Σας ευχαριστούμε που επισκεφτήκατε το Nature.com.Η έκδοση του προγράμματος περιήγησης που χρησιμοποιείτε έχει περιορισμένη υποστήριξη CSS.Για την καλύτερη εμπειρία, συνιστούμε να χρησιμοποιήσετε ένα ενημερωμένο πρόγραμμα περιήγησης (ή να απενεργοποιήσετε τη λειτουργία συμβατότητας στον Internet Explorer).Στο μεταξύ, για να διασφαλίσουμε τη συνεχή υποστήριξη, θα αποδώσουμε τον ιστότοπο χωρίς στυλ και JavaScript.
Υπάρχει ανάγκη για ένα αξιόπιστο σύστημα in vitro που μπορεί να αναπαράγει με ακρίβεια το φυσιολογικό περιβάλλον της καρδιάς για δοκιμές φαρμάκων.Η περιορισμένη διαθεσιμότητα συστημάτων καλλιέργειας ανθρώπινου καρδιακού ιστού έχει οδηγήσει σε ανακριβείς ερμηνείες των επιδράσεων των καρδιακών φαρμάκων.Εδώ, έχουμε αναπτύξει ένα μοντέλο καλλιέργειας καρδιακού ιστού (CTCM) που διεγείρει ηλεκτρομηχανικά τις φέτες της καρδιάς και υφίσταται φυσιολογική διάταση κατά τη συστολική και διαστολική φάση του καρδιακού κύκλου.Μετά από 12 ημέρες καλλιέργειας, αυτή η προσέγγιση βελτίωσε εν μέρει τη βιωσιμότητα των καρδιακών τομών, αλλά δεν διατήρησε πλήρως τη δομική τους ακεραιότητα.Επομένως, μετά από έλεγχο μικρών μορίων, διαπιστώσαμε ότι η προσθήκη 100 nM τριιωδοθυρονίνης (T3) και 1 μM δεξαμεθαζόνης (Dex) στο μέσο μας διατήρησε τη μικροδομή των τομών για 12 ημέρες.Σε συνδυασμό με τη θεραπεία T3/Dex, το σύστημα CTCM διατήρησε τα μεταγραφικά προφίλ, τη βιωσιμότητα, τη μεταβολική δραστηριότητα και τη δομική ακεραιότητα στο ίδιο επίπεδο με τον φρέσκο ​​καρδιακό ιστό για 12 ημέρες.Επιπλέον, το υπερβολικό τέντωμα του καρδιακού ιστού σε καλλιέργεια επάγει υπερτροφική καρδιακή σηματοδότηση, παρέχοντας στοιχεία για την ικανότητα του CTCM να μιμείται τις υπερτροφικές καταστάσεις που προκαλούνται από την καρδιακή διάταση.Συμπερασματικά, το CTCM μπορεί να μοντελοποιήσει τη φυσιολογία και την παθοφυσιολογία της καρδιάς σε καλλιέργεια για μεγάλες χρονικές περιόδους, επιτρέποντας αξιόπιστο έλεγχο φαρμάκων.
Πριν από την κλινική έρευνα, απαιτούνται αξιόπιστα in vitro συστήματα που μπορούν να αναπαράγουν με ακρίβεια το φυσιολογικό περιβάλλον της ανθρώπινης καρδιάς.Τέτοια συστήματα θα πρέπει να μιμούνται αλλοιωμένη μηχανική διάταση, καρδιακό ρυθμό και ηλεκτροφυσιολογικές ιδιότητες.Τα ζωικά μοντέλα χρησιμοποιούνται συνήθως ως πλατφόρμα διαλογής για την καρδιακή φυσιολογία με περιορισμένη αξιοπιστία στην αντανάκλαση των επιδράσεων των φαρμάκων στην ανθρώπινη καρδιά1,2.Τελικά, το Ideal Cardiac Tissue Culture Experimental Model (CTCM) είναι ένα μοντέλο που είναι ιδιαίτερα ευαίσθητο και ειδικό για διάφορες θεραπευτικές και φαρμακολογικές παρεμβάσεις, αναπαράγοντας με ακρίβεια τη φυσιολογία και την παθοφυσιολογία της ανθρώπινης καρδιάς3.Η απουσία ενός τέτοιου συστήματος περιορίζει την ανακάλυψη νέων θεραπειών για την καρδιακή ανεπάρκεια4,5 και έχει οδηγήσει στην καρδιοτοξικότητα των φαρμάκων ως κύριο λόγο εξόδου από την αγορά6.
Την τελευταία δεκαετία, οκτώ μη καρδιαγγειακά φάρμακα έχουν αποσυρθεί από την κλινική χρήση επειδή προκαλούν παράταση του διαστήματος QT που οδηγεί σε κοιλιακές αρρυθμίες και αιφνίδιο θάνατο7.Έτσι, υπάρχει μια αυξανόμενη ανάγκη για αξιόπιστες στρατηγικές προκλινικού προσυμπτωματικού ελέγχου για την αξιολόγηση της καρδιαγγειακής αποτελεσματικότητας και τοξικότητας.Η πρόσφατη χρήση καρδιομυοκυττάρων προερχόμενων από πολυδύναμα βλαστοκύτταρα (hiPS-CM) στον έλεγχο φαρμάκων και στις δοκιμές τοξικότητας παρέχει μια μερική λύση σε αυτό το πρόβλημα.Ωστόσο, η ανώριμη φύση των hiPS-CM και η έλλειψη πολυκυτταρικής πολυπλοκότητας του καρδιακού ιστού είναι οι κύριοι περιορισμοί αυτής της μεθόδου.Πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι αυτός ο περιορισμός μπορεί να ξεπεραστεί εν μέρει με τη χρήση πρώιμου hiPS-CM για το σχηματισμό υδρογέλης καρδιακού ιστού λίγο μετά την έναρξη των αυθόρμητων συσπάσεων και τη σταδιακή αύξηση της ηλεκτρικής διέγερσης με την πάροδο του χρόνου.Ωστόσο, αυτοί οι μικροιστοί hiPS-CM δεν διαθέτουν τις ώριμες ηλεκτροφυσιολογικές και συσταλτικές ιδιότητες του μυοκαρδίου των ενηλίκων.Επιπλέον, ο ανθρώπινος καρδιακός ιστός έχει μια πιο περίπλοκη δομή, που αποτελείται από ένα ετερογενές μείγμα διαφορετικών τύπων κυττάρων, συμπεριλαμβανομένων των ενδοθηλιακών κυττάρων, των νευρώνων και των στρωματικών ινοβλαστών, που διασυνδέονται με συγκεκριμένα σύνολα πρωτεϊνών εξωκυτταρικής μήτρας.Αυτή η ετερογένεια πληθυσμών μη καρδιομυοκυττάρων11,12,13 στην καρδιά του ενήλικου θηλαστικού είναι ένα σημαντικό εμπόδιο στη διαμόρφωση του καρδιακού ιστού χρησιμοποιώντας μεμονωμένους κυτταρικούς τύπους.Αυτοί οι κύριοι περιορισμοί υπογραμμίζουν τη σημασία της ανάπτυξης μεθόδων για την καλλιέργεια άθικτου μυοκαρδιακού ιστού υπό φυσιολογικές και παθολογικές συνθήκες.
Καλλιεργημένα λεπτά (300 μm) τμήματα της ανθρώπινης καρδιάς έχουν αποδειχθεί ένα πολλά υποσχόμενο μοντέλο άθικτου ανθρώπινου μυοκαρδίου.Αυτή η μέθοδος παρέχει πρόσβαση σε ένα πλήρες 3D πολυκύτταρο σύστημα παρόμοιο με τον ανθρώπινο καρδιακό ιστό.Ωστόσο, μέχρι το 2019, η χρήση καλλιεργημένων τμημάτων καρδιάς περιοριζόταν από τη σύντομη (24 ώρες) επιβίωση της καλλιέργειας.Αυτό οφείλεται σε έναν αριθμό παραγόντων, όπως η έλλειψη φυσικομηχανικής τάνυσης, η διεπαφή αέρα-υγρού και η χρήση απλών μέσων που δεν υποστηρίζουν τις ανάγκες του καρδιακού ιστού.Το 2019, αρκετές ερευνητικές ομάδες απέδειξαν ότι η ενσωμάτωση μηχανικών παραγόντων στα συστήματα καλλιέργειας καρδιακών ιστών μπορεί να παρατείνει τη διάρκεια της καλλιέργειας, να βελτιώσει την καρδιακή έκφραση και να μιμηθεί την καρδιακή παθολογία.Δύο κομψές μελέτες 17 και 18 δείχνουν ότι η μονοαξονική μηχανική φόρτιση έχει θετική επίδραση στον καρδιακό φαινότυπο κατά τη διάρκεια της καλλιέργειας.Ωστόσο, αυτές οι μελέτες δεν χρησιμοποίησαν τη δυναμική τρισδιάστατη φυσικομηχανική φόρτιση του καρδιακού κύκλου, καθώς οι καρδιακές τομές φορτώθηκαν είτε με ισομετρικές δυνάμεις εφελκυσμού 17 είτε με γραμμική αυξοτονική φόρτιση 18 .Αυτές οι μέθοδοι διάτασης ιστού είχαν ως αποτέλεσμα την καταστολή πολλών καρδιακών γονιδίων ή την υπερέκφραση γονιδίων που σχετίζονται με μη φυσιολογικές αποκρίσεις τεντώματος.Συγκεκριμένα, οι Pitoulis et al.19 ανέπτυξε ένα δυναμικό λουτρό καλλιέργειας τομής καρδιάς για την αναδόμηση του καρδιακού κύκλου χρησιμοποιώντας ανατροφοδότηση μορφοτροπέα δύναμης και κινήσεις τάσης.Αν και αυτό το σύστημα επιτρέπει την ακριβέστερη in vitro μοντελοποίηση του καρδιακού κύκλου, η πολυπλοκότητα και η χαμηλή απόδοση της μεθόδου περιορίζει την εφαρμογή αυτού του συστήματος.Το εργαστήριό μας ανέπτυξε πρόσφατα ένα απλοποιημένο σύστημα καλλιέργειας που χρησιμοποιεί ηλεκτρική διέγερση και ένα βελτιστοποιημένο μέσο για τη διατήρηση της βιωσιμότητας τμημάτων ιστού καρδιάς χοίρου και ανθρώπου για έως και 6 ημέρες20,21.
Στο τρέχον χειρόγραφο, περιγράφουμε ένα μοντέλο καλλιέργειας καρδιακού ιστού (CTCM) που χρησιμοποιεί τομές της χοιρινής καρδιάς που ενσωματώνει χυμικές ενδείξεις για την ανακεφαλαίωση της τρισδιάστατης καρδιακής φυσιολογίας και της παθοφυσιολογικής διάτασης κατά τη διάρκεια του καρδιακού κύκλου.Αυτό το CTCM μπορεί να αυξήσει την ακρίβεια της προκλινικής πρόβλεψης φαρμάκων σε επίπεδο που δεν είχε επιτευχθεί ποτέ πριν παρέχοντας ένα οικονομικά αποδοτικό καρδιακό σύστημα μεσαίας απόδοσης που μιμείται τη φυσιολογία/παθοφυσιολογία της καρδιάς των θηλαστικών για προκλινικές δοκιμές φαρμάκων.
Τα αιμοδυναμικά μηχανικά σήματα παίζουν κρίσιμο ρόλο στη διατήρηση της καρδιομυοκυτταρικής λειτουργίας in vitro 22,23,24.Στο τρέχον χειρόγραφο, έχουμε αναπτύξει ένα CTCM (Εικόνα 1α) που μπορεί να μιμηθεί το καρδιακό περιβάλλον των ενηλίκων προκαλώντας τόσο ηλεκτρική όσο και μηχανική διέγερση σε φυσιολογικές συχνότητες (1,2 Hz, 72 παλμούς ανά λεπτό).Για να αποφευχθεί το υπερβολικό τέντωμα του ιστού κατά τη διάρκεια της διαστολής, χρησιμοποιήθηκε μια συσκευή τρισδιάστατης εκτύπωσης για την αύξηση του μεγέθους του ιστού κατά 25% (Εικ. 1β).Η ηλεκτρική βηματοδότηση που προκαλείται από το σύστημα C-PACE χρονομετρήθηκε ώστε να ξεκινήσει 100 ms πριν από τη συστολή χρησιμοποιώντας ένα σύστημα απόκτησης δεδομένων για την πλήρη αναπαραγωγή του καρδιακού κύκλου.Το σύστημα ιστοκαλλιέργειας χρησιμοποιεί έναν προγραμματιζόμενο πνευματικό ενεργοποιητή (LB Engineering, Γερμανία) για να επεκτείνει κυκλικά μια εύκαμπτη μεμβράνη σιλικόνης για να προκαλέσει διαστολή των καρδιών στον άνω θάλαμο.Το σύστημα συνδέθηκε με μια εξωτερική γραμμή αέρα μέσω ενός μορφοτροπέα πίεσης, ο οποίος κατέστησε δυνατή την ακριβή ρύθμιση της πίεσης (± 1 mmHg) και του χρόνου (± 1 ms) (Εικ. 1γ).
a Συνδέστε το τμήμα ιστού στον δακτύλιο στήριξης 7 mm, που φαίνεται με μπλε χρώμα, μέσα στο θάλαμο καλλιέργειας της συσκευής.Ο θάλαμος καλλιέργειας διαχωρίζεται από τον θάλαμο αέρα με μια λεπτή εύκαμπτη μεμβράνη σιλικόνης.Τοποθετήστε ένα παρέμβυσμα μεταξύ κάθε θαλάμου για να αποφύγετε διαρροές.Το καπάκι της συσκευής περιέχει ηλεκτρόδια γραφίτη που παρέχουν ηλεκτρική διέγερση.β Σχηματική αναπαράσταση της συσκευής μεγάλου ιστού, του δακτυλίου οδήγησης και του δακτυλίου στήριξης.Τα τμήματα ιστού (καφέ) τοποθετούνται στην υπερμεγέθη συσκευή με τον οδηγό δακτύλιο τοποθετημένο στην αυλάκωση στο εξωτερικό άκρο της συσκευής.Χρησιμοποιώντας τον οδηγό, τοποθετήστε προσεκτικά το δακτύλιο στήριξης επικαλυμμένο με ακρυλική κόλλα ιστού πάνω από το τμήμα του καρδιακού ιστού.c Γράφημα που δείχνει τον χρόνο ηλεκτρικής διέγερσης ως συνάρτηση της πίεσης του θαλάμου αέρα που ελέγχεται από έναν προγραμματιζόμενο πνευματικό ενεργοποιητή (PPD).Μια συσκευή απόκτησης δεδομένων χρησιμοποιήθηκε για το συγχρονισμό της ηλεκτρικής διέγερσης χρησιμοποιώντας αισθητήρες πίεσης.Όταν η πίεση στο θάλαμο καλλιέργειας φτάσει στο καθορισμένο όριο, στέλνεται ένα παλμικό σήμα στο C-PACE-EM για να ενεργοποιήσει την ηλεκτρική διέγερση.d Εικόνα τεσσάρων CTCM τοποθετημένων σε ένα ράφι θερμοκοιτίδας.Τέσσερις συσκευές συνδέονται σε ένα PPD μέσω πνευματικού κυκλώματος και αισθητήρες πίεσης εισάγονται στην αιμοστατική βαλβίδα για την παρακολούθηση της πίεσης στο πνευματικό κύκλωμα.Κάθε συσκευή περιέχει έξι τμήματα ιστού.
Χρησιμοποιώντας έναν μόνο πνευματικό ενεργοποιητή, μπορέσαμε να ελέγξουμε 4 συσκευές CTCM, καθεμία από τις οποίες χωρούσε 6 τμήματα ιστού (Εικ. 1δ).Στο CTCM, η πίεση του αέρα στον θάλαμο αέρα μετατρέπεται σε σύγχρονη πίεση στον θάλαμο ρευστού και προκαλεί φυσιολογική διαστολή της τομής της καρδιάς (Εικόνα 2α και Συμπληρωματική ταινία 1).Εκτίμηση της διάτασης των ιστών στα 80 mm Hg.Τέχνη.έδειξε τέντωμα των τομών ιστού κατά 25% (Εικ. 2β).Αυτή η ποσοστιαία έκταση έχει αποδειχθεί ότι αντιστοιχεί σε φυσιολογικό μήκος σαρκομερίου 2,2–2,3 μm για φυσιολογική συσταλτικότητα της καρδιακής τομής17,19,25.Η κίνηση του ιστού αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας προσαρμοσμένες ρυθμίσεις κάμερας (Συμπληρωματικό Σχήμα 1).Το πλάτος και η ταχύτητα της κίνησης του ιστού (Εικ. 2c, d) αντιστοιχούσαν στο τέντωμα κατά τη διάρκεια του καρδιακού κύκλου και στο χρόνο κατά τη διάρκεια της συστολής και της διαστολής (Εικ. 2b).Η διάταση και η ταχύτητα του καρδιακού ιστού κατά τη διάρκεια της συστολής και της χαλάρωσης παρέμειναν σταθερές για 12 ημέρες σε καλλιέργεια (Εικ. 2στ).Για να αξιολογήσουμε την επίδραση της ηλεκτρικής διέγερσης στη συσταλτικότητα κατά τη διάρκεια της καλλιέργειας, αναπτύξαμε μια μέθοδο για τον προσδιορισμό της ενεργού παραμόρφωσης χρησιμοποιώντας έναν αλγόριθμο σκίασης (Συμπληρωματικό Σχήμα 2α, β) και μπορέσαμε να διακρίνουμε μεταξύ παραμορφώσεων με και χωρίς ηλεκτρική διέγερση.Το ίδιο τμήμα της καρδιάς (Εικ. 2στ).Στην κινητή περιοχή της κοπής (R6-9), η τάση κατά την ηλεκτρική διέγερση ήταν 20% υψηλότερη από ό,τι απουσία ηλεκτρικής διέγερσης, γεγονός που υποδεικνύει τη συμβολή της ηλεκτρικής διέγερσης στη συσταλτική λειτουργία.
Αντιπροσωπευτικά ίχνη πίεσης θαλάμου αέρα, πίεσης θαλάμου ρευστού και μετρήσεις κίνησης ιστού επιβεβαιώνουν ότι η πίεση του θαλάμου αλλάζει την πίεση του θαλάμου υγρού, προκαλώντας μια αντίστοιχη κίνηση της τομής του ιστού.β Αντιπροσωπευτικά ίχνη ποσοστιαίας έκτασης (μπλε) τμημάτων ιστού που αντιστοιχούν σε ποσοστιαία έκταση (πορτοκαλί).γ Η μετρούμενη κίνηση της καρδιακής τομής είναι σύμφωνη με τη μετρούμενη ταχύτητα κίνησης.(δ) Αντιπροσωπευτικές τροχιές κυκλικής κίνησης (μπλε γραμμή) και ταχύτητας (πορτοκαλί διακεκομμένη γραμμή) σε μια φέτα της καρδιάς.e Ποσοτικοποίηση του χρόνου κύκλου (n = 19 φέτες ανά ομάδα, από διαφορετικούς χοίρους), χρόνος συστολής (n = 19 φέτες ανά ομάδα), χρόνος χαλάρωσης (n = 19 φέτες ανά ομάδα, από διαφορετικούς χοίρους), κίνηση ιστού (n = 25 ).φέτες)/ομάδα από διαφορετικούς χοίρους), μέγιστη συστολική ταχύτητα (n = 24(D0), 25(D12) φέτες/ομάδα από διαφορετικούς χοίρους) και μέγιστο ρυθμό χαλάρωσης (n=24(D0), 25(D12) φέτες/ομάδα από διαφορετικούς χοίρους).Το t-test Student δύο ουρών δεν έδειξε σημαντική διαφορά σε καμία παράμετρο.στ Ίχνη αντιπροσωπευτικής ανάλυσης καταπόνησης τομών ιστού με (κόκκινο) και χωρίς (μπλε) ηλεκτρική διέγερση, δέκα τοπικές περιοχές τομών ιστού από την ίδια τομή.Τα κάτω πάνελ δείχνουν την ποσοτικοποίηση της ποσοστιαίας διαφοράς στην καταπόνηση σε τμήματα ιστού με και χωρίς ηλεκτρική διέγερση σε δέκα περιοχές από διαφορετικά τμήματα. (n = 8 φέτες/ομάδα από διαφορετικούς χοίρους, διενεργείται δοκιμή t-test Student δύο ουρών· ****p < 0,0001, **p < 0,01, *p < 0,05). (n = 8 φέτες/ομάδα από διαφορετικούς χοίρους, διενεργείται δοκιμή t-test Student δύο ουρών· ****p < 0,0001, **p < 0,01, *p < 0,05). (n = 8 срезов/группу от разных свиней, проводится двусторонний t-критерий Стьюдента; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05). (n = 8 τμήματα/ομάδα από διαφορετικούς χοίρους, t-test Student με δύο ουρές· ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05). （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p <0,0001，**p <0,01，5p <0,01， （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p <0,0001，**p <0,01，5p <0,01， (n = 8 срезов/группу, от разных свиней, двусторонний критерий Стьюдента; ****p <0,0001, **p <0,01, *p <0,05). (n = 8 τμήματα/ομάδα, από διαφορετικούς χοίρους, t-test Student δύο ουρών· ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05).Οι γραμμές σφάλματος αντιπροσωπεύουν τη μέση ± τυπική απόκλιση.
Στο προηγούμενο σύστημα στατικής βιομιμητικής καλλιέργειας φετών καρδιάς [20, 21], διατηρήσαμε τη βιωσιμότητα, τη λειτουργία και τη δομική ακεραιότητα των φετών καρδιάς για 6 ημέρες εφαρμόζοντας ηλεκτρική διέγερση και βελτιστοποιώντας τη σύνθεση του μέσου.Ωστόσο, μετά από 10 ημέρες, τα στοιχεία αυτά μειώθηκαν απότομα.Θα αναφερθούμε σε τομές που καλλιεργήθηκαν στο προηγούμενο σύστημα στατικής βιομιμητικής καλλιέργειας 20, 21 συνθήκες ελέγχου (Ctrl) και θα χρησιμοποιήσουμε το προηγουμένως βελτιστοποιημένο μέσο μας ως συνθήκες MC και καλλιέργεια υπό ταυτόχρονη μηχανική και ηλεκτρική διέγερση (CTCM).που ονομάζεται .Πρώτον, προσδιορίσαμε ότι η μηχανική διέγερση χωρίς ηλεκτρική διέγερση ήταν ανεπαρκής για τη διατήρηση της βιωσιμότητας του ιστού για 6 ημέρες (Συμπληρωματικό Σχήμα 3a,b).Είναι ενδιαφέρον ότι με την εισαγωγή της φυσικομηχανικής και ηλεκτρικής διέγερσης με χρήση STCM, η βιωσιμότητα των τομών καρδιάς 12 ημερών παρέμεινε η ίδια όπως σε φρέσκες τομές καρδιάς υπό συνθήκες MS, αλλά όχι υπό συνθήκες Ctrl, όπως φαίνεται από την ανάλυση MTT (Εικ. 1).3α).Αυτό υποδηλώνει ότι η μηχανική διέγερση και η προσομοίωση του καρδιακού κύκλου μπορεί να διατηρήσει βιώσιμες τομές ιστού για διπλάσιο χρόνο από ό,τι αναφέρθηκε στο προηγούμενο σύστημα στατικής καλλιέργειας.Ωστόσο, η αξιολόγηση της δομικής ακεραιότητας των τομών ιστού με ανοσοσήμανση της καρδιακής τροπονίνης Τ και της κοννεξίνης 43 έδειξε ότι η έκφραση της συνδετίνης 43 ήταν σημαντικά υψηλότερη στους ιστούς MC την ημέρα 12 από ό,τι στους μάρτυρες την ίδια ημέρα.Ωστόσο, η ομοιόμορφη έκφραση της σύνδεσης 43 και ο σχηματισμός του δίσκου Ζ δεν διατηρήθηκαν πλήρως (Εικ. 3b).Χρησιμοποιούμε ένα πλαίσιο τεχνητής νοημοσύνης (AI) για να ποσοτικοποιήσουμε τη δομική ακεραιότητα των ιστών26, έναν αγωγό βαθιάς εκμάθησης βάσει εικόνας που βασίζεται στη χρώση τροπονίνης-Τ και συνδεσίνης43 για να ποσοτικοποιήσει αυτόματα τη δομική ακεραιότητα και τον φθορισμό των τομών καρδιάς από την άποψη της ισχύος εντοπισμού.Αυτή η μέθοδος χρησιμοποιεί ένα Συνελικτικό Νευρωνικό Δίκτυο (CNN) και ένα πλαίσιο βαθιάς μάθησης για να ποσοτικοποιήσει αξιόπιστα τη δομική ακεραιότητα του καρδιακού ιστού με αυτοματοποιημένο και αμερόληπτο τρόπο, όπως περιγράφεται στην αναφορά.26. Ο ιστός MC παρουσίασε βελτιωμένη δομική ομοιότητα με την ημέρα 0 σε σύγκριση με τα τμήματα στατικού ελέγχου.Επιπλέον, η χρώση τριχρωμίου του Masson αποκάλυψε ένα σημαντικά χαμηλότερο ποσοστό ίνωσης υπό συνθήκες MS σε σύγκριση με τις συνθήκες ελέγχου την ημέρα 12 της καλλιέργειας (Εικ. 3γ).Ενώ το CTCM αύξησε τη βιωσιμότητα των τμημάτων του καρδιακού ιστού την ημέρα 12 σε επίπεδο παρόμοιο με αυτό του φρέσκου καρδιακού ιστού, δεν βελτίωσε σημαντικά τη δομική ακεραιότητα των τμημάτων της καρδιάς.
ένα γράφημα ράβδου δείχνει την ποσοτικοποίηση της βιωσιμότητας MTT φρέσκων καρδιών (D0) ή καλλιέργειας καρδιών φετών για 12 ημέρες είτε σε στατική καλλιέργεια (D12 Ctrl) είτε σε CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) .0001 σε σύγκριση με D0 και **p < 0,01 σε σύγκριση με D12 Ctrl). ένα γράφημα ράβδων δείχνει ποσοτικοποίηση της βιωσιμότητας MTT φρέσκων φετών καρδιάς (D0) ή καλλιέργειας καρδιών φετών για 12 ημέρες είτε σε στατική καλλιέργεια (D12 Ctrl) είτε σε CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl ), 12 (D12 Ctrl ), 12 (D12 MC, μονόδρομη δοκιμή εκτελείται από ##ομάδα MC; 0,0001 σε σύγκριση με D0 και **p < 0,01 σε σύγκριση με D12 Ctrl).το ιστόγραμμα δείχνει την ποσοτικοποίηση της βιωσιμότητας των φρέσκων καρδιακών τομών ΜΤΤ (D0) ή της καλλιέργειας τομών καρδιάς για 12 ημέρες είτε σε στατική καλλιέργεια (μάρτυρας D12) είτε σε CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (έλεγχος D12).####p < 0,0001 по сравнению με D0 και **p < 0,01 по сравнению με D12 Ctrl). ####p < 0,0001 σε σύγκριση με D0 και **p < 0,01 σε σύγκριση με D12 Ctrl). a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏D0)养12 天的MTT 活力的量化)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向向俛行单向 他 测0，#行单向ANOVA 测0 001，与D12 Ctrl 相比，**p <0,01). a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏(D0) 中新鲜心脏(D0)的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；与D0 相比，####p < 0,0001，与D12 Ctrl 相*)*)ιστόγραμμα που δείχνει την ποσοτικοποίηση της βιωσιμότητας του ΜΤΤ σε φρέσκες τομές καρδιάς (D0) ή τομές καρδιάς που καλλιεργήθηκαν για 12 ημέρες σε στατική καλλιέργεια (μάρτυρας D12) ή CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (έλεγχος D12)), 12 (D12 MC) τομές/ομάδα από διαφορετικούς χοίρους ANOVA, δοκιμασία μονής κατεύθυνσης.####p < 0,0001 по сравнению με D0, **p < 0,01 по сравнению με D12 Ctrl). ####p < 0,0001 σε σύγκριση με D0, **p < 0,01 σε σύγκριση με D12 Ctrl).b Troponin-T (πράσινο), κοννεξίνη 43 (κόκκινο) και DAPI (μπλε) σε πρόσφατα απομονωμένες τομές καρδιάς (D0) ή καρδιακές τομές καλλιεργημένες υπό στατικές συνθήκες (Ctrl) ή συνθήκες CTCM (MC) για 12 ημέρες) αντιπροσωπευτικών εικόνων ανοσοφθορισμού (κενή κλίμακα = 100 μm). Πραγματοποιείται ποσοτικοποίηση τεχνητής νοημοσύνης της δομικής ακεραιότητας του καρδιακού ιστού (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) φέτες/ομάδα η καθεμία από διαφορετικούς χοίρους, μονόδρομη δοκιμή ANOVA, ####p < 0,0001 σε σύγκριση με D0 και ****p < 0,000 Ctrl σε σύγκριση με D1. Ποσοτικοποίηση τεχνητής νοημοσύνης της δομικής ακεραιότητας του καρδιακού ιστού (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) φέτες/ομάδα η καθεμία από διαφορετικούς χοίρους, εκτελείται δοκιμή ANOVA μονής κατεύθυνσης· ####p < 0,0001 σε σύγκριση με D0 και ****p < 0,000 Ctrl σε σύγκριση με 0,000 C). Количественная оценка структурной целостности сердечной ткани искусственным интеллектом (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) резов/групп от разных свиней, проводится однофакторны, проводится однофакторны, проводится однофакторный, проводится однофакторный, проводится однофакторный D0 и ****p < 0,0001 по сравнению со D12 Ctrl). Ποσοτικοποίηση της δομικής ακεραιότητας του καρδιακού ιστού με τεχνητή νοημοσύνη (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) τομές/ομάδες από διαφορετικούς χοίρους, δοκιμή ANOVA μονής κατεύθυνσης που πραγματοποιήθηκε· ####p < 0,0001 έναντι με D0 και ****p <1 tr σε σύγκριση με D100).人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) φέτες/ομάδα καθεμία διαφορετικών χοίρων, μονόδρομη δοκιμή ANOVA.##00p比，****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）.人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) φέτες/ομάδα καθεμία από διαφορετικούς χοίρους, μονόδρομη δοκιμή ANOVA.##00p ; ，****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）. Искусственный интеллект для количественной оценки структурной целостности сердечной ткани (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) срезов/группу каждой из разных свиней, συσχέτιση ##000 ANOVA00. внения ****p < 0,0001 по сравнению со D12 Ctrl). Τεχνητή νοημοσύνη για την ποσοτικοποίηση της δομικής ακεραιότητας του καρδιακού ιστού (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) τομές/ομάδα καθεμία από διαφορετικούς χοίρους, δοκιμή ANOVA μονής κατεύθυνσης· ####p<0,0001 vs .D0 Για σύγκριση ****p <1 trl σε σύγκριση με D100). γ Αντιπροσωπευτικές εικόνες (αριστερά) και ποσοτικοποίηση (δεξιά) για φέτες καρδιάς που χρωματίστηκαν με χρώση τριχρωμίας Masson (Scale bare = 500 μm) (n = 10 φέτες/ομάδα η καθεμία από διαφορετικούς χοίρους, εκτελείται δοκιμή ANOVA μονής κατεύθυνσης· ####p <0,0001 D0001 σε σύγκριση με D1). γ Αντιπροσωπευτικές εικόνες (αριστερά) και ποσοτικός προσδιορισμός (δεξιά) για φέτες καρδιάς που βάφτηκαν με τρίχρωμη χρώση Masson (Scale bare = 500 μm) (n = 10 φέτες/ομάδα η καθεμία από διαφορετικούς χοίρους, εκτελείται δοκιμή ANOVA μονής κατεύθυνσης· #### p <0,0001 και 1 D001 σε σύγκριση με D1). c. ; #### p < 0,0001 по сравнению со D0 и ***p < 0,001 по сравнению со D12 Ctrl). γ Αντιπροσωπευτικές εικόνες (αριστερά) και ποσοτικός προσδιορισμός (δεξιά) τομών καρδιάς που χρωματίστηκαν με χρώση τριχρωμίου Masson (κλίμακα χωρίς επικάλυψη = 500 µm) (n = 10 τομές/ομάδα από διαφορετικούς χοίρους, μονόδρομη δοκιμή ANOVA που εκτελέστηκε· #### p <0 .0001 σε σύγκριση με D0.10tr σε σύγκριση με D0.20tr). c 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像（左）和量化（右）（裸m）（裸封（μ）（裸封切片/组，每组来自不同的猪，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0,0001 与D0 相比Ｘ0，D0 相比Ｘ0***p <0. . C 用 Masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 （左 左） 量化 （右） 裸尣庣度度度 = 500 μm） （n = 10 个 切片 组 每 组 来自 不同 猪 ， 进行 单向 单向 单向 单向 单向 单向 单向 单向 漋#0，比，***p < 0,001 与D12 Ctrl 相比）. c Репрезентативные изображения (слева) и количественный ανάλυση (справа) срезов сердца, окрашенных трихромным красителем Massona (чистая шкала = 500 μ.κ.μ.) (n = 10 στρέμματα/γούφα, όπως кторного дисперсионного ανάλυση ;### #p < 0,0001 по сравнению со D0, ***p < 0,001 по сравнению με D12 Ctrl). γ Αντιπροσωπευτικές εικόνες (αριστερά) και ποσοτικός προσδιορισμός (δεξιά) τομών καρδιάς που χρωματίστηκαν με χρώση τριχρωμίας Masson (κενό = 500 μm) (n = 10 τομές/ομάδα, η καθεμία από διαφορετικό χοίρειο, που δοκιμάστηκαν με μονόδρομη ανάλυση διακύμανσης ;### # p <0.0001 p <0.0001 σε σύγκριση με D0, 1001 σε σύγκριση με D0, C).Οι γραμμές σφάλματος αντιπροσωπεύουν τη μέση ± τυπική απόκλιση.
Υποθέσαμε ότι με την προσθήκη μικρών μορίων στο μέσο καλλιέργειας, η ακεραιότητα των καρδιομυοκυττάρων θα μπορούσε να βελτιωθεί και η ανάπτυξη ίνωσης να μειωθεί κατά τη διάρκεια της καλλιέργειας CTCM.Ως εκ τούτου, ελέγχαμε για μικρά μόρια χρησιμοποιώντας τις καλλιέργειες στατικού ελέγχου20,21 λόγω του μικρού αριθμού παραγόντων σύγχυσης.Η δεξαμεθαζόνη (Dex), η τριιωδοθυρονίνη (T3) και η SB431542 (SB) επιλέχθηκαν για αυτήν την εξέταση.Αυτά τα μικρά μόρια έχουν χρησιμοποιηθεί προηγουμένως σε καλλιέργειες hiPSC-CM για να προκαλέσουν ωρίμανση καρδιομυοκυττάρων αυξάνοντας το μήκος του σαρκομερίου, τα σωληνάρια Τ και την ταχύτητα αγωγής.Επιπλέον, τόσο το Dex (ένα γλυκοκορτικοειδές) όσο και το SB είναι γνωστό ότι καταστέλλουν τη φλεγμονή29,30.Επομένως, δοκιμάσαμε εάν η συμπερίληψη ενός ή ενός συνδυασμού αυτών των μικρών μορίων θα βελτίωνε τη δομική ακεραιότητα των τμημάτων της καρδιάς.Για τον αρχικό έλεγχο, η δόση κάθε ένωσης επιλέχθηκε με βάση τις συγκεντρώσεις που χρησιμοποιούνται συνήθως σε μοντέλα κυτταροκαλλιέργειας (1 μΜ Dex27, 100 nM T327 και 2,5 μΜ SB31).Μετά από 12 ημέρες καλλιέργειας, ο συνδυασμός T3 και Dex είχε ως αποτέλεσμα τη βέλτιστη δομική ακεραιότητα των καρδιομυοκυττάρων και την ελάχιστη ινώδη αναδιαμόρφωση (Συμπληρωματικά Σχήματα 4 και 5).Επιπλέον, η χρήση διπλών ή διπλασίων αυτών των συγκεντρώσεων Τ3 και Dex παρήγαγε επιβλαβή αποτελέσματα σε σύγκριση με τις κανονικές συγκεντρώσεις (Συμπληρωματικό Σχήμα 6a,b).
Μετά την αρχική διαλογή, πραγματοποιήσαμε μια διασταυρούμενη σύγκριση 4 συνθηκών καλλιέργειας (Εικόνα 4α): Ctrl: τομές καρδιάς που καλλιεργήθηκαν στην προηγουμένως περιγραφείσα στατική καλλιέργεια χρησιμοποιώντας το βελτιστοποιημένο μέσο μας.20.21 TD: T3 και Ctrl s Προστέθηκαν Dex την Τετάρτη.MC: τομές καρδιάς που καλλιεργήθηκαν σε CTCM χρησιμοποιώντας το προηγουμένως βελτιστοποιημένο μέσο μας.και MT: CTCM με προσθήκη T3 και Dex στο μέσο.Μετά από 12 ημέρες καλλιέργειας, η βιωσιμότητα των ιστών MS και ΜΤ παρέμεινε η ίδια όπως στους φρέσκους ιστούς που αξιολογήθηκαν με τη δοκιμασία ΜΤΤ (Εικ. 4β).Είναι ενδιαφέρον ότι η προσθήκη T3 και Dex σε καλλιέργειες transwell (TD) δεν οδήγησε σε σημαντική βελτίωση της βιωσιμότητας σε σύγκριση με τις συνθήκες Ctrl, υποδεικνύοντας έναν σημαντικό ρόλο της μηχανικής διέγερσης στη διατήρηση της βιωσιμότητας των τμημάτων της καρδιάς.
ένα διάγραμμα πειραματικού σχεδιασμού που απεικονίζει τις τέσσερις συνθήκες καλλιέργειας που χρησιμοποιούνται για την αξιολόγηση των επιδράσεων της μηχανικής διέγερσης και της συμπλήρωσης T3/Dex στο μέσο για 12 ημέρες. b Το γράφημα ράβδων δείχνει την ποσοτικοποίηση της βιωσιμότητας 12 ημέρες μετά την καλλιέργεια και στις 4 συνθήκες καλλιέργειας (Ctrl, TD, MC και MT) σε σύγκριση με φρέσκες φέτες καρδιάς (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD και D12 MT), 12 (D12 MC, η δοκιμή μίας ομάδας εκτελείται από #p. 0,0001, ###p < 0,001 σε σύγκριση με D0 και **p < 0,01 σε σύγκριση με D12 Ctrl). b Το γράφημα ράβδων δείχνει την ποσοτικοποίηση της βιωσιμότητας 12 ημέρες μετά την καλλιέργεια και στις 4 συνθήκες καλλιέργειας (Ctrl, TD, MC και MT) σε σύγκριση με φρέσκες φέτες καρδιάς (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD και D12 MT), 12 (D12 MC, η δοκιμή μίας ομάδας εκτελείται από #p. 0,0001, ###p < 0,001 σε σύγκριση με D0 και **p < 0,01 σε σύγκριση με D12 ctrl). b Гистограмма показывает количественную оценку жизнеспособности через 12 ημερών μετά την ολοκλήρωση των μαθημάτων σε όλες τις 4 προϋποθέσεις (έλεγχος, TD, MC και MT) μετά από 12 ημέρες μετά την ολοκλήρωση των μαθημάτων (D18, D1) D12 TD и D12 MT), 12 (D12 MC) резов/группу от разных свиней, проводится συσχετικότητας тест ANOVA; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 по сравнению со D0 и **1 сравни со D0 и **1 сравни со 0,0). β Το γράφημα ράβδων δείχνει την ποσοτικοποίηση της βιωσιμότητας 12 ημέρες μετά την καλλιέργεια και στις 4 συνθήκες καλλιέργειας (μάρτυρας, TD, MC και MT) σε σύγκριση με φρέσκες τομές καρδιάς (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD και D12 MT), 12 (D12 MC-up) από διαφορετικές τομές A#0. 001, ###p < 0,001 έναντι D0 και **p < 0,01 κατά σε σύγκριση με D12 Ctrl). b 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) (n = 1811D可D) (n = 18 (D5) D12 MT)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；####p < 0.0001，#0#0p <0.0001，#0#0p 0,01 与D12控制）.b 4 12 (D12 MC) b Гистограмма, показывающая все 4 условия культивирования (έλεγχος, TD, MC και MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD2 MT2 και D12) группа, односторонний тест ANOVA, ####p <0,0001, ###p <0,001 по сравнению со D0, **p <0,01 по сравнению со контролем D12). β Ιστόγραμμα που δείχνει και τις 4 συνθήκες καλλιέργειας (μάρτυρας, TD, MC και MT) σε σύγκριση με φρέσκες τομές καρδιάς (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD και D12 MT), από διαφορετικούς χοίρους 12 (D12 MC) τομές/ομάδα, μονόδρομη δοκιμή ANOVA v.#0<0#0<0#0<0. 0, **p<0,01 έναντι ελέγχου D12). γ Το γράφημα ράβδων δείχνει την ποσοτικοποίηση της ροής γλυκόζης 12 ημέρες μετά την καλλιέργεια και στις 4 συνθήκες καλλιέργειας (Ctrl, TD, MC και MT) σε σύγκριση με φρέσκες φέτες καρδιάς (D0) (n = 6 φέτες/ομάδα από διαφορετικούς χοίρους, πραγματοποιήθηκε δοκιμή ANOVA μονής κατεύθυνσης· ###p <0,000 και 1 tr < 0.001 σε σύγκριση με 1). γ Το γράφημα ράβδων δείχνει την ποσοτικοποίηση της ροής γλυκόζης 12 ημέρες μετά την καλλιέργεια και στις 4 συνθήκες καλλιέργειας (Ctrl, TD, MC και MT) σε σύγκριση με φρέσκες φέτες καρδιάς (D0) (n = 6 φέτες/ομάδα από διαφορετικούς χοίρους, πραγματοποιήθηκε δοκιμή ANOVA μονής κατεύθυνσης· ###p <0,000 και 1 tr < 0.001 σε σύγκριση με 1). c Гистограмма показывает количественную оценку потока глюкозы через 12 ημερών μετά την ολοκλήρωση της ομάδας σε 4 προϋποθέσεις για την ομάδα (έλεγχος, TD, MC και MT) με κραυγή με κρούση (6) й, односторонний Выполняется тест ANOVA; ###p < 0,001 по сравнению со D0 и ***p < 0,001 по сравнению со D12 Ctrl). γ Το ιστόγραμμα δείχνει ποσοτικοποίηση της ροής γλυκόζης 12 ημέρες μετά την καλλιέργεια και στις 4 συνθήκες καλλιέργειας (μάρτυρας, TD, MC και MT) σε σύγκριση με φρέσκες τομές καρδιάς (D0) (n = 6 τομές/ομάδα από διαφορετικούς χοίρους, μονόδρομη δοκιμή ANOVA που εκτελέστηκε; ###p < 0,001 σε σύγκριση με D0 και 10 tr). c 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) 盟萩12，糖通量定量（n = 6 片/组，来自不同猪，单向执行ANOVA 测试；###p < 0.001，丌10p 0.001，与0p 10D0. l 相比）. C 条形图 显示 所有 4 种 条件 （（ctrl 、 td 、 mc 和 mt） 新鲜 心脏 切片 切片 切片 切片后 后 12 天 的 通量 定量 （n = 6 片/组 ， 来自 猪 ， ， ， ， ， ， ， 组 ，试；###p < 0,001，与D0 相比，***p < 0,001 与D12 Ctrl 相比）。 c Gistogramma, показывающая кольчественную оценку потока глюкозы через 12 ημερών μετά την ολοκλήρωση όλων των 4 προϋποθέσεις (έλεγχος, TD, MC και MT) σε σχέση με 6 άτομα от разных свиней, односторонний Были проведены тесты ANOVA; ###p < 0,001 по сравнению со D0, ***p < 0,001 по сравнению со D12 (έλεγχος). γ Ιστόγραμμα που δείχνει ποσοτικοποίηση της ροής γλυκόζης στις 12 ημέρες μετά την καλλιέργεια και για τις 4 συνθήκες καλλιέργειας (μάρτυρας, TD, MC και MT) σε σύγκριση με φρέσκες τομές καρδιάς (D0) (n = 6 τομές/ομάδα, από διαφορετικούς χοίρους, μονόπλευρες Πραγματοποιήθηκαν δοκιμές ANOVA, ###p <0,000p <0,001 σε σύγκριση με το δείγμα αναφοράς).d Διαγράμματα ανάλυσης στελέχους φρέσκων (μπλε), ημέρας 12 MC (πράσινο) και 12 MT (κόκκινο) ιστών σε δέκα σημεία τομής περιοχής ιστού (n = 4 φέτες/ομάδα, δοκιμή ANOVA μονής κατεύθυνσης· δεν υπήρχε σημαντική διαφορά μεταξύ των ομάδων).e Ηφαίστειο που δείχνει διαφορικά εκφρασμένα γονίδια σε φρέσκες τομές καρδιάς (D0) σε σύγκριση με τομές καρδιάς που καλλιεργήθηκαν υπό στατικές συνθήκες (Ctrl) ή υπό συνθήκες MT (MT) για 10-12 ημέρες.f Χάρτης θερμότητας γονιδίων σαρκομερίου για τομές καρδιάς που καλλιεργήθηκαν υπό καθεμία από τις συνθήκες καλλιέργειας.Οι γραμμές σφάλματος αντιπροσωπεύουν τη μέση ± τυπική απόκλιση.
Η μεταβολική εξάρτηση από τη μετάβαση από την οξείδωση των λιπαρών οξέων στη γλυκόλυση είναι χαρακτηριστικό γνώρισμα της αποδιαφοροποίησης των καρδιομυοκυττάρων.Τα ανώριμα καρδιομυοκύτταρα χρησιμοποιούν κυρίως γλυκόζη για την παραγωγή ΑΤΡ και έχουν υποπλαστικά μιτοχόνδρια με λίγα cristae5,32.Οι αναλύσεις χρήσης γλυκόζης έδειξαν ότι υπό συνθήκες MC και MT, η χρήση γλυκόζης ήταν παρόμοια με αυτή στους ιστούς της ημέρας 0 (Εικόνα 4γ).Ωστόσο, τα δείγματα Ctrl έδειξαν σημαντική αύξηση στη χρήση γλυκόζης σε σύγκριση με τον φρέσκο ​​ιστό.Αυτό υποδεικνύει ότι ο συνδυασμός CTCM και T3/Dex ενισχύει τη βιωσιμότητα των ιστών και διατηρεί τον μεταβολικό φαινότυπο των καλλιεργημένων τομών καρδιάς 12 ημερών.Επιπλέον, η ανάλυση του στελέχους έδειξε ότι τα επίπεδα του στελέχους παρέμειναν τα ίδια όπως στον φρέσκο ​​καρδιακό ιστό για 12 ημέρες υπό συνθήκες MT και MS (Εικ. 4δ).
Για να αναλύσουμε τη συνολική επίδραση των CTCM και T3/Dex στο παγκόσμιο μεταγραφικό τοπίο του ιστού καρδιακής τομής, πραγματοποιήσαμε RNAseq σε καρδιακές φέτες και από τις τέσσερις διαφορετικές συνθήκες καλλιέργειας (Συμπληρωματικά δεδομένα 1).Είναι ενδιαφέρον ότι οι τομές ΜΤ έδειξαν υψηλή μεταγραφική ομοιότητα με φρέσκο ​​καρδιακό ιστό, με μόνο 16 διαφορικά εκφρασμένα από 13.642 γονίδια.Ωστόσο, όπως δείξαμε νωρίτερα, οι φέτες Ctrl εμφάνισαν 1229 διαφορικά εκφρασμένα γονίδια μετά από 10-12 ημέρες σε καλλιέργεια (Εικ. 4e).Αυτά τα δεδομένα επιβεβαιώθηκαν με qRT-PCR γονιδίων καρδιάς και ινοβλαστών (Συμπληρωματικό Σχήμα 7a-c).Είναι ενδιαφέρον ότι οι ενότητες Ctrl έδειξαν μείωση της ρύθμισης των γονιδίων του καρδιακού και του κυτταρικού κύκλου και ενεργοποίηση των προγραμμάτων φλεγμονωδών γονιδίων.Αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι η αποδιαφοροποίηση, η οποία συνήθως συμβαίνει μετά από μακροχρόνια καλλιέργεια, εξασθενεί πλήρως υπό συνθήκες ΜΤ (Συμπληρωματικό Σχήμα 8a,b).Η προσεκτική μελέτη των γονιδίων του σαρκομερίου έδειξε ότι μόνο υπό συνθήκες ΜΤ διατηρούνται τα γονίδια που κωδικοποιούν το σαρκομερίδιο (Εικ. 4f) και το κανάλι ιόντων (Συμπληρωματικό Σχ. 9), προστατεύοντάς τα από καταστολή υπό συνθήκες Ctrl, TD και MC.Αυτά τα δεδομένα καταδεικνύουν ότι με έναν συνδυασμό μηχανικής και χυμικής διέγερσης (T3/Dex), το μεταγραφικό τεμάχιο καρδιάς μπορεί να παραμείνει παρόμοιο με φρέσκες φέτες καρδιάς μετά από 12 ημέρες καλλιέργειας.
Αυτά τα μεταγραφικά ευρήματα υποστηρίζονται από το γεγονός ότι η δομική ακεραιότητα των καρδιομυοκυττάρων σε τομές καρδιάς διατηρείται καλύτερα υπό συνθήκες ΜΤ για 12 ημέρες, όπως φαίνεται από την άθικτη και εντοπισμένη σύνδεση 43 (Εικ. 5α).Επιπλέον, η ίνωση σε τομές καρδιάς υπό συνθήκες ΜΤ μειώθηκε σημαντικά σε σύγκριση με το Ctrl και παρόμοια με φρέσκια καρδιά (Εικ. 5β).Αυτά τα δεδομένα καταδεικνύουν ότι ο συνδυασμός μηχανικής διέγερσης και θεραπείας T3/Dex διατηρεί αποτελεσματικά την καρδιακή δομή σε καρδιακές τομές σε καλλιέργεια.
a Αντιπροσωπευτικές εικόνες ανοσοφθορισμού τροπονίνης-Τ (πράσινο), κοννεξίνης 43 (κόκκινο) και DAPI (μπλε) σε πρόσφατα απομονωμένες τομές καρδιάς (D0) ή καλλιεργημένες για 12 ημέρες και στις τέσσερις συνθήκες καλλιέργειας τομών καρδιάς (ράβδος κλίμακας = 100 μm).). Ποσοτικοποίηση τεχνητής νοημοσύνης της δομικής ακεραιότητας του καρδιακού ιστού (n = 7 (D0 και D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC και D12 MT) φέτες/ομάδα από διαφορετικούς χοίρους, πραγματοποιείται δοκιμή ANOVA μονής κατεύθυνσης. ιβ). Ποσοτικοποίηση τεχνητής νοημοσύνης της δομικής ακεραιότητας του καρδιακού ιστού (n = 7 (D0 και D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC και D12 MT) φέτες/ομάδα από διαφορετικούς χοίρους, εκτελείται δοκιμή ANOVA μονής κατεύθυνσης. ιβ). Количественная оценка структурной целостности ткани сердца со помощью искусственного интеллекта (n = 7 (D0 και D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC и D12 MT) сорезов/группу од разных свифаней, провоцы/группу од разных свифаней, ##VA; 01 по сравнению со D0 και *p < 0,05 ή ****p < 0,0001 по сравнению со D12 Ctrl). Ποσοτικοποίηση της δομικής ακεραιότητας του καρδιακού ιστού με χρήση τεχνητής νοημοσύνης (n = 7 (D0 και D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC και D12 MT) τομές/ομάδα από διαφορετικούς χοίρους, πραγματοποιήθηκε δοκιμή ANOVA μονής κατεύθυνσης· #### p < 0,0001 σε σύγκριση με D0 και *p 05 σε σύγκριση με D0 και *p <00p < .对不同猪的心脏组织结构完整性（n = 7（D0 和D12 Ctrl）、5（D12 TD、D12 MC 和D12 MT（D0 和D12 Ctrl）、5（D12 TD、D12 MC 和D12工智能量化，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0,0001 与D0 和*p < 0,05 相比，或****p 2 tr1D对 不同 猪 的 心脏 结构 完整性 （n = 7 (d0 和 d12 ctrl） （5 （d12 td 、 d12 mＥ2 mc智能量 化 进行 单向 单向 单向 测试 ； ######### p < 0,0001 与D0 和*p < 0,05 缛 C.相比）.Ποσοτικοποίηση της δομικής ακεραιότητας του καρδιακού ιστού με χρήση τεχνητής νοημοσύνης σε διαφορετικούς χοίρους (n = 7 (D0 και D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC και D12 MT) τομές/ομάδα) με δοκιμή ANOVA μονής κατεύθυνσης.#### p < 0,0001 по сравнению со D0 και *p < 0,05 или ****p < 0,0001 по сравнению με D12 Ctrl). #### p < 0,0001 σε σύγκριση με D0 και *p < 0,05 ή ****p < 0,0001 σε σύγκριση με D12 Ctrl). β Αντιπροσωπευτικές εικόνες και ποσοτικοποίηση για φέτες καρδιάς που χρωματίστηκαν με τρίχρωμη χρώση Masson (Μπάρα κλίμακας = 500 μm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD και D12 MC), 9 (D12 MT) φέτες/ομάδα από διαφορετικούς χοίρους. p. και ***p < 0,001, ή ****p < 0,0001 σε σύγκριση με D12 Ctrl). β Αντιπροσωπευτικές εικόνες και ποσοτικοποίηση για φέτες καρδιάς που χρωματίστηκαν με τρίχρωμη χρώση Masson (Μπάρα κλίμακας = 500 μm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD και D12 MC), 9 (D12 MT) φέτες/ομάδα από διαφορετικούς χοίρους. p. και ***p < 0,001, ή ****p < 0,0001 σε σύγκριση με D12 Ctrl). b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромным красителем Massona (масштабная линейка = 500 mkm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 Ctrl, D12 TD MT) ых свиней, выполняется односторонний тест ANOVA; ####p < 0,0001 με σπασίματα με D0 και ***p < 0,001 или ****p < 0,0001 με σραβενιю με D12 Ctrl). β Αντιπροσωπευτικές εικόνες και ποσοτικοποίηση τομών καρδιάς που χρωματίστηκαν με χρώση τριχρωμίου Masson (ράβδος κλίμακας = 500 μm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD και D12 MC), 9 (D12 MT) τομές/ομάδα από διαφορετικούς χοίρους, πραγματοποιήθηκαν μονόδρομες ANOVA ##0. 001 ή ****p < 0,0001 έναντι D12 Ctrl). b 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像和量化（比例尺= 500 µm）10（0D = 500 µm）10（D和D12 MC），来自不同猪的9 个（D12 MT）切片/组，进行单因素方差分析； 个（D12 MT）切片/组，进行单因素方差分析； <1####p 0,001，或****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）. b 用 μασόνος 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 和 量化 （比例 尺 尺 尺 【 1 （0 m） = 500 μm） l 、 d12 td 和 d12 mc） 来自 不同 的 9 个 d12 mt 切片 切片 切片 切片 切片 切燉 切燉 切燉 切燉片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片/组，进行单因素方差分方差分方差分析010. ***p < 0,001，或****p <0,0001 与D12 Ctrl 相比）. b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихром Massona (масштабная линейка = 500 mkm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD και D12 MC) , один- способ ANOVA; ####p < 0,0001 με σραβενιю με D0, ***p < 0,001 ή ****p < 0,0001 по σравнению με D12 Ctrl). β Αντιπροσωπευτικές εικόνες και ποσοτικοποίηση τομών καρδιάς που χρωματίστηκαν με τρίχρωμο Masson (ράβδος κλίμακας = 500 μm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD και D12 MC), 9 (D12 MT) τομές από διαφορετικούς χοίρους/ομάδα, μία μέθοδος ANOVA; ****p < 0,0001 σε σύγκριση με D12 Ctrl).Οι γραμμές σφάλματος αντιπροσωπεύουν τη μέση ± τυπική απόκλιση.
Τέλος, η ικανότητα του CTCM να μιμείται την καρδιακή υπερτροφία αξιολογήθηκε αυξάνοντας την έκταση του καρδιακού ιστού.Στο CTCM, η μέγιστη πίεση θαλάμου αέρα αυξήθηκε από 80 mmHg σε 80 mmHg.Τέχνη.(κανονική διάταση) έως 140 mmHg Art.(Εικ. 6α).Αυτό αντιστοιχεί σε μια αύξηση κατά 32% στο τέντωμα (Εικ. 6β), το οποίο προηγουμένως είχε δειχθεί ως το αντίστοιχο ποσοστό έκτασης που απαιτείται για τις τομές της καρδιάς για να επιτευχθεί ένα μήκος σαρκομερίου παρόμοιο με αυτό που παρατηρείται στην υπερτροφία.Η διάταση και η ταχύτητα του καρδιακού ιστού κατά τη διάρκεια της συστολής και της χαλάρωσης παρέμειναν σταθερές κατά τη διάρκεια έξι ημερών καλλιέργειας (Εικ. 6γ).Ο καρδιακός ιστός από καταστάσεις ΜΤ υποβλήθηκε σε συνθήκες φυσιολογικής διάτασης (MT (Κανονικό)) ή υπερβολικής έκτασης (MT (OS)) για έξι ημέρες.Ήδη μετά από τέσσερις ημέρες σε καλλιέργεια, ο υπερτροφικός βιοδείκτης NT-ProBNP ήταν σημαντικά αυξημένος στο μέσο υπό συνθήκες MT (OS) σε σύγκριση με MT (κανονικές) συνθήκες (Εικ. 7a).Επιπλέον, μετά από έξι ημέρες καλλιέργειας, το μέγεθος των κυττάρων στο MT (OS) (Εικ. 7b) αυξήθηκε σημαντικά σε σύγκριση με τις τομές της MT καρδιάς (φυσιολογικό).Επιπλέον, η πυρηνική μετατόπιση του NFATC4 αυξήθηκε σημαντικά σε υπερτεταμένους ιστούς (Εικ. 7γ).Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν την προοδευτική ανάπτυξη παθολογικής αναδιαμόρφωσης μετά από υπερδιάταση και υποστηρίζουν την ιδέα ότι η συσκευή CTCM μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως πλατφόρμα για τη μελέτη της σηματοδότησης καρδιακής υπερτροφίας που προκαλείται από τέντωμα.
Αντιπροσωπευτικά ίχνη πίεσης θαλάμου αέρα, πίεσης θαλάμου ρευστού και μετρήσεις κίνησης ιστού επιβεβαιώνουν ότι η πίεση του θαλάμου αλλάζει την πίεση του θαλάμου υγρού, προκαλώντας μια αντίστοιχη κίνηση της τομής του ιστού.β Αντιπροσωπευτικές καμπύλες ποσοστού τάνυσης και ρυθμού τάνυσης για φυσιολογικά τεντωμένες (πορτοκαλί) και υπερβολικές (μπλε) τομές ιστού.c Γράφημα ράβδων που δείχνει τον χρόνο κύκλου (n = 19 φέτες ανά ομάδα, από διαφορετικούς χοίρους), το χρόνο συστολής (n = 18-19 φέτες ανά ομάδα, από διαφορετικούς χοίρους), το χρόνο χαλάρωσης (n = 19 φέτες ανά ομάδα, από διαφορετικούς χοίρους) ), το πλάτος της κίνησης του ιστού (n = 14 φέτες / χοίροι = 14 slices/groups), από διαφορετικά από διαφορετικούς χοίρους) και μέγιστο ρυθμό χαλάρωσης (n = 14 (D0), 15 (D6) ) τομές/ομάδες) από διαφορετικούς χοίρους), το t-test Student δύο ουρών δεν έδειξε σημαντική διαφορά σε καμία παράμετρο, υποδεικνύοντας ότι αυτές οι παράμετροι παρέμειναν σταθερές κατά τη διάρκεια 6 ημερών καλλιέργειας με υπέρταση.Οι γραμμές σφάλματος αντιπροσωπεύουν τη μέση ± τυπική απόκλιση.
ένα γράφημα ράβδου ποσοτικοποίηση της συγκέντρωσης NT-ProBNP σε μέσα καλλιέργειας από φέτες καρδιάς που καλλιεργήθηκαν υπό συνθήκες κανονικής διάτασης MT (Norm) ή υπερβολικής έκτασης (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm και D4 MTOS) φέτες/ομάδα από διαφορετικούς χοίρους. **1 κανονική έκταση ANOVA. Γράφημα ράβδου ποσοτικοποίηση της συγκέντρωσης NT-ProBNP σε μέσα καλλιέργειας από φέτες καρδιάς που καλλιεργήθηκαν υπό συνθήκες κανονικής έκτασης MT (Norm) ή υπερβολικής έκτασης (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm και D4 MTOS) φέτες/ομάδα από διαφορετικούς χοίρους **.Ποσοτικό ιστόγραμμα συγκέντρωσης NT-ProBNP σε θρεπτικό μέσο καλλιέργειας από καρδιές που καλλιεργήθηκαν υπό συνθήκες κανονικής διάτασης MT (κανονικός) ή υπερέκτασης (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm και D4). MTOS) φέτες /ομάδα από διαφορετικούς χοίρους, διενεργήθηκε ανάλυση variance.**p < 0,01 по сравнению со нормальным растяжением). **p < 0,01 σε σύγκριση με την κανονική διάταση). a 在MT 正常拉伸(Norm) 或过度拉伸(OS) 条件下培养的心脏切片培养基中NT-ProBNP = 4 (D2 MTNorm)、3（D2 MTOS、D4 MTNorm 和D4 MTOS）来自不同猪的切片/组，进行双向方差分分切片/组，进行双向方差分分，p < 0,01）. μια ποσοτικοποίηση της συγκέντρωσης NT-ProBNP σε φέτες καρδιάς που καλλιεργήθηκαν υπό συνθήκες κανονικής διάτασης (Νορμ) ή υπερέντασης (OS) (n=4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm和D4 MTOS) από διαφορετικές动, **σε σύγκριση με τις κανονικές διατάσεις, p < 0,01).Ιστόγραμμα Ποσοτικοποίηση των συγκεντρώσεων NT-ProBNP σε φέτες καρδιάς που καλλιεργήθηκαν υπό συνθήκες κανονικής MT stretch (norm) ή overstretch (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm) και D4 MTOS) φέτες/ομάδα από διαφορετικούς χοίρους, αμφίδρομη ανάλυση διακύμανσης.**p < 0,01 по сравнению со нормальным растяжением). **p < 0,01 σε σύγκριση με την κανονική διάταση). β Αντιπροσωπευτικές εικόνες για καρδιές φέτες χρωματισμένες με τροπονίνη-T και WGA (αριστερά) και ποσοτικοποίηση μεγέθους κυττάρου (δεξιά) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) κύτταρα/ομάδα από 10 διαφορετικές φέτες από διαφορετικούς χοίρους, Εκτελείται τεστ t-test με δύο ουρές. β Αντιπροσωπευτικές εικόνες για καρδιές φέτες χρωματισμένες με τροπονίνη-T και WGA (αριστερά) και ποσοτικοποίηση μεγέθους κυττάρου (δεξιά) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) κύτταρα/ομάδα από 10 διαφορετικές φέτες από διαφορετικούς χοίρους, Εκτελείται τεστ Student t-Test δύο ουρών <1 με φυσιολογικό. ****0). b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных troponinom-Т и AZP (слева) и колιчественного συγκρότημα ορισμός клеток (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) - проводится хвостовой t-критерий Стьюдента; ****p < 0,0001 по сравнению со нормальным растяжением). β Αντιπροσωπευτικές εικόνες καρδιών τομέων χρωματισμένων με τροπονίνη-Τ και AZP (αριστερά) και ποσοτικοποίηση μεγέθους κυττάρων (δεξιά) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) κύτταρα/ομάδα από 10 διαφορετικές τομές από διαφορετικούς χοίρους, διεξήχθη δοκιμή t-test Student δύο ουρών <0 με κανονικό 00p. b 用肌钙蛋白-T 和WGA（左）和细胞大小量化（右）染色的心脏切片的代表n =30 ），来自不同猪的10 个不同切片的369（D6 MTNorm）细胞/组，两进行有尾学甸t比，****p < 0,0001）. β Αντιπροσωπευτικές εικόνες καρδιών κομματιών χρωματισμένων με ασβεστοΐνη-T και WGA (αριστερά) και μέγεθος κυττάρου (δεξιά) (n = 330 (D6 MTOS), 369 από 10 διαφορετικές φέτες (D6 MTNorm)) Κύτταρα/组，两方法有得0,0001). b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных troponinom-Т и AZP (слева) и количественная оценка размера клеток (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) εκ 10 , двусторонние критерий Стьюдента; ****p < 0,0001 по сравнению со нормальным растяжением). β Αντιπροσωπευτικές εικόνες τμημάτων καρδιάς χρωματισμένες με τροπονίνη-Τ και AZP (αριστερά) και ποσοτικοποίηση του μεγέθους των κυττάρων (δεξιά) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) από 10 διαφορετικές τομές από διαφορετικούς χοίρους) Κύτταρα/ομάδα, κριτήριο δύο ουρών Student's t;****p < 0,0001 σε σύγκριση με την κανονική καταπόνηση). γ. γ Αντιπροσωπευτικές εικόνες για την ημέρα 0 και την ημέρα 6 καρδιές MTOS τομές καρδιάς ανοσοεπισημασμένες για τροπονίνη-Τ και NFATC4 και ποσοτικοποίηση της μετατόπισης του NFATC4 στους πυρήνες των CMs (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) φέτες/ομάδα από διαφορετικούς χοίρους, Διενεργείται δοκιμή δύο ουρών *5 Student t-0. c. ных свиней , выполняется двусторонний t-критерий Стьюдента, *p < 0,05). γ Αντιπροσωπευτικές εικόνες για τομές καρδιάς σε MTOS 0 και 6 ημερών, ανοσοεπισημασμένες για τροπονίνη-Τ και NFATC4, και ποσοτικοποίηση της μετατόπισης NFATC4 στον πυρήνα των σπηλαιωδών κυττάρων (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) φέτες/ομάδα από διαφορετικούς χοίρους) διεξήχθησαν t-test σε δύο ουρές.*p < 0,05). c 用于肌钙蛋白-T 和NFATC4 免疫标记的第0 天和第6 天MTOS 心脏切片的代表性图天和第6 天MTOS 心脏切片的代表性弛的NFATC4 易位至CM 细胞核的量化（n = 4 (D0)、3 (D6 MTOS) 切片/组, 进行双尾学甪t 。 5 0. γ Αντιπροσωπευτικές εικόνες της ανοσοσήμανσης καλκανίνης-Τ και NFATC4 第0天和第6天MTOS 第6天MTOS φέτες καρδιάς και NFATC4 από διαφορετικούς πυρήνες NFATC4 易位至CM κυτταρικού πυρήνα的ποσότητα化 (n = 4 (D6, 礇 礻),间双尾学生et 电影；*p < 0,05). c. -критерий Стьюдента, *p < 0,05). γ Αντιπροσωπευτικές εικόνες καρδιών MTOS την ημέρα 0 και 6 για ανοσοσήμανση τροπονίνης-Τ και NFATC4 και ποσοτικό προσδιορισμό της μετατόπισης του NFATC4 στον πυρήνα του CM από διαφορετικούς χοίρους (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) φέτες/ομάδα, δύο ουρών <0' t -criter Students *5).Οι γραμμές σφάλματος αντιπροσωπεύουν τη μέση ± τυπική απόκλιση.
Η μεταφραστική καρδιαγγειακή έρευνα απαιτεί κυτταρικά μοντέλα που αναπαράγουν με ακρίβεια το καρδιακό περιβάλλον.Σε αυτή τη μελέτη, αναπτύχθηκε και χαρακτηρίστηκε μια συσκευή CTCM που μπορεί να διεγείρει εξαιρετικά λεπτά τμήματα της καρδιάς.Το σύστημα CTCM περιλαμβάνει φυσιολογικά συγχρονισμένη ηλεκτρομηχανική διέγερση και εμπλουτισμό υγρού T3 και Dex.Όταν τομές καρδιάς χοίρου εκτέθηκαν σε αυτούς τους παράγοντες, η βιωσιμότητα, η δομική τους ακεραιότητα, η μεταβολική δραστηριότητα και η μεταγραφική τους έκφραση παρέμειναν τα ίδια όπως στον φρέσκο ​​καρδιακό ιστό μετά από 12 ημέρες καλλιέργειας.Επιπλέον, το υπερβολικό τέντωμα του καρδιακού ιστού μπορεί να προκαλέσει υπερτροφία της καρδιάς που προκαλείται από υπερέκταση.Συνολικά, αυτά τα αποτελέσματα υποστηρίζουν τον κρίσιμο ρόλο των συνθηκών φυσιολογικής καλλιέργειας στη διατήρηση ενός φυσιολογικού καρδιακού φαινοτύπου και παρέχουν μια πλατφόρμα για τον έλεγχο φαρμάκων.
Πολλοί παράγοντες συμβάλλουν στη δημιουργία ενός βέλτιστου περιβάλλοντος για τη λειτουργία και την επιβίωση των καρδιομυοκυττάρων.Οι πιο προφανείς από αυτούς τους παράγοντες σχετίζονται με (1) μεσοκυτταρικές αλληλεπιδράσεις, (2) ηλεκτρομηχανική διέγερση, (3) χυμικούς παράγοντες και (4) μεταβολικά υποστρώματα.Οι φυσιολογικές αλληλεπιδράσεις κυττάρου με κύτταρο απαιτούν πολύπλοκα τρισδιάστατα δίκτυα πολλαπλών τύπων κυττάρων που υποστηρίζονται από μια εξωκυτταρική μήτρα.Τέτοιες πολύπλοκες κυτταρικές αλληλεπιδράσεις είναι δύσκολο να ανακατασκευαστούν in vitro με συν-καλλιέργεια μεμονωμένων τύπων κυττάρων, αλλά μπορούν εύκολα να επιτευχθούν χρησιμοποιώντας την οργανοτυπική φύση των καρδιακών τομών.
Το μηχανικό τέντωμα και η ηλεκτρική διέγερση των καρδιομυοκυττάρων είναι κρίσιμα για τη διατήρηση του καρδιακού φαινοτύπου33,34,35.Ενώ η μηχανική διέγερση έχει χρησιμοποιηθεί ευρέως για την προετοιμασία και την ωρίμανση του hiPSC-CM, αρκετές κομψές μελέτες προσπάθησαν πρόσφατα τη μηχανική διέγερση των καρδιών σε καλλιέργεια χρησιμοποιώντας μονοαξονική φόρτιση.Αυτές οι μελέτες δείχνουν ότι η 2D μονοαξονική μηχανική φόρτιση έχει θετική επίδραση στον φαινότυπο της καρδιάς κατά τη διάρκεια της καλλιέργειας.Σε αυτές τις μελέτες, τα τμήματα της καρδιάς είτε φορτώθηκαν με ισομετρικές δυνάμεις εφελκυσμού17, είτε με γραμμική αυτοτονική φόρτιση18 είτε ο καρδιακός κύκλος αναδημιουργήθηκε χρησιμοποιώντας ανάδραση μετατροπέα δύναμης και κινήσεις τάσης.Ωστόσο, αυτές οι μέθοδοι χρησιμοποιούν μονοαξονικό τέντωμα ιστού χωρίς περιβαλλοντική βελτιστοποίηση, με αποτέλεσμα την καταστολή πολλών καρδιακών γονιδίων ή την υπερέκφραση γονιδίων που σχετίζονται με μη φυσιολογικές αποκρίσεις τεντώματος.Το CTCM που περιγράφεται εδώ παρέχει ένα τρισδιάστατο ηλεκτρομηχανικό ερέθισμα που μιμείται τον φυσικό καρδιακό κύκλο όσον αφορά τον χρόνο κύκλου και τη φυσιολογική διάταση (25% διάταση, 40% συστολή, 60% διαστολή και 72 παλμούς ανά λεπτό).Αν και αυτή η τρισδιάστατη μηχανική διέγερση από μόνη της δεν είναι επαρκής για τη διατήρηση της ακεραιότητας των ιστών, απαιτείται συνδυασμός χυμικής και μηχανικής διέγερσης με χρήση T3/Dex για τη διατήρηση επαρκώς της βιωσιμότητας, της λειτουργίας και της ακεραιότητας του ιστού.
Οι χυμικοί παράγοντες παίζουν σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση του φαινοτύπου της καρδιάς των ενηλίκων.Αυτό τονίστηκε σε μελέτες HiPS-CM στις οποίες προστέθηκαν T3 και Dex σε μέσα καλλιέργειας για να επιταχυνθεί η ωρίμανση των κυττάρων.Η Τ3 μπορεί να επηρεάσει τη μεταφορά αμινοξέων, σακχάρων και ασβεστίου μέσω των κυτταρικών μεμβρανών36.Επιπλέον, η Τ3 προάγει την έκφραση του MHC-α και την καθοδική ρύθμιση του MHC-β, προάγοντας τον σχηματισμό μυοϊνιδίων ταχείας συστολής στα ώριμα καρδιομυοκύτταρα σε σύγκριση με τα μυοϊνίδια βραδείας συστολής στο εμβρυϊκό CM.Η ανεπάρκεια Τ3 σε υποθυρεοειδικούς ασθενείς έχει ως αποτέλεσμα την απώλεια των μυοϊνιδιακών ζωνών και τον μειωμένο ρυθμό ανάπτυξης τόνου37.Το Dex δρα στους υποδοχείς γλυκοκορτικοειδών και έχει αποδειχθεί ότι αυξάνει τη συσταλτικότητα του μυοκαρδίου σε απομονωμένες αιματωμένες καρδιές.38 αυτή η βελτίωση πιστεύεται ότι σχετίζεται με την επίδραση στην είσοδο που βασίζεται στην κατάθεση ασβεστίου (SOCE) 39,40.Επιπλέον, το Dex συνδέεται με τους υποδοχείς του, προκαλώντας μια ευρεία ενδοκυτταρική απόκριση που καταστέλλει την ανοσολογική λειτουργία και τη φλεγμονή30.
Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η φυσική μηχανική διέγερση (MS) βελτίωσε τη συνολική απόδοση της καλλιέργειας σε σύγκριση με το Ctrl, αλλά απέτυχε να διατηρήσει τη βιωσιμότητα, τη δομική ακεραιότητα και την καρδιακή έκφραση για 12 ημέρες σε καλλιέργεια.Σε σύγκριση με το Ctrl, η προσθήκη T3 και Dex σε καλλιέργειες CTCM (MT) βελτίωσε τη βιωσιμότητα και διατήρησε παρόμοια προφίλ μεταγραφής, δομική ακεραιότητα και μεταβολική δραστηριότητα με φρέσκο ​​καρδιακό ιστό για 12 ημέρες.Επιπλέον, με τον έλεγχο του βαθμού τάνυσης των ιστών, δημιουργήθηκε ένα μοντέλο καρδιακής υπερτροφίας που προκαλείται από υπερέκταση χρησιμοποιώντας το STCM, που απεικονίζει την ευελιξία του συστήματος STCM.Θα πρέπει να σημειωθεί ότι αν και η καρδιακή αναδιαμόρφωση και η ίνωση συνήθως περιλαμβάνουν άθικτα όργανα των οποίων τα κυκλοφορούντα κύτταρα μπορούν να παρέχουν τις κατάλληλες κυτοκίνες καθώς και φαγοκυττάρωση και άλλους παράγοντες αναδιαμόρφωσης, τμήματα της καρδιάς μπορούν να μιμούνται την ινωτική διαδικασία ως απόκριση στο στρες και το τραύμα.στους μυοϊνοβλάστες.Αυτό έχει αξιολογηθεί προηγουμένως σε αυτό το μοντέλο καρδιακής τομής.Θα πρέπει να σημειωθεί ότι οι παράμετροι CTCM μπορούν να διαμορφωθούν αλλάζοντας την πίεση/ηλεκτρικό πλάτος και συχνότητα για την προσομοίωση πολλών καταστάσεων όπως η ταχυκαρδία, η βραδυκαρδία και η μηχανική υποστήριξη του κυκλοφορικού (μηχανική καρδιά χωρίς φορτίο).Αυτό καθιστά το σύστημα μια μεσαία απόδοση για δοκιμές φαρμάκων.Η ικανότητα του CTCM να μοντελοποιεί την καρδιακή υπερτροφία που προκαλείται από υπερπροσπάθεια ανοίγει το δρόμο για τη δοκιμή αυτού του συστήματος για εξατομικευμένη θεραπεία.Συμπερασματικά, η παρούσα μελέτη καταδεικνύει ότι η μηχανική διάταση και η χυμική διέγερση είναι κρίσιμες για τη διατήρηση της καλλιέργειας τομών καρδιακού ιστού.
Αν και τα δεδομένα που παρουσιάζονται εδώ υποδηλώνουν ότι το CTCM είναι μια πολλά υποσχόμενη πλατφόρμα για τη μοντελοποίηση του ανέπαφου μυοκαρδίου, αυτή η μέθοδος καλλιέργειας έχει ορισμένους περιορισμούς.Ο κύριος περιορισμός της καλλιέργειας CTCM είναι ότι επιβάλλει συνεχείς δυναμικές μηχανικές πιέσεις στις τομές, γεγονός που αποκλείει την ικανότητα ενεργητικής παρακολούθησης των συσπάσεων της καρδιακής τομής κατά τη διάρκεια κάθε κύκλου.Επιπλέον, λόγω του μικρού μεγέθους των καρδιακών τομών (7 mm), η ικανότητα αξιολόγησης της συστολικής λειτουργίας εκτός συστημάτων καλλιέργειας με χρήση παραδοσιακών αισθητήρων δύναμης είναι περιορισμένη.Στο τρέχον χειρόγραφο, ξεπερνάμε εν μέρει αυτόν τον περιορισμό αξιολογώντας την οπτική τάση ως δείκτη της συσταλτικής λειτουργίας.Ωστόσο, αυτός ο περιορισμός θα απαιτήσει περαιτέρω εργασία και μπορεί να αντιμετωπιστεί στο μέλλον με την εισαγωγή μεθόδων οπτικής παρακολούθησης της λειτουργίας των καρδιών σε καλλιέργεια, όπως η οπτική χαρτογράφηση με χρήση ασβεστίου και χρωστικών ευαίσθητων στην τάση.Ένας άλλος περιορισμός του CTCM είναι ότι το μοντέλο εργασίας δεν χειρίζεται το φυσιολογικό στρες (προφόρτιση και μεταφόρτωση).Στο CTCM, η πίεση προκλήθηκε σε αντίθετες κατευθύνσεις για να αναπαραχθεί 25% φυσιολογική διάταση στη διαστολή (πλήρης διάταση) και στη συστολή (μήκος συστολής κατά την ηλεκτρική διέγερση) σε πολύ μεγάλους ιστούς.Αυτός ο περιορισμός θα πρέπει να αρθεί σε μελλοντικούς σχεδιασμούς CTCM με επαρκή πίεση στον καρδιακό ιστό και από τις δύο πλευρές και με την εφαρμογή των ακριβών σχέσεων πίεσης-όγκου που εμφανίζονται στους θαλάμους της καρδιάς.
Η αναδιαμόρφωση που προκαλείται από υπερένταση που αναφέρεται σε αυτό το χειρόγραφο περιορίζεται στη μίμηση υπερτροφικών σημάτων υπερέκτασης.Έτσι, αυτό το μοντέλο μπορεί να βοηθήσει στη μελέτη υπερτροφικής σηματοδότησης που προκαλείται από τέντωμα χωρίς την ανάγκη χυμικών ή νευρικών παραγόντων (που δεν υπάρχουν σε αυτό το σύστημα).Απαιτούνται περαιτέρω μελέτες για να αυξηθεί η πολλαπλότητα του CTCM, για παράδειγμα, η συγκαλλιέργεια με ανοσοκύτταρα, η κυκλοφορία χυμικών παραγόντων πλάσματος και η νεύρωση όταν η συγκαλλιέργεια με νευρωνικά κύτταρα θα βελτιώσει τις δυνατότητες μοντελοποίησης της νόσου με το CTCM.
Σε αυτή τη μελέτη χρησιμοποιήθηκαν 13 χοίροι.Όλες οι διαδικασίες σε ζώα πραγματοποιήθηκαν σύμφωνα με τις κατευθυντήριες οδηγίες του ιδρύματος και εγκρίθηκαν από την Επιτροπή Ιδρυματικής Φροντίδας και Χρήσης Ζώων του Πανεπιστημίου του Louisville.Το αορτικό τόξο συσφίχθηκε και η καρδιά εγχύθηκε με 1 L στείρας καρδιοπληγίας (110 mM NaCl, 1,2 mM CaCl2, 16 mM KCl, 16 mM MgCl2, 10 mM NaHC03, 5 U/mL ηπαρίνης, pH έως 7). Οι καρδιές διατηρήθηκαν σε παγωμένο καρδιοπληγικό διάλυμα μέχρι να μεταφερθούν στο εργαστήριο σε πάγο που είναι συνήθως <10 λεπτά. Οι καρδιές διατηρήθηκαν σε παγωμένο καρδιοπληγικό διάλυμα μέχρι να μεταφερθούν στο εργαστήριο σε πάγο που είναι συνήθως <10 λεπτά. сердца хранили во ледяном кардиоплегическом διαλύεται μέχρι μεταφοράς σε εργαστήρια στο λьду, что обычно занимает <10 мин. Οι καρδιές αποθηκεύτηκαν σε παγωμένο καρδιοπληγικό διάλυμα μέχρι να μεταφερθούν στο εργαστήριο σε πάγο, που συνήθως διαρκεί <10 λεπτά.将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钟将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钟 Держите сердца во ледяной кардиоплегии до транспортировки во εργαστήρια του льду, обычно <10 мин. Κρατήστε τις καρδιές σε πάγο καρδιοπληγία μέχρι τη μεταφορά στο εργαστήριο σε πάγο, συνήθως <10 λεπτά.
Η συσκευή CTCM αναπτύχθηκε σε λογισμικό SolidWorks με τη βοήθεια υπολογιστή σχεδιασμού (CAD).Οι θάλαμοι καλλιέργειας, τα διαχωριστικά και οι αεροθάλαμοι είναι κατασκευασμένοι από διαφανές ακρυλικό πλαστικό CNC.Ο εφεδρικός δακτύλιος διαμέτρου 7 mm είναι κατασκευασμένος από πολυαιθυλένιο υψηλής πυκνότητας (HDPE) στο κέντρο και έχει μια αυλάκωση δακτυλίου ο για να φιλοξενήσει το δακτύλιο σιλικόνης που χρησιμοποιείται για τη σφράγιση των μέσων από κάτω.Μια λεπτή μεμβράνη πυριτίου διαχωρίζει τον θάλαμο καλλιέργειας από την πλάκα διαχωρισμού.Η μεμβράνη σιλικόνης είναι κομμένη με λέιζερ από φύλλο σιλικόνης πάχους 0,02″ και έχει σκληρότητα 35Α.Το κάτω και το επάνω παρέμβυσμα σιλικόνης είναι κομμένα με λέιζερ από φύλλο σιλικόνης πάχους 1/16" και έχουν σκληρότητα 50Α.Οι βίδες και τα παξιμάδια από ανοξείδωτο χάλυβα 316L χρησιμοποιούνται για τη στερέωση του μπλοκ και τη δημιουργία αεροστεγούς σφράγισης.
Μια ειδική πλακέτα τυπωμένου κυκλώματος (PCB) έχει σχεδιαστεί για να ενσωματώνεται στο σύστημα C-PACE-EM.Οι υποδοχές σύνδεσης του ελβετικού μηχανήματος στο PCB συνδέονται με ηλεκτρόδια γραφίτη με επάργυρα χάλκινα σύρματα και μπρούτζινες βίδες 0-60 βιδωμένες στα ηλεκτρόδια.Η πλακέτα τυπωμένου κυκλώματος τοποθετείται στο κάλυμμα του 3D εκτυπωτή.
Η συσκευή CTCM ελέγχεται από έναν προγραμματιζόμενο πνευματικό ενεργοποιητή (PPD) που δημιουργεί μια ελεγχόμενη κυκλοφορική πίεση παρόμοια με έναν καρδιακό κύκλο.Καθώς η πίεση στο εσωτερικό του θαλάμου αέρα αυξάνεται, η εύκαμπτη μεμβράνη σιλικόνης διαστέλλεται προς τα πάνω, πιέζοντας το μέσο κάτω από την περιοχή του ιστού.Η περιοχή του ιστού στη συνέχεια θα τεντωθεί με αυτή την αποβολή υγρού, μιμούμενη τη φυσιολογική διαστολή της καρδιάς κατά τη διάρκεια της διαστολής.Στην κορυφή της χαλάρωσης, εφαρμόστηκε ηλεκτρική διέγερση μέσω ηλεκτροδίων γραφίτη, τα οποία μείωσαν την πίεση στον θάλαμο αέρα και προκάλεσαν συστολή τμημάτων ιστού.Στο εσωτερικό του σωλήνα υπάρχει μια αιμοστατική βαλβίδα με αισθητήρα πίεσης για την ανίχνευση της πίεσης στο σύστημα αέρα.Η πίεση που ανιχνεύεται από τον αισθητήρα πίεσης εφαρμόζεται σε έναν συλλέκτη δεδομένων που είναι συνδεδεμένος στο φορητό υπολογιστή.Αυτό επιτρέπει τη συνεχή παρακολούθηση της πίεσης στο εσωτερικό του θαλάμου αερίου.Όταν επιτεύχθηκε η μέγιστη πίεση θαλάμου (κανονική 80 mmHg, 140 mmHg OS), η συσκευή απόκτησης δεδομένων διατάχθηκε να στείλει ένα σήμα στο σύστημα C-PACE-EM για να δημιουργήσει ένα διφασικό σήμα τάσης για 2 ms, ρυθμισμένο στα 4 V.
Ελήφθησαν τομές καρδιάς και πραγματοποιήθηκαν συνθήκες καλλιέργειας σε 6 φρεάτια ως εξής: Μεταφέρετε τις καρδιές που συλλέγονται από το δοχείο μεταφοράς σε δίσκο που περιέχει ψυχρή (4°C) καρδιοπληγία.Η αριστερή κοιλία απομονώθηκε με αποστειρωμένη λεπίδα και κόπηκε σε κομμάτια 1-2 cm3.Αυτά τα μπλοκ ιστού προσαρτήθηκαν σε υποστηρίγματα ιστού με συγκολλητικό ιστού και τοποθετήθηκαν σε λουτρό ιστού δονούμενου μικροτόμου που περιείχε διάλυμα Tyrode και οξυγονώθηκε συνεχώς (3 g/L μονοοξίμη 2,3-βουτανοδιόνης (BDM), 140 mM NaCl (8,18 g)), 6 mM K471-g01, 6 mM KCl, 0,1-0glco (0). mM HEPES (2,38 g), 1 mM MgCl2 (1 ml διαλύματος 1 Μ), 1,8 mM CaCl2 (1,8 ml διαλύματος 1 Μ), έως 1 L ddH2O).Ο δονούμενος μικροτόμος ρυθμίστηκε να κόβει φέτες πάχους 300 μm σε συχνότητα 80 Hz, οριζόντιο εύρος δόνησης 2 mm και ρυθμό προώθησης 0,03 mm/s.Το λουτρό ιστού περιβαλλόταν από πάγο για να διατηρηθεί το διάλυμα δροσερό και η θερμοκρασία διατηρήθηκε στους 4°C.Μεταφέρετε τμήματα ιστού από το λουτρό μικροτόμου σε ένα λουτρό επώασης που περιέχει συνεχώς οξυγονωμένο διάλυμα Tyrode σε πάγο έως ότου ληφθούν αρκετές τομές για ένα τρυβλίο καλλιέργειας.Για καλλιέργειες transwell, τομές ιστού προσαρτήθηκαν σε αποστειρωμένα στηρίγματα πολυουρεθάνης πλάτους 6 mm και τοποθετήθηκαν σε 6 ml βελτιστοποιημένου μέσου (199 μέσο, ​​1x συμπλήρωμα ITS, 10% FBS, 5 ng/ml VEGF, 10 ng/ml FGF-αλκαλικό και 2Χ αντιβιοτικό-αντιμυκητιακό).Ηλεκτρική διέγερση (10 V, συχνότητα 1,2 Hz) εφαρμόστηκε στα τμήματα ιστού μέσω του C-Pace.Για τις συνθήκες TD, φρέσκο ​​T3 και Dex προστέθηκαν στα 100 nM και 1 μΜ σε κάθε αλλαγή του μέσου.Το μέσο είναι κορεσμένο με οξυγόνο πριν από την αντικατάσταση 3 φορές την ημέρα.Τομές ιστού καλλιεργήθηκαν σε επωαστήρα στους 37°C και 5% CO2.
Για καλλιέργειες CTCM, τομές ιστού τοποθετήθηκαν σε έναν προσαρμοσμένο τρισδιάστατο εκτυπωτή σε ένα τρυβλίο Petri που περιείχε τροποποιημένο διάλυμα Tyrode.Η συσκευή έχει σχεδιαστεί για να αυξάνει το μέγεθος της φέτας της καρδιάς κατά 25% της επιφάνειας του δακτυλίου στήριξης.Αυτό γίνεται έτσι ώστε τα τμήματα της καρδιάς να μην τεντώνονται μετά τη μεταφορά από το διάλυμα Tyrode στο μέσο και κατά τη διάρκεια της διαστολής.Χρησιμοποιώντας ιστοακρυλική κόλλα, τμήματα πάχους 300 μm στερεώθηκαν σε δακτύλιο στήριξης διαμέτρου 7 mm.Αφού συνδέσετε τα τμήματα ιστού στον δακτύλιο στήριξης, κόψτε τα πλεονάζοντα τμήματα ιστού και τοποθετήστε τα προσαρτημένα τμήματα ιστού πίσω στο λουτρό διαλύματος Tyrode σε πάγο (4°C) μέχρι να προετοιμαστούν αρκετά τμήματα για μία συσκευή.Ο συνολικός χρόνος επεξεργασίας για όλες τις συσκευές δεν πρέπει να υπερβαίνει τις 2 ώρες.Αφού προσαρτήθηκαν 6 τμήματα ιστού στους δακτυλίους στήριξης τους, συναρμολογήθηκε η συσκευή CTCM.Ο θάλαμος καλλιέργειας CTCM είναι προγεμισμένος με 21 ml προ-οξυγονωμένου μέσου.Μεταφέρετε τα τμήματα ιστού στο θάλαμο καλλιέργειας και αφαιρέστε προσεκτικά τυχόν φυσαλίδες αέρα με μια πιπέτα.Στη συνέχεια, το τμήμα του ιστού οδηγείται στην οπή και πιέζεται απαλά στη θέση του.Τέλος, τοποθετήστε το καπάκι του ηλεκτροδίου στη συσκευή και μεταφέρετε τη συσκευή στη θερμοκοιτίδα.Στη συνέχεια, συνδέστε το CTCM στον σωλήνα αέρα και στο σύστημα C-PACE-EM.Ο πνευματικός ενεργοποιητής ανοίγει και η βαλβίδα αέρα ανοίγει το CTCM.Το σύστημα C-PACE-EM διαμορφώθηκε ώστε να παρέχει 4 V στα 1,2 Hz κατά τη διάρκεια διφασικής βηματοδότησης για 2 ms.Το μέσο άλλαζε δύο φορές την ημέρα και τα ηλεκτρόδια άλλαζαν μία φορά την ημέρα για να αποφευχθεί η συσσώρευση γραφίτη στα ηλεκτρόδια.Εάν είναι απαραίτητο, τα τμήματα ιστού μπορούν να αφαιρεθούν από τα φρεάτια καλλιέργειας τους για να αποβληθούν τυχόν φυσαλίδες αέρα που μπορεί να έχουν πέσει κάτω από αυτά.Για συνθήκες επεξεργασίας MT, το T3/Dex προστέθηκε φρέσκο ​​με κάθε αλλαγή του μέσου με 100 nM T3 και 1 μM Dex.Οι συσκευές CTCM καλλιεργήθηκαν σε επωαστήρα στους 37°C και 5% CO2.
Για τη λήψη τεντωμένων τροχιών καρδιών, αναπτύχθηκε ένα ειδικό σύστημα κάμερας.Χρησιμοποιήθηκε κάμερα SLR (Canon Rebel T7i, Canon, Τόκιο, Ιαπωνία) με φακό μακροεντολής Navitar Zoom 7000 18-108 mm (Navitar, San Francisco, CA).Η οπτικοποίηση πραγματοποιήθηκε σε θερμοκρασία δωματίου μετά την αντικατάσταση του μέσου με φρέσκο ​​μέσο.Η κάμερα είναι τοποθετημένη σε γωνία 51° και το βίντεο εγγράφεται στα 30 καρέ ανά δευτερόλεπτο.Πρώτον, χρησιμοποιήθηκε λογισμικό ανοιχτού κώδικα (MUSCLEMOTION43) με το Image-J για να ποσοτικοποιήσει την κίνηση των καρδιών.Η μάσκα δημιουργήθηκε χρησιμοποιώντας το MATLAB (MathWorks, Natick, MA, ΗΠΑ) για τον καθορισμό των περιοχών ενδιαφέροντος για τις φέτες της καρδιάς για την αποφυγή του θορύβου.Οι μη αυτόματα τμηματοποιημένες μάσκες εφαρμόζονται σε όλες τις εικόνες σε μια ακολουθία πλαισίων και στη συνέχεια μεταβιβάζονται στην προσθήκη MUSCLEMOTION.Το Muscle Motion χρησιμοποιεί τη μέση ένταση των pixel σε κάθε πλαίσιο για να ποσοτικοποιήσει την κίνησή του σε σχέση με το πλαίσιο αναφοράς.Τα δεδομένα καταγράφηκαν, διηθήθηκαν και χρησιμοποιήθηκαν για να ποσοτικοποιηθεί ο χρόνος του κύκλου και να εκτιμηθεί το τέντωμα των ιστών κατά τη διάρκεια του καρδιακού κύκλου.Το εγγεγραμμένο βίντεο υποβλήθηκε σε μεταγενέστερη επεξεργασία χρησιμοποιώντας ψηφιακό φίλτρο μηδενικής φάσης πρώτης τάξης.Για να ποσοτικοποιηθεί το τέντωμα του ιστού (από κορυφή σε κορυφή), πραγματοποιήθηκε ανάλυση από κορυφή σε κορυφή για να γίνει διάκριση μεταξύ κορυφών και κατωφλιών στο καταγεγραμμένο σήμα.Επιπλέον, η αποτόνωση εκτελείται χρησιμοποιώντας ένα πολυώνυμο 6ης τάξης για την εξάλειψη της μετατόπισης του σήματος.Ο κώδικας προγράμματος αναπτύχθηκε στο MATLAB για τον προσδιορισμό της συνολικής κίνησης των ιστών, του χρόνου κύκλου, του χρόνου χαλάρωσης και του χρόνου συστολής (Συμπληρωματικός Κωδικός Προγράμματος 44).
Για ανάλυση καταπόνησης, χρησιμοποιώντας τα ίδια βίντεο που δημιουργήθηκαν για μηχανική εκτίμηση τεντώματος, εντοπίσαμε αρχικά δύο εικόνες που αντιπροσωπεύουν κορυφές κίνησης (το υψηλότερο (άνω) και το χαμηλότερο (κάτω) σημεία κίνησης) σύμφωνα με το λογισμικό MUSCLEMOTION.Στη συνέχεια τμηματοποιήσαμε τις περιοχές του ιστού και εφαρμόσαμε μια μορφή αλγόριθμου σκίασης στον τμηματοποιημένο ιστό (Συμπληρωματικό Σχήμα 2α).Ο τμηματοποιημένος ιστός στη συνέχεια χωρίστηκε σε δέκα υποεπιφάνειες και η τάση σε κάθε επιφάνεια υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας την ακόλουθη εξίσωση: Στέλεχος = (Sup-Sdown)/Sdown, όπου Sup και Sdown είναι οι αποστάσεις του σχήματος από τις πάνω και κάτω σκιές του υφάσματος, αντίστοιχα (Συμπληρωματικό Σχ. .2b).
Οι τομές καρδιάς σταθεροποιήθηκαν σε 4% παραφορμαλδεΰδη για 48 ώρες.Οι σταθεροποιημένοι ιστοί αφυδατώθηκαν σε 10% και 20% σακχαρόζη για 1 ώρα, στη συνέχεια σε σακχαρόζη 30% όλη τη νύχτα.Οι τομές στη συνέχεια ενσωματώθηκαν σε ένωση βέλτιστης θερμοκρασίας κοπής (ένωση OCT) και σταδιακά καταψύχθηκαν σε λουτρό ισοπεντανίου/ξηρού πάγου.Αποθηκεύστε τα μπλοκ ενσωμάτωσης OCT στους -80 °C μέχρι να διαχωριστούν.Οι αντικειμενοφόρες πλάκες προετοιμάστηκαν ως τομές με πάχος 8 μm.
Για να αφαιρέσετε το OCT από τα τμήματα της καρδιάς, θερμάνετε τις αντικειμενοφόρες πλάκες σε θερμαντικό μπλοκ στους 95 °C για 5 λεπτά.Προσθέστε 1 ml PBS σε κάθε αντικειμενοφόρο πλάκα και επωάστε για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου, στη συνέχεια διαποτίστε τις τομές ρυθμίζοντας 0,1% Triton-X σε PBS για 15 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου.Για να αποτρέψετε τη δέσμευση μη ειδικών αντισωμάτων στο δείγμα, προσθέστε 1 ml διαλύματος BSA 3% στις αντικειμενοφόρες πλάκες και επωάστε για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου.Το BSA στη συνέχεια αφαιρέθηκε και οι αντικειμενοφόρες πλάκες πλύθηκαν με PBS.Σημειώστε κάθε δείγμα με ένα μολύβι.Πρωτογενή αντισώματα (αραιωμένα 1:200 σε 1% BSA) (κοννεξίνη 43 (Abcam; #AB11370), NFATC4 (Abcam; #AB99431) και τροπονίνη-Τ (Thermo Scientific; #MA5-12960) προστέθηκαν σε διάστημα 90 λεπτών, και στη συνέχεια διευρύνθηκαν δευτερογενή αντισώματα Alex201% κατά 1% Αλεξία: 488 (Thermo Scientific; #A16079), κατά κουνελιού Alexa Fluor 594 (Thermo Scientific; #T6391) για επιπλέον 90 λεπτά Πλύθηκε 3 φορές με PBS Για να διακρίνουμε τη χρώση στόχου από το φόντο, χρησιμοποιήσαμε μόνο το δευτερεύον αντίσωμα ως έλεγχο. -x μεγέθυνση) και μικροσκόπιο Keyence με μεγέθυνση 40x.
Το WGA-Alexa Fluor 555 (Thermo Scientific; #W32464) σε 5 μg/ml σε PBS χρησιμοποιήθηκε για χρώση WGA και εφαρμόστηκε σε σταθερές τομές για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου.Οι αντικειμενοφόρες πλάκες στη συνέχεια πλύθηκαν με PBS και προστέθηκε μαύρο Sudan σε κάθε αντικειμενοφόρο πλάκα και επωάστηκε για 30 λεπτά.Οι αντικειμενοφόρες πλάκες στη συνέχεια πλύθηκαν με PBS και προστέθηκε μέσο ενσωμάτωσης vectashield.Οι διαφάνειες απεικονίστηκαν σε μικροσκόπιο Keyence σε μεγέθυνση 40x.
Το OCT αφαιρέθηκε από τα δείγματα όπως περιγράφεται παραπάνω.Αφού αφαιρέσετε το OCT, βυθίστε τις αντικειμενοφόρες πλάκες στο διάλυμα Bouin όλη τη νύχτα.Οι αντικειμενοφόρες πλάκες στη συνέχεια ξεπλύθηκαν με απεσταγμένο νερό για 1 ώρα και στη συνέχεια τοποθετήθηκαν σε διάλυμα Bibrich aloe acid fuchsin για 10 λεπτά.Στη συνέχεια οι αντικειμενοφόρες πλάκες πλύθηκαν με απεσταγμένο νερό και τοποθετήθηκαν σε διάλυμα 5% φωσφομολυβδαίνιο/5% φωσφοβολφραμικό οξύ για 10 λεπτά.Χωρίς ξέβγαλμα, μεταφέρετε τις αντικειμενοφόρες πλάκες απευθείας στο διάλυμα μπλε ανιλίνης για 15 λεπτά.Στη συνέχεια οι αντικειμενοφόρες πλάκες πλύθηκαν με απεσταγμένο νερό και τοποθετήθηκαν σε διάλυμα οξικού οξέος 1% για 2 λεπτά.Τα πλακίδια ξηράνθηκαν σε αιθανόλη 200 Ν και μεταφέρθηκαν σε ξυλόλιο.Οι χρωματισμένες διαφάνειες οπτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας μικροσκόπιο Keyence με αντικειμενικό φακό 10x.Το ποσοστό εμβαδού ίνωσης ποσοτικοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το λογισμικό Keyence Analyzer.
CyQUANT™ MTT Cell Viability Assay (Invitrogen, Carlsbad, CA), αριθμός καταλόγου V13154, σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή με ορισμένες τροποποιήσεις.Συγκεκριμένα, χρησιμοποιήθηκε χειρουργική διάτρηση με διάμετρο 6 mm για να εξασφαλιστεί ομοιόμορφο μέγεθος ιστού κατά την ανάλυση ΜΤΤ.Οι ιστοί απλώθηκαν ξεχωριστά στα φρεάτια μιας πλάκας 12 φρεατίων που περιείχε υπόστρωμα ΜΤΤ σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή.Οι τομές επωάζονται στους 37° C για 3 ώρες και ο ζωντανός ιστός μεταβολίζει το υπόστρωμα ΜΤΤ για να σχηματίσει μια μωβ ένωση φορμαζάνης.Αντικαταστήστε το διάλυμα MTT με 1 ml DMSO και επωάστε στους 37 °C για 15 λεπτά για να εκχυλιστεί η μωβ φορμαζάνη από τα καρδιακά τμήματα.Τα δείγματα αραιώθηκαν 1:10 σε DMSO σε πλάκες διαφανούς πυθμένα 96 φρεατίων και η ένταση του μωβ χρώματος μετρήθηκε στα 570 nm χρησιμοποιώντας συσκευή ανάγνωσης πλακών Cytation (BioTek).Οι μετρήσεις κανονικοποιήθηκαν στο βάρος κάθε φέτας της καρδιάς.
Τα μέσα φέτας καρδιάς αντικαταστάθηκαν με μέσα που περιέχουν 1 μCi/ml [5-3H]-γλυκόζη (Moravek Biochemicals, Brea, CA, USA) για τον προσδιορισμό χρήσης γλυκόζης όπως περιγράφηκε προηγουμένως.Μετά από 4 ώρες επώασης, προσθέστε 100 µl μέσου σε ανοιχτό σωλήνα μικροφυγοκέντρησης που περιέχει 100 μl 0,2 N HCl.Στη συνέχεια ο σωλήνας τοποθετήθηκε σε σωλήνα σπινθηρισμού που περιείχε 500 μl dH2O για να εξατμιστεί το [3H]2O για 72 ώρες στους 37°C.Στη συνέχεια αφαιρέστε το σωληνάριο της μικροφυγοκέντρησης από το σωλήνα σπινθηρισμού και προσθέστε 10 ml υγρού σπινθηρισμού.Οι μετρήσεις σπινθηρισμών πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας έναν αναλυτή υγρού σπινθηρισμού Tri-Carb 2900TR (Packard Bioscience Company, Meriden, CT, USA).Η χρησιμοποίηση της γλυκόζης στη συνέχεια υπολογίστηκε λαμβάνοντας υπόψη την ειδική δραστηριότητα της [5-3Η]-γλυκόζης, την ελλιπή ισορροπία και το υπόβαθρο, την αραίωση του [5-3Η]-σε μη επισημασμένη γλυκόζη και την αποτελεσματικότητα αντιστάθμισης σπινθηρισμού.Τα δεδομένα κανονικοποιούνται στη μάζα των τμημάτων της καρδιάς.
Μετά την ομογενοποίηση ιστού στο Trizol, το RNA απομονώθηκε από τομές καρδιάς χρησιμοποιώντας το Qiagen miRNeasy Micro Kit #210874 σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή.Η προετοιμασία της βιβλιοθήκης RNAsec, η αλληλουχία και η ανάλυση δεδομένων πραγματοποιήθηκαν ως εξής:
Ως πρώτη ύλη για την προετοιμασία της βιβλιοθήκης RNA χρησιμοποιήθηκε 1 μg RNA ανά δείγμα.Οι βιβλιοθήκες αλληλουχίας δημιουργήθηκαν χρησιμοποιώντας το κιτ προετοιμασίας βιβλιοθήκης NEBNext UltraTM RNA για την Illumina (NEB, ΗΠΑ) ακολουθώντας τις συστάσεις του κατασκευαστή και προστέθηκαν κωδικοί ευρετηρίου στις ακολουθίες χαρακτηριστικών για κάθε δείγμα.Εν συντομία, το mRNA καθαρίστηκε από ολικό RNA χρησιμοποιώντας μαγνητικά σφαιρίδια συνδεδεμένα με πολυ-Τ ολιγονουκλεοτίδια.Ο κατακερματισμός πραγματοποιείται χρησιμοποιώντας δισθενή κατιόντα σε υψηλή θερμοκρασία στο ρυθμιστικό διάλυμα αντίδρασης σύνθεσης πρώτης κλώνου NEBNext (5Χ).Ο πρώτος κλώνος cDNA συντέθηκε χρησιμοποιώντας τυχαίους εξαμερείς εκκινητές και M-MuLV ανάστροφη μεταγραφάση (RNase Η-).Το cDNA του δεύτερου κλώνου στη συνέχεια συντίθεται χρησιμοποιώντας DNA πολυμεράση Ι και RNase Η. Οι υπόλοιπες προεξοχές μετατρέπονται σε αμβλέα άκρα με δραστηριότητα εξωνουκλεάσης/πολυμεράσης.Μετά την αδενυλίωση του άκρου 3' του θραύσματος DNA, ένας προσαρμογέας NEBNext με δομή βρόχου φουρκέτας προσαρτάται σε αυτό για να προετοιμαστεί για υβριδισμό.Για επιλογή θραυσμάτων cDNA προτιμώμενου μήκους 150-200 bp.θραύσματα βιβλιοθήκης καθαρίστηκαν χρησιμοποιώντας το σύστημα AMPure XP (Beckman Coulter, Beverly, ΗΠΑ).Στη συνέχεια, 3 μl USER Enzyme (NEB, USA) με επιλεγμένο κατά μέγεθος cDNA συνδεδεμένο με έναν προσαρμογέα χρησιμοποιήθηκαν για 15 λεπτά στους 37°C και στη συνέχεια για 5 λεπτά στους 95°C πριν από την PCR.Στη συνέχεια πραγματοποιήθηκε η PCR χρησιμοποιώντας πολυμεράση DNA υψηλής πιστότητας Phusion, εκκινητές γενικής χρήσης PCR και εκκινητές Index (X).Τέλος, τα προϊόντα PCR καθαρίστηκαν (σύστημα AMPure XP) και η ποιότητα της βιβλιοθήκης αξιολογήθηκε σε σύστημα Agilent Bioanalyzer 2100.Η βιβλιοθήκη cDNA ακολούθως αναλύθηκε η αλληλουχία χρησιμοποιώντας έναν προσδιοριστή αλληλουχίας Novaseq.Τα αρχεία ακατέργαστων εικόνων από την Illumina μετατράπηκαν σε ακατέργαστες αναγνώσεις χρησιμοποιώντας το CASAVA Base Calling.Τα ακατέργαστα δεδομένα αποθηκεύονται σε αρχεία μορφής FASTQ(fq) που περιέχουν ακολουθίες ανάγνωσης και αντίστοιχες ποιότητες βάσης.Επιλέξτε HISAT2 για να αντιστοιχίσετε φιλτραρισμένες αναγνώσεις αλληλουχίας με το γονιδίωμα αναφοράς Sscrofa11.1.Γενικά, το HISAT2 υποστηρίζει γονιδιώματα οποιουδήποτε μεγέθους, συμπεριλαμβανομένων γονιδιωμάτων μεγαλύτερα από 4 δισεκατομμύρια βάσεων, και οι προεπιλεγμένες τιμές έχουν οριστεί για τις περισσότερες παραμέτρους.Ο συνδυασμός αναγνώσεων από δεδομένα RNA Seq μπορεί να ευθυγραμμιστεί αποτελεσματικά χρησιμοποιώντας το HISAT2, το ταχύτερο σύστημα που διατίθεται αυτήν τη στιγμή, με την ίδια ή καλύτερη ακρίβεια από οποιαδήποτε άλλη μέθοδο.
Η αφθονία των μεταγραφών αντανακλά άμεσα το επίπεδο γονιδιακής έκφρασης.Τα επίπεδα γονιδιακής έκφρασης αξιολογούνται από την αφθονία των μεταγραφών (αριθμός αλληλουχίας) που σχετίζονται με το γονιδίωμα ή τα εξόνια.Ο αριθμός των αναγνώσεων είναι ανάλογος με τα επίπεδα γονιδιακής έκφρασης, το μήκος γονιδίου και το βάθος αλληλουχίας.Υπολογίστηκαν FPKM (θραύσματα ανά χίλια ζεύγη βάσεων μεταγραφής με αλληλουχία ανά εκατομμύριο ζεύγη βάσεων) και προσδιορίστηκαν οι τιμές P της διαφορικής έκφρασης χρησιμοποιώντας το πακέτο DESeq2.Στη συνέχεια, υπολογίσαμε το ποσοστό ψευδούς ανακάλυψης (FDR) για κάθε τιμή P χρησιμοποιώντας τη μέθοδο Benjamini-Hochberg9 με βάση την ενσωματωμένη συνάρτηση R "p.adjust".
Το RNA που απομονώθηκε από τομές καρδιάς μετατράπηκε σε cDNA σε συγκέντρωση 200 ng/μl χρησιμοποιώντας το μίγμα SuperScript IV Vilo Master από την Thermo (Thermo, αρ. κατ. 11756050).Πραγματοποιήθηκε ποσοτική RT-PCR χρησιμοποιώντας διαφανή πλάκα αντίδρασης Applied Biosystems Endura Plate Microamp 384 φρεατίων (Thermo, αρ. κατ. 4483319) και οπτική κόλλα microamp (Thermo, αρ. κατ. 4311971).Το μίγμα της αντίδρασης αποτελούνταν από 5 μΙ Taqman Fast Advanced Master mix (Thermo, cat # 4444557), 0,5 μl Taqman Primer και 3,5 μl H2O αναμεμειγμένα ανά φρεάτιο.Εκτελέστηκαν τυπικοί κύκλοι qPCR και οι τιμές CT μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα όργανο PCR σε πραγματικό χρόνο Applied Biosystems Quantstudio 5 (μονάδα 384 φρεατίων, προϊόν # A28135).Τα αστάρια Taqman αγοράστηκαν από τη Thermo (GAPDH (Ss03375629_u1), PARP12 (Ss06908795_m1), PKDCC (Ss06903874_m1), CYGB (Ss06900188_m1), RGL81 (Ss03375629_u1), RGL81 (Ss0908795_m1), 8_mH), GATA4 (Ss03383805_u1), GJA1 (Ss03374839_u1), COL1A2 (Ss03375009_u1 ), COL3A1 (Ss04323794_m1), ACTA2 (Ss08_245 κανονικοποιήθηκαν τα δείγματα των γονιδίων του Ss08_245) GAPDH.
Η απελευθέρωση μέσων του NT-ProBNP αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας το κιτ NT-ProBNP (χοίρος) (Κατ. Αρ. MBS2086979, MyBioSource) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή.Εν συντομία, 250 μl από κάθε δείγμα και πρότυπο προστέθηκαν εις διπλούν σε κάθε φρεάτιο.Αμέσως μετά την προσθήκη του δείγματος, προσθέστε 50 μl Αντιδραστηρίου Δοκιμασίας Α σε κάθε φρεάτιο.Ανακινήστε απαλά την πλάκα και σφραγίστε με στεγανωτικό.Στη συνέχεια τα δισκία επωάστηκαν στους 37°C για 1 ώρα.Στη συνέχεια αναρροφήστε το διάλυμα και πλύνετε τα φρεάτια 4 φορές με 350 μl διαλύματος πλύσης 1Χ, επωάζοντας το διάλυμα πλύσης για 1-2 λεπτά κάθε φορά.Στη συνέχεια προσθέστε 100 μl Αντιδραστηρίου Δοκιμασίας Β ανά φρεάτιο και σφραγίστε με σφραγιστικό πλακών.Το δισκίο ανακινήθηκε ήπια και επωάστηκε στους 37°C για 30 λεπτά.Αναρροφήστε το διάλυμα και πλύνετε τα φρεάτια 5 φορές με 350 μl διαλύματος πλύσης 1Χ.Προσθέστε 90 µl διαλύματος υποστρώματος σε κάθε φρεάτιο και σφραγίστε την πλάκα.Επωάστε το τρυβλίο στους 37°C για 10-20 λεπτά.Προσθέστε 50 µl Stop Solution σε κάθε φρεάτιο.Η πλάκα μετρήθηκε αμέσως χρησιμοποιώντας συσκευή ανάγνωσης πλακών Cytation (BioTek) στα 450 nm.
Πραγματοποιήθηκαν αναλύσεις ισχύος για την επιλογή των μεγεθών ομάδων που θα παρέχουν >80% ισχύ για τον εντοπισμό απόλυτης αλλαγής 10% στην παράμετρο με ποσοστό σφάλματος τύπου Ι 5%. Πραγματοποιήθηκαν αναλύσεις ισχύος για την επιλογή των μεγεθών ομάδων που θα παρέχουν >80% ισχύ για τον εντοπισμό απόλυτης αλλαγής 10% στην παράμετρο με ποσοστό σφάλματος τύπου Ι 5%. Анализ мощности был выполнен для выбора размеров групп, которые обеспечатување >80% δυνατοτήτων для обнаружения 10% апсолютного изменения параметри со 5% частотой ошибок τύπου I. Πραγματοποιήθηκε ανάλυση ισχύος για να επιλεγούν μεγέθη ομάδων που θα παρείχαν >80% ισχύ για την ανίχνευση 10% απόλυτης αλλαγής παραμέτρου με ποσοστό σφάλματος τύπου Ι 5%.进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％褧测参数中10％绝对变化和5％褧型进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％褧测参数中10％绝对变化和5％褧型 Был проведен анализ мощности для выбора размера группы, который обеспечил бы > 80% αδυναμία για ανεπάρκεια 10% absolutnogo изменения параметров и 5% частоты ошибок τύπος I. Πραγματοποιήθηκε ανάλυση ισχύος για να επιλεγεί ένα μέγεθος ομάδας που θα παρείχε >80% ισχύ για τον εντοπισμό 10% απόλυτης αλλαγής παραμέτρου και 5% ποσοστό σφάλματος τύπου Ι.Τα τμήματα ιστού επιλέχθηκαν τυχαία πριν από το πείραμα.Όλες οι αναλύσεις ήταν τυφλές και τα δείγματα αποκωδικοποιήθηκαν μόνο αφού αναλυθούν όλα τα δεδομένα.Το λογισμικό GraphPad Prism (San Diego, CA) χρησιμοποιήθηκε για την εκτέλεση όλων των στατιστικών αναλύσεων. Για όλα τα στατιστικά στοιχεία, οι τιμές p θεωρήθηκαν σημαντικές σε τιμές <0,05. Για όλα τα στατιστικά στοιχεία, οι τιμές p θεωρήθηκαν σημαντικές σε τιμές <0,05. Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. Για όλα τα στατιστικά στοιχεία, οι τιμές p θεωρήθηκαν σημαντικές σε τιμές <0,05.对于所有统计数据，p 值在值<0,05 时被认为是显着的。对于所有统计数据，p 值在值<0,05 时被认为是显着的。 Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. Για όλα τα στατιστικά στοιχεία, οι τιμές p θεωρήθηκαν σημαντικές σε τιμές <0,05.Διεξήχθη το t-test Student με δύο ουρές στα δεδομένα με μόνο 2 συγκρίσεις.Χρησιμοποιήθηκε μονόδρομη ή αμφίδρομη ANOVA για τον προσδιορισμό της σημασίας μεταξύ πολλαπλών ομάδων.Κατά την εκτέλεση δοκιμών post hoc, εφαρμόστηκε η διόρθωση του Tukey για να ληφθούν υπόψη πολλαπλές συγκρίσεις.Τα δεδομένα RNAsec έχουν ειδικές στατιστικές εκτιμήσεις κατά τον υπολογισμό του FDR και του p.adjust όπως περιγράφεται στην ενότητα Μέθοδοι.
Για περισσότερες πληροφορίες σχετικά με το σχεδιασμό της μελέτης, ανατρέξτε στην περίληψη της Έκθεσης Έρευνας Φύσης που συνδέεται με αυτό το άρθρο.