Dankon pro via vizito al Nature.com. La retumilversio, kiun vi uzas, havas limigitan subtenon por CSS. Por la plej bona sperto, ni rekomendas, ke vi uzu ĝisdatigitan retumilon (aŭ malŝaltu la Kongruecan Reĝimon en Internet Explorer). Dume, por certigi daŭran subtenon, ni prezentos la retejon sen stiloj kaj JavaScript.
Ekzistas bezono de fidinda *in vitro* sistemo, kiu povas precize reprodukti la fiziologian medion de la koro por drogtestado. La limigita havebleco de homaj koraj histokulturaj sistemoj kondukis al malprecizaj interpretoj de koraj drogefikoj. Ĉi tie, ni evoluigis koran histokulturan modelon (CTCM), kiu elektromekanike stimulas kortranĉaĵojn kaj spertas fiziologian streĉadon dum la sistolaj kaj diastolaj fazoj de la kora ciklo. Post 12 tagoj da kultivado, ĉi tiu aliro parte plibonigis la viveblecon de korsekcioj, sed ne plene konservis ilian strukturan integrecon. Tial, post malgrandmolekula ekzamenado, ni trovis, ke la aldono de 100 nM trijodotironino (T3) kaj 1 μM deksametazono (Dex) al nia medio konservis la mikrostrukturon de la sekcioj dum 12 tagoj. En kombinaĵo kun T3/Dex-traktado, la CTCM-sistemo konservis transkripciajn profilojn, viveblecon, metabolan agadon kaj strukturan integrecon je la sama nivelo kiel freŝa kora histo dum 12 tagoj. Krome, troa streĉado de kora histo en kulturo induktas hipertrofan koran signaladon, provizante pruvojn pri la kapablo de CTCM imiti hipertrofajn kondiĉojn induktitajn de kora streĉado. Konklude, CTCM povas modeli la fiziologion kaj patofiziologion de la koro en kulturo dum longaj periodoj, ebligante fidindan drogtestadon.
Antaŭ klinika esplorado, fidindaj *in vitro* sistemoj estas bezonataj, kiuj povas precize reprodukti la fiziologian medion de la homa koro. Tiaj sistemoj devus imiti ŝanĝitan mekanikan streĉon, korfrekvencon kaj elektrofiziologiajn ecojn. Bestaj modeloj estas ofte uzataj kiel ekzamena platformo por kora fiziologio kun limigita fidindeco en reflektado de la efikoj de drogoj en la homa koro1,2. Fine, la Ideala Eksperimenta Modelo por Kora Histokulturo (*CTCM*) estas modelo tre sentema kaj specifa por diversaj terapiaj kaj farmakologiaj intervenoj, precize reproduktante la fiziologion kaj patofiziologion de la homa koro3. La foresto de tia sistemo limigas la malkovron de novaj traktadoj por korinsuficienco4,5 kaj kondukis al drogkardiotokseco kiel ĉefa kialo por eliro el la merkato6.
Dum la pasinta jardeko, ok ne-kardiovaskulaj medikamentoj estis retiritaj de klinika uzo ĉar ili kaŭzas plilongigon de la QT-intervalo, kondukante al ventriklaj aritmioj kaj subita morto7. Tial, ekzistas kreskanta bezono de fidindaj antaŭklinikaj ekzamenaj strategioj por taksi kardiovaskulan efikecon kaj toksecon. La lastatempa uzo de hom-induktitaj pluripotencaj stamĉeloj derivitaj kardiomiocitoj (hiPS-CM) en medikamento-ekzameno kaj tokseco-testado provizas partan solvon al ĉi tiu problemo. Tamen, la nematura naturo de hiPS-CM kaj la manko de multĉela komplekseco de kora histo estas gravaj limigoj de ĉi tiu metodo. Lastatempaj studoj montris, ke ĉi tiu limigo povas esti parte superita per uzado de fruaj hiPS-CM por formi korajn histajn hidroĝelojn baldaŭ post la komenco de spontaneaj kuntiriĝoj kaj iom post iom pliigante elektran stimulon laŭlonge de la tempo. Tamen, al ĉi tiuj hiPS-CM mikrohistoj mankas la maturaj elektrofiziologiaj kaj kuntiriĝaj ecoj de la plenkreska miokardio. Krome, homa kora histo havas pli kompleksan strukturon, konsistantan el heterogena miksaĵo de malsamaj ĉeltipoj, inkluzive de endotelaj ĉeloj, neŭronoj kaj stromaj fibroblastoj, interligitaj per specifaj aroj de eksterĉelaj matricaj proteinoj. Ĉi tiu diverseco de ne-kardiomiocitaj populacioj11,12,13 en la koro de plenkreskaj mamuloj estas grava baro al la modelado de kora histo uzante individuajn ĉeltipojn. Ĉi tiuj gravaj limigoj emfazas la gravecon de disvolvi metodojn por kultivi sendifektan miokardian histon sub fiziologiaj kaj patologiaj kondiĉoj.
Kulturitaj maldikaj (300 µm) sekcioj de la homa koro pruviĝis esti promesplena modelo de sendifekta homa miokardio. Ĉi tiu metodo provizas aliron al kompleta 3D multĉela sistemo simila al homa kora histo. Tamen, ĝis 2019, la uzo de kulturitaj korsekcioj estis limigita de la mallonga (24 h) kultiva postvivado. Ĉi tio ŝuldiĝas al pluraj faktoroj, inkluzive de la manko de fizik-mekanika streĉo, la aero-likva interfaco, kaj la uzo de simplaj medioj, kiuj ne subtenas la bezonojn de kora histo. En 2019, pluraj esplorgrupoj montris, ke la enkorpigo de mekanikaj faktoroj en korajn histokulturajn sistemojn povas plilongigi la kulturvivon, plibonigi koran esprimon kaj imiti koran patologion. Du elegantaj studoj 17 kaj 18 montras, ke uniaksa mekanika ŝarĝo havas pozitivan efikon sur kora fenotipo dum kultivado. Tamen, ĉi tiuj studoj ne uzis la dinamikan tridimensian fizik-mekanikan ŝarĝon de la kora ciklo, ĉar korsekcioj estis ŝarĝitaj per aŭ izometraj streĉaj fortoj 17 aŭ lineara aŭksotona ŝarĝo 18. Ĉi tiuj metodoj de hista streĉado rezultigis la subpremadon de multaj korgenoj aŭ la troesprimon de genoj asociitaj kun nenormalaj streĉaj respondoj. Rimarkinde, Pitoulis et al. 19 evoluigis dinamikan kortranĉaĵan kulturbanon por korcikla rekonstruo uzante fortotransduktilan retroligon kaj streĉajn transmisiojn. Kvankam ĉi tiu sistemo permesas pli precizan in vitro korciklan modeligadon, la komplekseco kaj malalta trairo de la metodo limigas la aplikon de ĉi tiu sistemo. Nia laboratorio ĵus evoluigis simpligitan kultursistemon uzante elektran stimulon kaj optimumigitan medion por konservi la viveblecon de sekcioj de porka kaj homa korhisto ĝis 6 tagoj 20,21.
En la nuna manuskripto, ni priskribas korhistokulturan modelon (KTM) uzantan sekciojn de la porka koro, kiu inkluzivas humorajn signalvortojn por resumi tridimensian korfiziologion kaj patofiziologian ŝveliĝon dum la korciklo. Ĉi tiu KTM povas pliigi la precizecon de antaŭklinika medikamentoprognozo al nivelo neniam antaŭe atingita per provizado de kostefika, mez-traira korsistemo, kiu imitas la fiziologion/patofiziologion de la mamula koro por antaŭklinika medikamentotestado.
Hemodinamikaj mekanikaj signaloj ludas kritikan rolon en la bontenado de kardiomiocita funkcio in vitro 22,23,24. En la nuna manuskripto, ni evoluigis CTCM (Figuro 1a), kiu povas imiti la plenkreskan koran medion per induktado de kaj elektra kaj mekanika stimulo je fiziologiaj frekvencoj (1.2 Hz, 72 batoj minute). Por eviti troan histan streĉadon dum diastolo, 3D-presilo estis uzata por pliigi la histan grandecon je 25% (Fig. 1b). Elektra stimulado induktita de la C-PACE-sistemo estis tempigita por komenciĝi 100 ms antaŭ la sistolo uzante daten-akiran sistemon por plene reprodukti la koran ciklon. La histokultura sistemo uzas programeblan pneŭmatikan aktuatoron (LB Engineering, Germanio) por cikle vastigi flekseblan silikonan membranon por kaŭzi vastiĝon de la kortranĉaĵoj en la supra ĉambro. La sistemo estis konektita al ekstera aerlinio tra premtransduktilo, kiu ebligis precize alĝustigi la premon (± 1 mmHg) kaj tempon (± 1 ms) (Fig. 1c).
a Alfiksu la histan sekcion al la 7 mm subtena ringo, montrita blue, ene de la kulturkamero de la aparato. La kulturkamero estas apartigita de la aerkamero per maldika fleksebla silikona membrano. Metu kuseneton inter ĉiun ĉambron por malhelpi elfluojn. La kovrilo de la aparato enhavas grafitajn elektrodojn, kiuj provizas elektran stimulon. b Skemata prezento de la granda hista aparato, gvida ringo kaj subtena ringo. La histaj sekcioj (brunaj) estas metitaj sur la supergrandan aparaton kun la gvida ringo metita en la kanelon sur la ekstera rando de la aparato. Uzante la gvidilon, zorge metu la subtenan ringon kovritan per hista akrila gluaĵo super la sekcion de kora histo. c Grafikaĵo montranta la tempon de elektra stimulo kiel funkcion de aerkamera premo kontrolita per programebla pneŭmatika aktuatoro (PPD). Datenakira aparato estis uzata por sinkronigi elektran stimulon uzante premsensilojn. Kiam la premo en la kulturkamero atingas la fiksitan sojlon, pulsa signalo estas sendita al la C-PACE-EM por ekigi elektran stimulon. d Bildo de kvar CTCM-oj metitaj sur inkubatora breto. Kvar aparatoj estas konektitaj al unu PPD per pneŭmatika cirkvito, kaj premsensiloj estas enigitaj en la hemostatan valvon por monitori la premon en la pneŭmatika cirkvito. Ĉiu aparato enhavas ses histajn sekciojn.
Uzante unuopan pneŭmatikan aktuatoron, ni povis kontroli 4 CTCM-aparatojn, el kiuj ĉiu povis teni 6 histajn sekciojn (Fig. 1d). En CTCM, la aerpremo en la aerkamero estas konvertita al sinkrona premo en la fluida kamero kaj induktas fiziologian ekspansion de la kortranĉaĵo (Figuro 2a kaj Aldona Filmo 1). Taksado de hista streĉo je 80 mm Hg. Art. montris streĉon de histaj sekcioj je 25% (Fig. 2b). Ĉi tiu procenta streĉo montriĝis korespondi al fiziologia sarkomera longo de 2,2–2,3 µm por normala kora sekcia kuntiriĝo17,19,25. Hista movado estis taksita uzante kutimajn fotilagordojn (Aldona Figuro 1). La amplitudo kaj rapideco de hista movado (Fig. 2c, d) korespondis al streĉo dum la kora ciklo kaj tempo dum sistolo kaj diastolo (Fig. 2b). Streĉo kaj rapideco de kora histo dum kuntiriĝo kaj malstreĉiĝo restis konstantaj dum 12 tagoj en kulturo (Fig. 2f). Por taksi la efikon de elektra stimulo sur kuntiriĝon dum kulturo, ni evoluigis metodon por determini aktivan misformaĵon uzante ombran algoritmon (Aldona Figuro 2a,b) kaj povis distingi inter misformaĵoj kun kaj sen elektra stimulo. La sama sekcio de la koro (Figuro 2f). En la movebla regiono de la tranĉo (R6-9), la tensio dum elektra stimulo estis 20% pli alta ol en la foresto de elektra stimulo, kio indikas la kontribuon de elektra stimulo al kuntiriĝo.
Reprezentaj spuroj de aerkamera premo, fluidkamera premo, kaj histamovadaj mezuradoj konfirmas, ke la kamera premo ŝanĝas la fluidkameran premon, kaŭzante korespondan movadon de la hista tranĉaĵo. b Reprezentaj spuroj de procenta streĉo (blua) de histaj sekcioj korespondantaj al procenta streĉo (oranĝa). c La mezurita moviĝo de la kora tranĉaĵo kongruas kun la mezurita moviĝrapido. (d) Reprezentaj trajektorioj de cikla moviĝo (blua linio) kaj rapideco (oranĝa punktita linio) en tranĉaĵo de la koro. e Kvantigo de ciklotempo (n = 19 tranĉaĵoj por grupo, de malsamaj porkoj), kuntiriĝtempo (n = 19 tranĉaĵoj por grupo, de malsamaj porkoj), histamovado (n = 25 tranĉaĵoj)/grupo de malsamaj porkoj), pinta sistola rapideco (n = 24(D0), 25(D12) tranĉaĵoj/grupo de malsamaj porkoj) kaj pinta malstreĉiĝrapideco (n=24(D0), 25(D12) tranĉaĵoj/grupo de malsamaj porkoj). Du-vosta Studenta t-testo montris neniun signifan diferencon en iu ajn parametro. f Reprezentaj spuroj de trostreĉa analizo de histaj sekcioj kun (ruĝa) kaj sen (blua) elektra stimulo, dek regionaj areoj de histaj sekcioj el la sama sekcio. La malsupraj paneloj montras la kvantigon de la procenta diferenco en trostreĉo en histaj sekcioj kun kaj sen elektra stimulo en dek areoj el malsamaj sekcioj. (n = 8 tranĉaĵoj/grupo el malsamaj porkoj, duvosta Studenta t-testo estas farita; ****p < 0,0001, **p < 0,01, *p < 0,05). (n = 8 tranĉaĵoj/grupo el malsamaj porkoj, duvosta Studenta t-testo estas farita; ****p < 0,0001, **p < 0,01, *p < 0,05). (n = 8 срезов/группу от разных свиней, проводится двусторонний t-критерий Стьюдента; *****p<0,1,00,
En nia antaŭa statika biomimetika kortranĉaĵa kultursistemo [20, 21], ni konservis la viveblecon, funkcion kaj strukturan integrecon de kortranĉaĵoj dum 6 tagoj per aplikado de elektra stimulo kaj optimumigo de la konsisto de la medio. Tamen, post 10 tagoj, ĉi tiuj ciferoj akre falis. Ni rilatos al sekcioj kultivitaj en nia antaŭa statika biomimetika kultursistemo 20, 21 kontrolkondiĉoj (Ctrl) kaj ni uzos nian antaŭe optimumigitan medion kiel MC-kondiĉojn kaj kulturon sub samtempa mekanika kaj elektra stimulo (CTCM). nomata . Unue, ni determinis, ke mekanika stimulo sen elektra stimulo ne sufiĉas por konservi histan viveblecon dum 6 tagoj (Aldona Figuro 3a,b). Interese, kun la enkonduko de fiziko-mekanika kaj elektra stimulo uzante STCM, la vivebleco de 12-tagaj korsekcioj restis la sama kiel en freŝaj korsekcioj sub MS-kondiĉoj, sed ne sub Ctrl-kondiĉoj, kiel montrite per MTT-analizo (Figuro 1). 3a). Ĉi tio sugestas, ke mekanika stimulo kaj simulado de la korciklo povas konservi histajn sekciojn viveblecaj duoble pli longe ol raportite en nia antaŭa statika kultursistemo. Tamen, takso de la struktura integreco de histaj sekcioj per imunomarkado de kora troponino T kaj koneksino 43 montris, ke la esprimo de koneksino 43 estis signife pli alta en MC-histoj en la 12-a tago ol en kontroloj en la sama tago. Tamen, unuforma esprimo de koneksino 43 kaj Z-diska formado ne estis plene konservitaj (Fig. 3b). Ni uzas artefaritinteligentecan (AI) kadron por kvantigi la strukturan integrecon de histo26, bild-bazitan profundan lernan dukton bazitan sur troponino-T kaj koneksina kolorigo43 por aŭtomate kvantigi la strukturan integrecon kaj fluoreskon de kortranĉaĵoj laŭ forto de lokalizo. Ĉi tiu metodo uzas Konvolucian Neŭralan Reton (CNN) kaj profundan lernan kadron por fidinde kvantigi la strukturan integrecon de kora histo aŭtomate kaj senantaŭjuĝe, kiel priskribite en la referenco.26. MC-histo montris plibonigitan strukturan similecon al tago 0 kompare kun statikaj kontrolsekcioj. Krome, la trikroma kolorigo de Masson rivelis signife pli malaltan procenton de fibrozo sub MS-kondiĉoj kompare kun kontrolkondiĉoj en la 12-a tago de kulturo (Fig. 3c). Dum CTCM pliigis la viveblecon de korhistaj sekcioj je la 12-a tago al nivelo simila al tiu de freŝa korhisto, ĝi ne signife plibonigis la strukturan integrecon de la korsekcioj.
Stanga diagramo montras kvantigon de la MTT-vivebleco de freŝaj kortranĉaĵoj (D0) aŭ kortranĉaĵa kulturo dum 12 tagoj aŭ en statika kulturo (D12 Ctrl) aŭ en CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) tranĉaĵoj/grupo de malsamaj porkoj, unudirekta ANOVA-testo estas farita; ####p < 0,0001 kompare kun D0 kaj **p < 0,01 kompare kun D12 Ctrl). Stanga diagramo montras kvantigon de la MTT-vivebleco de freŝaj kortranĉaĵoj (D0) aŭ kortranĉaĵa kulturo dum 12 tagoj aŭ en senmova kulturo (D12 Ctrl) aŭ en CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) tranĉaĵoj/grupo de malsamaj porkoj, unudirekta ANOVA-testo estas farita; ####p < 0,0001 kompare kun D0 kaj **p < 0,01 kompare kun D12 Ctrl).La histogramo montras la kvantigon de la viveblo de MTT-freŝaj korsekcioj (D0) aŭ kulturo de korsekcioj dum 12 tagoj en aŭ statika kulturo (D12-kontrolo) aŭ CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12-kontrolo). ) , 12 (D12 MC) sekcioj/grupo de malsamaj porkoj, unudirekta ANOVA-testo estas farita;####p < 0,0001 по сравнению с D0 и **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p < 0,0001 kompare kun D0 kaj **p < 0,01 kompare kun D12 Ctrl). a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切(D0)片(D0)或心脏切片培养12 天的MTT 活力的量化)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组葌力的量化)测试；与D0 相比，####p < 0.0001，与D12 Ctrl 相比，**p < 0.01)。 a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切(D0)片(D0) ，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；与D0 相比，####p < 0.00rl12相比，**p。)histogramo montranta la kvantigon de MTT-vivebleco en freŝaj korsekcioj (D0) aŭ korsekcioj kultivitaj dum 12 tagoj en statika kulturo (D12-kontrolo) aŭ CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12-kontrolo)), 12 (D12 MC) sekcioj/grupo de malsamaj porkoj, unudirekta ANOVA-testo;####p < 0,0001 по сравнению с D0, **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p < 0,0001 kompare al D0, **p < 0,01 kompare al D12 (Ctrl).b Troponino-T (verda), koneksino 43 (ruĝa) kaj DAPI (blua) en ĵus izolitaj korsekcioj (D0) aŭ korsekcioj kultivitaj sub statikaj kondiĉoj (Ctrl) aŭ CTCM-kondiĉoj (MC) dum 12 tagoj) de reprezentaj imunofluoreskaj bildoj (blanka skalo = 100 µm). Kvantigo de la struktura integreco de la kora histo per artefaritinteligenteco (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) tranĉaĵoj/grupo ĉiu el malsama porko, unudirekta ANOVA-testo estas farita; ####p < 0,0001 kompare kun D0 kaj ****p < 0,0001 kompare kun D12 Ctrl). Kvantigo de la struktura integreco de la kora histo per artefaritinteligenteco (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) tranĉaĵoj/grupo ĉiu el malsamaj porkoj, unudirekta ANOVA-testo estas farita; ####p < 0,0001 kompare kun D0 kaj ****p < 0,0001 kompare kun D12 Ctrl). Количественная оценка структурной целостности сердечной ткани искусственным интеллектом (n = 777), D1 (n = 5), (D12 MC) срезов/групп от разных свиней, проводится однофакторный тест ANOVA ####p < 0,0001 по сни сра в сне срав; 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). Kvantigo de la struktura integreco de kora histo per artefarita inteligenteco (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) sekcioj/grupoj de malsamaj porkoj, unudirekta ANOVA-testo farita; ####p < 0.0001 kontraŭ kun D0 kaj ****p < 0.0001 kompare kun D12 Ctrl).人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) tranĉaĵoj/grupo ĉiu el malsama porko, unudirekta ANOVA-testo <1 人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) tranĉaĵoj/grupo ĉiu el malsama porko, unudirekta ANOVA-testo <1 人工智能量化心脏组织结构完整性（n相比，****p < 0.0001 与D12 Ctrl 相比）。人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) tranĉaĵoj/grupo ĉiu el malsamaj porkoj, unudirekta ANOVA testo <1###0#0;与D0相比，****p < 0.0001 与D12 Ctrl 相比）。 Искусственный интеллект для количественной оценки структурной целостности сердечной ткан (D12), =77нl (D12), =77нl (D12), (D12 MC) срезов/группу каждой из разных свиней, односторонний тест ANOVA ####p <0,0001 vs. сравнению с D12 Ctrl). Artefarita inteligenteco por kvantigi la strukturan integrecon de kora histo (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) sekcioj/grupo de ĉiu malsama porko, unudirekta ANOVA-testo; ####p<0.0001 kontraŭ .D0 Por komparo ****p < 0.0001 kompare kun D12 Ctrl). c Reprezentaj bildoj (maldekstre) kaj kvantigo (dekstre) por kortranĉaĵoj makulitaj per la trikroma tinkturo de Masson (Skalo nuda = 500 µm) (n = 10 tranĉaĵoj/grupo ĉiu el malsama porko, unudirekta ANOVA-testo estas farita; ####p < 0,0001 kompare kun D0 kaj ***p < 0,001 kompare kun D12 Ctrl). c Reprezentaj bildoj (maldekstre) kaj kvantigo (dekstre) por kortranĉaĵoj makulitaj per la trikroma tinkturo de Masson (Skalo nuda = 500 µm) (n = 10 tranĉaĵoj/grupo ĉiu el malsamaj porkoj, unudirekta ANOVA-testo estas farita; #### p < 0,0001 kompare kun D0 kaj ***p < 0,001 kompare kun D12 Ctrl). c Репрезентативные изображения (слева) и количественная оценка (справа) срезов сердца, ошенташаш трихромным красителем Массона (масштаб без покрытия = 500 мкм) (n = 10 срезов/группу от разнынх разни выполняется односторонний тест ANOVA #### p < 0,0001 по сравнению с D0 и ***p < 0,001 по; сравнению с D12 Ctrl). c Reprezentaj bildoj (maldekstre) kaj kvantigo (dekstre) de korsekcioj makulitaj per la trikroma tinkturo de Masson (nekovrita skalo = 500 µm) (n = 10 sekcioj/grupo de malsamaj porkoj, unudirekta ANOVA-testo farita; #### p < 0,0001 kompare kun D0 kaj ***p < 0,001 kompare kun D12 Ctrl). c 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像（左）和量化（右）（裸尺（裸尺化（右）（裸尺（裸尺（10µ=（裸尺）个切片/组，每组来自不同的猪，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0.0001 与D0 相比 相比 ，D0***1 <，l2***相比）。 C 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 （左 左） 量化 （右） 裸尺度壺度尺度裸尺度 = 500 µm） （n = 10 个 切片 组 每 组 来自 不同 猪 ， 进行 切片 组 每 组 来自 不同 猪 ， 进行 切片 单吋### 0.0001 与D0 相比，***p < 0.001 与D12 Ctrl 相比）。 c Репрезентативные изображения (слева) и количественный анализ (справа) срезов сердца, онкраш трихромным красителем Массона (чистая шкала = 500 мкм) (n = 10 срезов/группа, каждый от другой другой протестировано с помощью однофакторного дисперсионного анализа ;### #p < 0,0001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Reprezentaj bildoj (maldekstre) kaj kvantigo (dekstre) de korsekcioj makulitaj per la trikroma tinkturo de Masson (blankaĵo = 500 µm) (n = 10 sekcioj/grupo, ĉiu de malsama porko, testitaj per unudirekta variancoanalizo; ### # p < 0,0001 kompare kun D0, ***p < 0,001 kompare kun D12 Ctrl).Erarstangoj reprezentas la meznombron ± norman devion.
Ni hipotezis, ke per aldono de malgrandaj molekuloj al la kulturmedio, la integreco de kardiomiocitoj povus esti plibonigita kaj la evoluo de fibrozo povus esti reduktita dum CTCM-kultivado. Tial ni ekzamenis malgrandajn molekulojn uzante niajn statikajn kontrolkulturojn20,21 pro la malgranda nombro da konfuzigaj faktoroj. Deksametazono (Dex), trijodotironino (T3), kaj SB431542 (SB) estis elektitaj por ĉi tiu ekzameno. Ĉi tiuj malgrandaj molekuloj antaŭe estis uzitaj en hiPSC-CM-kulturoj por indukti maturiĝon de kardiomiocitoj per pliigo de sarkomera longo, T-tubuloj, kaj kondukrapideco. Krome, kaj Dex (glukokortikoido) kaj SB estas konataj pro subpremado de inflamo29,30. Tial, ni testis ĉu la inkludo de unu aŭ kombinaĵo de ĉi tiuj malgrandaj molekuloj plibonigus la strukturan integrecon de korsekcioj. Por komenca ekzameno, la dozo de ĉiu komponaĵo estis elektita surbaze de la koncentriĝoj ofte uzataj en ĉelkulturmodeloj (1 μM Dex27, 100 nM T327, kaj 2.5 μM SB31). Post 12 tagoj da kultivado, la kombinaĵo de T3 kaj Dex rezultigis optimuman strukturan integrecon de kardiomiocitaj muskoloj kaj minimuman fibrecan remodelado (Aldonaj Figuroj 4 kaj 5). Krome, la uzo de duoblaj aŭ duoblaj ĉi tiuj koncentriĝoj de T3 kaj Dex produktis malutilajn efikojn kompare kun normalaj koncentriĝoj (Aldonaj Figuroj 6a,b).
Post komenca ekzameno, ni faris rektan komparon de 4 kulturkondiĉoj (Figuro 4a): Ctrl: korsekcioj kultivitaj en nia antaŭe priskribita statika kulturo uzante nian optimumigitan medion; 20.21 TD: T3 kaj Ctrl s Aldonitaj Dex merkrede; MC: korsekcioj kultivitaj en CTCM uzante nian antaŭe optimumigitan medion; kaj MT: CTCM kun T3 kaj Dex aldonitaj al la medio. Post 12 tagoj da kultivado, la viveblo de MS kaj MT histoj restis la sama kiel en freŝaj histoj taksitaj per MTT-analizo (Figuro 4b). Interese, la aldono de T3 kaj Dex al transputaj kulturoj (TD) ne rezultigis signifan plibonigon de viveblo kompare kun Ctrl-kondiĉoj, indikante gravan rolon de mekanika stimulo en konservado de la viveblo de korsekcioj.
Eksperimenta dezajndiagramo prezentanta la kvar kulturkondiĉojn uzitajn por taksi la efikojn de mekanika stimulo kaj T3/Dex-suplementado sur kultivmedio dum 12 tagoj. b Stanga diagramo montras kvantigon de viveblo 12 tagojn post kultivado en ĉiuj 4 kulturkondiĉoj (Ctrl, TD, MC, kaj MT) kompare kun freŝaj kortranĉaĵoj (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD kaj D12 MT), 12 (D12 MC) tranĉaĵoj/grupo de malsamaj porkoj, unudirekta ANOVA-testo estas farita; ####p < 0.0001, ###p < 0.001 kompare kun D0 kaj **p < 0.01 kompare kun D12 Ctrl). b Stanga diagramo montras kvantigon de viveblo 12 tagojn post kultivado en ĉiuj 4 kulturkondiĉoj (Ctrl, TD, MC, kaj MT) kompare kun freŝaj kortranĉaĵoj (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD kaj D12 MT), 12 (D12 MC) tranĉaĵoj/grupo de malsamaj porkoj, unudirekta ANOVA-testo estas farita; ####p < 0.0001, ###p < 0.001 kompare kun D0 kaj **p < 0.01 kompare kun D12 ctrl). b Гистограмма показывает количественную оценку жизнеспособности через 12 дней послеви кулрьта кулрез всех 4 условиях культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами срезами серезами серавнению срезами срезами серезами серодц1 (D1) (D1) (D12 Ctrl, D12 TD kaj D12 MT), 12 (D12 MC) срезов/группу от разных свиней, проводится односторонний тест ANOVA; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 по сравнению с D0 и **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). b La stangdiagramo montras la kvantigon de viveblo je 12 tagoj post kulturo en ĉiuj 4 kulturkondiĉoj (kontrolo, TD, MC, kaj MT) kompare kun freŝaj korsekcioj (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD, kaj D12 MT), 12 (D12 MC) sekcioj/grupo de malsamaj porkoj, unudirekta ANOVA-testo; ####p < 0.0001, ###p < 0.001 kontraŭ D0 kaj **p < 0.01 kompare kun D12 Ctrl). b 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) (n = 18 (D150)、D12、 TD 和D12 MT)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；####p < 0.0001，##D01，0##01，相比，**p < 0.01 与D12控制）。b 4 12 (D12 MC) b Гистограмма, показывающая все 4 условия культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнения сравнению сравнения сердца (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD и D12 MT), от разных свиней 12 (D12 MC) срезы/группа, одннос#тороднос#торнос#тора <0,0001, ###p <0,001 по сравнению с D0, **p <0,01 по сравнению с контролем D12). b Histogramo montranta ĉiujn 4 kulturkondiĉojn (kontrolo, TD, MC kaj MT) kompare kun freŝaj korsekcioj (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD kaj D12 MT), de malsamaj porkoj 12 (D12 MC) sekcioj/grupo, unudirekta ANOVA-testo; ####p<0.0001, ###p<0.001 kontraŭ D0, **p<0.01 kontraŭ kontrolo D12). c Stanga diagramo montras la kvantigon de glukoza fluo 12 tagojn post kultivado en ĉiuj 4 kulturkondiĉoj (Ctrl, TD, MC, kaj MT) kompare kun freŝaj kortranĉaĵoj (D0) (n = 6 tranĉaĵoj/grupo de malsamaj porkoj, unudirekta ANOVA-testo estas farita; ###p < 0,001, kompare kun D0 kaj ***p < 0,001 kompare kun D12 Ctrl). c Stanga diagramo montras la kvantigon de glukoza fluo 12 tagojn post kultivado en ĉiuj 4 kulturkondiĉoj (Ctrl, TD, MC, kaj MT) kompare kun freŝaj kortranĉaĵoj (D0) (n = 6 tranĉaĵoj/grupo de malsamaj porkoj, unudirekta ANOVA-testo estas farita; ###p < 0,001, kompare kun D0 kaj ***p < 0,001 kompare kun D12 Ctrl). c Гистограмма показывает количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после кульвта кульвовта 4 условиях культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца = (D0 правнению) (срезами сердца = (D6п) от разных свиней, односторонний Выполняется тест ANOVA ###p < 0,001 по сравнению с D0 и ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Histogramo montras kvantigon de glukozofluo 12 tagojn post-kultivado sub ĉiuj 4 kulturkondiĉoj (kontrolo, TD, MC kaj MT) kompare kun freŝaj korsekcioj (D0) (n = 6 sekcioj/grupo de malsamaj porkoj, unudirekta ANOVA-testo farita; ###p < 0,001 kompare kun D0 kaj ***p < 0,001 kompare kun D12 Ctrl). c 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) 盌厹12）天的葡萄糖通量定量（n = 6 片/组，来自不同猪，单向执行ANOVA 测试；###不p < 0.相比，***p < 0.001 与D12 Ctrl 相比）。 C 条形图 显示 所有 4 种 条件 （（ctrl 、 td 、 mc 和 mt） 新鲜 心脏 切片 切片片戇片扇培养 后 后 12 天 的 通量 定量 （n = 6 片/组 ， 来自 猪 ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ，猪单向执行ANOVA 测试；###p < 0.001，与D0 相比，***p < 0.001 与D12 Ctrl 相比）。 c Гистограмма, показывающая количественную оценку потока глюкозы через 12 дней последи верез всех 4 условий культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердц (n = D60) срезов/группа, от разных свиней, односторонний Были проведены тесты ANOVA ###p < 0,001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению с D12 (контроль). c Histogramo montranta kvantigon de glukozofluo 12 tagojn post la kulturo por ĉiuj 4 kulturkondiĉoj (kontrolo, TD, MC, kaj MT) kompare kun freŝaj korsekcioj (D0) (n = 6 sekcioj/grupo, de malsamaj porkoj, unupartiaj Ĉu ANOVA-testoj estis faritaj, ###p < 0,001 kompare kun D0, ***p < 0,001 kompare kun D12 (kontrolo).d Trostreĉiĝanalizaj grafikaĵoj de freŝaj (bluaj), 12-taga MC (verdaj), kaj 12-taga MT (ruĝaj) histoj ĉe dek regionaj histaj sekcpunktoj (n = 4 tranĉaĵoj/grupo, unudirekta ANOVA-testo; ne estis signifa diferenco inter la grupoj). e Vulkano-diagramo montranta diference esprimitajn genojn en freŝaj korsekcioj (D0) kompare kun korsekcioj kultivitaj sub senmovaj kondiĉoj (Ctrl) aŭ sub MT-kondiĉoj (MT) dum 10-12 tagoj. f Varmomapo de sarkomeraj genoj por korsekcioj kultivitaj sub ĉiu el la kulturkondiĉoj. Erarstangoj reprezentas la meznombron ± norman devion.
Metabola dependeco de la ŝanĝo de grasacida oksidado al glikolizo estas karakterizaĵo de kardiomiocita maldiferenciĝo. Nematuraj kardiomiocitoj ĉefe uzas glukozon por ATP-produktado kaj havas hipoplastajn mitokondriojn kun malmultaj krestetoj5,32. Analizoj de glukoza utiligo montris, ke sub MC kaj MT kondiĉoj, glukoza utiligo estis simila al tiu en histoj de tago 0 (Figuro 4c). Tamen, Ctrl-specimenoj montris signifan pliiĝon en glukoza utiligo kompare kun freŝa histo. Ĉi tio indikas, ke la kombinaĵo de CTCM kaj T3/Dex plibonigas histan viveblecon kaj konservas la metabolan fenotipon de 12-tagaj kultivitaj korsekcioj. Krome, trostreĉa analizo montris, ke trostreĉaj niveloj restis la samaj kiel en freŝa kora histo dum 12 tagoj sub MT kaj MS kondiĉoj (Figuro 4d).
Por analizi la ĝeneralan efikon de CTCM kaj T3/Dex sur la tutmondan transkripcian pejzaĝon de kortranĉa histo, ni efektivigis RNAseq sur kortranĉaĵoj el ĉiuj kvar malsamaj kulturkondiĉoj (Aldona Datumo 1). Interese, MT-sekcioj montris altan transkripcian similecon al freŝa korhisto, kun nur 16 diference esprimitaj el 13 642 genoj. Tamen, kiel ni montris antaŭe, Ctrl-sekcioj montris 1229 diference esprimitajn genojn post 10-12 tagoj en kulturo (Fig. 4e). Ĉi tiuj datumoj estis konfirmitaj per qRT-PCR de koraj kaj fibroblastaj genoj (Aldona Fig. 7a-c). Interese, la Ctrl-sekcioj montris malsuprenreguligon de koraj kaj ĉelciklaj genoj kaj aktivigon de inflamaj genprogramoj. Ĉi tiuj datumoj sugestas, ke maldiferenciĝo, kiu normale okazas post longdaŭra kultivado, estas tute malfortigita sub MT-kondiĉoj (Aldona Fig. 8a,b). Zorgema studo de sarkomeraj genoj montris, ke nur sub MT-kondiĉoj la genoj, kiuj kodas la sarkomeron (Fig. 4f) kaj jonkanalon (Aldona Fig. 9), estas konservitaj, protektante ilin kontraŭ subpremado sub Ctrl, TD, kaj MC-kondiĉoj. Ĉi tiuj datumoj montras, ke per kombinaĵo de mekanika kaj humora stimulo (T3/Dex), la transkriptomo de la kortranĉaĵo povas resti simila al freŝaj kortranĉaĵoj post 12 tagoj en kulturo.
Ĉi tiujn transskribajn trovojn subtenas la fakto, ke la struktura integreco de kardiomiocitoj en korsekcioj estas plej bone konservata sub MT-kondiĉoj dum 12 tagoj, kiel montras sendifekta kaj lokigita koneksino 43 (Fig. 5a). Krome, fibrozo en korsekcioj sub MT-kondiĉoj estis signife reduktita kompare kun Ctrl kaj simile al freŝaj korsekcioj (Fig. 5b). Ĉi tiuj datumoj montras, ke la kombinaĵo de mekanika stimulo kaj T3/Dex-traktado efike konservas korstrukturon en korsekcioj en kulturo.
Reprezentaj imunofluoreskaj bildoj de troponino-T (verda), koneksino 43 (ruĝa), kaj DAPI (blua) en ĵus izolitaj korsekcioj (D0) aŭ kultivitaj dum 12 tagoj en ĉiuj kvar korsekcioj-kulturkondiĉoj (skalbreto = 100 µm). Kvantigo de la struktura integreco de la kora histo per artefaritinteligenteco (n = 7 (D0 kaj D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC kaj D12 MT) tranĉaĵoj/grupo de malsamaj porkoj, unudirekta ANOVA-testo estas farita; ####p < 0,0001 kompare kun D0 kaj *p < 0,05, aŭ ****p < 0,0001 kompare kun D12 Ctrl). Kvantigo de la struktura integreco de la kora histo per artefaritinteligenteco (n = 7 (D0 kaj D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC kaj D12 MT) tranĉaĵoj/grupo de malsamaj porkoj, unudirekta ANOVA-testo estas farita; #### p < 0,0001 kompare kun D0 kaj *p < 0,05, aŭ ****p < 0,0001 kompare kun D12 Ctrl). Количественная оценка структурной целостности ткани сердца с помощью искусственного = инта2 (D01 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC kaj D12 MT) срезов/группу от разных свиней, проведен однофакторный тест ANOVA <1 п#0#0; сравнению с D0 и *p < 0,05 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). Kvantigo de la struktura integreco de kora histo uzante artefaritan inteligentecon (n = 7 (D0 kaj D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC kaj D12 MT) sekcioj/grupo de malsamaj porkoj, unudirekta ANOVA-testo farita; #### p < 0,0001 kompare kun D0 kaj *p < 0,05 aŭ ****p < 0,0001 kompare kun D12 Ctrl).对不同猪的心脏组织结构完整性（n = 7（D0 和D12 Ctrl）、5（D12 TD、D12 MC 和D12 MT）切片/组）进行人工智能量化，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0.0001 与D0 和*p （05*p < 0. 0.0001 与D12 Ctrl 相比）。对 不同 猪 的 心脏 结构 完整性 （n = 7 （d0 和 d12 ctrl） （5 （d12 td 、 d12 mc （12 （mc）人工 智能量 化 进行 单向 单向 单向 测试 ； ########## p < 0.0001 与D0 和*p ，斌*p ，斈****p < 0.05 0.0001 与D12 Ctrl 相比）。Kvantigo de la struktura integreco de kora histo uzante artefaritan inteligentecon en malsamaj porkoj (n = 7 (D0 kaj D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC kaj D12 MT) sekcioj/grupo) per unudirekta ANOVA-testo;#### p < 0,0001 по сравнению с D0 и *p < 0,05 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). #### p < 0,0001 kompare kun D0 kaj *p < 0,05 aŭ ****p < 0,0001 kompare kun D12 Ctrl). b Reprezentaj bildoj kaj kvantigo por kortranĉaĵoj makulitaj per la trikroma tinkturo de Masson (Skalo-strio = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD, kaj D12 MC), 9 (D12 MT) tranĉaĵoj/grupo de malsamaj porkoj, unudirekta ANOVA-testo estas farita; ####p < 0,0001 kompare kun D0 kaj ***p < 0,001, aŭ ****p < 0,0001 kompare kun D12 Ctrl). b Reprezentaj bildoj kaj kvantigo por kortranĉaĵoj makulitaj per la trikroma tinkturo de Masson (Skalo-strio = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD, kaj D12 MC), 9 (D12 MT) tranĉaĵoj/grupo de malsamaj porkoj, unudirekta ANOVA-testo estas farita; ####p < 0,0001 kompare kun D0 kaj ***p < 0,001, aŭ ****p < 0,0001 kompare kun D12 Ctrl). b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трашенных трашенных трашенных траственная Массона (масштабная линейка = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD и D12 MC), 9 (D12 MT) срезов/групапу, срезов/грунхпу зони пу выполняется односторонний тест ANOVA ####p < 0,0001 по сравнению с D0 и ***p <; 0,001 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). b Reprezentaj bildoj kaj kvantigo de korsekcioj makulitaj per la trikroma tinkturo de Masson (skalbreto = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD kaj D12 MC), 9 (D12 MT) sekcioj/grupo de malsamaj porkoj, farita unudirekta ANOVA; ####p < 0,0001 kontraŭ D0 kaj ***p < 0,001 aŭ ****p < 0,0001 kontraŭ D12 Ctrl). b 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像和量化（比例尺= 500 µm）㼈D12010（D12010 Ctrl、D12 TD 和D12 MC），来自不同猪的9 个（D12 MT）切片/组，进行单单因素方单同猪的9 个（D12 MT）切片/组，进行单因素方单因素方#单同猪的9＆#0.与D0 相比，***p < 0,001，或****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）。 b 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 和 量化 （比例 尺 尺 尺 = 500 µm（ 100 µm = 500 µm d d12 ctrl 、 d12 td 和 d12 mc） 来自 不同 的 9 个 d12 mt 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片/组，进行单因素方差分析；####p < 0.000p < 0.00 方差分析； < 0.001，或****p < 0.0001 与D12 Ctrl 相比）。 b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трашенных тросомна трос (масштабная линейка = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD и D12 MC), 9 (D12 MT) срезов от разных разных свинудпы / свинудпы способ ANOVA ####p < 0,0001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 или ****p < 0,0001; по сравнению с D12 Ctrl). b Reprezentaj bildoj kaj kvantigo de korsekcioj makulitaj per la trikromo de Masson (skalbreto = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD kaj D12 MC), 9 (D12 MT) sekcioj de malsamaj porkoj/grupo, unu ANOVA-metodo; ####p < 0,0001 kompare kun D0, ***p < 0,001 aŭ ****p < 0,0001 kompare kun D12 Ctrl).Erarstangoj reprezentas la meznombron ± norman devion.
Fine, la kapablo de CTCM imiti koran hipertrofion estis taksita per pliigo de kora hista streĉo. En CTCM, la pinta aerkamera premo pliiĝis de 80 mmHg ĝis 80 mmHg (normala streĉo) ĝis 140 mmHg (Fig. 6a). Ĉi tio korespondas al 32%-a pliiĝo de streĉo (Fig. 6b), kiu antaŭe estis montrita kiel la koresponda procenta streĉo necesa por ke korsekcioj atingu sarkomeran longon similan al tiu vidita en hipertrofio. Streĉo kaj rapideco de kora histo dum kuntiriĝo kaj malstreĉiĝo restis konstantaj dum ses tagoj da kulturo (Fig. 6c). Kora histo el MT-kondiĉoj estis submetita al normala streĉo (MT (Normala)) aŭ trostreĉaj kondiĉoj (MT (OS)) dum ses tagoj. Jam post kvar tagoj en kulturo, la hipertrofa biosigno NT-ProBNP estis signife pliigita en la medio sub MT (OS) kondiĉoj kompare kun MT (normalaj) kondiĉoj (Fig. 7a). Krome, post ses tagoj da kultivado, la ĉelgrandeco en MT (OS) (Fig. 7b) signife pliiĝis kompare kun sekcioj de MT-koro (normala). Krome, la nuklea translokigo de NFATC4 signife pliiĝis en trostreĉitaj histoj (Fig. 7c). Ĉi tiuj rezultoj montras la progreseman disvolviĝon de patologia remodelado post hiperdistensio kaj subtenas la koncepton, ke la CTCM-aparato povas esti uzata kiel platformo por studi streĉ-induktitan korhipertrofian signaladon.
Reprezentaj spuroj de aerkamera premo, fluidkamera premo, kaj histomovadmezuradoj konfirmas, ke la kamera premo ŝanĝas la fluidkameran premon, kaŭzante korespondan movadon de la histotranĉaĵo. b Reprezentaj kurboj de streĉa procento kaj streĉrapideco por normale streĉitaj (oranĝaj) kaj tro streĉitaj (bluaj) histosekcioj. c Stanga diagramo montranta ciklotempon (n = 19 tranĉaĵoj por grupo, de malsamaj porkoj), kuntiriĝtempon (n = 18-19 tranĉaĵoj por grupo, de malsamaj porkoj), malstreĉiĝtempon (n = 19 tranĉaĵoj por grupo, de malsamaj porkoj)), amplitudon de histomovado (n = 14 tranĉaĵoj/grupo, de malsamaj porkoj), pintan sistolian rapidon (n = 14 tranĉaĵoj/grupo, de malsamaj porkoj) kaj pintan malstreĉiĝrapidecon (n = 14 (D0), 15 (D6)) sekcioj/grupoj) de malsamaj porkoj, duvosta Studenta t-testo montris neniun signifan diferencon en iu ajn parametro, indikante, ke ĉi tiuj parametroj restis konstantaj dum 6 tagoj da kulturo kun trotensio. Erarstangoj reprezentas la meznombron ± norman devion.
Stanga diagramo-kvantigo de NT-ProBNP-koncentriĝo en kulturmedioj el kortranĉaĵoj kultivitaj sub MT normalaj streĉaj (Norm) aŭ trostreĉaj (OS) kondiĉoj (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, kaj D4 MTOS) tranĉaĵoj/grupo el malsamaj porkoj, Dudirekta ANOVA estas farita; **p < 0,01 kompare kun normala streĉo). Stangografika kvantigo de NT-ProBNP-koncentriĝo en kulturmedioj el kortranĉaĵoj kultivitaj sub MT normalaj streĉaj (Norm) aŭ trostreĉaj (OS) kondiĉoj (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, kaj D4 MTOS) tranĉaĵoj/grupo el malsamaj porkoj, Dudirekta ANOVA estas farita; **p < 0,01 kompare kun normala streĉo).Kvanta histogramo de NT-ProBNP-koncentriĝo en kulturmedio el kortranĉaĵoj kultivitaj sub kondiĉoj de normala MT-streĉado (normo) aŭ trostreĉado (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, kaj D4).MTOS) tranĉaĵoj/grupo el malsamaj porkoj, du-faktora variancoanalizo estas farita;**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p < 0,01 kompare kun normala streĉado). a 在MT 正常拉伸(Norm) 或过度拉伸(OS) 条件下培养的心脏切片培养基中NT-ProBNP浓度的条形图量化（n = 4 (D2 MTNorm)、3（D2 MTOS、D4 MTNorm 和D4 MTOS）来自不同猪的切片/组，进行双向方差分析；**与正常拉伸相比，p < 0,01） Kvantigo de NT-ProBNP-koncentriĝo en kortranĉaĵoj kultivitaj sub MT normala streĉado (Normo) aŭ trostreĉado (OS) kondiĉoj (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm和D4 MTOS) de malsamaj猪的切片/组，可以双向方方发发动 **kompare kun normala streĉado, p < 0,01).histogramo Kvantigo de NT-ProBNP-koncentriĝoj en kortranĉaĵoj kultivitaj sub kondiĉoj de normala MT-streĉado (normo) aŭ trostreĉado (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm) kaj D4 MTOS) tranĉaĵoj/grupo de malsamaj porkoj, dudirekta variancoanalizo;**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p < 0,01 kompare kun normala streĉado). b Reprezentaj bildoj por kortranĉaĵoj makulitaj per troponino-T kaj WGA (maldekstre) kaj ĉelgrandeca kvantigo (dekstre) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) ĉeloj/grupo el 10 malsamaj tranĉaĵoj el malsamaj porkoj, Du-vosta Studenta t-testo estas farita; ****p < 0,0001 kompare kun normala streĉado). b Reprezentaj bildoj por kortranĉaĵoj makulitaj per troponino-T kaj WGA (maldekstre) kaj ĉelgrandeca kvantigo (dekstre) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) ĉeloj/grupo el 10 malsamaj tranĉaĵoj el malsamaj porkoj, Duvosta Studenta t-testo estas farita; ****p < 0,0001 kompare kun normala streĉado). b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (сленсова) ичнова определения размера клеток (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) клеток/группу из 10 разных срезных срезных срезных срезных срезных два- проводится хвостовой t-критерий Стьюдента ****p < 0,0001 по сравнению с нормальным растяжением). b Reprezentaj bildoj de korsekcioj makulitaj per troponino-T kaj AZP (maldekstre) kaj ĉelgrandeckvantigo (dekstre) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) ĉeloj/grupo el 10 malsamaj sekcioj el malsamaj porkoj, duvosta Studenta t-testo estis farita; ****p < 0,0001 kompare kun normala trostreĉiĝo). b 用肌钙蛋白-T 和WGA（左）和细胞大小量化（右）染色的心脏切片的代表切的代表性30大小量化（右）染色的心脏切片的代表怏30） MTOS），来自不同猪的10 个不同切片的369（D6 MTNorm）细胞/组，两进行有尾学生t检验；与正常拉伸相比，****p < 0.0001）。 b Reprezentaj bildoj de kortranĉaĵoj makulitaj per kalkareino-T kaj WGA (maldekstre) kaj ĉelgrandeco (dekstre) (n = 330 (D6 MTOS), 369 el 10 malsamaj tranĉaĵoj (D6 MTNorm)) Ĉeloj/kg, t-testo; kompare kun normala streĉado, ****p < 0,0001). b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (сленсова) ичнативные оценка размера клеток (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) из 10 различных срезов от разныей разныей Клетки/группа, двусторонние критерий Стьюдента ****p < 0,0001 по сравнению с нормальным; rompo). b Reprezentaj bildoj de korsekcioj makulitaj per troponino-T kaj AZP (maldekstre) kaj kvantigo de ĉelgrandeco (dekstre) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) el 10 malsamaj sekcioj el malsamaj porkoj) Ĉeloj/grupo, duvosta kriterio Studenta t; ****p < 0,0001 kompare kun normala trostreĉiĝo). c Reprezentaj bildoj por tago 0 kaj tago 6 MTOS-kortranĉaĵoj imunomarkitaj por troponino-T kaj NFATC4 kaj kvantigo de la translokigo de NFATC4 al la nukleoj de CM-oj (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) tranĉaĵoj/grupo de malsamaj porkoj, Du-vosta Studenta t-testo estas farita; *p < 0,05). c Reprezentaj bildoj por tago 0 kaj tago 6 MTOS-kortranĉaĵoj imunomarkitaj por troponino-T kaj NFATC4 kaj kvantigo de la translokigo de NFATC4 al la nukleoj de CM-oj (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) tranĉaĵoj/grupo de malsamaj porkoj, Du-vosta Studenta t-testo estas farita; *p < 0,05). c Репрезентативные изображения для срезов сердца 0 и 6 дней MTOS, иммуномеченых для тропон, инFA для тропон и трозентативные количественная оценка транслокации NFATC4 в ядра кавернозных клеток (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) сретурапу/горнозных клеток свиней , выполняется двусторонний t-критерий Стьюдента *p < 0,05). c Reprezentaj bildoj por korsekcioj je 0 kaj 6 tagoj MTOS, imunomarkitaj por troponino-T kaj NFATC4, kaj kvantigo de NFATC4-translokigo en la nukleo de kavernecaj ĉeloj (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) tranĉaĵoj/grupo de malsamaj porkoj) plenumis duvostan Studentan t-teston; *p < 0,05). c 用于肌钙蛋白-T 和NFATC4 免疫标记的第0 天和第6 天MTOS心脏切片的代表性图像，以及来自不同猪的NFATC4 易位至CM 细胞核的量化 （D0) = 、（D0)切片/组, 进行双尾学生t 检验；*p < 0.05)。 c Reprezentaj bildoj de calcanin-T kaj NFATC4 imunomarkado 第0天和第6天MTOS kortranĉaĵoj, kaj NFATC4 de malsama NFATC4 易位至CM ĉelkerno的kvanto化 (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS,)时间双尾学生et 电影；*p < 0,05). c Репрезентативные изображения срезов сердца MTOS на 0 и 6 день для иммуномаркировки тромповки тромпон 4 день количественная оценка транслокации NFATC4 в ядра CM от разных свиней (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срезных/грустап,грус t-критерий Стьюдента *p < 0,05). c Reprezentaj bildoj de MTOS-kortranĉaĵoj je tagoj 0 kaj 6 por troponino-T kaj NFATC4-imunomarkado kaj kvantigo de NFATC4-translokigo en la nukleo de CM de malsamaj porkoj (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) tranĉaĵoj/grupo, duvosta t-kriterio de Student; *p < 0,05).Erarstangoj reprezentas meznombron ± norman devion.
Translacia kardiovaskula esplorado postulas ĉelajn modelojn, kiuj precize reproduktas la koran medion. En ĉi tiu studo, CTCM-aparato estis evoluigita kaj karakterizita, kiu povas stimuli ultramaldikajn sekciojn de la koro. La CTCM-sistemo inkluzivas fiziologie sinkronigitan elektromekanikan stimulon kaj riĉigon per T3 kaj Dex-fluidoj. Kiam porkaj korsekcioj estis eksponitaj al ĉi tiuj faktoroj, ilia viveblo, struktura integreco, metabola aktiveco kaj transskriba esprimo restis la samaj kiel en freŝa korhisto post 12 tagoj da kultivado. Krome, troa streĉado de korhisto povas kaŭzi hipertrofion de la koro kaŭzitan de hiperetendiĝo. Ĝenerale, ĉi tiuj rezultoj subtenas la kritikan rolon de fiziologiaj kulturkondiĉoj en konservado de normala kora fenotipo kaj provizas platformon por medikamento-testado.
Multaj faktoroj kontribuas al kreado de optimuma medio por la funkciado kaj supervivo de kardiomiocitoj. La plej evidentaj el ĉi tiuj faktoroj rilatas al (1) interĉelaj interagoj, (2) elektromekanika stimulo, (3) humoraj faktoroj, kaj (4) metabolaj substratoj. Fiziologiaj ĉel-al-ĉelaj interagoj postulas kompleksajn tridimensiajn retojn de pluraj ĉeltipoj subtenataj de eksterĉela matrico. Tiajn kompleksajn ĉelajn interagojn malfacilas rekonstrui in vitro per kunkultivado de individuaj ĉeltipoj, sed povas esti facile atingitaj uzante la organotipan naturon de korsekcioj.
Mekanika streĉado kaj elektra stimulo de kardiomiocitoj estas kritikaj por konservi koran fenotipon33,34,35. Dum mekanika stimulo estis vaste uzata por hiPSC-CM-kondiĉado kaj maturiĝo, pluraj elegantaj studoj ĵus provis mekanikan stimulon de kortranĉaĵoj en kulturo uzante uniaksan ŝarĝon. Ĉi tiuj studoj montras, ke 2D uniaksa mekanika ŝarĝo havas pozitivan efikon sur la fenotipon de la koro dum kulturo. En ĉi tiuj studoj, sekcioj de la koro estis aŭ ŝarĝitaj per izometraj streĉfortoj17, lineara aŭksotona ŝarĝo18, aŭ la kora ciklo estis rekreita uzante fortotransduktilan retroligon kaj streĉajn transmisiojn. Tamen, ĉi tiuj metodoj uzas uniaksan histostreĉadon sen media optimumigo, rezultante en la subpremado de multaj korgenoj aŭ troesprimo de genoj asociitaj kun nenormalaj streĉrespondoj. La CTCM priskribita ĉi tie provizas 3D elektromekanikan stimulon, kiu imitas la naturan koran ciklon laŭ ciklotempo kaj fiziologia streĉado (25% streĉado, 40% sistolo, 60% diastolo, kaj 72 batoj minute). Kvankam ĉi tiu tridimensia mekanika stimulo sole ne sufiĉas por konservi histan integrecon, kombinaĵo de humora kaj mekanika stimulo uzante T3/Dex estas necesa por adekvate konservi histan viveblecon, funkcion kaj integrecon.
Humoralaj faktoroj ludas gravan rolon en modulado de la fenotipo de la plenkreska koro. Ĉi tio estis elstarigita en studoj pri HiPS-CM, en kiuj T3 kaj Dex estis aldonitaj al kulturmedioj por akceli ĉelmaturiĝon. T3 povas influi la transporton de aminoacidoj, sukeroj kaj kalcio trans ĉelmembranojn36. Krome, T3 antaŭenigas MHC-α esprimon kaj malsuprenreguligon de MHC-β, antaŭenigante la formadon de rapidaj konvulsiaj miofibriloj en maturaj kardiomiocitoj kompare kun malrapidaj konvulsiaj miofibriloj en feta CM. Manko de T3 en hipotiroidaj pacientoj rezultigas la perdon de miofibrilaj bendoj kaj reduktitan rapidecon de tono-disvolviĝo37. Dex agas sur glukokortikoidaj receptoroj kaj oni montris, ke ĝi pliigas miokardian kuntiriĝon en izolitaj perfuzitaj koroj;38 oni supozas, ke ĉi tiu plibonigo rilatas al la efiko sur kalcia deponaĵo-movita eniro (SOCE)39,40. Krome, Dex ligiĝas al siaj receptoroj, kaŭzante larĝan intraĉelan respondon, kiu subpremas imunfunkcion kaj inflamon30.
Niaj rezultoj indikas, ke fizika mekanika stimulo (MS) plibonigis la ĝeneralan kulturefikecon kompare kun Ctrl, sed ne sukcesis konservi viveblecon, strukturan integrecon kaj koran esprimon dum 12 tagoj en kulturo. Kompare kun Ctrl, aldono de T3 kaj Dex al CTCM (MT) kulturoj plibonigis viveblecon kaj konservis similajn transskribprofilojn, strukturan integrecon kaj metabolan agadon kun freŝa korhisto dum 12 tagoj. Krome, per kontrolado de la grado de hista streĉo, hiperetendiĝo-induktita kora hipertrofia modelo estis kreita uzante STCM, ilustrante la versatilecon de la STCM-sistemo. Notindas, ke kvankam kora remodelado kaj fibrozo kutime implikas sendifektajn organojn, kies cirkulantaj ĉeloj povas provizi la taŭgajn citokinojn same kiel fagocitozon kaj aliajn remodeligajn faktorojn, sekcioj de la koro ankoraŭ povas imiti la fibrozan procezon en respondo al streso kaj traŭmato en miofibroblastojn. Ĉi tio estis antaŭe taksita en ĉi tiu kora tranĉaĵa modelo. Notindas, ke CTCM-parametroj povas esti modulitaj per ŝanĝo de premo/elektra amplitudo kaj frekvenco por simuli multajn kondiĉojn kiel takikardio, bradikardio kaj mekanika cirkula subteno (mekanika malŝarĝita koro). Tio faras la sistemon mezan trafluon por drogtestado. La kapablo de CTCM modeli trostreĉo-induktitan korhipertrofion pavimas la vojon por testi ĉi tiun sistemon por personigita terapio. Konklude, la nuna studo montras, ke mekanika streĉado kaj humora stimulo estas kritikaj por konservi la kulturon de korhistaj sekcioj.
Kvankam la datumoj prezentitaj ĉi tie sugestas, ke CTCM estas tre promesplena platformo por modelado de sendifekta miokardio, ĉi tiu kulturmetodo havas kelkajn limigojn. La ĉefa limigo de CTCM-kulturo estas, ke ĝi trudas kontinuajn dinamikajn mekanikajn streĉojn sur la tranĉaĵoj, kio malhelpas la kapablon aktive monitori kortranĉaĵojn dum ĉiu ciklo. Krome, pro la eta grandeco de korsekcioj (7 mm), la kapablo taksi sistolan funkcion ekster kultursistemoj uzante tradiciajn fortsensilojn estas limigita. En la nuna manuskripto, ni parte superas ĉi tiun limigon per taksado de optika tensio kiel indikilo de kuntiriĝa funkcio. Tamen, ĉi tiu limigo postulos plian laboron kaj eble estos traktita en la estonteco per enkonduko de metodoj por optika monitorado de la funkcio de kortranĉaĵoj en kulturo, kiel ekzemple optika mapado uzante kalcion kaj tensi-sentemajn tinkturfarbojn. Alia limigo de CTCM estas, ke la laboranta modelo ne manipulas fiziologian streĉon (antaŭŝarĝo kaj postŝarĝo). En CTCM, premo estis induktita en kontraŭaj direktoj por reprodukti 25% fiziologian streĉon en diastolo (plena streĉo) kaj sistolo (daŭro de kuntiriĝo dum elektra stimulo) en tre grandaj histoj. Ĉi tiu limigo devus esti forigita en estontaj CTCM-dezajnoj per adekvata premo sur la kora histo de ambaŭ flankoj kaj per aplikado de la precizaj premo-volumenaj rilatoj, kiuj okazas en la kameroj de la koro.
La trostreĉ-induktita remodelado raportita en ĉi tiu manuskripto limiĝas al imitado de hipertrofaj hiperstreĉaj signaloj. Tiel, ĉi tiu modelo povas helpi en la studo de streĉ-induktita hipertrofa signalado sen la bezono de humoraj aŭ neŭralaj faktoroj (kiuj ne ekzistas en ĉi tiu sistemo). Pliaj studoj estas necesaj por pliigi la diversecon de CTCM, ekzemple, kunkultivado kun imunĉeloj, cirkulantaj plasmaj humoraj faktoroj, kaj nervizado dum kunkultivado kun neŭronaj ĉeloj plibonigos la eblecojn de malsanmodelado per CTCM.
Dek tri porkoj estis uzitaj en ĉi tiu studo. Ĉiuj bestaj proceduroj estis faritaj laŭ instituciaj gvidlinioj kaj estis aprobitaj de la Institucia Komitato pri Bestoprizorgo kaj Uzo de la Universitato de Louisville. La aortarko estis fiksita kaj la koro estis perfuzita per 1 L da sterila kardioplegio (110 mM NaCl, 1.2 mM CaCl2, 16 mM KCl, 16 mM MgCl2, 10 mM NaHCO3, 5 U/mL heparino, pH ĝis 7.4); la koroj estis konservitaj en glacimalvarma kardioplegia solvaĵo ĝis transportado al la laboratorio sur glacio, kio kutime daŭras <10 minutojn. la koroj estis konservitaj en glacimalvarma kardioplegia solvaĵo ĝis transportado al la laboratorio sur glacio, kio kutime daŭras <10 minutojn. сердца хранили в ледяном кардиоплегическом растворе до транспортировки в лабораторию на, льдон на занимает <10 мин. koroj estis konservitaj en glacimalvarma kardioplegia solvaĵo ĝis transporto al la laboratorio sur glacio, kiu kutime daŭras <10 minutojn.将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钟将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钟 Держите сердца в ледяной кардиоплегии до транспортировки в лабораторию на льду, обычно <10. Konservu korojn sur glacio por kardioplegio ĝis transporto al la laboratorio sur glacio, kutime <10 min.
La CTCM-aparato estis evoluigita per la komputil-helpata dezajna (CAD) programaro SolidWorks. La kulturĉambroj, dividiloj kaj aerĉambroj estas faritaj el CNC-klara akrila plasto. La 7mm diametra subtena ringo estas farita el alt-denseca polietileno (HDPE) en la centro kaj havas O-ringan kanelon por akomodi la silikonan O-ringon uzatan por sigeli la medion sube. Maldika silika membrano apartigas la kulturĉambron de la apartiga plato. La silikona membrano estas lasere tranĉita el 0,02″ dika silikona folio kaj havas malmolecon de 35A. La malsupraj kaj supraj silikonaj kusenetoj estas lasere tranĉitaj el 1/16″ dika silikona folio kaj havas malmolecon de 50A. Ŝraŭboj kaj flugilŝraŭbingoj el 316L-neoksidebla ŝtalo estas uzataj por fiksi la blokon kaj krei hermetikan sigelon.
Dediĉita presita cirkvitplato (PCB) estas desegnita por esti integrita kun la sistemo C-PACE-EM. La konektiloj de la svisa maŝino sur la PCB estas konektitaj al grafitaj elektrodoj per arĝentkovritaj kupraj dratoj kaj bronzaj 0-60 ŝraŭboj ŝraŭbitaj en la elektrodojn. La presita cirkvitplato estas metita en la kovrilon de la 3D-printilo.
La CTCM-aparato estas kontrolata per programebla pneŭmatika aktuatoro (PPD), kiu kreas kontrolitan cirkulan premon similan al kora ciklo. Dum la premo ene de la aerkamero pliiĝas, la fleksebla silikona membrano disetendiĝas supren, devigante la medion sub la histan lokon. La areo de histo tiam estos streĉita per ĉi tiu elpelo de fluido, imitante la fiziologian disetendiĝon de la koro dum diastolo. Ĉe la pinto de malstreĉiĝo, elektra stimulo estis aplikita per grafitaj elektrodoj, kiuj reduktis la premon en la aerkamero kaj kaŭzis kuntiriĝon de histaj sekcioj. Interne de la tubo estas hemostata valvo kun premsensilo por detekti la premon en la aersistemo. La premo sentita de la premsensilo estas aplikita al datenkolektilo konektita al la tekokomputilo. Ĉi tio permesas kontinuan monitoradon de la premo ene de la gaskamero. Kiam la maksimuma kamera premo estis atingita (norma 80 mmHg, 140 mmHg OS), la datenakira aparato estis ordonita sendi signalon al la C-PACE-EM-sistemo por generi dufazan tensiosignalon dum 2 ms, agorditan je 4 V.
Korsekcioj estis akiritaj kaj kulturkondiĉoj en 6 putoj estis plenumitaj jene: Translokigu la rikoltitajn korojn el la translokiga ujo al pleto enhavanta malvarman (4°C) kardioplegion. La maldekstra ventriklo estis izolita per sterila klingo kaj tranĉita en pecojn de 1-2 cm3. Ĉi tiuj histoblokoj estis fiksitaj al histosubteniloj per hista gluo kaj metitaj en vibrantan mikrotoman histobanon enhavantan Tyrode-solvaĵon kaj kontinue oksigenitan (3 g/L 2,3-butanediona monooksimo (BDM), 140 mM NaCl (8.18 g)), 6 mM KCl (0.447 g), 10 mM D-glukozo (1.86 g), 10 mM HEPES (2.38 g), 1 mM MgCl2 (1 ml 1 M solvaĵo), 1.8 mM CaCl2 (1.8 ml 1 M solvaĵo), ĝis 1 L ddH2O). La vibranta mikrotomo estis agordita por tranĉi 300 µm dikajn tranĉaĵojn je frekvenco de 80 Hz, horizontala vibrada amplitudo de 2 mm, kaj antaŭenirapideco de 0.03 mm/s. La hista bano estis ĉirkaŭita per glacio por teni la solvaĵon malvarmeta kaj la temperaturo estis konservita je 4°C. Transdonu histajn sekciojn de la mikrotoma bano al inkubacia bano enhavanta kontinue oksigenitan Tyrode-solvaĵon sur glacio ĝis sufiĉe da sekcioj estas akiritaj por unu kulturplato. Por transputaj kulturoj, histaj sekcioj estis fiksitaj al sterilaj 6 mm larĝaj poliuretanaj subtenoj kaj metitaj en 6 ml da optimumigita medio (199-medio, 1x ITS-aldonaĵo, 10% FBS, 5 ng/ml VEGF, 10 ng/ml FGF-alkala kaj 2X antibiotika-kontraŭfunga). Elektra stimulo (10 V, frekvenco 1.2 Hz) estis aplikita al la histaj sekcioj per la C-Pace. Por TD-kondiĉoj, freŝa T3 kaj Dex estis aldonitaj je 100 nM kaj 1 μM ĉe ĉiu medioŝanĝo. La medio estas saturita per oksigeno antaŭ anstataŭigo 3 fojojn tage. Histaj sekcioj estis kultivitaj en inkubatoro je 37°C kaj 5% CO2.
Por CTCM-kulturoj, histaj sekcioj estis metitaj sur speciale faritan 3D-printilon en Petri-plado enhavanta modifitan Tyrode-solvaĵon. La aparato estas desegnita por pliigi la grandecon de la kortranĉaĵo je 25% de la areo de la subtena ringo. Ĉi tio estas farita tiel, ke la sekcioj de la koro ne streĉiĝu post translokigo de Tyrode-solvaĵo al la medio kaj dum diastolo. Uzante histoakrilan gluon, sekcioj 300 µm dikaj estis fiksitaj sur subtena ringo 7 mm en diametro. Post alkroĉado de la histaj sekcioj al la subtena ringo, fortranĉu la superfluajn histajn sekciojn kaj metu la alkroĉitajn histajn sekciojn reen en la banon de Tyrode-solvaĵo sur glacio (4°C) ĝis sufiĉe da sekcioj estas preparitaj por unu aparato. La tuta prilabora tempo por ĉiuj aparatoj ne devas superi 2 horojn. Post kiam 6 histaj sekcioj estis alkroĉitaj al siaj subtenaj ringoj, la CTCM-aparato estas kunmetita. La CTCM-kulturkamero estas antaŭplenigita per 21 ml da antaŭoksigenita medio. Transdonu la histajn sekciojn al la kulturkamero kaj zorge forigu iujn ajn aervezikojn per pipeto. La hista sekcio estas poste gvidata en la truon kaj milde premita en sian lokon. Fine, metu la elektrodan ĉapon sur la aparaton kaj translokigu la aparaton al la inkubatoro. Poste konektu la CTCM-on al la aertubo kaj la C-PACE-EM-sistemo. La pneŭmatika aktuatoro malfermiĝas kaj la aervalvo malfermas la CTCM-on. La C-PACE-EM-sistemo estis agordita por liveri 4 V je 1.2 Hz dum dufaza stimulado dum 2 ms. La medio estis ŝanĝita dufoje tage kaj la elektrodoj estis ŝanĝitaj unufoje tage por eviti amasiĝon de grafito sur la elektrodoj. Se necese, histaj sekcioj povas esti forigitaj el siaj kulturputoj por forpeli iujn ajn aervezikojn, kiuj eble falis sub ilin. Por MT-traktadkondiĉoj, T3/Dex estis aldonita freŝe kun ĉiu medioŝanĝo kun 100 nM T3 kaj 1 μM Dex. La CTCM-aparatoj estis kultivitaj en inkubatoro je 37°C kaj 5% CO2.
Por akiri streĉitajn trajektoriojn de kortranĉaĵoj, speciala kamera sistemo estis evoluigita. SLR-fotilo (Canon Rebel T7i, Canon, Tokio, Japanio) estis uzata kun Navitar Zoom 7000 18-108mm makro-lenso (Navitar, San-Francisko, Kalifornio). La bildigo estis farita je ĉambra temperaturo post anstataŭigo de la medio per freŝa medio. La fotilo estas poziciigita laŭ 51° angulo kaj la video estas registrita je 30 kadroj por sekundo. Unue, malfermfonteca programaro (MUSCLEMOTION43) estis uzata kun Image-J por kvantigi la moviĝon de kortranĉaĵoj. La masko estis kreita uzante MATLAB (MathWorks, Natick, MA, Usono) por difini interesregionojn por batantaj kortranĉaĵoj por eviti bruon. Mane segmentitaj maskoj estas aplikitaj al ĉiuj bildoj en kadra sekvenco kaj poste transdonitaj al la MUSCLEMOTION-kromprogramo. Muscle Motion uzas la mezan intensecon de la pikseloj en ĉiu kadro por kvantigi ĝian movadon relative al la referenca kadro. Datumoj estis registritaj, filtritaj kaj uzitaj por kvantigi la ciklotempon kaj taksi la histan streĉon dum la korciklo. La registrita filmeto estis post-prilaborita uzante unuaordan nul-fazan ciferecan filtrilon. Por kvantigi histan streĉon (pinto-al-pinto), pinto-al-pinto analizo estis farita por distingi inter pintoj kaj valoj en la registrita signalo. Krome, maltendenco estas farita uzante 6-ordajn polinomojn por elimini signalan drivon. Programkodo estis evoluigita en MATLAB por determini tutmondan histan moviĝon, ciklotempon, malstreĉiĝtempon kaj kuntiriĝtempon (Aldona Programa Kodo 44).
Por analizo de streĉo, uzante la samajn filmetojn kreitajn por takso de mekanika streĉo, ni unue spuris du bildojn reprezentantajn moviĝajn pintojn (la plej altaj (supraj) kaj plej malaltaj (malsupraj) punktoj de moviĝo) laŭ la programaro MUSCLEMOTION. Ni poste segmentis la histregionojn kaj aplikis formon de ombra algoritmo al la segmentita histo (Aldona Figuro 2a). La segmentita histo estis poste dividita en dek subsurfacojn, kaj la streĉo sur ĉiu surfaco estis kalkulita uzante la jenan ekvacion: Deformo = (Sup-Sdown)/Sdown, kie Sup kaj Sdown estas la distancoj de la formo de la supraj kaj malsupraj ombroj de la ŝtofo, respektive (Aldona Figuro 2b).
Korsekcioj estis fiksitaj en 4% paraformaldehido dum 48 horoj. Fiksitaj histoj estis senakvigitaj en 10% kaj 20% sakarozo dum 1 horo, poste en 30% sakarozo dum la nokto. La sekcioj estis poste enmetitaj en optimuman tranĉtemperaturan kombinaĵon (OCT-komponaĵo) kaj iom post iom frostigitaj en izopentano/sekglacia bano. Konservu OCT-enmetajn blokojn je -80 °C ĝis apartigo. Lamenoj estis preparitaj kiel sekcioj kun dikeco de 8 μm.
Por forigi OCT-on el korsekcioj, varmigu la lamvitrojn sur hejtilo je 95 °C dum 5 minutoj. Aldonu 1 ml da PBS al ĉiu lamvitro kaj kovu dum 30 minutoj je ĉambra temperaturo, poste trapenetru la sekciojn per agordo de 0.1% Triton-X en PBS dum 15 minutoj je ĉambra temperaturo. Por malhelpi nespecifajn antikorpojn ligiĝi al la specimeno, aldonu 1 ml da 3% BSA-solvaĵo al la lamvitroj kaj kovu dum 1 horo je ĉambra temperaturo. La BSA estis poste forigita kaj la lamvitroj estis lavitaj per PBS. Marku ĉiun specimenon per krajono. Primaraj antikorpoj (diluitaj 1:200 en 1% BSA) (koneksino 43 (Abcam; #AB11370), NFATC4 (Abcam; #AB99431) kaj troponino-T (Thermo Scientific; #MA5-12960) estis aldonitaj dum 90 minutoj, poste sekundaraj antikorpoj (diluitaj 1:200 en 1% BSA) kontraŭ musa Alexa Fluor 488 (Thermo Scientific; #A16079), kontraŭ kunikla Alexa Fluor 594 (Thermo Scientific; #T6391) dum pliaj 90 minutoj. Lavita 3 fojojn per PBS. Por distingi celan koloradon de la fono, ni uzis nur la sekundaran antikorpon kiel kontrolon. Fine, DAPI-nuklea tinkturfarbo estis aldonita kaj la lamenoj estis metitaj en vectashield (Vector Laboratories) kaj sigelitaj per ungolako. (-x pligrandigo) kaj Keyence-mikroskopo kun 40-x pligrandigo.
WGA-Alexa Fluor 555 (Thermo Scientific; #W32464) je 5 μg/ml en PBS estis uzata por WGA-kolorigo kaj aplikita al fiksitaj sekcioj dum 30 minutoj je ĉambra temperaturo. La lamenoj estis poste lavitaj per PBS kaj Sudan-nigro estis aldonita al ĉiu lameno kaj inkubaciitaj dum 30 minutoj. La lamenoj estis poste lavitaj per PBS kaj vectashield-enkorpiga medio estis aldonita. La lamenoj estis bildigitaj per Keyence-mikroskopo je 40-obla pligrandigo.
OCT estis forigita el la specimenoj kiel priskribite supre. Post forigo de la OCT, mergu la lamvitrojn en la solvaĵo de Bouin dum la nokto. La lamvitroj estis poste ellavitaj per distilita akvo dum 1 horo kaj poste metitaj en solvaĵon de Bibrich-aloeacido-fuksino dum 10 minutoj. Poste la lamvitroj estis lavitaj per distilita akvo kaj metitaj en solvaĵon de 5% fosfomolibdeno/5% fosfovolframa acido dum 10 minutoj. Sen ellavado, translokigu la lamvitrojn rekte en la anilinan bluan solvaĵon dum 15 minutoj. Poste la lamvitroj estis lavitaj per distilita akvo kaj metitaj en 1% acetacidan solvaĵon dum 2 minutoj. La lamvitroj estis sekigitaj en 200 N etanolo kaj translokigitaj al ksileno. Makulitaj lamvitroj estis bildigitaj per Keyence-mikroskopo kun 10x objektivo. La procento de fibroza areo estis kvantigita per la programaro Keyence Analyzer.
CyQUANT™ MTT Ĉela Vivebleca Analizo (Invitrogen, Carlsbad, Kalifornio), katalognumero V13154, laŭ la protokolo de la fabrikanto kun kelkaj modifoj. Aparte, kirurgia stampilo kun diametro de 6 mm estis uzata por certigi unuforman histograndecon dum MTT-analizo. Histoj estis individue platigitaj en la putojn de 12-puta plato enhavanta MTT-substraton laŭ la protokolo de la fabrikanto. La sekcioj estas kovitaj je 37°C dum 3 horoj kaj la vivanta histo metaboligas la MTT-substraton por formi purpuran formazanan komponaĵon. Anstataŭigu la MTT-solvaĵon per 1 ml da DMSO kaj kovigu je 37 °C dum 15 minutoj por ekstrakti purpuran formazanon el korsekcioj. Specimenoj estis diluitaj 1:10 en DMSO en 96-putaj klaraj fundaj platoj kaj la purpura kolorintenseco estis mezurita je 570 nm uzante Cytation-platlegilon (BioTek). La legaĵoj estis normaligitaj al la pezo de ĉiu tranĉaĵo de la koro.
La kortranĉaĵa medio estis anstataŭigita per medio enhavanta 1 μCi/ml [5-3H]-glukozon (Moravek Biochemicals, Brea, CA, Usono) por glukoza utiliganalizo kiel antaŭe priskribite. Post 4 horoj da inkubacio, aldonu 100 µl da medio al malferma mikrocentrifugila tubo enhavanta 100 µl da 0.2 N HCl. Poste la tubo estis metita en scintiligan tubon enhavantan 500 μl da dH2O por vaporigi [3H]2O dum 72 horoj je 37°C. Poste forigu la mikrocentrifugilan tubon de la scintiliga tubo kaj aldonu 10 ml da scintiliga fluido. Scintiligaj kalkuloj estis faritaj uzante likvan scintiligan analizilon Tri-Carb 2900TR (Packard Bioscience Company, Meriden, CT, Usono). Glukoza utiligo estis kalkulita konsiderante la specifan aktivecon por [5-3H]-glukozo, nekompletan ekvilibron kaj fonon, diluon de [5-3H]-al neetikedita glukozo, kaj la efikecon de scintila nombrilo. La datumoj estas normaligitaj al la maso de sekcioj de la koro.
Post hista homogenigo en Trizol, RNA estis izolita el korsekcioj uzante la Qiagen miRNeasy Micro Kit #210874 laŭ la protokolo de la fabrikanto. La preparado, sekvencado kaj datumanalizo de la RNAsec-biblioteko estis faritaj jene:
1 μg da RNA por ĉiu specimeno estis uzata kiel startmaterialo por la preparado de la RNA-biblioteko. Sekvencaj bibliotekoj estis generitaj uzante la NEBNext UltraTM RNA Library Preparation Kit por Illumina (NEB, Usono) laŭ la rekomendoj de la fabrikanto, kaj indickodoj estis aldonitaj al la atributaj sekvencoj por ĉiu specimeno. Mallonge, mRNA estis purigita el totala RNA uzante magnetajn globetojn ligitajn kun poli-T-oligonukleotidoj. Fragmentiĝo estas efektivigita uzante duvalentajn katjonojn je alta temperaturo en NEBNext First Strand Synthesis Reaction Buffer (5X). La unua-fadena cDNA estis sintezita uzante hazardajn heksamerajn komencilojn kaj M-MuLV-inversan transkriptazon (RNase H-). La dua-fadena cDNA estas poste sintezita uzante DNA-polimerazon I kaj RNase H. La ceteraj elstaraĵoj estas konvertitaj al malakraj finoj per eksonucleaza/polimeraza agado. Post adeniligo de la 3′ fino de la DNA-fragmento, NEBNext Adaptilo kun harpingla bukla strukturo estas ligita al ĝi por prepari ĝin por hibridigo. Por selektado de cDNA-fragmentoj de preferata longo 150-200 bp. Bibliotekaj fragmentoj estis purigitaj uzante la sistemon AMPure XP (Beckman Coulter, Beverly, Usono). Poste, 3 μl da USER Enzyme (NEB, Usono) kun laŭgrande elektita cDNA ligita per adaptilo estis uzata dum 15 minutoj je 37°C kaj poste dum 5 minutoj je 95°C antaŭ PCR. PCR estis poste plenumita uzante Phusion High-Fidelity DNA-polimerazon, universalajn PCR-prajnerojn kaj Index (X) prajnerojn. Fine, PCR-produktoj estis purigitaj (AMPure XP-sistemo) kaj la kvalito de la biblioteko estis taksita per sistemo Agilent Bioanalyzer 2100. La cDNA-biblioteko estis poste sekvencita uzante Novaseq-sekvencilon. Krudaj bilddosieroj de Illumina estis konvertitaj al krudaj legaĵoj uzante CASAVA Base Calling. Krudaj datumoj estas konservitaj en dosieroj en formato FASTQ(fq), kiuj enhavas legitajn sekvencojn kaj respondajn bazajn kvalitojn. Elektu HISAT2 por kongruigi filtritajn sekvencajn legaĵojn kun la referenca genaro Sscrofa11.1. Ĝenerale, HISAT2 subtenas genarojn de ajna grandeco, inkluzive de genaroj pli grandaj ol 4 miliardoj da bazoj, kaj defaŭltaj valoroj estas agorditaj por plej multaj parametroj. Splisaj legaĵoj el RNA Seq-datumoj povas esti efike vicigitaj uzante HISAT2, la plej rapida sistemo nuntempe havebla, kun la sama aŭ pli bona precizeco ol iu ajn alia metodo.
La abundo de transskribaĵoj rekte reflektas la nivelon de genekspresio. Genekspresio-niveloj estas taksataj per la abundo de transskribaĵoj (sekvenckalkulo) asociitaj kun la genaro aŭ eksonoj. La nombro de legaĵoj estas proporcia al genekspresio-niveloj, genlongo kaj sekvencprofundo. FPKM (fragmentoj por mil bazparoj de transskribaĵo sekvencita por miliono da bazparoj) estis kalkulitaj kaj P-valoroj de diferenciala esprimo estis determinitaj uzante la pakaĵon DESeq2. Ni poste kalkulis la indicon de falsa malkovro (FDR) por ĉiu P-valoro uzante la metodon de Benjamini-Hochberg9 bazitan sur la enkonstruita R-funkcio "p.adjust".
RNA izolita el korsekcioj estis konvertita al cDNA je koncentriĝo de 200 ng/μl uzante la SuperScript IV Vilo Master miksaĵon de Thermo (Thermo, kat. nr. 11756050). Kvanta RT-PCR estis farita uzante Applied Biosystems Endura Plate Microamp 384-putan travideblan reakcian platon (Thermo, kat. nr. 4483319) kaj mikroampan optikan gluaĵon (Thermo, kat. nr. 4311971). La reakcia miksaĵo konsistis el 5 µl da Taqman Fast Advanced Master miksaĵo (Thermo, kat. nr. 4444557), 0.5 µl da Taqman Primer kaj 3.5 µl da H2O miksita por ĉiu puto. Normaj qPCR-cikloj estis funkciigitaj kaj CT-valoroj estis mezuritaj uzante Applied Biosystems Quantstudio 5 realtempan PCR-instrumenton (384-puta modulo; produkta nr. A28135). Taqman-prajmeroj estis aĉetitaj de Thermo (GAPDH (Ss03375629_u1), PARP12 (Ss06908795_m1), PKDCC (Ss06903874_m1), CYGB (Ss06900188_m1), RGL1 (Ss06868890_m1), ACTN1 (Ss01009508_mH), GATA4 (Ss03383805_u1), GJA1 (Ss03374839_u1), COL1A2 (Ss03375009_u1), COL3A1 (Ss04323794_m1), ACTA2 (Ss04245588_m1). La CT-valoroj de ĉiuj specimenoj estis normaligitaj al la mastruma geno GAPDH.
La amaskomunikila liberigo de NT-ProBNP estis taksita uzante la NT-ProBNP-ilaron (porko) (Katalog-Nr. MBS2086979, MyBioSource) laŭ la protokolo de la fabrikanto. Mallonge, 250 µl de ĉiu specimeno kaj normo estis aldonitaj duoble al ĉiu puto. Tuj post aldono de la specimeno, aldonu 50 µl da Analiza Reakciaĵo A al ĉiu puto. Milde skuu la platon kaj sigelu ĝin per sigelaĵo. Poste la tablojdoj estis kovitaj je 37°C dum 1 horo. Poste aspiru la solvaĵon kaj lavu la putojn 4 fojojn per 350 µl da 1X lava solvaĵo, kovante la lavan solvaĵon dum 1-2 minutoj ĉiufoje. Poste aldonu 100 µl da Analiza Reakciaĵo B por ĉiu puto kaj sigelu ĝin per plata sigelaĵo. La tablojdo estis milde skuita kaj kovita je 37°C dum 30 minutoj. Aspiru la solvaĵon kaj lavu la putojn 5 fojojn per 350 µl da 1X lava solvaĵo. Aldonu 90 µl da substrata solvaĵo al ĉiu puto kaj sigelu la platon. Kovu la platon je 37°C dum 10-20 minutoj. Aldonu 50 µl da haltiga solvaĵo al ĉiu puto. La plato estis tuj mezurita uzante platlegilon Cytation (BioTek) agorditan je 450 nm.
Potencanalizoj estis faritaj por elekti la grupgrandecojn, kiuj provizos >80% potencon por detekti 10% absolutan ŝanĝon en la parametro kun 5% Tipo I erarofteco. Potencanalizoj estis faritaj por elekti la grupgrandecojn, kiuj provizos >80% potencon por detekti 10% absolutan ŝanĝon en la parametro kun 5% Tipo I erarofteco. Анализ мощности был выполнен для выбора размеров групп, которые обеспечат >80% мощноя тибедносто 10% абсолютного изменения параметра с 5% частотой ошибок типа I. Potencanalizo estis farita por elekti grupgrandecojn, kiuj provizus >80% potencon por detekti 10% absolutan parametroŝanĝon kun 5% Tipo I erarofteco.进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％I型错误率的组大小。进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％I型错误率的组大小。 Был проведен анализ мощности для выбора размера группы, который обеспечил бы > 80% мощдноя обнаружения 10% абсолютного изменения параметров и 5% частоты ошибок типа I. Potencanalizo estis farita por elekti grupgrandecon, kiu provizus >80% potencon por detekti 10% absolutan parametroŝanĝon kaj 5% tipon I eraroftecon.Histaj sekcioj estis hazarde elektitaj antaŭ la eksperimento. Ĉiuj analizoj estis kondiĉblindaj kaj specimenoj estis deĉifritaj nur post kiam ĉiuj datumoj estis analizitaj. La programaro GraphPad Prism (San-Diego, Kalifornio) estis uzata por plenumi ĉiujn statistikajn analizojn. Por ĉiuj statistikoj, p-valoroj estis konsiderataj signifaj ĉe valoroj <0.05. Por ĉiuj statistikoj, p-valoroj estis konsiderataj signifaj je valoroj <0,05. Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. Por ĉiuj statistikoj, p-valoroj estis konsiderataj signifaj je valoroj <0,05.对于所有统计数据，p 值在值<0.05 时被认为是显着的。对于所有统计数据，p 值在值<0.05 时被认为是显着的。 Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. Por ĉiuj statistikoj, p-valoroj estis konsiderataj signifaj je valoroj <0,05.Duflanka Studenta t-testo estis efektivigita sur la datumoj kun nur 2 komparoj. Unudirekta aŭ dudirekta ANOVA estis uzata por determini signifon inter pluraj grupoj. Dum post-hoc testoj, la korekto de Tukey estis aplikita por konsideri plurajn komparojn. RNAsec-datumoj havas specialajn statistikajn konsiderojn dum kalkulado de FDR kaj p.adjust kiel priskribite en la sekcio Metodoj.
Por pliaj informoj pri la studdezajno, vidu la resumon de Nature Research Report ligitan al ĉi tiu artikolo.
Afiŝtempo: 28-a de septembro 2022
