Tack för att du besöker Nature.com.Webbläsarversionen du använder har begränsat CSS-stöd.För bästa upplevelse rekommenderar vi att du använder en uppdaterad webbläsare (eller inaktiverar kompatibilitetsläge i Internet Explorer).Under tiden, för att säkerställa fortsatt support, kommer vi att rendera webbplatsen utan stilar och JavaScript.
Det finns ett behov av ett pålitligt in vitro-system som exakt kan reproducera hjärtats fysiologiska miljö för drogtester.Den begränsade tillgängligheten av humana hjärtvävnadsodlingssystem har lett till felaktiga tolkningar av hjärtläkemedelseffekter.Här har vi utvecklat en hjärtvävnadskulturmodell (CTCM) som elektromekaniskt stimulerar hjärtskivor och genomgår fysiologisk sträckning under de systoliska och diastoliska faserna av hjärtcykeln.Efter 12 dagars odling förbättrade detta tillvägagångssätt delvis livsdugligheten för hjärtsektioner, men bevarade inte helt deras strukturella integritet.Därför, efter liten molekylscreening, fann vi att tillsatsen av 100 nM trijodtyronin (T3) och 1 μM dexametason (Dex) till vårt medium bibehöll mikrostrukturen av sektionerna i 12 dagar.I kombination med T3/Dex-behandling bibehöll CTCM-systemet transkriptionsprofiler, viabilitet, metabolisk aktivitet och strukturell integritet på samma nivå som färsk hjärtvävnad i 12 dagar.Dessutom inducerar överdriven sträckning av hjärtvävnad i kultur hypertrofisk hjärtsignalering, vilket ger bevis för förmågan hos CTCM att efterlikna hypertrofiska tillstånd inducerade av hjärtsträckning.Sammanfattningsvis kan CTCM modellera hjärtats fysiologi och patofysiologi i kultur under långa tidsperioder, vilket möjliggör tillförlitlig läkemedelsscreening.
Före klinisk forskning behövs pålitliga in vitro-system som exakt kan återge den fysiologiska miljön i det mänskliga hjärtat.Sådana system bör efterlikna förändrad mekanisk sträckning, hjärtfrekvens och elektrofysiologiska egenskaper.Djurmodeller används ofta som en screeningplattform för hjärtfysiologi med begränsad tillförlitlighet när det gäller att återspegla effekterna av läkemedel i det mänskliga hjärtat1,2.I slutändan är Ideal Cardiac Tissue Culture Experimental Model (CTCM) en modell som är mycket känslig och specifik för olika terapeutiska och farmakologiska ingrepp, som exakt återger det mänskliga hjärtats fysiologi och patofysiologi3.Frånvaron av ett sådant system begränsar upptäckten av nya behandlingar för hjärtsvikt4,5 och har lett till läkemedelskardiotoxicitet som en viktig orsak till att lämna marknaden6.
Under det senaste decenniet har åtta icke-kardiovaskulära läkemedel tagits bort från klinisk användning eftersom de orsakar förlängning av QT-intervallet, vilket leder till ventrikulära arytmier och plötslig död7.Det finns således ett ökande behov av tillförlitliga prekliniska screeningstrategier för att bedöma kardiovaskulär effekt och toxicitet.Den senaste tidens användning av humaninducerade pluripotenta stamcellshärledda kardiomyocyter (hiPS-CM) vid läkemedelsscreening och toxicitetstester ger en partiell lösning på detta problem.Den omogna naturen hos hiPS-CM och avsaknaden av multicellulär komplexitet hos hjärtvävnad är dock stora begränsningar för denna metod.Nyligen genomförda studier har visat att denna begränsning delvis kan övervinnas genom att använda tidig hiPS-CM för att bilda hjärtvävnadshydrogeler kort efter uppkomsten av spontana sammandragningar och gradvis ökande elektrisk stimulering över tiden.Dessa hiPS-CM-mikrovävnader saknar emellertid de mogna elektrofysiologiska och kontraktila egenskaperna hos det vuxna myokardiet.Dessutom har mänsklig hjärtvävnad en mer komplex struktur, bestående av en heterogen blandning av olika celltyper, inklusive endotelceller, neuroner och stromala fibroblaster, sammankopplade av specifika uppsättningar av extracellulära matrisproteiner.Denna heterogenitet av icke-kardiomyocytpopulationer11,12,13 i det vuxna däggdjurshjärtat är en stor barriär för att modellera hjärtvävnad med hjälp av individuella celltyper.Dessa stora begränsningar understryker vikten av att utveckla metoder för att odla intakt myokardvävnad under fysiologiska och patologiska tillstånd.
Odlade tunna (300 µm) sektioner av det mänskliga hjärtat har visat sig vara en lovande modell av intakt humant myokardium.Denna metod ger tillgång till ett komplett 3D multicellulärt system som liknar mänsklig hjärtvävnad.Fram till 2019 begränsades dock användningen av odlade hjärtsektioner av den korta (24 timmar) kulturöverlevnaden.Detta beror på ett antal faktorer, inklusive avsaknaden av fysisk-mekanisk sträckning, luft-vätskegränssnittet och användningen av enkla medier som inte stödjer behoven hos hjärtvävnad.Under 2019 visade flera forskargrupper att inkorporering av mekaniska faktorer i hjärtvävnadsodlingssystem kan förlänga odlingslivslängden, förbättra hjärtuttrycket och efterlikna hjärtpatologi.Två eleganta studier 17 och 18 visar att enaxlig mekanisk belastning har en positiv effekt på hjärtfenotypen under odling.Dessa studier använde dock inte den dynamiska tredimensionella fysikalisk-mekaniska belastningen av hjärtcykeln, eftersom hjärtsektioner belastades med antingen isometriska dragkrafter 17 eller linjär auxotonisk belastning 18 .Dessa metoder för vävnadssträckning resulterade i undertryckandet av många hjärtgener eller överuttrycket av gener associerade med onormala sträckningssvar.Noterbart är Pitoulis et al.19 utvecklade ett dynamiskt odlingsbad för hjärtskivor för rekonstruktion av hjärtcykeln med hjälp av kraftomvandlarfeedback och spänningsdrifter.Även om detta system möjliggör mer exakt in vitro-hjärtcykelmodellering, begränsar metodens komplexitet och låga genomströmning tillämpningen av detta system.Vårt laboratorium har nyligen utvecklat ett förenklat odlingssystem som använder elektrisk stimulering och ett optimerat medium för att bibehålla livsdugligheten hos sektioner av gris och mänsklig hjärtvävnad i upp till 6 dagar20,21.
I det aktuella manuskriptet beskriver vi en hjärtvävnadskulturmodell (CTCM) med sektioner av grishjärtat som innehåller humorala signaler för att rekapitulera tredimensionell hjärtfysiologi och patofysiologisk utvidgning under hjärtcykeln.Denna CTCM kan öka noggrannheten i preklinisk läkemedelsförutsägelse till en nivå som aldrig tidigare uppnåtts genom att tillhandahålla ett kostnadseffektivt, medelhjärtsystem som efterliknar däggdjurshjärtats fysiologi/patofysiologi för preklinisk läkemedelstestning.
Hemodynamiska mekaniska signaler spelar en avgörande roll för att upprätthålla kardiomyocytfunktion in vitro 22,23,24.I det aktuella manuskriptet har vi utvecklat en CTCM (Figur 1a) som kan efterlikna den vuxna hjärtmiljön genom att inducera både elektrisk och mekanisk stimulering vid fysiologiska frekvenser (1,2 Hz, 72 slag per minut).För att undvika överdriven vävnadssträckning under diastole användes en 3D-utskriftsenhet för att öka vävnadsstorleken med 25 % (Fig. 1b).Elektrisk stimulering inducerad av C-PACE-systemet tidsinställdes för att starta 100 ms före systole med hjälp av ett datainsamlingssystem för att helt reproducera hjärtcykeln.Vävnadsodlingssystemet använder ett programmerbart pneumatiskt ställdon (LB Engineering, Tyskland) för att cykliskt expandera ett flexibelt silikonmembran för att orsaka expansion av hjärtskivorna i den övre kammaren.Systemet var anslutet till en extern luftledning genom en tryckgivare, vilket gjorde det möjligt att exakt justera trycket (± 1 mmHg) och tiden (± 1 ms) (fig. 1c).
a Fäst vävnadssektionen på 7 mm stödringen, visad i blått, inuti enhetens odlingskammare.Odlingskammaren är separerad från luftkammaren med ett tunt flexibelt silikonmembran.Placera en packning mellan varje kammare för att förhindra läckage.Enhetens lock innehåller grafitelektroder som ger elektrisk stimulering.b Schematisk representation av den stora vävnadsanordningen, styrringen och stödringen.Vävnadssektionerna (bruna) placeras på den överdimensionerade enheten med styrringen placerad i spåret på enhetens ytterkant.Använd guiden och placera försiktigt stödringen belagd med vävnadsakryllim över delen av hjärtvävnaden.c Graf som visar tidpunkten för elektrisk stimulering som en funktion av luftkammarens tryck som styrs av ett programmerbart pneumatiskt ställdon (PPD).En datainsamlingsanordning användes för att synkronisera elektrisk stimulering med hjälp av trycksensorer.När trycket i odlingskammaren når det inställda tröskelvärdet skickas en pulssignal till C-PACE-EM för att utlösa elektrisk stimulering.d Bild av fyra CTCM:er placerade på en inkubatorhylla.Fyra enheter är anslutna till en PPD via en pneumatisk krets, och trycksensorer sätts in i den hemostatiska ventilen för att övervaka trycket i den pneumatiska kretsen.Varje enhet innehåller sex vävnadssektioner.
Med ett enda pneumatiskt manöverdon kunde vi styra 4 CTCM-enheter, som var och en kunde hålla 6 vävnadssektioner (Fig. 1d).I CTCM omvandlas lufttrycket i luftkammaren till synkront tryck i vätskekammaren och inducerar fysiologisk expansion av hjärtskivan (Figur 2a och tilläggsfilm 1).Utvärdering av vävnadssträckning vid 80 mm Hg.Konst.visade sträckning av vävnadssnitt med 25 % (fig. 2b).Denna procentuella sträckning har visat sig motsvara en fysiologisk sarkomerlängd på 2,2–2,3 µm för normal hjärtsektionskontraktilitet17,19,25.Vävnadsrörelser bedömdes med hjälp av anpassade kamerainställningar (kompletterande figur 1).Amplituden och hastigheten för vävnadsrörelsen (fig. 2c, d) motsvarade sträckning under hjärtcykeln och tid under systole och diastole (fig. 2b).Sträckning och hastighet av hjärtvävnad under kontraktion och avslappning förblev konstant under 12 dagar i odling (fig. 2f).För att utvärdera effekten av elektrisk stimulering på kontraktilitet under odling utvecklade vi en metod för att bestämma aktiv deformitet med hjälp av en skuggningsalgoritm (kompletterande figur 2a,b) och kunde skilja mellan deformiteter med och utan elektrisk stimulering.Samma sektion av hjärtat (fig. 2f).I den rörliga delen av skärningen (R6-9) var spänningen under elektrisk stimulering 20 % högre än i frånvaro av elektrisk stimulering, vilket indikerar bidraget från elektrisk stimulering till kontraktil funktion.
Representativa spår av luftkammarens tryck, vätskekammarens tryck och vävnadsrörelsemätningar bekräftar att kammartrycket ändrar vätskekammarens tryck, vilket orsakar en motsvarande rörelse av vävnadsskivan.b Representativa spår av procent sträckning (blå) av vävnadssnitt motsvarande procent sträckning (orange).c Den uppmätta rörelsen av hjärtskivan överensstämmer med den uppmätta rörelsehastigheten.(d) Representativa banor för cyklisk rörelse (blå linje) och hastighet (orange prickad linje) i en del av hjärtat.e Kvantifiering av cykeltid (n = 19 skivor per grupp, från olika grisar), sammandragningstid (n = 19 skivor per grupp), relaxationstid (n = 19 skivor per grupp, från olika grisar), vävnadsrörelse (n = 25 ).skivor)/grupp från olika grisar), topp systolisk hastighet (n = 24(D0), 25(D12) skivor/grupp från olika grisar) och toppavslappningshastighet (n=24(D0), 25(D12) skivor/grupp från olika grisar).Two-tailed Students t-test visade ingen signifikant skillnad i någon parameter.f Representativa stamanalysspår av vävnadssnitt med (röd) och utan (blå) elektrisk stimulering, tio regionala områden av vävnadssnitt från samma sektion.De nedre panelerna visar kvantifieringen av den procentuella skillnaden i belastning i vävnadssnitt med och utan elektrisk stimulering i tio områden från olika sektioner. (n = 8 skivor/grupp från olika grisar, Two-tailed Student t-test utförs; ****p < 0,0001, **p < 0,01, *p < 0,05). (n = 8 skivor/grupp från olika grisar, Two-tailed Student t-test utförs; ****p < 0,0001, **p < 0,01, *p < 0,05). (n = 8 срезов/группу от разных свиней, проводится двусторонний t-критерий Стьюдента; ****p<0,0001, ***p<0,01,01,5p<0,01,01. (n = 8 sektioner/grupp från olika grisar, tvåsvansad Students t-test; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05). （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p < 0,0001，**p < 0,01＀0,5） （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p < 0,0001，**p < 0,01＀0,5） (n = 8 срезов/группу, от разных свиней, двусторонний критерий Стьюдента; ****p <0,0001, **p <0,01, *p <0,05). (n = 8 sektioner/grupp, från olika grisar, tvåsvansad Students t-test; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05).Felstaplar representerar medelvärdet ± standardavvikelsen.
I vårt tidigare statiska biomimetiska hjärtskivakultursystem [20, 21] bibehöll vi livskraften, funktionen och strukturella integriteten hos hjärtskivor i 6 dagar genom att applicera elektrisk stimulering och optimera mediets sammansättning.Men efter 10 dagar sjönk dessa siffror kraftigt.Vi kommer att hänvisa till avsnitt odlade i vårt tidigare statiska biomimetiska odlingssystem 20, 21 kontrollförhållanden (Ctrl) och vi kommer att använda vårt tidigare optimerade medium som MC-förhållanden och odling under samtidig mekanisk och elektrisk stimulering (CTCM).ringde.Först fastställde vi att mekanisk stimulering utan elektrisk stimulering var otillräcklig för att upprätthålla vävnadsviabilitet i 6 dagar (kompletterande fig. 3a, b).Intressant nog, med införandet av fysio-mekanisk och elektrisk stimulering med STCM, förblev livsdugligheten för 12-dagars hjärtsektioner densamma som i färska hjärtsektioner under MS-förhållanden, men inte under Ctrl-förhållanden, vilket visas av MTT-analys (Fig. 1).3a).Detta tyder på att mekanisk stimulering och simulering av hjärtcykeln kan hålla vävnadssektioner livskraftiga dubbelt så länge som rapporterats i vårt tidigare statiska odlingssystem.Utvärdering av den strukturella integriteten av vävnadssektioner genom immunmärkning av hjärttroponin T och connexin 43 visade dock att connexin 43-expression var signifikant högre i MC-vävnader på dag 12 än i kontroller samma dag.Emellertid upprätthölls inte enhetlig connexin 43-uttryck och Z-skivbildning helt (Fig. 3b).Vi använder ett ramverk för artificiell intelligens (AI) för att kvantifiera vävnadsstrukturell integritet26, en bildbaserad pipeline för djupinlärning baserad på troponin-T och connexinfärgning43 för att automatiskt kvantifiera den strukturella integriteten och fluorescensen av hjärtskivor i termer av styrka av lokalisering.Denna metod använder ett Convolutional Neural Network (CNN) och ett ramverk för djupinlärning för att tillförlitligt kvantifiera den strukturella integriteten hos hjärtvävnad på ett automatiserat och opartiskt sätt, som beskrivs i referensen.26. MC-vävnad visade förbättrad strukturell likhet med dag 0 jämfört med statiska kontrollsektioner.Dessutom avslöjade Massons trikromfärgning en signifikant lägre andel fibros under MS-förhållanden jämfört med kontrollförhållandena på dag 12 av odlingen (Fig. 3c).Medan CTCM ökade livsdugligheten för hjärtvävnadssektioner på dag 12 till en nivå som liknar den för färsk hjärtvävnad, förbättrade det inte signifikant den strukturella integriteten hos hjärtsektionerna.
ett stapeldiagram visar kvantifiering av MTT-viabiliteten för färska hjärtskivor (D0) eller hjärtskivorkulturer under 12 dagar, antingen i statisk kultur (D12 Ctrl) eller i CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) skivor (D12 MC) på ett sätt ANO-gris/grupp,# är utförd på ett sätt ANO-gris/grupp;#p; 01 jämfört med D0 och **p < 0,01 jämfört med D12 Ctrl). ett stapeldiagram visar kvantifiering av MTT-viabiliteten för färska hjärtskivor (D0) eller hjärtskivorkultur under 12 dagar, antingen i statisk kultur (D12 Ctrl) eller i CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl ), 12 (D12 MC) envägsskivor ANOs/# pigs,# är utförd envägs ANOs/#0;# test. 001 jämfört med D0 och **p < 0,01 jämfört med D12 Ctrl).histogrammet visar kvantifieringen av livsdugligheten för MTT färska hjärtsektioner (D0) eller odling av hjärtsektioner under 12 dagar i antingen statisk kultur (D12 kontroll) eller CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 kontroll). ) ), 12 (D12 MC) sektioner ANO, ett test utförs på olika sätt/grupp;####p < 0,0001 по сравнению с D0 и **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p < 0,0001 jämfört med D0 och **p < 0,01 jämfört med D12 Ctrl). a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切牄切切牄切 版(D2)天的MTT 活力的量化)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测踎D 0；测踎D#0p#0. ，与D12 Ctrl 相比，**p < 0,01)。 a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心不脏別片 片(D2 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；与D0 相比，####p < 0,0001，与D12 Ctrl 相比，**phistogram som visar kvantifieringen av MTT-viabilitet i färska hjärtsektioner (D0) eller hjärtsektioner odlade i 12 dagar i statisk odling (D12-kontroll) eller CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12-kontroll)), 12 (D12 MC) sektioner/grupp från olika ANOVA-test, envägs-ANOVA;####p < 0,0001 по сравнению с D0, **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p < 0,0001 jämfört med D0, **p < 0,01 jämfört med D12 Ctrl).b Troponin-T (grön), connexin 43 (röd) och DAPI (blå) i nyligen isolerade hjärtsektioner (D0) eller hjärtsektioner odlade under statiska förhållanden (Ctrl) eller CTCM-förhållanden (MC) i 12 dagar) av representativa immunfluorescensbilder (blank skala = 100 µm). Artificiell intelligens kvantifiering av hjärtvävnadens strukturella integritet (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) skivor/grupp vardera från olika grisar, envägs ANOVA-test utförs; ####p < 0,0001 jämfört med D0 och D100 p <1 0.Ctrl. Artificiell intelligens kvantifiering av hjärtvävnadens strukturella integritet (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) skivor/grupp vardera från olika grisar, envägs ANOVA-test utförs; ####p < 0,0001 jämfört med D0 och D100p < 10.Ctrl). Количественная оценка структурной целостности сердечной ткани искусственным интеллектом (n = 7 (D0), 7 (D12 с12), прег (D12 с12), праов (D12 с12), пра зных свиней, проводится однофакторный тест ANOVA; ####p < 0,0001 по сравнению с D0 och ****p < 0,0001 по сравни). Kvantifiering av den strukturella integriteten hos hjärtvävnad genom artificiell intelligens (n ​​= 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) sektioner/grupper från olika grisar, envägs ANOVA-test utfört; ####p < 0,0001 vs. med D0 och D1201 <Ctrl jämfört med D0 och D****01).人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) skivor/gruppera var och en av olika grisar, envägs ANO ，****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）.人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) skivor/grupp var och en av olika grisar, enkelriktad .#0#0VA-test .#0#D;#D; ，****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）. Искусственный интеллект для количественной оценки структурной целостности сердечной ткани (n = 7 (D0), 7 (D512 пуков) аждой из разных свиней, односторонний тест ANOVA; ####p <0,0001 vs. D0 Для сравнения ****p < 0,0001 по сравницения). Artificiell intelligens för att kvantifiera den strukturella integriteten hos hjärtvävnad (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) sektioner/grupp var och en av olika grisar, envägs ANOVA-test; ####p<0,0001 vs .D0 För jämförelse 0.****001).Ctrl c Representativa bilder (vänster) och kvantifiering (höger) för hjärtskivor färgade med Massons trikromfärgning (Skala blott = 500 µm) (n = 10 skivor/grupp vardera från olika grisar, envägs ANOVA-test utförs; ####p < 0,0001 jämfört med D0 och D*** Ctrl). c Representativa bilder (vänster) och kvantifiering (höger) för hjärtskivor färgade med Massons trikromfärgning (Skala blott = 500 µm) (n = 10 skivor/grupp vardera från olika grisar, envägs ANOVA-test utförs; #### p < 0,0001 jämfört med D0,01 ***p1 jämfört med D0 och D01 ***p). c Репрезентативные изображения (слева) och количественная оценка (справа) срезов сердца, окрашенных трихмных штаб без покрытия = 500 мкм) (n = 10 срезов/группу от разных свиней, выполняется одностороюсен тевностороюсен тев тев ### ANOVA;P#00; D0 och ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Representativa bilder (vänster) och kvantifiering (höger) av hjärtsektioner färgade med Massons trikromfärgning (obelagd skala = 500 µm) (n = 10 sektioner/grupp från olika grisar, envägs ANOVA-test utfört; #### p < 0 .0001 jämfört med D0 och D***p Ctrl jämfört med D0 och D***p). c 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像（左）和量化（右）（裼=尺0）（裸=尺0）（裸=尺0）切片/组，每组来自不同的猪，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0,0001 与D0 与D0 相比，01 相比，01 Ctrl <0.***p . C 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 （左 左） 量化 （右） 裸壸庰 帺壸庰度 = 500 µm） （n = 10 个 切片 组 每 组 来自 不同 猪 ， 进行 单向 单向 跑 0##Anova 浵 0##D相比，***p < 0,001 与D12 Ctrl 相比）. c Репрезентативные изображения (слева) och количественный анализ (справа) срезов сердца, окрашенных трихмный я шкала = 500 мкм) (n = 10 срезов/группа, каждый от другой свиньи, протестировано с помощью однофагного ;### #p < 0,0001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Representativa bilder (vänster) och kvantifiering (höger) av hjärtsektioner färgade med Massons trikromfärgning (blank = 500 µm) (n = 10 sektioner/grupp, var och en från en annan gris, testad genom envägsanalys av varians ;### # p < 0,0001 jämfört med D0,10***p < D0, Ctrl***p < D0, Ctrl).Felstaplar representerar medelvärdet ± standardavvikelsen.
Vi antog att genom att lägga till små molekyler till odlingsmediet kunde kardiomyocytintegriteten förbättras och fibrosutvecklingen minskas under CTCM-odling.Vi screenade därför för små molekyler med hjälp av våra statiska kontrollkulturer20,21 på grund av det lilla antalet störande faktorer.Dexametason (Dex), trijodtyronin (T3) och SB431542 (SB) valdes för denna screening.Dessa små molekyler har tidigare använts i hiPSC-CM-kulturer för att inducera mognad av kardiomyocyter genom att öka sarkomerlängden, T-tubuli och ledningshastighet.Dessutom är både Dex (en glukokortikoid) och SB kända för att undertrycka inflammation29,30.Därför testade vi om införandet av en eller en kombination av dessa små molekyler skulle förbättra den strukturella integriteten hos hjärtsektioner.För initial screening valdes dosen av varje förening baserat på de koncentrationer som vanligtvis används i cellodlingsmodeller (1 μM Dex27, 100 nM T327 och 2,5 μM SB31).Efter 12 dagars odling resulterade kombinationen av T3 och Dex i optimal kardiomyocytstrukturell integritet och minimal fibrös ombyggnad (kompletterande figurer 4 och 5).Dessutom gav användning av dubbla eller dubbla dessa koncentrationer av T3 och Dex skadliga effekter jämfört med normala koncentrationer (kompletterande fig. 6a,b).
Efter inledande screening utförde vi en head-to-head-jämförelse av 4 odlingsförhållanden (Figur 4a): Ctrl: hjärtsektioner odlade i vår tidigare beskrivna statiska kultur med vårt optimerade medium;20.21 TD: T3 och Ctrl s Lade till Dex på onsdag;MC: hjärtsektioner odlade i CTCM med vårt tidigare optimerade medium;och MT: CTCM med T3 och Dex tillsatta till mediet.Efter 12 dagars odling förblev livsdugligheten för MS- och MT-vävnader densamma som i färska vävnader utvärderade med MTT-analys (Fig. 4b).Intressant nog resulterade inte tillägget av T3 och Dex till transwell-kulturer (TD) i en signifikant förbättring av livsduglighet jämfört med Ctrl-förhållanden, vilket indikerar en viktig roll för mekanisk stimulering för att upprätthålla livskraften hos hjärtsektioner.
ett experimentellt designdiagram som visar de fyra odlingsbetingelserna som används för att utvärdera effekterna av mekanisk stimulering och T3/Dex-tillskott på medium under 12 dagar. b Stapeldiagram visar kvantifiering av livsduglighet 12 dagar efter odling i alla 4 odlingsförhållandena (Ctrl, TD, MC och MT) jämfört med färska hjärtskivor (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD och D12 MT), 12 (D12 MC) skivor (D12 MC) snittar/grupp #0;# är utförd på olika sätt ANO 0;#; 001, ###p < 0,001 jämfört med D0 och **p < 0,01 jämfört med D12 Ctrl). b Stapeldiagram visar kvantifiering av livsduglighet 12 dagar efter odling i alla 4 odlingsförhållandena (Ctrl, TD, MC och MT) jämfört med färska hjärtskivor (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD och D12 MT), 12 (D12 MC) skivor (D12 MC) snittar/grupp #0;# är utförd på olika sätt ANO 0;#; 001, ###p < 0,001 jämfört med D0 och **p < 0,01 jämfört med D12 ctrl). b Гистограмма показывает количественную оценку. ования (контроль, TD, MC och MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD och D12) пур (D12) пур (D12) пур т разных свиней, проводится односторонний тест ANOVA; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 på сравнению с D0 och **p < 0,01 p < 0,01). b Stapeldiagrammet visar kvantifieringen av livsduglighet 12 dagar efter odling under alla 4 odlingsförhållandena (kontroll, TD, MC och MT) jämfört med färska hjärtsektioner (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD och D12 MT), 12 (D12 MC) från olika sektioner/# 0 pigs, # 0 sektioner, # 0; 001, ###p < 0,001 vs. D0 och **p < 0,01 jämfört med D12 Ctrl). b. MT)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；####p < 0,0001，，，，，，，，，，，，，，，，，，，，，，，，，，，︎**01缛p < 0.0与D12控制）.b 4 12 (D12 MC) b Гистограмма, показывающая все 4 условия культивирования (контроль, TD, MC och MT) по сравнению со свежезц со свежезц (1) (1) D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD och D12 MT), från разных свиней 12 (D12 MC) срезы/группа, односторонний тест ANOVA; #с###p <0,#0#0p <0,#0#0p <0,#01p с D0, **p <0,01 по сравнению с контролем D12). b Histogram som visar alla 4 odlingsförhållandena (kontroll, TD, MC och MT) jämfört med färska hjärtsektioner (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD och D12 MT), från olika grisar 12 (D12 MC) sektioner/grupp, envägs ANOVAp1<0#0#0, #.0##0, #.0##0, #.0## **p<0,01 mot kontroll D12). c Stapeldiagram visar kvantifieringen av glukosflödet 12 dagar efter odlingen i alla 4 odlingsförhållandena (Ctrl, TD, MC och MT) jämfört med färska hjärtskivor (D0) (n = 6 skivor/grupp från olika grisar, envägs ANOVA-test utförs; ###p < 0,001, jämfört med 1,0,1***p < D0,1***p < D0 och D0,1***). c Stapeldiagram visar kvantifieringen av glukosflödet 12 dagar efter odlingen i alla 4 odlingsförhållandena (Ctrl, TD, MC och MT) jämfört med färska hjärtskivor (D0) (n = 6 skivor/grupp från olika grisar, envägs ANOVA-test utförs; ###p < 0,001, jämfört med 1,0,1***p < D0,1***p < D0 och D0,1***). c Гистограмма показывает количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после культивированис во 4висовис ания (контроль, TD, MC och MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 6 срезов/группу от разных сердца, Пруппу от разных сердца ся тест ANOVA; ###p < 0,001 по сравнению с D0 и ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Histogram visar kvantifiering av glukosflöde 12 dagar efter odling under alla 4 odlingsbetingelserna (kontroll, TD, MC och MT) jämfört med färska hjärtsektioner (D0) (n = 6 sektioner/grupp från olika grisar, envägs ANOVA-test utfört; ###p < 0,001 jämfört med D0 och 102p <Ctrl jämfört med D0 och 102p <Ctrl). c.通量定量（n = 6 片/组，来自不同猪，单向执行ANOVA 测试；###p < 0.001，与***D0 盌，与***D0 盌，与***D0 盌相比). C 条形图 显示 所有 4 种 条件 （（ctrl 、 td 、 mc 和 mt） 新鲜 心脏 条件 切 片 切 片 切 片 切养 后 后 12 天 的 通量 定量 （n = 6 片/组 ， 来自 猪 ， ， Ｇ ， 定量 （n = 6 片/组 ， 来自 猪 ， , ， ， 卌 ， ， 瑌 AN测试；###p < 0,001，与D0 相比，***p < 0,001 与D12 Ctrl 相比）。 c Гистограмма, показывающая количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после культивированивий после культивированивий рования (контроль, TD, MC och MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 6 срезов/групста, от развидхн, развидих роведены тесты ANOVA; ###p < 0,001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению с D12 (контроль). c Histogram som visar kvantifiering av glukosflöde 12 dagar efter odling för alla 4 odlingsbetingelserna (kontroll, TD, MC och MT) jämfört med färska hjärtsektioner (D0) (n = 6 sektioner/grupp, från olika grisar, unilaterala Om ANOVA-tester utfördes, ###p < 0,001 p < 0,001 jämfört med D***01 jämfört med D 0,001).d Stamanalysdiagram av färska (blå), dag 12 MC (grön) och dag 12 MT (röd) vävnader vid tio regionala vävnadssektionspunkter (n = 4 skivor/grupp, envägs ANOVA-test; det fanns ingen signifikant skillnad mellan grupperna).Vulkanplot som visar differentiellt uttryckta gener i färska hjärtsektioner (D0) jämfört med hjärtsektioner odlade under statiska förhållanden (Ctrl) eller under MT-förhållanden (MT) i 10-12 dagar.f Värmekarta över sarkomergener för hjärtsektioner odlade under var och en av odlingsbetingelserna.Felstaplar representerar medelvärdet ± standardavvikelsen.
Metaboliskt beroende av övergången från fettsyraoxidation till glykolys är ett kännetecken för kardiomyocytdedifferentiering.Omogna kardiomyocyter använder främst glukos för ATP-produktion och har hypoplastiska mitokondrier med få cristae5,32.Glukosanvändningsanalyser visade att under MC- och MT-förhållanden var glukosutnyttjandet liknande det i dag 0-vävnader (Figur 4c).Ctrl-prover visade dock en signifikant ökning av glukosutnyttjandet jämfört med färsk vävnad.Detta indikerar att kombinationen av CTCM och T3/Dex förbättrar vävnadsviabiliteten och bevarar den metaboliska fenotypen av 12-dagars odlade hjärtsektioner.Dessutom visade stamanalys att stamnivåerna förblev desamma som i färsk hjärtvävnad under 12 dagar under MT- och MS-förhållanden (Fig. 4d).
För att analysera den övergripande effekten av CTCM och T3/Dex på det globala transkriptionslandskapet av hjärtskivor, utförde vi RNAseq på hjärtskivor från alla fyra olika odlingsförhållanden (kompletterande data 1).Intressant nog visade MT-sektioner hög transkriptionell likhet med färsk hjärtvävnad, med endast 16 differentiellt uttryckta av 13 642 gener.Men som vi visade tidigare visade Ctrl-skivor 1229 differentiellt uttryckta gener efter 10–12 dagar i odling (Fig. 4e).Dessa data bekräftades av qRT-PCR av hjärt- och fibroblastgener (kompletterande fig. 7a-c).Intressant nog visade Ctrl-sektionerna nedreglering av hjärt- och cellcykelgener och aktivering av inflammatoriska genprogram.Dessa data tyder på att dedifferentiering, som normalt sker efter långvarig odling, är helt försvagad under MT-förhållanden (kompletterande fig. 8a,b).Noggranna studier av sarkomergener visade att endast under MT-förhållanden bevaras generna som kodar för sarkomeren (fig. 4f) och jonkanalen (kompletterande fig. 9), vilket skyddar dem från undertryckande under Ctrl-, TD- och MC-förhållanden.Dessa data visar att med en kombination av mekanisk och humoral stimulering (T3/Dex), kan hjärtats skivtranskriptom förbli liknande färska hjärtskivor efter 12 dagar i kultur.
Dessa transkriptionella fynd stöds av det faktum att den strukturella integriteten hos kardiomyocyter i hjärtsektioner bäst bevaras under MT-förhållanden i 12 dagar, vilket visas av intakt och lokaliserat connexin 43 (fig. 5a).Dessutom reducerades fibros i hjärtsektioner under MT-förhållanden signifikant jämfört med Ctrl och liknande färska hjärtsektioner (Fig. 5b).Dessa data visar att kombinationen av mekanisk stimulering och T3/Dex-behandling effektivt bevarar hjärtstrukturen i hjärtsektioner i kultur.
en representativ immunofluorescensbilder av troponin-T (grön), connexin 43 (röd) och DAPI (blå) i nyligen isolerade hjärtsektioner (D0) eller odlade i 12 dagar i alla fyra hjärtsektionsodlingsförhållanden (skala bar = 100 µm).). Artificiell intelligens kvantifiering av hjärtvävnadens strukturella integritet (n = 7 (D0 och D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC och D12 MT) skivor/grupp från olika grisar, envägs ANOVA-test utförs; ####p < 0,0001 jämfört med D0,0,0 och *p < eller D0,0,01 jämfört med D0,0. 12 Ctrl). Artificiell intelligens kvantifiering av hjärtvävnadens strukturella integritet (n = 7 (D0 och D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC och D12 MT) skivor/grupp från olika grisar, envägs ANOVA-test utförs; #### p < 0,0001 jämfört med D0,0,01 och *p < eller 0,0001 jämfört med D0,0. 12 Ctrl). Количественная оценка структурной целостности ткани сердца с помощью искусственного интеллекта (n = 7 (D122 Ctrl), D = 7 (D12, Ctrl), (D12 Ctrl), 2 MT) срезов/группу от разных свиней, проведен однофакторный тест ANOVA; #### p < 0,0001 p. внению с D12 Ctrl). Kvantifiering av hjärtvävnadens strukturella integritet med hjälp av artificiell intelligens (n ​​= 7 (D0 och D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC och D12 MT) sektioner/grupp från olika grisar, envägs ANOVA-test utfört; #### p < 0,0001 p < 0,0001 jämfört med D01,0 och D****0 0,0 5 jämfört med D01,00 och D****0. Ctrl).对不同猪的心脏组织结构完整性（n = 7（D0 和D12 Ctrl）、5（D12 TD、D12 MC 咼片忄ﺡ，片忈MTﺛ工智能量化，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0,0001 与D0 和*p < 0,05 相比，渔****p < 0,0000 Ctrl 0,0001对 不同 猪 的 心脏 结构 完整性 （n = 7 （d0 和 d12 ctrl） （5 （d12 td 、 d12 mc 廒 缌 d12 mc 廒智能量 化 进行 单向 单向 单向 测试 ； ########## p < 0,0001 与D0 和*p < 0,05 缌 0****D 1 与 0****相比).Kvantifiering av den strukturella integriteten av hjärtvävnad med hjälp av artificiell intelligens i olika grisar (n = 7 (D0 och D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC och D12 MT) sektioner/grupp) med ett envägs ANOVA-test;#### p < 0,0001 по сравнению с D0 и *p < 0,05 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). #### p < 0,0001 jämfört med D0 och *p < 0,05 eller ****p < 0,0001 jämfört med D12 Ctrl). b Representativa bilder och kvantifiering för hjärtskivor färgade med Massons trikromfärgning (Skalstapel = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD och D12 MC), 9 (D12 MT) skivor/grupp från olika grisar, test utförs envägs ANO.## och jämförs med <1NO.##, en-vägs, #***0.##. p < 0,001, eller ****p < 0,0001 jämfört med D12 Ctrl). b Representativa bilder och kvantifiering för hjärtskivor färgade med Massons trikromfärgning (Skalstapel = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD och D12 MC), 9 (D12 MT) skivor/grupp från olika grisar, test utförs envägs ANO.## och jämförs med <1NO.##, en-vägs, #***0.##. p < 0,001, eller ****p < 0,0001 jämfört med D12 Ctrl). b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромным красналасная ( = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD och D12 MC), 9 (D12 MT) срезов/группу от разных свиней, выполняется одни0#, #0; 1 по сравнению с D0 и ***p < 0,001 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). b Representativa bilder och kvantifiering av hjärtsektioner färgade med Massons trikromfärgning (skala streck = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD och D12 MC), 9 (D12 MT) sektioner/grupp från olika grisar, utförd envägs ANOVA <.#0pVA och #***0pVA, #***0p1 och 0.#s. 01 eller ****p < 0,0001 vs. D12 Ctrl). b 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像和量化（比例尺= 500 µm！D！D、D、0n（10n和D12 MC），来自不同猪的9 个（D12 MT）切片/组，进行单因素方差分渔；渔；缛缛0#***#p 0,001，或****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）. b 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 和 量化 （比例 尺 尺 尺 = 500 µ（n = 、0（n trl 、 d12 td 和 d12 mc） 来自 不同 的 9 个 d12 mt 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片片 切片 ​​切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片/组，进行单因素方差分#縌***p < 0,001，或****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）. b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромом Маснашения (маснашения = 5 массона) n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD och D12 MC), 9 (D12 MT) срезов от разных свиней / группы, один-способ ANOVA; #с###p < 0,0p < 0,0p < 0,0 001 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). b Representativa bilder och kvantifiering av hjärtsektioner färgade med Massons trikrom (skalstreck = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD och D12 MC), 9 (D12 MT) sektioner från olika grisar/grupp, en ANOVA-metod; ##.#00.***0, ***0, 0,1, 0, 0 eller 0. p < 0,0001 jämfört med D12 Ctrl).Felstaplar representerar medelvärdet ± standardavvikelsen.
Slutligen bedömdes förmågan hos CTCM att efterlikna hjärthypertrofi genom att öka hjärtvävnadssträckningen.I CTCM ökade topptrycket i luftkammaren från 80 mmHg till 80 mmHg.Konst.(normal stretch) upp till 140 mmHg Art.(Fig. 6a).Detta motsvarar en 32% ökning av sträckningen (fig. 6b), som tidigare visades som motsvarande procentuell sträckning som krävs för hjärtsektioner för att uppnå en sarkomerlängd liknande den som ses vid hypertrofi.Sträckning och hastighet av hjärtvävnad under kontraktion och avslappning förblev konstant under sex dagars odling (fig. 6c).Hjärtvävnad från MT-tillstånd utsattes för normal sträckning (MT (Normal)) eller översträckning (MT (OS)) under sex dagar.Redan efter fyra dagar i odling var den hypertrofiska biomarkören NT-ProBNP signifikant förhöjd i mediet under MT (OS) förhållanden jämfört med MT (normala) förhållanden (Fig. 7a).Dessutom, efter sex dagars odling, ökade cellstorleken i MT (OS) (Fig. 7b) signifikant jämfört med sektioner av MT-hjärta (normal).Dessutom ökade NFATC4 nukleär translokation signifikant i översträckta vävnader (Fig. 7c).Dessa resultat visar den progressiva utvecklingen av patologisk ombyggnad efter hyperdistension och stödjer konceptet att CTCM-enheten kan användas som en plattform för att studera sträckinducerad hjärthypertrofisignalering.
Representativa spår av luftkammarens tryck, vätskekammarens tryck och vävnadsrörelsemätningar bekräftar att kammartrycket ändrar vätskekammarens tryck, vilket orsakar en motsvarande rörelse av vävnadsskivan.b Representativa kurvor för sträckprocent och sträckhastighet för normalt sträckta (orange) och översträckta (blå) vävnadssnitt.c Stapeldiagram som visar cykeltid (n = 19 skivor per grupp, från olika grisar), sammandragningstid (n = 18-19 skivor per grupp, från olika grisar), avslappningstid (n = 19 skivor per grupp, från olika grisar) , amplitud av vävnadsrörelse (n = 14 skivor/grupp hastighet, från olika snitt/grupp), från olika sektioner/grupp, från olika snitt/grupp, från olika snitt/grupp, olika grisar) och maximal relaxationshastighet (n = 14 (D0), 15 (D6) ) sektioner/grupper) från olika grisar), visade tvåsidiga Students t-test ingen signifikant skillnad i någon parameter, vilket indikerar att dessa parametrar förblev konstanta under 6 dagars odling med överspänning.Felstaplar representerar medelvärdet ± standardavvikelsen.
ett stapeldiagram kvantifiering av NT-ProBNP-koncentration i odlingsmedier från hjärtskivor odlade under MT normal sträckning (Norm) eller översträckning (OS) förhållanden (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm och D4 MTOS) skivor/grupp från olika grisar, < 0-vägs sträckning, < 0-vägs sträckning med ANOpVA). ett stapeldiagram kvantifiering av NT-ProBNP-koncentrationen i odlingsmedier från hjärtskivor odlade under MT normal sträckning (Norm) eller översträckning (OS) förhållanden (n​= 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm och D4 MTOS) skivor/grupp från olika A**NOS, 0-vägs sträckning <0-vägs).Kvantitativt histogram av NT-ProBNP-koncentration i odlingsmedium från hjärtskivor odlade under förhållanden med normal MT-sträckning (norm) eller översträckning (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm och D4).MTOS) skivor/grupp från olika grisar, tvåfaktorsanalys utförs;**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p < 0,01 jämfört med normal stretch). en 在MT 正常拉伸(Norm) 或过度拉伸(OS) 条件下培养的心脏切片培养基中NT-ProBNP 絢度n (D2 MTNorm)、3（D2 MTOS、D4 MTNorm 和D4 MTOS）来自不同猪的切片/组，进行双向方与缛**帉方帎缛**析，p < 0,01）. a Kvantifiering av NT-ProBNP-koncentrationen i hjärtskivor odlade under MT normal sträckning (Norm) eller översträckning (OS) förhållanden (n​=4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm和D4 MTOS) från olika 猪暄切䉇幏发廐喑发弥动; **jämfört med normal stretching, p < 0,01).histogram Kvantifiering av NT-ProBNP-koncentrationer i hjärtskivor odlade under förhållanden med normal MT-sträckning (norm) eller översträckning (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm) och D4 MTOS) skivor/grupp från olika grisar, tvåvägsanalys av varians;**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p < 0,01 jämfört med normal stretch). b Representativa bilder för hjärtskivor färgade med troponin-T och WGA (vänster) och cellstorlekskvantifiering (höger) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) celler/grupp från 10 olika skivor från olika grisar, Tvåsvansad Student t-test utförs med normal sträckning 0; ****001 . b Representativa bilder för hjärtskivor färgade med troponin-T och WGA (vänster) och cellstorlekskvantifiering (höger) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) celler/grupp från 10 olika skivor från olika grisar, tvåsvansad Student t-test utförs 0; ****0p01 jämförs med 0; ****0p01). b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т och АЗП (слева) och количествениногосрашенных права) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) клеток/группу из 10 разных срезов от разных свиней, два- провохдит ента; ****p < 0,0001 по сравнению с нормальным растяжением). b Representativa bilder av hjärtsektioner färgade med troponin-T och AZP (vänster) och cellstorlekskvantifiering (höger) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) celler/grupp från 10 olika snitt från olika grisar, tvåsvansad Students t-test utfördes med 0; ****0p <1). b 用肌钙蛋白-T 和WGA（左）和细胞大小量化（右）染色的心脏切片的代表性（左）和细胞大小量化（右）染色的心脏切片的代表），来自不同猪的10 个不同切片的369（D6 MTNorm）细胞/组，两进行有鸎与季生有鸎季生比，****p < 0,0001）. b Representativa bilder av hjärtskivor färgade med calcarein-T och WGA (vänster) och cellstorlek (höger) (n = 330 (D6 MTOS), 369 från 10 olika skivor (D6 MTNorm)) Celler/组，两方法有埾学组，两方法有埾学缔；parivid test４0****ed med normal sträckning４p. 1). b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слева) и количественная (крашенных тропонином-Т и АЗП (слева) и количественная (крашенных тропонином-Т и АЗП (слева) n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) eller 10 räkenskapsperioder av разных свиней Клетки/группа, двустороСние критер,0p ****; сравнению с нормальным растяжением). b Representativa bilder av hjärtsektioner färgade med troponin-T och AZP (vänster) och kvantifiering av cellstorlek (höger) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) från 10 olika sektioner från olika grisar) Celler/grupp, tvåsidigt kriterium Elevens t;****p < 0,0001 jämfört med normal stam). c Representativa bilder för dag 0 och dag 6 MTOS-hjärtskivor immunmärkta för troponin-T och NFATC4 och kvantifiering av translokationen av NFATC4 till kärnorna av CM:er (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) skivor/grupp från olika grisar, tvåsvansad Student 0; 5-p test utförs 0; c Representativa bilder för dag 0 och dag 6 MTOS-hjärtskivor immunmärkta för troponin-T och NFATC4 och kvantifiering av translokationen av NFATC4 till kärnorna av CM:er (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) skivor/grupp från olika grisar , Tvåsvansad Student .0p- test utförs;0p-). c Репрезентативные изображения для срезов сердца 0 och 6 дней MTOS, иммуномеченых для тропонина-Т и NFATC4, och косней ции NFATC4 в ядра кавернозных клеток (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срезов/группу от разных свиней , выдуполняется та; *p < 0,05). c Representativa bilder för hjärtsektioner vid 0 och 6 dagars MTOS, immunmärkta för troponin-T och NFATC4, och kvantifiering av NFATC4-translokation i kärnan av kavernösa celler (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) skivor/grupp från olika grisar) utförde tvåsvansiga Student's;*p < 0,05). c 用于肌钙蛋白-T 和NFATC4 免疫标记的第0 天和第6 天MTOS 心脏切片的代主主性；媌的NFATC4 易位至CM 细胞核的量化（n = 4 (D0)、3 (D6 MTOS) 切片/组, 进行双尾学锟「t 棂锟「t .*0) c Representativa bilder av calcanin-T- och NFATC4-immunmärkning 第0天和第6天MTOS-hjärtskivor och NFATC4 från olika NFATC4 易位至CM-cellkärnans 的-kvantitet化 (n = 4 (D0), 缶 北鈻, 缇, 缌 , 缌 , 缌 , 缌 , 缌 , 缌 , 缌 , 缌尾学生et 电影；*p < 0,05). c Репрезентативные изображения срезов сердца MTOS på 0 och 6 dagar för иммуномаркировки тропонином-Т и NFATC4 och NFATC4 och ции NFATC4 в ядра CM от разных свиней (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срез/группа, два- хвостатый t-критерий Стьююд * Стьююд 0;5). c Representativa bilder av MTOS-hjärtskivor på dag 0 och 6 för troponin-T och NFATC4 immunmärkning och kvantifiering av NFATC4-translokation i kärnan av CM från olika grisar (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) skivor/grupp, tvåsvansad t -s;5p.Felstaplar representerar medelvärde ± standardavvikelse.
Translationell kardiovaskulär forskning kräver cellulära modeller som exakt återger hjärtmiljön.I denna studie utvecklades och karakteriserades en CTCM-enhet som kan stimulera ultratunna delar av hjärtat.CTCM-systemet inkluderar fysiologiskt synkroniserad elektromekanisk stimulering och T3- och Dex-vätskeanrikning.När grishjärtsektioner exponerades för dessa faktorer förblev deras livsduglighet, strukturella integritet, metaboliska aktivitet och transkriptionsuttryck desamma som i färsk hjärtvävnad efter 12 dagars odling.Dessutom kan överdriven sträckning av hjärtvävnaden orsaka hypertrofi av hjärtat orsakad av hyperextension.Sammantaget stöder dessa resultat den kritiska rollen av fysiologiska odlingsförhållanden för att upprätthålla en normal hjärtfenotyp och ger en plattform för läkemedelsscreening.
Många faktorer bidrar till att skapa en optimal miljö för kardiomyocyternas funktion och överlevnad.De mest uppenbara av dessa faktorer är relaterade till (1) intercellulära interaktioner, (2) elektromekanisk stimulering, (3) humorala faktorer och (4) metaboliska substrat.Fysiologiska cell-till-cell-interaktioner kräver komplexa tredimensionella nätverk av flera celltyper som stöds av en extracellulär matris.Sådana komplexa cellulära interaktioner är svåra att rekonstruera in vitro genom samodling av individuella celltyper, men kan enkelt uppnås med hjälp av hjärtsektionernas organotypiska natur.
Mekanisk sträckning och elektrisk stimulering av kardiomyocyter är avgörande för att bibehålla hjärtfenotyp33,34,35.Medan mekanisk stimulering har använts i stor utsträckning för hiPSC-CM-konditionering och mognad, har flera eleganta studier nyligen försökt mekanisk stimulering av hjärtskivor i kultur med enaxlig belastning.Dessa studier visar att 2D enaxlig mekanisk belastning har en positiv effekt på hjärtats fenotyp under odling.I dessa studier belastades sektioner av hjärtat antingen med isometriska dragkrafter17, linjär auxotonisk belastning18 eller så återskapades hjärtcykeln med hjälp av kraftomvandlarfeedback och spänningsdrifter.Dessa metoder använder emellertid enaxlig vävnadssträckning utan miljöoptimering, vilket resulterar i undertryckande av många hjärtgener eller överuttryck av gener associerade med onormala sträcksvar.CTCM som beskrivs här ger en 3D elektromekanisk stimulans som efterliknar den naturliga hjärtcykeln när det gäller cykeltid och fysiologisk sträckning (25 % stretch, 40 % systole, 60 % diastole och 72 slag per minut).Även om denna tredimensionella mekaniska stimulering ensam inte är tillräcklig för att bibehålla vävnadsintegritet, krävs en kombination av humoral och mekanisk stimulering med hjälp av T3/Dex för att adekvat bibehålla vävnadens viabilitet, funktion och integritet.
Humorala faktorer spelar en viktig roll för att modulera den vuxna hjärtfenotypen.Detta framhävdes i HiPS-CM-studier där T3 och Dex sattes till odlingsmedia för att påskynda cellmognaden.T3 kan påverka transporten av aminosyror, socker och kalcium över cellmembranen36.Dessutom främjar T3 MHC-α-uttryck och MHC-β-nedreglering, vilket främjar bildningen av myofibriller med snabba ryckningar i mogna kardiomyocyter jämfört med myofibriller med långsamma ryckningar i fetalt CM.T3-brist hos hypotyreospatienter resulterar i förlust av myofibrillära band och minskad tonusutveckling37.Dex verkar på glukokortikoidreceptorer och har visat sig öka myokardkontraktiliteten i isolerade perfuserade hjärtan;38 denna förbättring tros vara relaterad till effekten på kalciumavlagringsdrivet inträde (SOCE) 39,40.Dessutom binder Dex till sina receptorer, vilket orsakar ett brett intracellulärt svar som undertrycker immunfunktion och inflammation30.
Våra resultat indikerar att fysisk mekanisk stimulering (MS) förbättrade den totala kulturprestanda jämfört med Ctrl, men misslyckades med att upprätthålla livskraft, strukturell integritet och hjärtuttryck under 12 dagar i kultur.Jämfört med Ctrl förbättrade tillägg av T3 och Dex till CTCM (MT) kulturer livsduglighet och bibehöll liknande transkriptionsprofiler, strukturell integritet och metabolisk aktivitet med färsk hjärtvävnad i 12 dagar.Dessutom, genom att kontrollera graden av vävnadssträckning, skapades en hyperextension-inducerad hjärthypertrofimodell med användning av STCM, vilket illustrerar mångsidigheten hos STCM-systemet.Det bör noteras att även om hjärtremodellering och fibros vanligtvis involverar intakta organ vars cirkulerande celler kan tillhandahålla lämpliga cytokiner såväl som fagocytos och andra remodelleringsfaktorer, kan delar av hjärtat fortfarande efterlikna den fibrotiska processen som svar på stress och trauma.in i myofibroblaster.Detta har tidigare utvärderats i denna hjärtskivamodell.Det bör noteras att CTCM-parametrar kan moduleras genom att ändra tryck/elektrisk amplitud och frekvens för att simulera många tillstånd som takykardi, bradykardi och mekaniskt cirkulationsstöd (mekaniskt obelastat hjärta).Detta gör systemet till en medelstor genomströmning för drogtester.CTCM:s förmåga att modellera överansträngningsinducerad hjärthypertrofi banar vägen för att testa detta system för personlig terapi.Sammanfattningsvis visar den här studien att mekanisk sträckning och humoral stimulering är avgörande för att upprätthålla odlingen av hjärtvävnadssnitt.
Även om data som presenteras här tyder på att CTCM är en mycket lovande plattform för att modellera intakt myokard, har denna odlingsmetod vissa begränsningar.Den huvudsakliga begränsningen för CTCM-odling är att den utsätter fortlöpande dynamiska mekaniska påfrestningar på skivorna, vilket utesluter möjligheten att aktivt övervaka hjärtsnittssammandragningar under varje cykel.Dessutom, på grund av den lilla storleken på hjärtsektionerna (7 mm), är möjligheten att utvärdera systolisk funktion utanför odlingssystem med traditionella kraftsensorer begränsad.I det aktuella manuskriptet övervinner vi delvis denna begränsning genom att utvärdera optisk spänning som en indikator på kontraktil funktion.Denna begränsning kommer dock att kräva ytterligare arbete och kan komma att åtgärdas i framtiden genom att introducera metoder för optisk övervakning av funktionen hos hjärtskivor i kultur, såsom optisk kartläggning med användning av kalcium och spänningskänsliga färgämnen.En annan begränsning av CTCM är att arbetsmodellen inte manipulerar fysiologisk stress (preload och afterload).I CTCM inducerades tryck i motsatta riktningar för att reproducera 25 % fysiologisk sträckning i diastole (full stretch) och systole (sammandragningslängd under elektrisk stimulering) i mycket stora vävnader.Denna begränsning bör tas bort i framtida CTCM-designer genom adekvat tryck på hjärtvävnaden från båda sidor och genom att tillämpa de exakta tryck-volymförhållanden som uppstår i hjärtats kammare.
Den översträckningsinducerade ombyggnaden som rapporteras i detta manuskript är begränsad till att efterlikna hypertrofiska hyperstretch-signaler.Således kan denna modell hjälpa till vid studiet av stretchinducerad hypertrofisk signalering utan behov av humorala eller neurala faktorer (som inte finns i detta system).Ytterligare studier behövs för att öka mångfalden av CTCM, till exempel, samodling med immunceller, cirkulerande plasmahumorala faktorer och innervering vid samodling med neuronala celler kommer att förbättra möjligheterna till sjukdomsmodellering med CTCM.
Tretton grisar användes i denna studie.Alla djurförsök utfördes i enlighet med institutionella riktlinjer och godkändes av University of Louisville Institutional Animal Care and Use Committee.Aortabågen klämdes fast och hjärtat perfunderades med 1 L steril kardioplegi (110 mM NaCl, 1,2 mM CaCl2, 16 mM KCl, 16 mM MgCl2, 10 mM NaHCO3, 5 U/ml heparin, pH upp till 7,4); hjärtan bevarades i iskall kardioplegisk lösning tills de transporterades till labbet på is som vanligtvis är <10 min. hjärtan bevarades i iskall kardioplegisk lösning tills de transporterades till labbet på is som vanligtvis är <10 min. сердца хранили в ледяном кардиоплегическом растворе до транспортировки в лабораторию на льду, что обанично <10мно. hjärtan förvarades i iskall kardioplegisk lösning fram till transport till laboratoriet på is, vilket vanligtvis tar <10 min.将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10刂逛将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10刂逛 Держите сердца в ледяной кардиоплегии до транспортировки в лабораторию на льду, обычно <10 min. Håll hjärtan på is kardioplegi tills transport till laboratoriet på is, vanligtvis <10 min.
CTCM-enheten utvecklades i SolidWorks datorstödd design (CAD) programvara.Odlingskamrarna, avdelare och luftkammare är gjorda av CNC klar akrylplast.Backupringen med en diameter på 7 mm är gjord av högdensitetspolyeten (HDPE) i mitten och har ett o-ringsspår för att rymma O-ringen av silikon som används för att försegla media under.Ett tunt kiseldioxidmembran separerar odlingskammaren från separationsplattan.Silikonmembranet är laserskuret från 0,02 tum tjockt silikonark och har en hårdhet på 35A.De nedre och övre silikonpackningarna är laserskurna från 1/16 tum tjock silikonplåt och har en hårdhet på 50A.316L rostfria skruvar och vingmuttrar används för att fästa blocket och skapa en lufttät tätning.
Ett dedikerat kretskort (PCB) är designat för att integreras med C-PACE-EM-systemet.De schweiziska maskinkontakterna på kretskortet är anslutna till grafitelektroder med silverpläterade koppartrådar och brons 0-60 skruvar inskruvade i elektroderna.Det tryckta kretskortet placeras i locket på 3D-skrivaren.
CTCM-enheten styrs av ett programmerbart pneumatiskt ställdon (PPD) som skapar ett kontrollerat cirkulationstryck som liknar en hjärtcykel.När trycket inuti luftkammaren ökar, expanderar det flexibla silikonmembranet uppåt, vilket tvingar mediet under vävnadsplatsen.Vävnadsområdet kommer sedan att sträckas av denna utdrivning av vätska, vilket efterliknar den fysiologiska expansionen av hjärtat under diastole.Vid toppen av avslappningen applicerades elektrisk stimulering genom grafitelektroder, vilket minskade trycket i luftkammaren och orsakade sammandragning av vävnadssektioner.Inuti röret finns en hemostatisk ventil med en trycksensor för att detektera trycket i luftsystemet.Trycket som avkänns av trycksensorn appliceras på en datainsamlare som är ansluten till den bärbara datorn.Detta möjliggör kontinuerlig övervakning av trycket inuti gaskammaren.När det maximala kammartrycket nåddes (standard 80 mmHg, 140 mmHg OS), beordrades datainsamlingsenheten att skicka en signal till C-PACE-EM-systemet för att generera en bifasisk spänningssignal i 2 ms, inställd på 4 V.
Hjärtsektioner erhölls och odlingsbetingelser i 6 brunnar utfördes enligt följande: Överför de skördade hjärtan från överföringskärlet till en bricka innehållande kall (4°C) kardioplegi.Den vänstra ventrikeln isolerades med ett sterilt blad och skars i bitar om 1-2 cm3.Dessa vävnadsblock fästes på vävnadsstöd med vävnadslim och placerades i ett vibrerande mikrotomvävnadsbad innehållande Tyrodes lösning och syresattes kontinuerligt (3 g/L 2,3-butandionmonooxim (BDM), 140 mM NaCl (8,18 g) . ), 6 mM KCl (0,447 mM), (0,447 mM) (1,0 mM lucose D1000 g), (1 g/L 2,3 mM) 0,38 g), 1 mM MgCl2 (1 ml 1 M lösning), 1,8 mM CaCl2 (1,8 ml 1 M lösning), upp till 1 L ddH2O).Den vibrerande mikrotomen sattes att skära 300 µm tjocka skivor med en frekvens av 80 Hz, en horisontell vibrationsamplitud på 2 mm och en frammatningshastighet på 0,03 mm/s.Vävnadsbadet omgavs av is för att hålla lösningen sval och temperaturen hölls vid 4°C.Överför vävnadssektioner från mikrotombadet till ett inkubationsbad innehållande kontinuerligt syresatt Tyrode-lösning på is tills tillräckligt med sektioner erhålls för en odlingsplatta.För transwell-kulturer fästes vävnadssnitt på sterila 6 mm breda polyuretanstöd och placerades i 6 ml optimerat medium (199 medium, 1x ITS-tillskott, 10% FBS, 5 ng/ml VEGF, 10 ng/ml FGF-alkaliskt och 2X antibiotikum-antisvamp).Elektrisk stimulering (10 V, frekvens 1,2 Hz) applicerades på vävnadssektionerna genom C-Pace.För TD-förhållanden tillsattes färsk T3 och Dex vid 100 nM och 1 μM vid varje mediumbyte.Mediet är mättat med syre innan det ersätts 3 gånger om dagen.Vävnadssektioner odlades i en inkubator vid 37°C och 5% CO2.
För CTCM-kulturer placerades vävnadssnitt på en skräddarsydd 3D-skrivare i en petriskål innehållande modifierad Tyrodes lösning.Enheten är utformad för att öka storleken på hjärtats skiva med 25% av stödringens yta.Detta görs för att sektionerna av hjärtat inte ska sträcka sig efter att ha överförts från Tyrodes lösning till mediet och under diastole.Med användning av histoakryllim fixerades 300 µm tjocka sektioner på en stödring 7 mm i diameter.Efter att ha fäst vävnadssektionerna på stödringen, skär av de överflödiga vävnadssektionerna och placera de bifogade vävnadssektionerna tillbaka i badet med Tyrode-lösning på is (4°C) tills tillräckligt med sektioner har förberetts för en enhet.Den totala bearbetningstiden för alla enheter bör inte överstiga 2 timmar.Efter att 6 vävnadssektioner fästs vid deras stödringar, monterades CTCM-anordningen.CTCM-odlingskammaren är förfylld med 21 ml försyresatt medium.Överför vävnadssektionerna till odlingskammaren och ta försiktigt bort eventuella luftbubblor med en pipett.Vävnadssektionen styrs sedan in i hålet och trycks försiktigt på plats.Sätt slutligen på elektrodlocket på enheten och överför enheten till inkubatorn.Anslut sedan CTCM till luftslangen och C-PACE-EM-systemet.Det pneumatiska ställdonet öppnar och luftventilen öppnar CTCM.C-PACE-EM-systemet konfigurerades för att leverera 4 V vid 1,2 Hz under bifasisk stimulering i 2 ms.Mediet byttes två gånger om dagen och elektroderna byttes en gång om dagen för att undvika ansamling av grafit på elektroderna.Vid behov kan vävnadssektioner tas bort från deras odlingsbrunnar för att driva ut eventuella luftbubblor som kan ha fallit under dem.För MT-behandlingsförhållanden tillsattes T3/Dex färskt med varje mediumbyte med 100 nM T3 och 1 μM Dex.CTCM-anordningarna odlades i en inkubator vid 37°C och 5% CO2.
För att få utsträckta banor av hjärtskivor utvecklades ett speciellt kamerasystem.En SLR-kamera (Canon Rebel T7i, Canon, Tokyo, Japan) användes med ett Navitar Zoom 7000 18-108 mm makroobjektiv (Navitar, San Francisco, CA).Visualisering utfördes vid rumstemperatur efter att mediet ersatts med färskt medium.Kameran är placerad i en vinkel på 51° och video spelas in med 30 bilder per sekund.Först användes programvara med öppen källkod (MUSCLEMOTION43) med Image-J för att kvantifiera rörelsen hos hjärtskivor.Masken skapades med MATLAB (MathWorks, Natick, MA, USA) för att definiera områden av intresse för att slå hjärtskivor för att undvika brus.Manuellt segmenterade masker appliceras på alla bilder i en ramsekvens och skickas sedan till MUSCLEMOTION plug-in.Muscle Motion använder den genomsnittliga intensiteten av pixlarna i varje bildruta för att kvantifiera dess rörelse i förhållande till referensbilden.Data registrerades, filtrerades och användes för att kvantifiera cykeltiden och bedöma vävnadssträckning under hjärtcykeln.Den inspelade videon efterbehandlades med ett första ordningens nollfas digitalt filter.För att kvantifiera vävnadssträckning (topp-till-topp) utfördes topp-till-topp-analys för att skilja mellan toppar och dalar i den registrerade signalen.Dessutom utförs detrending med användning av ett polynom av 6:e ordningen för att eliminera signaldrift.Programkod utvecklades i MATLAB för att bestämma global vävnadsrörelse, cykeltid, avslappningstid och sammandragningstid (tilläggsprogramkod 44).
För töjningsanalys, med samma videor skapade för mekanisk sträckbedömning, spårade vi först två bilder som representerade rörelsetoppar (de högsta (övre) och lägsta (nedre) rörelsepunkterna) enligt MUSCLEMOTION-programvaran.Vi segmenterade sedan vävnadsregionerna och tillämpade en form av skuggalgoritm på den segmenterade vävnaden (kompletterande fig. 2a).Den segmenterade vävnaden delades sedan upp i tio underytor, och spänningen på varje yta beräknades med hjälp av följande ekvation: Strain = (Sup-Sdown)/Sdown, där Sup och Sdown är avstånden för formen från tygets övre respektive bottenskuggor (kompletterande bild .2b).
Hjärtsektioner fixerades i 4% paraformaldehyd under 48 timmar.Fixerade vävnader dehydrerades i 10% och 20% sackaros i 1 timme, sedan i 30% sackaros över natten.Sektionerna bäddades sedan in i blandning med optimal skärtemperatur (OCT-förening) och frystes gradvis i ett isopentan/torrisbad.Förvara OCT-inbäddningsblock vid -80 °C tills separation.Objektglas förbereddes som sektioner med en tjocklek på 8 μm.
För att ta bort OCT från hjärtsektioner, värm objektglasen på ett värmeblock vid 95 ° C i 5 min.Tillsätt 1 ml PBS till varje objektglas och inkubera i 30 minuter vid rumstemperatur, genomträng sedan sektionerna genom att sätta 0,1 % Triton-X i PBS i 15 minuter vid rumstemperatur.För att förhindra att ospecifika antikroppar binder till provet, tillsätt 1 ml 3 % BSA-lösning till objektglasen och inkubera i 1 timme vid rumstemperatur.BSA avlägsnades sedan och objektglasen tvättades med PBS.Markera varje prov med en penna.Primära antikroppar (utspädda 1:200 i 1 % BSA) (connexin 43 (Abcam; #AB11370), NFATC4 (Abcam; #AB99431) och troponin-T (Thermo Scientific; #MA5-12960) tillsattes under 90 minuter, sedan sekundärt i 1:00 mot influensa: BSA mot 1 eller 488 (Thermo Scientific; #A16079), mot kaninen Alexa Fluor 594 (Thermo Scientific; #T6391) i ytterligare 90 minuter Tvättad 3 gånger med PBS För att särskilja målfärgning från bakgrund använde vi endast den sekundära antikroppen som kontroll. Slutligen tillsattes DAPI i en nuclear-shield och en havsshield. med nagellack. -x förstoring) och Keyence-mikroskop med 40x förstoring.
WGA-Alexa Fluor 555 (Thermo Scientific; #W32464) vid 5 μg/ml i PBS användes för WGA-färgning och applicerades på fasta sektioner i 30 minuter vid rumstemperatur.Objektglasen tvättades sedan med PBS och Sudan black sattes till varje objektglas och inkuberades i 30 minuter.Objektglasen tvättades sedan med PBS och vectashield-inbäddningsmedium tillsattes.Objektglasen visualiserades på ett Keyence-mikroskop vid 40x förstoring.
OCT avlägsnades från proverna såsom beskrivits ovan.Efter att ha tagit bort OCT, doppa objektglasen i Bouins lösning över natten.Objektglasen sköljdes sedan med destillerat vatten under 1 timme och placerades sedan i en Bibrich-aloe-syrafuchsinlösning under 10 minuter.Därefter tvättades objektglasen med destillerat vatten och placerades i en lösning av 5 % fosfomolybden/5 % fosfovolframsyra under 10 minuter.Utan att skölja, överför objektglasen direkt till den blå anilinlösningen i 15 minuter.Därefter tvättades objektglasen med destillerat vatten och placerades i en 1% ättiksyralösning under 2 minuter.Objektglasen torkades i 200 N etanol och överfördes till xylen.Färgade objektglas visualiserades med användning av ett Keyence-mikroskop med ett 10x objektiv.Andelen fibrosarea kvantifierades med hjälp av programvaran Keyence Analyzer.
CyQUANT™ MTT Cell Viability Assay (Invitrogen, Carlsbad, CA), katalognummer V13154, enligt tillverkarens protokoll med vissa modifieringar.I synnerhet användes en kirurgisk stans med en diameter på 6 mm för att säkerställa enhetlig vävnadsstorlek under MTT-analys.Vävnader ströks individuellt ut i brunnarna på en 12-brunnars platta innehållande MTT-substrat enligt tillverkarens protokoll.Sektionerna inkuberas vid 37°C under 3 timmar och den levande vävnaden metaboliserar MTT-substratet för att bilda en lila formazanförening.Ersätt MTT-lösningen med 1 ml DMSO och inkubera vid 37 °C i 15 minuter för att extrahera lila formazan från hjärtsektioner.Prover späddes 1:10 i DMSO i 96-brunnars klara bottenplattor och lila färgintensitet mättes vid 570 nm med användning av en Cytation-plattläsare (BioTek).Avläsningarna normaliserades till vikten av varje del av hjärtat.
Hjärtskiva media ersattes med media innehållande 1 μCi/ml [5-3H]-glukos (Moravek Biochemicals, Brea, CA, USA) för analys av glukosanvändning som tidigare beskrivits.Efter 4 timmars inkubation, tillsätt 100 µl medium till ett öppet mikrocentrifugrör innehållande 100 µl 0,2 N HCl.Därefter placerades röret i ett scintillationsrör innehållande 500 μl dH2O för att indunsta [3H]2O i 72 timmar vid 37°C.Ta sedan bort mikrocentrifugröret från scintillationsröret och tillsätt 10 ml scintillationsvätska.Scintillationsräkningar utfördes med användning av en Tri-Carb 2900TR vätskescintillationsanalysator (Packard Bioscience Company, Meriden, CT, USA).Glukosutnyttjandet beräknades sedan med hänsyn till [5-3H]-glukosspecifik aktivitet, ofullständig jämvikt och bakgrund, utspädning av [5-3H]-till omärkt glukos och scintillationsräknarens effektivitet.Uppgifterna är normaliserade till massan av delar av hjärtat.
Efter vävnadshomogenisering i Trizol isolerades RNA från hjärtsektioner med hjälp av Qiagen miRNeasy Micro Kit #210874 enligt tillverkarens protokoll.Beredning, sekvensering och dataanalys av RNAsec-biblioteket utfördes enligt följande:
1 μg RNA per prov användes som utgångsmaterial för framställningen av RNA-biblioteket.Sekvenseringsbibliotek genererades med hjälp av NEBNext UltraTM RNA Library Preparation Kit för Illumina (NEB, USA) enligt tillverkarens rekommendationer, och indexkoder lades till attributsekvenserna för varje prov.Kortfattat renades mRNA från totalt RNA med användning av magnetiska pärlor fästa med poly-T-oligonukleotider.Fragmentering utförs med användning av tvåvärda katjoner vid hög temperatur i NEBNext First Strand Synthesis Reaction Buffer (5X).Den första strängens cDNA syntetiserades med användning av slumpmässiga hexamerprimrar och M-MuLV omvänt transkriptas (RNase H-).Den andra strängens cDNA syntetiseras sedan med användning av DNA-polymeras I och RNas H. De återstående överhängen omvandlas till trubbiga ändar genom exonukleas/polymerasaktivitet.Efter adenylering av 3′-änden av DNA-fragmentet fästs en NEBNext Adapter med en hårnålsöglestruktur för att förbereda den för hybridisering.För selektion av cDNA-fragment med föredragen längd 150-200 bp.biblioteksfragment renades med användning av AMPure XP-systemet (Beckman Coulter, Beverly, USA).Sedan användes 3 μl USER Enzyme (NEB, USA) med storleksvalt cDNA ligerat med en adapter i 15 minuter vid 37°C och sedan i 5 minuter vid 95°C före PCR.PCR utfördes sedan med användning av Phusion High-Fidelity DNA-polymeras, universella PCR-primrar och Index (X)-primrar.Slutligen renades PCR-produkter (AMPure XP-system) och bibliotekets kvalitet bedömdes på ett Agilent Bioanalyzer 2100-system.cDNA-biblioteket sekvenserades sedan med användning av en Novaseq-sekvenserare.Rå bildfiler från Illumina konverterades till råa läsningar med CASAVA Base Calling.Rådata lagras i FASTQ(fq)-formatfiler som innehåller lässekvenser och motsvarande baskvaliteter.Välj HISAT2 för att matcha filtrerade sekvensläsningar till Sscrofa11.1-referensgenomet.I allmänhet stöder HISAT2 genom av alla storlekar, inklusive genom som är större än 4 miljarder baser, och standardvärden är inställda för de flesta parametrar.Splitsning av läsningar från RNA Seq-data kan effektivt anpassas med HISAT2, det snabbaste systemet som finns tillgängligt för närvarande, med samma eller bättre noggrannhet än någon annan metod.
Överflödet av transkript återspeglar direkt nivån av genuttryck.Genuttrycksnivåer bedöms genom mängden transkript (sekvensering) associerade med genomet eller exonerna.Antalet läsningar är proportionellt mot genuttrycksnivåer, genlängd och sekvenseringsdjup.FPKM (fragment per tusen baspar av transkript sekvenserat per miljon baspar) beräknades och P-värden för differentiellt uttryck bestämdes med hjälp av DESeq2-paketet.Vi beräknade sedan den falska upptäcktsfrekvensen (FDR) för varje P-värde med Benjamini-Hochberg-metoden9 baserat på den inbyggda R-funktionen "p.adjust".
RNA isolerat från hjärtsektioner omvandlades till cDNA i en koncentration av 200 ng/μl med hjälp av SuperScript IV Vilo Master mix från Thermo (Thermo, kat.nr 11756050).Kvantitativ RT-PCR utfördes med användning av en Applied Biosystems Endura Plate Microamp 384-brunnars transparent reaktionsplatta (Thermo, kat. nr. 4483319) och mikroamp. optiskt lim (Thermo, kat. nr. 4311971).Reaktionsblandningen bestod av 5 µl Taqman Fast Advanced Master mix (Thermo, kat # 4444557), 0,5 µl Taqman Primer och 3,5 µl H2O blandat per brunn.Standard qPCR-cykler kördes och CT-värden mättes med ett Applied Biosystems Quantstudio 5 realtids-PCR-instrument (384-brunnars modul; produkt # A28135).Taqman-primrar köptes från Thermo (GAPDH (Ss03375629_u1), PARP12 (Ss06908795_m1), PKDCC (Ss06903874_m1), CYGB (Ss06900188_m1), RGL1 (Ss8906_08m6), 890608m1 (Ss89068m1) mH), GATA4 (Ss03383805_u1), GJA1 (Ss03374839_u1), COL1A2 (Ss03375009_u1), COL3A1 (Ss04323794_m1), ACTA2 (Ss04245588_m1) normaliserades till hushållsvärden av GDH, alla provvärdena av GDH:s gennormaliserade
Mediesläpp av NT-ProBNP utvärderades med hjälp av NT-ProBNP-kitet (gris) (kat. nr. MBS2086979, MyBioSource) enligt tillverkarens protokoll.Kortfattat tillsattes 250 ul av varje prov och standard i duplikat till varje brunn.Omedelbart efter tillsats av provet, tillsätt 50 µl analysreagens A till varje brunn.Skaka försiktigt plattan och förslut med tätningsmedel.Sedan inkuberades tabletterna vid 37°C under 1 timme.Aspirera sedan lösningen och tvätta brunnarna 4 gånger med 350 µl 1X tvättlösning, inkubera tvättlösningen i 1-2 minuter varje gång.Tillsätt sedan 100 µl analysreagens B per brunn och förslut med plattförsegling.Tabletten skakades försiktigt och inkuberades vid 37°C under 30 minuter.Aspirera lösningen och tvätta brunnarna 5 gånger med 350 µl 1X tvättlösning.Tillsätt 90 µl substratlösning till varje brunn och förslut plattan.Inkubera plattan vid 37°C i 10-20 minuter.Tillsätt 50 µl stopplösning till varje brunn.Plattan mättes omedelbart med en Cytation (BioTek) plattläsare inställd på 450 nm.
Effektanalyser utfördes för att välja gruppstorlekarna som ger >80 % effekt för att detektera en 10 % absolut förändring i parametern med en 5 % typ I-felfrekvens. Effektanalyser utfördes för att välja gruppstorlekarna som ger >80 % effekt för att detektera en 10 % absolut förändring i parametern med en 5 % typ I-felfrekvens. Анализ мощности был выполнен для выбора размеров групп, которые обеспечат >80% мощности för обнаружения 10% обеспечат тра с 5% частотой ошибок типа I. Effektanalys utfördes för att välja gruppstorlekar som skulle ge >80 % effekt för att detektera 10 % absolut parameterändring med en 5 % typ I-felfrekvens.MerMer Был проведен анализ мощности для выбора размера группы, который обеспечил бы > 80% мощности för обнаружения обнаружения параметров и 5% частоты ошибок типа I. En effektanalys utfördes för att välja en gruppstorlek som skulle ge >80 % effekt för att detektera 10 % absolut parameterändring och 5 % typ I-felfrekvens.Vävnadssektioner valdes slumpmässigt ut före experimentet.Alla analyser var tillståndsblinda och prover avkodades först efter att alla data hade analyserats.GraphPad Prism programvara (San Diego, CA) användes för att utföra alla statistiska analyser. För all statistik ansågs p-värdena signifikanta vid värden <0,05. För all statistik ansågs p-värdena vara signifikanta vid värden <0,05. Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. För all statistik ansågs p-värdena vara signifikanta vid värden <0,05.对于所有统计数据，p 值在值<0.05 时被认为是显着的。对于所有统计数据，p 值在值<0.05 时被认为是显着的。 Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. För all statistik ansågs p-värdena vara signifikanta vid värden <0,05.Tvåsidigt Students t-test utfördes på data med endast 2 jämförelser.Envägs eller tvåvägs ANOVA användes för att bestämma signifikans mellan flera grupper.När man utförde post hoc-tester användes Tukeys korrigering för att ta hänsyn till flera jämförelser.RNAsec-data har speciella statistiska överväganden vid beräkning av FDR och p.adjust enligt beskrivningen i avsnittet Metoder.
För mer information om studiedesign, se Nature Research Report abstract länkat till denna artikel.