Nature.com സന്ദർശിച്ചതിന് നന്ദി. നിങ്ങൾ ഉപയോഗിക്കുന്ന ബ്രൗസർ പതിപ്പിന് പരിമിതമായ CSS പിന്തുണ മാത്രമേ ഉള്ളൂ. മികച്ച അനുഭവത്തിനായി, നിങ്ങൾ ഒരു അപ്ഡേറ്റ് ചെയ്ത ബ്രൗസർ ഉപയോഗിക്കാൻ ഞങ്ങൾ ശുപാർശ ചെയ്യുന്നു (അല്ലെങ്കിൽ ഇന്റർനെറ്റ് എക്സ്പ്ലോററിൽ കോംപാറ്റിബിലിറ്റി മോഡ് പ്രവർത്തനരഹിതമാക്കുക). അതേസമയം, തുടർച്ചയായ പിന്തുണ ഉറപ്പാക്കാൻ, സ്റ്റൈലുകളും ജാവാസ്ക്രിപ്റ്റും ഇല്ലാതെ ഞങ്ങൾ സൈറ്റ് റെൻഡർ ചെയ്യും.
മയക്കുമരുന്ന് പരിശോധനയ്ക്കായി ഹൃദയത്തിന്റെ ഫിസിയോളജിക്കൽ പരിസ്ഥിതിയെ കൃത്യമായി പുനർനിർമ്മിക്കാൻ കഴിയുന്ന ഒരു വിശ്വസനീയമായ ഇൻ വിട്രോ സിസ്റ്റത്തിന്റെ ആവശ്യകതയുണ്ട്. മനുഷ്യ ഹൃദയ ടിഷ്യു കൾച്ചർ സിസ്റ്റങ്ങളുടെ പരിമിതമായ ലഭ്യത കാർഡിയാക് മയക്കുമരുന്ന് ഫലങ്ങളുടെ തെറ്റായ വ്യാഖ്യാനങ്ങൾക്ക് കാരണമായി. ഇവിടെ, ഹൃദയചക്രത്തിന്റെ സിസ്റ്റോളിക്, ഡയസ്റ്റോളിക് ഘട്ടങ്ങളിൽ ഹൃദയഭാഗങ്ങളെ ഇലക്ട്രോമെക്കാനിക്കലായി ഉത്തേജിപ്പിക്കുകയും ഫിസിയോളജിക്കൽ സ്ട്രെച്ചിന് വിധേയമാക്കുകയും ചെയ്യുന്ന ഒരു കാർഡിയാക് ടിഷ്യു കൾച്ചർ മോഡൽ (CTCM) ഞങ്ങൾ വികസിപ്പിച്ചെടുത്തിട്ടുണ്ട്. 12 ദിവസത്തെ കൾച്ചറിന് ശേഷം, ഈ സമീപനം ഹൃദയഭാഗങ്ങളുടെ പ്രവർത്തനക്ഷമത ഭാഗികമായി മെച്ചപ്പെടുത്തി, പക്ഷേ അവയുടെ ഘടനാപരമായ സമഗ്രത പൂർണ്ണമായും സംരക്ഷിച്ചില്ല. അതിനാൽ, ചെറിയ തന്മാത്രാ പരിശോധനയ്ക്ക് ശേഷം, ഞങ്ങളുടെ മാധ്യമത്തിൽ 100 ​​nM ട്രയോഡോഥൈറോണിൻ (T3), 1 μM ഡെക്സമെതസോൺ (Dex) എന്നിവ ചേർത്തത് 12 ദിവസത്തേക്ക് വിഭാഗങ്ങളുടെ സൂക്ഷ്മഘടന നിലനിർത്തുന്നുവെന്ന് ഞങ്ങൾ കണ്ടെത്തി. T3/Dex ചികിത്സയുമായി സംയോജിച്ച്, CTCM സിസ്റ്റം ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷണൽ പ്രൊഫൈലുകൾ, പ്രവർത്തനക്ഷമത, ഉപാപചയ പ്രവർത്തനം, ഘടനാപരമായ സമഗ്രത എന്നിവ 12 ദിവസത്തേക്ക് പുതിയ ഹൃദയകലകളുടെ അതേ തലത്തിൽ നിലനിർത്തി. കൂടാതെ, കൾച്ചറിൽ കാർഡിയാക് ടിഷ്യു അമിതമായി വലിച്ചുനീട്ടുന്നത് ഹൈപ്പർട്രോഫിക് കാർഡിയാക് സിഗ്നലിംഗിനെ പ്രേരിപ്പിക്കുന്നു, ഇത് കാർഡിയാക് സ്ട്രെച്ച് മൂലമുണ്ടാകുന്ന ഹൈപ്പർട്രോഫിക് അവസ്ഥകളെ അനുകരിക്കാനുള്ള CTCM ന്റെ കഴിവിന് തെളിവ് നൽകുന്നു. ഉപസംഹാരമായി, CTCM ന് ദീർഘകാലത്തേക്ക് കൾച്ചറിൽ ഹൃദയത്തിന്റെ ശരീരശാസ്ത്രവും പാത്തോഫിസിയോളജിയും മാതൃകയാക്കാൻ കഴിയും, ഇത് വിശ്വസനീയമായ മയക്കുമരുന്ന് പരിശോധന സാധ്യമാക്കുന്നു.
ക്ലിനിക്കൽ ഗവേഷണത്തിന് മുമ്പ്, മനുഷ്യ ഹൃദയത്തിന്റെ ഫിസിയോളജിക്കൽ പരിസ്ഥിതിയെ കൃത്യമായി പുനർനിർമ്മിക്കാൻ കഴിയുന്ന വിശ്വസനീയമായ ഇൻ വിട്രോ സംവിധാനങ്ങൾ ആവശ്യമാണ്. അത്തരം സംവിധാനങ്ങൾ മാറ്റം വരുത്തിയ മെക്കാനിക്കൽ സ്ട്രെച്ച്, ഹൃദയമിടിപ്പ്, ഇലക്ട്രോഫിസിയോളജിക്കൽ ഗുണങ്ങൾ എന്നിവയെ അനുകരിക്കണം. മനുഷ്യ ഹൃദയത്തിലെ മരുന്നുകളുടെ ഫലങ്ങൾ പ്രതിഫലിപ്പിക്കുന്നതിൽ പരിമിതമായ വിശ്വാസ്യതയുള്ള ഹൃദയ ഫിസിയോളജിക്കായുള്ള ഒരു സ്ക്രീനിംഗ് പ്ലാറ്റ്‌ഫോമായി മൃഗ മാതൃകകൾ സാധാരണയായി ഉപയോഗിക്കുന്നു1,2. ആത്യന്തികമായി, ഐഡിയൽ കാർഡിയാക് ടിഷ്യു കൾച്ചർ എക്സ്പിരിമെന്റൽ മോഡൽ (CTCM) വിവിധ ചികിത്സാ, ഫാർമക്കോളജിക്കൽ ഇടപെടലുകൾക്ക് വളരെ സെൻസിറ്റീവും നിർദ്ദിഷ്ടവുമായ ഒരു മാതൃകയാണ്, ഇത് മനുഷ്യ ഹൃദയത്തിന്റെ ഫിസിയോളജിയും പാത്തോഫിസിയോളജിയും കൃത്യമായി പുനർനിർമ്മിക്കുന്നു3. അത്തരമൊരു സംവിധാനത്തിന്റെ അഭാവം ഹൃദയസ്തംഭനത്തിനുള്ള പുതിയ ചികിത്സകളുടെ കണ്ടെത്തലിനെ പരിമിതപ്പെടുത്തുന്നു4,5 കൂടാതെ വിപണിയിൽ നിന്ന് പുറത്തുകടക്കുന്നതിനുള്ള ഒരു പ്രധാന കാരണമായി മയക്കുമരുന്ന് കാർഡിയോടോക്സിസിറ്റിയിലേക്ക് നയിച്ചു6.
കഴിഞ്ഞ ദശകത്തിൽ, എട്ട് നോൺ-കാർഡിയോവാസ്കുലാർ മരുന്നുകൾ ക്ലിനിക്കൽ ഉപയോഗത്തിൽ നിന്ന് പിൻവലിച്ചു, കാരണം അവ QT ഇടവേള ദീർഘിപ്പിക്കലിന് കാരണമാകുന്നു, ഇത് വെൻട്രിക്കുലാർ അരിഹ്‌മിയയിലേക്കും പെട്ടെന്നുള്ള മരണത്തിലേക്കും നയിക്കുന്നു. അതിനാൽ, ഹൃദയ സംബന്ധമായ ഫലപ്രാപ്തിയും വിഷാംശവും വിലയിരുത്തുന്നതിന് വിശ്വസനീയമായ പ്രീക്ലിനിക്കൽ സ്ക്രീനിംഗ് തന്ത്രങ്ങളുടെ ആവശ്യകത വർദ്ധിച്ചുവരികയാണ്. മയക്കുമരുന്ന് പരിശോധനയിലും വിഷാംശ പരിശോധനയിലും മനുഷ്യനിൽ നിന്നുള്ള പ്ലൂറിപോട്ടന്റ് സ്റ്റെം സെൽ-ഡെറിവേഡ് കാർഡിയോമയോസൈറ്റുകളുടെ (hiPS-CM) സമീപകാല ഉപയോഗം ഈ പ്രശ്നത്തിന് ഒരു ഭാഗിക പരിഹാരം നൽകുന്നു. എന്നിരുന്നാലും, hiPS-CM-കളുടെ അപക്വമായ സ്വഭാവവും കാർഡിയാക് ടിഷ്യുവിന്റെ മൾട്ടിസെല്ലുലാർ സങ്കീർണ്ണതയുടെ അഭാവവും ഈ രീതിയുടെ പ്രധാന പരിമിതികളാണ്. സ്വയമേവയുള്ള സങ്കോചങ്ങൾ ആരംഭിച്ചതിനുശേഷം താമസിയാതെ കാർഡിയാക് ടിഷ്യു ഹൈഡ്രോജലുകൾ രൂപപ്പെടുത്തുന്നതിനും കാലക്രമേണ ക്രമേണ വർദ്ധിച്ചുവരുന്ന വൈദ്യുത ഉത്തേജനത്തിനും തൊട്ടുപിന്നാലെ ആദ്യകാല hiPS-CM ഉപയോഗിച്ച് ഈ പരിമിതി ഭാഗികമായി മറികടക്കാൻ കഴിയുമെന്ന് സമീപകാല പഠനങ്ങൾ തെളിയിച്ചിട്ടുണ്ട്. എന്നിരുന്നാലും, ഈ hiPS-CM മൈക്രോടിഷ്യൂകൾക്ക് മുതിർന്നവരുടെ മയോകാർഡിയത്തിന്റെ പക്വമായ ഇലക്ട്രോഫിസിയോളജിക്കൽ, കോൺട്രാക്റ്റൈൽ ഗുണങ്ങൾ ഇല്ല. കൂടാതെ, മനുഷ്യ ഹൃദയ കലകൾക്ക് കൂടുതൽ സങ്കീർണ്ണമായ ഒരു ഘടനയുണ്ട്, അതിൽ എൻഡോതെലിയൽ കോശങ്ങൾ, ന്യൂറോണുകൾ, സ്ട്രോമൽ ഫൈബ്രോബ്ലാസ്റ്റുകൾ എന്നിവയുൾപ്പെടെ വ്യത്യസ്ത കോശ തരങ്ങളുടെ വൈവിധ്യമാർന്ന മിശ്രിതം അടങ്ങിയിരിക്കുന്നു, അവ പ്രത്യേക സെറ്റ് എക്സ്ട്രാ സെല്ലുലാർ മാട്രിക്സ് പ്രോട്ടീനുകളാൽ പരസ്പരം ബന്ധപ്പെട്ടിരിക്കുന്നു. മുതിർന്ന സസ്തനികളുടെ ഹൃദയത്തിലെ നോൺ-കാർഡിയോമയോസൈറ്റ് ജനസംഖ്യയുടെ ഈ വൈവിധ്യം11,12,13 വ്യക്തിഗത കോശ തരങ്ങൾ ഉപയോഗിച്ച് ഹൃദയ കലകളെ മാതൃകയാക്കുന്നതിനുള്ള ഒരു പ്രധാന തടസ്സമാണ്. ശാരീരികവും രോഗപരവുമായ സാഹചര്യങ്ങളിൽ കേടുകൂടാത്ത മയോകാർഡിയൽ ടിഷ്യു സംസ്ക്കരിക്കുന്നതിനുള്ള രീതികൾ വികസിപ്പിക്കുന്നതിന്റെ പ്രാധാന്യം ഈ പ്രധാന പരിമിതികൾ ഊന്നിപ്പറയുന്നു.
മനുഷ്യ ഹൃദയത്തിലെ കൾച്ചർ ചെയ്ത നേർത്ത (300 µm) ഭാഗങ്ങൾ കേടുകൂടാത്ത മനുഷ്യ മയോകാർഡിയത്തിന്റെ ഒരു വാഗ്ദാന മാതൃകയാണെന്ന് തെളിയിക്കപ്പെട്ടിട്ടുണ്ട്. ഈ രീതി മനുഷ്യ ഹൃദയ കലകൾക്ക് സമാനമായ ഒരു പൂർണ്ണമായ 3D മൾട്ടിസെല്ലുലാർ സിസ്റ്റത്തിലേക്ക് പ്രവേശനം നൽകുന്നു. എന്നിരുന്നാലും, 2019 വരെ, കൾച്ചർ ചെയ്ത ഹൃദയ വിഭാഗങ്ങളുടെ ഉപയോഗം ഹ്രസ്വമായ (24 മണിക്കൂർ) കൾച്ചർ അതിജീവനത്താൽ പരിമിതപ്പെടുത്തിയിരുന്നു. ഭൗതിക-മെക്കാനിക്കൽ സ്ട്രെച്ചിന്റെ അഭാവം, വായു-ദ്രാവക ഇന്റർഫേസ്, ഹൃദയ കലകളുടെ ആവശ്യങ്ങൾ പിന്തുണയ്ക്കാത്ത ലളിതമായ മാധ്യമങ്ങളുടെ ഉപയോഗം എന്നിവയുൾപ്പെടെ നിരവധി ഘടകങ്ങൾ ഇതിന് കാരണമായി. 2019 ൽ, കാർഡിയാക് ടിഷ്യു കൾച്ചർ സിസ്റ്റങ്ങളിൽ മെക്കാനിക്കൽ ഘടകങ്ങൾ ഉൾപ്പെടുത്തുന്നത് കൾച്ചർ ആയുസ്സ് വർദ്ധിപ്പിക്കാനും, കാർഡിയാക് എക്സ്പ്രഷൻ മെച്ചപ്പെടുത്താനും, കാർഡിയാക് പാത്തോളജി അനുകരിക്കാനും കഴിയുമെന്ന് നിരവധി ഗവേഷണ ഗ്രൂപ്പുകൾ തെളിയിച്ചു. കൾച്ചർ സമയത്ത് കാർഡിയാക് ഫിനോടൈപ്പിൽ ഏകാക്ഷീയ മെക്കാനിക്കൽ ലോഡിംഗ് ഒരു നല്ല സ്വാധീനം ചെലുത്തുന്നുവെന്ന് 17 ഉം 18 ഉം രണ്ട് മനോഹരമായ പഠനങ്ങൾ കാണിക്കുന്നു. എന്നിരുന്നാലും, ഹൃദയ വിഭാഗങ്ങൾ ഐസോമെട്രിക് ടെൻസൈൽ ഫോഴ്‌സുകൾ 17 അല്ലെങ്കിൽ ലീനിയർ ഓക്‌സോടോണിക് ലോഡിംഗ് 18 ഉപയോഗിച്ച് ലോഡ് ചെയ്‌തിരുന്നതിനാൽ, ഈ പഠനങ്ങൾ ഹൃദയ ചക്രത്തിന്റെ ചലനാത്മക ത്രിമാന ഭൗതിക-മെക്കാനിക്കൽ ലോഡിംഗ് ഉപയോഗിച്ചില്ല. ഈ ടിഷ്യു വലിച്ചുനീട്ടൽ രീതികൾ നിരവധി കാർഡിയാക് ജീനുകളെ അടിച്ചമർത്തുന്നതിനോ അസാധാരണമായ സ്ട്രെച്ച് പ്രതികരണങ്ങളുമായി ബന്ധപ്പെട്ട ജീനുകളുടെ അമിത പ്രകടനത്തിനോ കാരണമായി. ശ്രദ്ധേയമായി, പിറ്റൗളിസ് തുടങ്ങിയവർ 19 ഫോഴ്‌സ് ട്രാൻസ്‌ഡ്യൂസർ ഫീഡ്‌ബാക്കും ടെൻഷൻ ഡ്രൈവുകളും ഉപയോഗിച്ച് കാർഡിയാക് സൈക്കിൾ പുനർനിർമ്മാണത്തിനായി ഒരു ഡൈനാമിക് ഹാർട്ട് സ്ലൈസ് കൾച്ചർ ബാത്ത് വികസിപ്പിച്ചെടുത്തു. കൂടുതൽ കൃത്യമായ ഇൻ വിട്രോ കാർഡിയാക് സൈക്കിൾ മോഡലിംഗ് ഈ സിസ്റ്റം അനുവദിക്കുന്നുണ്ടെങ്കിലും, രീതിയുടെ സങ്കീർണ്ണതയും കുറഞ്ഞ ത്രൂപുട്ടും ഈ സിസ്റ്റത്തിന്റെ പ്രയോഗത്തെ പരിമിതപ്പെടുത്തുന്നു. പന്നിയിറച്ചിയുടെയും മനുഷ്യ ഹൃദയ കോശങ്ങളുടെയും വിഭാഗങ്ങളുടെ പ്രവർത്തനക്ഷമത 6 ദിവസം വരെ നിലനിർത്തുന്നതിന് വൈദ്യുത ഉത്തേജനവും ഒപ്റ്റിമൈസ് ചെയ്ത മാധ്യമവും ഉപയോഗിച്ച് ഞങ്ങളുടെ ലബോറട്ടറി അടുത്തിടെ ഒരു ലളിതമായ കൾച്ചർ സിസ്റ്റം വികസിപ്പിച്ചെടുത്തിട്ടുണ്ട്20,21.
നിലവിലെ കൈയെഴുത്തുപ്രതിയിൽ, പന്നിയിറച്ചി ഹൃദയത്തിന്റെ ഭാഗങ്ങൾ ഉപയോഗിച്ച്, ഹൃദയചക്രത്തിലെ ത്രിമാന കാർഡിയാക് ഫിസിയോളജിയും പാത്തോഫിസിയോളജിക്കൽ ഡിസ്റ്റൻഷനും സംഗ്രഹിക്കുന്നതിനായി ഹ്യൂമറൽ സൂചനകൾ ഉൾക്കൊള്ളുന്ന ഒരു കാർഡിയാക് ടിഷ്യു കൾച്ചർ മോഡൽ (CTCM) ഞങ്ങൾ വിവരിക്കുന്നു. പ്രീ-ക്ലിനിക്കൽ മയക്കുമരുന്ന് പരിശോധനയ്ക്കായി സസ്തനികളുടെ ഹൃദയത്തിന്റെ ഫിസിയോളജി/പാത്തോഫിസിയോളജിയെ അനുകരിക്കുന്ന ചെലവ് കുറഞ്ഞ, മിഡ്-ത്രൂപുട്ട് കാർഡിയാക് സിസ്റ്റം നൽകുന്നതിലൂടെ, പ്രീ-ക്ലിനിക്കൽ മയക്കുമരുന്ന് പ്രവചനത്തിന്റെ കൃത്യത മുമ്പൊരിക്കലും കൈവരിക്കാനാകാത്ത തലത്തിലേക്ക് വർദ്ധിപ്പിക്കാൻ ഈ CTCM-ന് കഴിയും.
കാർഡിയോമയോസൈറ്റ് പ്രവർത്തനം ഇൻ വിട്രോ 22,23,24 നിലനിർത്തുന്നതിൽ ഹീമോഡൈനാമിക് മെക്കാനിക്കൽ സിഗ്നലുകൾ നിർണായക പങ്ക് വഹിക്കുന്നു. നിലവിലെ കൈയെഴുത്തുപ്രതിയിൽ, ഫിസിയോളജിക്കൽ ഫ്രീക്വൻസികളിൽ (1.2 Hz, മിനിറ്റിൽ 72 സ്പന്ദനങ്ങൾ) വൈദ്യുതവും മെക്കാനിക്കൽ ഉത്തേജനവും പ്രേരിപ്പിച്ചുകൊണ്ട് മുതിർന്നവരുടെ ഹൃദയ പരിസ്ഥിതിയെ അനുകരിക്കാൻ കഴിയുന്ന ഒരു CTCM (ചിത്രം 1a) ഞങ്ങൾ വികസിപ്പിച്ചെടുത്തിട്ടുണ്ട്. ഡയസ്റ്റോളിനിടെ ടിഷ്യുവിന്റെ അമിതമായ നീറ്റൽ ഒഴിവാക്കാൻ, ടിഷ്യുവിന്റെ വലുപ്പം 25% വർദ്ധിപ്പിക്കാൻ ഒരു 3D പ്രിന്റിംഗ് ഉപകരണം ഉപയോഗിച്ചു (ചിത്രം 1b). കാർഡിയാക് സൈക്കിൾ പൂർണ്ണമായും പുനർനിർമ്മിക്കുന്നതിന് ഒരു ഡാറ്റ അക്വിസിഷൻ സിസ്റ്റം ഉപയോഗിച്ച് സിസ്റ്റോളിന് 100 എംഎസ് മുമ്പ് ആരംഭിക്കാൻ സി-പേസ് സിസ്റ്റം പ്രേരിപ്പിച്ച ഇലക്ട്രിക്കൽ പേസിംഗ് സമയബന്ധിതമാക്കി. മുകളിലെ അറയിലെ ഹൃദയ കഷ്ണങ്ങളുടെ വികാസത്തിന് കാരണമാകുന്ന ഒരു വഴക്കമുള്ള സിലിക്കൺ മെംബ്രൺ ചാക്രികമായി വികസിപ്പിക്കുന്നതിന് ടിഷ്യു കൾച്ചർ സിസ്റ്റം ഒരു പ്രോഗ്രാമബിൾ ന്യൂമാറ്റിക് ആക്യുവേറ്റർ (LB എഞ്ചിനീയറിംഗ്, ജർമ്മനി) ഉപയോഗിക്കുന്നു. ഒരു പ്രഷർ ട്രാൻസ്‌ഡ്യൂസർ വഴി സിസ്റ്റം ഒരു ബാഹ്യ എയർ ലൈനുമായി ബന്ധിപ്പിച്ചിരുന്നു, ഇത് മർദ്ദവും (± 1 mmHg) സമയവും (± 1 ms) കൃത്യമായി ക്രമീകരിക്കാൻ സാധ്യമാക്കി (ചിത്രം 1c).
a ഉപകരണത്തിന്റെ കൾച്ചർ ചേമ്പറിനുള്ളിൽ, നീല നിറത്തിൽ കാണിച്ചിരിക്കുന്ന 7 mm സപ്പോർട്ട് റിംഗിലേക്ക് ടിഷ്യു സെക്ഷൻ ഘടിപ്പിക്കുക. കൾച്ചർ ചേമ്പർ എയർ ചേമ്പറിൽ നിന്ന് ഒരു നേർത്ത ഫ്ലെക്സിബിൾ സിലിക്കൺ മെംബ്രൺ ഉപയോഗിച്ച് വേർതിരിച്ചിരിക്കുന്നു. ചോർച്ച തടയുന്നതിന് ഓരോ ചേമ്പറിനും ഇടയിൽ ഒരു ഗാസ്കറ്റ് സ്ഥാപിക്കുക. ഉപകരണത്തിന്റെ ലിഡിൽ വൈദ്യുത ഉത്തേജനം നൽകുന്ന ഗ്രാഫൈറ്റ് ഇലക്ട്രോഡുകൾ അടങ്ങിയിരിക്കുന്നു. b വലിയ ടിഷ്യു ഉപകരണം, ഗൈഡ് റിംഗ്, സപ്പോർട്ട് റിംഗ് എന്നിവയുടെ സ്കീമാറ്റിക് പ്രാതിനിധ്യം. ടിഷ്യു സെക്ഷനുകൾ (തവിട്ട്) ഉപകരണത്തിന്റെ പുറം അറ്റത്തുള്ള ഗ്രൂവിൽ ഗൈഡ് റിംഗ് സ്ഥാപിച്ചിരിക്കുന്ന വലുപ്പമുള്ള ഉപകരണത്തിൽ സ്ഥാപിച്ചിരിക്കുന്നു. ഗൈഡ് ഉപയോഗിച്ച്, ടിഷ്യു അക്രിലിക് പശ കൊണ്ട് പൊതിഞ്ഞ സപ്പോർട്ട് റിംഗ് കാർഡിയാക് ടിഷ്യുവിന്റെ ഭാഗത്തിന് മുകളിൽ ശ്രദ്ധാപൂർവ്വം സ്ഥാപിക്കുക. c പ്രോഗ്രാമബിൾ ന്യൂമാറ്റിക് ആക്യുവേറ്റർ (PPD) നിയന്ത്രിക്കുന്ന എയർ ചേമ്പർ മർദ്ദത്തിന്റെ പ്രവർത്തനമായി വൈദ്യുത ഉത്തേജനത്തിന്റെ സമയം കാണിക്കുന്ന ഗ്രാഫ്. പ്രഷർ സെൻസറുകൾ ഉപയോഗിച്ച് വൈദ്യുത ഉത്തേജനം സമന്വയിപ്പിക്കാൻ ഒരു ഡാറ്റ അക്വിസിഷൻ ഉപകരണം ഉപയോഗിച്ചു. കൾച്ചർ ചേമ്പറിലെ മർദ്ദം നിശ്ചിത പരിധിയിലെത്തുമ്പോൾ, വൈദ്യുത ഉത്തേജനം പ്രവർത്തനക്ഷമമാക്കുന്നതിന് C-PACE-EM-ലേക്ക് ഒരു പൾസ് സിഗ്നൽ അയയ്ക്കുന്നു. d ഒരു ഇൻകുബേറ്റർ ഷെൽഫിൽ സ്ഥാപിച്ചിരിക്കുന്ന നാല് CTCM-കളുടെ ചിത്രം. ഒരു ന്യൂമാറ്റിക് സർക്യൂട്ട് വഴി നാല് ഉപകരണങ്ങൾ ഒരു പിപിഡിയിലേക്ക് ബന്ധിപ്പിച്ചിരിക്കുന്നു, കൂടാതെ ന്യൂമാറ്റിക് സർക്യൂട്ടിലെ മർദ്ദം നിരീക്ഷിക്കുന്നതിന് പ്രഷർ സെൻസറുകൾ ഹെമോസ്റ്റാറ്റിക് വാൽവിലേക്ക് തിരുകുന്നു. ഓരോ ഉപകരണത്തിലും ആറ് ടിഷ്യു വിഭാഗങ്ങൾ അടങ്ങിയിരിക്കുന്നു.
ഒരൊറ്റ ന്യൂമാറ്റിക് ആക്യുവേറ്റർ ഉപയോഗിച്ച്, ഞങ്ങൾക്ക് 4 CTCM ഉപകരണങ്ങൾ നിയന്ത്രിക്കാൻ കഴിഞ്ഞു, അവയിൽ ഓരോന്നിനും 6 ടിഷ്യു ഭാഗങ്ങൾ ഉൾക്കൊള്ളാൻ കഴിയും (ചിത്രം 1d). CTCM-ൽ, എയർ ചേമ്പറിലെ വായു മർദ്ദം ദ്രാവക അറയിലെ സിൻക്രണസ് മർദ്ദമായി പരിവർത്തനം ചെയ്യപ്പെടുകയും ഹൃദയ സ്ലൈസിന്റെ ഫിസിയോളജിക്കൽ വികാസത്തിന് കാരണമാവുകയും ചെയ്യുന്നു (ചിത്രം 2a, സപ്ലിമെന്ററി മൂവി 1). 80 mm Hg-ൽ ടിഷ്യു സ്ട്രെച്ചിന്റെ വിലയിരുത്തൽ. കല. ടിഷ്യു വിഭാഗങ്ങളുടെ 25% സ്ട്രെച്ചിംഗ് കാണിച്ചു (ചിത്രം 2b). ഈ ശതമാനം സ്ട്രെച്ച് സാധാരണ കാർഡിയാക് സെക്ഷൻ സങ്കോചത്തിന് 2.2–2.3 µm എന്ന ഫിസിയോളജിക്കൽ സാർകോമെയർ നീളവുമായി പൊരുത്തപ്പെടുന്നതായി കാണിച്ചിരിക്കുന്നു. കസ്റ്റം ക്യാമറ ക്രമീകരണങ്ങൾ ഉപയോഗിച്ച് ടിഷ്യു ചലനം വിലയിരുത്തി (സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രം 1). ടിഷ്യു ചലനത്തിന്റെ വ്യാപ്തിയും വേഗതയും (ചിത്രം 2c, d) ഹൃദയ ചക്രത്തിലും സിസ്റ്റോളിലും ഡയസ്റ്റോളിലും ഉള്ള സമയവുമായി പൊരുത്തപ്പെടുന്നു (ചിത്രം 2b). സങ്കോചത്തിലും വിശ്രമത്തിലും ഹൃദയ കലകളുടെ സ്ട്രെച്ചും വേഗതയും സംസ്കാരത്തിൽ 12 ദിവസം സ്ഥിരമായി തുടർന്നു (ചിത്രം 2f). കൾച്ചർ സമയത്ത് സങ്കോചത്തിൽ വൈദ്യുത ഉത്തേജനത്തിന്റെ സ്വാധീനം വിലയിരുത്തുന്നതിന്, ഒരു ഷേഡിംഗ് അൽഗോരിതം ഉപയോഗിച്ച് സജീവമായ വൈകല്യം നിർണ്ണയിക്കുന്നതിനുള്ള ഒരു രീതി ഞങ്ങൾ വികസിപ്പിച്ചെടുത്തു (അനുബന്ധ ചിത്രം 2a,b) കൂടാതെ വൈദ്യുത ഉത്തേജനം ഉള്ളതും അല്ലാത്തതുമായ വൈകല്യങ്ങൾ തമ്മിൽ വേർതിരിച്ചറിയാൻ ഞങ്ങൾക്ക് കഴിഞ്ഞു. ഹൃദയത്തിന്റെ അതേ വിഭാഗം (ചിത്രം 2f). കട്ടിന്റെ ചലിക്കുന്ന മേഖലയിൽ (R6-9), വൈദ്യുത ഉത്തേജന സമയത്ത് വോൾട്ടേജ് വൈദ്യുത ഉത്തേജനത്തിന്റെ അഭാവത്തേക്കാൾ 20% കൂടുതലായിരുന്നു, ഇത് സങ്കോച പ്രവർത്തനത്തിന് വൈദ്യുത ഉത്തേജനത്തിന്റെ സംഭാവനയെ സൂചിപ്പിക്കുന്നു.
എയർ ചേമ്പർ മർദ്ദം, ഫ്ലൂയിഡ് ചേമ്പർ മർദ്ദം, ടിഷ്യു ചലന അളവുകൾ എന്നിവയുടെ പ്രതിനിധി ട്രെയ്‌സുകൾ, ചേമ്പർ മർദ്ദം ദ്രാവക ചേമ്പർ മർദ്ദത്തെ മാറ്റുന്നുവെന്നും, ടിഷ്യു സ്ലൈസിന്റെ അനുബന്ധ ചലനത്തിന് കാരണമാകുമെന്നും സ്ഥിരീകരിക്കുന്നു. b ശതമാനം സ്ട്രെച്ചിന് (ഓറഞ്ച്) അനുയോജ്യമായ ടിഷ്യു വിഭാഗങ്ങളുടെ ശതമാനം സ്ട്രെച്ചിന്റെ (നീല) പ്രതിനിധി ട്രെയ്‌സുകൾ. c കാർഡിയാക് സ്ലൈസിന്റെ അളന്ന ചലനം ചലനത്തിന്റെ അളന്ന വേഗതയുമായി പൊരുത്തപ്പെടുന്നു. (d) ഹൃദയത്തിന്റെ ഒരു സ്ലൈസിലെ ചാക്രിക ചലനത്തിന്റെയും (നീല രേഖ) വേഗതയുടെയും (ഓറഞ്ച് ഡോട്ടഡ് ലൈൻ) പ്രതിനിധി പാതകൾ. e സൈക്കിൾ സമയത്തിന്റെ അളവ് (വ്യത്യസ്ത പന്നികളിൽ നിന്ന് n = 19 കഷണങ്ങൾ), സങ്കോച സമയം (ഓരോ ഗ്രൂപ്പിലും n = 19 കഷണങ്ങൾ), വിശ്രമ സമയം (വ്യത്യസ്ത പന്നികളിൽ നിന്ന് n = 19 കഷണങ്ങൾ), ടിഷ്യു ചലനം (n = 25). വ്യത്യസ്ത പന്നികളിൽ നിന്നുള്ള കഷണങ്ങൾ)/ഗ്രൂപ്പ്), പീക്ക് സിസ്റ്റോളിക് വേഗത (n = 24(D0), വ്യത്യസ്ത പന്നികളിൽ നിന്നുള്ള 25(D12) കഷണങ്ങൾ/ഗ്രൂപ്പ്), പീക്ക് റിലാക്സേഷൻ നിരക്ക് (n=24(D0), വ്യത്യസ്ത പന്നികളിൽ നിന്നുള്ള 25(D12) കഷണങ്ങൾ/ഗ്രൂപ്പ്). ടു-ടെയിൽഡ് സ്റ്റുഡന്റ്‌സിന്റെ ടി-ടെസ്റ്റ് ഒരു പാരാമീറ്ററിലും കാര്യമായ വ്യത്യാസമൊന്നും കാണിച്ചില്ല. (ചുവപ്പ്) വൈദ്യുത ഉത്തേജനം ഉള്ളതും (നീല) ഇല്ലാത്തതുമായ ടിഷ്യു വിഭാഗങ്ങളുടെ പ്രതിനിധി സ്ട്രെയിൻ വിശകലനം, ഒരേ വിഭാഗത്തിൽ നിന്നുള്ള ടിഷ്യു വിഭാഗങ്ങളുടെ പത്ത് പ്രാദേശിക മേഖലകൾ. വ്യത്യസ്ത വിഭാഗങ്ങളിൽ നിന്നുള്ള പത്ത് മേഖലകളിൽ വൈദ്യുത ഉത്തേജനം ഉള്ളതും അല്ലാത്തതുമായ ടിഷ്യു വിഭാഗങ്ങളിലെ സ്ട്രെയിനിലെ ശതമാനം വ്യത്യാസത്തിന്റെ അളവ് താഴെയുള്ള പാനലുകൾ കാണിക്കുന്നു. (n = വ്യത്യസ്ത പന്നികളിൽ നിന്നുള്ള 8 കഷണങ്ങൾ/ഗ്രൂപ്പ്, രണ്ട് വാലുള്ള വിദ്യാർത്ഥി ടി-ടെസ്റ്റ് നടത്തുന്നു; ****p < 0.0001, **p < 0.01, *p < 0.05). (n = വ്യത്യസ്ത പന്നികളിൽ നിന്നുള്ള 8 കഷണങ്ങൾ/ഗ്രൂപ്പ്, രണ്ട് വാലുള്ള വിദ്യാർത്ഥി ടി-ടെസ്റ്റ് നടത്തുന്നു; ****p < 0.0001, **p < 0.01, *p < 0.05). (n = 8 വാക്യങ്ങൾ/ഗ്രൂപ്പുകളിൽ നിന്ന് റസ്‌നിഹ് സ്വീനെയ്, പ്രോവോഡിറ്റ്സ് ഡുസ്‌റ്റോറോൺനിയ് ടി-ക്രിതെറി സ്റ്റോർഡ് സെറ്റ്; (n = വ്യത്യസ്ത പന്നികളിൽ നിന്നുള്ള 8 വിഭാഗങ്ങൾ/ഗ്രൂപ്പ്, രണ്ട് വാലുള്ള വിദ്യാർത്ഥിയുടെ ടി-ടെസ്റ്റ്; ****p<0.0001, **p<0.01, *p<0.05). （n = 8 片/组,来自不同的猪,进行双尾学生t 检验；****p <0.0001,**p <0.01,*p <0.05） （n = 8 片/组,来自不同的猪,进行双尾学生t 检验；****p <0.0001,**p <0.01,*p <0.05） (n = 8 വാക്യങ്ങൾ/ഗ്രൂപ്പ്, യഥാക്രമം, ദ്വുസ്തൊരൊംനിഎ ക്രിതെര്യ് Стьюдента; ****p <0,0001, **p <0,01, *p <0,05). (n = 8 വിഭാഗങ്ങൾ/ഗ്രൂപ്പ്, വ്യത്യസ്ത പന്നികളിൽ നിന്ന്, രണ്ട് വാലുള്ള വിദ്യാർത്ഥിയുടെ ടി-ടെസ്റ്റ്; ****p<0.0001, **p<0.01, *p<0.05).പിശക് ബാറുകൾ ശരാശരി ± സ്റ്റാൻഡേർഡ് ഡീവിയേഷനെ പ്രതിനിധീകരിക്കുന്നു.
ഞങ്ങളുടെ മുൻ സ്റ്റാറ്റിക് ബയോമിമെറ്റിക് ഹാർട്ട് സ്ലൈസ് കൾച്ചർ സിസ്റ്റത്തിൽ [20, 21], വൈദ്യുത ഉത്തേജനം പ്രയോഗിച്ചും മീഡിയം കോമ്പോസിഷൻ ഒപ്റ്റിമൈസ് ചെയ്തും 6 ദിവസത്തേക്ക് ഹൃദയ സ്ലൈസുകളുടെ പ്രവർത്തനക്ഷമത, പ്രവർത്തനം, ഘടനാപരമായ സമഗ്രത എന്നിവ ഞങ്ങൾ നിലനിർത്തി. എന്നിരുന്നാലും, 10 ദിവസത്തിനുശേഷം, ഈ കണക്കുകൾ കുത്തനെ കുറഞ്ഞു. ഞങ്ങളുടെ മുൻ സ്റ്റാറ്റിക് ബയോമിമെറ്റിക് കൾച്ചർ സിസ്റ്റം 20, 21 നിയന്ത്രണ അവസ്ഥകളിൽ (Ctrl) കൾച്ചർ ചെയ്ത വിഭാഗങ്ങളെ ഞങ്ങൾ പരാമർശിക്കും, കൂടാതെ ഒരേസമയം മെക്കാനിക്കൽ, ഇലക്ട്രിക്കൽ ഉത്തേജനം (CTCM) പ്രകാരം MC അവസ്ഥകളായും കൾച്ചറായും മുമ്പ് ഒപ്റ്റിമൈസ് ചെയ്ത മീഡിയം ഞങ്ങൾ ഉപയോഗിക്കും. എന്ന് വിളിക്കുന്നു. ആദ്യം, വൈദ്യുത ഉത്തേജനം ഇല്ലാത്ത മെക്കാനിക്കൽ ഉത്തേജനം 6 ദിവസത്തേക്ക് ടിഷ്യു പ്രവർത്തനക്ഷമത നിലനിർത്താൻ പര്യാപ്തമല്ലെന്ന് ഞങ്ങൾ നിർണ്ണയിച്ചു (സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രം 3a,b). രസകരമെന്നു പറയട്ടെ, STCM ഉപയോഗിച്ച് ഫിസിയോ-മെക്കാനിക്കൽ, ഇലക്ട്രിക്കൽ ഉത്തേജനം അവതരിപ്പിച്ചതോടെ, 12 ദിവസത്തെ ഹൃദയ വിഭാഗങ്ങളുടെ പ്രവർത്തനക്ഷമത MS അവസ്ഥകളിൽ പുതിയ ഹൃദയ വിഭാഗങ്ങളിലെന്നപോലെ തുടർന്നു, പക്ഷേ MTT വിശകലനം കാണിക്കുന്നത് പോലെ Ctrl അവസ്ഥകളിൽ അല്ല. 3a). ഇത് സൂചിപ്പിക്കുന്നത് മെക്കാനിക്കൽ ഉത്തേജനവും കാർഡിയാക് സൈക്കിളിന്റെ സിമുലേഷനും നമ്മുടെ മുൻ സ്റ്റാറ്റിക് കൾച്ചർ സിസ്റ്റത്തിൽ റിപ്പോർട്ട് ചെയ്തതിനേക്കാൾ ഇരട്ടി കാലം ടിഷ്യു വിഭാഗങ്ങളെ പ്രവർത്തനക്ഷമമായി നിലനിർത്താൻ സഹായിക്കും എന്നാണ്. എന്നിരുന്നാലും, കാർഡിയാക് ട്രോപോണിൻ ടി, കണെക്സിൻ 43 എന്നിവയുടെ ഇമ്മ്യൂണോലേബലിംഗ് വഴി ടിഷ്യു വിഭാഗങ്ങളുടെ ഘടനാപരമായ സമഗ്രത വിലയിരുത്തിയപ്പോൾ, അതേ ദിവസത്തെ നിയന്ത്രണങ്ങളേക്കാൾ 12-ാം ദിവസം എംസി ടിഷ്യൂകളിൽ കണെക്സിൻ 43 എക്സ്പ്രഷൻ ഗണ്യമായി കൂടുതലായിരുന്നുവെന്ന് കാണിച്ചു. എന്നിരുന്നാലും, ഏകീകൃത കണെക്സിൻ 43 എക്സ്പ്രഷനും ഇസഡ്-ഡിസ്ക് രൂപീകരണവും പൂർണ്ണമായി നിലനിർത്തിയില്ല (ചിത്രം 3b). ടിഷ്യു ഘടനാപരമായ സമഗ്രത അളക്കാൻ ഞങ്ങൾ ഒരു കൃത്രിമ ബുദ്ധി (AI) ചട്ടക്കൂട് ഉപയോഗിക്കുന്നു, ട്രോപോണിൻ-ടി, കണെക്സിൻ സ്റ്റെയിനിംഗ് എന്നിവയെ അടിസ്ഥാനമാക്കിയുള്ള ഒരു ഇമേജ് അടിസ്ഥാനമാക്കിയുള്ള ആഴത്തിലുള്ള പഠന പൈപ്പ്ലൈൻ, പ്രാദേശികവൽക്കരണത്തിന്റെ ശക്തിയുടെ അടിസ്ഥാനത്തിൽ ഹൃദയ സ്ലൈസുകളുടെ ഘടനാപരമായ സമഗ്രതയും ഫ്ലൂറസെൻസും യാന്ത്രികമായി അളക്കുന്നു. റഫറൻസിൽ വിവരിച്ചിരിക്കുന്നതുപോലെ, കാർഡിയാക് ടിഷ്യുവിന്റെ ഘടനാപരമായ സമഗ്രതയെ ഓട്ടോമേറ്റഡ്, നിഷ്പക്ഷമായ രീതിയിൽ വിശ്വസനീയമായി അളക്കാൻ ഈ രീതി ഒരു കൺവല്യൂഷണൽ ന്യൂറൽ നെറ്റ്‌വർക്കും (CNN) ഒരു ആഴത്തിലുള്ള പഠന ചട്ടക്കൂടും ഉപയോഗിക്കുന്നു. 26. സ്റ്റാറ്റിക് കൺട്രോൾ വിഭാഗങ്ങളുമായി താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ MC ടിഷ്യു ദിവസം 0-ന് മെച്ചപ്പെട്ട ഘടനാപരമായ സമാനത കാണിച്ചു. കൂടാതെ, കൾച്ചറിന്റെ 12-ാം ദിവസത്തെ നിയന്ത്രണ സാഹചര്യങ്ങളുമായി താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ, മാസണിന്റെ ട്രൈക്രോം സ്റ്റെയിനിംഗ്, MS അവസ്ഥകളിൽ ഫൈബ്രോസിസിന്റെ ഗണ്യമായി കുറഞ്ഞ ശതമാനം വെളിപ്പെടുത്തി (ചിത്രം 3c). CTCM 12-ാം ദിവസം ഹൃദയ കലകളുടെ പ്രവർത്തനക്ഷമതയെ പുതിയ ഹൃദയ കലകളുടേതിന് സമാനമായ ഒരു തലത്തിലേക്ക് വർദ്ധിപ്പിച്ചെങ്കിലും, അത് ഹൃദയ ഭാഗങ്ങളിലെ ഘടനാപരമായ സമഗ്രതയെ കാര്യമായി മെച്ചപ്പെടുത്തിയില്ല.
സ്റ്റാറ്റിക് കൾച്ചറിൽ (D12 Ctrl) അല്ലെങ്കിൽ CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) വ്യത്യസ്ത പന്നികളിൽ നിന്നുള്ള സ്ലൈസുകൾ/ഗ്രൂപ്പിൽ 12 ദിവസത്തേക്ക് പുതിയ ഹാർട്ട് സ്ലൈസുകളുടെ (D0) അല്ലെങ്കിൽ ഹാർട്ട് സ്ലൈസുകൾ കൾച്ചറിന്റെ MTT പ്രവർത്തനക്ഷമതയുടെ അളവ് ഒരു ബാർ ഗ്രാഫ് കാണിക്കുന്നു, വൺ വേ ANOVA ടെസ്റ്റ് നടത്തുന്നു; ####p < 0.0001 താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ D0 ഉം **p < 0.01 താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ D12 Ctrl ഉം). സ്റ്റാറ്റിക് കൾച്ചറിൽ (D12 Ctrl) അല്ലെങ്കിൽ CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) വ്യത്യസ്ത പന്നികളിൽ നിന്നുള്ള സ്ലൈസുകൾ/ഗ്രൂപ്പിൽ 12 ദിവസത്തേക്ക് പുതിയ ഹാർട്ട് സ്ലൈസുകളുടെ (D0) അല്ലെങ്കിൽ ഹാർട്ട് സ്ലൈസുകൾ കൾച്ചറിന്റെ MTT പ്രവർത്തനക്ഷമതയുടെ അളവ് ഒരു ബാർ ഗ്രാഫ് കാണിക്കുന്നു, വൺ വേ ANOVA ടെസ്റ്റ് നടത്തുന്നു; ####p < 0.0001 താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ D0 ഉം **p < 0.01 താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ D12 Ctrl ഉം).സ്റ്റാറ്റിക് കൾച്ചർ (D12 കൺട്രോൾ) അല്ലെങ്കിൽ CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 കൺട്രോൾ) എന്നിവയിൽ 12 ദിവസത്തേക്ക് MTT ഫ്രഷ് ഹാർട്ട് സെക്ഷനുകളുടെ (D0) അല്ലെങ്കിൽ ഹാർട്ട് സെക്ഷനുകളുടെ കൾച്ചറിന്റെ പ്രവർത്തനക്ഷമതയുടെ അളവ് ഹിസ്റ്റോഗ്രാം കാണിക്കുന്നു. ) ), വ്യത്യസ്ത പന്നികളിൽ നിന്നുള്ള 12 (D12 MC) വിഭാഗങ്ങൾ/ഗ്രൂപ്പ്, ഒരു വൺ-വേ ANOVA പരിശോധന നടത്തുന്നു;####p <0,0001 по сравнению с D0 и **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p < 0.0001 മായി താരതമ്യം ചെയ്യുമ്പോൾ D0 ഉം **p < 0.01 മായി താരതമ്യം ചെയ്യുമ്പോൾ D12 Ctrl ഉം). എ或心脏切片培养12 天的MTT 活力的量化),来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行测试；与D0 相比,####p < 0.0001,与D12 Ctrl 相比,**p <0.01)。 എ ，来自不同猪的12 (D12 എംസി)സ്റ്റാറ്റിക് കൾച്ചർ (D12 കൺട്രോൾ) അല്ലെങ്കിൽ CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 കൺട്രോൾ)), 12 (D12 MC) വിഭാഗങ്ങൾ/ഗ്രൂപ്പ് എന്നിവയിൽ 12 ദിവസത്തേക്ക് കൾച്ചർ ചെയ്ത ഫ്രഷ് ഹാർട്ട് സെക്ഷനുകളിലെ (D0) അല്ലെങ്കിൽ ഹാർട്ട് സെക്ഷനുകളിലെ MTT പ്രവർത്തനക്ഷമതയുടെ അളവ് കാണിക്കുന്ന ഹിസ്റ്റോഗ്രാം, വ്യത്യസ്ത പന്നികളിൽ നിന്നുള്ള വൺ-വേ ANOVA ടെസ്റ്റ്;####p <0,0001 по сравнению с D0, **p <0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p < 0.0001 മായി താരതമ്യം ചെയ്യുമ്പോൾ D0, **p < 0.01 മായി താരതമ്യം ചെയ്യുമ്പോൾ D12 Ctrl).b പുതുതായി വേർതിരിച്ച ഹൃദയ വിഭാഗങ്ങളിൽ (D0) അല്ലെങ്കിൽ സ്റ്റാറ്റിക് അവസ്ഥകളിൽ (Ctrl) അല്ലെങ്കിൽ CTCM അവസ്ഥകളിൽ (MC) 12 ദിവസത്തേക്ക് കൾച്ചർ ചെയ്ത ഹൃദയ വിഭാഗങ്ങളിൽ (ബ്ലാങ്ക് സ്കെയിൽ = 100 µm) ട്രോപോണിൻ-ടി (പച്ച), കണെക്സിൻ 43 (ചുവപ്പ്), DAPI (നീല) എന്നിവ പ്രതിനിധാന ഇമ്മ്യൂണോഫ്ലൂറസെൻസ് ഇമേജുകളുടെ (ശൂന്യമായ സ്കെയിൽ = 100 µm) കൾച്ചർ ചെയ്തിരിക്കുന്നു. വ്യത്യസ്ത പന്നികളിൽ നിന്നുള്ള ഹൃദയ കലകളുടെ ഘടനാപരമായ സമഗ്രതയുടെ (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) സ്ലൈസുകൾ/ഗ്രൂപ്പ് എന്നിവയുടെ കൃത്രിമബുദ്ധി അളവ്, വൺ-വേ ANOVA പരിശോധന നടത്തുന്നു; ####p < 0.0001 താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ D0 ഉം ****p < 0.0001 താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ D12 Ctrl ഉം). വ്യത്യസ്ത പന്നികളിൽ നിന്നുള്ള ഹൃദയ കലകളുടെ ഘടനാപരമായ സമഗ്രതയുടെ (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) കഷണങ്ങൾ/ഗ്രൂപ്പ് എന്നിവയുടെ കൃത്രിമബുദ്ധി അളവ്, വൺ-വേ ANOVA പരിശോധന നടത്തുന്നു; ####p < 0.0001 D0 നെ അപേക്ഷിച്ച്, ****p < 0.0001 D12 Ctrl നെ അപേക്ഷിച്ച്). കൊളീച്ചെസ്‌റ്റ്‌വെന്നയ ഒസെങ്ക സ്‌ട്രൂക്‌ടൂർനോയ് സെർദെച്‌നോസ്‌റ്റി ഇൻസ്‌കൂസ്‌റ്റ്‌വെൻ്റിം ഇൻ്റലക്‌ടോം (n = 71Dl), (n = 71Dl), MC) സ്രെജൊവ്/ഗ്രൂപ്പ് ഓഫ് റസ്‌നിഷ് സ്വീനി, പ്രോവോഡിറ്റ്സ് ഓഡ്‌നോഫാക്‌ടോർണി ടെസ്‌റ്റ് അനോവ; ഡി 12 Ctrl എന്നതിലേക്ക് നോക്കുക). കൃത്രിമബുദ്ധി ഉപയോഗിച്ച് ഹൃദയ കലകളുടെ ഘടനാപരമായ സമഗ്രതയുടെ അളവ് നിർണ്ണയിക്കൽ (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) വ്യത്യസ്ത പന്നികളിൽ നിന്നുള്ള വിഭാഗങ്ങൾ/ഗ്രൂപ്പുകൾ, വൺ-വേ ANOVA പരിശോധന നടത്തി; ####p < 0.0001 vs. D0 ഉം ****p < 0.0001 ഉം D12 Ctrl നെ അപേക്ഷിച്ച്).人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) സ്ലൈസുകൾ/ഗ്രൂപ്പ് ഓരോന്നിനും വ്യത്യസ്ത പന്നികൾ, വൺ-വേ 1#00.相比,****p <0.0001 与D12 Ctrl 相比）。人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) സ്ലൈസുകൾ/ഗ്രൂപ്പ് ഓരോന്നിനും വ്യത്യസ്ത പന്നികൾ, വൺ-വേ 100 ടെസ്റ്റ്;与D0相比,****p <0.0001 与D12 Ctrl 相比）。 അസ്‌കുസ്‌റ്റ്‌വെൻ്റി ഇൻ്റലക്‌ട് ഡിലിയ കോളിചെസ്‌റ്റ്‌വെൻനോയ് ഒസ്‌റ്റേങ്കി സ്‌ട്രൂക്‌ടൂർനോയ് സെലോസ്‌റ്റ്‌നോസ്‌റ്റി സെർഡെക്‌നോയ് റ്റ്‌കാനി (120 എൽഡിഡി), (D12 MC) срезов/группу каждой из разных свиней, односторонний тест ANOVA; ####p <0,0001 വേഴ്സസ്. ഡി 12 Ctrl എന്നതിലേക്ക് നോക്കുക). കാർഡിയാക് ടിഷ്യുവിന്റെ ഘടനാപരമായ സമഗ്രത അളക്കുന്നതിനുള്ള കൃത്രിമബുദ്ധി (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) വിഭാഗങ്ങൾ/വ്യത്യസ്ത പന്നികളിൽ ഓരോന്നിന്റെയും ഗ്രൂപ്പ്, വൺ-വേ ANOVA ടെസ്റ്റ്; ####p<0.0001 vs .D0 താരതമ്യത്തിന് ****p < 0.0001 D12 Ctrl നെ അപേക്ഷിച്ച്). c മാസൺസ് ട്രൈക്രോം സ്റ്റെയിൻ (സ്കെയിൽ ബെയർ = 500 µm) ഉപയോഗിച്ച് കറ പുരണ്ട ഹൃദയ സ്ലൈസുകളുടെ പ്രതിനിധി ചിത്രങ്ങളും (ഇടത്) ക്വാണ്ടിഫിക്കേഷനും (വലത്) (വ്യത്യസ്ത പന്നികളിൽ നിന്നുള്ള n = 10 സ്ലൈസുകൾ/ഗ്രൂപ്പ് വീതം, വൺ-വേ ANOVA പരിശോധന നടത്തുന്നു; ####p < 0.0001 താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ D0 ഉം ***p < 0.001 താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ D12 Ctrl ഉം). c മാസൺസ് ട്രൈക്രോം സ്റ്റെയിൻ (സ്കെയിൽ ബെയർ = 500 µm) ഉപയോഗിച്ച് കറ പുരണ്ട ഹൃദയ സ്ലൈസുകളുടെ പ്രതിനിധി ചിത്രങ്ങളും (ഇടത്) ക്വാണ്ടിഫിക്കേഷനും (വലത്) (വ്യത്യസ്ത പന്നികളിൽ നിന്നുള്ള n = 10 സ്ലൈസുകൾ/ഗ്രൂപ്പ് വീതം, വൺ-വേ ANOVA ടെസ്റ്റ് നടത്തുന്നു; #### p < 0.0001 താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ D0 ഉം ***p < 0.001 താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ D12 Ctrl ഉം). c രെപ്രെസെൻ്റതിവ്ന്ыഎ ഇസോബ്രാജെനിയ (സ്ലേവ) കൂടാതെ കൊളിചെസ്ത്വെന്നയ ഒസെങ്ക (സ്പ്രാവ) സ്രെജൊവ് സെര്ദ്ത്സ, ഒക്രശെന്ы ക്രസിതെലെം മസോണ (മസ്തിഷ്ക പൊക്രിട്ടിയ = 500 എം.കെ.എം.) (n = 10 സ്രെസോവ്/ഗ്രുപ്പു അല്ലെങ്കിൽ മറ്റ് രാഷ്ട്രീയ, വ്യഞ്ജനങ്ങൾ тест ANOVA; #### p < 0,0001 по сравнению с D0 и ***p <0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c മാസൺസ് ട്രൈക്രോം സ്റ്റെയിൻ (അൺകോട്ടഡ് സ്കെയിൽ = 500 µm) ഉപയോഗിച്ച് കറ പുരണ്ട ഹൃദയഭാഗങ്ങളുടെ പ്രതിനിധാന ചിത്രങ്ങളും (ഇടത്) ക്വാണ്ടിഫിക്കേഷനും (വലത്) (n = വ്യത്യസ്ത പന്നികളിൽ നിന്നുള്ള 10 സെക്ഷൻസ്/ഗ്രൂപ്പ്, വൺ-വേ ANOVA ടെസ്റ്റ് നടത്തി; #### p < 0 .0001 D0 നെ അപേക്ഷിച്ച് ***p < 0.001 D12 നെ അപേക്ഷിച്ച് Ctrl). c 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像（左）和量化（創）（裸=5 10 个切片/组，每组来自不同的猪，进行单向ANOVA 测试；### p < 0.0001 与D0 相比, 20001 സി.ഡി. 相比). C 用 മാസൻ 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 （左 左） 量化 （右裸尺度 = 500 µm） （n = 10 个 切片 组 每 组 来自 不同 猪 ， 进行 单向 单 0.0001 与D0 相比，***p <0.001 与D12 Ctrl 相比）。 c രെപ്രെസെൻ്റതിവ്ന്ыഎ ഇസോബ്രാജെനിയ (സ്ലേവ) കൂടാതെ കൊളിചെസ്ത്വെംന്ыയ് അനലിസ് (സ്പ്രാവ) സ്രെജൊവ് സെര്ദ്ത്സ, ഒക്രശെംന്ыമ്യ് ക്രാസിറ്റേലം മാസോന (ചിസ്തയ ശകല = 500 എം.കെ.എം.) (n = 10 വിസ്തീർണ്ണം/ഗ്രൂപ്പ, കജ്ഹ്ഡിയിൽ നിന്ന് ഡ്രൂഗോയ് സ്വീംസ്, പ്രോസ്‌റ്റേസ് ഒദ്നൊഫക്തൊര്നൊഗൊ дисперсионного анализа ;### #p <0,0001 по сравнению с D0, ***p <0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c മാസൺസ് ട്രൈക്രോം സ്റ്റെയിൻ (ശൂന്യം = 500 µm) ഉപയോഗിച്ച് കറ പുരണ്ട ഹൃദയഭാഗങ്ങളുടെ പ്രതിനിധാന ചിത്രങ്ങളും (ഇടത്) ക്വാണ്ടിറ്റേഷനും (വലത്) (n = 10 സെക്ഷൻസ്/ഗ്രൂപ്പ്, ഓരോന്നും വ്യത്യസ്ത പന്നികളിൽ നിന്ന്, വേരിയൻസിന്റെ വൺ-വേ വിശകലനം ഉപയോഗിച്ച് പരിശോധിച്ചു;### # p < 0.0001 താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ D0, ***p < 0.001 താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ D12 Ctrl).പിശക് ബാറുകൾ ശരാശരി ± സ്റ്റാൻഡേർഡ് ഡീവിയേഷനെ പ്രതിനിധീകരിക്കുന്നു.
കൾച്ചർ മീഡിയത്തിലേക്ക് ചെറിയ തന്മാത്രകൾ ചേർക്കുന്നതിലൂടെ, CTCM കൾച്ചർ സമയത്ത് കാർഡിയോമയോസൈറ്റ് സമഗ്രത മെച്ചപ്പെടുത്താനും ഫൈബ്രോസിസ് വികസനം കുറയ്ക്കാനും കഴിയുമെന്ന് ഞങ്ങൾ അനുമാനിച്ചു. അതിനാൽ, ചെറിയ എണ്ണം ആശയക്കുഴപ്പമുണ്ടാക്കുന്ന ഘടകങ്ങൾ കാരണം ഞങ്ങളുടെ സ്റ്റാറ്റിക് കൺട്രോൾ കൾച്ചറുകൾ20,21 ഉപയോഗിച്ച് ചെറിയ തന്മാത്രകൾക്കായി ഞങ്ങൾ സ്‌ക്രീൻ ചെയ്തു. ഡെക്‌സമെതസോൺ (ഡെക്‌സ്), ട്രയോഡൊഥൈറോണിൻ (ടി3), എസ്‌ബി431542 (എസ്‌ബി) എന്നിവയാണ് ഈ സ്‌ക്രീനിനായി തിരഞ്ഞെടുത്തത്. സാർകോമെയർ നീളം, ടി-ട്യൂബ്യൂളുകൾ, ചാലക വേഗത എന്നിവ വർദ്ധിപ്പിച്ച് കാർഡിയോമയോസൈറ്റുകളുടെ പക്വതയെ പ്രേരിപ്പിക്കുന്നതിന് ഈ ചെറിയ തന്മാത്രകൾ മുമ്പ് ഹൈപിഎസ്‌സി-സിഎം കൾച്ചറുകളിൽ ഉപയോഗിച്ചിട്ടുണ്ട്. കൂടാതെ, ഡെക്‌സും (ഒരു ഗ്ലൂക്കോകോർട്ടിക്കോയിഡ്) എസ്‌ബിയും വീക്കം അടിച്ചമർത്തുമെന്ന് അറിയപ്പെടുന്നു29,30. അതിനാൽ, ഈ ചെറിയ തന്മാത്രകളുടെ ഒന്നോ സംയോജനമോ ഉൾപ്പെടുത്തുന്നത് ഹൃദയ വിഭാഗങ്ങളുടെ ഘടനാപരമായ സമഗ്രത മെച്ചപ്പെടുത്തുമോ എന്ന് ഞങ്ങൾ പരിശോധിച്ചു. പ്രാരംഭ സ്‌ക്രീനിങ്ങിനായി, സെൽ കൾച്ചർ മോഡലുകളിൽ സാധാരണയായി ഉപയോഗിക്കുന്ന സാന്ദ്രതകളെ അടിസ്ഥാനമാക്കിയാണ് ഓരോ സംയുക്തത്തിന്റെയും അളവ് തിരഞ്ഞെടുത്തത് (1 μM Dex27, 100 nM T327, 2.5 μM SB31). 12 ദിവസത്തെ കൾച്ചറിനുശേഷം, T3, Dex എന്നിവയുടെ സംയോജനം കാർഡിയോമയോസൈറ്റ് ഘടനാപരമായ സമഗ്രതയ്ക്കും കുറഞ്ഞ നാരുകളുള്ള പുനർനിർമ്മാണത്തിനും കാരണമായി (അനുബന്ധ ചിത്രങ്ങൾ 4 ഉം 5 ഉം). കൂടാതെ, T3, Dex എന്നിവയുടെ ഇരട്ടിയോ ഇരട്ടിയോ സാന്ദ്രത ഉപയോഗിക്കുന്നത് സാധാരണ സാന്ദ്രതകളെ അപേക്ഷിച്ച് ദോഷകരമായ ഫലങ്ങൾ ഉണ്ടാക്കി (അനുബന്ധ ചിത്രം 6a,b).
പ്രാരംഭ സ്ക്രീനിംഗിന് ശേഷം, ഞങ്ങൾ 4 കൾച്ചർ അവസ്ഥകളുടെ ഒരു ഹെഡ്-ടു-ഹെഡ് താരതമ്യം നടത്തി (ചിത്രം 4a): Ctrl: ഞങ്ങളുടെ ഒപ്റ്റിമൈസ് ചെയ്ത മീഡിയം ഉപയോഗിച്ച് മുമ്പ് വിവരിച്ച സ്റ്റാറ്റിക് കൾച്ചറിൽ കൾച്ചർ ചെയ്ത ഹൃദയ വിഭാഗങ്ങൾ; 20.21 TD: ബുധനാഴ്ച T3 ഉം Ctrl s ആഡ്ഡ് ഡെക്സും; MC: ഞങ്ങളുടെ മുമ്പ് ഒപ്റ്റിമൈസ് ചെയ്ത മീഡിയം ഉപയോഗിച്ച് CTCM ൽ കൾച്ചർ ചെയ്ത ഹൃദയ വിഭാഗങ്ങൾ; കൂടാതെ MT: മീഡിയത്തിൽ T3 ഉം ഡെക്സും ചേർത്ത CTCM. 12 ദിവസത്തെ കൃഷിക്ക് ശേഷവും, MS, MT ടിഷ്യൂകളുടെ പ്രവർത്തനക്ഷമത MTT അസ്സേ വിലയിരുത്തിയ പുതിയ ടിഷ്യൂകളിലെ പോലെ തന്നെ തുടർന്നു (ചിത്രം 4b). രസകരമെന്നു പറയട്ടെ, ട്രാൻസ്‌വെൽ കൾച്ചറുകളിൽ (TD) T3 ഉം ഡെക്സും ചേർത്തത് Ctrl അവസ്ഥകളുമായി താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ പ്രവർത്തനക്ഷമതയിൽ കാര്യമായ പുരോഗതി ഉണ്ടാക്കിയില്ല, ഇത് ഹൃദയ വിഭാഗങ്ങളുടെ പ്രവർത്തനക്ഷമത നിലനിർത്തുന്നതിൽ മെക്കാനിക്കൽ ഉത്തേജനത്തിന്റെ പ്രധാന പങ്ക് സൂചിപ്പിക്കുന്നു.
12 ദിവസത്തേക്ക് മീഡിയത്തിൽ മെക്കാനിക്കൽ ഉത്തേജനത്തിന്റെയും T3/Dex സപ്ലിമെന്റേഷന്റെയും ഫലങ്ങൾ വിലയിരുത്താൻ ഉപയോഗിക്കുന്ന നാല് കൾച്ചർ അവസ്ഥകളെ ചിത്രീകരിക്കുന്ന ഒരു പരീക്ഷണാത്മക ഡിസൈൻ ഡയഗ്രം. b വ്യത്യസ്ത പന്നികളിൽ നിന്നുള്ള പുതിയ ഹൃദയ കഷ്ണങ്ങൾ (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD, D12 MT), 12 (D12 MC) കഷ്ണങ്ങൾ/ഗ്രൂപ്പുകളുമായി താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ, 4 കൾച്ചർ അവസ്ഥകളിലും (Ctrl, TD, MC, MT) 12 ദിവസത്തെ കൾച്ചർ ശേഷമുള്ള പ്രവർത്തനക്ഷമതയുടെ അളവ് ബാർ ഗ്രാഫ് കാണിക്കുന്നു, വൺ-വേ ANOVA പരിശോധന നടത്തുന്നു; ###p < 0.0001, ###p < 0.001 D0 നെ അപേക്ഷിച്ച്, **p < 0.01 D12 Ctrl നെ അപേക്ഷിച്ച്). b വ്യത്യസ്ത പന്നികളിൽ നിന്നുള്ള പുതിയ ഹൃദയ കഷ്ണങ്ങൾ (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD, D12 MT), 12 (D12 MC) കഷ്ണങ്ങൾ/ഗ്രൂപ്പുകളുമായി താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ, 4 കൾച്ചർ അവസ്ഥകളിലും (Ctrl, TD, MC, MT) 12 ദിവസത്തെ കൾച്ചർ ശേഷമുള്ള പ്രവർത്തനക്ഷമതയുടെ അളവ് ബാർ ഗ്രാഫ് കാണിക്കുന്നു, വൺ-വേ ANOVA പരിശോധന നടത്തുന്നു; ###p < 0.0001, ###p < 0.001 D0 നെ അപേക്ഷിച്ച്, **p < 0.01 D12 ctrl നെ അപേക്ഷിച്ച്). b ജിസ്‌റ്റോഗ്രമ്മ പൊക്കസ്‌വീറ്റ് കോളിചെസ്‌റ്റ്‌വെന്നു ഒസെങ്കു ജിസ്‌നെസ്‌പോസോബ്‌നോസ്‌തി ചെറസ് 12 ദിവസം പോസ്‌ലെ ക്ലോസ്‌റ്റ്വി4 условиях культивирования (കോൺട്രോൾ, TD, MC , MT) പോൾ സ്രവണിയൂ സ്സോ സ്വേജിമി സെർഡ്സാമി സെർഡ്സാ (D0) (n = 125 и D12 MT), 12 (D12 MC) സ്രെജൊവ്/ഗ്രുപ്പു ഒത് രജ്ന്ыഹ് സ്വിനെയ്, പ്രൊവൊദ്യ്ത്സ്യ ഒദ്നൊസ്തൊരൊംയ് ടെസ്റ്റ് ANOVA; ####p <0,0001, ###p <0,001 по сравнению с D0 и **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). b വ്യത്യസ്ത പന്നികളിൽ നിന്നുള്ള പുതിയ ഹൃദയ വിഭാഗങ്ങൾ (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD, D12 MT), 12 (D12 MC) വിഭാഗങ്ങൾ/ഗ്രൂപ്പുകളുമായി താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ, 12 ദിവസത്തെ കൾച്ചർ അവസ്ഥകളിലെ (കൺട്രോൾ, TD, MC, MT) കൾച്ചറിന് ശേഷമുള്ള പ്രവർത്തനക്ഷമതയുടെ അളവ് ബാർ ഗ്രാഫ് കാണിക്കുന്നു, വൺ-വേ ANOVA ടെസ്റ്റ്; ####p < 0.0001, ###p < 0.001 vs. D0 and **p < 0.01 by താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ D12 Ctrl). b Ctrl、D12 TD 和D12 MT), 来自不同猪的12 (D12 MC)相比，**p <0.01 与D12控制).ബി 4 12 (ഡി 12 എംസി) ബി ഗൈസ്‌റ്റോഗ്രമ്മ, പോക്കസിവയസ് 4 ഉസ്‌ലോവിയ കുൽത്തിവിറോവനിയ (കോൺട്രോൾ, ടിഡി, എംസി, എംടി) സെർഡ്സാ (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD и D12 MT), റസ്‌നിഹ് സ്വീനി 12 (D12 MC) മുതൽ <0,0001, ###p <0,001 по сравнению с D0, **p <0,01 по сравнению с контролем D12). b വ്യത്യസ്ത പന്നികളിൽ നിന്നുള്ള 12 (D12 MC) വിഭാഗങ്ങൾ/ഗ്രൂപ്പ്, വൺ-വേ ANOVA ടെസ്റ്റ്; ####p<0.0001, ###p<0.001 vs. D0, **p<0.01 vs. control D12) എന്നിവയുമായി താരതമ്യം ചെയ്യുമ്പോൾ 4 കൾച്ചർ അവസ്ഥകളും (കൺട്രോൾ, TD, MC, MT) കാണിക്കുന്ന ഹിസ്റ്റോഗ്രാം. പുതിയ ഹൃദയ വിഭാഗങ്ങൾ (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD, D12 MT) c ബാർ ഗ്രാഫ്, 4 കൾച്ചർ അവസ്ഥകളിലും (Ctrl, TD, MC, MT) കൾച്ചർ ചെയ്തതിന് ശേഷമുള്ള 12 ദിവസത്തെ ഗ്ലൂക്കോസ് ഫ്ലക്സിന്റെ അളവ് പുതിയ ഹൃദയ സ്ലൈസുകളുമായി (D0) താരതമ്യം ചെയ്യുമ്പോൾ കാണിക്കുന്നു (n = വ്യത്യസ്ത പന്നികളിൽ നിന്നുള്ള 6 സ്ലൈസുകൾ/ഗ്രൂപ്പ്, വൺ-വേ ANOVA ടെസ്റ്റ് നടത്തുന്നു; ###p < 0.001, D0 യുമായി താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ ***p < 0.001, D12 Ctrl മായി താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ). c ബാർ ഗ്രാഫ്, 4 കൾച്ചർ അവസ്ഥകളിലും (Ctrl, TD, MC, MT) കൾച്ചർ ചെയ്തതിന് ശേഷമുള്ള 12 ദിവസത്തെ ഗ്ലൂക്കോസ് ഫ്ലക്സിന്റെ അളവ് പുതിയ ഹൃദയ സ്ലൈസുകളുമായി (D0) താരതമ്യം ചെയ്യുമ്പോൾ കാണിക്കുന്നു (n = വ്യത്യസ്ത പന്നികളിൽ നിന്നുള്ള 6 സ്ലൈസുകൾ/ഗ്രൂപ്പ്, വൺ-വേ ANOVA ടെസ്റ്റ് നടത്തുന്നു; ###p < 0.001, D0 യുമായി താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ ***p < 0.001, D12 Ctrl മായി താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ). c ഗൈസ്‌റ്റോഗ്രമ്മ പൊക്കസ്‌വീറ്റ് കോളിചെസ്‌റ്റ്‌വെന്നു ഒസെങ്കു പോട്ടോക ഗ്ലൂക്കോസ് ചെറസ് 12 ദിവസം പോസ്‌ലെ കോൾട്ടിവിറോവ്4 условиях культивирования (കോൺട്രോൾ, TD, MC , MT) പോൾ സ്രവ്നെനിഷും സ്വെജിമി സെർഡ്സാമി സെർഡ്സ് (D0) (n = 6 റസ്നിഹ് സ്വീനി, ഒദ്നൊസ്തൊരൊംന്ыയ് വ്ыപൊല്ംയെത്സ്യ ടെസ്ത് അനൊവ; ###p < 0,001 по сравнению с D0 и ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c കൾച്ചർ അവസ്ഥകളിൽ 12 ദിവസത്തെ ഗ്ലൂക്കോസ് ഫ്ലക്സിന്റെ അളവ് 4 കൾച്ചർ അവസ്ഥകളിലും (കൺട്രോൾ, ടിഡി, എംസി, എംടി) പുതിയ ഹൃദയ വിഭാഗങ്ങളുമായി (D0) താരതമ്യം ചെയ്യുമ്പോൾ ഹിസ്റ്റോഗ്രാം കാണിക്കുന്നു (n = വ്യത്യസ്ത പന്നികളിൽ നിന്നുള്ള 6 വിഭാഗങ്ങൾ/ഗ്രൂപ്പ്, വൺ-വേ ANOVA പരിശോധന നടത്തി; ###p < 0.001 താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ D0 ഉം ***p < 0.001 താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ D12 Ctrl ഉം). c 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD,MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0)天的葡萄糖通量定量（n = 6 片/组，来自不同猪，单向执行ANOVA 测试0.001 与D12 Ctrl 相比). C 条形图 显示 所有 4 种 条件കൂടാതെ测试；###p < 0.001,与D0 相比，***p <0.001 与D12 Ctrl 相比）。 സി ഗിസ്റ്റോഗ്രമ്മ, പൊകജ്ыവയുത്സ്യ കൊളിചെസ്ത്വെംനുയു ഒസെന്കു പൊതൊക ഗ്ലൂക്കോസി ചെരെസ് 12 ദിവസം പോസ്റ്റുകൾ കുല്ദ്൪ ഉസ്‌ലോവിയ് കുല്തിവിറോവനിയ (കോൺട്രോൾ, ടിഡി, എംസി, എംടി) പോൾ സ്‌വേജിമി സെർസാമി സെർഡ്‌സ (ഡി0) (n = 6 റസ്നിഹ് സ്വീനി, ഒദ്നൊസ്തൊരൊംന്ыയ് ബൈലി പ്രൊവെദെന്ы തെസ്ത്ы ANOVA; ###p <0,001 по сравнению с D0, ***p <0,001 по сравнению с D12 (контроль). c കൾച്ചർ ചെയ്ത 4 അവസ്ഥകൾക്കും (നിയന്ത്രണം, TD, MC, MT) കൾച്ചറിന് 12 ദിവസത്തെ ഗ്ലൂക്കോസ് ഫ്ലക്സിന്റെ അളവ് കാണിക്കുന്ന ഹിസ്റ്റോഗ്രാം, പുതിയ ഹൃദയ വിഭാഗങ്ങളുമായി (D0) താരതമ്യം ചെയ്യുമ്പോൾ (n = 6 വിഭാഗങ്ങൾ/ഗ്രൂപ്പ്, വ്യത്യസ്ത പന്നികളിൽ നിന്ന്, ഏകപക്ഷീയമായ ANOVA പരിശോധനകൾ നടത്തിയിരുന്നോ, ###p < 0.001 താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ D0, ***p < 0.001 താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ D12 (നിയന്ത്രണം).d പത്ത് പ്രാദേശിക ടിഷ്യു സെക്ഷൻ പോയിന്റുകളിലെ പുതിയ (നീല), ദിവസം 12 MC (പച്ച), ദിവസം 12 MT (ചുവപ്പ്) ടിഷ്യൂകളുടെ സ്ട്രെയിൻ വിശകലന പ്ലോട്ടുകൾ (n = 4 സ്ലൈസുകൾ/ഗ്രൂപ്പ്, വൺ-വേ ANOVA ടെസ്റ്റ്; ഗ്രൂപ്പുകൾക്കിടയിൽ കാര്യമായ വ്യത്യാസമൊന്നുമില്ല). e സ്റ്റാറ്റിക് അവസ്ഥകളിൽ (Ctrl) അല്ലെങ്കിൽ MT അവസ്ഥകളിൽ (MT) 10-12 ദിവസത്തേക്ക് കൾച്ചർ ചെയ്ത ഹൃദയ വിഭാഗങ്ങളുമായി താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ പുതിയ ഹൃദയ വിഭാഗങ്ങളിൽ (D0) വ്യത്യസ്തമായി പ്രകടിപ്പിക്കപ്പെട്ട ജീനുകൾ കാണിക്കുന്ന അഗ്നിപർവ്വത പ്ലോട്ട്. ഓരോ കൾച്ചർ സാഹചര്യങ്ങളിലും കൾച്ചർ ചെയ്ത ഹൃദയ വിഭാഗങ്ങൾക്കായുള്ള സാർകോമെയർ ജീനുകളുടെ ഹീറ്റ്മാപ്പ്. പിശക് ബാറുകൾ ശരാശരി ± സ്റ്റാൻഡേർഡ് ഡീവിയേഷനെ പ്രതിനിധീകരിക്കുന്നു.
ഫാറ്റി ആസിഡ് ഓക്‌സിഡേഷനിൽ നിന്ന് ഗ്ലൈക്കോളിസിസിലേക്കുള്ള മാറ്റത്തെ ഉപാപചയ ആശ്രയത്വം കാർഡിയോമയോസൈറ്റ് ഡീഡിഫറൻഷ്യേഷന്റെ ഒരു മുഖമുദ്രയാണ്. പക്വതയില്ലാത്ത കാർഡിയോമയോസൈറ്റുകൾ പ്രധാനമായും ATP ഉൽപാദനത്തിനായി ഗ്ലൂക്കോസ് ഉപയോഗിക്കുന്നു, കൂടാതെ കുറച്ച് ക്രിസ്റ്റേ ഉള്ള ഹൈപ്പോപ്ലാസ്റ്റിക് മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയയും ഉണ്ട്5,32. ഗ്ലൂക്കോസ് ഉപയോഗ വിശകലനങ്ങൾ കാണിക്കുന്നത് MC, MT സാഹചര്യങ്ങളിൽ, ഗ്ലൂക്കോസ് ഉപയോഗം 0 ദിവസത്തെ ടിഷ്യുകളിലേതിന് സമാനമാണെന്ന് (ചിത്രം 4c). എന്നിരുന്നാലും, പുതിയ ടിഷ്യുവിനെ അപേക്ഷിച്ച് Ctrl സാമ്പിളുകൾ ഗ്ലൂക്കോസ് ഉപയോഗത്തിൽ ഗണ്യമായ വർദ്ധനവ് കാണിച്ചു. CTCM, T3/Dex എന്നിവയുടെ സംയോജനം ടിഷ്യുവിന്റെ പ്രവർത്തനക്ഷമത വർദ്ധിപ്പിക്കുകയും 12 ദിവസത്തെ കൾച്ചർ ചെയ്ത ഹൃദയ വിഭാഗങ്ങളുടെ ഉപാപചയ ഫിനോടൈപ്പ് സംരക്ഷിക്കുകയും ചെയ്യുന്നുവെന്ന് ഇത് സൂചിപ്പിക്കുന്നു. കൂടാതെ, MT, MS അവസ്ഥകളിൽ 12 ദിവസത്തേക്ക് പുതിയ ഹൃദയ കോശങ്ങളിലെ പോലെ തന്നെ സ്‌ട്രെയിൻ ലെവലുകൾ തുടരുന്നുവെന്ന് സ്‌ട്രെയിൻ വിശകലനം കാണിച്ചു (ചിത്രം 4d).
കാർഡിയാക് സ്ലൈസ് ടിഷ്യുവിന്റെ ആഗോള ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷണൽ ലാൻഡ്‌സ്കേപ്പിൽ CTCM, T3/Dex എന്നിവയുടെ മൊത്തത്തിലുള്ള സ്വാധീനം വിശകലനം ചെയ്യുന്നതിനായി, നാല് വ്യത്യസ്ത കൾച്ചർ അവസ്ഥകളിൽ നിന്നുമുള്ള കാർഡിയാക് സ്ലൈസുകളിൽ ഞങ്ങൾ RNAseq നടത്തി (സപ്ലിമെന്ററി ഡാറ്റ 1). രസകരമെന്നു പറയട്ടെ, MT വിഭാഗങ്ങൾ പുതിയ ഹൃദയ കലകളുമായി ഉയർന്ന ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷണൽ സാമ്യം കാണിച്ചു, 13,642 ജീനുകളിൽ 16 എണ്ണം മാത്രമേ വ്യത്യസ്തമായി പ്രകടിപ്പിച്ചിട്ടുള്ളൂ. എന്നിരുന്നാലും, ഞങ്ങൾ നേരത്തെ കാണിച്ചതുപോലെ, Ctrl സ്ലൈസുകൾ കൾച്ചറിൽ 10-12 ദിവസങ്ങൾക്ക് ശേഷം 1229 വ്യത്യസ്തമായി പ്രകടിപ്പിച്ച ജീനുകൾ പ്രദർശിപ്പിച്ചു (ചിത്രം 4e). ഹൃദയത്തിന്റെയും ഫൈബ്രോബ്ലാസ്റ്റ് ജീനുകളുടെയും qRT-PCR വഴി ഈ ഡാറ്റ സ്ഥിരീകരിച്ചു (സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രം 7a-c). രസകരമെന്നു പറയട്ടെ, Ctrl വിഭാഗങ്ങൾ കാർഡിയാക്, സെൽ സൈക്കിൾ ജീനുകളുടെ നിയന്ത്രണം കുറയ്ക്കുന്നതും കോശ ചക്ര ജീനുകളുടെ സജീവമാക്കലും കാണിച്ചു. ദീർഘകാല കൾച്ചറിംഗിന് ശേഷം സാധാരണയായി സംഭവിക്കുന്ന ഡീഡിഫറൻഷ്യേഷൻ MT സാഹചര്യങ്ങളിൽ പൂർണ്ണമായും ദുർബലമാകുമെന്ന് ഈ ഡാറ്റ സൂചിപ്പിക്കുന്നു (സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രം 8a,b). സാർകോമെർ ജീനുകളെക്കുറിച്ചുള്ള ശ്രദ്ധാപൂർവ്വമായ പഠനം കാണിക്കുന്നത് MT സാഹചര്യങ്ങളിൽ മാത്രമേ സാർകോമെറിനെ (ചിത്രം 4f) എൻകോഡ് ചെയ്യുന്ന ജീനുകളും (അനുബന്ധ ചിത്രം 9) Ctrl, TD, MC അവസ്ഥകളിൽ അടിച്ചമർത്തലിൽ നിന്ന് സംരക്ഷിക്കുന്ന അയോൺ ചാനലും (അനുബന്ധ ചിത്രം 9) സംരക്ഷിക്കപ്പെടുന്നുള്ളൂ എന്നാണ്. മെക്കാനിക്കൽ, ഹ്യൂമറൽ ഉത്തേജനം (T3/Dex) എന്നിവയുടെ സംയോജനത്തിലൂടെ, കൾച്ചറിൽ 12 ദിവസത്തിനുശേഷം ഹാർട്ട് സ്ലൈസ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റോമിന് പുതിയ ഹാർട്ട് സ്ലൈസുകൾക്ക് സമാനമായി തുടരാൻ കഴിയുമെന്ന് ഈ ഡാറ്റ തെളിയിക്കുന്നു.
ഹൃദയ വിഭാഗങ്ങളിലെ കാർഡിയോമയോസൈറ്റുകളുടെ ഘടനാപരമായ സമഗ്രത 12 ദിവസത്തേക്ക് MT സാഹചര്യങ്ങളിൽ ഏറ്റവും നന്നായി സംരക്ഷിക്കപ്പെടുന്നു എന്ന വസ്തുത ഈ ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷണൽ കണ്ടെത്തലുകളെ പിന്തുണയ്ക്കുന്നു, ഇത് കേടുകൂടാതെ പ്രാദേശികവൽക്കരിച്ച കണെക്സിൻ 43 (ചിത്രം 5a) കാണിക്കുന്നു. കൂടാതെ, MT സാഹചര്യങ്ങളിൽ ഹൃദയ വിഭാഗങ്ങളിലെ ഫൈബ്രോസിസ് Ctrl നെ അപേക്ഷിച്ച് ഗണ്യമായി കുറഞ്ഞു, പുതിയ ഹൃദയ വിഭാഗങ്ങൾക്ക് സമാനമാണ് (ചിത്രം 5b). മെക്കാനിക്കൽ ഉത്തേജനത്തിന്റെയും T3/Dex ചികിത്സയുടെയും സംയോജനം സംസ്കാരത്തിലെ ഹൃദയ വിഭാഗങ്ങളിലെ ഹൃദയ ഘടനയെ ഫലപ്രദമായി സംരക്ഷിക്കുന്നുവെന്ന് ഈ ഡാറ്റ തെളിയിക്കുന്നു.
പുതുതായി വേർതിരിച്ച ഹൃദയ വിഭാഗങ്ങളിൽ (D0) ട്രോപോണിൻ-ടി (പച്ച), കണെക്സിൻ 43 (ചുവപ്പ്), ഡിഎപിഐ (നീല) എന്നിവയുടെ ഒരു പ്രതിനിധി ഇമ്മ്യൂണോഫ്ലൂറസെൻസ് ചിത്രങ്ങൾ അല്ലെങ്കിൽ നാല് ഹൃദയ വിഭാഗ കൾച്ചർ അവസ്ഥകളിലും 12 ദിവസത്തേക്ക് കൾച്ചർ ചെയ്തു (സ്കെയിൽ ബാർ = 100 µm). ). വ്യത്യസ്ത പന്നികളിൽ നിന്നുള്ള ഹൃദയ കലകളുടെ ഘടനാപരമായ സമഗ്രത (n = 7 (D0, D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC, D12 MT) സ്ലൈസുകൾ/ഗ്രൂപ്പിന്റെ കൃത്രിമബുദ്ധി അളവ്, വൺ-വേ ANOVA പരിശോധന നടത്തുന്നു; ####p < 0.0001 D0 നെ അപേക്ഷിച്ച് *p < 0.05, അല്ലെങ്കിൽ ****p < 0.0001 D12 Ctrl നെ അപേക്ഷിച്ച്). വ്യത്യസ്ത പന്നികളിൽ നിന്നുള്ള ഹൃദയ കലകളുടെ ഘടനാപരമായ സമഗ്രത (n = 7 (D0, D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC, D12 MT) സ്ലൈസുകൾ/ഗ്രൂപ്പിന്റെ കൃത്രിമബുദ്ധി അളവ്, വൺ-വേ ANOVA പരിശോധന നടത്തുന്നു; #### p < 0.0001 D0 നെ അപേക്ഷിച്ച് *p < 0.05, അല്ലെങ്കിൽ ****p < 0.0001 D12 Ctrl നെ അപേക്ഷിച്ച്). കൊളിചെസ്‌റ്റ്‌വെന്നയാ ഒഷെങ്ക സ്‌ട്രൂക്‌ടൂർനോയ് സെലോസ്‌റ്റ്‌നോസ്‌റ്റി ടകനി സെർഡ്‌സ് സ് പോമോഷ് ഇസ്‌കുസ്‌റ്റ്‌വെന്നോഗോ (ഡിഡൽ =10 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC и D12 MT) സ്രെസോവ്/ഗ്രൂപ്പ് ഓഫ് റസ്‌നിക് സ്‌വിനി, പ്രോവേഡൻ ഒഡ്‌നോഫാക്‌ടർ ടെസ്‌റ്റ് ANOVA <#,#00; сравнению с D0 и *p <0,05 или ****p <0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). വ്യത്യസ്ത പന്നികളിൽ നിന്നുള്ള കൃത്രിമബുദ്ധി (n = 7 (D0, D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC, D12 MT) വിഭാഗങ്ങൾ/ഗ്രൂപ്പ് ഉപയോഗിച്ച് ഹൃദയകലകളുടെ ഘടനാപരമായ സമഗ്രതയുടെ അളവ് അളക്കൽ, വൺ-വേ ANOVA പരിശോധന നടത്തി; ### p < 0.0001 D0 നെ അപേക്ഷിച്ച്, *p < 0.05 അല്ലെങ്കിൽ ****p < 0.0001 D12 Ctrl നെ അപേക്ഷിച്ച്).对不同猪的心脏组织结构完整性（n = 7（D0 和D12 Ctrl）、5（D12 TD,D12 MC 和D12 എംടി 0.0001 与D12 Ctrl 相比）。കൂടാതെ人工 智能量 化 进行 单向 单向 单向 测试 ； ########## p <0.0001 与D0 和*p <0.001 与D0 和*p <0.0.0 0.0001 与D12 Ctrl 相比).വ്യത്യസ്ത പന്നികളിൽ (n = 7 (D0, D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC, D12 MT) വിഭാഗങ്ങൾ/ഗ്രൂപ്പ്) കൃത്രിമബുദ്ധി ഉപയോഗിച്ച് ഹൃദയ കലകളുടെ ഘടനാപരമായ സമഗ്രതയുടെ അളവ് ഒരു വൺ-വേ ANOVA പരിശോധനയിലൂടെ;#### p <0,0001 по сравнению с D0 и *p < 0,05 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). #### p < 0.0001 മായി താരതമ്യം ചെയ്യുമ്പോൾ D0 ഉം *p < 0.05 ഉം അല്ലെങ്കിൽ ****p < 0.0001 മായി താരതമ്യം ചെയ്യുമ്പോൾ D12 Ctrl ഉം). b വ്യത്യസ്ത പന്നികളിൽ നിന്നുള്ള മാസൺസ് ട്രൈക്രോം സ്റ്റെയിൻ (സ്കെയിൽ ബാർ = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD, D12 MC), 9 (D12 MT) സ്ലൈസുകൾ/ഗ്രൂപ്പ് എന്നിവ ഉപയോഗിച്ച് കറ പുരണ്ട ഹൃദയ സ്ലൈസുകളുടെ പ്രാതിനിധ്യ ചിത്രങ്ങളും അളവുകോലും, വൺ-വേ ANOVA പരിശോധന നടത്തുന്നു; ###p < 0.0001 D0 യുമായി താരതമ്യം ചെയ്യുമ്പോൾ ***p < 0.001, അല്ലെങ്കിൽ ****p < 0.0001 D12 Ctrl മായി താരതമ്യം ചെയ്യുമ്പോൾ). b വ്യത്യസ്ത പന്നികളിൽ നിന്നുള്ള മാസൺസ് ട്രൈക്രോം സ്റ്റെയിൻ (സ്കെയിൽ ബാർ = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD, D12 MC), 9 (D12 MT) സ്ലൈസുകൾ/ഗ്രൂപ്പ് എന്നിവ ഉപയോഗിച്ച് കറ പുരണ്ട ഹൃദയ സ്ലൈസുകളുടെ പ്രാതിനിധ്യ ചിത്രങ്ങളും അളവുകോലും, വൺ-വേ ANOVA പരിശോധന നടത്തുന്നു; ###p < 0.0001 D0 യുമായി താരതമ്യം ചെയ്യുമ്പോൾ ***p < 0.001, അല്ലെങ്കിൽ ****p < 0.0001 D12 Ctrl മായി താരതമ്യം ചെയ്യുമ്പോൾ). b രെപ്രെസെൻ്റതിവ്ന്ыഎ ഇസോബ്രാജെനിയയും കൊളിചെസ്ത്വെന്നയ ഒസെങ്ക സ്രെജൊവ് സെര്ദ്ത്സ, ഒക്രശെന്ыഹ് ത്രിഹ്രൊമ്നൊജ്മ് (മാസ്‌റ്റബ്‌നയ്‌ഡ് ലൈനിംഗ് = 500 എംസിഎം) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD , D12 MC), 9 (D12 MT) ഒദ്നൊസ്തൊരൊംന്ыയ് ടെസ്ത് ANOVA; ####p <0,0001 по сравнению с D0 и ***p < 0,001 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). b മാസൺസ് ട്രൈക്രോം സ്റ്റെയിൻ (സ്കെയിൽ ബാർ = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD, D12 MC) ഉപയോഗിച്ച് കറ പുരണ്ട ഹൃദയഭാഗങ്ങളുടെ പ്രതിനിധാന ചിത്രങ്ങളും അളവെടുപ്പും, വ്യത്യസ്ത പന്നികളിൽ നിന്നുള്ള 9 (D12 MT) വിഭാഗങ്ങൾ/ഗ്രൂപ്പ്, വൺ-വേ ANOVA നടത്തി; ####p < 0.0001 vs. D0 and ***p < 0.001 അല്ലെങ്കിൽ ****p < 0.0001 vs. D12 Ctrl). b 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像和量化（比例尺= 500 µm（n =210（n Ctrl.与D0 相比，***p < 0.001,或****p <0.0001 与D12 Ctrl 相比）。 b 用 മാസൻ 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 和 量化、 d12 ctrl , d12 td 和 d12 mc） 来自 不同 的 9 个 d12 mt 切片 切片 切片 切片切片 切片 കൂടാതെ相比,***p <0.001，或****p <0.0001 与D12 Ctrl 相比）。 b റപ്രെസൻ്റതിവ്ന്ыഎ ഇസോബ്രാജെനിയയും കൊളിചെസ്റ്റ്വെന്നയ ഒഷെങ്ക സ്രെസോവ് സെർഡ്സാ, ഒക്രഷെന്ыഹ് ട്രൈക്രോമോസോം линейка = 500 മില്ലീമീറ്റർ) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD и D12 MC), 9 (D12 MT) റേസോവ് ഓഫ് റാസ്‌നിക് സ്വീനിയോ / ഗ്രുപ്പോപ്യ്, # NOP; 0,0001 പോ сравнению с D0, ***p < 0,001 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). b മാസൺസ് ട്രൈക്രോം (സ്കെയിൽ ബാർ = 500 µm) ഉപയോഗിച്ച് കറ പുരണ്ട ഹൃദയഭാഗങ്ങളുടെ പ്രതിനിധാന ചിത്രങ്ങളും അളവെടുപ്പും (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD, D12 MC), വ്യത്യസ്ത പന്നികൾ/ഗ്രൂപ്പിൽ നിന്നുള്ള 9 (D12 MT) വിഭാഗങ്ങൾ, ഒരു ANOVA രീതി; ####p < 0.0001 താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ D0, ***p < 0.001 അല്ലെങ്കിൽ ****p < 0.0001 താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ D12 Ctrl).പിശക് ബാറുകൾ ശരാശരി ± സ്റ്റാൻഡേർഡ് ഡീവിയേഷനെ പ്രതിനിധീകരിക്കുന്നു.
അവസാനമായി, കാർഡിയാക് ടിഷ്യു സ്ട്രെച്ച് വർദ്ധിപ്പിച്ചുകൊണ്ട് കാർഡിയാക് ഹൈപ്പർട്രോഫിയെ അനുകരിക്കാനുള്ള CTCM ന്റെ കഴിവ് വിലയിരുത്തി. CTCM-ൽ, പീക്ക് എയർ ചേമ്പർ മർദ്ദം 80 mmHg-ൽ നിന്ന് 80 mmHg ആയി വർദ്ധിച്ചു. കല. (സാധാരണ സ്ട്രെച്ച്) 140 mmHg-ലേക്ക് കല. (ചിത്രം 6a). ഇത് സ്ട്രെച്ചിലെ 32% വർദ്ധനവിന് തുല്യമാണ് (ചിത്രം 6b), ഹൈപ്പർട്രോഫിയിൽ കാണുന്നതുപോലെയുള്ള സാർകോമെർ നീളം കൈവരിക്കുന്നതിന് ഹൃദയ വിഭാഗങ്ങൾക്ക് ആവശ്യമായ അനുബന്ധ ശതമാനം സ്ട്രെച്ചായി ഇത് മുമ്പ് കാണിച്ചിരുന്നു. കൾച്ചറിന്റെ ആറ് ദിവസങ്ങളിൽ സങ്കോചത്തിലും വിശ്രമത്തിലും കാർഡിയാക് ടിഷ്യുവിന്റെ സ്ട്രെച്ചും വേഗതയും സ്ഥിരമായി തുടർന്നു (ചിത്രം 6c). MT അവസ്ഥകളിൽ നിന്നുള്ള കാർഡിയാക് ടിഷ്യു ആറ് ദിവസത്തേക്ക് സാധാരണ സ്ട്രെച്ച് (MT (സാധാരണ)) അല്ലെങ്കിൽ ഓവർസ്ട്രെച്ച് അവസ്ഥകൾക്ക് (MT (OS)) വിധേയമാക്കി. സംസ്കാരത്തിൽ നാല് ദിവസങ്ങൾക്ക് ശേഷം, MT (സാധാരണ) അവസ്ഥകളുമായി (ചിത്രം 7a) താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ MT (OS) സാഹചര്യങ്ങളിൽ ഹൈപ്പർട്രോഫിക് ബയോമാർക്കർ NT-ProBNP മീഡിയത്തിൽ ഗണ്യമായി ഉയർന്നു. കൂടാതെ, ആറ് ദിവസത്തെ കൾച്ചറിംഗിന് ശേഷം, MT (OS) ലെ കോശ വലുപ്പം (ചിത്രം 7b) MT ഹൃദയത്തിന്റെ ഭാഗങ്ങളെ അപേക്ഷിച്ച് (സാധാരണ) ഗണ്യമായി വർദ്ധിച്ചു. കൂടാതെ, അമിതമായി നീട്ടപ്പെട്ട കലകളിൽ NFATC4 ന്യൂക്ലിയർ ട്രാൻസ്‌ലോക്കേഷൻ ഗണ്യമായി വർദ്ധിച്ചു (ചിത്രം 7c). ഹൈപ്പർഡിസ്റ്റെൻഷനുശേഷം പാത്തോളജിക്കൽ പുനർനിർമ്മാണത്തിന്റെ പുരോഗമനപരമായ വികസനം ഈ ഫലങ്ങൾ കാണിക്കുന്നു, കൂടാതെ സ്ട്രെച്ച്-ഇൻഡ്യൂസ്ഡ് കാർഡിയാക് ഹൈപ്പർട്രോഫി സിഗ്നലിംഗ് പഠിക്കുന്നതിനുള്ള ഒരു പ്ലാറ്റ്‌ഫോമായി CTCM ഉപകരണം ഉപയോഗിക്കാമെന്ന ആശയത്തെ പിന്തുണയ്ക്കുന്നു.
എയർ ചേമ്പർ മർദ്ദം, ഫ്ലൂയിഡ് ചേമ്പർ മർദ്ദം, ടിഷ്യു ചലന അളവുകൾ എന്നിവയുടെ പ്രതിനിധി ട്രെയ്‌സുകൾ, ചേമ്പർ മർദ്ദം ദ്രാവക ചേമ്പർ മർദ്ദത്തെ മാറ്റുന്നുവെന്നും, ടിഷ്യു സ്ലൈസിന്റെ അനുബന്ധ ചലനത്തിന് കാരണമാകുമെന്നും സ്ഥിരീകരിക്കുന്നു. b സാധാരണയായി വലിച്ചുനീട്ടപ്പെട്ട (ഓറഞ്ച്) ഉം അമിതമായി നീട്ടിയ (നീല) ടിഷ്യു വിഭാഗങ്ങളും പ്രതിനിധീകരിക്കുന്ന സ്ട്രെച്ച് ശതമാനവും സ്ട്രെച്ച് റേറ്റ് കർവുകളും. c സൈക്കിൾ സമയം കാണിക്കുന്ന ബാർ ഗ്രാഫ് (വ്യത്യസ്ത പന്നികളിൽ നിന്ന് n = 19 കഷണങ്ങൾ, ഓരോ ഗ്രൂപ്പിലും, വ്യത്യസ്ത പന്നികളിൽ നിന്ന് n = 18-19 കഷണങ്ങൾ), വിശ്രമ സമയം (വ്യത്യസ്ത പന്നികളിൽ നിന്ന് n = 19 കഷണങ്ങൾ, ഓരോ ഗ്രൂപ്പിലും) ), ടിഷ്യു ചലനത്തിന്റെ വ്യാപ്തി (വ്യത്യസ്ത പന്നികളിൽ നിന്ന് n = 14 കഷണങ്ങൾ/ഗ്രൂപ്പ്), പീക്ക് സിസ്റ്റോളിക് വേഗത (വ്യത്യസ്ത പന്നികളിൽ നിന്ന് n = 14 കഷണങ്ങൾ/ഗ്രൂപ്പ്), പീക്ക് റിലാക്സേഷൻ നിരക്ക് (n = 14 (D0), 15 (D6) ) വ്യത്യസ്ത പന്നികളിൽ നിന്നുള്ള വിഭാഗങ്ങൾ/ഗ്രൂപ്പുകൾ), രണ്ട് വാലുള്ള വിദ്യാർത്ഥിയുടെ ടി-ടെസ്റ്റ് ഒരു പാരാമീറ്ററിലും കാര്യമായ വ്യത്യാസമൊന്നും കാണിച്ചില്ല, ഇത് അമിത വോൾട്ടേജുള്ള കൾച്ചറിന്റെ 6 ദിവസങ്ങളിൽ ഈ പാരാമീറ്ററുകൾ സ്ഥിരമായി നിലനിന്നിരുന്നുവെന്ന് സൂചിപ്പിക്കുന്നു. പിശക് ബാറുകൾ ശരാശരി ± സ്റ്റാൻഡേർഡ് ഡീവിയേഷനെ പ്രതിനിധീകരിക്കുന്നു.
വ്യത്യസ്ത പന്നികളിൽ നിന്നുള്ള MT നോർമൽ സ്ട്രെച്ച് (Norm) അല്ലെങ്കിൽ ഓവർസ്ട്രെച്ചിംഗ് (OS) അവസ്ഥകളിൽ (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, D4 MTOS) സ്ലൈസുകൾ/ഗ്രൂപ്പ് എന്നിവയിൽ കൾച്ചർ ചെയ്ത ഹാർട്ട് സ്ലൈസുകളിൽ നിന്നുള്ള കൾച്ചർ മീഡിയയിലെ NT-ProBNP സാന്ദ്രതയുടെ ബാർ ഗ്രാഫ് ക്വാണ്ടിഫിക്കേഷൻ, ടു-വേ ANOVA നടത്തുന്നു; **p < സാധാരണ സ്ട്രെച്ചുമായി താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ 0.01). വ്യത്യസ്ത പന്നികളിൽ നിന്നുള്ള MT നോർമൽ സ്ട്രെച്ച് (Norm) അല്ലെങ്കിൽ ഓവർസ്ട്രെച്ചിംഗ് (OS) അവസ്ഥകളിൽ (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, D4 MTOS) സ്ലൈസുകൾ/ഗ്രൂപ്പ് എന്നിവയിൽ കൾച്ചർ ചെയ്ത ഹാർട്ട് സ്ലൈസുകളിൽ നിന്നുള്ള കൾച്ചർ മീഡിയയിലെ NT-ProBNP സാന്ദ്രതയുടെ ബാർ ഗ്രാഫ് ക്വാണ്ടിഫിക്കേഷൻ, ടു-വേ ANOVA നടത്തുന്നു; **p < സാധാരണ സ്ട്രെച്ചുമായി താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ 0.01).സാധാരണ MT സ്ട്രെച്ച് (നോർം) അല്ലെങ്കിൽ ഓവർസ്ട്രെച്ച് (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, D4).MTOS) സ്ലൈസുകൾ / വ്യത്യസ്ത പന്നികളിൽ നിന്നുള്ള ഗ്രൂപ്പുകൾ, കൾച്ചർ മീഡിയത്തിൽ NT-ProBNP സാന്ദ്രതയുടെ ക്വാണ്ടിറ്റേറ്റീവ് ഹിസ്റ്റോഗ്രാം, വേരിയൻസിന്റെ രണ്ട്-ഘടക വിശകലനം നടത്തുന്നു;**p <0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p < 0.01 സാധാരണ സ്ട്രെച്ചിനെ അപേക്ഷിച്ച്). എ浓度的条形图量化（n = 4 (D2 MTNorm)、3（D2 MTOS,D4 MTNorm 和D4 എം.ടി.ഒ.എസ്. 0.01). MT നോർമൽ സ്ട്രെച്ച് (Norm) അല്ലെങ്കിൽ overstretch (OS) അവസ്ഥകൾ (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm和D4 MTOS) എന്നിവയിൽ സംസ്കരിച്ച ഹൃദയ സ്ലൈസുകളിലെ NT-ProBNP സാന്ദ്രതയുടെ അളവ്猪的切片/组，可以双向方方发发动, സാധാരണ വലിച്ചുനീട്ടലുമായി താരതമ്യം ചെയ്യുമ്പോൾ, p <0.01).ഹിസ്റ്റോഗ്രാം സാധാരണ MT സ്ട്രെച്ച് (നോർം) അല്ലെങ്കിൽ ഓവർസ്ട്രെച്ച് (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm) and D4 MTOS) സാഹചര്യങ്ങളിൽ കൾച്ചർ ചെയ്ത ഹാർട്ട് സ്ലൈസുകളിലെ NT-ProBNP സാന്ദ്രതയുടെ അളവ് വ്യത്യസ്ത പന്നികളിൽ നിന്നുള്ള സ്ലൈസുകൾ/ഗ്രൂപ്പ്, വേരിയൻസിന്റെ ടു-വേ വിശകലനം;**p <0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p < 0.01 സാധാരണ സ്ട്രെച്ചിനെ അപേക്ഷിച്ച്). b ട്രോപോണിൻ-T, WGA (ഇടത്) എന്നിവ ഉപയോഗിച്ച് കറ പുരണ്ട ഹൃദയ കഷ്ണങ്ങളുടെ പ്രതിനിധാന ചിത്രങ്ങൾ, വ്യത്യസ്ത പന്നികളിൽ നിന്നുള്ള 10 വ്യത്യസ്ത കഷ്ണങ്ങളിൽ നിന്നുള്ള സെൽ സൈസ് ക്വാണ്ടിഫിക്കേഷൻ (വലത്) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) കോശങ്ങൾ/ഗ്രൂപ്പ്, ടു-ടെയിൽഡ് സ്റ്റുഡന്റ് ടി-ടെസ്റ്റ് നടത്തുന്നു; ****p < 0.0001 സാധാരണ സ്ട്രെച്ചിനെ അപേക്ഷിച്ച്). b ട്രോപോണിൻ-T, WGA (ഇടത്) എന്നിവ ഉപയോഗിച്ച് കറ പുരണ്ട ഹൃദയ കഷ്ണങ്ങളുടെ പ്രതിനിധാന ചിത്രങ്ങൾ, വ്യത്യസ്ത പന്നികളിൽ നിന്നുള്ള 10 വ്യത്യസ്ത കഷ്ണങ്ങളിൽ നിന്നുള്ള സെൽ സൈസ് ക്വാണ്ടിഫിക്കേഷൻ (വലത്) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) കോശങ്ങൾ/ഗ്രൂപ്പ്, ടു-ടെയിൽഡ് സ്റ്റുഡന്റ് ടി-ടെസ്റ്റ് നടത്തുന്നു; ****p < 0.0001 സാധാരണ സ്ട്രെച്ചിനെ അപേക്ഷിച്ച്). b റപ്രെസൻ്റതിവ്ന്ыഎ ഇസോബ്രാജെനിയ സ്രെസോവ് സെർഡ്സാ, ഒക്രഷെൻ്റിഹ് ട്രോപോണിനം-ടി, അഗാഗ് (സ്ലേവ) അല്ലെങ്കിൽ കോൾ ഒപ്രെഡെലെനിയ റസ്മേര ക്ലെറ്റോക്ക് (സ്പ്രാവ) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) ക്ലെറ്റോക്ക്/ഗ്രൂപ്പ് അല്ലെങ്കിൽ 10 രാഷ്ട്രങ്ങൾ, വൃത്തങ്ങൾ പ്രൊവൊദ്യ്ത്സ്യ ഹ്വൊസ്തൊവൊയ് ടി-ക്രിറ്ററി സ്റ്റുഡൻ്റ; ****p <0,0001 по сравнению с нормальным растяжением). b ട്രോപോണിൻ-T, AZP (ഇടത്) എന്നിവ ഉപയോഗിച്ച് കറ പുരണ്ട ഹൃദയഭാഗങ്ങളുടെ പ്രതിനിധാന ചിത്രങ്ങൾ, വ്യത്യസ്ത പന്നികളിൽ നിന്നുള്ള 10 വ്യത്യസ്ത വിഭാഗങ്ങളിൽ നിന്നുള്ള സെൽ സൈസ് ക്വാണ്ടിഫിക്കേഷൻ (വലത്) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) കോശങ്ങൾ/ഗ്രൂപ്പ്, രണ്ട് വാലുള്ള വിദ്യാർത്ഥിയുടെ ടി-ടെസ്റ്റ് നടത്തി; ****p < 0.0001 സാധാരണ സ്ട്രെയിനുമായി താരതമ്യം ചെയ്യുമ്പോൾ). ബി MTOS）,来自不同猪的10 个不同切片的369（D6 MTNorm）细胞/组,两进行有尾学生t 检验；与正常拉伸相比,****p <0.0001）。 b കാൽക്കറിൻ-T, WGA (ഇടത്) എന്നിവ ഉപയോഗിച്ച് കറ പുരണ്ട ഹൃദയ കഷ്ണങ്ങളുടെ പ്രതിനിധാന ചിത്രങ്ങൾ, സെൽ വലുപ്പം (വലത്) (n = 330 (D6 MTOS), 10 വ്യത്യസ്ത സ്ലൈസുകളിൽ നിന്ന് 369 (D6 MTNorm)) കോശങ്ങൾ/ഗ്രന്ഥശാല, വ്യാകരണ പഠനങ്ങൾ t പരിശോധന; സാധാരണ സ്ട്രെച്ചിംഗുമായി താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ，****p < 0.0001). b റെപ്രെസൻ്റതിവ്ന്ыഎ ഇസോബ്രാജെനിയ സ്രെസോവ് സെർഡിസ, ഒക്രഷെംന്ыഹ് ട്രോപോണിനോം-ടി, ആൻഗ് (സ്ലേവ) അല്ലെങ്കിൽ കോൾ റസ്മേര ക്ലെറ്റോക്ക് (സ്പ്രാവ) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) അതായത് 10 റേസ്‌ലിക് സ്‌ക്രേസോവ് മുതൽ രാഷ്ട്രീയ സ്‌വിനിഷ്/ഗേൾഡ്‌ക്‌സ്, ക്രിതെരിയ് സ്റ്റ്യുഡൻ്റ; ****p <0,0001 по сравнению с нормальным растяжением). b ട്രോപോണിൻ-T, AZP എന്നിവ ഉപയോഗിച്ച് കറ പുരണ്ട ഹൃദയഭാഗങ്ങളുടെ പ്രതിനിധാന ചിത്രങ്ങൾ (ഇടത്) കോശ വലുപ്പത്തിന്റെ അളവ് (വലത്) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) വ്യത്യസ്ത പന്നികളിൽ നിന്നുള്ള 10 വ്യത്യസ്ത വിഭാഗങ്ങളിൽ നിന്ന്) കോശങ്ങൾ/ഗ്രൂപ്പ്, രണ്ട്-വാലുള്ള മാനദണ്ഡം വിദ്യാർത്ഥിയുടെ t; ****p < 0.0001 സാധാരണ സ്ട്രെയിനുമായി താരതമ്യം ചെയ്യുമ്പോൾ). c ട്രോപോണിൻ-T, NFATC4 എന്നിവയ്ക്കായി ഇമ്മ്യൂണോലേബൽ ചെയ്ത 0, 6 ദിവസ MTOS ഹാർട്ട് സ്ലൈസുകളുടെ പ്രതിനിധി ചിത്രങ്ങൾ, വ്യത്യസ്ത പന്നികളിൽ നിന്നുള്ള CM-കളുടെ (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) സ്ലൈസുകൾ/ഗ്രൂപ്പുകളുടെ ന്യൂക്ലിയസുകളിലേക്ക് NFATC4 ന്റെ ട്രാൻസ്‌ലോക്കേഷന്റെ അളവ്, ടു-ടെയിൽഡ് സ്റ്റുഡന്റ് ടി-ടെസ്റ്റ് നടത്തുന്നു; *p < 0.05). c ട്രോപോണിൻ-T, NFATC4 എന്നിവയ്ക്കായി ഇമ്മ്യൂണോലേബൽ ചെയ്ത 0, 6 ദിവസ MTOS ഹാർട്ട് സ്ലൈസുകളുടെ പ്രതിനിധി ചിത്രങ്ങൾ, വ്യത്യസ്ത പന്നികളിൽ നിന്നുള്ള CM-കളുടെ (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) സ്ലൈസുകൾ/ഗ്രൂപ്പുകളുടെ ന്യൂക്ലിയസുകളിലേക്ക് NFATC4 ന്റെ ട്രാൻസ്‌ലോക്കേഷന്റെ അളവ്, ടു-ടെയിൽഡ് സ്റ്റുഡന്റ് ടി-ടെസ്റ്റ് നടത്തുന്നു; *p < 0.05). c റപ്രെസൻ്ററ്റിവ്ന്ыഎ ഇസോബ്രാജെനിയ ഡ്ലിയ സ്രെസോവ് സെർഡ്സാ 0 അല്ലെങ്കിൽ 6 ദിവസം എംടിഒഎസ്, ഇമ്മുനോമെച്ചെന്ыഹ് ഡ്ലിയ ട്രോപോണിന-ടിസിടി, കോളിചെസ്‌റ്റ്‌വെന്നയ ഒസെങ്ക ട്രാൻസ്‌ലോക്കസികൾ NFATC4 വ്യൂ യാദ്ര കാവേർണോസ്‌ന്ыഹ് ക്ലെറ്റോക്ക് (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) ക്രമീകരണം/ഗ്രൂപ്പ് വ്ыപൊല്ംയെത്സ്യ двусторонний t-kriteriy stьюdenta; *p <0,05). c 0, 6 ദിവസത്തെ MTOS-ലെ ഹൃദയ വിഭാഗങ്ങളുടെ പ്രതിനിധി ചിത്രങ്ങൾ, ട്രോപോണിൻ-T, NFATC4 എന്നിവയ്ക്കായി ഇമ്മ്യൂണോലേബൽ ചെയ്‌തിരിക്കുന്നു, കൂടാതെ കാവെർണസ് കോശങ്ങളുടെ ന്യൂക്ലിയസിൽ NFATC4 ട്രാൻസ്‌ലോക്കേഷന്റെ അളവ് (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) വ്യത്യസ്ത പന്നികളിൽ നിന്നുള്ള കഷണങ്ങൾ/ഗ്രൂപ്പ്) രണ്ട് വാലുള്ള വിദ്യാർത്ഥിയുടെ ടി-ടെസ്റ്റ് നടത്തി; *p < 0.05). c 用于肌钙蛋白-T 和NFATC4心脏切片的代表性图像，以及来自不同猪的NFATC4 易位至CM 细胞核的量化 0切片/组, 进行双尾学生t 检验；*p <0.05)。 c calcanin-T, NFATC4 ഇമ്മ്യൂണോലേബലിംഗിൻ്റെ പ്രതിനിധി ചിത്രങ്ങൾ切礼/组, 时间双尾学生et 电影；*p <0.05). c റപ്രെസൻ്ററ്റിവ്ന്ыഎ ഇസോബ്രാജെനിയ സ്രെസോവ് സെർഡ്സാ എംടിഒഎസ് 0 അല്ലെങ്കിൽ 6 ദിവസങ്ങളിൽ ഇമ്മുനോമാർക്കൈറോവ്കി ട്രോപോണിനോം-4 കോളിചെസ്‌റ്റ്‌വെന്നയാ ഒസെങ്ക ട്രാൻസ്‌ലോക്കസികൾ NFATC4 യഡ്ര മുഖ്യമന്ത്രിയിൽ നിന്ന് റജ്‌നിഹ് സ്വിനെ (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) ക്രമീകരണം/ഗ്രൂപ്പ്, t-критерий Стьюдента; 0,05). c വ്യത്യസ്ത പന്നികളിൽ നിന്നുള്ള (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) സ്ലൈസുകൾ/ഗ്രൂപ്പ്, ടു-ടെയിൽഡ് ടി -മാനദണ്ഡം വിദ്യാർത്ഥികളുടെ; *p < 0.05) CM ന്റെ ന്യൂക്ലിയസിൽ ട്രോപോണിൻ-T, NFATC4 ഇമ്മ്യൂണോലേബലിംഗ്, NFATC4 ട്രാൻസ്‌ലോക്കേഷന്റെ അളവ് എന്നിവയ്ക്കായി 0, 6 ദിവസങ്ങളിലെ MTOS ഹൃദയ സ്ലൈസുകളുടെ പ്രതിനിധി ചിത്രങ്ങൾ.പിശക് ബാറുകൾ ശരാശരി ± സ്റ്റാൻഡേർഡ് ഡീവിയേഷനെ പ്രതിനിധീകരിക്കുന്നു.
ട്രാൻസ്ലേഷണൽ കാർഡിയോവാസ്കുലാർ ഗവേഷണത്തിന് ഹൃദയ പരിസ്ഥിതിയെ കൃത്യമായി പുനർനിർമ്മിക്കുന്ന സെല്ലുലാർ മോഡലുകൾ ആവശ്യമാണ്. ഈ പഠനത്തിൽ, ഹൃദയത്തിന്റെ അൾട്രാ-നേർത്ത ഭാഗങ്ങളെ ഉത്തേജിപ്പിക്കാൻ കഴിയുന്ന ഒരു CTCM ഉപകരണം വികസിപ്പിക്കുകയും സ്വഭാവസവിശേഷതകൾ നൽകുകയും ചെയ്തു. CTCM സിസ്റ്റത്തിൽ ഫിസിയോളജിക്കലി സിൻക്രൊണൈസ്ഡ് ഇലക്ട്രോമെക്കാനിക്കൽ ഉത്തേജനവും T3, ഡെക്സ് ദ്രാവക സമ്പുഷ്ടീകരണവും ഉൾപ്പെടുന്നു. പന്നിയിറച്ചി ഹൃദയ ഭാഗങ്ങളെ ഈ ഘടകങ്ങൾക്ക് വിധേയമാക്കിയപ്പോൾ, അവയുടെ പ്രവർത്തനക്ഷമത, ഘടനാപരമായ സമഗ്രത, ഉപാപചയ പ്രവർത്തനം, ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷണൽ എക്സ്പ്രഷൻ എന്നിവ 12 ദിവസത്തെ കൾച്ചറിനുശേഷം പുതിയ ഹൃദയ കലകളിലെന്നപോലെ തന്നെ തുടർന്നു. കൂടാതെ, ഹൃദയ കലകളുടെ അമിതമായ നീട്ടൽ ഹൈപ്പർ എക്സ്റ്റൻഷൻ മൂലമുണ്ടാകുന്ന ഹൃദയത്തിന്റെ ഹൈപ്പർട്രോഫിക്ക് കാരണമാകും. മൊത്തത്തിൽ, ഈ ഫലങ്ങൾ ഒരു സാധാരണ കാർഡിയാക് ഫിനോടൈപ്പ് നിലനിർത്തുന്നതിൽ ഫിസിയോളജിക്കൽ കൾച്ചർ അവസ്ഥകളുടെ നിർണായക പങ്കിനെ പിന്തുണയ്ക്കുകയും മയക്കുമരുന്ന് പരിശോധനയ്ക്ക് ഒരു വേദി നൽകുകയും ചെയ്യുന്നു.
കാർഡിയോമയോസൈറ്റുകളുടെ പ്രവർത്തനത്തിനും നിലനിൽപ്പിനും അനുയോജ്യമായ ഒരു അന്തരീക്ഷം സൃഷ്ടിക്കുന്നതിന് നിരവധി ഘടകങ്ങൾ സംഭാവന ചെയ്യുന്നു. ഈ ഘടകങ്ങളിൽ ഏറ്റവും വ്യക്തമായത് (1) ഇന്റർസെല്ലുലാർ ഇടപെടലുകൾ, (2) ഇലക്ട്രോമെക്കാനിക്കൽ ഉത്തേജനം, (3) ഹ്യൂമറൽ ഘടകങ്ങൾ, (4) മെറ്റബോളിക് സബ്‌സ്‌ട്രേറ്റുകൾ എന്നിവയുമായി ബന്ധപ്പെട്ടതാണ്. ഫിസിയോളജിക്കൽ സെൽ-ടു-സെൽ ഇടപെടലുകൾക്ക് ഒരു എക്സ്ട്രാ സെല്ലുലാർ മാട്രിക്സ് പിന്തുണയ്ക്കുന്ന ഒന്നിലധികം സെൽ തരങ്ങളുടെ സങ്കീർണ്ണമായ ത്രിമാന ശൃംഖലകൾ ആവശ്യമാണ്. അത്തരം സങ്കീർണ്ണമായ സെല്ലുലാർ ഇടപെടലുകൾ വ്യക്തിഗത സെൽ തരങ്ങളുടെ സഹ-സംസ്‌കാരം വഴി ഇൻ വിട്രോയിൽ പുനർനിർമ്മിക്കാൻ പ്രയാസമാണ്, പക്ഷേ ഹൃദയ വിഭാഗങ്ങളുടെ ഓർഗാനോടൈപ്പിക് സ്വഭാവം ഉപയോഗിച്ച് എളുപ്പത്തിൽ നേടാനാകും.
കാർഡിയാക് ഫിനോടൈപ്പ് നിലനിർത്തുന്നതിന് കാർഡിയോമയോസൈറ്റുകളുടെ മെക്കാനിക്കൽ സ്ട്രെച്ചും ഇലക്ട്രിക്കൽ സ്റ്റിമുലേഷനും നിർണായകമാണ്33,34,35. ഹൈപിഎസ്‌സി-സിഎം കണ്ടീഷനിംഗിനും പക്വതയ്ക്കും മെക്കാനിക്കൽ സ്റ്റിമുലേഷൻ വ്യാപകമായി ഉപയോഗിച്ചിട്ടുണ്ടെങ്കിലും, നിരവധി ഗംഭീര പഠനങ്ങൾ അടുത്തിടെ ഏകാക്ഷീയ ലോഡിംഗ് ഉപയോഗിച്ച് കൾച്ചറിലെ ഹൃദയ സ്ലൈസുകളുടെ മെക്കാനിക്കൽ സ്റ്റിമുലേഷൻ പരീക്ഷിച്ചു. കൾച്ചർ സമയത്ത് ഹൃദയത്തിന്റെ ഫിനോടൈപ്പിൽ 2D ഏകാക്ഷീയ മെക്കാനിക്കൽ ലോഡിംഗ് ഒരു നല്ല സ്വാധീനം ചെലുത്തുന്നുവെന്ന് ഈ പഠനങ്ങൾ കാണിക്കുന്നു. ഈ പഠനങ്ങളിൽ, ഹൃദയത്തിന്റെ ഭാഗങ്ങൾ ഐസോമെട്രിക് ടെൻസൈൽ ഫോഴ്‌സുകൾ17, ലീനിയർ ഓക്‌സോടോണിക് ലോഡിംഗ്18 എന്നിവയാൽ നിറഞ്ഞിരുന്നു, അല്ലെങ്കിൽ ഫോഴ്‌സ് ട്രാൻസ്‌ഡ്യൂസർ ഫീഡ്‌ബാക്കും ടെൻഷൻ ഡ്രൈവുകളും ഉപയോഗിച്ച് കാർഡിയാക് സൈക്കിൾ പുനഃസൃഷ്ടിച്ചു. എന്നിരുന്നാലും, ഈ രീതികൾ പാരിസ്ഥിതിക ഒപ്റ്റിമൈസേഷൻ ഇല്ലാതെ ഏകാക്ഷീയ ടിഷ്യു സ്ട്രെച്ചും ഉപയോഗിക്കുന്നു, ഇത് നിരവധി കാർഡിയാക് ജീനുകളെ അടിച്ചമർത്തുന്നതിനോ അസാധാരണമായ സ്ട്രെച്ച് പ്രതികരണങ്ങളുമായി ബന്ധപ്പെട്ട ജീനുകളുടെ അമിത പ്രകടനത്തിനോ കാരണമാകുന്നു. ഇവിടെ വിവരിച്ചിരിക്കുന്ന CTCM, സൈക്കിൾ സമയത്തിന്റെയും ഫിസിയോളജിക്കൽ സ്ട്രെച്ചിന്റെയും (25% സ്ട്രെച്ച്, 40% സിസ്റ്റോൾ, 60% ഡയസ്റ്റോൾ, മിനിറ്റിൽ 72 സ്പന്ദനങ്ങൾ) അടിസ്ഥാനത്തിൽ സ്വാഭാവിക കാർഡിയാക് സൈക്കിളിനെ അനുകരിക്കുന്ന ഒരു 3D ഇലക്ട്രോമെക്കാനിക്കൽ ഉത്തേജനം നൽകുന്നു. ടിഷ്യു സമഗ്രത നിലനിർത്താൻ ഈ ത്രിമാന മെക്കാനിക്കൽ ഉത്തേജനം മാത്രം പര്യാപ്തമല്ലെങ്കിലും, ടിഷ്യു പ്രവർത്തനക്ഷമത, പ്രവർത്തനം, സമഗ്രത എന്നിവ വേണ്ടത്ര നിലനിർത്തുന്നതിന് T3/Dex ഉപയോഗിച്ചുള്ള ഹ്യൂമറൽ, മെക്കാനിക്കൽ ഉത്തേജനങ്ങളുടെ സംയോജനം ആവശ്യമാണ്.
മുതിർന്നവരുടെ ഹൃദയ ഫിനോടൈപ്പിനെ മോഡുലേറ്റ് ചെയ്യുന്നതിൽ ഹ്യൂമറൽ ഘടകങ്ങൾ ഒരു പ്രധാന പങ്ക് വഹിക്കുന്നു. കോശ പക്വത ത്വരിതപ്പെടുത്തുന്നതിനായി കൾച്ചർ മീഡിയയിൽ T3, Dex എന്നിവ ചേർത്ത HiPS-CM പഠനങ്ങളിൽ ഇത് എടുത്തുകാണിച്ചിട്ടുണ്ട്. കോശ സ്തരങ്ങളിലുടനീളം അമിനോ ആസിഡുകൾ, പഞ്ചസാര, കാൽസ്യം എന്നിവയുടെ ഗതാഗതത്തെ T3 സ്വാധീനിച്ചേക്കാം36. കൂടാതെ, T3 MHC-α എക്സ്പ്രഷനും MHC-β ഡൌൺറെഗുലേഷനും പ്രോത്സാഹിപ്പിക്കുന്നു, ഇത് ഗര്ഭപിണ്ഡത്തിന്റെ CM-ലെ സ്ലോ ട്വിച്ച് മയോഫിബ്രിലുകളെ അപേക്ഷിച്ച് പക്വതയുള്ള കാർഡിയോമയോസൈറ്റുകളിൽ ഫാസ്റ്റ് ട്വിച്ച് മയോഫിബ്രിലുകളുടെ രൂപീകരണം പ്രോത്സാഹിപ്പിക്കുന്നു. ഹൈപ്പോതൈറോയിഡ് രോഗികളിൽ T3 യുടെ കുറവ് മയോഫിബ്രില്ലാർ ബാൻഡുകളുടെ നഷ്ടത്തിനും ടോൺ വികസന നിരക്ക് കുറയുന്നതിനും കാരണമാകുന്നു37. ഡെക്സ് ഗ്ലൂക്കോകോർട്ടിക്കോയിഡ് റിസപ്റ്ററുകളിൽ പ്രവർത്തിക്കുകയും ഒറ്റപ്പെട്ട പെർഫ്യൂസ് ചെയ്ത ഹൃദയങ്ങളിൽ മയോകാർഡിയൽ സങ്കോചം വർദ്ധിപ്പിക്കുകയും ചെയ്യുന്നതായി കാണിച്ചിരിക്കുന്നു;38 ഈ മെച്ചപ്പെടുത്തൽ കാൽസ്യം നിക്ഷേപ-ഡ്രൈവൺ എൻട്രി (SOCE) യിലെ ഫലവുമായി ബന്ധപ്പെട്ടിരിക്കുന്നുവെന്ന് കരുതപ്പെടുന്നു39,40. കൂടാതെ, ഡെക്സ് അതിന്റെ റിസപ്റ്ററുകളുമായി ബന്ധിപ്പിക്കുന്നു, ഇത് രോഗപ്രതിരോധ പ്രവർത്തനത്തെയും വീക്കത്തെയും അടിച്ചമർത്തുന്ന വിശാലമായ ഇൻട്രാ സെല്ലുലാർ പ്രതികരണത്തിന് കാരണമാകുന്നു30.
ഞങ്ങളുടെ ഫലങ്ങൾ സൂചിപ്പിക്കുന്നത്, Ctrl നെ അപേക്ഷിച്ച് ഫിസിക്കൽ മെക്കാനിക്കൽ സ്റ്റിമുലേഷൻ (MS) മൊത്തത്തിലുള്ള കൾച്ചർ പ്രകടനം മെച്ചപ്പെടുത്തി, പക്ഷേ കൾച്ചറിൽ 12 ദിവസങ്ങളിൽ പ്രവർത്തനക്ഷമത, ഘടനാപരമായ സമഗ്രത, കാർഡിയാക് എക്സ്പ്രഷൻ എന്നിവ നിലനിർത്തുന്നതിൽ പരാജയപ്പെട്ടു എന്നാണ്. Ctrl നെ അപേക്ഷിച്ച്, CTCM (MT) കൾച്ചറുകളിൽ T3, Dex എന്നിവ ചേർക്കുന്നത് പ്രവർത്തനക്ഷമത മെച്ചപ്പെടുത്തുകയും 12 ദിവസത്തേക്ക് പുതിയ ഹൃദയ കലകളിൽ സമാനമായ ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ പ്രൊഫൈലുകൾ, ഘടനാപരമായ സമഗ്രത, ഉപാപചയ പ്രവർത്തനം എന്നിവ നിലനിർത്തുകയും ചെയ്തു. കൂടാതെ, ടിഷ്യു സ്ട്രെച്ചിന്റെ അളവ് നിയന്ത്രിക്കുന്നതിലൂടെ, STCM ഉപയോഗിച്ച് ഒരു ഹൈപ്പർ എക്സ്റ്റൻഷൻ-ഇൻഡ്യൂസ്ഡ് കാർഡിയാക് ഹൈപ്പർട്രോഫി മോഡൽ സൃഷ്ടിച്ചു, ഇത് STCM സിസ്റ്റത്തിന്റെ വൈവിധ്യത്തെ വ്യക്തമാക്കുന്നു. കാർഡിയാക് റീമോഡലിംഗിലും ഫൈബ്രോസിസിലും സാധാരണയായി രക്തചംക്രമണ കോശങ്ങൾക്ക് ഉചിതമായ സൈറ്റോകൈനുകളും ഫാഗോസൈറ്റോസിസും മറ്റ് പുനർനിർമ്മാണ ഘടകങ്ങളും നൽകാൻ കഴിയുന്ന കേടുകൂടാത്ത അവയവങ്ങൾ ഉൾപ്പെടുന്നുണ്ടെങ്കിലും, സമ്മർദ്ദത്തിനും ആഘാതത്തിനും പ്രതികരണമായി ഹൃദയത്തിന്റെ ഭാഗങ്ങൾക്ക് ഇപ്പോഴും ഫൈബ്രോട്ടിക് പ്രക്രിയയെ അനുകരിക്കാൻ കഴിയും. മയോഫൈബ്രോബ്ലാസ്റ്റുകളിലേക്ക്. ഈ കാർഡിയാക് സ്ലൈസ് മോഡലിൽ ഇത് മുമ്പ് വിലയിരുത്തിയിട്ടുണ്ട്. ടാക്കിക്കാർഡിയ, ബ്രാഡികാർഡിയ, മെക്കാനിക്കൽ രക്തചംക്രമണ പിന്തുണ (മെക്കാനിക്കൽ അൺലോഡഡ് ഹാർട്ട്) തുടങ്ങിയ നിരവധി അവസ്ഥകളെ അനുകരിക്കുന്നതിന് മർദ്ദം/വൈദ്യുത വ്യാപ്തിയും ആവൃത്തിയും മാറ്റുന്നതിലൂടെ CTCM പാരാമീറ്ററുകൾ മോഡുലേറ്റ് ചെയ്യാൻ കഴിയുമെന്ന് ശ്രദ്ധിക്കേണ്ടതാണ്. ഇത് ഈ സിസ്റ്റത്തെ മയക്കുമരുന്ന് പരിശോധനയ്ക്ക് ഒരു മീഡിയം ത്രൂപുട്ടാക്കി മാറ്റുന്നു. അമിതമായ അദ്ധ്വാനം മൂലമുണ്ടാകുന്ന കാർഡിയാക് ഹൈപ്പർട്രോഫിയെ മാതൃകയാക്കാനുള്ള CTCM-ന്റെ കഴിവ് വ്യക്തിഗതമാക്കിയ തെറാപ്പിക്കായി ഈ സിസ്റ്റം പരീക്ഷിക്കുന്നതിന് വഴിയൊരുക്കുന്നു. ഉപസംഹാരമായി, കാർഡിയാക് ടിഷ്യു വിഭാഗങ്ങളുടെ സംസ്കാരം നിലനിർത്തുന്നതിന് മെക്കാനിക്കൽ സ്ട്രെച്ചും ഹ്യൂമറൽ ഉത്തേജനവും നിർണായകമാണെന്ന് ഈ പഠനം തെളിയിക്കുന്നു.
ഇവിടെ അവതരിപ്പിച്ച ഡാറ്റ CTCM കേടുകൂടാത്ത മയോകാർഡിയത്തെ മാതൃകയാക്കുന്നതിനുള്ള വളരെ പ്രതീക്ഷ നൽകുന്ന ഒരു പ്ലാറ്റ്‌ഫോമാണെന്ന് സൂചിപ്പിക്കുന്നുണ്ടെങ്കിലും, ഈ കൾച്ചർ രീതിക്ക് ചില പരിമിതികളുണ്ട്. CTCM കൾച്ചറിന്റെ പ്രധാന പരിമിതി സ്ലൈസുകളിൽ തുടർച്ചയായ ഡൈനാമിക് മെക്കാനിക്കൽ സമ്മർദ്ദങ്ങൾ അടിച്ചേൽപ്പിക്കുന്നു എന്നതാണ്, ഇത് ഓരോ സൈക്കിളിലും കാർഡിയാക് സ്ലൈസ് സങ്കോചങ്ങളെ സജീവമായി നിരീക്ഷിക്കാനുള്ള കഴിവിനെ തടയുന്നു. കൂടാതെ, കാർഡിയാക് വിഭാഗങ്ങളുടെ ചെറിയ വലിപ്പം (7 മില്ലീമീറ്റർ) കാരണം, പരമ്പരാഗത ഫോഴ്‌സ് സെൻസറുകൾ ഉപയോഗിച്ച് കൾച്ചർ സിസ്റ്റങ്ങൾക്ക് പുറത്ത് സിസ്റ്റോളിക് പ്രവർത്തനം വിലയിരുത്താനുള്ള കഴിവ് പരിമിതമാണ്. നിലവിലെ കൈയെഴുത്തുപ്രതിയിൽ, കോൺട്രാക്റ്റൈൽ ഫംഗ്ഷന്റെ സൂചകമായി ഒപ്റ്റിക്കൽ വോൾട്ടേജ് വിലയിരുത്തുന്നതിലൂടെ ഞങ്ങൾ ഈ പരിമിതിയെ ഭാഗികമായി മറികടക്കുന്നു. എന്നിരുന്നാലും, ഈ പരിമിതിക്ക് കൂടുതൽ ജോലി ആവശ്യമായി വരും, കൂടാതെ ഭാവിയിൽ കാൽസ്യം, വോൾട്ടേജ്-സെൻസിറ്റീവ് ഡൈകൾ എന്നിവ ഉപയോഗിച്ച് ഒപ്റ്റിക്കൽ മാപ്പിംഗ് പോലുള്ള കൾച്ചറിലെ ഹാർട്ട് സ്ലൈസുകളുടെ പ്രവർത്തനത്തിന്റെ ഒപ്റ്റിക്കൽ നിരീക്ഷണത്തിനുള്ള രീതികൾ അവതരിപ്പിച്ചുകൊണ്ട് ഇത് പരിഹരിക്കപ്പെട്ടേക്കാം. CTCM ന്റെ മറ്റൊരു പരിമിതി, വർക്കിംഗ് മോഡൽ ഫിസിയോളജിക്കൽ സ്ട്രെസ് (പ്രീലോഡ്, ആഫ്റ്റർലോഡ്) കൈകാര്യം ചെയ്യുന്നില്ല എന്നതാണ്. CTCM-ൽ, വളരെ വലിയ ടിഷ്യൂകളിൽ ഡയസ്റ്റോളിൽ (പൂർണ്ണ സ്ട്രെച്ച്) 25% ഫിസിയോളജിക്കൽ സ്ട്രെച്ച്, സിസ്റ്റോൾ (വൈദ്യുത ഉത്തേജന സമയത്ത് സങ്കോചത്തിന്റെ ദൈർഘ്യം) എന്നിവ പുനർനിർമ്മിക്കുന്നതിന് വിപരീത ദിശകളിലേക്ക് സമ്മർദ്ദം പ്രേരിപ്പിച്ചു. ഭാവിയിലെ CTCM ഡിസൈനുകളിൽ, ഹൃദയകലകളിൽ ഇരുവശത്തുനിന്നും മതിയായ സമ്മർദ്ദം ചെലുത്തിക്കൊണ്ടും ഹൃദയത്തിന്റെ അറകളിൽ സംഭവിക്കുന്ന കൃത്യമായ മർദ്ദ-വ്യാപ്ത ബന്ധങ്ങൾ പ്രയോഗിച്ചുകൊണ്ടും ഈ പരിമിതി നീക്കം ചെയ്യണം.
ഈ കൈയെഴുത്തുപ്രതിയിൽ റിപ്പോർട്ട് ചെയ്തിരിക്കുന്ന ഓവർസ്ട്രെച്ച്-ഇൻഡ്യൂസ്ഡ് റീമോഡലിംഗ് ഹൈപ്പർട്രോഫിക് ഹൈപ്പർസ്ട്രെച്ച് സിഗ്നലുകളെ അനുകരിക്കുന്നതിലേക്ക് പരിമിതപ്പെടുത്തിയിരിക്കുന്നു. അതിനാൽ, ഹ്യൂമറൽ അല്ലെങ്കിൽ ന്യൂറൽ ഘടകങ്ങളുടെ (ഈ സിസ്റ്റത്തിൽ നിലവിലില്ലാത്ത) ആവശ്യമില്ലാതെ തന്നെ സ്ട്രെച്ച്-ഇൻഡ്യൂസ്ഡ് ഹൈപ്പർട്രോഫിക് സിഗ്നലിംഗിനെക്കുറിച്ചുള്ള പഠനത്തിന് ഈ മോഡലിന് സഹായിക്കാനാകും. CTCM ന്റെ ഗുണിതം വർദ്ധിപ്പിക്കുന്നതിന് കൂടുതൽ പഠനങ്ങൾ ആവശ്യമാണ്, ഉദാഹരണത്തിന്, രോഗപ്രതിരോധ കോശങ്ങളുമായി സഹ-കൾച്ചർ ചെയ്യൽ, പ്ലാസ്മ ഹ്യൂമറൽ ഘടകങ്ങൾ പ്രചരിപ്പിക്കൽ, ന്യൂറോണൽ കോശങ്ങളുമായി സഹ-കൾച്ചർ ചെയ്യുമ്പോൾ കണ്ടുപിടുത്തം എന്നിവ CTCM ഉപയോഗിച്ച് രോഗ മോഡലിംഗിന്റെ സാധ്യതകൾ മെച്ചപ്പെടുത്തും.
ഈ പഠനത്തിൽ പതിമൂന്ന് പന്നികളെ ഉപയോഗിച്ചു. എല്ലാ മൃഗ നടപടിക്രമങ്ങളും സ്ഥാപന മാർഗ്ഗനിർദ്ദേശങ്ങൾക്കനുസൃതമായി നടപ്പിലാക്കുകയും ലൂയിസ്‌വില്ലെ സർവകലാശാലയിലെ ഇൻസ്റ്റിറ്റ്യൂഷണൽ ആനിമൽ കെയർ ആൻഡ് യൂസ് കമ്മിറ്റി അംഗീകരിക്കുകയും ചെയ്തു. അയോർട്ടിക് ആർക്ക് ക്ലാമ്പ് ചെയ്യുകയും ഹൃദയം 1 ലിറ്റർ സ്റ്റെറൈൽ കാർഡിയോപ്ലെജിയ (110 mM NaCl, 1.2 mM CaCl2, 16 mM KCl, 16 mM MgCl2, 10 mM NaHCO3, 5 U/mL ഹെപ്പാരിൻ, pH 7.4 വരെ) ഉപയോഗിച്ച് പെർഫ്യൂസ് ചെയ്യുകയും ചെയ്തു; സാധാരണയായി 10 മിനിറ്റിനുള്ളിൽ ഐസിൽ ലാബിലേക്ക് കൊണ്ടുപോകുന്നതുവരെ ഹൃദയങ്ങൾ ഐസ്-കോൾഡ് കാർഡിയോപ്ലെജിക് ലായനിയിൽ സൂക്ഷിച്ചിരുന്നു. സാധാരണയായി 10 മിനിറ്റിനുള്ളിൽ ഐസിൽ ലാബിലേക്ക് കൊണ്ടുപോകുന്നതുവരെ ഹൃദയങ്ങൾ ഐസ്-കോൾഡ് കാർഡിയോപ്ലെജിക് ലായനിയിൽ സൂക്ഷിച്ചിരുന്നു. സെർഡ്സാ ക്രാനിലി വോ ലെഡിയനോം കർദിയോപ്ലെഗിചെസ്‌കോം റസ്‌റ്റ്‌വോറെ ഡൊ ട്രാൻസ്‌പോർട്ടിറോവ്‌കി വ്യൂ ലബോറട്ടറിസ് ന ലുഡു, <10 മിനിറ്റ്. ഐസിൽ ലബോറട്ടറിയിലേക്ക് കൊണ്ടുപോകുന്നതുവരെ ഹൃദയങ്ങൾ ഐസ്-കോൾഡ് കാർഡിയോപ്ലെജിക് ലായനിയിൽ സൂക്ഷിച്ചിരുന്നു, സാധാരണയായി 10 മിനിറ്റിൽ താഴെ മാത്രമേ എടുക്കൂ.将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钟。将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钟。 ഡെർജിറ്റെ സെർഡ്‌സാ വ ലെഡിയനോയ് കർദിയോപ്ലേഗി ഡൊ ട്രാൻസ്‌പോർട്ടിറോവ്കി വ് ലബോറട്ടറിയിൽ ലിഡു, ഒബിച്നോ <10 മി. സാധാരണയായി 10 മിനിറ്റിനു താഴെ, ഐസിൽ ലബോറട്ടറിയിലേക്ക് കൊണ്ടുപോകുന്നതുവരെ ഹൃദയങ്ങൾ ഐസ് കാർഡിയോപ്ലെജിയയിൽ സൂക്ഷിക്കുക.
സോളിഡ് വർക്ക്സ് കമ്പ്യൂട്ടർ-എയ്ഡഡ് ഡിസൈൻ (CAD) സോഫ്റ്റ്‌വെയറിൽ വികസിപ്പിച്ചെടുത്തതാണ് CTCM ഉപകരണം. കൾച്ചർ ചേമ്പറുകൾ, ഡിവൈഡറുകൾ, എയർ ചേമ്പറുകൾ എന്നിവ CNC ക്ലിയർ അക്രിലിക് പ്ലാസ്റ്റിക് ഉപയോഗിച്ചാണ് നിർമ്മിച്ചിരിക്കുന്നത്. 7mm വ്യാസമുള്ള ബാക്ക്-അപ്പ് റിംഗ് മധ്യഭാഗത്ത് ഉയർന്ന സാന്ദ്രതയുള്ള പോളിയെത്തിലീൻ (HDPE) കൊണ്ടാണ് നിർമ്മിച്ചിരിക്കുന്നത്, കൂടാതെ മീഡിയയെ സീൽ ചെയ്യാൻ ഉപയോഗിക്കുന്ന സിലിക്കൺ ഓ-റിംഗ് ഉൾക്കൊള്ളാൻ ഒരു o-റിംഗ് ഗ്രൂവും ഉണ്ട്. ഒരു നേർത്ത സിലിക്ക മെംബ്രൺ കൾച്ചർ ചേമ്പറിനെ സെപ്പറേഷൻ പ്ലേറ്റിൽ നിന്ന് വേർതിരിക്കുന്നു. 0.02″ കട്ടിയുള്ള സിലിക്കൺ ഷീറ്റിൽ നിന്ന് ലേസർ കട്ട് ചെയ്ത സിലിക്കൺ മെംബ്രണും 35A കാഠിന്യവുമുണ്ട്. അടിഭാഗത്തെയും മുകളിലെയും സിലിക്കൺ ഗാസ്കറ്റുകൾ 1/16″ കട്ടിയുള്ള സിലിക്കൺ ഷീറ്റിൽ നിന്ന് ലേസർ കട്ട് ചെയ്തതും 50A കാഠിന്യമുള്ളതുമാണ്. ബ്ലോക്ക് ഉറപ്പിക്കുന്നതിനും എയർടൈറ്റ് സീൽ സൃഷ്ടിക്കുന്നതിനും 316L സ്റ്റെയിൻലെസ് സ്റ്റീൽ സ്ക്രൂകളും വിംഗ് നട്ടുകളും ഉപയോഗിക്കുന്നു.
C-PACE-EM സിസ്റ്റവുമായി സംയോജിപ്പിക്കുന്നതിനായി ഒരു ഡെഡിക്കേറ്റഡ് പ്രിന്റഡ് സർക്യൂട്ട് ബോർഡ് (PCB) രൂപകൽപ്പന ചെയ്‌തിരിക്കുന്നു. PCB-യിലെ സ്വിസ് മെഷീൻ കണക്റ്റർ സോക്കറ്റുകൾ വെള്ളി പൂശിയ ചെമ്പ് വയറുകളും ഇലക്ട്രോഡുകളിൽ സ്ക്രൂ ചെയ്ത വെങ്കല 0-60 സ്ക്രൂകളും ഉപയോഗിച്ച് ഗ്രാഫൈറ്റ് ഇലക്ട്രോഡുകളുമായി ബന്ധിപ്പിച്ചിരിക്കുന്നു. പ്രിന്റഡ് സർക്യൂട്ട് ബോർഡ് 3D പ്രിന്ററിന്റെ കവറിൽ സ്ഥാപിച്ചിരിക്കുന്നു.
ഒരു പ്രോഗ്രാമബിൾ ന്യൂമാറ്റിക് ആക്യുവേറ്റർ (PPD) ആണ് CTCM ഉപകരണം നിയന്ത്രിക്കുന്നത്, ഇത് ഒരു കാർഡിയാക് സൈക്കിളിന് സമാനമായ ഒരു നിയന്ത്രിത രക്തചംക്രമണ മർദ്ദം സൃഷ്ടിക്കുന്നു. എയർ ചേമ്പറിനുള്ളിലെ മർദ്ദം വർദ്ധിക്കുന്നതിനനുസരിച്ച്, വഴക്കമുള്ള സിലിക്കൺ മെംബ്രൺ മുകളിലേക്ക് വികസിക്കുകയും, ടിഷ്യു സൈറ്റിന് കീഴിലുള്ള മാധ്യമത്തെ നിർബന്ധിക്കുകയും ചെയ്യുന്നു. ദ്രാവകത്തിന്റെ ഈ പുറന്തള്ളൽ വഴി ടിഷ്യുവിന്റെ വിസ്തീർണ്ണം നീട്ടപ്പെടും, ഇത് ഡയസ്റ്റോളിന്റെ സമയത്ത് ഹൃദയത്തിന്റെ ഫിസിയോളജിക്കൽ വികാസത്തെ അനുകരിക്കുന്നു. വിശ്രമത്തിന്റെ ഉച്ചസ്ഥായിയിൽ, ഗ്രാഫൈറ്റ് ഇലക്ട്രോഡുകൾ വഴി വൈദ്യുത ഉത്തേജനം പ്രയോഗിച്ചു, ഇത് എയർ ചേമ്പറിലെ മർദ്ദം കുറയ്ക്കുകയും ടിഷ്യു വിഭാഗങ്ങളുടെ സങ്കോചത്തിന് കാരണമാവുകയും ചെയ്തു. വായു സംവിധാനത്തിലെ മർദ്ദം കണ്ടെത്തുന്നതിന് ഒരു പ്രഷർ സെൻസറുള്ള ഒരു ഹെമോസ്റ്റാറ്റിക് വാൽവ് പൈപ്പിനുള്ളിൽ ഉണ്ട്. പ്രഷർ സെൻസർ മനസ്സിലാക്കുന്ന മർദ്ദം ലാപ്‌ടോപ്പുമായി ബന്ധിപ്പിച്ചിരിക്കുന്ന ഒരു ഡാറ്റ കളക്ടറിൽ പ്രയോഗിക്കുന്നു. ഇത് ഗ്യാസ് ചേമ്പറിനുള്ളിലെ മർദ്ദം തുടർച്ചയായി നിരീക്ഷിക്കാൻ അനുവദിക്കുന്നു. പരമാവധി ചേമ്പർ മർദ്ദം (സ്റ്റാൻഡേർഡ് 80 mmHg, 140 mmHg OS) എത്തുമ്പോൾ, ഡാറ്റാ അക്വിസിഷൻ ഉപകരണത്തോട് 2 ms നായി 4 V ആയി സജ്ജീകരിച്ചിരിക്കുന്ന ഒരു ബൈഫാസിക് വോൾട്ടേജ് സിഗ്നൽ സൃഷ്ടിക്കുന്നതിന് C-PACE-EM സിസ്റ്റത്തിലേക്ക് ഒരു സിഗ്നൽ അയയ്ക്കാൻ ഉത്തരവിട്ടു.
ഹൃദയ ഭാഗങ്ങൾ എടുക്കുകയും 6 കിണറുകളിലെ കൾച്ചർ അവസ്ഥകൾ ഇനിപ്പറയുന്ന രീതിയിൽ നടത്തുകയും ചെയ്തു: വിളവെടുത്ത ഹൃദയങ്ങളെ ട്രാൻസ്ഫർ പാത്രത്തിൽ നിന്ന് തണുത്ത (4° C) കാർഡിയോപ്ലെജിയ അടങ്ങിയ ഒരു ട്രേയിലേക്ക് മാറ്റുക. ഇടത് വെൻട്രിക്കിൾ ഒരു സ്റ്റെറൈൽ ബ്ലേഡ് ഉപയോഗിച്ച് വേർതിരിച്ച് 1-2 cm3 കഷണങ്ങളായി മുറിക്കുക. ഈ ടിഷ്യു ബ്ലോക്കുകൾ ടിഷ്യു പശ ഉപയോഗിച്ച് ടിഷ്യു സപ്പോർട്ടുകളിൽ ഘടിപ്പിച്ച് ടൈറോഡിന്റെ ലായനി അടങ്ങിയ വൈബ്രേറ്റിംഗ് മൈക്രോടോം ടിഷ്യു ബാത്തിൽ സ്ഥാപിക്കുകയും തുടർച്ചയായി ഓക്സിജൻ നൽകുകയും ചെയ്തു (3 g/L 2,3-ബ്യൂട്ടാനെഡിയോൺ മോണോഓക്സിം (BDM), 140 mM NaCl (8.18 g). , 6 mM KCl (0.447 g), 10 mM D-ഗ്ലൂക്കോസ് (1.86 g), 10 mM HEPES (2.38 g), 1 mM MgCl2 (1 ml 1 M ലായനി), 1.8 mM CaCl2 (1.8 ml 1 M ലായനി), 1 L ddH2O വരെ. വൈബ്രേറ്റിംഗ് മൈക്രോടോം 80 Hz ആവൃത്തിയിൽ 300 µm കട്ടിയുള്ള കഷ്ണങ്ങൾ മുറിക്കാൻ സജ്ജമാക്കി, 2 mm തിരശ്ചീന വൈബ്രേഷൻ ആംപ്ലിറ്റ്യൂഡും 0.03 mm/s അഡ്വാൻസ് നിരക്കും നൽകി. ലായനി തണുപ്പിക്കുന്നതിനായി ടിഷ്യു ബാത്ത് ഐസ് കൊണ്ട് ചുറ്റപ്പെട്ടു, താപനില 4°C-ൽ നിലനിർത്തി. ഒരു കൾച്ചർ പ്ലേറ്റിന് ആവശ്യമായ ഭാഗങ്ങൾ ലഭിക്കുന്നതുവരെ മൈക്രോടോം ബാത്തിൽ നിന്ന് ടിഷ്യു ഭാഗങ്ങൾ ഐസിൽ തുടർച്ചയായി ഓക്സിജൻ അടങ്ങിയ ടൈറോഡ് ലായനി അടങ്ങിയ ഇൻകുബേഷൻ ബാത്തിലേക്ക് മാറ്റുക. ട്രാൻസ്‌വെൽ കൾച്ചറുകൾക്ക്, ടിഷ്യു ഭാഗങ്ങൾ അണുവിമുക്തമായ 6 mm വീതിയുള്ള പോളിയുറീൻ സപ്ലിമെന്റുകളിൽ ഘടിപ്പിച്ച് 6 ml ഒപ്റ്റിമൈസ് ചെയ്ത മീഡിയത്തിൽ (199 മീഡിയം, 1x ITS സപ്ലിമെന്റ്, 10% FBS, 5 ng/ml VEGF, 10 ng/ml FGF-ആൽക്കലൈൻ, 2X ആന്റിബയോട്ടിക്-ആന്റിഫംഗൽ) സ്ഥാപിച്ചു. C-Pace വഴി ടിഷ്യു വിഭാഗങ്ങളിൽ വൈദ്യുത ഉത്തേജനം (10 V, ഫ്രീക്വൻസി 1.2 Hz) പ്രയോഗിച്ചു. TD അവസ്ഥകൾക്ക്, 100 nM ലും ഓരോ മീഡിയം മാറ്റത്തിലും 1 μM ലും പുതിയ T3 ഉം Dex ഉം ചേർത്തു. ഒരു ദിവസം 3 തവണ മാറ്റിസ്ഥാപിക്കുന്നതിന് മുമ്പ് മീഡിയം ഓക്സിജൻ ഉപയോഗിച്ച് പൂരിതമാക്കുന്നു. 37°C ലും 5% CO2 ലും ഇൻകുബേറ്ററിൽ ടിഷ്യു ഭാഗങ്ങൾ കൾച്ചർ ചെയ്തു.
CTCM കൾച്ചറുകൾക്കായി, പരിഷ്കരിച്ച ടൈറോഡിന്റെ ലായനി അടങ്ങിയ ഒരു പെട്രി ഡിഷിലെ ഒരു ഇഷ്ടാനുസൃതമായി നിർമ്മിച്ച 3D പ്രിന്ററിൽ ടിഷ്യു ഭാഗങ്ങൾ സ്ഥാപിച്ചു. സപ്പോർട്ട് റിങ്ങിന്റെ വിസ്തൃതിയുടെ 25% ഹൃദയത്തിന്റെ ഭാഗത്തിന്റെ വലുപ്പം വർദ്ധിപ്പിക്കുന്നതിനാണ് ഉപകരണം രൂപകൽപ്പന ചെയ്തിരിക്കുന്നത്. ടൈറോഡിന്റെ ലായനിയിൽ നിന്ന് മീഡിയത്തിലേക്ക് മാറ്റിയതിനുശേഷവും ഡയസ്റ്റോളിനിടെയും ഹൃദയത്തിന്റെ ഭാഗങ്ങൾ വലിച്ചുനീട്ടാതിരിക്കാനാണ് ഇത് ചെയ്യുന്നത്. ഹിസ്റ്റോഅക്രിലിക് പശ ഉപയോഗിച്ച്, 300 µm കട്ടിയുള്ള ഭാഗങ്ങൾ 7 മില്ലീമീറ്റർ വ്യാസമുള്ള ഒരു സപ്പോർട്ട് റിംഗിൽ ഉറപ്പിച്ചു. ടിഷ്യു ഭാഗങ്ങൾ സപ്പോർട്ട് റിംഗിൽ ഘടിപ്പിച്ച ശേഷം, അധിക ടിഷ്യു ഭാഗങ്ങൾ മുറിച്ചുമാറ്റി, ഒരു ഉപകരണത്തിന് ആവശ്യമായ ഭാഗങ്ങൾ തയ്യാറാക്കുന്നതുവരെ ഘടിപ്പിച്ച ടിഷ്യു ഭാഗങ്ങൾ ഐസിലെ (4°C) ടൈറോഡ് ലായനിയുടെ ബാത്തിൽ തിരികെ വയ്ക്കുക. എല്ലാ ഉപകരണങ്ങൾക്കുമുള്ള ആകെ പ്രോസസ്സിംഗ് സമയം 2 മണിക്കൂറിൽ കൂടരുത്. 6 ടിഷ്യു വിഭാഗങ്ങൾ അവയുടെ സപ്പോർട്ട് റിംഗുകളിൽ ഘടിപ്പിച്ച ശേഷം, CTCM ഉപകരണം കൂട്ടിച്ചേർക്കപ്പെട്ടു. CTCM കൾച്ചർ ചേമ്പർ 21 മില്ലി പ്രീ-ഓക്സിജനേറ്റഡ് മീഡിയം ഉപയോഗിച്ച് മുൻകൂട്ടി നിറച്ചിരിക്കുന്നു. ടിഷ്യു ഭാഗങ്ങൾ കൾച്ചർ ചേമ്പറിലേക്ക് മാറ്റുകയും ഒരു പൈപ്പറ്റ് ഉപയോഗിച്ച് വായു കുമിളകൾ ശ്രദ്ധാപൂർവ്വം നീക്കം ചെയ്യുകയും ചെയ്യുക. തുടർന്ന് ടിഷ്യു വിഭാഗം ദ്വാരത്തിലേക്ക് നയിക്കുകയും സൌമ്യമായി അമർത്തുകയും ചെയ്യുന്നു. ഒടുവിൽ, ഉപകരണത്തിൽ ഇലക്ട്രോഡ് തൊപ്പി സ്ഥാപിച്ച് ഉപകരണം ഇൻകുബേറ്ററിലേക്ക് മാറ്റുക. തുടർന്ന് CTCM എയർ ട്യൂബിലേക്കും C-PACE-EM സിസ്റ്റത്തിലേക്കും ബന്ധിപ്പിക്കുക. ന്യൂമാറ്റിക് ആക്യുവേറ്റർ തുറക്കുകയും എയർ വാൽവ് CTCM തുറക്കുകയും ചെയ്യുന്നു. 2 ms ബൈഫാസിക് പേസിംഗിൽ 1.2 Hz-ൽ 4 V നൽകുന്നതിന് C-PACE-EM സിസ്റ്റം കോൺഫിഗർ ചെയ്‌തു. മീഡിയം ഒരു ദിവസം രണ്ടുതവണ മാറ്റി, ഇലക്ട്രോഡുകളിൽ ഗ്രാഫൈറ്റ് അടിഞ്ഞുകൂടുന്നത് ഒഴിവാക്കാൻ ഇലക്ട്രോഡുകൾ ഒരു ദിവസം ഒരിക്കൽ മാറ്റി. ആവശ്യമെങ്കിൽ, ടിഷ്യു ഭാഗങ്ങൾ അവയുടെ കൾച്ചർ കിണറുകളിൽ നിന്ന് നീക്കം ചെയ്ത് അവയ്ക്ക് കീഴിൽ വീണേക്കാവുന്ന ഏതെങ്കിലും വായു കുമിളകൾ പുറന്തള്ളാൻ കഴിയും. MT ചികിത്സാ സാഹചര്യങ്ങളിൽ, 100 nM T3, 1 μM Dex എന്നിവ ഉപയോഗിച്ച് ഓരോ മീഡിയം മാറ്റവും ഉപയോഗിച്ച് T3/Dex പുതുതായി ചേർത്തു. CTCM ഉപകരണങ്ങൾ 37°C, 5% CO2 എന്നിവയിൽ ഒരു ഇൻകുബേറ്ററിൽ കൾച്ചർ ചെയ്‌തു.
ഹൃദയ സ്ലൈസുകളുടെ സ്ട്രെച്ചഡ് ട്രെജക്ടറികൾ ലഭിക്കുന്നതിന്, ഒരു പ്രത്യേക ക്യാമറ സിസ്റ്റം വികസിപ്പിച്ചെടുത്തു. നാവിറ്റാർ സൂം 7000 18-108mm മാക്രോ ലെൻസിനൊപ്പം (നാവിറ്റാർ, സാൻ ഫ്രാൻസിസ്കോ, കാലിഫോർണിയ) ഒരു SLR ക്യാമറ ഉപയോഗിച്ചു. മീഡിയം പുതിയ മീഡിയം ഉപയോഗിച്ച് മാറ്റിസ്ഥാപിച്ച ശേഷം മുറിയിലെ താപനിലയിൽ ദൃശ്യവൽക്കരണം നടത്തി. ക്യാമറ 51° ആംഗിളിൽ സ്ഥാപിച്ചിരിക്കുന്നു, വീഡിയോ സെക്കൻഡിൽ 30 ഫ്രെയിമുകളിൽ റെക്കോർഡുചെയ്യുന്നു. ആദ്യം, ഹൃദയ സ്ലൈസുകളുടെ ചലനം അളക്കാൻ ഓപ്പൺ സോഴ്‌സ് സോഫ്റ്റ്‌വെയർ (MUSCLEMOTION43) ഇമേജ്-ജെ ഉപയോഗിച്ച് ഉപയോഗിച്ചു. ശബ്ദം ഒഴിവാക്കാൻ ഹൃദയ സ്ലൈസുകൾ അടിക്കുന്നതിന് താൽപ്പര്യമുള്ള പ്രദേശങ്ങൾ നിർവചിക്കുന്നതിന് MATLAB (MathWorks, Natick, MA, USA) ഉപയോഗിച്ചാണ് മാസ്ക് സൃഷ്ടിച്ചത്. ഒരു ഫ്രെയിം ശ്രേണിയിലെ എല്ലാ ചിത്രങ്ങളിലും സ്വമേധയാ സെഗ്‌മെന്റഡ് മാസ്കുകൾ പ്രയോഗിക്കുകയും തുടർന്ന് MUSCLEMOTION പ്ലഗ്-ഇന്നിലേക്ക് കൈമാറുകയും ചെയ്യുന്നു. റഫറൻസ് ഫ്രെയിമുമായി താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ അതിന്റെ ചലനം അളക്കുന്നതിന് മസിൽ മോഷൻ ഓരോ ഫ്രെയിമിലെയും പിക്സലുകളുടെ ശരാശരി തീവ്രത ഉപയോഗിക്കുന്നു. ഡാറ്റ റെക്കോർഡുചെയ്‌ത് ഫിൽട്ടർ ചെയ്‌ത് സൈക്കിൾ സമയം അളക്കുന്നതിനും കാർഡിയാക് സൈക്കിളിൽ ടിഷ്യു സ്ട്രെച്ച് വിലയിരുത്തുന്നതിനും ഉപയോഗിച്ചു. റെക്കോർഡുചെയ്‌ത വീഡിയോ ഒരു ഫസ്റ്റ്-ഓർഡർ സീറോ-ഫേസ് ഡിജിറ്റൽ ഫിൽട്ടർ ഉപയോഗിച്ച് പോസ്റ്റ്-പ്രോസസ് ചെയ്‌തു. ടിഷ്യു സ്ട്രെച്ച് (പീക്ക്-ടു-പീക്ക്) അളക്കുന്നതിന്, റെക്കോർഡുചെയ്‌ത സിഗ്നലിലെ കൊടുമുടികളും ട്രോകളും തമ്മിൽ വേർതിരിച്ചറിയാൻ പീക്ക്-ടു-പീക്ക് വിശകലനം നടത്തി. കൂടാതെ, സിഗ്നൽ ഡ്രിഫ്റ്റ് ഇല്ലാതാക്കാൻ ആറാം ഓർഡർ പോളിനോമിയൽ ഉപയോഗിച്ച് ഡീട്രെൻഡിംഗ് നടത്തുന്നു. ആഗോള ടിഷ്യു ചലനം, സൈക്കിൾ സമയം, വിശ്രമ സമയം, സങ്കോച സമയം (സപ്ലിമെന്ററി പ്രോഗ്രാം കോഡ് 44) എന്നിവ നിർണ്ണയിക്കാൻ MATLAB-ൽ പ്രോഗ്രാം കോഡ് വികസിപ്പിച്ചെടുത്തു.
മെക്കാനിക്കൽ സ്ട്രെച്ച് അസസ്‌മെന്റിനായി സൃഷ്ടിച്ച അതേ വീഡിയോകൾ ഉപയോഗിച്ച്, സ്ട്രെയിൻ വിശകലനത്തിനായി, MUSCLEMOTION സോഫ്റ്റ്‌വെയർ അനുസരിച്ച് ചലന കൊടുമുടികളെ (ഏറ്റവും ഉയർന്ന (മുകളിലെ) ഏറ്റവും താഴ്ന്ന (താഴ്ന്ന) ചലന പോയിന്റുകൾ) പ്രതിനിധീകരിക്കുന്ന രണ്ട് ചിത്രങ്ങൾ ഞങ്ങൾ ആദ്യം കണ്ടെത്തി. തുടർന്ന് ഞങ്ങൾ ടിഷ്യു മേഖലകളെ വിഭജിച്ച് സെഗ്‌മെന്റഡ് ടിഷ്യുവിൽ ഒരു തരം ഷേഡിംഗ് അൽഗോരിതം പ്രയോഗിച്ചു (അനുബന്ധ ചിത്രം 2a). പിന്നീട് സെഗ്‌മെന്റഡ് ടിഷ്യുവിനെ പത്ത് ഉപസർഫസുകളായി വിഭജിച്ചു, ഓരോ ഉപരിതലത്തിലെയും സമ്മർദ്ദം ഇനിപ്പറയുന്ന സമവാക്യം ഉപയോഗിച്ച് കണക്കാക്കി: സ്ട്രെയിൻ = (മുകളിലെ-താഴേക്ക്)/Sdown, ഇവിടെ Sup ഉം Sdown ഉം യഥാക്രമം തുണിയുടെ മുകളിലും താഴെയുമുള്ള നിഴലുകളിൽ നിന്നുള്ള ആകൃതിയുടെ ദൂരമാണ് (അനുബന്ധ ചിത്രം .2b).
ഹൃദയഭാഗങ്ങൾ 4% പാരാഫോർമാൽഡിഹൈഡിൽ 48 മണിക്കൂർ ഉറപ്പിച്ചു. സ്ഥിരമായ കലകളെ 10% ഉം 20% സുക്രോസും ഉപയോഗിച്ച് 1 മണിക്കൂർ നേരത്തേക്ക് നിർജ്ജലീകരണം ചെയ്തു, തുടർന്ന് 30% സുക്രോസിൽ രാത്രി മുഴുവൻ ചേർത്തു. പിന്നീട് ഭാഗങ്ങൾ ഒപ്റ്റിമൽ കട്ടിംഗ് ടെമ്പറേച്ചർ കോമ്പൗണ്ടിൽ (OCT കോമ്പൗണ്ട്) ഉൾച്ചേർക്കുകയും ക്രമേണ ഒരു ഐസോപെന്റേൻ/ഡ്രൈ ഐസ് ബാത്തിൽ മരവിപ്പിക്കുകയും ചെയ്തു. വേർപിരിയുന്നതുവരെ OCT എംബെഡിംഗ് ബ്ലോക്കുകൾ -80 °C ൽ സൂക്ഷിക്കുക. 8 μm കട്ടിയുള്ള ഭാഗങ്ങളായി സ്ലൈഡുകൾ തയ്യാറാക്കി.
ഹൃദയഭാഗങ്ങളിൽ നിന്ന് OCT നീക്കം ചെയ്യാൻ, സ്ലൈഡുകൾ 95 °C-ൽ ഒരു ഹീറ്റിംഗ് ബ്ലോക്കിൽ 5 മിനിറ്റ് ചൂടാക്കുക. ഓരോ സ്ലൈഡിലേക്കും 1 മില്ലി PBS ചേർത്ത് മുറിയിലെ താപനിലയിൽ 30 മിനിറ്റ് ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്യുക, തുടർന്ന് മുറിയിലെ താപനിലയിൽ 15 മിനിറ്റ് PBS-ൽ 0.1% ട്രൈറ്റൺ-എക്സ് സജ്ജീകരിച്ച് വിഭാഗങ്ങളെ പെർമിറ്റ് ചെയ്യുക. നിർദ്ദിഷ്ടമല്ലാത്ത ആന്റിബോഡികൾ സാമ്പിളിൽ ബന്ധിപ്പിക്കുന്നത് തടയാൻ, സ്ലൈഡുകളിലേക്ക് 1 മില്ലി 3% BSA ലായനി ചേർത്ത് മുറിയിലെ താപനിലയിൽ 1 മണിക്കൂർ ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്യുക. തുടർന്ന് BSA നീക്കം ചെയ്യുകയും സ്ലൈഡുകൾ PBS ഉപയോഗിച്ച് കഴുകുകയും ചെയ്തു. ഓരോ സാമ്പിളും പെൻസിൽ ഉപയോഗിച്ച് അടയാളപ്പെടുത്തുക. പ്രാഥമിക ആന്റിബോഡികൾ (1% BSA-യിൽ നേർപ്പിച്ചത് 1:200) (കണെക്സിൻ 43 (Abcam; #AB11370), NFATC4 (Abcam; #AB99431), ട്രോപോണിൻ-T (തെർമോ സയന്റിഫിക്; #MA5-12960) എന്നിവ 90 മിനിറ്റിനുള്ളിൽ ചേർത്തു, തുടർന്ന് മൗസ് അലക്സാ ഫ്ലൂർ 488 (തെർമോ സയന്റിഫിക്; #A16079), മുയൽ അലക്സാ ഫ്ലൂർ 594 (തെർമോ സയന്റിഫിക്; #T6391) എന്നിവയ്‌ക്കെതിരെ സെക്കൻഡറി ആന്റിബോഡികൾ (1% BSA-യിൽ നേർപ്പിച്ചത് 1:200) 90 മിനിറ്റ് കൂടി ചേർത്തു. PBS ഉപയോഗിച്ച് 3 തവണ കഴുകി പശ്ചാത്തലത്തിൽ നിന്ന് ടാർഗെറ്റ് സ്റ്റെയിനിംഗ് വേർതിരിച്ചറിയാൻ, ഞങ്ങൾ സെക്കൻഡറി ആന്റിബോഡി മാത്രം ഒരു നിയന്ത്രണമായി ഉപയോഗിച്ചു. ഒടുവിൽ, DAPI ന്യൂക്ലിയർ സ്റ്റെയിൻ ചേർത്തു, സ്ലൈഡുകൾ ഒരു വെക്റ്റാഷീൽഡിൽ (വെക്റ്റർ ലബോറട്ടറീസ്) സ്ഥാപിച്ച് നെയിൽ പോളിഷ് ഉപയോഗിച്ച് സീൽ ചെയ്തു. -x മാഗ്നിഫിക്കേഷൻ) 40x മാഗ്നിഫിക്കേഷനോടുകൂടിയ കീയൻസ് മൈക്രോസ്കോപ്പും.
പി‌ബി‌എസിൽ 5 μg/ml ൽ WGA-Alexa Fluor 555 (Thermo Scientific; #W32464) WGA സ്റ്റെയിനിംഗിനായി ഉപയോഗിച്ചു, കൂടാതെ മുറിയിലെ താപനിലയിൽ 30 മിനിറ്റ് സ്ഥിരമായ ഭാഗങ്ങളിൽ പ്രയോഗിച്ചു. പിന്നീട് സ്ലൈഡുകൾ PBS ഉപയോഗിച്ച് കഴുകി, ഓരോ സ്ലൈഡിലും സുഡാൻ ബ്ലാക്ക് ചേർത്ത് 30 മിനിറ്റ് ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്തു. തുടർന്ന് സ്ലൈഡുകൾ PBS ഉപയോഗിച്ച് കഴുകി, വെക്റ്റാഷീൽഡ് എംബെഡിംഗ് മീഡിയം ചേർത്തു. 40x മാഗ്നിഫിക്കേഷനിൽ ഒരു കീയൻസ് മൈക്രോസ്കോപ്പിൽ സ്ലൈഡുകൾ ദൃശ്യവൽക്കരിച്ചു.
മുകളിൽ വിവരിച്ചതുപോലെ സാമ്പിളുകളിൽ നിന്ന് OCT നീക്കം ചെയ്തു. OCT നീക്കം ചെയ്തതിനുശേഷം, സ്ലൈഡുകൾ ഒരു രാത്രി മുഴുവൻ ബോയിൻസ് ലായനിയിൽ മുക്കിവയ്ക്കുക. സ്ലൈഡുകൾ 1 മണിക്കൂർ വാറ്റിയെടുത്ത വെള്ളത്തിൽ കഴുകി, തുടർന്ന് 10 മിനിറ്റ് ബിബ്രിച്ച് ആലോ ആസിഡ് ഫ്യൂസിൻ ലായനിയിൽ വച്ചു. തുടർന്ന് സ്ലൈഡുകൾ വാറ്റിയെടുത്ത വെള്ളത്തിൽ കഴുകി 5% ഫോസ്ഫോമോളിബ്ഡിനം/5% ഫോസ്ഫോട്ടൂങ്സ്റ്റിക് ആസിഡ് ലായനിയിൽ 10 മിനിറ്റ് വച്ചു. കഴുകിക്കളയാതെ, സ്ലൈഡുകൾ നേരിട്ട് അനിലിൻ നീല ലായനിയിലേക്ക് 15 മിനിറ്റ് മാറ്റുക. തുടർന്ന് സ്ലൈഡുകൾ വാറ്റിയെടുത്ത വെള്ളത്തിൽ കഴുകി 1% അസറ്റിക് ആസിഡ് ലായനിയിൽ 2 മിനിറ്റ് വച്ചു. സ്ലൈഡുകൾ 200 N എത്തനോളിൽ ഉണക്കി സൈലീനിലേക്ക് മാറ്റി. 10x ഒബ്ജക്റ്റീവ് ഉപയോഗിച്ച് ഒരു കീയൻസ് മൈക്രോസ്കോപ്പ് ഉപയോഗിച്ച് സ്റ്റെയിൻ ചെയ്ത സ്ലൈഡുകൾ ദൃശ്യവൽക്കരിച്ചു. കീയൻസ് അനലൈസർ സോഫ്റ്റ്‌വെയർ ഉപയോഗിച്ച് ഫൈബ്രോസിസ് ഏരിയ ശതമാനം കണക്കാക്കി.
CyQUANT™ MTT സെൽ വയബിലിറ്റി അസ്സേ (ഇൻവിട്രോജൻ, കാൾസ്ബാഡ്, CA), കാറ്റലോഗ് നമ്പർ V13154, നിർമ്മാതാവിന്റെ പ്രോട്ടോക്കോൾ അനുസരിച്ച് ചില പരിഷ്കാരങ്ങളോടെ. പ്രത്യേകിച്ചും, MTT വിശകലന സമയത്ത് ഏകീകൃത ടിഷ്യു വലുപ്പം ഉറപ്പാക്കാൻ 6 മില്ലീമീറ്റർ വ്യാസമുള്ള ഒരു സർജിക്കൽ പഞ്ച് ഉപയോഗിച്ചു. നിർമ്മാതാവിന്റെ പ്രോട്ടോക്കോൾ അനുസരിച്ച് MTT സബ്‌സ്‌ട്രേറ്റ് അടങ്ങിയ 12-കിണർ പ്ലേറ്റിന്റെ കിണറുകളിൽ ടിഷ്യുകൾ വ്യക്തിഗതമായി പ്ലേറ്റ് ചെയ്തു. ഭാഗങ്ങൾ 37° C താപനിലയിൽ 3 മണിക്കൂർ ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്യുന്നു, ജീവനുള്ള ടിഷ്യു MTT സബ്‌സ്‌ട്രേറ്റിനെ മെറ്റബോളിസ് ചെയ്ത് ഒരു പർപ്പിൾ ഫോർമാസാൻ സംയുക്തം ഉണ്ടാക്കുന്നു. MTT ലായനി 1 മില്ലി DMSO ഉപയോഗിച്ച് മാറ്റി 37°C താപനിലയിൽ 15 മിനിറ്റ് ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്ത് ഹൃദയ ഭാഗങ്ങളിൽ നിന്ന് പർപ്പിൾ ഫോർമാസാൻ വേർതിരിച്ചെടുക്കുന്നു. സാമ്പിളുകൾ DMSO-യിൽ 1:10 എന്ന അനുപാതത്തിൽ 96-വെൽ ക്ലിയർ അടിഭാഗ പ്ലേറ്റുകളിൽ നേർപ്പിച്ചു, സൈറ്റേഷൻ പ്ലേറ്റ് റീഡർ (ബയോടെക്) ഉപയോഗിച്ച് 570 nm-ൽ പർപ്പിൾ വർണ്ണ തീവ്രത അളന്നു. ഹൃദയത്തിന്റെ ഓരോ സ്ലൈസിന്റെയും ഭാരത്തിലേക്ക് വായനകൾ സാധാരണമാക്കി.
മുമ്പ് വിവരിച്ചതുപോലെ ഗ്ലൂക്കോസ് ഉപയോഗ പരിശോധനയ്ക്കായി 1 μCi/ml [5-3H]-ഗ്ലൂക്കോസ് (മൊറാവെക് ബയോകെമിക്കൽസ്, ബ്രിയ, CA, USA) അടങ്ങിയ മീഡിയ ഉപയോഗിച്ച് ഹാർട്ട് സ്ലൈസ് മീഡിയ മാറ്റിസ്ഥാപിച്ചു. 4 മണിക്കൂർ ഇൻകുബേഷനുശേഷം, 0.2 N HCl യുടെ 100 µl അടങ്ങിയ ഒരു തുറന്ന മൈക്രോസെൻട്രിഫ്യൂജ് ട്യൂബിലേക്ക് 100 µl മീഡിയം ചേർക്കുക. തുടർന്ന് ട്യൂബ് 500 μl dH2O അടങ്ങിയ ഒരു സിന്റിലേഷൻ ട്യൂബിൽ 37°C ൽ 72 മണിക്കൂർ ബാഷ്പീകരിക്കാൻ [3H]2O സ്ഥാപിച്ചു. തുടർന്ന് സിന്റിലേഷൻ ട്യൂബിൽ നിന്ന് മൈക്രോസെൻട്രിഫ്യൂജ് ട്യൂബ് നീക്കം ചെയ്ത് 10 മില്ലി സിന്റിലേഷൻ ദ്രാവകം ചേർക്കുക. ട്രൈ-കാർബ് 2900TR ലിക്വിഡ് സിന്റിലേഷൻ അനലൈസർ (പാക്കാർഡ് ബയോസയൻസ് കമ്പനി, മെറിഡൻ, CT, USA) ഉപയോഗിച്ച് സിന്റിലേഷൻ എണ്ണൽ നടത്തി. [5-3H]-ഗ്ലൂക്കോസ് നിർദ്ദിഷ്ട പ്രവർത്തനം, അപൂർണ്ണമായ സന്തുലിതാവസ്ഥയും പശ്ചാത്തലവും, [5-3H]-ലേബൽ ചെയ്യാത്ത ഗ്ലൂക്കോസിലേക്ക് നേർപ്പിക്കൽ, സിന്റിലേഷൻ കൗണ്ടർ കാര്യക്ഷമത എന്നിവ കണക്കിലെടുത്താണ് ഗ്ലൂക്കോസ് ഉപയോഗം കണക്കാക്കിയത്. ഹൃദയത്തിന്റെ ഭാഗങ്ങളുടെ പിണ്ഡത്തിലേക്ക് ഡാറ്റ സാധാരണവൽക്കരിക്കുന്നു.
ട്രൈസോളിലെ ടിഷ്യു ഹോമോജനൈസേഷനുശേഷം, നിർമ്മാതാവിന്റെ പ്രോട്ടോക്കോൾ അനുസരിച്ച് Qiagen miRNeasy മൈക്രോ കിറ്റ് #210874 ഉപയോഗിച്ച് ഹൃദയഭാഗങ്ങളിൽ നിന്ന് RNA വേർതിരിച്ചു. RNAsec ലൈബ്രറി തയ്യാറാക്കൽ, ക്രമപ്പെടുത്തൽ, ഡാറ്റ വിശകലനം എന്നിവ ഇനിപ്പറയുന്ന രീതിയിൽ നടത്തി:
ആർ‌എൻ‌എ ലൈബ്രറി തയ്യാറാക്കുന്നതിനായി ഒരു സാമ്പിളിന് 1 μg ആർ‌എൻ‌എ പ്രാരംഭ മെറ്റീരിയലായി ഉപയോഗിച്ചു. നിർമ്മാതാവിന്റെ ശുപാർശകളെ തുടർന്ന് NEBNext അൾട്രാ TM ആർ‌എൻ‌എ ലൈബ്രറി പ്രിപ്പറേഷൻ കിറ്റ് ഫോർ ഇല്ലുമിന (NEB, യുഎസ്എ) ഉപയോഗിച്ചാണ് സീക്വൻസിങ് ലൈബ്രറികൾ സൃഷ്ടിച്ചത്, കൂടാതെ ഓരോ സാമ്പിളിനുമുള്ള ആട്രിബ്യൂട്ട് സീക്വൻസുകളിൽ ഇൻഡെക്സ് കോഡുകൾ ചേർത്തു. ചുരുക്കത്തിൽ, പോളി-ടി ഒലിഗോ ന്യൂക്ലിയോടൈഡുകൾ ഘടിപ്പിച്ച കാന്തിക ബീഡുകൾ ഉപയോഗിച്ച് മൊത്തം ആർ‌എൻ‌എയിൽ നിന്ന് എം‌ആർ‌എൻ‌എ ശുദ്ധീകരിച്ചു. NEBNext ഫസ്റ്റ് സ്ട്രാൻഡ് സിന്തസിസ് റിയാക്ഷൻ ബഫറിൽ (5X) ഉയർന്ന താപനിലയിൽ ഡൈവാലന്റ് കാറ്റേഷനുകൾ ഉപയോഗിച്ചാണ് ഫ്രാഗ്മെന്റേഷൻ നടത്തുന്നത്. റാൻഡം ഹെക്സാമർ പ്രൈമറുകളും എം-മുൾവി റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റേസും (ആർ‌എൻ‌എ‌എസ് എച്ച്-) ഉപയോഗിച്ചാണ് ആദ്യ സ്ട്രാൻഡ് സിഡി‌എൻ‌എ സമന്വയിപ്പിച്ചത്. രണ്ടാമത്തെ സ്ട്രാൻഡ് സിഡി‌എൻ‌എയെ ഡി‌എൻ‌എ പോളിമറേസ് I, ആർ‌എൻ‌എ‌എസ് എച്ച് എന്നിവ ഉപയോഗിച്ച് സമന്വയിപ്പിക്കുന്നു. ശേഷിക്കുന്ന ഓവർഹാംഗുകൾ എക്സോണുക്ലീസ്/പോളിമറേസ് പ്രവർത്തനം വഴി ബ്ലണ്ട് അറ്റങ്ങളാക്കി മാറ്റുന്നു. ഡി‌എൻ‌എ ശകലത്തിന്റെ 3′ അറ്റത്തിന്റെ അഡിനൈലേഷനുശേഷം, ഹൈബ്രിഡൈസേഷനായി തയ്യാറാക്കുന്നതിനായി ഒരു ഹെയർപിൻ ലൂപ്പ് ഘടനയുള്ള ഒരു NEBNext അഡാപ്റ്റർ അതിൽ ഘടിപ്പിച്ചിരിക്കുന്നു. 150-200 bp നീളമുള്ള cDNA ഫ്രാഗ്മെന്റുകൾ തിരഞ്ഞെടുക്കുന്നതിന്. AMPure XP സിസ്റ്റം (Beckman Coulter, Beverly, USA) ഉപയോഗിച്ച് ലൈബ്രറി ഫ്രാഗ്മെന്റുകൾ ശുദ്ധീകരിച്ചു. തുടർന്ന്, ഒരു അഡാപ്റ്റർ ഉപയോഗിച്ച് വലുപ്പം അനുസരിച്ച് തിരഞ്ഞെടുത്ത cDNA ഉള്ള 3 μl USER എൻസൈം (NEB, USA) 37°C യിൽ 15 മിനിറ്റും തുടർന്ന് 95°C യിൽ 5 മിനിറ്റും PCR ന് മുമ്പ് ഉപയോഗിച്ചു. തുടർന്ന് PCR ഫ്യൂഷൻ ഹൈ-ഫിഡിലിറ്റി DNA പോളിമറേസ്, യൂണിവേഴ്സൽ PCR പ്രൈമറുകൾ, ഇൻഡെക്സ് (X) പ്രൈമറുകൾ എന്നിവ ഉപയോഗിച്ച് നടത്തി. ഒടുവിൽ, PCR ഉൽപ്പന്നങ്ങൾ ശുദ്ധീകരിച്ചു (AMPure XP സിസ്റ്റം) ഒരു Agilent Bioanalyzer 2100 സിസ്റ്റത്തിൽ ലൈബ്രറി ഗുണനിലവാരം വിലയിരുത്തി. തുടർന്ന് ഒരു Novaseq സീക്വൻസർ ഉപയോഗിച്ച് cDNA ലൈബ്രറി ക്രമീകരിച്ചു. ഇല്ലുമിനയിൽ നിന്നുള്ള റോ ഇമേജ് ഫയലുകൾ CASAVA ബേസ് കോളിംഗ് ഉപയോഗിച്ച് റോ റീഡുകളായി പരിവർത്തനം ചെയ്തു. റീഡ് സീക്വൻസുകളും അനുബന്ധ അടിസ്ഥാന ഗുണങ്ങളും അടങ്ങിയ FASTQ(fq) ഫോർമാറ്റ് ഫയലുകളിലാണ് റോ ഡാറ്റ സംഭരിച്ചിരിക്കുന്നത്. ഫിൽട്ടർ ചെയ്ത സീക്വൻസിംഗ് റീഡുകളെ Sscrofa11.1 റഫറൻസ് ജീനോമുമായി പൊരുത്തപ്പെടുത്തുന്നതിന് HISAT2 തിരഞ്ഞെടുക്കുക. പൊതുവേ, 4 ബില്യൺ ബേസുകളിൽ കൂടുതലുള്ള ജീനോമുകൾ ഉൾപ്പെടെ ഏത് വലുപ്പത്തിലുള്ള ജീനോമുകളെയും HISAT2 പിന്തുണയ്ക്കുന്നു, കൂടാതെ മിക്ക പാരാമീറ്ററുകൾക്കും ഡിഫോൾട്ട് മൂല്യങ്ങൾ സജ്ജീകരിച്ചിരിക്കുന്നു. നിലവിൽ ലഭ്യമായ ഏറ്റവും വേഗതയേറിയ സിസ്റ്റമായ HISAT2 ഉപയോഗിച്ച് RNA Seq ഡാറ്റയിൽ നിന്നുള്ള സ്പ്ലൈസിംഗ് റീഡുകൾ കാര്യക്ഷമമായി വിന്യസിക്കാൻ കഴിയും, മറ്റേതൊരു രീതിയേക്കാളും അതേ അല്ലെങ്കിൽ മികച്ച കൃത്യതയോടെ.
ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റുകളുടെ സമൃദ്ധി ജീൻ എക്സ്പ്രഷന്റെ നിലവാരത്തെ നേരിട്ട് പ്രതിഫലിപ്പിക്കുന്നു. ജീനോം അല്ലെങ്കിൽ എക്സോണുകളുമായി ബന്ധപ്പെട്ട ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റുകളുടെ സമൃദ്ധി (സീക്വൻസിങ് കൗണ്ട്) ഉപയോഗിച്ചാണ് ജീൻ എക്സ്പ്രഷൻ ലെവലുകൾ വിലയിരുത്തുന്നത്. റീഡുകളുടെ എണ്ണം ജീൻ എക്സ്പ്രഷൻ ലെവലുകൾ, ജീൻ നീളം, സീക്വൻസിങ് ഡെപ്ത് എന്നിവയ്ക്ക് ആനുപാതികമാണ്. FPKM (ദശലക്ഷം ബേസ് ജോഡികളിൽ ക്രമീകരിച്ച ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റിന്റെ ആയിരം ബേസ് ജോഡികളിലെ ശകലങ്ങൾ) കണക്കാക്കി, DESeq2 പാക്കേജ് ഉപയോഗിച്ച് ഡിഫറൻഷ്യൽ എക്സ്പ്രഷന്റെ P- മൂല്യങ്ങൾ നിർണ്ണയിച്ചു. തുടർന്ന് ബിൽറ്റ്-ഇൻ R-ഫംഗ്ഷൻ "p.adjust" അടിസ്ഥാനമാക്കി ബെഞ്ചമിനി-ഹോച്ച്ബർഗ് രീതി9 ഉപയോഗിച്ച് ഓരോ P മൂല്യത്തിനും തെറ്റായ കണ്ടെത്തൽ നിരക്ക് (FDR) ഞങ്ങൾ കണക്കാക്കി.
തെർമോയിൽ നിന്നുള്ള സൂപ്പർസ്ക്രിപ്റ്റ് IV വിലോ മാസ്റ്റർ മിക്സ് (തെർമോ, പൂച്ച നമ്പർ 11756050) ഉപയോഗിച്ച് ഹൃദയഭാഗങ്ങളിൽ നിന്ന് വേർതിരിച്ചെടുത്ത ആർ‌എൻ‌എ 200 ng/μl സാന്ദ്രതയിൽ സിഡിഎൻ‌എ ആയി പരിവർത്തനം ചെയ്തു. അപ്ലൈഡ് ബയോസിസ്റ്റംസ് എൻഡ്യൂറ പ്ലേറ്റ് മൈക്രോആമ്പ് 384-വെൽ സുതാര്യമായ റിയാക്ഷൻ പ്ലേറ്റ് (തെർമോ, പൂച്ച നമ്പർ 4483319), മൈക്രോആമ്പ് ഒപ്റ്റിക്കൽ പശ (തെർമോ, പൂച്ച നമ്പർ 4311971) എന്നിവ ഉപയോഗിച്ചാണ് ക്വാണ്ടിറ്റേറ്റീവ് ആർ‌ടി-പി‌സി‌ആർ നടത്തിയത്. പ്രതികരണ മിശ്രിതത്തിൽ 5 µl തഖ്മാൻ ഫാസ്റ്റ് അഡ്വാൻസ്ഡ് മാസ്റ്റർ മിക്സ് (തെർമോ, പൂച്ച നമ്പർ 4444557), 0.5 µl തഖ്മാൻ പ്രൈമർ, 3.5 µl H2O എന്നിവ ഓരോ കിണറിലും കലർത്തി. സ്റ്റാൻഡേർഡ് qPCR സൈക്കിളുകൾ പ്രവർത്തിപ്പിക്കുകയും CT മൂല്യങ്ങൾ ഒരു അപ്ലൈഡ് ബയോസിസ്റ്റംസ് ക്വാണ്ട്സ്റ്റുഡിയോ 5 റിയൽ-ടൈം പിസിആർ ഉപകരണം (384-കിണർ മൊഡ്യൂൾ; ഉൽപ്പന്ന നമ്പർ A28135) ഉപയോഗിച്ച് അളക്കുകയും ചെയ്തു. തെർമോ (GAPDH (Ss03375629_u1), PARP12 (Ss06908795_m1), PKDCC (Ss06903874_m1), CYGB (Ss06900188_m1), RGL1 (Ss06868890_m1), ACTN1 (Ss01009508_mH), GATA4 (Ss03383805_u1), GJA1 (Ss03374839_u1), COL1A2 (Ss03375009_u1), COL3A1 (Ss04323794_m1), ACTA2 (Ss04245588_m1) എന്നിവയിൽ നിന്നാണ് തഖ്മാൻ പ്രൈമറുകൾ വാങ്ങിയത്. എല്ലാ സാമ്പിളുകളുടെയും CT മൂല്യങ്ങൾ ഹൗസ് കീപ്പിംഗ് ജീൻ GAPDH-ലേക്ക് നോർമലൈസ് ചെയ്തു.
നിർമ്മാതാവിന്റെ പ്രോട്ടോക്കോൾ അനുസരിച്ച് NT-ProBNP കിറ്റ് (പന്നി) (Cat. No. MBS2086979, MyBioSource) ഉപയോഗിച്ച് NT-ProBNP യുടെ മീഡിയ റിലീസ് വിലയിരുത്തി. ചുരുക്കത്തിൽ, ഓരോ സാമ്പിളിന്റെയും സ്റ്റാൻഡേർഡിന്റെയും 250 µl ഓരോ കിണറിലും തനിപ്പകർപ്പായി ചേർത്തു. സാമ്പിൾ ചേർത്ത ഉടനെ, ഓരോ കിണറിലും 50 µl അസ്സേ റീജന്റ് എ ചേർക്കുക. പ്ലേറ്റ് സൌമ്യമായി കുലുക്കി സീലന്റ് ഉപയോഗിച്ച് സീൽ ചെയ്യുക. തുടർന്ന് ടാബ്‌ലെറ്റുകൾ 37°C ൽ 1 മണിക്കൂർ ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്തു. തുടർന്ന് ലായനി ആസ്പിറേറ്റ് ചെയ്ത് 350 µl 1X വാഷ് ലായനി ഉപയോഗിച്ച് കിണറുകൾ 4 തവണ കഴുകുക, ഓരോ തവണയും 1-2 മിനിറ്റ് വാഷ് ലായനി ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്യുക. തുടർന്ന് ഓരോ കിണറിലും 100 µl അസ്സേ റീജന്റ് B ചേർത്ത് പ്ലേറ്റ് സീലന്റ് ഉപയോഗിച്ച് സീൽ ചെയ്യുക. ടാബ്‌ലെറ്റ് സൌമ്യമായി കുലുക്കി 37°C ൽ 30 മിനിറ്റ് ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്തു. ലായനി ആസ്പിരേറ്റ് ചെയ്ത് 350 µl 1X വാഷ് ലായനി ഉപയോഗിച്ച് കിണറുകൾ 5 തവണ കഴുകുക. ഓരോ കിണറിലും 90 µl സബ്‌സ്‌ട്രേറ്റ് ലായനി ചേർത്ത് പ്ലേറ്റ് അടയ്ക്കുക. പ്ലേറ്റ് 37°C യിൽ 10-20 മിനിറ്റ് ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്യുക. ഓരോ കിണറിലും 50 µl സ്റ്റോപ്പ് സൊല്യൂഷൻ ചേർക്കുക. 450 nm-ൽ സജ്ജീകരിച്ച സൈറ്റേഷൻ (ബയോടെക്) പ്ലേറ്റ് റീഡർ ഉപയോഗിച്ച് പ്ലേറ്റ് ഉടൻ അളന്നു.
5% ടൈപ്പ് I പിശക് നിരക്കിൽ പാരാമീറ്ററിൽ 10% കേവല മാറ്റം കണ്ടെത്തുന്നതിന് 80% ത്തിലധികം പവർ നൽകുന്ന ഗ്രൂപ്പ് വലുപ്പങ്ങൾ തിരഞ്ഞെടുക്കുന്നതിന് പവർ വിശകലനങ്ങൾ നടത്തി. 5% ടൈപ്പ് I പിശക് നിരക്കിൽ പാരാമീറ്ററിൽ 10% കേവല മാറ്റം കണ്ടെത്തുന്നതിന് 80% ത്തിലധികം പവർ നൽകുന്ന ഗ്രൂപ്പ് വലുപ്പങ്ങൾ തിരഞ്ഞെടുക്കുന്നതിന് പവർ വിശകലനങ്ങൾ നടത്തി. അനലിസ് മോഷ്നോസ്റ്റി ബൈൽ വൈപോൾനെൻ ഡ്ലിയ വൈബോറ റജ്മെറോവ് ഗ്രൂപ്പ്, കൊതൊര്യ്യ ഒബെസ്പെചത്>80% മോഷ്നോസ്തി ദ്ല്യ10% അബ്‌സോൾയുട്ട്‌നോഗോ ഇസ്‌മെനെനിയ പരാമെത്രയിൽ 5% ചാസ്‌റ്റോയ് ഓഷിബോക് ടിപ്പ ഐ. 5% ടൈപ്പ് I പിശക് നിരക്കിൽ 10% കേവല പാരാമീറ്റർ മാറ്റം കണ്ടെത്തുന്നതിന് 80% ത്തിലധികം പവർ നൽകുന്ന ഗ്രൂപ്പ് വലുപ്പങ്ങൾ തിരഞ്ഞെടുക്കുന്നതിന് പവർ വിശകലനം നടത്തി.进行功效分析以选择将提供> 80;进行功效分析以选择将提供> 80; ബൈൽ പ്രൊവെഡൻ അനലിസ് മോഷ്‌നോസ്‌റ്റി ഡ്ലിയ വൈബോറ റജ്‌മേര ഗ്രുപ്പി, കോടോറി ഒബെസ്‌പെച്ചിൽ ബി > 80% മോഷ്‌നോസ്‌റ്റി%00 അബ്‌സോൾയുട്ട്‌നോഗോ ഇസ്‌മെനെനിയ പാരാമെട്രോവും 5% ചാസ്‌റ്റോട്ടി ഓഷിബോക് ടിപ്പയും ഐ. 10% കേവല പാരാമീറ്റർ മാറ്റവും 5% ടൈപ്പ് I പിശക് നിരക്കും കണ്ടെത്തുന്നതിന് 80% ത്തിലധികം പവർ നൽകുന്ന ഒരു ഗ്രൂപ്പ് വലുപ്പം തിരഞ്ഞെടുക്കുന്നതിന് ഒരു പവർ വിശകലനം നടത്തി.പരീക്ഷണത്തിന് മുമ്പ് ടിഷ്യു വിഭാഗങ്ങൾ ക്രമരഹിതമായി തിരഞ്ഞെടുത്തു. എല്ലാ വിശകലനങ്ങളും കണ്ടീഷൻ ബ്ലൈൻഡ് ആയിരുന്നു, എല്ലാ ഡാറ്റയും വിശകലനം ചെയ്തതിനുശേഷം മാത്രമേ സാമ്പിളുകൾ ഡീകോഡ് ചെയ്തിട്ടുള്ളൂ. എല്ലാ സ്റ്റാറ്റിസ്റ്റിക്കൽ വിശകലനങ്ങളും നടത്താൻ ഗ്രാഫ്പാഡ് പ്രിസം സോഫ്റ്റ്‌വെയർ (സാൻ ഡീഗോ, കാലിഫോർണിയ) ഉപയോഗിച്ചു. എല്ലാ സ്ഥിതിവിവരക്കണക്കുകൾക്കും, <0.05 എന്ന മൂല്യത്തിൽ p-മൂല്യങ്ങൾ പ്രധാനമായി കണക്കാക്കപ്പെട്ടു. എല്ലാ സ്ഥിതിവിവരക്കണക്കുകൾക്കും, <0.05 മൂല്യങ്ങളിൽ p-മൂല്യങ്ങൾ പ്രാധാന്യമുള്ളതായി കണക്കാക്കപ്പെട്ടു. Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. എല്ലാ സ്ഥിതിവിവരക്കണക്കുകൾക്കും, <0.05 മൂല്യങ്ങളിൽ p-മൂല്യങ്ങൾ പ്രാധാന്യമുള്ളതായി കണക്കാക്കപ്പെട്ടു.对于所有统计数据，p 值在值<0.05 时被认为是显着的。对于所有统计数据，p 值在值<0.05 时被认为是显着的。 Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. എല്ലാ സ്ഥിതിവിവരക്കണക്കുകൾക്കും, <0.05 മൂല്യങ്ങളിൽ p-മൂല്യങ്ങൾ പ്രാധാന്യമുള്ളതായി കണക്കാക്കപ്പെട്ടു.രണ്ട് ടെയിൽഡ് സ്റ്റുഡന്റ്‌സ് ടി-ടെസ്റ്റ് ഡാറ്റയിൽ നടത്തിയത് വെറും രണ്ട് താരതമ്യങ്ങൾ മാത്രമായിരുന്നു. ഒന്നിലധികം ഗ്രൂപ്പുകൾക്കിടയിലുള്ള പ്രാധാന്യം നിർണ്ണയിക്കാൻ വൺ-വേ അല്ലെങ്കിൽ ടു-വേ ANOVA ഉപയോഗിച്ചു. പോസ്റ്റ് ഹോക്ക് ടെസ്റ്റുകൾ നടത്തുമ്പോൾ, ഒന്നിലധികം താരതമ്യങ്ങൾ കണക്കിലെടുക്കുന്നതിന് ടുക്കിയുടെ തിരുത്തൽ പ്രയോഗിച്ചു. മെത്തേഡ്‌സ് വിഭാഗത്തിൽ വിവരിച്ചിരിക്കുന്നതുപോലെ FDR, p.adjust എന്നിവ കണക്കാക്കുമ്പോൾ RNAsec ഡാറ്റയ്ക്ക് പ്രത്യേക സ്റ്റാറ്റിസ്റ്റിക്കൽ പരിഗണനകളുണ്ട്.
പഠന രൂപകൽപ്പനയെക്കുറിച്ചുള്ള കൂടുതൽ വിവരങ്ങൾക്ക്, ഈ ലേഖനവുമായി ലിങ്ക് ചെയ്‌തിരിക്കുന്ന നേച്ചർ റിസർച്ച് റിപ്പോർട്ട് സംഗ്രഹം കാണുക.