Kiitos käynnistäsi Nature.com-sivustolla. Käyttämäsi selainversio tukee CSS:ää rajoitetusti. Parhaan käyttökokemuksen saavuttamiseksi suosittelemme käyttämään päivitettyä selainta (tai poistamaan yhteensopivuustilan käytöstä Internet Explorerissa). Sillä välin tuen jatkuvuuden varmistamiseksi renderöimme sivuston ilman tyylejä ja JavaScriptiä.
Lääkeainetestausta varten tarvitaan luotettava in vitro -järjestelmä, joka pystyy tarkasti toistamaan sydämen fysiologisen ympäristön. Ihmisen sydänkudosviljelyjärjestelmien rajallinen saatavuus on johtanut sydämen lääkevaikutusten epätarkkoihin tulkintoihin. Tässä tutkimuksessa olemme kehittäneet sydänkudosviljelymallin (CTCM), joka stimuloi sydänleikkeitä sähkömekaanisesti ja käy läpi fysiologisen venytyksen sydänsyklin systolisen ja diastolisen vaiheen aikana. 12 päivän viljelyn jälkeen tämä lähestymistapa paransi osittain sydänleikkeiden elinkykyä, mutta ei täysin säilyttänyt niiden rakenteellista eheyttä. Siksi pienmolekyyliseulonnan jälkeen havaitsimme, että 100 nM trijodityroniinin (T3) ja 1 μM deksametasonin (Dex) lisääminen kasvatusalustaan ​​säilytti leikkeiden mikrorakenteen 12 päivän ajan. Yhdessä T3/Dex-käsittelyn kanssa CTCM-järjestelmä säilytti transkriptioprofiilit, elinkykyisyyden, metabolisen aktiivisuuden ja rakenteellisen eheyden samalla tasolla kuin tuoreessa sydänkudoksessa 12 päivän ajan. Lisäksi sydänkudoksen liiallinen venytys viljelyssä indusoi hypertrofista sydänsignalointia, mikä osoittaa CTCM:n kyvyn jäljitellä sydämen venytyksen aiheuttamia hypertrofisia tiloja. Yhteenvetona voidaan todeta, että CTCM voi mallintaa sydämen fysiologiaa ja patofysiologiaa viljelmässä pitkien ajanjaksojen ajan, mikä mahdollistaa luotettavan lääkeaineseulonnan.
Ennen kliinistä tutkimusta tarvitaan luotettavia in vitro -järjestelmiä, jotka pystyvät tarkasti toistamaan ihmissydämen fysiologisen ympäristön. Tällaisten järjestelmien tulisi jäljitellä muuttunutta mekaanista venytystä, sykettä ja elektrofysiologisia ominaisuuksia. Eläinmalleja käytetään yleisesti sydänfysiologian seulonta-alustana, ja niiden luotettavuus lääkkeiden vaikutusten heijastamisessa ihmissydämessä on rajallinen1,2. Lopulta ihanteellinen sydänkudosviljelykoemalli (CTCM) on malli, joka on erittäin herkkä ja spesifinen erilaisille terapeuttisille ja farmakologisille interventioille ja joka toistaa tarkasti ihmissydämen fysiologian ja patofysiologian3. Tällaisen järjestelmän puuttuminen rajoittaa uusien sydämen vajaatoiminnan hoitojen löytämistä4,5 ja on johtanut lääkkeiden kardiotoksisuuteen merkittävänä syynä markkinoilta poistumiseen6.
Viimeisen vuosikymmenen aikana kahdeksan sydän- ja verisuonitautien ulkopuolista lääkettä on poistettu kliinisestä käytöstä, koska ne pidentävät QT-aikaa, mikä johtaa kammioperäisiin rytmihäiriöihin ja äkilliseen kuolemaan7. Siksi luotettavien prekliinisten seulontastrategioiden tarve sydän- ja verisuonitautien tehon ja toksisuuden arvioimiseksi kasvaa. Ihmisen indusoimien pluripotenttien kantasolujen tuottamien kardiomyosyyttien (hiPS-CM) viimeaikainen käyttö lääkeseulonnassa ja toksisuustestauksessa tarjoaa osittaisen ratkaisun tähän ongelmaan. HiPS-CM:ien kehittymätön luonne ja sydänkudoksen monisoluisen monimutkaisuuden puute ovat kuitenkin tämän menetelmän merkittäviä rajoituksia. Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että tämä rajoitus voidaan osittain ratkaista käyttämällä varhaista hiPS-CM:ää sydänkudoshydrogeelien muodostamiseen pian spontaanien supistusten alkamisen jälkeen ja lisäämällä sähköistä stimulaatiota vähitellen ajan myötä. Näistä hiPS-CM-mikrokudoksista puuttuu kuitenkin aikuisen sydänlihaksen kypsät elektrofysiologiset ja supistuvat ominaisuudet. Lisäksi ihmisen sydänkudoksella on monimutkaisempi rakenne, joka koostuu heterogeenisestä seoksesta eri solutyyppejä, mukaan lukien endoteelisolut, neuronit ja stroomafibroblastit, jotka ovat yhteydessä toisiinsa erityisillä solunulkoisten matriisiproteiinien sarjoilla. Tämä ei-kardiomyosyyttipopulaatioiden heterogeenisuus11,12,13 aikuisen nisäkkään sydämessä on merkittävä este sydänkudoksen mallintamiselle yksittäisten solutyyppien avulla. Nämä merkittävät rajoitukset korostavat sellaisten menetelmien kehittämisen tärkeyttä, joilla viljellään ehjää sydänlihaskudosta fysiologisissa ja patologisissa olosuhteissa.
Ihmisen sydämestä otetuista ohuista (300 µm) leikkeistä on tullut lupaava malli ehjästä ihmisen sydänlihaksesta. Tämä menetelmä tarjoaa pääsyn täydelliseen kolmiulotteiseen monisoluiseen järjestelmään, joka on samanlainen kuin ihmisen sydänkudos. Vuoteen 2019 asti viljeltyjen sydänleikkeiden käyttöä rajoitti kuitenkin lyhyt (24 h) viljelmän eloonjäämisaika. Tämä johtuu useista tekijöistä, kuten fysikaalis-mekaanisen venytyksen puutteesta, ilma-neste-rajapinnasta ja yksinkertaisten väliaineiden käytöstä, jotka eivät tue sydänkudoksen tarpeita. Vuonna 2019 useat tutkimusryhmät osoittivat, että mekaanisten tekijöiden sisällyttäminen sydänkudosviljelyjärjestelmiin voi pidentää viljelyn kestoa, parantaa sydämen ilmentymistä ja jäljitellä sydänpatologiaa. Kaksi eleganttia tutkimusta 17 ja 18 osoittavat, että yksiaksiaalisella mekaanisella kuormituksella on positiivinen vaikutus sydämen fenotyyppiin viljelyn aikana. Näissä tutkimuksissa ei kuitenkaan käytetty sydämen syklin dynaamista kolmiulotteista fysikaalis-mekaanista kuormitusta, koska sydänleikkeet kuormitettiin joko isometrisillä vetovoimilla 17 tai lineaarisella auksotonisella kuormituksella 18. Nämä kudosvenytysmenetelmät johtivat monien sydängeenien suppressioon tai epänormaaleihin venytysvasteisiin liittyvien geenien yli-ilmentymiseen. Erityisesti Pitoulis ym.19 kehittivät dynaamisen sydänsiivuviljelykylvyn sydämen syklin rekonstruktiota varten käyttäen voima-anturin takaisinkytkentää ja jännitysmoottoreita. Vaikka tämä järjestelmä mahdollistaa tarkemman sydämen syklin mallinnuksen in vitro, menetelmän monimutkaisuus ja alhainen läpimenokapasiteetti rajoittavat järjestelmän soveltamista. Laboratoriomme on äskettäin kehittänyt yksinkertaistetun viljelyjärjestelmän, jossa käytetään sähköstimulaatiota ja optimoitua elatusainetta sian ja ihmisen sydänkudosleikkeiden elinkykyisyyden ylläpitämiseksi jopa 6 päivän ajan20,21.
Tässä käsikirjoituksessa kuvaamme sydänkudosviljelymallin (CTCM), jossa käytetään sian sydämen osia ja joka sisältää humoraalisia vihjeitä sydämen kolmiulotteisen fysiologian ja patofysiologisen laajenemisen toistamiseksi sydämen toimintasyklin aikana. Tämä CTCM voi lisätä prekliinisen lääkeennusteen tarkkuutta ennennäkemättömälle tasolle tarjoamalla kustannustehokkaan, keskitason sydänjärjestelmän, joka jäljittelee nisäkkäiden sydämen fysiologiaa/patofysiologiaa prekliinisissä lääketesteissä.
Hemodynaamisilla mekaanisilla signaaleilla on ratkaiseva rooli sydänlihassolujen toiminnan ylläpitämisessä in vitro [22,23,24]. Tässä käsikirjoituksessa olemme kehittäneet CTCM:n (kuva 1a), joka voi jäljitellä aikuisen sydänympäristöä indusoimalla sekä sähköistä että mekaanista stimulaatiota fysiologisilla taajuuksilla (1,2 Hz, 72 lyöntiä minuutissa). Liiallisen kudosvenytyksen välttämiseksi diastolen aikana käytettiin 3D-tulostuslaitetta kudoskoon kasvattamiseksi 25 %:lla (kuva 1b). C-PACE-järjestelmän indusoima sähköinen tahdistus ajoitettiin alkamaan 100 ms ennen systolia käyttämällä tiedonkeruujärjestelmää sydämen toimintakierron täydelliseksi toistamiseksi. Kudosviljelyjärjestelmä käyttää ohjelmoitavaa pneumaattista toimilaitetta (LB Engineering, Saksa) joustavan silikonikalvon sykliseen laajentamiseen, mikä aiheuttaa sydänviipaleiden laajenemisen yläkammiossa. Järjestelmä oli kytketty ulkoiseen ilmajohtoon paineanturin kautta, mikä mahdollisti paineen (± 1 mmHg) ja ajan (± 1 ms) tarkan säätämisen (kuva 1c).
a Kiinnitä kudososa laitteen viljelykammion sisällä olevaan 7 mm:n tukirenkaaseen, joka on merkitty sinisellä. Viljelykammio on erotettu ilmakammiosta ohuella joustavalla silikonikalvolla. Aseta tiiviste jokaisen kammion väliin vuotojen estämiseksi. Laitteen kansi sisältää grafiittielektrodeja, jotka tarjoavat sähköisen stimulaation. b Kaaviomainen esitys suuresta kudoslaitteesta, ohjausrenkaasta ja tukirenkaasta. Kudosleikkeet (ruskeat) asetetaan ylisuurelle laitteelle siten, että ohjausrengas on laitteen ulkoreunan urassa. Aseta ohjaimen avulla kudosakryyliliimalla päällystetty tukirengas varovasti sydänkudososan päälle. c Kaavio, joka näyttää sähköisen stimulaation ajan ilmakammion paineen funktiona, jota ohjataan ohjelmoitavalla pneumaattisella toimilaitteella (PPD). Tiedonkeruulaitetta käytettiin sähköisen stimulaation synkronointiin paineantureiden avulla. Kun viljelykammion paine saavuttaa asetetun kynnysarvon, C-PACE-EM:lle lähetetään pulssisignaali sähköisen stimulaation laukaisemiseksi. d Kuva neljästä CTCM:stä, jotka on sijoitettu inkubaattorihyllylle. Neljä laitetta on kytketty yhteen PPD:hen pneumaattisen piirin kautta, ja paineanturit on asetettu hemostaattiseen venttiiliin pneumaattisen piirin paineen valvomiseksi. Jokainen laite sisältää kuusi kudosleikettä.
Yhdellä pneumaattisella toimilaitteella pystyimme ohjaamaan neljää CTCM-laitetta, joista kuhunkin mahtui kuusi kudosleikettä (kuva 1d). CTCM:ssä ilmakammion ilmanpaine muunnetaan nestekammion synkroniseksi paineeksi, mikä indusoi sydänleikkeen fysiologisen laajenemisen (kuva 2a ja lisäelokuva 1). Kudosvenytyksen arviointi 80 mmHg:n paineella. Art. osoitti kudosleikkeiden venyneen 25 % (kuva 2b). Tämän prosentuaalisen venytyksen on osoitettu vastaavan fysiologista sarkomeerin pituutta 2,2–2,3 µm normaalilla sydämen leikkeen supistuvuustasolla17,19,25. Kudosliikettä arvioitiin käyttämällä mukautettuja kamera-asetuksia (lisäkuva 1). Kudosliikkeen amplitudi ja nopeus (kuva 2c, d) vastasivat venytystä sydämen syklin aikana sekä aikaa systolen ja diastolen aikana (kuva 2b). Sydänkudoksen venymä ja nopeus supistumisen ja relaksaation aikana pysyivät vakioina 12 päivän ajan viljelyssä (kuva 2f). Sähköisen stimulaation vaikutuksen supistumiseen viljelyn aikana arvioimiseksi kehitimme menetelmän aktiivisen epämuodostuman määrittämiseksi varjostusalgoritmia käyttäen (lisäkuva 2a,b) ja pystyimme erottamaan epämuodostumat sähköisen stimulaation kanssa ja ilman sitä. Sama sydämen osa (kuva 2f). Leikkauksen liikkuvalla alueella (R6-9) jännite sähköisen stimulaation aikana oli 20 % korkeampi kuin ilman sähköistä stimulaatiota, mikä osoittaa sähköisen stimulaation osuuden supistumistoimintaan.
Ilmakammion paineen, nestekammion paineen ja kudosliikkeen mittausten edustavat käyrät vahvistavat, että kammion paine muuttaa nestekammion painetta aiheuttaen vastaavan kudosleikkeen liikkeen. b Kudosleikkeiden prosentuaalisen venymän (sininen) edustavat käyrät, jotka vastaavat prosentuaalista venytystä (oranssi). c Sydänleikkeen mitattu liike on yhdenmukainen mitatun liikenopeuden kanssa. (d) Sydänleikkeen syklisen liikkeen (sininen viiva) ja nopeuden (oranssi katkoviiva) edustavat radat. e Sykliajan (n = 19 leiketta ryhmää kohden, eri sioista), supistumisajan (n = 19 leiketta ryhmää kohden), relaksaatioajan (n = 19 leiketta ryhmää kohden, eri sioista), kudosliikkeen (n = 25 leiketta)/ryhmä eri sioista), systolisen huippunopeuden (n = 24(D0), 25(D12) leiketta/ryhmä eri sioista) ja relaksaationopeuden (n = 24(D0), 25(D12) leiketta/ryhmä eri sioista) kvantifiointi. Kaksisuuntainen Studentin t-testi ei osoittanut merkittävää eroa missään parametrissa. f Edustavat venymäanalyysijäljet ​​kudosleikkeistä, joissa on (punainen) ja ilman (sininen) sähköistä stimulaatiota, kymmenen alueellista aluetta samasta leikkeestä peräisin olevista kudosleikkeistä. Alapaneelit näyttävät prosentuaalisen eron kvantifioinnin kudosleikkeissä, joissa on ja ei ole sähköistä stimulaatiota, kymmenellä alueella eri leikkeistä. (n = 8 viipaletta/ryhmä eri sioista, kaksisuuntainen Studentin t-testi suoritetaan; ****p < 0,0001, **p < 0,01, *p < 0,05). (n = 8 viipaletta/ryhmä eri sioista, kaksisuuntainen Studentin t-testi suoritetaan; ****p < 0,0001, **p < 0,01, *p < 0,05). (n = 8 срезов/группу от разных свиней, проводится двусторонний t-критерий Стьюдента; ****p<0,0001, **p<0,01,5). (n = 8 leikettä/ryhmä eri sioista, kaksisuuntainen Studentin t-testi; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05). （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p < 0,0001，**p < 0,01，*5） （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p < 0,0001，**p < 0,01，*5） (n = 8 срезов/группу, от разных свиней, двусторонний критерий Стьюдента; ****p <0,0001, **p <0,01, *p <0,05). (n = 8 leikettä/ryhmä, eri sioista, kaksisuuntainen Studentin t-testi; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05).Virhepalkit edustavat keskiarvoa ± keskihajontaa.
Edellisessä staattisessa biomimeettisessä sydänleikkeiden viljelyjärjestelmässämme [20, 21] ylläpidimme sydänleikkeiden elinkykyä, toimintaa ja rakenteellista eheyttä 6 päivän ajan käyttämällä sähköistä stimulaatiota ja optimoimalla viljelyalustan koostumusta. 10 päivän kuluttua nämä luvut kuitenkin laskivat jyrkästi. Viittaamme aiemmassa staattisessa biomimeettisessä viljelyjärjestelmässämme 20, 21 viljeltyihin leikkeisiin kontrolliolosuhteissa (Ctrl) ja käytämme aiemmin optimoitua viljelyalustaamme MC-olosuhteissa ja viljelyssä samanaikaisen mekaanisen ja sähköisen stimulaation (CTCM) alaisena. nimeltään . Ensin totesimme, että mekaaninen stimulaatio ilman sähköistä stimulaatiota ei riittänyt ylläpitämään kudoksen elinkykyä 6 päivän ajan (lisäkuva 3a, b). Mielenkiintoista on, että fysio-mekaanisen ja sähköisen stimulaation käyttöönoton myötä STCM:llä 12 päivän sydänleikkeiden elinkyky pysyi samana kuin tuoreissa sydänleikkeissä MS-olosuhteissa, mutta ei Ctrl-olosuhteissa, kuten MTT-analyysi osoittaa (kuva 1). 3a). Tämä viittaa siihen, että mekaaninen stimulaatio ja sydämen syklin simulointi voivat pitää kudosleikkeet elinkykyisinä kaksi kertaa pidempään kuin aiemmassa staattisessa viljelyjärjestelmässämme raportoitiin. Kudosleikkeiden rakenteellisen eheyden arviointi sydämen troponiini T:n ja konneksiini 43:n immunoleimauksella osoitti kuitenkin, että konneksiini 43:n ilmentyminen oli merkittävästi korkeampaa MC-kudoksissa päivänä 12 kuin kontrolliryhmissä samana päivänä. Konneksiini 43:n ilmentyminen ja Z-levyjen muodostuminen eivät kuitenkaan täysin säilyneet (kuva 3b). Käytämme tekoälykehikkoa (AI) kudoksen rakenteellisen eheyden kvantifiointiin26 ja kuvapohjaista syväoppimisprosessia, joka perustuu troponiini-T:hen ja konneksiinivärjäykseen43 sydänleikkeiden rakenteellisen eheyden ja fluoresenssin automaattiseen kvantifiointiin lokalisaation voimakkuuden perusteella. Tämä menetelmä käyttää konvoluutiohermoverkkoa (CNN) ja syväoppimiskehikkoa sydänkudoksen rakenteellisen eheyden luotettavaan kvantifiointiin automatisoidulla ja puolueettomalla tavalla, kuten viitteessä on kuvattu.26. MC-kudos osoitti parantunutta rakenteellista samankaltaisuutta päivään 0 verrattuna staattisiin kontrollileikkeisiin. Lisäksi Massonin trikromivärjäys paljasti merkittävästi alhaisemman fibroosin prosenttiosuuden MS-olosuhteissa verrattuna kontrolliryhmiin viljelypäivänä 12 (kuva 3c). Vaikka CTCM lisäsi sydänkudosleikkeiden elinkykyä päivänä 12 samalle tasolle kuin tuoreella sydänkudoksella, se ei parantanut merkittävästi sydänleikkeiden rakenteellista eheyttä.
Pylväsdiagrammi näyttää tuoreiden sydänviipaleiden (päivä 0) tai sydänviipaleiden viljelmän MTT:n elinkykyisyyden kvantifioinnin 12 päivän ajan joko staattisessa viljelmässä (päivä 12 Ctrl) tai CTCM:ssä (päivä 12 MC) (n = 18 (päivä 0), 15 (päivä 12 Ctrl), 12 (päivä 12 MC) viipaletta/ryhmä eri sioista, suoritettiin yksisuuntainen ANOVA-testi; ####p < 0,0001 verrattuna päivään 0 ja **p < 0,01 verrattuna päivän 12 Ctrl). Pylväsdiagrammi näyttää tuoreiden sydänviipaleiden (päivä 0) tai sydänviipaleiden viljelmän MTT:n elinkykyisyyden kvantifioinnin 12 päivän ajan joko staattisessa viljelmässä (päivä 12 Ctrl) tai CTCM:ssä (päivä 12 MC) (n = 18 (päivä 0), 15 (päivä 12 Ctrl), 12 (päivä 12 MC) viipaletta/ryhmä eri sioista, suoritettiin yksisuuntainen ANOVA-testi; ####p < 0,0001 verrattuna päivään 0 ja **p < 0,01 verrattuna päivän 12 Ctrl).Histogrammi näyttää MTT-tuoreista sydänleikkeistä (D0) tai sydänleikkeiden viljelystä 12 päivän ajan joko staattisessa viljelyssä (D12-kontrolli) tai CTCM:ssä (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12-kontrolli). ) , 12 (D12 MC) leiketta/ryhmä eri sioista, ja suoritetaan yksisuuntainen ANOVA-testi;####p < 0,0001 по сравнению с D0 и **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p < 0,0001 verrattuna D0:aan ja **p < 0,01 verrattuna D12-Ctrl-kohtaan). a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切片(D0)或心脏切片培养12 天的 活力的量化)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组葐，ANO进测试；与D0 相比，####p < 0,0001，与D12 Ctrl 相比，**p < 0,01). a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切片(D0) ，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；与D0 相比，####p < 与 1，####p < 与 0.0001相比，**p.)histogrammi, joka näyttää MTT:n elinkykyisyyden kvantifioinnin tuoreissa sydänleikkeissä (päivä 0) tai 12 päivää staattisessa viljelmässä (päivä 12 kontrolli) tai CTCM:ssä (päivä 12 MC) viljellyissä sydänleikkeissä (n = 18 (päivä 0), 15 (päivä 12 kontrolli)), 12 (päivä 12 MC) leikettä/ryhmä eri sioista, yksisuuntainen ANOVA-testi;####p < 0,0001 по сравнению с D0, **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p < 0,0001 verrattuna D0:aan, **p < 0,01 verrattuna D12:n Ctrl-kohtaan).b Troponiini-T (vihreä), konneksiini 43 (punainen) ja DAPI (sininen) tuoreissa eristetyissä sydänleikkeissä (D0) tai staattisissa olosuhteissa (Ctrl) tai CTCM-olosuhteissa (MC) 12 päivän ajan viljellyissä sydänleikkeissä edustavissa immunofluoresenssikuvissa (tyhjä skaala = 100 µm). Sydänkudoksen rakenteellisen eheyden tekoälyllä tehty kvantifiointi (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) viipaletta/ryhmä kukin eri siasta, suoritettiin yksisuuntainen ANOVA-testi; ####p < 0,0001 verrattuna D0:aan ja ****p < 0,0001 verrattuna D12 Ctrl:ään). Sydänkudoksen rakenteellisen eheyden tekoälyllä kvantifioitu määritys (n = 7 (päivä 0), 7 (päivä 12 Ctrl), 5 (päivä 12 MC) viipaletta/ryhmä kukin eri sioista, suoritettiin yksisuuntainen ANOVA-testi; ####p < 0,0001 verrattuna päivään 0 ja ****p < 0,0001 verrattuna päivän 12 Ctrl). Количественная оценка структурной целостности сердечной ткани искусственным интеллектом (n = 7 (D0), 7 MC (D12) Ctrl 2 срезов/групп от разных свиней, проводится однофакторный тест ANOVA; D12 Ctrl). Sydänkudoksen rakenteellisen eheyden kvantifiointi tekoälyn avulla (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) leikettä/ryhmää eri sioista, yksisuuntainen ANOVA-testi suoritettu; ####p < 0,0001 vs. D0 ja ****p < 0,0001 verrattuna D12 Ctrl -tilaan).人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) viipaletta/ryhmä kukin eri sioista, yksisuuntainen ANOVA-testi <丸与䎎0p1;#.相比，****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）.人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) viipaletta/ryhmä kukin eri sioista, yksisuuntainen ANOVA-testi1#0###0p0;与D0相比，****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）. Искусственный интеллект для количественной оценки структурной целостности сердечной ткани (n = 7 (D0), 7 (D5) (D121) срезов/группу каждой из разных свиней, односторонний тест ANOVA; ####p <0,0001 vs. D0 Для сравнения ****p D < 0,20юсравсне). Tekoäly sydänkudoksen rakenteellisen eheyden kvantifiointiin (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) leikettä/ryhmä kukin eri sioista, yksisuuntainen ANOVA-testi; ####p<0,0001 vs. D0 Vertailun vuoksi ****p < 0,0001 verrattuna D12 Ctrl:ään). c Edustavat kuvat (vasemmalla) ja kvantifiointi (oikealla) Massonin trikromivärillä värjätyille sydänviipaleille (skaala tyhjä = 500 µm) (n = 10 viipaletta/ryhmä kukin eri siasta, suoritettiin yksisuuntainen ANOVA-testi; ####p < 0,0001 verrattuna päivään D0 ja ***p < 0,001 verrattuna päivän D12 Ctrl -väriin). c Edustavat kuvat (vasen) ja kvantifiointi (oikea) Massonin trikromivärillä värjätyille sydänviipaleille (skaala tyhjä = 500 µm) (n = 10 viipaletta/ryhmä kukin eri sioista, suoritetaan yksisuuntainen ANOVA-testi; #### p < 0,0001 verrattuna päivään D0 ja ***p < 0,001 verrattuna päivän D12 Ctrl -hoitoon). c Репрезентативные изображения (слева) и количественная оценка (справа) срезов сердца, окрашенных трихром (масштаб без покрытия = 500 мкм) (n = 10 срезов/группу от разных свиней, выполняется односторонний тест# p#VA; 0,0001 по сравнению с D0 и ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Edustavat kuvat (vasemmalla) ja kvantifiointi (oikealla) Massonin trikromivärillä värjätyistä sydänleikkeistä (päällystämätön hilse = 500 µm) (n = 10 leikettä/ryhmä eri sioista, yksisuuntainen ANOVA-testi suoritettu; #### p < 0,0001 verrattuna päivään D0 ja ***p < 0,001 verrattuna päivän D12 Ctrl -väriin). c 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像（左）和量化（右）（裸尺0）（裸尺0） 10 个切片/组，每组来自不同的猪，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0,0001 与D0 相比 0.0001 与D0 相比相比）. C 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 （左 左） 量化 （右） 尸尦躸 尸尺度裸尺度 = 500 µm） （n = 10 个 切片 组 每 组 来自 不同 猪 ， 进行 单向 单曑进行 单向 单拑 单拐 单 向 单向0,0001 与D0 相比，***p < 0,001 与D12 Ctrl 相比）. c Репрезентативные изображения (слева) и количественный анализ (справа) срезов сердца, окрашенных трихром (чистая шкала = 500 мкм) (n = 10 срезов/группа, каждый от другой свиньи, протестировано с помощью одноф дисперсионного анализа ;### #p < 0,0001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Edustavat kuvat (vasemmalla) ja kvantifiointi (oikealla) sydänleikkeistä, värjätty Massonin trikromivärillä (tyhjä = 500 µm) (n = 10 leikettä/ryhmä, kukin eri siasta, testattu yksisuuntaisella varianssianalyysillä;### # p < 0,0001 verrattuna päivään D0, ***p < 0,001 verrattuna päivän 12 Ctrl -väriin).Virhepalkit edustavat keskiarvoa ± keskihajontaa.
Oletimme, että lisäämällä pieniä molekyylejä viljelyalustaan ​​voitaisiin parantaa sydänlihassolujen eheyttä ja vähentää fibroosin kehittymistä CTCM-viljelyn aikana. Siksi seuloimme pieniä molekyylejä käyttämällä staattisia kontrolliviljelmiämme20,21 sekoittavien tekijöiden pienen määrän vuoksi. Tähän seulontaan valittiin deksametasoni (Dex), trijodityroniini (T3) ja SB431542 (SB). Näitä pieniä molekyylejä on aiemmin käytetty hiPSC-CM-viljelmissä sydänlihassolujen kypsymisen indusoimiseksi lisäämällä sarkomeerin pituutta, T-tubuluksia ja johtumisnopeutta. Lisäksi sekä Dexin (glukokortikoidi) että SB:n tiedetään hillitsevän tulehdusta29,30. Siksi testasimme, parantaisiko yhden tai useamman näistä pienistä molekyyleistä sisällyttäminen sydänleikkeiden rakenteellista eheyttä. Alustavaa seulontaa varten kunkin yhdisteen annos valittiin soluviljelymalleissa yleisesti käytettyjen pitoisuuksien perusteella (1 μM Dex27, 100 nM T327 ja 2,5 μM SB31). 12 päivän viljelyn jälkeen T3:n ja Dex:n yhdistelmä johti optimaaliseen sydänlihassolujen rakenteelliseen eheyteen ja minimaaliseen säikeiden uudelleenmuodostukseen (lisäkuvat 4 ja 5). Lisäksi näiden T3- ja Dex-pitoisuuksien kaksinkertaistuminen tai kaksinkertaistaminen aiheutti haitallisia vaikutuksia verrattuna normaaleihin pitoisuuksiin (lisäkuva 6a, b).
Alustavan seulonnan jälkeen suoritimme neljän viljelyolosuhteen vertailun (kuva 4a): Ctrl: sydänleikkeet viljelty aiemmin kuvatussa staattisessa viljelmässä käyttäen optimoitua elatusalustaamme; 20.21 TD: T3 ja Ctrl+ Dex lisätty keskiviikkona; MC: sydänleikkeet viljelty CTCM-viljelmässä käyttäen aiemmin optimoitua elatusalustaamme; ja MT: CTCM, johon oli lisätty T3 ja Dex. 12 päivän viljelyn jälkeen MS- ja MT-kudosten elinkyky pysyi samana kuin tuoreissa kudoksissa MTT-määrityksellä arvioituna (kuva 4b). Mielenkiintoista on, että T3:n ja Dex:n lisääminen transwell-viljelmiin (TD) ei johtanut merkittävään elinkyvyn paranemiseen Ctrl-olosuhteisiin verrattuna, mikä osoittaa mekaanisen stimulaation tärkeän roolin sydänleikkeiden elinkykyisyyden ylläpitämisessä.
Kokeellisen suunnittelun kaavio, joka kuvaa neljää viljelyolosuhdetta, joita käytettiin mekaanisen stimulaation ja T3/Dex-lisäravinteen vaikutusten arvioimiseen elatusaineessa 12 päivän ajan. b Pylväsdiagrammi näyttää elinkykyisyyden kvantifioinnin 12 päivää viljelyn jälkeen kaikissa neljässä viljelyolosuhteessa (kontrolli, TD, MC ja MT) verrattuna tuoreisiin sydänviipaleihin (päivä 0) (n = 18 (päivä 0), 15 (päivä 12 Ctrl, päivä 12 TD ja päivä 12 MT), 12 (päivä 12 MC) viipaletta/ryhmä eri sioista, suoritettiin yksisuuntainen ANOVA-testi; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 verrattuna päivään 0 ja **p < 0,01 verrattuna päivään 12 Ctrl). b Pylväsdiagrammi näyttää elinkykyisyyden kvantifioinnin 12 päivää viljelyn jälkeen kaikissa neljässä viljelyolosuhteessa (kontrolli, TD, MC ja MT) verrattuna tuoreisiin sydänviipaleihin (päivä 0) (n = 18 (päivä 0), 15 (päivä 12 Ctrl, päivä 12 TD ja päivä 12 MT), 12 (päivä 12 MC) viipaletta/ryhmä eri sioista, suoritettiin yksisuuntainen ANOVA-testi; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 verrattuna päivään 0 ja **p < 0,01 verrattuna päivän 12 kontrolliin). b Гистограмма показывает количественную оценку жизнеспособности через 12 дней после культивирования во4 культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TDD1) срезов/группу от разных свиней, проводится односторонний тест ANOVA; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 по сравнению с D0 и **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). b Pylväsdiagrammi näyttää elinkykyisyyden kvantifioinnin 12 päivää viljelyn jälkeen kaikissa neljässä viljelyolosuhteessa (kontrolli, TD, MC ja MT) verrattuna tuoreisiin sydänleikkeisiin (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD ja D12 MT), 12 (D12 MC) leikettä/ryhmä eri sioista, yksisuuntainen ANOVA-testi; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 vs. D0 ja **p < 0,01 verrattuna D12 Ctrl -leikkeeseen). b 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片、、』切片ぁ぀D1215D120)和D12 MT)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；####p < 0.0001，##001相比，**p < 0,01 与D12控制）.b 4 12 (D12 MC) b Гистограмма, показывающая все 4 условия культивирования (контроль, TD, MC ja MT) по сравнению со свежими со свежими срез0дми срез0 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD ja D12 MT), от разных свиней 12 (D12 MC) срезы/группа, односторонний тест ANOVA, ####p <0, ####p <0, ####p <0, сравнению с D0, **p <0,01 по сравнению с контролем D12). b Histogrammi, joka näyttää kaikki neljä viljelyolosuhdetta (kontrolli, TD, MC ja MT) verrattuna tuoreisiin sydänleikkeisiin (päivä 0) (n = 18 (päivä 0), 15 (päivä 12 Ctrl, päivä 12 TD ja päivä 12 MT), eri sioista, 12 (päivä 12 MC) leikettä/ryhmä, yksisuuntainen ANOVA-testi; ####p<0,0001, ###p<0,001 vs. päivä 0, **p<0,01 vs. kontrolli päivä 12). c Pylväsdiagrammi näyttää glukoosivuon kvantifioinnin 12 päivää viljelyn jälkeen kaikissa neljässä viljelyolosuhteessa (kontrolli, TD, MC ja MT) verrattuna tuoreisiin sydänviipaleihin (päivä 0) (n = 6 viipaletta/ryhmä eri sioista, suoritettiin yksisuuntainen ANOVA-testi; ###p < 0,001 verrattuna päivään 0 ja ***p < 0,001 verrattuna päivään 12 Ctrl). c Pylväsdiagrammi näyttää glukoosivuon kvantifioinnin 12 päivää viljelyn jälkeen kaikissa neljässä viljelyolosuhteessa (kontrolli, TD, MC ja MT) verrattuna tuoreisiin sydänviipaleihin (päivä 0) (n = 6 viipaletta/ryhmä eri sioista, suoritettiin yksisuuntainen ANOVA-testi; ###p < 0,001 verrattuna päivään 0 ja ***p < 0,001 verrattuna päivään 12 Ctrl). c Гистограмма показывает количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после культивирования во 4 всусехво культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 6 срезов/группу от развиных от разнению односторонний Выполняется тест ANOVA; ###p < 0,001 по сравнению с D0 и ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Histogrammi näyttää glukoosivuon kvantifioinnin 12 päivää viljelyn jälkeen kaikissa neljässä viljelyolosuhteessa (kontrolli, TD, MC ja MT) verrattuna tuoreisiin sydänleikkeisiin (D0) (n = 6 leikettä/ryhmä eri sioista, yksisuuntainen ANOVA-testi suoritettu; ###p < 0,001 verrattuna D0:aan ja ***p < 0,001 verrattuna D12 Ctrl-näytteeseen). c 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) 相掐12，天的葡萄糖通量定量（n = 6 片/组，来自不同猪，单向执行ANOVA 测试；###D < 0.0.0.相比，***p < 0,001 与D12 Ctrl 相比）. C 条形图 显示 所有 4 种 条件 （（ctrl 、 td 、 mc 和 mt） 新鲜 心脏 切片 切片 切片培养 后 后 12 天 的 通量 定量 （n = 6 片/组 ， 来自 猪 ， ， 的 ， ， ，，猪单向执行ANOVA 测试；###p < 0,001，与D0 相比，***p < 0,001 与D12 Ctrl 相比）. c Гистограмма, показывающая количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после кулививирования культивирования (контроль, TD, MC ja MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 6 срезов/группа, от раз свиней, односторонний Были проведены тесты ANOVA; ###p < 0,001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению с D12 (контроль). c Histogrammi, joka näyttää glukoosivuon kvantifioinnin 12 päivää viljelyn jälkeen kaikissa neljässä viljelyolosuhteessa (kontrolli, TD, MC ja MT) verrattuna tuoreisiin sydänleikkeisiin (päivä 0) (n = 6 leikettä/ryhmä, eri sioista, yksipuolisesti). Where-ANOVA-testit suoritettiin, ###p < 0,001 verrattuna päivään 0, ***p < 0,001 verrattuna päivään 12 (kontrolli).d Kanta-analyysikaaviot tuoreista (sininen), päivän 12 MC (vihreä) ja päivän 12 MT (punainen) kudoksista kymmenessä alueellisessa kudosleikepisteessä (n = 4 leiketta/ryhmä, yksisuuntainen ANOVA-testi; ryhmien välillä ei ollut merkitsevää eroa). e Tulivuorikaavio, joka näyttää erilaisesti ilmentyneet geenit tuoreissa sydänleikkeissä (D0) verrattuna staattisissa olosuhteissa (Ctrl) tai MT-olosuhteissa (MT) 10–12 päivän ajan viljeltyihin sydänleikkeisiin. f Sarkomeerigeenien lämpökartta kussakin viljelyolosuhteessa viljeltyihin sydänleikkeisiin. Virhepalkit edustavat keskiarvoa ± keskihajontaa.
Metabolinen riippuvuus rasvahappojen hapettumisen ja glykolyysin välisestä siirtymisestä on kardiomyosyyttien dedifferentiaation tunnusmerkki. Epäkypsät kardiomyosyytit käyttävät pääasiassa glukoosia ATP:n tuotantoon ja niillä on hypoplastisia mitokondrioita, joissa on vain vähän kristoja5,32. Glukoosin käyttöanalyysit osoittivat, että MC- ja MT-olosuhteissa glukoosin käyttö oli samanlaista kuin päivän 0 kudoksissa (kuva 4c). Ctrl-näytteissä havaittiin kuitenkin merkittävää glukoosin käytön kasvua tuoreeseen kudokseen verrattuna. Tämä osoittaa, että CTCM:n ja T3/Dex:n yhdistelmä parantaa kudoksen elinkykyä ja säilyttää 12 päivää viljeltyjen sydänleikkeiden metabolisen fenotyypin. Lisäksi kanta-analyysi osoitti, että kanta-tasot pysyivät samoina kuin tuoreessa sydänkudoksessa 12 päivän ajan MT- ja MS-olosuhteissa (kuva 4d).
Analysoidaksemme CTCM:n ja T3/Dex:n kokonaisvaikutusta sydänleikekudoksen globaaliin transkriptiomaisemaan, suoritimme RNA-sekvenssin sydänleikkeille kaikista neljästä eri viljelyolosuhteesta (lisätiedot 1). Mielenkiintoista kyllä, MT-leikkeet osoittivat korkeaa transkriptionaalista samankaltaisuutta tuoreen sydänkudoksen kanssa, ja vain 16 geeniä ilmentyi eri tavoin 13 642 geenistä. Kuten aiemmin osoitimme, Ctrl-leikkeet osoittivat 1229 eri tavoin ilmentynyttä geeniä 10–12 päivän viljelyn jälkeen (kuva 4e). Nämä tiedot vahvistettiin sydän- ja fibroblastigeenien qRT-PCR:llä (lisäkuvat 7a-c). Mielenkiintoista kyllä, Ctrl-leikkeet osoittivat sydän- ja solusykligeenien vähentynyttä säätelyä ja tulehdusgeeniohjelmien aktivoitumista. Nämä tiedot viittaavat siihen, että dedifferentiaatio, joka normaalisti tapahtuu pitkäaikaisen viljelyn jälkeen, on täysin heikentynyt MT-olosuhteissa (lisäkuvat 8a, b). Sarkomeerigeenien huolellinen tutkimus osoitti, että vain MT-olosuhteissa sarkomeeria (kuva 4f) ja ionikanavaa (lisäkuva 9) koodaavat geenit säilyvät, mikä suojaa niitä suppressiolta Ctrl-, TD- ja MC-olosuhteissa. Nämä tiedot osoittavat, että mekaanisen ja humoraalisen stimulaation (T3/Dex) yhdistelmällä sydänviipaleen transkriptomi voi pysyä samankaltaisena kuin tuoreet sydänviipaleet 12 päivän viljelyn jälkeen.
Näitä transkriptiolöydöksiä tukee se, että sydänleikkeiden kardiomyosyyttien rakenteellinen eheys säilyy parhaiten MT-olosuhteissa 12 päivän ajan, kuten ehjä ja lokalisoitunut konneksiini 43 osoittaa (kuva 5a). Lisäksi sydänleikkeiden fibroosi MT-olosuhteissa oli merkittävästi vähentynyt verrattuna Ctrl-hoitoon ja samankaltainen kuin tuoreissa sydänleikkeissä (kuva 5b). Nämä tiedot osoittavat, että mekaanisen stimulaation ja T3/Dex-käsittelyn yhdistelmä säilyttää tehokkaasti sydämen rakenteen sydänleikkeissä viljelmässä.
a Edustavat immunofluoresenssikuvat troponiini-T:stä (vihreä), konneksiini 43:sta (punainen) ja DAPI:sta (sininen) tuoreista eristetyistä sydänleikkeistä (D0) tai viljeltyinä 12 päivän ajan kaikissa neljässä sydänleikeviljelyolosuhteessa (skaalapalkki = 100 µm). ). Sydänkudoksen rakenteellisen eheyden tekoälyllä kvantifioitu määritys (n = 7 (D0 ja D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC ja D12 MT) viipaletta/ryhmä eri sioista, suoritettiin yksisuuntainen ANOVA-testi; ####p < 0,0001 verrattuna D0:aan ja *p < 0,05 tai ****p < 0,0001 verrattuna D12 Ctrl:ään). Sydänkudoksen rakenteellisen eheyden tekoälyllä kvantifioitu määritys (n = 7 (D0 ja D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC ja D12 MT) viipaletta/ryhmä eri sioista, suoritettiin yksisuuntainen ANOVA-testi; #### p < 0,0001 verrattuna D0:aan ja *p < 0,05 tai ****p < 0,0001 verrattuna D12 Ctrl:ään). Количественная оценка структурной целостности ткани сердца с помощью искусственного интеллекта (n = 71,2D10) D12 MC ja D12 MT) срезов/группу от разных свиней, проведен однофакторный тест ANOVA #### p < 0,0001 по сравне * 0,0001 по сравне; ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). Sydänkudoksen rakenteellisen eheyden kvantifiointi tekoälyn avulla (n = 7 (D0 ja D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC ja D12 MT) leikettä/ryhmä eri sioista, yksisuuntainen ANOVA-testi suoritettu; #### p < 0,0001 verrattuna D0:aan ja *p < 0,05 tai ****p < 0,0001 verrattuna D12 Ctrl:ään).对不同猪的心脏组织结构完整性（n = 7（D0 和D12 Ctrl）、5（D12 TD、D12 MC 和D12 MT）切片/组）进行人工智能量化，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0.0001 与D0 和*盌渖戌*p. 0.0001 与D12 Ctrl 相比）.对 不同 猪 的 心脏 结构 完整性 (n = 7 （d0 和 d12 ctrl） （5 （d12 td 、 d12 mc12 mc人工 智能量 化 进行 单向 单向 单向 测试 ； ########## p < 0,0001 与D0 和*p 戯戔 戸戔 戔 戔 戔0,0001 与D12 Ctrl 相比）.Sydänkudoksen rakenteellisen eheyden kvantifiointi tekoälyn avulla eri sioilla (n = 7 (D0 ja D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC ja D12 MT) osiota/ryhmä) yksisuuntaisella ANOVA-testillä;#### p < 0,0001 по сравнению с D0 и *p < 0,05 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). #### p < 0,0001 verrattuna D0:aan ja *p < 0,05 tai ****p < 0,0001 verrattuna D12:een (Ctrl). b Edustavat kuvat ja kvantifiointi Massonin trikromivärillä värjätyille sydänviipaleille (skaalapalkki = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD ja D12 MC), 9 (D12 MT) viipaletta/ryhmä eri sioista, suoritettiin yksisuuntainen ANOVA-testi; ####p < 0,0001 verrattuna D0:aan ja ***p < 0,001 tai ****p < 0,0001 verrattuna D12 Ctrl:ään). b Edustavat kuvat ja kvantifiointi Massonin trikromivärillä värjätyille sydänviipaleille (skaalapalkki = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD ja D12 MC), 9 (D12 MT) viipaletta/ryhmä eri sioista, suoritettiin yksisuuntainen ANOVA-testi; ####p < 0,0001 verrattuna D0:aan ja ***p < 0,001 tai ****p < 0,0001 verrattuna D12 Ctrl:ään). b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромным красителеным красителенная линейка = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD ja D12 MC), 9 (D12 MT) срезов/группу от разных свиней, выпояроннияйстостостонодANOтс; ####p < 0,0001 по сравнению с D0 и ***p < 0,001 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). b Edustavat kuvat ja Massonin trikromivärillä värjättyjen sydänleikkeiden kvantifiointi (skaalapalkki = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD ja D12 MC), 9 (D12 MT) leikettä/ryhmä eri sioista, suoritettu yksisuuntainen ANOVA; ####p < 0,0001 vs. D0 ja ***p < 0,001 tai ****p < 0,0001 vs. D12 Ctrl). b 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像和量化（比例尺= 500 µm）D01（n Ctrl、D12 TD 和D12 MC），来自不同猪的9 个（D12 MT）切片/组，进行单因素方差 10.0#0##p与D0 相比，***p < 0,001，或****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）. b 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 和 量化 （比例 尺 尺 尺 = 500 µ0n（ 、 d12 ctrl 、 d12 td 和 d12 mc） 来自 不同 的 9 个 d12 mt 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 组，进行单因素方差分析；##.0001p##.相比，***p < 0,001，或****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）. b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромом Масссона (тил500ромом Масссона мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD ja D12 MC), 9 (D12 MT) срезов от разных свиней / группы, один- способ ANOVA <ене, по 0 #p01 с D0, ***p < 0,001 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). b Edustavat kuvat ja Massonin trikromilla värjättyjen sydänleikkeiden kvantifiointi (skaalapalkki = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD ja D12 MC), 9 (D12 MT) leikettä eri sioista/ryhmästä, yksi ANOVA-menetelmä; ####p < 0,0001 verrattuna D0:aan, ***p < 0,001 tai ****p < 0,0001 verrattuna D12 Ctrl:ään).Virhepalkit edustavat keskiarvoa ± keskihajontaa.
Lopuksi CTCM:n kykyä jäljitellä sydämen hypertrofiaa arvioitiin lisäämällä sydänkudoksen venytystä. CTCM:ssä ilmakammion huippupaine nousi 80 mmHg:sta 80 mmHg:iin. Art. (normaali venytys) jopa 140 mmHg:iin Art. (kuva 6a). Tämä vastaa 32 %:n venytyksen kasvua (kuva 6b), joka aiemmin osoitettiin vastaavana prosentuaalisena venytyksenä, joka tarvitaan sydänleikkeiltä hypertrofiaa vastaavan sarkomeerin pituuden saavuttamiseksi. Sydänkudoksen venytys ja nopeus supistumisen ja relaksaation aikana pysyivät vakioina kuuden viljelypäivän ajan (kuva 6c). MT-olosuhteista peräisin olevaa sydänkudosta venytettiin normaalisti (MT (normaali)) tai ylivenytyksellä (MT (OS)) kuuden päivän ajan. Jo neljän viljelypäivän jälkeen hypertrofinen biomarkkeri NT-ProBNP oli merkittävästi koholla MT (OS) -olosuhteissa olevassa elatusaineessa verrattuna MT (normaali) -olosuhteisiin (kuva 7a). Lisäksi kuuden viljelypäivän jälkeen solukoko MT (OS) -olosuhteissa (kuva 7b) kasvoi merkittävästi verrattuna MT-sydämen (normaali) leikkeisiin. Lisäksi NFATC4:n siirtyminen ydinalueelle lisääntyi merkittävästi ylivenytetyissä kudoksissa (kuva 7c). Nämä tulokset osoittavat patologisen uudelleenmuodostumisen progressiivista kehittymistä hyperdistension jälkeen ja tukevat käsitystä, että CTCM-laitetta voidaan käyttää alustana venytyksen aiheuttaman sydämen hypertrofian signaloinnin tutkimiseen.
Ilmakammion paineen, nestekammion paineen ja kudosliikkeen mittausten edustavat käyrät vahvistavat, että kammion paine muuttaa nestekammion painetta aiheuttaen vastaavan kudosleikkeen liikkeen. b Edustavat venytysprosentti- ja venytysnopeuskäyrät normaalisti venytetyille (oranssi) ja ylivenytetyille (sininen) kudosleikkeille. c Pylväsdiagrammi, joka näyttää sykliajan (n = 19 leiketta ryhmää kohden, eri sioista), supistumisajan (n = 18–19 leiketta ryhmää kohden, eri sioista), relaksaatioajan (n = 19 leiketta ryhmää kohden, eri sioista)), kudosliikkeen amplitudin (n = 14 leiketta/ryhmä, eri sioista), systolista huippunopeutta (n = 14 leiketta/ryhmä, eri sioista) ja relaksaationopeuden huippua (n = 14 (D0), 15 (D6) leikettä/ryhmää) eri sioista). Kaksisuuntainen Studentin t-testi ei osoittanut merkittävää eroa missään parametrissa, mikä osoittaa, että nämä parametrit pysyivät vakioina 6 päivän ylijännitteisen viljelyn aikana. Virhepalkit edustavat keskiarvoa ± keskihajontaa.
Pylväsdiagrammi, jossa kvantifioitiin NT-ProBNP-pitoisuus sydänviipaleiden viljelyalustassa, jota viljeltiin MT:n normaalissa venytyksen (Norm) tai ylivenytyksen (OS) olosuhteissa (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm ja D4 MTOS) viipaletta/ryhmä eri sioista, suoritettiin kaksisuuntainen ANOVA; **p < 0,01 verrattuna normaaliin venytykseen). Pylväsdiagrammi NT-ProBNP-pitoisuuden kvantifioinnista sydänviipaleiden viljelyalustassa, joita viljeltiin MT:n normaalissa venytyksen (Norm) tai ylivenytyksen (OS) olosuhteissa (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm ja D4 MTOS) viipaletta/ryhmä eri sioista, kaksisuuntainen ANOVA; **p < 0,01 verrattuna normaaliin venytykseen).Normaalissa MT-venymässä (normaali) tai ylivenymässä (OS) viljeltyjen sydänviipaleiden kvantitatiivinen histogrammi NT-ProBNP-pitoisuudesta viljelyalustassa (n = 4 (päivä 2 MTNorm), 3 (päivä 2 MTNorm, päivä 4 MTNorm ja päivä 4).MTOS) viipaletta/ryhmä eri sioista, kaksifaktorinen varianssianalyysi suoritetaan;**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p < 0,01 verrattuna normaaliin venytykseen). a 在MT 正常拉伸(Norm) 或过度拉伸(OS) 条件下培养的心脏切片培养基中NT-ProBNP浓度的条形图量化（n = 4 (D2 MTNorm)、3（D2 MTOS、D4 MTNorm 和D4 MTOS）来自不同猪的切片/组，进行双向方差分析；**与正常拉伸相比，p < 0,01). a NT-ProBNP-konsentraation kvantifiointi sydänviipaleissa, jotka on viljelty MT normaalin venytys (Norm) tai overstretch (OS) olosuhteissa (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm和D4 MTOS) erilaisista猪的切片/组，可以双向方方发发动 **verrattuna normaaliin venytykseen, p < 0,01).histogrammi NT-ProBNP-pitoisuuksien kvantifiointi sydänleikkeissä, joita viljeltiin normaalin MT-venytyksen (norm) tai ylivenytyksen (OS) olosuhteissa (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm) ja D4 MTOS) leiketta/ryhmä eri sioilta, kaksisuuntainen varianssianalyysi;**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p < 0,01 verrattuna normaaliin venytykseen). b Edustavat kuvat troponiini-T:llä ja WGA:lla värjätyistä sydänviipaleista (vasen) ja solukoon kvantifioinnista (oikea) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) solua/ryhmä 10 eri viipaleesta eri sioista, kaksisuuntainen Studentin t-testi suoritettu; ****p < 0,0001 verrattuna normaaliin venymään). b Edustavat kuvat troponiini-T:llä ja WGA:lla värjätyistä sydänviipaleista (vasen) ja solukoon kvantifioinnista (oikea) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) solua/ryhmä 10 eri viipaleesta eri sioista, kaksisuuntainen Studentin t-testi suoritettu; ****p < 0,0001 verrattuna normaaliin venymään). b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слева) и количественанного количественанного клеток (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) клеток/группу из 10 разных срезов от разных свиней, два- проводих хвостовой t-критерий Стьюдента; ****p < 0,0001 по сравнению с нормальным растяжением). b Edustavat kuvat troponiini-T:llä ja AZP:llä värjätyistä sydänleikkeistä (vasen) ja solukoon kvantifioinnista (oikea) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) solua/ryhmä 10 eri leikkeestä eri sioista, suoritettiin kaksisuuntainen Studentin t-testi; ****p < 0,0001 verrattuna normaaliin kantaan). b 用肌钙蛋白-T 和WGA（左）和细胞大小量化（右）染色的心脏切片的代脏切片的代表揃330D MTOS），来自不同猪的10 个不同切片的369（D6 MTNorm）细胞/组，两进行有尾t学甦 检验；与正常拉伸相比，****p < 0,0001）. b Edustavat kuvat kalkareiini-T:llä ja WGA:lla värjätyistä sydänviipaleista (vasen) ja solukoosta (oikea) (n = 330 (D6 MTOS), 369 10 eri viipaleesta (D6 MTNorm)) Solut/组，两方法有尾学生t-testi；verrattuna normaaliin venytykseen，****p < 0,0001). b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т ja АЗП (слева) и колкичестверанкая (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) из 10 различных срезов от разных свиней Клетки/группа, двутрийстороней Стьюдента; ****p < 0,0001 по сравнению с нормальным растяжением). b Edustavat kuvat troponiini-T:llä ja AZP:llä värjätyistä sydänleikkeistä (vasen) ja solukoon kvantifiointi (oikea) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) 10 eri leikkeestä eri sioilta) Solut/ryhmä, kaksisuuntainen kriteeri Studentin t; ****p < 0,0001 verrattuna normaaliin kantaan). c Edustavat kuvat päivien 0 ja 6 MTOS-sydänleikkeistä, jotka on immunoleimattu troponiini-T:lle ja NFATC4:lle, ja NFATC4:n siirtymisen kvantifiointi sydämen solujen tumiin (n = 4 (päivä 0), 3 (päivä 6) MTOS-leikettä/ryhmä eri sioista, kaksisuuntainen Studentin t-testi suoritettiin; *p < 0,05). c Edustavat kuvat päivien 0 ja 6 MTOS-sydänleikkeistä, jotka on immunoleimattu troponiini-T:lle ja NFATC4:lle, ja NFATC4:n siirtymisen CM:ien tumiin kvantifiointi (n = 4 (päivä 0), 3 (päivä 6) MTOS-leikettä/ryhmä eri sioista, kaksisuuntainen Studentin t-testi suoritettiin; *p < 0,05). c Репрезентативные изображения для срезов сердца 0 и 6 дней MTOS, иммуномеченых для тропонина-Т ja NFATC4, чиякола оценка транслокации NFATC4 в ядра кавернозных клеток (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срезов/группу от разных свинетпля , , двусторонний t-критерий Стьюдента; *p < 0,05). c Edustavat kuvat sydänleikkeistä 0 ja 6 päivän MTOS kohdalla, immunoleimattu troponiini-T:lle ja NFATC4:lle, ja NFATC4:n translokaation kvantifiointi kavernoottisten solujen tumassa (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) viipaletta/ryhmä eri sioista) suoritettiin kaksisuuntaisella Studentin t-testillä; *p < 0,05). c 用于肌钙蛋白-T 和NFATC4 免疫标记的第0 天和第6 天MTOS心脏切片的代表性图像，以及来自不同猪的NFATC4 易位至CM 细マ核的量化6的量化 4（Dn)切片/组, 进行双尾学生t 检验；*p < 0,05). c Edustavia kuvia kalkaniini-T:n ja NFATC4:n immunoleimauksesta 第0天和第6天MTOS-sydänviipaleista ja NFATC4:stä eri NFATC4 易位至CM-soluytimestä的缓quantity化 (n = 4 (D0), 缄, 焤OS 3 (D)时间双尾学生et 电影；*p < 0,05). c Репрезентативные изображения срезов сердца MTOS на 0 и 6 день для иммуномаркировки тропонином-Т и NFATC4 тропонином-Т ja NFATC4 транслокации NFATC4 в ядра CM от разных свиней (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срез/группа, два- хвостатый t-критерий *

Свиней; 0,05). c Edustavat kuvat MTOS-sydänleikkeistä päivinä 0 ja 6 troponiini-T:n ja NFATC4:n immunoleimausta ja NFATC4:n translokaation kvantifiointia varten CM:n tumassa eri sioista (n = 4 (päivä 0), 3 (päivä 6) MTOS-leikettä/ryhmä, kaksisuuntainen t-kriteeri Studentin; *p < 0,05).Virhepalkit edustavat keskiarvoa ± keskihajontaa.
Translationaalinen sydän- ja verisuonitutkimus vaatii solumalleja, jotka toistavat tarkasti sydämen ympäristön. Tässä tutkimuksessa kehitettiin ja karakterisoitiin CTCM-laite, joka voi stimuloida sydämen ultraohuita osia. CTCM-järjestelmä sisältää fysiologisesti synkronoidun sähkömekaanisen stimulaation sekä T3- ja Dex-nesteen rikastuksen. Kun sian sydänleikkeet altistettiin näille tekijöille, niiden elinkyky, rakenteellinen eheys, metabolinen aktiivisuus ja transkriptionaalinen ilmentyminen pysyivät samoina kuin tuoreessa sydänkudoksessa 12 päivän viljelyn jälkeen. Lisäksi sydänkudoksen liiallinen venytys voi aiheuttaa sydämen hypertrofiaa yliojennuksen vuoksi. Kaiken kaikkiaan nämä tulokset tukevat fysiologisten viljelyolosuhteiden kriittistä roolia normaalin sydämen fenotyypin ylläpitämisessä ja tarjoavat alustan lääkeaineiden seulonnalle.
Sydänlihassolujen toiminnan ja selviytymisen optimaalisen ympäristön luomiseen vaikuttavat monet tekijät. Ilmeisimmät näistä tekijöistä liittyvät (1) solujen välisiin vuorovaikutuksiin, (2) sähkömekaaniseen stimulaatioon, (3) humoraalisiin tekijöihin ja (4) aineenvaihdunnan substraatteihin. Fysiologiset solujen väliset vuorovaikutukset vaativat monimutkaisia ​​kolmiulotteisia verkostoja, joissa on useita solutyyppejä ja joita tukee solunulkoinen matriisi. Tällaisia ​​monimutkaisia ​​soluvuorovaikutuksia on vaikea rekonstruoida in vitro yksittäisten solutyyppien yhteisviljelyllä, mutta se voidaan helposti saavuttaa käyttämällä sydänleikkeiden organotyyppistä luonnetta.
Sydänlihassolujen mekaaninen venytys ja sähköinen stimulaatio ovat kriittisiä sydämen fenotyypin ylläpitämiselle33,34,35. Vaikka mekaanista stimulaatiota on käytetty laajalti hiPSC-CM-kohotuksessa ja kypsyttämisessä, useissa eleganteissa tutkimuksissa on viime aikoina yritetty stimuloida sydänleikkeitä mekaanisesti viljelmässä yksiaksiaalisen kuormituksen avulla. Nämä tutkimukset osoittavat, että 2D-yksiaksiaalisella mekaanisella kuormituksella on positiivinen vaikutus sydämen fenotyyppiin viljelyn aikana. Näissä tutkimuksissa sydämen osia joko kuormitettiin isometrisillä vetovoimilla17, lineaarisella auksotonisella kuormituksella18 tai sydämen sykli luotiin uudelleen käyttämällä voima-anturin takaisinkytkentää ja jännitysmoottoreita. Nämä menetelmät käyttävät kuitenkin yksiaksiaalista kudosvenytystä ilman ympäristön optimointia, mikä johtaa monien sydängeenien vaimentumiseen tai epänormaaleihin venytysvasteisiin liittyvien geenien yli-ilmentymiseen. Tässä kuvattu CTCM tarjoaa 3D-sähkömekaanisen stimulaation, joka jäljittelee luonnollista sydämen sykliaikaa ja fysiologista venytystä (25 % venytys, 40 % systole, 60 % diastole ja 72 lyöntiä minuutissa). Vaikka tämä kolmiulotteinen mekaaninen stimulaatio yksinään ei riitä ylläpitämään kudoksen eheyttä, tarvitaan humoraalisen ja mekaanisen stimulaation yhdistelmää T3/Dex-laitteella kudoksen elinkelpoisuuden, toiminnan ja eheyden ylläpitämiseksi riittävästi.
Humoraalisilla tekijöillä on tärkeä rooli aikuisen sydämen fenotyypin moduloinnissa. Tämä korostui HiPS-CM-tutkimuksissa, joissa T3:a ja Dex:ää lisättiin viljelyalustoihin solujen kypsymisen nopeuttamiseksi. T3 voi vaikuttaa aminohappojen, sokereiden ja kalsiumin kuljetukseen solukalvojen läpi36. Lisäksi T3 edistää MHC-α:n ilmentymistä ja MHC-β:n alasääntelyä, mikä edistää nopeiden nykimissolujen myofibrillien muodostumista kypsissä kardiomyosyyteissä verrattuna hitaisiin nykimissoluihin sikiön kardiomyosyyteissä. T3:n puutos kilpirauhasen vajaatoimintapotilailla johtaa myofibrillaaristen juovien menetykseen ja hidastuneeseen sävyn kehittymiseen37. Dex vaikuttaa glukokortikoidireseptoreihin ja sen on osoitettu lisäävän sydänlihaksen supistuvuutta eristetyissä perfusoiduissa sydämissä;38 tämän parannuksen uskotaan liittyvän vaikutukseen kalsiumkertymien ohjaamaan sisäänmenoon (SOCE)39,40. Lisäksi Dex sitoutuu reseptoreihinsa aiheuttaen laajan solunsisäisen vasteen, joka heikentää immuunitoimintaa ja tulehdusta30.
Tuloksemme osoittavat, että fyysinen mekaaninen stimulaatio (MS) paransi viljelmän kokonaissuorituskykyä Ctrl-hoitoon verrattuna, mutta ei onnistunut ylläpitämään elinkykyä, rakenteellista eheyttä ja sydämen ilmentymistä 12 päivän ajan viljelmässä. Ctrl-hoitoon verrattuna T3:n ja Dex:n lisääminen CTCM (MT) -viljelmiin paransi elinkykyä ja säilytti samankaltaiset transkriptioprofiilit, rakenteellisen eheyden ja metabolisen aktiivisuuden tuoreen sydänkudoksen kanssa 12 päivän ajan. Lisäksi kontrolloimalla kudosvenytysastetta luotiin STCM:n avulla hyperekstension aiheuttama sydämen hypertrofiamalli, joka havainnollistaa STCM-järjestelmän monipuolisuutta. On huomattava, että vaikka sydämen uudelleenmuodostuminen ja fibroosi yleensä sisältävät ehjiä elimiä, joiden verenkierrossa olevat solut voivat tarjota sopivia sytokiineja sekä fagosytoosia ja muita uudelleenmuodostustekijöitä, sydämen osat voivat silti jäljitellä fibroottista prosessia stressin ja trauman seurauksena. Tätä on aiemmin arvioitu tässä sydänleikemallissa. On huomattava, että CTCM-parametreja voidaan moduloida muuttamalla painetta/sähköistä amplitudia ja taajuutta monien tilojen, kuten takykardian, bradykardian ja mekaanisen verenkierron tuen (mekaanisesti kuormittamaton sydän), simuloimiseksi. Tämä tekee järjestelmästä keskitason läpimenon lääketestaukseen. CTCM:n kyky mallintaa ylirasituksesta johtuvaa sydämen hypertrofiaa tasoittaa tietä tämän järjestelmän testaamiselle yksilöllistettyä hoitoa varten. Yhteenvetona voidaan todeta, että tämä tutkimus osoittaa, että mekaaninen venytys ja humoraalinen stimulaatio ovat ratkaisevan tärkeitä sydänkudosleikkeiden viljelyn ylläpitämiseksi.
Vaikka tässä esitetyt tiedot viittaavat siihen, että CTCM on erittäin lupaava alusta ehjän sydänlihaksen mallintamiseen, tällä viljelymenetelmällä on joitakin rajoituksia. CTCM-viljelyn pääasiallinen rajoitus on, että se kohdistaa viipaleille jatkuvia dynaamisia mekaanisia rasituksia, mikä estää sydämen viipaleiden supistumisten aktiivisen seurannan jokaisen syklin aikana. Lisäksi sydänleikkeiden pienen koon (7 mm) vuoksi kyky arvioida systolista toimintaa viljelyjärjestelmien ulkopuolella perinteisiä voima-antureita käyttäen on rajallista. Tässä käsikirjoituksessa ylitämme tämän rajoituksen osittain arvioimalla optista jännitettä supistumistoiminnan indikaattorina. Tämä rajoitus vaatii kuitenkin lisätyötä, ja se voidaan ratkaista tulevaisuudessa ottamalla käyttöön menetelmiä sydänviipaleiden toiminnan optiseen seurantaan viljelyssä, kuten optinen kartoitus kalsium- ja jänniteherkkien väriaineiden avulla. Toinen CTCM:n rajoitus on, että työmalli ei manipuloi fysiologista stressiä (esikuormitusta ja jälkikuormitusta). CTCM:ssä paine indusoitiin vastakkaisiin suuntiin 25 %:n fysiologisen venytyksen toistamiseksi diastolessa (täysi venytys) ja systolessa (supistuksen pituus sähköstimulaation aikana) erittäin suurissa kudoksissa. Tämä rajoitus tulisi poistaa tulevissa CTCM-malleissa kohdistamalla riittävä paine sydänkudokseen molemmilta puolilta ja soveltamalla tarkkoja paine-tilavuussuhteita, jotka esiintyvät sydämen kammioissa.
Tässä käsikirjoituksessa raportoitu ylivenytyksen aiheuttama uudelleenmuodostus rajoittuu hypertrofisten hypervenytyssignaalien matkimiseen. Siten tämä malli voi auttaa venytyksen aiheuttaman hypertrofisen signaloinnin tutkimisessa ilman humoraalisten tai hermostollisten tekijöiden tarvetta (joita tässä järjestelmässä ei ole). Lisätutkimuksia tarvitaan CTCM:n moninaisuuden lisäämiseksi, esimerkiksi yhteisviljely immuunisolujen, verenkierrossa olevien humoraalisten tekijöiden ja hermotuksen kanssa, kun yhteisviljely hermosolujen kanssa parantaa tautimallinnuksen mahdollisuuksia CTCM:llä.
Tässä tutkimuksessa käytettiin kolmetoista sikaa. Kaikki eläintoimenpiteet suoritettiin laitoksen ohjeiden mukaisesti ja Louisvillen yliopiston eläintenhoito- ja käyttökomitea hyväksyi ne. Aortankaari suljettiin puristimella ja sydän perfusoitiin 1 litralla steriiliä kardioplegiaa (110 mM NaCl, 1,2 mM CaCl2, 16 mM KCl, 16 mM MgCl2, 10 mM NaHCO3, 5 U/ml hepariinia, pH enintään 7,4); Sydämet säilöttiin jääkylmässä kardioplegisessa liuoksessa, kunnes ne kuljetettiin laboratorioon jäiden päällä, mikä kestää yleensä alle 10 minuuttia. Sydämet säilöttiin jääkylmässä kardioplegisessa liuoksessa, kunnes ne kuljetettiin laboratorioon jäiden päällä, mikä kestää yleensä alle 10 minuuttia. сердца хранили в ледяном кардиоплегическом растворе до транспортировки в лабораторию на льду, что обынетза.10маетза. Sydämet säilytettiin jääkylmässä kardioplegisessa liuoksessa, kunnes ne kuljetettiin laboratorioon jäiden päällä, mikä yleensä kestää alle 10 minuuttia.将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钟将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钟 Держите сердца в ледяной кардиоплегии до транспортировки в лабораторию на льду, обычно <10 мин. Pidä sydämet jäässä kardioplegian vuoksi, kunnes ne kuljetetaan laboratorioon jäissä, yleensä alle 10 minuuttia.
CTCM-laite kehitettiin SolidWorks-tietokoneavusteisella suunnitteluohjelmistolla (CAD). Viljelykammiot, jakajat ja ilmakammiot on valmistettu CNC-työstetystä kirkkaasta akryylimuovista. 7 mm:n halkaisijaltaan oleva tukirengas on valmistettu keskellä olevasta suurtiheyksisestä polyeteenistä (HDPE) ja siinä on o-rengasura silikonista valmistetun o-renkaan sijoittamiseksi alla olevan elatusalustan tiivistämiseen. Ohut piidioksidikalvo erottaa viljelykammion erotuslevystä. Silikonikalvo on laserleikattu 0,02 tuuman paksuisesta silikonilevystä ja sen kovuus on 35A. Pohja- ja yläosan silikonitiivisteet on laserleikattu 1/16 tuuman paksuisesta silikonilevystä ja niiden kovuus on 50A. Lohkon kiinnittämiseen ja ilmatiiviin tiivisteen luomiseen käytetään 316L-ruuveja ja siipimuttereita.
C-PACE-EM-järjestelmään on suunniteltu integroitavaksi erillinen piirilevy (PCB). Piirilevyn sveitsiläiset koneliittimet on kytketty grafiittielektrodeihin hopeoiduilla kuparijohdoilla ja elektrodeihin ruuvatuilla pronssisilla 0-60-ruuveilla. Piirilevy on sijoitettu 3D-tulostimen kanteen.
CTCM-laitetta ohjataan ohjelmoitavalla pneumaattisella toimilaitteella (PPD), joka luo kontrolloidun verenkiertopaineen, joka muistuttaa sydämen sykliä. Kun ilmakammion sisäinen paine kasvaa, joustava silikonikalvo laajenee ylöspäin pakottaen väliaineen kudosalueen alle. Kudosalue venyy tämän nesteen poistumisen vaikutuksesta, jäljitellen sydämen fysiologista laajenemista diastolen aikana. Rentoutumisen huipulla sähköistä stimulaatiota annettiin grafiittielektrodien kautta, mikä alensi ilmakammion painetta ja aiheutti kudosleikkeiden supistumisen. Putken sisällä on hemostaattinen venttiili, jossa on paineanturi ilmajärjestelmän paineen havaitsemiseksi. Paineanturin mittaama paine syötetään kannettavaan tietokoneeseen kytkettyyn tiedonkeruulaitteeseen. Tämä mahdollistaa kaasukammion sisäisen paineen jatkuvan seurannan. Kun kammion maksimipaine saavutettiin (vakio 80 mmHg, 140 mmHg OS), tiedonkeruulaitteelle annettiin käsky lähettää signaali C-PACE-EM-järjestelmälle kaksivaiheisen jännitesignaalin tuottamiseksi 2 ms:n ajaksi, asetettuna 4 V:iin.
Sydänleikkeet otettiin ja viljelyolosuhteet kuudessa kuopassa suoritettiin seuraavasti: Siirrettiin kerätyt sydämet siirtoastiasta kylmää (4 °C) kardioplegiaa sisältävälle tarjottimelle. Vasen kammio eristettiin steriilillä terällä ja leikattiin 1–2 cm3:n paloiksi. Nämä kudosblokit kiinnitettiin kudosalustoihin kudosliimalla ja asetettiin värähtelevään mikrotomiin, joka sisälsi Tyroden liuosta ja hapetettiin jatkuvasti (3 g/l 2,3-butaanidionimono-oksiimia (BDM), 140 mM NaCl (8,18 g)), 6 mM KCl (0,447 g), 10 mM D-glukoosi (1,86 g), 10 mM HEPES (2,38 g), 1 mM MgCl2 (1 ml 1 M liuosta), 1,8 mM CaCl2 (1,8 ml 1 M liuosta), enintään 1 l ddH2O:ta). Tärinäinen mikrotomi asetettiin leikkaamaan 300 µm paksuja viipaleita 80 Hz:n taajuudella, 2 mm:n vaakasuuntaisella värähtelyamplitudilla ja 0,03 mm/s:n etenemisnopeudella. Kudoskylpy ympäröitiin jäällä liuoksen pitämiseksi viileänä ja lämpötila pidettiin 4 °C:ssa. Siirrä kudosleikkeet mikrotomikylvystä inkubointikylpyyn, joka sisälsi jatkuvasti hapetettua Tyrode-liuosta jäiden päällä, kunnes saatiin tarpeeksi leikkeitä yhdelle viljelylevylle. Transwell-viljelmiä varten kudosleikkeet kiinnitettiin steriileihin 6 mm leveisiin polyuretaanialustoihin ja asetettiin 6 ml:aan optimoitua kasvatusalustaa (199-elatusaine, 1x ITS-lisä, 10 % FBS, 5 ng/ml VEGF, 10 ng/ml FGF-emäksinen ja 2X antibiootti-sienilääke). Kudosleikkeisiin kohdistettiin sähköinen stimulaatio (10 V, taajuus 1,2 Hz) C-Pacen kautta. TD-olosuhteissa lisättiin tuoretta T3:a ja Dex:ää pitoisuuksina 100 nM ja 1 μM jokaisella kasvatusalustan vaihdolla. Kasvualusta kyllästetään hapella ennen sen vaihtamista kolme kertaa päivässä. Kudosleikkeitä viljeltiin inkubaattorissa 37 °C:ssa ja 5 % CO2:ssa.
CTCM-viljelmiä varten kudosleikkeet asetettiin mittatilaustyönä valmistetulle 3D-tulostimelle petrimaljaan, joka sisälsi modifioitua Tyroden liuosta. Laite on suunniteltu lisäämään sydänleikkeen kokoa 25 %:lla tukirenkaan pinta-alasta. Tämä tehdään niin, että sydänleikkeet eivät veny Tyroden liuoksesta väliaineeseen siirron jälkeen ja diastolen aikana. Histoakryyliliimalla kiinnitettiin 300 µm:n paksuiset leikkeet halkaisijaltaan 7 mm olevaan tukirenkaaseen. Kun kudosleikkeet oli kiinnitetty tukirenkaaseen, ylimääräiset kudosleikkeet leikattiin pois ja kiinnitetyt kudosleikkeet asetettiin takaisin Tyroden liuoshauteeseen jään päällä (4 °C), kunnes yhdelle laitteelle oli valmistettu tarpeeksi leikkeitä. Kaikkien laitteiden kokonaiskäsittelyaika ei saisi ylittää 2 tuntia. Kun 6 kudosleikettä oli kiinnitetty tukirenkaisiinsa, CTCM-laite koottiin. CTCM-viljelykammio on esitäytetty 21 ml:lla esihapetettua väliainetta. Siirrä kudosleikkeet viljelykammioon ja poista varovasti mahdolliset ilmakuplat pipetilla. Kudosleike ohjataan sitten reikään ja painetaan varovasti paikalleen. Lopuksi elektrodikorkki asetetaan laitteen päälle ja laite siirretään inkubaattoriin. Liitä sitten CTCM ilmaletkuun ja C-PACE-EM-järjestelmään. Pneumaattinen toimilaite avautuu ja ilmaventtiili avaa CTCM:n. C-PACE-EM-järjestelmä konfiguroitiin syöttämään 4 V:n jännitettä 1,2 Hz:n taajuudella bifaasisen tahdistuksen aikana 2 ms:n ajan. Elatusaine vaihdettiin kahdesti päivässä ja elektrodit kerran päivässä grafiitin kertymisen välttämiseksi elektrodeille. Tarvittaessa kudosleikkeet voidaan poistaa viljelykaivoistaan ​​mahdollisten niiden alle joutuneiden ilmakuplien poistamiseksi. MT-käsittelyolosuhteissa T3/Dex lisättiin tuoreena jokaisen elatusaineen vaihdon yhteydessä 100 nM T3:a ja 1 μM Dex:ää. CTCM-laitteita viljeltiin inkubaattorissa 37 °C:ssa ja 5 % CO2:ssa.
Sydänleikkeiden venytettyjen trajektorien saamiseksi kehitettiin erityinen kamerajärjestelmä. Järjestelmäkameraa (Canon Rebel T7i, Canon, Tokio, Japani) käytettiin Navitar Zoom 7000 18-108 mm makro-objektiivin (Navitar, San Francisco, Kalifornia) kanssa. Visualisointi suoritettiin huoneenlämmössä sen jälkeen, kun väliaine oli vaihdettu uuteen. Kamera asetettiin 51 asteen kulmaan ja video tallentui 30 kuvaa sekunnissa. Ensin käytettiin avoimen lähdekoodin ohjelmistoa (MUSCLEMOTION43) Image-J:n kanssa sydänleikkeiden liikkeen kvantifiointiin. Maski luotiin käyttämällä MATLABia (MathWorks, Natick, MA, USA) sykkivien sydänleikkeiden kiinnostusalueiden määrittämiseksi kohinan välttämiseksi. Manuaalisesti segmentoidut maskit levitettiin kaikkiin kuvasarjan kuviin ja siirrettiin sitten MUSCLEMOTION-laajennukseen. Muscle Motion käyttää kunkin kuvan pikseleiden keskimääräistä intensiteettiä kvantifioidakseen sen liikkeen suhteessa referenssikehykseen. Tiedot tallennettiin, suodatettiin ja niitä käytettiin sykliajan kvantifiointiin ja kudosvenytyksen arviointiin sydämen syklin aikana. Tallennettu video jälkikäsiteltiin käyttämällä ensimmäisen asteen nollavaiheista digitaalisuodatinta. Kudosvenytyksen (huipusta huippuun) kvantifioimiseksi suoritettiin huipusta huippuun -analyysi tallennetun signaalin huippujen ja pohjien erottamiseksi. Lisäksi trendin poisto suoritetaan käyttämällä kuudennen asteen polynomia signaalin ajautumisen poistamiseksi. MATLABissa kehitettiin ohjelmakoodi kudoksen globaalin liikkeen, sykliajan, relaksaatioajan ja supistumisajan määrittämiseksi (Supplementary Program Code 44).
Venymäanalyysiä varten, käyttäen samoja mekaanisen venymän arviointiin luotuja videoita, jäljitimme ensin kaksi kuvaa, jotka edustavat liikepiikkejä (liikkeen korkein (ylempi) ja alempi (alempi) piste) MUSCLEMOTION-ohjelmiston mukaisesti. Sitten segmentoimme kudosalueet ja sovelsimme segmentoituun kudokseen varjostusalgoritmia (lisäkuva 2a). Segmentoitu kudos jaettiin sitten kymmeneen alipintaan, ja kunkin pinnan jännitys laskettiin seuraavalla yhtälöllä: Venymä = (Sup-Sdown)/Sdown, jossa Sup ja Sdown ovat muodon etäisyydet kankaan ylä- ja alavarjoista (lisäkuva 2b).
Sydänleikkeet fiksoitiin 4 % paraformaldehydissä 48 tuntia. Fiksoidut kudokset dehydratoitiin 10 % ja 20 % sakkaroosissa 1 tunnin ajan ja sitten 30 % sakkaroosissa yön yli. Sitten leikkeet upotettiin optimaaliseen leikkauslämpötilaan sopivaan yhdisteeseen (OCT-yhdiste) ja jäädytettiin vähitellen isopentaani/hiilihappojäähauteessa. Säilytä OCT-upotusblokkeja -80 °C:ssa erottelemiseen asti. Lasilevyt valmistettiin 8 μm:n paksuisiksi leikkeiksi.
OCT-spektroskopian poistamiseksi sydänleikkeistä lämmitä lasilevyjä lämmitysblokissa 95 °C:ssa 5 minuuttia. Lisää 1 ml PBS:ää jokaiselle lasilevylle ja inkuboi 30 minuuttia huoneenlämmössä, minkä jälkeen leikkeet läpäisevät liuottamalla 0,1 % Triton-X:ää PBS:ssä 15 minuutiksi huoneenlämmössä. Estääksesi epäspesifisten vasta-aineiden sitoutumisen näytteeseen, lisää lasilevyille 1 ml 3 % BSA-liuosta ja inkuboi 1 tunti huoneenlämmössä. BSA poistettiin sitten ja lasilevyt pestiin PBS:llä. Merkitse jokainen näyte kynällä. Primaariset vasta-aineet (laimennettuna 1:200 1 % BSA:han) (konneksiini 43 (Abcam; #AB11370), NFATC4 (Abcam; #AB99431) ja troponiini-T (Thermo Scientific; #MA5-12960) lisättiin 90 minuutin aikana, sitten sekundaariset vasta-aineet (laimennettuna 1:200 1 % BSA:han) hiiren Alexa Fluor 488:aa (Thermo Scientific; #A16079) ja kaniinin Alexa Fluor 594:ää (Thermo Scientific; #T6391) vastaan ​​lisättiin vielä 90 minuutin ajan. Pesin kolme kertaa PBS:llä. Kohdevärjäyksen erottamiseksi taustasta käytimme vain sekundaarista vasta-ainetta kontrollina. Lopuksi lisättiin DAPI-tumavärjäys ja lasilevyt asetettiin vectashieldiin (Vector Laboratories) ja suljettiin kynsilakalla. -x suurennos) ja Keyence-mikroskooppiin 40-kertaisella suurennuksella.
WGA-värjäykseen käytettiin WGA-Alexa Fluor 555 -värjäystä (Thermo Scientific; #W32464) PBS-liuoksessa, jonka pitoisuus oli 5 μg/ml, ja sitä annosteltiin kiinteisiin leikkeisiin 30 minuutiksi huoneenlämmössä. Sen jälkeen lasilevyt pestiin PBS-liuoksella ja jokaiselle lasilevylle lisättiin Sudanmustaa ja inkuboitiin 30 minuuttia. Sen jälkeen lasilevyt pestiin PBS-liuoksella ja niihin lisättiin Vectashield-upotusväliainetta. Lasilevyt visualisoitiin Keyence-mikroskoopilla 40-kertaisella suurennuksella.
OCT poistettiin näytteistä edellä kuvatulla tavalla. OCT:n poistamisen jälkeen lasilevyt upotettiin Bouinin liuokseen yön yli. Sen jälkeen lasilevyt huuhdeltiin tislatulla vedellä yhden tunnin ajan ja asetettiin sitten Bibrichin aloe happo-fuksiini-liuokseen 10 minuutiksi. Sen jälkeen lasilevyt pestiin tislatulla vedellä ja asetettiin 5 % fosfomolybdeeni/5 % fosfovolframihappoliuokseen 10 minuutiksi. Ilman huuhtelua lasilevyt siirrettiin suoraan aniliinisiniliuokseen 15 minuutiksi. Sitten lasilevyt pestiin tislatulla vedellä ja asetettiin 1 % etikkahappoliuokseen 2 minuutiksi. Lasilevyt kuivattiin 200 N etanolissa ja siirrettiin ksyleeniin. Värjätyt lasilevyt visualisoitiin Keyence-mikroskoopilla, jossa oli 10x objektiivi. Fibroosipinta-alan prosenttiosuus kvantifioitiin Keyence Analyzer -ohjelmistolla.
CyQUANT™ MTT -solujen elinkykymääritys (Invitrogen, Carlsbad, CA), luettelonumero V13154, valmistajan protokollan mukaisesti ja muutamin muutoksin. Erityisesti käytettiin 6 mm:n halkaisijaltaan olevaa kirurgista rei'itintä tasaisen kudoskoon varmistamiseksi MTT-analyysin aikana. Kudokset asetettiin yksittäin 12-kuoppaisen levyn kuoppiin, jotka sisälsivät MTT-substraattia valmistajan protokollan mukaisesti. Leikkeitä inkuboidaan 37 °C:ssa 3 tuntia, ja elävä kudos metaboloi MTT-substraatin muodostaen violetin formatsaaniyhdisteen. Korvaa MTT-liuos 1 ml:lla DMSO:ta ja inkuboidaan 37 °C:ssa 15 minuuttia violetin formatsaanin erottamiseksi sydänleikkeistä. Näytteet laimennettiin 1:10 DMSO:lla 96-kuoppaisissa kirkaspohjaisissa levyissä ja violetin värin intensiteetti mitattiin 570 nm:ssä käyttäen Cytation-levynlukijaa (BioTek). Lukemat normalisoitiin kunkin sydänleikkeen painoon.
Sydänleikeviljelyalusta korvattiin 1 μCi/ml [5-3H]-glukoosia (Moravek Biochemicals, Brea, CA, USA) sisältävällä alustalla glukoosin hyväksikäyttömääritystä varten aiemmin kuvatulla tavalla. Neljän tunnin inkuboinnin jälkeen lisää 100 µl viljelyalustaa avoimeen mikrosentrifugiputkeen, joka sisältää 100 µl 0,2 N HCl:a. Sitten putki asetettiin tuikeputkeen, joka sisälsi 500 μl dH2O:ta, [3H]2O:n haihduttamiseksi 72 tunniksi 37 °C:ssa. Poista sitten mikrosentrifugiputki tuikeputkesta ja lisää 10 ml tuikenestettä. Tuikelaskenta suoritettiin Tri-Carb 2900TR -nestetuikeanalysaattorilla (Packard Bioscience Company, Meriden, CT, USA). Glukoosin käyttöaste laskettiin ottaen huomioon [5-3H]-glukoosispesifinen aktiivisuus, epätäydellinen tasapaino ja tausta, [5-3H]-glukoosiin liittyvä laimeneminen leimaamattomaan glukoosiin ja tuikelaskurin tehokkuus. Tiedot on normalisoitu sydämen leikkeiden massan suhteen.
Kudoshomogenisoinnin jälkeen Trizolissa RNA eristettiin sydänleikkeistä käyttämällä Qiagen miRNeasy Micro Kit #210874 -pakkausta valmistajan ohjeiden mukaisesti. RNAsec-kirjaston valmistelu, sekvensointi ja data-analyysi suoritettiin seuraavasti:
Lähtömateriaalina RNA-kirjaston valmistuksessa käytettiin 1 μg RNA:ta näytettä kohden. Sekvensointikirjastot luotiin käyttämällä NEBNext UltraTM RNA Library Preparation Kit for Illumina (NEB, USA) -pakkausta valmistajan suositusten mukaisesti, ja indeksikoodit lisättiin kunkin näytteen attribuuttisekvensseihin. Lyhyesti sanottuna mRNA puhdistettiin kokonais-RNA:sta käyttämällä poly-T-oligonukleotideihin kiinnitettyjä magneettihelmiä. Fragmentointi suoritetaan käyttämällä kaksiarvoisia kationeja korkeassa lämpötilassa NEBNext First Strand Synthesis Reaction Bufferissa (5X). Ensimmäisen juosteen cDNA syntetisoitiin käyttämällä satunnaisia ​​heksameerialukkeita ja M-MuLV-käänteiskopioijaentsyymiä (RNase H-). Toisen juosteen cDNA syntetisoidaan sitten käyttämällä DNA-polymeraasi I:tä ja RNase H:ta. Jäljelle jääneet ulokkeet muunnetaan tylppiksi päiksi eksonukleaasi/polymeraasiaktiivisuudella. DNA-fragmentin 3'-pään adenyloinnin jälkeen siihen kiinnitetään NEBNext-sovitin, jossa on hiusneulasilmukkarakenne, hybridisaation valmistelua varten. Edullisen pituisten 150–200 bp:n cDNA-fragmenttien valintaa varten. Kirjastofragmentit puhdistettiin käyttämällä AMPure XP -järjestelmää (Beckman Coulter, Beverly, USA). Sitten 3 μl USER-entsyymiä (NEB, USA) ja kokoon valittua, adapterilla ligoitua cDNA:ta käytettiin 15 minuutin ajan 37 °C:ssa ja sitten 5 minuutin ajan 95 °C:ssa ennen PCR:ää. PCR suoritettiin sitten käyttämällä Phusion High-Fidelity DNA-polymeraasia, universaaleja PCR-alukkeita ja Index (X) -alukkeita. Lopuksi PCR-tuotteet puhdistettiin (AMPure XP -järjestelmä) ja kirjaston laatu arvioitiin Agilent Bioanalyzer 2100 -järjestelmällä. cDNA-kirjasto sekvensoitiin sitten Novaseq-sekvensserillä. Illuminan raakakuvatiedostot muunnettiin raakalukemiksi käyttämällä CASAVA Base Calling -menetelmää. Raakadatan tallennus tapahtuu FASTQ(fq)-muotoisissa tiedostoissa, jotka sisältävät luetut sekvenssit ja vastaavat emäslaadut. Valitse HISAT2 yhdistääksesi suodatetut sekvensointilukemat Sscrofa11.1-referenssigenomiin. Yleisesti ottaen HISAT2 tukee kaikenkokoisia genomeja, mukaan lukien yli 4 miljardin emäksen genomeja, ja useimmille parametreille on asetettu oletusarvot. RNA-sekvensointidatan silmukointiluentoja voidaan tehokkaasti kohdistaa käyttämällä HISAT2:ta, joka on tällä hetkellä nopein saatavilla oleva järjestelmä, samalla tai paremmalla tarkkuudella kuin mikään muu menetelmä.
Transkriptien runsaus heijastaa suoraan geenien ilmentymisen tasoa. Geenien ilmentymistasot arvioidaan genomiin tai eksoneihin liittyvien transkriptien runsauden (sekvensointimäärän) perusteella. Lukemien määrä on verrannollinen geenien ilmentymistasoihin, geenin pituuteen ja sekvensointisyvyyteen. FPKM (fragmentteja tuhatta sekvensoitua transkriptin emäsparia kohden miljoonaa emäsparia kohden) laskettiin ja differentiaalisen ilmentymisen P-arvot määritettiin käyttämällä DESeq2-pakettia. Sitten laskimme virheellisten löydösten määrän (FDR) kullekin P-arvolle käyttämällä Benjamini-Hochbergin menetelmää9, joka perustuu sisäänrakennettuun R-funktioon "p.adjust".
Sydänleikkeistä eristetty RNA muunnettiin cDNA:ksi 200 ng/μl:n pitoisuudella käyttäen Thermon SuperScript IV Vilo Master -seosta (Thermo, tuotenro 11756050). Kvantitatiivinen RT-PCR suoritettiin käyttämällä Applied Biosystemsin Endura Plate Microamp 384-kuoppaista läpinäkyvää reaktiolevyä (Thermo, tuotenro 4483319) ja microamp-optista liimaa (Thermo, tuotenro 4311971). Reaktioseos koostui 5 µl:sta Taqman Fast Advanced Master -seosta (Thermo, tuotenro 4444557), 0,5 µl:sta Taqman Primeria ja 3,5 µl:sta vettä sekoitettuna kuoppaa kohden. Standardit qPCR-syklit suoritettiin ja CT-arvot mitattiin Applied Biosystemsin Quantstudio 5 -reaaliaikaisella PCR-laitteella (384-kuoppainen moduuli; tuotenro A28135). Taqman-alukkeet hankittiin Thermolta (GAPDH (Ss03375629_u1), PARP12 (Ss06908795_m1), PKDCC (Ss06903874_m1), CYGB (Ss06900188_m1), RGL1 (Ss06868890_m1), ACTN1 (Ss01009508_mH), GATA4 (Ss03383805_u1), GJA1 (Ss03374839_u1), COL1A2 (Ss03375009_u1), COL3A1 (Ss04323794_m1), ACTA2 (Ss04245588_m1). Kaikkien näytteiden CT-arvot normalisoitiin GAPDH-kodinhoitogeenin suhteen.
NT-ProBNP:n vapautumista väliaineesta arvioitiin käyttämällä NT-ProBNP-pakkausta (sika) (tuotenro MBS2086979, MyBioSource) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Lyhyesti sanottuna, 250 µl kutakin näytettä ja standardia lisättiin kahtena rinnakkaisena jokaiseen kuoppaan. Heti näytteen lisäämisen jälkeen lisää 50 µl määritysreagenssia A jokaiseen kuoppaan. Ravista levyä varovasti ja sulje tiivisteaineella. Sitten tabletteja inkuboitiin 37 °C:ssa 1 tunnin ajan. Sitten liuos imetään pois ja kuopat pestään 4 kertaa 350 µl:lla 1X pesuliuosta, inkuboiden pesuliuosta 1–2 minuuttia joka kerta. Sitten lisätään 100 µl määritysreagenssia B kuoppaa kohden ja suljetaan levytiivisteaineella. Tablettia ravistettiin varovasti ja inkuboitiin 37 °C:ssa 30 minuuttia. Liuos imetään pois ja kuopat pestään 5 kertaa 350 µl:lla 1X pesuliuosta. Lisää 90 µl substraattiliuosta jokaiseen kuoppaan ja sulje levy. Inkuboi levyä 37 °C:ssa 10–20 minuuttia. Lisää 50 µl pysäytysliuosta jokaiseen kuoppaan. Levy mitattiin välittömästi Cytation (BioTek) -levynlukijalla, joka oli asetettu 450 nm:iin.
Tehoanalyysit tehtiin ryhmäkokojen valitsemiseksi, jotka tarjoavat yli 80 %:n tehon havaita parametrin 10 %:n absoluuttinen muutos 5 %:n tyypin I virhesuhteella. Tehoanalyysejä tehtiin ryhmäkokojen valitsemiseksi, jotka tarjoavat yli 80 %:n tehon havaita parametrin 10 %:n absoluuttinen muutos 5 %:n tyypin I virhesuhteella. Анализ мощности был выполнен для выбора размеров групп, которые обеспечат >80% мощности для обнаружения для обнаружения изменения параметра с 5% частотой ошибок типа I. Tehoanalyysi suoritettiin ryhmäkokojen valitsemiseksi, jotka antaisivat yli 80 %:n tehon havaita 10 %:n absoluuttisen parametrimuutoksen 5 %:n tyypin I virhesuhteella.进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％I型错误率的组大小.进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％I型错误率的组大小. Был проведен анализ мощности для выбора размера группы, который обеспечил бы > 80% мощности для обеспечилоѶ10% изменения параметров и 5% частоты ошибок типа I. Tehoanalyysi suoritettiin ryhmäkoon valitsemiseksi, joka tarjoaisi yli 80 %:n tehon 10 %:n absoluuttisen parametrimuutoksen ja 5 %:n tyypin I virhesuhteen havaitsemiseen.Kudosleikkeet valittiin satunnaisesti ennen koetta. Kaikki analyysit tehtiin sokkoanalyysillä, ja näytteet dekoodattiin vasta kaikkien tietojen analysoinnin jälkeen. Kaikki tilastolliset analyysit tehtiin GraphPad Prism -ohjelmistolla (San Diego, CA). Kaikissa tilastoissa p-arvoja pidettiin merkitsevinä arvoilla <0,05. Kaikissa tilastoissa p-arvoja pidettiin merkitsevinä arvoilla <0,05. Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. Kaikissa tilastoissa p-arvoja pidettiin merkitsevinä arvoilla <0,05.对于所有统计数据，p 值在值<0,05 时被认为是显着的.对于所有统计数据，p 值在值<0,05 时被认为是显着的. Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. Kaikissa tilastoissa p-arvoja pidettiin merkitsevinä arvoilla <0,05.Kaksisuuntainen Studentin t-testi tehtiin aineistolle, jossa oli vain kaksi vertailua. Useiden ryhmien välisen merkitsevyyden määrittämiseen käytettiin yksisuuntaista tai kaksisuuntaista ANOVAa. Post hoc -testejä suoritettaessa käytettiin Tukeyn korjausta useiden vertailujen huomioon ottamiseksi. RNAsec-datassa on erityisiä tilastollisia näkökohtia FDR:n ja p.adjust-arvon laskennassa, kuten Menetelmät-osiossa on kuvattu.
Lisätietoja tutkimusasetelmasta on tässä artikkelissa linkitetyssä Nature Research Report -abstraktissa.