Cảm ơn bạn đã ghé thăm Nature.com. Phiên bản trình duyệt bạn đang sử dụng có hỗ trợ CSS hạn chế. Để có trải nghiệm tốt nhất, chúng tôi khuyên bạn nên sử dụng trình duyệt được cập nhật (hoặc tắt Chế độ tương thích trong Internet Explorer). Trong thời gian chờ đợi, để đảm bảo hỗ trợ liên tục, chúng tôi sẽ hiển thị trang web mà không có kiểu dáng và JavaScript.
Cần có một hệ thống nuôi cấy in vitro đáng tin cậy có thể tái tạo chính xác môi trường sinh lý của tim để thử nghiệm thuốc. Sự hạn chế về nguồn cung cấp các hệ thống nuôi cấy mô tim người đã dẫn đến những diễn giải không chính xác về tác dụng của thuốc lên tim. Ở đây, chúng tôi đã phát triển một mô hình nuôi cấy mô tim (CTCM) kích thích điện cơ các lát cắt tim và trải qua sự kéo giãn sinh lý trong các pha tâm thu và tâm trương của chu kỳ tim. Sau 12 ngày nuôi cấy, phương pháp này đã cải thiện một phần khả năng sống sót của các lát cắt tim, nhưng không hoàn toàn bảo tồn được cấu trúc toàn vẹn của chúng. Do đó, sau khi sàng lọc các phân tử nhỏ, chúng tôi nhận thấy rằng việc bổ sung 100 nM triiodothyronine (T3) và 1 μM dexamethasone (Dex) vào môi trường nuôi cấy đã duy trì được cấu trúc vi mô của các lát cắt trong 12 ngày. Kết hợp với điều trị bằng T3/Dex, hệ thống CTCM duy trì được hồ sơ phiên mã, khả năng sống sót, hoạt động trao đổi chất và tính toàn vẹn cấu trúc ở mức độ tương đương với mô tim tươi trong 12 ngày. Ngoài ra, việc kéo căng quá mức mô tim trong môi trường nuôi cấy gây ra tín hiệu phì đại tim, cung cấp bằng chứng cho khả năng của CTCM trong việc mô phỏng các điều kiện phì đại do kéo căng tim gây ra. Tóm lại, CTCM có thể mô phỏng sinh lý và bệnh lý của tim trong môi trường nuôi cấy trong thời gian dài, cho phép sàng lọc thuốc đáng tin cậy.
Trước khi tiến hành nghiên cứu lâm sàng, cần có các hệ thống nuôi cấy tế bào trong ống nghiệm đáng tin cậy có thể tái tạo chính xác môi trường sinh lý của tim người. Các hệ thống này cần mô phỏng sự thay đổi về độ giãn cơ học, nhịp tim và các đặc tính điện sinh lý. Mô hình động vật thường được sử dụng làm nền tảng sàng lọc sinh lý tim mạch nhưng độ tin cậy trong việc phản ánh tác dụng của thuốc trên tim người còn hạn chế^1,2. Cuối cùng, Mô hình Thực nghiệm Nuôi cấy Mô Tim Lý tưởng (CTCM) là một mô hình có độ nhạy và độ đặc hiệu cao đối với nhiều can thiệp điều trị và dược lý khác nhau, tái tạo chính xác sinh lý và bệnh lý của tim người³. Sự thiếu vắng một hệ thống như vậy đã hạn chế việc phát hiện ra các phương pháp điều trị mới cho suy tim^4,5 và dẫn đến độc tính tim mạch của thuốc là lý do chính khiến thuốc bị loại khỏi thị trường⁶.
Trong thập kỷ qua, tám loại thuốc không liên quan đến tim mạch đã bị rút khỏi sử dụng lâm sàng vì chúng gây kéo dài khoảng QT dẫn đến rối loạn nhịp thất và đột tử7. Do đó, ngày càng cần các chiến lược sàng lọc tiền lâm sàng đáng tin cậy để đánh giá hiệu quả và độc tính tim mạch. Việc sử dụng gần đây các tế bào cơ tim có nguồn gốc từ tế bào gốc đa năng cảm ứng ở người (hiPS-CM) trong sàng lọc thuốc và thử nghiệm độc tính đã giải quyết được một phần vấn đề này. Tuy nhiên, bản chất chưa trưởng thành của hiPS-CM và sự thiếu phức tạp đa tế bào của mô tim là những hạn chế chính của phương pháp này. Các nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng hạn chế này có thể được khắc phục một phần bằng cách sử dụng hiPS-CM giai đoạn sớm để tạo thành hydrogel mô tim ngay sau khi bắt đầu co bóp tự phát và tăng dần kích thích điện theo thời gian. Tuy nhiên, các mô vi mô hiPS-CM này thiếu các đặc tính điện sinh lý và co bóp trưởng thành của cơ tim người trưởng thành. Ngoài ra, mô tim người có cấu trúc phức tạp hơn, bao gồm hỗn hợp không đồng nhất của các loại tế bào khác nhau, bao gồm tế bào nội mô, tế bào thần kinh và nguyên bào sợi mô đệm, được kết nối với nhau bởi các bộ protein ma trận ngoại bào đặc hiệu. Sự không đồng nhất của các quần thể tế bào không phải tế bào cơ tim11,12,13 trong tim động vật có vú trưởng thành là một rào cản lớn đối với việc mô hình hóa mô tim bằng cách sử dụng các loại tế bào riêng lẻ. Những hạn chế lớn này nhấn mạnh tầm quan trọng của việc phát triển các phương pháp nuôi cấy mô cơ tim nguyên vẹn trong điều kiện sinh lý và bệnh lý.
Các lát cắt mỏng (300 µm) được nuôi cấy từ tim người đã được chứng minh là một mô hình đầy hứa hẹn cho cơ tim người nguyên vẹn. Phương pháp này cung cấp khả năng tiếp cận một hệ thống đa tế bào 3D hoàn chỉnh tương tự như mô tim người. Tuy nhiên, cho đến năm 2019, việc sử dụng các lát cắt tim được nuôi cấy bị hạn chế bởi thời gian sống sót ngắn (24 giờ). Điều này là do một số yếu tố bao gồm thiếu sự kéo giãn cơ học vật lý, giao diện không khí-chất lỏng và việc sử dụng môi trường đơn giản không đáp ứng được nhu cầu của mô tim. Năm 2019, một số nhóm nghiên cứu đã chứng minh rằng việc kết hợp các yếu tố cơ học vào hệ thống nuôi cấy mô tim có thể kéo dài thời gian nuôi cấy, cải thiện biểu hiện tim và mô phỏng bệnh lý tim. Hai nghiên cứu xuất sắc 17 và 18 cho thấy tải trọng cơ học đơn trục có tác động tích cực đến kiểu hình tim trong quá trình nuôi cấy. Tuy nhiên, các nghiên cứu này không sử dụng tải trọng cơ học vật lý ba chiều động của chu kỳ tim, vì các lát cắt tim được tải bằng lực căng đẳng trương 17 hoặc tải trọng auxotonic tuyến tính 18. Các phương pháp kéo giãn mô này dẫn đến sự ức chế nhiều gen tim hoặc sự biểu hiện quá mức của các gen liên quan đến phản ứng kéo giãn bất thường. Đáng chú ý, Pitoulis et al. 19 đã phát triển một bể nuôi cấy lát cắt tim động để tái tạo chu kỳ tim bằng cách sử dụng phản hồi từ bộ chuyển đổi lực và các bộ truyền động lực căng. Mặc dù hệ thống này cho phép mô hình hóa chu kỳ tim trong ống nghiệm chính xác hơn, nhưng sự phức tạp và năng suất thấp của phương pháp đã hạn chế ứng dụng của hệ thống này. Phòng thí nghiệm của chúng tôi gần đây đã phát triển một hệ thống nuôi cấy đơn giản hơn bằng cách sử dụng kích thích điện và môi trường được tối ưu hóa để duy trì khả năng sống của các lát cắt mô tim lợn và người trong tối đa 6 ngày20,21.
Trong bài báo này, chúng tôi mô tả một mô hình nuôi cấy mô tim (CTCM) sử dụng các lát cắt của tim lợn, kết hợp các tín hiệu thể dịch để tái tạo sinh lý tim ba chiều và sự giãn nở bệnh lý trong chu kỳ tim. Mô hình CTCM này có thể nâng cao độ chính xác của dự đoán thuốc tiền lâm sàng lên mức chưa từng đạt được trước đây bằng cách cung cấp một hệ thống tim hiệu quả về chi phí, năng suất trung bình, mô phỏng sinh lý/bệnh lý của tim động vật có vú để thử nghiệm thuốc tiền lâm sàng.
Các tín hiệu cơ học huyết động đóng vai trò quan trọng trong việc duy trì chức năng tế bào cơ tim trong ống nghiệm 22,23,24. Trong bài báo này, chúng tôi đã phát triển một hệ thống CTCM (Hình 1a) có thể mô phỏng môi trường tim người trưởng thành bằng cách tạo ra cả kích thích điện và cơ học ở tần số sinh lý (1,2 Hz, 72 nhịp/phút). Để tránh tình trạng mô bị kéo giãn quá mức trong thì tâm trương, một thiết bị in 3D đã được sử dụng để tăng kích thước mô lên 25% (Hình 1b). Nhịp tim điện do hệ thống C-PACE tạo ra được hẹn giờ bắt đầu 100 ms trước thì tâm thu bằng cách sử dụng hệ thống thu thập dữ liệu để tái tạo hoàn toàn chu kỳ tim. Hệ thống nuôi cấy mô sử dụng một bộ truyền động khí nén có thể lập trình (LB Engineering, Đức) để giãn nở màng silicon mềm dẻo theo chu kỳ, gây ra sự giãn nở của các lát cắt tim ở buồng trên. Hệ thống được kết nối với đường dẫn khí bên ngoài thông qua một bộ chuyển đổi áp suất, cho phép điều chỉnh chính xác áp suất (± 1 mmHg) và thời gian (± 1 ms) (Hình 1c).
a Gắn phần mô vào vòng đỡ 7 mm (màu xanh lam) bên trong buồng nuôi cấy của thiết bị. Buồng nuôi cấy được ngăn cách với buồng khí bằng một màng silicon mỏng, linh hoạt. Đặt một miếng đệm giữa mỗi buồng để ngăn rò rỉ. Nắp của thiết bị chứa các điện cực than chì cung cấp kích thích điện. b Sơ đồ mô tả thiết bị mô lớn, vòng dẫn hướng và vòng đỡ. Các phần mô (màu nâu) được đặt trên thiết bị quá khổ với vòng dẫn hướng được đặt trong rãnh ở cạnh ngoài của thiết bị. Sử dụng vòng dẫn hướng, cẩn thận đặt vòng đỡ được phủ chất kết dính acrylic mô lên trên phần mô tim. c Đồ thị thể hiện thời gian kích thích điện theo chức năng của áp suất buồng khí được điều khiển bởi bộ truyền động khí nén lập trình (PPD). Một thiết bị thu thập dữ liệu được sử dụng để đồng bộ hóa kích thích điện bằng cách sử dụng cảm biến áp suất. Khi áp suất trong buồng nuôi cấy đạt đến ngưỡng đã đặt, một tín hiệu xung được gửi đến C-PACE-EM để kích hoạt kích thích điện. d Hình ảnh bốn CTCM được đặt trên giá đỡ của máy ấp trứng. Bốn thiết bị được kết nối với một PPD thông qua một mạch khí nén, và các cảm biến áp suất được lắp vào van cầm máu để theo dõi áp suất trong mạch khí nén. Mỗi thiết bị chứa sáu phần mô.
Sử dụng một bộ truyền động khí nén duy nhất, chúng tôi có thể điều khiển 4 thiết bị CTCM, mỗi thiết bị có thể giữ 6 lát cắt mô (Hình 1d). Trong CTCM, áp suất không khí trong buồng khí được chuyển đổi thành áp suất đồng bộ trong buồng chất lỏng và gây ra sự giãn nở sinh lý của lát cắt tim (Hình 2a và Video bổ sung 1). Đánh giá độ giãn của mô ở áp suất 80 mm Hg cho thấy các lát cắt mô bị giãn 25% (Hình 2b). Tỷ lệ giãn này được chứng minh là tương ứng với chiều dài sarcomere sinh lý là 2,2–2,3 µm đối với khả năng co bóp bình thường của lát cắt tim17,19,25. Chuyển động của mô được đánh giá bằng cách sử dụng cài đặt camera tùy chỉnh (Hình bổ sung 1). Biên độ và vận tốc chuyển động của mô (Hình 2c, d) tương ứng với độ giãn trong chu kỳ tim và thời gian trong thì tâm thu và tâm trương (Hình 2b). Độ giãn và vận tốc của mô tim trong quá trình co bóp và giãn nở vẫn không đổi trong 12 ngày nuôi cấy (Hình 2f). Để đánh giá tác động của kích thích điện lên khả năng co bóp trong quá trình nuôi cấy, chúng tôi đã phát triển một phương pháp xác định biến dạng chủ động bằng thuật toán tô bóng (Hình bổ sung 2a,b) và có thể phân biệt giữa các biến dạng có và không có kích thích điện. Cùng một phần của tim (Hình 2f). Trong vùng chuyển động của vết cắt (R6-9), điện áp trong quá trình kích thích điện cao hơn 20% so với khi không có kích thích điện, điều này cho thấy sự đóng góp của kích thích điện vào chức năng co bóp.
Các đường biểu diễn đại diện của áp suất buồng khí, áp suất buồng chất lỏng và các phép đo chuyển động mô xác nhận rằng sự thay đổi áp suất buồng làm thay đổi áp suất buồng chất lỏng, gây ra chuyển động tương ứng của lát cắt mô. b Các đường biểu diễn đại diện của phần trăm giãn (màu xanh lam) của các lát cắt mô tương ứng với phần trăm giãn (màu cam). c Chuyển động đo được của lát cắt tim phù hợp với tốc độ chuyển động đo được. (d) Quỹ đạo đại diện của chuyển động tuần hoàn (đường màu xanh lam) và vận tốc (đường chấm màu cam) trong một lát cắt tim. e Định lượng thời gian chu kỳ (n = 19 lát cắt mỗi nhóm, từ các con lợn khác nhau), thời gian co bóp (n = 19 lát cắt mỗi nhóm), thời gian giãn (n = 19 lát cắt mỗi nhóm, từ các con lợn khác nhau), chuyển động mô (n = 25 lát cắt/nhóm từ các con lợn khác nhau), vận tốc tâm thu cực đại (n = 24 (D0), 25 (D12) lát cắt/nhóm từ các con lợn khác nhau) và tốc độ giãn cực đại (n = 24 (D0), 25 (D12) lát cắt/nhóm từ các con lợn khác nhau). Kiểm định t-test hai phía của Student cho thấy không có sự khác biệt đáng kể ở bất kỳ thông số nào. f. Các đường biểu diễn phân tích biến dạng điển hình của các lát cắt mô có (màu đỏ) và không có (màu xanh) kích thích điện, mười vùng khác nhau của các lát cắt mô từ cùng một phần. Các bảng phía dưới cho thấy định lượng sự khác biệt phần trăm về biến dạng trong các lát cắt mô có và không có kích thích điện ở mười vùng khác nhau từ các phần khác nhau. (n = 8 lát cắt/nhóm từ các con lợn khác nhau, thực hiện kiểm định t-test hai phía của Student; ****p < 0,0001, **p < 0,01, *p < 0,05). (n = 8 lát cắt/nhóm từ các con lợn khác nhau, thực hiện kiểm định t-test hai phía của Student; ****p < 0,0001, **p < 0,01, *p < 0,05). (n = 8 срезов/группу от разных свиней, проводится двусторонний t-критерий Стьюдента; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05). (n = 8 phần/nhóm từ các con lợn khác nhau, kiểm định t hai phía của Student; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05). （n = 8 片/组,来自不同的猪,进行双尾学生t 检验；****p < 0,0001,**p < 0,01,*p < 0,05)。 （n = 8 片/组,来自不同的猪,进行双尾学生t 检验；****p < 0,0001,**p < 0,01,*p < 0,05)。 (n = 8 срезов/группу, от разных свиней, двусторонний критерий Стьюдента; ****p <0,0001, **p <0,01, *p <0,05). (n = 8 phần/nhóm, từ các con lợn khác nhau, kiểm định t hai phía của Student; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05).Các vạch sai số biểu thị giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn.
Trong hệ thống nuôi cấy lát cắt tim mô phỏng sinh học tĩnh trước đây của chúng tôi [20, 21], chúng tôi đã duy trì khả năng sống, chức năng và tính toàn vẹn cấu trúc của các lát cắt tim trong 6 ngày bằng cách áp dụng kích thích điện và tối ưu hóa thành phần môi trường. Tuy nhiên, sau 10 ngày, các chỉ số này giảm mạnh. Chúng tôi sẽ gọi các lát cắt được nuôi cấy trong hệ thống nuôi cấy mô phỏng sinh học tĩnh trước đây của chúng tôi [20, 21] là điều kiện kiểm soát (Ctrl) và chúng tôi sẽ sử dụng môi trường đã được tối ưu hóa trước đây của chúng tôi làm điều kiện MC và nuôi cấy dưới sự kích thích cơ học và điện đồng thời (CTCM). Đầu tiên, chúng tôi xác định rằng kích thích cơ học mà không có kích thích điện là không đủ để duy trì khả năng sống của mô trong 6 ngày (Hình bổ sung 3a,b). Điều thú vị là, với việc đưa vào kích thích sinh lý-cơ học và điện bằng cách sử dụng STCM, khả năng sống của các lát cắt tim 12 ngày vẫn giữ nguyên như ở các lát cắt tim tươi trong điều kiện MS, nhưng không phải trong điều kiện Ctrl, như được thể hiện bằng phân tích MTT (Hình 1). 3a). Điều này cho thấy rằng kích thích cơ học và mô phỏng chu kỳ tim có thể giữ cho các lát cắt mô sống lâu gấp đôi so với báo cáo trong hệ thống nuôi cấy tĩnh trước đây của chúng tôi. Tuy nhiên, việc đánh giá tính toàn vẹn cấu trúc của các lát cắt mô bằng cách nhuộm miễn dịch troponin T tim và connexin 43 cho thấy biểu hiện connexin 43 cao hơn đáng kể trong mô MC vào ngày thứ 12 so với nhóm đối chứng cùng ngày. Tuy nhiên, biểu hiện connexin 43 đồng nhất và sự hình thành đĩa Z không được duy trì hoàn toàn (Hình 3b). Chúng tôi sử dụng khung trí tuệ nhân tạo (AI) để định lượng tính toàn vẹn cấu trúc mô26, một quy trình học sâu dựa trên hình ảnh dựa trên nhuộm troponin-T và connexin43 để tự động định lượng tính toàn vẹn cấu trúc và huỳnh quang của các lát cắt tim về cường độ định vị. Phương pháp này sử dụng Mạng thần kinh tích chập (CNN) và khung học sâu để định lượng một cách đáng tin cậy tính toàn vẹn cấu trúc của mô tim một cách tự động và không thiên vị, như được mô tả trong tài liệu tham khảo. 26. Mô MC cho thấy sự tương đồng về cấu trúc được cải thiện so với ngày 0 so với các lát cắt đối chứng tĩnh. Ngoài ra, nhuộm trichrome của Masson cho thấy tỷ lệ xơ hóa thấp hơn đáng kể trong điều kiện MS so với điều kiện đối chứng vào ngày thứ 12 nuôi cấy (Hình 3c). Mặc dù CTCM làm tăng khả năng sống sót của các lát mô tim vào ngày thứ 12 lên mức tương đương với mô tim tươi, nhưng nó không cải thiện đáng kể tính toàn vẹn cấu trúc của các lát mô tim.
Biểu đồ cột thể hiện định lượng khả năng sống sót của lát cắt tim tươi (D0) hoặc lát cắt tim được nuôi cấy trong 12 ngày trong môi trường nuôi cấy tĩnh (D12 Ctrl) hoặc trong môi trường CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) lát cắt/nhóm từ các con lợn khác nhau, thực hiện kiểm định ANOVA một chiều; ####p < 0,0001 so với D0 và **p < 0,01 so với D12 Ctrl). Biểu đồ cột thể hiện định lượng khả năng sống sót của lát cắt tim tươi (D0) hoặc lát cắt tim được nuôi cấy trong 12 ngày trong môi trường nuôi cấy tĩnh (D12 Ctrl) hoặc trong môi trường CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) lát cắt/nhóm từ các con lợn khác nhau, thực hiện kiểm định ANOVA một chiều; ####p < 0,0001 so với D0 và **p < 0,01 so với D12 Ctrl).Biểu đồ cột thể hiện định lượng khả năng sống sót của các lát cắt tim tươi MTT (D0) hoặc nuôi cấy các lát cắt tim trong 12 ngày trong môi trường nuôi cấy tĩnh (D12 đối chứng) hoặc CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 đối chứng)), 12 (D12 MC) lát cắt/nhóm từ các con lợn khác nhau, một phép thử ANOVA một chiều được thực hiện;####p < 0,0001 по сравнению с D0 и **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p < 0,0001 so với D0 và **p < 0,01 so với D12 Ctrl). a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切片(D0)或心脏切片培养12 天的MTT 活力的量化), 来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；与D0相比,####p < 0,0001,与D12 Ctrl 相比,**p < 0,01)。 a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切片(D0) ,来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；与D0 相比，####p < 0.0001，与D12 Ctrl 相比，**p。)Biểu đồ cột thể hiện định lượng khả năng sống sót của MTT trong các lát cắt tim tươi (D0) hoặc các lát cắt tim được nuôi cấy trong 12 ngày trong môi trường nuôi cấy tĩnh (D12 đối chứng) hoặc CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 đối chứng)), 12 lát cắt (D12 MC)/nhóm từ các con lợn khác nhau, kiểm định ANOVA một chiều;####p < 0,0001 по сравнению с D0, **p < 0,01 по сравнению сравнению с D12 Ctrl). ####p < 0,0001 so với D0, **p < 0,01 so với D12 Ctrl).b Troponin-T (màu xanh lá cây), connexin 43 (màu đỏ) và DAPI (màu xanh lam) trong các lát cắt tim mới được phân lập (D0) hoặc các lát cắt tim được nuôi cấy trong điều kiện tĩnh (Ctrl) hoặc điều kiện CTCM (MC) trong 12 ngày) của các hình ảnh huỳnh quang miễn dịch tiêu biểu (thang đo trống = 100 µm). Định lượng bằng trí tuệ nhân tạo về tính toàn vẹn cấu trúc mô tim (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) lát cắt/nhóm, mỗi nhóm lấy từ một con lợn khác nhau, thực hiện kiểm định ANOVA một chiều; ####p < 0,0001 so với D0 và ****p < 0,0001 so với D12 Ctrl). Định lượng bằng trí tuệ nhân tạo về tính toàn vẹn cấu trúc mô tim (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) lát cắt/nhóm, mỗi nhóm lấy từ các con lợn khác nhau, thực hiện kiểm định ANOVA một chiều; ####p < 0,0001 so với D0 và ****p < 0,0001 so với D12 Ctrl). Độ chính xác của các bước điều chỉnh được thực hiện (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12) MC) срезов/групп от разных свиней, проводится однофакторный тест ANOVA; ####p < 0,0001 по сравнению с D0 и ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). Định lượng tính toàn vẹn cấu trúc của mô tim bằng trí tuệ nhân tạo (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) phần/nhóm từ các con lợn khác nhau, thực hiện kiểm định ANOVA một chiều; ####p < 0,0001 so với D0 và ****p < 0,0001 so với D12 Ctrl).人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) lát/nhóm của mỗi con lợn khác nhau, thử nghiệm ANOVA một chiều;####p < 0,0001 与D0相比,****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比)。人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) lát/nhóm từng con lợn khác nhau, thử nghiệm ANOVA một chiều;####p < 0,0001 与D0相比,*****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比)。 Искусственный интеллект для количественной оценки структурной целостности сердечной ткани (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) срезов/группу каждой из разных свиней, односторонний тест ANOVA; ####p <0,0001 so với D0 Для сравнения ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). Sử dụng trí tuệ nhân tạo để định lượng tính toàn vẹn cấu trúc của mô tim (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) phần/nhóm của các con lợn khác nhau, kiểm định ANOVA một chiều; ####p<0.0001 so với D0. Để so sánh ****p < 0.0001 so với D12 Ctrl). c Hình ảnh đại diện (trái) và định lượng (phải) cho các lát cắt tim được nhuộm bằng thuốc nhuộm trichrome của Masson (Tỷ lệ bản đồ = 500 µm) (n = 10 lát cắt/nhóm, mỗi lát cắt từ một con lợn khác nhau, thực hiện kiểm định ANOVA một chiều; ####p < 0,0001 so với D0 và ***p < 0,001 so với D12 Ctrl). c Hình ảnh đại diện (trái) và định lượng (phải) cho các lát cắt tim được nhuộm bằng thuốc nhuộm trichrome của Masson (Tỷ lệ bản đồ = 500 µm) (n = 10 lát cắt/nhóm, mỗi nhóm từ các con lợn khác nhau, thực hiện kiểm định ANOVA một chiều; #### p < 0,0001 so với D0 và ***p < 0,001 so với D12 Ctrl). c Репрезентативные изображения (слева) và количественная оценка (справа) срезов сердца, окрашенных трихромным красителем Массона (масштаб без покрытия = 500 мкм) (n = 10 срезов/группу от разных свиней, выполняется односторонний тест ANOVA; #### p < 0,0001 по сравнению с D0 và ***p < 0,001 по bằng phím D12 Ctrl). c Hình ảnh đại diện (trái) và định lượng (phải) của các lát cắt tim được nhuộm bằng thuốc nhuộm Masson's trichrome (thang đo không phủ = 500 µm) (n = 10 lát cắt/nhóm từ các con lợn khác nhau, đã thực hiện kiểm định ANOVA một chiều; #### p < 0,0001 so với D0 và ***p < 0,001 so với D12 Ctrl). c 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像（左)和量化（右）（裸尺度= 500 µm）（n = 10个切片/组,每组来自不同的猪,进行单向ANOVA 测试；#### p < 0,0001 与D0 相比,***p < 0,001 与D12 Ctrl相比)。 C 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 (左 左) 量化 （右) 裸尺度 裸尺度 裸尺度裸尺度 = 500 µm) （n = 10 个 切片 组 每 组 来自 不同 猪 , 进行 单向 单向 Anova 测试；#### p < 0,0001与D0 相比,***p < 0,001 与D12 Ctrl 相比)。 c Репрезентативные изображения (слева) và количественный анализ (справа) срезов сердца, окрашенных трихромным красителем Массона (чистая шкала = 500 мкм) (n = 10 срезов/группа, каждый от другой свиньи, протестировано с помощью однофакторного дисперсионного анализа ;### #p < 0,0001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Hình ảnh đại diện (trái) và định lượng (phải) của các lát cắt tim được nhuộm bằng thuốc nhuộm trichrome của Masson (mẫu trắng = 500 µm) (n = 10 lát cắt/nhóm, mỗi lát cắt từ một con lợn khác nhau, được kiểm tra bằng phân tích phương sai một chiều; ### # p < 0,0001 so với D0, ***p < 0,001 so với D12 Ctrl).Các vạch sai số biểu thị giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn.
Chúng tôi giả thuyết rằng bằng cách thêm các phân tử nhỏ vào môi trường nuôi cấy, tính toàn vẹn của tế bào cơ tim có thể được cải thiện và sự phát triển xơ hóa có thể giảm đi trong quá trình nuôi cấy CTCM. Do đó, chúng tôi đã sàng lọc các phân tử nhỏ bằng cách sử dụng các mẫu nuôi cấy đối chứng tĩnh của chúng tôi20,21 do số lượng các yếu tố gây nhiễu ít. Dexamethasone (Dex), triiodothyronine (T3) và SB431542 (SB) đã được chọn cho quá trình sàng lọc này. Các phân tử nhỏ này trước đây đã được sử dụng trong nuôi cấy hiPSC-CM để thúc đẩy sự trưởng thành của tế bào cơ tim bằng cách tăng chiều dài sarcomere, ống T và tốc độ dẫn truyền. Ngoài ra, cả Dex (một loại glucocorticoid) và SB đều được biết là có khả năng ức chế viêm29,30. Do đó, chúng tôi đã thử nghiệm xem việc bổ sung một hoặc kết hợp các phân tử nhỏ này có cải thiện tính toàn vẹn cấu trúc của các lát cắt tim hay không. Đối với quá trình sàng lọc ban đầu, liều lượng của mỗi hợp chất được lựa chọn dựa trên nồng độ thường được sử dụng trong các mô hình nuôi cấy tế bào (1 μM Dex27, 100 nM T327 và 2,5 μM SB31). Sau 12 ngày nuôi cấy, sự kết hợp giữa T3 và Dex đã mang lại tính toàn vẹn cấu trúc tối ưu cho tế bào cơ tim và sự tái cấu trúc xơ hóa tối thiểu (Hình bổ sung 4 và 5). Ngoài ra, việc sử dụng nồng độ T3 và Dex gấp đôi hoặc gấp ba lần các nồng độ này đã gây ra tác dụng có hại so với nồng độ bình thường (Hình bổ sung 6a,b).
Sau khi sàng lọc ban đầu, chúng tôi đã thực hiện so sánh trực tiếp 4 điều kiện nuôi cấy (Hình 4a): Ctrl: các lát cắt tim được nuôi cấy trong môi trường nuôi cấy tĩnh đã được mô tả trước đây của chúng tôi bằng môi trường tối ưu hóa; 20.21 TD: T3 và Ctrl được bổ sung Dex vào thứ Tư; MC: các lát cắt tim được nuôi cấy trong CTCM bằng môi trường tối ưu hóa trước đây của chúng tôi; và MT: CTCM với T3 và Dex được thêm vào môi trường. Sau 12 ngày nuôi cấy, khả năng sống sót của mô MS và MT vẫn giữ nguyên như ở mô tươi được đánh giá bằng xét nghiệm MTT (Hình 4b). Điều thú vị là, việc bổ sung T3 và Dex vào nuôi cấy xuyên màng (TD) không dẫn đến sự cải thiện đáng kể về khả năng sống sót so với điều kiện Ctrl, cho thấy vai trò quan trọng của kích thích cơ học trong việc duy trì khả năng sống sót của các lát cắt tim.
a Sơ đồ thiết kế thí nghiệm mô tả bốn điều kiện nuôi cấy được sử dụng để đánh giá tác động của kích thích cơ học và bổ sung T3/Dex lên môi trường trong 12 ngày. b Biểu đồ cột thể hiện định lượng khả năng sống sót sau 12 ngày nuôi cấy trong cả 4 điều kiện nuôi cấy (Ctrl, TD, MC và MT) so với các lát tim tươi (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD và D12 MT), 12 (D12 MC) lát/nhóm từ các con lợn khác nhau, thực hiện kiểm định ANOVA một chiều; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 so với D0 và **p < 0,01 so với D12 Ctrl). b Biểu đồ cột thể hiện định lượng khả năng sống sót sau 12 ngày nuôi cấy trong cả 4 điều kiện nuôi cấy (Ctrl, TD, MC và MT) so với các lát tim tươi (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD và D12 MT), 12 (D12 MC) lát/nhóm từ các con lợn khác nhau, thực hiện kiểm định ANOVA một chiều; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 so với D0 và **p < 0,01 so với D12 ctrl). b Гистограмма показывает количественную оценку жизнеспособности через 12 дней после культивирования во ngày 4 tháng 8 культивирования (контроль, TD, MC и MT) có thể được sử dụng để điều chỉnh tốc độ (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD и D12 MT), 12 (D12 MC) срезов/группу от разных свиней, sử dụng ANOVA; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 по сравнению с D0 и **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). b Biểu đồ cột thể hiện định lượng khả năng sống sót sau 12 ngày nuôi cấy trong cả 4 điều kiện nuôi cấy (đối chứng, TD, MC và MT) so với các lát cắt tim tươi (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD và D12 MT), 12 (D12 MC) lát cắt/nhóm từ các con lợn khác nhau, kiểm định ANOVA một chiều; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 so với D0 và **p < 0,01 khi so sánh với D12 Ctrl). b 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) (n = 18 (D0)、15 (D12 Ctrl、D12 TD 和D12 MT),来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；####p < 0,0001,###p < 0,001 与D0 相比,**p < 0,01 与D12控制)。b 4 12 (D12 MC) b Гистограмма, показывающая все 4 условия культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD и D12 MT), от разных свиней 12 (D12 MC) срезы/группа, односторонний тест ANOVA; ####p <0,0001, ###p <0,001 по сравнению с D0, **p <0,01 по сравнению с контролем D12). b Biểu đồ cột thể hiện tất cả 4 điều kiện nuôi cấy (kiểm soát, TD, MC và MT) so với các lát cắt tim tươi (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD và D12 MT), từ các con lợn khác nhau 12 (D12 MC) lát cắt/nhóm, kiểm định ANOVA một chiều; ####p<0.0001, ###p<0.001 so với D0, **p<0.01 so với nhóm đối chứng D12). c Biểu đồ cột thể hiện định lượng dòng glucose 12 ngày sau khi nuôi cấy trong cả 4 điều kiện nuôi cấy (Ctrl, TD, MC và MT) so với các lát tim tươi (D0) (n = 6 lát/nhóm từ các con lợn khác nhau, thực hiện kiểm định ANOVA một chiều; ###p < 0,001, so với D0 và ***p < 0,001 so với D12 Ctrl). c Biểu đồ cột thể hiện định lượng dòng glucose 12 ngày sau khi nuôi cấy trong cả 4 điều kiện nuôi cấy (Ctrl, TD, MC và MT) so với các lát tim tươi (D0) (n = 6 lát/nhóm từ các con lợn khác nhau, thực hiện kiểm định ANOVA một chiều; ###p < 0,001, so với D0 và ***p < 0,001 so với D12 Ctrl). c Гистограмма показывает количественную оценку потока через 12 ngày ngày 4 tháng 4 (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 6 срезов/группу от разных свиней, односторонний Выполняется тест ANOVA; ###p < 0,001 по сравнению с D0 и ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Biểu đồ cột thể hiện định lượng dòng glucose 12 ngày sau khi nuôi cấy trong cả 4 điều kiện nuôi cấy (đối chứng, TD, MC và MT) so với các lát cắt tim tươi (D0) (n = 6 lát cắt/nhóm từ các con lợn khác nhau, đã thực hiện kiểm định ANOVA một chiều; ###p < 0,001 so với D0 và ***p < 0,001 so với D12 Ctrl). c 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) 相比，培养后12天的葡萄糖通量定量（n = 6 片/组，来自不同猪，单向执行ANOVA 测试；###p < 0,001,与D0 相比,***p < 0,001与D12 Ctrl 相比)。 C 条形图 显示 所有 4 种 条件 （（ctrl 、 td 、 mc 和 mt) 新鲜 心脏 切片 切片 切片 相比 , 培养 后后 12 天 的 通量 定量 （n = 6 片/组 ` 来自 猪 ` ` ` ` ` ` ` ` ` ` ` 猪 猪单向执行ANOVA 测试；###p < 0,001,与D0 相比,***p < 0,001 与D12 Ctrl 相比)。 c Гистограмма, показывающая количественную оценку потока глюкозы через 12 ngày ngày 4 tháng 8 культивирования (контроль, TD, MC и MT) đã giành được một khoản tiền lớn (D0) (n = 6 срезов/группа, от разных свиней, односторонний Были sử dụng ANOVA; ###p < 0,001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению сравнению с D12 (контроль). c Biểu đồ cột thể hiện định lượng dòng glucose sau 12 ngày nuôi cấy đối với cả 4 điều kiện nuôi cấy (đối chứng, TD, MC và MT) so với các lát cắt tim tươi (D0) (n = 6 lát cắt/nhóm, từ các con lợn khác nhau, một bên). Các phép thử ANOVA đã được thực hiện, ###p < 0,001 so với D0, ***p < 0,001 so với D12 (đối chứng).d. Biểu đồ phân tích biến dạng của mô tươi (màu xanh lam), mô ngày thứ 12 nuôi cấy trong điều kiện tĩnh (màu xanh lục) và mô ngày thứ 12 nuôi cấy trong điều kiện chuyển hóa (màu đỏ) tại mười điểm cắt mô theo vùng (n = 4 lát cắt/nhóm, kiểm định ANOVA một chiều; không có sự khác biệt đáng kể giữa các nhóm). e. Biểu đồ núi lửa thể hiện các gen biểu hiện khác biệt trong các lát cắt tim tươi (D0) so với các lát cắt tim được nuôi cấy trong điều kiện tĩnh (Ctrl) hoặc trong điều kiện chuyển hóa (MT) trong 10-12 ngày. f. Bản đồ nhiệt của các gen sarcomere cho các lát cắt tim được nuôi cấy trong từng điều kiện nuôi cấy. Thanh lỗi biểu thị giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn.
Sự phụ thuộc trao đổi chất vào quá trình chuyển đổi từ oxy hóa axit béo sang đường phân là dấu hiệu đặc trưng của sự mất biệt hóa tế bào cơ tim. Các tế bào cơ tim chưa trưởng thành chủ yếu sử dụng glucose để sản xuất ATP và có ty thể kém phát triển với ít nếp gấp màng trong (cristae)5,32. Phân tích sử dụng glucose cho thấy rằng trong điều kiện MC và MT, mức độ sử dụng glucose tương tự như ở mô ngày 0 (Hình 4c). Tuy nhiên, các mẫu Ctrl cho thấy sự gia tăng đáng kể về mức độ sử dụng glucose so với mô tươi. Điều này cho thấy sự kết hợp giữa CTCM và T3/Dex giúp tăng cường khả năng sống của mô và bảo tồn kiểu hình trao đổi chất của các lát cắt tim được nuôi cấy trong 12 ngày. Ngoài ra, phân tích biến dạng cho thấy mức độ biến dạng vẫn giữ nguyên như ở mô tim tươi trong 12 ngày trong điều kiện MT và MS (Hình 4d).
Để phân tích tác động tổng thể của CTCM và T3/Dex lên toàn bộ cấu trúc phiên mã của mô lát cắt tim, chúng tôi đã thực hiện RNAseq trên các lát cắt tim từ cả bốn điều kiện nuôi cấy khác nhau (Dữ liệu bổ sung 1). Điều thú vị là, các lát cắt MT cho thấy sự tương đồng phiên mã cao với mô tim tươi, chỉ có 16 gen biểu hiện khác biệt trong số 13.642 gen. Tuy nhiên, như chúng tôi đã chỉ ra trước đó, các lát cắt Ctrl cho thấy 1229 gen biểu hiện khác biệt sau 10-12 ngày nuôi cấy (Hình 4e). Dữ liệu này đã được xác nhận bằng qRT-PCR của các gen tim và nguyên bào sợi (Hình bổ sung 7a-c). Điều thú vị là, các lát cắt Ctrl cho thấy sự giảm biểu hiện của các gen tim và chu kỳ tế bào và sự hoạt hóa các chương trình gen viêm. Những dữ liệu này cho thấy rằng sự mất biệt hóa, thường xảy ra sau khi nuôi cấy dài hạn, đã bị giảm thiểu hoàn toàn trong điều kiện MT (Hình bổ sung 8a,b). Nghiên cứu kỹ lưỡng các gen sarcomere cho thấy chỉ trong điều kiện MT thì các gen mã hóa sarcomere (Hình 4f) và kênh ion (Hình bổ sung 9) mới được bảo tồn, giúp chúng không bị ức chế trong điều kiện Ctrl, TD và MC. Dữ liệu này chứng minh rằng với sự kết hợp giữa kích thích cơ học và thể dịch (T3/Dex), hệ gen của lát cắt tim có thể duy trì sự tương đồng với lát cắt tim tươi sau 12 ngày nuôi cấy.
Những phát hiện về phiên mã này được củng cố bởi thực tế là tính toàn vẹn cấu trúc của tế bào cơ tim trong các lát cắt tim được bảo tồn tốt nhất trong điều kiện MT trong 12 ngày, như được thể hiện bằng connexin 43 nguyên vẹn và khu trú (Hình 5a). Ngoài ra, xơ hóa trong các lát cắt tim trong điều kiện MT đã giảm đáng kể so với nhóm đối chứng (Ctrl) và tương tự như các lát cắt tim tươi (Hình 5b). Những dữ liệu này chứng minh rằng sự kết hợp giữa kích thích cơ học và điều trị bằng T3/Dex giúp bảo tồn hiệu quả cấu trúc tim trong các lát cắt tim nuôi cấy.
a Hình ảnh huỳnh quang miễn dịch đại diện của troponin-T (màu xanh lá), connexin 43 (màu đỏ) và DAPI (màu xanh lam) trong các lát cắt tim mới được phân lập (D0) hoặc được nuôi cấy trong 12 ngày trong cả bốn điều kiện nuôi cấy lát cắt tim (thang đo = 100 µm). Định lượng bằng trí tuệ nhân tạo về tính toàn vẹn cấu trúc mô tim (n = 7 (D0 và D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC và D12 MT) lát cắt/nhóm từ các con lợn khác nhau, thực hiện kiểm định ANOVA một chiều; ####p < 0,0001 so với D0 và *p < 0,05, hoặc ****p < 0,0001 so với D12 Ctrl). Định lượng bằng trí tuệ nhân tạo về tính toàn vẹn cấu trúc mô tim (n = 7 (D0 và D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC và D12 MT) lát cắt/nhóm từ các con lợn khác nhau, thực hiện kiểm định ANOVA một chiều; #### p < 0,0001 so với D0 và *p < 0,05, hoặc ****p < 0,0001 so với D12 Ctrl). Tỷ lệ tín dụng của bạn có thể được cung cấp bởi các khoản nợ phải trả (n = 7 (D0 и D12) Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC и D12 MT) срезов/группу bởi vì nó đã được sử dụng bởi ANOVA; #### p < 0,0001 по сравнению с D0 и *p < 0,05 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). Định lượng tính toàn vẹn cấu trúc của mô tim bằng trí tuệ nhân tạo (n = 7 (D0 và D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC và D12 MT) mẫu/nhóm từ các con lợn khác nhau, thực hiện kiểm định ANOVA một chiều; #### p < 0,0001 so với D0 và *p < 0,05 hoặc ****p < 0,0001 so với D12 Ctrl).对不同猪的心脏组织结构完整性（n = 7（D0 和D12 Ctrl）、5（D12 TD、D12 MC 和D12 MT).与D12 Ctrl 相比)。对 不同 猪 的 心脏 结构 完整性 （n = 7 （d0 和 d12 ctrl） （5 （d12 td 、 d12 mc 和 d12 mt) 组） 人工智能量 化 进行 单向 单向 单向 测试 ； ########## p < 0,0001 与D0 和*p < 0,05 相比,或*****p < 0,0001与D12 Ctrl 相比)。Định lượng tính toàn vẹn cấu trúc của mô tim bằng trí tuệ nhân tạo ở các con lợn khác nhau (n = 7 (D0 và D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC và D12 MT) phần/nhóm) với phép thử ANOVA một chiều;#### p < 0,0001 по сравнению с D0 и *p < 0,05 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). #### p < 0,0001 so với D0 và *p < 0,05 hoặc ****p < 0,0001 so với D12 Ctrl). b Hình ảnh đại diện và định lượng cho các lát cắt tim được nhuộm bằng thuốc nhuộm Masson's trichrome (Thang đo = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD và D12 MC), 9 (D12 MT) lát cắt/nhóm từ các con lợn khác nhau, thực hiện kiểm định ANOVA một chiều; ####p < 0,0001 so với D0 và ***p < 0,001, hoặc ****p < 0,0001 so với D12 Ctrl). b Hình ảnh đại diện và định lượng cho các lát cắt tim được nhuộm bằng thuốc nhuộm Masson's trichrome (Thang đo = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD và D12 MC), 9 (D12 MT) lát cắt/nhóm từ các con lợn khác nhau, thực hiện kiểm định ANOVA một chiều; ####p < 0,0001 so với D0 và ***p < 0,001, hoặc ****p < 0,0001 so với D12 Ctrl). b Người quản lý tài sản và người quản lý tài sản của bạn có thể kiếm được nhiều tiền hơn Массона (масштабная линейка = 500 mm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD и D12 MC), 9 (D12 MT) срезов/группу от разных свиней, выполняется односторонний тест ANOVA; ####p < 0,0001 по сравнению с D0 và ***p < 0,001 hoặc ****p < 0,0001 по bằng phím D12 Ctrl). b Hình ảnh đại diện và định lượng các lát cắt tim được nhuộm bằng thuốc nhuộm Masson's trichrome (thang đo = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD và D12 MC), 9 (D12 MT) lát cắt/nhóm từ các con lợn khác nhau, thực hiện phân tích phương sai một chiều; ####p < 0,0001 so với D0 và ***p < 0,001 hoặc ****p < 0,0001 so với D12 Ctrl). b 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像和量化（比例尺= 500 µm)（n = 10（D0、D12 Ctrl、D12 TD和D12 MC), 来自不同猪的9 个（D12 MT)切片/组,进行单因素方差分析；####p < 0.0001 与D0 相比,***p < 0,001,或****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比)。 b 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 和 量化 （比例 尺 尺 尺 = 500 µm) （n = 10 （d0 、 d12 ctrl 、 d12 td 和 d12 mc) 来自 不同 的 9 个 d12 mt 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片hình ảnh ####p < 0,0001 与D0相比,***p < 0,001,或****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比)。 b Người quản lý tài sản và người quản lý tài sản của bạn có thể kiếm được nhiều tiền hơn (mасштабная линейка = 500 mкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD và D12 MC), 9 (D12 MT) срезов от разных свиней / группы, один- способ ANOVA; ####p < 0,0001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). b Hình ảnh đại diện và định lượng các lát cắt tim được nhuộm bằng thuốc nhuộm Masson's trichrome (thang đo = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD và D12 MC), 9 (D12 MT) lát cắt từ các con lợn khác nhau/nhóm, một phương pháp ANOVA; ####p < 0,0001 so với D0, ***p < 0,001 hoặc ****p < 0,0001 so với D12 Ctrl).Các vạch sai số biểu thị giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn.
Cuối cùng, khả năng của CTCM trong việc mô phỏng phì đại tim được đánh giá bằng cách tăng độ căng của mô tim. Trong CTCM, áp suất buồng khí cực đại tăng từ 80 mmHg lên 80 mmHg (độ căng bình thường) đến 140 mmHg (Hình 6a). Điều này tương ứng với mức tăng độ căng 32% (Hình 6b), trước đây đã được chứng minh là tỷ lệ phần trăm độ căng cần thiết để các lát cắt tim đạt được chiều dài sarcomere tương tự như thấy trong phì đại. Độ căng và vận tốc của mô tim trong quá trình co và giãn vẫn không đổi trong sáu ngày nuôi cấy (Hình 6c). Mô tim từ điều kiện MT được đặt trong điều kiện căng bình thường (MT (Normal)) hoặc điều kiện căng quá mức (MT (OS)) trong sáu ngày. Chỉ sau bốn ngày nuôi cấy, dấu ấn sinh học phì đại NT-ProBNP đã tăng đáng kể trong môi trường nuôi cấy trong điều kiện MT (OS) so với điều kiện MT (bình thường) (Hình 7a). Ngoài ra, sau sáu ngày nuôi cấy, kích thước tế bào trong MT (OS) (Hình 7b) tăng lên đáng kể so với các phần của tim MT (bình thường). Thêm vào đó, sự dịch chuyển hạt nhân NFATC4 tăng lên đáng kể trong các mô bị kéo giãn quá mức (Hình 7c). Những kết quả này cho thấy sự phát triển dần dần của quá trình tái cấu trúc bệnh lý sau khi giãn quá mức và ủng hộ quan điểm rằng thiết bị CTCM có thể được sử dụng như một nền tảng để nghiên cứu tín hiệu phì đại tim do kéo giãn gây ra.
Các đường biểu diễn đại diện của áp suất buồng khí, áp suất buồng chất lỏng và các phép đo chuyển động mô xác nhận rằng sự thay đổi áp suất buồng làm thay đổi áp suất buồng chất lỏng, gây ra chuyển động tương ứng của lát mô. b Các đường cong phần trăm giãn và tốc độ giãn đại diện cho các lát mô được kéo giãn bình thường (màu cam) và kéo giãn quá mức (màu xanh). c Biểu đồ cột thể hiện thời gian chu kỳ (n = 19 lát cắt mỗi nhóm, từ các con lợn khác nhau), thời gian co thắt (n = 18-19 lát cắt mỗi nhóm, từ các con lợn khác nhau), thời gian giãn (n = 19 lát cắt mỗi nhóm, từ các con lợn khác nhau), biên độ chuyển động của mô (n = 14 lát cắt/nhóm, từ các con lợn khác nhau), vận tốc tâm thu cực đại (n = 14 lát cắt/nhóm, từ các con lợn khác nhau) và tốc độ giãn cực đại (n = 14 (D0), 15 (D6)) lát cắt/nhóm từ các con lợn khác nhau), phép thử t hai phía của Student cho thấy không có sự khác biệt đáng kể ở bất kỳ thông số nào, cho thấy các thông số này vẫn không đổi trong 6 ngày nuôi cấy với điện áp quá cao. Các thanh lỗi biểu thị giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn.
Biểu đồ cột thể hiện định lượng nồng độ NT-ProBNP trong môi trường nuôi cấy từ các lát cắt tim được nuôi cấy trong điều kiện kéo giãn bình thường (Norm) hoặc kéo giãn quá mức (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm và D4 MTOS) lát cắt/nhóm từ các con lợn khác nhau, phân tích ANOVA hai chiều được thực hiện; **p < 0,01 so với điều kiện kéo giãn bình thường). Biểu đồ cột thể hiện định lượng nồng độ NT-ProBNP trong môi trường nuôi cấy từ các lát cắt tim được nuôi cấy trong điều kiện kéo giãn bình thường (Norm) hoặc kéo giãn quá mức (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm và D4 MTOS) lát cắt/nhóm từ các con lợn khác nhau, phân tích ANOVA hai chiều được thực hiện; **p < 0,01 so với điều kiện kéo giãn bình thường).Biểu đồ tần suất định lượng nồng độ NT-ProBNP trong môi trường nuôi cấy từ các lát cắt tim được nuôi cấy trong điều kiện giãn MT bình thường (norm) hoặc giãn quá mức (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm và D4 MTOS) lát cắt/nhóm từ các con lợn khác nhau, phân tích phương sai hai yếu tố được thực hiện;**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p < 0,01 so với độ giãn bình thường). a 在MT 正常拉伸(Norm) 或过度拉伸(OS) 条件下培养的心脏切片培养基中NT-ProBNP浓度的条形图量化（n = 4 (D2 MTNorm)、3（D2 MTOS、D4 MTNorm 和D4 MTOS). 0,01). a Định lượng nồng độ NT-ProBNP trong các lát tim được nuôi cấy trong điều kiện MT căng bình thường (Định mức) hoặc căng quá mức (OS) (n ​​= 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm和D4 MTOS) từ các điều kiện khác nhau; **so với kéo giãn bình thường, p < 0,01).Biểu đồ tần suất Định lượng nồng độ NT-ProBNP trong các lát cắt tim được nuôi cấy trong điều kiện giãn MT bình thường (norm) hoặc giãn quá mức (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm) và D4 MTOS) lát cắt/nhóm từ các con lợn khác nhau, phân tích phương sai hai chiều;**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p < 0,01 so với độ giãn bình thường). b Hình ảnh đại diện cho các lát cắt tim được nhuộm bằng troponin-T và WGA (trái) và định lượng kích thước tế bào (phải) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) tế bào/nhóm từ 10 lát cắt khác nhau từ các con lợn khác nhau, đã thực hiện kiểm định t-test hai phía của Student; ****p < 0,0001 so với độ giãn bình thường). b Hình ảnh đại diện cho các lát cắt tim được nhuộm bằng troponin-T và WGA (trái) và định lượng kích thước tế bào (phải) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) tế bào/nhóm từ 10 lát cắt khác nhau từ các con lợn khác nhau, đã thực hiện kiểm định t-test hai phía của Student; ****p < 0,0001 so với độ giãn bình thường). b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слева) и người quản lý tài chính (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) клеток/группу из 10 разных срезов от разных свиней, два- проводится хвостовой t-критерий Стьюдента ****p < 0,0001 по сравнению сравнению с нормальным растяжением). b Hình ảnh đại diện của các lát cắt tim được nhuộm bằng troponin-T và AZP (trái) và định lượng kích thước tế bào (phải) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) tế bào/nhóm từ 10 lát cắt khác nhau của các con lợn khác nhau, đã thực hiện kiểm định t hai phía của Student; ****p < 0,0001 so với chủng bình thường). b 用肌钙蛋白-T 和WGA(左)和细胞大小量化（右)染色的心脏切片的代表性图像（n = 330（D6 MTOS), 来自不同猪的10 个不同切片的369（D6 MTNorm）细胞/组,两进行有尾学生t 检验；与正常拉伸相比,****p < 0,0001)。 b Hình ảnh đại diện của các lát cắt tim được nhuộm bằng calcarein-T và WGA (trái) và kích thước tế bào (phải) (n = 330 (D6 MTOS), 369 từ 10 lát cắt khác nhau (D6 MTNorm)) Cells/组，两方法有尾学生t test；compared with normal stretching，****p < 0.0001). b Việc sử dụng các công cụ hỗ trợ, quản lý tài chính, công cụ hỗ trợ và công cụ hỗ trợ của bạn và các công cụ khác оценка размера клеток (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) và 10 различных срезов от разных свиней Клетки/группа, двусторонние критерий Стьюдента; ****p < 0,0001 по сравнению с нормальным растяжением). b Hình ảnh đại diện của các lát cắt tim được nhuộm bằng troponin-T và AZP (trái) và định lượng kích thước tế bào (phải) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) từ 10 lát cắt khác nhau từ các con lợn khác nhau) Số tế bào/nhóm, tiêu chí hai phía t của Student; ****p < 0,0001 so với chủng bình thường). c Hình ảnh đại diện cho các lát cắt tim MTOS ngày 0 và ngày 6 được nhuộm miễn dịch đối với troponin-T và NFATC4 và định lượng sự dịch chuyển của NFATC4 đến nhân của tế bào cơ tim (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) lát cắt/nhóm từ các con lợn khác nhau, thực hiện kiểm định t-test hai phía; *p < 0,05). c Hình ảnh đại diện cho các lát cắt tim MTOS ngày 0 và ngày 6 được nhuộm miễn dịch đối với troponin-T và NFATC4 và định lượng sự dịch chuyển của NFATC4 đến nhân của tế bào cơ tim (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) lát cắt/nhóm từ các con lợn khác nhau, thực hiện kiểm định t-test hai phía; *p < 0,05). c Sử dụng các công cụ hỗ trợ 0 và 6 MTOS, имуномеченых для тропонина-Т và NFATC4, и количественная оценка транслокации NFATC4 được cung cấp bởi các nhà cung cấp dịch vụ (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срезов/группу от разных свиней , выполняется двусторонний t-критерий Стьюдента; *p < 0,05). c Hình ảnh đại diện cho các lát cắt tim ở thời điểm 0 và 6 ngày MTOS, được nhuộm miễn dịch cho troponin-T và NFATC4, và định lượng sự dịch chuyển của NFATC4 trong nhân của các tế bào hang (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) lát cắt/nhóm từ các con lợn khác nhau) được thực hiện bằng phép thử t Student hai phía; *p < 0,05). c 用于肌钙蛋白-T 和NFATC4 免疫标记的第0 天和第6 天MTOS NFATC4 易位至CM 细胞核的量化（n = 4 (D0)、3 (D6 MTOS)切片/组, 进行双尾学生t 检验；*p < 0,05)。 c Hình ảnh đại diện của nhãn miễn dịch calcanin-T và NFATC4 第0天和第6天MTOS lát tim và NFATC4 từ các nhân tế bào NFATC4 易位至CM khác nhau的quantity化 (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) 切礼/组,时间双尾学生et 电影；*p < 0,05). c Sử dụng phần mềm quản lý MTOS trên 0 và 6 trên thiết bị của bạn để sử dụng MTOS на 0 và 6 trên thiết bị di động тропонином-Т và NFATC4 и количественная оценка транслокации NFATC4 в ядра CM от разных свиней (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срез/группа, два- хвостатый t-критерий Стьюдента; c Hình ảnh đại diện của các lát cắt tim MTOS vào ngày 0 và ngày 6 để nhuộm miễn dịch troponin-T và NFATC4 và định lượng sự dịch chuyển NFATC4 trong nhân của tế bào cơ tim từ các con lợn khác nhau (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) lát cắt/nhóm, kiểm định t hai phía theo tiêu chí Student; *p < 0,05).Các vạch sai số biểu thị giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn.
Nghiên cứu chuyển dịch lâm sàng về tim mạch đòi hỏi các mô hình tế bào tái tạo chính xác môi trường tim. Trong nghiên cứu này, một thiết bị CTCM đã được phát triển và đặc trưng hóa, có khả năng kích thích các lát cắt siêu mỏng của tim. Hệ thống CTCM bao gồm kích thích điện cơ đồng bộ sinh lý và làm giàu dịch nuôi cấy bằng T3 và Dex. Khi các lát cắt tim lợn được tiếp xúc với các yếu tố này, khả năng sống sót, tính toàn vẹn cấu trúc, hoạt động trao đổi chất và biểu hiện phiên mã của chúng vẫn giữ nguyên như mô tim tươi sau 12 ngày nuôi cấy. Ngoài ra, việc kéo căng quá mức mô tim có thể gây phì đại tim do giãn quá mức. Nhìn chung, những kết quả này ủng hộ vai trò quan trọng của các điều kiện nuôi cấy sinh lý trong việc duy trì kiểu hình tim bình thường và cung cấp nền tảng cho việc sàng lọc thuốc.
Nhiều yếu tố góp phần tạo ra môi trường tối ưu cho hoạt động và sự sống còn của tế bào cơ tim. Các yếu tố rõ ràng nhất liên quan đến (1) tương tác giữa các tế bào, (2) kích thích điện cơ, (3) các yếu tố thể dịch và (4) chất nền chuyển hóa. Tương tác tế bào-tế bào sinh lý đòi hỏi mạng lưới ba chiều phức tạp của nhiều loại tế bào được hỗ trợ bởi ma trận ngoại bào. Những tương tác tế bào phức tạp như vậy rất khó tái tạo trong ống nghiệm bằng cách nuôi cấy đồng thời các loại tế bào riêng lẻ, nhưng có thể dễ dàng đạt được bằng cách sử dụng bản chất giống cơ quan của các lát cắt tim.
Việc kéo giãn cơ học và kích thích điện đối với tế bào cơ tim rất quan trọng để duy trì kiểu hình tim33,34,35. Mặc dù kích thích cơ học đã được sử dụng rộng rãi để điều hòa và trưởng thành tế bào cơ tim hiPSC, một số nghiên cứu tinh tế gần đây đã thử nghiệm kích thích cơ học các lát cắt tim trong nuôi cấy bằng cách sử dụng tải trọng đơn trục. Những nghiên cứu này cho thấy tải trọng cơ học đơn trục 2D có tác động tích cực đến kiểu hình của tim trong quá trình nuôi cấy. Trong các nghiên cứu này, các phần của tim được tải bằng lực căng đẳng trương17, tải trọng auxotonic tuyến tính18, hoặc chu kỳ tim được tái tạo bằng cách sử dụng phản hồi bộ chuyển đổi lực và bộ truyền động lực căng. Tuy nhiên, các phương pháp này sử dụng kéo giãn mô đơn trục mà không tối ưu hóa môi trường, dẫn đến sự ức chế nhiều gen tim hoặc biểu hiện quá mức các gen liên quan đến phản ứng kéo giãn bất thường. CTCM được mô tả ở đây cung cấp một kích thích điện cơ 3D bắt chước chu kỳ tim tự nhiên về thời gian chu kỳ và độ kéo giãn sinh lý (kéo giãn 25%, tâm thu 40%, tâm trương 60% và 72 nhịp mỗi phút). Mặc dù chỉ riêng kích thích cơ học ba chiều này không đủ để duy trì tính toàn vẹn của mô, mà cần kết hợp kích thích thể dịch và cơ học bằng T3/Dex để duy trì đầy đủ khả năng sống, chức năng và tính toàn vẹn của mô.
Các yếu tố thể dịch đóng vai trò quan trọng trong việc điều chỉnh kiểu hình tim ở người trưởng thành. Điều này đã được nhấn mạnh trong các nghiên cứu HiPS-CM, trong đó T3 và Dex được thêm vào môi trường nuôi cấy để đẩy nhanh quá trình trưởng thành của tế bào. T3 có thể ảnh hưởng đến sự vận chuyển axit amin, đường và canxi qua màng tế bào36. Ngoài ra, T3 thúc đẩy biểu hiện MHC-α và điều hòa giảm MHC-β, thúc đẩy sự hình thành các sợi cơ co nhanh ở tế bào cơ tim trưởng thành so với các sợi cơ co chậm ở tế bào cơ tim thai nhi. Sự thiếu hụt T3 ở bệnh nhân suy giáp dẫn đến mất các dải sợi cơ và tốc độ phát triển trương lực giảm37. Dex tác động lên các thụ thể glucocorticoid và đã được chứng minh là làm tăng khả năng co bóp cơ tim trong tim được tưới máu cô lập;38 sự cải thiện này được cho là có liên quan đến tác động lên sự xâm nhập do lắng đọng canxi (SOCE)39,40. Thêm vào đó, Dex liên kết với các thụ thể của nó, gây ra phản ứng nội bào rộng rãi ức chế chức năng miễn dịch và viêm nhiễm30.
Kết quả của chúng tôi cho thấy kích thích cơ học vật lý (MS) đã cải thiện hiệu suất nuôi cấy tổng thể so với nhóm đối chứng (Ctrl), nhưng không duy trì được khả năng sống sót, tính toàn vẹn cấu trúc và biểu hiện tim mạch trong hơn 12 ngày nuôi cấy. So với nhóm đối chứng, việc bổ sung T3 và Dex vào nuôi cấy CTCM (MT) đã cải thiện khả năng sống sót và duy trì cấu hình phiên mã, tính toàn vẹn cấu trúc và hoạt động trao đổi chất tương tự với mô tim tươi trong 12 ngày. Ngoài ra, bằng cách kiểm soát mức độ kéo giãn mô, một mô hình phì đại tim do kéo giãn quá mức đã được tạo ra bằng cách sử dụng STCM, minh họa tính linh hoạt của hệ thống STCM. Cần lưu ý rằng mặc dù quá trình tái cấu trúc và xơ hóa tim thường liên quan đến các cơ quan nguyên vẹn mà các tế bào lưu thông có thể cung cấp các cytokine thích hợp cũng như thực bào và các yếu tố tái cấu trúc khác, nhưng các lát cắt của tim vẫn có thể bắt chước quá trình xơ hóa để đáp ứng với căng thẳng và chấn thương, biến chúng thành các nguyên bào sợi cơ. Điều này đã được đánh giá trước đây trong mô hình lát cắt tim này. Cần lưu ý rằng các thông số của CTCM có thể được điều chỉnh bằng cách thay đổi biên độ áp suất/điện và tần số để mô phỏng nhiều tình trạng khác nhau như nhịp tim nhanh, nhịp tim chậm và hỗ trợ tuần hoàn cơ học (tim không tải cơ học). Điều này làm cho hệ thống có năng suất trung bình để thử nghiệm thuốc. Khả năng của CTCM trong việc mô phỏng phì đại tim do gắng sức quá mức mở đường cho việc thử nghiệm hệ thống này trong liệu pháp cá nhân hóa. Tóm lại, nghiên cứu hiện tại chứng minh rằng sự kéo giãn cơ học và kích thích thể dịch là rất quan trọng để duy trì nuôi cấy các lát cắt mô tim.
Mặc dù dữ liệu trình bày ở đây cho thấy CTCM là một nền tảng rất hứa hẹn để mô phỏng cơ tim nguyên vẹn, phương pháp nuôi cấy này vẫn có một số hạn chế. Hạn chế chính của nuôi cấy CTCM là nó tạo ra các ứng suất cơ học động liên tục lên các lát cắt, điều này cản trở khả năng theo dõi chủ động sự co bóp của lát cắt tim trong mỗi chu kỳ. Ngoài ra, do kích thước nhỏ của các lát cắt tim (7 mm), khả năng đánh giá chức năng tâm thu bên ngoài hệ thống nuôi cấy bằng cách sử dụng các cảm biến lực truyền thống bị hạn chế. Trong bài báo này, chúng tôi đã khắc phục một phần hạn chế này bằng cách đánh giá điện áp quang học như một chỉ báo về chức năng co bóp. Tuy nhiên, hạn chế này sẽ cần nghiên cứu thêm và có thể được giải quyết trong tương lai bằng cách giới thiệu các phương pháp theo dõi quang học chức năng của các lát cắt tim trong nuôi cấy, chẳng hạn như lập bản đồ quang học bằng cách sử dụng thuốc nhuộm nhạy cảm với canxi và điện áp. Một hạn chế khác của CTCM là mô hình hoạt động không thao tác với ứng suất sinh lý (tiền tải và hậu tải). Trong CTCM, áp suất được tạo ra theo hướng ngược nhau để tái tạo 25% độ giãn sinh lý trong thì tâm trương (giãn hoàn toàn) và thì tâm thu (chiều dài co bóp trong quá trình kích thích điện) trong các mô rất lớn. Hạn chế này cần được loại bỏ trong các thiết kế CTCM tương lai bằng cách tạo áp lực thích hợp lên mô tim từ cả hai phía và bằng cách áp dụng chính xác mối quan hệ áp suất-thể tích xảy ra trong các buồng tim.
Sự tái cấu trúc do kéo giãn quá mức được báo cáo trong bài viết này chỉ giới hạn ở việc mô phỏng các tín hiệu kéo giãn quá mức gây phì đại. Do đó, mô hình này có thể giúp nghiên cứu tín hiệu phì đại do kéo giãn mà không cần đến các yếu tố thể dịch hoặc thần kinh (vốn không tồn tại trong hệ thống này). Cần có thêm các nghiên cứu để tăng tính đa dạng của CTCM, ví dụ, nuôi cấy đồng thời với các tế bào miễn dịch, các yếu tố thể dịch trong huyết tương lưu thông và sự chi phối thần kinh khi nuôi cấy đồng thời với các tế bào thần kinh sẽ cải thiện khả năng mô hình hóa bệnh lý bằng CTCM.
Mười ba con lợn đã được sử dụng trong nghiên cứu này. Tất cả các quy trình trên động vật đều được thực hiện theo hướng dẫn của cơ sở và được Ủy ban Chăm sóc và Sử dụng Động vật của Đại học Louisville phê duyệt. Cung động mạch chủ được kẹp lại và tim được truyền dịch với 1 lít dung dịch gây liệt tim vô trùng (110 mM NaCl, 1,2 mM CaCl2, 16 mM KCl, 16 mM MgCl2, 10 mM NaHCO3, 5 U/mL heparin, pH lên đến 7,4); Các quả tim được bảo quản trong dung dịch gây ngừng tim lạnh như đá cho đến khi được vận chuyển đến phòng thí nghiệm trên đá, thường là trong vòng chưa đầy 10 phút. Các quả tim được bảo quản trong dung dịch gây ngừng tim lạnh như đá cho đến khi được vận chuyển đến phòng thí nghiệm trên đá, thường là trong vòng chưa đầy 10 phút. bạn có thể sử dụng một số công cụ để cung cấp cho bạn một danh sách các công cụ có thể giúp bạn có được một khoản vay lớn thời gian <10 phút. Các quả tim được bảo quản trong dung dịch gây ngừng tim lạnh như đá cho đến khi vận chuyển đến phòng thí nghiệm trên đá, quá trình này thường mất chưa đến 10 phút.通常<10分钟。通常<10分钟。 Bạn có thể sử dụng thẻ tín dụng của mình để đạt được điều đó trong khoảng thời gian dưới 10 phút. Giữ tim trong dung dịch gây ngừng tim bằng đá cho đến khi vận chuyển đến phòng thí nghiệm cũng trên đá, thường là <10 phút.
Thiết bị CTCM được phát triển bằng phần mềm thiết kế hỗ trợ máy tính (CAD) SolidWorks. Các buồng nuôi cấy, vách ngăn và buồng khí được làm bằng nhựa acrylic trong suốt gia công CNC. Vòng đỡ đường kính 7mm được làm bằng polyetylen mật độ cao (HDPE) ở trung tâm và có rãnh để chứa vòng đệm silicon dùng để bịt kín môi trường bên dưới. Một màng silica mỏng ngăn cách buồng nuôi cấy với tấm phân tách. Màng silicon được cắt bằng laser từ tấm silicon dày 0,02 inch và có độ cứng 35A. Các miếng đệm silicon đáy và đỉnh được cắt bằng laser từ tấm silicon dày 1/16 inch và có độ cứng 50A. Ốc vít và đai ốc cánh bằng thép không gỉ 316L được sử dụng để cố định khối và tạo ra lớp bịt kín khí.
Một bo mạch in (PCB) chuyên dụng được thiết kế để tích hợp với hệ thống C-PACE-EM. Các ổ cắm kết nối máy Thụy Sĩ trên PCB được kết nối với các điện cực than chì bằng dây đồng mạ bạc và ốc vít đồng thau 0-60 được bắt vào các điện cực. Bo mạch in được đặt trong nắp của máy in 3D.
Thiết bị CTCM được điều khiển bởi một bộ truyền động khí nén lập trình được (PPD) tạo ra áp suất tuần hoàn được kiểm soát tương tự như chu kỳ tim. Khi áp suất bên trong buồng khí tăng lên, màng silicon mềm dẻo giãn nở lên trên, đẩy môi trường xuống dưới vị trí mô. Vùng mô sau đó sẽ bị kéo căng do sự đẩy chất lỏng này ra, mô phỏng sự giãn nở sinh lý của tim trong thì tâm trương. Ở đỉnh điểm của sự giãn nở, kích thích điện được áp dụng thông qua các điện cực than chì, làm giảm áp suất trong buồng khí và gây co thắt các phần mô. Bên trong ống có một van cầm máu với cảm biến áp suất để phát hiện áp suất trong hệ thống khí. Áp suất được cảm biến áp suất đo được sẽ được truyền đến bộ thu thập dữ liệu được kết nối với máy tính xách tay. Điều này cho phép theo dõi liên tục áp suất bên trong buồng khí. Khi đạt đến áp suất buồng tối đa (tiêu chuẩn 80 mmHg, 140 mmHg OS), thiết bị thu thập dữ liệu được lệnh gửi tín hiệu đến hệ thống C-PACE-EM để tạo ra tín hiệu điện áp hai pha trong 2 ms, được đặt ở mức 4 V.
Các lát cắt tim được lấy và điều kiện nuôi cấy trong 6 giếng được thực hiện như sau: Chuyển tim đã thu hoạch từ bình chuyển sang khay chứa dung dịch gây ngừng tim lạnh (4°C). Tâm thất trái được tách ra bằng dao vô trùng và cắt thành từng mảnh 1-2 cm³. Các khối mô này được gắn vào giá đỡ mô bằng chất kết dính mô và đặt trong bể mô vi cắt rung chứa dung dịch Tyrode và được sục khí oxy liên tục (3 g/L 2,3-butanedione monooxime (BDM), 140 mM NaCl (8,18 g), 6 mM KCl (0,447 g), 10 mM D-glucose (1,86 g), 10 mM HEPES (2,38 g), 1 mM MgCl2 (1 ml dung dịch 1 M), 1,8 mM CaCl2 (1,8 ml dung dịch 1 M), đến 1 L ddH2O). Máy cắt lát rung được thiết lập để cắt các lát dày 300 µm với tần số 80 Hz, biên độ rung ngang 2 mm và tốc độ tiến dao 0,03 mm/s. Bể chứa mô được bao quanh bởi đá để giữ cho dung dịch luôn mát và nhiệt độ được duy trì ở mức 4°C. Chuyển các lát mô từ bể cắt lát sang bể ủ chứa dung dịch Tyrode được sục khí oxy liên tục trên đá cho đến khi thu được đủ số lượng lát cắt cho một đĩa nuôi cấy. Đối với nuôi cấy xuyên màng (transwell), các lát mô được gắn vào giá đỡ polyurethane vô trùng rộng 6 mm và đặt trong 6 ml môi trường tối ưu (môi trường 199, chất bổ sung ITS 1x, 10% FBS, 5 ng/ml VEGF, 10 ng/ml FGF-kiềm và kháng sinh-kháng nấm 2X). Kích thích điện (10 V, tần số 1,2 Hz) được áp dụng cho các lát mô thông qua thiết bị C-Pace. Đối với điều kiện TD, T3 và Dex tươi được thêm vào với nồng độ 100 nM và 1 μM mỗi lần thay môi trường. Môi trường nuôi cấy được bão hòa oxy trước khi thay mới 3 lần mỗi ngày. Các lát cắt mô được nuôi cấy trong tủ ấm ở 37°C và 5% CO2.
Đối với nuôi cấy CTCM, các lát cắt mô được đặt trên máy in 3D tự chế trong đĩa Petri chứa dung dịch Tyrode đã được điều chỉnh. Thiết bị được thiết kế để tăng kích thước lát cắt tim lên 25% diện tích vòng đỡ. Điều này được thực hiện để các lát cắt tim không bị giãn ra sau khi được chuyển từ dung dịch Tyrode sang môi trường nuôi cấy và trong giai đoạn tâm trương. Sử dụng keo histoacrylic, các lát cắt dày 300 µm được cố định trên vòng đỡ đường kính 7 mm. Sau khi gắn các lát cắt mô vào vòng đỡ, cắt bỏ phần mô thừa và đặt các lát cắt mô đã gắn trở lại vào dung dịch Tyrode trên đá (4°C) cho đến khi chuẩn bị đủ lát cắt cho một thiết bị. Tổng thời gian xử lý cho tất cả các thiết bị không được vượt quá 2 giờ. Sau khi 6 lát cắt mô được gắn vào vòng đỡ, thiết bị CTCM được lắp ráp. Buồng nuôi cấy CTCM được đổ đầy trước 21 ml môi trường đã được oxy hóa. Chuyển các lát cắt mô vào buồng nuôi cấy và cẩn thận loại bỏ bọt khí bằng pipet. Sau đó, đưa mảnh mô vào lỗ và ấn nhẹ vào vị trí. Cuối cùng, đặt nắp điện cực lên thiết bị và chuyển thiết bị vào lồng ấp. Tiếp theo, kết nối CTCM với ống dẫn khí và hệ thống C-PACE-EM. Bộ truyền động khí nén mở ra và van khí mở CTCM. Hệ thống C-PACE-EM được cấu hình để cung cấp 4 V ở tần số 1,2 Hz trong quá trình tạo nhịp hai pha trong 2 ms. Môi trường nuôi cấy được thay hai lần một ngày và điện cực được thay một lần một ngày để tránh tích tụ than chì trên điện cực. Nếu cần, có thể lấy các mảnh mô ra khỏi giếng nuôi cấy để loại bỏ bất kỳ bọt khí nào có thể rơi xuống bên dưới. Đối với điều kiện điều trị MT, T3/Dex được thêm mới mỗi lần thay môi trường với nồng độ 100 nM T3 và 1 μM Dex. Các thiết bị CTCM được nuôi cấy trong lồng ấp ở 37°C và 5% CO2.
Để thu được quỹ đạo kéo giãn của các lát cắt tim, một hệ thống camera đặc biệt đã được phát triển. Camera SLR (Canon Rebel T7i, Canon, Tokyo, Nhật Bản) được sử dụng với ống kính macro Navitar Zoom 7000 18-108mm (Navitar, San Francisco, CA). Quá trình quan sát được thực hiện ở nhiệt độ phòng sau khi thay môi trường nuôi cấy bằng môi trường mới. Camera được đặt ở góc 51° và video được ghi lại ở tốc độ 30 khung hình/giây. Đầu tiên, phần mềm mã nguồn mở (MUSCLEMOTION43) được sử dụng với Image-J để định lượng chuyển động của các lát cắt tim. Mặt nạ được tạo bằng MATLAB (MathWorks, Natick, MA, Hoa Kỳ) để xác định các vùng quan tâm cho các lát cắt tim đang đập nhằm tránh nhiễu. Các mặt nạ được phân đoạn thủ công được áp dụng cho tất cả các hình ảnh trong một chuỗi khung hình và sau đó được chuyển đến plugin MUSCLEMOTION. Muscle Motion sử dụng cường độ trung bình của các pixel trong mỗi khung hình để định lượng chuyển động của nó so với khung tham chiếu. Dữ liệu được ghi lại, lọc và sử dụng để định lượng thời gian chu kỳ và đánh giá độ giãn của mô trong chu kỳ tim. Video đã ghi được xử lý hậu kỳ bằng bộ lọc kỹ thuật số bậc nhất không pha. Để định lượng độ giãn mô (đỉnh-đỉnh), phân tích đỉnh-đỉnh được thực hiện để phân biệt giữa các đỉnh và đáy trong tín hiệu đã ghi. Ngoài ra, việc loại bỏ xu hướng được thực hiện bằng đa thức bậc 6 để loại bỏ sự trôi dạt của tín hiệu. Mã chương trình được phát triển trong MATLAB để xác định chuyển động tổng thể của mô, thời gian chu kỳ, thời gian thư giãn và thời gian co thắt (Mã chương trình bổ sung 44).
Để phân tích biến dạng, sử dụng cùng các video được tạo ra để đánh giá độ giãn cơ học, trước tiên chúng tôi đã vẽ hai hình ảnh đại diện cho các đỉnh chuyển động (điểm cao nhất (trên) và thấp nhất (dưới)) theo phần mềm MUSCLEMOTION. Sau đó, chúng tôi phân đoạn các vùng mô và áp dụng một dạng thuật toán tô bóng cho mô đã phân đoạn (Hình bổ sung 2a). Mô đã phân đoạn sau đó được chia thành mười bề mặt nhỏ, và ứng suất trên mỗi bề mặt được tính bằng phương trình sau: Biến dạng = (Sup-Sdown)/Sdown, trong đó Sup và Sdown là khoảng cách của hình dạng đến bóng trên và bóng dưới của vải, tương ứng (Hình bổ sung 2b).
Các lát cắt tim được cố định trong dung dịch paraformaldehyde 4% trong 48 giờ. Mô đã cố định được khử nước trong dung dịch sucrose 10% và 20% trong 1 giờ, sau đó trong dung dịch sucrose 30% qua đêm. Sau đó, các lát cắt được nhúng vào hợp chất nhiệt độ cắt tối ưu (hợp chất OCT) và đông lạnh dần trong bể isopentane/đá khô. Bảo quản các khối nhúng OCT ở -80 °C cho đến khi tách. Các lam kính được chuẩn bị dưới dạng các lát cắt có độ dày 8 μm.
Để loại bỏ OCT khỏi các lát cắt tim, hãy làm nóng các lam kính trên khối gia nhiệt ở 95 °C trong 5 phút. Thêm 1 ml PBS vào mỗi lam kính và ủ trong 30 phút ở nhiệt độ phòng, sau đó làm thấm các lát cắt bằng cách đặt dung dịch Triton-X 0,1% trong PBS trong 15 phút ở nhiệt độ phòng. Để ngăn chặn các kháng thể không đặc hiệu liên kết với mẫu, hãy thêm 1 ml dung dịch BSA 3% vào các lam kính và ủ trong 1 giờ ở nhiệt độ phòng. Sau đó, loại bỏ BSA và rửa các lam kính bằng PBS. Đánh dấu từng mẫu bằng bút chì. Các kháng thể chính (pha loãng 1:200 trong 1% BSA) (connexin 43 (Abcam; #AB11370), NFATC4 (Abcam; #AB99431) và troponin-T (Thermo Scientific; #MA5-12960)) được thêm vào trong 90 phút, sau đó là các kháng thể phụ (pha loãng 1:200 trong 1% BSA) chống lại chuột Alexa Fluor 488 (Thermo Scientific; #A16079), chống lại thỏ Alexa Fluor 594 (Thermo Scientific; #T6391) trong 90 phút nữa. Rửa 3 lần với PBS. Để phân biệt sự nhuộm màu mục tiêu với nền, chúng tôi chỉ sử dụng kháng thể phụ làm đối chứng. Cuối cùng, thuốc nhuộm nhân DAPI được thêm vào và các lam kính được đặt trong vectashield (Vector Laboratories) và niêm phong bằng sơn móng tay. (độ phóng đại -x) và kính hiển vi Keyence với độ phóng đại 40x.
Thuốc nhuộm WGA-Alexa Fluor 555 (Thermo Scientific; #W32464) với nồng độ 5 μg/ml trong dung dịch PBS được sử dụng để nhuộm WGA và được nhỏ lên các lát cắt đã cố định trong 30 phút ở nhiệt độ phòng. Sau đó, các lam kính được rửa sạch bằng PBS và thêm Sudan black vào mỗi lam kính rồi ủ trong 30 phút. Tiếp theo, các lam kính được rửa sạch bằng PBS và thêm môi trường nhúng Vectashield. Các lam kính được quan sát dưới kính hiển vi Keyence ở độ phóng đại 40x.
OCT được loại bỏ khỏi các mẫu như mô tả ở trên. Sau khi loại bỏ OCT, ngâm các lam kính trong dung dịch Bouin qua đêm. Sau đó, rửa sạch các lam kính bằng nước cất trong 1 giờ và đặt trong dung dịch Bibrich aloe acid fuchsin trong 10 phút. Tiếp theo, rửa sạch các lam kính bằng nước cất và đặt trong dung dịch 5% phosphomolybdenum/5% phosphotungstic acid trong 10 phút. Không cần rửa lại, chuyển trực tiếp các lam kính vào dung dịch aniline blue trong 15 phút. Sau đó, rửa sạch các lam kính bằng nước cất và đặt trong dung dịch axit axetic 1% trong 2 phút. Làm khô các lam kính bằng ethanol 200 N và chuyển sang xylene. Các lam kính đã nhuộm được quan sát bằng kính hiển vi Keyence với vật kính 10x. Tỷ lệ diện tích xơ hóa được định lượng bằng phần mềm Keyence Analyzer.
Thử nghiệm đánh giá khả năng sống của tế bào CyQUANT™ MTT (Invitrogen, Carlsbad, CA), mã số V13154, được thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất với một số sửa đổi. Cụ thể, một dụng cụ bấm sinh thiết có đường kính 6 mm được sử dụng để đảm bảo kích thước mô đồng nhất trong quá trình phân tích MTT. Các mô được cấy riêng lẻ vào các giếng của đĩa 12 giếng chứa chất nền MTT theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Các lát cắt được ủ ở 37°C trong 3 giờ và mô sống sẽ chuyển hóa chất nền MTT để tạo thành hợp chất formazan màu tím. Thay dung dịch MTT bằng 1 ml DMSO và ủ ở 37°C trong 15 phút để chiết xuất formazan màu tím từ các lát cắt tim. Các mẫu được pha loãng 1:10 trong DMSO trong đĩa 96 giếng đáy trong suốt và cường độ màu tím được đo ở bước sóng 570 nm bằng máy đọc đĩa Cytation (BioTek). Các kết quả đo được chuẩn hóa theo trọng lượng của mỗi lát cắt tim.
Môi trường nuôi cấy lát cắt tim được thay thế bằng môi trường chứa 1 μCi/ml [5-3H]-glucose (Moravek Biochemicals, Brea, CA, USA) để thực hiện xét nghiệm sử dụng glucose như đã mô tả trước đây. Sau 4 giờ ủ, thêm 100 µl môi trường vào một ống ly tâm nhỏ mở nắp chứa 100 µl HCl 0,2 N. Sau đó, đặt ống vào một ống đo độ phóng xạ chứa 500 μl nước cất để làm bay hơi [3H]2O trong 72 giờ ở 37°C. Sau đó, lấy ống ly tâm nhỏ ra khỏi ống đo độ phóng xạ và thêm 10 ml dung dịch đo độ phóng xạ. Số lượng phóng xạ được đo bằng máy phân tích độ phóng xạ lỏng Tri-Carb 2900TR (Packard Bioscience Company, Meriden, CT, USA). Sau đó, mức độ sử dụng glucose được tính toán có tính đến hoạt độ đặc hiệu của [5-3H]-glucose, trạng thái cân bằng chưa hoàn toàn và nền, sự pha loãng của [5-3H]-glucose không được đánh dấu và hiệu suất của máy đếm nhấp nháy. Dữ liệu được chuẩn hóa theo khối lượng của các phần tim.
Sau khi đồng nhất mô trong Trizol, RNA được phân lập từ các lát cắt tim bằng bộ kit Qiagen miRNeasy Micro Kit #210874 theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Quá trình chuẩn bị thư viện RNAsec, giải trình tự và phân tích dữ liệu được thực hiện như sau:
1 μg RNA mỗi mẫu được sử dụng làm nguyên liệu ban đầu để chuẩn bị thư viện RNA. Thư viện giải trình tự được tạo ra bằng cách sử dụng Bộ dụng cụ chuẩn bị thư viện RNA NEBNext UltraTM dành cho Illumina (NEB, Hoa Kỳ) theo khuyến nghị của nhà sản xuất, và mã chỉ mục được thêm vào chuỗi thuộc tính cho mỗi mẫu. Tóm lại, mRNA được tinh sạch từ tổng RNA bằng cách sử dụng các hạt từ tính gắn với oligonucleotide poly-T. Quá trình phân mảnh được thực hiện bằng cách sử dụng các cation hóa trị hai ở nhiệt độ cao trong dung dịch đệm phản ứng tổng hợp sợi đầu tiên NEBNext (5X). cDNA sợi đầu tiên được tổng hợp bằng cách sử dụng mồi hexamer ngẫu nhiên và enzyme phiên mã ngược M-MuLV (RNase H-). Sau đó, cDNA sợi thứ hai được tổng hợp bằng cách sử dụng DNA polymerase I và RNase H. Các phần nhô ra còn lại được chuyển đổi thành đầu cùn bằng hoạt động của exonuclease/polymerase. Sau khi adenyl hóa đầu 3′ của đoạn DNA, một bộ chuyển đổi NEBNext với cấu trúc vòng kẹp tóc được gắn vào để chuẩn bị cho quá trình lai hóa. Để chọn các đoạn cDNA có chiều dài ưu tiên 150-200 bp, các đoạn thư viện được tinh sạch bằng hệ thống AMPure XP (Beckman Coulter, Beverly, USA). Sau đó, 3 μl enzyme USER (NEB, USA) với cDNA đã được chọn lọc kích thước và gắn adapter được sử dụng trong 15 phút ở 37°C và sau đó trong 5 phút ở 95°C trước khi thực hiện PCR. PCR sau đó được thực hiện bằng cách sử dụng polymerase DNA Phusion High-Fidelity, mồi PCR phổ quát và mồi Index (X). Cuối cùng, sản phẩm PCR được tinh sạch (hệ thống AMPure XP) và chất lượng thư viện được đánh giá trên hệ thống Agilent Bioanalyzer 2100. Thư viện cDNA sau đó được giải trình tự bằng máy giải trình tự Novaseq. Các tệp hình ảnh thô từ Illumina được chuyển đổi thành các bản đọc thô bằng CASAVA Base Calling. Dữ liệu thô được lưu trữ trong các tệp định dạng FASTQ(fq) chứa các trình tự đọc và chất lượng cơ sở tương ứng. Chọn HISAT2 để khớp các bản đọc giải trình tự đã lọc với bộ gen tham chiếu Sscrofa11.1. Nhìn chung, HISAT2 hỗ trợ bộ gen ở mọi kích thước, bao gồm cả bộ gen lớn hơn 4 tỷ base, và hầu hết các tham số đều được thiết lập giá trị mặc định. Các đoạn đọc nối từ dữ liệu RNA Seq có thể được căn chỉnh hiệu quả bằng HISAT2, hệ thống nhanh nhất hiện có, với độ chính xác tương đương hoặc tốt hơn bất kỳ phương pháp nào khác.
Số lượng bản sao chép phản ánh trực tiếp mức độ biểu hiện gen. Mức độ biểu hiện gen được đánh giá bằng số lượng bản sao chép (số lượng trình tự) liên quan đến bộ gen hoặc exon. Số lượng đọc tỷ lệ thuận với mức độ biểu hiện gen, chiều dài gen và độ sâu trình tự. FPKM (số đoạn trên mỗi nghìn cặp base của bản sao chép được giải trình tự trên mỗi triệu cặp base) được tính toán và giá trị P của biểu hiện khác biệt được xác định bằng cách sử dụng gói DESeq2. Sau đó, chúng tôi tính toán tỷ lệ phát hiện sai (FDR) cho mỗi giá trị P bằng phương pháp Benjamini-Hochberg9 dựa trên hàm tích hợp sẵn của R “p.adjust”.
RNA được phân lập từ các lát cắt tim được chuyển đổi thành cDNA ở nồng độ 200 ng/μl bằng cách sử dụng hỗn hợp SuperScript IV Vilo Master mix của Thermo (Thermo, mã số 11756050). RT-PCR định lượng được thực hiện bằng cách sử dụng đĩa phản ứng trong suốt 384 giếng Applied Biosystems Endura Plate Microamp (Thermo, mã số 4483319) và chất kết dính quang học microamp (Thermo, mã số 4311971). Hỗn hợp phản ứng bao gồm 5 µl hỗn hợp Taqman Fast Advanced Master mix (Thermo, mã số 4444557), 0,5 µl mồi Taqman và 3,5 µl H2O được trộn đều trong mỗi giếng. Các chu kỳ qPCR tiêu chuẩn được chạy và giá trị CT được đo bằng thiết bị PCR thời gian thực Applied Biosystems Quantstudio 5 (mô-đun 384 giếng; sản phẩm # A28135). Các mồi Taqman được mua từ Thermo (GAPDH (Ss03375629_u1), PARP12 (Ss06908795_m1), PKDCC (Ss06903874_m1), CYGB (Ss06900188_m1), RGL1 (Ss06868890_m1), ACTN1 (Ss01009508_mH), GATA4 (Ss03383805_u1), GJA1 (Ss03374839_u1), COL1A2 (Ss03375009_u1), COL3A1 (Ss04323794_m1), ACTA2 (Ss04245588_m1)). Giá trị CT của tất cả các mẫu được chuẩn hóa so với gen nội chuẩn GAPDH.
Việc giải phóng NT-ProBNP được đánh giá bằng cách sử dụng bộ kit NT-ProBNP (lợn) (Mã số MBS2086979, MyBioSource) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Tóm tắt, 250 µl mỗi mẫu và mẫu chuẩn được thêm vào mỗi giếng (hai lần lặp lại). Ngay sau khi thêm mẫu, thêm 50 µl thuốc thử A vào mỗi giếng. Lắc nhẹ đĩa và niêm phong bằng chất bịt kín. Sau đó, ủ đĩa ở 37°C trong 1 giờ. Tiếp theo, hút bỏ dung dịch và rửa các giếng 4 lần với 350 µl dung dịch rửa 1X, ủ dung dịch rửa trong 1-2 phút mỗi lần. Sau đó, thêm 100 µl thuốc thử B vào mỗi giếng và niêm phong bằng chất bịt kín đĩa. Lắc nhẹ đĩa và ủ ở 37°C trong 30 phút. Hút bỏ dung dịch và rửa các giếng 5 lần với 350 µl dung dịch rửa 1X. Thêm 90 µl dung dịch chất nền vào mỗi giếng và đậy kín đĩa. Ủ đĩa ở 37°C trong 10-20 phút. Thêm 50 µl dung dịch dừng phản ứng vào mỗi giếng. Đo ngay lập tức bằng máy đọc đĩa Cytation (BioTek) ở bước sóng 450 nm.
Phân tích công suất được thực hiện để lựa chọn kích thước nhóm sao cho đạt được công suất >80% nhằm phát hiện sự thay đổi tuyệt đối 10% của tham số với tỷ lệ sai số loại I là 5%. Phân tích công suất được thực hiện để lựa chọn kích thước nhóm sao cho đạt được công suất >80% nhằm phát hiện sự thay đổi tuyệt đối 10% trong tham số với tỷ lệ sai số loại I là 5%. Анализ мощности был выполнен для выбора размеров групп, которые обеспечат >80% số tiền hiện có обнаружения 10% tỷ lệ tín dụng tỷ lệ 5% cho khoản vay I. Phân tích công suất được thực hiện để chọn kích thước nhóm sao cho đạt được công suất >80% nhằm phát hiện sự thay đổi tuyệt đối 10% của thông số với tỷ lệ sai số loại I là 5%.进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10%进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10% Bạn có thể tiết kiệm được một khoản tiền lớn để có được khoản vay > 80% lãi suất tối đa обнаружения 10% tỷ lệ tín dụng khoản vay và 5% khoản vay của tôi I. Phân tích công suất được thực hiện để chọn kích thước nhóm sao cho đạt được công suất >80% để phát hiện sự thay đổi tuyệt đối 10% của thông số và tỷ lệ sai số loại I là 5%.Các mẫu mô được chọn ngẫu nhiên trước khi thí nghiệm. Tất cả các phân tích đều được thực hiện mà không biết trước điều kiện thí nghiệm và các mẫu chỉ được giải mã sau khi tất cả dữ liệu đã được phân tích. Phần mềm GraphPad Prism (San Diego, CA) được sử dụng để thực hiện tất cả các phân tích thống kê. Đối với tất cả các số liệu thống kê, giá trị p được coi là có ý nghĩa thống kê khi nhỏ hơn 0,05. Đối với tất cả các số liệu thống kê, giá trị p được coi là có ý nghĩa thống kê khi giá trị <0,05. Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. Đối với tất cả các số liệu thống kê, giá trị p được coi là có ý nghĩa thống kê khi giá trị <0,05.对于所有统计数据,p 值在值<0.05 时被认为是显着的。对于所有统计数据,p 值在值<0.05 时被认为是显着的。 Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. Đối với tất cả các số liệu thống kê, giá trị p được coi là có ý nghĩa thống kê khi giá trị <0,05.Kiểm định t hai phía của Student được thực hiện trên dữ liệu chỉ với 2 phép so sánh. Phân tích phương sai một chiều hoặc hai chiều (ANOVA) được sử dụng để xác định ý nghĩa thống kê giữa nhiều nhóm. Khi thực hiện các kiểm định hậu nghiệm, hiệu chỉnh Tukey được áp dụng để tính đến nhiều phép so sánh. Dữ liệu RNAsec có những cân nhắc thống kê đặc biệt khi tính toán FDR và ​​p.adjust như được mô tả trong phần Phương pháp.
Để biết thêm thông tin về thiết kế nghiên cứu, vui lòng xem bản tóm tắt Báo cáo Nghiên cứu Nature được liên kết với bài viết này.