Tapadh leibh airson tadhal air Nature.com. Tha taic CSS cuibhrichte aig an dreach brabhsair a tha thu a’ cleachdadh. Airson an eòlas as fheàrr, tha sinn a’ moladh gun cleachd thu brabhsair ùraichte (no gun cuir thu dheth Modh Co-chòrdalachd ann an Internet Explorer). Aig an aon àm, gus dèanamh cinnteach à taic leantainneach, nì sinn an làrach-lìn gun stoidhlichean agus JavaScript.
Tha feum air siostam earbsach in vitro as urrainn àrainneachd fhiseòlasach a’ chridhe ath-riochdachadh gu ceart airson deuchainnean dhrogaichean. Tha cho gann ‘s a tha siostaman cultar clò cridhe daonna ri fhaighinn air leantainn gu mìneachaidhean mì-cheart air buaidhean dhrogaichean cairdiach. An seo, tha sinn air modail cultar clò cairdiach (CTCM) a leasachadh a bhios a’ brosnachadh slisnean cridhe gu dealan-mheacanaigeach agus a bhios a’ dol tro shìneadh fiseòlasach rè ìrean sistolach is diastolach a’ chearcall cairdiach. Às deidh 12 latha de chultar, leasaich an dòigh-obrach seo comas-beò earrannan cridhe gu ìre, ach cha do ghlèidh e an ionracas structarail gu h-iomlan. Mar sin, às deidh sgrìonadh mholacilean beaga, fhuair sinn a-mach gun do chùm cur 100 nM triiodothyronine (T3) agus 1 μM dexamethasone (Dex) ris a’ mheadhan againn meanbh-structar nan earrannan airson 12 latha. Còmhla ri làimhseachadh T3 / Dex, chùm siostam CTCM pròifilean tar-sgrìobhaidh, comas-beò, gnìomhachd metabolach, agus ionracas structarail aig an aon ìre ri clò cridhe ùr airson 12 latha. A bharrachd air sin, bidh cus sìneadh de fhigheagan cairdiach ann an cultar ag adhbhrachadh comharran cairdiach hipeartrófach, a’ toirt fianais airson comas CTCM atharrais a dhèanamh air suidheachaidhean hipeartrófach air an adhbhrachadh le sìneadh cairdiach. Mar cho-dhùnadh, faodaidh CTCM modaladh a dhèanamh air fiseòlas agus paite-fiseòlas a’ chridhe ann an cultar thar ùine mhòr, a’ comasachadh sgrìonadh dhrogaichean earbsach.
Mus tèid rannsachadh clionaigeach a dhèanamh, tha feum air siostaman earbsach in vitro as urrainn àrainneachd fhiseòlasach cridhe an duine ath-riochdachadh gu ceart. Bu chòir do shiostaman mar sin atharrais a dhèanamh air sìneadh meacanaigeach atharraichte, ìre cridhe, agus feartan electro-fhiseòlasach. Bithear a’ cleachdadh modailean bheathaichean gu cumanta mar àrd-ùrlar sgrìonaidh airson fiseòlas cridhe le earbsachd cuibhrichte ann a bhith a’ nochdadh buaidhean dhrogaichean ann an cridhe an duine1,2. Mu dheireadh, tha am Modail Deuchainneach Cultar Clò Cairdiach Ideal (CTCM) na mhodail a tha gu math mothachail agus sònraichte airson diofar eadar-theachdan leigheasach agus cungaidh-leigheis, ag ath-riochdachadh gu ceart fiseòlas agus paite-fhiseòlas cridhe an duine3. Tha dìth siostam mar sin a’ cuingealachadh lorg leigheasan ùra airson fàilligeadh cridhe4,5 agus tha e air leantainn gu cardiotoxicity dhrogaichean mar phrìomh adhbhar airson a’ mhargaidh fhàgail6.
Thar an deich bliadhna a dh’fhalbh, chaidh ochd drogaichean neo-cardas-bhìorasach a tharraing a-mach à cleachdadh clionaigeach leis gu bheil iad ag adhbhrachadh leudachadh eadar-ama QT a’ leantainn gu arrhythmias ventricular agus bàs obann7. Mar sin, tha feum a’ sìor fhàs air ro-innleachdan sgrìonaidh ro-clionaigeach earbsach gus èifeachdas agus puinnseanta cardiovascular a mheasadh. Tha an cleachdadh o chionn ghoirid de cardiomyocytes a thig bho cheallan gas pluripotent air an adhbhrachadh le daoine (hiPS-CM) ann an sgrìonadh dhrogaichean agus deuchainnean puinnseanta a’ toirt seachad fuasgladh pàirteach air an duilgheadas seo. Ach, tha nàdar neo-aibidh hiPS-CM agus dìth iom-fhillteachd ioma-cheallach clò cridhe nan crìochan mòra air an dòigh seo. Tha sgrùdaidhean o chionn ghoirid air sealltainn gum faodar faighinn thairis air a’ chuingealachadh seo gu ìre le bhith a’ cleachdadh hiPS-CM tràth gus hydrogels clò cridhe a chruthachadh goirid às deidh toiseach giorrachaidhean gun spionnadh agus mean air mhean a’ meudachadh brosnachadh dealain thar ùine. Ach, chan eil na feartan electrophysiological agus cùmhnantail aibidh aig na microtissues hiPS-CM seo aig a bheil myocardium inbheach. A bharrachd air sin, tha structar nas iom-fhillte aig clò cridhe daonna, anns a bheil measgachadh neo-aonghnèitheach de dhiofar sheòrsaichean cealla, a’ gabhail a-steach ceallan endothelial, neurons, agus fibroblasts stromal, ceangailte ri chèile le seataichean sònraichte de phròtainean maitrís taobh a-muigh na cealla. Tha an neo-aonghnèitheachd seo de shluagh neo-cardiomyocyte11,12,13 ann an cridhe mamalan inbheach na phrìomh bhacadh air modaladh clò cridhe a’ cleachdadh seòrsaichean cealla fa leth. Tha na prìomh chuingealachaidhean seo a’ cur cuideam air cho cudromach sa tha e dòighean a leasachadh airson clò miocairdiach slàn a chultarachadh fo chumhachan fiseòlasach agus paiteòlach.
Tha earrannan tana (300 µm) de chridhe an duine air dearbhadh gur e modail gealltanach de myocardium daonna slàn a th’ ann. Tha an dòigh seo a’ toirt cothrom air siostam ioma-cheallach 3D iomlan coltach ri clò cridhe an duine. Ach, gu ruige 2019, bha cleachdadh earrannan cridhe air an cultarachadh cuibhrichte leis a’ mhairsinneachd chultar goirid (24 uair). Tha seo mar thoradh air grunn nithean a’ gabhail a-steach dìth sìneadh corporra-meacanaigeach, an eadar-aghaidh èadhair-leaghan, agus cleachdadh meadhanan sìmplidh nach eil a’ toirt taic do fheumalachdan clò cridhe. Ann an 2019, sheall grunn bhuidhnean rannsachaidh gum faod a bhith a’ toirt a-steach factaran meacanaigeach ann an siostaman cultar clò cridhe beatha chultar a leudachadh, abairt cridhe a leasachadh, agus pathology cridhe aithris. Tha dà sgrùdadh eireachdail 17 agus 18 a’ sealltainn gu bheil buaidh mhath aig luchdachadh meacanaigeach uniaxial air phenotype cridhe rè cultar. Ach, cha do chleachd na sgrùdaidhean sin an luchdachadh fiosaigeach-meacanaigeach trì-thaobhach fiùghantach de chearcall a’ chridhe, leis gun deach earrannan cridhe a luchdachadh le feachdan tensile isometric 17 no luchdachadh auxotonic loidhneach 18. Mar thoradh air na modhan sin airson sìneadh clò, chaidh mòran ghinean cridhe a chumail fodha no chaidh cus ginean co-cheangailte ri freagairtean sìneadh neo-àbhaisteach a chur an cèill. Gu sònraichte, leasaich Pitoulis et al. 19 amar cultar sliseag cridhe fiùghantach airson ath-thogail cearcall cridhe a’ cleachdadh fios-air-ais transducer feachd agus draibhearan teannachaidh. Ged a leigeas an siostam seo le modaladh cearcall cridhe in vitro nas cruinne, tha iom-fhillteachd agus toradh ìosal an dòigh a’ cuingealachadh cleachdadh an t-siostaim seo. O chionn ghoirid, tha an obair-lann againn air siostam cultar sìmplidh a leasachadh a’ cleachdadh brosnachadh dealain agus meadhan leasaichte gus beòshlaint earrannan de fhigheagan cridhe muice is daonna a chumail suas airson suas ri 6 latha 20,21.
Anns an làmh-sgrìobhainn làithreach, tha sinn a’ toirt cunntas air modail cultar clò cridhe (CTCM) a’ cleachdadh earrannan de chridhe muice a tha a’ toirt a-steach comharran humoral gus fiseòlas cridhe trì-thaobhach agus leudachadh pathophysiological rè cearcall cridhe ath-aithris. Faodaidh an CTCM seo cruinneas ro-innse dhrogaichean ro-clionaigeach a mheudachadh gu ìre nach deach a choileanadh a-riamh roimhe le bhith a’ toirt seachad siostam cridhe meadhan-toraidh cosg-èifeachdach a bhios ag atharrais air fiseòlas/pathophysiology cridhe mamaileach airson deuchainnean dhrogaichean ro-clionaigeach.
Tha pàirt chudromach aig comharran meacanaigeach hemodynamic ann a bhith a’ cumail suas gnìomh cardiomyocyte in vitro 22,23,24. Anns an làmh-sgrìobhainn làithreach, tha sinn air CTCM (Figear 1a) a leasachadh as urrainn àrainneachd cridhe inbheach ath-aithris le bhith ag adhbhrachadh brosnachadh dealain is meacanaigeach aig triceadan fiseòlasach (1.2 Hz, 72 buille gach mionaid). Gus cus sìneadh clò a sheachnadh rè diastole, chaidh inneal clò-bhualaidh 3D a chleachdadh gus meud clò a mheudachadh 25% (Figear 1b). Chaidh pacadh dealain air a bhrosnachadh leis an t-siostam C-PACE a chlàradh gus tòiseachadh 100 ms ron systole a’ cleachdadh siostam togail dàta gus cearcall a’ chridhe ath-riochdachadh gu h-iomlan. Bidh an siostam cultar clò a’ cleachdadh actuator niùmatach prògramaichte (LB Engineering, a’ Ghearmailt) gus membran silicone sùbailte a leudachadh gu cearcallach gus leudachadh nan sliseagan cridhe anns an t-seòmar àrd adhbhrachadh. Bha an siostam ceangailte ri loidhne adhair taobh a-muigh tro transducer cuideam, a rinn e comasach an cuideam (± 1 mmHg) agus an ùine (± 1 ms) atharrachadh gu ceart (Figear 1c).
a Ceangail an earrann clò ris an fhàinne taice 7 mm, air a shealltainn ann an gorm, taobh a-staigh seòmar cultar an inneil. Tha an seòmar cultar air a sgaradh bhon t-seòmar èadhair le membran silicone tana sùbailte. Cuir gasgaid eadar gach seòmar gus casg a chuir air aodion. Tha electrodan grafait ann am mullach an inneil a bheir seachad brosnachadh dealain. b Riochdachadh sgemataig den inneal clò mòr, fàinne stiùiridh agus fàinne taice. Tha na h-earrannan clò (donn) air an cur air an inneal ro-mhòr leis an fhàinne stiùiridh air a chuir anns a’ chlais air oir a-muigh an inneil. A’ cleachdadh an stiùiridh, cuir gu faiceallach an fhàinne taic còmhdaichte le glaodh acrylic clò thairis air an earrann de chlò cairdiach. c Graf a’ sealltainn ùine a’ bhrosnachaidh dealain mar ghnìomh cuideam seòmar èadhair fo smachd gnìomhaiche niùmatach prògramaichte (PPD). Chaidh inneal togail dàta a chleachdadh gus brosnachadh dealain a shioncronachadh a’ cleachdadh mothachairean cuideam. Nuair a ruigeas an cuideam anns an t-seòmar cultar an stairsneach suidhichte, thèid comharra cuisle a chuir chun C-PACE-EM gus brosnachadh dealain a bhrosnachadh. d Ìomhaigh de cheithir CTCMan air an cur air sgeilp goireadair. Tha ceithir innealan ceangailte ri aon PPD tro chuairt niùmatach, agus tha mothachairean cuideam air an cur a-steach don bhalbha hemostatic gus sùil a chumail air a’ chuideam anns a’ chuairt niùmatach. Tha sia earrannan clò anns gach inneal.
Le bhith a’ cleachdadh aon ghnìomhaiche niùmatach, bha sinn comasach air 4 innealan CTCM a smachdachadh, agus b’ urrainn do gach fear dhiubh 6 earrannan clò a chumail (Figear 1d). Ann an CTCM, tha cuideam an èadhair anns an t-seòmar èadhair air a thionndadh gu cuideam sioncronaich anns an t-seòmar lionn agus ag adhbhrachadh leudachadh fiseòlasach air sliseag a’ chridhe (Figear 2a agus Film a bharrachd 1). Sheall measadh air sìneadh clò aig 80 mm Hg. Art. sìneadh earrannan clò le 25% (Figear 2b). Chaidh a shealltainn gu bheil an sìneadh ceudad seo a’ freagairt ri fad sarcomere fiseòlasach de 2.2–2.3 µm airson cùmhnantachd earrann cridhe àbhaisteach17,19,25. Chaidh gluasad clò a mheasadh a’ cleachdadh roghainnean camara àbhaisteach (Figear a bharrachd 1). Bha meud agus astar gluasad clò (Figear 2c, d) a’ freagairt ri sìneadh rè cearcall a’ chridhe agus ùine rè systole agus diastole (Figear 2b). Dh’fhan sìneadh agus astar clò cridhe rè cùmhnantachadh agus fois seasmhach airson 12 latha ann an cultar (Figear 2f). Gus measadh a dhèanamh air buaidh brosnachaidh dealain air cùmhnantachd rè cultar, leasaich sinn dòigh airson deformachadh gnìomhach a dhearbhadh a’ cleachdadh algairim sgàileachaidh (Figear a bharrachd 2a, b) agus bha sinn comasach air eadar-dhealachadh a dhèanamh eadar deformachaidhean le agus às aonais brosnachadh dealain. An aon earrann den chridhe (Figear 2f). Anns an roinn gluasadach den ghearradh (R6-9), bha am bholtadh rè brosnachadh dealain 20% nas àirde na bha e nuair nach robh brosnachadh dealain ann, a tha a’ nochdadh tabhartas brosnachaidh dealain do ghnìomh cùmhnantachaidh.
Tha lorgan riochdachail de chuideam seòmar adhair, cuideam seòmar lionn, agus tomhais gluasad clò a’ dearbhadh gu bheil cuideam an t-seòmair ag atharrachadh cuideam seòmar lionn, ag adhbhrachadh gluasad co-fhreagarrach den t-sliseag clò. b Lorgan riochdachail de shìneadh sa cheud (gorm) de earrannan clò a tha a’ freagairt ri sìneadh sa cheud (orains). c Tha gluasad tomhaiste na slise cairdiach a rèir astar gluasaid tomhaiste. (d) Trajectoirean riochdachail de ghluasad cearcallach (loidhne ghorm) agus astar (loidhne dhotagach orains) ann an sliseag den chridhe. e Meudachadh air ùine cearcall (n = 19 sliseag gach buidheann, bho mhucan eadar-dhealaichte), ùine giorrachadh (n = 19 sliseag gach buidheann), ùine fois (n = 19 sliseag gach buidheann, bho mhucan eadar-dhealaichte), gluasad clò (n = 25 sliseag)/buidheann bho mhucan eadar-dhealaichte), astar siostail as àirde (n = 24(D0), 25(D12) sliseag/buidheann bho mhucan eadar-dhealaichte) agus ìre fois as àirde (n=24(D0), 25(D12) sliseag/buidheann bho mhucan eadar-dhealaichte). Cha do sheall deuchainn-t dà-earballach Oileanach eadar-dhealachadh cudromach ann am paramadair sam bith. Lorgan mion-sgrùdaidh deformachaidh riochdachail de earrannan clò le (dearg) agus às aonais (gorm) brosnachadh dealain, deich raointean roinneil de earrannan clò bhon aon earrann. Tha na pannalan aig a’ bhonn a’ sealltainn tomhas an eadar-dhealachaidh sa cheud ann an deformachadh ann an earrannan clò le agus às aonais brosnachadh dealain ann an deich raointean bho earrannan eadar-dhealaichte. (n = 8 slisnean/buidheann bho mhucan eadar-dhealaichte, deuchainn-t dà-earballach Oileanach air a dhèanamh; ****p < 0.0001, **p < 0.01, *p < 0.05). (n = 8 slisnean/buidheann bho mhucan eadar-dhealaichte, deuchainn-t dà-earballach Oileanach air a dhèanamh; ****p < 0.0001, **p < 0.01, *p < 0.05). (n = 8 срезов / Групу ОТ От разнта; дтьюд 0,0001, * P <0,05). (n = 8 earrannan/buidheann bho mhucan eadar-dhealaichte, deuchainn-t dà-earballach an Oileanaich; ****p<0.0001, **p<0.01, *p<0.05). n = 8 片/组, 来自不同的猪, 进行双尾学生t 检验；****p <0.0001，**p <0.01，*p <0.05） n = 8 片/组, 来自不同的猪, 进行双尾学生t 检验；****p <0.0001，**p <0.01，*p <0.05） (n = 8 срезов/группу, от разных свиней, двусторонний критерий Стьюдента; ****p <0,0001, **p <0,01, *p <0,01, *p <0,00, *p). (n = 8 earrannan/buidheann, bho mhucan eadar-dhealaichte, deuchainn-t dà-earballach an Oileanaich; ****p<0.0001, **p<0.01, *p<0.05).Tha bàraichean mearachd a’ riochdachadh a’ chuibheasachd ± an claonadh àbhaisteach.
Anns an t-siostam cultar sliseag cridhe bith-mhìmeatach statach againn roimhe [20, 21], chùm sinn beòthalachd, gnìomh agus ionracas structarail sliseag cridhe airson 6 latha le bhith a’ cur brosnachadh dealain an sàs agus a’ leasachadh co-dhèanamh a’ mheadhain. Ach, às deidh 10 latha, thuit na figearan seo gu mòr. Bheir sinn iomradh air earrannan a chaidh a chultarachadh anns an t-siostam cultar bith-mhìmeatach statach againn roimhe 20, 21 cumhaichean smachd (Ctrl) agus cleachdaidh sinn am meadhan a chaidh a leasachadh roimhe mar chumhachan MC agus cultar fo bhrosnachadh meacanaigeach is dealain aig an aon àm (CTCM). ris an canar . An toiseach, cho-dhùin sinn nach robh brosnachadh meacanaigeach às aonais brosnachadh dealain gu leòr gus beòthalachd clò a chumail suas airson 6 latha (Figear a bharrachd 3a, b). Gu inntinneach, le toirt a-steach brosnachadh fisio-mheacanaigeach agus dealain a’ cleachdadh STCM, dh’fhan beòthalachd earrannan cridhe 12-latha mar an ceudna ri earrannan cridhe ùra fo chumhachan MS, ach chan ann fo chumhachan Ctrl, mar a chithear le mion-sgrùdadh MTT (Figear 1). 3a). Tha seo a’ moladh gum faod brosnachadh meacanaigeach agus atharrais air cearcall cridhe earrannan clò a chumail beòthail airson dà uair cho fada ‘s a chaidh aithris anns an t-siostam cultar statach againn roimhe. Ach, sheall measadh air ionracas structarail earrannan clò le bhith a’ dèanamh immuno-lipeadh de troponin T cairdiach agus connexin 43 gu robh an abairt connexin 43 gu math nas àirde ann an clò MC air latha 12 na ann an smachdan air an aon latha. Ach, cha deach an abairt connexin 43 èideadh agus cruthachadh diosc-Z a chumail suas gu h-iomlan (Figear 3b). Bidh sinn a’ cleachdadh frèam inntleachd fuadain (AI) gus ionracas structarail clò a thomhas26, loidhne-phìoban ionnsachaidh domhainn stèidhichte air ìomhaigh stèidhichte air troponin-T agus dathadh connexin43 gus ionracas structarail agus fluorescence sliseagan cridhe a thomhas gu fèin-ghluasadach a thaobh neart an t-suidheachaidh. Bidh an dòigh seo a’ cleachdadh Lìonra Neural Convolutional (CNN) agus frèam ionnsachaidh domhainn gus ionracas structarail clò cairdiach a thomhas gu earbsach ann an dòigh fèin-ghluasadach agus neo-chlaon, mar a chaidh a mhìneachadh san iomradh.26. Sheall clò MC coltas structarail nas fheàrr ri latha 0 an taca ri earrannan smachd statach. A bharrachd air an sin, nochd dathadh trichrome Masson ceudad gu math nas ìsle de fibrosis fo chumhachan MS an taca ri cumhaichean smachd air latha 12 de chultar (Figear 3c). Ged a mheudaich CTCM beòthalachd earrannan clò cridhe aig latha 12 gu ìre coltach ri ìre clò cridhe ùr, cha do leasaich e gu mòr slàinteachd structarail earrannan a’ chridhe.
Tha graf bàr a’ sealltainn tomhas air comasachd MTT sliseagan cridhe ùra (D0) no cultar sliseagan cridhe airson 12 latha an dàrna cuid ann an cultar statach (D12 Ctrl) no ann an CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) sliseagan/buidheann bho mhucan eadar-dhealaichte, aon dòigh anns a bheil deuchainn ANOVA air a dhèanamh; ####p < 0.0001 an taca ri D0 agus **p < 0.01 an taca ri D12 Ctrl). Tha graf bàr a’ sealltainn tomhas air comasachd MTT sliseagan cridhe ùra (D0) no cultar sliseagan cridhe airson 12 latha an dàrna cuid ann an cultar statach (D12 Ctrl) no ann an CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) sliseagan/buidheann bho mhucan eadar-dhealaichte, aon dòigh anns a bheil deuchainn ANOVA air a dhèanamh; ####p < 0.0001 an taca ri D0 agus **p < 0.01 an taca ri D12 Ctrl).Tha an histogram a’ sealltainn tomhas comasachd earrannan cridhe ùra MTT (D0) no cultar earrannan cridhe airson 12 latha ann an cultar statach (smachd D12) no CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (smachd D12). ) ), 12 (D12 MC) earrannan/buidheann bho mhucan eadar-dhealaichte, thèid deuchainn ANOVA aon-shligheach a dhèanamh;####p < 0,0001 по сравнению с D0 и ** p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p < 0.0001 an taca ri D0 agus **p < 0.01 an taca ri D12 Ctrl). a 条形图显示在静态培养 (D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切 片或心脏切片培养12 天的MTT 活力的量化), 来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组, VA 匑A测试；与D0相比,####p <0.0001,与D12 Ctrl 相比,**p <0.01). a 条形图显示在静态培养 (D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切 片， 来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组, 进行单向ANOVA 测试；与D0 相比,####p < 0.0001, 与 测试；与D0 相比,####p < 0.0001, 丂)histogram a’ sealltainn tomhas comasachd MTT ann an earrannan cridhe ùra (D0) no earrannan cridhe air an cultar airson 12 latha ann an cultar statach (smachd D12) no CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (smachd D12)), 12 (D12 MC) earrannan/buidheann bho mhucan eadar-dhealaichte, deuchainn ANOVA aon-shligheach;####p < 0,0001 по сравнению с D0, ** p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p < 0.0001 an taca ri D0, **p < 0.01 an taca ri D12 Ctrl).b Troponin-T (uaine), connexin 43 (dearg) agus DAPI (gorm) ann an earrannan cridhe a chaidh an sgaradh às ùr (D0) no earrannan cridhe air an cultar fo chumhachan statach (Ctrl) no cumhachan CTCM (MC) airson 12 latha) de dhealbhan immunofluorescence riochdachail (sgèile bàn = 100 µm). Tomhas inntleachd shaorga air ionracas structarail clò a’ chridhe (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) sliseagan/buidheann gach fear bho mhuc eadar-dhealaichte, deuchainn ANOVA aon-shligheach air a dhèanamh; ####p < 0.0001 an taca ri D0 agus ****p < 0.0001 an taca ri D12 Ctrl). Tomhas inntleachd shaorga air ionracas structarail clò a’ chridhe (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) sliseagan/buidheann gach fear bho mhucan eadar-dhealaichte, deuchainn ANOVA aon-shligheach air a dhèanamh; ####p < 0.0001 an taca ri D0 agus ****p < 0.0001 an taca ri D12 Ctrl). Количественная оценка структурной целостности сердечной ткани искусственным интеллектом (n = 7 (D0), 7 (D 2 ) , C 1 (D 1 ), 7 (D 1 ), C 1 (D 1 ), 7 (D 1 ), 7 (D 1 ), 7 (D 1) срезов/групп от разных свиней, проводится однофакторный тест ANOVA; сравнению с D12 Ctrl). Measadh air ionracas structarail clò cairdiach le inntleachd fuadain (n = 7 earrannan/buidhnean (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) bho mhucan eadar-dhealaichte, deuchainn ANOVA aon-shligheach air a dhèanamh; ####p < 0.0001 an taca ri D0 agus ****p < 0.0001 an taca ri D12 Ctrl).人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) sliseagan/buidheann gach aon de dhiofar mhuc, deuchainn ANOVA aon-shligheach;###p.0.相比，****p <0.0001 与D12 Ctrl 相比）.人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) sliseagan/buidheann gach aon de dhiofar mhucan, deuchainn aon-shligheach ANOVAp 1 <##.00;与D0相比，****p <0.0001 与D12 Ctrl 相比）. Искусственный интеллект для количественной оценки структурной целостности сердечной ткани (n = 7 (D 1 ) , C 7 (D 1 ) срезов/группу каждой из разных свиней, односторонний тест ANOVA; с D12 Ctrl). Inntleachd shaorga gus ionracas structarail clò cairdiach a thomhas (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) earrannan/buidheann gach fear de mhucan eadar-dhealaichte, deuchainn ANOVA aon-shligheach; ####p<0.0001 an aghaidh .D0 Airson coimeas ****p < 0.0001 an taca ri D12 Ctrl). c Ìomhaighean riochdachail (clì) agus tomhas (deas) airson slisneagan cridhe air an dath le dath trichrome Masson (Scale bare = 500 µm) (n = 10 slisneagan/buidheann gach fear bho mhuc eadar-dhealaichte, deuchainn ANOVA aon-shligheach air a dhèanamh; ####p < 0.0001 an taca ri D0 agus ***p < 0.001 an taca ri D12 Ctrl). c Ìomhaighean riochdachail (clì) agus tomhas (deas) airson slisneagan cridhe air an dath le dath trichrome Masson (Scale bare = 500 µm) (n = 10 slisneagan/buidheann gach fear bho mhucan eadar-dhealaichte, deuchainn ANOVA aon-shligheach air a dhèanamh; #### p < 0.0001 an taca ri D0 agus ***p < 0.001 an taca ri D12 Ctrl). c Репрезентативные изображения (слева) agus количественная оценка (справа) срезов сердца, окрашенныыых Массона (масштаб без покрытия = 500 мкм) (n = 10 срезов/группу от разных свиней, выполняется онстон; #### p < 0,0001 по сравнению с D0 agus ***p <0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Dealbhan riochdachail (clì) agus tomhas (deas) de earrannan cridhe air an dath le dath trichrome Masson (sgèile gun chòmhdach = 500 µm) (n = 10 earrannan/buidheann bho mhucan eadar-dhealaichte, deuchainn ANOVA aon-shligheach air a dhèanamh; #### p < 0 .0001 an taca ri D0 agus ***p < 0.001 an taca ri D12 Ctrl). c 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像（左）和量化（右）（覸=尺） 10 个切片/组, 每组来自不同的猪, 进行单向ANOVA 测试；#### p < 0.0001 与D0 相比， 0 rl 2 相比 1 ** 0 1 C 2 p < 0.0001 与D0 相比 , * 0 rl相比）. C用 Masson三色染料的心脏切片的代表性 (左 左) 量化 (右) 表性 左 左）裸尺度 = 500 µm） （n = 10 个 切片 组 每 组 来自 不同 猪 , 进行 单向 单 向 < p # An # ova # 向 吋0.0001D0 相比, ***p <0.001 与D12 Ctrl 相比）. c Ререзентативные изображения (слева) agus количественный анализ (справа) срезов сердца, окрашенныыыыыыы красителем Массона (чистая шкала = 500 мкм) (n = 10 срезов/группа, каждый от другой свиньи, провоь ипроте однофакторного дисперсионного анализа;### #p < 0,0001 по сравнению с D0, ***p <0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Ìomhaighean riochdachail (clì) agus tomhas (deas) de earrannan cridhe air an dath le dath trichrome Masson (bàn = 500 µm) (n = 10 earrannan/buidheann, gach fear bho mhuc eadar-dhealaichte, air a dhearbhadh le mion-sgrùdadh atharrachaidh aon-shligheach; ### # p < 0.0001 an taca ri D0, ***p < 0.001 an taca ri D12 Ctrl).Tha bàraichean mearachd a’ riochdachadh a’ chuibheasachd ± an claonadh àbhaisteach.
Bha sinn den bheachd gum faodadh ionracas cardiomyocyte a bhith air a leasachadh agus leasachadh fibrosis a lùghdachadh rè cultar CTCM le bhith a’ cur mholacilean beaga ris a’ mheadhan chultar. Mar sin, rinn sinn sgrìonadh airson mholacilean beaga a’ cleachdadh ar cultaran smachd statach20,21 air sgàth an àireamh bheag de nithean troimh-chèile. Chaidh Dexamethasone (Dex), triiodothyronine (T3), agus SB431542 (SB) a thaghadh airson an sgrìonaidh seo. Chaidh na moileacilean beaga seo a chleachdadh roimhe seo ann an cultaran hiPSC-CM gus aibidh cardiomyocytes a bhrosnachadh le bhith ag àrdachadh fad sarcomere, T-tubules, agus astar giùlain. A bharrachd air an sin, tha fios gu bheil an dà chuid Dex (glucocorticoid) agus SB a’ cur bacadh air sèid29,30. Mar sin, rinn sinn deuchainn an leasaicheadh ​​​​toirt a-steach aon no measgachadh de na moileacilean beaga seo ionracas structarail earrannan cridhe. Airson sgrìonadh tùsail, chaidh dòs gach todhar a thaghadh stèidhichte air na dùmhlachdan a thathas a’ cleachdadh gu cumanta ann am modalan cultar cealla (1 μM Dex27, 100 nM T327, agus 2.5 μM SB31). Às dèidh 12 latha de chultar, dh’adhbhraich measgachadh T3 agus Dex ionracas structarail cardiomyocyte as fheàrr agus ath-dhealbhadh snàithleach glè bheag (Figearan Taiceil 4 agus 5). A bharrachd air an sin, thug cleachdadh dùmhlachd dùbailte no dùbailte de T3 agus Dex droch bhuaidhean an taca ri dùmhlachdan àbhaisteach (Fig. Taiceil 6a, b).
Às dèidh sgrìonadh tùsail, rinn sinn coimeas ceann-ri-ceann de 4 suidheachaidhean cultarach (Figear 4a): Ctrl: earrannan cridhe air an cultarachadh anns a’ chultar statach againn a chaidh a mhìneachadh roimhe a’ cleachdadh ar meadhan leasaichte; 20.21 TD: T3 agus Ctrl s air an cur ri Dex air Diciadain; MC: earrannan cridhe air an cultarachadh ann an CTCM a’ cleachdadh ar meadhan leasaichte roimhe; agus MT: CTCM le T3 agus Dex air an cur ris a’ mheadhan. Às dèidh 12 latha de dh’àiteachadh, dh’fhan beòthalachd fhigheagan MS agus MT mar a bha e ann an fhigheagan ùra air am measadh le deuchainn MTT (Figear 4b). Gu inntinneach, cha do lean cur T3 agus Dex ri cultaran transwell (TD) gu leasachadh mòr ann am beòthalachd an taca ri suidheachaidhean Ctrl, a’ nochdadh pàirt chudromach de bhrosnachadh meacanaigeach ann a bhith a’ cumail suas beòthalachd earrannan cridhe.
Diagram dealbhaidh deuchainneach a’ sealltainn nan ceithir suidheachaidhean cultarach a chaidh a chleachdadh gus measadh a dhèanamh air buaidh brosnachaidh meacanaigeach agus cur-ris T3/Dex air meadhan airson 12 latha. (b) Tha graf bàr a’ sealltainn tomhas air beòshlaint 12 latha às dèidh cultar anns na 4 suidheachaidhean cultarach (Ctrl, TD, MC, agus MT) an taca ri sliseagan cridhe ùra (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD agus D12 MT), 12 (D12 MC) sliseagan/buidheann bho mhucan eadar-dhealaichte, thathar a’ dèanamh deuchainn ANOVA aon-shligheach; ####p < 0.0001, ###p < 0.001 an taca ri D0 agus **p < 0.01 an taca ri D12 Ctrl). b Tha graf bàr a’ sealltainn tomhas air beòshlaint 12 latha às dèidh cultar anns na 4 suidheachaidhean cultarach (Ctrl, TD, MC, agus MT) an taca ri slisneagan cridhe ùra (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD agus D12 MT), 12 (D12 MC) slisneagan/buidheann bho mhucan eadar-dhealaichte, thathar a’ dèanamh deuchainn ANOVA aon-shligheach; ####p < 0.0001, ###p < 0.001 an taca ri D0 agus **p < 0.01 an taca ri D12 ctrl). b gistogramama piocadh piostail 4 airson 12 latha piostail условиях культивирования (контроль, TD, MC agus MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n= ), 118 (D0, D1), 18 (D0), 18 (D0), 18 (D0) D12 MT), 12 (D12 MC) срезов/группу от разных свиней, проводится односторонний тест ANOVA; с D0 и ** p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). b Tha a’ ghraf-bhàr a’ sealltainn tomhas comasachd 12 latha às dèidh cultar anns na 4 suidheachaidhean cultarach uile (smachd, TD, MC, agus MT) an taca ri earrannan cridhe ùra (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD, agus D12 MT), 12 (D12 MC) earrannan/buidheann bho dhiofar mhucan, deuchainn ANOVA aon-shligheach; ####p < 0.0001, ###p < 0.001 vs. D0 agus **p < 0.01 an taca ri D12 Ctrl). b 条形图显示所有4种培养条件（Ctrl,TD,MC和MT）与新鲜心脏切片(D0) (n= 12D,10) TD 和D12 MT), 来自不同猪的12 (D12 MC) 切 片/组, 进行单向ANOVA 测试；####p <0.0001，#.#0p < 0.0001，#.#0p < 0.0001，#. <0.01与D12控制）.b 4 12 (D12 MC) b Гистограмма, показывающая все 4 условия культивирования (контроль, TD, MC agus MT) по сравнению со сезадию (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD и D12 MT), от разных свиней 12 (D12 MC) срезы/группа, односторонеpа, односторонеpа,#0; ###p <0,001 по сравнению с D0, **p <0,01 по сравнению с контролем D12). b Histogram a’ sealltainn nan 4 suidheachaidhean cultarach (smachd, TD, MC agus MT) an coimeas ri earrannan cridhe ùra (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD agus D12 MT), bho dhiofar earrannan/buidheann mucan 12 (D12 MC), deuchainn ANOVA aon-shligheach; ####p<0.0001, ###p<0.001 vs. D0, **p<0.01 vs. smachd D12). c Tha graf bàr a’ sealltainn tomhas sruth glùcois 12 latha às dèidh cultar anns na 4 suidheachaidhean cultarach uile (Ctrl, TD, MC, agus MT) an taca ri sliseagan cridhe ùra (D0) (n = 6 sliseagan/buidheann bho mhucan eadar-dhealaichte, deuchainn ANOVA aon-shligheach air a dhèanamh; ###p < 0.001, an taca ri D0 agus ***p < 0.001 an taca ri D12 Ctrl). c Tha graf bàr a’ sealltainn tomhas sruth glùcois 12 latha às dèidh cultar anns na 4 suidheachaidhean cultarach uile (Ctrl, TD, MC, agus MT) an taca ri sliseagan cridhe ùra (D0) (n = 6 sliseagan/buidheann bho mhucan eadar-dhealaichte, deuchainn ANOVA aon-shligheach air a dhèanamh; ###p < 0.001, an taca ri D0 agus ***p < 0.001 an taca ri D12 Ctrl). c gistogramama piocadh piostail 4 airson piostail 4 условиях культивирования (контроль, TD, MC agus MT) airson сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 6 срет разных свиней, односторонний Выполняется тест ANOVA; c Tha an histogram a’ sealltainn tomhas sruthadh glùcois 12 latha às dèidh cultar fo na 4 suidheachaidhean cultarach uile (smachd, TD, MC agus MT) an taca ri earrannan cridhe ùra (D0) (n = 6 earrannan/buidheann bho mhucan eadar-dhealaichte, deuchainn ANOVA aon-shligheach air a dhèanamh; ###p < 0.001 an taca ri D0 agus ***p < 0.001 an taca ri D12 Ctrl). c 条形图显示所有4种培养条件（Ctrl,TD,MC和MT）与新鲜心脏切片(D0)相比吻天的葡萄糖通量定量（n = 6 片/组, 来自不同猪，单向执行ANOVA 测试；####p <0.001 ，D*##p < 0.001 ，D*** 0.001 与D12 Ctrl 相比）. C 条形图 显示 所有4种 条件 (ctrl 、 td 、 mc 和 mt) 新鲜 心脏 切片切片切片切片切片片切片片切片片切片和 mt.培养 后 后 12 天 的 通量定量 = 6 片/组, 来自猪, ，, ，, ，, 猪 猪槑单测试；###p <0.001，与D0 相比, ***p <0.001 与D12 Ctrl 相比）. c gistoграмма, показывающая количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после кульельивильски 4 условий культивирования (контроль, TD, MC agus MT) airson сравнению со свежими срезами сердца (D0) (nп = 6 сро, по сравнению) разных свиней, односторонний Были проведены тесты ANOVA; (kontrol). c Histogram a’ sealltainn tomhas sruthadh glùcois 12 latha às dèidh cultar airson nan 4 suidheachaidhean cultarach uile (smachd, TD, MC, agus MT) an taca ri earrannan cridhe ùra (D0) (n = 6 earrannan/buidheann, bho mhucan eadar-dhealaichte, aon-thaobhach far an deach deuchainnean ANOVA a dhèanamh, ###p < 0.001 an taca ri D0, ***p < 0.001 an taca ri D12 (smachd).d Plotaichean mion-sgrùdaidh deformachaidh de fhigheagan ùra (gorm), latha 12 MC (uaine), agus latha 12 MT (dearg) aig deich puingean earrann fhigheagan roinneil (n = 4 sliseagan/buidheann, deuchainn ANOVA aon-shligheach; cha robh eadar-dhealachadh mòr eadar buidhnean). e Plota bholcàno a’ sealltainn ginean air an cur an cèill ann an diofar dhòighean ann an earrannan cridhe ùra (D0) an taca ri earrannan cridhe air an cultar fo chumhachan statach (Ctrl) no fo chumhachan MT (MT) airson 10-12 latha. f Mapa teas de ghinean sarcomere airson earrannan cridhe air an cultar fo gach aon de na cumhaichean cultar. Tha bàraichean mearachd a’ riochdachadh a’ chuibheasachd ± an claonadh àbhaisteach.
Tha eisimeileachd metabolach air an atharrachadh bho ocsaidachadh searbhag geir gu glycolysis na chomharradh air dì-eadar-dhealachadh cardiomyocyte. Bidh cardiomyocytes neo-aibidh a’ cleachdadh glùcois sa mhòr-chuid airson cinneasachadh ATP agus tha mitochondria hypoplastic aca le glè bheag de cristae5,32. Sheall mion-sgrùdaidhean cleachdadh glùcois fo chumhachan MC agus MT, gu robh cleachdadh glùcois coltach ris an fhear ann an clò latha 0 (Figear 4c). Ach, sheall sampallan Ctrl àrdachadh mòr ann an cleachdadh glùcois an taca ri clò ùr. Tha seo a’ nochdadh gu bheil an cothlamadh de CTCM agus T3 / Dex a’ neartachadh beòthalachd clò agus a’ gleidheadh ​​​​​​an fheinotype metabolach de earrannan cridhe cultarach 12-latha. A bharrachd air an sin, sheall mion-sgrùdadh deformachaidh gun do dh’ fhan ìrean deformachaidh mar a bha iad ann an clò cridhe ùr airson 12 latha fo chumhachan MT agus MS (Figear 4d).
Gus buaidh iomlan CTCM agus T3/Dex air cruth-tìre tar-sgrìobhaidh cruinneil clò sliseag cairdiach a sgrùdadh, rinn sinn RNAseq air slisneagan cairdiach bho na ceithir suidheachaidhean cultarach eadar-dhealaichte (Dàta a bharrachd 1). Gu inntinneach, sheall earrannan MT coltas tar-sgrìobhaidh àrd ri clò cridhe ùr, le dìreach 16 air an cur an cèill gu eadar-dhealaichte a-mach à 13,642 ginean. Ach, mar a sheall sinn roimhe, sheall slisneagan Ctrl 1229 ginean air an cur an cèill gu eadar-dhealaichte às deidh 10–12 latha ann an cultar (Figear 4e). Chaidh an dàta seo a dhearbhadh le qRT-PCR de ghinean cridhe agus fibroblast (Figear a bharrachd 7a-c). Gu inntinneach, sheall na h-earrannan Ctrl sìos-riaghladh ginean cearcall cairdiach agus cealla agus gnìomhachadh phrògraman gine sèididh. Tha an dàta seo a’ moladh gu bheil dì-eadar-dhealachadh, a bhios mar as trice a’ tachairt às deidh cultar fad-ùine, air a lughdachadh gu tur fo chumhachan MT (Figear a bharrachd 8a,b). Sheall sgrùdadh cùramach air ginean sarcomere nach eil na ginean a tha a’ còdachadh an sarcomere (Figear 4f) agus an t-sianal ian (Figear Taiceil 9) air an glèidheadh ​​ach fo chumhachan MT, gan dìon bho bhith air an casg fo chumhachan Ctrl, TD, agus MC. Tha an dàta seo a’ sealltainn, le measgachadh de bhrosnachadh meacanaigeach agus humoral (T3/Dex), gum faod transcriptome sliseag a’ chridhe fuireach coltach ri slisneagan cridhe ùra an dèidh 12 latha ann an cultar.
Tha na co-dhùnaidhean tar-sgrìobhaidh seo air an taiceadh leis an fhìrinn gu bheil ionracas structarail cardiomyocytes ann an earrannan cridhe air a ghleidheadh ​​​​​​as fheàrr fo chumhachan MT airson 12 latha, mar a chithear le connexin 43 slàn agus ionadail (Figear 5a). A bharrachd air an sin, chaidh fibrosis ann an earrannan cridhe fo chumhachan MT a lùghdachadh gu mòr an taca ri Ctrl agus coltach ri earrannan cridhe ùra (Figear 5b). Tha an dàta seo a’ sealltainn gu bheil an cothlamadh de bhrosnachadh meacanaigeach agus làimhseachadh T3 / Dex a’ gleidheadh ​​​​​​structar cairdiach gu h-èifeachdach ann an earrannan cridhe ann an cultar.
Dealbhan riochdachail de immunofluorescence de troponin-T (uaine), connexin 43 (dearg), agus DAPI (gorm) ann an earrannan cridhe ùr-aonraichte (D0) no air an cultarachadh airson 12 latha anns na ceithir suidheachaidhean cultarachaidh earrannan cridhe (bàr-sgèile = 100 µm). Tomhas inntleachd shaorga air ionracas structarail clò a’ chridhe (n = 7 (D0 agus D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC agus D12 MT) sliseagan/buidheann bho mhucan eadar-dhealaichte, deuchainn ANOVA aon-shligheach air a dhèanamh; ####p < 0.0001 an taca ri D0 agus *p < 0.05, no ****p < 0.0001 an taca ri D12 Ctrl). Tomhas inntleachd shaorga air ionracas structarail clò a’ chridhe (n = 7 (D0 agus D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC agus D12 MT) sliseagan/buidheann bho mhucan eadar-dhealaichte, deuchainn ANOVA aon-shligheach air a dhèanamh; #### p < 0.0001 an taca ri D0 agus *p < 0.05, no ****p < 0.0001 an taca ri D12 Ctrl). Количественная оценка структурной целостности ткани сердца с помощью искусственного интеллекта ( n = 1 C 2 ), D = 2 TD, D12 MC agus D12 MT) срезов/группу от разных свиней, проведен однофакторный тест ANOVA; 0,05 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). Measadh air ionracas structarail clò cridhe le bhith a’ cleachdadh inntleachd shaorga (n = 7 (D0 agus D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC agus D12 MT) earrannan/buidheann bho mhucan eadar-dhealaichte, deuchainn ANOVA aon-shligheach air a dhèanamh; #### p < 0.0001 an taca ri D0 agus *p < 0.05 no ****p < 0.0001 an taca ri D12 Ctrl).对不同猪的心脏组织结构完整性（n = 7（D0 和D12 Ctrl）,5（D12 TD,D12 MC和D12 MT）切片/组）进行人工智能量化, 进行单向ANOVA 测试；#### p < 0.0001 与D0 撌*p < 0. 0.0001 airson D12 Ctrl mu dheidhinn).对 不同 猪 的 心脏 结构 完整性 （n = 7（d0 和 d12 ctrl） （d12 td 、 d12 mc 2 m 和 ）人工 智能量 化 进行 单向 单向 单向 测试 ； ######### p < 0.0001 与D0 和*p < 0.0**** 港 测测测试 ； ######### p < 0.0001 与D0 和*p < 0.0**** 港 渔0渔0戯Luchdaich sìos D12 Ctrl 相比）.Measadh air ionracas structarail clò cridhe le bhith a’ cleachdadh inntleachd shaorga ann an diofar mhucan (n = 7 earrannan/buidheann (D0 agus D12 Ctrl), 5 earrannan/buidheann (D12 TD, D12 MC agus D12 MT)) le deuchainn ANOVA aon-shligheach;#### p < 0,0001 по сравнению с D0 и * p < 0,05 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). #### p < 0.0001 an taca ri D0 agus *p < 0.05 no ****p < 0.0001 an taca ri D12 Ctrl). b Ìomhaighean riochdachail agus tomhas airson slisneagan cridhe air an dath le dath trichrome Masson (Bàr-sgèile = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD, agus D12 MC), 9 (D12 MT) slisneagan/buidheann bho mhucan eadar-dhealaichte, deuchainn ANOVA aon-shligheach air a dhèanamh; ####p < 0.0001 an taca ri D0 agus ***p < 0.001, no ****p < 0.0001 an taca ri D12 Ctrl). b Ìomhaighean riochdachail agus tomhas airson slisneagan cridhe air an dath le dath trichrome Masson (Bàr-sgèile = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD, agus D12 MC), 9 (D12 MT) slisneagan/buidheann bho mhucan eadar-dhealaichte, deuchainn ANOVA aon-shligheach air a dhèanamh; ####p < 0.0001 an taca ri D0 agus ***p < 0.001, no ****p < 0.0001 an taca ri D12 Ctrl). b ath-bheothachadh изображения agus количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромным красимали (масштабная линейка = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD agus D12 MC), 9 (D12 MT) срезов/группу от разныпу от разныпх снеы срезов односторонний тест ANOVA; b Ìomhaighean riochdachail agus tomhas de earrannan cridhe air an dath le dath trichrome Masson (bàr-sgèile = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD agus D12 MC), 9 (D12 MT) earrannan/buidheann bho mhucan eadar-dhealaichte, air an dèanamh ANOVA aon-shligheach; ####p < 0.0001 vs. D0 agus ***p < 0.001 no ****p < 0.0001 vs. D12 Ctrl). b 用Masson三色染料染色的心脏切片的代表性图像和量化（比例尺= 500 µm) 1（ 1 D = 1（ Ctrl, D12 TD 和D12 MC）, 来自不同猪的9, D12 MT）切片/组, 进行单因素方差分#00 <0;相比, ***p <0.001，或****p < 0.0001 airson D12 Ctrl mu dheidhinn). b 用 masson 三色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 和 量化 (比 尺 尺 尺 = 500 µm) = 500 µm（ 、 d12 ctrl 、d12 td 和 d12 mc切片切片 切片切片切片切片切片切片切片切片/组，进行单因素方差分析；#0.##0

相比, *** p <0.001，或****p <0.0001 与D12 Ctrl 相比）. b reprезентативные изображения agus количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромом намасома = 500 МКк (N = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD ро Aova anova; #### p <0,0001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). b Ìomhaighean riochdachail agus tomhas de earrannan cridhe air an dath le trichrome Masson (bàr-sgèile = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD agus D12 MC), 9 earrannan (D12 MT) bho dhiofar mhucan/buidheann, aon dhòigh ANOVA; ####p < 0.0001 an taca ri D0, ***p < 0.001 no ****p < 0.0001 an taca ri D12 Ctrl).Tha bàraichean mearachd a’ riochdachadh a’ chuibheasachd ± an claonadh àbhaisteach.
Mu dheireadh, chaidh comas CTCM ath-aithris a dhèanamh air hypertrophy cairdiach le bhith ag àrdachadh sìneadh clò cairdiach. Ann an CTCM, dh’èirich cuideam as àirde seòmar adhair bho 80 mmHg gu 80 mmHg. Art. (sìneadh àbhaisteach) suas gu 140 mmHg Art. (Figear 6a). Tha seo a’ freagairt ri àrdachadh 32% ann an sìneadh (Figear 6b), a chaidh a shealltainn roimhe seo mar an ceudad sìneadh co-fhreagarrach a dh’ fheumar airson earrannan cridhe gus fad sarcomere a choileanadh coltach ris an fhear a chithear ann an hypertrophy. Dh’fhan sìneadh agus astar clò cairdiach rè giorrachadh agus fois seasmhach rè sia latha de chultar (Figear 6c). Chaidh clò cairdiach bho chumhachan MT a chuir fo shìneadh àbhaisteach (MT (Àbhaisteach)) no cus-shìneadh (MT (OS)) airson sia latha. Mu thràth às deidh ceithir latha ann an cultar, bha am biomarker hypertrophic NT-ProBNP air a thogail gu mòr anns a’ mheadhan fo chumhachan MT (OS) an taca ri cumhachan MT (àbhaisteach) (Figear 7a). A bharrachd air sin, an dèidh sia latha de chultarachadh, mheudaich meud nan ceallan ann an MT (OS) (Figear 7b) gu mòr an taca ri earrannan de chridhe MT (àbhaisteach). A bharrachd air sin, bha gluasad niùclasach NFATC4 air a mheudachadh gu mòr ann an clò a bha air an sìneadh ro mhòr (Figear 7c). Tha na toraidhean seo a’ sealltainn leasachadh adhartach ath-dhealbhadh pathological an dèidh hyperdistension agus a’ toirt taic don bhun-bheachd gum faodar an inneal CTCM a chleachdadh mar àrd-ùrlar airson sgrùdadh a dhèanamh air comharran hypertrophy cairdiach air adhbhrachadh le sìneadh.
Tha lorgan riochdachail de chuideam seòmar adhair, cuideam seòmar lionn, agus tomhasan gluasad clò a’ dearbhadh gu bheil cuideam an t-seòmair ag atharrachadh cuideam seòmar lionn, ag adhbhrachadh gluasad co-fhreagarrach den t-sliseag clò. b Lùban ceudad sìneadh agus ìre sìneadh riochdachail airson earrannan clò a tha air an sìneadh gu h-àbhaisteach (orains) agus air an sìneadh ro mhòr (gorm). c Graf bàr a’ sealltainn ùine cearcall (n = 19 sliseag gach buidheann, bho mhucan eadar-dhealaichte), ùine giorrachadh (n = 18-19 sliseag gach buidheann, bho mhucan eadar-dhealaichte), ùine fois (n = 19 sliseag gach buidheann, bho mhucan eadar-dhealaichte)), meud gluasad clò (n = 14 sliseag/buidheann, bho mhucan eadar-dhealaichte), astar siostail as àirde (n = 14 sliseag/buidheann, bho mhucan eadar-dhealaichte) agus ìre fois as àirde (n = 14 (D0), 15 (D6)) earrannan/buidhnean) bho mhucan eadar-dhealaichte), cha do sheall deuchainn-t Oileanach dà-earballach eadar-dhealachadh mòr ann am paramadair sam bith, a’ nochdadh gun do dh’fhan na paramadairean sin seasmhach rè 6 latha de chultar le cus bholtaids. Tha bàraichean mearachd a’ riochdachadh a’ chuibheasachd ± claonadh àbhaisteach.
Tomhas graf bàr de dùmhlachd NT-ProBNP ann am meadhanan cultarach bho shliseagan cridhe air an cultar fo chumhachan sìneadh àbhaisteach (Norm) no cus-shìneadh (OS) MT (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, agus D4 MTOS) sliseagan/buidheann bho mhucan eadar-dhealaichte, thathar a’ dèanamh ANOVA dà-shligheach; **p < 0.01 an taca ri sìneadh àbhaisteach). Tomhas graf bàr de dùmhlachd NT-ProBNP ann am meadhanan cultarach bho shliseagan cridhe air an cultar fo chumhachan sìneadh àbhaisteach (Norm) no cus-shìneadh (OS) MT (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, agus D4 MTOS) sliseagan/buidheann bho mhucan eadar-dhealaichte, thathar a’ dèanamh ANOVA dà-shligheach; **p < 0.01 an taca ri sìneadh àbhaisteach).Histogram cainneachdail de dùmhlachd NT-ProBNP ann am meadhan cultar bho shliseagan cridhe air an cultar fo chumhachan sìneadh MT àbhaisteach (norm) no cus-shìneadh (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, agus D4).MTOS) sliseagan /buidheann bho dhiofar mhucan, thathar a’ dèanamh mion-sgrùdadh dà-fhactar air atharrachaidh;** p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p < 0.01 an taca ri sìneadh àbhaisteach). a 在MT 正常拉伸(Norm) 或过度拉伸(OS) 条件下培养的心脏切 片培养基中NT-ProBNP浓度的条形图量化（n = 4 (D2 MTNorm) 、 3 (D2 MTOS 、 D4 MTNorm 和D4) MTOS）来自不同猪的切片/组，进行双向方差分析；** 与正常拉伸相比,p < 0.01）. a Àireamhachadh dùmhlachd NT-ProBNP ann an sliseagan cridhe air an àiteachadh fo chumhachan sìnte àbhaisteach MT (Norm) no cus cuideam (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm和D4 MTOS) bho dhiofar猪的切片/组，可以双向方方发发动; ** an coimeas ri sìneadh àbhaisteach, p <0.01).histogram Meudachadh air dùmhlachd NT-ProBNP ann an slisneagan cridhe air an cultar fo chumhachan sìneadh MT àbhaisteach (norm) no cus-shìneadh (OS) (n = 4 slisneagan/buidheann (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm) agus D4 MTOS) bho dhiofar mhucan, mion-sgrùdadh dà-shligheach air atharrachaidh;** p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p < 0.01 an taca ri sìneadh àbhaisteach). b Ìomhaighean riochdachail airson slisnichean cridhe air an dath le troponin-T agus WGA (clì) agus tomhas meud cealla (deas) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) ceallan/buidheann bho 10 slisnichean eadar-dhealaichte bho mhucan eadar-dhealaichte, deuchainn-t dà-earballach Oileanach air a dhèanamh; ****p < 0.0001 an taca ri sìneadh àbhaisteach). b Ìomhaighean riochdachail airson slisneagan cridhe air an dath le troponin-T agus WGA (clì) agus tomhas meud cealla (deas) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) ceallan/buidheann bho 10 slisneagan eadar-dhealaichte bho mhucan eadar-dhealaichte, deuchainn-t Oileanach dà-earballach air a dhèanamh; ****p < 0.0001 an taca ri sìneadh àbhaisteach). b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слева) agus колипониче размера клеток (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) клеток/группу из 10 ìre хвостовой t-критерий Стьюдента ****p < 0,0001 по сравнению с нормальным растяжением). b Ìomhaighean riochdachail de earrannan cridhe air an dath le troponin-T agus AZP (clì) agus tomhas meud cealla (deas) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) ceallan/buidheann bho 10 earrannan eadar-dhealaichte bho mhucan eadar-dhealaichte, chaidh deuchainn-t dà-earballach Oileanach a dhèanamh; ****p < 0.0001 an taca ri strain àbhaisteach). b 用肌钙蛋白-T 和WGA（左）和细胞大小量化（右）染色 的心脏切 片的代表怼（ MTOS）,来自不同猪的10 个不同切片的369 (D6 MTNorm) 细胞/组, 两进行有尾学生t检验；与正常拉伸相比，****p< 0.0001）. b Dealbhan riochdachail de shliseagan cridhe air an dath le calcarein-T agus WGA (clì) agus meud cealla (deas) (n = 330 (D6 MTOS), 369 bho 10 sliseagan eadar-dhealaichte (D6 MTNorm)) Ceallan/Ceallan, deuchainn t airson sìneadh àbhaisteach; an coimeas ri sìneadh àbhaisteach, ****p < 0.0001). b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слева) и коликема клеток (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) agus 10 различных срезов от разных свиней Клетки / критерий Стьюдента ****p <0,0001 по сравнению с нормальным растяжением). b Ìomhaighean riochdachail de earrannan cridhe air an dath le troponin-T agus AZP (clì) agus tomhas meud cealla (deas) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) bho 10 earrannan eadar-dhealaichte bho mhucan eadar-dhealaichte) Ceallan/buidheann, slatan-tomhais dà-earballach Oileanach's t; ****p < 0.0001 an taca ri strain àbhaisteach). c Dealbhan riochdachail airson slisneagan cridhe MTOS latha 0 agus latha 6 air an immunolipadh airson troponin-T agus NFATC4 agus tomhas air gluasad NFATC4 gu niuclasan CM (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) slisneagan/buidheann bho mhucan eadar-dhealaichte, deuchainn-t Oileanach dà-earballach air a dhèanamh; *p < 0.05). c Dealbhan riochdachail airson slisneagan cridhe MTOS latha 0 agus latha 6 air an immunolipadh airson troponin-T agus NFATC4 agus tomhas air gluasad NFATC4 gu niuclasan CM (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) slisneagan/buidheann bho mhucan eadar-dhealaichte, deuchainn-t Oileanach dà-earballach air a dhèanamh; *p < 0.05). c Repрезентативные изображения для срезов сердца 0 agus 6 le MTOS, иммуномеченых для тропонина-Т 4 количественная оценка транслокации NFATC4 в ядра кавернозных клеток (n = 4 (D0), 3 (D6) MTS выполняется двусторонний t-критерий Стьюдента *p <0,05). c Dealbhan riochdachail airson earrannan cridhe aig MTOS 0 agus 6 latha, air an lipéadachadh le immunology airson troponin-T agus NFATC4, agus tomhas gluasad NFATC4 ann an niùclas cheallan uaimheach (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) sliseagan/buidheann bho mhucan eadar-dhealaichte) air an dèanamh deuchainn-t dà-earballach an Oileanaich; *p < 0.05). c 用于肌钙蛋白-T 和NFATC4 免疫标记的第0 天和第6 天MTOS心脏切片的代表性图像, 以及来自不同猪的NFATC4 易位至CM 细胞核的量化（n = 4 MT = 4 MT = 4 MT切 片/组, 进行双尾学生t 检验；*p < 0.05). c Ìomhaighean riochdachail de immunolabeling calcanin-T agus NFATC4 第0天和第6 天MTOS sliseagan cridhe, agus NFATC4 bho dhiofar NFATC4 易位至 niuclas cealla CM的quantity化 (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) 化时间双尾学生et 电影；*p <0.05). c Repрезентативные изображения срезов сердца MTOS de 0 agus 6 airson имуномаркировки тропображения сердца MTS оценка транслокации NFATC4 в ядра CM от разных свиней (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срез/группа, два- хвостатыты meud; *p <0,05). c Ìomhaighean riochdachail de shliseagan cridhe MTOS aig latha 0 agus 6 airson lipéadachadh immuno troponin-T agus NFATC4 agus tomhas gluasad NFATC4 ann an niùclas CM bho mhucan eadar-dhealaichte (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) sliseagan/buidheann, slatan-tomhais t dà-earballach Oileanach; *p < 0.05).Tha bàraichean mearachd a’ riochdachadh a’ chuibheasachd ± an claonadh àbhaisteach.
Tha feum aig rannsachadh cardiovascular eadar-theangachaidh air modalan ceallach a bhios ag ath-riochdachadh àrainneachd a’ chridhe gu ceart. Anns an sgrùdadh seo, chaidh inneal CTCM a leasachadh agus a chomharrachadh as urrainn earrannan tana den chridhe a bhrosnachadh. Tha siostam CTCM a’ toirt a-steach brosnachadh dealan-mheacanaigeach sioncronaichte gu fiseòlasach agus beairteachadh lionn T3 agus Dex. Nuair a chaidh earrannan cridhe muice fhoillseachadh do na factaran sin, dh’fhan an comas-beò, an ionracas structarail, an gnìomhachd metabolach, agus an abairt tar-sgrìobhaidh mar a bha iad ann an clò cridhe ùr às deidh 12 latha de chultar. A bharrachd air an sin, faodaidh cus sìneadh de chlach-chridhe hypertrophy a’ chridhe adhbhrachadh air adhbhrachadh le hyperextension. Gu h-iomlan, tha na toraidhean sin a’ toirt taic don dreuchd chudromach a th’ aig suidheachaidhean cultar fiseòlasach ann a bhith a’ cumail suas phenotype cridhe àbhaisteach agus a’ toirt seachad àrd-ùrlar airson sgrìonadh dhrogaichean.
Tha mòran nithean a’ cur ri bhith a’ cruthachadh àrainneachd as fheàrr airson gnìomhachd agus mairsinneachd cardiomyocytes. Tha na nithean as follaisiche de na nithean sin co-cheangailte ri (1) eadar-obrachaidhean eadar-cheallach, (2) brosnachadh dealan-mheacanaigeach, (3) factaran humoral, agus (4) fo-stratan metabolach. Feumaidh eadar-obrachaidhean fiseòlasach cealla-gu-cealla lìonraidhean trì-thaobhach iom-fhillte de dhiofar sheòrsaichean cealla le taic bho mhaitris taobh a-muigh na cealla. Tha e duilich eadar-obrachaidhean cealla iom-fhillte mar sin ath-thogail in vitro le co-chultar de sheòrsaichean cealla fa leth, ach faodar an coileanadh gu furasta le bhith a’ cleachdadh nàdar organotypic earrannan cridhe.
Tha sìneadh meacanaigeach agus brosnachadh dealain cardiomyocytes deatamach airson fenotype cairdiach a chumail suas33,34,35. Ged a chaidh brosnachadh meacanaigeach a chleachdadh gu farsaing airson suidheachadh agus aibidh hiPSC-CM, tha grunn sgrùdaidhean eireachdail air feuchainn o chionn ghoirid ri brosnachadh meacanaigeach sliseagan cridhe ann an cultar a’ cleachdadh luchdachadh uniaxial. Tha na sgrùdaidhean seo a’ sealltainn gu bheil buaidh mhath aig luchdachadh meacanaigeach uniaxial 2D air fenotype a’ chridhe rè cultar. Anns na sgrùdaidhean seo, chaidh earrannan den chridhe a luchdachadh le feachdan tensile isometric17, luchdachadh auxotonic loidhneach18, no chaidh cearcall a’ chridhe ath-chruthachadh a’ cleachdadh fios-air-ais transducer feachd agus draibhearan teannachaidh. Ach, bidh na dòighean sin a’ cleachdadh sìneadh clò uniaxial gun leasachadh àrainneachdail, agus mar thoradh air sin bidh mòran ghinean cairdiach air an cur às no cus ginean co-cheangailte ri freagairtean sìneadh neo-àbhaisteach. Tha an CTCM a tha air a mhìneachadh an seo a’ toirt seachad brosnachadh electromeacanaigeach 3D a bhios ag atharrais air cearcall nàdarra a’ chridhe a thaobh ùine cearcall agus sìneadh fiseòlasach (sìneadh 25%, systole 40%, diastole 60%, agus 72 buille gach mionaid). Ged nach eil an spreagadh meacanaigeach trì-thaobhach seo leis fhèin gu leòr airson ionracas clò a chumail suas, tha feum air measgachadh de bhrosnachadh humoral agus meacanaigeach a’ cleachdadh T3/Dex gus beòshlaint, gnìomh agus ionracas clò a chumail suas gu leòr.
Tha pàirt chudromach aig factaran humoral ann a bhith ag atharrachadh phenotype cridhe inbheach. Chaidh seo a shoilleireachadh ann an sgrùdaidhean HiPS-CM anns an deach T3 agus Dex a chur ri meadhanan cultarach gus luathachadh aibidh cheallan. Faodaidh T3 buaidh a thoirt air còmhdhail amino-aigéid, shiùcairean agus calcium thar membran cealla36. A bharrachd air an sin, bidh T3 a’ brosnachadh abairt MHC-α agus lùghdachadh MHC-β, a’ brosnachadh cruthachadh myofibrils twitch luath ann an cardiomyocytes aibidh an taca ri myofibrils twitch slaodach ann an CM fetal. Bidh easbhaidh T3 ann an euslaintich hypothyroid ag adhbhrachadh call chòmhlain myofibrillar agus ìre nas ìsle de leasachadh tòna37. Bidh Dex ag obair air gabhadan glucocorticoid agus chaidh a shealltainn gu bheil e ag àrdachadh cùmhnantachd myocardial ann an cridheachan perfused iomallach;38 thathas den bheachd gu bheil an leasachadh seo co-cheangailte ris a’ bhuaidh air inntrigeadh air a stiùireadh le tasgadh calcium (SOCE)39,40. A bharrachd air an sin, bidh Dex a’ ceangal ris na gabhadan aige, ag adhbhrachadh freagairt intracellular farsaing a chuireas casg air gnìomh dìonachd agus sèid30.
Tha na toraidhean againn a’ nochdadh gun do leasaich brosnachadh meacanaigeach corporra (MS) coileanadh iomlan cultar an taca ri Ctrl, ach dh’fhàillig e ri bhith comasach air beòshlaint, ionracas structarail, agus abairt cairdiach a chumail suas thairis air 12 latha ann an cultar. An taca ri Ctrl, leasaich cur T3 agus Dex ri cultaran CTCM (MT) beòshlaint agus chùm e suas pròifilean tar-sgrìobhaidh, ionracas structarail, agus gnìomhachd metabolach coltach ri chèile le clò cridhe ùr airson 12 latha. A bharrachd air an sin, le bhith a’ cumail smachd air ìre sìneadh clò, chaidh modail hypertrophy cairdiach air adhbhrachadh le hyperextension a chruthachadh a’ cleachdadh STCM, a’ sealltainn ioma-chruthachd siostam STCM. Bu chòir a thoirt fa-near, ged a bhios ath-dhealbhadh cairdiach agus fibrosis mar as trice a’ toirt a-steach buill-bodhaig slàn aig a bheil ceallan cuairteachaidh as urrainn na cytokines iomchaidh a thoirt seachad a bharrachd air phagocytosis agus factaran ath-dhealbhachaidh eile, faodaidh earrannan den chridhe fhathast am pròiseas fibrotach aithris mar fhreagairt do chuideam agus trauma a-steach do myofibroblasts. Chaidh seo a mheasadh roimhe seo anns a’ mhodail sliseag cairdiach seo. Bu chòir a thoirt fa-near gum faodar paramadairean CTCM atharrachadh le bhith ag atharrachadh cuideam / meud dealain agus tricead gus mòran shuidheachaidhean leithid tachycardia, bradycardia, agus taic cuairteachaidh meacanaigeach (cridhe gun luchdachadh meacanaigeach). Tha seo a’ ciallachadh gu bheil an siostam aig ìre meadhanach de thoradh airson deuchainnean dhrogaichean. Tha comas CTCM modaladh a dhèanamh air hypertrophy cairdiach air adhbhrachadh le cus oidhirp a’ rèiteachadh na slighe airson an siostam seo a dhearbhadh airson leigheas pearsanaichte. Mar cho-dhùnadh, tha an sgrùdadh seo a’ sealltainn gu bheil sìneadh meacanaigeach agus brosnachadh humoral deatamach airson cultar earrannan clò cairdiach a chumail suas.
Ged a tha an dàta a tha air a thaisbeanadh an seo a’ moladh gur e àrd-ùrlar gealltanach a th’ ann an CTCM airson modaladh myocardium slàn, tha cuid de chuingealachaidhean aig an dòigh cultar seo. Is e am prìomh chuingealachadh air cultar CTCM gu bheil e a’ cur cuideaman meacanaigeach fiùghantach leantainneach air na sliseagan, a chuireas casg air a’ chomas sùil a chumail gu gnìomhach air giorrachaidhean sliseagan cridhe rè gach cearcall. A bharrachd air an sin, air sgàth meud beag nan earrannan cridhe (7 mm), tha comas gnìomh siostòlach a mheasadh taobh a-muigh siostaman cultar a’ cleachdadh mothachairean feachd traidiseanta cuingealaichte. Anns an làmh-sgrìobhainn làithreach, tha sinn a’ faighinn thairis air a’ chuingealachadh seo gu ìre le bhith a’ measadh bholtaids optigeach mar chomharradh air gnìomh cùmhnantail. Ach, feumaidh an cuingealachadh seo tuilleadh obrach agus faodar dèiligeadh ris san àm ri teachd le bhith a’ toirt a-steach dòighean airson sgrùdadh optigeach air gnìomh sliseagan cridhe ann an cultar, leithid mapadh optigeach a’ cleachdadh calcium agus dathan mothachail air bholtaids. Is e cuingealachadh eile air CTCM nach eil am modail obrach a’ làimhseachadh cuideam fiseòlasach (ro-luchdachadh agus às dèidh luchd). Ann an CTCM, chaidh cuideam a bhrosnachadh ann an stiùiridhean mu choinneamh gus sìneadh fiseòlasach 25% ann an diastole (sìneadh slàn) agus systole (fad giorrachadh rè brosnachadh dealain) ath-riochdachadh ann an clò glè mhòr. Bu chòir an cuingealachadh seo a thoirt air falbh ann an dealbhaidhean CTCM san àm ri teachd le cuideam iomchaidh a chur air clò a’ chridhe bho gach taobh agus le bhith a’ cur an sàs na dàimhean cuideam-meud ceart a tha a’ tachairt ann an seòmraichean a’ chridhe.
Tha an ath-mhodaileadh air adhbhrachadh le cus-shìneadh a tha air aithris san làmh-sgrìobhainn seo cuingealaichte ri bhith ag atharrais air comharran hyper-shìneadh hipeartrófach. Mar sin, faodaidh am modail seo cuideachadh le bhith a’ sgrùdadh comharran hipeartrófach air adhbhrachadh le sìneadh gun fheum air factaran humoral no neural (nach eil ann san t-siostam seo). Tha feum air tuilleadh sgrùdaidhean gus iomadachd CTCM a mheudachadh, mar eisimpleir, co-chultarachadh le ceallan dìonachd, factaran humoral plasma a tha a’ cuairteachadh, agus innervation nuair a leasaicheas co-chultarachadh le ceallan neuronal na cothroman airson modaladh galair le CTCM.
Chaidh trì mucan deug a chleachdadh san sgrùdadh seo. Chaidh a h-uile modh-obrach bheathaichean a dhèanamh a rèir stiùiridhean institiùideach agus chaidh an aontachadh le Comataidh Cùram is Cleachdadh Bheathaichean Institiùideach Oilthigh Louisville. Chaidh bogha an aorta a chlampadh agus chaidh 1 L de cardioplegia sterile (110 mM NaCl, 1.2 mM CaCl2, 16 mM KCl, 16 mM MgCl2, 10 mM NaHCO3, 5 U/mL heparin, pH suas gu 7.4) a thoirt a-steach don chridhe; Chaidh na cridheachan a ghleidheadh ​​ann am fuasgladh cardioplegic fuar-deighe gus an deach an giùlan chun obair-lann air deigh a tha mar as trice <10 mionaidean. Chaidh na cridheachan a ghleidheadh ​​ann am fuasgladh cardioplegic fuar-deighe gus an deach an giùlan chun obair-lann air deigh a tha mar as trice <10 mionaidean. сердца хранили в ледяном кардиоплегическом растворе do транспортировки в лабораторию na льду, что обынинию 1. Chaidh cridheachan a stòradh ann am fuasgladh cardioplegic fuar-deighe gus an deach an giùlan chun obair-lann air deigh, a bheir mar as trice <10 mionaidean.将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实 验室, 通常<10分钟。将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实 验室, 通常<10分钟。 Держите сердца в ледяной кардиоплегии до транспортировки в лабораторию na льду, обычно <10 mionaidean. Cùm cridheachan air cardioplegia deigh gus an tèid an giùlan chun obair-lann air deigh, mar as trice <10 min.
Chaidh an inneal CTCM a leasachadh ann am bathar-bog dealbhaidh le taic coimpiutair (CAD) SolidWorks. Tha na seòmraichean cultar, na roinneadairean agus na seòmraichean èadhair air an dèanamh de phlastaig acrylic soilleir CNC. Tha an fhàinne cùl-taic 7mm ann an trast-thomhas air a dhèanamh de polyethylene dùmhlachd àrd (HDPE) sa mheadhan agus tha clais-O ann gus àite a thoirt don O-fàinne silicone a thathas a’ cleachdadh gus na meadhanan fodha a sheulachadh. Tha membran silica tana a’ sgaradh an t-seòmar cultar bhon phlàta dealachaidh. Tha am membran silicone air a ghearradh le laser bho dhuilleag silicone 0.02″ de thighead agus tha cruas de 35A aige. Tha na gasgaidean silicone aig a’ bhonn agus aig a’ mhullach air an gearradh le laser bho dhuilleag silicone 1/16″ de thighead agus tha cruas de 50A aca. Tha sgriothan stàilinn gun smal 316L agus cnothan sgiath air an cleachdadh airson am bloc a cheangal agus ròn èadhair a chruthachadh.
Tha bòrd cuairte clò-bhuailte (PCB) sònraichte air a dhealbhadh gus a bhith air a thoirt a-steach leis an t-siostam C-PACE-EM. Tha na socaidean ceangail inneal Eilbheiseach air a’ PCB ceangailte ri electrodan grafait le uèirichean copair airgid-phlàtaichte agus sgriothan umha 0-60 air an sgrìobadh a-steach do na electrodan. Tha am bòrd cuairte clò-bhuailte air a chur ann an còmhdach a’ chlò-bhualadair 3D.
Tha an inneal CTCM fo smachd gnìomhaiche niùmatach prògramaichte (PPD) a chruthaicheas cuideam cuairteachaidh fo smachd coltach ri cearcall cridhe. Mar a bhios an cuideam taobh a-staigh seòmar an adhair ag àrdachadh, bidh am membran silicone sùbailte a’ leudachadh suas, a’ sparradh a’ mheadhain fon làrach clò. Thèid an raon clò a shìneadh an uairsin leis an tilgeil a-mach seo de lionn, ag atharrais air leudachadh fiseòlasach a’ chridhe rè diastole. Aig ìre as àirde fois, chaidh brosnachadh dealain a chuir an sàs tro electrodan grafait, a lughdaich an cuideam anns an t-seòmar adhair agus a dh’ adhbhraich giorrachadh earrannan clò. Taobh a-staigh a’ phìoba tha bhalbha hemostatic le sensor cuideam gus an cuideam anns an t-siostam adhair a lorg. Tha an cuideam a tha air a mhothachadh leis an sensor cuideam air a chuir gu cruinneadair dàta ceangailte ris an laptop. Leigidh seo le sgrùdadh leantainneach a dhèanamh air a’ chuideam taobh a-staigh seòmar a’ ghasa. Nuair a chaidh an cuideam seòmar as àirde a ruighinn (àbhaisteach 80 mmHg, 140 mmHg OS), chaidh òrdachadh don inneal togail dàta comharra a chuir chun t-siostam C-PACE-EM gus comharra bholtaids dà-ìre a chruthachadh airson 2 ms, air a shuidheachadh gu 4 V.
Fhuaireadh earrannan cridhe agus chaidh suidheachaidhean cultar ann an 6 tobraichean a choileanadh mar a leanas: Gluais na cridheachan a chaidh a bhuain bhon t-soitheach gluasaid gu treidhe anns an robh cardioplegia fuar (4° C.). Chaidh an ventricle clì a sgaradh le lann steirile agus a ghearradh ann am pìosan de 1-2 cm3. Chaidh na blocaichean clò seo a cheangal ri taicean clò le glaodh clò agus an cur ann an amar clò microtome crith anns an robh fuasgladh Tyrode agus air a ocsaideanachadh gu leantainneach (3 g / L 2,3-butanedione monooxime (BDM), 140 mM NaCl (8.18 g).), 6 mM KCl (0.447 g), 10 mM D-glucose (1.86 g), 10 mM HEPES (2.38 g), 1 mM MgCl2 (1 ml fuasgladh 1 M), 1.8 mM CaCl2 (1.8 ml fuasgladh 1 M), suas ri 1 L ddH2O). Chaidh am microtome crithidh a shuidheachadh gus sliseagan 300 µm de thighead a ghearradh aig tricead 80 Hz, leud crithidh chòmhnard de 2 mm, agus ìre adhartais de 0.03 mm/s. Bha deigh timcheall an amar-fhighe gus am fuasgladh a chumail fionnar agus chaidh an teòthachd a chumail aig 4°C. Gluais earrannan fhighe bhon amar-fhighe microtome gu amar goir anns an robh fuasgladh Tyrode le ocsaidean leantainneach air deigh gus an robh earrannan gu leòr rim faighinn airson aon phlàta cultar. Airson cultaran transwell, chaidh earrannan fhighe a cheangal ri taicean polyurethane sterile 6 mm de leud agus an cur ann an 6 ml de mheadhan leasaichte (meadhan 199, 1x stuth-cuideachaidh ITS, 10% FBS, 5 ng/ml VEGF, 10 ng/ml FGF-alcaileach agus 2X antibiotic-antifungal). Chaidh brosnachadh dealain (10 V, tricead 1.2 Hz) a chur air na h-earrannan fhighe tron ​​C-Pace. Airson suidheachaidhean TD, chaidh T3 agus Dex ùr a chur ris aig 100 nM agus 1 μM aig gach atharrachadh meadhanach. Tha am meadhan air a shàthadh le ocsaidean mus tèid a chur na àite 3 tursan san latha. Chaidh earrannan clò a chur ann an goireadair aig 37°C agus 5% CO2.
Airson cultaran CTCM, chaidh earrannan clò a chur air clò-bhualadair 3D dèanta gu sònraichte ann am mias Petri anns an robh fuasgladh Tyrode atharraichte. Tha an inneal air a dhealbhadh gus meud sliseag a’ chridhe a mheudachadh le 25% de raon an fhàinne taice. Tha seo air a dhèanamh gus nach bi earrannan a’ chridhe a’ sìneadh às deidh dhaibh a bhith air an gluasad bho fhuasgladh Tyrode chun mheadhan agus rè diastole. A’ cleachdadh glaodh histoacrylic, chaidh earrannan 300 µm de thighead a cheangal air fàinne taice 7 mm ann an trast-thomhas. Às deidh na h-earrannan clò a cheangal ris an fhàinne taice, geàrr dheth na h-earrannan clò a bharrachd agus cuir na h-earrannan clò ceangailte air ais ann an amar fuasgladh Tyrode air deigh (4°C) gus am bi earrannan gu leòr air an ullachadh airson aon inneal. Cha bu chòir an ùine giollachd iomlan airson gach inneal a bhith nas fhaide na 2 uair a thìde. Às deidh 6 earrannan clò a cheangal ris na fàinneachan taice aca, chaidh an inneal CTCM a chruinneachadh. Tha seòmar cultar CTCM air a lìonadh ro-làimh le 21 ml de mheadhan ro-ocsaideanaichte. Gluais na h-earrannan clò chun t-seòmar cultar agus thoir air falbh gu faiceallach builgeanan èadhair sam bith le pipette. Tha an earrann clò an uair sin air a stiùireadh a-steach don toll agus air a bhrùthadh gu socair na àite. Mu dheireadh, cuir caip an electrode air an inneal agus gluais an inneal chun an goireadair. An uair sin ceangail an CTCM ris an tiùb èadhair agus an siostam C-PACE-EM. Fosglaidh an gnìomhaiche niùmatach agus fosglaidh am bhalbha èadhair an CTCM. Chaidh an siostam C-PACE-EM a rèiteachadh gus 4 V a lìbhrigeadh aig 1.2 Hz rè pacadh dà-ìre airson 2 ms. Chaidh am meadhan atharrachadh dà uair san latha agus chaidh na electrodan atharrachadh aon uair san latha gus casg a chuir air cruinneachadh grafait air na electrodan. Ma tha feum air, faodar earrannan clò a thoirt a-mach às na tobraichean cultar aca gus builgeanan èadhair sam bith a dh’ fhaodadh a bhith air tuiteam fodha a thoirt a-mach. Airson suidheachaidhean làimhseachaidh MT, chaidh T3/Dex ùr a chur ris le gach atharrachadh meadhan le 100 nM T3 agus 1 μM Dex. Chaidh na h-innealan CTCM a chultarachadh ann an goireadair aig 37°C agus 5% CO2.
Gus slighean-rathaid sìnte de shliseagan cridhe fhaighinn, chaidh siostam camara sònraichte a leasachadh. Chaidh camara SLR (Canon Rebel T7i, Canon, Tokyo, Iapan) a chleachdadh le lionsa macro Navitar Zoom 7000 18-108mm (Navitar, San Francisco, CA). Chaidh an dealbh-sgrìn a dhèanamh aig teòthachd an t-seòmair às deidh meadhan ùr a chur na àite. Tha a’ chamara suidhichte aig ceàrn 51° agus tha bhidio air a chlàradh aig 30 frèamaichean san diog. An toiseach, chaidh bathar-bog stòr fosgailte (MUSCLEMOTION43) a chleachdadh le Image-J gus gluasad shliseagan cridhe a thomhas. Chaidh am masg a chruthachadh a’ cleachdadh MATLAB (MathWorks, Natick, MA, USA) gus roinnean inntinneach a mhìneachadh airson sliseagan cridhe a’ bualadh gus fuaim a sheachnadh. Tha masgaichean air an roinn le làimh air an cur an sàs anns a h-uile ìomhaigh ann an sreath frèamaichean agus an uairsin air an cur chun plugan MUSCLEMOTION. Bidh Muscle Motion a’ cleachdadh dian cuibheasach nam piogsail anns gach frèam gus a ghluasad a thomhas an coimeas ris a’ fhrèam iomraidh. Chaidh dàta a chlàradh, a shìoladh agus a chleachdadh gus ùine cearcall a thomhas agus sìneadh clò a mheasadh rè cearcall a’ chridhe. Chaidh am bhidio clàraichte a phròiseasadh às dèidh sin le bhith a’ cleachdadh criathrag didseatach ìre neoni den chiad òrdugh. Gus sìneadh clò a thomhas (bun-gu-bun), chaidh mion-sgrùdadh bun-gu-bun a dhèanamh gus eadar-dhealachadh a dhèanamh eadar buinneagan agus troighean anns a’ chomharra clàraichte. A bharrachd air an sin, thèid dì-ghluasad a dhèanamh le bhith a’ cleachdadh poileanoman den 6mh òrdugh gus gluasad comharra a thoirt air falbh. Chaidh còd prògraim a leasachadh ann am MATLAB gus gluasad clò cruinneil, ùine cearcall, ùine fois, agus ùine crìonaidh a dhearbhadh (Còd Prògram a bharrachd 44).
Airson mion-sgrùdadh deformachaidh, a’ cleachdadh nan aon bhideothan a chaidh a chruthachadh airson measadh sìneadh meacanaigeach, rinn sinn an toiseach sgrùdadh air dà ìomhaigh a’ riochdachadh prìomh ghluasadan (na puingean gluasaid as àirde (àrd) agus as ìsle (ìosal)) a rèir bathar-bog MUSCLEMOTION. An uairsin roinn sinn na roinnean clò agus chuir sinn seòrsa de algairim sgàileachaidh an sàs air an clò roinnte (Figear a bharrachd 2a). Chaidh an clò roinnte an uairsin a roinn ann an deich fo-uachdaran, agus chaidh an cuideam air gach uachdar obrachadh a-mach a’ cleachdadh a’ cho-aontar a leanas: Deformachadh = (Sup-Sdown)/Sdown, far a bheil Sup agus Sdown nan astaran den chumadh bho na faileasan àrda is ìosal den aodach, fa leth (Figear a bharrachd .2b).
Chaidh earrannan cridhe a dhaingneachadh ann an 4% paraformaldehyde airson 48 uairean. Chaidh clòthan daingnichte a dhì-uisgeachadh ann an 10% agus 20% siùcros airson 1 uair a thìde, agus an uairsin ann an 30% siùcros thar oidhche. An uairsin chaidh na h-earrannan a leabachadh ann an todhar teòthachd gearraidh as fheàrr (todhar OCT) agus an uairsin a reothadh mean air mhean ann an amar isopentane/deigh tioram. Stòraich blocaichean leabachaidh OCT aig -80 °C gus an dealaich iad. Chaidh sleamhnagan ullachadh mar earrannan le tiugh de 8 μm.
Gus OCT a thoirt air falbh bho earrannan cridhe, teas na sleamhnagan air bloc teasachaidh aig 95 °C airson 5 mionaidean. Cuir 1 ml PBS ri gach sleamhnag agus goir iad airson 30 mionaid aig teòthachd an t-seòmair, an uairsin cuir 0.1% Triton-X ann am PBS tron ​​earrannan airson 15 mionaidean aig teòthachd an t-seòmair. Gus casg a chuir air antibodies neo-shònraichte bho bhith a’ ceangal ris an sampall, cuir 1 ml de fhuasgladh 3% BSA ris na sleamhnagan agus goir iad airson 1 uair aig teòthachd an t-seòmair. Chaidh am BSA a thoirt air falbh an uairsin agus chaidh na sleamhnagan a nighe le PBS. Comharraich gach sampall le peansail. Chaidh antibodies bun-sgoile (air an caolachadh 1:200 ann an 1% BSA) (connexin 43 (Abcam; #AB11370), NFATC4 (Abcam; #AB99431) agus troponin-T (Thermo Scientific; #MA5-12960) a chur ris thairis air 90 mionaid, agus an uairsin antibodies àrd-sgoile (air an caolachadh 1:200 ann an 1% BSA) an aghaidh Alexa Fluor 488 luchaige (Thermo Scientific; #A16079), an aghaidh Alexa Fluor 594 coineanach (Thermo Scientific; #T6391) airson 90 mionaid a bharrachd. Air an nighe 3 tursan le PBS. Gus dathadh targaid a dhealachadh bhon chùl-raon, chleachd sinn an antibody àrd-sgoile a-mhàin mar smachd. Mu dheireadh, chaidh dathadh niùclasach DAPI a chur ris agus chaidh na sleamhnagan a chur ann an vectashield (Vector Laboratories) agus an seulachadh le snas ìnean. meudachadh -x) agus miocroscop Keyence le meudachadh 40x.
Chaidh WGA-Alexa Fluor 555 (Thermo Scientific; #W32464) aig 5 μg/ml ann am PBS a chleachdadh airson dathachadh WGA agus chaidh a chur air earrannan stèidhichte airson 30 mionaid aig teòthachd an t-seòmair. An uairsin chaidh na sleamhnagan a nighe le PBS agus chaidh dubh Sudan a chur ri gach sleamhnag agus a ghoir airson 30 mionaid. An uairsin chaidh na sleamhnagan a nighe le PBS agus chaidh meadhan leabachaidh vectashield a chur ris. Chaidh na sleamhnagan fhaicinn air miocroscop Keyence aig meudachadh 40x.
Chaidh OCT a thoirt a-mach às na sampallan mar a chaidh a mhìneachadh gu h-àrd. Às dèidh an OCT a thoirt air falbh, bog na sleamhnagan ann am fuasgladh Bouin thar oidhche. Chaidh na sleamhnagan an uairsin a shruthladh le uisge grùide airson 1 uair a thìde agus an uairsin a chur ann am fuasgladh searbhag aloe Bibrich fuchsin airson 10 mionaidean. An uairsin chaidh na sleamhnagan a nighe le uisge grùide agus an cur ann am fuasgladh de 5% fosfomolybdenum / 5% searbhag fosfotungstic airson 10 mionaidean. Gun a bhith a’ sruthladh, gluais na sleamhnagan gu dìreach a-steach don fhuasgladh gorm aniline airson 15 mionaidean. An uairsin chaidh na sleamhnagan a nighe le uisge grùide agus an cur ann am fuasgladh searbhag aiseatach 1% airson 2 mhionaid. Chaidh na sleamhnagan a thiormachadh ann an ethanol 200 N agus an gluasad gu xylene. Chaidh na sleamhnagan dathte fhaicinn le bhith a’ cleachdadh miocroscop Keyence le amas 10x. Chaidh ceudad farsaingeachd fibrosis a thomhas le bhith a’ cleachdadh bathar-bog Keyence Analyzer.
Deuchainn Seasmhachd Cealla MTT CyQUANT™ (Invitrogen, Carlsbad, CA), àireamh catalog V13154, a rèir protocol an neach-dèanamh le beagan atharrachaidhean. Gu sònraichte, chaidh punch lannsaichte le trast-thomhas de 6 mm a chleachdadh gus dèanamh cinnteach à meud clò cunbhalach rè mion-sgrùdadh MTT. Chaidh clòthan a phlàtadh leotha fhèin ann an tobraichean truinnsear 12-tobar anns an robh fo-strat MTT a rèir protocol an neach-dèanamh. Tha na h-earrannan air an goradh aig 37° C. airson 3 uairean a thìde agus bidh an clò beò a’ metaboliseadh an fo-strat MTT gus todhar formazan purpaidh a chruthachadh. Cuir 1 ml DMSO an àite fuasgladh MTT agus goradh aig 37°C airson 15 mionaidean gus formazan purpaidh a thoirt a-mach à earrannan cridhe. Chaidh sampallan a lagachadh 1:10 ann an DMSO ann am truinnsearan bonn soilleir 96-tobar agus chaidh dian dath purpaidh a thomhas aig 570 nm a’ cleachdadh leughadair truinnsear Cytation (BioTek). Chaidh leughaidhean a dhèanamh àbhaisteach gu cuideam gach sliseag den chridhe.
Chaidh meadhanan sliseag cridhe a chur an àite meadhanan anns an robh 1 μCi/ml [5-3H]-glùcois (Moravek Biochemicals, Brea, CA, USA) airson deuchainn cleachdadh glùcois mar a chaidh a mhìneachadh roimhe. Às dèidh 4 uairean a thìde de ghoir, cuir 100 µl de mheadhan ri tiùb microcentrifuge fosgailte anns an robh 100 µl de 0.2 N HCl. An uairsin chaidh an tiùb a chur ann an tiùb scintillation anns an robh 500 μl de dH2O gus [3H]2O a ghalachadh airson 72 uair aig 37°C. An uairsin thoir air falbh an tiùb microcentrifuge bhon tiùb scintillation agus cuir 10 ml de lionn scintillation ris. Chaidh cunntasan scintillation a dhèanamh a’ cleachdadh anailisiche scintillation leaghaidh Tri-Carb 2900TR (Packard Bioscience Company, Meriden, CT, USA). Chaidh cleachdadh glùcois obrachadh a-mach an uair sin a’ gabhail a-steach gnìomhachd shònraichte [5-3H]-glùcois, cothromachadh neo-choileanta agus cùl-raon, caolachadh [5-3H]-gu glùcois gun lipéad, agus èifeachdas cunntair scintillation. Tha an dàta air a cho-chothromachadh ri mais earrannan a’ chridhe.
Às dèidh homogenachadh clò ann an Trizol, chaidh RNA a sgaradh bho earrannan cridhe a’ cleachdadh an Qiagen miRNeasy Micro Kit #210874 a rèir protocol an neach-dèanamh. Chaidh ullachadh leabharlann RNAsec, sreath-sgrùdadh agus mion-sgrùdadh dàta a dhèanamh mar a leanas:
Chaidh 1 μg de RNA gach sampall a chleachdadh mar stuth tòiseachaidh airson ullachadh leabharlann an RNA. Chaidh leabharlannan sreathachaidh a chruthachadh a’ cleachdadh Pasgan Ullachaidh Leabharlann RNA NEBNext UltraTM airson Illumina (NEB, USA) a’ leantainn mholaidhean an neach-dèanamh, agus chaidh còdan clàr-amais a chur ris na sreathan feartan airson gach sampall. Goirid, chaidh mRNA a ghlanadh bho RNA iomlan a’ cleachdadh grìogagan magnetach ceangailte ri oligonucleotides poly-T. Tha an roinneadh air a dhèanamh a’ cleachdadh cationan dà-bhailteach aig teòthachd àrd ann am Bufair Ath-bhualadh Synthesis First Strand NEBNext (5X). Chaidh cDNA a’ chiad shreath a cho-chur a’ cleachdadh prìomhairean hexamer air thuaiream agus transcriptase cùil M-MuLV (RNase H-). Tha an dàrna sreath cDNA an uairsin air a cho-chur a’ cleachdadh polymerase DNA I agus RNase H. Tha na h-oirean a tha air fhàgail air an tionndadh gu cinn maol le gnìomhachd exonuclease / polymerase. Às deidh adenylation ceann 3′ a’ phìos DNA, tha Adapter NEBNext le structar lùb hairpin ceangailte ris gus ullachadh airson hibridachadh. Airson taghadh de phìosan cDNA den fhaid as fheàrr leotha 150-200 bp. Chaidh bloighean leabharlainn a ghlanadh a’ cleachdadh siostam AMPure XP (Beckman Coulter, Beverly, USA). An uairsin, chaidh 3 μl de USER Enzyme (NEB, USA) le cDNA taghte a rèir meud ceangailte ri inneal-atharrachaidh a chleachdadh airson 15 mionaidean aig 37°C agus an uairsin airson 5 mionaidean aig 95°C mus deach PCR a dhèanamh. Chaidh PCR a dhèanamh an uairsin a’ cleachdadh polymerase DNA Phusion High-Fidelity, prìomhairean PCR uile-choitcheann, agus prìomhairean Index (X). Mu dheireadh, chaidh toraidhean PCR a ghlanadh (siostam AMPure XP) agus chaidh càileachd na leabharlainn a mheasadh air siostam Agilent Bioanalyzer 2100. Chaidh an leabharlann cDNA an uairsin a shreathachadh a’ cleachdadh sreathadair Novaseq. Chaidh faidhlichean ìomhaigh amh bho Illumina a thionndadh gu leughaidhean amh a’ cleachdadh CASAVA Base Calling. Tha dàta amh air a stòradh ann am faidhlichean cruth FASTQ(fq) anns a bheil sreathan leughaidh agus feartan bunaiteach co-fhreagarrach. Tagh HISAT2 gus leughaidhean sreathachaidh sìolaichte a mhaidseadh ris a’ ghineam fiosrachaidh Sscrofa11.1. San fharsaingeachd, tha HISAT2 a’ toirt taic do ghinean de mheud sam bith, a’ gabhail a-steach ginean nas motha na 4 billean bonn, agus tha luachan bunaiteach air an suidheachadh airson a’ mhòr-chuid de pharaimeatairean. Faodar leughaidhean splicing bho dhàta RNA Seq a cho-thaobhadh gu h-èifeachdach le bhith a’ cleachdadh HISAT2, an siostam as luaithe a tha ri fhaighinn an-dràsta, leis an aon chruinneas no nas fheàrr na dòigh sam bith eile.
Tha pailteas nan tar-sgrìobhaidhean a’ nochdadh gu dìreach ìre gnìomhachd gine. Tha ìrean gnìomhachd gine air am measadh a rèir pailteas nan tar-sgrìobhaidhean (cunntadh sreath) co-cheangailte ris a’ ghìom no na h-exons. Tha an àireamh de leughaidhean co-rèireach ri ìrean gnìomhachd gine, fad a’ ghine, agus doimhneachd sreath. Chaidh FPKM (bloighean gach mìle paidhir bonn de thar-sgrìobhadh air an sreath gach millean paidhir bonn) obrachadh a-mach agus chaidh luachan-P an eadar-dhealachaidh gnìomhachd a dhearbhadh a’ cleachdadh am pasgan DESeq2. An uairsin rinn sinn obrachadh a-mach an ìre lorg meallta (FDR) airson gach luach P a’ cleachdadh dòigh Benjamini-Hochberg9 stèidhichte air an gnìomh-R togte “p.adjust”.
Chaidh RNA a chaidh a sgaradh bho earrannan cridhe a thionndadh gu cDNA aig dùmhlachd de 200 ng/μl a’ cleachdadh measgachadh SuperScript IV Vilo Master bho Thermo (Thermo, àir. cat. 11756050). Chaidh RT-PCR cainneachdail a dhèanamh a’ cleachdadh plàta ath-bhualadh follaiseach 384-tobar Applied Biosystems Endura Plate Microamp (Thermo, àir. cat. 4483319) agus glaodh optigeach microamp (Thermo, àir. cat. 4311971). Bha am measgachadh ath-bhualadh air a dhèanamh suas de 5 µl de mheasgachadh Taqman Fast Advanced Master (Thermo, àir. cat. 4444557), 0.5 µl Taqman Primer agus 3.5 µl de H2O measgaichte gach tobar. Chaidh cearcallan qPCR àbhaisteach a ruith agus chaidh luachan CT a thomhas a’ cleachdadh inneal PCR fìor-ùine Quantstudio 5 bho Applied Biosystems (modúl 384-tobar; àir. toraidh A28135). Chaidh prìmearan Taqman a cheannach bho Thermo (GAPDH (Ss03375629_u1), PARP12 (Ss06908795_m1), PKDCC (Ss06903874_m1), CYGB (Ss06900188_m1), RGL1 (Ss06868890_m1), ACTN1 (Ss01009508_mH), GATA4 (Ss03383805_u1), GJA1 (Ss03374839_u1), COL1A2 (Ss03375009_u1), COL3A1 (Ss04323794_m1), ACTA2 (Ss04245588_m1). Chaidh luachan CT nan sampallan uile a dhèanamh àbhaisteach a rèir a’ ghine gleidhidh-taighe GAPDH.
Chaidh measadh a dhèanamh air mar a chaidh NT-ProBNP fhoillseachadh sna meadhanan le bhith a’ cleachdadh an inneal NT-ProBNP (muc) (Àir. Cat. MBS2086979, MyBioSource) a rèir protocol an neach-dèanamh. Gu h-aithghearr, chaidh 250 µl de gach sampall agus inbhe a chur ann an dùblachadh ri gach tobar. Dìreach às dèidh an sampall a chur ris, cuir 50 µl de Ath-bhualadair Deuchainn A ri gach tobar. Crith am plàta gu socair agus dùin le sealant. An uairsin chaidh na clàran a ghoir aig 37°C airson 1 uair a thìde. An uairsin tarraing an fhuasgladh a-mach agus nigh na tobraichean 4 tursan le 350 µl de fhuasgladh nighe 1X, a’ goir an fhuasgladh nighe airson 1-2 mionaidean gach uair. An uairsin cuir 100 µl de Ath-bhualadair Deuchainn B ris gach tobar agus dùin le sealant plàta. Chaidh an clàr a chrathadh gu socair agus a ghoir aig 37°C airson 30 mionaid. Tarraing an fhuasgladh a-mach agus nigh na tobraichean 5 tursan le 350 µl de fhuasgladh nighe 1X. Cuir 90 µl de fhuasgladh fo-strat ri gach tobar agus seulaich am plàta. Goir am plàta aig 37°C airson 10-20 mionaid. Cuir 50 µl de fhuasgladh stad ri gach tobar. Chaidh am plàta a thomhas sa bhad le bhith a’ cleachdadh leughadair plàta Cytation (BioTek) a chaidh a shuidheachadh aig 450 nm.
Chaidh mion-sgrùdaidhean cumhachd a dhèanamh gus na meudan buidhne a thaghadh a bheir seachad cumhachd >80% gus atharrachadh iomlan 10% anns a’ pharamadair a lorg le ìre mearachd Seòrsa I de 5%. Chaidh mion-sgrùdaidhean cumhachd a dhèanamh gus na meudan buidhne a thaghadh a bheir seachad cumhachd >80% gus atharrachadh iomlan 10% anns a’ pharamadair a lorg le ìre mearachd Seòrsa I de 5%. Анализ мощности был выполнен для выбора размеров групп, которые обеспечат >80% мощности для обинару1 1 абсолютного измения параметра с 5% частотой ошибок типа I. Chaidh mion-sgrùdadh cumhachd a dhèanamh gus meudan bhuidhnean a thaghadh a bheireadh seachad cumhachd >80% gus atharrachadh paramadair iomlan 10% a lorg le ìre mearachd Seòrsa I 5%.进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％I型错误率 的 组大小.进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％I型错误率 的 组大小. Был проведен анализ мощности для выбора размера размера группы, который обеспечил бы > 80% мощности для выбора размера группы, который обеспечил бы > 80% мощности нля ноля диля дони абсолютного изменения параметров agus 5% частоты ошибок типа I. Chaidh mion-sgrùdadh cumhachd a dhèanamh gus meud buidhne a thaghadh a bheireadh seachad cumhachd >80% gus atharrachadh paramadair iomlan 10% agus ìre mearachd seòrsa I 5% a lorg.Chaidh earrannan clò a thaghadh air thuaiream ron deuchainn. Bha a h-uile mion-sgrùdadh dall air an t-suidheachadh agus cha deach na sampallan a dhì-chòdachadh gus an deach a h-uile dàta a sgrùdadh. Chaidh bathar-bog GraphPad Prism (San Diego, CA) a chleachdadh gus a h-uile mion-sgrùdadh staitistigeil a dhèanamh. Airson a h-uile staitistig, chaidh luachan-p a mheas cudromach aig luachan <0.05. Airson a h-uile staitistig, chaidh luachan-p a mheas cudromach aig luachan <0.05. Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. Airson a h-uile staitistig, chaidh luachan-p a mheas cudromach aig luachan <0.05.对于所有统计数据，p值在值<0.05 时被认为是显着的。对于所有统计数据，p值在值<0.05 时被认为是显着的。 Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. Airson a h-uile staitistig, chaidh luachan-p a mheas cudromach aig luachan <0.05.Rinneadh deuchainn-t dà-earballach Oileanach air an dàta le dìreach 2 choimeas. Chaidh ANOVA aon-shligheach no dà-shligheach a chleachdadh gus cudromachd a dhearbhadh eadar grunn bhuidhnean. Nuair a bha deuchainnean iar-dheuchainn gan dèanamh, chaidh ceartachadh Tukey a chur an sàs gus cunntas a thoirt air grunn choimeasan. Tha beachdachaidhean staitistigeil sònraichte aig dàta RNAsec nuair a thathar a’ tomhas FDR agus p.adjust mar a tha air a mhìneachadh anns an earrann Modhan.
Airson tuilleadh fiosrachaidh mu dhealbhadh sgrùdaidh, faic geàrr-chunntas Aithisg Rannsachaidh Nàdair a tha ceangailte ris an artaigil seo.