شكرًا لك على زيارة Nature.com.إصدار المتصفح الذي تستخدمه لديه دعم محدود لـ CSS.للحصول على أفضل تجربة ، نوصي باستخدام مستعرض محدث (أو تعطيل وضع التوافق في Internet Explorer).في غضون ذلك ، لضمان استمرار الدعم ، سنعرض الموقع بدون أنماط وجافا سكريبت.
هناك حاجة إلى نظام موثوق في المختبر يمكنه إعادة إنتاج البيئة الفسيولوجية للقلب بدقة لاختبار المخدرات.أدى التوافر المحدود لأنظمة زراعة أنسجة القلب البشري إلى تفسيرات غير دقيقة لتأثيرات الأدوية القلبية.هنا ، قمنا بتطوير نموذج زراعة الأنسجة القلبية (CTCM) الذي يحفز بشكل كهروميكانيكي شرائح القلب ويخضع للتمدد الفسيولوجي خلال المرحلتين الانقباضي والانبساطي لدورة القلب.بعد 12 يومًا من الثقافة ، أدى هذا النهج جزئيًا إلى تحسين قابلية أقسام القلب للحياة ، لكنه لم يحافظ بشكل كامل على سلامتها الهيكلية.لذلك ، بعد فحص الجزيء الصغير ، وجدنا أن إضافة 100 نانومتر ثلاثي يودوثيرونين (T3) و 1 ميكرومتر ديكساميثازون (Dex) إلى وسطنا يحافظ على البنية المجهرية للأقسام لمدة 12 يومًا.بالاقتران مع علاج T3 / Dex ، حافظ نظام CTCM على ملفات تعريف النسخ ، والحيوية ، والنشاط الأيضي ، والسلامة الهيكلية على نفس مستوى أنسجة القلب الطازجة لمدة 12 يومًا.بالإضافة إلى ذلك ، يؤدي التمدد المفرط لأنسجة القلب في المزرعة إلى إحداث إشارات قلبية تضخمية ، مما يوفر دليلًا على قدرة CTCM على محاكاة الظروف الضخمية التي يسببها تمدد القلب.في الختام ، يمكن لـ CTCM نمذجة الفسيولوجيا والفيزيولوجيا المرضية للقلب في الثقافة على مدى فترات طويلة من الزمن ، مما يتيح فحصًا موثوقًا للأدوية.
قبل إجراء الأبحاث السريرية ، هناك حاجة إلى أنظمة موثوقة في المختبر يمكنها إعادة إنتاج البيئة الفسيولوجية لقلب الإنسان بدقة.يجب أن تحاكي هذه الأنظمة التمدد الميكانيكي المتغير ، ومعدل ضربات القلب ، والخصائص الكهربية.تُستخدم النماذج الحيوانية بشكل شائع كمنصة فحص لفسيولوجيا القلب مع موثوقية محدودة في عكس تأثيرات الأدوية في قلب الإنسان.في نهاية المطاف ، النموذج التجريبي المثالي لزراعة الأنسجة القلبية (CTCM) هو نموذج حساس للغاية ومخصص لمختلف التدخلات العلاجية والدوائية ، ويعيد إنتاج فسيولوجيا وفسيولوجيا القلب البشري بدقة 3.يحد غياب مثل هذا النظام من اكتشاف علاجات جديدة لفشل القلب 4،5 وأدى إلى تسمم القلب كأحد الأسباب الرئيسية للخروج من السوق.
على مدى العقد الماضي ، تم سحب ثمانية أدوية غير متعلقة بالقلب والأوعية الدموية من الاستخدام السريري لأنها تسبب إطالة فترة QT مما يؤدي إلى عدم انتظام ضربات القلب البطيني والموت المفاجئ 7.وبالتالي ، هناك حاجة متزايدة لاستراتيجيات موثوقة للفحص قبل السريري لتقييم فعالية القلب والأوعية الدموية والسمية.يوفر الاستخدام الأخير للخلايا العضلية للقلب المشتقة من الخلايا الجذعية المتعددة القدرات (hiPS-CM) في فحص الأدوية واختبار السمية حلاً جزئيًا لهذه المشكلة.ومع ذلك ، فإن الطبيعة غير الناضجة لـ hiPS-CMs ونقص التعقيد متعدد الخلايا لأنسجة القلب من القيود الرئيسية لهذه الطريقة.أظهرت الدراسات الحديثة أنه يمكن التغلب على هذا القيد جزئيًا باستخدام hiPS-CM المبكر لتشكيل الهلاميات المائية لأنسجة القلب بعد وقت قصير من بداية الانقباضات التلقائية وزيادة التحفيز الكهربائي تدريجيًا بمرور الوقت.ومع ذلك ، فإن هذه الأنسجة الدقيقة hiPS-CM تفتقر إلى الخصائص الكهربية الناضجة والتقلص لعضلة القلب البالغة.بالإضافة إلى ذلك ، يحتوي نسيج القلب البشري على بنية أكثر تعقيدًا ، تتكون من خليط غير متجانس من أنواع مختلفة من الخلايا ، بما في ذلك الخلايا البطانية ، والخلايا العصبية ، والأرومات الليفية اللحمية ، المترابطة بواسطة مجموعات محددة من بروتينات المصفوفة خارج الخلية.هذا التباين بين المجموعات غير العضلية القلبية 11 ، 12 ، 13 في قلب الثدييات البالغة هو عائق رئيسي لنمذجة أنسجة القلب باستخدام أنواع الخلايا الفردية.تؤكد هذه القيود الرئيسية على أهمية تطوير طرق لزراعة أنسجة عضلة القلب السليمة في ظل الظروف الفسيولوجية والمرضية.
أثبتت المقاطع الرفيعة (300 ميكرومتر) من قلب الإنسان أنها نموذج واعد لعضلة القلب البشرية السليمة.توفر هذه الطريقة الوصول إلى نظام كامل متعدد الخلايا ثلاثي الأبعاد مشابه لنسيج قلب الإنسان.ومع ذلك ، حتى عام 2019 ، كان استخدام أقسام القلب المثقف محدودًا بسبب بقاء الثقافة القصيرة (24 ساعة).ويرجع ذلك إلى عدد من العوامل بما في ذلك عدم التمدد الفيزيائي والميكانيكي ، والواجهة بين الهواء والسائل ، واستخدام الوسائط البسيطة التي لا تدعم احتياجات أنسجة القلب.في عام 2019 ، أظهرت العديد من المجموعات البحثية أن دمج العوامل الميكانيكية في أنظمة زراعة الأنسجة القلبية يمكن أن يطيل عمر المزرعة ، ويحسن التعبير القلبي ، ويحاكي علم أمراض القلب.تظهر دراستان أنيقتان 17 و 18 أن التحميل الميكانيكي أحادي المحور له تأثير إيجابي على النمط الظاهري للقلب أثناء الثقافة.ومع ذلك ، لم تستخدم هذه الدراسات التحميل الفيزيائي الميكانيكي الديناميكي ثلاثي الأبعاد لدورة القلب ، حيث تم تحميل أقسام القلب إما بقوى شد متساوية القياس 17 أو تحميل مساعد خطي 18.أدت طرق تمدد الأنسجة هذه إلى كبت العديد من جينات القلب أو الإفراط في التعبير عن الجينات المرتبطة باستجابات التمدد غير الطبيعية.والجدير بالذكر أن بيتوليس وآخرون.قام 19 بتطوير حمام ثقافة شريحة القلب الديناميكي لإعادة بناء دورة القلب باستخدام التغذية المرتدة لمحول الطاقة ومحركات التوتر.على الرغم من أن هذا النظام يسمح بنمذجة دورة القلب المختبرية بشكل أكثر دقة ، إلا أن التعقيد وانخفاض الإنتاجية لهذه الطريقة يحد من تطبيق هذا النظام.طور مختبرنا مؤخرًا نظام استزراع مبسط باستخدام التحفيز الكهربائي ووسيلة محسّنة للحفاظ على صلاحية أقسام من أنسجة الخنازير والقلب البشري لمدة تصل إلى 6 أيام.
في المخطوطة الحالية ، نصف نموذج زراعة الأنسجة القلبية (CTCM) باستخدام أقسام من قلب الخنازير تتضمن إشارات خلطية لتلخيص فسيولوجيا القلب ثلاثية الأبعاد والانتفاخ الفسيولوجي المرضي أثناء الدورة القلبية.يمكن لهذا CTCM زيادة دقة التنبؤ بالعقاقير قبل السريرية إلى مستوى لم يتحقق من قبل من خلال توفير نظام قلب فعال من حيث التكلفة ومتوسط ​​الإنتاجية يحاكي الفسيولوجيا / الفيزيولوجيا المرضية لقلب الثدييات لاختبار العقاقير قبل السريرية.
تلعب الإشارات الميكانيكية الديناميكية الدموية دورًا مهمًا في الحفاظ على وظيفة خلايا عضلة القلب في المختبر 22،23،24.في المخطوطة الحالية ، قمنا بتطوير CTCM (الشكل 1 أ) التي يمكن أن تحاكي البيئة القلبية للبالغين عن طريق إحداث التحفيز الكهربائي والميكانيكي على الترددات الفسيولوجية (1.2 هرتز ، 72 نبضة في الدقيقة).لتجنب تمدد الأنسجة المفرط أثناء الانبساط ، تم استخدام جهاز طباعة ثلاثية الأبعاد لزيادة حجم الأنسجة بنسبة 25٪ (الشكل 1 ب).تم ضبط السرعة الكهربائية التي يسببها نظام C-PACE لبدء 100 مللي ثانية قبل الانقباض باستخدام نظام الحصول على البيانات لإعادة إنتاج الدورة القلبية بالكامل.يستخدم نظام زراعة الأنسجة مشغل هوائي قابل للبرمجة (LB Engineering ، ألمانيا) لتوسيع غشاء سيليكون مرن بشكل دوري لإحداث توسع في شرائح القلب في الغرفة العلوية.تم توصيل النظام بخط هواء خارجي من خلال محول ضغط ، مما جعل من الممكن ضبط الضغط بدقة (± 1 مم زئبق) والوقت (± 1 مللي ثانية) (الشكل 1 ج).
أرفق قسم الأنسجة بحلقة الدعم مقاس 7 مم ، الموضحة باللون الأزرق ، داخل غرفة الثقافة بالجهاز.يتم فصل غرفة الثقافة عن غرفة الهواء بواسطة غشاء سيليكون مرن رقيق.ضع حشية بين كل حجرة لمنع التسرب.يحتوي غطاء الجهاز على أقطاب من الجرافيت توفر التحفيز الكهربائي.(ب) تمثيل تخطيطي لجهاز الأنسجة الكبير وحلقة التوجيه وحلقة الدعم.يتم وضع أقسام الأنسجة (البني) على الجهاز كبير الحجم مع وضع الحلقة التوجيهية في الأخدود على الحافة الخارجية للجهاز.باستخدام الدليل ، ضع بعناية حلقة الدعم المطلية بمادة لاصقة من الأكريليك على جزء من نسيج القلب.ج رسم بياني يوضح وقت التحفيز الكهربائي كدالة لضغط غرفة الهواء المتحكم فيه بواسطة مشغل هوائي قابل للبرمجة (PPD).تم استخدام جهاز الحصول على البيانات لمزامنة التحفيز الكهربائي باستخدام مستشعرات الضغط.عندما يصل الضغط في حجرة الثقافة إلى العتبة المحددة ، يتم إرسال إشارة نبضية إلى C-PACE-EM لتحفيز التحفيز الكهربائي.د صورة لأربعة CTCMs موضوعة على رف حاضنة.أربعة أجهزة متصلة بـ PPD واحد عبر دائرة تعمل بالهواء المضغوط ، ويتم إدخال مستشعرات الضغط في الصمام المرقئ لمراقبة الضغط في الدائرة الهوائية.يحتوي كل جهاز على ستة أقسام مناديل.
باستخدام مشغل هوائي واحد ، تمكنا من التحكم في 4 أجهزة CTCM ، كل منها يمكن أن يحتوي على 6 أقسام من الأنسجة (الشكل 1 د).في CTCM ، يتم تحويل ضغط الهواء في حجرة الهواء إلى ضغط متزامن في غرفة السوائل ويحث على التوسع الفسيولوجي لشريحة القلب (الشكل 2 أ والفيلم الإضافي 1).تقييم تمدد الأنسجة عند 80 ملم زئبق.فن.أظهر شد أقسام الأنسجة بنسبة 25٪ (الشكل 2 ب).وقد ثبت أن هذه النسبة المئوية للتمدد تتوافق مع طول قسيم عضلي فسيولوجي يتراوح بين 2.2 و 2.3 ميكرومتر من أجل انقباض قسم القلب الطبيعي.تم تقييم حركة الأنسجة باستخدام إعدادات الكاميرا المخصصة (الشكل التكميلي 1).تتوافق سعة وسرعة حركة الأنسجة (الشكل 2 ج ، د) مع التمدد أثناء الدورة القلبية والوقت أثناء الانقباض والانبساط (الشكل 2 ب).ظل تمدد وسرعة أنسجة القلب أثناء الانقباض والاسترخاء ثابتًا لمدة 12 يومًا في الثقافة (الشكل 2f).لتقييم تأثير التحفيز الكهربائي على الانقباض أثناء الثقافة ، قمنا بتطوير طريقة لتحديد التشوه النشط باستخدام خوارزمية التظليل (الشكل التكميلي 2 أ ، ب) وتمكنا من التمييز بين التشوهات مع وبدون التحفيز الكهربائي.نفس القسم من القلب (الشكل 2f).في المنطقة المتحركة من القطع (R6-9) ، كان الجهد أثناء التحفيز الكهربائي أعلى بنسبة 20٪ منه في حالة عدم وجود التحفيز الكهربائي ، مما يشير إلى مساهمة التحفيز الكهربائي في وظيفة الانقباض.
تؤكد الآثار التمثيلية لضغط غرفة الهواء وضغط غرفة السوائل وقياسات حركة الأنسجة أن ضغط الغرفة يغير ضغط غرفة السوائل ، مما يتسبب في حركة مقابلة لشريحة الأنسجة.ب آثار تمثيلية للنسبة المئوية للتمدد (الأزرق) لأقسام الأنسجة المقابلة لنسبة التمدد (البرتقالي).ج تتوافق الحركة المقاسة لشريحة القلب مع سرعة الحركة المقاسة.(د) المسارات التمثيلية للحركة الدورية (الخط الأزرق) والسرعة (الخط المنقط البرتقالي) في شريحة من القلب.هـ - القياس الكمي لوقت الدورة (ن = 19 شريحة لكل مجموعة ، من خنازير مختلفة) ، وقت الانكماش (ن = 19 شريحة لكل مجموعة) ، وقت الاسترخاء (ن = 19 شريحة لكل مجموعة ، من خنازير مختلفة) ، حركة الأنسجة (ن = 25).شرائح) / مجموعة من خنازير مختلفة) ، ذروة السرعة الانقباضية (ن = 24 (D0) ، 25 (D12) شريحة / مجموعة من خنازير مختلفة) ومعدل استرخاء الذروة (n = 24 (D0) ، 25 (D12) شرائح / مجموعة من خنازير مختلفة).أظهر اختبار الطالب ثنائي الذيل عدم وجود فرق كبير في أي معلمة.و آثار تحليل الإجهاد التمثيلي لأقسام الأنسجة مع (أحمر) وبدون تحفيز كهربائي (أزرق) ، عشر مناطق إقليمية من أقسام الأنسجة من نفس القسم.تُظهر الألواح السفلية القياس الكمي للفرق المئوي في الإجهاد في أقسام الأنسجة مع أو بدون تحفيز كهربائي في عشر مناطق من أقسام مختلفة. (ن = 8 شرائح / مجموعة من خنازير مختلفة ، يتم إجراء اختبار الطالب ثنائي الذيل ؛ **** p <0.0001 ، ** p <0.01 ، * p <0.05). (ن = 8 شرائح / مجموعة من خنازير مختلفة ، يتم إجراء اختبار الطالب ثنائي الذيل ؛ **** p <0.0001 ، ** p <0.01 ، * p <0.05). (ن = 8 срезов / группу от разных свиней، проводится двусторонний t-критерий Стьюдента؛ **** p <0،0001، * p. <0،01، * p. <0،01) (ن = 8 أقسام / مجموعة من خنازير مختلفة ، اختبار الطالب ثنائي الذيل ؛ **** p <0.0001 ، ** p <0.01 ، * p <0.05). （n = 8 片 / 组 ， 来自 不同 的 猪 ， 进行 双 尾 学生 t 检验 ； **** p <0.0001 ， ** p <0.01 ， * p <0.05）。 （n = 8 片 / 组 ， 来自 不同 的 猪 ， 进行 双 尾 学生 t 检验 ； **** p <0.0001 ， ** p <0.01 ， * p <0.05）。 (ن = 8 срезов / группу، от разных свиней، двусторонний критерий Стьюдента؛ **** p <0،0001، ** p <0،01، * p <0،05). (ن = 8 أقسام / مجموعة ، من خنازير مختلفة ، اختبار الطالب ثنائي الذيل ؛ **** p <0.0001 ، ** p <0.01 ، * p <0.05).تمثل أشرطة الخطأ متوسط ​​± الانحراف المعياري.
في نظام استنبات شرائح القلب الاستاتيكي السابق [20 ، 21] ، حافظنا على الجدوى والوظيفة والسلامة الهيكلية لشرائح القلب لمدة 6 أيام من خلال تطبيق التحفيز الكهربائي وتحسين التركيبة المتوسطة.ومع ذلك ، بعد 10 أيام ، انخفضت هذه الأرقام بشكل حاد.سوف نشير إلى الأقسام التي تم تربيتها في نظام الثقافة الحيوية الثابتة السابق 20 ، 21 ظروف تحكم (Ctrl) وسنستخدم وسيطنا المُحسَّن سابقًا كظروف MC وثقافة في ظل التحفيز الميكانيكي والكهربائي المتزامن (CTCM).مُسَمًّى .أولاً ، قررنا أن التحفيز الميكانيكي بدون التحفيز الكهربائي كان غير كافٍ للحفاظ على بقاء الأنسجة لمدة 6 أيام (الشكل التكميلي 3 أ ، ب).ومن المثير للاهتمام ، أنه مع إدخال التحفيز الفيزيائي والميكانيكي والكهربائي باستخدام STCM ، ظلت صلاحية أقسام القلب لمدة 12 يومًا كما هي في أقسام القلب الجديدة تحت ظروف MS ، ولكن ليس في ظل ظروف Ctrl ، كما هو موضح في تحليل MTT (الشكل 1).3 أ).يشير هذا إلى أن التحفيز الميكانيكي ومحاكاة الدورة القلبية يمكن أن تحافظ على أقسام الأنسجة قابلة للحياة لمرتين ما تم الإبلاغ عنه في نظام الثقافة الثابتة السابق.ومع ذلك ، أظهر تقييم السلامة الهيكلية لأقسام الأنسجة عن طريق الوسم المناعي لتروبونين القلب T و connexin 43 أن تعبير connexin 43 كان أعلى بشكل ملحوظ في أنسجة MC في اليوم 12 منه في عناصر التحكم في نفس اليوم.ومع ذلك ، لم يتم الاحتفاظ بشكل كامل بتعبير connexin 43 وتشكيل قرص Z (الشكل 3 ب).نحن نستخدم إطارًا للذكاء الاصطناعي (AI) لقياس التكامل البنيوي للأنسجة ، وهو عبارة عن خط أنابيب للتعلم العميق قائم على الصور يعتمد على تروبونين-تي وكونيكسين تلطيخ لقياس السلامة الهيكلية وإضاءة شرائح القلب تلقائيًا من حيث قوة التوطين.تستخدم هذه الطريقة شبكة عصبية تلافيفية (CNN) وإطار عمل تعليمي عميق لتحديد السلامة الهيكلية لأنسجة القلب بطريقة آلية وغير متحيزة ، كما هو موضح في المرجع.26. أظهرت أنسجة MC تحسنًا في التشابه الهيكلي لليوم 0 مقارنة بأقسام التحكم الساكنة.بالإضافة إلى ذلك ، كشف تلوين Masson ثلاثي الألوان عن نسبة أقل بكثير من التليف تحت ظروف MS مقارنة بظروف التحكم في اليوم 12 من الثقافة (الشكل 3 ج).في حين أن CTCM زاد من قابلية أقسام أنسجة القلب في اليوم الثاني عشر إلى مستوى مماثل لمستوى أنسجة القلب الطازجة ، إلا أنه لم يحسن بشكل كبير من السلامة الهيكلية لأقسام القلب.
يُظهر الرسم البياني الشريطي القياس الكمي لجدوى MTT لشرائح القلب الطازجة (D0) أو ثقافة شرائح القلب لمدة 12 يومًا إما في الثقافة الثابتة (D12 Ctrl) أو في CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0) ، 15 (D12 Ctrl) ، 12 (D12 MC) شرائح / مجموعة من خنازير مختلفة ، طريقة واحدة مقارنة باختبار ANOVA و # 0،01. يُظهر الرسم البياني الشريطي القياس الكمي لجدوى MTT لشرائح القلب الطازجة (D0) أو ثقافة شرائح القلب لمدة 12 يومًا إما في الثقافة الثابتة (D12 Ctrl) أو في CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0) ، 15 (D12 Ctrl) ، 12 (D12 MC) شرائح / مجموعة من خنازير مختلفة ، طريقة واحدة مقارنة باختبار ANOVA و # 0،01.يُظهر الرسم البياني القياس الكمي لجدوى أقسام القلب الطازجة MTT (D0) أو ثقافة أقسام القلب لمدة 12 يومًا في أي ثقافة ثابتة (تحكم D12) أو CTCM (D12 MC) (ن = 18 (D0) ، 15 (تحكم D12).)) ، 12 (D12 MC) أقسام / مجموعة من خنازير مختلفة ، يتم إجراء اختبار ANOVA أحادي الاتجاه ؛#### p <0،0001 по сравнению с D0 и ** p <0،01 по сравнению с D12 Ctrl). #### p <0.0001 مقارنة بـ D0 و ** p <0.01 مقارنة بـ D12 Ctrl). أ 条形图 显示 在 静态 培养 (D12 Ctrl) 或 CTCM (D12 MC) (ن = 18 (D0) ، 15 (D12 Ctrl) 中 新鲜 心脏 切片 (D0) 或 心脏 切片 培养 12 天 的 MTT 活力 的 量化) ， 来自 不同 猪 ### AN p <0.0001 ， 与 D12 Ctrl 相比 ， ** p <0.01)。 أ 条形图 显示 在 静态 培养 (D12 Ctrl) 或 CTCM (D12 MC) (ن = 18 (D0) ، 15 (D12 Ctrl) 中 新鲜 心脏 切片 (D0) ， 来自 不同 猪 的 12 (D12 MC) 切片 / 组 ， 进行 单向 ANOVA ### 1 D0 )رسم بياني يوضح القياس الكمي لجدوى MTT في أقسام القلب الطازج (D0) أو أقسام القلب المزروعة لمدة 12 يومًا في ثقافة ثابتة (تحكم D12) أو CTCM (D12 MC) (ن = 18 (D0) ، 15 (تحكم D12)) ، 12 (D12 MC) أقسام / مجموعة من خنازير مختلفة ، اختبار ANOVA أحادي الاتجاه ؛#### p <0،0001 по сравнению с D0، ** p <0،01 по сравнению с D12 Ctrl). #### p <0.0001 مقارنة بـ D0 ، ** p <0.01 مقارنة بـ D12 Ctrl).(ب) Troponin-T (أخضر) و connexin 43 (أحمر) و DAPI (أزرق) في أقسام قلب معزولة حديثًا (D0) أو أقسام قلب مستزرعة في ظروف ثابتة (Ctrl) أو ظروف CTCM (MC) لمدة 12 يومًا) من صور التألق المناعي التمثيلية (مقياس فارغ = 100 ميكرومتر). قياس الذكاء الاصطناعي للسلامة الهيكلية لأنسجة القلب (ن = 7 (D0) ، 7 (D12 Ctrl) ، 5 (D12 MC) شرائح / مجموعة كل واحدة من خنزير مختلف ، اختبار ANOVA أحادي الاتجاه ؛ #### p <0.0001 مقارنة بـ D0 و **** p <0.0001 مقارنة بـ D12 Ctrl). قياس الذكاء الاصطناعي للسلامة الهيكلية لأنسجة القلب (ن = 7 (D0) ، 7 (D12 Ctrl) ، 5 (D12 MC) شرائح / مجموعة كل واحدة من خنازير مختلفة ، يتم إجراء اختبار ANOVA أحادي الاتجاه ؛ #### p <0.0001 مقارنة بـ D0 و **** p <0.0001 مقارنة بـ D12 Ctrl). оличественная оценка структурной целостности сердечной ткани искуственным интеллектом (n = 7 (D0урной) / MC пп от разных свиней، проводится однофакторный тест ANOVA ؛ #### p <0،0001 по сравнению с D0 и **** p <0،0001 по сран). القياس الكمي للسلامة الهيكلية لأنسجة القلب بواسطة الذكاء الاصطناعي (ن = 7 (D0) ، 7 (D12 Ctrl) ، 5 (D12 MC) أقسام / مجموعات من خنازير مختلفة ، اختبار ANOVA أحادي الاتجاه ؛ #### p <0.0001 مقابل D0 و **** p <0.0001 مقارنة بـ D12 Ctrl).人工智能 量化 心脏 组织 结构 完整性 （n = 7 (D0) ، 7 (D12 Ctrl) ، 5 (D12 MC) شرائح / مجموعة كل واحدة من الخنازير المختلفة ، اختبار ANOVA أحادي الاتجاه ؛ #### p <0.0001 与 D0 相比 ， **** p <0.0001 与 D12 Ctrl 相比）。人工智能 量化 心脏 组织 结构 完整性 （n = 7 (D0) ، 7 (D12 Ctrl) ، 5 (D12 MC) شرائح / مجموعة كل من الخنازير المختلفة ، اختبار ANOVA أحادي الاتجاه ؛ #### p <0.0001 与 D0 相比 ， **** p <0.0001 与 D12 Ctrl 相比）。 скусственный интеллект для количественной оценки структурной целостности сердечзной ткани، n = 7 (D012) . الذكاء الاصطناعي لقياس السلامة الهيكلية لأنسجة القلب (ن = 7 (D0) ، 7 (D12 Ctrl) ، 5 (D12 MC) أقسام / مجموعة كل واحدة من الخنازير المختلفة ، اختبار ANOVA أحادي الاتجاه ؛ #### p <0.0001 مقابل .D0 للمقارنة **** p <0.0001 مقارنة بـ D12 Ctrl). ج صور تمثيلية (يسار) وتقدير كمي (يمين) لشرائح القلب الملطخة بصبغة ترايكروم ماسون (المقياس العاري = 500 ميكرومتر) (ن = 10 شرائح / مجموعة من خنزير مختلف ، يتم إجراء اختبار ANOVA أحادي الاتجاه ؛ #### p <0.0001 مقارنة بـ D0 و *** p <0.001 مقارنة بـ D12 Ctrl). ج صور تمثيلية (يسار) وتقدير كمي (يمين) لشرائح القلب الملطخة بصبغة ترايكروم ماسون (المقياس العاري = 500 ميكرومتر) (ن = 10 شرائح / مجموعة من خنازير مختلفة ، يتم إجراء اختبار ANOVA أحادي الاتجاه ؛ #### p <0.0001 مقارنة بـ D0 و *** p <0.001 مقارنة بـ D12 Ctrl). c Репрезентативные изображения (слева) و количественная (справа) срезов сердца، окрашенсных сона (масштаб без покрытия = 500 мкм) (العدد = 10 срезов / группу от разных свиней، выполняется односторонснсния) ю с D0 и *** p <0،001 по сравнению с D12 Ctrl). ج صور تمثيلية (يسار) وتقدير (يمين) لأقسام القلب ملطخة بصبغة ماسون ثلاثية الألوان (مقياس غير مصقول = 500 ميكرومتر) (ن = 10 أقسام / مجموعة من خنازير مختلفة ، تم إجراء اختبار ANOVA أحادي الاتجاه ؛ #### p <0 .0001 مقارنة بـ D0 و *** p <0.001 مقارنة بـ D12 Ctrl). ج 用 ماسون 三 色 染料 染色 的 心脏 切片 的 代表性 图像 （左） 和 量化 （右） （裸 尺度 = 500 µm） （n = 10 切片 / 组 ， 每组 来自 猪 ， 进行 单向 ANOVA 测试 ### D0.000 。 C 用 ماسون 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 （左 左） 量化 （右） 裸 尺度 裸 尺度 裸 尺度 裸 尺度 = 500 م） （ن = 10 个 切片 组 每 组 来自 不同 猪 ， 进行 D0 #### ####相比）。 c Репрезентативные изображения (слева) و количественный (справа) срезов сердца ، окрашенный анализ (справа) сона (истая шкала = 500 мкм) (n = 10 срезов / группа، каждый от другой свиньи، протестировано срезовоно комощононор. о анализа ؛ ### #p <0،0001 по сравнению с D0 ، *** p <0،001 по сравнению с D12 Ctrl). ج صور تمثيلية (يسار) وتقدير (يمين) لأقسام القلب ملطخة بصبغة ماسون ثلاثية الألوان (فارغة = 500 ميكرومتر) (ن = 10 أقسام / مجموعة ، كل منها من خنزير مختلف ، تم اختبارها من خلال تحليل التباين أحادي الاتجاه ؛ ### # p <0.0001 مقارنة بـ D0 ، *** p <0.001 مقارنة بـ D12 Ctrl).تمثل أشرطة الخطأ متوسط ​​± الانحراف المعياري.
افترضنا أنه من خلال إضافة جزيئات صغيرة إلى وسط الاستزراع ، يمكن تحسين سلامة خلايا عضلة القلب وتقليل تطور التليف أثناء ثقافة CTCM.لذلك قمنا بفحص الجزيئات الصغيرة باستخدام ثقافات التحكم الثابتة لدينا بسبب العدد الصغير من العوامل المربكة.تم اختيار ديكساميثازون (Dex) وثلاثي يودوثيرونين (T3) و SB431542 (SB) لهذه الشاشة.تم استخدام هذه الجزيئات الصغيرة سابقًا في ثقافات hiPSC-CM للحث على نضوج خلايا عضلة القلب عن طريق زيادة طول القسيم العضلي ، والأنابيب T ، وسرعة التوصيل.بالإضافة إلى ذلك ، من المعروف أن كل من Dex (جلايكورتيكويد) و SB يثبطان الالتهاب.لذلك ، قمنا باختبار ما إذا كان تضمين واحد أو مجموعة من هذه الجزيئات الصغيرة سيحسن السلامة الهيكلية لأقسام القلب.للفحص الأولي ، تم اختيار جرعة كل مركب بناءً على التركيزات المستخدمة بشكل شائع في نماذج زراعة الخلايا (1 ميكرومتر Dex27 و 100 نانومتر T327 و 2.5 ميكرومتر SB31).بعد 12 يومًا من الثقافة ، أدى الجمع بين T3 و Dex إلى السلامة الهيكلية المثلى لخلايا عضلة القلب والحد الأدنى من إعادة التشكيل الليفي (الشكلان التكميليان 4 و 5).بالإضافة إلى ذلك ، أدى استخدام ضعف أو ضعف هذه التركيزات من T3 و Dex إلى تأثيرات ضارة مقارنة بالتركيزات العادية (الشكل التكميلي 6 أ ، ب).
بعد الفحص الأولي ، أجرينا مقارنة وجهاً لوجه لظروف الثقافة الأربعة (الشكل 4 أ): Ctrl: أقسام القلب المزروعة في ثقافتنا الثابتة الموصوفة سابقًا باستخدام وسيطنا الأمثل ؛20.21 TD: T3 و Ctrl s أضيفا Dex يوم الأربعاء ؛MC: أقسام القلب المزروعة في CTCM باستخدام وسيطنا المُحسَّن مسبقًا ؛و MT: CTCM مع إضافة T3 و Dex إلى الوسط.بعد 12 يومًا من الزراعة ، ظلت صلاحية أنسجة MS و MT كما هي في الأنسجة الطازجة التي تم تقييمها بواسطة اختبار MTT (الشكل 4 ب).ومن المثير للاهتمام ، أن إضافة T3 و Dex إلى ثقافات transwell (TD) لم ينتج عنه تحسن كبير في الجدوى مقارنة بشروط Ctrl ، مما يشير إلى دور مهم للتحفيز الميكانيكي في الحفاظ على قابلية أقسام القلب.
مخطط تصميم تجريبي يصور ظروف الثقافة الأربعة المستخدمة لتقييم آثار التحفيز الميكانيكي ومكملات T3 / Dex على متوسط ​​لمدة 12 يومًا. يوضح الرسم البياني الشريطي B الكمي للبقاء بعد 12 يومًا من الثقافة في جميع الظروف الثقافية الأربعة (CTRL ، TD ، MC ، و MT) مقارنةً بشرائح القلب الطازجة (D0) (ن = 18 (D0) ، 15 (D12 Ctrl ، D12 TD و D12 MT) ، 12 (D12 MC) من بين الخنازير المختلفة ، يتم إجراء اختبار واحد. ** p <0.01 مقارنة بـ D12 CTRL). يوضح الرسم البياني الشريطي B الكمي للبقاء بعد 12 يومًا من الثقافة في جميع الظروف الثقافية الأربعة (CTRL ، TD ، MC ، و MT) مقارنةً بشرائح القلب الطازجة (D0) (ن = 18 (D0) ، 15 (D12 Ctrl ، D12 TD و D12 MT) ، 12 (D12 MC) من بين الخنازير المختلفة ، يتم إجراء اختبار واحد. ** p <0.01 مقارنة بـ D12 CTRL). b истограмма показывает количественную оценку изнеспособности ерез 12 дней после культивирововснсти вирования (контроль، TD، MC и MT) по сравнению совежими срезами сердца (D0) (ن = 18 (D0) ، 15 (D12 Ctrl ، D12 ، TDорово (D12MT)) азных свиней، проводится односторонний тест ANOVA؛ #### p <0،0001، ### p <0،001 по сравнению с D0 и ** p <0،01 по срав. (ب) يوضح الرسم البياني الشريطي القياس الكمي للبقاء في 12 يومًا بعد الثقافة في جميع ظروف الثقافة الأربعة (التحكم ، TD ، MC ، و MT) مقارنة بأقسام القلب الطازجة (D0) (ن = 18 (D0) ، 15 (D12 Ctrl ، D12 TD ، و D12 MT) ، 12 (D12 MC) أقسام / مجموعة من خنازير مختلفة ، في اتجاه واحد اختبار ANOVA ؛ #### p <0.01. ب 条形图 显示 所有 4 种 培养 条件 （Ctrl 、 TD 、 MC 和 MT） 与 新鲜 心脏 切片 (D0) (ن = 18 (D0) 、 15 (D12 Ctrl 、 D12 TD 和 D12 MT) ， 来自 不同 猪 的 12 (D12 MCOV) ### 0.00 ， 进行相比 ， ** ف <0.01 与 D12 控制）。ب 4 12 (D12 MC) ب Гистограмма، показывающая все 4 условия культивирования (контроль، TD، MC и MT) по сравнению со свсежзим 0)، 15 (D12 Ctrl، D12 TD и D12 MT)، от разных свиней 12 (D12 MC) срезы / группа، односторонний тест ANOVA؛ #### p <0،0001، ### p0،01،001 сравнению с контролем D12). ب رسم بياني يوضح جميع ظروف الاستنبات الأربعة (التحكم ، TD ، MC ، MT) مقارنة بأقسام القلب الطازجة (D0) (العدد = 18 (D0) ، 15 (D12 Ctrl ، D12 TD و D12 MT) ، من الخنازير المختلفة 12 (D12 MC) الأقسام / المجموعة ، اختبار ANOVA أحادي الاتجاه ؛ #### p <0.0001، ### p <0.001 مقابل D0، ** D p <0.01. ج يوضح الرسم البياني الشريطي القياس الكمي لتدفق الجلوكوز بعد 12 يومًا من الثقافة في جميع ظروف الثقافة الأربعة (Ctrl و TD و MC و MT) مقارنة بشرائح القلب الطازجة (D0) (n = 6 شرائح / مجموعة من خنازير مختلفة ، يتم إجراء اختبار ANOVA أحادي الاتجاه ؛ ### p <0.001 ، مقارنة بـ D0 و *** p <0.001 مقارنة بـ D12 Ctrl). ج يوضح الرسم البياني الشريطي القياس الكمي لتدفق الجلوكوز بعد 12 يومًا من الثقافة في جميع ظروف الثقافة الأربعة (Ctrl و TD و MC و MT) مقارنة بشرائح القلب الطازجة (D0) (n = 6 شرائح / مجموعة من خنازير مختلفة ، يتم إجراء اختبار ANOVA أحادي الاتجاه ؛ ### p <0.001 ، مقارنة بـ D0 و *** p <0.001 مقارنة بـ D12 Ctrl). ج Гистограмма показывает количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после культивированся ильтивированся рования (контроль، TD، MC и MT) по сравнению свежими срезами сердца (D0) (n = 6 срезов / групупуй осазнини) олняется тест ANOVA ؛ ### p <0،001 по сравнению с D0 и *** p <0،001 по сравнению с D12 Ctrl). ج يُظهر الرسم البياني الرسم البياني القياس الكمي لتدفق الجلوكوز بعد 12 يومًا من الثقافة تحت جميع ظروف الثقافة الأربعة (التحكم ، TD ، MC و MT) مقارنة بأقسام القلب الطازجة (D0) (ن = 6 أقسام / مجموعة من خنازير مختلفة ، تم إجراء اختبار ANOVA أحادي الاتجاه ؛ ### p <0.001 مقارنة بـ D0 و *** p <0.001 مقارنة بـ D12 Ctrl). ج 条形图 显示 所有 4 种 培养 条件 （Ctrl 、 TD 、 MC 和 MT） 与 新鲜 心脏 切片 (D0) 相比 ， 培养 后 12 天 的 葡萄糖 n = 6 片 / 组 ， 不同 猪 ， 单向 执行 ANOVA 测试 ### p <0.001 ### p <0.001 ### p <0.001 ）。 C 条形图 显示 所有 4 种 条件 （（ctrl 、 td 、 mc 和 mt） 新鲜 心脏 切片 切片 切片 相比 ， 培养 后 后 12 天 的 （n = 6 片 / 组 ， 来自 猪 ， ， ， ， ， 0.00 ， *** ف <0.001 与 D12 Ctrl 相比）。 ج Гистограмма، показывающая количественную оценку потока глюкозы через 12 показывающая вирования (контроль، TD، MC и MT) по сравнению свежими срезами сердца (D0) (n = 6 срезов / группа، основний ыли проведены тесты ANOVA؛ ### p <0،001 по сравнению с D0، *** p <0،001 по сравнению с D12 (контроль). ج رسم بياني يوضح القياس الكمي لتدفق الجلوكوز في 12 يومًا بعد الثقافة لجميع ظروف الثقافة الأربعة (التحكم ، TD ، MC ، و MT) مقارنة بأقسام القلب الطازجة (D0) (ن = 6 أقسام / مجموعة ، من خنازير مختلفة ، تم إجراء اختبارات ANOVA من جانب واحد ، ### p <0.001 مقارنة بـ D0 ، *** p <0.001 مقارنة بـ D12 (مجموعة التحكم).د قطع تحليل سلالة من الأنسجة الطازجة (الزرقاء) ، اليوم 12 MC (الأخضر) ، واليوم 12 طن متري (الأحمر) في عشر نقاط قسم الأنسجة الإقليمية (ن = 4 شرائح / مجموعة ، اختبار ANOVA أحادي الاتجاه ؛ لم يكن هناك فرق كبير بين المجموعات).مخطط بركان يُظهر الجينات المعبر عنها تفاضليًا في أقسام القلب الجديدة (D0) مقارنة بأقسام القلب المزروعة في ظل ظروف ثابتة (Ctrl) أو تحت ظروف MT (MT) لمدة 10-12 يومًا.و خريطة الحرارة لجينات قسيم عضلي لأقسام القلب المزروعة تحت كل من ظروف الاستنبات.تمثل أشرطة الخطأ متوسط ​​± الانحراف المعياري.
الاعتماد الأيضي على التحول من أكسدة الأحماض الدهنية إلى تحلل السكر هو سمة مميزة لاختلال التمايز في عضلة القلب.تستخدم خلايا عضلة القلب غير الناضجة الجلوكوز في المقام الأول لإنتاج ATP ولديها ميتوكوندريا ناقصة التنسج مع القليل من الكريستالات.أظهرت تحليلات استخدام الجلوكوز أنه في ظل ظروف MC و MT ، كان استخدام الجلوكوز مشابهًا لذلك في أنسجة اليوم 0 (الشكل 4 ج).ومع ذلك ، أظهرت عينات Ctrl زيادة معنوية في استخدام الجلوكوز مقارنة بالأنسجة الطازجة.يشير هذا إلى أن الجمع بين CTCM و T3 / Dex يعزز قابلية الأنسجة ويحافظ على النمط الظاهري الأيضي لأقسام القلب المزروعة لمدة 12 يومًا.بالإضافة إلى ذلك ، أظهر تحليل الإجهاد أن مستويات الإجهاد ظلت كما هي في أنسجة القلب الطازجة لمدة 12 يومًا تحت ظروف MT و MS (الشكل 4 د).
لتحليل التأثير الكلي لـ CTCM و T3 / Dex على المشهد النسخي العالمي لأنسجة شريحة القلب ، أجرينا RNAseq على شرائح القلب من جميع ظروف الثقافة الأربعة المختلفة (البيانات التكميلية 1).ومن المثير للاهتمام ، أن أقسام MT أظهرت تشابهًا نسبيًا عاليًا مع أنسجة القلب الطازجة ، مع التعبير عن 16 فقط تفاضليًا من أصل 13642 جينًا.ومع ذلك ، كما أوضحنا سابقًا ، عرضت شرائح Ctrl 1229 جينًا معبرًا تفاضليًا بعد 10-12 يومًا في الثقافة (الشكل 4 هـ).تم تأكيد هذه البيانات بواسطة qRT-PCR لجينات القلب والأرومة الليفية (الشكل التكميلي 7 أ-ج).ومن المثير للاهتمام أن أقسام Ctrl أظهرت انخفاضًا في تنظيم جينات دورة القلب والخلية وتنشيط برامج الجينات الالتهابية.تشير هذه البيانات إلى أن عدم التمايز ، الذي يحدث عادةً بعد الزراعة طويلة الأجل ، يتم تخفيفه تمامًا في ظل ظروف MT (الشكل التكميلي 8 أ ، ب).أظهرت دراسة متأنية لجينات القسيم العضلي أنه في ظل ظروف MT فقط ، يتم الحفاظ على الجينات التي تشفر الساركومير (الشكل 4f) والقناة الأيونية (الشكل التكميلي 9) ، مما يحميها من الكبت تحت ظروف Ctrl و TD و MC.توضح هذه البيانات أنه مع مزيج من التحفيز الميكانيكي والخلطي (T3 / Dex) ، يمكن أن تظل نسخة شريحة القلب مماثلة لشرائح القلب الطازجة بعد 12 يومًا في الثقافة.
هذه النتائج النسخية مدعومة بحقيقة أن السلامة الهيكلية لخلايا عضلة القلب في أقسام القلب يتم الحفاظ عليها بشكل أفضل تحت ظروف MT لمدة 12 يومًا ، كما يتضح من connexin 43 السليمة والمترجمة (الشكل 5 أ).بالإضافة إلى ذلك ، تم تقليل التليف في أقسام القلب تحت ظروف MT بشكل كبير مقارنةً بـ Ctrl ومشابه لأقسام القلب الحديثة (الشكل 5 ب).توضح هذه البيانات أن الجمع بين التحفيز الميكانيكي وعلاج T3 / Dex يحافظ بشكل فعال على بنية القلب في أقسام القلب في الثقافة.
صور تمثيلية للتألق المناعي لـ تروبونين- T (أخضر) ، وكونيكسين 43 (أحمر) ، و DAPI (أزرق) في أقسام القلب المعزولة حديثًا (D0) أو مثقفًا لمدة 12 يومًا في جميع ظروف زراعة قسم القلب الأربعة (شريط المقياس = 100 ميكرومتر).). قياس الذكاء الاصطناعي للسلامة الهيكلية لأنسجة القلب (ن = 7 (D0 و D12 Ctrl) ، 5 (D12 TD ، D12 MC و D12 MT) شرائح / مجموعة من خنازير مختلفة ، اختبار ANOVA أحادي الاتجاه ؛ #### p <0.0001 مقارنة بـ D0 و * p <0.05 ، أو **** p <0.0001 مقارنة بـ D12 Ctrl). قياس الذكاء الاصطناعي للسلامة الهيكلية لأنسجة القلب (ن = 7 (D0 و D12 Ctrl) ، 5 (D12 TD ، D12 MC و D12 MT) شرائح / مجموعة من خنازير مختلفة ، اختبار ANOVA أحادي الاتجاه ؛ #### p <0.0001 مقارنة بـ D0 و * p <0.05 ، أو **** p <0.0001 مقارنة بـ D12 Ctrl). оличественная оценка структурной целостности ткани сердца спомощью искуственного интеллект0 (Dинтеллект0 (Dинтеллект0 (n = 5 MT). ю с D12 Ctrl). القياس الكمي للسلامة الهيكلية لأنسجة القلب باستخدام الذكاء الاصطناعي (ن = 7 (D0 و D12 Ctrl) ، 5 أقسام / مجموعة (D12 TD ، D12 MC و D12 MT) من خنازير مختلفة ، اختبار ANOVA أحادي الاتجاه ؛ #### p <0.0001 مقارنة بـ D0 و * p <0.05 أو **** p <0.0001 مقارنة بـ D12 Ctrl).. 。. ل 相比）。القياس الكمي للسلامة الهيكلية لأنسجة القلب باستخدام الذكاء الاصطناعي في الخنازير المختلفة (ن = 7 (D0 و D12 Ctrl) ، 5 (D12 TD و D12 MC و D12 MT) أقسام / مجموعة) مع اختبار ANOVA أحادي الاتجاه ؛#### p <0،0001 по сравнению с D0 и * p <0،05 или **** p <0،0001 по сравнению с D12 Ctrl). #### p <0.0001 مقارنة بـ D0 و * p <0.05 أو **** p <0.0001 مقارنة بـ D12 Ctrl). ب الصور التمثيلية والقياس الكمي لشرائح القلب الملطخة بصبغة ماسون ثلاثية الألوان (شريط المقياس = 500 ميكرومتر) (ن = 10 (D0 ، D12 Ctrl ، D12 TD ، و D12 MC) ، شرائح / مجموعة 9 (D12 MT) من خنازير مختلفة ، يتم إجراء اختبار ANOVA أحادي الاتجاه ؛ #### p <0.0001 مقارنة بـ D0 أو *** p <0.0001. ب الصور التمثيلية والقياس الكمي لشرائح القلب الملطخة بصبغة ماسون ثلاثية الألوان (شريط المقياس = 500 ميكرومتر) (ن = 10 (D0 ، D12 Ctrl ، D12 TD ، و D12 MC) ، شرائح / مجموعة 9 (D12 MT) من خنازير مختلفة ، يتم إجراء اختبار ANOVA أحادي الاتجاه ؛ #### p <0.0001 مقارنة بـ D0 أو *** p <0.0001. b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца ، окрашенных трихромным колас нейка = 500 мкм) (العدد = 10 (D0، D12 Ctrl، D12 TD и D12 MC)، 9 (D12 MT) авнению с D0 и *** p <0،001 или **** p <0،0001 по сравнению с D12 Ctrl). ب الصور التمثيلية والقياس الكمي لأقسام القلب الملطخة بصبغة ماسون ثلاثية الألوان (شريط المقياس = 500 ميكرومتر) (ن = 10 (D0 ، D12 Ctrl ، D12 TD و D12 MC) ، 9 (D12 MT) أقسام / مجموعة من خنازير مختلفة ، تم إجراء ANOVA في اتجاه واحد ؛ #### p <0.0001 vs. ب 用 ماسون 三 色 染料 染色 的 心脏 切片 的 代表性 图像 和 量化 （比例尺 = 500 ميكرون） （ن = 10 （D0 、 D12 Ctrl 、 D12 TD 和 D12 MC） ， 来自 不同 猪 的 9 个 （（， ， *** p <0.001 ， 或 **** p <0.0001 与 D12 Ctrl 相比）。 ب 用 ماسون 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 和 量化 （比例 尺 尺 尺 = 500 µ م） n = 10 （d0 、 d12 ctrl 、 d12 td 和 d12 mc） 不同 的 9 个 mt 切片组 ， 进行 单 因素 方差 分析 ； #### p <0.0001 与 D0 相比 ， *** p <0.001 ， 或 **** p <0.0001 与 D12 Ctrl 相比）。 ب Репрезентативные изображения و количественная оценка срезов сердца ، окрашенных трихромом баснасная) (ن = 10 (D0، D12 Ctrl، D12 TD и D12 MC)، 9 (D12 MT) срезов от разных свиней / группы، один- способ ANOVA؛ #### p <0،0001 по сран1 по сравнению с D12 Ctrl). ب الصور التمثيلية والقياس الكمي لأقسام القلب الملطخة بثلاثية الكروم من ماسون (شريط المقياس = 500 ميكرومتر) (ن = 10 (D0 ، D12 Ctrl ، D12 TD و D12 MC) ، 9 (D12 MT) أقسام من خنازير / مجموعة مختلفة ، طريقة ANOVA واحدة ؛ #### p <0.0001 مقارنة بـ D0 ، *** p <0.001 أو **** p <0.0001).تمثل أشرطة الخطأ متوسط ​​± الانحراف المعياري.
أخيرًا ، تم تقييم قدرة CTCM على محاكاة تضخم القلب عن طريق زيادة تمدد أنسجة القلب.في CTCM ، زاد ضغط غرفة الهواء القصوى من 80 مم زئبق إلى 80 مم زئبق.فن.(امتداد عادي) حتى 140 مم زئبق فن.(الشكل 6 أ).هذا يتوافق مع زيادة بنسبة 32٪ في التمدد (الشكل 6 ب) ، والتي تم عرضها سابقًا على أنها النسبة المئوية المطابقة المطلوبة لأقسام القلب لتحقيق طول قسيم عضلي مشابه لذلك الذي يظهر في التضخم.ظل تمدد وسرعة أنسجة القلب أثناء الانقباض والاسترخاء ثابتًا خلال ستة أيام من الثقافة (الشكل 6 ج).تعرضت الأنسجة القلبية من حالات MT إلى تمدد طبيعي (MT (عادي)) أو ظروف تمدد مفرط (MT (OS)) لمدة ستة أيام.بالفعل بعد أربعة أيام في الثقافة ، تم رفع المرقم الحيوي الضخامي NT-ProBNP بشكل ملحوظ في الوسط تحت ظروف MT (OS) مقارنة بظروف MT (العادية) (الشكل 7 أ).بالإضافة إلى ذلك ، بعد ستة أيام من الاستنبات ، زاد حجم الخلية في MT (OS) (الشكل 7 ب) بشكل ملحوظ مقارنة بأقسام القلب MT (الطبيعي).بالإضافة إلى ذلك ، تمت زيادة الإزفاء النووي لـ NFATC4 بشكل كبير في الأنسجة الممدودة بشكل مفرط (الشكل 7 ج).تُظهر هذه النتائج التطور التدريجي لإعادة النمذجة المرضية بعد فرط التوتر وتدعم مفهوم أن جهاز CTCM يمكن استخدامه كمنصة لدراسة إشارات تضخم القلب الناجم عن التمدد.
تؤكد الآثار التمثيلية لضغط غرفة الهواء وضغط غرفة السوائل وقياسات حركة الأنسجة أن ضغط الغرفة يغير ضغط غرفة السوائل ، مما يتسبب في حركة مقابلة لشريحة الأنسجة.(ب) نسبة التمدد التمثيلية ومنحنيات معدل التمدد لأقسام الأنسجة المشدودة بشكل طبيعي (البرتقالي) والمفرطة (الزرقاء).ج رسم بياني شريطي يوضح وقت الدورة (ن = 19 شريحة لكل مجموعة ، من خنازير مختلفة) ، وقت الانكماش (ن = 18-19 شريحة لكل مجموعة ، من خنازير مختلفة) ، وقت الاسترخاء (ن = 19 شريحة لكل مجموعة ، من خنازير مختلفة)) ، سعة حركة الأنسجة (ن = 14 شريحة / مجموعة ، من خنازير مختلفة) ، ذروة سرعة الانقباض (ن = 14 شريحة / مجموعة مختلفة) مجموعات) من خنازير مختلفة) ، لم يظهر اختبار t للطالب ثنائي الذيل أي اختلاف كبير في أي معلمة ، مما يشير إلى أن هذه المعلمات ظلت ثابتة خلال 6 أيام من الثقافة مع زيادة الجهد.تمثل أشرطة الخطأ متوسط ​​± الانحراف المعياري.
رسم بياني شريطي لتركيز NT-ProBNP في وسائط الثقافة من شرائح القلب المستزرعة تحت ظروف التمدد الطبيعي MT (Norm) أو التمدد الزائد (OS) (n = 4 (D2 MTNorm) ، 3 (D2 MTOS ، D4 MTNorm ، و D4 MTOS) شرائح / مجموعة من خنازير مختلفة ، يتم إجراء ANOVA ثنائي الاتجاه ؛ ** p <0.01 مقارنة بالتمدد الطبيعي). رسم بياني شريطي لتركيز NT-ProBNP في وسائط الثقافة من شرائح القلب المستزرعة تحت ظروف التمدد الطبيعي MT (Norm) أو التمدد الزائد (OS) (n = 4 (D2 MTNorm) ، 3 (D2 MTOS ، D4 MTNorm ، و D4 MTOS) شرائح / مجموعة من خنازير مختلفة ، يتم إجراء ANOVA ثنائي الاتجاه ؛ ** p <0.01 مقارنة بالتمدد الطبيعي).الرسم البياني الكمي لتركيز NT-ProBNP في وسط الاستزراع من شرائح القلب المستزرعة في ظل ظروف امتداد MT الطبيعي (القاعدة) أو التمدد الزائد (OS) (n = 4 (D2 MTNorm) ، 3 (D2 MTOS ، D4 MTNorm ، D4) .MTOS) شرائح / مجموعة من خنازير مختلفة ، يتم إجراء تحليل عاملين للتباين ؛** p <0،01 по сравнению с нормальным растяжением). ** ف <0.01 مقارنة بالتمدد الطبيعي). a 在 MT 正常 拉伸 (Norm) 或 过度 拉伸 (OS) 条件 下 培养 的 心脏 切片 培养基 中 NT-ProBNP 浓度 的 条形图 量化 （n = 4 (D2 MTNorm) 、 3 （D2 MTOS 、 D4 MTNorm 和 D4 MTOS） 来自 不同 猪 的 进行 / 不同 猪 进行 / 不同 进行 / <0.01）。 أ القياس الكمي لتركيز NT-ProBNP في شرائح القلب المزروعة تحت ظروف التمدد الطبيعي MT (Norm) أو التمدد الزائد (OS) (n = 4 (D2 MTNorm) ، 3 (D2 MTOS ، D4 MTNorm 和 D4 MTOS) من مختلف 猪 的 切片 / 组 可以 双向 方 发 发动 ؛ ** مقارنة بالتمدد الطبيعي ، p <0.01).الرسم البياني الكمي لتركيزات NT-ProBNP في شرائح القلب المزروعة في ظل ظروف امتداد MT الطبيعي (القاعدة) أو التمدد الزائد (OS) (n = 4 (D2 MTNorm) ، 3 (D2 MTOS ، D4 MTNorm) و D4 MTOS) شرائح / مجموعة من خنازير مختلفة ، تحليل ثنائي الاتجاه للتباين ؛** p <0،01 по сравнению с нормальным растяжением). ** ف <0.01 مقارنة بالتمدد الطبيعي). ب صور تمثيلية لشرائح القلب ملطخة بـ Troponin-T و WGA (يسار) وتقدير حجم الخلية (يمين) (n = 330 (D6 MTOS) ، 369 (D6 MTNorm) خلية / مجموعة من 10 شرائح مختلفة من خنازير مختلفة ، يتم إجراء اختبار t للطالب ثنائي الذيل ؛ **** p <0.0001 مقارنة بالتمدد الطبيعي). ب صور تمثيلية لشرائح القلب ملطخة بـ Troponin-T و WGA (يسار) وتقدير حجم الخلية (يمين) (n = 330 (D6 MTOS) ، 369 (D6 MTNorm) خلية / مجموعة من 10 شرائح مختلفة من خنازير مختلفة ، يتم إجراء اختبار t للطالب ثنائي الذيل ؛ **** p <0.0001 مقارنة بالتمدد الطبيعي). ب Репрезентативные изображения срезов сердца ، окрашенных тропонином-и и АЗП (слева) и количеоденино клеток (справа) (n = 330 (D6 MTOS)، 369 (D6 MTNorm) клеток / групу из 10 разных срезов от разных свиней، двад- сровай Стьюдента؛ **** p <0،0001 по сравнению с нормальным растяжением). ب صور تمثيلية لأقسام القلب ملطخة بتروبونين- T و AZP (يسار) وتقدير حجم الخلية (يمين) (ن = 330 (D6 MTOS) ، 369 (D6 MTNorm) خلية / مجموعة من 10 أقسام مختلفة من خنازير مختلفة ، تم إجراء اختبار t للطالب ثنائي الذيل ؛ **** p <0.0001 مقارنة بالسلالة العادية). ب 用 肌钙蛋白 -T 和 WGA （左） 和 细胞 大小 量化 （右） 染色 的 心脏 切片 的 代表性 图像 （n = 330 （D6 MTOS） 来自 不同 猪 的 10 个 不同 369 （MTNorm） / ص <0.0001）。 ب صور تمثيلية لشرائح القلب ملطخة بـ calcarein-T و WGA (يسار) وحجم الخلية (يمين) (n = 330 (D6 MTOS) ، 369 من 10 شرائح مختلفة (D6 MTNorm)) الخلايا / 组 ， 两 方法 有 尾 t اختبار ； مقارنة بالتمدد الطبيعي ， **** p <0.0001). ب Репрезентативные изображения срезов сердца ، окрашенных тропонином-и и АЗП (слевта) количестцны справа) (ن = 330 (D6 MTOS) ، 369 (D6 MTNorm) из 10 различных срезов от разных свиней Клетки / группа، двусторонниер؛ по сравнению с нормальным растяжением). ب صور تمثيلية لأقسام القلب ملطخة بـ Troponin-T و AZP (يسار) وتقدير حجم الخلية (يمين) (n = 330 (D6 MTOS) ، 369 (D6 MTNorm) من 10 أقسام مختلفة من خنازير مختلفة) خلايا / مجموعة ، معيار ثنائي الذيل للطالب ؛**** p <0.0001 مقارنة بالسلالة العادية). ج صور تمثيلية لليوم 0 واليوم 6 شرائح قلب MTOS التي تحمل علامات مناعية من أجل تروبونين- T و NFATC4 والقياس الكمي لانتقال NFATC4 إلى نوى CMs (ن = 4 (D0) ، 3 (D6 MTOS) شرائح / مجموعة من خنازير مختلفة ، يتم إجراء اختبار t للطالب ثنائي الذيل ؛ * p <0.05). ج صور تمثيلية لليوم 0 واليوم 6 شرائح قلب MTOS التي تحمل علامات مناعية من أجل تروبونين- T و NFATC4 والقياس الكمي لانتقال NFATC4 إلى نوى CMs (ن = 4 (D0) ، 3 (D6 MTOS) شرائح / مجموعة من خنازير مختلفة ، يتم إجراء اختبار t للطالب ثنائي الذيل ؛ * p <0.05). c Репрезентативные изображения срезов сердца 0 и 6 дней MTOS ، иммуномеченых для тропония-и NFATC4 транслокации NFATC4 в ядра кавернозных клеток (n = 4 (D0)، 3 (D6 MTOS) срезов / группу от разных свиней، всны терий Стьюдента ؛ * p <0،05). ج صور تمثيلية لأقسام القلب عند 0 و 6 أيام من MTOS ، والمسمى المناعي لـ Troponin-T و NFATC4 ، والتقدير الكمي لانتقال NFATC4 في نواة الخلايا الكهفية (n = 4 (D0) ، 3 (D6 MTOS) شرائح / مجموعة من خنازير مختلفة) تم إجراء اختبار t للطالب ثنائي الذيل ؛* ف <0.05). ج 用于 肌钙蛋白 -T 和 NFATC4 免疫 标记 的 第 0 天和 第 6 天 MTOS 心脏 切片 的 代表性 图像 ， 来自 不同 猪 的 NFATC4 易位 至 CM 细胞核 的 量化 （n = 4 (D0) 、 3 (D6 MTOS) 切片 / ج صور تمثيلية للتسميات المناعية لـ calcanin-T و NFATC4 第 0 天和 第 6 شرائح قلب MTOS ، و NFATC4 من نواة خلية NFATC4 易位 至 CM مختلفة 的 الكمية 化 (n = 4 (D0) ، 3 (D6 MTOS) 切 礼 / 组 ،). c Репрезентативные изображения срезов сердца MTOS на 0 и 6 день для иммуномаркировки тропонином-оропонином-Торопонином-C4 транслокации NFATC4 в ядра CM от разных свиней (n = 4 (D0)، 3 (D6 MTOS) срез / группа، два- востатый t-крит. ج صور تمثيلية لشرائح قلب MTOS في اليوم 0 و 6 للتوسيم المناعي لـ Troponin-T و NFATC4 والقياس الكمي لانتقال NFATC4 في نواة CM من خنازير مختلفة (n = 4 (D0) ، 3 (D6 MTOS) شرائح / مجموعة ، ذيل t -criterion Student ؛ * p <0.05).تمثل أشرطة الخطأ يعني ± الانحراف المعياري.
تتطلب أبحاث القلب والأوعية الدموية المترجمة نماذج خلوية تعيد إنتاج بيئة القلب بدقة.في هذه الدراسة ، تم تطوير جهاز CTCM وتمييزه بحيث يمكن أن يحفز أقسامًا رقيقة جدًا من القلب.يشتمل نظام CTCM على تحفيز كهروميكانيكي متزامن فسيولوجيًا وإثراء سائل T3 و Dex.عندما تعرضت أقسام قلب الخنازير لهذه العوامل ، ظلت قابليتها للحياة ، وسلامتها الهيكلية ، ونشاطها الأيضي ، والتعبير النسخي كما هي في أنسجة القلب الطازجة بعد 12 يومًا من الثقافة.بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن يؤدي التمدد المفرط لنسيج القلب إلى تضخم القلب الناجم عن فرط التمدد.بشكل عام ، تدعم هذه النتائج الدور الحاسم لظروف الثقافة الفسيولوجية في الحفاظ على النمط الظاهري للقلب وتوفير منصة لفحص الأدوية.
تساهم العديد من العوامل في خلق بيئة مثالية لعمل الخلايا العضلية للقلب وبقائها على قيد الحياة.ترتبط أكثر هذه العوامل وضوحًا بـ (1) التفاعلات بين الخلايا ، (2) التحفيز الكهروميكانيكي ، (3) العوامل الخلطية ، و (4) ركائز التمثيل الغذائي.تتطلب التفاعلات الفسيولوجية من خلية إلى أخرى شبكات معقدة ثلاثية الأبعاد لأنواع خلايا متعددة مدعومة بمصفوفة خارج الخلية.يصعب إعادة بناء مثل هذه التفاعلات الخلوية المعقدة في المختبر عن طريق الثقافة المشتركة لأنواع الخلايا الفردية ، ولكن يمكن تحقيقها بسهولة باستخدام الطبيعة العضوية النمطية لأقسام القلب.
يعد التمدد الميكانيكي والتحفيز الكهربائي لخلايا عضلة القلب أمرًا بالغ الأهمية للحفاظ على النمط الظاهري للقلب.بينما تم استخدام التحفيز الميكانيكي على نطاق واسع لتكييف hiPSC-CM والنضج ، فقد حاولت العديد من الدراسات الأنيقة مؤخرًا التحفيز الميكانيكي لشرائح القلب في الثقافة باستخدام التحميل أحادي المحور.تظهر هذه الدراسات أن التحميل الميكانيكي أحادي المحور ثنائي الأبعاد له تأثير إيجابي على النمط الظاهري للقلب أثناء الثقافة.في هذه الدراسات ، تم تحميل أقسام من القلب إما بقوى شد متساوية القياس ، أو تحميل مساعد خطي 18 ، أو تم إعادة إنشاء الدورة القلبية باستخدام ردود فعل محول القوة ومحركات التوتر.ومع ذلك ، فإن هذه الأساليب تستخدم تمدد الأنسجة أحادي المحور دون تحسين البيئة ، مما يؤدي إلى كبت العديد من الجينات القلبية أو الإفراط في التعبير عن الجينات المرتبطة باستجابات التمدد غير الطبيعية.يوفر CTCM الموصوف هنا حافزًا كهروميكانيكيًا ثلاثي الأبعاد يحاكي الدورة القلبية الطبيعية من حيث وقت الدورة والتمدد الفسيولوجي (امتداد 25 ٪ ، وانقباض 40 ٪ ، وانبساط 60 ٪ ، و 72 نبضة في الدقيقة).على الرغم من أن هذا التحفيز الميكانيكي ثلاثي الأبعاد وحده لا يكفي للحفاظ على سلامة الأنسجة ، إلا أن مزيجًا من التحفيز الخلطي والميكانيكي باستخدام T3 / Dex مطلوب للحفاظ بشكل كافٍ على قابلية الأنسجة ووظيفتها وسلامتها.
تلعب العوامل الخلطية دورًا مهمًا في تعديل النمط الظاهري لقلب البالغين.تم تسليط الضوء على هذا في دراسات HiPS-CM حيث تمت إضافة T3 و Dex إلى وسائط الثقافة لتسريع نضج الخلايا.قد يؤثر T3 على نقل الأحماض الأمينية والسكريات والكالسيوم عبر أغشية الخلايا.بالإضافة إلى ذلك ، يعزز T3 تعبير MHC-α وتقليل تنظيم MHC-، مما يعزز تكوين اللييفات العضلية السريعة في خلايا عضلة القلب الناضجة مقارنةً بالنشل البطيء لللييفات العضلية في CM الجنين.يؤدي نقص T3 في مرضى الغدة الدرقية إلى فقدان العصابات الليفية العضلية وانخفاض معدل تطور النغمة.يعمل Dex على مستقبلات الجلوكوكورتيكويد وقد ثبت أنه يزيد من انقباض عضلة القلب في القلوب المعزولة المروية ؛38 يُعتقد أن هذا التحسن مرتبط بالتأثير على الإدخال المدفوع برواسب الكالسيوم (SOCE) 39،40.بالإضافة إلى ذلك ، يرتبط Dex بمستقبلاته ، مما يتسبب في استجابة واسعة داخل الخلايا تثبط وظيفة المناعة والالتهابات.
تشير نتائجنا إلى أن التحفيز الميكانيكي الفيزيائي (MS) أدى إلى تحسين الأداء العام للثقافة مقارنةً بـ Ctrl ، لكنه فشل في الحفاظ على الجدوى والسلامة الهيكلية والتعبير القلبي على مدى 12 يومًا في الثقافة.مقارنة بـ Ctrl ، أدت إضافة T3 و Dex إلى ثقافات CTCM (MT) إلى تحسين الجدوى والحفاظ على ملفات تعريف النسخ المماثلة ، والسلامة الهيكلية ، والنشاط الأيضي مع أنسجة القلب الطازجة لمدة 12 يومًا.بالإضافة إلى ذلك ، من خلال التحكم في درجة تمدد الأنسجة ، تم إنشاء نموذج تضخم القلب الناجم عن فرط التمدد باستخدام STCM ، مما يوضح تنوع نظام STCM.وتجدر الإشارة إلى أنه على الرغم من أن إعادة تشكيل القلب والتليف عادة ما يشمل أعضاء سليمة يمكن لخلاياها المنتشرة أن توفر السيتوكينات المناسبة وكذلك البلعمة وعوامل إعادة البناء الأخرى ، إلا أن أقسام القلب لا تزال تحاكي العملية الليفية استجابة للإجهاد والصدمات.في الخلايا الليفية العضلية.تم تقييم هذا مسبقًا في نموذج شريحة القلب هذا.وتجدر الإشارة إلى أن معلمات CTCM يمكن تعديلها عن طريق تغيير الضغط / السعة الكهربائية والتردد لمحاكاة العديد من الظروف مثل عدم انتظام دقات القلب ، وبطء القلب ، ودعم الدورة الدموية الميكانيكية (القلب الميكانيكي غير المحمل).هذا يجعل النظام متوسط ​​الإنتاجية لاختبار المخدرات.تمهد قدرة CTCM على نمذجة تضخم القلب الناجم عن الإجهاد الطريق لاختبار هذا النظام من أجل العلاج الشخصي.في الختام ، توضح الدراسة الحالية أن التمدد الميكانيكي والتحفيز الخلطي ضروريان للحفاظ على ثقافة أقسام أنسجة القلب.
على الرغم من أن البيانات المقدمة هنا تشير إلى أن CTCM هي منصة واعدة جدًا لنمذجة عضلة القلب السليمة ، إلا أن طريقة الثقافة هذه لها بعض القيود.يتمثل القيد الرئيسي لثقافة CTCM في أنها تفرض ضغوطًا ميكانيكية ديناميكية مستمرة على الشرائح ، مما يحول دون القدرة على مراقبة تقلصات شريحة القلب بنشاط خلال كل دورة.بالإضافة إلى ذلك ، نظرًا لصغر حجم أقسام القلب (7 مم) ، فإن القدرة على تقييم الوظيفة الانقباضية خارج أنظمة الاستزراع باستخدام مستشعرات القوة التقليدية محدودة.في المخطوطة الحالية ، تغلبنا جزئيًا على هذا القيد من خلال تقييم الجهد البصري كمؤشر على وظيفة الانقباض.ومع ذلك ، سيتطلب هذا القيد مزيدًا من العمل ويمكن معالجته في المستقبل من خلال إدخال طرق للمراقبة البصرية لوظيفة شرائح القلب في الثقافة ، مثل رسم الخرائط الضوئية باستخدام أصباغ حساسة للكالسيوم والجهد.يتمثل أحد القيود الأخرى لـ CTCM في أن نموذج العمل لا يعالج الإجهاد الفسيولوجي (التحميل المسبق والتحميل اللاحق).في CTCM ، تم تحفيز الضغط في اتجاهين متعاكسين لإعادة إنتاج تمدد فسيولوجي بنسبة 25٪ في الانبساط (امتداد كامل) والانقباض (طول الانقباض أثناء التحفيز الكهربائي) في الأنسجة الكبيرة جدًا.يجب إزالة هذا القيد في تصميمات CTCM المستقبلية عن طريق الضغط الكافي على أنسجة القلب من كلا الجانبين وعن طريق تطبيق علاقات الضغط والحجم الدقيقة التي تحدث في غرف القلب.
تقتصر إعادة النمذجة التي يسببها التمدد المفرط المبلغ عنها في هذه المخطوطة على محاكاة إشارات تمدد مفرط الضخامي.وبالتالي ، يمكن أن يساعد هذا النموذج في دراسة الإشارات التضخمية التي يسببها التمدد دون الحاجة إلى عوامل خلطية أو عصبية (غير موجودة في هذا النظام).هناك حاجة إلى مزيد من الدراسات لزيادة تعدد الـ CTCM ، على سبيل المثال ، الزراعة المشتركة مع الخلايا المناعية ، والعوامل الخلطية للبلازما المنتشرة ، والتعصيب عند الزراعة المشتركة مع الخلايا العصبية ستحسن إمكانيات نمذجة المرض باستخدام CTCM.
تم استخدام ثلاثة عشر خنزير في هذه الدراسة.تم تنفيذ جميع الإجراءات الخاصة بالحيوانات وفقًا للمبادئ التوجيهية المؤسسية وتمت الموافقة عليها من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسية بجامعة لويزفيل.تم تثبيت القوس الأبهر وتم إرواء القلب بـ 1 لتر من شلل القلب المعقم (110 ملي كلوريد الصوديوم ، 1.2 ملي كلوريد الكالسيوم ، 16 ملي مولار بوكل ، 16 ملي مولار كلوريد ، 10 ملي مولار NaHCO3 ، 5 يو / مل هيبارين ، درجة الحموضة تصل إلى 7.4) ؛ تم حفظ القلوب في محلول مشلول القلب المثلج حتى يتم نقلها إلى المختبر على الجليد الذي عادة ما يكون أقل من 10 دقائق. تم حفظ القلوب في محلول مشلول القلب المثلج حتى يتم نقلها إلى المختبر على الجليد الذي عادة ما يكون أقل من 10 دقائق. сердца ранили в ледяном кардиоплегическом растворе транспортировки в лабораторию бораторию бораторию бораторию تم تخزين القلوب في محلول مشلول القلب المثلج حتى نقلها إلى المختبر على الجليد ، والذي يستغرق عادة أقل من 10 دقائق.将 心脏 保存 在 冰冷 的 心脏停搏 液 中 ， 直到 冰上 运送 到 实验室 ， 通常 <10 分钟。将 心脏 保存 在 冰冷 的 心脏停搏 液 中 ， 直到 冰上 运送 到 实验室 ， 通常 <10 分钟。 كلمات بمعنى: ержите сердца в ледяной кардиоплегии транспортировки в лабораторию на льду، обычно <10 мин. حافظ على القلوب في حالة شلل القلب الجليدي حتى يتم نقلها إلى المختبر على الجليد ، عادةً أقل من 10 دقائق.
تم تطوير جهاز CTCM في برنامج SolidWorks للتصميم بمساعدة الكمبيوتر (CAD).غرف الثقافة والفواصل وغرف الهواء مصنوعة من بلاستيك الأكريليك الشفاف CNC.الحلقة الاحتياطية بقطر 7 مم مصنوعة من البولي إيثيلين عالي الكثافة (HDPE) في الوسط ولديها أخدود دائري لاستيعاب الحلقة المصنوعة من السيليكون المستخدمة لإغلاق الوسائط تحتها.يفصل غشاء سيليكا رقيق غرفة الثقافة عن لوحة الفصل.يتم قطع غشاء السيليكون بالليزر من لوح سيليكون بسمك 0.02 ″ ولديه صلابة 35A.حشيات السيليكون السفلية والعلوية مقطوعة بالليزر من لوح سيليكون بسمك 1/16 ″ ولها صلابة 50 أمبير.يتم استخدام مسامير لولبية من الفولاذ المقاوم للصدأ 316L وصواميل مجنحة لتثبيت الكتلة وإنشاء مانع تسرب محكم.
تم تصميم لوحة الدوائر المطبوعة المخصصة (PCB) لتتكامل مع نظام C-PACE-EM.مآخذ موصل الآلة السويسرية على PCB متصلة بأقطاب الجرافيت بواسطة أسلاك نحاسية مطلية بالفضة ومسامير من البرونز 0-60 مثبتة في الأقطاب الكهربائية.يتم وضع لوحة الدوائر المطبوعة في غطاء الطابعة ثلاثية الأبعاد.
يتم التحكم في جهاز CTCM بواسطة مشغل هوائي قابل للبرمجة (PPD) الذي يخلق ضغطًا دوريًا محكومًا مشابهًا لدورة القلب.مع زيادة الضغط داخل حجرة الهواء ، يتمدد غشاء السيليكون المرن لأعلى ، مما يجبر الوسيط تحت موقع الأنسجة.سيتم بعد ذلك شد منطقة الأنسجة عن طريق طرد السوائل ، مما يحاكي التمدد الفسيولوجي للقلب أثناء الانبساط.في ذروة الاسترخاء ، تم تطبيق التحفيز الكهربائي من خلال أقطاب الجرافيت ، مما أدى إلى تقليل الضغط في غرفة الهواء وتسبب في تقلص أقسام الأنسجة.يوجد داخل الأنبوب صمام مرقئ مزود بمستشعر ضغط لاكتشاف الضغط في نظام الهواء.يتم تطبيق الضغط الذي يستشعره مستشعر الضغط على مجمع البيانات المتصل بالكمبيوتر المحمول.هذا يسمح بالمراقبة المستمرة للضغط داخل غرفة الغاز.عندما تم الوصول إلى الحد الأقصى لضغط الغرفة (معيار 80 مم زئبق ، 140 مم زئبق OS) ، أُمر جهاز الحصول على البيانات بإرسال إشارة إلى نظام C-PACE-EM لتوليد إشارة جهد ثنائي الطور لمدة 2 مللي ثانية ، مضبوطة على 4 فولت.
تم الحصول على أقسام القلب وأجريت ظروف الاستزراع في 6 آبار على النحو التالي: نقل القلوب المحصودة من وعاء النقل إلى صينية تحتوي على شلل قلبي بارد (4 درجات مئوية).تم عزل البطين الأيسر بشفرة معقمة ومقطع إلى قطع من 1-2 سم 3.تم ربط كتل الأنسجة هذه بدعامات الأنسجة بمادة لاصقة للأنسجة ووضعها في حمام أنسجة مشراح اهتزازي يحتوي على محلول Tyrode ومع الأكسجين باستمرار (3 جم / لتر 2،3-بوتانيديون أحادي أكسيد (BDM) ، 140 ملي مول كلوريد الصوديوم (8.18 جم).) ، 6 ملي كلوريد الصوديوم (0.447 جم) ، 10 ملي مولار من الجلوكوز (1.86 جم) ، 1 ملي مولار HEPES (1.86 جم) ، 1 ملي مولار HEPES). 2 (1.8 مل محلول 1 م) ، حتى 1 لتر ddH2O).تم ضبط المبضع الاهتزازي على قطع شرائح بسمك 300 ميكرومتر بتردد 80 هرتز ، وسعة اهتزاز أفقية تبلغ 2 مم ، ومعدل تقدم يبلغ 0.03 مم / ثانية.تم إحاطة حمام الأنسجة بالجليد للحفاظ على برودة المحلول وتم الحفاظ على درجة الحرارة عند 4 درجات مئوية.نقل أقسام الأنسجة من حمام مشراح إلى حمام حضانة يحتوي على محلول Tyrode المؤكسج باستمرار على الجليد حتى يتم الحصول على أقسام كافية للوحة ثقافة واحدة.بالنسبة لمزارع الترانسويل ، تم ربط أقسام الأنسجة بدعامات عقيمة من البولي يوريثين بعرض 6 مم ووضعها في 6 مل من الوسط المُحسَّن (199 متوسطة ، مكمل 1x ITS ، 10 ٪ FBS ، 5 ​​نانوغرام / مل VEGF ، 10 نانوغرام / مل FGF-alkaline و 2 X مضاد حيوي - مضاد للفطريات).تم تطبيق التحفيز الكهربائي (10 فولت ، التردد 1.2 هرتز) على أقسام الأنسجة من خلال C-Pace.لظروف TD ، تمت إضافة T3 و Dex الطازجة عند 100 نانومتر و 1 ميكرومتر عند كل تغيير متوسط.الوسط مشبع بالأكسجين قبل الاستبدال 3 مرات في اليوم.تمت زراعة أقسام الأنسجة في حاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ من ثاني أكسيد الكربون.
بالنسبة لثقافات CTCM ، تم وضع أقسام الأنسجة على طابعة ثلاثية الأبعاد مصنوعة خصيصًا في طبق بتري يحتوي على محلول Tyrode المعدل.الجهاز مصمم لزيادة حجم شريحة القلب بنسبة 25٪ من مساحة الحلقة الداعمة.يتم ذلك حتى لا تتمدد أقسام القلب بعد نقلها من محلول Tyrode إلى الوسط وأثناء الانبساط.باستخدام غراء هيستو أكريليك ، تم تثبيت المقاطع بسمك 300 ميكرومتر على حلقة دعم بقطر 7 مم.بعد إرفاق أقسام الأنسجة بحلقة الدعم ، قم بقطع أقسام الأنسجة الزائدة ووضع أقسام الأنسجة المرفقة مرة أخرى في حمام محلول Tyrode على الجليد (4 درجات مئوية) حتى يتم تحضير أقسام كافية لجهاز واحد.يجب ألا يتجاوز إجمالي وقت المعالجة لجميع الأجهزة ساعتين.بعد ربط 6 أقسام من الأنسجة بحلقات الدعم الخاصة بهم ، تم تجميع جهاز CTCM.غرفة ثقافة CTCM مملوءة مسبقًا بـ 21 مل وسط مؤكسج مسبقًا.نقل أقسام الأنسجة إلى غرفة الثقافة وإزالة أي فقاعات الهواء بعناية باستخدام ماصة.ثم يتم توجيه قسم الأنسجة في الفتحة ويتم ضغطه برفق في مكانه.أخيرًا ، ضع غطاء القطب على الجهاز وانقل الجهاز إلى الحاضنة.ثم قم بتوصيل CTCM بأنبوب الهواء ونظام C-PACE-EM.يفتح المشغل الهوائي ويفتح صمام الهواء CTCM.تم تكوين نظام C-PACE-EM ليقدم 4 فولت عند 1.2 هرتز أثناء سرعة ثنائية الطور لمدة 2 مللي ثانية.تم تغيير الوسيط مرتين في اليوم وتم تغيير الأقطاب الكهربائية مرة واحدة يوميًا لتجنب تراكم الجرافيت على الأقطاب الكهربائية.إذا لزم الأمر ، يمكن إزالة أقسام الأنسجة من آبارها المزروعة لطرد أي فقاعات هواء قد تكون قد سقطت تحتها.لظروف العلاج MT ، تمت إضافة T3 / Dex طازجًا مع كل تغيير متوسط ​​مع 100 نانومتر T3 و 1 ميكرومتر Dex.تمت زراعة أجهزة CTCM في حاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ من ثاني أكسيد الكربون.
للحصول على مسارات ممتدة لشرائح القلب ، تم تطوير نظام كاميرا خاص.تم استخدام كاميرا SLR (Canon Rebel T7i، Canon، Tokyo، Japan) مع عدسة ماكرو Navitar Zoom 7000 18-108mm (Navitar، San Francisco، CA).تم إجراء التصور في درجة حرارة الغرفة بعد استبدال الوسيط بوسط جديد.تم وضع الكاميرا بزاوية 51 درجة ويتم تسجيل الفيديو بمعدل 30 إطارًا في الثانية.أولاً ، تم استخدام برنامج مفتوح المصدر (MUSCLEMOTION43) مع Image-J لتحديد حركة شرائح القلب.تم إنشاء القناع باستخدام MATLAB (MathWorks ، Natick ، ​​MA ، الولايات المتحدة الأمريكية) لتحديد مناطق الاهتمام لضرب شرائح القلب لتجنب الضوضاء.يتم تطبيق أقنعة مجزأة يدويًا على جميع الصور في تسلسل إطار ثم تمريرها إلى المكون الإضافي MUSCLEMOTION.يستخدم Muscle Motion متوسط ​​كثافة البكسلات في كل إطار لتحديد حركته بالنسبة للإطار المرجعي.تم تسجيل البيانات وتصفيتها واستخدامها لتحديد وقت الدورة وتقييم تمدد الأنسجة أثناء الدورة القلبية.تمت معالجة الفيديو المسجل لاحقًا باستخدام مرشح رقمي أحادي الطور من الدرجة الأولى.لقياس امتداد الأنسجة (من الذروة إلى الذروة) ، تم إجراء تحليل من الذروة إلى الذروة للتمييز بين القمم والقيعان في الإشارة المسجلة.بالإضافة إلى ذلك ، يتم إجراء عملية التراجع باستخدام متعدد الحدود من الدرجة السادسة للتخلص من انحراف الإشارة.تم تطوير رمز البرنامج في MATLAB لتحديد حركة الأنسجة العالمية ، ووقت الدورة ، ووقت الاسترخاء ، ووقت الانكماش (رمز البرنامج التكميلي 44).
لتحليل الإجهاد ، باستخدام نفس مقاطع الفيديو التي تم إنشاؤها لتقييم التمدد الميكانيكي ، قمنا أولاً بتتبع صورتين تمثلان ذروات الحركة (أعلى (أعلى) وأدنى (أقل) نقاط الحركة) وفقًا لبرنامج MUSCLEMOTION.قمنا بعد ذلك بتقسيم مناطق الأنسجة وطبقنا شكلاً من أشكال خوارزمية التظليل على الأنسجة المجزأة (الشكل التكميلي 2 أ).تم بعد ذلك تقسيم الأنسجة المجزأة إلى عشرة أسطح تحتية ، وتم حساب الضغط على كل سطح باستخدام المعادلة التالية: Strain = (Sup-Sdown) / Sdown ، حيث Sup و Sdown هما مسافات الشكل من الظلال العلوية والسفلية للنسيج ، على التوالي (الشكل التكميلي 2 ب).
تم إصلاح أقسام القلب في 4٪ بارافورمالدهيد لمدة 48 ساعة.تم تجفيف الأنسجة الثابتة في 10٪ و 20٪ سكروز لمدة ساعة واحدة ، ثم في 30٪ سكروز طوال الليل.تم بعد ذلك دمج المقاطع في مركب درجة حرارة القطع المثلى (مركب OCT) وتم تجميدها تدريجياً في حمام جليدي آيزوبنتان / جاف.قم بتخزين كتل التضمين OCT عند -80 درجة مئوية حتى الفصل.تم تحضير الشرائح على شكل مقاطع بسمك 8 ميكرومتر.
لإزالة أكتوبر من أقسام القلب ، قم بتسخين الشرائح على كتلة تسخين عند 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.أضف 1 مل من PBS إلى كل شريحة واحتضانها لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، ثم تخلل الأقسام عن طريق ضبط 0.1٪ Triton-X في برنامج تلفزيوني لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.لمنع الأجسام المضادة غير المحددة من الارتباط بالعينة ، أضف 1 مل من محلول BSA 3٪ إلى الشرائح واحتضانها لمدة ساعة في درجة حرارة الغرفة.ثم تمت إزالة مساحة سطح الجسم وغسل الشرائح باستخدام برنامج تلفزيوني.ضع علامة على كل عينة بقلم رصاص.تمت إضافة الأجسام المضادة الأولية (المخففة 1: 200 في 1٪ BSA) (connexin 43 (Abcam ؛ # AB11370) ، NFATC4 (Abcam ؛ # AB99431) و تروبونين- T (Thermo Scientific ؛ # MA5-12960) على مدار 90 دقيقة ، ثم الأجسام المضادة الثانوية (المخففة 1: 200 في 1٪ BSA) ضد الفأر Thermo Fluor # 488 T6391) لمدة 90 دقيقة إضافية وغسلها 3 مرات باستخدام PBS لتمييز تلطيخ الهدف عن الخلفية ، استخدمنا فقط الجسم المضاد الثانوي كعنصر تحكم.وأخيرًا ، تمت إضافة صبغة DAPI النووية وتم وضع الشرائح في vectashield (مختبرات Vector) ومختومة بطلاء الأظافر. -x التكبير) ومجهر Keyence مع تكبير 40x.
تم استخدام WGA-Alexa Fluor 555 (Thermo Scientific ؛ # W32464) عند 5 ميكروغرام / مل في PBS لتلوين WGA وتم تطبيقه على أقسام ثابتة لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.تم بعد ذلك غسل الشرائح باستخدام برنامج تلفزيوني وأضيف أسود السودان إلى كل شريحة واحتضانها لمدة 30 دقيقة.تم بعد ذلك غسل الشرائح باستخدام PBS وأضيف وسط دمج vectashield.تم تصور الشرائح على مجهر Keyence بتكبير 40x.
تمت إزالة OCT من العينات كما هو موضح أعلاه.بعد إزالة OCT ، اغمر الشرائح في محلول Bouin بين عشية وضحاها.تم بعد ذلك شطف الشرائح بالماء المقطر لمدة ساعة واحدة ثم وضعها في محلول فوشين حمض الصبار Bibrich لمدة 10 دقائق.ثم تم غسل الشرائح بالماء المقطر ووضعها في محلول من 5٪ فوسفوموليبدينوم / 5٪ حمض فوسفوتونجستيك لمدة 10 دقائق.بدون شطف ، انقل الشرائح مباشرة إلى محلول الأنيلين الأزرق لمدة 15 دقيقة.ثم تم غسل الشرائح بالماء المقطر ووضعها في محلول حمض أسيتيك 1٪ لمدة دقيقتين.تم تجفيف الشرائح في 200 نيتروجين إيثانول ونقلها إلى زيلين.تم تصور الشرائح الملطخة باستخدام مجهر Keyence بهدف 10x.تم قياس نسبة منطقة التليف باستخدام برنامج Keyence Analyzer.
CyQUANT ™ MTT Cell Viability Assay (Invitrogen، Carlsbad، CA) ، رقم الكتالوج V13154 ، وفقًا لبروتوكول الشركة المصنعة مع بعض التعديلات.على وجه الخصوص ، تم استخدام ثقب جراحي بقطر 6 مم لضمان حجم موحد للأنسجة أثناء تحليل MTT.تم طلاء الأنسجة بشكل فردي في آبار لوحة تحتوي على 12 بئراً تحتوي على ركيزة MTT وفقًا لبروتوكول الشركة المصنعة.يتم تحضين المقاطع عند 37 درجة مئوية لمدة 3 ساعات ويستقلب النسيج الحي ركيزة MTT لتشكيل مركب فورمازان أرجواني.استبدل محلول MTT بـ 1 مل DMSO واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة لاستخراج فورمازان الأرجواني من أقسام القلب.تم تخفيف العينات بنسبة 1:10 في DMSO في ألواح سفلية صافية 96 جيدًا وشدة اللون الأرجواني المقاسة عند 570 نانومتر باستخدام قارئ لوحة Cytation (BioTek).تم تطبيع القراءات لوزن كل شريحة من القلب.
تم استبدال وسائط شريحة القلب بوسائط تحتوي على 1 μCi / ml [5-3H] -جلوكوز (Moravek Biochemicals ، Brea ، CA ، USA) لفحص استخدام الجلوكوز كما هو موضح سابقًا.بعد 4 ساعات من الحضانة ، أضف 100 ميكرولتر من الوسط إلى أنبوب ميكروسينتريفوجي مفتوح يحتوي على 100 ميكرولتر من 0.2 نيتروجين حمض الهيدروكلوريك.ثم تم وضع الأنبوب في أنبوب وميض يحتوي على 500 ميكرولتر من DH O ليتبخر [3H] 2O لمدة 72 ساعة عند 37 درجة مئوية.ثم قم بإزالة أنبوب الطرد المركزي الدقيق من أنبوب التلألؤ وأضف 10 مل من سائل التلألؤ.تم إجراء أعداد التلألؤ باستخدام محلل التلألؤ السائل Tri-Carb 2900TR (Packard Bioscience Company ، Meriden ، CT ، الولايات المتحدة الأمريكية).تم حساب استخدام الجلوكوز بعد ذلك مع الأخذ في الاعتبار [5-3H] - النشاط النوعي للجلوكوز ، والتوازن غير الكامل والخلفية ، وتخفيف [5-3H] - إلى الجلوكوز غير المسمى ، وكفاءة عداد التلألؤ.يتم تطبيع البيانات لكتلة أقسام القلب.
بعد تجانس الأنسجة في Trizol ، تم عزل الحمض النووي الريبي من أقسام القلب باستخدام Qiagen miRNeasy Micro Kit # 210874 وفقًا لبروتوكول الشركة المصنعة.تم إجراء إعداد مكتبة RNAsec وتسلسلها وتحليل البيانات على النحو التالي:
تم استخدام 1 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي لكل عينة كمواد أولية لإعداد مكتبة الحمض النووي الريبي.تم إنشاء مكتبات التسلسل باستخدام NEBNext UltraTM RNA Library Preparation Kit لـ Illumina (NEB ، الولايات المتحدة الأمريكية) باتباع توصيات الشركة المصنعة ، وتمت إضافة رموز الفهرس إلى تسلسل السمات لكل عينة.باختصار ، تمت تنقية mRNA من إجمالي الحمض النووي الريبي باستخدام خرز مغناطيسي متصل بأوليغنوكليوتيدات بولي-تي.يتم إجراء التجزئة باستخدام الكاتيونات ثنائية التكافؤ عند درجة حرارة عالية في محلول تفاعل تخليق أول حبلا NEBNext (5X).تم تصنيع أول حبلا (كدنا) باستخدام بادئات سداسية عشوائية ونسخة عكسية M-MuLV (RNase H-).ثم يتم تصنيع الخيط الثاني (كدنا) باستخدام DNA polymerase I و RNase H. يتم تحويل الأجزاء المتراكمة المتبقية إلى نهايات حادة بواسطة نشاط نوكلياز خارجي / بوليميراز.بعد إضافة الغد للنهاية 3 لجزء الحمض النووي ، يتم توصيل محول NEBNext بهيكل حلقة دبوس الشعر لتحضيره للتهجين.لاختيار أجزاء (كدنا) ذات الطول المفضل 150-200 نقطة أساس.تمت تنقية أجزاء المكتبة باستخدام نظام AMPure XP (Beckman Coulter ، Beverly ، الولايات المتحدة الأمريكية).بعد ذلك ، تم استخدام 3 ميكرولتر من إنزيم USER (NEB ، الولايات المتحدة الأمريكية) مع cDNA محدد الحجم مرتبط بمحول لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية ثم لمدة 5 دقائق عند 95 درجة مئوية قبل PCR.تم بعد ذلك إجراء PCR باستخدام بوليميريز DNA Phusion عالي الدقة ، وأشعال PCR العالمي ، وأشعال الفهرس (X).أخيرًا ، تمت تنقية منتجات PCR (نظام AMPure XP) وتقييم جودة المكتبة على نظام Agilent Bioanalyzer 2100.تم بعد ذلك تسلسل مكتبة (كدنا) باستخدام جهاز التسلسل Novaseq.تم تحويل ملفات الصور الأولية من Illumina إلى قراءات أولية باستخدام CASAVA Base Calling.يتم تخزين البيانات الأولية في ملفات بتنسيق FASTQ (fq) التي تحتوي على تسلسلات القراءة والصفات الأساسية المقابلة.حدد HISAT2 لمطابقة قراءات التسلسل المصفاة للجينوم المرجعي Sscrofa11.1.بشكل عام ، يدعم HISAT2 الجينوم بأي حجم ، بما في ذلك الجينومات الأكبر من 4 مليارات قاعدة ، ويتم تعيين القيم الافتراضية لمعظم المعلمات.يمكن محاذاة قراءات الربط من بيانات RNA Seq بكفاءة باستخدام HISAT2 ، وهو أسرع نظام متاح حاليًا ، بنفس الدقة أو دقة أفضل من أي طريقة أخرى.
تعكس وفرة النصوص بشكل مباشر مستوى التعبير الجيني.يتم تقييم مستويات التعبير الجيني من خلال وفرة النصوص (عدد التسلسل) المرتبطة بالجينوم أو exons.يتناسب عدد القراءات مع مستويات التعبير الجيني وطول الجين وعمق التسلسل.تم حساب FPKM (أجزاء لكل ألف زوج أساسي من النسخ المتسلسلة لكل مليون زوج أساسي) وتم تحديد قيم P للتعبير التفاضلي باستخدام حزمة DESeq2.قمنا بعد ذلك بحساب معدل الاكتشاف الخاطئ (FDR) لكل قيمة P باستخدام طريقة Benjamini-Hochberg 9 بناءً على وظيفة R المضمنة "p.adjust".
تم تحويل الحمض النووي الريبي المعزول من أقسام القلب إلى (كدنا) بتركيز 200 نانوغرام / ميكرولتر باستخدام مزيج SuperScript IV Vilo Master من Thermo (Thermo ، القط رقم 11756050).تم إجراء RT-PCR الكمي باستخدام صفيحة تفاعل شفافة من أبيد سيستمز Endura Plate Microamp 384 بئر (Thermo ، cat. رقم 4483319) ولاصق بصري microamp (Thermo ، القط. رقم 4311971).يتكون خليط التفاعل من 5 ميكرولتر من مزيج Taqman Fast Advanced Master (Thermo ، القط # 4444557) ، 0.5 ميكرولتر Taqman Primer و 3.5 ميكرولتر H2O مخلوط في البئر.تم تشغيل دورات qPCR القياسية وتم قياس قيم التصوير المقطعي المحوسب باستخدام أداة PCR في الوقت الفعلي لتطبيق النظم البيولوجية Quantstudio 5 (وحدة 384 بئر ؛ المنتج # A28135).تم شراء بادئات Taqman من Thermo (GAPDH (Ss03375629_u1) ، PARP12 (Ss06908795_m1) ، PKDCC (Ss06903874_m1) ، CYGB (Ss06900188_m1) ، RGL1 (Ss068890_m1s) u1) ، GJA1 (Ss03374839_u1) ، COL1A2 (Ss03375009_u1) ، COL3A1 (Ss04323794_m1) ، ACTA2 (Ss04245588_m1) تم تطبيع قيم CT لجميع العينات لجين التدبير المنزلي GAPDH.
تم تقييم إصدار الوسائط لـ NT-ProBNP باستخدام مجموعة NT-ProBNP (خنزير) (Cat. No. MBS2086979 ، MyBioSource) وفقًا لبروتوكول الشركة المصنعة.باختصار ، تمت إضافة 250 ميكرولتر من كل عينة والمعيار في نسختين إلى كل بئر.مباشرة بعد إضافة العينة ، أضف 50 ميكرولتر من كاشف الفحص A لكل بئر.قم بهز اللوحة بلطف وختمها باستخدام مادة مانعة للتسرب.ثم تم تحضين الأقراص عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة.ثم اسحب المحلول واغسل الآبار 4 مرات بـ 350 ميكرولتر من محلول غسيل 1X ، واحتضان محلول الغسيل لمدة 1-2 دقيقة في كل مرة.ثم أضف 100 ميكرولتر من Assay Reagent B لكل بئر وختم بلوح مانع التسرب.تم رج القرص برفق وحضنته عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.اسحب المحلول واغسل الآبار 5 مرات بـ 350 ميكرولتر من محلول غسيل 1X.أضف 90 ميكرولتر من محلول الركيزة لكل بئر وختم اللوحة.احتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية لمدة 10-20 دقيقة.أضف 50 ميكرولتر من محلول الإيقاف لكل بئر.تم قياس اللوحة على الفور باستخدام قارئ لوحة Cytation (BioTek) تم ضبطه عند 450 نانومتر.
تم إجراء تحليلات الطاقة لاختيار أحجام المجموعة التي ستوفر طاقة> 80٪ لاكتشاف تغيير مطلق بنسبة 10٪ في المعلمة بمعدل خطأ 5٪ من النوع الأول. تم إجراء تحليلات الطاقة لاختيار أحجام المجموعة التي ستوفر طاقة> 80٪ لاكتشاف تغيير مطلق بنسبة 10٪ في المعلمة بمعدل خطأ 5٪ من النوع الأول. Анализ мощности был выполнен для выбора размеров групп، которые обеспечат> 80٪ мощности дяя обнароров ия параметра с 5٪ астотой ошибок типа I. تم إجراء تحليل الطاقة لتحديد أحجام المجموعة التي من شأنها أن توفر طاقة> 80٪ لاكتشاف تغيير المعلمة المطلق بنسبة 10٪ مع معدل خطأ من النوع الأول بنسبة 5٪.进行 功效 分析 以 选择 将 提供> 80 ％ 功效 以 检测 参数 中 10 绝对 变化 和 5 ％ 的 组 大小。进行 功效 分析 以 选择 将 提供> 80 ％ 功效 以 检测 参数 中 10 绝对 变化 和 5 ％ 的 组 大小。 ыл проведен анализ мощности для выбора размера группы، который обеспечил бы> 80٪ من 10٪ من الأشخاص нения параметров и 5٪ астоты ошибок типа I. تم إجراء تحليل للطاقة لتحديد حجم المجموعة الذي من شأنه أن يوفر قوة> 80٪ لاكتشاف تغيير المعلمة المطلق بنسبة 10٪ ومعدل الخطأ من النوع الأول بنسبة 5٪.تم اختيار أقسام الأنسجة بشكل عشوائي قبل التجربة.كانت جميع التحليلات عمياء للحالة ولم يتم فك تشفير العينات إلا بعد تحليل جميع البيانات.تم استخدام برنامج GraphPad Prism (سان دييغو ، كاليفورنيا) لإجراء جميع التحليلات الإحصائية. لجميع الإحصائيات ، اعتبرت قيم p مهمة عند قيم <0.05. لجميع الإحصائيات ، اعتبرت قيم p مهمة عند قيم <0.05. اقرأ المزيد p-значения знаения значимыми при значениях <0،05. لجميع الإحصائيات ، اعتبرت قيم p مهمة عند قيم <0.05.对于 所有 统计 数据 ， ص 值 在 值 <0.05 时 被 认为 是 显 着 的。对于 所有 统计 数据 ， ص 值 在 值 <0.05 时 被 认为 是 显 着 的。 اقرأ المزيد p-значения знаения значимыми при значениях <0،05. لجميع الإحصائيات ، اعتبرت قيم p مهمة عند قيم <0.05.تم إجراء اختبار الطالب ثنائي الذيل على البيانات بمقارنات 2 فقط.تم استخدام ANOVA أحادية الاتجاه أو ثنائية الاتجاه لتحديد الأهمية بين مجموعات متعددة.عند إجراء الاختبارات اللاحقة ، تم تطبيق تصحيح Tukey لحساب المقارنات المتعددة.تحتوي بيانات RNAsec على اعتبارات إحصائية خاصة عند حساب FDR و p كما هو موضح في قسم الأساليب.
لمزيد من المعلومات حول تصميم الدراسة ، راجع ملخص تقرير Nature Research المرتبط بهذه المقالة.