Tack för att du besöker Nature.com. Webbläsarversionen du använder har begränsat CSS-stöd. För bästa möjliga upplevelse rekommenderar vi att du använder en uppdaterad webbläsare (eller inaktiverar kompatibilitetsläge i Internet Explorer). Under tiden, för att säkerställa fortsatt stöd, kommer vi att rendera webbplatsen utan stilar och JavaScript.
Det finns ett behov av ett tillförlitligt in vitro-system som korrekt kan reproducera hjärtats fysiologiska miljö för läkemedelstestning. Den begränsade tillgängligheten av system för mänsklig hjärtvävnadsodling har lett till felaktiga tolkningar av läkemedelseffekter på hjärtat. Här har vi utvecklat en hjärtvävnadsodlingsmodell (CTCM) som elektromekaniskt stimulerar hjärtskivor och genomgår fysiologisk sträckning under hjärtcykelns systoliska och diastoliska faser. Efter 12 dagars odling förbättrade denna metod delvis livskraften hos hjärtsektionerna, men bevarade inte helt deras strukturella integritet. Därför fann vi, efter screening av små molekyler, att tillsatsen av 100 nM trijodtyronin (T3) och 1 μM dexametason (Dex) till vårt medium bibehöll sektionernas mikrostruktur i 12 dagar. I kombination med T3/Dex-behandling bibehöll CTCM-systemet transkriptionsprofiler, livskraft, metabolisk aktivitet och strukturell integritet på samma nivå som färsk hjärtvävnad i 12 dagar. Dessutom inducerar överdriven sträckning av hjärtvävnad i kultur hypertrofisk hjärtsignalering, vilket ger bevis för CTCM:s förmåga att härma hypertrofiska tillstånd inducerade av hjärtsträckning. Sammanfattningsvis kan CTCM modellera hjärtats fysiologi och patofysiologi i kultur över långa tidsperioder, vilket möjliggör tillförlitlig läkemedelsscreening.
Innan klinisk forskning påbörjas behövs tillförlitliga in vitro-system som korrekt kan reproducera den fysiologiska miljön i det mänskliga hjärtat. Sådana system bör härma förändrad mekanisk stretch, hjärtfrekvens och elektrofysiologiska egenskaper. Djurmodeller används ofta som en screeningsplattform för hjärtfysiologi med begränsad tillförlitlighet när det gäller att återspegla läkemedels effekter i det mänskliga hjärtat1,2. I slutändan är den ideala hjärtvävnadsodlingsexperimentella modellen (CTCM) en modell som är mycket känslig och specifik för olika terapeutiska och farmakologiska interventioner, och korrekt reproducerar fysiologin och patofysiologin i det mänskliga hjärtat3. Avsaknaden av ett sådant system begränsar upptäckten av nya behandlingar för hjärtsvikt4,5 och har lett till läkemedels kardiotoxicitet som en viktig anledning till att lämna marknaden6.
Under det senaste decenniet har åtta icke-kardiovaskulära läkemedel dragits tillbaka från klinisk användning eftersom de orsakar QT-förlängning som leder till ventrikulära arytmier och plötslig död7. Det finns således ett ökande behov av tillförlitliga prekliniska screeningsstrategier för att bedöma kardiovaskulär effekt och toxicitet. Den senaste tidens användning av humaninducerade pluripotenta stamcells-deriverade kardiomyocyter (hiPS-CM) vid läkemedelsscreening och toxicitetstestning ger en delvis lösning på detta problem. Emellertid är den omogna naturen hos hiPS-CM och bristen på multicellulär komplexitet i hjärtvävnaden stora begränsningar med denna metod. Nyligen genomförda studier har visat att denna begränsning delvis kan övervinnas genom att använda tidig hiPS-CM för att bilda hjärtvävnadshydrogeler kort efter spontana kontraktioner och gradvis öka den elektriska stimuleringen över tid. Dessa hiPS-CM-mikrovävnader saknar dock de mogna elektrofysiologiska och kontraktila egenskaperna hos det vuxna myokardiet. Dessutom har mänsklig hjärtvävnad en mer komplex struktur, bestående av en heterogen blandning av olika celltyper, inklusive endotelceller, neuroner och stromala fibroblaster, sammankopplade av specifika uppsättningar extracellulära matrixproteiner. Denna heterogenitet av icke-kardiomyocytpopulationer11,12,13 i det vuxna däggdjurshjärtat är ett stort hinder för modellering av hjärtvävnad med hjälp av individuella celltyper. Dessa stora begränsningar betonar vikten av att utveckla metoder för att odla intakt hjärtmuskelvävnad under fysiologiska och patologiska förhållanden.
Odlade tunna (300 µm) snitt av det mänskliga hjärtat har visat sig vara en lovande modell av intakt mänskligt myokardium. Denna metod ger tillgång till ett komplett 3D-flercelligt system liknande mänsklig hjärtvävnad. Fram till 2019 var dock användningen av odlade hjärtsnitt begränsad av den korta (24 timmar) kulturöverlevnaden. Detta beror på ett antal faktorer, inklusive bristen på fysikalisk-mekanisk sträckning, luft-vätske-gränssnittet och användningen av enkla medier som inte stöder hjärtvävnadens behov. År 2019 visade flera forskargrupper att införlivande av mekaniska faktorer i hjärtvävnadsodlingssystem kan förlänga kulturens livslängd, förbättra hjärtuttrycket och härma hjärtpatologi. Två eleganta studier 17 och 18 visar att enaxlig mekanisk belastning har en positiv effekt på hjärtfenotypen under odling. Dessa studier använde dock inte den dynamiska tredimensionella fysikalisk-mekaniska belastningen av hjärtcykeln, eftersom hjärtsnitten belastades med antingen isometriska dragkrafter 17 eller linjär auxoton belastning 18. Dessa metoder för vävnadssträckning resulterade i undertryckandet av många hjärtgener eller överuttryck av gener associerade med onormala sträckningsresponser. Det är värt att notera att Pitoulis et al. 19 utvecklade ett dynamiskt hjärtskivsodlingsbad för rekonstruktion av hjärtcykeln med hjälp av krafttransduktoråterkoppling och spänningsdrivningar. Även om detta system möjliggör mer exakt in vitro-hjärtcykelmodellering, begränsar metodens komplexitet och låga genomströmning tillämpningen av detta system. Vårt laboratorium har nyligen utvecklat ett förenklat odlingssystem med elektrisk stimulering och ett optimerat medium för att bibehålla livskraften hos sektioner av hjärtvävnad från svin och människor i upp till 6 dagar 20,21.
I det aktuella manuskriptet beskriver vi en hjärtvävnadsodlingsmodell (CTCM) med hjälp av sektioner av grishjärtat som innehåller humorala signaler för att återskapa tredimensionell hjärtfysiologi och patofysiologisk utspändhet under hjärtcykeln. Denna CTCM kan öka noggrannheten i preklinisk läkemedelsprediktion till en nivå som aldrig tidigare uppnåtts genom att tillhandahålla ett kostnadseffektivt hjärtsystem med medelhög genomströmning som efterliknar fysiologin/patofysiologin hos däggdjurshjärtat för preklinisk läkemedelstestning.
Hemodynamiska mekaniska signaler spelar en avgörande roll för att upprätthålla kardiomyocytfunktionen in vitro 22,23,24. I det aktuella manuskriptet har vi utvecklat en CTCM (Figur 1a) som kan efterlikna den vuxna hjärtmiljön genom att inducera både elektrisk och mekanisk stimulering vid fysiologiska frekvenser (1,2 Hz, 72 slag per minut). För att undvika överdriven vävnadssträckning under diastole användes en 3D-utskriftsenhet för att öka vävnadsstorleken med 25 % (Fig. 1b). Elektrisk pacing inducerad av C-PACE-systemet tidsinställdes för att starta 100 ms före systole med hjälp av ett datainsamlingssystem för att fullständigt reproducera hjärtcykeln. Vävnadsodlingssystemet använder ett programmerbart pneumatiskt ställdon (LB Engineering, Tyskland) för att cykliskt expandera ett flexibelt silikonmembran för att orsaka expansion av hjärtskivorna i den övre kammaren. Systemet var anslutet till en extern luftledning via en tryckgivare, vilket gjorde det möjligt att exakt justera trycket (± 1 mmHg) och tiden (± 1 ms) (Fig. 1c).
a Fäst vävnadssektionen vid den 7 mm stora stödringen, som visas i blått, inuti enhetens odlingskammare. Odlingskammaren är separerad från luftkammaren med ett tunt, flexibelt silikonmembran. Placera en packning mellan varje kammare för att förhindra läckage. Enhetens lock innehåller grafitelektroder som ger elektrisk stimulering. b Schematisk representation av den stora vävnadsenheten, styrringen och stödringen. Vävnadssektionerna (bruna) placeras på den överdimensionerade enheten med styrringen placerad i spåret på enhetens ytterkant. Använd styrningen och placera försiktigt stödringen belagd med vävnadsakryllim över hjärtvävnadssektionen. c Diagram som visar tiden för elektrisk stimulering som en funktion av luftkammartrycket som styrs av ett programmerbart pneumatiskt ställdon (PPD). En datainsamlingsenhet användes för att synkronisera elektrisk stimulering med hjälp av trycksensorer. När trycket i odlingskammaren når det inställda tröskelvärdet skickas en pulssignal till C-PACE-EM för att utlösa elektrisk stimulering. d Bild av fyra CTCM placerade på en inkubatorhylla. Fyra enheter är anslutna till en PPD via en pneumatisk krets, och trycksensorer sätts in i hemostasventilen för att övervaka trycket i den pneumatiska kretsen. Varje anordning innehåller sex vävnadssektioner.
Med hjälp av ett enda pneumatiskt ställdon kunde vi styra fyra CTCM-enheter, som var och en kunde hålla sex vävnadssektioner (Fig. 1d). I CTCM omvandlas lufttrycket i luftkammaren till synkront tryck i vätskekammaren och inducerar fysiologisk expansion av hjärtskivan (Figur 2a och kompletterande film 1). Utvärdering av vävnadssträckning vid 80 mm Hg. Art. visade en sträckning av vävnadssektioner med 25 % (Fig. 2b). Denna procentuella sträckning har visat sig motsvara en fysiologisk sarkomerlängd på 2,2–2,3 µm för normal hjärtsektionens kontraktilitet17,19,25. Vävnadsrörelsen bedömdes med hjälp av anpassade kamerainställningar (Kompletterande figur 1). Amplituden och hastigheten för vävnadsrörelsen (Fig. 2c, d) motsvarade sträckningen under hjärtcykeln och tiden under systole och diastole (Fig. 2b). Sträckningen och hastigheten hos hjärtvävnaden under kontraktion och relaxation förblev konstanta i 12 dagar i kultur (Fig. 2f). För att utvärdera effekten av elektrisk stimulering på kontraktilitet under odling utvecklade vi en metod för att bestämma aktiv deformitet med hjälp av en skuggningsalgoritm (kompletterande figur 2a, b) och kunde skilja mellan deformiteter med och utan elektrisk stimulering. Samma del av hjärtat (figur 2f). I det rörliga området av snittet (R6-9) var spänningen under elektrisk stimulering 20 % högre än i frånvaro av elektrisk stimulering, vilket indikerar den elektriska stimuleringens bidrag till den kontraktila funktionen.
Representativa spår av luftkammartryck, vätskekammartryck och mätningar av vävnadsrörelser bekräftar att kammartrycket förändrar vätskekammartrycket, vilket orsakar en motsvarande rörelse av vävnadsskivan. b Representativa spår av procentuell sträckning (blå) av vävnadssektioner motsvarande procentuell sträckning (orange). c Den uppmätta rörelsen hos hjärtskivan överensstämmer med den uppmätta rörelsehastigheten. (d) Representativa banor för cyklisk rörelse (blå linje) och hastighet (orange streckad linje) i en hjärtskiva. e Kvantifiering av cykeltid (n = 19 skivor per grupp, från olika grisar), kontraktionstid (n = 19 skivor per grupp), relaxationstid (n = 19 skivor per grupp, från olika grisar), vävnadsrörelse (n = 25 skivor)/grupp från olika grisar), maximal systolisk hastighet (n = 24(D0), 25(D12) skivor/grupp från olika grisar) och maximal relaxationshastighet (n=24(D0), 25(D12) skivor/grupp från olika grisar). Tvåsidigt Student's t-test visade ingen signifikant skillnad i någon parameter. Representativa töjningsanalysspår av vävnadssnitt med (röd) och utan (blå) elektrisk stimulering, tio regionala områden av vävnadssnitt från samma snitt. De nedre panelerna visar kvantifieringen av den procentuella skillnaden i töjning i vävnadssnitt med och utan elektrisk stimulering i tio områden från olika snitt. (n = 8 skivor/grupp från olika grisar, tvåsidigt Student t-test utförs; ****p < 0,0001, **p < 0,01, *p < 0,05). (n = 8 skivor/grupp från olika grisar, tvåsidigt Student t-test utförs; ****p < 0,0001, **p < 0,01, *p < 0,05). (n = 8 срезов/группу от разных свиней, проводится двусторонний t-критерий Стьюдента; ****p<0,0001, ***p<0,01,01,5p<0,01,01. (n = 8 sektioner/grupp från olika grisar, tvåsidigt Student's t-test; ****p < 0,0001, **p < 0,01, *p < 0,05). （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p < 0,0001，**p < 0,01＀0,5） （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p < 0,0001，**p < 0,01＀0,5） (n = 8 срезов/группу, от разных свиней, двусторонний критерий Стьюдента; ****p <0,0001, **p <0,01, *p <0,05). (n = 8 sektioner/grupp, från olika grisar, tvåsidigt Student's t-test; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05).Felstaplar representerar medelvärdet ± standardavvikelsen.
I vårt tidigare statiska biomimetiska hjärtskivsodlingssystem [20, 21] bibehöll vi livskraften, funktionen och den strukturella integriteten hos hjärtskivorna i 6 dagar genom att applicera elektrisk stimulering och optimera mediets sammansättning. Efter 10 dagar sjönk dock dessa siffror kraftigt. Vi kommer att referera till snitt odlade i vårt tidigare statiska biomimetiska odlingssystem 20, 21 kontrollförhållanden (Ctrl) och vi kommer att använda vårt tidigare optimerade medium som MC-förhållanden och odling under samtidig mekanisk och elektrisk stimulering (CTCM). kallad . Först fastställde vi att mekanisk stimulering utan elektrisk stimulering var otillräcklig för att bibehålla vävnadens livskraft i 6 dagar (kompletterande figur 3a, b). Intressant nog, med införandet av fysiomekanisk och elektrisk stimulering med STCM, förblev livskraften hos 12-dagars hjärtsnitt densamma som i färska hjärtsnitt under MS-förhållanden, men inte under Ctrl-förhållanden, vilket visas av MTT-analys (Fig. 1). 3a). Detta tyder på att mekanisk stimulering och simulering av hjärtcykeln kan hålla vävnadssnitten livskraftiga dubbelt så länge som rapporterats i vårt tidigare statiska odlingssystem. Emellertid visade bedömning av vävnadssnittens strukturella integritet genom immunmärkning av hjärttroponin T och connexin 43 att connexin 43-uttryck var signifikant högre i MC-vävnader på dag 12 än i kontrollerna samma dag. Emellertid bibehölls inte enhetligt connexin 43-uttryck och Z-diskbildning helt och hållet (Fig. 3b). Vi använder ett ramverk för artificiell intelligens (AI) för att kvantifiera vävnadens strukturella integritet26, en bildbaserad djupinlärningspipeline baserad på troponin-T och connexinfärgning43 för att automatiskt kvantifiera den strukturella integriteten och fluorescensen hos hjärtskivor i termer av lokaliseringsstyrka. Denna metod använder ett faltningsneuralt nätverk (CNN) och ett djupinlärningsramverk för att tillförlitligt kvantifiera den strukturella integriteten hos hjärtvävnad på ett automatiserat och opartiskt sätt, såsom beskrivs i referensen.26. MC-vävnad visade förbättrad strukturell likhet till dag 0 jämfört med statiska kontrollsnitt. Dessutom avslöjade Massons trikromfärgning en signifikant lägre andel fibros under MS-förhållanden jämfört med kontrollförhållanden på dag 12 av odlingen (Fig. 3c). Medan CTCM ökade livskraften hos hjärtvävnadssektioner vid dag 12 till en nivå som liknar den för färsk hjärtvävnad, förbättrade det inte signifikant hjärtsektionernas strukturella integritet.
Ett stapeldiagram visar kvantifiering av MTT-viabiliteten hos färska hjärtskivor (D0) eller hjärtskivskultur under 12 dagar antingen i statisk kultur (D12 Ctrl) eller i CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) skivor/grupp från olika grisar, ett sätt ANOVA-test utförs; ####p < 0,0001 jämfört med D0 och **p < 0,01 jämfört med D12 Ctrl). Ett stapeldiagram visar kvantifiering av MTT-viabiliteten hos färska hjärtskivor (D0) eller hjärtskivskultur under 12 dagar antingen i statisk kultur (D12 Ctrl) eller i CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) skivor/grupp från olika grisar, ett sätt ANOVA-test utförs; ####p < 0,0001 jämfört med D0 och **p < 0,01 jämfört med D12 Ctrl).Histogrammet visar kvantifieringen av viabiliteten hos färska MTT-hjärtsektioner (D0) eller odling av hjärtsektioner i 12 dagar i antingen statisk odling (D12-kontroll) eller CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12-kontroll). ) ), 12 (D12 MC) sektioner/grupp från olika grisar, ett envägs ANOVA-test utförs;####p < 0,0001 по сравнению с D0 и **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p < 0,0001 jämfört med D0 och **p < 0,01 jämfört med D12 Ctrl). a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切片(D0)或心脏切片培养12 天的MTT 活力的量化)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/绐十AN，进茅测试；与D0 相比，####p < 0,0001，与D12 Ctrl 相比，**p < 0,01). a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切片(D0) ，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；与D0 相比，##与D，#与D， Ctrl1D， Ctrl1D相比，**p.)histogram som visar kvantifieringen av MTT-viabilitet i färska hjärtsektioner (D0) eller hjärtsektioner odlade i 12 dagar i statisk kultur (D12-kontroll) eller CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12-kontroll)), 12 (D12 MC) sektioner/grupp från olika grisar, envägs ANOVA-test;####p < 0,0001 по сравнению с D0, **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p < 0,0001 jämfört med D0, **p < 0,01 jämfört med D12 Ctrl).b Troponin-T (grönt), connexin 43 (rött) och DAPI (blått) i nyligen isolerade hjärtsektioner (D0) eller hjärtsektioner odlade under statiska förhållanden (Ctrl) eller CTCM-förhållanden (MC) i 12 dagar) av representativa immunofluorescensbilder (blankskala = 100 µm). Kvantifiering av hjärtvävnadens strukturella integritet med hjälp av artificiell intelligens (n ​​= 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) skivor/grupp från olika grisar, envägs ANOVA-test utförs; ####p < 0,0001 jämfört med D0 och ****p < 0,0001 jämfört med D12 Ctrl). Kvantifiering av hjärtvävnadens strukturella integritet med hjälp av artificiell intelligens (n ​​= 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) skivor/grupp från olika grisar, envägs ANOVA-test utförs; ####p < 0,0001 jämfört med D0 och ****p < 0,0001 jämfört med D12 Ctrl). Количественная оценка структурной целостности сердечной ткани искусственным интеллектом (n = 7 (D0), 7 (D12 с12) från разных свиней, проводится однофакторный тест ANOVA; Kvantifiering av hjärtvävnadens strukturella integritet med artificiell intelligens (n ​​= 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) sektioner/grupper från olika grisar, envägs ANOVA-test utfört; ####p < 0,0001 vs. med D0 och ****p < 0,0001 jämfört med D12 Ctrl).人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) skivor/gruppera var och en av olika grisar, envägs ANOV-test .##0 .#0VA <1;##相比，****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）.人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) skivor/gruppera var och en av olika grisar, enkelriktad ANOVA-test <0##0p;与D0相比，****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）. Искусственный интеллект для количественной оценки структурной целостности сердечной ткани (n = 7 (D0), 7 (D512 Ctrl), 7 (D512 Ctrl), MC срезов/группу каждой из разных свиней, односторонний тест ANOVA ####p <0,0001 vs. Ctrl). Artificiell intelligens för att kvantifiera hjärtvävnadens strukturella integritet (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) sektioner/grupp vardera av olika grisar, envägs ANOVA-test; ####p<0,0001 vs .D0 För jämförelse ****p < 0,0001 jämfört med D12 Ctrl). c Representativa bilder (vänster) och kvantifiering (höger) för hjärtskivor färgade med Massons trikromfärgning (Scale bare = 500 µm) (n = 10 skivor/grupp vardera från olika grisar, envägs ANOVA-test utförs; ####p < 0,0001 jämfört med D0 och ***p < 0,001 jämfört med D12 Ctrl). c Representativa bilder (vänster) och kvantifiering (höger) för hjärtskivor färgade med Massons trikromfärgning (Scale bare = 500 µm) (n = 10 skivor/grupp vardera från olika grisar, envägs ANOVA-test utförs; #### p < 0,0001 jämfört med D0 och ***p < 0,001 jämfört med D12 Ctrl). c Репрезентативные изображения (слева) och количественная оценка (справа) срезов сердца, окрашенных трихмных (масштаб без покрытия = 500 мкм) (n = 10 срезов/группу от разных свиней, выполняется односторон мкм) сравнению с D0 и ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Representativa bilder (vänster) och kvantifiering (höger) av hjärtsektioner färgade med Massons trikromfärg (obelagd skala = 500 µm) (n = 10 sektioner/grupp från olika grisar, envägs ANOVA-test utfört; #### p < 0,0001 jämfört med D0 och ***p < 0,001 jämfört med D12 Ctrl). c 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像（左）和量化（右）（裸=尺0）（裸=尺0）（裸=尺0）（裸=尺0） 10 个切片/组，每组来自不同的猪，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0,0001 与D0 缎***01D <0．***02D Ctrl 相比）. C 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 （左 左） 量化 （右） 裸壸庣 帺壸庣裸尺度 = 500 µm） （n = 10 个 切片 组 每 组 来自 不同 猪 ， 进行 单向 单ﵛ 单 向 A# nova 0,0001 与D0 相比，***p < 0,001 与D12 Ctrl 相比）. c Репрезентативные изображения (слева) och количественный анализ (справа) срезов сердца, окрашенных трихмный (чистая шкала = 500 мкм) (n = 10 срезов/группа, каждый от другой свиньи, протестировано с помощогруппа дисперсионного анализа ;### #p < 0,0001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Representativa bilder (vänster) och kvantifiering (höger) av hjärtsektioner färgade med Massons trikromfärgning (blank = 500 µm) (n = 10 sektioner/grupp, var och en från en annan gris, testade med envägsvariansanalys; ### # p < 0,0001 jämfört med D0, ***p < 0,001 jämfört med D12 Ctrl).Felstaplar representerar medelvärdet ± standardavvikelsen.
Vi antog att genom att tillsätta små molekyler till odlingsmediet kunde kardiomyocyternas integritet förbättras och fibrosutvecklingen minskas under CTCM-odling. Vi screenade därför för små molekyler med våra statiska kontrollkulturer20,21 på grund av det lilla antalet störfaktorer. Dexametason (Dex), trijodtyronin (T3) och SB431542 (SB) valdes för denna screening. Dessa små molekyler har tidigare använts i hiPSC-CM-kulturer för att inducera mognad av kardiomyocyter genom att öka sarkomerlängd, T-tubuli och ledningshastighet. Dessutom är både Dex (en glukokortikoid) och SB kända för att undertrycka inflammation29,30. Därför testade vi om införandet av en eller en kombination av dessa små molekyler skulle förbättra den strukturella integriteten hos hjärtsektioner. För initial screening valdes dosen av varje förening baserat på de koncentrationer som vanligtvis används i cellodlingsmodeller (1 μM Dex27, 100 nM T327 och 2,5 μM SB31). Efter 12 dagars odling resulterade kombinationen av T3 och Dex i optimal strukturell integritet hos kardiomyocyterna och minimal fibrös ombyggnad (kompletterande figurer 4 och 5). Dessutom producerade användning av dubbla eller dubbla dessa koncentrationer av T3 och Dex skadliga effekter jämfört med normala koncentrationer (kompletterande figurer 6a, b).
Efter den initiala screeningen utförde vi en direkt jämförelse av fyra odlingsförhållanden (Figur 4a): Ctrl: hjärtsektioner odlade i vår tidigare beskrivna statiska kultur med vårt optimerade medium; 20.21 TD: T3 och Ctrl tillsatte Dex på onsdagen; MC: hjärtsektioner odlade i CTCM med vårt tidigare optimerade medium; och MT: CTCM med T3 och Dex tillsatt till mediet. Efter 12 dagars odling förblev viabiliteten hos MS- och MT-vävnader densamma som i färska vävnader bedömda med MTT-analys (Fig. 4b). Intressant nog resulterade tillsatsen av T3 och Dex till transwell-kulturer (TD) inte i en signifikant förbättring av viabiliteten jämfört med Ctrl-förhållanden, vilket indikerar en viktig roll för mekanisk stimulering för att upprätthålla viabiliteten hos hjärtsektionerna.
Ett experimentellt designdiagram som visar de fyra odlingsbetingelser som användes för att utvärdera effekterna av mekanisk stimulering och T3/Dex-tillskott på medium i 12 dagar. b Stapeldiagrammet visar kvantifiering av viabilitet 12 dagar efter odling under alla fyra odlingsförhållanden (Ctrl, TD, MC och MT) jämfört med färska hjärtskivor (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD och D12 MT), 12 (D12 MC) skivor/grupp från olika grisar, envägs ANOVA-test utförs; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 jämfört med D0 och **p < 0,01 jämfört med D12 Ctrl). b Stapeldiagrammet visar kvantifiering av viabilitet 12 dagar efter odling under alla fyra odlingsförhållanden (Ctrl, TD, MC och MT) jämfört med färska hjärtskivor (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD och D12 MT), 12 (D12 MC) skivor/grupp från olika grisar, envägs ANOVA-test utförs; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 jämfört med D0 och **p < 0,01 jämfört med D12 ctrl). b Гистограмма показывает количественную оценку жизнеспособности через 12 дней после культивирования вох культивирования (контроль, TD, MC och MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 TD), MC (D12 TD), och D12 TD, D12 TD, D12 срезов/группу от разных свиней, проводится односторонний тест ANOVA ####p < 0,0001, ###p < 0,001 по сравни; с D0 и **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). b Stapeldiagrammet visar kvantifieringen av viabiliteten 12 dagar efter odling under alla fyra odlingsförhållanden (kontroll, TD, MC och MT) jämfört med färska hjärtsektioner (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD och D12 MT), 12 (D12 MC) sektioner/grupp från olika grisar, envägs ANOVA-test; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 vs. D0 och **p < 0,01 jämfört med D12 Ctrl). b.和D12 MT)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；####p < 0.0001， 0##p < 0.0#1， 0##相比，**p < 0,01 与D12控制）.b 4 12 (D12 MC) b Гистограмма, показывающая все 4 условия культивирования (контроль, TD, MC och MT) по сравнению со свежезими (0n) = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD och D12 MT), от разных свиней 12 (D12 MC) срезы/группа, односторонний тест ANOVA <0 ##00по1, ##00#0p; сравнению с D0, **p <0,01 по сравнению с контролем D12). b Histogram som visar alla 4 odlingsbetingelser (kontroll, TD, MC och MT) jämfört med färska hjärtsnitt (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD och D12 MT), från olika grisar 12 (D12 MC) snitt/grupp, envägs ANOVA-test; ####p<0,0001, ###p<0,001 vs. D0, **p<0,01 vs. kontroll D12). c Stapeldiagrammet visar kvantifieringen av glukosflöde 12 dagar efter odling under alla fyra odlingsförhållanden (Ctrl, TD, MC och MT) jämfört med färska hjärtskivor (D0) (n = 6 skivor/grupp från olika grisar, envägs ANOVA-test utförs; ###p < 0,001, jämfört med D0 och ***p < 0,001 jämfört med D12 Ctrl). c Stapeldiagrammet visar kvantifieringen av glukosflöde 12 dagar efter odling under alla fyra odlingsförhållanden (Ctrl, TD, MC och MT) jämfört med färska hjärtskivor (D0) (n = 6 skivor/grupp från olika grisar, envägs ANOVA-test utförs; ###p < 0,001, jämfört med D0 och ***p < 0,001 jämfört med D12 Ctrl). c Гистограмма показывает количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после культивирования во 4висованис культивирования (контроль, TD, MC och MT) för сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 6 срезов/группихот, односторонний Выполняется тест ANOVA; ###p < 0,001 по сравнению с D0 и ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Histogrammet visar kvantifiering av glukosflöde 12 dagar efter odling under alla fyra odlingsförhållanden (kontroll, TD, MC och MT) jämfört med färska hjärtsnitt (D0) (n = 6 snitt/grupp från olika grisar, envägs ANOVA-test utfört; ###p < 0,001 jämfört med D0 och ***p < 0,001 jämfört med D12 Ctrl). c 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) 相毹养吐养吐天的葡萄糖通量定量（n = 6 片/组，来自不同猪，单向执行ANOVA 测试；#0，D < 0.相比，***p < 0,001 与D12 Ctrl 相比）. C 条形图 显示 所有 4 种 条件 （（ctrl 、 td 、 mc 和 mt） 新鲜 心脏 切缌 切 片 切 片 切 片 切培养 后 后 12 天 的 通量 定量 （n = 6 片/组 ， 来自 猪 ， ， ， ， ， ， ， ，猪单向执行ANOVA 测试；###p < 0,001，与D0 相比，***p < 0,001 与D12 Ctrl 相比）. c Гистограмма, показывающая количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после культивирования культивирования (контроль, TD, MC och MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 6 срезов/групрапа, срезов, хрезовирования односторонний Были проведены тесты ANOVA; ###p < 0,001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению с D12 (контроль). c Histogram som visar kvantifiering av glukosflöde 12 dagar efter odling för alla 4 odlingsbetingelser (kontroll, TD, MC och MT) jämfört med färska hjärtsnitt (D0) (n = 6 snitt/grupp, från olika grisar, unilaterala där ANOVA-test utfördes, ###p < 0,001 jämfört med D0, ***p < 0,001 jämfört med D12 (kontroll).d Töjningsanalysdiagram av färska (blå), dag 12 MC (grön) och dag 12 MT (röd) vävnader vid tio regionala vävnadssnittspunkter (n = 4 skivor/grupp, envägs ANOVA-test; det fanns ingen signifikant skillnad mellan grupperna). e Vulkandiagram som visar differentiellt uttryckta gener i färska hjärtsnitt (D0) jämfört med hjärtsnitt odlade under statiska förhållanden (Ctrl) eller under MT-förhållanden (MT) i 10–12 dagar. f Värmekarta över sarkomergener för hjärtsnitt odlade under var och en av odlingsförhållandena. Felstaplar representerar medelvärdet ± standardavvikelsen.
Metaboliskt beroende av övergången från fettsyraoxidation till glykolys är ett kännetecken för kardiomyocytdedifferentiering. Omogna kardiomyocyter använder primärt glukos för ATP-produktion och har hypoplastiska mitokondrier med få cristae5,32. Analyser av glukosutnyttjande visade att glukosutnyttjandet under MC- och MT-förhållanden var likt det i dag 0-vävnader (Figur 4c). Ctrl-prover visade dock en signifikant ökning av glukosutnyttjande jämfört med färsk vävnad. Detta indikerar att kombinationen av CTCM och T3/Dex förbättrar vävnadens viabilitet och bevarar den metaboliska fenotypen hos 12-dagars odlade hjärtsnitt. Dessutom visade töjningsanalys att töjningsnivåerna förblev desamma som i färsk hjärtvävnad i 12 dagar under MT- och MS-förhållanden (Fig. 4d).
För att analysera den övergripande effekten av CTCM och T3/Dex på det globala transkriptionella landskapet av hjärtvävnad utförde vi RNAseq på hjärtvävnader från alla fyra olika odlingsbetingelser (kompletterande data 1). Intressant nog visade MT-sektioner hög transkriptionell likhet med färsk hjärtvävnad, med endast 16 differentiellt uttryckta av 13 642 gener. Men som vi visade tidigare uppvisade Ctrl-sektioner 1229 differentiellt uttryckta gener efter 10–12 dagar i odling (Fig. 4e). Dessa data bekräftades med qRT-PCR av hjärt- och fibroblastgener (kompletterande figur 7a-c). Intressant nog visade Ctrl-sektionerna nedreglering av hjärt- och cellcykelgener och aktivering av inflammatoriska genprogram. Dessa data tyder på att dedifferentiering, som normalt sker efter långvarig odling, är helt försvagad under MT-förhållanden (kompletterande figur 8a, b). Noggranna studier av sarkomergener visade att endast under MT-förhållanden bevaras generna som kodar för sarkomeren (fig. 4f) och jonkanalen (kompletterande fig. 9), vilket skyddar dem från undertryckning under Ctrl-, TD- och MC-förhållanden. Dessa data visar att med en kombination av mekanisk och humoral stimulering (T3/Dex) kan hjärtskivans transkriptom förbli likt färska hjärtskivor efter 12 dagar i kultur.
Dessa transkriptionsfynd stöds av det faktum att kardiomyocyternas strukturella integritet i hjärtsektioner bäst bevaras under MT-förhållanden i 12 dagar, vilket visas av intakt och lokaliserat connexin 43 (Fig. 5a). Dessutom minskade fibrosen i hjärtsektioner under MT-förhållanden signifikant jämfört med Ctrl och liknade färska hjärtsektioner (Fig. 5b). Dessa data visar att kombinationen av mekanisk stimulering och T3/Dex-behandling effektivt bevarar hjärtstrukturen i hjärtsektioner i kultur.
Representativa immunofluorescensbilder av troponin-T (grönt), connexin 43 (rött) och DAPI (blått) i nyligen isolerade hjärtsektioner (D0) eller odlade i 12 dagar under alla fyra odlingsbetingelser för hjärtsektioner (skalstapel = 100 µm). Kvantifiering av hjärtvävnadens strukturella integritet med hjälp av artificiell intelligens (n ​​= 7 (D0 och D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC och D12 MT) skivor/grupp från olika grisar, envägs ANOVA-test utförs; ####p < 0,0001 jämfört med D0 och *p < 0,05, eller ****p < 0,0001 jämfört med D12 Ctrl). Kvantifiering av hjärtvävnadens strukturella integritet med hjälp av artificiell intelligens (n ​​= 7 (D0 och D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC och D12 MT) skivor/grupp från olika grisar, envägs ANOVA-test utförs; #### p < 0,0001 jämfört med D0 och *p < 0,05, eller ****p < 0,0001 jämfört med D12 Ctrl). Количественная оценка структурной целостности ткани сердца с помощью искусственного интеллекта (n = 7 (D12 Ctrl), (D12 Ctrl) MC och D12 MT) срезов/группу от разных свиней, проведен однофакторный тест ANOVA #### p < 0,0001 по сравнению 0,0001 по сравнению <****d0p 0,0 p. 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). Kvantifiering av hjärtvävnadens strukturella integritet med hjälp av artificiell intelligens (n ​​= 7 (D0 och D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC och D12 MT) sektioner/grupp från olika grisar, envägs ANOVA-test utfört; #### p < 0,0001 jämfört med D0 och *p < 0,05 eller ****p < 0,0001 jämfört med D12 Ctrl).对不同猪的心脏组织结构完整性（n = 7（D0 和D12 Ctrl）、5（D12 TD、D12 MC 和D12 MT）切片/组）进行人工智能量化，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0.0001 与D0 帒*p <0.0*p <0.0*p <0.0*p <0.0*p <0. 0,0001 与D12 Ctrl 相比）。对 不同 猪 的 心脏 结构 完整性 （n = 7 （d0 和 d12 ctrl） （5 （d12 td 、 t ， ， d12 mc 廒人工 智能量 化 进行 单向 单向 单向 测试 ； ########## p < 0,0001 与D0 和*p < 0,05****p < 0,05 0,0001 与D12 Ctrl 相比).Kvantifiering av hjärtvävnadens strukturella integritet med hjälp av artificiell intelligens hos olika grisar (n = 7 (D0 och D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC och D12 MT) sektioner/grupp) med ett envägs ANOVA-test;#### p < 0,0001 по сравнению с D0 и *p < 0,05 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). #### p < 0,0001 jämfört med D0 och *p < 0,05 eller ****p < 0,0001 jämfört med D12 Ctrl). b Representativa bilder och kvantifiering för hjärtskivor färgade med Massons trikromfärgning (skalstapel = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD och D12 MC), 9 (D12 MT) skivor/grupp från olika grisar, envägs ANOVA-test utförs; ####p < 0,0001 jämfört med D0 och ***p < 0,001, eller ****p < 0,0001 jämfört med D12 Ctrl). b Representativa bilder och kvantifiering för hjärtskivor färgade med Massons trikromfärgning (skalstapel = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD och D12 MC), 9 (D12 MT) skivor/grupp från olika grisar, envägs ANOVA-test utförs; ####p < 0,0001 jämfört med D0 och ***p < 0,001, eller ****p < 0,0001 jämfört med D12 Ctrl). b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромным красимасная ( линейка = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD och D12 MC), 9 (D12 MT) срезов/группу от разных свиней, ведонсолня ANOVA; ####p < 0,0001 по сравнению с D0 и ***p < 0,001 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). b Representativa bilder och kvantifiering av hjärtsektioner färgade med Massons trikromfärgning (skalstapel = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD och D12 MC), 9 (D12 MT) sektioner/grupp från olika grisar, utförda envägs-ANOVA; ####p < 0,0001 vs. D0 och ***p < 0,001 eller ****p < 0,0001 vs. D12 Ctrl). b 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像和量化（比例尺= 500 µm = 01！D = 010n Ctrl、D12 TD 和D12 MC），来自不同猪的9 个（D12 MT）切片/组，进行单因素方垕因素方垐＆ 0#0分#0与D0 相比，***p < 0,001，或****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）。 b 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 和 量化 （比例 尺 尺 尺 = 500 µn = 0（n 、 d12 ctrl 、 d12 td 和 d12 mc） 来自 不同 的 9 个 d12 mt 切片 切片 切片 切片 切片 切片切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片/组，进行单因素方差分析； 1.0##D <.0##D相比，***p < 0,001，或****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）. b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромом Маснашалия (маснашят) мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD och D12 MC), 9 (D12 MT) срезов от разных свиней / группы, один-способ ANOVA; #0пос000 с D0, ***p < 0,001 eller ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). b Representativa bilder och kvantifiering av hjärtsektioner färgade med Massons trikrom (skalstapel = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD och D12 MC), 9 (D12 MT) sektioner från olika grisar/grupp, en ANOVA-metod; ####p < 0,0001 jämfört med D0, ***p < 0,001 eller ****p < 0,0001 jämfört med D12 Ctrl).Felstaplar representerar medelvärdet ± standardavvikelsen.
Slutligen utvärderades CTCM:s förmåga att imitera hjärthypertrofi genom att öka hjärtvävnadens sträckning. I CTCM ökade det maximala luftkammartrycket från 80 mmHg till 80 mmHg Art. (normal sträckning) upp till 140 mmHg Art. (Fig. 6a). Detta motsvarar en ökning med 32 % i sträckning (Fig. 6b), vilket tidigare visats som motsvarande procentuella sträckning som krävs för hjärtsektioner för att uppnå en sarkomerlängd liknande den som ses vid hypertrofi. Sträckning och hastighet hos hjärtvävnaden under kontraktion och relaxation förblev konstant under sex dagars odling (Fig. 6c). Hjärtvävnad från MT-förhållanden utsattes för normal sträckning (MT (Normal)) eller översträckningsförhållanden (MT (OS)) i sex dagar. Redan efter fyra dagar i odling var den hypertrofiska biomarkören NT-ProBNP signifikant förhöjd i mediet under MT (OS)-förhållanden jämfört med MT (normala) förhållanden (Fig. 7a). Dessutom ökade cellstorleken i MT (OS) (Fig. 7b) signifikant efter sex dagars odling jämfört med sektioner av MT-hjärta (normalt). Dessutom ökade NFATC4-kärntranslokationen signifikant i översträckta vävnader (Fig. 7c). Dessa resultat visar den progressiva utvecklingen av patologisk ombyggnad efter hyperdistension och stöder konceptet att CTCM-enheten kan användas som en plattform för att studera stretchinducerad hjärthypertrofisignalering.
Representativa spår av mätningar av luftkammartryck, vätskekammartryck och vävnadsrörelse bekräftar att kammartrycket förändrar vätskekammartrycket, vilket orsakar en motsvarande rörelse av vävnadsskivan. b Representativa kurvor för sträckningsprocent och sträckningshastighet för normalt sträckta (orange) och översträckta (blå) vävnadssnitt. c Stapeldiagram som visar cykeltid (n = 19 skivor per grupp, från olika grisar), kontraktionstid (n = 18–19 skivor per grupp, från olika grisar), relaxationstid (n = 19 skivor per grupp, från olika grisar)), amplitud för vävnadsrörelse (n = 14 skivor/grupp, från olika grisar), maximal systolisk hastighet (n = 14 skivor/grupp, från olika grisar) och maximal relaxationshastighet (n = 14 (D0), 15 (D6)) snitt/grupper) från olika grisar), tvåsidigt Student's t-test visade ingen signifikant skillnad i någon parameter, vilket indikerar att dessa parametrar förblev konstanta under 6 dagars odling med överspänning. Felstaplar representerar medelvärdet ± standardavvikelsen.
En stapeldiagramskvantifiering av NT-ProBNP-koncentration i odlingsmedium från hjärtskivor odlade under MT normala sträcknings- (Norm) eller översträcknings- (OS) förhållanden (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm och D4 MTOS) skivor/grupp från olika grisar. Tvåvägs ANOVA utförs; **p < 0,01 jämfört med normal sträckning). En stapeldiagramskvantifiering av NT-ProBNP-koncentration i odlingsmedium från hjärtskivor odlade under MT normala sträcknings- (Norm) eller översträcknings- (OS) förhållanden (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm och D4 MTOS) skivor/grupp från olika grisar. Tvåvägs ANOVA utförs; **p < 0,01 jämfört med normal sträckning).Kvantitativt histogram av NT-ProBNP-koncentration i odlingsmedium från hjärtskivor odlade under förhållanden med normal MT-sträckning (norm) eller översträckning (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm och D4).MTOS) skivor/grupp från olika grisar, tvåfaktorvariansanalys utförs;**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p < 0,01 jämfört med normal stretch). a 在MT 正常拉伸(Norm) 或过度拉伸(OS) 条件下培养的心脏切片培养基中NT-ProBNP浓度的条形图量化（n = 4 (D2 MTNorm)、3（D2 MTOS、D4 MTNorm 和D4 MTOS）来自不同猪的切片/组，进行双向方差分析；**与正常拉伸相比，p < 0,01）. a Kvantifiering av NT-ProBNP-koncentration i hjärtskivor odlade under MT normal stretch (Norm) eller översträckning (OS) förhållanden (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm和D4 MTOS) från olika猪的切片/组，可以双向方方发发动;**jämfört med normal stretching, p < 0,01).histogram Kvantifiering av NT-ProBNP-koncentrationer i hjärtskivor odlade under förhållanden med normal MT-sträckning (norm) eller översträckning (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm) och D4 MTOS) skivor/grupp från olika grisar, tvåvägsvariansanalys;**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p < 0,01 jämfört med normal stretch). b Representativa bilder för hjärtskivor färgade med troponin-T och WGA (vänster) och kvantifiering av cellstorlek (höger) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) celler/grupp från 10 olika skivor från olika grisar, tvåsidigt Student t-test utförs; ****p < 0,0001 jämfört med normal sträckning). b Representativa bilder för hjärtskivor färgade med troponin-T och WGA (vänster) och kvantifiering av cellstorlek (höger) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) celler/grupp från 10 olika skivor från olika grisar, tvåsidigt Student t-test utförs; ****p < 0,0001 jämfört med normal sträckning). b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т och АЗП (слева) och количествениногого клеток (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) клеток/группу из 10 разных срезов от разных свиней, двх-из t-критерий Стьюдента; ****p < 0,0001 по сравнению с нормальным растяжением). b Representativa bilder av hjärtsektioner färgade med troponin-T och AZP (vänster) och kvantifiering av cellstorlek (höger) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) celler/grupp från 10 olika sektioner från olika grisar, tvåsidigt Student's t-test utfördes; ****p < 0,0001 jämfört med normal stam). b 用肌钙蛋白-T 和WGA（左）和细胞大小量化（右）染色的心脏切片的代表性 3（n MTOS），来自不同猪的10 个不同切片的369（D6 MTNorm）细胞/组，两进行有尾学甌检验；与正常拉伸相比，****p < 0,0001）. b Representativa bilder av hjärtskivor färgade med calcarein-T och WGA (vänster) och cellstorlek (höger) (n = 330 (D6 MTOS), 369 från 10 olika skivor (D6 MTNorm)) Celler/cell, jämfört med normal sträckning, ****p < 0,0001). b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т och АЗП (слева) och количественная (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) из 10 различных срезов от разных свиней Клетки/групюца, двусторонидер; ****p < 0,0001 по сравнению с нормальным растяжением). b Representativa bilder av hjärtsektioner färgade med troponin-T och AZP (vänster) och kvantifiering av cellstorlek (höger) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) från 10 olika sektioner från olika grisar) Celler/grupp, tvåsidigt kriterium Student's t; ****p < 0,0001 jämfört med normal stam). c Representativa bilder för dag 0 och dag 6 MTOS-hjärtskivor immunmärkta för troponin-T och NFATC4 och kvantifiering av translokationen av NFATC4 till kärnorna i CM (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) skivor/grupp från olika grisar, tvåsidigt Student t-test utförs; *p < 0,05). c Representativa bilder för dag 0 och dag 6 MTOS-hjärtskivor immunmärkta för troponin-T och NFATC4 och kvantifiering av translokationen av NFATC4 till kärnorna i CM (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) skivor/grupp från olika grisar, tvåsidigt Student t-test utförs; *p < 0,05). c Репрезентативные изображения для срезов сердца 0 och 6 дней MTOS, иммуномеченых для тропонина-Т и NFATC4, och ковленич транслокации NFATC4 в ядра кавернозных клеток (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срезов/группу от разных свиняней , выпусян t-критерий Стьюдента; *p < 0,05). c Representativa bilder för hjärtsektioner vid 0 och 6 dagars MTOS, immunmärkta för troponin-T och NFATC4, och kvantifiering av NFATC4-translokation i kärnan av kavernösa celler (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) skivor/grupp från olika grisar) utfört tvåsidigt Student's t-test; *p < 0,05). c 用于肌钙蛋白-T 和NFATC4 免疫标记的第0 天和第6 天MTOS心脏切片的代表性图像，以及来自不同猪的NFATC4 易位至CM 细胞核的量匀MT 匀4（n) =、3D (n)切片/组, 进行双尾学生t 检验；*p < 0,05). c Representativa bilder av calcanin-T och NFATC4 immunmärkning 第0天和第6天MTOS hjärtskivor, och NFATC4 från olika NFATC4 易位至CM cellkärna的kvantitet化 (n = 4 (D0), 缤 刻 , 3 (D6 , 焇 , 焇 , 缤)时间双尾学生et 电影；*p < 0,05). c Репрезентативные изображения срезов сердца MTOS på 0 och 6 dagar för иммуномаркировки тропонином-Т и NFATC4 och NFATC4 och транслокации NFATC4 в ядра CM от разных свиней (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срез/группа, два- хвостатый t-критеритер, 0). c Representativa bilder av MTOS-hjärtskivor vid dag 0 och 6 för troponin-T- och NFATC4-immunmärkning och kvantifiering av NFATC4-translokation i kärnan hos CM från olika grisar (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) skivor/grupp, tvåsidigt t-kriterium Student's; *p < 0,05).Felstaplar representerar medelvärde ± standardavvikelse.
Translationell kardiovaskulär forskning kräver cellulära modeller som korrekt reproducerar hjärtmiljön. I denna studie utvecklades och karakteriserades en CTCM-enhet som kan stimulera ultratunna sektioner av hjärtat. CTCM-systemet inkluderar fysiologiskt synkroniserad elektromekanisk stimulering och T3- och Dex-vätskeanrikning. När svinhjärtsektioner exponerades för dessa faktorer förblev deras livskraft, strukturella integritet, metaboliska aktivitet och transkriptionella uttryck desamma som i färsk hjärtvävnad efter 12 dagars odling. Dessutom kan överdriven sträckning av hjärtvävnad orsaka hypertrofi av hjärtat orsakad av hyperextension. Sammantaget stöder dessa resultat den kritiska rollen av fysiologiska odlingsförhållanden för att upprätthålla en normal hjärtfenotyp och ger en plattform för läkemedelsscreening.
Många faktorer bidrar till att skapa en optimal miljö för kardiomyocyters funktion och överlevnad. De mest uppenbara av dessa faktorer är relaterade till (1) intercellulära interaktioner, (2) elektromekanisk stimulering, (3) humorala faktorer och (4) metaboliska substrat. Fysiologiska cell-till-cell-interaktioner kräver komplexa tredimensionella nätverk av flera celltyper som stöds av en extracellulär matrix. Sådana komplexa cellulära interaktioner är svåra att rekonstruera in vitro genom samodling av enskilda celltyper, men kan enkelt uppnås med hjälp av hjärtsektionernas organotypiska natur.
Mekanisk stretch och elektrisk stimulering av kardiomyocyter är avgörande för att upprätthålla hjärtfenotypen33,34,35. Medan mekanisk stimulering har använts i stor utsträckning för hiPSC-CM-konditionering och mognad, har flera eleganta studier nyligen försökt med mekanisk stimulering av hjärtskivor i kultur med hjälp av enaxlig belastning. Dessa studier visar att 2D enaxlig mekanisk belastning har en positiv effekt på hjärtats fenotyp under odling. I dessa studier belastades sektioner av hjärtat antingen med isometriska dragkrafter17, linjär auxoton belastning18, eller så återskapades hjärtcykeln med hjälp av krafttransduktoråterkoppling och spänningsdrivningar. Dessa metoder använder dock enaxlig vävnadssträckning utan miljöoptimering, vilket resulterar i undertryckande av många hjärtgener eller överuttryck av gener associerade med onormala sträckresponser. CTCM som beskrivs här ger en 3D elektromekanisk stimulus som efterliknar den naturliga hjärtcykeln i termer av cykeltid och fysiologisk stretch (25 % stretch, 40 % systole, 60 % diastole och 72 slag per minut). Även om denna tredimensionella mekaniska stimulering ensam inte är tillräcklig för att upprätthålla vävnadens integritet, krävs en kombination av humoral och mekanisk stimulering med T3/Dex för att på ett adekvat sätt upprätthålla vävnadens viabilitet, funktion och integritet.
Humorala faktorer spelar en viktig roll i att modulera fenotypen hos vuxna hjärtceller. Detta framhävdes i HiPS-CM-studier där T3 och Dex tillsattes till odlingsmedier för att accelerera cellmognad. T3 kan påverka transporten av aminosyror, sockerarter och kalcium över cellmembran36. Dessutom främjar T3 MHC-α-uttryck och MHC-β-nedreglering, vilket främjar bildandet av snabba myofibriller i mogna kardiomyocyter jämfört med långsamma myofibriller i foster-CM. T3-brist hos patienter med hypotyreos resulterar i förlust av myofibrillära band och en minskad hastighet av tonusutveckling37. Dex verkar på glukokortikoidreceptorer och har visat sig öka myokardiell kontraktilitet i isolerade perfunderade hjärtan;38 denna förbättring tros vara relaterad till effekten på kalciumdepositionsdriven entré (SOCE)39,40. Dessutom binder Dex till sina receptorer, vilket orsakar ett brett intracellulärt svar som undertrycker immunfunktion och inflammation30.
Våra resultat indikerar att fysisk mekanisk stimulering (MS) förbättrade den totala kulturprestanda jämfört med Ctrl, men misslyckades med att bibehålla viabilitet, strukturell integritet och hjärtuttryck under 12 dagar i kultur. Jämfört med Ctrl förbättrade tillsats av T3 och Dex till CTCM (MT)-kulturer viabiliteten och bibehöll liknande transkriptionsprofiler, strukturell integritet och metabolisk aktivitet med färsk hjärtvävnad i 12 dagar. Genom att kontrollera graden av vävnadssträckning skapades dessutom en hyperextension-inducerad hjärthypertrofimodell med STCM, vilket illustrerar STCM-systemets mångsidighet. Det bör noteras att även om hjärtremodellering och fibros vanligtvis involverar intakta organ vars cirkulerande celler kan tillhandahålla lämpliga cytokiner samt fagocytos och andra remodelleringsfaktorer, kan sektioner av hjärtat fortfarande härma den fibrotiska processen som svar på stress och trauma in i myofibroblaster. Detta har tidigare utvärderats i denna hjärtskivsmodell. Det bör noteras att CTCM-parametrar kan moduleras genom att ändra tryck/elektrisk amplitud och frekvens för att simulera många tillstånd såsom takykardi, bradykardi och mekaniskt cirkulationsstöd (mekaniskt obelastat hjärta). Detta gör systemet till ett system med medelhög genomströmning för läkemedelstestning. CTCM:s förmåga att modellera överansträngningsinducerad hjärthypertrofi banar väg för att testa detta system för personlig behandling. Sammanfattningsvis visar den aktuella studien att mekanisk stretch och humoral stimulering är avgörande för att upprätthålla odlingen av hjärtvävnadssnitt.
Även om de data som presenteras här tyder på att CTCM är en mycket lovande plattform för modellering av intakt myokardium, har denna odlingsmetod vissa begränsningar. Den huvudsakliga begränsningen med CTCM-odling är att den påför kontinuerliga dynamiska mekaniska påfrestningar på skivorna, vilket utesluter möjligheten att aktivt övervaka hjärtskivornas kontraktioner under varje cykel. På grund av hjärtsektionernas lilla storlek (7 mm) är dessutom möjligheten att utvärdera systolisk funktion utanför odlingssystem med traditionella kraftsensorer begränsad. I det aktuella manuskriptet övervinner vi delvis denna begränsning genom att utvärdera optisk spänning som en indikator på kontraktil funktion. Denna begränsning kommer dock att kräva ytterligare arbete och kan komma att åtgärdas i framtiden genom att introducera metoder för optisk övervakning av hjärtskivornas funktion i odling, såsom optisk kartläggning med kalcium och spänningskänsliga färgämnen. En annan begränsning med CTCM är att arbetsmodellen inte manipulerar fysiologisk stress (förbelastning och efterbelastning). I CTCM inducerades tryck i motsatta riktningar för att reproducera 25 % fysiologisk stretch i diastole (full stretch) och systole (kontraktionslängd under elektrisk stimulering) i mycket stora vävnader. Denna begränsning bör undanröjas i framtida CTCM-designer genom tillräckligt tryck på hjärtvävnaden från båda sidor och genom att tillämpa exakt de tryck-volymförhållanden som uppstår i hjärtats kamrar.
Den översträckningsinducerade ombyggnaden som rapporteras i detta manuskript är begränsad till att härma hypertrofiska hypersträckningssignaler. Således kan denna modell hjälpa till vid studiet av sträckningsinducerad hypertrofisk signalering utan behov av humorala eller neurala faktorer (som inte existerar i detta system). Ytterligare studier behövs för att öka multipliciteten av CTCM, till exempel kommer samodling med immunceller, humorala faktorer i cirkulerande plasma och innervation när samodling med neuronala celler kommer att förbättra möjligheterna till sjukdomsmodellering med CTCM.
Tretton grisar användes i denna studie. Alla djurförsök utfördes i enlighet med institutionella riktlinjer och godkändes av University of Louisville Institutional Animal Care and Use Committee. Aortabågen klämdes fast och hjärtat perfunderades med 1 liter steril kardioplegi (110 mM NaCl, 1,2 mM CaCl2, 16 mM KCl, 16 mM MgCl2, 10 mM NaHCO3, 5 U/ml heparin, pH upp till 7,4); Hjärtan bevarades i iskall kardioplegisk lösning tills de transporterades till laboratoriet på is, vilket vanligtvis är <10 minuter. Hjärtan bevarades i iskall kardioplegisk lösning tills de transporterades till laboratoriet på is, vilket vanligtvis är <10 minuter. сердца хранили в ледяном кардиоплегическом растворе до транспортировки в лабораторию на льду, что обанично <10мно. hjärtan förvarades i iskall kardioplegisk lösning fram till transport till laboratoriet på is, vilket vanligtvis tar <10 minuter.将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10刂逛将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10刂逛 Держите сердца в ледяной кардиоплегии до транспортировки в лабораторию на льду, обычно <10 min. Håll hjärtan på is vid kardioplegi tills transport till laboratoriet på is, vanligtvis <10 min.
CTCM-enheten utvecklades i SolidWorks CAD-programvara. Odlingskamrarna, avdelarna och luftkamrarna är tillverkade av CNC-bearbetad klar akrylplast. Stödringen med 7 mm diameter är tillverkad av högdensitetspolyeten (HDPE) i mitten och har ett o-ringsspår för att rymma silikon-o-ringen som används för att täta mediet under. Ett tunt kiseldioxidmembran separerar odlingskammaren från separationsplattan. Silikonmembranet är laserskuret från 0,02 tum tjock silikonplåt och har en hårdhet på 35A. De nedre och övre silikonpackningarna är laserskurna från 1/16 tum tjock silikonplåt och har en hårdhet på 50A. Skruvar och vingmuttrar i rostfritt stål (316L) används för att fästa blocket och skapa en lufttät tätning.
Ett dedikerat kretskort (PCB) är utformat för att integreras med C-PACE-EM-systemet. Kontaktuttagen för schweizisk maskin på kretskortet är anslutna till grafitelektroder med försilvrade koppartrådar och brons 0-60 skruvar som är skruvade in i elektroderna. Kretskortet placeras i 3D-skrivarens hölje.
CTCM-enheten styrs av ett programmerbart pneumatiskt ställdon (PPD) som skapar ett kontrollerat cirkulationstryck liknande ett hjärttryck. När trycket inuti luftkammaren ökar expanderar det flexibla silikonmembranet uppåt, vilket tvingar mediet under vävnadsområdet. Vävnadsområdet kommer sedan att sträckas ut genom denna utstötning av vätska, vilket imiterar hjärtats fysiologiska expansion under diastole. Vid maximal avslappning applicerades elektrisk stimulering via grafitelektroder, vilket minskade trycket i luftkammaren och orsakade sammandragning av vävnadssektionerna. Inuti röret finns en hemostatisk ventil med en trycksensor för att detektera trycket i luftsystemet. Trycket som avkänns av trycksensorn appliceras på en datainsamlare ansluten till den bärbara datorn. Detta möjliggör kontinuerlig övervakning av trycket inuti gaskammaren. När det maximala kammartrycket uppnåddes (standard 80 mmHg, 140 mmHg överbelastning) beordrades datainsamlingsenheten att skicka en signal till C-PACE-EM-systemet för att generera en tvåfasig spänningssignal under 2 ms, inställd på 4 V.
Hjärtsektioner togs och odlingsförhållandena i 6 brunnar utfördes enligt följande: Överförde de skördade hjärtana från överföringskärlet till en bricka innehållande kall (4°C) kardioplegi. Vänster kammare isolerades med ett sterilt blad och skars i bitar om 1-2 cm3. Dessa vävnadsblock fästes på vävnadsstöd med vävnadslim och placerades i ett vibrerande mikrotomvävnadsbad innehållande Tyrodes lösning och kontinuerligt syresatt (3 g/L 2,3-butandionmonooxim (BDM), 140 mM NaCl (8,18 g), 6 mM KCl (0,447 g), 10 mM D-glukos (1,86 g), 10 mM HEPES (2,38 g), 1 mM MgCl2 (1 ml 1 M lösning), 1,8 mM CaCl2 (1,8 ml 1 M lösning), upp till 1 L ddH2O). Den vibrerande mikrotomen ställdes in för att skära 300 µm tjocka skivor med en frekvens på 80 Hz, en horisontell vibrationsamplitud på 2 mm och en matningshastighet på 0,03 mm/s. Vävnadsbadet omgavs av is för att hålla lösningen sval och temperaturen hölls vid 4 °C. Överför vävnadssnitten från mikrotombadet till ett inkubationsbad innehållande kontinuerligt syresatt Tyrode-lösning på is tills tillräckligt med snitt erhölls för en odlingsplatta. För transwell-kulturer fästes vävnadssnitten på sterila 6 mm breda polyuretanstöd och placerades i 6 ml optimerat medium (199 medium, 1x ITS-tillskott, 10 % FBS, 5 ng/ml VEGF, 10 ng/ml FGF-alkaliskt och 2X antibiotika-svampdödande medel). Elektrisk stimulering (10 V, frekvens 1,2 Hz) applicerades på vävnadssnitten genom C-Pace. För TD-förhållanden tillsattes färsk T3 och Dex vid 100 nM och 1 μM vid varje mediumbyte. Mediet mättas med syre före utbyte 3 gånger per dag. Vävnadssnitt odlades i en inkubator vid 37 °C och 5 % CO2.
För CTCM-kulturer placerades vävnadssnitt på en specialtillverkad 3D-skrivare i en petriskål innehållande modifierad Tyrodes lösning. Anordningen är utformad för att öka storleken på hjärtsnittet med 25 % av stödringens yta. Detta görs så att hjärtsnitten inte töjs ut efter överföring från Tyrodes lösning till mediet och under diastole. Med hjälp av histoakryllim fixerades snitt med en tjocklek på 300 µm på en stödring med en diameter på 7 mm. Efter att vävnadssnitten fästs vid stödringen, skars de överflödiga vävnadssnitten av och placerades tillbaka i badet med Tyrode-lösning på is (4 °C) tills tillräckligt många snitt har förberetts för en enhet. Den totala bearbetningstiden för alla enheter bör inte överstiga 2 timmar. Efter att 6 vävnadssnitt fästs vid sina stödringar monterades CTCM-enheten. CTCM-odlingskammaren är förfylld med 21 ml försyresatt medium. Överför vävnadssnitten till odlingskammaren och avlägsna försiktigt eventuella luftbubblor med en pipett. Vävnadssektionen styrs sedan in i hålet och trycks försiktigt på plats. Sätt slutligen elektrodskyddet på enheten och överför enheten till inkubatorn. Anslut sedan CTCM-enheten till luftslangen och C-PACE-EM-systemet. Det pneumatiska ställdonet öppnas och luftventilen öppnar CTCM-enheten. C-PACE-EM-systemet konfigurerades för att leverera 4 V vid 1,2 Hz under bifasisk pacing i 2 ms. Mediet byttes två gånger om dagen och elektroderna byttes en gång om dagen för att undvika ansamling av grafit på elektroderna. Vid behov kan vävnadssektionerna tas bort från sina odlingsbrunnar för att driva ut eventuella luftbubblor som kan ha fallit under dem. För MT-behandlingsförhållanden tillsattes T3/Dex färskt vid varje mediumbyte med 100 nM T3 och 1 μM Dex. CTCM-enheterna odlades i en inkubator vid 37 °C och 5 % CO2.
För att erhålla sträckta banor av hjärtskivor utvecklades ett speciellt kamerasystem. En systemkamera (Canon Rebel T7i, Canon, Tokyo, Japan) användes med ett Navitar Zoom 7000 18-108mm makroobjektiv (Navitar, San Francisco, CA). Visualisering utfördes vid rumstemperatur efter att mediet hade ersatts med nytt medium. Kameran placerades i en 51° vinkel och video spelades in med 30 bilder per sekund. Först användes öppen källkodsprogramvara (MUSCLEMOTION43) med Image-J för att kvantifiera rörelsen hos hjärtskivorna. Masken skapades med hjälp av MATLAB (MathWorks, Natick, MA, USA) för att definiera regioner av intresse för hjärtskivor som slår för att undvika brus. Manuellt segmenterade masker appliceras på alla bilder i en bildsekvens och skickas sedan till MUSCLEMOTION-pluginet. Muscle Motion använder den genomsnittliga intensiteten hos pixlarna i varje bildruta för att kvantifiera dess rörelse i förhållande till referensbildrutan. Data registrerades, filtrerades och användes för att kvantifiera cykeltiden och bedöma vävnadssträckningen under hjärtcykeln. Den inspelade videon efterbehandlades med ett digitalt filter av första ordningen med nollfas. För att kvantifiera vävnadssträckning (topp-till-topp) utfördes topp-till-topp-analys för att skilja mellan toppar och dalar i den inspelade signalen. Dessutom utförs trendavreglering med ett polynom av sjätte ordningen för att eliminera signaldrift. Programkod utvecklades i MATLAB för att bestämma global vävnadsrörelse, cykeltid, relaxationstid och kontraktionstid (kompletterande programkod 44).
För töjningsanalys, med samma videor som skapats för mekanisk töjningsbedömning, ritade vi först två bilder som representerade rörelsetoppar (de högsta (övre) och lägsta (nedre) rörelsepunkterna) enligt MUSCLEMOTION-programvaran. Vi segmenterade sedan vävnadsområdena och tillämpade en form av skuggningsalgoritm på den segmenterade vävnaden (kompletterande figur 2a). Den segmenterade vävnaden delades sedan in i tio underytor, och spänningen på varje yta beräknades med följande ekvation: Töjning = (Sup-Sdown)/Sdown, där Sup och Sdown är avstånden mellan formen och tygets övre respektive nedre skuggor (kompletterande figur 2b).
Hjärtsektioner fixerades i 4 % paraformaldehyd i 48 timmar. Fixerade vävnader dehydrerades i 10 % och 20 % sackaros i 1 timme och sedan i 30 % sackaros över natten. Sektionerna inbäddades sedan i OCT-förening (optimal cutting temperature compound) och frystes gradvis i ett isopentan/torrisbad. Förvara OCT-inbäddningsblocken vid -80 °C tills de separerades. Objektglasen framställdes som sektioner med en tjocklek av 8 μm.
För att avlägsna OCT från hjärtsektioner, värm objektglasen på ett värmeblock vid 95 °C i 5 minuter. Tillsätt 1 ml PBS till varje objektglas och inkubera i 30 minuter i rumstemperatur, permeera sedan sektionerna genom att sätta 0,1 % Triton-X i PBS i 15 minuter i rumstemperatur. För att förhindra att ospecifika antikroppar binder till provet, tillsätt 1 ml 3 % BSA-lösning till objektglasen och inkubera i 1 timme i rumstemperatur. BSA togs sedan bort och objektglasen tvättades med PBS. Markera varje prov med en penna. Primära antikroppar (utspädda 1:200 i 1 % BSA) (connexin 43 (Abcam; #AB11370), NFATC4 (Abcam; #AB99431) och troponin-T (Thermo Scientific; #MA5-12960) tillsattes under 90 minuter, sedan sekundära antikroppar (utspädda 1:200 i 1 % BSA) mot mus Alexa Fluor 488 (Thermo Scientific; #A16079), mot kanin Alexa Fluor 594 (Thermo Scientific; #T6391) i ytterligare 90 minuter. Tvättades 3 gånger med PBS. För att skilja målfärgning från bakgrund använde vi endast den sekundära antikroppen som kontroll. Slutligen tillsattes DAPI-kärnfärgning och objektglasen placerades i en Vectashield (Vector Laboratories) och förseglades med nagellack. (-x förstoring) och Keyence-mikroskop med 40x förstoring.
WGA-Alexa Fluor 555 (Thermo Scientific; #W32464) vid 5 μg/ml i PBS användes för WGA-färgning och applicerades på fixerade sektioner i 30 minuter vid rumstemperatur. Objektglasen tvättades sedan med PBS och Sudansvart tillsattes till varje objektglas och inkuberades i 30 minuter. Objektglasen tvättades sedan med PBS och Vectashield-inbäddningsmedium tillsattes. Objektglasen visualiserades i ett Keyence-mikroskop vid 40x förstoring.
OCT avlägsnades från proverna enligt beskrivningen ovan. Efter att OCT avlägsnats, doppades objektglasen i Bouins lösning över natten. Objektglasen sköljdes sedan med destillerat vatten i 1 timme och placerades sedan i en Bibrich-aloe vera-fuchsinlösning i 10 minuter. Därefter tvättades objektglasen med destillerat vatten och placerades i en lösning av 5 % fosfomolybden/5 % fosfovolframsyra i 10 minuter. Överför objektglasen direkt till anilinblåttlösningen utan att skölja i 15 minuter. Därefter tvättades objektglasen med destillerat vatten och placerades i en 1 % ättiksyralösning i 2 minuter. Objektglasen torkades i 200 N etanol och överfördes till xylen. Färgade objektglas visualiserades med ett Keyence-mikroskop med 10x objektiv. Procentandelen fibrosarea kvantifierades med hjälp av Keyence Analyzer-programvaran.
CyQUANT™ MTT Cell Viability Assay (Invitrogen, Carlsbad, CA), katalognummer V13154, enligt tillverkarens protokoll med vissa modifieringar. I synnerhet användes en kirurgisk stans med en diameter på 6 mm för att säkerställa enhetlig vävnadsstorlek under MTT-analysen. Vävnaderna placerades individuellt i brunnarna på en 12-brunnsplatta innehållande MTT-substrat enligt tillverkarens protokoll. Sektionerna inkuberas vid 37 °C i 3 timmar och den levande vävnaden metaboliserar MTT-substratet för att bilda en lila formazanförening. Ersätt MTT-lösningen med 1 ml DMSO och inkubera vid 37 °C i 15 minuter för att extrahera lila formazan från hjärtsektionerna. Proverna späddes 1:10 i DMSO i 96-brunnsplattor med klar botten och den lila färgintensiteten mättes vid 570 nm med hjälp av en Cytation-plattläsare (BioTek). Avläsningarna normaliserades till vikten av varje skiva av hjärtat.
Hjärtskivsmedium ersattes med medium innehållande 1 μCi/ml [5-3H]-glukos (Moravek Biochemicals, Brea, CA, USA) för glukosutnyttjandeanalys enligt tidigare beskrivning. Efter 4 timmars inkubation tillsattes 100 µl medium till ett öppet mikrocentrifugrör innehållande 100 µl 0,2 N HCl. Därefter placerades röret i ett scintillationsrör innehållande 500 µl dH₂O för att avdunsta [3H]₂O i 72 timmar vid 37°C. Ta sedan bort mikrocentrifugröret från scintillationsröret och tillsätt 10 ml scintillationsvätska. Scintillationsräkningar utfördes med en Tri-Carb 2900TR vätskescintillationsanalysator (Packard Bioscience Company, Meriden, CT, USA). Glukosutnyttjandet beräknades sedan med hänsyn till [5-3H]-glukosspecifik aktivitet, ofullständig jämvikt och bakgrund, utspädning av [5-3H]-till omärkt glukos och scintillationsräknarens effektivitet. Data är normaliserade till massan av hjärtsektioner.
Efter vävnadshomogenisering i Trizol isolerades RNA från hjärtsektioner med hjälp av Qiagen miRNeasy Micro Kit #210874 enligt tillverkarens protokoll. RNAsec-biblioteksberedning, sekvensering och dataanalys utfördes enligt följande:
1 μg RNA per prov användes som utgångsmaterial för framställningen av RNA-biblioteket. Sekvenseringsbibliotek genererades med hjälp av NEBNext UltraTM RNA Library Preparation Kit för Illumina (NEB, USA) enligt tillverkarens rekommendationer, och indexkoder lades till attributsekvenserna för varje prov. Kortfattat renades mRNA från totalt RNA med hjälp av magnetiska pärlor fästa med poly-T-oligonukleotider. Fragmentering utfördes med hjälp av divalenta katjoner vid hög temperatur i NEBNext First Strand Synthesis Reaction Buffer (5X). Första strängens cDNA syntetiserades med hjälp av slumpmässiga hexamerprimers och M-MuLV omvänt transkriptas (RNase H-). Andra strängens cDNA syntetiseras sedan med hjälp av DNA-polymeras I och RNase H. De återstående överhängena omvandlas till trubbiga ändar genom exonukleas/polymerasaktivitet. Efter adenylering av 3'-änden av DNA-fragmentet fästs en NEBNext-adapter med en hårnålsöglestruktur till den för att förbereda den för hybridisering. För selektion av cDNA-fragment med föredragen längd 150-200 bp. Biblioteksfragment renades med hjälp av AMPure XP-systemet (Beckman Coulter, Beverly, USA). Därefter användes 3 μl USER-enzym (NEB, USA) med storleksselekterat cDNA ligerat med en adapter i 15 minuter vid 37°C och sedan i 5 minuter vid 95°C före PCR. PCR utfördes sedan med Phusion High-Fidelity DNA-polymeras, universella PCR-primers och Index (X)-primers. Slutligen renades PCR-produkterna (AMPure XP-system) och bibliotekskvaliteten bedömdes på ett Agilent Bioanalyzer 2100-system. cDNA-biblioteket sekvenserades sedan med hjälp av en Novaseq-sekvenserare. Råa bildfiler från Illumina konverterades till råa avläsningar med hjälp av CASAVA Base Calling. Rådata lagras i FASTQ(fq)-formatfiler som innehåller avläsningssekvenser och motsvarande baskvaliteter. Välj HISAT2 för att matcha filtrerade sekvenseringsavläsningar med Sscrofa11.1-referensgenomet. Generellt sett stöder HISAT2 genom av alla storlekar, inklusive genom större än 4 miljarder baser, och standardvärden är inställda för de flesta parametrar. Splitsningsläsningar från RNA-sekvensdata kan effektivt justeras med hjälp av HISAT2, det snabbaste systemet som för närvarande finns tillgängligt, med samma eller bättre noggrannhet än någon annan metod.
Transkriptmängden återspeglar direkt nivån av genuttryck. Genuttrycksnivåer bedöms genom mängden transkript (sekvenseringsantal) associerade med genomet eller exonerna. Antalet avläsningar är proportionellt mot genuttrycksnivåer, genlängd och sekvenseringsdjup. FPKM (fragment per tusen baspar av sekvenserat transkript per miljon baspar) beräknades och P-värden för differentiellt uttryck bestämdes med hjälp av DESeq2-paketet. Vi beräknade sedan falsk upptäcktsfrekvens (FDR) för varje P-värde med hjälp av Benjamini-Hochberg-metoden9 baserat på den inbyggda R-funktionen "p.adjust".
RNA isolerat från hjärtsektioner omvandlades till cDNA vid en koncentration av 200 ng/μl med hjälp av SuperScript IV Vilo Master mix från Thermo (Thermo, kat.nr. 11756050). Kvantitativ RT-PCR utfördes med en Applied Biosystems Endura Plate Microamp 384-brunns transparent reaktionsplatta (Thermo, kat.nr. 4483319) och mikroamp optiskt adhesiv (Thermo, kat.nr. 4311971). Reaktionsblandningen bestod av 5 µl Taqman Fast Advanced Master mix (Thermo, kat.nr. 4444557), 0,5 µl Taqman Primer och 3,5 µl H2O blandat per brunn. Standard qPCR-cykler kördes och CT-värden mättes med ett Applied Biosystems Quantstudio 5 realtids-PCR-instrument (384-brunnsmodul; produktnr. A28135). Taqman-primers köptes från Thermo (GAPDH (Ss03375629_u1), PARP12 (Ss06908795_m1), PKDCC (Ss06903874_m1), CYGB (Ss06900188_m1), RGL1 (Ss06868890_m1), ACTN1 (Ss01009508_mH), GATA4 (Ss03383805_u1), GJA1 (Ss03374839_u1), COL1A2 (Ss03375009_u1), COL3A1 (Ss04323794_m1), ACTA2 (Ss04245588_m1). CT-värdena för alla prover normaliserades till hushållsgenen GAPDH.
Mediefrisättning av NT-ProBNP bedömdes med hjälp av NT-ProBNP-kit (pig) (katalognr. MBS2086979, MyBioSource) enligt tillverkarens protokoll. Kortfattat tillsattes 250 µl av varje prov och standard i duplikat till varje brunn. Omedelbart efter tillsats av provet tillsattes 50 µl analysreagens A till varje brunn. Skaka försiktigt plattan och förslut med tätningsmedel. Tabletterna inkuberades sedan vid 37 °C i 1 timme. Aspirera sedan lösningen och tvätta brunnarna 4 gånger med 350 µl 1X tvättlösning, inkubera tvättlösningen i 1-2 minuter varje gång. Tillsätt sedan 100 µl analysreagens B per brunn och förslut med platttätningsmedel. Tabletten skakades försiktigt och inkuberades vid 37 °C i 30 minuter. Aspirera lösningen och tvätta brunnarna 5 gånger med 350 µl 1X tvättlösning. Tillsätt 90 µl substratlösning till varje brunn och förslut plattan. Inkubera plattan vid 37 °C i 10–20 minuter. Tillsätt 50 µl stopplösning till varje brunn. Plattan mättes omedelbart med en Cytation (BioTek) plattläsare inställd på 450 nm.
Poweranalyser utfördes för att välja gruppstorlekar som ger >80 % effekt för att detektera en absolut parameterförändring på 10 % med en typ I-felfrekvens på 5 %. Poweranalyser utfördes för att välja gruppstorlekar som ger >80 % effekt för att detektera en absolut parameterförändring på 10 % med en typ I-felfrekvens på 5 %. Анализ мощности был выполнен для выбора размеров групп, которые обеспечат >80% мощности för обнаружения 10% обеспечат параметра с 5% частотой ошибок типа I. Poweranalys utfördes för att välja gruppstorlekar som skulle ge >80 % effekt för att detektera 10 % absolut parameterförändring med en typ I-felfrekvens på 5 %.进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％I型错误率的组大小。进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％I型错误率的组大小。 Был проведен анализ мощности för выбора размера группы, который обеспечил бы 80% мощности для обнаружения изменения параметров и 5% частоты ошибок типа I. En effektanalys utfördes för att välja en gruppstorlek som skulle ge >80 % effekt för att detektera 10 % absolut parameterförändring och 5 % typ I-felfrekvens.Vävnadssektioner valdes slumpmässigt ut före experimentet. Alla analyser var konditionsblindande och proverna avkodades först efter att all data hade analyserats. GraphPad Prism-programvaran (San Diego, CA) användes för att utföra alla statistiska analyser. För all statistik ansågs p-värden vara signifikanta vid värden <0,05. För all statistik ansågs p-värden vara signifikanta vid värden <0,05. Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. För all statistik ansågs p-värden vara signifikanta vid värden <0,05.对于所有统计数据，p 值在值<0.05 时被认为是显着的。对于所有统计数据，p 值在值<0.05 时被认为是显着的。 Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. För all statistik ansågs p-värden vara signifikanta vid värden <0,05.Tvåsidigt Student's t-test utfördes på data med endast två jämförelser. Envägs- eller tvåvägs-ANOVA användes för att bestämma signifikans mellan flera grupper. Vid post hoc-tester tillämpades Tukeys korrigering för att ta hänsyn till multipla jämförelser. RNAsec-data har speciella statistiska överväganden vid beräkning av FDR och p.adjust enligt beskrivningen i metodavsnittet.
För mer information om studiedesign, se sammanfattningen av Nature Research Report som är länkad till den här artikeln.