Cảm ơn bạn đã ghé thăm Nature.com. Phiên bản trình duyệt bạn đang sử dụng có hỗ trợ CSS hạn chế. Để có trải nghiệm tốt nhất, chúng tôi khuyên bạn nên sử dụng trình duyệt đã cập nhật (hoặc tắt Chế độ tương thích trong Internet Explorer). Trong thời gian chờ đợi, để đảm bảo hỗ trợ liên tục, chúng tôi sẽ hiển thị trang web mà không có kiểu dáng và JavaScript.
Cần có một hệ thống in vitro đáng tin cậy có thể tái tạo chính xác môi trường sinh lý của tim để thử nghiệm thuốc. Tính khả dụng hạn chế của các hệ thống nuôi cấy mô tim người đã dẫn đến những diễn giải không chính xác về tác dụng của thuốc đối với tim. Ở đây, chúng tôi đã phát triển một mô hình nuôi cấy mô tim (CTCM) kích thích điện cơ các lát cắt tim và trải qua quá trình kéo giãn sinh lý trong giai đoạn tâm thu và tâm trương của chu kỳ tim. Sau 12 ngày nuôi cấy, phương pháp này đã cải thiện một phần khả năng sống của các lát cắt tim, nhưng không bảo toàn hoàn toàn tính toàn vẹn về mặt cấu trúc của chúng. Do đó, sau khi sàng lọc phân tử nhỏ, chúng tôi thấy rằng việc bổ sung 100 nM triiodothyronine (T3) và 1 μM dexamethasone (Dex) vào môi trường của chúng tôi đã duy trì cấu trúc vi mô của các lát cắt trong 12 ngày. Kết hợp với xử lý T3/Dex, hệ thống CTCM duy trì hồ sơ phiên mã, khả năng sống, hoạt động trao đổi chất và tính toàn vẹn về mặt cấu trúc ở cùng mức như mô tim tươi trong 12 ngày. Ngoài ra, việc kéo căng quá mức mô tim trong nuôi cấy gây ra tín hiệu tim phì đại, cung cấp bằng chứng về khả năng của CTCM trong việc mô phỏng các tình trạng phì đại do sự kéo căng tim gây ra. Tóm lại, CTCM có thể mô hình hóa sinh lý và bệnh lý của tim trong nuôi cấy trong thời gian dài, cho phép sàng lọc thuốc đáng tin cậy.
Trước khi tiến hành nghiên cứu lâm sàng, cần có các hệ thống in vitro đáng tin cậy có thể tái tạo chính xác môi trường sinh lý của tim người. Các hệ thống như vậy phải mô phỏng được độ giãn cơ học, nhịp tim và các đặc tính điện sinh lý đã thay đổi. Các mô hình động vật thường được sử dụng làm nền tảng sàng lọc sinh lý tim với độ tin cậy hạn chế trong việc phản ánh tác dụng của thuốc đối với tim người1,2. Cuối cùng, Mô hình thực nghiệm nuôi cấy mô tim lý tưởng (CTCM) là một mô hình có độ nhạy và độ đặc hiệu cao đối với nhiều can thiệp điều trị và dược lý, tái tạo chính xác sinh lý và bệnh lý của tim người3. Việc thiếu một hệ thống như vậy hạn chế việc khám phá ra các phương pháp điều trị mới cho bệnh suy tim4,5 và đã dẫn đến độc tính trên tim của thuốc là một lý do chính khiến thuốc không còn được lưu hành trên thị trường6.
Trong thập kỷ qua, tám loại thuốc không phải thuốc tim mạch đã bị ngừng sử dụng lâm sàng vì chúng gây kéo dài khoảng QT dẫn đến loạn nhịp thất và đột tử7. Do đó, nhu cầu về các chiến lược sàng lọc tiền lâm sàng đáng tin cậy để đánh giá hiệu quả và độc tính tim mạch ngày càng tăng. Việc sử dụng gần đây các tế bào cơ tim có nguồn gốc từ tế bào gốc đa năng cảm ứng ở người (hiPS-CM) trong sàng lọc thuốc và thử nghiệm độc tính cung cấp một giải pháp một phần cho vấn đề này. Tuy nhiên, bản chất chưa trưởng thành của hiPS-CM và sự thiếu phức tạp đa bào của mô tim là những hạn chế chính của phương pháp này. Các nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng hạn chế này có thể được khắc phục một phần bằng cách sử dụng hiPS-CM sớm để tạo thành hydrogel mô tim ngay sau khi bắt đầu co bóp tự phát và tăng dần kích thích điện theo thời gian. Tuy nhiên, các vi mô hiPS-CM này thiếu các đặc tính co bóp và điện sinh lý trưởng thành của cơ tim người trưởng thành. Ngoài ra, mô tim người có cấu trúc phức tạp hơn, bao gồm hỗn hợp không đồng nhất của các loại tế bào khác nhau, bao gồm tế bào nội mô, tế bào thần kinh và nguyên bào sợi mô đệm, được kết nối với nhau bằng các bộ protein ma trận ngoại bào cụ thể. Sự không đồng nhất này của các quần thể không phải tế bào cơ tim11,12,13 trong tim động vật có vú trưởng thành là rào cản lớn đối với việc mô hình hóa mô tim bằng cách sử dụng các loại tế bào riêng lẻ. Những hạn chế lớn này nhấn mạnh tầm quan trọng của việc phát triển các phương pháp nuôi cấy mô cơ tim nguyên vẹn trong điều kiện sinh lý và bệnh lý.
Các lát mỏng (300 µm) nuôi cấy của tim người đã được chứng minh là một mô hình đầy hứa hẹn về cơ tim người nguyên vẹn. Phương pháp này cung cấp khả năng tiếp cận hệ thống đa bào 3D hoàn chỉnh tương tự như mô tim người. Tuy nhiên, cho đến năm 2019, việc sử dụng các lát tim nuôi cấy bị hạn chế bởi thời gian sống sót sau nuôi cấy ngắn (24 giờ). Điều này là do một số yếu tố bao gồm thiếu độ giãn cơ học vật lý, giao diện không khí-lỏng và sử dụng môi trường đơn giản không hỗ trợ nhu cầu của mô tim. Năm 2019, một số nhóm nghiên cứu đã chứng minh rằng việc kết hợp các yếu tố cơ học vào hệ thống nuôi cấy mô tim có thể kéo dài tuổi thọ nuôi cấy, cải thiện biểu hiện tim và mô phỏng bệnh lý tim. Hai nghiên cứu tinh tế 17 và 18 cho thấy tải trọng cơ học đơn trục có tác động tích cực đến kiểu hình tim trong quá trình nuôi cấy. Tuy nhiên, các nghiên cứu này không sử dụng tải trọng cơ học vật lý ba chiều động của chu kỳ tim, vì các lát tim được tải bằng lực kéo đẳng trương 17 hoặc tải trọng auxotonic tuyến tính 18. Các phương pháp kéo căng mô này dẫn đến việc ức chế nhiều gen tim hoặc biểu hiện quá mức các gen liên quan đến phản ứng kéo căng bất thường. Đáng chú ý, Pitoulis và cộng sự đã phát triển một bồn nuôi cấy lát cắt tim động để tái tạo chu kỳ tim bằng cách sử dụng phản hồi của bộ chuyển đổi lực và truyền động căng. Mặc dù hệ thống này cho phép mô hình hóa chu kỳ tim trong ống nghiệm chính xác hơn, nhưng tính phức tạp và thông lượng thấp của phương pháp này hạn chế việc áp dụng hệ thống này. Phòng thí nghiệm của chúng tôi gần đây đã phát triển một hệ thống nuôi cấy đơn giản hóa bằng cách sử dụng kích thích điện và môi trường được tối ưu hóa để duy trì khả năng sống của các lát cắt mô tim lợn và người trong tối đa 6 ngày20,21.
Trong bản thảo hiện tại, chúng tôi mô tả một mô hình nuôi cấy mô tim (CTCM) sử dụng các phần của tim lợn kết hợp các tín hiệu dịch thể để tóm tắt sinh lý tim ba chiều và sự căng giãn bệnh lý trong chu kỳ tim. CTCM này có thể tăng độ chính xác của dự đoán thuốc tiền lâm sàng lên mức chưa từng đạt được trước đây bằng cách cung cấp một hệ thống tim hiệu quả về chi phí, thông lượng trung bình mô phỏng sinh lý/bệnh lý của tim động vật có vú để thử nghiệm thuốc tiền lâm sàng.
Các tín hiệu cơ học huyết động đóng vai trò quan trọng trong việc duy trì chức năng của tế bào cơ tim trong ống nghiệm 22,23,24. Trong bản thảo hiện tại, chúng tôi đã phát triển một CTCM (Hình 1a) có thể mô phỏng môi trường tim của người lớn bằng cách tạo ra cả kích thích điện và cơ học ở tần số sinh lý (1,2 Hz, 72 nhịp mỗi phút). Để tránh kéo căng mô quá mức trong thời kỳ tâm trương, một thiết bị in 3D đã được sử dụng để tăng kích thước mô lên 25% (Hình 1b). Nhịp tim điện do hệ thống C-PACE tạo ra được định thời gian bắt đầu 100 ms trước thời kỳ tâm thu bằng hệ thống thu thập dữ liệu để tái tạo đầy đủ chu kỳ tim. Hệ thống nuôi cấy mô sử dụng bộ truyền động khí nén có thể lập trình (LB Engineering, Đức) để mở rộng theo chu kỳ một màng silicon mềm dẻo nhằm gây ra sự mở rộng các lát cắt tim ở buồng trên. Hệ thống được kết nối với đường khí bên ngoài thông qua một bộ chuyển đổi áp suất, giúp điều chỉnh chính xác áp suất (± 1 mmHg) và thời gian (± 1 ms) (Hình 1c).
a Gắn phần mô vào vòng đỡ 7 mm, được hiển thị màu xanh lam, bên trong buồng nuôi cấy của thiết bị. Buồng nuôi cấy được ngăn cách với buồng khí bằng một màng silicon mỏng linh hoạt. Đặt một miếng đệm giữa mỗi buồng để tránh rò rỉ. Nắp của thiết bị chứa các điện cực than chì cung cấp kích thích điện. b Sơ đồ biểu diễn thiết bị mô lớn, vòng dẫn hướng và vòng đỡ. Các phần mô (màu nâu) được đặt trên thiết bị quá khổ với vòng dẫn hướng được đặt trong rãnh ở mép ngoài của thiết bị. Sử dụng hướng dẫn, cẩn thận đặt vòng đỡ được phủ keo acrylic mô lên phần mô tim. c Đồ thị hiển thị thời gian kích thích điện theo chức năng của áp suất buồng khí được điều khiển bởi bộ truyền động khí nén có thể lập trình (PPD). Một thiết bị thu thập dữ liệu được sử dụng để đồng bộ hóa kích thích điện bằng cảm biến áp suất. Khi áp suất trong buồng nuôi cấy đạt đến ngưỡng đã đặt, tín hiệu xung sẽ được gửi đến C-PACE-EM để kích hoạt kích thích điện. d Hình ảnh bốn CTCM được đặt trên kệ lồng ấp. Bốn thiết bị được kết nối với một PPD thông qua mạch khí nén và các cảm biến áp suất được đưa vào van cầm máu để theo dõi áp suất trong mạch khí nén. Mỗi thiết bị chứa sáu phần mô.
Sử dụng một bộ truyền động khí nén duy nhất, chúng tôi có thể điều khiển 4 thiết bị CTCM, mỗi thiết bị có thể chứa 6 phần mô (Hình 1d). Trong CTCM, áp suất không khí trong buồng khí được chuyển đổi thành áp suất đồng bộ trong buồng chất lỏng và gây ra sự giãn nở sinh lý của lát cắt tim (Hình 2a và Phim bổ sung 1). Đánh giá độ giãn mô ở 80 mm Hg. Nghệ thuật cho thấy độ giãn của các phần mô là 25% (Hình 2b). Độ giãn phần trăm này đã được chứng minh là tương ứng với chiều dài sarcomere sinh lý là 2,2–2,3 µm đối với khả năng co bóp bình thường của phần tim17,19,25. Chuyển động của mô được đánh giá bằng cách sử dụng cài đặt camera tùy chỉnh (Hình bổ sung 1). Biên độ và vận tốc chuyển động của mô (Hình 2c, d) tương ứng với độ giãn trong chu kỳ tim và thời gian trong kỳ tâm thu và tâm trương (Hình 2b). Độ giãn và vận tốc của mô tim trong quá trình co bóp và giãn nở vẫn không đổi trong 12 ngày nuôi cấy (Hình 2f). Để đánh giá tác động của kích thích điện lên khả năng co bóp trong quá trình nuôi cấy, chúng tôi đã phát triển một phương pháp để xác định biến dạng hoạt động bằng thuật toán tô bóng (Hình bổ sung 2a, b) và có thể phân biệt giữa các biến dạng có và không có kích thích điện. Cùng một phần của tim (Hình 2f). Ở vùng di động của vết cắt (R6-9), điện áp trong quá trình kích thích điện cao hơn 20% so với khi không có kích thích điện, điều này cho thấy sự đóng góp của kích thích điện vào chức năng co bóp.
Các dấu vết đại diện của áp suất buồng khí, áp suất buồng chất lỏng và các phép đo chuyển động mô xác nhận rằng áp suất buồng thay đổi áp suất buồng chất lỏng, gây ra chuyển động tương ứng của lát cắt mô. b Các dấu vết đại diện của phần trăm kéo dài (màu xanh) của các phần mô tương ứng với phần trăm kéo dài (màu cam). c Chuyển động đo được của lát cắt tim phù hợp với tốc độ chuyển động đo được. (d) Quỹ đạo đại diện của chuyển động tuần hoàn (đường màu xanh) và vận tốc (đường chấm màu cam) trong một lát cắt tim. e Định lượng thời gian chu kỳ (n = 19 lát cắt trên mỗi nhóm, từ những con lợn khác nhau), thời gian co bóp (n = 19 lát cắt trên mỗi nhóm, từ những con lợn khác nhau), thời gian giãn nở (n = 19 lát cắt trên mỗi nhóm, từ những con lợn khác nhau), chuyển động mô (n = 25 lát cắt)/nhóm từ những con lợn khác nhau), vận tốc tâm thu cực đại (n = 24(D0), 25(D12) lát cắt/nhóm từ những con lợn khác nhau) và tốc độ giãn nở cực đại (n = 24(D0), 25(D12) lát cắt/nhóm từ những con lợn khác nhau). Kiểm định t hai đuôi không cho thấy sự khác biệt đáng kể trong bất kỳ thông số nào. f Phân tích biến dạng đại diện theo dõi các phần mô có (màu đỏ) và không có (màu xanh) kích thích điện, mười vùng khu vực của các phần mô từ cùng một phần. Các bảng dưới cùng cho thấy định lượng phần trăm khác biệt về biến dạng ở các phần mô có và không có kích thích điện ở mười vùng từ các phần khác nhau. (n = 8 lát/nhóm từ những con lợn khác nhau, thực hiện kiểm định t của Two-tailed Student; ****p < 0,0001, **p < 0,01, *p < 0,05). (n = 8 lát/nhóm từ những con lợn khác nhau, thực hiện kiểm định t của Two-tailed Student; ****p < 0,0001, **p < 0,01, *p < 0,05). (n = 8 срезов/группу от разных свиней, проводится двусторонний t-критерий Стьюдента; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05). (n = 8 phần/nhóm từ những con lợn khác nhau, kiểm định t hai đuôi; ****p < 0,0001, **p < 0,01, *p < 0,05). （n = 8 片/组,来自不同的猪,进行双尾学生t 检验；****p < 0,0001,**p < 0,01,*p < 0,05)。 （n = 8 片/组,来自不同的猪,进行双尾学生t 检验；****p < 0,0001,**p < 0,01,*p < 0,05)。 (n = 8 срезов/группу, от разных свиней, двусторонний критерий Стьюдента; ****p <0,0001, **p <0,01, *p <0,05). (n = 8 phần/nhóm, từ những con lợn khác nhau, kiểm định t hai đuôi; ****p <0,0001, **p <0,01, *p <0,05).Thanh lỗi biểu thị giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn.
Trong hệ thống nuôi cấy lát tim sinh học tĩnh trước đây của chúng tôi [20, 21], chúng tôi đã duy trì khả năng sống, chức năng và tính toàn vẹn về mặt cấu trúc của lát tim trong 6 ngày bằng cách áp dụng kích thích điện và tối ưu hóa thành phần môi trường. Tuy nhiên, sau 10 ngày, những con số này giảm mạnh. Chúng tôi sẽ tham chiếu đến các lát được nuôi cấy trong hệ thống nuôi cấy sinh học tĩnh trước đây của chúng tôi 20, 21 điều kiện kiểm soát (Ctrl) và chúng tôi sẽ sử dụng môi trường được tối ưu hóa trước đó của chúng tôi làm điều kiện MC và nuôi cấy trong điều kiện kích thích cơ học và điện đồng thời (CTCM). được gọi là . Đầu tiên, chúng tôi xác định rằng kích thích cơ học mà không có kích thích điện là không đủ để duy trì khả năng sống của mô trong 6 ngày (Hình bổ sung 3a, b). Điều thú vị là, với sự ra đời của kích thích cơ học và điện sinh lý bằng STCM, khả năng sống của các lát tim 12 ngày vẫn giống như trong các lát tim tươi trong điều kiện MS, nhưng không phải trong điều kiện Ctrl, như phân tích MTT thể hiện (Hình 1). 3a). Điều này cho thấy rằng kích thích cơ học và mô phỏng chu kỳ tim có thể duy trì khả năng sống của các lát mô gấp đôi thời gian được báo cáo trong hệ thống nuôi cấy tĩnh trước đây của chúng tôi. Tuy nhiên, đánh giá tính toàn vẹn về mặt cấu trúc của các lát cắt mô bằng cách gắn nhãn miễn dịch troponin T và connexin 43 của tim cho thấy biểu hiện connexin 43 cao hơn đáng kể ở các mô MC vào ngày 12 so với nhóm đối chứng vào cùng ngày. Tuy nhiên, biểu hiện connexin 43 đồng nhất và sự hình thành đĩa Z không được duy trì đầy đủ (Hình 3b). Chúng tôi sử dụng khuôn khổ trí tuệ nhân tạo (AI) để định lượng tính toàn vẹn về mặt cấu trúc của mô26, một đường ống học sâu dựa trên hình ảnh dựa trên nhuộm troponin-T và connexin43 để tự động định lượng tính toàn vẹn về mặt cấu trúc và huỳnh quang của các lát cắt tim theo cường độ định vị. Phương pháp này sử dụng Mạng nơ-ron tích chập (CNN) và khuôn khổ học sâu để định lượng đáng tin cậy tính toàn vẹn về mặt cấu trúc của mô tim theo cách tự động và không thiên vị, như đã mô tả trong tài liệu tham khảo. 26. Mô MC cho thấy sự tương đồng về mặt cấu trúc được cải thiện so với ngày 0 so với các lát cắt đối chứng tĩnh. Ngoài ra, nhuộm ba màu Masson cho thấy tỷ lệ xơ hóa thấp hơn đáng kể trong điều kiện MS so với điều kiện đối chứng vào ngày 12 của quá trình nuôi cấy (Hình 3c). Trong khi CTCM làm tăng khả năng sống của các lát cắt mô tim vào ngày thứ 12 lên mức tương tự như mô tim tươi, thì nó không cải thiện đáng kể tính toàn vẹn về mặt cấu trúc của các lát cắt tim.
Biểu đồ thanh cho thấy định lượng khả năng sống của MTT của lát tim tươi (D0) hoặc nuôi cấy lát tim trong 12 ngày trong nuôi cấy tĩnh (D12 Ctrl) hoặc trong CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) lát/nhóm từ những con lợn khác nhau, thực hiện thử nghiệm ANOVA một chiều; ####p < 0,0001 so với D0 và **p < 0,01 so với D12 Ctrl). Biểu đồ thanh cho thấy định lượng khả năng sống của MTT của lát tim tươi (D0) hoặc nuôi cấy lát tim trong 12 ngày trong nuôi cấy tĩnh (D12 Ctrl) hoặc trong CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) lát/nhóm từ những con lợn khác nhau, thực hiện kiểm tra ANOVA một chiều; ####p < 0,0001 so với D0 và **p < 0,01 so với D12 Ctrl).Biểu đồ histogram cho thấy định lượng khả năng sống của các lát tim tươi MTT (D0) hoặc nuôi cấy các lát tim trong 12 ngày trong nuôi cấy tĩnh (đối chứng D12) hoặc CTCM (MC D12) (n = 18 (D0), 15 (đối chứng D12). ) ), 12 (MC D12) lát/nhóm từ những con lợn khác nhau, một thử nghiệm ANOVA một chiều được thực hiện;####p < 0,0001 по сравнению с D0 и **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p < 0,0001 so với D0 và **p < 0,01 so với D12 Ctrl). a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切片(D0)或心脏切片培养12 天的MTT 活力的量化), 来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；与D0相比,####p < 0,0001,与D12 Ctrl 相比,**p < 0,01)。 a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切片(D0) ,来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；与D0 相比，####p < 0.0001，与D12 Ctrl 相比，**p。)biểu đồ hình cột cho thấy định lượng khả năng sống của MTT trong các lát cắt tim tươi (D0) hoặc các lát cắt tim được nuôi cấy trong 12 ngày trong môi trường nuôi cấy tĩnh (đối chứng D12) hoặc CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (đối chứng D12)), 12 (D12 MC) lát cắt/nhóm từ những con lợn khác nhau, kiểm tra ANOVA một chiều;####p < 0,0001 по сравнению с D0, **p < 0,01 по сравнению сравнению с D12 Ctrl). ####p < 0,0001 so với D0, **p < 0,01 so với D12 Ctrl).b Troponin-T (xanh lá cây), connexin 43 (đỏ) và DAPI (xanh lam) trong các lát cắt tim mới phân lập (D0) hoặc các lát cắt tim được nuôi cấy trong điều kiện tĩnh (Ctrl) hoặc điều kiện CTCM (MC) trong 12 ngày) của hình ảnh miễn dịch huỳnh quang tiêu biểu (thang đo trống = 100 µm). Định lượng trí tuệ nhân tạo về tính toàn vẹn của cấu trúc mô tim (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) lát cắt/nhóm từ mỗi con lợn khác nhau, thực hiện thử nghiệm ANOVA một chiều; ####p < 0,0001 so với D0 và ****p < 0,0001 so với D12 Ctrl). Định lượng trí tuệ nhân tạo về tính toàn vẹn của cấu trúc mô tim (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) lát cắt/nhóm từ mỗi con lợn khác nhau, thực hiện kiểm định ANOVA một chiều; ####p < 0,0001 so với D0 và ****p < 0,0001 so với D12 Ctrl). Độ chính xác của các bước điều chỉnh được thực hiện (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12) MC) срезов/групп от разных свиней, проводится однофакторный тест ANOVA; ####p < 0,0001 по сравнению с D0 и ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). Định lượng tính toàn vẹn về mặt cấu trúc của mô tim bằng trí tuệ nhân tạo (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) phần/nhóm từ những con lợn khác nhau, thực hiện thử nghiệm ANOVA một chiều; ####p < 0,0001 so với D0 và ****p < 0,0001 so với D12 Ctrl).人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) lát/nhóm của mỗi con lợn khác nhau, thử nghiệm ANOVA một chiều;####p < 0,0001 与D0相比,****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比)。人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) lát/nhóm từng con lợn khác nhau, thử nghiệm ANOVA một chiều;####p < 0,0001 与D0相比,*****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比)。 Искусственный интеллект для количественной оценки структурной целостности сердечной ткани (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) срезов/группу каждой из разных свиней, односторонний тест ANOVA; ####p <0,0001 so với D0 Для сравнения ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). Trí tuệ nhân tạo để định lượng tính toàn vẹn về mặt cấu trúc của mô tim (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) phần/nhóm của mỗi con lợn khác nhau, kiểm định ANOVA một chiều; ####p < 0,0001 so với .D0 Để so sánh ****p < 0,0001 so với D12 Ctrl). c Hình ảnh đại diện (trái) và định lượng (phải) cho lát cắt tim nhuộm bằng thuốc nhuộm Masson trichrome (Vảy trần = 500 µm) (n = 10 lát cắt/nhóm từ mỗi con lợn khác nhau, thực hiện thử nghiệm ANOVA một chiều; ####p < 0,0001 so với D0 và ***p < 0,001 so với D12 Ctrl). c Hình ảnh đại diện (trái) và định lượng (phải) cho lát cắt tim nhuộm bằng thuốc nhuộm Masson trichrome (Vảy trần = 500 µm) (n = 10 lát cắt/nhóm từ mỗi con lợn khác nhau, thực hiện kiểm định ANOVA một chiều; #### p < 0,0001 so với D0 và ***p < 0,001 so với D12 Ctrl). c Репрезентативные изображения (слева) và количественная оценка (справа) срезов сердца, окрашенных трихромным красителем Массона (масштаб без покрытия = 500 мкм) (n = 10 срезов/группу от разных свиней, выполняется односторонний тест ANOVA; #### p < 0,0001 по сравнению с D0 và ***p < 0,001 по bằng phím D12 Ctrl). c Hình ảnh đại diện (trái) và định lượng (phải) của các lát cắt tim nhuộm bằng thuốc nhuộm Masson trichrome (thang đo không tráng = 500 µm) (n = 10 lát cắt/nhóm từ những con lợn khác nhau, thực hiện thử nghiệm ANOVA một chiều; #### p < 0,0001 so với D0 và ***p < 0,001 so với D12 Ctrl). c 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像（左)和量化（右）（裸尺度= 500 µm）（n = 10个切片/组,每组来自不同的猪,进行单向ANOVA 测试；#### p < 0,0001 与D0 相比,***p < 0,001 与D12 Ctrl 相比)。 C 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 (左 左) 量化 （右) 裸尺度 裸尺度 裸尺度裸尺度 = 500 µm) （n = 10 个 切片 组 每 组 来自 不同 猪 , 进行 单向 单向 Anova 测试；#### p < 0,0001与D0 相比,***p < 0,001 与D12 Ctrl 相比)。 c Репрезентативные изображения (слева) và количественный анализ (справа) срезов сердца, окрашенных трихромным красителем Массона (чистая шкала = 500 мкм) (n = 10 срезов/группа, каждый от другой свиньи, протестировано с помощью однофакторного дисперсионного анализа ;### #p < 0,0001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Hình ảnh đại diện (trái) và định lượng (phải) của các lát cắt tim nhuộm bằng thuốc nhuộm Masson trichrome (khoảng trống = 500 µm) (n = 10 lát cắt/nhóm, mỗi lát cắt từ một con lợn khác nhau, được kiểm tra bằng phân tích phương sai một chiều;### # p < 0,0001 so với D0, ***p < 0,001 so với D12 Ctrl).Thanh lỗi biểu thị giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn.
Chúng tôi đưa ra giả thuyết rằng bằng cách thêm các phân tử nhỏ vào môi trường nuôi cấy, tính toàn vẹn của tế bào cơ tim có thể được cải thiện và sự phát triển xơ hóa giảm trong quá trình nuôi cấy CTCM. Do đó, chúng tôi đã sàng lọc các phân tử nhỏ bằng cách sử dụng các nuôi cấy kiểm soát tĩnh của mình20,21 do số lượng nhỏ các yếu tố gây nhiễu. Dexamethasone (Dex), triiodothyronine (T3) và SB431542 (SB) đã được chọn để sàng lọc này. Các phân tử nhỏ này trước đây đã được sử dụng trong nuôi cấy hiPSC-CM để thúc đẩy sự trưởng thành của tế bào cơ tim bằng cách tăng chiều dài sarcomere, ống T và tốc độ dẫn truyền. Ngoài ra, cả Dex (một glucocorticoid) và SB đều được biết là có tác dụng ức chế viêm29,30. Do đó, chúng tôi đã kiểm tra xem việc đưa vào một hoặc kết hợp các phân tử nhỏ này có cải thiện tính toàn vẹn về mặt cấu trúc của các lát cắt tim hay không. Đối với sàng lọc ban đầu, liều lượng của mỗi hợp chất được lựa chọn dựa trên nồng độ thường được sử dụng trong các mô hình nuôi cấy tế bào (1 μM Dex27, 100 nM T327 và 2,5 μM SB31). Sau 12 ngày nuôi cấy, sự kết hợp của T3 và Dex dẫn đến tính toàn vẹn cấu trúc tế bào cơ tim tối ưu và tái cấu trúc sợi tối thiểu (Hình bổ sung 4 và 5). Ngoài ra, việc sử dụng gấp đôi hoặc gấp đôi nồng độ T3 và Dex này gây ra những tác động có hại so với nồng độ bình thường (Hình bổ sung 6a, b).
Sau khi sàng lọc ban đầu, chúng tôi đã tiến hành so sánh trực tiếp 4 điều kiện nuôi cấy (Hình 4a): Ctrl: các lát cắt tim được nuôi cấy trong môi trường nuôi cấy tĩnh đã mô tả trước đây của chúng tôi bằng môi trường được tối ưu hóa của chúng tôi; 20,21 TD: T3 và Ctrl s Thêm Dex vào thứ Tư; MC: các lát cắt tim được nuôi cấy trong CTCM bằng môi trường được tối ưu hóa trước đây của chúng tôi; và MT: CTCM có T3 và Dex được thêm vào môi trường. Sau 12 ngày nuôi cấy, khả năng sống của mô MS và MT vẫn giống như ở mô tươi được đánh giá bằng xét nghiệm MTT (Hình 4b). Điều thú vị là việc bổ sung T3 và Dex vào nuôi cấy transwell (TD) không dẫn đến cải thiện đáng kể về khả năng sống so với điều kiện Ctrl, cho thấy vai trò quan trọng của kích thích cơ học trong việc duy trì khả năng sống của các lát cắt tim.
Sơ đồ thiết kế thử nghiệm mô tả bốn điều kiện nuôi cấy được sử dụng để đánh giá tác động của kích thích cơ học và bổ sung T3/Dex vào môi trường trong 12 ngày. b Biểu đồ thanh cho thấy định lượng khả năng sống sau 12 ngày nuôi cấy trong tất cả 4 điều kiện nuôi cấy (Ctrl, TD, MC và MT) so với các lát tim tươi (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD và D12 MT), 12 (D12 MC) lát/nhóm từ những con lợn khác nhau, thực hiện kiểm định ANOVA một chiều; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 so với D0 và **p < 0,01 so với D12 Ctrl). b Biểu đồ thanh cho thấy định lượng khả năng sống sau 12 ngày nuôi cấy trong tất cả 4 điều kiện nuôi cấy (Ctrl, TD, MC và MT) so với các lát tim tươi (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD và D12 MT), 12 (D12 MC) lát/nhóm từ những con lợn khác nhau, thực hiện kiểm định ANOVA một chiều; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 so với D0 và **p < 0,01 so với D12 ctrl). b Гистограмма показывает количественную оценку жизнеспособности через 12 дней после культивирования во ngày 4 tháng 8 культивирования (контроль, TD, MC и MT) có thể được sử dụng để điều chỉnh tốc độ (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD и D12 MT), 12 (D12 MC) срезов/группу от разных свиней, sử dụng ANOVA; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 по сравнению с D0 и **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). b Biểu đồ thanh cho thấy định lượng khả năng sống sau 12 ngày nuôi cấy trong cả 4 điều kiện nuôi cấy (đối chứng, TD, MC và MT) so với các lát tim tươi (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD và D12 MT), 12 (D12 MC) lát/nhóm từ những con lợn khác nhau, kiểm tra ANOVA một chiều; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 so với D0 và **p < 0,01 so với D12 Ctrl). b 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) (n = 18 (D0)、15 (D12 Ctrl、D12 TD 和D12 MT),来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；####p < 0,0001,###p < 0,001 与D0 相比,**p < 0,01 与D12控制)。b4 12 (D12 MC) b Гистограмма, показывающая все 4 условия культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD и D12 MT), от разных свиней 12 (D12 MC) срезы/группа, односторонний тест ANOVA; ####p <0,0001, ###p <0,001 по сравнению с D0, **p <0,01 по сравнению с контролем D12). b Biểu đồ histogram thể hiện tất cả 4 điều kiện nuôi cấy (kiểm soát, TD, MC và MT) so với các lát cắt tim tươi (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD và D12 MT), từ 12 lát cắt/nhóm lợn khác nhau (D12 MC), kiểm tra ANOVA một chiều; ####p<0,0001, ###p<0,001 so với D0, **p<0,01 so với kiểm soát D12). Biểu đồ thanh cho thấy định lượng dòng glucose sau 12 ngày nuôi cấy trong cả 4 điều kiện nuôi cấy (Ctrl, TD, MC và MT) so với các lát tim tươi (D0) (n = 6 lát/nhóm từ những con lợn khác nhau, thực hiện kiểm định ANOVA một chiều; ###p < 0,001, so với D0 và ***p < 0,001 so với D12 Ctrl). Biểu đồ thanh cho thấy định lượng dòng glucose sau 12 ngày nuôi cấy trong cả 4 điều kiện nuôi cấy (Ctrl, TD, MC và MT) so với các lát tim tươi (D0) (n = 6 lát/nhóm từ những con lợn khác nhau, thực hiện kiểm định ANOVA một chiều; ###p < 0,001, so với D0 và ***p < 0,001 so với D12 Ctrl). c Гистограмма показывает количественную оценку потока через 12 ngày ngày 4 tháng 8 культивирования (контроль, TD, MC и MT) đã giành được một khoản tiền lớn (D0) (n = 6 срезов/группу от разых свиней, односторонний Выполняется đó là ANOVA; ###p < 0,001 по сравнению с D0 и ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Biểu đồ hình cột cho thấy lượng glucose lưu thông 12 ngày sau khi nuôi cấy trong cả 4 điều kiện nuôi cấy (kiểm soát, TD, MC và MT) so với các lát cắt tim tươi (D0) (n = 6 lát cắt/nhóm từ những con lợn khác nhau, thực hiện thử nghiệm ANOVA một chiều; ###p < 0,001 so với D0 và ***p < 0,001 so với D12 Ctrl). c 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) 相比，培养后12天的葡萄糖通量定量（n = 6 片/组，来自不同猪，单向执行ANOVA 测试；###p < 0,001,与D0 相比,***p < 0,001与D12 Ctrl 相比)。 C 条形图 显示 所有 4 种 条件 （（ctrl 、 td 、 mc 和 mt) 新鲜 心脏 切片 切片 切片 相比 , 培养 后后 12 天 的 通量 定量 （n = 6 片/组 ` 来自 猪 ` ` ` ` ` ` ` ` ` ` ` 猪 猪单向执行ANOVA 测试；###p < 0,001,与D0 相比,***p < 0,001 与D12 Ctrl 相比)。 c Гистограмма, показывающая количественную оценку потока глюкозы через 12 ngày ngày 4 tháng 8 культивирования (контроль, TD, MC и MT) đã giành được một khoản tiền lớn (D0) (n = 6 срезов/группа, от разных свиней, односторонний Были sử dụng ANOVA; ###p < 0,001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению сравнению с D12 (контроль). c Biểu đồ tần suất cho thấy định lượng thông lượng glucose ở ngày thứ 12 sau khi nuôi cấy đối với tất cả 4 điều kiện nuôi cấy (kiểm soát, TD, MC và MT) so với các lát cắt tim tươi (D0) (n = 6 lát cắt/nhóm, từ những con lợn khác nhau, một bên. Khi thực hiện các thử nghiệm ANOVA, ###p < 0,001 so với D0, ***p < 0,001 so với D12 (kiểm soát).d Biểu đồ phân tích biến dạng của mô tươi (màu xanh lam), ngày 12 MC (màu xanh lá cây) và ngày 12 MT (màu đỏ) tại mười điểm cắt mô khu vực (n = 4 lát cắt/nhóm, thử nghiệm ANOVA một chiều; không có sự khác biệt đáng kể giữa các nhóm). e Biểu đồ núi lửa cho thấy các gen được biểu hiện khác biệt trong các lát cắt tim tươi (D0) so với các lát cắt tim được nuôi cấy trong điều kiện tĩnh (Ctrl) hoặc trong điều kiện MT (MT) trong 10-12 ngày. f Bản đồ nhiệt của các gen sarcomere đối với các lát cắt tim được nuôi cấy trong từng điều kiện nuôi cấy. Thanh lỗi biểu thị giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn.
Sự phụ thuộc về mặt chuyển hóa vào quá trình chuyển đổi từ quá trình oxy hóa axit béo sang quá trình đường phân là một dấu hiệu đặc trưng của sự mất biệt hóa tế bào cơ tim. Các tế bào cơ tim chưa trưởng thành chủ yếu sử dụng glucose để sản xuất ATP và có ty thể kém sản với ít mào5,32. Phân tích việc sử dụng glucose cho thấy trong điều kiện MC và MT, việc sử dụng glucose tương tự như trong các mô ngày 0 (Hình 4c). Tuy nhiên, các mẫu Ctrl cho thấy mức sử dụng glucose tăng đáng kể so với mô tươi. Điều này chỉ ra rằng sự kết hợp của CTCM và T3/Dex làm tăng khả năng sống của mô và bảo tồn kiểu hình chuyển hóa của các lát cắt tim nuôi cấy trong 12 ngày. Ngoài ra, phân tích chủng cho thấy mức độ chủng vẫn giống như trong mô tim tươi trong 12 ngày trong điều kiện MT và MS (Hình 4d).
Để phân tích tác động tổng thể của CTCM và T3/Dex lên bối cảnh phiên mã toàn cầu của mô lát cắt tim, chúng tôi đã thực hiện RNAseq trên các lát cắt tim từ cả bốn điều kiện nuôi cấy khác nhau (Dữ liệu bổ sung 1). Điều thú vị là các lát cắt MT cho thấy sự tương đồng phiên mã cao với mô tim tươi, với chỉ 16 gen được biểu hiện khác biệt trong số 13.642 gen. Tuy nhiên, như chúng tôi đã trình bày trước đó, các lát cắt Ctrl đã hiển thị 1229 gen được biểu hiện khác biệt sau 10–12 ngày nuôi cấy (Hình 4e). Những dữ liệu này đã được xác nhận bằng qRT-PCR của gen tim và nguyên bào sợi (Hình bổ sung 7a-c). Điều thú vị là các lát cắt Ctrl cho thấy sự điều hòa giảm các gen chu kỳ tế bào và tim và kích hoạt các chương trình gen gây viêm. Những dữ liệu này cho thấy sự mất biệt hóa, thường xảy ra sau khi nuôi cấy dài hạn, bị suy yếu hoàn toàn trong điều kiện MT (Hình bổ sung 8a, b). Nghiên cứu cẩn thận về các gen sarcomere cho thấy chỉ trong điều kiện MT, các gen mã hóa sarcomere (Hình 4f) và kênh ion (Hình bổ sung 9) mới được bảo tồn, bảo vệ chúng khỏi bị ức chế trong điều kiện Ctrl, TD và MC. Những dữ liệu này chứng minh rằng với sự kết hợp giữa kích thích cơ học và thể dịch (T3/Dex), bản sao lát cắt tim có thể vẫn giống với lát cắt tim tươi sau 12 ngày nuôi cấy.
Những phát hiện phiên mã này được hỗ trợ bởi thực tế là tính toàn vẹn về mặt cấu trúc của tế bào cơ tim trong các lát cắt tim được bảo quản tốt nhất trong điều kiện MT trong 12 ngày, như thể hiện bằng connexin 43 nguyên vẹn và tại chỗ (Hình 5a). Ngoài ra, tình trạng xơ hóa trong các lát cắt tim trong điều kiện MT đã giảm đáng kể so với Ctrl và tương tự như các lát cắt tim tươi (Hình 5b). Những dữ liệu này chứng minh rằng sự kết hợp giữa kích thích cơ học và xử lý T3/Dex có hiệu quả bảo quản cấu trúc tim trong các lát cắt tim trong nuôi cấy.
Hình ảnh miễn dịch huỳnh quang tiêu biểu của troponin-T (màu xanh lá cây), connexin 43 (màu đỏ) và DAPI (màu xanh lam) trong các lát cắt tim mới phân lập (D0) hoặc nuôi cấy trong 12 ngày trong tất cả bốn điều kiện nuôi cấy lát cắt tim (thanh tỷ lệ = 100 µm). ). Định lượng trí tuệ nhân tạo về tính toàn vẹn của cấu trúc mô tim (n = 7 (D0 và D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC và D12 MT) lát cắt/nhóm từ những con lợn khác nhau, thực hiện kiểm định ANOVA một chiều; ####p < 0,0001 so với D0 và *p < 0,05 hoặc ****p < 0,0001 so với D12 Ctrl). Định lượng trí tuệ nhân tạo về tính toàn vẹn của cấu trúc mô tim (n = 7 (D0 và D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC và D12 MT) lát cắt/nhóm từ những con lợn khác nhau, thực hiện kiểm định ANOVA một chiều; #### p < 0,0001 so với D0 và *p < 0,05 hoặc ****p < 0,0001 so với D12 Ctrl). Tỷ lệ tín dụng của bạn có thể được cung cấp bởi các khoản nợ phải trả (n = 7 (D0 и D12) Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC и D12 MT) срезов/группу bởi vì nó đã được sử dụng bởi ANOVA; #### p < 0,0001 по сравнению с D0 и *p < 0,05 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). Định lượng tính toàn vẹn về mặt cấu trúc của mô tim bằng trí tuệ nhân tạo (n = 7 (D0 và D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC và D12 MT) phần/nhóm từ những con lợn khác nhau, thực hiện thử nghiệm ANOVA một chiều; #### p < 0,0001 so với D0 và *p < 0,05 hoặc ****p < 0,0001 so với D12 Ctrl).对不同猪的心脏组织结构完整性（n = 7（D0 和D12 Ctrl）、5（D12 TD、D12 MC 和D12 MT).与D12 Ctrl 相比)。对 不同 猪 的 心脏 结构 完整性 （n = 7 （d0 和 d12 ctrl） （5 （d12 td 、 d12 mc 和 d12 mt) 组） 人工智能量 化 进行 单向 单向 单向 测试 ； ########## p < 0,0001 与D0 和*p < 0,05 相比,或*****p < 0,0001与D12 Ctrl 相比)。Định lượng tính toàn vẹn về mặt cấu trúc của mô tim bằng trí tuệ nhân tạo trên các con lợn khác nhau (n = 7 (D0 và D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC và D12 MT) phần/nhóm) với thử nghiệm ANOVA một chiều;#### p < 0,0001 по сравнению с D0 и *p < 0,05 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). #### p < 0,0001 so với D0 và *p < 0,05 hoặc ****p < 0,0001 so với D12 Ctrl). b Hình ảnh đại diện và định lượng cho lát cắt tim nhuộm bằng thuốc nhuộm Masson trichrome (Thanh tỷ lệ = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD và D12 MC), 9 (D12 MT) lát cắt/nhóm từ những con lợn khác nhau, thực hiện kiểm định ANOVA một chiều; ####p < 0,0001 so với D0 và ***p < 0,001 hoặc ****p < 0,0001 so với D12 Ctrl). b Hình ảnh đại diện và định lượng cho lát cắt tim nhuộm bằng thuốc nhuộm Masson trichrome (Thanh tỷ lệ = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD và D12 MC), 9 (D12 MT) lát cắt/nhóm từ những con lợn khác nhau, thực hiện kiểm định ANOVA một chiều; ####p < 0,0001 so với D0 và ***p < 0,001 hoặc ****p < 0,0001 so với D12 Ctrl). b Người quản lý tài sản và người quản lý tài sản của bạn có thể kiếm được nhiều tiền hơn Массона (масштабная линейка = 500 mét) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD и D12 MC), 9 (D12 MT) срезов/группу от разных свиней, выполняется односторонний тест ANOVA; ####p < 0,0001 по сравнению с D0 và ***p < 0,001 hoặc ****p < 0,0001 по bằng phím D12 Ctrl). b Hình ảnh tiêu biểu và định lượng các lát cắt tim nhuộm bằng thuốc nhuộm Masson trichrome (thanh tỷ lệ = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD và D12 MC), 9 (D12 MT) lát cắt/nhóm từ những con lợn khác nhau, thực hiện ANOVA một chiều; ####p < 0,0001 so với D0 và ***p < 0,001 hoặc ****p < 0,0001 so với D12 Ctrl). b 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像和量化（比例尺= 500 µm)（n = 10（D0、D12 Ctrl、D12 TD和D12 MC), 来自不同猪的9 个（D12 MT)切片/组,进行单因素方差分析；####p < 0.0001 与D0 相比,***p < 0,001,或****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比)。 b 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 和 量化 （比例 尺 尺 尺 = 500 µm) （n = 10 （d0 、 d12 ctrl 、 d12 td 和 d12 mc) 来自 不同 的 9 个 d12 mt 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 ####p < 0,0001 与D0相比,***p < 0,001,或****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比)。 b Người quản lý tài sản và người quản lý tài sản của bạn có thể kiếm được nhiều tiền hơn (масштабная линейка = 500 mm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD và D12 MC), 9 (D12 MT) срезов от разных свиней / группы, один- способ ANOVA; ####p < 0,0001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). b Hình ảnh tiêu biểu và định lượng các lát cắt tim nhuộm Masson trichrome (thanh tỷ lệ = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD và D12 MC), 9 (D12 MT) lát cắt từ các con lợn/nhóm khác nhau, một phương pháp ANOVA; ####p < 0,0001 so với D0, ***p < 0,001 hoặc ****p < 0,0001 so với D12 Ctrl).Thanh lỗi biểu thị giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn.
Cuối cùng, khả năng của CTCM trong việc bắt chước phì đại tim đã được đánh giá bằng cách tăng độ giãn mô tim. Trong CTCM, áp suất buồng khí đỉnh tăng từ 80 mmHg lên 80 mmHg. Art. (độ giãn bình thường) lên đến 140 mmHg Art. (Hình 6a). Điều này tương ứng với độ giãn tăng 32% (Hình 6b), trước đây được thể hiện là phần trăm độ giãn tương ứng cần thiết để các lát cắt tim đạt được chiều dài sarcomere tương tự như chiều dài thấy trong phì đại. Độ giãn và vận tốc của mô tim trong quá trình co và giãn vẫn không đổi trong sáu ngày nuôi cấy (Hình 6c). Mô tim từ điều kiện MT đã được trải qua điều kiện kéo giãn bình thường (MT (Bình thường)) hoặc điều kiện kéo giãn quá mức (MT (OS)) trong sáu ngày. Ngay sau bốn ngày nuôi cấy, chỉ điểm sinh học phì đại NT-ProBNP đã tăng đáng kể trong môi trường trong điều kiện MT (OS) so với điều kiện MT (bình thường) (Hình 7a). Ngoài ra, sau sáu ngày nuôi cấy, kích thước tế bào trong MT (OS) (Hình 7b) tăng đáng kể so với các phần của tim MT (bình thường). Ngoài ra, sự chuyển vị nhân NFATC4 tăng đáng kể trong các mô bị kéo căng quá mức (Hình 7c). Những kết quả này cho thấy sự phát triển tiến triển của quá trình tái tạo bệnh lý sau khi tăng căng và hỗ trợ khái niệm rằng thiết bị CTCM có thể được sử dụng làm nền tảng để nghiên cứu tín hiệu phì đại tim do kéo căng.
Các dấu vết đại diện của áp suất buồng khí, áp suất buồng chất lỏng và các phép đo chuyển động mô xác nhận rằng áp suất buồng thay đổi áp suất buồng chất lỏng, gây ra chuyển động tương ứng của lát mô. b Đường cong tỷ lệ kéo giãn và tốc độ kéo giãn đại diện cho các phần mô được kéo giãn bình thường (màu cam) và bị kéo giãn quá mức (màu xanh). c Biểu đồ thanh hiển thị thời gian chu kỳ (n = 19 lát cắt trên mỗi nhóm, từ những con lợn khác nhau), thời gian co (n = 18-19 lát cắt trên mỗi nhóm, từ những con lợn khác nhau), thời gian giãn nở (n = 19 lát cắt trên mỗi nhóm, từ những con lợn khác nhau)), biên độ chuyển động mô (n = 14 lát cắt/nhóm, từ những con lợn khác nhau), vận tốc tâm thu cực đại (n = 14 lát cắt/nhóm, từ những con lợn khác nhau) và tốc độ giãn nở cực đại (n = 14 (D0), 15 (D6)) phần/nhóm) từ những con lợn khác nhau), kiểm định t hai đuôi không cho thấy sự khác biệt đáng kể ở bất kỳ tham số nào, cho thấy các tham số này vẫn không đổi trong 6 ngày nuôi cấy với quá điện áp. Thanh lỗi biểu thị giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn.
Biểu đồ thanh định lượng nồng độ NT-ProBNP trong môi trường nuôi cấy từ các lát tim được nuôi cấy trong điều kiện kéo giãn bình thường (Norm) hoặc kéo giãn quá mức (OS) của MT (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm và D4 MTOS) lát/nhóm từ những con lợn khác nhau, Phân tích phương sai hai chiều được thực hiện; **p < 0,01 so với kéo giãn bình thường). Biểu đồ thanh định lượng nồng độ NT-ProBNP trong môi trường nuôi cấy từ các lát tim được nuôi cấy trong điều kiện kéo giãn bình thường (Norm) hoặc kéo giãn quá mức (OS) của MT (n ​​= 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm và D4 MTOS) lát/nhóm từ những con lợn khác nhau, Phân tích phương sai hai chiều được thực hiện; **p < 0,01 so với kéo giãn bình thường).Biểu đồ định lượng nồng độ NT-ProBNP trong môi trường nuôi cấy từ lát cắt tim được nuôi cấy trong điều kiện kéo giãn MT bình thường (norm) hoặc kéo giãn quá mức (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm và D4).MTOS) lát cắt/nhóm từ những con lợn khác nhau, phân tích phương sai hai yếu tố được thực hiện;**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p < 0,01 so với độ giãn bình thường). a 在MT 正常拉伸(Norm) 或过度拉伸(OS) 条件下培养的心脏切片培养基中NT-ProBNP浓度的条形图量化（n = 4 (D2 MTNorm)、3（D2 MTOS、D4 MTNorm 和D4 MTOS). < 0,01）。 a Định lượng nồng độ NT-ProBNP trong các lát tim được nuôi cấy trong điều kiện MT căng bình thường (Định mức) hoặc căng quá mức (OS) (n ​​= 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm和D4 MTOS) từ các điều kiện khác nhau; **so với kéo giãn bình thường, p < 0,01).Biểu đồ tần suất Định lượng nồng độ NT-ProBNP trong lát cắt tim được nuôi cấy trong điều kiện MT kéo dài (norm) hoặc kéo dài quá mức (OS) bình thường (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm) và D4 MTOS) lát cắt/nhóm từ những con lợn khác nhau, phân tích phương sai hai chiều;**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p < 0,01 so với độ giãn bình thường). b Hình ảnh đại diện cho lát cắt tim nhuộm troponin-T và WGA (trái) và định lượng kích thước tế bào (phải) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) tế bào/nhóm từ 10 lát cắt khác nhau từ những con lợn khác nhau, Kiểm định t hai đuôi được thực hiện; ****p < 0,0001 so với độ giãn bình thường). b Hình ảnh đại diện cho lát cắt tim nhuộm troponin-T và WGA (trái) và định lượng kích thước tế bào (phải) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) tế bào/nhóm từ 10 lát cắt khác nhau từ những con lợn khác nhau, Kiểm định t hai đuôi Student được thực hiện; ****p < 0,0001 so với độ giãn bình thường). b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слева) и người quản lý tài chính (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) клеток/группу из 10 разных срезов от разных свиней, два- проводится хвостовой t-критерий Стьюдента ****p < 0,0001 по сравнению сравнению с нормальным растяжением). b Hình ảnh tiêu biểu của các lát cắt tim nhuộm troponin-T và AZP (trái) và định lượng kích thước tế bào (phải) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) tế bào/nhóm từ 10 lát cắt khác nhau từ những con lợn khác nhau, kiểm định t hai đuôi của Student đã được thực hiện; ****p < 0,0001 so với dòng bình thường). b 用肌钙蛋白-T 和WGA(左)和细胞大小量化（右)染色的心脏切片的代表性图像（n = 330（D6 MTOS), 来自不同猪的10 个不同切片的369（D6 MTNorm）细胞/组,两进行有尾学生t 检验；与正常拉伸相比,****p < 0,0001)。 b Hình ảnh tiêu biểu của lát cắt tim nhuộm calcarein-T và WGA (trái) và kích thước tế bào (phải) (n = 330 (D6 MTOS), 369 từ 10 lát cắt khác nhau (D6 MTNorm)) Tế bào/Kiểm tra t của nghiên cứu kéo dài trung bình；so với kéo giãn bình thường，****p < 0,0001). b Việc sử dụng các công cụ hỗ trợ, quản lý tài chính, công cụ hỗ trợ và công cụ hỗ trợ của bạn và các công cụ khác оценка размера клеток (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) và 10 различных срезов от разных свиней Клетки/группа, двусторонние критерий Стьюдента; ****p < 0,0001 по сравнению с нормальным (thực tế). b Hình ảnh tiêu biểu của các lát cắt tim nhuộm troponin-T và AZP (trái) và định lượng kích thước tế bào (phải) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) từ 10 lát cắt khác nhau từ những con lợn khác nhau) Tế bào/nhóm, tiêu chuẩn hai đuôi t của Student; ****p < 0,0001 so với dòng bình thường). c Hình ảnh đại diện cho lát cắt tim MTOS ngày 0 và ngày 6 được gắn nhãn miễn dịch đối với troponin-T và NFATC4 và định lượng sự chuyển vị của NFATC4 đến nhân của CM (n = 4 (D0), 3 lát cắt (D6 MTOS)/nhóm từ những con lợn khác nhau, Kiểm định t hai đuôi được thực hiện; *p < 0,05). c Hình ảnh đại diện cho lát cắt tim MTOS ngày 0 và ngày 6 được gắn nhãn miễn dịch đối với troponin-T và NFATC4 và định lượng sự chuyển vị của NFATC4 đến nhân của CM (n = 4 (D0), 3 lát cắt (D6 MTOS)/nhóm từ những con lợn khác nhau, Kiểm định t hai đuôi được thực hiện; *p < 0,05). c Sử dụng các công cụ hỗ trợ 0 và 6 MTOS, имуномеченых для тропонина-Т và NFATC4, и количественная оценка транслокации NFATC4 được cung cấp bởi các nhà cung cấp dịch vụ (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срезов/группу от разных свиней , выполняется двусторонний t-критерий Стьюдента; *p < 0,05). c Hình ảnh đại diện cho các lát cắt tim vào ngày thứ 0 và ngày thứ 6 sau MTOS, được gắn nhãn miễn dịch đối với troponin-T và NFATC4, và định lượng sự chuyển vị NFATC4 trong nhân tế bào hang (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) lát cắt/nhóm từ những con lợn khác nhau) đã thực hiện kiểm định t hai đuôi của Student; *p < 0,05). c 用于肌钙蛋白-T 和NFATC4 免疫标记的第0 天和第6 天MTOS NFATC4 易位至CM 细胞核的量化（n = 4 (D0)、3 (D6 MTOS)切片/组, 进行双尾学生t 检验；*p < 0,05)。 c Hình ảnh đại diện của nhãn miễn dịch calcanin-T và NFATC4 第0天和第6天MTOS lát tim và NFATC4 từ các nhân tế bào NFATC4 易位至CM khác nhau的quantity化 (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) 切礼/组,时间双尾学生et 电影；*p < 0,05). c Sử dụng phần mềm quản lý MTOS trên 0 và 6 trên thiết bị của bạn để sử dụng MTOS на 0 và 6 trên thiết bị di động тропонином-Т và NFATC4 и количественная оценка транслокации NFATC4 в ядра CM от разных свиней (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срез/группа, два- хвостатый t-критерий Стьюдента; c Hình ảnh tiêu biểu của lát cắt tim MTOS vào ngày 0 và ngày 6 để đánh dấu miễn dịch troponin-T và NFATC4 và định lượng sự chuyển vị NFATC4 trong nhân CM từ những con lợn khác nhau (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) lát cắt/nhóm, tiêu chuẩn t hai đuôi của Student; *p < 0,05).Thanh lỗi biểu thị giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn.
Nghiên cứu tim mạch chuyển dịch đòi hỏi các mô hình tế bào tái tạo chính xác môi trường tim. Trong nghiên cứu này, một thiết bị CTCM đã được phát triển và mô tả đặc điểm có thể kích thích các phần siêu mỏng của tim. Hệ thống CTCM bao gồm kích thích cơ điện đồng bộ sinh lý và làm giàu dịch T3 và Dex. Khi các phần tim lợn tiếp xúc với các yếu tố này, khả năng sống, tính toàn vẹn về mặt cấu trúc, hoạt động trao đổi chất và biểu hiện phiên mã của chúng vẫn giống như trong mô tim tươi sau 12 ngày nuôi cấy. Ngoài ra, việc kéo căng quá mức mô tim có thể gây ra chứng phì đại tim do quá căng. Nhìn chung, những kết quả này hỗ trợ vai trò quan trọng của các điều kiện nuôi cấy sinh lý trong việc duy trì kiểu hình tim bình thường và cung cấp nền tảng để sàng lọc thuốc.
Nhiều yếu tố góp phần tạo nên môi trường tối ưu cho hoạt động và sự sống còn của tế bào cơ tim. Yếu tố rõ ràng nhất trong số này liên quan đến (1) tương tác giữa các tế bào, (2) kích thích điện cơ, (3) yếu tố dịch thể và (4) chất nền chuyển hóa. Tương tác sinh lý giữa tế bào với tế bào đòi hỏi mạng lưới ba chiều phức tạp của nhiều loại tế bào được hỗ trợ bởi ma trận ngoại bào. Những tương tác tế bào phức tạp như vậy rất khó tái tạo trong ống nghiệm bằng cách nuôi cấy đồng thời các loại tế bào riêng lẻ, nhưng có thể dễ dàng đạt được bằng cách sử dụng bản chất cơ quan của các lát cắt tim.
Kéo giãn cơ học và kích thích điện của tế bào cơ tim là rất quan trọng để duy trì kiểu hình tim33,34,35. Trong khi kích thích cơ học đã được sử dụng rộng rãi để điều hòa và trưởng thành hiPSC-CM, một số nghiên cứu tinh tế gần đây đã thử kích thích cơ học các lát cắt tim trong nuôi cấy bằng cách sử dụng tải trọng đơn trục. Các nghiên cứu này cho thấy tải trọng cơ học đơn trục 2D có tác động tích cực đến kiểu hình của tim trong quá trình nuôi cấy. Trong các nghiên cứu này, các phần của tim được tải bằng lực kéo đẳng trương17, tải trọng auxotonic tuyến tính18 hoặc chu kỳ tim được tái tạo bằng cách sử dụng phản hồi của bộ chuyển đổi lực và truyền động căng thẳng. Tuy nhiên, các phương pháp này sử dụng lực kéo giãn mô đơn trục mà không tối ưu hóa môi trường, dẫn đến ức chế nhiều gen tim hoặc biểu hiện quá mức các gen liên quan đến phản ứng kéo giãn bất thường. CTCM được mô tả ở đây cung cấp kích thích cơ điện 3D mô phỏng chu kỳ tim tự nhiên về thời gian chu kỳ và độ kéo giãn sinh lý (độ kéo giãn 25%, tâm thu 40%, tâm trương 60% và 72 nhịp mỗi phút). Mặc dù chỉ riêng kích thích cơ học ba chiều này là không đủ để duy trì tính toàn vẹn của mô, nhưng cần phải kết hợp kích thích cơ học và kích thích dịch thể bằng T3/Dex để duy trì đầy đủ khả năng sống, chức năng và tính toàn vẹn của mô.
Các yếu tố dịch thể đóng vai trò quan trọng trong việc điều chỉnh kiểu hình tim ở người trưởng thành. Điều này được nhấn mạnh trong các nghiên cứu HiPS-CM trong đó T3 và Dex được thêm vào môi trường nuôi cấy để đẩy nhanh quá trình trưởng thành của tế bào. T3 có thể ảnh hưởng đến quá trình vận chuyển axit amin, đường và canxi qua màng tế bào36. Ngoài ra, T3 thúc đẩy biểu hiện MHC-α và điều hòa giảm MHC-β, thúc đẩy sự hình thành các sợi cơ co giật nhanh ở tế bào cơ tim trưởng thành so với các sợi cơ co giật chậm ở CM thai nhi. Thiếu hụt T3 ở bệnh nhân suy giáp dẫn đến mất các dải sợi cơ và tốc độ phát triển trương lực giảm37. Dex tác động lên các thụ thể glucocorticoid và đã được chứng minh là làm tăng khả năng co bóp cơ tim ở những tim được tưới máu riêng lẻ; 38 sự cải thiện này được cho là có liên quan đến tác dụng lên sự xâm nhập do lắng đọng canxi (SOCE) 39,40. Ngoài ra, Dex liên kết với các thụ thể của nó, gây ra phản ứng nội bào rộng rãi ức chế chức năng miễn dịch và tình trạng viêm30.
Kết quả của chúng tôi chỉ ra rằng kích thích cơ học vật lý (MS) đã cải thiện hiệu suất nuôi cấy tổng thể so với Ctrl, nhưng không duy trì được khả năng sống, tính toàn vẹn về cấu trúc và biểu hiện tim trong hơn 12 ngày nuôi cấy. So với Ctrl, việc bổ sung T3 và Dex vào nuôi cấy CTCM (MT) đã cải thiện khả năng sống và duy trì các cấu hình phiên mã, tính toàn vẹn về cấu trúc và hoạt động trao đổi chất tương tự với mô tim tươi trong 12 ngày. Ngoài ra, bằng cách kiểm soát mức độ kéo căng mô, một mô hình phì đại tim do quá trình kéo căng quá mức đã được tạo ra bằng cách sử dụng STCM, minh họa cho tính linh hoạt của hệ thống STCM. Cần lưu ý rằng mặc dù quá trình tái tạo và xơ hóa tim thường liên quan đến các cơ quan còn nguyên vẹn mà các tế bào lưu thông của chúng có thể cung cấp các cytokine thích hợp cũng như thực bào và các yếu tố tái tạo khác, các phần của tim vẫn có thể bắt chước quá trình xơ hóa để đáp ứng với căng thẳng và chấn thương. thành nguyên bào sợi cơ. Điều này đã được đánh giá trước đây trong mô hình lát cắt tim này. Cần lưu ý rằng các thông số CTCM có thể được điều chỉnh bằng cách thay đổi biên độ và tần số áp suất/điện để mô phỏng nhiều tình trạng như nhịp tim nhanh, nhịp tim chậm và hỗ trợ tuần hoàn cơ học (tim không tải cơ học). Điều này làm cho hệ thống có thông lượng trung bình để thử nghiệm thuốc. Khả năng của CTCM trong việc mô hình hóa chứng phì đại tim do gắng sức quá mức mở đường cho việc thử nghiệm hệ thống này cho liệu pháp cá nhân hóa. Tóm lại, nghiên cứu hiện tại chứng minh rằng sự kéo giãn cơ học và kích thích dịch thể là rất quan trọng để duy trì nuôi cấy các phần mô tim.
Mặc dù dữ liệu trình bày ở đây cho thấy CTCM là một nền tảng rất hứa hẹn để mô hình hóa cơ tim nguyên vẹn, phương pháp nuôi cấy này có một số hạn chế. Hạn chế chính của nuôi cấy CTCM là nó áp đặt ứng suất cơ học động liên tục lên các lát cắt, ngăn cản khả năng theo dõi chủ động các cơn co thắt lát cắt tim trong mỗi chu kỳ. Ngoài ra, do kích thước nhỏ của các lát cắt tim (7 mm), khả năng đánh giá chức năng tâm thu bên ngoài các hệ thống nuôi cấy bằng các cảm biến lực truyền thống bị hạn chế. Trong bản thảo hiện tại, chúng tôi đã khắc phục một phần hạn chế này bằng cách đánh giá điện áp quang học như một chỉ báo về chức năng co bóp. Tuy nhiên, hạn chế này sẽ cần phải nghiên cứu thêm và có thể được giải quyết trong tương lai bằng cách giới thiệu các phương pháp theo dõi quang học chức năng của các lát cắt tim trong nuôi cấy, chẳng hạn như lập bản đồ quang học sử dụng thuốc nhuộm nhạy cảm với điện áp và canxi. Một hạn chế khác của CTCM là mô hình làm việc không điều chỉnh ứng suất sinh lý (tải trước và tải sau). Trong CTCM, áp suất được tạo ra theo các hướng ngược nhau để tái tạo độ giãn sinh lý 25% ở kỳ tâm trương (căng hoàn toàn) và kỳ tâm thu (độ dài co bóp trong quá trình kích thích điện) ở các mô rất lớn. Hạn chế này cần được loại bỏ trong các thiết kế CTCM trong tương lai bằng cách tạo áp lực thích hợp lên mô tim từ cả hai bên và áp dụng mối quan hệ áp suất-thể tích chính xác như trong các buồng tim.
Sự tái tạo mô hình do kéo giãn quá mức được báo cáo trong bản thảo này chỉ giới hạn ở việc mô phỏng các tín hiệu kéo giãn quá mức phì đại. Do đó, mô hình này có thể giúp nghiên cứu tín hiệu phì đại do kéo giãn mà không cần các yếu tố thể dịch hoặc thần kinh (không tồn tại trong hệ thống này). Cần có thêm các nghiên cứu để tăng tính đa dạng của CTCM, ví dụ, nuôi cấy đồng thời với các tế bào miễn dịch, các yếu tố thể dịch huyết tương lưu thông và sự chi phối khi nuôi cấy đồng thời với các tế bào thần kinh sẽ cải thiện khả năng mô hình hóa bệnh bằng CTCM.
Mười ba con lợn đã được sử dụng trong nghiên cứu này. Tất cả các quy trình trên động vật đều được thực hiện theo hướng dẫn của cơ sở và được Ủy ban Chăm sóc và Sử dụng Động vật của Cơ sở thuộc Đại học Louisville chấp thuận. Cung động mạch chủ được kẹp và tim được tưới 1 L thuốc gây tê liệt tim vô trùng (110 mM NaCl, 1,2 mM CaCl2, 16 mM KCl, 16 mM MgCl2, 10 mM NaHCO3, 5 U/mL heparin, pH lên đến 7,4); tim được bảo quản trong dung dịch làm tê liệt tim lạnh cho đến khi được vận chuyển đến phòng thí nghiệm trên đá, thường mất <10 phút. tim được bảo quản trong dung dịch làm tê liệt tim lạnh cho đến khi được vận chuyển đến phòng thí nghiệm trên đá, thường mất <10 phút. bạn có thể sử dụng một số công cụ để cung cấp cho bạn một danh sách các công cụ có thể giúp bạn có được một khoản vay lớn thời gian <10 phút. tim được bảo quản trong dung dịch làm tê liệt tim lạnh cho đến khi vận chuyển đến phòng xét nghiệm trên đá, thường mất <10 phút.通常<10分钟。通常<10分钟。 Bạn có thể sử dụng thẻ tín dụng của mình để đạt được điều đó trong khoảng thời gian dưới 10 phút. Giữ tim trên đá lạnh cho đến khi vận chuyển đến phòng xét nghiệm trên đá lạnh, thường là <10 phút.
Thiết bị CTCM được phát triển trong phần mềm thiết kế hỗ trợ máy tính (CAD) SolidWorks. Các buồng nuôi cấy, vách ngăn và buồng khí được làm bằng nhựa acrylic trong suốt CNC. Vòng đệm dự phòng đường kính 7mm được làm bằng polyethylene mật độ cao (HDPE) ở giữa và có rãnh vòng chữ O để chứa vòng chữ O silicon được sử dụng để bịt kín môi trường bên dưới. Một màng silica mỏng ngăn cách buồng nuôi cấy với tấm phân tách. Màng silicon được cắt bằng laser từ tấm silicon dày 0,02 inch và có độ cứng 35A. Các miếng đệm silicon ở dưới cùng và trên cùng được cắt bằng laser từ tấm silicon dày 1/16 inch và có độ cứng 50A. Vít và đai ốc cánh bằng thép không gỉ 316L được sử dụng để cố định khối và tạo ra lớp đệm kín khí.
Một bảng mạch in chuyên dụng (PCB) được thiết kế để tích hợp với hệ thống C-PACE-EM. Các ổ cắm đầu nối máy Thụy Sĩ trên PCB được kết nối với các điện cực graphite bằng dây đồng mạ bạc và các vít đồng 0-60 được vặn vào các điện cực. Bảng mạch in được đặt trong nắp máy in 3D.
Thiết bị CTCM được điều khiển bởi bộ truyền động khí nén có thể lập trình (PPD) tạo ra áp suất tuần hoàn được kiểm soát tương tự như chu kỳ tim. Khi áp suất bên trong buồng khí tăng lên, màng silicon mềm dẻo sẽ mở rộng lên trên, ép môi trường bên dưới vị trí mô. Khu vực mô sau đó sẽ được kéo căng do sự đẩy chất lỏng này ra ngoài, mô phỏng sự giãn nở sinh lý của tim trong thời kỳ tâm trương. Ở đỉnh điểm của sự thư giãn, kích thích điện được áp dụng thông qua các điện cực than chì, giúp giảm áp suất trong buồng khí và gây ra sự co lại của các phần mô. Bên trong ống là một van cầm máu có cảm biến áp suất để phát hiện áp suất trong hệ thống khí. Áp suất do cảm biến áp suất cảm nhận được sẽ được áp dụng cho bộ thu dữ liệu được kết nối với máy tính xách tay. Điều này cho phép theo dõi liên tục áp suất bên trong buồng khí. Khi đạt đến áp suất buồng tối đa (tiêu chuẩn 80 mmHg, 140 mmHg OS), thiết bị thu thập dữ liệu được lệnh gửi tín hiệu đến hệ thống C-PACE-EM để tạo tín hiệu điện áp hai pha trong 2 ms, được đặt thành 4 V.
Các lát cắt tim đã được lấy và các điều kiện nuôi cấy trong 6 giếng đã được thực hiện như sau: Chuyển các trái tim đã thu hoạch từ bình chuyển sang một khay chứa cardioplegia lạnh (4° C.). Tâm thất trái được cô lập bằng một lưỡi dao vô trùng và cắt thành các mảnh 1-2 cm3. Các khối mô này đã được gắn vào các giá đỡ mô bằng keo dán mô và đặt trong một bồn mô vi phẫu rung có chứa dung dịch Tyrode và liên tục được oxy hóa (3 g/L 2,3-butanedione monooxime (BDM), 140 mM NaCl (8,18 g). , 6 mM KCl (0,447 g), 10 mM D-glucose (1,86 g), 10 mM HEPES (2,38 g), 1 mM MgCl2 (1 ml dung dịch 1 M), 1,8 mM CaCl2 (1,8 ml dung dịch 1 M), lên đến 1 L ddH2O). Máy cắt mô rung được thiết lập để cắt lát dày 300 µm ở tần số 80 Hz, biên độ rung theo chiều ngang là 2 mm và tốc độ tiến là 0,03 mm/giây. Bể mô được bao quanh bởi nước đá để giữ cho dung dịch mát và nhiệt độ được duy trì ở mức 4°C. Chuyển các lát mô từ bể cắt mô sang bể ủ chứa dung dịch Tyrode liên tục được oxy hóa trên đá cho đến khi thu được đủ các lát cho một đĩa nuôi cấy. Đối với nuôi cấy transwell, các lát mô được gắn vào các giá đỡ polyurethane vô trùng rộng 6 mm và đặt trong 6 ml môi trường tối ưu (môi trường 199, chất bổ sung ITS 1x, FBS 10%, VEGF 5 ng/ml, FGF-kiềm 10 ng/ml và kháng sinh-kháng nấm 2X). Kích thích điện (10 V, tần số 1,2 Hz) được áp dụng cho các lát mô thông qua C-Pace. Đối với điều kiện TD, T3 và Dex mới được thêm vào ở mức 100 nM và 1 μM sau mỗi lần thay đổi môi trường. Môi trường được bão hòa oxy trước khi thay thế 3 lần một ngày. Các phần mô được nuôi cấy trong lồng ấp ở 37°C và 5% CO2.
Đối với nuôi cấy CTCM, các lát cắt mô được đặt trên máy in 3D tùy chỉnh trong đĩa Petri chứa dung dịch Tyrode đã được sửa đổi. Thiết bị được thiết kế để tăng kích thước lát cắt tim lên 25% diện tích của vòng đỡ. Điều này được thực hiện để các lát cắt tim không bị giãn ra sau khi được chuyển từ dung dịch Tyrode sang môi trường và trong thời kỳ tâm trương. Sử dụng keo histoacrylic, các lát cắt dày 300 µm được cố định trên một vòng đỡ có đường kính 7 mm. Sau khi gắn các lát cắt mô vào vòng đỡ, cắt bỏ các lát cắt mô thừa và đặt các lát cắt mô đã gắn trở lại vào bồn dung dịch Tyrode trên đá (4°C) cho đến khi chuẩn bị đủ các lát cắt cho một thiết bị. Tổng thời gian xử lý cho tất cả các thiết bị không được quá 2 giờ. Sau khi 6 lát cắt mô được gắn vào vòng đỡ của chúng, thiết bị CTCM đã được lắp ráp. Buồng nuôi cấy CTCM được đổ đầy trước 21 ml môi trường đã được oxy hóa trước. Chuyển các phần mô vào buồng nuôi cấy và cẩn thận loại bỏ mọi bọt khí bằng pipet. Sau đó, phần mô được đưa vào lỗ và ấn nhẹ vào đúng vị trí. Cuối cùng, đặt nắp điện cực vào thiết bị và chuyển thiết bị vào lồng ấp. Sau đó, kết nối CTCM với ống khí và hệ thống C-PACE-EM. Bộ truyền động khí nén mở ra và van khí mở CTCM. Hệ thống C-PACE-EM được cấu hình để cung cấp 4 V ở tần số 1,2 Hz trong quá trình tạo nhịp hai pha trong 2 ms. Môi trường được thay đổi hai lần một ngày và các điện cực được thay đổi một lần một ngày để tránh tích tụ than chì trên các điện cực. Nếu cần, có thể lấy các phần mô ra khỏi giếng nuôi cấy của chúng để loại bỏ mọi bọt khí có thể rơi xuống bên dưới chúng. Đối với điều kiện xử lý MT, T3/Dex được thêm mới với mỗi lần thay đổi môi trường bằng 100 nM T3 và 1 μM Dex. Các thiết bị CTCM được nuôi cấy trong lồng ấp ở 37°C và 5% CO2.
Để có được quỹ đạo kéo dài của các lát cắt tim, một hệ thống camera đặc biệt đã được phát triển. Một máy ảnh SLR (Canon Rebel T7i, Canon, Tokyo, Nhật Bản) đã được sử dụng với ống kính macro Navitar Zoom 7000 18-108mm (Navitar, San Francisco, CA). Quá trình hình ảnh hóa được thực hiện ở nhiệt độ phòng sau khi thay môi trường bằng môi trường mới. Máy ảnh được đặt ở góc 51° và video được ghi ở tốc độ 30 khung hình mỗi giây. Đầu tiên, phần mềm nguồn mở (MUSCLEMOTION43) đã được sử dụng với Image-J để định lượng chuyển động của các lát cắt tim. Mặt nạ được tạo bằng MATLAB (MathWorks, Natick, MA, Hoa Kỳ) để xác định các vùng quan tâm cho các lát cắt tim đập để tránh nhiễu. Các mặt nạ phân đoạn thủ công được áp dụng cho tất cả các hình ảnh trong một chuỗi khung hình và sau đó được chuyển đến plug-in MUSCLEMOTION. Muscle Motion sử dụng cường độ trung bình của các pixel trong mỗi khung hình để định lượng chuyển động của nó so với khung tham chiếu. Dữ liệu đã được ghi lại, lọc và sử dụng để định lượng thời gian chu kỳ và đánh giá độ giãn mô trong chu kỳ tim. Video được ghi lại đã được xử lý hậu kỳ bằng bộ lọc kỹ thuật số pha không bậc nhất. Để định lượng độ giãn mô (đỉnh-đến-đỉnh), phân tích đỉnh-đến-đỉnh đã được thực hiện để phân biệt giữa các đỉnh và đáy trong tín hiệu được ghi lại. Ngoài ra, việc khử xu hướng được thực hiện bằng cách sử dụng đa thức bậc 6 để loại bỏ sự trôi tín hiệu. Mã chương trình đã được phát triển trong MATLAB để xác định chuyển động mô toàn cầu, thời gian chu kỳ, thời gian giãn nở và thời gian co lại (Mã chương trình bổ sung 44).
Đối với phân tích biến dạng, sử dụng cùng các video được tạo ra để đánh giá độ giãn cơ học, trước tiên chúng tôi đã theo dõi hai hình ảnh biểu diễn các đỉnh chuyển động (điểm chuyển động cao nhất (trên) và thấp nhất (dưới)) theo phần mềm MUSCLEMOTION. Sau đó, chúng tôi phân đoạn các vùng mô và áp dụng một dạng thuật toán tô bóng cho mô đã phân đoạn (Hình bổ sung 2a). Sau đó, mô đã phân đoạn được chia thành mười bề mặt phụ và ứng suất trên mỗi bề mặt được tính bằng phương trình sau: Biến dạng = (Sup-Sdown)/Sdown, trong đó Sup và Sdown lần lượt là khoảng cách của hình dạng từ bóng trên cùng và bóng dưới cùng của vải (Hình bổ sung .2b).
Các lát cắt tim được cố định trong paraformaldehyd 4% trong 48 giờ. Các mô cố định được khử nước trong sucrose 10% và 20% trong 1 giờ, sau đó trong sucrose 30% qua đêm. Các lát cắt sau đó được nhúng trong hợp chất nhiệt độ cắt tối ưu (hợp chất OCT) và dần dần đông lạnh trong bồn isopentane/đá khô. Bảo quản các khối nhúng OCT ở -80 °C cho đến khi tách ra. Các phiến kính được chuẩn bị dưới dạng các lát cắt có độ dày 8 μm.
Để loại bỏ OCT khỏi các lát cắt tim, hãy làm nóng các phiến kính trên một khối gia nhiệt ở 95 °C trong 5 phút. Thêm 1 ml PBS vào mỗi phiến kính và ủ trong 30 phút ở nhiệt độ phòng, sau đó thấm các lát kính bằng cách đặt 0,1% Triton-X trong PBS trong 15 phút ở nhiệt độ phòng. Để ngăn ngừa các kháng thể không đặc hiệu liên kết với mẫu, hãy thêm 1 ml dung dịch BSA 3% vào các phiến kính và ủ trong 1 giờ ở nhiệt độ phòng. Sau đó, BSA được loại bỏ và các phiến kính được rửa bằng PBS. Đánh dấu từng mẫu bằng bút chì. Kháng thể chính (pha loãng 1:200 trong 1% BSA) (connexin 43 (Abcam; #AB11370), NFATC4 (Abcam; #AB99431) và troponin-T (Thermo Scientific; #MA5-12960) được thêm vào trong hơn 90 phút, sau đó kháng thể thứ cấp (pha loãng 1:200 trong 1% BSA) chống lại chuột Alexa Fluor 488 (Thermo Scientific; #A16079), chống lại thỏ Alexa Fluor 594 (Thermo Scientific; #T6391) trong 90 phút nữa. Rửa 3 lần bằng PBS Để phân biệt nhuộm mục tiêu với nền, chúng tôi chỉ sử dụng kháng thể thứ cấp làm đối chứng. Cuối cùng, nhuộm hạt nhân DAPI được thêm vào và các tiêu bản được đặt trong vectashield (Vector Laboratories) và được phủ kín bằng sơn móng tay. Độ phóng đại -x) và kính hiển vi Keyence có độ phóng đại 40x.
WGA-Alexa Fluor 555 (Thermo Scientific; #W32464) ở nồng độ 5 μg/ml trong PBS được sử dụng để nhuộm WGA và áp dụng cho các phần cố định trong 30 phút ở nhiệt độ phòng. Sau đó, các slide được rửa bằng PBS và Sudan đen được thêm vào từng slide và ủ trong 30 phút. Sau đó, các slide được rửa bằng PBS và thêm môi trường nhúng vectashield. Các slide được quan sát trên kính hiển vi Keyence ở độ phóng đại 40 lần.
OCT được lấy ra khỏi các mẫu như mô tả ở trên. Sau khi lấy OCT ra, nhúng các phiến kính vào dung dịch Bouin qua đêm. Sau đó, rửa sạch các phiến kính bằng nước cất trong 1 giờ và sau đó đặt vào dung dịch axit fuchsin lô hội Bibrich trong 10 phút. Sau đó, rửa các phiến kính bằng nước cất và đặt vào dung dịch phosphomolypden 5%/axit phosphotungstic 5% trong 10 phút. Không rửa sạch, chuyển các phiến kính trực tiếp vào dung dịch xanh anilin trong 15 phút. Sau đó, rửa các phiến kính bằng nước cất và đặt vào dung dịch axit axetic 1% trong 2 phút. Các phiến kính được sấy khô trong etanol 200 N và chuyển vào xylen. Các phiến kính nhuộm màu được quan sát bằng kính hiển vi Keyence có vật kính 10x. Tỷ lệ phần trăm diện tích xơ hóa được định lượng bằng phần mềm Keyence Analyzer.
Xét nghiệm khả năng sống của tế bào CyQUANT™ MTT (Invitrogen, Carlsbad, CA), số danh mục V13154, theo giao thức của nhà sản xuất với một số sửa đổi. Đặc biệt, một mũi đục phẫu thuật có đường kính 6 mm đã được sử dụng để đảm bảo kích thước mô đồng đều trong quá trình phân tích MTT. Các mô được mạ riêng lẻ vào các giếng của một đĩa 12 giếng chứa chất nền MTT theo giao thức của nhà sản xuất. Các lát cắt được ủ ở 37° C trong 3 giờ và mô sống chuyển hóa chất nền MTT để tạo thành hợp chất formazan màu tím. Thay thế dung dịch MTT bằng 1 ml DMSO và ủ ở 37 °C trong 15 phút để chiết xuất formazan màu tím từ các lát cắt tim. Các mẫu được pha loãng theo tỷ lệ 1:10 trong DMSO trong các đĩa đáy trong suốt 96 giếng và cường độ màu tím được đo ở 570 nm bằng máy đọc đĩa Cytation (BioTek). Các chỉ số được chuẩn hóa theo trọng lượng của từng lát cắt tim.
Môi trường lát cắt tim được thay thế bằng môi trường chứa 1 μCi/ml [5-3H]-glucose (Moravek Biochemicals, Brea, CA, Hoa Kỳ) để thử nghiệm sử dụng glucose như đã mô tả trước đây. Sau 4 giờ ủ, thêm 100 µl môi trường vào ống ly tâm nhỏ mở chứa 100 µl HCl 0,2 N. Sau đó, ống được đặt trong ống nhấp nháy chứa 500 μl dH2O để bay hơi [3H]2O trong 72 giờ ở 37°C. Sau đó, lấy ống ly tâm nhỏ ra khỏi ống nhấp nháy và thêm 10 ml dung dịch nhấp nháy. Đếm nhấp nháy được thực hiện bằng máy phân tích nhấp nháy lỏng Tri-Carb 2900TR (Packard Bioscience Company, Meriden, CT, Hoa Kỳ). Sau đó, việc sử dụng glucose được tính toán có tính đến hoạt động cụ thể của [5-3H]-glucose, trạng thái cân bằng và nền không hoàn chỉnh, pha loãng [5-3H]-glucose không được đánh dấu và hiệu quả phản ứng nhấp nháy. Dữ liệu được chuẩn hóa theo khối lượng của các phần của tim.
Sau khi đồng nhất mô trong Trizol, RNA được phân lập từ các phần tim bằng Qiagen miRNeasy Micro Kit #210874 theo giao thức của nhà sản xuất. Chuẩn bị thư viện RNAsec, giải trình tự và phân tích dữ liệu được thực hiện như sau:
1 μg RNA trên mỗi mẫu được sử dụng làm vật liệu khởi đầu để chuẩn bị thư viện RNA. Thư viện giải trình tự được tạo ra bằng Bộ chuẩn bị thư viện RNA NEBNext UltraTM cho Illumina (NEB, Hoa Kỳ) theo khuyến nghị của nhà sản xuất và mã chỉ mục được thêm vào trình tự thuộc tính cho mỗi mẫu. Tóm lại, mRNA được tinh chế từ tổng RNA bằng cách sử dụng các hạt từ tính gắn với oligonucleotide poly-T. Phân mảnh được thực hiện bằng cách sử dụng các cation hóa trị hai ở nhiệt độ cao trong Đệm phản ứng tổng hợp sợi đầu tiên NEBNext (5X). cDNA sợi đầu tiên được tổng hợp bằng cách sử dụng các đoạn mồi hexamer ngẫu nhiên và phiên mã ngược M-MuLV (RNase H-). Sau đó, cDNA sợi thứ hai được tổng hợp bằng cách sử dụng DNA polymerase I và RNase H. Các phần nhô ra còn lại được chuyển thành đầu tù nhờ hoạt động của exonuclease/polymerase. Sau khi adenyl hóa đầu 3' của đoạn DNA, một Bộ chuyển đổi NEBNext có cấu trúc vòng kẹp tóc được gắn vào nó để chuẩn bị cho quá trình lai. Để lựa chọn các đoạn cDNA có độ dài ưa thích 150-200 bp. các đoạn thư viện được tinh chế bằng hệ thống AMPure XP (Beckman Coulter, Beverly, Hoa Kỳ). Sau đó, 3 μl Enzyme USER (NEB, Hoa Kỳ) với cDNA được chọn kích thước được nối bằng bộ chuyển đổi được sử dụng trong 15 phút ở 37°C và sau đó trong 5 phút ở 95°C trước khi PCR. Sau đó, PCR được thực hiện bằng cách sử dụng Phusion High-Fidelity DNA polymerase, các đoạn mồi PCR phổ biến và các đoạn mồi Index (X). Cuối cùng, các sản phẩm PCR được tinh chế (hệ thống AMPure XP) và chất lượng thư viện được đánh giá trên hệ thống Agilent Bioanalyzer 2100. Sau đó, thư viện cDNA được giải trình tự bằng máy giải trình tự Novaseq. Các tệp hình ảnh thô từ Illumina được chuyển đổi thành các bản đọc thô bằng cách sử dụng CASAVA Base Calling. Dữ liệu thô được lưu trữ trong các tệp định dạng FASTQ(fq) chứa các trình tự đã đọc và các đặc tính của bazơ tương ứng. Chọn HISAT2 để khớp các bản đọc giải trình tự đã lọc với bộ gen tham chiếu Sscrofa11.1. Nhìn chung, HISAT2 hỗ trợ bộ gen có bất kỳ kích thước nào, bao gồm bộ gen lớn hơn 4 tỷ bazơ và các giá trị mặc định được đặt cho hầu hết các tham số. Các lần đọc ghép nối từ dữ liệu RNA Seq có thể được căn chỉnh hiệu quả bằng HISAT2, hệ thống nhanh nhất hiện có, với độ chính xác tương đương hoặc tốt hơn bất kỳ phương pháp nào khác.
Sự phong phú của các bản sao phản ánh trực tiếp mức độ biểu hiện gen. Mức độ biểu hiện gen được đánh giá bằng sự phong phú của các bản sao (số lượng giải trình tự) liên quan đến bộ gen hoặc exon. Số lần đọc tỷ lệ thuận với mức độ biểu hiện gen, chiều dài gen và độ sâu giải trình tự. FPKM (các đoạn trên một nghìn cặp bazơ của bản sao được giải trình tự trên một triệu cặp bazơ) đã được tính toán và các giá trị P của biểu hiện khác biệt đã được xác định bằng cách sử dụng gói DESeq2. Sau đó, chúng tôi đã tính toán tỷ lệ phát hiện sai (FDR) cho mỗi giá trị P bằng phương pháp Benjamini-Hochberg9 dựa trên hàm R tích hợp “p.adjust”.
RNA được phân lập từ các phần tim được chuyển đổi thành cDNA ở nồng độ 200 ng/μl bằng cách sử dụng hỗn hợp SuperScript IV Vilo Master từ Thermo (Thermo, số cat. 11756050). RT-PCR định lượng được thực hiện bằng cách sử dụng tấm phản ứng trong suốt 384 giếng Endura Plate Microamp của Applied Biosystems (Thermo, số cat. 4483319) và chất kết dính quang học microamp (Thermo, số cat. 4311971). Hỗn hợp phản ứng bao gồm 5 µl hỗn hợp Taqman Fast Advanced Master (Thermo, số cat. 4444557), 0,5 µl Taqman Primer và 3,5 µl H2O được trộn đều cho mỗi giếng. Các chu trình qPCR chuẩn được chạy và các giá trị CT được đo bằng thiết bị PCR thời gian thực Quantstudio 5 của Applied Biosystems (mô-đun 384 giếng; sản phẩm số A28135). Các mồi Taqman được mua từ Thermo (GAPDH (Ss03375629_u1), PARP12 (Ss06908795_m1), PKDCC (Ss06903874_m1), CYGB (Ss06900188_m1), RGL1 (Ss06868890_m1), ACTN1 (Ss01009508_mH), GATA4 (Ss03383805_u1), GJA1 (Ss03374839_u1), COL1A2 (Ss03375009_u1), COL3A1 (Ss04323794_m1), ACTA2 (Ss04245588_m1) Giá trị CT của tất cả các mẫu đã được chuẩn hóa theo gen quản gia GAPDH.
Bản phát hành phương tiện truyền thông của NT-ProBNP được đánh giá bằng cách sử dụng bộ dụng cụ NT-ProBNP (lợn) (Mã số danh mục MBS2086979, MyBioSource) theo giao thức của nhà sản xuất. Tóm lại, 250 µl của mỗi mẫu và chuẩn được thêm vào mỗi giếng theo bản sao. Ngay sau khi thêm mẫu, thêm 50 µl Thuốc thử xét nghiệm A vào mỗi giếng. Lắc nhẹ đĩa và niêm phong bằng chất bịt kín. Sau đó, các viên thuốc được ủ ở 37°C trong 1 giờ. Sau đó, hút dung dịch và rửa các giếng 4 lần bằng 350 µl dung dịch rửa 1X, ủ dung dịch rửa trong 1-2 phút mỗi lần. Sau đó, thêm 100 µl Thuốc thử xét nghiệm B vào mỗi giếng và niêm phong bằng chất bịt kín đĩa. Lắc nhẹ viên thuốc và ủ ở 37°C trong 30 phút. Hút dung dịch và rửa giếng 5 lần bằng 350 µl dung dịch rửa 1X. Thêm 90 µl dung dịch nền vào mỗi giếng và đậy kín đĩa. Ủ đĩa ở 37°C trong 10-20 phút. Thêm 50 µl dung dịch dừng phản ứng vào mỗi giếng. Đĩa được đo ngay lập tức bằng máy đọc đĩa Cytation (BioTek) được đặt ở 450 nm.
Phân tích công suất được thực hiện để chọn quy mô nhóm sẽ cung cấp >80% công suất để phát hiện sự thay đổi tuyệt đối 10% trong tham số với tỷ lệ lỗi loại I là 5%. Phân tích công suất được thực hiện để chọn kích thước nhóm sẽ cung cấp >80% công suất để phát hiện sự thay đổi tuyệt đối 10% trong tham số với tỷ lệ lỗi loại I là 5%. Анализ мощности был выполнен для выбора размеров групп, которые обеспечат >80% số tiền hiện có обнаружения 10% tỷ lệ tín dụng tỷ lệ chi tiêu là 5% cho khoản vay I. Phân tích công suất được thực hiện để lựa chọn quy mô nhóm có thể cung cấp >80% công suất để phát hiện 10% thay đổi tham số tuyệt đối với tỷ lệ lỗi loại I là 5%.进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10%进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10% Bạn có thể tiết kiệm được một khoản tiền lớn để có được khoản vay > 80% lãi suất tối đa обнаружения 10% tỷ lệ tín dụng khoản vay và 5% khoản vay của tôi I. Phân tích công suất đã được thực hiện để chọn quy mô nhóm có thể cung cấp >80% công suất để phát hiện 10% thay đổi tham số tuyệt đối và tỷ lệ lỗi loại I là 5%.Các phần mô được chọn ngẫu nhiên trước khi thử nghiệm. Tất cả các phân tích đều mù tình trạng và các mẫu chỉ được giải mã sau khi tất cả dữ liệu đã được phân tích. Phần mềm GraphPad Prism (San Diego, CA) được sử dụng để thực hiện tất cả các phân tích thống kê. Đối với tất cả các số liệu thống kê, giá trị p được coi là có ý nghĩa ở mức giá trị <0,05. Đối với tất cả các số liệu thống kê, giá trị p được coi là có ý nghĩa ở mức giá trị <0,05. Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. Đối với tất cả các số liệu thống kê, giá trị p được coi là có ý nghĩa ở mức giá trị <0,05.对于所有统计数据,p 值在值<0.05 时被认为是显着的。对于所有统计数据,p 值在值<0.05 时被认为是显着的。 Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. Đối với tất cả các số liệu thống kê, giá trị p được coi là có ý nghĩa ở mức giá trị <0,05.Kiểm định t của Student hai đuôi được thực hiện trên dữ liệu chỉ có 2 phép so sánh. Phân tích phương sai một chiều hoặc hai chiều được sử dụng để xác định ý nghĩa giữa nhiều nhóm. Khi thực hiện các phép thử sau hoc, hiệu chỉnh Tukey được áp dụng để tính đến nhiều phép so sánh. Dữ liệu RNAsec có những cân nhắc thống kê đặc biệt khi tính toán FDR và ​​p.adjust như mô tả trong phần Phương pháp.
Để biết thêm thông tin về thiết kế nghiên cứu, hãy xem bản tóm tắt Báo cáo nghiên cứu thiên nhiên có liên kết đến bài viết này.