0.01 与D12 控制）b 4 12 (D12 MC) b Гистограмма, показывающая все 4 условия культивирования (контроль, TD, MC и MT) (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD na D12 MT), разных свиней 12 (D12 MC) срезы/группа, односторорон##pппа, одностороронтый тест ANOVA; <0,001 по сравнению с D0, **p <0,01 na сравнению с контролем D12). b Histogram na-egosi ọnọdụ ọdịbendị anọ niile (njikwa, TD, MC na MT) ma e jiri ya tụnyere akụkụ obi ọhụrụ (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD na D12 MT), site na ngalaba/otu ezi dị iche iche 12 (D12 MC), ule ANOVA otu ụzọ; ####p<0.0001, ###p<0.001 vs. D0, **p<0.01 vs. njikwa D12). C Grafụ Bar na-egosi nha nke mmụba glucose ụbọchị iri na abụọ mgbe ọdịbendị gasịrị n'ọnọdụ ọdịbendị anọ niile (Ctrl, TD, MC, na MT) ma e jiri ya tụnyere iberibe obi ọhụrụ (D0) (n = Mpekere isii/otu sitere na ezi dị iche iche, a na-eme ule ANOVA otu ụzọ; ###p < 0.001, ma e jiri ya tụnyere D0 na ***p < 0.001 ma e jiri ya tụnyere D12 Ctrl). C Grafụ Bar na-egosi nha nke mmụba glucose ụbọchị iri na abụọ mgbe ọdịbendị gasịrị n'ọnọdụ ọdịbendị anọ niile (Ctrl, TD, MC, na MT) ma e jiri ya tụnyere iberibe obi ọhụrụ (D0) (n = Mpekere isii/otu sitere na ezi dị iche iche, a na-eme ule ANOVA otu ụzọ; ###p < 0.001, ma e jiri ya tụnyere D0 na ***p < 0.001 ma e jiri ya tụnyere D12 Ctrl). c Гистограмма показывает количественую оценку потока глюкозы через 12. культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со сравнению односторонний Выполняется тест ANOVA; c Histogram na-egosi nha nke mmiri glucose n'ime ụbọchị iri na abụọ mgbe e mesịrị mmepe ahụ n'okpuru ọnọdụ ọdịbendị anọ niile (njikwa, TD, MC na MT) ma e jiri ya tụnyere akụkụ obi ọhụrụ (D0) (n = ngalaba isii/otu sitere na ezi dị iche iche, emere ule ANOVA otu ụzọ; ###p < 0.001 ma e jiri ya tụnyere D0 na ***p < 0.001 ma e jiri ya tụnyere D12 Ctrl). c 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) 王寔，幸比，幸比，吹天的葡萄糖通量定量（n = 6 片/组，来自不同猪，单向执行ANOVA 测试；*##p < 0.000 丛0.001 与D12 Ctrl 相比） C 条形图 显示 所有 4 种 条件 （（ctrl 、 td mc 和 mt） 新鲜 心脏 切片 切片培养 后 12 天 的 通量 定量 （n = 6 片/组 ，测试；###p <0.001，与D0 相比，***p <0.001 与D12 Ctrl 相比）. c Гистограмма, показывающая казывающая количественную условий культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению свиней, односторонний Были проведены тесты ANOVA; D12 (kọntịrọlь). c Histogram na-egosi nha nke mmiri glucose na ụbọchị iri na abụọ mgbe e mechachara ya maka ọnọdụ ọdịbendị anọ niile (njikwa, TD, MC, na MT) ma e jiri ya tụnyere akụkụ obi ọhụrụ (D0) (n = ngalaba isii/otu, site na ezi dị iche iche, n'otu akụkụ. E mere nnwale ANOVA, ###p < 0.001 ma e jiri ya tụnyere D0, ***p < 0.001 ma e jiri ya tụnyere D12 (njikwa).d Atụmatụ nyocha nke anụ ahụ ọhụrụ (acha anụnụ anụnụ), ụbọchị nke 12 MC (akwụkwọ ndụ akwụkwọ ndụ), na ụbọchị nke 12 MT (ọbara ọbara) na isi ihe iri nke anụ ahụ mpaghara (n = mpekere anọ/otu, ule ANOVA otu ụzọ; enweghị nnukwu ọdịiche dị n'etiti otu). e atụmatụ ugwu mgbawa na-egosi mkpụrụ ndụ ihe nketa gosipụtara dị iche iche na ngalaba obi ọhụrụ (D0) ma e jiri ya tụnyere ngalaba obi a zụlitere n'okpuru ọnọdụ static (Ctrl) ma ọ bụ n'okpuru ọnọdụ MT (MT) maka ụbọchị 10-12. f Maapụ okpomọkụ nke mkpụrụ ndụ ihe nketa sarcomere maka ngalaba obi a zụlitere n'okpuru ọnọdụ ọdịbendị ọ bụla. Ogwe njehie na-anọchite anya nkezi ± ọkọlọtọ mgbanwe.
Ndabere na metabolism na mgbanwe site na oxidation nke abụba acid gaa na glycolysis bụ ihe e ji amata ọdịiche dị n'etiti obi na akwara. Mkpụrụ ndụ cardiomyocytes ndị na-etobeghị eto na-eji glucose eme ihe maka mmepụta ATP ma nwee obere mitochondria hypoplastic yana obere cristae5,32. Nyocha ojiji glucose gosiri na n'okpuru ọnọdụ MC na MT, ojiji glucose yiri nke dị n'anụ ahụ ụbọchị 0 (Foto 4c). Agbanyeghị, ihe nlele Ctrl gosiri mmụba dị ukwuu na ojiji glucose ma e jiri ya tụnyere anụ ahụ ọhụrụ. Nke a na-egosi na njikọta nke CTCM na T3/Dex na-eme ka anụ ahụ dịkwuo ndụ ma na-echekwa ụdị metabolic nke akụkụ obi a zụlitere ụbọchị 12. Na mgbakwunye, nyocha nrụgide gosiri na ọkwa nrụgide nọgidere otu ihe ahụ dị na anụ ahụ obi ọhụrụ ruo ụbọchị 12 n'okpuru ọnọdụ MT na MS (Foto 4d).
Iji nyochaa mmetụta zuru oke nke CTCM na T3/Dex na mpaghara akwụkwọ ọkọwa okwu zuru ụwa ọnụ nke anụ ahụ obi, anyị mere RNAseq na mpekere obi sitere na ọnọdụ ọdịbendị anọ dị iche iche (Data Mgbakwunye 1). N'ụzọ na-akpali mmasị, ngalaba MT gosiri nnukwu myirịta nke mkpụrụ ndụ obi ọhụrụ, naanị mkpụrụ ndụ ihe nketa 16 gosipụtara n'ụzọ dị iche iche n'ime mkpụrụ ndụ ihe nketa 13,642. Agbanyeghị, dịka anyị gosiri na mbụ, mpekere Ctrl gosipụtara mkpụrụ ndụ ihe nketa 1229 gosipụtara n'ụzọ dị iche iche mgbe ụbọchị 10-12 gasịrị na ọdịbendị (Fig. 4e). QRT-PCR nke mkpụrụ ndụ ihe nketa obi na fibroblast kwadoro data ndị a (Fig. Mgbakwunye 7a-c). N'ụzọ na-akpali mmasị, ngalaba Ctrl gosipụtara mbelata nke mkpụrụ ndụ ihe nketa obi na mkpụrụ ndụ ihe nketa na ịgbalite mmemme mkpụrụ ndụ ihe nketa mkpali. Data ndị a na-egosi na a na-ebelata ọdịiche, nke na-emekarị mgbe a kụchara mkpụrụ ndụ ihe nketa ogologo oge, n'okpuru ọnọdụ MT (Fig. Mgbakwunye 8a,b). Nnyocha e mere nke ọma gbasara mkpụrụ ndụ ihe nketa sarcomere gosiri na naanị n'okpuru ọnọdụ MT ka mkpụrụ ndụ ihe nketa na-agbanwe sarcomere (Foto 4f) na ọwa ion (Foto mgbakwunye 9) dị, na-echebe ha pụọ ​​na mgbochi n'okpuru ọnọdụ Ctrl, TD, na MC. Data ndị a na-egosi na site na njikọta nke mkpali mekaniki na humoral (T3/Dex), mkpụrụ obi nwere ike ịnọgide na-adị ka mkpụrụ obi ọhụrụ mgbe ụbọchị iri na abụọ gasịrị na omenala.
Ihe ndị a e ji mee nchọpụta akwụkwọ ndị a na-akwado site n'eziokwu ahụ bụ na a na-echekwa iguzosi ike n'ezi ihe nke mkpụrụ ndụ obi n'okpuru ọnọdụ MT ruo ụbọchị iri na abụọ, dịka egosiri site na njikọ 43 na-adịghị emebi emebi na nke dị n'ógbè (Fig. 5a). Na mgbakwunye, fibrosis na mkpụrụ ndụ obi n'okpuru ọnọdụ MT belatara nke ukwuu ma e jiri ya tụnyere Ctrl na ihe yiri ya na mkpụrụ ndụ obi ọhụrụ (Fig. 5b). Data ndị a na-egosi na njikọta nke mkpali igwe na ọgwụgwọ T3/Dex na-echebe usoro obi nke ọma na akụkụ obi n'ọdịbendị.
onyonyo immunofluorescence nke troponin-T (akwụkwọ ndụ akwụkwọ ndụ), connexin 43 (ọbara ọbara), na DAPI (acha anụnụ anụnụ) n'ime akụkụ obi dị ọhụrụ (D0) ma ọ bụ nke a kụrụ ruo ụbọchị iri na abụọ n'ọnọdụ ọdịbendị akụkụ obi anọ niile (ọkwa nha = 100 µm). Nnwale ọgụgụ isi arụrụ arụ nke iguzosi ike n'ezi ihe nke anụ ahụ obi (n = 7 (D0 na D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC na D12 MT) mpekere/otu sitere na ezi dị iche iche, a na-eme ule ANOVA otu ụzọ; ####p < 0.0001 ma e jiri ya tụnyere D0 na *p < 0.05, ma ọ bụ ****p < 0.0001 ma e jiri ya tụnyere D12 Ctrl). Nnwale ọgụgụ isi arụrụ arụ nke ịdị n'otu nke anụ ahụ obi (n = 7 (D0 na D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC na D12 MT) mpekere/otu sitere na ezi dị iche iche, a na-eme ule ANOVA otu ụzọ; #### p < 0.0001 ma e jiri ya tụnyere D0 na *p < 0.05, ma ọ bụ ****p < 0.0001 ma e jiri ya tụnyere D12 Ctrl). Количественная оценка структурной целостности ткани сердца с помощью искусственного интеллекта (n = 2), 1 (D) D12 MC и D12 MT) срезов/группу от разных свиней, проведен однофакторный тест ANOVA; ma ọ bụ ****p <0,0001 na сравнению с D12 Ctrl). Ngụkọta nke nhazi nke anụ ahụ obi site na iji ọgụgụ isi arụrụ arụ (n = 7 (D0 na D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC na D12 MT) ngalaba/otu sitere na ezi dị iche iche, emere ule ANOVA otu ụzọ; #### p < 0.0001 ma e jiri ya tụnyere D0 na *p < 0.05 ma ọ bụ ****p < 0.0001 ma e jiri ya tụnyere D12 Ctrl).对不同猪的心脏组织结构完整性（n = 7（D0 和D12 Ctrl）、5（D12 TD、D12 MC 和D12 MT）切片/组）进行人工智能量化，进行单向ANOVA 测试；### p <0.0001 世****D0 和*p <0.05 ， 0.05与D12 Ctrl 相比）对 不同 猪 的 心脏结构 完整性 （n = 7 （d0 和 d12 ctrl） (5 （d12 td 、 d12 mc 和 d12 mc智能量 化 进行 单向 单向 单向 测试 ； ######### p <0.0001 与D0 和*p < 0.05 相比1 Ctrl 相比).Ngụkọta nke iguzosi ike n'ezi ihe nke anụ ahụ obi site na iji ọgụgụ isi arụ ọrụ n'ime ezi dị iche iche (n = 7 (D0 na D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC na D12 MT) ngalaba/otu) site na iji ule ANOVA otu ụzọ;#### p <0,0001 по сравнению с D0 na *p <0,05 ma ọ bụ ****p <0,0001 na сравнению с D12 Ctrl). #### p < 0.0001 ma e jiri ya tụnyere D0 na *p < 0.05 ma ọ bụ ****p < 0.0001 ma e jiri ya tụnyere D12 Ctrl). b Foto ndị a na-anọchite anya na nhazi maka iberibe obi e ji ntụpọ trichrome nke Masson mee (ogwe nha = 500 µm) mee (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD, na D12 MC), mpekere/otu 9 (D12 MT) sitere na ezi dị iche iche, a na-eme ule ANOVA otu ụzọ; ####p < 0.0001 ma e jiri ya tụnyere D0 na ***p < 0.001, ma ọ bụ ****p < 0.0001 ma e jiri ya tụnyere D12 Ctrl). b Foto ndị a na-anọchite anya na nhazi maka iberibe obi e ji ntụpọ trichrome nke Masson mee (ogwe nha = 500 µm) mee (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD, na D12 MC), mpekere/otu 9 (D12 MT) sitere na ezi dị iche iche, a na-eme ule ANOVA otu ụzọ; ####p < 0.0001 ma e jiri ya tụnyere D0 na ***p < 0.001, ma ọ bụ ****p < 0.0001 ma e jiri ya tụnyere D12 Ctrl). b Репрезентативные изображения линейка = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD na D12 MC), 9 (D12 MT) ANOVA; ####p <0,0001 pо сравнению с D0 и ***p <0,001 ma ọ bụ ****p <0,0001 p D12 Ctrl). b Foto ndị a na-anọchite anya ya na nha nke akụkụ obi e ji ntụpọ trichrome nke Masson mee (ogwe nha = 500 µm) mee (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD na D12 MC), ngalaba/otu 9 (D12 MT) sitere na ezi dị iche iche, nke emere otu ụzọ ANOVA; ####p < 0.0001 vs. D0 na ***p < 0.001 ma ọ bụ ****p < 0.0001 vs. D12 Ctrl). b 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像和量化（比例尺= 500 µm）（n = 10！ TD 和D12 MC），来自不同猪的9 个（D12 MT）切片/组，进行单因素方差分析；####p <10 .相比，***p <0.001，或****p < 0.0001 与D12 Ctrl 相比） b 用 masson 三 色 染料 的 代表性 和 量化 （比例 尺 尺 尺 = 500 µm） 1 ctrl d12 td 和 d12 mc） 来自 不同 的 9 个 d12 mt 切片 切片 切片 切片 切片切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片/组，进行单因素方差分析；*####p < 0.0001 0.001, 或****p <0.0001 与D12 Ctrl 相比） b Репрезентативные изображения 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD na D12 MC), 9 (D12 MT) срезов от разных свиней / групппы, один-##способ ANOVA; сравнению с D0, ***p <0,001 ma ọ bụ ****p <0,0001 na сравнению с D12 Ctrl). b Foto ndị a na-anọchite anya ya na nha nke akụkụ obi e ji trichrome nke Masson (ogwe nha = 500 µm) mee (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD na D12 MC), ngalaba 9 (D12 MT) sitere na ezi/otu dị iche iche, otu usoro ANOVA; ####p < 0.0001 ma e jiri ya tụnyere D0, ***p < 0.001 ma ọ bụ ****p < 0.0001 ma e jiri ya tụnyere D12 Ctrl).Ogwe njehie na-anọchite anya nkezi ± nkewa ọkọlọtọ.
N'ikpeazụ, a tụlere ikike CTCM nwere iṅomi oke ọbara mgbali obi site n'ịbawanye oke ọbara mgbali obi. Na CTCM, nrụgide ikuku kachasị elu mụbara site na 80 mmHg ruo 80 mmHg. Art. (ngbatị nkịtị) ruo 140 mmHg Art. (Fig. 6a). Nke a kwekọrọ na mmụba nke 32% na mgbatị (Fig. 6b), nke egosiri na mbụ dị ka pasentị dabara adaba achọrọ maka akụkụ obi iji nweta ogologo sarcomere yiri nke a hụrụ na hypertrophy. Mgbatị na ọsọ nke anụ ahụ obi n'oge mgbatị na izu ike nọgidere na-agbanwe agbanwe n'ime ụbọchị isii nke ọdịbendị (Fig. 6c). A na-etinye anụ ahụ obi site na MT n'ọnọdụ mgbatị nkịtị (MT (Nkịtị)) ma ọ bụ ọnọdụ oke ọbara mgbali elu (MT (OS)) ruo ụbọchị isii. Mgbe ụbọchị anọ gasịrị na omenala, ihe ngosi hypertrophic NT-ProBNP dị elu nke ukwuu na mpaghara n'okpuru ọnọdụ MT (OS) ma e jiri ya tụnyere ọnọdụ MT (nkịtị) (Fig. 7a). Na mgbakwunye, mgbe ụbọchị isii nke ịkọ ihe gasịrị, nha mkpụrụ ndụ dị na MT (OS) (Foto 7b) mụbara nke ukwuu ma e jiri ya tụnyere akụkụ nke obi MT (nkịtị). Na mgbakwunye, mgbanwe nuklia NFATC4 mụbara nke ukwuu na anụ ahụ ndị gbatịrị agbatị (Foto 7c). Nsonaazụ ndị a na-egosi mmepe na-aga n'ihu nke mgbanwe ọrịa mgbe ọbara mgbali elu gasịrị ma na-akwado echiche ahụ na enwere ike iji ngwaọrụ CTCM dị ka ikpo okwu iji mụọ akara hypertrophy obi nke na-akpalite.
Ihe ndị a na-ahụ anya nke nrụgide ụlọ ikuku, nrụgide ụlọ mmiri, na nha mmegharị anụ ahụ na-egosi na nrụgide ụlọ na-agbanwe nrụgide ụlọ mmiri, na-eme ka mmegharị kwekọrọ na nkebi anụ ahụ. b Pasentị mgbatị ahụ na-anọchite anya na usoro ọsọ ịgbatị maka akụkụ anụ ahụ a na-agbatịkarị (oroma) na nke a na-agbatịkarị (acha anụnụ anụnụ). c Graf bar na-egosi oge okirikiri (n = mpekere 19 kwa otu, site na ezi dị iche iche), oge mkpụmkpụ (n = mpekere 18-19 kwa otu, site na ezi dị iche iche), oge ezumike (n = mpekere 19 kwa otu, site na ezi dị iche iche)), oke mmegharị anụ ahụ (n = mpekere 14/otu, site na ezi dị iche iche), ọsọ systolic kacha elu (n = mpekere 14/otu, site na ezi dị iche iche) na ọnụego ezumike kacha elu (n = 14 (D0), 15 (D6) ) ngalaba/otu) site na ezi dị iche iche), ule t-nwale nwa akwụkwọ nwere ọdụ abụọ egosighi nnukwu ọdịiche na paramita ọ bụla, na-egosi na paramita ndị a nọgidere na-agbanwe agbanwe n'ime ụbọchị 6 nke ọdịbendị na oke voltaji. Ogwe njehie na-anọchite anya nkezi ± ọkọlọtọ ọdịiche.
a Usoro nhazi nke ọnụọgụ NT-ProBNP na mgbasa ozi omenala site na iberibe obi a zụlitere n'okpuru ọnọdụ MT nkịtị (Norm) ma ọ bụ oke mgbatị (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, na D4 MTOS) mpekere/otu sitere na ezi dị iche iche, ANOVA ụzọ abụọ a na-eme; **p < 0.01 ma e jiri ya tụnyere mgbatị nkịtị). a Usoro nhazi nke ọnụọgụ NT-ProBNP na mgbasa ozi omenala site na iberibe obi a zụlitere n'okpuru ọnọdụ MT nkịtị (Norm) ma ọ bụ oke mgbatị (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, na D4 MTOS) mpekere/otu sitere na ezi dị iche iche, ANOVA ụzọ abụọ a na-eme; **p < 0.01 ma e jiri ya tụnyere mgbatị nkịtị).Histogram ọnụọgụgụ nke ntinye NT-ProBNP na mpaghara ọdịbendị sitere na iberibe obi a zụlitere n'okpuru ọnọdụ nke MT nkịtị (nkịtị) ma ọ bụ oke mgbatị (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, na D4).MTOS) iberibe /otu sitere na ezi dị iche iche, a na-eme nyocha ihe abụọ nke mgbanwe;**p <0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p < 0.01 ma e jiri ya tụnyere mgbatị nkịtị). a 在MT 正常拉伸(Norm) 或过度拉伸(OS) 条件下培养的心脏切片培养基中NT-ProBNP (D2 MTNorm) , 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm 和D4 MTOS）来自不同猪的切片/组，进行双向方差分析；**与正常拉伸相比，p <0.01）. A Quantification nke NT-ProBNP itinye uche na obi mpekere omenala n'okpuru MT normal stretch (Norm) ma ọ bụ overstretch (OS) ọnọdụ (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm和D4 MTOS) si dị iche iche.猪的切片/组，可以双向方方发发动 ** atụnyere mgbatị nkịtị, p <0.01).histogram Ngụkọta nke mkpokọta NT-ProBNP na iberibe obi a zụlitere n'okpuru ọnọdụ nke MT nkịtị (nkịtị) ma ọ bụ oke mgbatị (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm) na D4 MTOS) mpekere/otu sitere na ezi dị iche iche, nyocha ụzọ abụọ nke ọdịiche;**p <0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p < 0.01 ma e jiri ya tụnyere mgbatị nkịtị). b Foto ndị a na-anọchite anya maka iberibe obi e ji troponin-T na WGA (aka ekpe) na nha nha mkpụrụ ndụ mee (aka nri) (n = 330 (D6 MTOS), mkpụrụ ndụ 369 (D6 MTNorm)/otu sitere na mpekere iri dị iche iche sitere na ezi dị iche iche, a na-eme ule t-ụmụ akwụkwọ nwere ọdụ abụọ; ****p < 0.0001 ma e jiri ya tụnyere mgbatị nkịtị). b Foto ndị a na-anọchite anya maka iberibe obi e ji troponin-T na WGA (aka ekpe) na nha nha mkpụrụ ndụ mee (aka nri) (n = 330 (D6 MTOS), mkpụrụ ndụ 369 (D6 MTNorm)/otu sitere na mpekere iri dị iche iche sitere na ezi dị iche iche, a na-eme ule t-ụmụ akwụkwọ nwere ọdụ abụọ; ****p < 0.0001 ma e jiri ya tụnyere mgbatị nkịtị). b Репрезентативные изображения срезов сердцать, клеток (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) клеток/группу из 10 разных срезов от разных свиней, дова- t-критерий Стьюдента; ****p <0,0001 по сравнению с нормальным растяжением). b Foto ndị a na-egosi akụkụ obi nke e ji troponin-T na AZP (aka ekpe) na nha mkpụrụ ndụ (aka nri) (n = 330 (D6 MTOS), mkpụrụ ndụ 369 (D6 MTNorm)/otu sitere na ngalaba iri dị iche iche site na ezi dị iche iche, ule t-nwale nwa akwụkwọ nwere ọdụ abụọ; ****p < 0.0001 ma e jiri ya tụnyere ụdị nje nkịtị). b 用肌钙蛋白-T 和WGA（左）和细胞大小量化（右）染色的心脏切片的代表）性3＃n MTOS）来自不同猪的10 个不同切片的369（D6 MTNorm）细胞/组，两进行有尾学生t检验；与正常拉伸相比，****p < 0.0001). b Foto ndị a na-egosi nke mkpụrụ obi e ji calcarein-T na WGA (aka ekpe) na nha mkpụrụ ndụ (aka nri) mee (n = 330 (D6 MTOS), 369 site na mpekere iri dị iche iche (D6 MTNorm)) Mkpụrụ ndụ/Nnwale nke mkpụrụ ndụ； ma e jiri ya tụnyere ịgbatị nkịtị，****p < 0.0001). b Репрезентативные изображения срезов сердцать, (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) Стьюдента; ****p <0,0001 по сравнению с нормальным растяжением). b Foto ndị a na-anọchite anya akụkụ obi nke e ji troponin-T na AZP (aka ekpe) mee, yana nha mkpụrụ ndụ (aka nri) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) site na ngalaba iri dị iche iche site na ezi dị iche iche) Mkpụrụ ndụ/otu, ihe atụ nwere ọdụ abụọ. Nwa akwụkwọ t; ****p < 0.0001 ma e jiri ya tụnyere ụdị nje nkịtị). c Foto ndị a na-anọchite anya maka ụbọchị 0 na ụbọchị 6. Mpekere obi MTOS nke e ji immunolabeled mee maka troponin-T na NFATC4 na nha nke ntụgharị nke NFATC4 gaa na nuclei nke CMs (n = 4 (D0), mpekere 3 (D6 MTOS)/ìgwè sitere na ezi dị iche iche, a na-eme ule t-nwale ụmụ akwụkwọ nwere ọdụ abụọ; *p < 0.05). c Foto ndị a na-anọchite anya maka ụbọchị 0 na ụbọchị 6. Mpekere obi MTOS nke e ji immunolabeled mee maka troponin-T na NFATC4 na nha nke ntụgharị nke NFATC4 gaa na nuclei nke CMs (n = 4 (D0), mpekere 3 (D6 MTOS)/otu sitere na ezi dị iche iche, a na-eme ule t-nwale ụmụ akwụkwọ nwere ọdụ abụọ; *p < 0.05). c. оценка транслокации NFATC4 в ядра кавернозных клеток (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) двусторонний t-критерий Стьюдента; c Foto ndị a na-anọchite anya maka akụkụ obi n'ime ụbọchị 0 na 6 MTOS, nke ejiri immunolabeled maka troponin-T na NFATC4, na ọnụọgụ nke mgbanwe NFATC4 n'ime nucleus nke mkpụrụ ndụ cavernous (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) mpekere/ìgwè sitere na ezi dị iche iche) mere ule t-nwa akwụkwọ nwere ọdụ abụọ; *p < 0.05). c 用于肌钙蛋白-T 和NFATC4 免疫标记的第0 天和第6 天MTOS心脏切片的代表性图像，以及来自不同猪的NFATC4 易位至CM 细胞核的量化（n = 4 (D0)进行双尾学生t 检验；*p <0.05). c ihe nnochita anya calcanin-T na NFATC4 immunolabeling 第0天和第6天MTOS mpekere obi, na NFATC4 sitere na NFATC4 dị iche iche时间双尾学生et 电影；*p <0.05). c Репрезентативные изображения срезов сердца MTOS на 0 и 6 день для оценка транслокации NFATC4 в ядра CM от разных свиней (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срез/группа, два- хвостатый t-крить; 0,05). c Foto ndị a na-anọchite anya nke mkpụrụ obi MTOS n'ụbọchị 0 na 6 maka troponin-T na NFATC4 immunolabeling na nha nke ntụgharị NFATC4 n'ime nucleus nke CM site na ezi dị iche iche (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) mpekere/otu, t-trailerion nke ụmụ akwụkwọ; *p < 0.05).Ogwe njehie na-anọchite anya ntụgharị nkezi ± ọkọlọtọ.
Nnyocha obi na akwara nke nsụgharị chọrọ ụdị mkpụrụ ndụ nke na-emegharị gburugburu obi nke ọma. N'ọmụmụ ihe a, e mepụtara ma kọwaa ngwaọrụ CTCM nke nwere ike ịkpalite akụkụ obi dị gịrịgịrị. Sistemụ CTCM gụnyere mkpali electromechanical nke physiologically combined physiologically na mmụba mmiri T3 na Dex. Mgbe akụkụ obi porcine gosipụtara ihe ndị a, ike ha, iguzosi ike n'ezi ihe, ọrụ metabolic, na ngosipụta transcriptal nọgidere otu ihe ahụ dị na anụ ahụ obi ọhụrụ mgbe ụbọchị 12 nke omenala gasịrị. Na mgbakwunye, ịgbatị oke nke anụ ahụ obi nwere ike ibute hypertrophy nke obi nke hyperextension kpatara. N'ozuzu, nsonaazụ ndị a na-akwado ọrụ dị mkpa nke ọnọdụ ọdịbendị physiological na ịnọgide na-enwe ụdị obi nkịtị ma na-enye ikpo okwu maka nyocha ọgwụ.
Ọtụtụ ihe na-enye aka n'ịmepụta gburugburu ebe obibi kacha mma maka ọrụ na ndụ nke mkpụrụ ndụ akwara obi. Ihe ndị kacha pụta ìhè n'ime ihe ndị a metụtara (1) mmekọrịta dị n'etiti mkpụrụ ndụ, (2) mkpali electromechanical, (3) ihe ndị na-eme ka mmadụ nwee obi ụtọ, na (4) ihe ndị na-eme ka ihe dị n'ime sel dị n'ime ahụ. Mmekọrịta dị n'etiti mkpụrụ ndụ na mkpụrụ ndụ chọrọ netwọk akụkụ atọ dị mgbagwoju anya nke ọtụtụ ụdị mkpụrụ ndụ nke matrix extracellular na-akwado. Mmekọrịta dị mgbagwoju anya dị otú ahụ siri ike ịrụgharị n'ime vitro site na mmekorita nke ụdị mkpụrụ ndụ nke ọ bụla, mana enwere ike imezu ya ngwa ngwa site na iji ọdịdị organotypic nke akụkụ obi.
Mgbatị ígwè na mkpali eletriki nke cardiomyocytes dị oke mkpa maka ịnọgide na-enwe ụdị obi33,34,35. Ọ bụ ezie na ejiriwo mkpali ígwè mee ihe maka nhazi na ntozu okè nke hiPSC-CM, ọtụtụ ọmụmụ ihe mara mma anwalela mkpali ígwè nke iberibe obi na omenala site na iji ibu otuaxial. Ọmụmụ ihe ndị a na-egosi na ibu otuaxial nke 2D nwere mmetụta dị mma na ụdị obi n'oge ọdịbendị. N'ọmụmụ ihe ndị a, e tinyere akụkụ nke obi na ike nrụgide isometric17, ibu otuaxial nke linear18, ma ọ bụ jiri nzaghachi transducer ike na draịva nrụgide mepụtaghachi okirikiri obi. Agbanyeghị, ụzọ ndị a na-eji ịgbatị anụ ahụ uniaxial na-enweghị nhazi gburugburu ebe obibi, na-ebute mgbochi nke ọtụtụ mkpụrụ ndụ ihe nketa obi ma ọ bụ oke ngosipụta nke mkpụrụ ndụ ihe nketa jikọtara ya na nzaghachi ịgbatị na-adịghị mma. CTCM akọwara ebe a na-enye mkpali electromechanical 3D nke na-eṅomi usoro obi eke n'ihe gbasara oge okirikiri na ịgbatị ahụ (25% mgbatị, 40% systole, 60% diastole, na 72 beats kwa nkeji). Ọ bụ ezie na mkpali igwe a nke nwere akụkụ atọ ezughi oke iji nọgide na-enwe iguzosi ike n'ezi ihe nke anụ ahụ, a chọrọ njikọta nke mkpali humoral na nke mekanikal site na iji T3/Dex iji nọgide na-enwe ike, ọrụ, na iguzosi ike n'ezi ihe nke anụ ahụ nke ọma.
Ihe ndị na-eme ihe ọchị na-arụ ọrụ dị mkpa n'ịgbanwe ụdị obi ndị toro eto. E gosipụtara nke a na ọmụmụ HiPS-CM ebe etinyere T3 na Dex na mgbasa ozi omenala iji mee ka mkpụrụ ndụ too ngwa ngwa. T3 nwere ike imetụta mbufe nke amino acid, shuga na calcium n'ofe akpụkpọ ahụ sel36. Na mgbakwunye, T3 na-akwalite ngosipụta MHC-α na mbelata MHC-β, na-akwalite nhazi nke myofibrils twitch ngwa ngwa na cardiomyocytes tozuru okè ma e jiri ya tụnyere myofibrils twitch nwayọ na fetal CM. Enweghị T3 na ndị ọrịa hypothyroid na-ebute mfu nke eriri myofibrillar na mbelata ọnụego mmepe ụda37. Dex na-arụ ọrụ na ndị na-anabata glucocorticoid ma egosila na ọ na-eme ka myocardial contractivity dịkwuo elu na obi perfused dịpụrụ adịpụ; 38 a na-eche na mmelite a metụtara mmetụta na ntinye calcium deposit-driven (SOCE) 39,40. Na mgbakwunye, Dex na-ejikọ na ndị na-anabata ya, na-akpata nzaghachi dị ukwuu n'ime sel nke na-egbochi ọrụ ahụ ji alụso ọrịa ọgụ na mbufụt30.
Nsonaazụ anyị na-egosi na mkpali anụ ahụ (MS) mere ka arụmọrụ omenala zuru oke ka mma ma e jiri ya tụnyere Ctrl, mana ọ naghị enwe ike ịnọgide na-adị ndụ, iguzosi ike n'ezi ihe, na ngosipụta obi ruo ụbọchị iri na abụọ n'ọdịbendị. Ma e jiri ya tụnyere Ctrl, itinye T3 na Dex na omenala CTCM (MT) mere ka ndụ dịkwuo mma ma nọgide na-enwe profaịlụ ntụgharị yiri nke ahụ, iguzosi ike n'ezi ihe, na ọrụ metabolic na anụ ahụ obi ọhụrụ ruo ụbọchị iri na abụọ. Na mgbakwunye, site n'ịchịkwa ọkwa nke ịgbatị anụ ahụ, e ji STCM mepụta ụdị hypertrophy obi nke hyperextension kpatara, na-egosi mgbanwe nke sistemụ STCM. Ọ dị mkpa ịmara na ọ bụ ezie na mgbanwe obi na fibrosis na-agụnyekarị akụkụ ahụ ndị na-adịghị emebi emebi nke mkpụrụ ndụ na-agagharị agagharị nwere ike inye cytokines kwesịrị ekwesị yana phagocytosis na ihe ndị ọzọ na-agbanwe agbanwe, akụkụ nke obi ka nwere ike iṅomi usoro fibrotic na nzaghachi na nrụgide na trauma. n'ime myofibroblasts. A tụlere nke a na mbụ na ụdị iberibe obi a. Ọ dị mkpa ịmara na enwere ike ịgbanwe paramita CTCM site na ịgbanwe nrụgide/oke eletriki na ugboro ole iji mee ka ọtụtụ ọnọdụ dị ka tachycardia, bradycardia, na nkwado mgbasa ọbara igwe (obi a na-ebughị n'ime igwe). Nke a na-eme ka usoro a bụrụ usoro dị mfe maka nnwale ọgwụ. Ike CTCM nwere iji ihe atụ nke oke nrụgide obi nke na-akpata na-eme ka ụzọ dị mma maka ịnwale usoro a maka ọgwụgwọ nkeonwe. Na mmechi, ọmụmụ ihe a na-egosi na mgbatị ahụ na mkpali humoral dị oke mkpa maka ịnọgide na-enwe ọdịbendị nke akụkụ anụ ahụ obi.
Ọ bụ ezie na data ewepụtara ebe a na-egosi na CTCM bụ ikpo okwu dị mma maka ịme ihe nlereanya myocardium na-adịghị emebi emebi, usoro ọdịbendị a nwere oke ụfọdụ. Mmachi bụ isi nke ọdịbendị CTCM bụ na ọ na-etinye nrụgide mekaniki na-aga n'ihu na mpekere ndị ahụ, nke na-egbochi ikike inyocha mkpụkọ obi n'oge okirikiri ọ bụla. Na mgbakwunye, n'ihi obere nha nke akụkụ obi (7 mm), ikike inyocha ọrụ systolic n'èzí sistemụ omenala site na iji ihe mmetụta ike ọdịnala pere mpe. N'akwụkwọ edemede ugbu a, anyị na-emeri oke a site n'inyocha voltaji anya dị ka ihe ngosi nke ọrụ nkwekọrịta. Agbanyeghị, mmachi a ga-achọ ọrụ ọzọ ma enwere ike idozi ya n'ọdịnihu site na itinye usoro maka nlekota anya nke ọrụ nke mpekere obi na omenala, dị ka maapụ anya site na iji agba calcium na voltaji nwere mmetụta. Mmachi ọzọ nke CTCM bụ na ụdị ọrụ anaghị achịkwa nrụgide physiological (bugoro na mgbe ebuchara). Na CTCM, a kpaliri nrụgide n'akụkụ ndị ọzọ iji mepụta 25% physiological stretch na diastole (ogologo mkpụkọ n'oge mkpali eletriki) na nnukwu anụ ahụ. A ga-ewepụ mmachi a n'ime atụmatụ CTCM n'ọdịnihu site na nrụgide zuru oke na anụ ahụ obi site n'akụkụ abụọ yana site n'itinye njikọ kpọmkwem na olu nrụgide nke na-eme n'ime ụlọ nke obi.
Ndozigharị nke oke nrụgide kpatara akọwara n'akwụkwọ a bụ naanị iṅomi mgbaàmà hypertrophic hyperstretch. Ya mere, ụdị a nwere ike inye aka n'ọmụmụ ihe mgbaàmà hypertrophic nke na-akpali agbatị na-enweghị mkpa maka ihe humoral ma ọ bụ neural factors (nke na-adịghị na sistemụ a). A chọrọ ọmụmụ ihe ndị ọzọ iji mee ka ọtụtụ CTCM dịkwuo elu, dịka ọmụmaatụ, ịzụlite na mkpụrụ ndụ ahụ ji alụso ọrịa ọgụ, ihe ndị na-ekesa humoral plasma, na innervation mgbe ịzụlite na mkpụrụ ndụ neuronal ga-eme ka ohere nke ịme ihe nlereanya ọrịa na CTCM ka mma.
E jiri ezi iri na atọ mee nnyocha a. Emere usoro anụmanụ niile dịka ntuziaka ụlọ ọrụ si dị, Kọmitii Nlekọta na Ojiji nke Mahadum Louisville kwadoro ya. E ji eriri akwara kụchie ma tinye 1 L nke obi dị ọcha (110 mM NaCl, 1.2 mM CaCl2, 16 mM KCl, 16 mM MgCl2, 10 mM NaHCO3, 5 U/mL heparin, pH ruo 7.4); A na-echekwa obi ndị ahụ n'ime mmiri ọgwụ obi oyi-ice ruo mgbe e bugara ha n'ụlọ nyocha n'elu ice nke na-adịkarị ihe karịrị nkeji iri. A na-echekwa obi ndị ahụ n'ime mmiri ọgwụ obi oyi-ice ruo mgbe e bugara ha n'ụlọ nyocha n'elu ice nke na-adịkarị ihe karịrị nkeji iri. сердца хранили в ледяном кардиоплегическом растворе до транспортиртировки в лабораторию на льду, что обымы. A na-echekwa obi n'ime mmiri ọgwụ obi oyi na-atụ ruo mgbe e bufere ya gaa n'ụlọ nyocha n'elu ice, nke na-ewekarị ihe na-erughị nkeji iri.将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钟。将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钟。 Держите сердца в ледяной кардиоплегии до транспортировки в лабораторию на льду, обычно <10 мин. Debe obi gị n'elu ice cardioplegia ruo mgbe e bufere gị gaa n'ụlọ nyocha n'elu ice, nke na-abụkarị ihe na-erughị nkeji iri.
E mepụtara ngwaọrụ CTCM site na ngwanrọ SolidWorks nke kọmputa na-enyere aka na imewe (CAD). E ji plastik acrylic CNC clear mee ụlọ omenala, ihe nkesa na ụlọ ikuku. E ji polyethylene dị elu (HDPE) mee mgbanaka nkwado nke dayameta 7mm n'etiti ya ma nwee oghere o-ring iji mee ka mgbanaka silicone dị n'okpuru kpuchie ihe ndị dị n'okpuru ya. Akpụkpọ silica dị gịrịgịrị na-ekewa ụlọ ọdịbendị ahụ na efere nkewa. A na-eji laser bepụ akpụkpọ silicone ahụ site na mpempe silicone dị arọ 0.02″ ma nwee ike nke 35A. A na-eji laser bepụ gaskets silicone ala na elu site na mpempe silicone dị arọ 1/16″ ma nwee ike nke 50A. A na-eji skru ígwè anaghị agba nchara 316L na nku nku maka ijikọ ngọngọ ahụ ma mepụta mkpuchi ikuku na-adịghị ekwe ka ikuku ghara ịbanye.
E mere bọọdụ sekit e biri ebi (PCB) ka e wee jikọta ya na sistemụ C-PACE-EM. A na-ejikọ oghere njikọ igwe swiss dị na PCB na electrodes graphite site na waya ọla kọpa e ji ọlaọcha kpuchie na skru ọla nchara 0-60 nke a kpụkọrọ n'ime electrodes. A na-etinye bọọdụ sekit e biri ebi n'ime mkpuchi nke ngwa nbipute 3D.
Ngwaọrụ CTCM nwere ike iji ihe na-emegharị pneumatic (PPD) nke na-emepụta nrụgide ọbara a na-achịkwa nke yiri okirikiri obi. Ka nrụgide dị n'ime ụlọ ikuku na-abawanye, akpụkpọ ahụ silicone na-agbanwe agbanwe na-agbasa elu, na-amanye ihe dị n'okpuru ebe anụ ahụ dị. A ga-agbatị mpaghara anụ ahụ site na mwepụ a nke mmiri mmiri, na-eṅomi mgbasawanye nke obi n'oge diastole. N'oge ezumike kachasị elu, e tinyere mkpali eletriki site na elektrọd graphite, nke belatara nrụgide dị n'ime ụlọ ikuku ma mee ka akụkụ anụ ahụ gbawaa. N'ime paịpụ ahụ, e nwere valvụ hemostatic nwere ihe mmetụta nrụgide iji chọpụta nrụgide dị na sistemụ ikuku. A na-etinye nrụgide nke ihe mmetụta nrụgide ahụ na-ahụ na onye na-anakọta data ejikọtara na laptọọpụ. Nke a na-enye ohere nlekota nrụgide na-aga n'ihu n'ime ụlọ gas. Mgbe erutere nrụgide ụlọ kachasị elu (ọkọlọtọ 80 mmHg, 140 mmHg OS), e nyere ngwaọrụ nnweta data iwu ka o ziga mgbaàmà na sistemụ C-PACE-EM iji mepụta mgbaàmà voltaji biphasic maka 2 ms, nke edobere na 4 V.
E nwetara akụkụ obi ma mee ọnọdụ ọdịbendị n'ime olulu isii dịka ndị a: Bufee obi ndị a gbutere site na arịa mbufe gaa na tray nwere oyi (4° C.) cardioplegia. E kewapụrụ ventricle aka ekpe na agụba dị ọcha ma bee ya n'ime iberibe 1-2 cm3. E jikọtara blọk anụ ahụ ndị a na nkwado anụ ahụ site na iji ihe na-ejikọ anụ ahụ ma tinye ha n'ime bat nke anụ ahụ microtome na-ama jijiji nke nwere ihe ngwọta Tyrode ma na-etinye oxygen mgbe niile (3 g/L 2,3-butanedione monooxime (BDM), 140 mM NaCl (8.18 g). , 6 mM KCl (0.447 g), 10 mM D-glucose (1.86 g), 10 mM HEPES (2.38 g), 1 mM MgCl2 (1 ml 1 M ngwọta), 1.8 mM CaCl2 (1.8 ml 1 M ngwọta), ruo 1 L ddH2O). E tinyere microtome ahụ na-ama jijiji ka ọ bee iberibe dị 300 µm n'ọtụtụ ugboro nke 80 Hz, oke mkpọtụ kwụ ọtọ nke 2 mm, na ọnụego mbugharị nke 0.03 mm/s. E jiri ice gbaa bat anụ ahụ gburugburu iji mee ka ngwọta ahụ dị jụụ ma nọgide na-enwe okpomọkụ na 4°C. Bufee akụkụ anụ ahụ site na bat microtome gaa na bat incubation nke nwere ihe ngwọta Tyrode oxygen na-aga n'ihu na ice ruo mgbe e nwetara akụkụ zuru oke maka otu efere ọdịbendị. Maka ọdịbendị transwell, etinyere akụkụ anụ ahụ na nkwado polyurethane obosara 6 mm dị ọcha ma tinye ya na 6 ml nke ọkara kachasị mma (199 ọkara, 1x mgbakwunye ITS, 10% FBS, 5 ng/ml VEGF, 10 ng/ml FGF-alkaline na 2X antibiotic-antifungal). E tinyere mkpali eletriki (10 V, ugboro 1.2 Hz) na akụkụ anụ ahụ site na C-Pace. Maka ọnọdụ TD, a na-agbakwunye T3 na Dex ọhụrụ na 100 nM na 1 μM na mgbanwe ọkara ọ bụla. A na-ejupụta ihe mkpuchi ahụ na oxygen tupu a dochie ya ugboro atọ n'ụbọchị. A na-akụ akụkụ anụ ahụ n'ime ihe na-eme ka ahụ dị ọkụ na 37°C na 5% CO2.
Maka ọdịbendị CTCM, etinyere akụkụ anụ ahụ n'elu igwe nbipute 3D emere nke ọma n'ime efere Petri nwere ihe ngwọta Tyrode agbanwere agbanwe. Emebere ngwaọrụ a iji mee ka akụkụ obi dịkwuo elu site na 25% nke mpaghara mgbanaka nkwado. A na-eme nke a ka akụkụ obi ghara ịgbatị mgbe ebufere ya site na ihe ngwọta Tyrode gaa na etiti na n'oge diastole. Site na iji gluu histoacrylic, etinyere akụkụ 300 µm ọkpụrụkpụ na mgbanaka nkwado 7 mm na dayameta. Mgbe etinyere akụkụ anụ ahụ na mgbanaka nkwado, bepụ akụkụ anụ ahụ karịrị akarị ma tinye akụkụ anụ ahụ ejikọtara azụ n'ime bat nke ihe ngwọta Tyrode na ice (4°C) ruo mgbe edoziri akụkụ zuru oke maka otu ngwaọrụ. Oge nhazi zuru oke maka ngwaọrụ niile ekwesịghị ịgafe awa 2. Mgbe etinyere akụkụ anụ ahụ 6 na mgbaaka nkwado ha, a chịkọtara ngwaọrụ CTCM. A na-ejupụta ụlọ ọdịbendị CTCM na ihe eji eme oxygen tupu oge eruo. Bufee akụkụ anụ ahụ na ụlọ ọdịbendị ma jiri nlezianya wepụ afụ ikuku ọ bụla na pipette. A na-eduzi akụkụ anụ ahụ n'ime oghere ahụ ma jiri nwayọ pịa ya. N'ikpeazụ, tinye mkpuchi elektrọd na ngwaọrụ ahụ wee bufee ngwaọrụ ahụ na incubator. Mgbe ahụ jikọọ CTCM na tube ikuku na sistemụ C-PACE-EM. Ihe na-eme ka ikuku rụọ ọrụ na-emeghe ma valvụ ikuku na-emepe CTCM. Ehaziri sistemụ C-PACE-EM ka ọ na-enye 4 V na 1.2 Hz n'oge ngagharị biphasic maka ms 2. A gbanwere usoro ahụ ugboro abụọ n'ụbọchị ma gbanwee elektrọd otu ugboro n'ụbọchị iji zere mkpokọta graphite na elektrọd. Ọ bụrụ na ọ dị mkpa, enwere ike iwepụ akụkụ anụ ahụ na olulu ọdịbendị ha iji chụpụ afụ ikuku ọ bụla nke nwere ike ịda n'okpuru ha. Maka ọnọdụ ọgwụgwọ MT, etinyere T3/Dex ọhụrụ na mgbanwe ọkara ọ bụla yana 100 nM T3 na 1 μM Dex. E tinyere ngwaọrụ CTCM na incubator na 37°C na 5% CO2.
Iji nweta ụzọ ndị gbatịrị agbatị nke mkpụrụ obi, e mepụtara sistemụ igwefoto pụrụ iche. E jiri igwefoto SLR (Canon Rebel T7i, Canon, Tokyo, Japan) mee ihe na lensị macro Navitar Zoom 7000 18-108mm (Navitar, San Francisco, CA). E mere ihe ngosi na okpomọkụ ụlọ mgbe ejiri ihe ọhụrụ dochie ihe ahụ. E tinyere igwefoto ahụ n'akụkụ 51° ma dekọọ vidiyo na okpokolo iri atọ kwa sekọnd. Nke mbụ, ejiri ngwanrọ mepere emepe (MUSCLEMOTION43) jiri Image-J tụọ mmegharị nke mkpụrụ obi. E ji MATLAB (MathWorks, Natick, MA, USA) mepụta ihe mkpuchi ahụ iji kọwaa mpaghara mmasị maka ịkụ mkpụrụ obi iji zere mkpọtụ. A na-etinye ihe mkpuchi aka kewara na onyonyo niile na usoro etiti wee nyefee ya na nkwụnye MUSCLEMOTION. Mmegharị ahụ na-eji ike nkezi nke pikselụ dị na okpokolo ọ bụla iji tụọ mmegharị ya ma e jiri ya tụnyere okpokolo ntụaka. E dekọrọ data, tee ya ma jiri ya tụọ oge okirikiri ma nyochaa mgbatị anụ ahụ n'oge okirikiri obi. E jiri nzacha dijitalụ efu nke usoro mbụ hazie vidiyo e dekọrọ. Iji tụọ mgbatị anụ ahụ (elu-ruo-elu), e mere nyocha elu-ruo-elu iji mata ọdịiche dị n'etiti elu na oghere dị na mgbaama e dekọrọ. Na mgbakwunye, a na-eji polynomial nke usoro nke isii eme detrending iji wepụ mgbaama. E mepụtara koodu mmemme na MATLAB iji chọpụta mmegharị anụ ahụ zuru ụwa ọnụ, oge okirikiri, oge ezumike, na oge mkpụmkpụ (Koodu Mmemme Mgbakwunye 44).
Maka nyocha nrụgide, site na iji otu vidiyo ndị e kere maka nyocha mgbatị igwe, anyị buru ụzọ chọpụta onyonyo abụọ na-anọchite anya elu mmegharị (ebe kachasị elu (elu) na nke kacha ala (ala) nke mmegharị) dịka ngwanrọ MUSCLEMOTION si dị. Anyị kewara mpaghara anụ ahụ wee tinye ụdị algọridim shading na anụ ahụ kewara ekewa (Foto mgbakwunye 2a). E kewara anụ ahụ kewara ekewa n'ime ala iri, a gbakọọ nrụgide dị n'elu nke ọ bụla site na iji usoro a: Strain = (Sup-Sdown)/Sdown, ebe Sup na Sdown bụ anya nke ọdịdị site na onyinyo elu na ala nke ákwà ahụ, n'otu n'otu (Foto mgbakwunye .2b).
E tinyere akụkụ obi na 4% paraformaldehyde ruo awa 48. E tinyere akụkụ ahụ ndị a rụchara arụcha na 10% na 20% sucrose maka awa 1, wee tinye 30% sucrose n'ime 30% sucrose n'otu abalị. E tinyeziri akụkụ ndị ahụ na ngwakọta okpomọkụ kachasị mma (OCT compound) ma jiri nwayọọ nwayọọ kpọnwụọ na mmiri ịsa ahụ akọrọ/ikpo mmiri oyi. Debe blọk ndị e tinyere na OCT na -80 °C ruo mgbe ha kewara. E kwadebere slide dị ka akụkụ nwere ọkpụrụkpụ nke 8 μm.
Iji wepụ OCT n'ime obi, kpoo slide ndị ahụ ọkụ na blọk ọkụ na 95 °C maka nkeji ise. Tinye 1 ml PBS na slide ọ bụla wee tinye ya na okpomọkụ ụlọ maka nkeji iri atọ, wee banye n'ime ngalaba ndị ahụ site na ịtọ 0.1% Triton-X na PBS maka nkeji iri na ise na okpomọkụ ụlọ. Iji gbochie mgbochi nje ndị na-abụghị nke a kapịrị ọnụ ijikọ na ihe nlele ahụ, tinye 1 ml nke ngwọta BSA 3% na slide ma tinye ya na okpomọkụ ụlọ maka otu awa. E wepụrụ BSA ahụ ma jiri PBS saa slide ndị ahụ. Jiri pensụl mee akara ihe nlele ọ bụla. A gbakwụnyela ọgwụ mgbochi mbụ (agbazere 1:200 na 1% BSA) (connexin 43 (Abcam; #AB11370), NFATC4 (Abcam; #AB99431) na troponin-T (Thermo Scientific; #MA5-12960) n'ime nkeji iri itoolu, emesịa tinye ọgwụ mgbochi nke abụọ (agbazere 1:200 na 1% BSA) megide òké Alexa Fluor 488 (Thermo Scientific; #A16079), megide oke bekee Alexa Fluor 594 (Thermo Scientific; #T6391) maka nkeji iri itoolu ọzọ. A sachara ya ugboro atọ na PBS Iji mata ntụpọ ebumnuche site na ndabere, anyị jiri naanị antibody nke abụọ dị ka njikwa. N'ikpeazụ, etinyere ntụpọ nuklia DAPI ma tinye slides ahụ na vectasheld (Vector Laboratories) ma mechie ya na ntu. -x magnification) na Keyence microscope nwere 40x magnification.
E jiri WGA-Alexa Fluor 555 (Thermo Scientific; #W32464) na 5 μg/ml na PBS mee ihe maka ịcha WGA ma tinye ya na akụkụ ndị a kapịrị ọnụ ruo nkeji iri atọ na okpomọkụ ụlọ. E jiri PBS saa slide ndị ahụ, tinyekwa Sudan black na slide ọ bụla ma tinye ya na mkpuchi maka nkeji iri atọ. E jiri PBS sachaa slide ndị ahụ ma tinye ihe mkpuchi vectasheld. E jiri igwe microscope Keyence mee ihe na-eme ka ọ dị elu nke ukwuu.
E wepụrụ OCT n'ime ihe nlele ndị ahụ dịka akọwara n'elu. Mgbe ewepụsịrị OCT ahụ, mikpuo slide ndị ahụ n'ime mmiri Bouin n'otu abalị. E jiri mmiri a gwakọtara agwakọta sachaa slide ndị ahụ ruo otu awa wee tinye ha na mmiri Bibrich aloe acid fuchsin maka nkeji iri. E mesịa, e jiri mmiri a gwakọtara agwakọta saa slide ndị ahụ ma tinye ha na mmiri 5% phosphomolybdenum/5% phosphotungstic acid maka nkeji iri. Na-asachapụghị ha, bufee slide ndị ahụ ozugbo na mmiri aniline blue maka nkeji iri na ise. E mesịa, e jiri mmiri a gwakọtara agwakọta saa slide ndị ahụ ma tinye ha na mmiri acetic acid 1% maka nkeji abụọ. E ji 200 N ethanol kpọọ nkụ ma bufee ha na xylene. E jiri igwe microscope Keyence mee ihe onyonyo slide ndị ahụ nwere ihe mgbaru ọsọ iri. E jiri sọftụwia Keyence Analyzer tụọ pasentị mpaghara Fibrosis.
Nnyocha Ọdịdị Cell CyQUANT™ MTT (Invitrogen, Carlsbad, CA), nọmba katalọgụ V13154, dịka usoro onye nrụpụta si dị, yana mgbanwe ụfọdụ. Karịsịa, e jiri mkpịsị aka ịwa ahụ nke dayameta nke 6 mm iji hụ na nha anụ ahụ dị otu n'oge nyocha MTT. E tinyere anụ ahụ n'otu n'otu n'ime olulu mmiri nke efere olulu 12 nwere ihe mkpuchi MTT dịka usoro onye nrụpụta si dị. A na-etinye akụkụ ndị ahụ na okpomọkụ 37°C. ruo awa 3, anụ ahụ dị ndụ na-agbanwe ihe mkpuchi MTT iji mepụta ihe mkpuchi formazan odo odo. Dochie ngwọta MTT na 1 ml DMSO ma tinye ya na okpomọkụ 37°C maka nkeji 15 iji wepụta formazan odo odo na akụkụ obi. A gwakọtara ihe nlele 1:10 na DMSO na efere ala doro anya nke ọma 96 na ike agba odo odo nke a tụrụ na 570 nm site na iji ihe na-agụ efere Cytation (BioTek). E mere ka ọgụgụ ahụ dị ka ibu nke ibe ọ bụla nke obi.
E jiri ihe mgbasa ozi nwere 1 μCi/ml [5-3H]-glucose (Moravek Biochemicals, Brea, CA, USA) dochie ihe mgbasa ozi obi maka nnwale ojiji glucose dịka akọwara na mbụ. Mgbe awa anọ nke incubation gasịrị, tinye 100 µl nke etiti na tube microcentrifuge mepere emepe nke nwere 100 µl nke 0.2 N HCl. E mesịa, etinye tube ahụ na tube scintillation nwere 500 μl nke dH2O ka ọ ghara ịpụ [3H]2O maka awa 72 na 37°C. Wee wepụ tube microcentrifuge na tube scintillation ma tinye 10 ml nke mmiri scintillation. Ejiri Tri-Carb 2900TR mmiri scintillation analyzer (Packard Bioscience Company, Meriden, CT, USA) mee ọnụọgụ scintillation. E wee gbakọọ ojiji glucose site na iji ya na-atụle ọrụ [5-3H] nke glucose, nguzozi na ndabere na-ezughị ezu, mmụba nke [5-3H] ruo glucose a na-akpọghị aha, na arụmọrụ scintillation. A na-eme ka data ahụ dị ka nke ọma na oke nke akụkụ obi.
Mgbe e mechara ka anụ ahụ dị n'otu na Trizol, e kewapụrụ RNA site na akụkụ obi site na iji Qiagen miRNeasy Micro Kit #210874 dịka usoro nke onye nrụpụta si dị. Emere nkwadebe, usoro na nyocha data n'ọbá akwụkwọ RNAsec dị ka ndị a:
E jiri 1 μg nke RNA kwa ihe nlele mee ihe dị ka ihe mmalite maka nkwadebe nke ọbá akwụkwọ RNA. E jiri NEBNext UltraTM RNA Library Preparation Kit maka Illumina (NEB, USA) mepụta ọbá akwụkwọ nhazi usoro iheomume site na iji NEBNext UltraTM RNA Library Preparation Kit maka Illumina (NEB, USA) dịka ndụmọdụ onye nrụpụta si dị, a gbakwụnyekwara koodu index na usoro njirimara maka ihe nlele ọ bụla. N'ụzọ dị mkpirikpi, e sachara mRNA site na RNA zuru oke site na iji beads magnetik nke ejikọtara na poly-T oligonucleotides. A na-eme nkewa site na iji cations divalent na okpomọkụ dị elu na NEBNext First Strand Synthesis Reaction Buffer (5X). E jiri praịma hexamer random na M-MuLV reverse transcriptase (RNase H-) mepụta cDNA nke mbụ. E mesịa jiri DNA polymerase I na RNase H mepụta cDNA nke abụọ. A na-agbanwe overhangs ndị fọdụrụ ka ha bụrụ nsọtụ blunt site na ọrụ exonuclease/polymerase. Mgbe a na-ewepụ njedebe 3′ nke iberibe DNA ahụ, a na-ejikọ NEBNext Adapter nwere nhazi loop hairpin na ya iji kwadebe ya maka njikọta. Maka nhọrọ nke iberibe cDNA nke ogologo kachasị mma, e jiri sistemụ AMPure XP (Beckman Coulter, Beverly, USA) sachaa iberibe ọbá akwụkwọ cDNA nke dị 150-200 bp. site na iji sistemụ AMPure XP (Beckman Coulter, Beverly, USA). Mgbe ahụ, e jiri 3 μl USER Enzyme (NEB, USA) nke nwere cDNA ahọpụtara nha ya na ihe nkwụnye ya mee ihe maka nkeji iri na ise na 37°C wee jiri nkeji ise na 95°C tupu PCR. Emechara jiri Phusion High-Fidelity DNA polymerase, universal PCR primers, na Index (X) primers mee PCR. N'ikpeazụ, e mere PCR ngwaahịa (AMPure XP sistemu) ma nyochaa ịdị mma ọbá akwụkwọ na sistemụ Agilent Bioanalyzer 2100. E jiri usoro Novaseq sequencer dekọọ ọbá akwụkwọ cDNA. E jiri CASAVA Base Calling gbanwee faịlụ onyonyo raw sitere na Illumina ka ọ bụrụ agụ raw. A na-echekwa data raw na faịlụ usoro FASTQ(fq) nke nwere usoro agụ na àgwà ntọala kwekọrọ. Họrọ HISAT2 ka o kwekọọ na agụmagụ usoro nzacha na mkpụrụ ndụ ihe nketa Sscrofa11.1. N'ozuzu, HISAT2 na-akwado mkpụrụ ndụ ihe nketa nke nha ọ bụla, gụnyere mkpụrụ ndụ ihe nketa karịrị ijeri anọ, a na-edobekwa ụkpụrụ ndabara maka ọtụtụ paramita. Enwere ike ịhazi ọnụọgụgụ sitere na data RNA Seq nke ọma site na iji HISAT2, sistemụ kachasị ọsọ dị ugbu a, yana otu ma ọ bụ nke ka mma karịa usoro ọ bụla ọzọ.
Ọnụọgụgụ nke akwụkwọ ndị a na-egosi kpọmkwem ọkwa nke mkpụrụ ndụ ihe nketa. A na-enyocha ọkwa ngosipụta mkpụrụ ndụ ihe nketa site na ọtụtụ akwụkwọ ndị a na-ede (ọnụọgụ nhazi) nke jikọtara ya na genome ma ọ bụ exons. Ọnụọgụgụ nke akwụkwọ ndị a na-ede kwekọrọ na ọkwa ngosipụta mkpụrụ ndụ ihe nketa, ogologo mkpụrụ ndụ ihe nketa, na omimi usoro. A gbakọọ FPKM (nkewa kwa puku ụzọ isi nke akwụkwọ ndị a na-edezi kwa nde ụzọ isi) ma chọpụta uru P nke ngosipụta dị iche site na iji ngwugwu DESeq2. Anyị gbakọọkwara ọnụego nchọpụta ụgha (FDR) maka uru P ọ bụla site na iji usoro Benjamini-Hochberg9 dabere na ọrụ R arụnyere na ya "p.adjust".
A gbanwere RNA nke e kewapụrụ site na akụkụ obi ka ọ bụrụ cDNA na mkpokọta 200 ng/μl site na iji ngwakọta SuperScript IV Vilo Master sitere na Thermo (Thermo, cat. no. 11756050). Ejiri efere mmeghachi omume Applied Biosystems Endura Plate Microamp 384-well transparent (Thermo, cat. no. 4483319) na ihe mgbakwunye optical microamp (Thermo, cat. no. 4311971) mee Quantitative RT-PCR. Ngwakọta mmeghachi omume ahụ nwere ngwakọta Taqman Fast Advanced Master 5 µl (Thermo, cat # 4444557), 0.5 µl Taqman Primer na 3.5 µl H2O agwakọtara kwa olulu mmiri. Ejiri usoro qPCR ọkọlọtọ mee ihe, a tụrụkwa ụkpụrụ CT site na iji ngwa PCR Applied Biosystems Quantstudio 5 real-time (modulu 384-well; ngwaahịa # A28135). A zụtara ihe ndị e ji eme Taqman primers site na Thermo (GAPDH (Ss03375629_u1), PARP12 (Ss06908795_m1), PKDCC (Ss06903874_m1), CYGB (Ss06900188_m1), RGL1 (Ss06868890_m1), ACTN1 (Ss01009508_mH), GATA4 (Ss03383805_u1), GJA1 (Ss03374839_u1), COL1A2 (Ss03375009_u1), COL3A1 (Ss04323794_m1), ACTA2 (Ss04245588_m1) A gbanwere ụkpụrụ CT nke ihe nlele niile ka ọ bụrụ nke a na-ahụ maka ụlọ GAPDH.
E jiri ngwa NT-ProBNP (ezi) (MBS2086979, MyBioSource) nyochaa mwepụta mgbasa ozi nke NT-ProBNP dịka usoro nke onye nrụpụta si dị. N'ụzọ dị mkpirikpi, etinyere 250 µl nke ihe nlele na ọkọlọtọ ọ bụla n'otu abụọ na olulu mmiri ọ bụla. Ozugbo etinyere ihe nlele ahụ, tinye 50 µl nke Assay Reagent A na olulu mmiri ọ bụla. Jiri nwayọ maa efere ahụ ma mechie ya na ihe mkpuchi. Mgbe ahụ, a kpọchiri mbadamba na 37°C maka otu awa. Mgbe ahụ, gbanye mmiri ọgwụ ahụ ma saa olulu mmiri ahụ ugboro anọ na 350 µl nke ihe ngwọta ịsa ahụ 1X, tinye mmiri ọgwụ ahụ maka nkeji 1-2 oge ọ bụla. Mgbe ahụ, tinye 100 µl nke Assay Reagent B kwa olulu mmiri ma mechie ya na ihe mkpuchi efere. E jiri nwayọọ maa mbadamba ahụ ma tinye ya na okpomọkụ 37°C maka nkeji 30. Tinye mmiri ọgwụ ahụ n'ime olulu mmiri ma saa olulu mmiri ahụ ugboro ise site na iji mmiri ịsa ahụ 350 µl nke 1X. Tinye 90 µl nke mmiri ọgwụ n'ime olulu mmiri ọ bụla ma mechie efere ahụ. Tinye efere ahụ na okpomọkụ 37°C maka nkeji 10-20. Tinye 50 µl Stop Solution na olulu mmiri ọ bụla. A tụrụ efere ahụ ozugbo site na iji ihe na-agụ efere Cytation (BioTek) nke dị na 450 nm.
E mere nyocha ike iji họrọ nha otu nke ga-enye ike karịrị 80% iji chọpụta mgbanwe zuru oke nke 10% na paramita ahụ site na ọnụego njehie nke 5% Ụdị I. E mere nyocha ike iji họrọ nha otu nke ga-enye ike karịrị 80% iji chọpụta mgbanwe zuru oke nke 10% na paramita ahụ site na ọnụego njehie nke 5% Ụdị I. Анализ мощности был выполнене для выбора размеров групп, которые обеспечат > 80% изменения параметра с 5% частотой ошибок типа I. E mere nyocha ike iji họrọ nha otu ga-enye ike karịrị 80% iji chọpụta mgbanwe paramita 10% zuru oke site na ọnụego njehie nke 5% Ụdị I.进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％I变化和5％I型给介看關进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％I变化和5％I型给介看關 Был проведен анализ мощности для выбора размера группы, который обеспечил бы > 80% мощности для обнару абсолютного изменения параметров na 5% частоты ошибок типа I. E mere nyocha ike iji họrọ nha otu nke ga-enye ike karịrị 80% iji chọpụta mgbanwe paramita 10% zuru oke na ọnụego njehie ụdị I 5%.A họọrọ akụkụ anụ ahụ n'enweghị usoro tupu nnwale ahụ. Nyocha niile bụ nke a na-apụghị ịchọpụta ma ọlị, a na-akọwakwa ihe nlele naanị mgbe enyochachara data niile. E jiri ngwanrọ GraphPad Prism (San Diego, CA) mee nyocha ọnụọgụgụ niile. Maka ọnụọgụgụ niile, a na-ewere uru p dị ka ihe dị mkpa na uru <0.05. Maka ọnụ ọgụgụ niile, a na-ewere uru p dị ka ihe dị mkpa na uru <0.05. Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. Maka ọnụ ọgụgụ niile, a na-ewere uru p dị ka ihe dị mkpa na uru <0.05.对于所有统计数据，p 值在值<0.05 时被认为是显着的。对于所有统计数据，p 值在值<0.05 时被认为是显着的。 Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. Maka ọnụ ọgụgụ niile, a na-ewere uru p dị ka ihe dị mkpa na uru <0.05.E mere ule t nke ụmụ akwụkwọ nwere ọdụ abụọ na data ahụ, naanị ntụnyere abụọ. E jiri otu ụzọ ma ọ bụ ụzọ abụọ ANOVA chọpụta mkpa dị n'etiti ọtụtụ otu. Mgbe a na-eme ule posthoc, e tinyere mgbazi Tukey iji tụlee ọtụtụ ntụnyere. Data RNAsec nwere ihe pụrụ iche a na-atụle na ọnụọgụgụ mgbe a na-agbakọ FDR na p.adjust dịka akọwara na ngalaba Usoro.
Maka ozi ndị ọzọ gbasara nhazi ọmụmụ ihe, lee nchịkọta akụkọ gbasara Nature Research Report nke jikọtara na akụkọ a.