نشكركم على زيارة موقع Nature.com. يُعاني متصفحكم من محدودية دعم CSS. للحصول على أفضل تجربة، نوصي باستخدام متصفح مُحدّث (أو تعطيل وضع التوافق في Internet Explorer). في هذه الأثناء، ولضمان استمرار الدعم، سنعرض الموقع بدون أنماط CSS وجافا سكريبت.
ثمة حاجة ماسة إلى نظام موثوق به في المختبر قادر على محاكاة البيئة الفيزيولوجية للقلب بدقة لاختبار الأدوية. وقد أدى محدودية أنظمة زراعة أنسجة القلب البشري المتاحة إلى تفسيرات غير دقيقة لتأثيرات أدوية القلب. في هذه الدراسة، طورنا نموذجًا لزراعة أنسجة القلب (CTCM) يحفز شرائح القلب كهربائيًا وميكانيكيًا، ويخضع لتمدد فيزيولوجي خلال مرحلتي الانقباض والانبساط من الدورة القلبية. بعد 12 يومًا من الزراعة، حسّن هذا النهج جزئيًا من حيوية مقاطع القلب، ولكنه لم يحافظ على سلامتها البنيوية بشكل كامل. لذلك، وبعد فحص الجزيئات الصغيرة، وجدنا أن إضافة 100 نانومول من ثلاثي يودوثيرونين (T3) و1 ميكرومول من ديكساميثازون (Dex) إلى وسط الزراعة حافظت على البنية المجهرية للمقاطع لمدة 12 يومًا. وبالتزامن مع معالجة T3/Dex، حافظ نظام CTCM على التعبير الجيني، والحيوية، والنشاط الأيضي، والسلامة البنيوية عند نفس مستوى أنسجة القلب الطازجة لمدة 12 يومًا. بالإضافة إلى ذلك، يُحفز التمدد المفرط لأنسجة القلب في المزارع الخلوية إشارات تضخم القلب، مما يُقدم دليلاً على قدرة تقنية CTCM على محاكاة حالات التضخم الناجمة عن تمدد القلب. وختاماً، تُتيح تقنية CTCM محاكاة وظائف القلب الفيزيولوجية والمرضية في المزارع الخلوية على مدى فترات طويلة، مما يُمكّن من إجراء فحص دوائي موثوق.
قبل إجراء البحوث السريرية، يلزم وجود أنظمة مخبرية موثوقة قادرة على محاكاة البيئة الفيزيولوجية للقلب البشري بدقة. ينبغي لهذه الأنظمة أن تحاكي التغيرات في التمدد الميكانيكي، ومعدل ضربات القلب، والخصائص الفيزيولوجية الكهربائية. تُستخدم النماذج الحيوانية عادةً كمنصة فحص لفيزيولوجيا القلب، إلا أنها محدودة الموثوقية في عكس تأثيرات الأدوية على القلب البشري^1،2. في نهاية المطاف، يُعدّ نموذج زراعة أنسجة القلب التجريبي المثالي (CTCM) نموذجًا عالي الحساسية والنوعية لمختلف التدخلات العلاجية والدوائية، حيث يُحاكي بدقة فيزيولوجيا وأمراض القلب البشري³. يُعيق غياب مثل هذا النظام اكتشاف علاجات جديدة لفشل القلب^4،5، وقد أدى إلى سمية الأدوية للقلب كسبب رئيسي لسحبها من السوق⁶.
خلال العقد الماضي، سُحبت ثمانية أدوية غير قلبية وعائية من الاستخدام السريري لتسببها في إطالة فترة QT، مما يؤدي إلى اضطرابات نظم القلب البطينية والموت المفاجئ.⁷ لذا، تزداد الحاجة إلى استراتيجيات فحص ما قبل السريرية موثوقة لتقييم فعالية الأدوية القلبية الوعائية وسميتها. يوفر الاستخدام الحديث للخلايا العضلية القلبية المشتقة من الخلايا الجذعية المحفزة متعددة القدرات البشرية (hiPS-CM) في فحص الأدوية واختبار سميتها حلاً جزئياً لهذه المشكلة. مع ذلك، يُعد عدم نضج خلايا hiPS-CM وافتقارها إلى التعقيد متعدد الخلايا في أنسجة القلب من أبرز عيوب هذه الطريقة. وقد أظهرت دراسات حديثة إمكانية التغلب جزئياً على هذا القيد باستخدام خلايا hiPS-CM في مراحلها المبكرة لتكوين هيدروجيلات أنسجة القلب بعد فترة وجيزة من بدء الانقباضات التلقائية، مع زيادة التحفيز الكهربائي تدريجياً بمرور الوقت. إلا أن هذه الأنسجة الدقيقة من خلايا hiPS-CM تفتقر إلى الخصائص الفيزيولوجية الكهربائية والتقلصية الناضجة لعضلة القلب البالغة. إضافةً إلى ذلك، يتميز نسيج القلب البشري ببنية أكثر تعقيدًا، إذ يتكون من مزيج غير متجانس من أنواع خلايا مختلفة، تشمل الخلايا البطانية والخلايا العصبية والخلايا الليفية السدوية، والمترابطة فيما بينها بواسطة مجموعات محددة من بروتينات المصفوفة خارج الخلوية. ويُعدّ هذا التباين في تجمعات الخلايا غير العضلية القلبية في قلب الثدييات البالغة عائقًا رئيسيًا أمام نمذجة نسيج القلب باستخدام أنواع الخلايا الفردية. وتؤكد هذه القيود الرئيسية على أهمية تطوير طرق لزراعة نسيج عضلة القلب السليم في ظل الظروف الفيزيولوجية والمرضية.
أثبتت المقاطع الرقيقة (300 ميكرومتر) من قلب الإنسان المزروع أنها نموذج واعد لعضلة القلب البشرية السليمة. تتيح هذه الطريقة الوصول إلى نظام ثلاثي الأبعاد متعدد الخلايا كامل يُحاكي نسيج قلب الإنسان. مع ذلك، وحتى عام 2019، كان استخدام مقاطع القلب المزروعة محدودًا بسبب قصر فترة بقاء الخلايا المزروعة (24 ساعة). ويعود ذلك إلى عدة عوامل، منها نقص التمدد الفيزيائي الميكانيكي، والسطح الفاصل بين الهواء والسائل، واستخدام أوساط بسيطة لا تُلبي احتياجات نسيج القلب. في عام 2019، أثبتت عدة مجموعات بحثية أن دمج العوامل الميكانيكية في أنظمة زراعة أنسجة القلب يُمكن أن يُطيل فترة الزراعة، ويُحسّن التعبير القلبي، ويُحاكي أمراض القلب. تُشير دراستان رائعتان (17 و18) إلى أن التحميل الميكانيكي أحادي المحور له تأثير إيجابي على النمط الظاهري القلبي أثناء الزراعة. مع ذلك، لم تستخدم هذه الدراسات التحميل الفيزيائي الميكانيكي الديناميكي ثلاثي الأبعاد لدورة القلب، إذ تم تحميل مقاطع القلب إما بقوى شد متساوية القياس¹⁷ أو بتحميل خطي متغير التوتر¹⁸. وقد أدت هذه الطرق لتمديد الأنسجة إلى تثبيط العديد من جينات القلب أو الإفراط في التعبير عن الجينات المرتبطة باستجابات التمدد غير الطبيعية. والجدير بالذكر أن بيتوليس وآخرون¹⁹ طوروا حوضًا ديناميكيًا لزراعة شرائح القلب لإعادة بناء دورة القلب باستخدام تغذية راجعة من محول القوة ومحركات الشد. ورغم أن هذا النظام يسمح بنمذجة أكثر دقة لدورة القلب في المختبر، إلا أن تعقيد الطريقة وانخفاض إنتاجيتها يحدان من تطبيقها. وقد طور مختبرنا مؤخرًا نظام زراعة مبسطًا باستخدام التحفيز الكهربائي ووسط مُحسَّن للحفاظ على حيوية مقاطع من أنسجة قلب الخنزير والإنسان لمدة تصل إلى 6 أيام^20،21.
في هذه الدراسة، نصف نموذجًا لزراعة أنسجة القلب (CTCM) باستخدام مقاطع من قلب الخنزير، يتضمن إشارات هرمونية لمحاكاة وظائف القلب ثلاثية الأبعاد والتمدد المرضي خلال دورة القلب. يمكن لهذا النموذج أن يزيد من دقة التنبؤات الدوائية قبل السريرية إلى مستوى غير مسبوق، وذلك بتوفير نظام قلبي فعال من حيث التكلفة ومتوسط ​​الإنتاجية، يحاكي وظائف القلب الطبيعية والمرضية لدى الثدييات، مما يُسهّل اختبار الأدوية قبل السريرية.
تلعب الإشارات الميكانيكية الديناميكية الدموية دورًا حاسمًا في الحفاظ على وظيفة خلايا عضلة القلب في المختبر 22،23،24. في هذه الدراسة، قمنا بتطوير جهاز محاكاة لنمو عضلة القلب (CTCM) (الشكل 1أ) يُحاكي بيئة القلب لدى البالغين من خلال تحفيز كلٍ من التحفيز الكهربائي والميكانيكي بترددات فسيولوجية (1.2 هرتز، 72 نبضة في الدقيقة). ولتجنب التمدد المفرط للأنسجة أثناء الانبساط، استُخدم جهاز طباعة ثلاثية الأبعاد لزيادة حجم الأنسجة بنسبة 25% (الشكل 1ب). تم ضبط توقيت التحفيز الكهربائي المُحفز بواسطة نظام C-PACE ليبدأ قبل 100 مللي ثانية من الانقباض باستخدام نظام جمع البيانات لإعادة إنتاج دورة القلب بالكامل. يستخدم نظام زراعة الأنسجة مُشغلًا هوائيًا قابلًا للبرمجة (LB Engineering، ألمانيا) لتوسيع غشاء سيليكون مرن بشكل دوري، مما يؤدي إلى تمدد شرائح القلب في الحجرة العلوية. تم توصيل النظام بخط هواء خارجي من خلال محول ضغط، مما جعل من الممكن ضبط الضغط بدقة (± 1 مم زئبق) والوقت (± 1 مللي ثانية) (الشكل 1 ج).
أ- قم بتثبيت قطعة النسيج على حلقة الدعم مقاس 7 مم، الموضحة باللون الأزرق، داخل حجرة الاستزراع بالجهاز. تفصل غشاء سيليكوني رقيق ومرن حجرة الاستزراع عن حجرة الهواء. ضع حشية بين كل حجرة لمنع التسرب. يحتوي غطاء الجهاز على أقطاب جرافيتية توفر التحفيز الكهربائي. ب- رسم تخطيطي لجهاز الأنسجة الكبير، وحلقة التوجيه، وحلقة الدعم. توضع قطع الأنسجة (باللون البني) على الجهاز كبير الحجم مع وضع حلقة التوجيه في الأخدود الموجود على الحافة الخارجية للجهاز. باستخدام حلقة التوجيه، ضع حلقة الدعم المغطاة بمادة لاصقة أكريليكية للأنسجة بعناية فوق قطعة نسيج القلب. ج- رسم بياني يوضح زمن التحفيز الكهربائي كدالة لضغط حجرة الهواء الذي يتم التحكم فيه بواسطة مشغل هوائي قابل للبرمجة (PPD). تم استخدام جهاز جمع البيانات لمزامنة التحفيز الكهربائي باستخدام مستشعرات الضغط. عندما يصل الضغط في حجرة الاستزراع إلى العتبة المحددة، يتم إرسال إشارة نبضية إلى C-PACE-EM لتشغيل التحفيز الكهربائي. د- صورة لأربعة أجهزة CTCM موضوعة على رف حاضنة. تتصل أربعة أجهزة بجهاز PPD واحد عبر دائرة هوائية، ويتم إدخال مستشعرات الضغط في صمام وقف النزيف لمراقبة الضغط في الدائرة الهوائية. يحتوي كل جهاز على ستة أقسام نسيجية.
باستخدام مشغل هوائي واحد، تمكّنا من التحكم في 4 أجهزة تصوير مقطعي محوسب (CTCM)، يستوعب كل منها 6 مقاطع نسيجية (الشكل 1د). في تقنية CTCM، يُحوّل ضغط الهواء في حجرة الهواء إلى ضغط متزامن في حجرة السائل، مما يُحفّز تمددًا فسيولوجيًا لشريحة القلب (الشكل 2أ والفيديو التكميلي 1). أظهر تقييم تمدد الأنسجة عند ضغط 80 مم زئبق تمددًا في المقاطع النسيجية بنسبة 25% (الشكل 2ب). وقد ثبت أن هذه النسبة المئوية للتمدد تُقابل طولًا فسيولوجيًا للقطعة العضلية يتراوح بين 2.2 و2.3 ميكرومتر لانقباض طبيعي لشريحة القلب^17،19،25. تم تقييم حركة الأنسجة باستخدام إعدادات كاميرا مُخصصة (الشكل التكميلي 1). تطابقت سعة وسرعة حركة الأنسجة (الشكل 2ج، د) مع التمدد خلال دورة القلب والوقت خلال الانقباض والانبساط (الشكل 2ب). ظلّ تمدد وسرعة نسيج القلب أثناء الانقباض والانبساط ثابتين لمدة 12 يومًا في المزرعة (الشكل 2f). ولتقييم تأثير التحفيز الكهربائي على الانقباضية أثناء المزرعة، طوّرنا طريقة لتحديد التشوه النشط باستخدام خوارزمية تظليل (الشكل التكميلي 2a، b)، وتمكّنا من التمييز بين التشوهات مع التحفيز الكهربائي وبدونه. في نفس مقطع القلب (الشكل 2f)، في المنطقة المتحركة من القطع (R6-9)، كان الجهد الكهربائي أثناء التحفيز الكهربائي أعلى بنسبة 20% منه في غياب التحفيز الكهربائي، مما يدل على مساهمة التحفيز الكهربائي في وظيفة الانقباض.
تؤكد الرسوم البيانية التمثيلية لضغط حجرة الهواء، وضغط حجرة السائل، وقياسات حركة الأنسجة، أن ضغط الحجرة يُغير ضغط حجرة السائل، مما يُسبب حركة مُقابلة لشريحة النسيج. ب- رسوم بيانية تمثيلية لنسبة التمدد (باللون الأزرق) لمقاطع الأنسجة المُقابلة لنسبة التمدد (باللون البرتقالي). ج- تتوافق الحركة المقاسة لشريحة القلب مع سرعة الحركة المقاسة. د- مسارات تمثيلية للحركة الدورية (الخط الأزرق) والسرعة (الخط البرتقالي المنقط) في شريحة من القلب. هـ- قياس كمي لزمن الدورة (عدد الشرائح = 19 شريحة لكل مجموعة، من خنازير مختلفة)، وزمن الانقباض (عدد الشرائح = 19 شريحة لكل مجموعة)، وزمن الاسترخاء (عدد الشرائح = 19 شريحة لكل مجموعة، من خنازير مختلفة)، وحركة الأنسجة (عدد الشرائح = 25). تم قياس سرعة الانقباض القصوى (عدد الشرائح = 24 (اليوم 0)، 25 (اليوم 12) شريحة/مجموعة من خنازير مختلفة) ومعدل الاسترخاء الأقصى (عدد الشرائح = 24 (اليوم 0)، 25 (اليوم 12) شريحة/مجموعة من خنازير مختلفة). أظهر اختبار t للطالب ذو الطرفين عدم وجود فرق معنوي في أي من المعايير. تُظهر الرسوم البيانية لتحليل الإجهاد في مقاطع الأنسجة مع (باللون الأحمر) وبدون (باللون الأزرق) تحفيزًا كهربائيًا، في عشر مناطق من مقاطع الأنسجة من نفس المقطع. تُظهر اللوحات السفلية قياس النسبة المئوية للاختلاف في الإجهاد في مقاطع الأنسجة مع وبدون تحفيز كهربائي في عشر مناطق من مقاطع مختلفة. (n = 8 شرائح/مجموعة من خنازير مختلفة، تم إجراء اختبار t للطالب ذي الذيلين؛ ****p < 0.0001، **p < 0.01، *p < 0.05). (n = 8 شرائح/مجموعة من خنازير مختلفة، تم إجراء اختبار t للطالب ذي الذيلين؛ ****p < 0.0001، **p < 0.01، *p < 0.05). (n = 8 срезов/гruппу от разных свиней, проводится двусторонний t-клитераий Стьюдента; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05). (n = 8 أقسام/مجموعة من خنازير مختلفة، اختبار t للطالب ذو الذيلين؛ ****p<0.0001، **p<0.01، *p<0.05). (n = 8 片/组، في حالة وجود إجابة على هذا السؤال، t 检验؛ ****p < 0.0001، **p < 0.01، *p < 0.05). (n = 8 片/组، في حالة وجود إجابة على هذا السؤال، t 检验؛ ****p < 0.0001، **p < 0.01، *p < 0.05). (n = 8 срезов/гruппу, от разных свиней, двусторонний кriteryй Стьюдента; ****p <0,0001, **p <0,01, *p <0,05). (n = 8 أقسام/مجموعة، من خنازير مختلفة، اختبار t للطالب ذو الذيلين؛ ****p<0.0001، **p<0.01، *p<0.05).تمثل أشرطة الخطأ المتوسط ​​± الانحراف المعياري.
في نظام زراعة شرائح القلب الحيوي الثابت السابق [20، 21]، حافظنا على حيوية ووظيفة وسلامة بنية شرائح القلب لمدة 6 أيام من خلال تطبيق التحفيز الكهربائي وتحسين تركيبة الوسط. مع ذلك، انخفضت هذه النسب بشكل حاد بعد 10 أيام. سنشير إلى المقاطع المزروعة في نظام الزراعة الحيوي الثابت السابق [20، 21] بظروف التحكم (Ctrl)، وسنستخدم وسطنا المُحسَّن سابقًا كظروف MC، وسنزرع تحت التحفيز الميكانيكي والكهربائي المتزامن (CTCM). أولًا، وجدنا أن التحفيز الميكانيكي وحده غير كافٍ للحفاظ على حيوية الأنسجة لمدة 6 أيام (الشكل التكميلي 3أ، ب). ومن المثير للاهتمام، أنه مع إدخال التحفيز الفيزيولوجي الميكانيكي والكهربائي باستخدام STCM، ظلت حيوية مقاطع القلب بعد 12 يومًا مماثلة لحيوية مقاطع القلب الطازجة في ظل ظروف MS، ولكن ليس في ظل ظروف Ctrl، كما هو موضح في تحليل MTT (الشكل 1). 3أ). يشير هذا إلى أن التحفيز الميكانيكي ومحاكاة دورة القلب يمكن أن يحافظا على حيوية مقاطع الأنسجة لمدة ضعف المدة المذكورة في نظام الاستزراع الثابت السابق. مع ذلك، أظهر تقييم السلامة البنيوية لمقاطع الأنسجة باستخدام التلوين المناعي للتروبونين T القلبي والكونيكسين 43 أن تعبير الكونيكسين 43 كان أعلى بشكل ملحوظ في أنسجة MC في اليوم الثاني عشر مقارنةً بالعينات الضابطة في اليوم نفسه. ومع ذلك، لم يتم الحفاظ على التعبير المنتظم للكونيكسين 43 وتكوين القرص Z بشكل كامل (الشكل 3ب). نستخدم إطار عمل للذكاء الاصطناعي (AI) لقياس السلامة البنيوية للأنسجة،²⁶ وهو عبارة عن مسار تعلم عميق قائم على الصور يعتمد على تلوين التروبونين T والكونيكسين،⁴³ لقياس السلامة البنيوية والتألق لشرائح القلب تلقائيًا من حيث قوة التموضع. تستخدم هذه الطريقة شبكة عصبية التفافية (CNN) وإطار عمل للتعلم العميق لقياس السلامة البنيوية لأنسجة القلب بشكل موثوق وآلي وغير متحيز، كما هو موضح في المرجع. ٢٦. أظهر نسيج MC تشابهًا بنيويًا مُحسَّنًا مع اليوم صفر مقارنةً بمقاطع التحكم الثابتة. بالإضافة إلى ذلك، كشف تلوين ماسون ثلاثي الألوان عن نسبة تليف أقل بكثير في ظل ظروف MS مقارنةً بظروف التحكم في اليوم ١٢ من الزراعة (الشكل ٣ج). في حين أن CTCM زاد من حيوية مقاطع نسيج القلب في اليوم ١٢ إلى مستوى مماثل لنسيج القلب الطازج، إلا أنه لم يُحسِّن بشكل ملحوظ السلامة البنيوية لمقاطع القلب.
يوضح الرسم البياني الشريطي قياس قابلية بقاء شرائح القلب الطازجة (D0) أو شرائح القلب المزروعة لمدة 12 يومًا إما في مزرعة ثابتة (D12 Ctrl) أو في CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0)، 15 (D12 Ctrl)، 12 (D12 MC) شريحة/مجموعة من خنازير مختلفة، تم إجراء اختبار ANOVA أحادي الاتجاه؛ ####p < 0.0001 مقارنة بـ D0 و **p < 0.01 مقارنة بـ D12 Ctrl). يوضح الرسم البياني الشريطي قياس قابلية بقاء شرائح القلب الطازجة (D0) أو شرائح القلب المزروعة لمدة 12 يومًا إما في مزرعة ثابتة (D12 Ctrl) أو في CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0)، 15 (D12 Ctrl)، 12 (D12 MC) شريحة/مجموعة من خنازير مختلفة، تم إجراء اختبار ANOVA أحادي الاتجاه؛ ####p < 0.0001 مقارنة بـ D0 و **p < 0.01 مقارنة بـ D12 Ctrl).يوضح الرسم البياني كمية حيوية مقاطع القلب الطازجة MTT (D0) أو زراعة مقاطع القلب لمدة 12 يومًا إما في مزرعة ثابتة (D12 control) أو CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0)، 15 (D12 control). ) )، 12 (D12 MC) مقطعًا / مجموعة من خنازير مختلفة، يتم إجراء اختبار ANOVA أحادي الاتجاه؛####p < 0,0001 по сравнению с D0 и **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p < 0.0001 مقارنةً بـ D0 و **p < 0.01 مقارنةً بـ D12 Ctrl). أ مفتاح التحكم (D12 Ctrl) أو CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0)، 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切片(D0) تم اختباره على أساس 12 لونًا من MTT، و12 لونًا (D12 MC) من ANOVA测试؛ 与D0 相比، ####p < 0.0001، إلى D12 Ctrl 相比، **p <0.01) . أ مفتاح التحكم (D12 Ctrl) أو CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0)، 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切片(D0) ، قم باستبدال رقم 12 (D12 MC) باستخدام / 组، قم باستبدال ANOVA ；与D0 相比، ####p < 0.0001، 与D12 Ctrl 相比، **p.)رسم بياني يوضح كمية حيوية MTT في مقاطع القلب الطازجة (D0) أو مقاطع القلب التي تمت زراعتها لمدة 12 يومًا في مزرعة ثابتة (D12 control) أو CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0)، 15 (D12 control))، 12 (D12 MC) مقطعًا / مجموعة من خنازير مختلفة، اختبار ANOVA أحادي الاتجاه؛####p < 0,0001 по сравнению с D0, **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p < 0.0001 مقارنةً بـ D0، **p < 0.01 مقارنةً بـ D12 Ctrl).ب- تروبونين-تي (أخضر)، كونيكسين 43 (أحمر) وDAPI (أزرق) في مقاطع القلب المعزولة حديثًا (D0) أو مقاطع القلب المزروعة في ظل ظروف ثابتة (Ctrl) أو ظروف CTCM (MC) لمدة 12 يومًا) لصور التألق المناعي التمثيلية (مقياس فارغ = 100 ميكرومتر). تم إجراء اختبار ANOVA أحادي الاتجاه باستخدام الذكاء الاصطناعي لتقييم السلامة الهيكلية لأنسجة القلب (n = 7 (D0)، 7 (D12 Ctrl)، 5 (D12 MC) شريحة/مجموعة لكل منها من خنزير مختلف؛ ####p < 0.0001 مقارنة بـ D0 و ****p < 0.0001 مقارنة بـ D12 Ctrl). تم إجراء قياس الذكاء الاصطناعي لسلامة بنية أنسجة القلب (n = 7 (D0)، 7 (D12 Ctrl)، 5 (D12 MC) شرائح/مجموعة لكل منها من خنازير مختلفة، وتم إجراء اختبار ANOVA أحادي الاتجاه؛ ####p < 0.0001 مقارنة بـ D0 و ****p < 0.0001 مقارنة بـ D12 Ctrl). تتميز البنية الهيكلية الشاملة بذكاء متقن (n = 7 (D0)، 7 (D12 Ctrl)، 5 (D12 MC) من مسافة/مجموعة اختلافات مختلفة، اختبار اختبار ANOVA ####p < 0,0001 по сравнению с D0 و ****p < 0,0001 по сравнению с; (D12 Ctrl). قياس السلامة الهيكلية لأنسجة القلب بواسطة الذكاء الاصطناعي (ن = 7 (D0)، 7 (D12 Ctrl)، 5 (D12 MC) مقاطع/مجموعات من خنازير مختلفة، تم إجراء اختبار ANOVA أحادي الاتجاه؛ ####p < 0.0001 مقابل D0 و ****p < 0.0001 مقارنة بـ D12 Ctrl).人工智能量化心脏组织结构完整性(n = 7 (D0)، 7 (D12 Ctrl)، 5 (D12 MC) شرائح/مجموعة لكل من الخنازير المختلفة، اختبار ANOVA أحادي الاتجاه؛####p <0.0001 与D0相比،****p <0.0001 与D12 Ctrl 相比).人工智能量化心脏组织结构完整性(n = 7 (D0)، 7 (D12 Ctrl)، 5 (D12 MC) شرائح/مجموعة لكل من الخنازير المختلفة، اختبار ANOVA أحادي الاتجاه؛####p <0.0001与D0相比، ****p <0.0001 与D12 Ctrl 相比). الذكاء المتقن لتجميع النقاط الهيكلية ذات الصلة المتبادلة (n = 7 (D0)، 7 (D12 Ctrl)، 5 (D12 MC) المجموعة/المجموعة كل شيء من مختلف الألوان، اختبار متماثل ANOVA ####p <0,0001 vs. D0 Для сравнения ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). الذكاء الاصطناعي لتحديد السلامة الهيكلية لأنسجة القلب (ن = 7 (D0)، 7 (D12 Ctrl)، 5 (D12 MC) مقاطع/مجموعة لكل خنزير مختلف، اختبار ANOVA أحادي الاتجاه؛ ####p<0.0001 مقابل D0 للمقارنة ****p < 0.0001 مقارنة بـ D12 Ctrl). ج- صور تمثيلية (يسار) وقياس كمي (يمين) لشرائح القلب المصبوغة بصبغة ماسون ثلاثية الألوان (مقياس الرسم = 500 ميكرومتر) (عدد الشرائح = 10 شرائح/مجموعة لكل منها من خنزير مختلف، تم إجراء اختبار ANOVA أحادي الاتجاه؛ ####p < 0.0001 مقارنة بـ D0 و ***p < 0.001 مقارنة بـ D12 Ctrl). ج- صور تمثيلية (يسار) وقياس كمي (يمين) لشرائح القلب المصبوغة بصبغة ماسون ثلاثية الألوان (مقياس الرسم = 500 ميكرومتر) (عدد الشرائح = 10 شرائح/مجموعة لكل منها من خنازير مختلفة، تم إجراء اختبار ANOVA أحادي الاتجاه؛ #### p < 0.0001 مقارنة بـ D0 و ***p < 0.001 مقارنة بـ D12 Ctrl). c التصوير التمثيلي (الشرفة) والنقاط المجمعة (الحقيقية) على الجانب الآخر من ماسونا الثلاثي الأبعاد المزخرف (الماسون) بدون تغطية = 500 متر) (العدد = 10 مجموعات/مجموعة من خيول مختلفة، يتم استخدام مفردة اختبار أنوفا. #### p < 0,0001 по сравнению с D0 и ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). ج- صور تمثيلية (يسار) وقياس كمي (يمين) لمقاطع القلب المصبوغة بصبغة ماسون ثلاثية الألوان (مقياس غير مطلي = 500 ميكرومتر) (عدد المقاطع = 10 مقاطع/مجموعة من خنازير مختلفة، تم إجراء اختبار ANOVA أحادي الاتجاه؛ #### p < 0.0001 مقارنة بـ D0 و ***p < 0.001 مقارنة بـ D12 Ctrl). ج ماسون ماسون لديه القدرة على تحديد حجم الصفائح المعدنية (左) و 和量化 (右) (الحجم = 500 ميكرومتر) (ن = 10)个切片/组، 组来自不同的猪، 进行单向ANOVA 测试；#### p <0.0001 与D0 相比،***p <0.001 与D12 Ctrl 相比). C 用 ماسون 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 (左 左) 量化 (右) 裸尺度 裸尺度 裸尺度 裸尺度= 500 ميكرومتر) (ن = 10 ميكرومترات في المتر المربع في المتر المربع في المتر المربع في أنوفا 测试；#### p <0.0001 في D0 相比،***p <0.001 与D12 Ctrl 相比). ج التصوير التمثيلي (العلوي) والتحليل الجماعي (الصحيح) على طول الجزء العلوي من ثلاثية ماسونا (الشفاف) نطاق = 500 متر) (ن = 10 مجموعات/مجموعات، من سفن أخرى، متظاهرة مع تعزيز однофактолного диспронного анлиза ;### #p < 0,0001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). ج- صور تمثيلية (يسار) وقياس كمي (يمين) لمقاطع القلب المصبوغة بصبغة ماسون ثلاثية الألوان (الخلفية = 500 ميكرومتر) (عدد المقاطع = 10 مقاطع/مجموعة، كل منها من خنزير مختلف، تم اختبارها بواسطة تحليل التباين أحادي الاتجاه؛### # p < 0.0001 مقارنة بـ D0، ***p < 0.001 مقارنة بـ D12 Ctrl).تمثل أشرطة الخطأ المتوسط ​​± الانحراف المعياري.
افترضنا أن إضافة جزيئات صغيرة إلى وسط الاستنبات قد تُحسّن سلامة خلايا عضلة القلب وتقلل من تطور التليف أثناء استنبات خلايا عضلة القلب المشتقة من الخلايا الجذعية المحفزة متعددة القدرات (CTCM). ولذلك، أجرينا فحصًا للجزيئات الصغيرة باستخدام مزارع التحكم الثابتة لدينا^20،21 نظرًا لقلة العوامل المؤثرة. وقع اختيارنا على ديكساميثازون (Dex) وثلاثي يودوثيرونين (T3) وSB431542 (SB) لهذا الفحص. وقد استُخدمت هذه الجزيئات الصغيرة سابقًا في استنبات خلايا عضلة القلب المشتقة من الخلايا الجذعية المحفزة متعددة القدرات (hiPSC-CM) لتحفيز نضج خلايا عضلة القلب عن طريق زيادة طول الساركومير والأنابيب المستعرضة وسرعة التوصيل. إضافةً إلى ذلك، من المعروف أن كلاً من ديكساميثازون (وهو غلوكوكورتيكويد) وSB431542 يثبطان الالتهاب^29،30. لذلك، اختبرنا ما إذا كانت إضافة جزيء واحد أو مزيج من هذه الجزيئات الصغيرة ستُحسّن السلامة الهيكلية لقطاعات القلب. لأغراض الفحص الأولي، تم اختيار جرعة كل مركب بناءً على التركيزات الشائعة الاستخدام في نماذج زراعة الخلايا (1 ميكرومول من Dex27، و100 نانومول من T327، و2.5 ميكرومول من SB31). بعد 12 يومًا من الزراعة، أدى الجمع بين T3 وDex إلى سلامة هيكلية مثالية لخلايا عضلة القلب وأقل قدر من إعادة تشكيل الأنسجة الليفية (الشكلان التكميليان 4 و5). بالإضافة إلى ذلك، أدى استخدام ضعف هذه التركيزات من T3 وDex إلى آثار ضارة مقارنةً بالتركيزات الطبيعية (الشكلان التكميليان 6أ و6ب).
بعد الفحص الأولي، أجرينا مقارنة مباشرة بين أربع ظروف زراعة (الشكل 4أ): المجموعة الضابطة (Ctrl): مقاطع قلبية مزروعة في وسط زراعة ثابت سبق وصفه باستخدام وسطنا الأمثل؛ المجموعة المعالجة بـ T3 (TD): مقاطع قلبية مزروعة في وسط زراعة ثابت (CTCM) مع إضافة ديكساميثازون (Dex) يوم الأربعاء؛ المجموعة المعالجة بـ MC: مقاطع قلبية مزروعة في وسط زراعة ثابت (CTCM) باستخدام وسطنا الأمثل سابقًا؛ والمجموعة المعالجة بـ MT: وسط زراعة ثابت (CTCM) مع إضافة T3 وDex. بعد 12 يومًا من الزراعة، ظلت حيوية أنسجة MS وMT مماثلة للأنسجة الطازجة، وذلك وفقًا لاختبار MTT (الشكل 4ب). ومن المثير للاهتمام أن إضافة T3 وDex إلى مزارع Transwell (TD) لم تُسفر عن تحسن ملحوظ في الحيوية مقارنةً بظروف المجموعة الضابطة (Ctrl)، مما يشير إلى دور مهم للتحفيز الميكانيكي في الحفاظ على حيوية مقاطع القلب.
مخطط تصميم تجريبي يوضح ظروف الاستزراع الأربعة المستخدمة لتقييم تأثيرات التحفيز الميكانيكي ومكملات T3/Dex على الوسط لمدة 12 يومًا. ب- يوضح الرسم البياني الشريطي قياس حيوية الخلايا بعد 12 يومًا من الزراعة في جميع ظروف الزراعة الأربعة (Ctrl، TD، MC، وMT) مقارنة بشرائح القلب الطازجة (D0) (n = 18 (D0)، 15 (D12 Ctrl، D12 TD وD12 MT)، 12 (D12 MC) شريحة/مجموعة من خنازير مختلفة، تم إجراء اختبار ANOVA أحادي الاتجاه؛ ####p < 0.0001، ###p < 0.001 مقارنة بـ D0 و**p < 0.01 مقارنة بـ D12 Ctrl). ب- يوضح الرسم البياني الشريطي قياس حيوية الخلايا بعد 12 يومًا من الزراعة في جميع ظروف الزراعة الأربعة (Ctrl، TD، MC، وMT) مقارنة بشرائح القلب الطازجة (D0) (n = 18 (D0)، 15 (D12 Ctrl، D12 TD وD12 MT)، 12 (D12 MC) شريحة/مجموعة من خنازير مختلفة، تم إجراء اختبار ANOVA أحادي الاتجاه؛ ####p < 0.0001، ###p < 0.001 مقارنة بـ D0 و**p < 0.01 مقارنة بـ D12 ctrl). ب يُظهر السجل القيمة الجماعية للثروة خلال 12 يومًا من الثقافة في جميع الخدمات الأربع الزراعة (التحكم، TD، MC وMT) من خلال سلاسل من الخيوط (D0) (n = 18 (D0)، 15 (D12 Ctrl، D12 TD وD12 MT)، 12 (D12 MC) مجموعة/مجموعة من خيول مختلفة، توفر اختبار ANOVA التفردي؛ ####p < 0,0001, ###p < 0,001 по сравнению с D0 и **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ب- يوضح الرسم البياني الشريطي كمية الحيوية بعد 12 يومًا من الزراعة في جميع ظروف الزراعة الأربعة (التحكم، TD، MC، وMT) مقارنة بمقاطع القلب الطازجة (D0) (n = 18 (D0)، 15 (D12 Ctrl، D12 TD، وD12 MT)، 12 (D12 MC) مقطع/مجموعة من خنازير مختلفة، اختبار ANOVA أحادي الاتجاه؛ ####p < 0.0001، ###p < 0.001 مقابل D0 و**p < 0.01 مقارنة بـ D12 Ctrl). b قم باختيار 4 种培养条件(Ctrl، TD، MC وMT) من أجل تحديد (D0) (n = 18 (D0)، 15 (D12 Ctrl، D12 TD وD12 MT)، تحليل 12 (D12 MC) تحليل / تحليل، تحليل تحليل ANOVA؛ ####p < 0.0001، ###p < 0.001 与D0 相比، **p < 0.01 与D12 控制).ب 4 12 (D12 MC) ب السجل، يسلط الضوء على جميع 4 أنواع من الزراعة (التحكم، TD، MC وMT) من خلال سلاسل التوريد العالمية (D0) (n = 18 (D0)، 15 (D12 Ctrl، D12 TD وD12 MT)، من مختلف الأسلاك 12 (D12 MC) مجموعات/مجموعة، اختبار خاص ANOVA ####p <0,0001, ###p <0,001 على сравнению مع D0, **p <0,01 على сравнению مع التحكم D12). ب- رسم بياني يوضح جميع ظروف الاستزراع الأربعة (التحكم، TD، MC وMT) مقارنة بمقاطع القلب الطازجة (D0) (n = 18 (D0)، 15 (D12 Ctrl، D12 TD وD12 MT)، من خنازير مختلفة 12 (D12 MC) مقطع/مجموعة، اختبار ANOVA أحادي الاتجاه؛ ####p<0.0001، ###p<0.001 مقابل D0، **p<0.01 مقابل التحكم D12). ج- يوضح الرسم البياني الشريطي كمية تدفق الجلوكوز بعد 12 يومًا من الزراعة في جميع ظروف الزراعة الأربعة (Ctrl، TD، MC، وMT) مقارنة بشرائح القلب الطازجة (D0) (n = 6 شرائح/مجموعة من خنازير مختلفة، تم إجراء اختبار ANOVA أحادي الاتجاه؛ ###p < 0.001، مقارنة بـ D0 و ***p < 0.001 مقارنة بـ D12 Ctrl). ج- يوضح الرسم البياني الشريطي كمية تدفق الجلوكوز بعد 12 يومًا من الزراعة في جميع ظروف الزراعة الأربعة (Ctrl، TD، MC، وMT) مقارنة بشرائح القلب الطازجة (D0) (n = 6 شرائح/مجموعة من خنازير مختلفة، تم إجراء اختبار ANOVA أحادي الاتجاه؛ ###p < 0.001، مقارنة بـ D0 و ***p < 0.001 مقارنة بـ D12 Ctrl). c يُظهر السجل انخفاضًا جماعيًا في نسبة الجلوكوز خلال 12 يومًا بعد الزراعة في جميع الخدمات الأربع تربية (التحكم، TD، MC وMT) من خلال تداخل سلسلة من الخيوط (D0) (ن = 6 مجموعات/مجموعة من مختلف الأنواع) يتم اختبار الخنازير الفردية بواسطة اختبار ANOVA ؛ ###p < 0,001 по сравнению с D0 и ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). ج- يوضح الرسم البياني كمية تدفق الجلوكوز بعد 12 يومًا من الزراعة في جميع ظروف الزراعة الأربعة (التحكم، TD، MC وMT) مقارنة بمقاطع القلب الطازجة (D0) (n = 6 مقاطع/مجموعة من خنازير مختلفة، تم إجراء اختبار ANOVA أحادي الاتجاه؛ ###p < 0.001 مقارنة بـ D0 و ***p < 0.001 مقارنة بـ D12 Ctrl). c 条形图显示所有4 种培养条件(Ctrl، TD، MC وMT) قم بإلغاء تحديد (D0) 相比، 培养后12 تحليل التباين (n = 6 片/组، 不同猪، 单向执行ANOVA 测试؛ ###p < 0.001، 与D0 相比، ***p < 0.001与D12 السيطرة 相比). C تم تصميمه بواسطة 4 种 条件 （(ctrl , td , mc وmt) تم تصميمه من خلال الصور الملتقطة بواسطة 相比، 培养 后 后12 天 的 通量 定量 (n = 6 片 / 组 , 猪 , , , , , , , 猪单向执ANOVA) 测试؛ ###p < 0.001، 与D0 相比، ***p < 0.001 与D12 Ctrl 相比). ج السجل الذي يوضح مجموع نقاط الجلوكوز خلال 12 يومًا من الزراعة لجميع 4 أجيال تربية (التحكم، TD، MC وMT) من خلال سلاسل من الخيوط (D0) (ن = 6 مجموعات/مجموعة، من تم اختبار اختبارات ANOVA لخيوط مختلفة ومتميزة؛ ###p < 0,001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению с D12 (التحكم). ج- رسم بياني يوضح كمية تدفق الجلوكوز في اليوم 12 بعد الزراعة لجميع ظروف الزراعة الأربعة (التحكم، TD، MC، وMT) مقارنة بمقاطع القلب الطازجة (D0) (n = 6 مقاطع/مجموعة، من خنازير مختلفة، أحادي الجانب). تم إجراء اختبارات ANOVA، ###p < 0.001 مقارنة بـ D0، ***p < 0.001 مقارنة بـ D12 (التحكم).د- مخططات تحليل الإجهاد لأنسجة طازجة (أزرق)، وأنسجة في اليوم 12 من الزرع الميكانيكي (أخضر)، وأنسجة في اليوم 12 من الزرع الميكانيكي (أحمر) عند عشر نقاط مقطعية إقليمية (ن = 4 شرائح/مجموعة، اختبار تحليل التباين أحادي الاتجاه؛ لم يكن هناك فرق معنوي بين المجموعات). هـ- مخطط بركاني يوضح الجينات المُعبَّر عنها بشكل مختلف في مقاطع القلب الطازجة (اليوم 0) مقارنةً بمقاطع القلب المزروعة في ظروف ثابتة (Ctrl) أو في ظروف الزرع الميكانيكي (MT) لمدة 10-12 يومًا. و- خريطة حرارية لجينات الساركومير لمقاطع القلب المزروعة في كل من ظروف الزرع. تمثل أشرطة الخطأ المتوسط ​​± الانحراف المعياري.
يُعدّ الاعتماد الأيضي على التحوّل من أكسدة الأحماض الدهنية إلى تحلل الجلوكوز سمةً مميزةً لتراجع تمايز خلايا عضلة القلب. تستخدم خلايا عضلة القلب غير الناضجة الجلوكوز بشكل أساسي لإنتاج الأدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP)، وتتميز بوجود ميتوكوندريا ناقصة التنسج ذات عدد قليل من الأعراف^5,32. أظهرت تحليلات استهلاك الجلوكوز أنه في ظل ظروف MC وMT، كان استهلاك الجلوكوز مماثلاً لاستهلاكه في أنسجة اليوم صفر (الشكل 4ج). مع ذلك، أظهرت عينات التحكم (Ctrl) زيادةً ملحوظةً في استهلاك الجلوكوز مقارنةً بالأنسجة الطازجة. يشير هذا إلى أن الجمع بين CTCM وT3/Dex يُحسّن من حيوية الأنسجة ويحافظ على النمط الظاهري الأيضي لقطاعات القلب المزروعة لمدة 12 يومًا. بالإضافة إلى ذلك، أظهر تحليل السلالة أن مستويات السلالة ظلت كما هي في أنسجة القلب الطازجة لمدة 12 يومًا في ظل ظروف MT وMS (الشكل 4د).
لتحليل التأثير الكلي لوسط زراعة الخلايا المتحكم به (CTCM) وهرمون T3/Dex على التعبير الجيني الشامل لشرائح أنسجة القلب، أجرينا تسلسل الحمض النووي الريبوزي (RNAseq) على شرائح القلب من جميع ظروف الزراعة الأربعة المختلفة (البيانات التكميلية 1). ومن المثير للاهتمام أن مقاطع MT أظهرت تشابهًا كبيرًا في التعبير الجيني مع أنسجة القلب الطازجة، حيث لم يُظهر سوى 16 جينًا مختلفًا من أصل 13642 جينًا. ومع ذلك، وكما أوضحنا سابقًا، أظهرت شرائح Ctrl 1229 جينًا مختلفًا بعد 10-12 يومًا من الزراعة (الشكل 4هـ). وقد تم تأكيد هذه البيانات بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الحقيقي (qRT-PCR) لجينات القلب والخلايا الليفية (الشكل التكميلي 7أ-ج). ومن المثير للاهتمام أيضًا أن مقاطع Ctrl أظهرت انخفاضًا في التعبير عن جينات القلب وجينات دورة الخلية، وتنشيطًا لبرامج الجينات الالتهابية. تشير هذه البيانات إلى أن فقدان التمايز، الذي يحدث عادةً بعد الزراعة طويلة الأمد، يتلاشى تمامًا في ظل ظروف MT (الشكل التكميلي 8أ، ب). أظهرت دراسة دقيقة لجينات الساركومير أنه في ظل ظروف التحفيز الميكانيكي فقط، تُحفظ الجينات المشفرة للساركومير (الشكل 4f) وقناة الأيونات (الشكل التكميلي 9)، مما يحميها من التثبيط في ظل ظروف التحكم، والتحفيز الحراري، والتحفيز المغناطيسي. تُبين هذه البيانات أنه مع الجمع بين التحفيز الميكانيكي والهرموني (T3/Dex)، يمكن أن يظل النسخ الجيني لشريحة القلب مشابهًا لشرائح القلب الطازجة بعد 12 يومًا من الزراعة.
تؤكد هذه النتائج الجينية حقيقة أن السلامة البنيوية لخلايا عضلة القلب في مقاطع القلب تُحفظ على أفضل وجه في ظل ظروف التحفيز الميكانيكي لمدة 12 يومًا، كما يتضح من وجود الكونكسين 43 سليمًا وموضعيًا (الشكل 5أ). إضافةً إلى ذلك، انخفض التليف في مقاطع القلب في ظل ظروف التحفيز الميكانيكي بشكل ملحوظ مقارنةً بالمجموعة الضابطة، وكان مشابهًا لمقاطع القلب الطازجة (الشكل 5ب). تُظهر هذه البيانات أن الجمع بين التحفيز الميكانيكي ومعالجة T3/Dex يحافظ بفعالية على بنية القلب في مقاطع القلب المزروعة.
أ- صور تمثيلية للتألق المناعي للتروبونين-T (أخضر)، والكونيكسين 43 (أحمر)، وDAPI (أزرق) في مقاطع القلب المعزولة حديثًا (D0) أو المزروعة لمدة 12 يومًا في جميع ظروف زراعة مقاطع القلب الأربعة (مقياس الرسم = 100 ميكرومتر). تم إجراء اختبار ANOVA أحادي الاتجاه باستخدام الذكاء الاصطناعي لتقييم السلامة الهيكلية لأنسجة القلب (n = 7 (D0 و D12 Ctrl)، 5 (D12 TD، D12 MC و D12 MT) شرائح/مجموعة من خنازير مختلفة؛ ####p < 0.0001 مقارنة بـ D0 و *p < 0.05، أو ****p < 0.0001 مقارنة بـ D12 Ctrl). تم إجراء اختبار ANOVA أحادي الاتجاه باستخدام الذكاء الاصطناعي لتقييم السلامة الهيكلية لأنسجة القلب (n = 7 (D0 و D12 Ctrl)، 5 (D12 TD، D12 MC و D12 MT) شرائح/مجموعة من خنازير مختلفة؛ #### p < 0.0001 مقارنة بـ D0 و *p < 0.05، أو ****p < 0.0001 مقارنة بـ D12 Ctrl). نقاط تكاملية هيكلية ذات جودة عالية مع الذكاء الذكي (n = 7 (D0 و D12 Ctrl)، 5 (D12 TD، D12 MC وD12) MT) спезов/group от зный свиней, проведен однофаctorный тест ANOVA; #### p < 0,0001 по сравнению с D0 и *p < 0,05 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). تم قياس السلامة الهيكلية لأنسجة القلب باستخدام الذكاء الاصطناعي (ن = 7 (D0 و D12 Ctrl)، 5 (D12 TD، D12 MC و D12 MT) مقاطع/مجموعة من خنازير مختلفة، تم إجراء اختبار ANOVA أحادي الاتجاه؛ #### p < 0.0001 مقارنة بـ D0 و *p < 0.05 أو ****p < 0.0001 مقارنة بـ D12 Ctrl).قم بتكوين مجموعة من العناصر (n = 7 (D0 وD12 Ctrl) و5 (D12 TD وD12 MC وD12 MT) 片 / 组) 进行 人工智能量化، 进行单向ANOVA 测试；#### p <0.0001 与D0 和*p < 0.05 相比، أو ****p < 0.0001 اضغط على D12 Ctrl.يمكن أن يتم تحديد عدد من العناصر بواسطة n = 7 (d0 وd12 ctrl) (5 (d12 td، d12 mc، d12 mt) 组) ########## p < 0.0001 与D0 和*p < 0.05 相比، 或****p < 0.0001 与D12 Ctrl 相比).تحديد كمية السلامة الهيكلية لأنسجة القلب باستخدام الذكاء الاصطناعي في خنازير مختلفة (ن = 7 (D0 و D12 Ctrl)، 5 (D12 TD، D12 MC و D12 MT) أقسام/مجموعة) باستخدام اختبار ANOVA أحادي الاتجاه؛#### p < 0,0001 по сравнению с D0 и *p < 0,05 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). #### p < 0.0001 مقارنةً بـ D0 و *p < 0.05 أو ****p < 0.0001 مقارنةً بـ D12 Ctrl). ب- صور تمثيلية وقياس كمي لشرائح القلب المصبوغة بصبغة ماسون ثلاثية الألوان (مقياس الرسم = 500 ميكرومتر) (ن = 10 (D0، D12 Ctrl، D12 TD، وD12 MC)، 9 (D12 MT) شرائح/مجموعة من خنازير مختلفة، تم إجراء اختبار ANOVA أحادي الاتجاه؛ ####p < 0.0001 مقارنة بـ D0 و***p < 0.001، أو ****p < 0.0001 مقارنة بـ D12 Ctrl). ب- صور تمثيلية وقياس كمي لشرائح القلب المصبوغة بصبغة ماسون ثلاثية الألوان (مقياس الرسم = 500 ميكرومتر) (ن = 10 (D0، D12 Ctrl، D12 TD، وD12 MC)، 9 (D12 MT) شرائح/مجموعة من خنازير مختلفة، تم إجراء اختبار ANOVA أحادي الاتجاه؛ ####p < 0.0001 مقارنة بـ D0 و***p < 0.001، أو ****p < 0.0001 مقارنة بـ D12 Ctrl). ب تصوير تمثيلي ومجموع نقاط على طول الطريق، حدود ثلاثية الأبعاد لماسونا (خط الإنتاج = 500) مم) (n = 10 (D0، D12 Ctrl، D12 TD وD12 MC)، 9 (D12 MT) مجموعات/مجموعة من خيول مختلفة، يتم اختيارها اختبار التباين ANOVA؛ ####p < 0,0001 по сравнению с D0 и ***p < 0,001 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). ب- صور تمثيلية وقياس كمي لمقاطع القلب المصبوغة بصبغة ماسون ثلاثية الألوان (مقياس الرسم = 500 ميكرومتر) (ن = 10 (D0، D12 Ctrl، D12 TD و D12 MC)، 9 (D12 MT) مقاطع/مجموعة من خنازير مختلفة، تم إجراء تحليل التباين أحادي الاتجاه؛ ####p < 0.0001 مقابل D0 و ***p < 0.001 أو ****p < 0.0001 مقابل D12 Ctrl). ب ماسون يقيس حجم الصفائح المعدنية ويحدد حجمها (حجم = 500 ميكرومتر) (ن = 10 (D0، D12 Ctrl، D12 TD وD12 MC)، 来自不同猪的9 个(D12 MT)切片/组،进行单因素方差分析；####p < 0.0001 与D0 相比،***p < 0.001، أو ****p < 0.0001، D12 Ctrl 相比). ب 用 ماسون 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 و 量化 (الحجم = 500 ميكرومتر) `n = 10 `d0، d12 ctrl، d12 td و d12 mc) 来自 不同 的 9 个 d12 mt 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 لا يمكن أن يكون هناك أي مشكلة في هذا المنتج؛####p <0.0001 与D0相比،***p <0.001، أو****p <0.0001، D12 Ctrl 相比). ب تصوير تمثيلي ومجموع نقاط على طول الطريق، ماسون ثلاثي الألوان (الخط الضخم = 500 م) (ن = 10) (D0، D12 Ctrl، D12 TD وD12 MC)، 9 (D12 MT) من خلال مجموعات / مجموعات مختلفة، один- способ ANOVA ####p < 0,0001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 أو ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). ب- صور تمثيلية وقياس كمي لمقاطع القلب المصبوغة بصبغة ماسون ثلاثية الألوان (مقياس الرسم = 500 ميكرومتر) (ن = 10 (D0، D12 Ctrl، D12 TD و D12 MC)، 9 (D12 MT) مقاطع من خنازير مختلفة/مجموعة، طريقة ANOVA واحدة؛ ####p < 0.0001 مقارنة بـ D0، ***p < 0.001 أو ****p < 0.0001 مقارنة بـ D12 Ctrl).تمثل أشرطة الخطأ المتوسط ​​± الانحراف المعياري.
أخيرًا، تم تقييم قدرة تقنية التصوير المقطعي المحوسب بالتباين (CTCM) على محاكاة تضخم عضلة القلب عن طريق زيادة تمدد أنسجة القلب. في هذه التقنية، ارتفع ضغط حجرة الهواء من 80 مم زئبق إلى 80 مم زئبق (تمدد طبيعي) وصولًا إلى 140 مم زئبق (الشكل 6أ). يُعادل هذا زيادة بنسبة 32% في التمدد (الشكل 6ب)، وهي النسبة المئوية للتمدد المطلوبة لقطاعات القلب لتحقيق طول ساركومير مماثل لما يُلاحظ في حالة التضخم. بقي تمدد وسرعة أنسجة القلب أثناء الانقباض والانبساط ثابتين خلال ستة أيام من الزراعة (الشكل 6ج). خضعت أنسجة القلب من ظروف التمدد المتوسط ​​(MT) لتمدد طبيعي (MT (طبيعي)) أو تمدد مفرط (MT (OS)) لمدة ستة أيام. بعد أربعة أيام فقط من الزراعة، ارتفع مستوى المؤشر الحيوي للتضخم NT-ProBNP بشكل ملحوظ في الوسط في ظروف التمدد المفرط (MT (OS)) مقارنةً بظروف التمدد الطبيعي (MT (طبيعي)) (الشكل 7أ). بالإضافة إلى ذلك، بعد ستة أيام من الاستزراع، ازداد حجم الخلايا في MT (OS) (الشكل 7ب) بشكل ملحوظ مقارنةً بمقاطع قلب MT (الطبيعي). كما لوحظ ازدياد ملحوظ في انتقال NFATC4 إلى النواة في الأنسجة المتمددة بشكل مفرط (الشكل 7ج). تُظهر هذه النتائج التطور التدريجي لإعادة التشكيل المرضي بعد التمدد المفرط، وتدعم فكرة إمكانية استخدام جهاز CTCM كمنصة لدراسة إشارات تضخم عضلة القلب الناتج عن التمدد.
تؤكد الرسوم البيانية التمثيلية لضغط حجرة الهواء، وضغط حجرة السائل، وقياسات حركة الأنسجة، أن ضغط الحجرة يُغير ضغط حجرة السائل، مما يُسبب حركة مُقابلة لشريحة النسيج. ب- منحنيات تمثيلية لنسبة التمدد ومعدل التمدد لشرائح الأنسجة المُمددة بشكل طبيعي (برتقالي) والمُمددة بشكل مُفرط (أزرق). ج- رسم بياني شريطي يُوضح زمن الدورة (عدد الشرائح = 19 شريحة لكل مجموعة، من خنازير مختلفة)، وزمن الانقباض (عدد الشرائح = 18-19 شريحة لكل مجموعة، من خنازير مختلفة)، وزمن الاسترخاء (عدد الشرائح = 19 شريحة لكل مجموعة، من خنازير مختلفة)، وسعة حركة النسيج (عدد الشرائح = 14 شريحة/مجموعة، من خنازير مختلفة)، وذروة سرعة الانقباض (عدد الشرائح = 14 شريحة/مجموعة، من خنازير مختلفة)، وذروة معدل الاسترخاء (عدد الشرائح = 14 (اليوم 0)، 15 (اليوم 6)) من خنازير مختلفة). أظهر اختبار t للطالب ذو الطرفين عدم وجود فرق معنوي في أي من المعايير، مما يُشير إلى أن هذه المعايير ظلت ثابتة خلال 6 أيام من الزراعة مع زيادة الجهد. تمثل أشرطة الخطأ المتوسط ​​± الانحراف المعياري.
رسم بياني شريطي يوضح كمية تركيز NT-ProBNP في أوساط الاستزراع من شرائح القلب التي تمت زراعتها في ظل ظروف التمدد الطبيعي (Norm) أو التمدد المفرط (OS) (n = 4 (D2 MTNorm)، 3 (D2 MTOS، D4 MTNorm، وD4 MTOS) شرائح/مجموعة من خنازير مختلفة، تم إجراء تحليل التباين ثنائي الاتجاه؛ **p < 0.01 مقارنة بالتمدد الطبيعي). رسم بياني شريطي يوضح كمية تركيز NT-ProBNP في أوساط الاستزراع من شرائح القلب التي تمت زراعتها في ظل ظروف التمدد الطبيعي (Norm) أو التمدد المفرط (OS) (n = 4 (D2 MTNorm)، 3 (D2 MTOS، D4 MTNorm، وD4 MTOS) شرائح/مجموعة من خنازير مختلفة، تم إجراء تحليل التباين ثنائي الاتجاه؛ **p < 0.01 مقارنة بالتمدد الطبيعي).الرسم البياني الكمي لتركيز NT-ProBNP في وسط الاستنبات من شرائح القلب المزروعة في ظل ظروف التمدد الطبيعي للأنابيب الدقيقة (norm) أو التمدد المفرط (OS) (n = 4 (D2 MTNorm)، 3 (D2 MTOS، D4 MTNorm، وD4).MTOS) شرائح / مجموعة من خنازير مختلفة، تم إجراء تحليل التباين ثنائي العوامل؛**p < 0,01 по сравнению с ноrmальным растязением). **قيمة الاحتمالية أقل من 0.01 مقارنةً بالتمدد الطبيعي). a نظام التشغيل MT (المعيار) المعتمد من نظام التشغيل (OS) يعتمد على نظام التشغيل NT-ProBNP الذي يعتمد على نظام التشغيل (n) = 4 (D2 MTNorm)、3(D2 MTOS، D4 MTNorm وD4 MTOS) قم بالتسجيل في 不同猪的切片/组، 进行双向方差分析；**与正常拉伸相比،p < 0.01) تقدير كمي لتركيز NT-ProBNP في شرائح القلب المستزرعة تحت ظروف التمدد العادي (Norm) أو التمدد الزائد (OS) لـ MT (ن = 4 (D2 MTNorm)، 3 (D2 MTOS، D4 MTNorm وD4 MTOS) من مختلف أنواع الخلايا؛ **مقارنة مع التمدد الطبيعي، P <0.01).الرسم البياني لتحديد كمية تركيزات NT-ProBNP في شرائح القلب المزروعة في ظل ظروف التمدد الطبيعي للأنابيب الدقيقة (norm) أو التمدد المفرط (OS) (n = 4 (D2 MTNorm)، 3 (D2 MTOS، D4 MTNorm و D4 MTOS) شرائح/مجموعة من خنازير مختلفة، تحليل التباين ثنائي الاتجاه؛**p < 0,01 по сравнению с ноrmальным растязением). **قيمة الاحتمالية أقل من 0.01 مقارنةً بالتمدد الطبيعي). ب- صور تمثيلية لشرائح القلب المصبوغة بالتروبونين-T و WGA (يسار) وقياس حجم الخلية (يمين) (ن = 330 (D6 MTOS)، 369 (D6 MTNorm) خلية/مجموعة من 10 شرائح مختلفة من خنازير مختلفة، تم إجراء اختبار t للطالب ذي الذيلين؛ ****p < 0.0001 مقارنة بالتمدد الطبيعي). ب- صور تمثيلية لشرائح القلب المصبوغة بالتروبونين-T و WGA (يسار) وقياس حجم الخلية (يمين) (ن = 330 (D6 MTOS)، 369 (D6 MTNorm) خلية/مجموعة من 10 شرائح مختلفة من خنازير مختلفة، تم إجراء اختبار t للطالب ذي الذيلين؛ ****p < 0.0001 مقارنة بالتمدد الطبيعي). ب تصوير تمثيلي لسلسلة من الخيوط والتروبونيوم المزخرف-T وAP (السطح) ومجموعة من المقابض ذات حجم التقريب (صحيح) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) مجموعة/مجموعة من 10 مجموعات مختلفة من سلاسل مختلفة، اثنان- ينشئ طالبًا متميزًا على شكل حرف T ؛ ****p < 0,0001 по сравнению с ноrmальным растязением). ب- صور تمثيلية لمقاطع القلب المصبوغة بالتروبونين-T وAZP (يسار) وقياس حجم الخلية (يمين) (ن = 330 (D6 MTOS)، 369 (D6 MTNorm) خلية/مجموعة من 10 مقاطع مختلفة من خنازير مختلفة، تم إجراء اختبار t للطالب ذي الذيلين؛ ****p < 0.0001 مقارنة بالسلالة الطبيعية). ب 用肌钙蛋白-T وWGA(左) و细胞大小量化(右)染色的心脏切片的代表性图像(n = 330(D6) MTOS)، 10 سلاسل من 369 (D6 MTNorm)، 细胞/组، 两进行有尾学生t 检验؛ 与正常拉伸相比، ****p <0.0001). ب- صور تمثيلية لشرائح القلب المصبوغة بالكالكارين-T وWGA (يسار) وحجم الخلية (يمين) (ن = 330 (D6 MTOS)، 369 من 10 شرائح مختلفة (D6 MTNorm)) خلايا/مجموعة، اختبار t للطالب في الطريقتين؛ مقارنة بالتمدد الطبيعي، ****p < 0.0001). ب تصوير تمثيلي من خلال البحر والتروبونيوم المزخرف- TP و AP (السطح) والأوساخ ذات الحجم الكلي (الصحيح) (ن = 330 (D6 MTOS)، 369 (D6 MTNorm) من بين 10 مجموعات مختلفة من مجموعات/مجموعات الخنازير المختلفة، الطالبة المعيارية؛ ****p < 0,0001 по сравнению с ноrmальным растязением). ب- صور تمثيلية لمقاطع القلب المصبوغة بالتروبونين-T وAZP (يسار) وقياس حجم الخلية (يمين) (ن = 330 (D6 MTOS)، 369 (D6 MTNorm) من 10 مقاطع مختلفة من خنازير مختلفة) خلايا/مجموعة، معيار ذو طرفين t للطالب؛ ****p < 0.0001 مقارنة بالسلالة الطبيعية). ج- صور تمثيلية لشرائح القلب MTOS في اليوم 0 واليوم 6 المصبوغة مناعياً للتروبونين-T و NFATC4 وتحديد كمية انتقال NFATC4 إلى نوى خلايا عضلة القلب (ن = 4 (D0)، 3 (D6 MTOS) شرائح/مجموعة من خنازير مختلفة، تم إجراء اختبار t للطالب ذي الذيلين؛ *p < 0.05). ج- صور تمثيلية لشرائح القلب MTOS في اليوم 0 واليوم 6 المصبوغة مناعياً للتروبونين-T و NFATC4 وتحديد كمية انتقال NFATC4 إلى نوى خلايا عضلة القلب (ن = 4 (D0)، 3 (D6 MTOS) شرائح/مجموعة من خنازير مختلفة، تم إجراء اختبار t للطالب ذي الذيلين؛ *p < 0.05). c تصوير تمثيلي لسلسلة من 0 و6 أيام MTOS، وخلايا مناعية للتروبوني-T وNFATC4، ونقاط تجميع نقل NFATC4 إلى وحدة التحكم الكهرومغناطيسية (n = 4 (D0)، 3 (D6 MTOS) من مجموعة/مجموعة من سلاسل مختلفة، выполняется двусторонний t-criteriй Student; * ع <0,05). ج- صور تمثيلية لمقاطع القلب في اليومين 0 و6 من MTOS، تم تلوينها مناعياً للتروبونين-T وNFATC4، وتم قياس انتقال NFATC4 في نواة الخلايا الكهفية (ن = 4 (D0)، 3 (D6 MTOS) شرائح/مجموعة من خنازير مختلفة) تم إجراؤها باختبار t للطالب ذي الذيلين؛ *p < 0.05). c 用于肌钙蛋白-T وNFATC4 免疫标记的第0 天和第6 天MTOS تم تحديد حجم الصورة الحقيقية، وقد تم تحديدها من قبل NFATC4 أو CM من CM (n = 4 (D0)، 3 (D6 MTOS)片/组، 进行双尾学生t 检验；*p <0.05). c صور تمثيلية لشرائح القلب المناعية calcanin-T و NFATC4 第0天和第6天MTOS، و NFATC4 من كمية مختلفة من نواة خلية NFATC4 CM (n = 4 (D0)، 3 (D6 MTOS) 切礼 / 组،时间双尾学生et 电影；*p <0.05). c تصوير تمثيلي لسلسلة MTOS من 0 إلى 6 أيام للعلامات المناعية-T وNFATC4 وجمع نقل النقاط NFATC4 في CM من أسلاك مختلفة (n = 4 (D0)، 3 (D6 MTOS) بين/المجموعة، ثنائي-معيار t مخصص الطالب; * ع <0,05). ج- صور تمثيلية لشرائح قلب MTOS في اليوم 0 و 6 للتلوين المناعي للتروبونين-T و NFATC4 وتحديد كمية انتقال NFATC4 في نواة CM من خنازير مختلفة (n = 4 (D0)، 3 (D6 MTOS) شرائح/مجموعة، معيار t ثنائي الذيل Student's؛ *p < 0.05).تمثل أشرطة الخطأ المتوسط ​​± الانحراف المعياري.
تتطلب الأبحاث الانتقالية في مجال أمراض القلب والأوعية الدموية نماذج خلوية تحاكي بيئة القلب بدقة. في هذه الدراسة، تم تطوير جهاز CTCM وتوصيفه، وهو قادر على تحفيز مقاطع رقيقة جدًا من القلب. يتضمن نظام CTCM تحفيزًا كهروميكانيكيًا متزامنًا مع الظروف الفيزيولوجية، بالإضافة إلى إثراء السائل بهرمون T3 وديكساميثازون. عند تعريض مقاطع قلب الخنزير لهذه العوامل، ظلت حيويتها وسلامتها البنيوية ونشاطها الأيضي وتعبيرها الجيني مماثلة لتلك الموجودة في أنسجة القلب الطازجة بعد 12 يومًا من الزراعة. علاوة على ذلك، يمكن أن يؤدي التمدد المفرط لأنسجة القلب إلى تضخم القلب الناتج عن فرط التمدد. بشكل عام، تدعم هذه النتائج الدور الحاسم لظروف الزراعة الفيزيولوجية في الحفاظ على النمط الظاهري الطبيعي للقلب، وتوفر منصة لفحص الأدوية.
تساهم عوامل عديدة في تهيئة بيئة مثالية لعمل خلايا عضلة القلب وبقائها. ومن أبرز هذه العوامل: (1) التفاعلات بين الخلايا، (2) التحفيز الكهروميكانيكي، (3) العوامل الخلطية، و(4) الركائز الأيضية. تتطلب التفاعلات الفسيولوجية بين الخلايا شبكات ثلاثية الأبعاد معقدة من أنواع متعددة من الخلايا مدعومة بمادة خارج خلوية. يصعب إعادة بناء هذه التفاعلات الخلوية المعقدة في المختبر عن طريق الزراعة المشتركة لأنواع الخلايا الفردية، ولكن يمكن تحقيق ذلك بسهولة باستخدام الطبيعة العضوية لقطاعات القلب.
يُعدّ التمديد الميكانيكي والتحفيز الكهربائي لخلايا عضلة القلب ضروريين للحفاظ على النمط الظاهري للقلب^33،34،35. وبينما يُستخدم التحفيز الميكانيكي على نطاق واسع في تهيئة ونضج خلايا عضلة القلب المُشتقة من الخلايا الجذعية المُستحثة متعددة القدرات (hiPSC-CM)، فقد سعت دراسات حديثة ومُتقنة إلى تحفيز شرائح القلب ميكانيكيًا في المزارع الخلوية باستخدام التحميل أحادي المحور. تُظهر هذه الدراسات أن التحميل الميكانيكي أحادي المحور ثنائي الأبعاد له تأثير إيجابي على النمط الظاهري للقلب أثناء الزراعة الخلوية. في هذه الدراسات، تم تحميل مقاطع القلب إما بقوى شد متساوية القياس¹⁷، أو بتحميل خطي مُتغير التوتر¹⁸، أو أُعيد إنشاء دورة القلب باستخدام تغذية راجعة من مُحول القوة ومحركات الشد. مع ذلك، تستخدم هذه الطرق تمديد الأنسجة أحادي المحور دون تحسين البيئة، مما يؤدي إلى تثبيط العديد من جينات القلب أو الإفراط في التعبير عن الجينات المرتبطة باستجابات التمديد غير الطبيعية. يوفر جهاز CTCM الموصوف هنا تحفيزًا كهروميكانيكيًا ثلاثي الأبعاد يحاكي دورة القلب الطبيعية من حيث زمن الدورة والتمدد الفسيولوجي (25% تمدد، 40% انقباض، 60% انبساط، و72 نبضة في الدقيقة). ورغم أن هذا التحفيز الميكانيكي ثلاثي الأبعاد وحده لا يكفي للحفاظ على سلامة الأنسجة، إلا أن الجمع بين التحفيز الهرموني والميكانيكي باستخدام T3/Dex ضروري للحفاظ على حيوية الأنسجة ووظيفتها وسلامتها بشكل كافٍ.
تلعب العوامل الخلطية دورًا هامًا في تعديل النمط الظاهري للقلب لدى البالغين. وقد برز ذلك في دراسات خلايا عضلة القلب المُستحثة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات (HiPS-CM)، حيث أُضيف هرمون T3 والديكساميثازون (Dex) إلى أوساط الاستنبات لتسريع نضج الخلايا. قد يؤثر هرمون T3 على نقل الأحماض الأمينية والسكريات والكالسيوم عبر أغشية الخلايا³⁶. بالإضافة إلى ذلك، يُعزز هرمون T3 التعبير عن MHC-α ويُثبط MHC-β، مما يُحفز تكوين اللييفات العضلية سريعة الانقباض في خلايا عضلة القلب الناضجة مقارنةً باللييفات العضلية بطيئة الانقباض في خلايا عضلة القلب الجنينية. يؤدي نقص هرمون T3 لدى مرضى قصور الغدة الدرقية إلى فقدان حزم اللييفات العضلية وانخفاض معدل تطور التوتر العضلي³⁷. يعمل الديكساميثازون على مستقبلات الجلوكوكورتيكويد، وقد ثبت أنه يزيد من انقباض عضلة القلب في القلوب المعزولة المروية³⁸؛ ويُعتقد أن هذا التحسن مرتبط بتأثيره على دخول الكالسيوم المُحفز بترسبات الكالسيوم (SOCE)^39،40. بالإضافة إلى ذلك، يرتبط ديكس بمستقبلاته، مما يتسبب في استجابة واسعة النطاق داخل الخلايا تعمل على قمع وظيفة المناعة والالتهاب 30.
تشير نتائجنا إلى أن التحفيز الميكانيكي الفيزيائي (MS) حسّن الأداء العام للزراعة مقارنةً بالمجموعة الضابطة (Ctrl)، ولكنه لم يحافظ على حيوية الخلايا وسلامتها البنيوية والتعبير القلبي على مدى 12 يومًا في الزراعة. بالمقارنة مع المجموعة الضابطة، أدى إضافة هرمون T3 وديكساميثازون (Dex) إلى مزارع CTCM (MT) إلى تحسين حيوية الخلايا والحفاظ على أنماط نسخ جينية مماثلة، وسلامة بنيوية، ونشاط أيضي مماثل لأنسجة القلب الطازجة لمدة 12 يومًا. بالإضافة إلى ذلك، ومن خلال التحكم في درجة تمدد الأنسجة، تم إنشاء نموذج لتضخم عضلة القلب الناتج عن فرط التمدد باستخدام STCM، مما يوضح تنوع نظام STCM. تجدر الإشارة إلى أنه على الرغم من أن إعادة تشكيل القلب والتليف عادةً ما يشملان أعضاءً سليمة يمكن لخلاياها الدورية توفير السيتوكينات المناسبة بالإضافة إلى البلعمة وعوامل إعادة التشكيل الأخرى، إلا أن أجزاء من القلب لا تزال قادرة على محاكاة عملية التليف استجابةً للإجهاد والصدمات. وقد تم تقييم ذلك سابقًا في نموذج شريحة القلب هذا. تجدر الإشارة إلى إمكانية تعديل معايير نظام CTCM بتغيير الضغط/السعة الكهربائية والتردد لمحاكاة العديد من الحالات، مثل تسرع القلب، وبطء القلب، والدعم الميكانيكي للدورة الدموية (القلب غير المُحمّل ميكانيكيًا). وهذا ما يجعل النظام متوسط ​​الإنتاجية لاختبار الأدوية. كما أن قدرة نظام CTCM على محاكاة تضخم عضلة القلب الناتج عن الإجهاد المفرط تُمهّد الطريق لاختبار هذا النظام في العلاج الشخصي. في الختام، تُظهر هذه الدراسة أن التمدد الميكانيكي والتحفيز الخلطي عنصران أساسيان للحفاظ على زراعة مقاطع أنسجة القلب.
على الرغم من أن البيانات المعروضة هنا تشير إلى أن تقنية التصوير المقطعي المحوسب بالتباين (CTCM) تُعد منصة واعدة للغاية لنمذجة عضلة القلب السليمة، إلا أن هذه الطريقة في زراعة الأنسجة لها بعض القيود. يتمثل القيد الرئيسي في أنها تفرض إجهادات ميكانيكية ديناميكية مستمرة على الشرائح، مما يحول دون القدرة على مراقبة انقباضات شرائح القلب بشكل فعال خلال كل دورة. إضافةً إلى ذلك، ونظرًا لصغر حجم مقاطع القلب (7 مم)، فإن القدرة على تقييم وظيفة الانقباض خارج أنظمة الزراعة باستخدام مجسات القوة التقليدية محدودة. في هذه الدراسة، نتغلب جزئيًا على هذا القيد من خلال تقييم الجهد الضوئي كمؤشر على وظيفة الانقباض. مع ذلك، سيتطلب هذا القيد مزيدًا من البحث، ويمكن معالجته مستقبلًا من خلال استحداث طرق للمراقبة الضوئية لوظيفة شرائح القلب في الزراعة، مثل التخطيط الضوئي باستخدام أصباغ حساسة للكالسيوم والجهد. ومن القيود الأخرى لتقنية CTCM أن النموذج المستخدم لا يُراعي الإجهاد الفسيولوجي (الحمل القبلي والبعدي). في تقنية التصوير المقطعي المحوسب للقلب (CTCM)، تم تطبيق ضغط في اتجاهين متعاكسين لمحاكاة تمدد فسيولوجي بنسبة 25% خلال الانبساط (التمدد الكامل) والانقباض (مدة الانقباض أثناء التحفيز الكهربائي) في أنسجة كبيرة جدًا. ينبغي التغلب على هذا القيد في تصميمات تقنية التصوير المقطعي المحوسب للقلب المستقبلية من خلال تطبيق ضغط كافٍ على نسيج القلب من كلا الجانبين، وتطبيق علاقات الضغط والحجم الدقيقة التي تحدث في حجرات القلب.
يقتصر إعادة التشكيل الناجم عن التمدد المفرط، والمذكور في هذه الدراسة، على محاكاة إشارات التمدد المفرط المصاحبة لتضخم الأنسجة. وبالتالي، يمكن لهذا النموذج أن يُسهم في دراسة إشارات التضخم الناتجة عن التمدد دون الحاجة إلى عوامل خلطية أو عصبية (غير موجودة في هذا النظام). وتتطلب دراسات إضافية توسيع نطاق نموذج CTCM، فعلى سبيل المثال، سيؤدي التشارك في زراعة الخلايا مع الخلايا المناعية، وعوامل خلطية من بلازما الدم، والتزويد العصبي عند التشارك في زراعة الخلايا مع الخلايا العصبية، إلى تحسين إمكانيات نمذجة الأمراض باستخدام CTCM.
تم استخدام ثلاثة عشر خنزيرًا في هذه الدراسة. تم إجراء جميع الإجراءات على الحيوانات وفقًا للإرشادات المؤسسية وتمت الموافقة عليها من قبل لجنة رعاية الحيوانات واستخدامها المؤسسية بجامعة لويزفيل. تم تثبيت قوس الأبهر وتم تروية القلب بـ 1 لتر من محلول كارديوبليجيا معقم (110 مليمول/لتر كلوريد الصوديوم، 1.2 مليمول/لتر كلوريد الكالسيوم، 16 مليمول/لتر كلوريد البوتاسيوم، 16 مليمول/لتر كلوريد المغنيسيوم، 10 مليمول/لتر بيكربونات الصوديوم، 5 وحدات/مل هيبارين، درجة الحموضة تصل إلى 7.4)؛ تم حفظ القلوب في محلول كارديوبليجي بارد جداً حتى نقلها إلى المختبر على الجليد، وهو ما يستغرق عادةً أقل من 10 دقائق. تم حفظ القلوب في محلول كارديوبليجي بارد جداً حتى نقلها إلى المختبر على الجليد، وهو ما يستغرق عادةً أقل من 10 دقائق. يتم نقل سلسلة من الشقوق في القلب إلى وسائل النقل في مختبرات البشر، والتي يتم إجراؤها بشكل طبيعي <10 دقائق. تم حفظ القلوب في محلول كارديوبليجي بارد جداً حتى نقلها إلى المختبر على الجليد، وهو ما يستغرق عادةً أقل من 10 دقائق.لا داعي للقلق بشأن هذا الأمر.لا داعي للقلق بشأن هذا الأمر. يتم توصيله عبر أجهزة القلب والأوعية الدموية إلى وسائل النقل في مختبرات البشر، بشكل طبيعي <10 دقائق. احتفظ بالقلوب على الثلج حتى يتم نقلها إلى المختبر على الثلج، وعادة ما تكون المدة أقل من 10 دقائق.
تم تطوير جهاز CTCM باستخدام برنامج التصميم بمساعدة الحاسوب SolidWorks. صُنعت حجرات الاستزراع، والفواصل، وحجرات الهواء من بلاستيك أكريليك شفاف مُشكّل باستخدام تقنية CNC. الحلقة الداعمة، بقطر 7 مم، مصنوعة من البولي إيثيلين عالي الكثافة (HDPE) في المنتصف، وتحتوي على أخدود لحلقة دائرية من السيليكون تُستخدم لإحكام إغلاق الوسط الغذائي أسفلها. يفصل غشاء رقيق من السيليكا حجرة الاستزراع عن لوحة الفصل. تم قص غشاء السيليكون بالليزر من صفائح سيليكون بسماكة 0.02 بوصة، وبصلابة 35A. أما الحشيات العلوية والسفلية المصنوعة من السيليكون، فقد تم قصها بالليزر من صفائح سيليكون بسماكة 1/16 بوصة، وبصلابة 50A. استُخدمت براغي وصواميل مجنحة من الفولاذ المقاوم للصدأ 316L لتثبيت الكتلة وإحكام إغلاقها.
صُممت لوحة دوائر مطبوعة (PCB) مخصصة لتتكامل مع نظام C-PACE-EM. تُوصل مقابس التوصيل السويسرية الموجودة على لوحة الدوائر المطبوعة بأقطاب جرافيتية بواسطة أسلاك نحاسية مطلية بالفضة ومسامير برونزية مقاس 0-60 مثبتة في الأقطاب. تُوضع لوحة الدوائر المطبوعة داخل غطاء طابعة ثلاثية الأبعاد.
يُتحكم بجهاز CTCM بواسطة مشغل هوائي قابل للبرمجة (PPD) يُولّد ضغطًا دورانيًا مُتحكمًا به يُحاكي دورة القلب. مع ازدياد الضغط داخل حجرة الهواء، يتمدد غشاء السيليكون المرن إلى الأعلى، دافعًا الوسط أسفل موضع النسيج. ثم تتمدد منطقة النسيج نتيجةً لهذا الطرد للسائل، مُحاكيًا التمدد الفسيولوجي للقلب أثناء الانبساط. عند ذروة الاسترخاء، يُطبّق تحفيز كهربائي عبر أقطاب جرافيتية، مما يُقلل الضغط في حجرة الهواء ويُسبب انقباض أجزاء النسيج. يوجد داخل الأنبوب صمام مُرقئ مزود بمستشعر ضغط لرصد الضغط في نظام الهواء. يُرسل الضغط المُستشعر إلى مُجمّع بيانات مُتصل بجهاز الكمبيوتر المحمول. هذا يسمح بالمراقبة المُستمرة للضغط داخل حجرة الغاز. عندما تم الوصول إلى أقصى ضغط للحجرة (80 ملم زئبق قياسي، 140 ملم زئبق OS)، تم إصدار أمر لجهاز جمع البيانات بإرسال إشارة إلى نظام C-PACE-EM لتوليد إشارة جهد ثنائية الطور لمدة 2 مللي ثانية، مضبوطة على 4 فولت.
تم الحصول على مقاطع من القلب، وتمت زراعتها في 6 آبار على النحو التالي: نُقلت القلوب المستأصلة من وعاء النقل إلى صينية تحتوي على محلول كارديوبليجيا بارد (4 درجات مئوية). عُزل البطين الأيسر بشفرة معقمة وقُطع إلى قطع بحجم 1-2 سم مكعب. رُبطت هذه القطع النسيجية بدعامات نسيجية باستخدام لاصق نسيجي، ووُضعت في حمام نسيجي ميكروتوم اهتزازي يحتوي على محلول تايرود، مع تزويد مستمر بالأكسجين (3 غ/ل من أحادي أوكسيم 2،3-بيوتانديون (BDM)، 140 ملي مولار كلوريد الصوديوم (8.18 غ)، 6 ملي مولار كلوريد البوتاسيوم (0.447 غ)، 10 ملي مولار د-جلوكوز (1.86 غ)، 10 ملي مولار هيبس (2.38 غ)، 1 ملي مولار كلوريد المغنيسيوم (1 مل من محلول 1 مولار)، 1.8 ملي مولار كلوريد الكالسيوم (1.8 مل من محلول 1 مولار)، حتى 1 لتر من الماء المقطر. تم ضبط الميكروتوم الاهتزازي لقطع شرائح بسمك 300 ميكرومتر بتردد 80 هرتز، وسعة اهتزاز أفقي 2 مم، ومعدل تقدم 0.03 مم/ثانية. وُضع حوض الأنسجة في الثلج للحفاظ على برودة المحلول، وحُفظت درجة الحرارة عند 4 درجات مئوية. نُقلت مقاطع الأنسجة من حوض الميكروتوم إلى حوض حضانة يحتوي على محلول تايرود مُؤكسج باستمرار على الثلج حتى تم الحصول على عدد كافٍ من المقاطع لطبق زراعة واحد. بالنسبة لزراعات ترانسويل، تم تثبيت مقاطع الأنسجة على دعامات بولي يوريثان معقمة بعرض 6 مم، ووضعت في 6 مل من وسط مُحسَّن (وسط 199، مُكمِّل ITS بتركيز 1x، 10% مصل بقري جنيني، 5 نانوغرام/مل عامل نمو بطانة الأوعية الدموية، 10 نانوغرام/مل عامل نمو الخلايا الليفية القلوي، ومضاد حيوي/مضاد للفطريات بتركيز 2x). طُبِّق تحفيز كهربائي (10 فولت، تردد 1.2 هرتز) على مقاطع الأنسجة من خلال جهاز C-Pace. في ظروف TD، أُضيف هرمون T3 وديكساميثازون طازجان بتركيز 100 نانومولار و1 ميكرومولار على التوالي عند كل تغيير للوسط. يُشبع الوسط بالأكسجين قبل استبداله ثلاث مرات يوميًا. زُرعت مقاطع الأنسجة في حاضنة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية وتركيز 5% من ثاني أكسيد الكربون.
في مزارع CTCM، وُضعت شرائح الأنسجة على طابعة ثلاثية الأبعاد مُصممة خصيصًا في طبق بتري يحتوي على محلول تايرود مُعدّل. صُمم الجهاز لزيادة حجم شريحة القلب بنسبة 25% من مساحة حلقة الدعم. يُجرى ذلك لمنع تمدد شرائح القلب بعد نقلها من محلول تايرود إلى الوسط الغذائي وأثناء الانبساط. باستخدام غراء هيستوأكريليك، ثُبّتت شرائح بسمك 300 ميكرومتر على حلقة دعم قطرها 7 مليمترات. بعد تثبيت شرائح الأنسجة على حلقة الدعم، قُصّت الشرائح الزائدة ووُضعت الشرائح المُثبّتة مرة أخرى في حمام محلول تايرود على الثلج (4 درجات مئوية) حتى يتم تحضير عدد كافٍ من الشرائح لجهاز واحد. يجب ألا يتجاوز إجمالي وقت المعالجة لجميع الأجهزة ساعتين. بعد تثبيت 6 شرائح نسيجية على حلقات الدعم الخاصة بها، جُمع جهاز CTCM. تُملأ حجرة زراعة CTCM مسبقًا بـ 21 مل من الوسط الغذائي المُؤكسج. انقل شرائح الأنسجة إلى حجرة الاستزراع، وأزل فقاعات الهواء بعناية باستخدام ماصة. ثم أدخل شريحة النسيج في الفتحة واضغط عليها برفق لتثبيتها في مكانها. بعد ذلك، ضع غطاء القطب الكهربائي على الجهاز وانقله إلى الحاضنة. ثم وصّل جهاز CTCM بأنبوب الهواء ونظام C-PACE-EM. سيفتح المشغل الهوائي وصمام الهواء جهاز CTCM. تم ضبط نظام C-PACE-EM لتوفير 4 فولت بتردد 1.2 هرتز أثناء التحفيز ثنائي الطور لمدة 2 مللي ثانية. تم تغيير الوسط مرتين يوميًا، وتم تغيير الأقطاب الكهربائية مرة واحدة يوميًا لتجنب تراكم الجرافيت عليها. عند الضرورة، يمكن إخراج شرائح الأنسجة من آبار الاستزراع لطرد أي فقاعات هواء قد تكون قد سقطت تحتها. في ظروف علاج MT، أُضيف T3/Dex طازجًا مع كل تغيير للوسط بتركيز 100 نانومولار من T3 و1 ميكرومولار من Dex. تم استزراع أجهزة CTCM في حاضنة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية وتركيز 5% من ثاني أكسيد الكربون.
للحصول على مسارات ممتدة لشرائح القلب، تم تطوير نظام كاميرا خاص. استُخدمت كاميرا SLR (Canon Rebel T7i، Canon، طوكيو، اليابان) مع عدسة Navitar Zoom 7000 18-108mm ماكرو (Navitar، سان فرانسيسكو، كاليفورنيا). أُجريت عملية التصوير في درجة حرارة الغرفة بعد استبدال الوسط بوسط جديد. وُضعت الكاميرا بزاوية 51 درجة، وسُجّل الفيديو بمعدل 30 إطارًا في الثانية. في البداية، استُخدم برنامج مفتوح المصدر (MUSCLEMOTION43) مع برنامج Image-J لقياس حركة شرائح القلب. أُنشئ القناع باستخدام برنامج MATLAB (MathWorks، ناتيك، ماساتشوستس، الولايات المتحدة الأمريكية) لتحديد مناطق الاهتمام لشرائح القلب النابض لتجنب التشويش. طُبّقت أقنعة مُجزأة يدويًا على جميع الصور في تسلسل الإطارات، ثم مُررت إلى مُلحق MUSCLEMOTION. يستخدم برنامج Muscle Motion متوسط ​​شدة البكسلات في كل إطار لقياس حركته بالنسبة إلى الإطار المرجعي. تم تسجيل البيانات وتصفيتها واستخدامها لتحديد زمن الدورة وتقييم تمدد الأنسجة خلال دورة القلب. خضع الفيديو المسجل لمعالجة لاحقة باستخدام مرشح رقمي من الدرجة الأولى ذي طور صفري. ولتحديد تمدد الأنسجة (من الذروة إلى الذروة)، أُجري تحليل من الذروة إلى الذروة للتمييز بين الذروات والقيعان في الإشارة المسجلة. بالإضافة إلى ذلك، تم إزالة الاتجاه باستخدام دالة متعددة الحدود من الدرجة السادسة للتخلص من انحراف الإشارة. طُوّر برنامج بلغة MATLAB لتحديد الحركة الكلية للأنسجة، وزمن الدورة، وزمن الاسترخاء، وزمن الانقباض (رمز البرنامج التكميلي 44).
لتحليل الإجهاد، وباستخدام مقاطع الفيديو نفسها المُستخدمة في تقييم التمدد الميكانيكي، قمنا أولاً بتحديد صورتين تمثلان ذروتي الحركة (أعلى (العلوي) وأدنى (السفلي) نقطة حركة) وفقًا لبرنامج MUSCLEMOTION. ثم قمنا بتقسيم مناطق النسيج وتطبيق خوارزمية تظليل على النسيج المُقسّم (الشكل التكميلي 2أ). بعد ذلك، قُسّم النسيج المُقسّم إلى عشرة أسطح فرعية، وحُسب الإجهاد على كل سطح باستخدام المعادلة التالية: الإجهاد = (العلوي - السفلي) / السفلي، حيث يُمثل Sup وSdown المسافة بين الشكل وظلال النسيج العلوية والسفلية على التوالي (الشكل التكميلي 2ب).
ثُبِّتت مقاطع القلب في محلول بارافورمالدهيد بنسبة 4% لمدة 48 ساعة. ثم جُفِّفت الأنسجة المُثبَّتة في محلول سكروز بنسبة 10% و20% لمدة ساعة واحدة، ثم في محلول سكروز بنسبة 30% طوال الليل. بعد ذلك، غُمرت المقاطع في مركب درجة حرارة القطع المثلى (OCT) وجُمِّدت تدريجيًا في حمام من الأيزوبنتان والثلج الجاف. تُحفظ قوالب التضمين OCT عند درجة حرارة -80 درجة مئوية حتى فصلها. جُهِّزت الشرائح على شكل مقاطع بسمك 8 ميكرومتر.
لإزالة مادة OCT من مقاطع القلب، سخّن الشرائح على جهاز تسخين عند 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. أضف 1 مل من محلول الفوسفات الملحي (PBS) إلى كل شريحة، ثم حضّنها لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، قم بنقع المقاطع في محلول Triton-X بتركيز 0.1% في محلول الفوسفات الملحي (PBS) لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. لمنع ارتباط الأجسام المضادة غير النوعية بالعينة، أضف 1 مل من محلول ألبومين المصل البقري (BSA) بتركيز 3% إلى الشرائح، ثم حضّنها لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، أزل ألبومين المصل البقري (BSA) واغسل الشرائح بمحلول الفوسفات الملحي (PBS). ضع علامة على كل عينة بقلم رصاص. أُضيفت الأجسام المضادة الأولية (مخففة بنسبة 1:200 في محلول BSA بنسبة 1%) (كونيكسين 43 (Abcam؛ #AB11370)، وNFATC4 (Abcam؛ #AB99431)، وتروبونين-T (Thermo Scientific؛ #MA5-12960)) على مدى 90 دقيقة، ثم أُضيفت الأجسام المضادة الثانوية (مخففة بنسبة 1:200 في محلول BSA بنسبة 1%) ضد Alexa Fluor 488 الفأري (Thermo Scientific؛ #A16079)، وضد Alexa Fluor 594 الأرنبي (Thermo Scientific؛ #T6391) لمدة 90 دقيقة إضافية. غُسلت الشرائح 3 مرات بمحلول PBS. ولتمييز التلوين المستهدف عن الخلفية، استخدمنا الجسم المضاد الثانوي فقط كعنصر تحكم. أخيرًا، أُضيف صبغ DAPI النووي، ووُضعت الشرائح في حاضنة Vectashield (Vector Laboratories) وأُغلقت بطلاء الأظافر. استُخدم مجهر Keyence بتكبير 40x.
استُخدم صبغ WGA-Alexa Fluor 555 (Thermo Scientific؛ #W32464) بتركيز 5 ميكروغرام/مل في محلول ملحي فوسفاتي (PBS) لتلوين WGA، ووُضع على المقاطع المثبتة لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ثم غُسلت الشرائح بمحلول ملحي فوسفاتي، وأُضيف إليها صبغة سودان السوداء، وحُضنت لمدة 30 دقيقة أخرى. بعد ذلك، غُسلت الشرائح مرة أخرى بمحلول ملحي فوسفاتي، وأُضيف إليها وسط التضمين Vectashield. وتمت معاينة الشرائح باستخدام مجهر Keyence بتكبير 40x.
أُزيلت مادة OCT من العينات كما هو موضح سابقًا. بعد إزالة OCT، غُمرت الشرائح في محلول بوين طوال الليل. ثم شُطفت الشرائح بالماء المقطر لمدة ساعة، ثم وُضعت في محلول فوشين حمض الألوة من Bibrich لمدة 10 دقائق. بعد ذلك، غُسلت الشرائح بالماء المقطر ووُضعت في محلول من 5% فوسفوموليبدينوم/5% حمض الفوسفوتنجستيك لمدة 10 دقائق. دون شطف، نُقلت الشرائح مباشرةً إلى محلول أزرق الأنيلين لمدة 15 دقيقة. ثم غُسلت الشرائح بالماء المقطر ووُضعت في محلول حمض الخليك بنسبة 1% لمدة دقيقتين. جُففت الشرائح في إيثانول 200 مولار ونُقلت إلى الزيلين. فُحصت الشرائح المصبوغة باستخدام مجهر Keyence بعدسة تكبير 10x. حُسبت نسبة مساحة التليف باستخدام برنامج Keyence Analyzer.
تم استخدام اختبار CyQUANT™ MTT لقياس حيوية الخلايا (Invitrogen، كارلسباد، كاليفورنيا)، رقم الكتالوج V13154، وفقًا لبروتوكول الشركة المصنعة مع بعض التعديلات. على وجه الخصوص، استُخدم مثقب جراحي بقطر 6 مم لضمان تجانس حجم الأنسجة أثناء تحليل MTT. وُضعت الأنسجة بشكل فردي في آبار صفيحة ذات 12 بئرًا تحتوي على ركيزة MTT وفقًا لبروتوكول الشركة المصنعة. حُضنت المقاطع عند 37 درجة مئوية لمدة 3 ساعات، حيث استقلبت الأنسجة الحية ركيزة MTT لتكوين مركب فورمازان بنفسجي. استُبدل محلول MTT بـ 1 مل من DMSO وحُضنت عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة لاستخلاص الفورمازان البنفسجي من مقاطع القلب. خُففت العينات بنسبة 1:10 في DMSO في صفائح ذات 96 بئرًا ذات قاع شفاف، وقُيس شدة اللون البنفسجي عند 570 نانومتر باستخدام قارئ صفائح Cytation (BioTek). نُسبت القراءات إلى وزن كل شريحة من القلب.
تم استبدال وسط زراعة شرائح القلب بوسط يحتوي على 1 ميكروكوري/مل من الجلوكوز الموسوم بالنظير [5-3H] (شركة مورافيك للمواد الكيميائية الحيوية، بريا، كاليفورنيا، الولايات المتحدة الأمريكية) لإجراء اختبار استهلاك الجلوكوز كما هو موضح سابقًا. بعد 4 ساعات من الحضانة، أُضيف 100 ميكرولتر من الوسط إلى أنبوب طرد مركزي صغير مفتوح يحتوي على 100 ميكرولتر من حمض الهيدروكلوريك 0.2 مولار. ثم وُضع الأنبوب في أنبوب وميض يحتوي على 500 ميكرولتر من الماء المقطر لتبخير [3H]2O لمدة 72 ساعة عند 37 درجة مئوية. بعد ذلك، أُزيل أنبوب الطرد المركزي الصغير من أنبوب الوميض وأُضيف 10 مل من سائل الوميض. أُجريت عمليات العد الوميضي باستخدام محلل الوميض السائل Tri-Carb 2900TR (شركة باكارد للعلوم الحيوية، ميريدن، كونيتيكت، الولايات المتحدة الأمريكية). ثم حُسب استهلاك الجلوكوز مع مراعاة النشاط النوعي للجلوكوز الموسوم بـ[5-3H]، وعدم اكتمال التوازن، والخلفية، وتخفيف [5-3H] إلى الجلوكوز غير الموسوم، وكفاءة عداد الوميض. وتمت معايرة البيانات وفقًا لكتلة مقاطع القلب.
بعد تجانس الأنسجة في محلول تريزول، تم استخلاص الحمض النووي الريبوزي (RNA) من مقاطع القلب باستخدام مجموعة Qiagen miRNeasy Micro Kit رقم 210874 وفقًا لبروتوكول الشركة المصنعة. تم تحضير مكتبة الحمض النووي الريبوزي (RNAsec) وتسلسلها وتحليل بياناتها على النحو التالي:
استُخدم 1 ميكروغرام من الحمض النووي الريبوزي (RNA) لكل عينة كمادة أولية لتحضير مكتبة الحمض النووي الريبوزي. تم إنشاء مكتبات التسلسل باستخدام مجموعة NEBNext Ultra™ RNA Library Preparation Kit for Illumina (NEB، الولايات المتحدة الأمريكية) وفقًا لتوصيات الشركة المصنعة، وأُضيفت رموز فهرسة إلى تسلسلات السمات لكل عينة. باختصار، تم تنقية الحمض النووي الريبوزي الرسول (mRNA) من الحمض النووي الريبوزي الكلي باستخدام خرز مغناطيسي مرتبط بأوليغونوكليوتيدات متعددة الثايمين (poly-T). تم إجراء التجزئة باستخدام كاتيونات ثنائية التكافؤ عند درجة حرارة عالية في محلول تفاعل تخليق السلسلة الأولى NEBNext (5X). تم تخليق السلسلة الأولى من الحمض النووي التكميلي (cDNA) باستخدام بادئات سداسية عشوائية وإنزيم النسخ العكسي M-MuLV (RNase H-). ثم تم تخليق السلسلة الثانية من الحمض النووي التكميلي باستخدام بوليميراز الحمض النووي I وRNase H. تم تحويل النهايات المتدلية المتبقية إلى نهايات غير لاصقة بواسطة نشاط الإكسونوكلياز/البوليميراز. بعد إضافة مجموعة أدينيل إلى الطرف 3′ لقطعة الحمض النووي، يتم ربط محول NEBNext ذي بنية حلقة دبوس الشعر بها لتحضيرها للتهجين. لاختيار قطع الحمض النووي المكمل (cDNA) ذات الطول المفضل (150-200 زوج قاعدي)، تم تنقية قطع المكتبة باستخدام نظام AMPure XP (بيكمان كولتر، بيفرلي، الولايات المتحدة الأمريكية). بعد ذلك، تم استخدام 3 ميكرولتر من إنزيم USER (NEB، الولايات المتحدة الأمريكية) مع الحمض النووي المكمل (cDNA) المُختار حسب الحجم والمُرتبط بالمحول لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية، ثم لمدة 5 دقائق عند 95 درجة مئوية قبل تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR). ثم أُجري تفاعل البلمرة المتسلسل باستخدام بوليميراز الحمض النووي عالي الدقة Phusion، وبادئات تفاعل البلمرة المتسلسل العامة، وبادئات الفهرسة (X). أخيرًا، تم تنقية نواتج تفاعل البلمرة المتسلسل (باستخدام نظام AMPure XP) وتقييم جودة المكتبة على نظام Agilent Bioanalyzer 2100. ثم تم تسلسل مكتبة الحمض النووي المكمل (cDNA) باستخدام جهاز التسلسل Novaseq. تم تحويل ملفات الصور الخام من Illumina إلى قراءات خام باستخدام برنامج CASAVA Base Calling. تُخزَّن البيانات الخام في ملفات بصيغة FASTQ (fq) تحتوي على تسلسلات القراءات وجودة القواعد المقابلة. اختر HISAT2 لمطابقة قراءات التسلسل المُفلترة مع الجينوم المرجعي Sscrofa11.1. يدعم HISAT2 عمومًا الجينومات من أي حجم، بما في ذلك الجينومات التي يزيد حجمها عن 4 مليارات قاعدة، ويتم ضبط القيم الافتراضية لمعظم المعلمات. يمكن محاذاة قراءات التضفير من بيانات تسلسل الحمض النووي الريبوزي (RNA-Seq) بكفاءة باستخدام HISAT2، وهو أسرع نظام متاح حاليًا، بدقة مماثلة أو أفضل من أي طريقة أخرى.
يعكس وفرة النسخ الجينية مستوى التعبير الجيني بشكل مباشر. ويتم تقييم مستويات التعبير الجيني من خلال وفرة النسخ الجينية (عدد التسلسلات) المرتبطة بالجينوم أو الإكسونات. يتناسب عدد القراءات طرديًا مع مستويات التعبير الجيني، وطول الجين، وعمق التسلسل. تم حساب FPKM (عدد القطع لكل ألف زوج قاعدي من النسخة المتسلسلة لكل مليون زوج قاعدي) وتحديد قيم P للتعبير التفاضلي باستخدام حزمة DESeq2. ثم قمنا بحساب معدل الاكتشاف الخاطئ (FDR) لكل قيمة P باستخدام طريقة بنجاميني-هوخبيرغ⁹ بالاعتماد على دالة R المدمجة "p.adjust".
تم تحويل الحمض النووي الريبوزي (RNA) المستخلص من مقاطع القلب إلى حمض نووي تكميلي (cDNA) بتركيز 200 نانوغرام/ميكرولتر باستخدام مزيج SuperScript IV Vilo Master من شركة Thermo (رقم المنتج: 11756050). أُجري تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي العكسي (RT-qPCR) باستخدام صفيحة تفاعل شفافة ذات 384 بئراً من نوع Applied Biosystems Endura Plate Microamp (رقم المنتج: 4483319) ومادة لاصقة بصرية من نوع microamp (رقم المنتج: 4311971). يتكون مزيج التفاعل من 5 ميكرولتر من مزيج Taqman Fast Advanced Master (رقم المنتج: 4444557)، و0.5 ميكرولتر من بادئ Taqman، و3.5 ميكرولتر من الماء المقطر لكل بئر. تم تشغيل دورات تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي القياسية، وقُيست قيم العتبة (CT) باستخدام جهاز Applied Biosystems Quantstudio 5 لتفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي (وحدة 384 بئراً؛ رقم المنتج: A28135). تم شراء بادئات Taqman من Thermo (GAPDH (Ss03375629_u1)، PARP12 (Ss06908795_m1)، PKDCC (Ss06903874_m1)، CYGB (Ss06900188_m1)، RGL1 (Ss06868890_m1)، ACTN1 (Ss01009508_mH)، GATA4 (Ss03383805_u1)، GJA1 (Ss03374839_u1)، COL1A2 (Ss03375009_u1)، COL3A1 (Ss04323794_m1)، ACTA2 (Ss04245588_m1). تم تطبيع قيم CT لجميع العينات إلى جين GAPDH المنزلي.
تم تقييم إطلاق NT-ProBNP باستخدام مجموعة NT-ProBNP (الخنزير) (رقم المنتج: MBS2086979، MyBioSource) وفقًا لبروتوكول الشركة المصنعة. باختصار، أُضيف 250 ميكرولتر من كل عينة ومعيار إلى كل بئر، مكررًا مرتين. مباشرةً بعد إضافة العينة، أُضيف 50 ميكرولتر من كاشف الفحص A إلى كل بئر. رُجّت الصفيحة برفق وأُغلقت بمادة مانعة للتسرب. ثم حُضنت الأقراص عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. بعد ذلك، سُحب المحلول وغُسلت الآبار 4 مرات باستخدام 350 ميكرولتر من محلول الغسيل 1X، مع تحضين محلول الغسيل لمدة 1-2 دقيقة في كل مرة. ثم أُضيف 100 ميكرولتر من كاشف الفحص B إلى كل بئر وأُغلقت الصفيحة بمادة مانعة للتسرب. رُجّت الأقراص برفق وحُضنت عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. اسحب المحلول واغسل الآبار 5 مرات باستخدام 350 ميكرولتر من محلول الغسل المخفف (1X). أضف 90 ميكرولتر من محلول الركيزة إلى كل بئر وأغلق الصفيحة بإحكام. حضّن الصفيحة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 10-20 دقيقة. أضف 50 ميكرولتر من محلول الإيقاف إلى كل بئر. قُيست الصفيحة فورًا باستخدام جهاز قراءة الصفائح Cytation (BioTek) مضبوطًا على 450 نانومتر.
تم إجراء تحليلات القوة لاختيار أحجام المجموعات التي ستوفر قوة تزيد عن 80٪ للكشف عن تغيير مطلق بنسبة 10٪ في المعلمة مع معدل خطأ من النوع الأول بنسبة 5٪. تم إجراء تحليلات القوة لاختيار أحجام المجموعات التي ستوفر قوة تزيد عن 80٪ للكشف عن تغيير مطلق بنسبة 10٪ في المعلمة مع معدل خطأ من النوع الأول بنسبة 5٪. تم استخدام التحليل لاختيار مجموعة واسعة النطاق التي تشمل > 80% قوة للتوعية 10% تقدير مطلق معلمة بنسبة 5% من النوع I. تم إجراء تحليل القدرة الإحصائية لاختيار أحجام المجموعات التي من شأنها أن توفر قدرة إحصائية تزيد عن 80% للكشف عن تغيير مطلق في المعلمة بنسبة 10% مع معدل خطأ من النوع الأول بنسبة 5%.进行功效分析以选择将提供> 80% من الماء المقطر 10% من الماء و5% من الفوسفات.进行功效分析以选择将提供> 80% من الماء المقطر 10% من الماء و5% من الفوسفات. تم التحقق من قوة التحليل لاختيار مجموعات كبيرة الحجم والتي يجب أن تكون > 80% قوة للتغطية 10% مطلقة معلمات التحسين ونسبة 5% من النوع الأول. تم إجراء تحليل القوة لاختيار حجم المجموعة الذي من شأنه أن يوفر قوة تزيد عن 80٪ للكشف عن تغيير مطلق في المعلمة بنسبة 10٪ ومعدل خطأ من النوع الأول بنسبة 5٪.تم اختيار مقاطع الأنسجة عشوائيًا قبل التجربة. أُجريت جميع التحليلات دون معرفة مسبقة بحالة العينات، ولم تُفكّ رموز العينات إلا بعد تحليل جميع البيانات. استُخدم برنامج GraphPad Prism (سان دييغو، كاليفورنيا) لإجراء جميع التحليلات الإحصائية. بالنسبة لجميع الإحصائيات، تم اعتبار قيم p ذات دلالة إحصائية عند القيم <0.05. بالنسبة لجميع الإحصائيات، تم اعتبار قيم p ذات دلالة إحصائية عند القيم <0.05. لجميع الإحصائيات p-значения значимым по значения <0,05. بالنسبة لجميع الإحصائيات، تم اعتبار قيم p ذات دلالة إحصائية عند القيم <0.05.对于所有统计数据،p 值在值<0.05 时被认为是显着的.对于所有统计数据،p 值在值<0.05 时被认为是显着的. لجميع الإحصائيات p-значения значимым по значения <0,05. بالنسبة لجميع الإحصائيات، تم اعتبار قيم p ذات دلالة إحصائية عند القيم <0.05.أُجري اختبار t للطالب ذي الطرفين على البيانات التي تتضمن مقارنتين فقط. استُخدم تحليل التباين أحادي الاتجاه أو ثنائي الاتجاه لتحديد الدلالة الإحصائية بين المجموعات المتعددة. عند إجراء اختبارات ما بعد التحليل، طُبِّق تصحيح توكي لمراعاة المقارنات المتعددة. تتطلب بيانات RNAsec اعتبارات إحصائية خاصة عند حساب معدل الاكتشاف الخاطئ (FDR) وقيمة p المعدلة، كما هو موضح في قسم الطرق.
للحصول على مزيد من المعلومات حول تصميم الدراسة، راجع ملخص تقرير أبحاث الطبيعة المرتبط بهذه المقالة.